CN105316295A - 一种制备猪圆环病毒2型敏感细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用生物制品领域，更具体涉及一种猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法以及使用该方法制备的细胞系及其应用。本发明还提供了猪圆环病毒2型敏感细胞系制备高滴度的猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法。本发明提供的猪圆环病毒2型敏感细胞系形态均一、细胞生长速度稳定、生物学特性稳定，能产生高滴度的猪圆环病毒2型，可用于猪圆环病毒2型灭活疫苗和相关诊断试剂的研究和应用。

Description

一种制备猪圆环病毒2型敏感细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，更具体涉及一种猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法以及使用该方法制备的细胞系及其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(简称PCV2)感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)等多种疾病(总称为猪圆环病毒病，PCVDs)，其临床特征为体重逐渐减轻，以及体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。从病理学观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎。PCV2感染性疾病引起得死亡率增高、饲料报酬降低，加上我国规模化主场饲养管理水平相对较为落后，因此PCVD也给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。

随着PCV2疫苗的出现，使用PCV2抗原制成的疫苗在对PMWS的预防中初见成效。随着针对PCV2引起的PMWS及其它疾病的疫苗、诊断试剂和治疗方法的形成与发展，我们需要有效可靠的方法来获取足量的PCV2病毒。各实验室培养PCV2均在猪肾细胞系PK15上增殖，但是，其病毒滴度低，病毒含量都低于10^5.0TCID₅₀/ml。经免疫荧光试验显示，受PCV2感染的PK15细胞比例仅有20％-30％。因为PCV2培养滴度太低，难以获得足够的PCV2病毒，从而影响了PCV2研究及其诊断制品和疫苗的研究与开发，为了获得关于疫苗、诊断试剂和治疗手段的更多信息，进行更为直接有效的研究，因此，就需要获得一种制备持续对PCV2具有高感染性的敏感细胞系的方法。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种制备猪圆环病毒2型敏感细胞系的方法以及使用该方法制备的细胞系。

本发明的主要目的在于提供一种制备猪圆环病毒2型敏感细胞系的方法，所述方法包括：(1)将猪肾细胞按照有限稀释法进行细胞克隆和亚细胞克隆，获得亚细胞克隆株；(2)选择对猪圆环病毒2型感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株进行细胞培养；(3)将步骤(2)培养成单层的猪肾细胞亚克隆株加入孵育剂进行孵育；(4)弃去步骤(3)的孵育剂及脱落细胞；(5)将步骤(4)剩余的贴壁细胞经消化传代，以细胞生长液进行培养，即得猪圆环病毒2型敏感细胞系。

优选地，步骤(1)使用的猪肾细胞为未被猪圆环病毒2型感染的猪肾细胞，经胰蛋白酶消化为单细胞后进行滴度稀释，分别在37℃5％CO₂的条件下培养于96孔细胞培养板中培养至肉眼可见细胞克隆后，进行亚细胞培养，获得亚克隆细胞株。

优选地，步骤(2)为将猪肾细胞亚克隆株接种到96孔细胞培养板中，接种猪圆环病毒2型于37℃5％CO₂的条件下培养2小时，使用间接免疫荧光法检测感染病毒最多的细胞，选择对猪圆环病毒感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株。

优选地，步骤(3)所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖；更优选地，所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖；最优选地，所述孵育剂为浓度为300mmol/L的D-氨基葡萄糖。

优选地，步骤(3)所述孵育剂孵育时间为25-35分钟；更优选地，所述的孵育时间为30分钟。

优选地，步骤(5)所述的细胞生长液为含50～100μg/mlDEAE-Dextran和5％体积百分比的胎牛血清的MEM。

本发明所用猪肾细胞为PK15细胞。

本发明还提供了一种如上所述的猪肾克隆细胞用于高滴度的猪圆环病毒2型的制备方法，将上述的猪肾克隆细胞用胰蛋白酶消化后，同步接种猪圆环病毒2型，37℃含5％CO₂温箱中培养4d，可以观察到细胞病变，表现为细胞聚堆、脱落和拉网，培养至120h细胞脱落病变可达80％以上，收获即可获得高滴度的猪圆环病毒2型病毒液。

优选地，本发明如上所述的收获的高滴度猪圆环病毒2型病毒液滴度为≥10^7.0TCID₅₀/ml。

本发明还提供了一种使用所述的猪肾细胞生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，所述包括：(1)培养猪肾克隆细胞；(2)增殖病毒；(3)收获病毒，灭活，加入佐剂制备灭活疫苗。

