CN111270016A

CN111270016A - 一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用

Info

Publication number: CN111270016A
Application number: CN202010243513.0A
Authority: CN
Inventors: 朱洪伟; 张兴晓; 张建龙; 姜琳琳; 黄清荣; 于馨; 陈国忠
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2020-06-12

Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒扩增引物及其应用。该引物包括至少一个能够识别新型冠状病毒N基因上的特异区域的寡核苷酸引物，新型冠状病毒N基因上的特异区域的序列范围包括新型冠状病毒参考毒株基因组28778‑28971的区域序列。采用该引物可以快速地从血液、唾液、痰液、空气等样本提取的RNA中的检测新型冠状病毒核酸，具有简便、快速，不需要大型仪器和专业人员培训的优点，可作为新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的初筛、环境检测方法，亦可作为临床诊断的重要参考。

Description

一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用。

背景技术

目前，新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19) 在没有确切疗效的治疗药物和疫苗预防前提下，精准诊断、隔离病患仍是防止疫情传播最为有效的防控措施。因此，快速、特异、灵敏的病原检测对于新型冠状病毒肺炎的科学防控至关重要。

COVID-19的临床诊断主要基于流行病学史，临床表现和一些辅助检查，例如核酸检测，CT扫描，免疫识别技术(IgM/IgG的即时检测(POCT)，酶联免疫吸附测定(ELISA))和血液培养。在核酸检测技术领域， SARS-CoV-2的两种常用核酸检测技术是实时定量聚合酶链反应 (RT-qPCR)和高通量测序。SARS-CoV-2的权威鉴定方法是病毒血培养和全基因组高通量测序。然而，高通量测序技术由于其设备依赖性和成本高，在临床诊断中的应用受到限制。因此，RT-qPCR是检测呼吸道分泌物和血液中致病性病毒最常用、最有效、最直接的方法。在COVID-19爆发之初，许多公司很快推出了用于临床诊断的RT-qPCR测试试剂盒。已有报道采用两种1步RT-qPCR分析(基于TaqMan的荧光信号)分别检测病毒基因组的两个不同区域。通过该方法，阴性对照样品均被确认为阴性样品，而来自呼吸道标本的两名SARS-CoV-2感染患者样品被确认为阳性样品。另一项研究表明，使用RT-qPCR(基于非探针SYBR的荧光信号)在患者自行收集的唾液中SARS-CoV-2的阳性率为91.7％(11/12)，这表明唾液是一种有前景的非侵入性标本，可用于SARS-CoV-2感染患者的诊断，监测和感染控制。RT-qPCR检测对SARS-CoV和MERS-CoV感染也具有较高的敏感性和特异性。

虽然RT-qPCR方法具有显而易见的优势，然而，该方法也存在着灵敏度低、仪器和人员依赖性强等缺点。研究表明，目前使用的RT-qPCR检测 SARS-CoV的灵敏度只能达到50％-79％，这取决于使用的方案、样本类型和采集的临床样本数量。因此，提高对SARS-CoV-2感染的RT-qPCR的检测率至关重要。此外，RT-qPCR还存在其他一些缺点，包括由于患者样品的保存和操作，核酸检测操作繁琐以及结果等待时间长而带来的某些生物安全隐患，此外，该方法需要精密昂贵仪器和高素质操作人员，难以在基层检测机构推广和普及。因此，亟需开发特异性强、敏感性高兼具高效、快捷、可视化的检测产品(技术)，用于医院、社区和居家隔离、环境检测的有效补充。

近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比RT-qPCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP) 已在一定范围内得到了应用。LAMP技术依赖于识别保守序列DNA的6个特异性片段的4条引物(2条外引物和2条内引物)和一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)。反应体系一般包括4条引物、Bst DNA聚合酶缓冲液、具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜碱、Mg₂SO₄等。该方法具有灵敏度高(比传统的PCR方法高2-5个数量级)、反应时间短(30-60min即可完成反应)、临床使用不需要特殊的仪器、操作简单(只需将反应液、酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中60-65℃左右保温30-60min，肉眼观察结果)等优点。其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中。

