MÉTODO DE DIAGNOSTICO VIRAL Y POZO PARA USO EN EL MISMO Campo de la Invención La presente invención se refiere a un pozo único de base plana adecuado para utilizarse en un método de diagnóstico viral. Más particularmente, el pozo tiene una base planar o plana, como opuesta a una base curva. La invención también se refiere a un método de diagnóstico viral que emplea tales pozos únicos. En una modalidad de este método se emplea un medio de cultivo de tejido especialmente desarrollado complementado con hormonas y enzimas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los procedimientos de diagnóstico convencionales para identificar virus incluyen contenedores para siembra con líneas celulares particulares seleccionadas por su sensibilidad para ciertos virus y después inocular el cultivo celular con una muestra biológica, conteniendo putativamente un virus. Tales muestras biológicas incluyen entre otras cosas, saliva, orina, heces, fluido cerebroespinal (CSF) , fluidos respiratorios y muestras tales como provenientes de la boca, cavidad nasal, garganta, piel y genitales. El cultivo celular inoculado se incuba entonces y las células se examinan para efectos citopáticos inducidos por el virus. Como ciertos virus solo se desarrollan en ciertas células, el virus puede identificarse sobre la base del tipo celular en el cual ya sea se induce un efecto citopático (CPE) o no se
- - induce un efecto citopático. Existe un número de protocolos alternativos para este procedimiento incluyendo someter las células que se han inoculado con una preparación del virus mediante tripsonización para retirar las células, seguido por la detección del virus utilizando anticuerpos monoclonales específicos para polipéptidos derivados virales que se etiquetan con una molécula informadora tal como una molécula de fluoresceína (FITC). Una alternativa adicional es incluir un cubreobjetos dentro de un tubo de cultivo a fin de mejorar la recuperación de las células. El método convencional (o de tambor tradicional) utiliza tubos con tapa de rosca que se siembran con lineas celulares apropiadas. Después de que las células alcanzan aproximadamente un 80% de confluencia, el tubo se inocula con un espécimen apropiado y se monitorea por CPE por hasta tres semanas. Se requiere un monitoreo diario del CPE durante la primera semana. Es necesario el monitoreo menos frecuente para la segunda y tercera semanas. Con frecuencia, se requiere el pasaje a ciegas para mejorar la recuperación del virus . Una de las desventajas de este método es que se requiere el tiempo y una labor intensa debido al monitoreo diario de los tubos. Generalmente, dos personas inspeccionan el mismo tubo para CPE mediante microscopio óptico para
evitar la subjetividad. Además, no todos los virus provocan un CPE visible y aquellos que no, son incapaces de detectarse por este método. Además, la formación de CPE monitoreado en el método de tubo convencional es altamente dependiente de la sensibilidad de las líneas celulares y la capacidad del virus para producir un CPE visible. La toxicidad del espécimen también puede producir cambios de manera desventajosa similares al CPE viral dando un resultado falso. También algunos virus producen CPE solo después de un largo periodo de tiempo (por ejemplo Citomagalovirus (CMV) ) . Asi, a medida que se obtienen los resultados mediante el método de tubo convencional se basan predominantemente en la detección de CPE y no se confirman de forma habitual por cualquier otro método, pudiendo ocurrir un diagnóstico inadecuado. Otra limitación del método de tubo convencional es que es difícil de utilizar más de 2 o 3 tubos por espécimen debido a la acumulación resultante de los tubos. Por ejemplo, 40 especímenes por día crearían 500 tubos para analizarse solo en la primera semana. El método de centrifugación y cultivo es actualmente el método más avanzado utilizado por aquellos en la materia para recuperar virus. Este método emplea el uso de un vial de plástico de 5 ml (de centrifugación y cultivo) , de 16 mm de diámetro que tiene una tapa translúcida. Después de un tratamiento apropiado, un cubreobjetos redondo (13 mm)
- - se inserta en el vial. El vial se siembra entonces con una linea celular sensible que desarrolla una monocapa sobre el cubreobjetos. Cuando la monocapa celular alcanza aproximadamente 80-90% de confluencia, el medio se elimina, la monocapa se inocula con el espécimen del paciente y el vial se incuba. Después, el vial incubado se monitorea por CPE, seguido por el retiro del cubreobjetos. La prueba puede entonces fijarse a un portaobjetos del microscopio y se tiñe con anticuerpos monoclonales. La ventaja del método de centrifugación y cultivo es que puede mejorarse la recuperación de los virus mediante la centrifugación de los viales después de la inoculación la cual puede acortar la duración de tiempo tomado para obtener los resultados en tan poco como en 2-3 días. Además, utilizando el método de centrifugación y cultivo no existe la necesidad de esperar un CPE visible. El cubreobjetos puede retirarse en el segundo o tercer día y teñirse con anticuerpos monoclonales apropiados y confirmarse los resultados utilizando el teñido del antígeno del anticuerpo. Sin embargo, el método de centrifugación y cultivo tiene varias desventajas. Es tardado ya que los cubreobjetos requieren un tratamiento especial; tal como múltiples lavados con detergente y acetona seguido por el lavado con agua destilada y la esterilización. Los cubreobjetos también tienen que insertarse manualmente en los viales. Además, si
