CN103898044A - 猪圆环病毒2型高敏感性pk15细胞系l8的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法，它的步骤如下：（1）将PK15细胞复苏后培养于细胞瓶中长成细胞单层，用质量分数为0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生长液吹打，所述DMEM生长液含质量分数为10%的胎牛血清和质量分数为1%的双抗，分散细胞成单个，用系列稀释法进行细胞克隆；（2）通过间接免疫荧光筛选出对PCV2高敏感性的单细胞株。本发明采用更为方便高效的单细胞克隆技术获得一株对PCV2具有更高感染率的细胞系，命名为L8。通过对该细胞系的稳定性以及纯净性检测发现该细胞系能够稳定的提高PCV2在细胞内的增殖滴度。

Description

猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法

技术领域

本发明涉及促进2型猪圆环病毒体外细胞增殖技术领域。具体涉及猪圆环病毒2型高敏感性单细胞株的筛选及培养。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine cirovirus type 2，PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、增生性坏死性肺炎、母猪繁殖与呼吸综合征、猪皮炎与肾病综合征和仔猪传染性先天性震颤等多种疾病，其中断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）最为常见且该病在世界范围内广泛流行，给各国养猪业造成了巨大的损失。此外，猪圆环病毒2型又常造成其他细菌或病毒的并发或继发感染，从而增加了猪传染病的预防和控制难度。

由于猪圆环病毒2型体外细胞增殖比较困难，其病毒滴度一般都在10^4.0 —10^5.0TCID₅₀/mL之间，免疫荧光染色显示接种PCV2的PK15细胞中仅有20%左右的细胞对PCV2易感。这可能是制约PCV2全病毒灭活苗疫苗开发的技术瓶颈，因此研究提高PCV2在细胞内增殖滴度的方法成了国内外学者研究的热点和难点，同时也成为了全病毒灭活苗开发所需要克服的最大障碍。

发明内容

本发明的目的是获得对猪圆环病毒2型具有较高敏感性的细胞株，通过对该细胞株的克隆、筛选与生物学特性的测定进一步验证其功能，并增殖获得具有较高滴度的猪圆环病毒2型细胞毒。

本发明涉及基于对所筛选出的细胞生物特性以及其对猪圆环2型病毒增殖促进情况的检测。所述的克隆细胞能够提高猪圆环病毒2型的体外增殖能力和滴度，有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发通过悬浮培养技术制备高效价PCV2全病毒灭活疫苗。

本发明的技术方案是：通过系列稀释法克隆获得单细胞株，并进一步通过间接免疫荧光（IFA）筛选出对PCV2高敏感性的单细胞株。一种猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法，它的步骤如下：

（1）将PK15细胞复苏后培养于细胞瓶中长成细胞单层，用质量分数为0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生长液吹打，所述DMEM生长液含质量分数为10%的胎牛血清和质量分数为1%的双抗，分散细胞成单个，用系列稀释法进行细胞克隆；

（2）通过间接免疫荧光筛选出对PCV2高敏感性的单细胞株。

所述步骤（1）中用系列稀释法进行细胞克隆的步骤如下：

① 将PK15细胞稀释到5x10⁴ 至 1x10⁵cells/mL，在96孔板中，除了A1孔其他所有孔用八孔排枪加入100μL DMEM生长液，取稀释好的PK15细胞液200μL加入到A1孔中；

② 第一系列的稀释：如图1中竖向箭头所示，在A1孔中取100μL 至B1中进行倍比稀释，用枪吸吹混匀，同样取100μL至C1孔中，以此类推进行倍比稀释至H1孔后，最后从H1孔中取出100μL细胞混合液弃掉；

第二系列的稀释：如图1中横向箭头所示，在第一系列稀释完之后，用八孔排枪取100μL细胞培养液加入到第一排中进行倍比稀释并吸吹混匀之后，再从第一排孔中取100μL细胞混合液至第二排中进行同样操作；同样进行倍比稀释至第十二排孔，弃掉最后取出的100μL细胞混合液；