本发明所克隆的细胞系，生物学特性稳定，无细菌、支原体和外源微病毒污染，细胞纯净。将细胞分散后按M.O.I.＝0.1同步接种PCV2后37℃培养4—5天，病毒滴度达10^7.0TCID₅₀/ml，比PK15细胞的病毒滴度高100倍，且连续传50代后细胞的敏感性和易感性是稳定的，表明PK15细胞克隆株更利于PCV2的复制和增殖。

附图说明

图1PCV2在PKK细胞的生长曲线(实时定量PCR)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7.4的PBS，配制方法：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。

本发明所用细胞生长液及细胞维持液为含有50～100μg/mlDEAE-Dextran的MEM液。

本发明所用猪圆环病毒2型SH株(PorcineCircovirusType2，strainSH)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCCNo.2389，公开于中国专利CN101240264A。

实施例1

猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备

1PK15细胞连续有限稀释进行细胞克隆

将保存的无猪圆环病毒1型(PCV1)及2型(PCV2)污染的处于对数生长期的PK15细胞经胰蛋白酶消化为单个细胞后进行连续梯度稀释，然后分别培养于96孔细胞板，在37℃5％CO₂条件下培养10-14天，挑选有单个细胞生长的细胞孔，将细胞进行亚克隆培养，并连续亚克隆培养3次，获得亚克隆细胞株。

2克隆细胞的病毒敏感试验

将PK15细胞不同亚克隆细胞株分别以每孔200μL的量加入96孔细胞培养板，置于37℃5％CO₂培养箱中培养12h后，接种PCV2SH株病毒液，每孔接种100μL，每个稀释度重复4个孔，最后每孔补加100μL含2％胎牛血清的MEM细胞维持液，于37℃5％CO₂条件下培养48h，同时设立接毒正常PK15细胞对照孔。观察细胞形态，弃去细胞维持液，用PBS洗细胞3次，经80％冷丙酮固定后，分别加入特异性PCV2抗血清(不与PCV1反应)购自VMRD公司(货号210-70-PCRV)。37℃作用30min，PBS洗涤3次后加入FITC-SPA(Boster公司)，37℃作用30min，洗涤后于荧光显微镜下观察特异性荧光细胞，并以未接毒的细胞作为阴性对照，挑选荧光数量最多(远多于正常PK15细胞荧光数量)的PK15细胞亚克隆株。

3克隆细胞的孵育试验

将上述步骤得到的PK15细胞亚克隆株使用细胞生长液培养至形成良好的细胞单层，换用细胞维持液培养，加入浓度为300mmol/L的D-氨基葡萄糖进行细胞孵育，孵育30分钟，观察到20％-30％细胞崩解、脱落，弃去孵育剂，并用细胞维持液洗去脱落死亡的细胞。经胰蛋白酶消化进行传代培养。即得猪圆环病毒2型敏感细胞系，命名为PKK细胞系。

实施例2

高滴度猪圆环病毒2型的增殖

1病毒的增殖

将获得的PKK细胞接种于细胞培养瓶内，加入含5％胎牛血清的MEM细胞生长液，37℃培养72小时可以形成细胞单层后，将细胞用胰蛋白酶消化分散后按M.O.I.＝0.1和细胞同步接种PCV2SH株，加入含2％胎牛血清的MEM细胞维持液，放于37℃培养每天观察，培养96h以后，可以观察到细胞病变，表现为细胞聚堆、脱落和拉网，待细胞病变达80％以上，取出冰冻于-20℃，经冻融后用IFA测定病毒含量。

2病毒TCID₅₀测定

将处于对数生长期的PKK细胞消化后制备含6×10⁴cell/mL的PKK细胞悬液，以每孔200μL的量加入96孔细胞培养板，置于37℃5％CO₂培养箱中培养12h后，将PCV2病毒液进行10倍系列稀释、取10-3和10-4、10-5、10-64个稀释度，接种96孔板，每孔接种100μL，每个稀释度重复8个孔，最后每孔补加100μL含2％胎牛血清的MEM细胞维持液，置于37℃5％CO₂培养箱中继续培养48h。同时设立不接毒正常PKK细胞对照孔。

