CN107164491A - 一种通用型巢氏pcr检测伪狂犬病毒的方法 - Google Patents

一种通用型巢氏pcr检测伪狂犬病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于：通过编码伪狂犬病毒糖蛋白gH中碱基序列得到两对检测引物，将待测样本提取DNA得到样本DNA，将所述样本DNA用两对检测引物进行两次PCR扩增，每次PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以检测伪狂犬病毒。所述方法通过编码糖蛋白gH基因的保守序列，设计两对引物PRV‑O‑F、PRV‑O‑R和PRV‑I‑F、PRV‑I‑R，进行两次PCR扩增，第一次扩增加强PCR的特异性，第二次扩增加强PCR检测的敏感性，两轮PCR提高了PCR的敏感性和特异性。克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，与现有的核酸杂交，基因芯片等检测方法相比成本较低，检测周期短。

Description

一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域,具体为一种通用巢式PCR检测伪狂犬病毒方法。
技术背景
伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV) 导致的一种急性高度接触性传染病。PR在不同的区域感染的比例不同，一般在养猪密集的地方流行比较严重，在多种动物均有不同程度的感染，但是猪是该病的天然宿主，感染本病后一般都会发热、奇痒，感染严重的猪会出现急性脑脊髓炎，凡是被该病感染的猪可终身带毒散毒，该病的发生给养猪业带来重大的经济损失，伪狂犬的净化是当前国内规模化猪场净化的首要任务。
伪狂犬病毒(PRV)属疱诊病毒科疱疹病毒甲亚科，暂定水痘病毒属，该病毒是一个封闭的核衣壳，属于双股DNA病毒，有囊膜，其粒子直径为50-180nm，基因组大小约为143kd，可以编码70-100种病毒蛋白,PRV感染的发生与该病毒的囊膜有着直接的关系，但是裸露的PRV同样具有感染性，但是其感染性比有囊膜病毒的感染性低。PRV中已经发现的糖蛋白有gM，gH，gE，gK，gL，gI，gC， gB，gD，gG和gN11种。糖蛋白又分为必须蛋白和非必须蛋白，在病毒增殖中必须糖蛋白有gN，gH，gK，gD，gB和gL蛋白，在病毒增殖中扮演非必须的蛋白有 gM，gE，gI，gC和gG。近年来，国内外学者建立了中和实验，乳胶凝集试验，酶联免疫吸附试验，核酸杂交，普通PCR诊断，实时荧光定量PCR检测，基因芯片等技术进行PRV的检测。其中普通PCR成本较低，操作方便，得到了广泛的应用，但是由于其灵敏度较低，PRV基因组较高的GC含量使扩增有较大的非特异性等因素使其推广应用具有一定的局限性。
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两次PCR扩增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且二次PCR引物发生非特异性结合的概率极低。当前伪狂犬PCR检测的靶标多为gB，但是目前gB变异较大，导致检测灵敏度降低。gH由UL22基因编码，含686个氨基酸残基，保守性很高，为PRV复制必需的一种结构蛋白，因此，编码gH糖蛋白的基因序列可作为检测PRV的诊断靶标。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种快速简便的巢式PCR检测PRV的方法，通过编码糖蛋白gH基因的保守序列，设计两对引物PRV-O-F、PRV-O-R和PRV-I-F、 PRV-I-R，进行两次PCR扩增，第一次扩增加强PCR的特异性，第二次扩增加强 PCR检测的敏感性，两轮PCR提高了PCR的敏感性和特异性。克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，与现有的核酸杂交，基因芯片等检测方法相比成本较低，检测周期短。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于：通过编码伪狂犬病毒糖蛋白gH中碱基序列得到两对检测引物，将待测样本提取DNA得到样本 DNA，将所述样本DNA用两对检测引物进行两次PCR扩增，每次PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以检测伪狂犬病毒。
所述两对检测引物，分别为外侧引物PRV-O-F、PRV-O-R和内侧引物PRV-I-F、 PRV-I-R；所述外侧引物对应于伪狂犬病毒(PRV)糖蛋白gH中UL22基因末端与 UL21基因区间；所述内侧引物在外侧引物扩增序列内侧、且对应于伪狂犬病毒 (PRV)糖蛋白gH中UL22基因末端。
具体包括以下步骤：
1)编码得到所述外侧引物序列为：
PRV-O-F：上游引物5’-GCTCGCCCTCGTCAGCAAC-3’
PRV-O-R：下游引物5’-AACACGCGCACGCAGAGAGT-3’
编码得到所述内侧引物序列为：