- - es necesario el teñido inmunofluorescente, el procedimiento se vuelve aún más complicado y tardado. El medio para el método de centrifugación y cultivo tiene que eliminarse y el cubreobjetos retirarse manualmente utilizando pinzas específicas, secado al aire y fijarse a un portaobjetos del microscopio, utilizando grasa al vacío. El retiro de los cubreobjetos es tedioso, ya que los cubreobjetos pueden romperse mediante manipulación ruda o voltearse de manera no intencional o fijarse al portaobjetos del microscopio con el lado superior de la monocapa hacia abajo. Puede surgir otra complicación si las células sembradas también se desarrollan en la parte inferior del cubreobjetos, ocasionando así que el cubreobjetos se fije al vial y haga muy difícil el retiro del cubreobjetos. Prácticamente, como para el método de tubo convencional, utilizando el método de centrifugación y cultivo es imposible utilizar más de 2 o 3 tubos por espécimen debido a la acumulación de los tubos (i.e., 40 especímenes por día crea 500 centrifugaciones y cultivos por semana) . Además, se requiere una gran cantidad de anticuerpos monoclonales para el teñido de inmunofluorescencia a fin de cubrir el cubreobjetos redondo de 13 mm. El método de placa de 96 pozos es otro método que se utiliza solo en casos limitados para la recuperación de virus que se desarrollan en la misma linea celular. Por
ejemplo, si los pozos se siembran con la línea celular LLC-MK2, es posible la recuperación de los virus de parainfluenza y también de influenza. El método de placa de 96 pozos tiene las ventajas en que es relativamente fácil inocular líneas celulares sembradas con un espécimen particular. Además, también es posible que pueda inocularse un gran número de especímenes sobre la misma placa y aumentarse mediante centrifugación. Aún además, el método de placa de 96 pozos solo utiliza una pequeña cantidad de los medios (0.3 ml en lugar de 1-1.5 ml utilizado en el método de centrifugación y cultivo) , pueden utilizarse técnicas de antígeno-anticuerpo para la confirmación de los resultados y el método también permite la facilidad para "leer" el monitoreo de CPE. Sin embargo, el método de placa de 96 pozos también tiene sus desventajas. La placa completa debe utilizarse para la detección del antígeno-anticuerpo que no es generalmente práctico y toda la placa tiene que utilizarse en el mismo - día, aún cuando el número de especímenes es más pequeño que el requerido para la placa completa. Esto significa que por cada día, debe utilizarse un nuevo conjunto de placas diferentes. Esto resulta desventajoso en una situación en donde, una vez que se completa la detección, no existen células restantes disponibles para un procedimiento de repetición en el caso de un error o después de un periodo de incubación prolongado. Además, comúnmente solo pueden
- utilizarse una o dos lineas celulares diferentes por placa y el mismo tipo de espécimen inoculado sobre la placa. La metodología de pozo único, como se describe en la Patente de Inovación Australiana No. 2001100242, alivia los problemas asociados con los métodos convencionales antes descritos y proporciona un proceso alternativo, efectivo y económico para conducir el diagnóstico viral. La descripción de esa patente se incorpora en la presente en su totalidad mediante la referencia. Los pozos de base plana se conoce que proporcionan ciertas ventajas cuando se utilizan en el contexto de los ensayos de diagnóstico. En particular, proporcionan un análisis más preciso comparado con dichos pozos de base redonda o curva. Sin embargo, los pozos de base plana simples también tienen una desventaja en que tiende a formarse un menisco en la base del pozo dando como resultado la distribución desigual de la solución a través de la base del pozo. A la luz de esto, el inventor ha desarrollado un pozo de base plana que alivia este problema como se describe abajo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con esto, en un primer aspecto de la invención proporciona un pozo de base plana para utilizarse en un ensayo, comprendiendo el pozo: una cámara principal que tiene una abertura para
recibir una muestra líquida, paredes laterales que se extienden desde la abertura y una base de cámara; y una sub-cámara que se extiende desde la base de cámara de la cámara principal y que se adapta para recibir una cantidad predeterminada de la muestra liquida, en donde la sub-cámara tiene una base plana . Ventajosamente, este ordenamiento asegura que la muestra líquida colocada en la sub-cámara no pueda formar un menisco arriba de las paredes laterales de la cámara principal. Más bien, una muestra líquida colocada en la sub-cámara puede retener una superficie convexa que se extiende desde la sub-cámara hacia y/o en la cámara principal. El ordenamiento también asegura que la superficie base sobre la cual descansa cualquier muestra líquida es plana, proporcionando un análisis más preciso como se describió previamente arriba. En otra modalidad la invención proporciona una unidad de pozos, que comprende uno o más de los pozos únicos de base plana de acuerdo con la invención. En una modalidad adicional la invención proporciona un método para llevar a cabo un ensayo, comprendiendo dicho método utilizar un pozo único de base plana de acuerdo con la invención o utilizar una unidad de pozos de acuerdo con la
- - invención . Aún otro aspecto de la invención proporciona un método para detectar un virus, comprendiendo dicho método: proporcionar uno o más pozos únicos de base plana de acuerdo con la invención como se describe en la presente sembrados con una línea celular preseleccionada; inocular un espécimen para analizarse en uno o más pozos; y examinar uno o más virus preseleccionados en el uno o más pozos En una modalidad adicional la invención proporciona un método para detectar un virus comprendiendo dicho método: proporcionar un pozo único de base plana de acuerdo con la invención como se describe en la presente sembrado con una línea celular adecuada para la inoculación de virus; el pre-tratamiento específico de un espécimen para obtener una muestra que contiene potencialmente un virus a detectarse; inocular la línea celular con la muestra; incubar la línea celular inoculada; reemplazar el medio de muestra de la línea celular inoculada con un medio de recuperación de virus que comprende un medio de cultivo celular complementado
