CN103364560A

CN103364560A - 一种测定杆状病毒滴度的方法

Info

Publication number: CN103364560A
Application number: CN2013103097875A
Authority: CN
Inventors: 李晶梅; 朱薇; 温文生; 漆世华; 谢红玲; 靖志强; 李建; 秦红刚; 廖园园
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明公开了一种测定杆状病毒滴度的方法，该方法包括如下步骤：将对数生长期的昆虫细胞以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养；弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察；计算病毒的TCID₅₀。本发明测定杆状病毒滴度的方法结合了间接免疫荧光，是一种直接判定各孔细胞是否感染的TCID₅₀测定方法，重复性好，得到的检测结果更为准确，不需要结合细胞病变来进行判断，没有主观和经验因素的影响。

Description

一种测定杆状病毒滴度的方法

技术领域

本发明涉及病毒滴度（含量）测定，具体涉及一种测定杆状病毒滴度的方法。

背景技术

昆虫杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是一种能够高效表达外源基因的真核表达载体系统。以苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV）为基本研究模型的BEVS是功用最多的、应用最广泛的真核细胞表达载体系统之一。以AcMNPV为基本研究模型的BEVS已经充分商品化，包括多种商品化的载体、高效的转染试剂、培养基，并且有成熟的构建方法和成功案例。优化最适病毒感染量（MOI）是提高BEVS外源基因表达量的重要手段，所以需要精确定量杆状病毒滴度。常用的杆状病毒滴度测定方法包括噬斑法、终点稀释法、比色指示剂法、荧光定量PCR方法等，还有用于测定杆状病毒滴度的商品化试剂盒，比如BACPAC商品化检测试剂盒、Fastplas商品化检测试剂盒。

1）噬斑法是测定病毒滴度最经典的方法，接毒后在细胞上铺琼脂凝胶，培养5～8天，计数噬斑，通过噬斑数和稀释度的换算，获得病毒效价。噬斑法方法操作繁琐，并且要求操作者有一定的操作经验。

2）终点稀释法是以50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）表示，接毒后细胞培养5～8天，显微镜下观察细胞病变（CPE），判定各孔是否感染。需要杆状病毒感染细胞使细胞出现明显的CPE，凭经验进行判断，在细胞病变并不十分明显的情况下有漏检的可能，即主观和经验因素对检测结果的影响较大。

3）比色指示剂法是通过检测细胞活性、间接判断各孔是否感染。比色指示剂法实质也是一种终点稀释法，在结果判定步骤中引入比色指示剂操作，通过颜色变化判断各孔细胞是否感染病毒。噻唑蓝（MTT）是常用试剂之一，使用MTT作为比色指示剂的杆状病毒滴度测定的方法俗称MTT法。

4）荧光定量PCR方法通过定量病毒核酸而定量杆状病毒，不能区分病毒死活。

5）BACPAC商品化检测试剂盒是基于gp64蛋白和gp64单克隆抗体的检测试剂盒，显色系统为过氧化物酶和过氧化物酶底物。在噬斑法的基础上进行改进，缩短了检测时间；经由免疫染色检测感染细胞、辨识度高；显微镜下计数病灶，获得病毒效价。

6）Fastplas商品化检测试剂盒是基于gp64蛋白和gp64抗体的检测试剂盒，显色系统为β-gal和X-gal底物。

终点稀释法测定病毒滴度俗称TCID₅₀测定，是使用最为广泛的一种病毒含量测定方法。如前所述，将传统的终点稀释法用于杆状病毒的测定有一定的不足。所谓的不足主要是指低浓度杆状病毒感染细胞引起的细胞病变不明显，结果判断易受操作者的主观因素影响。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种测定杆状病毒滴度的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种测定杆状病毒滴度的方法，包括如下步骤：

（1）昆虫细胞板的制备：将对数生长期的昆虫细胞以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底。

（2）接种杆状病毒：将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养。

（3）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数：弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察，细胞膜显示亮绿色荧光判定该细胞所在孔为阳性孔。

（4）病毒滴度计算：计算病毒的TCID₅₀。

步骤（1）中所述的昆虫细胞优选为Sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞。

步骤（1）昆虫细胞板的制备优选为：将处于对数生长期的、悬浮培养中的昆虫细胞，用培养基稀释，稀释后的细胞液以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的细胞密度铺到96孔细胞培养板，置27℃培养箱中培养1小时，昆虫细胞贴于孔底，备用。

步骤（2）接种杆状病毒优选为：将被检的杆状病毒进行10倍系列稀释，取适当稀释度的杆状病毒液接种于96孔细胞培养板，0.1mL/孔，每个稀释度6～8个重复，置27℃培养箱中培养，4～6天。

步骤（3）中所述的gp64单抗优选为针对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV）膜蛋白gp64的，gp64单抗可以是通过自行筛选杂交瘤细胞株制备获得的，也可以是通过购买商品化的gp64单抗获得的；gp64单抗是针对AcMNPV膜蛋白gp64，因此该方法适用于基于AcMNPV的杆状病毒。