PRV-I-F：上游引物5’-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3’
PRV-I-R：下游引物5’-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3’
2)提取样品DNA
采集小猪血样，收集样本血清，用柱式血液样本DNA提取试剂盒提取DNA 得到样品DNA；
3)PCR扩增与电泳检测
A：用外侧检测引物PRV-O-F、PRV-O-R进行第一次PCR扩增，PCR反应体系为：PremixTaq 12-13μL，PRV-O-F0.5-1.5μL，PRV-O-R0.5-1.5μL，ddH2O8-9 μL，模板1-3μL；反应条件为90-96℃预变性4-6min；90-96℃变性25-35s, 55-60℃退火25-35s,70-75℃延伸25-35s；70-75℃再延伸8-12min，2-5℃ 10min，PCR产物用0.6-1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；
B：用内侧检测引物PRV-I-F、PRV-I-R对第一次扩增产物模板进行第二次扩增，PCR反应体系为：Premix Taq 12-13μL，PRV-O-F0.5-1.5μL，PRV-O-R0.5-1.5 μL，ddH2O8-9μL，模板1-3μL；反应条件为90-96℃预变性4-6min；90-96℃变性25-35s,55-65℃退火25-35s,70-75℃延伸25-35s；70-75℃再延伸 8-12min，2-5℃10min，PCR产物用0.6-1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测；
其中，所述外侧引物扩增出的条带序列为SEQIDNO.1所示的DNA片段；所述内侧引物扩增出的条带序列为SEQIDNO.2所示的DNA片段。
本发明的技术效果为：
本发明所述的检测方法包括检测伪狂犬病毒编码糖蛋白gH的保守的特异性UL22基因，巢式PCR所用的两对检测引物PRV-O-F、PRV-O-R和PRV-I-F、PRV-I-R 的设计，PCR最佳反应条件的确定；所述的巢式PCR先对检测样品用外侧引物进行第一次PCR扩增，扩增产物作为模板用内侧引物进行第二次扩增。本发明针对伪狂犬病毒基因组特征，应用分子生物学技术研制和开发出了一种快速、简便的巢式PCR检测方法具有特异性、敏感性和准确性高的特点。采用的血清DNA提取检测避免了猪只的处死，对带毒量较低的规模化猪场伪狂犬检测和净化提供了便利。同时还适用于待检猪的脾脏、肺脏等样品，所述巢式PCR检测方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
附图说明
图1为巢式PCR引物特异性检测的凝胶电泳图；
图1中M为DL2000DNA Marker，1-5中的模板分别为伪狂犬，细小，圆环，大肠杆菌，空肠弯曲菌基因组。
图2为为巢式PCR引物特异性检测的凝胶电泳图；
图2中M为DL2000DNA Marker，1-5中的模板分别为伪狂犬，细小，圆环，大肠杆菌，空肠弯曲菌基因组。
图3为巢式PCR外侧引物敏感性检测的凝胶电泳图；
图3中M为DL2000DNA Marker，1-9中模板拷贝数依次为4.0×109，4.0 ×108，4.0×107，4.0×106，4.0×105，4.0×104，4.0×103，4.0×102，4.0× 101，4.0，10为阴性对照。
图4为巢式PCR内侧引物敏感性检测的凝胶电泳图；
图4中1-9分别以第一次PCR产物为相应模板，10为阴性对照。
图5为巢式PCR引物干扰性检测的凝胶电泳图；
图5中M为DL2000DNA Marker，1为外侧引物PRV-O-F、PRV-O-R检测，2 为内侧引物PRV-I-F、PRV-I-R检测。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明所述方法可行性分型及鉴定试验：
一种快速简便的巢式PCR检测PRV的方法，所述方法包含普通PCR用的Taq Mix，DNA提取试剂盒，目的基因外侧扩增引物(PRV-O-F、PRV-O-R)和内侧引物 (PRV-I-F、PRV-I-R)，阴性对照，阳性标准品。
所述方法目的基因外侧扩增引物序列PRV-O-F至PRV-O-R为：
PRV-O-F：上游引物5’-GCTCGCCCTCGTCAGCAAC-3’
PRV-O-R：下游引物5’-AACACGCGCACGCAGAGAGT-3’
所述方法目的基因内侧扩增引物序列PRV-I-F至PRV-I-R为：
PRV-I-F：上游引物5’-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3’
PRV-I-R：下游引物5’-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3’
所述外侧引物扩增出的条带序列为SEQIDNO.1所示的DNA片段；
所述内侧引物扩增出的条带序列为SEQIDNO.2所示的DNA片段；
所述阴性对照为无DNA、RNA的ddH2O。
所述阳性标准品为含有SEQIDNO.1序列的阳性质粒pMD20-T-gH，其构建方法如下：