目前，并未有用于新型冠状病毒核酸环介导等温扩增引物及其检测技术的报道。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用。采用本发明的引物可以快速地从血液、唾液、痰液、空气等样本提取的RNA中的检测新型冠状病毒核酸，具有简便、快速、特异、敏感等优点，不需要大型仪器和专业人员培训的优点，可作为新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的初筛、环境检测方法，亦可作为临床诊断的重要参考。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种用于新型冠状病毒扩增的引物，包括至少一个能够识别新型冠状病毒N基因上的特异区域的寡核苷酸引物，新型冠状病毒N基因上的特异区域的序列范围包括新型冠状病毒参考毒株基因组 28778-28971的区域序列。

采取上述方案的有益效果为：本发明提供的引物是可以用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的寡核苷酸引物，采用该引物进行环介导等温扩增检测，具有快速、简便、特异、敏感等优点。

进一步，包括引物22LoopF和/或引物22LoopB，以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，引物22LoopF的序列包括与参考基因组第28834-28853位区域序列反向互补的序列；引物22LoopB 的序列包括与参考基因组第28912-28930位区域一致的序列。

具体的，引物22LoopF的序列可以为与参考基因组第28834-28853 位区域序列反向互补的序列；引物22LoopB的序列可以为与参考基因组第 28912-28930位区域一致的序列。

进一步，引物22LoopF的核苷酸序列包括SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列包括SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。

具体的，引物22LoopF的核苷酸序列可以为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列可以为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。

采取上述方案的有益效果为：2LoopF和22LoopB两条引物的加入使得等温扩增的速度明显加快，并大大提高检测敏感性。

进一步，包括引物22F3、引物22B3、引物22FIP、引物22BIP中的一个或任几个所述引物22FIP包括22F1c和22F2寡核苷酸片段，引物22BIP 包括22B1c和22B2寡核苷酸片段以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，所述引物22F3的序列包括与参考基因组第28778-28797位区域序列一致的序列；所述引物22B3的序列包括与参考基因组第28952-28971位区域序列反向互补的序列；22F2寡核苷酸片段包括与参考基因组第28809-28827位区域序列一致的序列；22F1c寡核苷酸片段包括与参考基因组第28866-28885位区域序列反向互补的序列； 22B1c寡核苷酸片段包括与参考基因组第28889-28910位区域一致的序列；22B2寡核苷酸片段包括与参考基因组第28932-28951位区域序列反向互补的序列。

进一步，引物22F3的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物22B3的核苷酸序列包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；引物22FIP 的核苷酸序列包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；引物22BIP的核苷酸序列包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。

进一步，包括引物22F3、引物22B3、引物22FIP、引物22BIP、引物 22LoopF、引物22LoopB中的一个或任几个；所述引物22FIP包括22F1c 和22F2寡核苷酸片段，引物22BIP包括22B1c和22B2寡核苷酸片段；

以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，所述引物22F3的序列与参考基因组第28778-28797位区域序列一致；所述引物 22B3的序列与参考基因组第28952-28971位区域序列反向互补；22F2寡核苷酸片段与参考基因组第28809-28827位区域序列一致；22F1c寡核苷酸片段与参考基因组第28866-28885位区域序列反向互补；22B1c寡核苷酸片段与参考基因组第28889-28910位区域序列一致；22B2寡核苷酸片段与参考基因组第28932-28951位区域序列反向互补；引物22LoopF的序列与参考基因组第28834-28853位区域序列反向互补；引物22LoopB 的序列与参考基因组第28912-28930位区域序列一致。

采取上述方案的有益效果为：经过对SARS-CoV-2与其他冠状病毒基因组多序列比对分析基础上，结合N基因保守性强的优点，设计了上述引物序列，经试验研究发现，本发明选取的这些引物能够特异性地识别 SARS-CoV-2核蛋白基因，并通过具有链置换能力的DNA聚合酶进行循环扩增，放大扩增信号，使检测方法具有特异、快速、敏感的优点。