③ 在96孔板中补加DMEM生长液至200μL，将培养板置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养，培养4—5d时可在显微镜下挑出单克隆细胞孔并分别按照挑选的前后顺序命名为L1、L5、L6、L8、L12和L15，继续培养10d即细胞长满孔的1/3-1/2面积时可将细胞转至24孔板中培养，细胞在24孔板中长满后可转至6孔板中培养，细胞在6孔板中长满再转至25cm²的细胞瓶中培养，在细胞培养过程中2—3d更换一次DMEM生长液，将培养的单细胞克隆冻存。

本发明的有益效果是：本发明采用更为方便高效的单细胞克隆技术获得一株对PCV2具有更高感染率的细胞系，命名为L8。通过对该细胞系的稳定性以及纯净性检测发现该细胞系能够稳定的提高PCV2在细胞内的增殖滴度。

本发明中我们选用培养PCV2增殖所需的实验室常用PK15细胞来作为克隆细胞的母细胞，首先通过一种更为有效简便的系列稀释法来获得更多单细胞株；其次将所挑选出来的单细胞株扩大培养后，再通过特异性强的间接免疫荧光（IFA）技术对克隆细胞进行PCV2易感性的筛选。最终挑选出对PCV2细胞敏感性最高的细胞系，所克隆的细胞系细胞形态均一、生长性能好，连续传代几十代以后，仍然保持对PCV2高敏感性，病毒毒价可稳定在10^6.5TCID₅₀/mL以上。在该克隆细胞株连续传代过程中，每隔5代我们对其进行了纯净性检验，结果表明该克隆细胞株纯净，无支原体、无PCV1及其它外源病毒污染。这为针对PCV2的科学实验及相关通过悬浮培养技术培养病毒提供技术支撑。

附图说明

图1为系列稀释法简图；

图2为L8各代细胞PCV1的PCR检测胶图，注：M：DNA Marker DL2000，1.2为阳性对照，3为F1代L8细胞，4为F5代L8细胞，5为F10代L8细胞，6为F15代L8细胞，7为F20代L8细胞；

图3为L8各代细胞PPV的PCR检测胶图，注：M：DNA Marker DL2000，4为阳性对照，1为F1代L8细胞，2为F5代L8细胞，3为F10代L8细胞，5为F15代L8细胞，6为F20代L8细胞；

图4为L8各代细胞PRV的PCR检测胶图，注：M：DNA Marker DL2000，2为阳性对照，1为F1代L8细胞，3为F5代L8细胞，4为F10代L8细胞，5为F15代L8细胞，6为F20代L8细胞；

图5为L8各代细胞PRRSV的PCR检测胶图，注：M：DNA Marker DL2000，6为阳性对照，1为F1代L8细胞，2为F5代L8细胞，3为F10代L8细胞，4为F15代L8细胞，5为F20代L8细胞。

具体实施方式

一、猪圆环病毒2型高敏感性的PK1 5单细胞株的克隆与筛选

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及毒株

PK15细胞购自中国兽药监察所（冻存）；PCV2—DF株购自河南省动物性食品安全重点实验室。

1.1.2主要试剂

DMEM高糖培养基(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、0.25%胰蛋白酶购自索莱宝公司、0.01M PBS液的配制：取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钠1.15g，磷酸氢二钾0.2g，溶于800mL三蒸水中充分溶解后定容至1000mL，调pH值到7.4，高压灭菌后4℃保存备用。

PCV2阳性血清（VMRD公司）、兔抗猪IG-g-FITC二抗（Sigma）公司、兔血清封闭液（博士德）、D-氨基葡萄糖（Sigma公司）、DMSO购自Solarbio公司、其它试剂均为分析纯试剂。

1.2  方法

1.2.1单细胞克隆的筛选方法（系列稀释法）

PK15细胞复苏后培养于细胞瓶中长成细胞单层，用适量0.25%的胰酶消化，加入适量DMEM生长液（含10%胎牛血清和1%双抗）吹打，分散细胞成单个。用系列稀释法进行细胞克隆，如图1所示，操作如下：