A.按照康为世纪Universal Genomic DNA Kit试剂盒操作说明书提取感染细胞的PRV病毒基因组DNA留做模板；以PRV-O-F和PRV-O-R作为扩增引物，PCR 反应体系为：PremixTaq 12.5μL，PRV-O-F 1μL，PRV-O-R 1μL，ddH2O 8.5 μL，模板2μL；反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s,58℃退火30s, 72℃延伸30s,共35个循环；72℃再延伸10min,4℃30min。PCR产物于 0.8％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
B.PCR产物的连接、转化、及序列分析：PCR产物用Omega公司的胶回收试剂盒回收，然后与pMD20-T克隆载体进行连接，连接体系为：pMD20-T vector 1μL，PCR回收产物1μL，Ligation Mighty Mix 5μL，ddH2O 3μL；16℃恒温连接30min后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp抗性的LB培养基上； 37℃培养过夜，通过抗性筛选出正确的重组子。
C.重组质粒的鉴定：用引物PRV-O-F和PRV-O-R对挑选的阳性克隆进行菌落PCR鉴定，阳性产物送上海生工测序比对，鉴定正确的重组子命名为 pMD20-T-gH。
D.重组质粒的提取：鉴定正确的重组子用LB肉汤进行增菌后采用康为公司的高纯度质粒小提试剂盒PurePlasmid Mini Kit提取质粒并测定浓度，计算拷贝数。
特异性试验：
提取圆环2型，细小病毒，大肠杆菌，空肠弯曲菌基因组当模板，对巢式 PCR所用到的两对引物PRV-O-F、PRV-O-R和PRV-I-F、PRV-I-R进行特异性检测，检验两对引物的特异性。
敏感性试验：
通过对重组质粒pMD20-T-gH进行10倍倍比稀释，选取各稀释度质粒当做模板用引物PRV-O-F和PRV-O-R进行第一次PCR扩增，扩增产物作为相应梯度的模板用引物PRV-I-F至PRV-I-R做第二次PCR扩增，两次扩增产物分别用0.8％琼脂糖胶进行检测，观察经过巢式PCR两次扩增后所能检测到的最低拷贝数为101。
干扰试验：
对特异性试验中用到的基因组与伪狂犬基因组取等量进行混合，用引物 PRV-O-F、PRV-O-R和PRV-I-F、PRV-I-R分别进行PCR扩增，检验引物的抗干扰性，能否从混合基因组模板中扩增出目的条带。
符合率试验：
提取HB-98株，Bartha-K61株，鄂A株，SA215株，BUK株，TK200株等毒株的基因组，测定浓度后计算出拷贝数，梯度稀释至个位数拷贝数，经过两轮巢式PCR扩增后，各类基因组均能检测到101个数量级的基因拷贝数。
本发明方法可行性鉴定试验的具体实施例如下：
实施例1
重组阳性质粒pMD20-T-gH构建：
1、gH基因的克隆
根据伪狂犬病毒gH基因相对保守片段与上下游相应序列，设计一对巢式PC R外侧引物，上游引物PRV-O-F：5’-GCTCGCCCTCGTCAGCAAC-3’，下游引物P RV-O-R：5’-AACACGCGCACGCAGAGAGT-3’。
提取伪狂犬病毒(PRV)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，采用上述引物PCR扩增部分保守gH基因。PCR反应体系为：Premix Taq 12.5μL，PRV-O-F 1μL，PRV-O-R 1μL，ddH2O 8.5μL，模板2μL；反应条件为94℃预变性5min； 94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环；72℃再延伸 10min,4℃30min。PCR产物于0.8％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，结果如图1 所示，获得了一条约499bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。
2、pMD20-T-gH阳性质粒构建
将上述PCR产物用Omega公司的胶回收试剂盒回收，然后与塔克拉公司的 pMD20-T克隆载体进行连接，连接体系为：pMD20-T vector 1μL，PCR回收产物 1μL，LigationMighty Mix 5μL，ddH2O 3μL；16℃恒温连接30min后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp抗性的LB培养基上；37℃培养过夜，通过抗性筛选出正确的重组子。
3、pMD20-T-gH阳性重组子鉴定
用引物PRV-O-F和PRV-O-R对挑选的阳性克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的重组子命名为pMD20-T-gH
4、重组质粒pMD20-T-gH的提取
测序鉴定正确的重组子用LB肉汤进行增菌后采用康为公司的高纯度质粒小提试剂盒PurePlasmid Mini Kit提取质粒并测定浓度，计算拷贝数。
实施例2：
巢式PCR引物特性检测与反应条件的优化
