CN104894296B - 检测猪流感病毒h3n2的引物、分子信标探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测猪流感病毒H3N2的引物、分子信标探针及试剂盒，属于动物病原微生物检测技术领域。本发明的引物和分子信标探针特异性高，稳定性好，检测准确率高，分子信标诊断试剂盒具有检测快速、灵敏性高、稳定性好、易于定量、假阳性低等特点，有利于规模化和自动化检测分析。采用分子信标实时荧光定量RT‑PCR方法，克服了病毒分离操作过程繁琐且不易鉴定和传统RT‑PCR检测速度慢、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。

Description

检测猪流感病毒H3N2的引物、分子信标探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及动物病原微生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪流感病毒H3N2的引物、分子信标探针及试剂盒。

背景技术

猪流感(swine influenza，SI)是甲型(A型)流感病毒引起的猪或人的一种急性、人畜共患呼吸道传染性疾病。目前已经发现流感病毒的HA有16个亚型，NA有9个亚型，已从猪体内分离到H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1、H5N2和H9N2等11种不同亚型的SIV。近几年流行病学的研究结果表明：我国猪群中存在H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等病毒的感染,其中以H3N2和H1N1亚型流行和危害比较严重。流行于世界范围内猪群中的H3N2亚型SI都是由类人型H3N2亚型毒株引起的,与此同时,人类流感的暴发与SI的流行存在惊人的平行性和相关性,种种迹象表明,H3N2亚型SIV与同时期引起人流感大流行的同亚型流感病毒之间遗传关系十分紧密。因此,建立H3N2亚型SIV的快速检测方法不仅在兽医学领域具有重要意义,而且对人流感的研究也有借鉴作用。

要实现对H3N2流感突变株快速检测，最快捷可行的是对病毒的核酸进行检测，目前使用最多的是荧光定量RT-PCR方法。本发明结合分子信标技术建立猪H3N2流感的荧光定量RT-PCR方法。不同亚型的猪流感病毒，致病性差异很大，使用传统方法或不能快速、准确的检测出疫病，或无法对病毒进行分型。本发明结合分子信标方法对流感病毒进行分型，采用该技术，即使出现新的流感病毒，通过改变分子信标探针，对新的流感毒株进行识别，这对于流感病毒检测功能是非常强大的。

分子信标是设计最为巧妙的探针，由一段包含了茎环结构的单链寡核苷酸组成，形成一个发夹型结构。在其环状部分，一般是一段长度为15～30碱基的序列，能与目标分子特异结合，茎区是长度为5～8碱基的互补序列，茎区的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。发夹结构保证了分子信标的高选择性，只有完全互补的单链DNA或RNA分子才能引起分子信标的发夹结构完全打开，从而发出荧光，因此分子信标具备高度的特异性，在检测快速变异的病毒时非常有优势，在病毒分型时也是功能强大的工具。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种检测猪流感H3N2病毒的HA和NA基因的引物；另外提供一种检测猪流感H3N2病毒的HA和NA基因的分子信标探针；以及提供一种检测猪流感H3N2病毒的试剂盒。

本发明通过以下技术方案实现上述目的:

一种检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，包括以下组分：

1)检测H3NA的HA基因的引物和分子信标探针，引物核苷酸序列如SEQ:NO:1-2所示；分子信标探针核苷酸序列如SEQ:NO:5所示，该序列5’端标记有发光的报告荧光基团FAM，3’端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle；

2)检测H3NA的NA基因的引物和分子信标探针；引物核苷酸序列如SEQ:NO:3-4所示；分子信标探针核苷酸序列如SEQ:NO:6所示，该序列5’端标记有发光的报告荧光基团HEX，3’端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle。

上述试剂盒还包括RT-PCR反应缓冲液、RT-PCR酶。

SEQ：NO:1 GATCCTATGGATTTCCTTTGCC

SEQ：NO:2 CAAATGTTGCACCTAATGTTGC

SEQ：NO:3 GTTATTCTGGTATTTTCTCCGTTG

SEQ：NO:4 TCCTCTTTCCTTCCCCTTATC

SEQ:NO:5 5’-Fam+CAGCG CTTTGTGTTGTTTTGCTGGGTTTCATC CGCTG+Dabcyle-3’

SEQNO:65’-Hex+CAGCG AGCTGCATCAATCGGTGCTTTTATGT CGC TG+Dabcyle-3’

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

采用分子信标实时荧光定量RT-PCR方法，克服了病毒分离操作过程繁琐且不易鉴定和传统PCR检测速度慢、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可以对样品中的病毒含量进行精确的定量检测。本发明的引物和分子信标探针特异性高，稳定性好，检测准确率高，分子信标诊断试剂盒具有检测快速、灵敏性高、稳定性好、易于定量、假阳性低等特点，有利于规模化和自动化检测分析。