步骤（3）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数优选为：弃去细胞板内培养基，80%（V/V）丙酮固定10～20min，PBS洗细胞板，加入gp64单抗孵育，PBS洗细胞板，加入羊抗鼠荧光抗体孵育，PBS洗细胞板，荧光显微镜下观察，细胞膜显示亮绿色荧光判定该细胞所在孔为阳性孔；所述的80%丙酮优选为-20℃的80%丙酮。

步骤（4）中所述的TCID₅₀的计算优选为用Reed-Muench法。

本发明提供的测定杆状病毒滴度的方法是一种改良的终点稀释法，也可以说是结合了间接免疫荧光（IFA）的TCID₅₀测定方法。原理为：gp64蛋白是杆状病毒的膜蛋白之一，感染了杆状病毒的细胞在细胞膜上存在gp64蛋白，用gp64单抗检测gp64蛋白，再通过羊抗鼠荧光抗体检测gp64单抗，在荧光显微镜下观察细胞的荧光，直接判定细胞是否被杆状病毒感染，通过稀释度换算确定病毒滴度。

本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：

本发明测定杆状病毒滴度的方法结合了IFA的TCID₅₀测定方法，是一种直接判定各孔细胞是否感染的TCID₅₀测定方法，重复性好，得到的检测结果更为准确，不需要结合细胞病变来进行判断，没有主观和经验因素的影响。该方法适用于所有基于AcMNPV的杆状病毒。

附图说明

图1是测定杆状病毒滴度的方法的操作流程图。

图2是显微镜下观察结果图，A：感染重组杆状病毒的Sf9细胞（紫外光、400倍放大）；B：健康Sf9细胞（紫外光、400倍放大）；C：部分细胞感染重组杆状病毒（可见光、100倍放大）；D：部分细胞感染重组杆状病毒（与C同一视野，紫外光、100倍放大）。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明测定杆状病毒滴度的方法的操作流程图如图1所示。

实施例1 测定Bac-HANA株重组杆状病毒滴度

（1）材料

Sf9细胞为一种常用的昆虫细胞，购自invitrogen公司；基于AcMNPV的重组杆状病毒Bac-HANA（一种表达禽流感HA和NA基因的重组杆状病毒，构建方法见申请号为CN200910104637.4的专利）；gp64单抗为ebioscience公司产品；羊抗鼠荧光抗体为Thermo公司产品；SF900Ⅱ无血清培养基为Gibco公司产品；PBS（0.01M，pH7.2）。

（2）操作方法

1）Sf9细胞板的制备：Sf9细胞以SF900Ⅱ无血清培养基在摇瓶中进行悬浮培养，摇床转速110rpm，培养温度27℃。处于对数生长期的、悬浮培养中的Sf9细胞，以SF900Ⅱ无血清培养基稀释，稀释后的细胞液以3×10⁴/0.1mL/孔的细胞密度铺到96孔细胞培养板，置27℃培养箱中静置培养1小时，Sf9细胞贴于孔底，备用。

2）接种杆状病毒：被检的杆状病毒（Bac-HANA）以SF900Ⅱ无血清培养基进行10倍系列稀释，取10^-4～10^-85个稀释度的杆状病毒液接种于96孔细胞培养板，0.1mL/孔，每个稀释度8个重复，置27℃培养箱中静置培养5天。

3）目测CPE确定被感染的细胞孔数：通过观察细胞变大、变圆等特征性病变判定感染孔。

4）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数：弃去细胞板内培养基，用-20℃保存的80%（V/V）丙酮固定10～20min，PBS洗细胞板2遍，加入gp64单抗37℃孵育1小时，PBS洗细胞板4遍，加入羊抗鼠荧光抗体37℃孵育1小时，PBS洗细胞板4遍，纯化水洗细胞板1遍，荧光显微镜下观察，判定感染孔。

5）TCID₅₀计算：用Reed-Muench法计算。

（3）结果

倒置荧光显微镜下观察经IFA操作的Sf9细胞，感染重组杆状病毒的细胞膜有亮绿色荧光，没有感染重组杆状病毒的阴性细胞无任何荧光信号（图2A、B），容易区分感染细胞和非感染细胞孔。图2C与图2D为同一视野，不同光下的情况。其中，图2D为紫外光下，感染细胞和非感染细胞清晰可辨，图2C为可见光下，感染细胞和非感染细胞很难区分。所以结合了IFA的TCID₅₀测定方法，感染和非感染细胞的辨识度更高，检测结果更为可信。

经三次重复测定Bac-HANA 株重组杆状病毒，含量分别为10^8.33TCID₅₀/mL、10^8.2TCID₅₀/mL、10^8.5TCID₅₀/mL。说明该方法重复性好，不同时间测定同一样品，得到的结果相同或相近。