- - con al menos una hormona y al menos una enzima; incubar la linea celular inoculada; y analizar la línea celular incubada para la presencia de un virus. En aún otra modalidad la invención proporciona el uso de un pozo único de base plana o el uso de una unidad de pozos de acuerdo con la invención, en un ensayo. Otro aspecto de la invención proporciona el uso de un pozo único de base plana de acuerdo con la invención en un método para detectar un virus, comprendiendo dicho método; proporcionar uno o más pozos únicos de base plana de acuerdo con la invención como se describe en la presente sembrado con una línea celular preseleccionada; inocular un espécimen para analizarse en uno o más pozos; y examinar uno o más virus preseleccionados en el uno o más pozos. En una modalidad adicional la invención proporciona el uso de un pozo único de base plana de acuerdo con la invención en un método para detectar un virus, comprendiendo dicho método: proporcionar un pozo único de base plana de acuerdo con la invención como se describe en la presente sembrado con una línea celular adecuada para la
inoculación de virus; el pre-tratamiento específico de un espécimen para obtener una muestra que contiene potencialmente un virus a detectarse; inocular la línea celular con la muestra; incubar la línea celular inoculada; reemplazar el medio de muestra con un medio de recuperación de virus que comprende un medio de cultivo celular complementado con al menos una hormona y al menos una enzima; incubar la línea celular inoculada; y analizar la linea celular incubada para la presencia de un virus. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las modalidades de la presente invención se ilustran con los dibujos acompañantes no limitantes en los cuales : La Figura 1 es una representación esquemática que ilustra una vista en perspectiva del pozo; La Figura 2 es una representación esquemática que ilustra una vista lateral seccional del pozo; La Figura 3 es una representación esquemática que ilustra una vista inferior del pozo; y La Figura 4 es una representación esquemática que ilustra una configuración de pozo típica para un arreglo de
12 x 8. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La cámara principal y la sub-cámara pueden tomar cualquier forma adecuada, siempre que la sub-cámara se extienda desde la base de cámara de la cámara principal. Los pozos únicos de base plana pueden tomar cualquier forma adecuada, siempre que la base del pozo que recibe el espécimen sea plana. Por ejemplo, los pozos pueden tener una sección transversal circular, cuadrada, triangular o hexagonal. También los pozos pueden ser uniformes en la sección transversal a lo largo de su altura. De manera alternativa los pozos pueden ahusarse hacia su parte superior o su extremo inferior. Se apreciará que los pozos se formarán utilizando materiales estándar como se utiliza para los arreglos de bandejas de micro titulación convencionales y mediante técnicas estándar. Preferentemente, la cámara principal tiene una sección transversal cuadrada y la sub-cámara tiene una sección transversal circular. El arco del lado circular de la sub-cámara, en esta modalidad, preferentemente se extiende hacia el borde de cada lado de la cámara principal. Esto se apreciará a partir de las figuras acompañantes que ilustran mejor esta característica. Típicamente la sub-cámara puede contener un volumen predeterminado de aproximadamente 30 µl en total, de tal
- manera que en la sub-cámara una muestra líquida forma una gota teniendo ventajosamente una superficie convexa que se extiende desde la abertura de la sub-cámara y además, de tal manera que la profundidad del líquido es sustancialmente constante a través de la sub-cámara, aliviando así la desventaja de que se coloque una muestra líquida en un pozo y forme un menisco arriba de las paredes laterales del pozo. Preferentemente la proporción de la altura de la cámara principal en comparación con la sub-cámara es de 10:1 y la proporción del ancho de la cámara principal en comparación con la sub-cámara se encuentra entre 2:1 y 1:1. En una modalidad preferida, la altura del pozo es de llmm, incluyendo una altura de lOmm para la cámara principal y una profundidad de lmm para la sub-cámara. El ancho del pozo es generalmente de 8mm y tiene una grosor de pared de aproximadamente lmm y el ancho interno de la sub-cámara es de aproximadamente 6mm. Así la cámara principal típicamente permite un volumen de aproximadamente 360 µl y la sub-cámara típicamente permite un volumen de aproximadamente 28.3 µl . Esta modalidad particular puede proporcionar igualmente ventajas si los pozos de utilizan en una unidad de pozos. Por ejemplo, en donde se unen un número de pozos y no se utilizan de manera individual. Así, de acuerdo con una modalidad alternativa de la invención se proporciona una unidad de pozos que incluye más de uno de los pozos de
acuerdo con la invención. Una unidad de pozos puede ser por ejemplo de una configuración de placa de 96 o 48 pozos o una unidad como se describe en la Patente de Inovación Australiana No. 2001100242. Se apreciará por un experto en la materia que en el contexto de algunos métodos de ensayo en donde se requieren pozos para insertarse en una placa, que los pozos puedan proporcionarse con medios para facilitar el embrague con la placa de pozos en donde se insertan. Por ejemplo, los pozos pueden ahusarse como se mencionó arriba para proporcionar un ajuste por fricción en un receptáculo de la placa de pozo. De manera alternativa, los pozos pueden proporcionarse con una acanaladura o una indentación o ranura que coopera con el receptáculo de la placa en que el pozo se inserta. En algunos casos, los pozos pueden desalojarse de la placa de pozos durante el análisis o durante el transporte de la placa. Como tal, en una modalidad preferida los pozos incluyen alguna forma de identificación, tal como codificación o marcación por color. Los pozos pueden por ejemplo tener marcaciones que indican su posición (columna y fila) sobre la placa. Para ayudar al análisis, los pozos pueden también incluir una base plana que se proporciona con divisiones marcadas. Por ejemplo, la base plana de cada pozo puede incluir una línea delgada transversal que divide la base