根据Taq酶的特性，经过退火温度梯度的摸索，外侧引物的最佳扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸10min。内侧引物的最佳扩增条件如下：94℃预变性5min； 94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸10min。
特异性试验：
提取圆环2型，细小病毒，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌基因组当模板，对巢式PCR所用到的两对引物PRV-O-F、PRV-O-R和PRV-I-F、PRV-I-R进行特异性检测，检验两对引物的特异性，结果如图1、2所示，两对引物均具有良好的特异性和较高的扩增效率。
敏感性试验：
提取重组质粒pMD20-T-gH，测定浓度后计算出拷贝数为4.0×1010，进行10 倍倍比稀释至个位数拷贝数(4copy)，选取各稀释度质粒当做模板用引物 PRV-O-F、PRV-O-R进行第一次PCR扩增，PCR产物用0.8％琼脂糖胶检测，结果如图3所示，第一次PCR扩增电泳结果显示，外侧引物可检测到基因拷贝数为 4.0×104，且扩增特异性好。扩增产物作为相应梯度的模板用引物PRV-I-F、 PRV-I-R做第二次PCR扩增，扩增产物用0.8％琼脂糖胶进行检测，结果如图4 所示，经过巢式PCR两次扩增后所能检测到的最低40个拷贝数，比当前以gB为靶标的检测方法灵敏度提高了2-3个数量级。
干扰试验：
对特异性试验中用到的基因组与伪狂犬基因组取等量进行混合，用引物 PRV-O-F、PRV-O-R和PRV-I-F、PRV-I-R分别进行PCR扩增，检验引物的抗干扰性，能否从混合基因组模板中扩增出目的条带，结果如图5所示，两对引物均能从混合模板中扩增出特异性条带，显示引物抗干扰性较好。
符合率试验：
为验证巢式引物对各地区流行伪狂犬病毒检测的敏感性，提取了HB-98株，Bartha-K61株，鄂A株，SA215株，BUK株，TK200株等毒株的基因组，测定浓度后计算出拷贝数，梯度稀释至个位数拷贝数，经过两轮巢式PCR扩增后，各类基因组均能检测到101个数量级的基因拷贝数，证明本发明方法切实可行。
经上述论证，本发明所述一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法是：
1、采样与DNA提取
A：血清样本处理：前腔静脉采血，1500r/min离心30分钟，收集样本血清，取100μL用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。
B：组织样品处理：取待检测猪只样本的组织器官0.25g，剪碎后用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。
2、PCR扩增与电泳检测
A：用外侧检测引物PRV-O-F、PRV-O-R进行第一次PCR扩增，PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增。
B：用内侧检测引物PRV-I-F、PRV-I-R对第一次扩增产物模板进行第二次扩增，PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
3、结果分析
根据巢式PCR扩增结果判定：在第一次PCR扩增后电泳检测到目标条带则报告为阳性，且检测样本带毒量较高；第二次PCR扩增后电泳检测到目标条带的也判断为阳性，表明样品带毒量相对较低；两轮巢式PCR后检测均无目的条带的则报告为阴性。
本发明所述方法的具体实施例如下：
实施例3
1、临床样品
2017年3月从湖北某家规模化猪场采集小猪血样10份，1500r/min离心 30分钟，收集样本血清，按照康为公司的柱式血液样本DNA提取试剂盒提取DNA。
2、PCR扩增与电泳检测
A：用外侧检测引物PRV-O-F、PRV-O-R进行第一次PCR扩增，PCR反应体系为：PremixTaq 12.5μL，PRV-O-F 1μL，PRV-O-R 1μL，ddH2O 8.5μL，模板 2μL；反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环；72℃再延伸10min,4℃10min。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增。
B：用内侧检测引物PRV-I-F、PRV-I-R对第一次扩增产物模板进行第二次扩增，PCR反应体系为：Premix Taq 12.5μL，PRV-O-F 1μL，PRV-O-R 1μL，ddH2O 8.5μL，模板2μL；反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s,60℃退火30s, 72℃延伸30s,共35个循环；72℃再延伸10min,4℃10min。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
3、检测结果
通过巢式PCR进行2次扩增后电泳检测，10份血清样本共检测到4份阳性，测序结果显示4份阳性产物均为伪狂犬基因，证明该方法检测的结果具有可靠性。