进一步，引物22F3的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物22B3的核苷酸序列包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；引物22FIP 的核苷酸序列包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；引物22BIP的核苷酸序列包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；引物22LoopF的核苷酸序列包括SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列包括SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。

采取上述方案的有益效果为：在扩增的起始阶段，上游内部引物22FIP 的22F2序列首先与模板相应位置结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物22F3与模板相应位置结合并延伸，置换出完整的22FIP连接的互补单链。22FIP上的22F1c与此单链上的互补位置碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物22BIP与22B3先后启动类似于22FIP和22F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。在扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，22FIP与茎环的22F2c 区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换。形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，22BIP引物上的22B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物22LoopF和 22LoopB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，循环扩增。扩增的最后产物是茎环结构倍数、不同长度DNA的混合物。

其中，SEQ ID NO：3由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8组成，而 SEQ ID NO：4由SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10组成。SEQ ID NO： 7与参考基因组第28809-28827位区域序列一致；SEQ ID NO：8与参考基因组第28866-28885位区域序列反向互补；SEQ ID NO：9与参考基因组第28889-28910位区域序列一致；SEQ ID NO：10与参考基因组第 28932-28951位区域序列反向互补。

采取上述方案的有益效果为：本发明选用上述序列的引物具有扩增特异性强的优点，可在Bst DNA聚合酶作用下形成2个扩增环，可实现快速扩增模板特异性序列；快速、敏感，22LoopF和22LoopB两条引物的加入使得等温扩增的速度明显加快，并大大提高检测敏感性。

本发明还提供一种包括或用于合成上述引物的核苷酸片段、载体和/或菌株。

本发明还提供一种用于检测新型冠状病毒的核苷酸片段、载体和/或菌株，所述核苷酸片段包括新型冠状病毒参考毒株核衣壳编码基因N序列，核苷酸片段的序列包括SEQID NO：11所示核苷酸序列；所述载体包括该核苷酸片段；所述菌株包括该核苷酸片段。

本发明还提供一种基于新型冠状病毒N基因的RNA阳性对照物，所述 RNA阳性对照物包括上述核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段。具体的，核糖核酸片段的序列可以包括SEQ ID NO：12所示的序列。

上述的核苷酸片段、载体、菌株和/或RNA阳性对照物可以在制备检测冠状病毒的试剂盒中进行应用。优选的，在可以在制备检测新型冠状病毒的试剂盒中进行应用。

例如，在本发明实施例中，本发明提供了一种用于检测冠状病毒的 SARS-CoV-2N基因片段，该基因片段包括新型冠状病毒参考毒株核衣壳编码基因N序列，(GenBank登录号：NC_045512.2，基因组中第28274位至第29533位序列)。并在基因5′-末端和3′-末端分别引入限制性酶切位点。将该基因片段通过质粒构建的方式可以获得重组质粒 pGEM-SARSCoVN。将重组质粒通过转化等方式可以获得含有该质粒的菌株。将重组质粒经线性化、纯化、转录等操作后，可以作为用于检测冠状病毒的试剂盒的阳性对照或敏感性试验的RNA模板。

采取上述方案的有益效果为：本发明所述的重组SARS-CoV-2 N基因质粒载体pGEM-SARSCoVN以及体外转录的RNA分子具有无感染性、易于获得、便于定量等优点，可用于基于核酸检测方法的科学研究与临床应用的阳性对照标准品。

本发明还提供上述引物在制备检测冠状病毒的试剂盒中的应用。优选地，用于制备检测新型冠状病毒的试剂盒。

采取上述方案的有益效果为：采用本发明的引物可以快速地从血液、唾液、痰液、空气等样本提取的RNA中的检测新型冠状病毒核酸，具有简便、快速，不需要大型仪器和专业人员培训的优点，可作为新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的初筛、环境检测方法，亦可作为临床诊断的重要参考。

本发明提供一种检测冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述引物。优选地，本发明提供一种检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述引物。