分子信标探针与传统的TaqMan-TAMRA(TaqMan-四甲基罗丹明)探针比较具有以下优势：

1.提高灵敏度：发夹结构保证了分子信标的高选择性，只有完全互补的单链DNA或RNA分子才能引起分子信标的发夹结构完全打开，从而发出荧光,因此它所具有的高选择性、高灵敏度的优越性。

2.提高信噪比：由于采用的非荧光染料作为淬灭分子，因此荧光本底比较低，有效的降低了背景干扰。

3.简化实验：分子信标探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高。

附图说明

图1：分子信标荧光定量PCR标准曲线；

图2：猪流感H3N2病毒分子信标荧光定量PCR方法敏感性实验；

图3：猪流感H3N2病毒H3(A)、N2(B)基因分子信标荧光定量PCR方法特异性实验检测结果曲线图。

具体实施方式

为便于理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例来进一步阐述本发明。以下实施例中，“n×”(n表示数字)意为稀释n倍。

实施例中使用的生物材料及试剂说明：

H3N2毒株由哈尔滨兽医研究所提供；RNA抽提试剂盒购自Promega公司；pMD18-T、反转录用M-MLV、逆转录试剂盒、感受态细胞JM109试剂盒、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

实施例1

1)设计引物和分子信标探针

根据Gen Bank数据库中下载的H3N2亚型SIV的HA、NA基因核苷酸序列，利用DNAStar软件进行同源性分析比较，选出高度保守且特异的核苷酸区域共10段，登录http://www.ncbi.nlm.nih.gov/进行BLAST确定其保守性。运用Oligo 6.0软件对这些保守序列做碱基组成成分及稳定性等方面分析，并从引物和探针设计等原则综合考虑，最终筛选出2段最合适的保守序列，该段保守序列位于SIV基因组的HA基因和NA基因的5’非翻译区。设计的2对特异性引物H3F、H3R、N2F、N2R和2个特异分子信标探针H3P、N2P，引物和探针均由上海闪晶生物技术公司合成，探针5′端标记的荧光报告基团是FAM和HEX，3′端标记的荧光淬灭基团为4(二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸(DABCYL)，HA基因目的扩增片段为106bp，NA基因的扩增片段为85bp。

2)定量标准质粒的构建和制备

以提取H3N2猪流感的RNA为模板，按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书步骤进行反转录，合成cDNA，以cDNA为模板，用H3F/H3R和N2F/N2R引物分别进行PCR扩增。

扩增体系如下：

cDNA 10μL

上游引物H3F/N2F(10μM) 2μL

下游引物H3R/N2R(10μM) 2μL

Mix：25μL

ddH₂O up to 50μL

配好体系混匀后，低速离心，将液体全部置于管底，用PCR自动扩增仪进行扩增，扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性15sec；60℃退火15sec；72℃延伸1min；30个循环后再延伸10min。扩增结束后在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，将106bp和85bp处的目的条带切割下来，通过胶回收试剂盒(Omega公司)进行纯化，纯化的目的片段与pMD18-T载体在16℃条件下连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大培养并做PCR鉴定，鉴定为阳性的单克隆菌落送大连宝生物技术有限公司进行测序验证，测序验证正确的单克隆菌落扩大培养。

上述鉴定阳性且测序验证正确的单克隆菌液用质粒抽提试剂盒(TAKARA公司)进行质粒抽提和纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度，并根据以下公式换算为质粒拷贝数。质粒浓度(μg/μL)＝OD₂₆₀×稀释倍数×50/1000；质粒拷贝数＝质粒浓度×6.02×10²³mol/1000M，M代表质粒分子量。该质粒便为以下步骤制作标准曲线的定量标准质粒。

3)病毒RNA的提取：

取H3N2猪流感病毒尿囊液，按Omega公司RNA小量提取试剂盒使用说明书进行，步骤如下：

①取560μL Buffer AVL加入1.5mL离心管中；

②吸取140μL已知阳性病毒样品，加入上述1.5mL离心管中，漩涡振荡混合均匀，静置10min；

③加560μL无水乙醇，漩涡振荡混合均匀；

④吸取上一步中的溶液630μL小心加入column中，6000×g离心1min，弃滤液；

⑤重复步骤4；

⑥加入500μL Buffer AW1，6000×g离心1min,弃滤液；

⑦加入500μL Buffer AW2，6000×g离心1min,弃滤液；；

⑧将column置回到2mL离心管中，12000×g离心1min；

⑨将column置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在column膜中央加60μLBuffer AVE，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱RNA。

4)病毒RNA的逆转录：

以步骤3)提取的RNA为模板，按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，反转录体系如下：5×AMV buffer 4μL，dNTP(10mM)2μL，RandomPrimer(6-9mer)50pmol，AMV反转录酶10U，RNA样品1μg，RNaseInhibitor 20U，加DEPC H₂O至20μL。将各试剂混合均匀，置PCR仪中按以下程序进行：

30℃10min，42℃温浴30min，90℃5min反应结束后-20℃保存，用于荧光定量PCR检测。

5)分子信标荧光定量PCR反应条件的优化：

以步骤4)所得的cDNA为模板，通过对反应体系中不同的引物浓度、分子信标探针浓度等实验结果比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号曲线、扩增效率接近1的反应体系。经优化后的25μL最佳反应体系为：2x qPCR buffer 12.5μL，SEQNO:1-2或者3-4上下游引物(10pmol/μL)各为0.5μL，SEQNO:5或6探针(10pmol/μL)1μL，cDNA 1μL，DEPC水补足25μL。将该体系瞬时离心后，按下列反应参数进行：95℃3min；95℃20S、60℃15S、72℃15s，扩增45个循环。扩增过程中收集荧光信号。

猪流感H3N2病毒分子信标荧光定量PCR的检测结果判定：进行荧光定量PCR时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为定量标准质粒，阴性对照为灭菌水，检测结果若出现典型的S型扩增曲线，则判定为阳性结果，表明检测样品中含有猪流感H3N2病毒；若检测样品中不含有猪流感H3N2病毒则无扩增信号。

6)分子信标荧光定量PCR标准曲线的建立

用无菌双蒸水将步骤2)获得的定量标准质粒稀释至2.475×10⁹，2.475×10⁸，2.475×10⁷，2.475×10⁶，2.475×10⁵copies/μL，用步骤5)最优化的体系进行反应，反应条件按上述优化好的条件进行。检测结束后荧光定量PCR会自动绘制标准曲线(图1)。本检测方法在2.475×10⁹～2.475×10⁵copies/reaction范围内具有良好的线性关系。

7)检测灵敏度分析

步骤2)获得的定量标准质粒用无菌双蒸水稀释至2.475×10⁹，2.475×10⁸，2.475×10⁷，2.475×10⁶，2.475×10⁵，2.475×10⁴，2.475×10³，2.475×10²，2.475×10¹copies/μL，用步骤5)最优化的体系进行反应，反应条件按上述优化好的条件进行检测其灵敏度。通过分析检测结果可以看出，检测灵敏度可达到10²拷贝/μL(图2)。

8)特异性分析

设定可能存在潜在交叉反应的病毒cDNA为模板(H1、H5、H9亚型SIV、PCV2、CSFV、PEDV、TGEV、PRRSV)，设定无菌蒸馏水作为阴性对照，H3N2 cDNA作为阳性对照，按上述最优反应体系和条件进行荧光定量PCR反应，结果显示该检测体系特异性良好，非目标病毒核酸均没有扩增曲线，只有猪流感H3N2病毒才有良好的扩增曲线(图3)。

9)稳定性分析

选取3个已知阳性的临床样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复实验：将3个已知阳性样品在同一批中进行检测，每个样品设置两个重复，分析同一样品在批内检测的稳定性；批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每次单独检测一个样品，样品设置两个重复，比较同一样品在不同批次中检测的稳定性。从下表中的检测结果分析，可以看出批内变异系数在0.63％-1.14％之间，批间变异系数在1.09％-1.46％之间，所以可以判断出本检测方法稳定性良好。

表1 SIV H3基因重复性试验结果

Table 2 The reproducibility test result of real-time for H3 genes ofSIV

表2 SIV N2基因重复性试验结果

Table 3 The reproducibility test result of real-time for N2 genes ofSIV

10)临床样品检测

对实验室所保存的101份猪流感疑似样品，用建立的荧光定量PCR方法和试剂盒方法(圣湘生物)进行检测，两者符合率为100％。

Claims (2)

1.一种检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

1)检测H3NA的HA基因的引物和分子信标探针，引物核苷酸序列如SEQ:NO:1-2所示；分子信标探针核苷酸序列如SEQ:NO:5所示，该序列5’端标记有发光的报告荧光基团FAM，3’端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle；

2)检测H3NA的NA基因的引物和分子信标探针；引物核苷酸序列如SEQ:NO:3-4所示；分子信标探针核苷酸序列如SEQ:NO:6所示，该序列5’端标记有发光的报告荧光基团HEX，3’端标记有不发光的淬灭基团Dabcyle。

2.根据权利要求1所述的检测猪流感病毒H3N2的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括RT-PCR反应缓冲液、RT-PCR酶。