综上所述，本发明的特点在于，糖蛋白gH是伪狂犬病毒复制过程中所必须的，由相对保守的基因UL22编码，通过编码gH糖蛋白的碱基序列设计特异性引物可以扩增出伪狂犬病毒的野毒株和基因缺失疫苗毒株，检测范围更为宽广。巢式 PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段，第一轮扩增使用较高退火温度提高PCR的特异性，第二次内侧引物使用第一次PCR扩增的模板提高检测的敏感性，经过两轮PCR扩增，可以提高普通PCR的特异性和灵敏度，且二次PCR引物发生非特异性结合的概率极低，本发明的方法对现有流行毒株检测的最低拷贝数可达到101个数量级，最低拷贝数为40，比目前以gB为靶标的检测方法灵敏度高2-3个数量级，具有更强的特异性，能够达到快速、准确、安全、低污染的检测效果。此外，本发明方法可用于对组织样本、血清、血浆和精液等样本的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的原则之内所做的任何简单修改、等同变换与改型，仍应属于本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 长江大学
<120> 一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法
<130> 2017.6
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 499
<212> DNA
<213> 伪狂犬病毒糖蛋白gH
<400> 1
gctcgccctcgtcagcaacgacagcgccgcgtgcgactacacggaccgcatgcccgagtc 60
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gcgctactcctccgcgggcacgatcctggagaccgtcctcatcgagtccaaggacatgga 180
ggagcagctcatggccggcgccaactccaccatccccagcttcaacccgacgctgcacgg 240
cggcgacgtcaaggccctgatgctcttccccaacggcaccgtggtcgacctgctgtcgtt 300
cacgtcgacgcggctcgcgcccgtgtccccggcctacgtggtggcctccgtcgtgggggc 360
ggccatcaccgtggggatcctgtacgccctgttcaagatgctctgcagcttctcctccga 420
gggctattctcggttaataaacgccaggtcgtgaggcccgcgccgggccgcgaacccaga 480
ctctctgcgtgcgcgtgtt 499
<210> 2
<211> 356
<212> DNA
<213> 伪狂犬病毒糖蛋白gH
<400> 2
gcgtgtactgcgactgcgtgttcgtgcgctactcctccgcgggcacgatcctggagaccg 60
tcctcatcgagtccaaggacatggaggagcagctcatggccggcgccaactccaccatcc 120
ccagcttcaacccgacgctgcacggcggcgacgtcaaggccctgatgctcttccccaacg 180
gcaccgtggtcgacctgctgtcgttcacgtcgacgcggctcgcgcccgtgtccccggcct 240
acgtggtggcctccgtcgtgggggcggccatcaccgtggggatcctgtacgccctgttca 300
agatgctctgcagcttctcctccgagggctattctcggttaataaacgccaggtcg 356

Claims (3)

1.一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于：通过编码伪狂犬病毒糖蛋白gH中碱基序列得到两对检测引物，将待测样本提取DNA得到样本DNA，将所述样本DNA用两对检测引物进行两次PCR扩增，每次PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以检测伪狂犬病毒。
2.根据权利要求1所述的一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述两对检测引物，分别为外侧引物PRV-O-F、PRV-O-R和内侧引物PRV-I-F、PRV-I-R；所述外侧引物对应于伪狂犬病毒(PRV)糖蛋白gH中UL22基因末端与UL21基因区间；所述内侧引物在外侧引物扩增序列内侧、且对应于伪狂犬病毒(PRV)糖蛋白gH中UL22基因末端。
3.根据权利要求1或2所述的一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)编码得到所述外侧引物序列为：
PRV-O-F：上游引物5’-GCTCGCCCTCGTCAGCAAC-3’
PRV-O-R：下游引物5’-AACACGCGCACGCAGAGAGT-3’
