JPS6274299A - ウイルス分離用プレ−ト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はウィルス分離用プレート、更に詳細には、特定
の４糧の細胞を夫々含有する培地全保持せしめた細胞培
養プレートであって、ウィルス分離法の簡便化、ひいて
はウィルス検査のルチン化ｆｅ可能ならしめるウィルス
分離用プレートに関する。

〔従来の技術及びその間頂点〕

ウィルスは生きている細胞内でのみ増殖可能なので、病
原ウィルス全分離・検査するためには、患者材料を生き
ている培養細胞に接イ重し培發を行なうことが必要であ
る。しかも、ウィルスによって細胞の１惑受注が異なる
ため、斯かる分離・・Ｉｆ用として何種類もの細胞を生
かしておき、目的のウィルスに感受性のある細胞を適在
濾んでイ史えるようにしておく必要がある。このように
、ウィルスの分離・検査には細胞培養の技術と設備、更
には分離・検査用の細胞が特に必要であるため、ウィル
スの分離・検査は細菌検査と異なって一役病院の検査室
では行なわれていないのが実状である。

そして、仮に細胞培養が可能な施設があっても、病因と
して多数のウィルスが考えられる場合には、ウィルスの
分離・検査は著しく困碓な作夾である。

例えば、急性気道感染症（かぜ症候群）のような場合に
は、病因としてインフルエンザ（ｉｎｆ　１ｕｅｎｚａ
ｌ、バラインフルエンザ（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｌ、ＲＳ　、アデノ（ａｄｅｎｏ　）、エンテａ　（ｅ
ｎｔｅｒｏ　）等多数のウィルスが考えられるが、これ
らの全てのウィルスに感受性を有する細胞はない。従っ
て１．＠者材料をインフルエンザウィルス分離用の細胞
、パラインフルエンザウィルス分離用の・細胞、ＲＳウ
ィルス分離用の細胞というように、感受性を異にする多
種類の細胞に接種全行ない試行錯誤によって培養細胞を
見出す以外に方法はない。しかし、これは美大な仕事ｉ
ｔ必要とし、ルチン検査として実施しうるものではない
。それ故に、衛生研究所等の専門施設でも、インフルエ
ンザ以外の急性気道感染症患者からのウィルスの分離を
業務として行なってはいない。

すなわち、ウィルス病は最も日常的な疾患であるにもか
かわらず、ウィルス分離が容易でなくルチン化されてい
ないために、病因ウィルス不明のまま診療が行なわれて
いるのが実状であった。

〔問題点を解決するための手段〕 斯かる実状において、本発明者は病因として多種類のウ
ィルスが考えられる場合にもウィルス分離・検査を日常
のルチン検査として実行可能なものとすべく鋭意研究の
結果、特定の４種類の細胞を夫々含有する培地を倒み合
わせて使用すれば、ウィルス分離を系絖的に行なうこと
ができ、従来、試行錯誤により行なわれていた困難な作
業が飛躍的に簡便化され、更にこの４種類の培地をマイ
クロプレートに保持せしめた形、聾で病院等に供給する
ことＫよって、細胞培養技術や設備のない一般病院の検
査室でも細胞培養技術と同じようにウィルス分離・検査
が可能になることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、次の４１類の細胞、（ｉ）　　ヒト
胎児肺由来の＃！維芽細胞（ＨＥ　Ｌ　）（ｉ）　　Ｈ
ｅｐ−２ （ｉ１）　　Ｖｅｒ。

（Ｍ　　ＭＤＣＫ を夫々含有する培地を保持せしめたことを特徴とするウ
ィルス分離用プレー）・である。

以下、本発明のウィルス分離用プレート金、これに使用
される上記４種類の細胞の頭文字をとってｒ　ＨＨＶＭ
プレート」という。

本発明において使用される４種類の細胞は、いずれも一
般に入手可能なものであるが、ウィルスに対する細胞の
感受性を一定に保ち、常に安定した検査結果を得るため
、適宜継代培養を行なって使用するのが好ましい。

