CN101864495B - 一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包含RNA提取液、甲型流感病毒核酸恒温扩增反应液、甲型流感病毒阳性对照、阴性对照。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；可同时满足高通量和低通量的样品检测，且整个反应过程不需要复杂的仪器。

Description

一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。 

背景技术

流感病毒分为甲、乙、丙三型，甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。流感甲型病毒的表面抗原会经常发生细小变异，即病毒通过细小的变化伪装自己，从而达到躲避人体免疫系统识别的目的。甲型病毒变异的结果是每年引发流感的毒株都有可能不同，人们每年都需要重新接种流感疫苗进行预防，往往会导致流感的全球性大暴发。 

甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型(H1～H15)，N有9个亚型(N1～N9)。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。一般情况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。但1997年香港首次报道发生18例H5N1人禽流感感染病例，其中6例死亡，引起全球广泛关注。1997年以后，世界上又先后几次发生了禽流感病毒感染人的事件。具有高致病性的H5N1、H7N7、H9N2、等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。 

同许多其它的呼吸系统病毒性疾病相似，流感也是一种季节性疾病，夏季的发病率较低，冬季的发病率较高。同时发病时间与地理位置有关，北半球通常在1～2月份达到高峰，南半球的流行通常在5～9月。 

流感发病严重程度与个体免疫状况有关，一般说来，仅约50％的感染病人会发展成典型流感临床症状。流感典型症状以突然发热、头晕头痛、肌痛、全身症状轻、同时可伴有喉咙痛和咳嗽、鼻塞、流涕、胸痛、眼痛、畏光等症状。发热体温可达39～40℃，一般持续2～3d后渐退。一般是全身症状较重而呼吸道症状并不严重。其最常见的并发症是继发性细菌性肺炎。 

预防流感，除接种流感疫苗外，还需注意保持个人卫生，养成良好的个人卫生习惯；居室和办公室，都要经常通风，减少室内聚集的细菌和病毒数，保持室内清新的空气；疾病流行期应尽量避免到公共场所，比如商场、电影院等人群密集的地方；要加强体育锻炼，经常坚持户外运动，以增强身体抵抗力。 

近年来的发展起来针对甲型流感病毒的荧光定量PCR(Fluorescence QuantitativePCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在甲型流感病毒的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前甲型流感检测的主要方法，目前国内市场上已经有了关于甲型流感核酸定量检测试剂盒。 

FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造成假阳性等问题。 

交叉引物扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种(三对)特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、多次温度循环等过程，此交叉引物恒温扩增靶核苷酸序列的方法及其应用本申请人之前已申请专利(申请号：200810134583.1)。在此方法的基础上制备了本发明的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒特异性好，灵敏度高，步骤简单，反应速度快。 

本发明所提供的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，包括下列组成： 

(1)RNA提取液：RNA提取试剂盒； 

(2)恒温扩增反应液： 

包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermol buffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中： 

所述的外围引物分别为： 

正向外围引物序列为5’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’(SEQ ID NO1)； 

反向外围引物序列为5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’(SEQ ID NO2)； 

所述的两条探针的序列分别为： 

正向5’端Biotin标记探针5’-biotin-CATGGAATGGCTAAAGACAA-3’(SEQ ID NO3)； 

反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5’-CCTTAGTCAGAGGTGACAAG-FitC-3’(SEQ ID NO4)； 

所述的扩增交叉引物分别为： 

扩增反向引物5’-CTATCATCCCGTCAGGCCCACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’(SEQ ID NO5)； 

扩增正向引物5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAGCTATCATCCCGTCAGGCCC-3’(SEQ ID NO6)； 

(3)阳性对照模板：为含有甲型流感M基因片段的转录产物； 

(4)阴性对照：无菌双蒸水。 

恒温扩增反应液中所述的1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。 

本发明试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。 

本发明提供的甲型流感核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg²⁺浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了甲型流感核酸恒温扩增定性检测的方法。 

本发明所要解决的另一技术问题是提供一种应用本发明试剂盒的甲型流感核酸恒温扩增定性检测方法，包括如下步骤： 

(1)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA； 

(2)将步骤(1)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应90分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板； 

(3)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置(申请号：200610109620.4)中进行检测，15分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有甲型流感核酸。 

本发明的试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测甲型流感的要求。本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。对样本的检测仅仅需要2个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。本发明与现有技术相比，具有以下有益效果： 

1.特异性好，灵敏度高步骤简单，可重复性高； 

2.反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时； 

3.整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会； 

4.可同时满足高通量和低通量的样品检测； 

5.整个反应过程不需要复杂的仪器。 

附图说明

图1实施例3的检测甲型流感的特异性； 

图中从左至右依次为：甲型H3N2、甲型H5N1、甲型H9N7、甲型H1N1流感、季节性流感B、禽流感H5N1、人季节性流感H1N1； 

图2实施例4的检测甲型流感的灵敏度； 

图中从左至右分别表示10⁴拷贝/微升、10³拷贝/微升、10²拷贝/微升、10拷贝/微升、阴性对照。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

实施例1试剂盒的组成与配制 

a)RNA提取试剂：RNA提取试剂盒 

b)反应液：两条外围引物(0.05μmol)，两条探针(0.5μmol)，和两条交叉引物(0.5μmol)，1×Thermol buffer，MgSO₄(6mmol)，dNTPs溶液(0.4mmol)，Bst DNA聚合酶(10U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为16μl。其中： 

外围引物分别为： 

正向外围引物序列为5’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’(SEQ ID NO1)； 

反向外围引物序列为5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’(SEQID NO2)； 

两条探针的序列分别为： 

正向5’端Biotin标记探针5’-biotin-CATGGAATGGCTAAAGACAA-3’(SEQID NO3)； 

反向3’端异硫氰酸荧光素Fi tC标记探针5’-CCTTAGTCAGAGGTGACAAG-Fi tC-3’(SEQIDNO4)； 

扩增交叉引物分别为： 

扩增反向引物5’-CTATCATCCCGTCAGGCCCACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’(SEQID NO5)； 

扩增正向引物5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAGCTATCATCCCGTCAGGCCC-3’(SEQ ID NO6) 

1×Thermol buffer的组成：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mMMgSO₄，0.1％Triton X-100。 

所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。 

阳性对照：含有甲型流感M基因[[NCBI gene bank number：CY058637.1(13-244)]的RNA片段。阳性对照为含有长232bp的甲型流感病毒M基因序列，序列如下： 

TTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTTTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTGGAAAGTGTCTTTGCAGGAAAGAACACAGATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGT(SEQ IDNO7) 

阳性对照的制备步骤：利用一条外围引物和带有T7启动子的另一条外围引物以甲型流感病毒的基因组RNA模板进行RT-PCR扩增获得目的基因；用Promega的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过Promega的RiboMAX^TM Large Scale RNA Production Systems转录出目的的RNA片段。用分光光度计测A₂₈₀定量并稀释至10⁶拷贝/μl，-20℃保存。 

d)阴性对照：无菌双蒸水。 

实施例2 

用本发明试剂盒检测甲型流感核酸的具体方法 

a)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA。 

b)取标本RNA作为模板加入到装有反应液的PCR管中，在60℃进行扩增反应90分钟，其中标本RNA 4μl，反应液16μl；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板。 

c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。当样本中含有甲型流感核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。 

反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要2个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。 

实施例3 

用本发明试剂盒检测甲型流感核酸的专一性 

按照实施例2的方法检测甲型H3N2、甲型H5N1、甲型H9N7、甲型H1N1流感、季节性流感B、禽流感H5N1、人季节性流感H1N1。其结果如表1，见图1 

表1甲型流感的专一性检测结果 

序号	名称	检测结果
			1	甲型H3N2	+
2	甲型H5N1	+
			3	甲型H9N7	+
4	甲型H1N1流感	+
			5	季节性流感B	-
6	禽流感H5N1	+
			7	人季节性流感H1N1	+

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性 

从表1测试结果可见，用本发明试剂盒检测甲型流感核酸具有很强的专一性。 

实施例4 

用本发明试剂盒检测甲型流感核酸的灵敏度 

提取培养的甲型流感核酸的RNA，对其进行定量，分别稀释至浓度为10⁴拷贝/微升、10³拷贝/微升、10²拷贝/微升、10¹拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测甲型流感核酸的灵敏度。结果如图2所示，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速甲型流感核酸的要求。 

Claims (4)

1.一种甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：包括下列组成：

(1)RNA提取液；

(2)恒温扩增反应液：

包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

正向外围引物序列为5’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’SEQ ID NO1；

反向外围引物序列为5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’SEQ ID NO2；

所述的两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5’-biotin-CATGGAATGGCTAAAGACAA-3’SEQ IDNO3；

反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5’-CCTTAGTCAGAGGTGACAAG-FitC-3’SEQ ID NO4；

所述的扩增交叉引物分别为：

扩增反向引物5’-CTATCATCCCGTCAGGCCCACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’SEQ ID NO5；

扩增正向引物5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAGCTATCATCCCGTCAGGCCC-3’SEQ ID NO6；

(3)阳性对照：为含有甲型流感M基因片段的cRNA产物；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的恒温扩增反应液中1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

3.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为含有长232bp的甲型流感病毒M基因序列cRNA片段，序列如下：TTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTTTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTGGAAAGTGTCTTTGCAGGAAAGAACACAGATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGT  SEQ ID NO7。

4.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照通过下列步骤制备：

利用一条外围引物和带有T7启动子的另一条外围引物以甲型H1N1病毒的基因组RNA模板进行RT-PCR扩增获得目的基因；用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物转录出目的的RNA片段，用分光光度计测A₂₈₀定量并稀释至10⁶拷贝/μl，-20℃保存。

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