采取上述方案的有益效果为：该试剂盒在检测冠状病毒时具有特异、快速、敏感等优点。

进一步，检测冠状病毒的试剂盒还包括：扩增反应缓冲液、dNTPs、Bst DNA聚合酶、反转录酶以及对照标准品中的一种或几种。所述试剂盒还可以包括待检RNA样本。

采取上述方案的有益效果为：

采用该试剂盒进行检测，可以快速地从血液、唾液、痰液、空气等样本提取的RNA中的检测新型冠状病毒核酸，具有简便、快速，不需要大型仪器和专业人员培训的优点，可作为新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的初筛、环境检测方法，亦可作为临床诊断的重要参考。

所述对照标准品包括阳性对照品和/或阴性对照标准品。

阳性对照标准品可以通过以下方法制备：合成用于检测冠状病毒的 SARS-CoV-2N基因片段，该基因片段包括新型冠状病毒参考毒株核衣壳编码基因N序列，(GenBank登录号：NC_045512.2，基因组中第28274位至第29533位序列)，具体为SEQ ID NO：11所示核苷酸序列，在基因5′-末端和3′-末端分别引入限制性酶切位点。将该基因片段通过质粒构建的方式可以获得重组质粒pGEM-SARSCoVN。将重组质粒经线性化、纯化、转录得到RNA，即为阳性对照标准品。

本发明还提供一种制备检测冠状病毒试剂盒的方法，包括以下步骤：合成上述引物。

本发明还提供一种检测冠状病毒的方法，包括以下步骤：

(1)制备阳性对照标准品；

(2)制备阴性对照标准品；

(3)制备引物混合液；

(4)建立环介导等温扩增反应体系，进行扩增；

(5)检测结果判断。

采取上述方案的有益效果为：具有快速、简便、特异、敏感等优点。

优选地，在步骤(4)进行扩增的时候，可以采用封闭的扩增、显色一体化的8联反应管，反应结束后只需将微量反应管倒置，反应液浸泡管盖上的染料，静置30s，再将反应液甩至管底。肉眼观察检测结果。采用上述方案的有益效果是：冻干的核酸检测染料置于反应管盖内侧，反应结束后不需要开盖加显色染料，确保了整个反应和结果判定全过程，微量反应管盖始终闭合，不需打开，避免因开盖带来的气溶胶污染。

附图说明

图1为特异性引物在SARS-CoV-2参考基因组中的位置，由左至右的箭头表示该引物与参考基因组序列一致；由右至左方向的箭头表示该引物与参考基因组序列反向互补。

图2为验证新型冠状病毒RT-LAMP检测结果敏感性的实验结果，图2 中，微量反应管上方数字示RT-LAMP反应起始模板的拷贝数。

图3为实施例3的检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明涉及一套用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的寡核苷酸引物以及应用这些引物建立的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。该扩增反应体系包括扩增反应缓冲液、特异性引物、dNTPs、Bst DNA 聚合酶、反转录酶以及待检RNA样本。建立的反应体系置于60℃水浴中反应30分钟，通过核酸检测或显色试剂判定结果。该方法可快速地从血液、唾液、痰液、空气等样本提取的RNA中的检测新型冠状病毒核酸，具有简便、快速，不需要大型仪器和专业人员培训的优点，可作为新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例的初筛、环境检测方法，亦可作为临床诊断的重要参考。

下面通过具体的实施例进行介绍。

实施例1制备用于检测新型冠状病毒的试剂盒

步骤1：制备阳性对照标准品

委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成新型冠状病毒参考毒株核衣壳编码基因N序列，(GenBank登录号：NC_045512.2，基因组中第28274位至第29533位序列)。基因5′-末端和3′-末端分别引入KpnI和BamHI限制性酶切位点，将其命名为SARS-CoV-2N基因。

合成的SARS-CoV-2N基因和

-3Z(Promega)质粒载体分别经 Kpn I和BamHI双酶切获得具有黏性末端的线性载体和外源基因。具体酶切反应体系如下：

37℃酶切反应30min，反应结束后的线性质粒载体和外源基因用Cycle-Pure PCR产物回收试剂盒(Omega Bio-tek)回收后，建立连接反应，具体反应体系为：