- - plana en cuatro cuartos. Así, el análisis de un cuarto proporcionará datos útiles para el análisis de la base plana como un todo. Se apreciará que cualquier número de divisiones de la base plana puede ser adecuado para este propósito. Los pozos de la invención tienen una variedad extremadamente amplia de usos. Hablando ampliamente, los pozos de la presente invención son útiles para ensayos. El experto reconocerá que tales ensayos incluyen pero no se limitan a los Ensayos Inmunoabsorbentes enlazados a la Enzima (ELISA) , cultivo celular bacterial, técnicas de amplificación por PCR, técnicas de cristalización de proteína, prueba de susceptibilidad anti-viral y técnicas de selección química y de droga. En una modalidad por ejemplo, los pozos de la invención son útiles para ensayos de diagnóstico viral. Como se utiliza en la presente, la referencia a un ensayo debe entenderse como la referencia a cualquiera de las técnicas de laboratorio convencionales que utilizan pozos de micro titulación. De acuerdo con esto, en un segundo aspecto la invención proporciona un método para detectar un virus comprendiendo dicho método: proporcionar uno o más pozos únicos de base plana de acuerdo con la invención como se describe en la presente sembrado con una línea celular
- - preseleccionada; inocular un espécimen para analizarse en el uno o más de los pozos; y examinar uno o más de los virus preseleccionados en el uno o más pozos. En una modalidad la invención proporciona un método para llevar a cabo un ensayo utilizando dicho método uno o más de los pozos únicos de base plana de acuerdo con la invención como se describe en la presente. Preferentemente el ensayo es un ensayo de diagnóstico viral. En una modalidad adicional la invención proporciona un método para detectar un virus comprendiendo dicho método: proporcionar un pozo único de base plana de acuerdo con la invención como se describe en la presente con una línea celular adecuada para la inoculación de virus; el pre-tratamiento específico de un espécimen para obtener una muestra que contiene potencialmente un virus a detectarse; inocular la línea celular con la muestra; incubar la línea celular inoculada; reemplazar los medios de muestra de la línea celular inoculada con medios de recuperación de virus que comprende un medio de cultivo celular complementado con al menos una hormona y al menos
- - una enzima; incubar la línea celular inoculada; y analizar la linea celular incubada para la presencia de un virus. Se apreciará que en este método los medios de muestra tipicamente serán medios de mantenimiento que se han inoculado con la muestra. Como se utiliza en la presente, el término "pozo único de base plana" incluye dentro de su alcance un pozo único que tiene cualquier forma en sección transversal, siempre que la base del pozo que recibe el espécimen sea plana . En el contexto de los aspectos de diagnóstico virales de la presente invención el uso de un pozo único de base plana asegura que el examen para los virus, utilizando técnicas estándar tales como fluorescencia invertida o microscopía óptica, proporcione resultados más exactos, en comparación con por ejemplo el examen de una muestra ubicada en la base de un pozo que tiene una base redonda o ligeramente curva. Los pozos únicos de base plana pueden proporcionarse ya sembrados con una línea celular preseleccionada que se determinará, dependiendo de su adecuabilidad para el desarrollo y el aislamiento del virus o los virus particulares a analizarse. Por ejemplo, la línea
- celular LLC-MK2 es adecuada para la detección de los virus de parainfluenza, MDCK para los virus de influenza; HEP-2 para los virus Sincitiales Respiratorios (RSV) y MRC-5 para citomegalovirus (CMV) , virus de herpes simplex (HSV) , Enterovirus y Rinovirus. Un experto podrá seleccionar la linea celular apropiada para el desarrollo y aislamiento de un virus dado. Se reconocerá que los pozos únicos de base plana sembrados descritos en la presente pueden proporcionarse en una forma adecuada para uso inmediato (i.e., listos para el formato de uso), en el método de ensayo de selección. Un experto en la materia apreciará que en un formato listo para el uso la linea celular preseleccionada se proporcionará usualmente aproximadamente 80-90% de confluente. También se apreciará que la estabilidad en almacenamiento de tal línea celular preseleccionada dependerá de la línea celular particular proporcionada. Alternativamente, los pozos únicos de base plana pueden proporcionarse en una forma adecuada, para almacenamiento a largo plazo. Por ejemplo, los pozos únicos de base plana sembrados pueden proporcionarse congelados utilizando técnicas estándar para la conservación a largo plazo de las células. Por ejemplo, pero sin limitar el proceso de congelamiento de células en cualquier forma, las células pueden desarrollarse a una confluencia adecuada en
- los pozos únicos de base plana y el medio de crecimiento remplazarse con un medio de almacenamiento adecuado. Después de esta etapa, las células pueden someterse a un proceso de enfriamiento y finalmente almacenarse a -70-80 grados Celsius. El medio de almacenamiento puede o no contener un crioconservador . El crioconservador que puede agregarse al medio de almacenamiento no se limita particularmente sino puede incluir DMSO y/o suero. Una persona experta en la materia estaría familiarizada con los crioconservadores adecuados y su uso. No todas las líneas celulares pueden sobrevivir al proceso de congelamiento y un experto reconocerá qué lineas celulares serían adecuadas y no adecuadas a este respecto. Se reconocerá que las líneas celulares proporcionadas en un formato de congelamiento se someterían entonces a un proceso de deshielo apropiado y el medio de almacenamiento reemplazarse con el medio de recuperación de virus. Se apreciará por el experto en la materia que una vez deshieladas las células se desarrollarían comúnmente entonces a 80-90% de confluencia antes de utilizarse en el método de la invención como se describe en la presente. La referencia a la cuestión del pozo de base plana que se "siembra" con una línea celular debe entenderse como la referencia al pozo que se pre-siembra con una línea celular preseleccionada antes de proporcionarse para
