CN101560575A - 流感病毒rt-pcr检测引物及检测流感病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种流感病毒RT－PCR检测引物及检测流感病毒的方法，包括甲型流感病毒通用性引物、甲型H1N1流感病毒H1通用性引物、新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物等3对共6条寡核苷酸引物序列，同时公开了待检样本的处理、RT－PCR反应体系及反应条件、结果分析。能快速有效的甄别甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、新甲型H1N1流感病毒，为临床诊断、检验检疫等领域的流感疫情早期预警机制提供了可行的技术支持。

Description

流感病毒RT-PCR检测引物及检测流感病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种RT-PCR检测技术，尤其涉及一种流感病毒RT-PCR检测引物及检测流感病毒的方法。

背景技术

流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为A型、B型、C型。A型流感病毒根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型；B型和C型流感病毒不分亚型。A型常引起世界性大流行；B型、C型则以局部暴发和散发流行为特征。

2009年3月，墨西哥和美国先后发现了甲型H1N1流感病毒感染病例，至2009年5月21日，已经有42个国家出现甲型H1N1流感确诊病例，全球确诊病例超过1万，感染人数呈不断上升趋势。目前的数据显示，该病毒已经具备了人际传播的能力，人群对该病毒的免疫低下，因此病毒在人际之间的传播能力较普通流感病毒强。

甲型H1N1流感潜伏期一般1至7天，早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。部分患者病情来势凶猛、突然高热、体温超过39℃，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、休克及Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，最后导致死亡。甲型流感H1N1亚型病毒的基因核酸序列与季节性流感病毒H1N1接近，病原的诊断需要采用较为复杂和繁琐的基因序列测定，难以在普通实验室进行。

现有技术中，采用的流感病毒检测方法为鸡胚病毒分离培养方法，灵敏度高。

上述现有技术至少存在以下缺点：

操作费时、需3周时间，而且对实验室的要求也比较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的流感病毒RT-PCR检测引物及检测流感病毒的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的流感病毒RT-PCR检测引物，包括以下一种或多种引物：

甲型流感病毒通用性引物、甲型H1N1流感病毒H1通用性引物、新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物；

所述甲型流感病毒通用性引物针对甲型流感病毒M基因相对保守区；

所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物针对甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区；

所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物针对新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区。

本发明的应用上述的流感病毒RT-PCR检测引物检测流感病毒的方法，其特征在于，包括步骤：

首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；

然后，利用一步法RT-PCR试剂盒加入所述引物进行核酸扩增；

之后，利用RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特异性条带的大小判断待检样本流感病毒是否阳性。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的流感病毒RT-PCR检测引物及检测流感病毒的方法，由于包括针对甲型流感病毒M基因、甲型H1N1流感病毒HA基因或新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区的引物。可以通过RT-PCR法检测流感病毒，操作简单、应用方便。

具体实施方式

本发明的甲型流感病毒RT-PCR检测引物，其较佳的具体实施方式是，包括以下一种或多种引物：

甲型流感病毒通用性引物、甲型H1N1流感病毒H1通用性引物、新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物；

所述甲型流感病毒通用性引物针对甲型流感病毒M基因相对保守区；

所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物针对甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区；

所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物针对新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区。

所述引物包括长度为20～26bp的寡核苷酸片段。

所述甲型流感病毒通用性引物包括以下两条序列：

5’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’；5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’；

所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物包括以下两条序列：

5’-AAGAGCACACATAATGCCAT-3’；5’-CCATTRGARCACATCCAG-3’；

所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物包括以下两条序列：

5’-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3’；5’-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3’。

每种所述引物的两条序列中，其中一条与病毒基因正向序列互补；另一条与病毒基因反向序列互补。

本发明应用上述的甲型流感病毒RT-PCR检测引物检测流感病毒的方法包括步骤：

首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；

然后，利用一步法RT-PCR试剂盒加入所述引物进行核酸扩增；

之后，利用RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特异性条带的大小判断待检样本流感病毒是否阳性。

所述流感病毒可以包括以下一种或多种病毒：

甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、新甲型H1N1流感病毒。

本发明中，包括3种引物，每种引物包括两条，其中一条与病毒基因正向序列互补，另一条与反向序列互补。引物序列(5’→3’)及其检测的靶片段和扩增效果描述如下：

编号	RT-PCR引物名称及序列	检测靶基因	扩增片段长度	扩增效果
					Univer-FluA	FluA-M-F30：5′-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’FluA-M-R264：5′-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’	M	235bp	当前流行所有甲型流感病毒均能检出
Univer-H1	H1F1147：5′-AAGAGCACACATAATGCCAT-3’H1R1673：5′-CCATTRGARCACATCCAG-3’	HA	527bp	当前流行所有甲型流感病毒H1N1亚型均能检出
					SWH1	SWH1F768：5′-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3’SWH1R920：5′-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3’	HA	153bp	当前流行新甲型流感病毒H1N1及猪流感病毒H1N1均应能检出

本发明中，应用RT-PCR反应液检测待测样品中新甲型流感病毒H1N1的方式，从待测样本中提取核酸RNA后，直接进行一步法RT-PCR检测、琼脂糖凝胶电泳及结果分析，能够准确、高效地检出待检样本中甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、新甲型H1N1流感病毒，可用于流感病毒的实验室确诊。