（1）将细胞稀释到5x10⁴ 至 1x10⁵cells/mL；

（2）在96孔板中，除了A1孔其他所有孔用八孔排枪加入100μL细胞培养液；

（3）取稀释好的细胞液200μL加入到A1孔中；

（4）第一系列的稀释：如图1中竖向箭头所示，在A1孔中取100μL至B1中进行倍比稀释，用枪吸吹混匀后。同样取100μL至C1孔中，以此类推进行倍比稀释至H1孔后，最后从H1孔中取出100μL细胞混合液弃掉；

（5）第二系列的稀释：如图1中横向箭头所示，在第一系列稀释完之后，用八孔排枪取100μL细胞培养液加入到第一排中进行倍比稀释并吸吹混匀之后，再从第一排孔中取100μL细胞混合液至第二排中进行同样操作；以此类推进行倍比稀释至第十二排孔，弃掉最后取出的100μL细胞混合液；

（6）在96孔板中补加培养基至200μL，将培养板置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养；

（7）培养4—5d时可在显微镜下挑出单克隆细胞孔并做好标记，继续培养10d左右即细胞长满孔的1/3—1/2面积时可将细胞转至24孔板中培养，细胞在24孔板中长满后可转至6孔板中培养，细胞在6孔板中长满再转至25cm²的细胞瓶中培养（注：细胞培养过程中2—3d更换一次新鲜培养液），将培养的单细胞克隆冻存并以备后续的筛选鉴定用。

1.2.2 PCV2增值易感PK15克隆细胞筛选

复苏不同的PK15克隆细胞，传3代后用0.25%的胰酶消化下来，加培养基，再加10%的病毒液充分混匀后封装到24孔板中，500μL/孔，置于37℃ 5%CO₂温箱中静置培养24h以后，弃掉上清液。加入含2mM D-氨基葡萄糖2%胎牛血清继续培养48h，用IFA检测病毒感染的细胞量，挑选出PCV2易感的克隆细胞。

1.2.3间接免疫荧光试验(IFA)

将上述的24孔板弃去维持液，用PBS洗涤3次，晾干；用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤2次，晾干；用0.2% Tritonx-100/PBS处理接毒细胞，37℃10min，PBS洗涤2次，晾干；每孔加正常兔血清封闭液37℃封闭1h，倒掉；一抗处理，VMRD公司的多抗（1:1000）37℃孵育45min，PBS洗5次；二抗处理，兔抗猪IgG-FITC(1:200) 37℃孵育45min，PBS洗5次；PBS洗3次；80%甘油封底，荧光镜检。有荧光物质着染的细胞即为PCV2感染细胞。

1.2.4 PK15细胞的传代、冻存与复苏

将复苏后的PK15细胞培养于细胞瓶中，待生成至细胞单层，用1mL 0.25%胰酶消化，加入6mL DMEM培养液（含10%胎牛血清和1%双抗）吹打，分散细胞成单个，加入培养液，分瓶后放置于37℃温箱培养1—2d，形成单层，再用适量胰酶消化，一直传代。传代过程中，取不同代次细胞加入适量细胞冻存液冻存。

将P5, P10, P20代PK15细胞单层，用PBS液洗2次，加入适量0.25%胰酶消化，加入适量生长液，1000rpm离心10min，去上清，加入适量细胞冻存液（DMEM）含30%胎牛血清、10% DMSO，悬浮细胞，放入冻存盒中，放置于-80℃超低温冰箱中保存，之后再转入液氮灌中长期保存。

1.2.5病毒TCID₅₀测定

用新消化的PK15细胞液将20代的病毒液做10^-1到10^-7倍稀释后接种到96孔板上，每个稀释度8孔，同时设有阴性对照。37℃, 5% CO₂温箱中静置培养，24h后，弃去培养液，加含2mM D-氨基葡萄糖2%胎牛血清的1640培养基维持液，每孔100μL，继续培养48h，弃去维持液，用PBS洗涤3次，晾干；用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤2次，晾干；用0.2% Tritonx-100/PBS处理接毒细胞，37℃10min，PBS洗涤2次，晾干；每孔加正常兔血清封闭液37℃封闭1h，倒掉；一抗处理，VMRD公司的多抗（1:1000）37℃孵育45min，PBS洗5次；二抗处理，兔抗猪IgG-FITC(1:800) 37℃孵育45min，PBS洗5次；PBS封底，荧光镜检。根据Karber氏法计算病毒TCID₅₀。