- utilizarse en una prueba de diagnóstico viral. De manera alternativa, los pozos sembrados pueden realmente sembrarse subsecuente al proporcionarse para utilizarse en una prueba de diagnóstico viral. La etapa de siembra de los pozos puede incluir las sub-etapas de depositar la línea celular preseleccionada diluida en un medio de crecimiento en los pozos, incubar las células en un incubador de C02 hasta que las células alcanzan aproximadamente 80-90% de confluencia y reemplazar el medio de crecimiento con un medio de mantenimiento. Se apreciará que, cuando múltiples pozos se comparan directamente para el desarrollo y aislamiento de un virus particular, el volumen de los medios en cada pozo debe ser idéntico. En ciertas modalidades, se siembra una pluralidad de pozos con una línea celular preseleccionada para proporcionar un ordenamiento de pozos, por ejemplo un ordenamiento convencional de 12 por 8 para una placa de 96 pozos o un ordenamiento de 6 por 8 para una placa de 48 pozos. De manera alternativa, puede proporcionarse si se desea, un ordenamiento más grande, tal como el ordenamiento de 14 por 8. El número de pozos proporcionado no se limita particularmente. Se apreciará que si se proporcionan tales ordenamientos, diferentes células se sembrarán generalmente en diferentes columnas del ordenamiento, dependiendo de nuevo
- - de los virus a detectarse. Se apreciará que los pozos únicos de base plana pre-sembrados de la invención pueden proporcionarse sellados de manera adecuada para permitir el transporte y para evitar la contaminación y evaporación. Por ejemplo, en el caso de una pluralidad de pozos el sello puede tomar la forma de una cubierta que se ajusta sobre el ordenamiento completo de pozos, tal como una cubierta de placa estándar de 48 o 96 pozos. De manera alternativa, en el caso de un pozo único de base plana, el sello puede tomar la forma de una tapa adecuada que sella el pozo individualmente. En otra alternativa, el sello puede ser una membrana de sellado adecuada . Se apreciará también que la cubierta ya sea para una pluralidad de pozos o para un pozo único de base plana de acuerdo con la invención como se describe en la presente puede contener marcadores para ayudar en su uso. Por ejemplo, la cubierta puede contener un símbolo o letra que represente la línea celular contenida dentro. La etapa de inocular el espécimen a analizarse en una o más células se conduce de acuerdo con procedimientos conocidos. Por ejemplo, esto generalmente involucrará el retiro de una cantidad apropiada del medio de mantenimiento para cada pozo a inocularse y depositar una cantidad, generalmente de aproximadamente 200-300 µl, del sobrenadante
- - del espécimen en cada pozo. Los pozos pueden entonces centrifugarse/incubarse por ejemplo a 4000 rpm a 35°C durante aproximadamente 50-60 minutos dependiendo del tipo de centrifugado utilizado. Después de retirarse de la centrífuga, el inoculado puede retirarse de los pozos, por ejemplo mediante aspiración por vacío y reemplazarse con un medio de mantenimiento o el medio de recuperación de virus adecuado. Esto incluye preferentemente el medio de cultivo celular complementado con una hormona y una enzima. Como se utiliza en la presente, el término "un espécimen a analizarse" incluye los especímenes de muestra obtenidos a partir del sujeto que pueden o nó infectarse con un virus. Por lo tanto la muestra puede contener un virus detectable o puede ser un virus libre. Las muestras adecuadas pueden obtenerse de saliva, suero, orina, heces, fluido cerebroespinal (CSF) , fluidos respiratorios tales como lavados bronquial alveolar y aspiraciones nasofaríngeas y muestras tales como aquellas de la boca, cavidad nasal, garganta, piel y genitales. El espécimen de muestra puede prepararse para utilizarse mediante dilución con un medio adecuado que es compatible con la línea celular y el virus. El sujeto puede ser de cualquier especie animal que pueda infectarse con un virus. Por ejemplo, el sujeto puede ser un ave, pescado o mamífero. En algunas modalidades, el
- sujeto es un mamífero. Los mamíferos adecuados incluyen animales de granja tales como oveja, ganado, cerdos, venados y lo similar, animales de compañía tales como perros, gatos, conejos, conejillos de Indias y lo similar, animales de laboratorio tales como ratones, ratas, monos y lo similar, animales en cautiverio tales como aquellos conservados en zoológicos y humanos. Los mamíferos preferidos son los humanos. En otras modalidades, el sujeto puede ser un ave, particularmente aves de granja tales como gallinas y pavos. Los métodos de pre-tratamiento específicos de especímenes para obtener las muestras adecuadas para la detección de virus son bien conocidos por el experto pero pueden incluirse sin limitarse a sonicación y centrifugación. Como se utiliza en la presente los términos "medio de recuperación de virus" o "medios de recuperación de virus" se refiere a un medio o medios que se utilizan para el desarrollo y aislamiento de virus. Por ejemplo, el medio de recuperación de virus incluye el medio de mantenimiento. Se ha encontrado por el presente inventor que los medios de cultivo celular que se dosificas tanto con hormona como enzima optimiza de manera ventajosa la recuperación del virus al mantener la sensibilidad de la línea celular a su máximo así como ayudar a la unión de los virus a la pared celular y en algunos casos reducir el tiempo tomado para obtener el resultado.
