CN101665781A - 高滴度猪圆环病毒2型培养细胞、制备方法及其用法 - Google Patents

高滴度猪圆环病毒2型培养细胞、制备方法及其用法 Download PDF

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本发明高滴度猪圆环病毒2型(PCV2)培养细胞、制备方法及其用法，属于生物技术领域。为获得能稳定产生高滴度PCV2的PK15细胞系，对PK15母细胞进行有限稀释后进行了连续的细胞克隆和亚克隆，利用IFA筛选，获得1株对PCV2具有高敏感性的PK15－B1细胞系。该细胞系生物学特性稳定，无外源微生物污染。该细胞接种100TCID50/ml PCV2后，37℃培养3－4天，病毒滴度达107.0TCID50/ml，比接种PK15母细胞的病毒滴度高100倍，表明PK15－B1细胞系对PCV2更为敏感，更利于PCV2的复制。本研究筛选的PK15－B1克隆细胞株及高滴度PCV2制备方法可用于PCV2疫苗和相关诊断试剂的研究与产品生产。

Description

高滴度猪圆环病毒2型培养细胞、制备方法及其用法
一、技术领域
本发明涉及高滴度猪圆环病毒2型(PCV2)培养细胞、制备方法及其用法，属于高新生物技术领域，专用于高滴度猪圆环病毒2型培养细胞克隆株的建立、筛选和鉴定，筛选的PK15-B1克隆细胞及高滴度PCV2制备方法可用于PCV2疫苗和相关诊断试剂的研究与产品制备。
二、背景技术
猪圆环病毒2型(PCV2)现被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要因素，同时还发现PCV2与其它疾病相关，这些疾病包括肾病皮炎综合症、繁殖障碍、出生前心肌炎和弥散坏死性肺炎。PCV2是猪圆环病毒(PCV)两种基因型中的一种，为小颗粒、无包膜、环状单股DNA病毒，属环状病毒科，因能持续感染猪肾细胞(PK15)而被首次鉴定识别。
使用PCV2抗原制成的疫苗在对PMWS的预防中初见成效。随着针对PCV2引起的PMWS及其它疾病的疫苗、诊断试剂和治疗方法的形成与发展，我们需要有效可靠的方法来获取足量的PCV2病毒。各实验室培养PCV2均在猪肾细胞系PK15上增殖。但是，病毒滴度低，病毒含量都低于105.0TCID50/ml。免疫荧光试验显示，受PCV2感染的PK15细胞比例仅有20％-30％。
三、发明内容
技术问题  本发明的目的是筛选一株对PCV2高度易感且稳定的同源性PK15细胞系，并能持续产出高滴度的PCV2，用于病毒增殖，培养的病毒可用于PCV2疫苗和相关诊断试剂的研究与产品制备。
PK15细胞虽然适合PCV2增殖，但病毒滴度比较低，病毒的含量不能满足疫苗和诊断抗原的制备。本研究通过细胞克隆和筛选，成功获得一株能持续稳定增殖高滴度PCV2的PK15克隆细胞株PK15-B1。
PK15-B1克隆细胞株形态均一，细胞生长具有S型曲线，细胞连续传代至第70代，细胞形态和生长速度稳定，无支原体、PCV1、HCV、PPV、BVDV和PRV等外源微生物污染。将PK15-B1细胞接种于细胞培养瓶内，加入含8％-10％犊牛血清的MEM营养液，37℃培养48小时可以形成细胞单层，接种PCV2(104.0/ml以上)，加入含4％-5％犊牛血清的MEM营养液，于37℃培养72-96h，可以出现细胞病变，PCV2TCID50可达107.0/ml。
技术方案  PK15-B1细胞克隆株通过以下方法构建而成：
(1)PK15细胞连续有限稀释进行细胞克隆  将保存的无猪圆环病毒1型(PCV1)污染的PK15细胞经胰蛋白酶消化为单个细胞后进行连续梯度稀释，然后分别培养于96孔细胞板，37℃5％CO2条件下培养10-14天，挑选有单个细胞生长的细胞孔中细胞进行亚克隆培养，并连续亚克隆培养3次，获得亚克隆细胞株；