本発明において、４種類の細＠全生きたまま供給するた
め、そしてウィルス感染細胞の増殖用として使用される
培地は、これらの細胞の培養が可能なものであれば特に
制限はなく、通常上記４種類の細胞の培養にｉ重用され
るものであればいずれをも用いることができる。この増
殖用培地は、４種類の細胞の夫々について同一であって
も異なってもよい。

また、本発明に使用されるプレートは、検査の目的に応
じて適宜選択することができるが、少なくとも４個の凹
部全有するものが好適である。凹部の形状は、細胞を含
む培地を保持しうるものであれば特に制限されないが、
穴の深さがウィルス分離操作において試験液の添加や培
地の震動等が具合良く行なえる程度のものが好ましい。

斯かる条件ｋ　ｆｆ４足するプレートの好ましいものと
しては、例えば縦横に複数の穴を設けた通常の組織培養
用マイクロプレート等が挙げられる。

本発明のＨＨＶＭプレートは、上記４種類の細胞を夫々
１０４〜１０５／ｒｎ１８度に増殖用培地で細胞ａを調
整した懸濁液を、夫々プレートの凹部に適当量接種する
ことにより調製される。

本発明のＨＨＶＭプレー）ｋ用いてウィルスを分離する
には、患者材料を４種類の細胞全夫々含有する増殖用培
地に接種し、常法に従っていずれかの培地に細胞変性効
果（ＣＰＥ）が現われるまで培養を行なう。培養日数は
、ウィルスによって異なり、通常２〜９日程度である。

次いで、感染細胞を選択し採取２行なう。採取は、ＣＰ
Ｅの最も強く現われた培地から行なう。感染細胞の選択
を行なうには、ＣＰＥの他、赤血球吸着現象の如きウィ
ルスの検査に使用される通常の判別方法を併用丈るのが
好ましい。そして、ウィルス分離に好適な感染細胞の選
別全適確に行なうためには、後記第１表に示すような分
離のだめの指標となるウィルス固有の特徴を整理したも
のを用意しておくのが好ましい。斯かる指標表があれば
、分離されたウィルスの種類を正確に判別することがで
き、最終的にウィルスの型を決定するまでの分離・検査
の作＠を系統的に行なうことができる。斯くして選別さ
れ採取された感染細胞は、常法に従って継代培養を行な
うことによりウィルスを分離することができる。分離さ
れたウィルスは既に種類が判っているので、常法に従っ
て抗原抗体反応等を用いて型を決定すればよい。

〔作用〕

本発明のＨＨＶＭプレートの４ａｉ類の細胞に、−例と
して急性気道感染症の病因となる各種のウィルスを作用
させＣＰＥを観察した結果、及び赤血球凝集（ＨＡＩ試
験を行なった結果を第１表に示す。

第１表から明らかな如く、４種類の細胞はウィルスによ
って感受性が異なるため、この相異を指標とすれば病因
として多種類のウィルスが考えられても、ウィルスを容
易に分離することができ、同定することができる。

第１表 注）　表には、分離のための指標となる顕著な変化のみ
示した。

′注）　ウィルスの略号は次のものを示す。表中の名称
について以下同じ。

Ｆｌｕ　：　　インフルエンザウィルスｐａｒａｆｌ　
：バラインフルエンザウイルスｐｏｌｉｏ　　：ポリオ
ウイルス ＨＳＶ　　：ヘルペス　シンプレックス　（ｈｅｒｐｅ
ｓｓｙｍｐＬｅｘ　）ウィルス ＣＭＶ　　：サイトメガロ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ　　
）　ウィルス〔実施例〕 次に実施例及び試験例を挙げて説明する。