La enzima agregada al medio de cultivo celular no se limita y una persona experta en la materia puede identificar las enzimas adecuadas. En algunas modalidades, el término "enzima" se refiere a una enzima proteolítica. En estas modalidades, la enzima es preferentemente una serina o aspartato proteasa. Las enzimas ejemplificativas incluyen tripsina, quimiotripsina o pepsina. En las modalidades preferidas, la enzima es tripsina. La hormona agregada al medio de cultivo celular no se limita y una persona experta en la materia puede identificar las hormonas adecuadas. En algunas modalidades, el término "hormona" se refiere a corticoesteroides, preferentemente un glucocorticoide. Más preferentemente, la hormona se selecciona a partir de dexametasona, hidrocortisona, cortisona, acetato, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, fludrocortisona, acetato, acetato de desoxicorticosterona (DOCA) y aldoesterona . En una modalidad preferida, la hormona es dexametasona. La hormona puede ser ya sea sintética o que se presente de manera natural. Aunque la combinación de la hormona y la enzima es la modalidad más preferida, alternativamente se ha encontrado que pueden también ser útiles el DMSO (dimetiisulfóxido) y el DEAE (dextrano) . La cantidad de la enzima agregada al medio de
- cultivo se encuentra preferentemente dentro del rango de 1-5 µg/ml y preferentemente aproximadamente 2.5 µg/ml. La concentración de la hormona en el medio de cultivo se encuentra preferentemente dentro del rango de 10"4M-10~6M y preferentemente aproximadamente 10"5M. Sin embargo, en el caso de la dexametasona y la tripsina, las cuales se prefieren, se ha encontrado que un medio de cultivo celular complementado con aproximadamente 2.5 µg/ml de tripsina y dexametasona a una concentración de aproximadamente 10~5 da el resultado óptimo. De acuerdo con esto, una modalidad específica del método de la invención emplea un medio de recuperación de virus que incluye un medio de cultivo celular complementado con 2.5 µg/ml de tripsina y dexametasona a una concentración de 10~5M. El medio de cultivo celular que puede utilizarse de acuerdo con la invención no se limita particularmente. Por ejemplo, estos pueden incluir el medio-199, DMEM, RPMI-1640 o MEM-EAGLE. Sin embargo, como se reconocerá fácilmente existe una amplia variedad de medios diferentes que pueden soportar el crecimiento de las células y que se encuentran fácilmente disponibles para el experto en la materia. Sin embargo, de acuerdo con una modalidad preferida el medio de cultivo celular es MEM-EAGLE. El medio de cultivo celular puede complementarse
- - con aditivos que soportan el crecimiento celular y de virus y tales aditivos se conocen por el experto en la materia. Se sabe que las líneas celulares y/o los virus particulares pueden requerir aditivos específicos para el desarrollo y viabilidad óptimos. Los aditivos ejemplificativos incluyen L-glutamina, amino ácidos, antibióticos, suero, sales de Hank balanceadas, azúcares tales como D-glucosa, sales inorgánicas, vitaminas, rojo de fenilo, amortiguadores tales como HEPES y surfactantes tales como Tween 80. El medio de recuperación de Virus antes descrito puede utilizarse en procedimientos de diagnóstico convencionales para identificar virus tales como el método de tubo y el método de centrifugación y cultivo convencional. Alternativamente, el medio de recuperación de virus puede utilizarse en el método de la invención como se describe en la presente. El medio de recuperación de virus utilizado en el método de la invención puede utilizarse para la recuperación de un número de virus diferentes que son adecuados para el cultivo celular. El experto reconocerá que tales virus incluyen, pero no se limitan a, los virus respiratorios, Parainfluenza 1,2,3,4 (Pl 1,2,3,4), Infleunza A, B (Inf A,B), virus sincitial Respiratorio (RSV) , Adenovirus (AD) , Rinovirus (RH) , Citomegalovirus (CMV) y virus del grupo de Enterovirus (ENT) que consiste de Ecovirus, Coxakievirus,