(2)对猪圆环病毒2型(PCV2)敏感的PK15克隆细胞株的筛选  将PK15细胞不同克隆细胞株分别接种于96孔细胞培养板内，待细胞长满单层接种PCV2分离病毒，于37℃5％CO2条件下培养48h，观察细胞形态，弃去培养液，用PBS洗细胞3次，经无水乙醇固定后，分别加入PCV2抗血清(筛选自临床阳性血清)，37℃作用30min，PBS洗涤3次后加入FITC-SPA(Boster公司)，37℃作用30min，洗涤后于荧光显微镜下观察特异性荧光细胞，并以未接毒的细胞作为阴性对照，挑选荧光数量最多(远多于正常PK15细胞荧光数量)的PK15细胞克隆株进行传代，获得PK15-B1克隆细胞株，并于-196℃保存。
用上述获得的PK15-B1细胞克隆株进行猪圆环病毒2型的增殖：
将PK15-B1克隆细胞接种于细胞培养瓶内，加入含8％-10％犊牛血清的MEM营养液，37℃培养48小时可以形成细胞长满单层，接种PCV2(104.0/ml以上)，加入含4％-5％犊牛血清的MEM营养液，于37℃培养96-72h，可以出现细胞病变，PCV2滴度达107.0/TCID50/ml。
有益效果
PCV2是引起5-14周龄仔猪患PMWS的主要因素，该病给养猪产业带来了巨大的经济损失。国外PCV2疫苗主要有基因工程疫苗和全病毒灭活疫苗，但因为PCV2滴度太低，难以获得足够的PCV2病毒，从而影响了PCV2研究及其诊断制品和疫苗的研究与开发。我国至今尚无商品化PCV2疫苗。为了获得关于疫苗、诊断试剂和治疗手段的更多信息，进行更为直接有效的研究，就需要获得一株持续对PCV2具有高感染性的细胞系。
对PCV2敏感度高的PK15-B1细胞接毒后细胞状态会发生一定变化，表现为细胞聚集、拉网和脱落，疑为病变，该现象还未见报道。病毒滴度和病毒生长曲线测定表明，PK15-B1克隆株较之PK15细胞更利于PCV2的复制与增殖，PCV2滴度达107.0/TCID50/ml，并且这种敏感性在传代至第50代内也没有丢失。经检测，PK15-B1细胞中未检测到常见的几种交叉感染病毒，无细菌和支原体感染。因此，PK15-B1细胞克隆株及高滴度PCV2的增殖方法在PCV2研究与疾病防治方面具有广阔的应用前景。目前，我们已经利用PK15-B1细胞克隆株研制成功PCV2灭活疫苗(SH株)。
四、附图说明
图1 PK15-B1细胞株细胞生长曲线
图2 PK15-B1细胞外源病毒检测
M：标准分子且2000bp DNALadder；Lane 1：DNA病毒PCV1PCR产物；Lane 2：PK15-B1细胞外源DNA PCR产物，分子量大小413bp；Lane 3：RNA病毒BVDV RT-PCR产物，分子量大小290bp；Lane 5：RNA病毒HCV RT-PCR产物，分子量大小378bp；Lane 7：RNA病毒EMCVRT-PCR产物，分子量大小186bp；Lane 4、6、8：PK15-B1细胞外源RNA RT-PCR产物
图3 PCV2在PK15-B1细胞的生长曲线(实时定量PCR)
图4细胞克隆筛选步骤
生物材料保藏：细胞克隆株PK15-B1为猪肾细胞传代细胞PK15-B1，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2009年5月4日，保藏号为CCTCC NO：C200936。
五、具体实施方式
1对PCV2易感的PK15细胞系的克隆和筛选
(1)PK15细胞连续有限稀释进行细胞克隆  将保存的无猪圆环病毒1型(PCV1)污染的PK15细胞(中国典型培养物保藏中心)经胰蛋白酶消化为单个细胞后进行连续梯度稀释，然后分别培养于96孔细胞板，37℃5％CO2条件下培养10-14天，挑选有单个细胞生长的细胞孔中细胞进行亚克隆培养，并连续亚克隆培养3次，获得亚克隆细胞株；