三次重复测定Bac-HANA 株重组杆状病毒含量，在IFA操作之前通过目测法判定CPE确定病毒含量（也就是常规的终点稀释法），含量分别为10^7.0TCID₅₀/mL、10^7.5TCID₅₀/mL、10^7.2TCID₅₀/mL，并且10^-6稀释度某些孔的CPE不是很明显。本发明的方法比常规的终点稀释法测定的结果数值高，是方法敏感性不同所致。以本发明的方法测定的病毒含量，结果判定步骤受人为因素影响小，所以结果更为客观。

实施例2 测定Bac-2ORF2株重组杆状病毒滴度

（1）材料

Sf9细胞为一种常用的昆虫细胞，购自invitrogen公司；基于AcMNPV的重组杆状病毒rBac-2ORF2（一种表达圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒，构建方法见申请号为CN201210270504.6的专利）；gp64单抗为ebioscience公司产品；Cap蛋白单抗为美国RTI公司产品，羊抗鼠荧光抗体为Thermo公司产品；SF900Ⅱ无血清培养基为Gibco公司产品；PBS（0.01M，pH7.2）。

（2）操作方法

2）接种杆状病毒：被检的杆状病毒以SF900Ⅱ无血清培养基进行10倍系列稀释，取10^-4～10^-85个稀释度的杆状病毒液接种于96孔细胞培养板，0.1mL/孔，每个稀释度8个重复，置27℃培养箱中静置培养5天。

3）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数：弃去细胞板内培养基，用-20℃保存的80%（V/V）固定10～20min，PBS洗细胞板2遍，加入gp64单抗37℃孵育1小时，PBS洗细胞板4遍，加入羊抗鼠荧光抗体37℃孵育1小时，PBS洗细胞板4遍，纯化水洗细胞板1遍，荧光显微镜下观察，判定感染孔。

4）TCID₅₀计算：用Reed-Muench法计算；

5）以上操作进行时，用Cap蛋白单抗进行平行操作，比较gp64单抗和Cap单抗的TCID₅₀测定结果。

（3）结果

gp64单抗做为一抗，三次重复测定rBac-2ORF2株重组杆状病毒，含量分别为10^8.0TCID₅₀/mL、10^8.2TCID₅₀/mL、10^8.0TCID₅₀/mL；Cap单抗做为一抗，三次重复测定rBac-2ORF2株重组杆状病毒，含量分别为10^8.2 TCID₅₀/mL、10^8.2TCID₅₀/mL、10^7.8TCID₅₀/mL。分别用gp64单抗和Cap单抗的测定rBac-2ORF2重组杆状病毒的TCID₅₀，得到的结果相同或相近。说明用IFA方法测定病毒的TCID₅₀含量时，使用杆状病毒的固有膜蛋白gp64的单抗和重组杆状病毒表达的目的蛋白的单抗，有着相同的测定效果。

综合分析实施例1和实施例2的结果，Bac-HANA株重组杆状病毒、rBac-2ORF2株重组杆状病毒是基于AcMNPV重组杆状病毒，虽然表达不同的蛋白，但都能被gp64单抗识别，显微镜下Sf9细胞被感染有亮绿色荧光，说明本发明测定杆状病毒滴度的方法普遍适合于基于AcMNPV重组杆状病毒的TCID₅₀含量测定方法。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）昆虫细胞板的制备：将对数生长期的昆虫细胞以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；

（2）接种杆状病毒：将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养；

（3）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数：弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察，细胞膜显示亮绿色荧光判定该细胞所在孔为阳性孔；

（4）病毒滴度计算：计算病毒的TCID₅₀。

2.根据权利要求1所述的测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的昆虫细胞为Sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞。

3.根据权利要求1所述的测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于：步骤（1）昆虫细胞板的制备为：将处于对数生长期的、悬浮培养中的昆虫细胞，用培养基稀释，稀释后的细胞液以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的细胞密度铺到96孔细胞培养板，置27℃培养箱中培养1小时，昆虫细胞贴于孔底，备用。

4.根据权利要求1所述的测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于：步骤（2）接种杆状病毒为：将被检的杆状病毒进行10倍系列稀释，取适当稀释度的杆状病毒液接种于96孔细胞培养板，0.1mL/孔，每个稀释度6～8个重复，置27℃培养箱中培养，4～6天。

5.根据权利要求1所述的测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的gp64单抗是针对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒膜蛋白gp64的。

6.根据权利要求5所述的测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于：所述的测定杆状病毒滴度的方法适用于基于苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒的杆状病毒。

7.根据权利要求1所述的测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于：步骤（3）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数为：弃去细胞板内培养基，80%丙酮固定10～20min，PBS洗细胞板，加入gp64单抗孵育，PBS洗细胞板，加入羊抗鼠荧光抗体孵育，PBS洗细胞板，荧光显微镜下观察，细胞膜显示亮绿色荧光判定该细胞所在孔为阳性孔。

8.根据权利要求7所述的测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于：所述的80%丙酮为-20℃的80%丙酮。

9.根据权利要求1所述的测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的TCID₅₀的计算用Reed-Muench法。