具体实施例：

包括了寡核苷酸引物的设计、待检样本的处理、检测和分析。为进一步说明新甲型H1N1流感病毒RT-PCR检测引物及应用方法，参照下列实施例进行说明：

实施例一：甲型流感病毒H1N1RT-PCR寡核苷酸引物的设计与合成：

GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)中和中国国家流感中心病毒序列数据库中下载猪源流感病毒H1N1和甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1等亚型M基因和HA基因全序列，软件比对分析所有甲型流感病毒M基因序列的一致性，选择相对保守区设计引物；将猪源H1N1、新甲型H1N1和季节性甲型流感病毒H1N1所有HA基因序列放在一起比对，分别选择保守区和异变区设计引物。引物设计中允许同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：①探针长度L在19~28bp之间；②Tm值在42~59℃之间；③GC％在25~75％之间；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率>90％；⑦进行BLAST筛选，特异性分数>L×0.4。最佳Tm值设定在47℃，最佳探针长度为20-25bp。

实施例二：本发明检测未知病毒的应用举例：

1.病毒RNA的提取：

取病毒采样液200μL，加入500μL裂解液，按RNeasy Mini Kit(Qiagen公司，catalog#74104)说明书提取病毒RNA 50μL。

2.RT-PCR反应：

1)体系配置：使用QIAGEN One step RT-PCR Kit(catalog#210212)反应液。

2)RT-PCR：将加好上述反应体系的反应管放于PCR仪进行RT-PCR，反应程序如下

60℃作用1分钟；

42℃作用10分钟；

50℃作用30分钟；

95℃作用15分钟；

94℃变性30秒；

50℃退火30秒；

72℃延伸1分钟；

回到第5步，34个循环；

72℃作用10分钟；

4℃保存。

3.RT-PCR产物检测：各取5ul产物于1.5％Agrorose gel进行电泳观察结果。

4.结果判断：在系统成立即阴阳性参考均正常的条件下，判断阴阳性结果，分别如下：

阳性：FluA在234处、H1在327bp处、SWH 1在153bp、HuSwH1在527bp处出现特异性条带，判为阳性结果。

阴性：未出现条带，或不在上述位置出现非特异性条带，均判为阴性结果。

本发明提供了3套共6条用于甄别流感病毒的寡核苷酸引物序列，并提供了RT-PCR的检测体系及其在流感病毒快速检测中的应用。

检测评价：

特异性评价：共选取国内近三年流行季节性流感病毒H1N1亚型20株进行检测，Univer-FluA和Univer-H1均能检出，而SW-H1不能检出；选取10株猪流感病毒H1N1亚型、2株新甲型流感病毒H1N1亚型进行检测，三对引物均能检出；选取甲型流感病毒H3N2进行检测，除Univer-FluA检测为阳性外，其余2对检测均为阴性；选取B型流感病毒进行检测，四对引物检测均为阴性。

灵敏性评价：用来自美国血凝单位为32HA/50μL的H1N1毒株(A/California/09/2009)200μL提取RNA 50μL，10倍梯度稀释显示灵敏性达到10-5-10-7稀释度。

本发明可以将RT-PCR技术应用于新甲型H1N1流感病毒(猪流感)的甄别、检测体系中。为新甲型H1N1流感病毒的实验室诊断提供了有效的检测技术，为新甲型H1N1流感病毒的早发现、早预防和早治疗以及公共卫生策略的制定提供技术手段和检测依据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>流感病毒RT-PCR检测引物及检测流感病毒的方法

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>甲型流感病毒通用性引物

<400>1

ttctaaccga ggtcgaaacg

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>甲型流感病毒通用性引物

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acaaagcgtc tacgctgcag

<210>3

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>甲型H1N1流感病毒H1通用性引物

<400>3

aagagcacac ataatgccat

210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>甲型H1N1流感病毒H1通用性引物

<400>4

ccattrgarc acatccag

<210>5

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物

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aataacatta gaagcaactg g

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物

<400>6

aggctggtgt ttatrgcacc

01-05-22

关闭窗

Claims (6)

1、一种流感病毒RT-PCR检测引物，其特征在于，包括以下一种或多种引物：

甲型流感病毒通用性引物、甲型H1N1流感病毒H1通用性引物、新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物；

所述甲型流感病毒通用性引物针对甲型流感病毒M基因相对保守区；

所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物针对甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区；

所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物针对新甲型H1N1流感病毒HA基因相对保守区。

2、根据权利要求1所述的流感病毒RT-PCR检测引物，其特征在于，所述引物包括长度为20～26bp的寡核苷酸片段。

3、根据权利要求2所述的流感病毒RT-PCR检测引物，其特征在于：

所述甲型流感病毒通用性引物包括以下两条序列：

5’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’；5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’；

所述甲型H1N1流感病毒H1通用性引物包括以下两条序列：

5’-AAGAGCACACATAATGCCAT-3’；5’-CCATTRGARCACATCCAG-3’；

所述新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物包括以下两条序列：

5’-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3’；5’-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3’。

4、根据权利要求3所述的流感病毒RT-PCR检测引物，其特征在于，每种所述引物的两条序列中，其中一条与病毒基因正向序列互补；另一条与病毒基因反向序列互补。

5、一种应用权利要求1至4任一项所述的流感病毒RT-PCR检测引物检测流感病毒的方法，其特征在于，包括步骤：

首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；

然后，利用一步法RT-PCR试剂盒加入所述引物进行核酸扩增；

之后，利用RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特异性条带的大小判断待检样本流感病毒是否阳性。

6、根据权利要求5所述的检测流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一种或多种病毒：

甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、新甲型H1N1流感病毒。