(2)对猪圆环病毒2型(PCV2)敏感的PK15克隆细胞株的筛选  将PK15细胞不同克隆细胞株分别接种于96孔细胞培养板内，待细胞长满单层接种PCV2分离病毒PCV2-SH(保藏号为CGMCC NO.2389，专利申请号为2008100244231，公开号：CN101240264，公开日：2008.08.13)，于37℃5％CO2条件下培养48h，观察细胞形态，弃去培养液，用PBS洗细胞3次，经无水乙醇固定后，分别加入PCV2阳性血清(筛选自临床)，37℃作用30min，PBS洗涤3次后加入FITC-SPA(Boster公司)，37℃作用30min，洗涤后于荧光显微镜下观察特异性荧光细胞，并以未接毒的细胞作为阴性对照，挑选荧光数量最多(远多于正常PK15细胞荧光数量)的PK15细胞克隆株进行传代，并于-196℃保存。
2高滴度猪圆环病毒2型的增殖方法
经过细胞培养条件的筛选和优化，确定如下培养方法，可以获得高滴度PCV2。即：将PK15-B1克隆细胞接种于细胞培养瓶内，加入含8％-10％犊牛血清的MEM营养液，37℃培养48小时可以形成细胞长满单层，接种PCV2，加入含4％-5％犊牛血清的MEM营养液，于37℃培养96-72h，收获细胞培养物，冻融3次，用IFA方法测定病毒滴度，PCV2滴度达106.0TCID50/ml。
3 PK15-B1细胞系的特性研究
3.1细胞形态
分别取等量的PK15母细胞、克隆株PK15-B1细胞接种于6孔板中，加入含8％-10％犊牛血清的MEM营养液，37℃培养48小时，待细胞长满单层观察其形态差异。同PK15细胞相比，PK15-B1细胞克隆株的形态并非典型的梭状，细胞形态纵向变短，而横向则变粗，细胞边缘也平滑了许多。
3.2细胞生长速度
取约1×105个细胞接种于6孔板中培养，加入含8％-10％犊牛血清的MEM营养液，37℃培养，分别于第8，16，24，32和48小时取其中1孔细胞进行染色、计数，每个孔做3个重复，该实验重复3次。证明PK15-B1细胞的生长速度相对变缓。
3.3细胞生物学稳定性
将克隆筛选后的PK15细胞传至第50代，选取5、10、20、50代铺于96孔板，待长满单层，分别接种PCV2，37℃培养96小时，观察细胞病变；细胞病变出现时间没有变化，证明细胞对病毒的敏感性没有发生改变。
选取5、10、20、50代细胞铺于96孔板，待长满单层，分别接种PCV2，37℃培养48h后，用IFA方法检测荧光数量，观察不同代次间荧光数量的差异，以判定克隆的PK15-B1细胞对PCV2易感的特性是否稳定。结果表明，第5、10、20和50代PK15-B1接种病毒后进行荧光染色，染色的结果没有区别，可见该克隆细胞株对PCV2的易感性并未因代次的增高而发生改变。
3.4细胞外源病毒检测
取第5、10、20、50代PK15-B1细胞，按病毒提取的方法，进行DNA/RNA提取，用针对PCV1、HCV、PPV、BVDV和PRV的特异性PCR引物，进行PCR/RT-PCR，同时设定已知病毒对照，分别测定PK15-B1细胞是否存在该病毒。PCR结果显示，其它外源病毒检测都为阴性。
3.5细胞支原体检测
同时，按《中国兽药典》附录的方法，取少量细胞上清按比例接种于支原体培养基中，于37℃培养5-7天，并设立阴性对照，测定是否存在支原体。若培养基变为金黄色则证明有支原体污染，未变色则表明未被支原体污染。证明该克隆细胞株无支原体污染。
4 PCV2在克隆细胞株上的生长曲线