1.2.6 L8对PCV2增殖稳定性检测

L8克隆株的P5、P10、P15、P20分别接种等量的病毒，用IFA法检测阳性细胞数，观察不同代次间阳性细胞数的差异，来判定克隆株L8是否对PCV2增殖稳定。

2 结果 

2.1细胞克隆与PCV2 IFA检测

将PK15进行细胞克隆，获得6个单克隆细胞株，分别命名为L1、L5、L6、L8、L12和L15。通过IFA检测结果显示，L8克隆细胞对PCV2最为易感，L12最不易感。L8克隆细胞病毒感染后72h，绿色荧光物质着染的PCV2阳性细胞数明显增多。

2.2  PK15-L8克隆细胞培养PCV2毒株TCID₅₀测定

将等量的PCV2病毒分别接种到L8、L12和PK15母细胞，37℃培养48h后，分别用IFA方法测定其TCID₅₀。结果显示，细胞克隆株L8的病毒滴度达到10^6.75TCID₅₀/mL、L12的病毒滴度达到10^2.25 TCID₅₀/mLPK15母细胞增殖滴度达到10^4.75 TCID₅₀/mL。

2.3  PK15-L8克隆细胞传代、冻存与复苏

将L8细胞传代至20代，均贴壁良好，细胞长成单层后形态一致。将P5、P10、P15细胞冻存于-196 ℃一个月，复苏后均生长良好。

2.4 PK15-L8对PCV2增殖的稳定性

P5、P10、P15、P20分别接种PCV2-DF毒72h通过IFA检测其TCID₅₀，结果表明阳性细胞数量无明显差异，可见筛选的克隆细胞对PCV2增殖比较稳定。

表1  不同代次的L8细胞检测的PCV2-DF毒的TCID₅₀

二、猪圆环病毒2型高敏感性PK1 5-L8细胞株纯净性检测

1 材料与方法

1.1 细胞

PK15-L8细胞，取第5.10.15.20代次细胞，由本实验室克隆。

1.2主要试剂

Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000等购自宝生物工程(大连)有限公司；病毒DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司、胶回收试剂盒购于BioTeke公司、引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 参考检测的外源病毒

猪圆环病毒1型（PCV1）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）

1.4 无菌检验

L8细胞F1、F5 、F15 、F20代次的上清液加入无菌检验的各管培养基均未转变混浊，说明无细菌和霉菌污染。

1.5 支原体检验

按照 中国兽药典 附录的方法进行

1.6 PCR方法检测外源病毒

各种外源病毒PCR检测引物如表2所示：

表2：各种外源病毒PCR检测引物

取L8细胞F1、F5、F15、F20代次的细胞和上清混合液冻融3次后，按照病毒DNA/RNA提取试剂盒的操作说明书进行细胞核酸的提取，将提取的病毒DNA作为模板做PCR扩增，同时设阳性和阴性对照，PCR反应体系为：模板DNA 3μL，上、下游引物P1/P2各0.5μL，rTaq DNA聚合酶12μL，补水至25μL；混匀后进行PCR扩增。PCR 扩增程序为：95℃ 5min之后，94℃ 40s，53℃ 50s，72℃ 45s，30个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，取10μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR的结果。

3 结果

3.1 无菌检验

各代次供细胞无菌检验的各管培养基均未转变混浊，说明L8无细菌和霉菌污染。

3.2 支原体检验

各代次供试细胞支原体检验用液体培养基的颜色没有明显变化，pH值也未出现士0.5的变化；固体培养基中未出现典型的“煎蛋”状支原体菌落，说明无支原体污染。

3.3 外源性病毒检验

3.3.1 PCV1检测结果

PCR方法对PCV1的检测结果如图2所示，可见各代次的L8细胞中均不含有PCV1。

3.3.2 PPV检测结果

PCR方法对PPV的检测结果如图3所示，可见各代次的L8细胞中均不含有PPV。

3.3.3 PRV检测结果

PCR方法对PRV的检测结果如图4所示，可见各代次的L8细胞中均不含有PRV。

3.3.2 PRRSV检测结果

RT-PCR方法对PRRSV的检测结果如图5所示，可见各代次的L8细胞中均不含有PRRSV。

4 讨论

PCV2对养猪业危害严重，主要由于感染PCV2的猪群免疫力下降，然后容易感染猪瘟、猪蓝耳病等其它病毒病并继发细菌感染，进而对猪群造成难以控制的病势。一直以来，PCV2培养滴度太低，难以获得足够的病毒粒子，这也是目前造成该病毒感染难以控制的关键所在。想要提高病毒滴度，通过特定技术获得一株持续稳定的对PCV2高感染性的细胞系是非常必要的。

本发明中我们选用培养PCV2增殖所需的实验室常用PK15细胞来作为克隆细胞的母细胞，首先通过一种更为有效简便的系列稀释法来获得更多单细胞株；其次将所挑选出来的单细胞株扩大培养后，再通过特异性强的间接免疫荧光（IFA）技术对克隆细胞进行PCV2易感性的筛选。最终挑选出对PCV2细胞敏感性最高的细胞系，所克隆的细胞系细胞形态均一、生长性能好，连续传代几十代以后，仍然保持对PCV2高敏感性，病毒毒价可稳定在10^6.5 TCID₅₀/mL以上。在该克隆细胞株连续传代过程中，每隔5代我们对其进行了纯净性检验，结果表明该克隆细胞株纯净，无支原体、无PCV1及其它外源病毒污染。这为针对PCV2的科学实验及相关通过悬浮培养技术培养病毒提供技术支撑。

Claims (2)

1.一种猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：

（1）将PK15细胞复苏后培养于细胞瓶中长成细胞单层，用质量分数为0.25%的胰酶消化，然后加入DMEM生长液吹打，所述DMEM生长液含质量分数为10%的胎牛血清和质量分数为1%的双抗，分散细胞成单个，用系列稀释法进行细胞克隆；

（2）通过间接免疫荧光筛选出对PCV2高敏感性的单细胞株。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型高敏感性PK15细胞系L8的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中用系列稀释法进行细胞克隆的步骤如下：

① 将PK15细胞稀释到5x10⁴ 至 1x10⁵cells/mL，在96孔板中，除了A1孔其他所有孔用八孔排枪加入100μL DMEM生长液，取稀释好的PK15细胞液200μL加入到A1孔中；

② 第一系列的稀释：在A1孔中取100μL 至B1中进行倍比稀释，用枪吸吹混匀，同样取100μL至C1孔中，以此类推进行倍比稀释至H1孔后，最后从H1孔中取出100μL细胞混合液弃掉；

第二系列的稀释：在第一系列稀释完之后，用八孔排枪取100μL细胞培养液加入到第一排中进行倍比稀释并吸吹混匀之后，再从第一排孔中取100μL细胞混合液至第二排中进行同样操作；同样进行倍比稀释至第十二排孔，弃掉最后取出的100μL细胞混合液；

③ 在96孔板中补加DMEM生长液至200μL，将培养板置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养，培养4—5d时可在显微镜下挑出单克隆细胞孔并分别按照挑选的前后顺序命名为L1、L5、L6、L8、L12和L15，继续培养10d即细胞长满孔的1/3-1/2面积时可将细胞转至24孔板中培养，细胞在24孔板中长满后可转至6孔板中培养，细胞在6孔板中长满再转至25cm²的细胞瓶中培养，在细胞培养过程中2—3d更换一次DMEM生长液，将培养的单细胞克隆冻存。

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