弃掉接毒PCV2继续培养48h后的96孔板内的细胞维持液，用PBS洗涤后，4℃预冷的80％丙酮水溶液固定30min后，弃去固定液，用PBS洗涤干净残留得丙酮溶液后。在PCV2接毒细胞孔和未接毒细胞孔中分别加入100μL用PBS1:400稀释PCV2抗血清置37℃湿盒中作用1h后,PBS洗涤3次，每次3min；加入100μL用PBS稀释100倍兔抗猪荧光抗体IgG-FITC二抗，37℃湿盒作用1h，PBS洗涤3次，置倒置显微镜下观察结果。结果判定:阳性细胞孔内可观察到阳性细胞胞核内有典型的特异性亮绿色荧光，而阴性对照、空白对照的细胞孔内无特异性绿色荧光。根据细胞荧光孔数，按照Reed-Muench方法计算病毒毒价，PCV2滴度达10^7.0/TCID₅₀/mL。

实施例3

PKK细胞系的特性研究

1细胞形态

分别取等量的PK15细胞、PKK细胞接种于6孔板中，加入含5％胎牛血清的MEM细胞培养液，37℃培养72小时，待细胞长满单层观察其形态差异。同PK15细胞相比，PKK细胞克隆株的形态并非典型的梭状，细胞形态纵向变短，而横向则变粗，细胞边缘平滑整齐了许多。细胞呈岛屿状生长，培养长成单层后细胞大小一致的。

2细胞生长速度

取约1×10⁵个PK15细胞、PKK细胞接种于6孔板中培养，加入含5％胎牛血清的MEM细胞生长液，37℃培养，分别于第8，16，24，32和48小时取其中1孔细胞进行染色、计数，每个孔做3个重复，该实验重复3次，计平均数。结果见表1。证明PKK细胞的生长速度相对变缓。

表1PK15细胞及PKK细胞生长速度对比

组别	8h细胞数	16h细胞数	24h细胞数	32h细胞数	48h细胞数
						PK15	1.5×105	2×105	2.5×105	4×105	6.5×105
PKK	1.3×105	1.5×105	2×105	3×105	4×105

3细胞生物学稳定性

将PKK细胞传至第50代，选取5、10、20、30、50代细胞长满单层后，将细胞用胰蛋白酶消化分散后按M.O.I.＝0.1接种PCV2SH株，分别加入含2％胎牛血清的MEM细胞维持液，放于37℃培养，每天观察，培养96h后，可以观察到细胞病变，并且不同代次之间细胞病变出现的时间没有明显差异，均表现为细胞聚集、拉网和脱落，待细胞病变达80％以上，分别取出冰冻于-20℃，经冻融后用IFA测定病毒含量，不同代次细胞繁殖的PCV2滴度均在10^7.0TCID₅₀/mL左右，证明细胞对PCV2病毒的敏感性没有发生改变。

选取5、10、20、30、50代PKK细胞铺于96孔板，待长满单层，分别接种PCV2，37℃培养48h后，用IFA方法检测荧光数量，观察不同代次间荧光数量的差异，以判定克隆的PKK细胞对PCV2易感的特性是否稳定。结果表明，第5、10、20、30和50代PKK细胞接种病毒后进行荧光染色，染色的结果没有区别，可见该克隆细胞株对PCV2的易感性并未因代次的增高而发生改变。

4细胞株纯净性检验

取第5、10、20、30、50代PKK细胞，按病毒提取的方法，进行DNA/RNA提取，用针对PCV1、HCV、PPV、BVDV和PRV的特异性PCR引物，进行PCR/RT-PCR，同时设定已知病毒对照，分别测定PKK细胞是否存在该病毒。PCR结果显示，其它外源病毒检测都为阴性。

同时，按《中国兽药典》附录的方法，取少量细胞上清按比例接种于支原体培养基中，于37℃培养5-7天，并设立阴性对照，测定是否存在支原体。若培养基变为金黄色则证明有支原体污染，未变色则表明未被支原体污染。同时取第5、10、20、30、50代PKK细胞，用PCR方法检测支原体，经检测PCR支原体阴性，不同代次接种的支原体培养基颜色无变化，证明该克隆细胞株无支原体污染。

实施例4

猪圆环病毒2型在PK15细胞及PKK细胞增殖对比

取约1×10⁵个细胞接种于6孔细胞板中培养，待细胞长满单层在每个孔中接种等量PCV2SH株(100TCID₅₀)，加入等量维持液1mL，并于接种后第24、48、72、96、120小时收获细胞上清。分别用IFA和实时定量PCR方法测定病毒TCID₅₀和分析病毒核酸。