室温连接不少于15min，得到连接产物。随后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α。具体方法如下：取大肠杆菌感受态细胞DH5α，在溶融状态下加入连接产物，冰上放置30min。随后在42℃水浴热激90s，再冰浴 1-2min。加入800μL SOC培养基，37℃温和振荡培养60min。取200μL 涂布于LB/Ampicillin筛选平板培养基上，37℃培养箱中培养过夜。将中等大小菌落接种于LB/Ampicillin液体培养基，37℃震荡培养12h。应用质粒提取试剂盒(Omega Bio-tek)提取质粒。kpn I/BamH I双酶切法鉴定阳性质粒，获得阳性重组质粒，命名为pGEM-SARSCoVN。阳性重组质粒经 XbaI线性化、纯化后做为模板，应用T7 RiboMAX^TM ExpressLarge Scale RNA Production System(Promega)试剂盒，建立如下体外转录体系：

混匀后37℃水浴中反应30min，得到反应混合液。向反应混合液中加入1U的RQ1RNase-Free DNase(Promega)，37℃作用15min，消化模板DNA。随后反应混合物用RNeasyMini Kit(Qiagen)试剂盒纯化 RNA转录物，50μL RNase-Free H₂O溶解后备用。

按以下公式：copies/μl＝6.02×10²³×10^-9×RNA浓度/(片段长度×340)将RNA转录物稀释成不同浓度后作为阳性对照标准品或敏感性试验的RNA模板。将阳性对照标准品置于-80℃保存。

步骤2：制备阴性对照标准品

以无菌无酶水(DNase/RNase-free ddH₂O)作为阴性对照，具体制备方法包括：用超纯去离子水配置0.1％(v/v)的焦碳酸二乙酯(DEPC)，混匀过夜，经121℃，20min高压灭菌后分装。经检测无核酸酶和蛋白酶活性。

步骤3：制备引物混合液

引物组包括引物22F3、引物22B3、引物22FIP、引物22BIP、引物 22LoopF、引物22LoopB这6条引物。

引物22F3的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物22B3 的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；引物22FIP的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；引物22BIP的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；引物22LoopF的核苷酸序列为SEQID NO：5 所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。引物22FIP由22F1c和22F2两个寡核苷酸片段组成，引物22BIP 由22B1c和22B2两个寡核苷酸片段组成。为方便理解，特异性引物在 SARS-CoV-2参考基因组中的位置参照图如图1所示。其中22F3序列与新型冠状病毒参考毒株基因组第28778-28797位区域序列一致；引物22B3与参考基因组第28952-28971位区域序列反向互补；22F2 与参考基因组第28809-28827位区域序列一致；22F1c与参考基因组第 28866-28885位区域序列反向互补；22B1c与参考基因组第28889-28910 位区域序列一致；22B2与参考基因组第28932-28951位区域序列反向互补；22LoopF与参考基因组第28834-28853位区域序列反向互补； 22LoopB与参考基因组第28912-28930位区域序列一致。

委托北京六合华大基因科技有限公司合成上述6条引物。

将6条合成的引物冻干粉先分别用无菌无酶水稀释成100μM。之后制备引物混合液，在100μL的引物混合液中分别加入2μL22F3、2μL 22B3、16μL 22FIP、16μL 22BIP、4μL22LoopF、4μL 22LoopB 和56μL无菌无酶水。

步骤4：建立环介导等温扩增反应体系

在8联橙绿变色反应管(海基生物)中建立25μL等温扩增反应体系，具体如下：

反应体系配制好后，轻混匀微量反应管内液体，小心盖上含OG染料的管盖。严禁剧烈混合或倒置反应管。小心置于60-65℃反应20-45min。

步骤5：检测结果判断

将微量反应管倒置，反应液浸泡管盖上的染料，静置30s。再将反应液甩至管底，若样品反应管呈绿色为阳性，若管为深橙色为阴性(即未发生扩增)。如置于紫外灯下观察，阳性样品呈亮绿色，阴性样品管为依然为深橙色。