编码得到所述内侧引物序列为：
PRV-I-F：上游引物5’-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3’
PRV-I-R：下游引物5’-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3’
2)提取样品DNA
采集猪血样，收集样本血清，用柱式血液样本DNA提取试剂盒提取DNA得到样品DNA；
3)PCR扩增与电泳检测
A：用外侧检测引物PRV-O-F、PRV-O-R进行第一次PCR扩增，PCR反应体系为：Premix Taq12-13μL，PRV-O-F0.5-1.5μL，PRV-O-R0.5-1.5μL，ddH2O8-9μL，模板1-3μL；反应条件为90-96℃预变性4-6min；90-96℃变性25-35s,55-60℃退火25-35s,70-75℃延伸25-35s；70-75℃再延伸8-12min，2-5℃10min，PCR产物用0.6-1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；
B：用内侧检测引物PRV-I-F、PRV-I-R对第一次扩增产物模板进行第二次扩增，PCR反应体系为：Premix Taq 12-13μL，PRV-O-F0.5-1.5μL，PRV-O-R0.5-1.5μL，ddH2O8-9μL，模板1-3μL；反应条件为90-96℃预变性4-6min；90-96℃变性25-35s,55-65℃退火25-35s,70-75℃延伸25-35s；70-75℃再延伸8-12min，2-5℃10min，PCR产物用0.6-1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测；
其中，所述外侧引物扩增出的条带序列为SEQIDNO.1所示的DNA片段；所述内侧引物扩增出的条带序列为SEQIDNO.2所示的DNA片段。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762933A (zh) * 2019-01-25 2019-05-17 长江大学 一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式rt-pcr检测引物及方法
CN109762930A (zh) * 2018-06-26 2019-05-17 长江大学 一种通用型巢式pcr检测伪狂犬病毒的方法
CN109825640A (zh) * 2019-01-08 2019-05-31 长江大学 一种非洲猪瘟病毒巢式pcr检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898044A (zh) * 2014-03-20 2014-07-02 河南农业大学 猪圆环病毒2型高敏感性pk15细胞系l8的制备方法
CN104726611A (zh) * 2013-12-19 2015-06-24 普莱柯生物工程股份有限公司 一种检测猪伪狂犬野毒的方法、引物及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104726611A (zh) * 2013-12-19 2015-06-24 普莱柯生物工程股份有限公司 一种检测猪伪狂犬野毒的方法、引物及试剂盒
CN103898044A (zh) * 2014-03-20 2014-07-02 河南农业大学 猪圆环病毒2型高敏感性pk15细胞系l8的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYUN A YOON等: "Molecular survey of latent pseudorabies virus infection in nervous tissues of slaughtered pigs by nested and real-time PCR", 《THE JOURNAL OF MICROBIOLOGY》 *
吴旭锦等: "猪伪狂犬病病毒套式PCR检测方法的建立与应用", 《动物医学进展》 *
赵丽等: "PCR检测猪伪狂犬病毒方法的研究", 《中国预防兽医学报》 *
赵丽等: "鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立", 《生物工程学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762930A (zh) * 2018-06-26 2019-05-17 长江大学 一种通用型巢式pcr检测伪狂犬病毒的方法
CN109825640A (zh) * 2019-01-08 2019-05-31 长江大学 一种非洲猪瘟病毒巢式pcr检测方法
CN109762933A (zh) * 2019-01-25 2019-05-17 长江大学 一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式rt-pcr检测引物及方法

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