1TCID₅₀测定

将PCV2病毒液作10-1到10-7倍比稀释后分别接种于长满单层的PK15细胞、PKK细胞，每个稀释度8个孔，同时设立阴性对照，培养48h后，用IFA方法进行检测。结果见表2。表明PKK细胞更有利于PCV2的复制和增殖。

表2猪圆环病毒2型在PK15细胞及PKK细胞增殖滴度对比

2实时定量PCR

取PCV2病毒液，按照ViralNucleicAcidExtraction试剂盒说明书提取PCV2DNA。PCR引物序列如下：F：5′-CCAGGAGGGCGTTGTGACT-3′，R：5′-CGCTACCGTTGGAGAAGGAA-3′，引物由Invitrogen生物公司合成。实时PCR反应体系25μL：cDNA2μL，rTaq酶12.5μL、上游引物(F2)1μL、下游引物(R2)1μLddH2O8.5μL，反应条件为：95℃预变性5min,变性95℃40s，59.3℃30s，72℃30s，30个循环，72℃延伸10min。。同时设定不加DNA的阴性对照，2×PowerSYBRGreenPCRMasterMix(ABI公司)10μL，引物F/R浓度均为400nmol/L。反应在ABI7300荧光定量PCR仪(ABI公司)上进行。以含有PCV2全基因序列的质粒pMD18-PCV2，为标准样品。纯化后经紫外分光光Real-timePCR反应，根据各稀释度Ct值得出检测范围，并绘制标准曲线。结果见表3及图1。结果表明，当接种病毒达到120小时时，病毒含量达到最高。

表3PCV2在PK15细胞及PKK细胞上增殖情况对比

组别	24h	48h	72h	96h	120h
						PK15	11.74	12.52	12.56	12.78	12.92
PKK	13.41	13.69	13.78	13.82	13.93

实施例5

PKK细胞系在制备猪圆环病毒2型灭活疫苗中的应用

1抗原的制备

取PKK细胞，经胰蛋白酶消化传代，加入含5％胎牛血清的MEM细胞培养液，37℃培养，形成良好细胞单层，以M.O.I.＝0.1接种PCV2SH株病毒液，加入含2％胎牛血清的MEM细胞维持液，继续培养至细胞80％以上病变时收获病毒液，冰冻于-20℃，经冻融后用IFA测定病毒含量，PCV2滴度达10^7.0/TCID₅₀/mL。

然后加入0.02％灭活剂BEI灭活37℃灭活72h，然后37℃加入10％V/V(0.1M)硫代硫酸钠终止BEI活性，然后将灭活后的病毒液于-20℃冷冻保存备用。

2疫苗的配制

取上述步骤制备的PCV2病毒液按1:1比例加入206佐剂(法国SEPPIC公司产品)，充分混合均匀即得猪圆环病毒2型灭活疫苗(成品含有灭活前PCV2病毒液10^6.0/TCID₅₀/mL)。

3疫苗的效力试验

选择30头15-18日龄PCV2ELISA抗体和PCV2抗原阴性断奶仔猪，随机分成3组，10头/组，第1组免疫猪圆环病毒2型灭活疫苗，颈部肌肉注射免疫，2ml/头，两周后用相同免疫剂量加强免疫一次；第2组为攻毒对照组；第3组为空白对照组，只接种钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA)和巯基乙酸培养基。二免后3周用PCV2病毒攻击，肌肉注射，3×10^5.0TCID₅₀/头，攻毒后第4、7天分别在猪的两腋下及两臀部分四点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA,0.5mg/ml)，4mL/头，腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19天仅腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。检测指标：(1)分别于首免后14、21、35天采血，测定ELISA抗体和中和抗体效价，观察抗体产生动态。(2)攻毒后1-20天测量体温，观察临床症状。(3)组织病理学观察。

ELISA抗体检测用大肠杆菌表达的PCV2-ORF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，37℃作用2h后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min；每孔加200μL的0.15％BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μL，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标的SPA(1:10000倍稀释)，100μL/孔，37℃作用1h；洗涤；加底物液TMB(3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺)显色，最后用2mol/L的H₂SO₄终止反应。结果判定：待检血清OD₄₅₀值/阴性血清OD₄₅₀值≥2.1为阳性。

血清中和试验采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30min，10000rpm离心5min，小心吸出上清，做1:2稀释后进行倍比稀释；分别与等量100TCID₅₀PCV2病毒液混合，37℃1h，接种于含PKK细胞单层的96孔板内，100μl/孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37℃继续培养48h，80℅丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50％特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。