実施例１ 下記方法によりＨＨＶＭプレートをＡ製した。

ｔｌ）　　ａｌ胞 ヒト二倍体細胞としてＨＥＬ、ｉ化細胞としてＨｅｐ−
２、Ｖｅ　ｒｏ　、　ＭＤＣＫ　ｆ用いた。

（２１増殖用培地 ■）（ＥＬ及びＭＤＣＫ用 ＭＥＭイーグル培地（以下、ＭＥＭという）＋１０チウ
シ胎児血清（ＦＣ８ｌ＋ペニシリン１００Ｕ／＋＋＋ｔ
＋ストレプトマイシン１００　μｇ−／づ ■Ｈｅｐ−２及びＶｅｒｏ用 ＭＥＭ＋１．’Ｏ［子ウシ血清（Ｃ８Ｉ＋ペニシリン１
００　Ｕ　／　ｍｌ＋ストレプトマイシン１００１ｔＰ
／ｍ１ （３）細胞の継代 ■継代日 ウィルスに対する細胞の感受性金一定に保ち、常に安定
した結果を得るために、ＨＥＬ、　ｔ（ｅｐ−２、Ｖｅ
ｒｏ、　ＭＤＣＫはすべて月、金、水、月、金、水と定
期的に継代した。継代細胞はすべてＡ、Ｈの２系列とし
、ＡとＢの継代金１列ずらした。

すなわち、第１週にＡを月、全１省日に）迷代し、Ｂを
水−日に継代すれば、第２週は１３が月、金曜日の継代
となり、Ａは水曜日の継代になる。

第３週ｌハまｆｃＡが月、金になる。このようにして、
毎週月曜日、金４日の２回、同一条件の細胞をプレート
Ａ、ＬＳＪ用に供することがで角るようにした。

■継代法 Ｃ式Ｍｔｔ＋全含まない燐酸緩衝液（−ＰＢＳ　）で細
胞を洗った後、ＨＥ　ＬとＨｅｐ−’ｌは０３１％トリ
プシン（ＴＲＹＰＳＩＮ　１　：　２５０　、ディフコ
社製）で７・角化、Ｖｅｒｏ　とＭＤＣＫは０．１％ト
リプシンと０．０２チＥＤＴＡ　（ドータイト　２ＮＡ
、和光紬薬製）の′ｆｒ喰混合液で消化した。消化後、
ＨＥＬはルーびん１本の細胞を２倍１１００７１１Ｊに
（細胞数は約１５　Ｘ　１０’　／　ｍｌ　）　、　）
Ｉｅｐ−２は５Ｘ１ｔ）’／ｎｌ、　Ｖｅｒｏば７Ｘ１
０’／ｄ、ＭＤＣＫは１５×１０４／ダに増殖用培地で
細胞数を調整して懸濁液とし、ルーびんには５Ｑｍｌ、
角びん（５５×５５Ｘ１５０ｙｍｌには１５．７＋／！
全接種して継代した。

＋４）　　ＨＨＶＭプレートの調製 ■１偏整日 毎週月、金の２回、上述した細胞継代と同時に調製した
。

■＠胞懸濁液 マイクロプレート調製用の細胞懸濁液は上述の細抱継代
用と同一のものを用いた。すなわち、ａ胞数１４ＨＦＪ
Ｌ　：　１５　Ｘ　ＬＯ’／ｌｎｌ、　Ｈｅｐ−２：　
５Ｘ　１０’／ｍｌ、　　Ｖｅｒｏ　　：　　７　Ｘ　
１０’　／ｒｎ１％　ＭＤＣＫ　：１５　Ｘ　１０’　
／ｒＩＩｌである。

■プレー１への接種 組織培養用マイクロプレート（８×１２穴、豊島復作所
製）を横に使い上から横２列づつＨＥＬ、Ｈｅｐ−２、
Ｖｅｒｏ　、　ＭＤＣＫのｌ１ｊＩ序に、細胞懸濁液０
．２　ｍｌ！を各穴に接種した。

■培養 ３６℃、ＣＯ２培妻（へ）で３〜５日培養した。すなわ
ち、月曜日にＡｎしたプレートは木、金、土に使用し、
金曜日に調製したものを月、火、水に使用した。

試験例１ 実施例１で得たＨ）（ＶＭプレートを用いて急性気道感
染症患者の保有するウィルスの分離・検査を下記方法に
より行なった。

〔Ｉ〕試験方法 （ｉ）咽頭ぬぐい液 患児の咽頭を擦っだめん棒を３−の運搬用培地（ＭＥＨ
＋０．５俤ゼラチン＋０．０２チウシ血ｐアルブミン＋
ペニシリン３００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン３００
μＪ／ｍｌ　）に攪きまぜ、３０００回１５分遠心後、
上清を用いた。

１２）材料接種 ■細胞の洗浄 分離用プレートを一気に手で損って培養液金捨て、穴の
境についた液をティッシュペーパーで拭き取った後、Ｐ
ＢＳｉ各穴に０．２　ｍｌ加え、１分後再び一気に液を
振り捨て、プレート表面についたｆをペーパーで拭き取
った。

■推持液の滴下 次の２１類の維持液０．１　ｍｌを各穴に滴下した。

ａ、ＨＥＬ及びＨｅｐ−２用 Ｍ　Ｅ　Ｍ　＋　２％無ガンマグロブリンＣ３＋ペニシ
リン１００Ｕ／ｍＪ＋ストレプトマイシン１００　ｐｆ
／ｍｌ ｂ、Ｖｅｒｏ及びＭＤＣＫ用 Ｍ　Ｅ　Ｍ　＋　５％Ｍ　Ｅ　Ｍ　ヒタミン溶１（ｉ０
０×４縮、ギプコ社製）＋グルコース２ｍＱ／罰＋結晶
トリプシン（タイプ１、シグマ社製）０．２μ？昨ｌ＋
ペニシリン１０００／＊Ａ＋ストレプトマイシン１００
μＬ？ｉｎｌ■材料接種 各穴に維持液Ｏ３ｌ　ｍｌ加えたプレートの１列８穴（
４種細胞各２穴）に咽頭ぬぐいＱ、（ｉ倹体）各Ｑ、　
ｌ　ｍｅ　ｆ接種した。１枚のプレートに１１＋＊体を
接種し、残りの１列８穴には運搬用培地Ｑ、　ｌ　ｍ、
ｌを接種し対照とした。

（３）培養 ３６°Ｃ５Ｃｏ、培養器で培要した。

（４）　ＣＰ　Ｅ観察 接種後、隔日にＣＰＥをＬ視察した。

（５）赤面法吸音現象 培養７日月、Ｖｅｒｏ細胞の１列に０．１４モルモット
血球０．１　ｒｎ１滴下し４℃、３０分放置後、サーモ
ミキサーでプレートを震動させて吸着しない血球を浮上
させ吸着の有無？判定した。

（６）継代 ＣＰＥが確認されたときは、パスツールピペットで感染
細胞と培養液企及い上げ試験管の同一細胞２本に接種継
代した。襟数の細胞にＣＰＥが認めら□、たときは、最
もＣＰＥの強いものを同じ細胞で継代し九。赤血球吸着
性全盲するものは同一細胞に継代した。

（７）同定 すべての分離株についてモルモット、ミドリザルおよび
ヒトＯ型皿球の０．５チ赤血球浮遊液を用い、赤血球凝
集（ＨＡ）試験を行い、ＣＰＥとＨＡ試験の結果から、
次のような順序で同定乞進めた。

ヒト）について国立予防衛生研究所から分与された標準
抗血清（Ａ：熊本／３７／７９−パンコク／１０／８３
　、フィリピン／　２／８３　。

Ｂ：レンガポール／２２２／フ９．ノルウエー／１／８
４１を用い赤血球凝集抑制（ＨＩ　１試験を行なった。

■ＲＳウィルス ｆ（ｅｐ−２だけにＣＰＥ（シンシチウム）を形成し、
Ｉ（Ａ（−１の分離株について、自家製のモルモット抗
ＲＳウィルス血清を用い、中和試験を行なった。

■バラインフルエンザウィルス （＋）の株について自家製のモルモット抗パラインフル
エンザ１，２．３型血清と用いＨ１試験を行なった。

■アデノウィルス アゾン様ＣＰＥを示した株について、患者の堅ア血清を
用いてＣＦ試験を行ないアデノウィルス共通抗原を確認
した後、サル血球のＨＡ　（＋）　（−）に分けて、手
研から分与された抗血清を用い、番号の若い順序に中和
試験を行なった。

■エンテロウィルス エンテロウィルス様のＣＰＥを示したものにライて、抗
ポリ第１，２，３ブー／ｌ／、ＣＯＸ　Ｂ１−６プール
血清で中和試験を行ない、陰性ノモのはエコーウィルス
のプール血清で中和試、倹を行なった。プール血清で陽
性の場合はそれぞれ単独の抗血清で型決めの中和試験を
行なった。

■ヘルペスンンブレツクスウイルス（ｌ（ＳＶ）ヘルペ
スウィルス様のＣＰＥ１示したものについては、家兎に
免疫して作成した抗ヘルペスシンプレンクスウイルス抗
体で同定を行なった。

■サイトメガロウィルス［ＣＭ￥１ す１トメガロウイルス様のＣＰＥＩ示したものについて
、ヒト血清中よりスクリーニングで得られた抗サイトメ
ガロウィルス血清にて同定を行なった。

〔■〕ウィルス分分離積 仙台市スペルマン病院小児科を訪れた小児急性気道パ１
に染症１，０７２例の咽頭ぬぐい液ｉ　ＨＨＶＭプレー
トに接種してウィルス分離を試みたところ、３１５例（
２９チ）からウィルスが分離された。

（ｉ）分離ウィルスの種類 分離されたウィルス３１５株のうち同定できたものは３
１４（朱であるが、その内訳はインフルエンザＡ（２ｍ
１．インフルエン”ｆＢ　（ｉ４６株）、ハラインフル
エンザ−２（３９１，パラインフルエンザ−３（２株）
、Ｒ８（７０株）、アデノ−１（９株）、アデノ−２（
ｉ４株）、アデノ−３（４株）、ポリオ−２（２株）、
ｃｏｘ　Ｂ　５　（５株１　ｓヘルペスシンプレックス
（）１ｓＶＩ　　（２１株）、サイトメガロ（ＣＭＶＩ
（２６株）の１２１１煩であったエンテロ１１味は未同
定である。

（２）４橿細抱のウィルス感受性 ３１５株のウィルスがどの細胞で分離されたかを第２表
に−まとめて示した。

以下余白 第２表に示す如く、インフルエンザウィルスは、Ａ％Ｂ
いずれもＭＤＣＫだけにＣＰＥが認められた。パライン
フルエンザウィルスは２．３型ともにＶｅｒｏ　　だけ
にＣＰＥＩシン′シチウム）が認められた。ＲＳウィル
スはＨｅｐ−２にはシンシチウム、ＨＥＬには変性型の
ＣＩ）　Ｅが出現したが、分離率はＨｅｐ−２の方が高
かった。アデノウィルスは４種類の細胞すべてにＣＰＥ
ＥがｉＺめられたが、感受性には若干の差が認められた
。

Ｈｅｐ−２が最も感受性が高かったが、ＣＰＥはＩ（Ｅ
ＬＯ方が見やすかった。エンテロウィルスは４種細胞に
対する感受性に違いが認められ、ｃｏｘ　Ｂ　５ウイ／
ｌ／スは１４ｅｐ−２とＶｅｒＯで、ボリオウイ／ｌ／
スはＨＥＬ、Ｈｅｐ−２、ＶｅｒＯで分離された。未同
定のエンテロウィルスの中にばｆ（Ｅ　Ｌのみで分離さ
れたものと、Ｈｅｐ−２およびＶｅｒ。

でも分離されたものに分けられた。Ｈ６ＶはＨＥ　Ｌ　
、　ｔ（ｅｐ−２、Ｖｅｒｏ　、　ＭＤＣＫすべてにＣ
ＰＥが出現したが、ＭＤＣＫの感受性が劣った。ＣＭＶ
はＨＥＬだけにＣＰＥを認めた。

ｆ３）　ＣＰ　Ｅ出現までの日数 分離ウィルス３１５株のうち、ＣＰＥ出現の遅いＣＭＶ
ｉ除いたインフルエンザ、バラインフルエンザ、ｔｔｓ
、アデノ、エンテロ、Ｈ８’Ｖの２８９株について、最
も感受性の高い細胞でＣＰＥが出現するまでの日数を示
しだのが第３表である。

第３表 第３表に示す如く、インフルエンザウィルスは１４６株
のうち７６株（５２１が３日以内に、１３２株（９０％
）が５日目まで）てＣＰＥを示した。ＲＳウィルスは７
０株中５２株（７４％）が５日目までに、６８株（９７
％）が７日までにＣＰＥ’ｉ示した。アデノウィルスは
ＣＰＥの出現が比較的遅く、２５株中５日以内に１７株
（６３％）、７日までに２１櫟（７８鴫）が検出された
。エンテロウィルスは１８昧中１７株（９４チ）が７日
以内にＣＰＥを示した。

Ｈ８Ｖは最も早く２１株すべて６日以内にＣＰＥが認め
られた。

斯くして、約１，０００例の小児急１ヶ気道・”へ染症
の咽頭ぬぐい液から１（）（ＶＭプレーｈ’を用いウィ
ルス分離ヲ試み、インフルエンザＡ、Ｂ、パラインフル
エンザ２，３；Ｒ３；アデノ１，２゜３　；　Ｈ８Ｖ　
；　ＣＭＶ　；　ＣＯＸ　Ｂ５　、ポリ第２のほか未同
定のエンテロウィルスを分離することができた。従って
、主要な病原ウィルスはほとんど分離可能であることが
分った。そして、急性気道感染症のような症候群の場合
でも、ＨＨＶＭプレートを使えば多種類の目標ウィルス
を分離できることが判明した。

〔発明の効果〕

本発明のウィルス分離用のＨＨＶＭプレートは、紙上の
妬く構成されるものであるため、実用上、極めて有利に
使用できるものである。

ｆｉｌ　　本発明）Ｉｆ（ＶＭプレートを用いたウィル
スの分離・検出法は従来のチューブ法に比較し、著しく
簡便であり、しかもウィルス感受性はチューブ法に劣ら
ない。

ＨＨＶＭプレートの１穴が従来法のチューブ１本に相当
するから、便用細胞の量はチューブ法の約１０分の１で
済む。従って、細Ｊ＠調製に要する４其ならびにＪ＠ｒ
ｓも１０分の１で済む訳で、従来のチューブ法に比較し
著しい省力化、経済化が可能である。

また、例えば９６穴のプレートであれば１枚で１０枚体
を４種類の細胞に接種できる訳であり、ＣＯ，培養器１
台で１，０００枚体以上の検査も可能である。しかも、
１枚のプレートは９６本のチューブに相当するから、Ｃ
ＰＥの観察もチューブを１本ずつ操作する従来の方法と
比較して著しい省力化が可能である。

以上の招来、　ＨＨＶＭプレー）ｋ用いることによって
、急性気道感染症のような症候群の場合でも、ウィルス
分＊’を十分ルチン検査として行なうことができる。

（２１ｆＨｆｆＭプレートを供給されれば、一般病院の
検査室では検体を接種してＣＰＥを観察するだけで、ウ
ィルス分離が可能になる。すなわち、作業の１変が細旭
検査と同レベルになる訳で、例えば週２回プレートヲ供
給されれば、毎日ウィルス分離が可能であシ１、一般病
院でもルチン検査としてウィルス分離が可能になる。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の４種類の細胞、 （ｉ）ヒト胎児肺由来の繊維芽細胞 （ｉｉ）Ｈｅｐ−２ （ｉｉｉ）Ｖｅｒｏ （ｉｖ）ＭＤＣＫ を夫々含有する培地を保持せしめたことを特徴とするウ
   ィルス分離用プレート。