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Enterovirus y Poliovirus y también virus no respiratorios tales como, pero sin limitarse a, virus de Herpes simplex (HSV) 1,2, virus de Varicela zoster (VZV), Rubéola, paperas, sarampión, rotavirus y poliomavirus . En el método de la invención las células inoculadas pueden incubarse con el espécimen para analizarse utilizando condiciones conocidas. Por ejemplo, las células inoculadas pueden incubarse a 37 °C por un periodo que da como resultado la infección de las células con el virus, tal como 45 a 90 minutos, especialmente 60 minutos. La incubación puede llevarse a cabo en una incubadora y puede llevarse a cabo con centrifugación. El virus puede detectarse utilizando métodos de detección comunes conocidos en la materia tales como técnicas de inmunodetección tales como inmunofluorescencia, teñido, visualización de CPE, técnicas moleculares comúnmente utilizadas tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR), PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) y amplificación en base a la secuencia de ácido nucleico (NASBA) . A fin de preparar los pozos para examen, se emplea generalmente un número de etapas de lavado de acuerdo con la metodología convencional. Por ejemplo, se retira generalmente el medio de mantenimiento y las células se secan al aire en los pozos. Los pozos pueden entonces llenarse con por ejemplo una mezcla fría de metanol-acetona (proporción de
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1:2) y fijarse durante 15 minutos a -25°C. Después que se retira la mezcla, los pozos pueden secarse al aire de nuevo. Los anticuerpos monoclonales especificos pueden entonces agregarse a cada uno de los pozos, dependiendo del virus a detectarse y los pozos incubarse según se necesite. Los anticuerpos monoclonales pueden eliminarse entonces y lavarse de nuevo los pozos. Este proceso puede repetirse con anticuerpos secundarios. Después de un secado final al aire, pueden agregarse al pozo 1-2 gotas de un medio de preparación fluorescente y examinarse los contenidos por inmunofluorescencia . Ahora se hará referencia a los dibujos acompañantes que ilustran las modalidades de la presente invención. Refiriéndose a Figura 1, una modalidad particularmente preferida del pozo único de base plana 10 a utilizarse de acuerdo con la invención incluye una cámara principal 11 que es cuadrada en sección transversal y una sub-cámara 12 que es circular en sección transversal. La sub-cámara 12 se extiende desde una base de cámara 13 de la cámara principal 11. Como tal, la abertura 14 de la sub-cámara se define por la base de cámara 13 de la cámara principal. El arco de la pared exterior 15 de la sub-cámara 12 se extiende hacia los lados exteriores de cada pared 16 de la cámara principal 11 (ilustrada mejor en la Figura 3).
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Una pared 16 de la cámara principal 11 incluye una ranura 17 para recibir una porción cooperativa de una placa de pozo (no mostrada) en la cual el pozo 10 se va a colocar. Esto facilita la fijación segura del pozo 10 en la placa y alivia los problemas asociados con los pozos 10 que se desprenden de la placa. La sub-cámara 12 tiene un volumen predeterminado de manera que recibe una muestra líquida y forma la muestra líquida en una gota que tiene ventajosamente una superficie convexa que se extiende desde la abertura 14 de la sub-cámara. Esto asegura que la profundidad del líquido es substancialmente constante a través de la sub-cámara, en comparación con una muestra líquida que se coloca en un pozo y forma un menisco arriba de las paredes laterales del pozo. En ese caso, la profundidad del líquido en los lados del pozo en donde se forma el menisco será sustancialmente más grande que en medio del pozo en donde el menisco se encuentra en su punto más bajo. Preferentemente, la altura X del pozo es de llmm, incluyendo una altura Y de lOmm para la cámara principal y una profundidad Z de lmm para la sub-cámara. El pozo es generalmente de 8mm a través de su ancho W y tiene un grosor de pared T de aproximadamente lmm. Así, el ancho interno ¿ es de aproximadamente 6mm. La cámara principal tipicamente define un volumen de aproximadamente 360 µl y la sub-cámara
- - un volumen de aproximadamente 28.3 µl . La Figura 4 ejemplifica un ejemplo de una configuración de placa de pozos típica de 12 x 8 (i.e., 2 x 6 x 8) incluyendo un listado de virus a detectarse, lineas celulares relevantes y días de retiro para cada línea. La placa se compone de 96 pozos individuales de base plana de acuerdo con la presente invención. Como se observará a partir de la Figura 4, la placa puede sembrarse con diferentes lineas celulares en el siguiente orden: Columnas 1-3 LLC-MK2 Columnas 4,5 MDCK Columna 6 Hep2 Columna 7 A549 Columna 8 RK13 Columnas 9-12 MRC-5 Una placa establecida en esta forma permitiría por ejemplo la selección, sin limitarse de los virus respiratorios de Parainfluenza 1,2,3,4 (Pl 1,2,3,4), Influenza A, B (Inf A,B) RSV, Adenovirus (AD) , Rinovirus (RH) , Citomegalovirus (CMV) y virus del grupo de Enterovirus (ENT) que consiste de Ecovirus (Eco) , Coxsaquievirus (cox) , Enterovirus (Ent) y Poliovirus (Polio), así como, pero sin limitarse a los virus no respiratorios, virus del Herpes simplex (HSV) 1,2 y el virus de Varicela zoster (VZV) .