按常规方法进行病理解剖，观察脏器病理变化，并采集肺脏、脾脏、淋巴结等脏器4％福尔马林固定后，制备石蜡切片，HE染色，显微镜观察组织病变。

免疫后14天，免疫组能检测到PCV2抗体；首免疫后35天，疫苗免疫组ELISA抗体和中和抗体效价分别达1:3200和1:32以上，而且，ELISA抗体和中和抗体水平基本一致。结果见表4。

表4仔猪攻毒保护试验抗体检测结果

攻毒对照组所有猪攻毒后第1～3周体温升高(>40℃)，持续3～6天，攻毒后第10天出现被毛粗乱、食欲减退现象，第11天有1头死亡；空白对照猪在整个攻毒期中体温始终保持正常，无异常临床表现。疫苗免疫的猪，攻毒后第1周有2～3头猪出现体温超过40℃，持续1～2天，但均未见到明显异常临床表现。疫苗保护效率100％。结果见表5。

表5攻毒后20天内猪只临床症状统计结果

※:被毛粗乱，皮肤苍白，食欲减退，有死亡现象。

为了评价疫苗对猪体的保护效果，我们分别在攻毒前及宰杀时对猪体进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗免疫组猪相对日增重与空白对照组相似(P＝0.48>0.05)，但明显高于非免疫攻毒对照组(P＝0.02<0.05)，证明疫苗均有较好免疫保护作用。

攻毒后第11天，攻毒对照猪1头死亡，病理剖解表现为肺脏出血、弹性变低，腹股沟、髂下、颌下、肠系膜淋巴结肿胀、出血，脾脏边缘轻微出血等。攻毒后第20天，即试验结束时，扑杀所有试验猪，进行病理解剖和组织病理学检查。试验结果表明非免疫攻毒对照组猪有明显肉眼病理变化，淋巴结组织中淋巴细胞缺失、巨噬细胞浸润、包涵体病变；肺脏组织有单核细胞浸润；而免疫猪病理变化很不明显。具体结果见表6。

表6攻毒猪病理变化统计结果

本研究用猪圆环病毒2型灭活疫苗接种仔猪，结果均无异常临床表现，仔猪免疫后14天产生ELISA抗体和中和抗体，首免后35天攻毒，无异常临床表现和病理变化，免疫保护效率达100％，免疫效果良好。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将猪肾细胞按照有限稀释法进行细胞克隆和亚细胞克隆，获得亚细胞克隆株；

2)选择对猪圆环病毒2型感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株进行细胞培养；

3)将步骤2)培养成单层的猪肾细胞亚克隆株加入孵育剂进行孵育；

4)弃去步骤3)的孵育剂及脱落细胞；

5)将步骤4)剩余的贴壁细胞经消化传代，以细胞生长液进行培养，即得猪圆环病毒2型敏感细胞系。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤1)使用的猪肾细胞为未被猪圆环病毒2型感染的猪肾细胞，经胰蛋白酶消化为单细胞后进行滴度稀释，分别在37℃5％CO₂的条件下培养于96孔细胞培养板中培养至肉眼可见细胞克隆后，进行亚细胞培养，获得亚克隆细胞株。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤2)为将猪肾细胞亚克隆株接种到96孔细胞培养板中，接种猪圆环病毒2型于37℃5％CO₂的条件下培养2小时，使用间接免疫荧光法检测感染病毒最多的细胞，选择对猪圆环病毒感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖；更优选地，所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖；最优选地，所述孵育剂为浓度为300mmol/L的D-氨基葡萄糖。

5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育剂孵育时间为25-35分钟；更优选地，所述的孵育时间为30分钟。

6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，优选地，步骤(5)所述的细胞生长液为含50～100μg/mlDEAE-Dextran和5％体积百分比的胎牛血清的MEM。

7.一种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系用于高滴度的猪圆环病毒2型的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系用胰蛋白酶消化后，同步接种猪圆环病毒2型，37℃含5％CO₂温箱中培养4-5d，细胞脱落病变达80％以上，收获即可获得高滴度的猪圆环病毒2型病毒液。

8.根据权利要求7所述的高滴度的猪圆环病毒2型的制备方法，其特征在于，所述的收获的高滴度猪圆环病毒2型病毒液滴度为≥10^7.0TCID₅₀/ml。

9.一种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养猪肾克隆细胞；

2)增殖病毒；

3)收获病毒，灭活，加入佐剂制备灭活疫苗。

10.一种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗。