CN102154219B - 一种猪甲型h1n1流感病毒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物病毒领域，提供了猪源甲型H1N1流感病毒。该病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8个片段，其核苷酸序列依次分别如说明书的核苷酸序列表中序列1-8所示。本发明通过健康猪只鼻咽拭标本分离培养和DIF、RT-PCR鉴定，以及病毒的8个基因全序列测序比对，获得并证实所分离的病毒为猪甲型H1N1流感病毒毒株，命名为A/swine/zhejiang/26/2009(H1N1)，保藏号：CCTCC NO：V201016。本发明的毒株补充了我国猪只甲型流感病毒的极有价值的遗传信息，对该病原引起感染监测体系的完善有重要作用，还可用于制备甲型H1N1病毒感染的快速诊断试剂。
Description
技术领域
本发明属于微生物病毒领域，涉及流感病毒株，具体涉及一种猪甲型H1N1病毒的新毒株及其用途。
背景技术
流感病毒分为甲、乙、丙三型，甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒的表面抗原会经常发生细小变异，这种变异被称为“飘变”(drift)，形象地说，“飘变”就是病毒通过细小的变化伪装自己，从而达到躲避人体免疫系统识别的目的。甲型流感病毒“飘变”的结果是每年引发流感的毒株都有可能不同，人们每年都需要重新接种流感疫苗进行预防。“转变”(shift)主要是以前流行于人和动物的流感病毒基因片段重组的结果，导致一种新的病毒“亚型”出现。因为人体内几乎没有抵御这种新型病毒的抗体，所以“转变”的结果往往会导致流感的全球性大暴发。2009年4月，始发于北美的甲型H1N1流感，是北美猪重组株H1N1和欧亚猪流感H1N1病毒重组而成，它包含了人、禽、猪三个来源的基因片段，并且通过了几次重组。2009年6月，WHO宣称此次流感疫情为全球流感大流行。
甲型流感病毒是引起人、畜、禽感染的重要人畜共患病毒病原，并可在世界范围引起人群发生流感大流行。接种流感疫苗是避免患流感最有效的方法。由于流感病毒经常变异，疫苗使用中的主要问题是毒种的选择，制造疫苗的毒株力求接近流行株。目前人群流感病毒的分离主要依靠细胞培养，也有用鸡胚培养，鉴定型与亚型采用血凝抑制、免疫荧光、RT-PCR等。2009年的1月，我国浙江地区屠宰场宰杀健康猪只鼻咽拭标本分离培养，鉴定为猪甲型H1N1流感病毒。猪历来被认为是流感病毒基因发生重组的重要动物宿主，尽管人和猪H1N1流感病毒都起源于禽，但是H1N1流感病毒在猪只中的抗原性相对稳定，人群缺乏对猪H1N1流感病毒的血清抗体。因此，对猪只H1N1流感病毒遗传进化信息了解保存，对掌握流感病毒宿主间重组、溯源，丰富病毒库，完善对该病原引起感染监测体系有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的猪源甲型H1N1流感病毒，为猪、人甲型H1N1流感病毒全基因片段变异、重组监测提供生物信息，利用该株猪源甲型H1N1流感病毒制备动物免疫血清，为甲型H1N1的HA蛋白变异提供生物信息。
本发明另一个目的是提供上述病毒株的制备方法和疫苗研究。
本发明提供了一种猪源甲型H1N1流感病毒，该病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8个片段，8个片段的核苷酸序列分别如说明书的核苷酸序列表所示。该病毒感染MDCK细胞，可致细胞产生团聚变圆、脱落现象。
本发明采用屠宰场宰杀的健康猪只鼻咽拭标本进行病毒的分离培养，单克隆荧光抗体鉴定培养物为甲型流感病毒。同时提取病毒核酸，采用HA、NA、PB1、PB2、PA、M、NP、NS的8个片段的特异引物进行8个片段全基因RT-PCR扩增，扩增产物经凝胶回收后测序。进入GenBank对8个片段全基因进行搜寻比对，证实8个基因均与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源。HA蛋白327位水解位点处氨基酸序列为“IPSVQSR↓GL”，为非高致病力毒株特征。命名为A/swine/zhejiang/26/2009(H1N1)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉市武昌珞珈山.武汉大学，保藏日期：2009年6月10日，保藏号为CCTCC NO：V201016，分类命名：流感病毒A/swine/zhejiang/26/2009(H1N1)。
具体来说，本发明提供的甲型H1N1流感病毒A/swine/zhejiang/26/2009(H1N1)，具有8个片段全基因序列和下述特征：
1)感染MDCK细胞引起细胞团聚变圆、破碎；
2)荧光标记单克隆抗体观察，显示被感染细胞有绿色荧光；
3)感染细胞培养上清能凝集鸡红细胞
4)HA全基因序列与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源
5)NA全基因序列与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源
6)PB1全基因序列与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源
7)PB2全基因序列与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源
8)PA全基因序列与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源
9)M全基因序列与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源
10)NP全基因序列与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源
11)NS全基因序列与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％同源
本发明提供了上述病毒的制备方法，包括如下步骤：
(1)屠宰场宰杀健康猪只鼻咽拭标本，经抗生素处理置4℃冰箱，4-5h后接种于MDCK 细胞，过夜；
(2)观察细胞病变效应，病变细胞采用甲型流感病毒单克隆荧光抗体检测，荧光显微镜下观察鉴定甲型流感病毒；
(3)提取病毒RNA，RNA反转录为c-DNA；用HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8个片段的引物进行PCR扩增，扩增产物测序。
所述的抗生素可以是青霉素和链霉素。
所述的细胞病变效应是指细胞产生团聚变圆、脱落现象。
本发明的病毒株可以用于制备猪源甲型流感病毒诊断试剂。也可以用于制备猪源甲型流感病毒疫苗。
具体而言，本发明通过下述方法和步骤进行：
1)样品采集：屠宰场宰杀健康猪只鼻咽拭标本，保存在含BSA和双抗的MEM缓冲液，4h内冷链运送至实验室。
2)病原体分离培养：标本经抗生素处理置4℃冰箱，4h后接种于MDCK细胞，在5％CO237℃条件下培养，第二天观察细胞病变效应(CPE)，病变细胞采用甲型、乙型流感病毒单克隆荧光抗体检测，荧光显微镜下观察鉴定甲型、乙型流感病毒。
3)RT-PCR鉴定：用Trizol法提取病毒RNA；以血凝素基因片段设计引物，MMLV(takara)37℃作用1h将RNA反转录为c-DNA；进行PCR，循环条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，51℃30s，72℃ 30s，72℃ 5min。扩增产物凝胶电泳观察产物bp数，鉴定甲型流感病毒亚型。
4)8个片段测序引物RT-PCR及序列分析：用Trizol法提取病毒RNA；用Oligo(dT)和随机六核苷酸引物，MMLV(takara)37℃作用1h将RNA反转录为c-DNA；以血凝素、神经氨酸酶、病毒聚合酶(PB1、PB2、PA)、基质蛋白、核蛋白、非结构蛋白8个基因片段设计引物，进行PCR，循环条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 30s，72℃ 5min。扩增产物凝胶电泳切割回收提纯后在DNA序列自动分析仪上测序。
5)8个片段基因进化分析：用MEGA4软件对测序的8个片段基因进行系统发生分析构建进化树。
结果显示：
1)MDCK细胞为狗肾二倍体上皮细胞，细胞呈上皮样形态；细胞感染流感病毒后可以出现细胞圆缩、脱落等的细胞病变。
采用Dako Cytomation公司制备的IMAGENTM甲、乙型流感(Code no k6106)单克隆荧光抗体，在荧光显微镜下观察鉴定为甲型流感病毒。