实施例2

验证采用本发明实施例1所述引物进行新型冠状病毒环介导等温扩增 (RT-LAMP)的检测结果敏感性。包括以下步骤：

稀释RNA模板：取体外转录制备好的RNA作为模板(即实施例步骤1 制备的阳性对照标准品)，定量后用无菌无酶去离子水将RNA拷贝数浓度分别稀释至10³ copies/μL、10²copies/μL、10¹ copies/μL、5copies/μL 和10⁰ copy/μL，同时取阴性对照作为0copy/μL模板RNA。

检测体系的建立

在0.2ml微量反应管中(海基生物)，按下表所述剂量加入试剂，建立环介导等温扩增反应体系：

反应体系配制好后，轻混匀微量反应管内液体，小心盖上含OG染料的管盖。严禁剧烈混合或倒置反应管。

小心置于60℃水浴中反应30min。反应结束后将反应微量反应管倒置，反应液浸泡管盖上的染料，静置30s。再将反应液甩至管底，判定反应结果，确定反应敏感性。

结果如图2所示，从5copies/μL至10³copies/μL拷贝数浓度的RNA 均可以观察到阳性反应，拷贝数浓度为5copies/μL的RNA反应时有肉眼可见的变色反应，10个拷贝数的模板RNA则可显示强烈的变色反应，说明应用本发明提供的引物及试剂盒所建立的检测方法，其检测下限可达到5个拷贝数的RNA分子，具有检测灵敏的优点。

实施例3

验证采用本发明实施例1所述引物进行新型冠状病毒环介导等温扩增 (RT-LAMP)的检测结果特异性。包括以下步骤：选取NATtrol Respiratory Validation Panel 3试剂盒(ZeptoMetrix)中灭活的严重呼吸障碍综合征病毒(SARS-CoV)、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、H1亚型甲型流感病毒(Influenza H1)、H3亚型甲型流感病毒(Influenza H3)、乙型流感病毒(Influenza B)以及甲型呼吸道合胞体病毒(RSV-A)7种常见呼吸道病毒对照物为特异性检测受试病毒。应用病毒DNA/RNA提取试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司)提取以上病毒的RNA，并与本研究制备的 SARS-CoV-2 N基因转录物共同作为待检样本，建立环介导等温扩增反应。 60℃水浴中反应30min，反应结束后判定反应结果，确定反应敏感性。

结果如图3所示，建立的新型冠状病毒环介导等温扩增的检测方法，仅能检测出SARS-CoV-2 N基因转录物，而其他其中常见冠状病毒扩增结果均为阴性，显示了本方法良好的特异性，为该方法临床应用的前提条件。

实施例4

采用本发明实施例1所述引物的RT-LAMP检测方法在新型冠状病毒肺炎临床检测中的参比应用。

应用本发明建立的检测方法与山东省某新型冠状病毒感染的肺炎定点收治医院检验科的核酸检测方法(RT-qPCR)进行了平行比较。以合成的N基因转录物为阳性对照(简写为P)，以无菌无核酶的去离子水为阴性对照(简写为N)，待检样本为医院检验科提供的28份样本。

实验结果如表1所示，经对比分析发现，本发明所用的方法与RT-qPCR 方法的阳性符合率为88.3％(5/6)；阴性符合率为100％(12/12)；弱阳性符合率为10％(1/10)，检测时阴性对照和阳性对照组也均符合预期。根据检测结果比较，本发明建立的RT-LAMP检测方法在阳性和阴性符合率上与 RT-qPCR方法接近，达到94.4％(17/18)，但是在10份RT-qPCR检测为弱阳性的样本中，RT-LAMP方法既检测出3例阳性，也有6例检测为阴性的结果，因此，弱阳性样本的符合率为10％(1/10)。由于RT-qPCR方法弱阳性结果代表扩增的不确定性(Ct值在38-40之间)，即可能是样本中确有低浓度核酸，也可能是环境污染或非特异性扩增所致，因此，检测结果没有实际临床诊断意义。但RT-LAMP结果的这种不确定性较低，仅有1 份样本检出结果为弱阳性(即显色介于绿色和橙色之间)，因此，说明使用本发明提供的试剂盒可以在临床诊断方面可能给出更为明确的结果。