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En un ejemplo adicional, la configuración de una placa de pozo de 6 x 8 puede consistir de líneas celulares sembradas en el siguiente orden: Columnas 1-3 A 549 Columnas 4-6 MRC-5 Esto permitiría por ejemplo la detección de virus tales como CMV, HSV 1,2, VZV, AD, y los del grupo de Enterovirus . Finalmente una configuración de pozos de 14x8 permitiría finalmente la detección de patógenos como Pl 1,2,3,4; Inf A,B; RSV; AD; RH; ENT (Echo, cox, Ent, Polio); HSV 1,2; VZV; Rubéola; Paperas, sarampión, Rotavirus, Poliomavirus y también otros virus patógenos utilizando líneas celulares apropiadas. El retiro de las líneas celulares, debido a la naturaleza individual de los pozos, puede ser selectivo dependiendo del tiempo de programación que sea apropiado para la detección viral específica en cuestión. En particular, si se desea la detección de Pl 1-4, tomando por ejemplo la fila A, los pozos Al hasta A3 se retiran en el día 2. De forma similar, si se desea la detección de Inf A,B, se retiran los pozos A4 y A5 en el día dos. Sin embargo, si se requiere la detección de Entero, entonces se retira el pozo All en el día apropiado (1-3) . La naturaleza específica de los pozos individuales facilita este retiro selectivo y la detección
- - viral . Ahora se hará referencia a un procedimiento particular que puede seguirse utilizando el equipo de un aspecto de la invención, muchas etapas de las cuales pueden ser opcionales y no deben considerarse para ser limitantes de la invención de cualquier forma. Utilizando pipetas al vacío y de pasteur de vidrio estériles, el medio se aspira de todos los pozos a inocularse. Se facilita de manera ventajosa la eliminación de las pipetas pasteur en un gran contenedor para objetos cortantes . Utilizando una pipeta desechable, se inoculan un número apropiado de pozos de la placa de pozo con aproximadamente 150-200 µl de espécimen por pozo. El espécimen restante se almacena a -70°C. La tapa se reemplaza entonces sobre la placa y los datos escritos sobre los pozos inoculados en la placa. La placa se pesa entonces sobre una balanza digital y se balancea con placas de balance y tarjetas hasta que todas las placas sean de pesos equivalentes (+/-0.5g) y pueden balancearse en una centrífuga. La centrífuga corre a aproximadamente 37 °C y 3500 rpm durante un periodo de 60 minutos. Utilizando vacío y pipetas pasteur estériles cada espécimen se aspira entonces de cada pozo y utilizando una pipeta desechable fresca para cada espécimen, cada pozo se
- llena con el medio de recuperación de virus BAC. Los especímenes se incuban entonces en un ambiente humidificado a 37 °C en un incubador de C02 (5%) mediante la colocación cuidadosa de las placas en el incubador de C02 e incubando a 37°C hasta siete días después de la inoculación del último espécimen. El teñido inmunofluorescente se utiliza ventajosamente para la detección del virus específico en pozos únicos, utilizando anticuerpos monoclonales especificos. Generalmente, se sigue el siguiente procedimiento : Utilizando una succión al vacío, el medio se retira del (de los) pozo(s) apropiado (s) y los pozos se retiran de la placa utilizando pinzas especiales y se transfieren hacia un soporte diferente. Estos se secan al aire durante 3 minutos. Se agregan entonces 300 µl de una mezcla de acetona y metanol fríos (2:1) a cada pozo y se dejan fijar durante 15 minutos a -20°C. El fijador se desecha entonces y la muestra se seca de nuevo al aire durante 2-3 minutos. Se agrega entonces un anticuerpo monoclonal específico (primario) a cada pozo y la placa de cubierta se coloca en su lugar y las muestras se incuban durante 30 minutos a 37°C. Las muestras se retiran entonces del incubador y cada pozo se llena con Salina Amortiguada con Fosfato (PBS) . El PBS se desecha entonces. Este proceso se repite cuatro veces más. De
- nuevo, la muestra se seca al aire durante 3 minutos, después de lo cual se agrega a cada pozo un anticuerpo secundario específico para el anticuerpo primario. Después de esto, la incubación de la muestra tiene lugar de nuevo después de los tratamientos repetidos con PBS como se mencionó arriba y un lavado final con agua doblemente destilada. Una pequeña cantidad (1 gota) de un medio de preparación especialmente preparado, se agrega entonces y los resultados se observan bajo microscopio fluorescente. Puede también emplearse una etapa de teñido inmunofluorescente. A través de toda esta especificación y las reivindicaciones siguientes, a menos que lo requiera el contexto de otro modo, la palabra "comprende" y las variantes tales como "comprenden" y "comprendiendo", se entenderán para implicar la inclusión de una entidad completa establecida o grupo de entidades completas pero no la exclusión de cualquier otra entidad completa o grupo de entidades completas o etapas. Los expertos en la materia apreciarán que la invención descrita en la presente es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes a las específicamente descritas. Debe entenderse que la invención incluye todas las tales variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta especificación,
- - individual o colectivamente y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera de dos o más de dichas etapas o características .