2)分离株病毒经Oligo(dT)和随机六核苷酸引物RT为cDNA，经HA、NA、PB1、PB2、PA、M、NP、NS的8个片段的特异测序引物PCR成功扩增出1717bp的HA，1390bp的NA，2191bp的PB1，2242bp的PB2，2154bp的PA，994bp的M，1485bp的NP和885bp的NS。
3)本发明方法中采用的细胞系为本领域公知的MDCK细胞。
4)本发明A/swine/zhejiang/26/2009(H1N1)毒株是2009年1月从浙江屠宰场宰杀的健康猪只鼻咽拭标本分离株，与A/swine/Hong Kong/NS1179/2007(H1N1)99％基因同源。本发明猪源甲型H1N1流感的基因序列为中国猪源流感病毒库提供了重要的生物信息；为流感病毒变异特别是宿主间重组溯源提供可参考生物信息；补充了中国猪源甲型H1N1基因数据和病毒毒种株；并可用于疫苗的研究。
本发明属微生物病毒领域，具体涉及一种猪源甲型H1N1流感病毒毒株及其用途。本发明通过屠宰场宰杀的健康猪只鼻咽拭标本分离培养和DIF、RT-PCR鉴定，以及病毒的8个基因全序列测序比对，证实所分离的病毒为猪甲型H1N1流感病毒毒株，命名为A/swine/zhejiang/26/2009(H1N1)保藏编号：CCTCC NO：V201016。发明毒株得到甲型H1N1的8个基因全序列，补充了我国流感病毒的极有价值的遗传信息和具有8个基因全序列测序的流感病毒毒种保存，对该病原引起宿主间流感监测体系的完善有重要作用。本发明A/swine/zhejiang/26/2009(H1N1)毒株还可用于制备猪源H1N1病毒感染的快速诊断试剂和猪只疫苗研究。
附图说明
图1是培养液替换为不含病毒是病毒接种液后36小时的正常MDCK对照细胞。
图2是接种该流感病毒100 TCID50病毒后36小时的MDCK细胞。
图3是荧光显微镜观察甲、乙型荧光标记单克隆抗体染色的正常对照细胞。
图4为荧光显微镜观察甲、乙型荧光标记单克隆抗体染色的感染细胞。
具体实施方式
采集我国浙江地区屠宰场宰杀健康猪只600例鼻咽拭标本进行培养鉴定。经细胞培养分离到能产生明显细胞病变并能稳定传代增殖的病毒7株，鉴定为猪甲型H1N1流感病毒。
1)病原体分离培养：咽拭标本处理培养参照WHO推荐的方法，标本青霉素、链霉素处理(终浓度均为100ug/ml)大于4h，1500g 4℃离心10min，取上清接种于MDCK细胞，在5％CO2 37℃条件下培养，24h后在倒置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，病变细胞经DIF 染色，荧光显微镜观察鉴定为甲型流感病毒。
2)甲型H1N1流感病毒全基因测序：
分别采用8个基因片段的测序引物，对8个基因片段进行RT-PCR扩增。细胞培养液用Invitrogen公司TRIzol
LS Reagent试剂抽提病毒核酸，AMV逆转录酶(Promega)逆转录，逆转录条件为42℃1h，95℃5min。保真PCR(Ex Taq，TaKaRa)，PCR条件为：94℃，45s，50℃，45s，72℃，60s，扩增30个循环，72℃延伸7min。PCR扩增产物送上海市基康生物技术有限公司测序。
结果显示，单克隆直接免疫荧光观察，为甲型流感病毒；对本发明病毒的HA基因全序列测序并采用MEGA4.0分析软件进行同源性分析，证实所分离株A/swine/HongKong/NS1179/2007(H1N1)氨基酸序列有99％同源猪甲型H1N1流感病毒。而感染本发明病毒的MDCK细胞出现细团缩、脱落的细胞病变。
Claims (2)
1.一种猪源甲型H1N1流感病毒，其特征在于，该病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8个片段，8个片段的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-8所示，该病毒的保藏号为CCTCC NO：V201016。
2.如权利要求1所述的病毒，其特征在于，该病毒感染MDCK细胞，细胞产生团聚变圆、脱落现象。
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| 杜宁，王大燕，舒跃龙.《2009新甲型H1N1流感病毒病原学概述》.《病毒学报》.2009,第25卷(第6期),第479页-第484页. * |
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