表1.RT-qPCR与RT-LAMP检测方法在临床样本中的符合情况

实施例5

步骤3：制备引物混合液

引物组包括引物22LoopF和引物22LoopB。引物22LoopF的核苷酸序列为SEQ IDNO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列为 SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。22LoopF与参考基因组第28834-28853 位区域序列反向互补；22LoopB与参考基因组第28912-28930位区域序列一致。委托北京六合华大基因科技有限公司合成上述引物。

其余均与实施例1相同。

实施例6

步骤3：制备引物混合液

引物组包括引物22F3、引物22B3、引物22FIP、引物22BIP。

引物22F3的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物22B3 的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；引物22FIP的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；引物22BIP的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。引物22FIP由22F1c和22F2两个寡核苷酸片段组成，引物22BIP由22B1c和22B2两个寡核苷酸片段组成。其中22F3 序列与新型冠状病毒参考毒株基因组第28778-28797位区域序列一致；引物22B3与参考基因组第28952-28971位区域序列反向互补；22F2与参考基因组第28809-28827位区域序列一致；22F1c与参考基因组第28866-28885位区域序列反向互补；22B1c与参考基因组第 28889-28910位区域序列一致；22B2与参考基因组第28932-28951位区域序列反向互补。委托北京六合华大基因科技有限公司合成上述引物。

其余均与实施例1相同。

实施例7

步骤3：制备引物混合液

引物组包括引物22F3、引物22B3、引物22LoopF、引物22LoopB。

引物22F3的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物22B3 的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；引物22LoopF的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列为 SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。其中22F3序列与新型冠状病毒参考毒株基因组第28778-28797位区域序列一致；引物22B3与参考基因组第28952-28971位区域序列反向互补；22LoopF与参考基因组第 28834-28853位区域序列反向互补；22LoopB与参考基因组第 28912-28930位区域序列一致。委托北京六合华大基因科技有限公司合成上述引物。

其余均与实施例1相同。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 一种用于新型冠状病毒扩增引物及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaggcttct acgctgaagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgctctcaa gctggttcaa 20

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccctactg ctgcctggag gcagtcaagc ctcttctcg 39

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctcctgcta gaatggctgg catctgtcaa gcagcagcaa ag 42

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aactgttgcg actacgtgat 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcggtgat gctgctctt 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcccctactg ctgcctggag 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagtcaagc ctcttctcg 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctcctgcta gaatggctgg ca 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctgtcaagc agcagcaaag 20

<210> 11

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210> 12

<211> 1294

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggcgaauuc gagcucggua ccaugucuga uaauggaccc caaaaucagc gaaaugcacc 60