取约1×105个细胞接种于6孔细胞板中培养，待细胞长满单层在每个孔中接种等量PCV2(100TCID50/ml)，加入等量维持液1mL，并于接种后第24、48、72和96小时收获细胞上清，分别用IFA和实时定量PCR方法测定病毒TCID50和分析病毒核酸，重复3次。结果表明，当接种病毒达到72-96小时时，病毒含量达到最高。
4.1 TCID50测定
将PCV2病毒液作10-1到10-8倍比稀释后分别接种于长满单层的PK15母细胞、克隆的PK15-B1细胞，每个稀释度4个孔，同时设立阴性对照，培养48h后，用IFA方法进行检测。
4.2实时定量PCR
取PCV2病毒液，用zonDNA试剂提取病毒DNA。PCR引物序列如下：F：5′-CCAGGAGGGCGTTCTGACT-3′，R：5′-CGTTACCGCTGGAG AAGGAA-3′，引物由Invitrogen生物公司合成。实时PCR反应体系20μL：cDNA 1μL，2×Power SYBRGreen PCR Master Mix(ABI公司)10μL，引物F/R浓度均为400nmol/L。反应在ABI7300荧光定量PCR仪(ABI公司)上进行，反应条件为：50℃2min；预变性95℃2min；95℃15s，60℃1min；共进行40个循环。同时设定不加DNA的阴性对照。
以含有PCV2全基因序列的质粒pTSH(冯志新，姜平，王先炜，李玉峰，许家荣。猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立。中国病毒学，2006，21(4)：371-374)为标准样品。纯化后经紫外分光光Real-time PCR反应，根据各稀释度Ct值得出检测范围，并绘制标准曲线。

Claims (3)

1.高滴度猪圆环病毒2型培养细胞，该细胞克隆株PK15-B1为猪肾细胞传代细胞PK15-B1，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2009年5月4日，保藏号为CCTCC NO：C200936。
2.权利要求1所述高滴度猪圆环病毒2型培养细胞的制备方法，包括：
(1)PK15细胞连续有限稀释进行细胞克隆将保存的无猪圆环病毒1型PCV1污染的PK15细胞经胰蛋白酶消化为单个细胞后进行连续梯度稀释，然后分别培养于96孔细胞板，37℃5％CO2条件下培养10-14天，挑选有单个细胞生长的细胞孔中细胞进行亚克隆培养，并连续亚克隆培养3次，获得亚克隆细胞株；
(2)对猪圆环病毒2型PCV2敏感的PK15克隆细胞的筛选将PK15细胞不同克隆细胞株分别接种于96孔细胞培养板内，待细胞长满单层接种PCV2分离病毒，于37℃体积比5％CO2条件下培养48h，观察细胞形态，弃去培养液，用PBS洗细胞3次，经无水乙醇固定后，分别加入PCV2抗血清，37℃作用30min，PBS洗涤3次后加入FITC-SPA，37℃作用30min，洗涤后于荧光显微镜下观察特异性荧光细胞，并以未接毒的细胞作为阴性对照，挑选荧光数量最多的PK15细胞克隆株进行传代，并于-196℃保存。
3.权利要求1所述高滴度猪圆环病毒2型培养细胞用于增殖高滴度猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：
将PK15-B1克隆细胞接种于细胞培养瓶内，加入含体积比8％-10％犊牛血清的MEM营养液，37℃培养48小时可以形成细胞长满单层，接种104.0/ml以上的PCV2，加入含体积比4％-5％犊牛血清的MEM营养液，于37℃培养72-96h，收获细胞培养物，冻融3次，用IFA方法测定，PCV2滴度可达107.0TCID50/ml。
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