ccgcauuacg uuugguggac ccucagauuc aacuggcagu aaccagaaug gagaacgcag 120

uggggcgcga ucaaaacaac gucggcccca agguuuaccc aauaauacug cgucuugguu 180

caccgcucuc acucaacaug gcaaggaaga ccuuaaauuc ccucgaggac aaggcguucc 240

aauuaacacc aauagcaguc cagaugacca aauuggcuac uaccgaagag cuaccagacg 300

aauucguggu ggugacggua aaaugaaaga ucucagucca agaugguauu ucuacuaccu 360

aggaacuggg ccagaagcug gacuucccua uggugcuaac aaagacggca ucauaugggu 420

ugcaacugag ggagccuuga auacaccaaa agaucacauu ggcacccgca auccugcuaa 480

caaugcugca aucgugcuac aacuuccuca aggaacaaca uugccaaaag gcuucuacgc 540

agaagggagc agaggcggca gucaagccuc uucucguucc ucaucacgua gucgcaacag 600

uucaagaaau ucaacuccag gcagcaguag gggaacuucu ccugcuagaa uggcuggcaa 660

uggcggugau gcugcucuug cuuugcugcu gcuugacaga uugaaccagc uugagagcaa 720

aaugucuggu aaaggccaac aacaacaagg ccaaacuguc acuaagaaau cugcugcuga 780

ggcuucuaag aagccucggc aaaaacguac ugccacuaaa gcauacaaug uaacacaagc 840

uuucggcaga cgugguccag aacaaaccca aggaaauuuu ggggaccagg aacuaaucag 900

acaaggaacu gauuacaaac auuggccgca aauugcacaa uuugccccca gcgcuucagc 960

guucuucgga augucgcgca uuggcaugga agucacaccu ucgggaacgu gguugaccua 1020

cacaggugcc aucaaauugg augacaaaga uccaaauuuc aaagaucaag ucauuuugcu 1080

gaauaagcau auugacgcau acaaaacauu cccaccaaca gagccuaaaa aggacaaaaa 1140

gaagaaggcu gaugaaacuc aagccuuacc gcagagacag aagaaacagc aaacugugac 1200

ucuucuuccu gcugcagauu uggaugauuu cuccaaacaa uugcaacaau ccaugagcag 1260

ugcugacuca acucaggccu aaggauccuc uaga 1294

Claims

1.一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，包括至少一个能够识别新型冠状病毒N基因上的特异区域的寡核苷酸引物，新型冠状病毒N基因上的特异区域的序列范围包括新型冠状病毒参考毒株基因组28778-28971的区域序列。

2.根据权利要求1所述一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，包括引物22LoopF和/或引物22LoopB，以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，引物22LoopF的序列包括与参考基因组第28834-28853位区域序列反向互补的序列；引物22LoopB的序列包括与参考基因组第28912-28930位区域一致的序列。

3.根据权利要求2所述一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，引物22LoopF的核苷酸序列包括SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；引物22LoopB的核苷酸序列包括SEQ IDNO：6所示核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述一种用于新型冠状病毒扩增的引物，其特征在于，包括引物22F3、引物22B3、引物22FIP、引物22BIP中的一个或任几个；所述引物22FIP包括22F1c和22F2寡核苷酸片段，引物22BIP包括22B1c和22B2寡核苷酸片段；以新型冠状病毒参考毒株基因组为参考基因组，所述引物22F3的序列包括与参考基因组第28778-28797位区域序列一致的序列；所述引物22B3的序列包括与参考基因组第28952-28971位区域序列反向互补的序列；22F2寡核苷酸片段包括与参考基因组第28809-28827位区域序列一致的序列；22F1c寡核苷酸片段包括与参考基因组第28866-28885位区域序列反向互补的序列；22B1c寡核苷酸片段包括与参考基因组第28889-28910位区域一致的序列；22B2寡核苷酸片段包括与参考基因组第28932-28951位区域序列反向互补的序列；

优选的：

引物22F3的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物22B3的核苷酸序列包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；引物22FIP的核苷酸序列包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；引物22BTP的核苷酸序列包括SEQ TD NO：4所示核苷酸序列。

5.权利要求1-4任一项所述引物在制备检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。

6.一种用于检测新型冠状病毒的核苷酸片段、载体和/或菌株，其特征在于，所述核苷酸片段包括新型冠状病毒参考毒株核衣壳编码基因N序列，核苷酸片段的序列包括SEQ TDNO：11所示核苷酸序列；所述载体包括该核苷酸片段；所述菌株包括该核苷酸片段。

7.一种基于新型冠状病毒N基因的RNA阳性对照物，其特征在于，所述RNA阳性对照物包括权利要求6所述核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段。

8.权利要求6或7所述核苷酸片段、载体、菌株和/或RNA阳性对照物在制备检测冠状病毒的试剂盒中的应用。

9.一种检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述引物；

优先的还包括：扩增反应缓冲液、dNTPs、Bst DNA聚合酶、反转录酶、对照标准品中的一种或几种。

10.一种制备检测冠状病毒试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：合成权利要求1-4任一项所述引物。