KR20070118633A - 바이러스 진단 방법 및 이에 사용되는 웰 - Google Patents

바이러스 진단 방법 및 이에 사용되는 웰 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스 진단 방법에 사용하기 적합한 단일 평판바닥 웰(well)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 상기 웰은 곡선의 바닥이 아닌 판상 또는 평판상의 바닥을 가지고 있다. 또한, 본 발명은 이러한 단일 웰을 이용한 바이러스 진단 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 실시예에서, 호르몬 및 효소가 보충된 특별히 개발된 조직 배양 배지가 이용된다.
바이러스, 진단 방법, 웰, 배양, 셀라인

Description

바이러스 진단 방법 및 이에 사용되는 웰{VIRAL DIAGNOSTIC METHOD AND WELL FOR USE IN SAME}
본 발명은 바이러스 진단 방법에 사용하기 적합한 단일 평판바닥 웰(well)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 상기 웰은 곡선의 바닥이 아닌 판상 또는 평판상의 바닥을 가지고 있다. 또한, 본 발명은 이러한 단일 웰을 이용한 바이러스 진단 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 실시예에서, 호르몬 및 효소가 보충된 특별히 개발된 조직 배양 배지가 이용된다.
바이러스를 식별하는 종래의 진단 절차는 어떤 바이러스들에 대한 감응성에 기초하여 선택된 특정한 셀라인을 용기에 시딩하는 단계 및 바이러스를 포함하는 것으로 추정되는 생물학적 샘플을 세포 배양에 접종하는 단계를 포함한다. 이러한 생물학적 샘플들은 그중에서도 특히 타액, 소변, 분(faeces), 뇌척수액(CSF), 호흡기액, 및 구강, 비강, 인후, 피부 및 생식기로부터 채취한 면봉(swab)을 포함한다. 이후, 접종된 세포 배양은 배양되고, 세포들은 바이러스에 의하여 유발된 세포변성 효과 여부가 검사된다. 일정한 바이러스들은 일정한 세포들에서만 성장하므로, 바이러스는 세포변성 효과(CPE)를 유발하거나, 유발하지 않는 세포의 형태를 기초로 하여 식별될 수 있다.
이러한 절차에는 세포들을 제거하기 위하여 trypsonisation에 의하여 바이러스 프레파라트로 배양된 표적 세포(subjecting cells)를 포함하고, 플루오레세인(fluorescein:FITC) 분자와 같은 보고 분자(reporter molecule)로 분류되는 바이러스기원 폴리펩티드에 특이적인 단일 클론 항체를 이용한 바이러스 탐지가 이어지는 다수의 대안적인 프로토콜들이 있다. 다른 대안은 세포의 재분리(recovery)를 강화하기 위하여 배양 튜브 내에 커버 슬립(cover slip)을 포함하는 것이다.
종래(또는 전통적인-드럼) 방식은 적절한 셀라인으로 시딩된 스크루캡 튜브를 이용한다. 세포들이 약 80% 콘플루언시(confluency)에 도달한 후, 튜브는 적절한 표본으로 배양되고, 3주간 CPE가 모니터링된다. CPE의 일단위 모니터링은 제 1주간 요구된다. 제 2 및 3주간에는 이에 비해 적은 빈도로 모니터링된다. 때로는, 바이러스 재분리를 보강하기 위하여 블라인드 패시지(blind passage)가 요구된다.
상기 방법의 불리한 점들 중 하나는 튜브의 일단위 모니터링이 요구됨에 따라 시간 및 노동 강도가 높다는 것이다. 일반적으로, 주관성을 피하기 위하여 2인이 광학 현미경으로 동일 튜브에서 CPE를 검사한다. 게다가, 모든 바이러스들이 육안으로 관찰 가능한 CPE 및 이러한 방식에 의하여 감지할 수 있는 CPE를 유발하는 것은 아니다. 더욱이, 종래의 튜브 방식에서 모니터링되는 CPE 형성은 셀라인의 감응성 및 관찰 가능한 CPE를 유발하는 바이러스의 능력에 크게 의존한다. 불리하게도, 표본의 독성으로 인하여 잘못된 결과를 보여주는 바이러스성 CPE와 유사한 변화가 유발될 수 있다. 또한, 어떤 바이러스들(예컨대, 시토마갈로바이러스(cytomagalovirus;CMV))은 상당한 시간이 경과한 후에만 CPE를 생산한다. 이와 같이, 종래의 튜브 방법에 의하여 얻어지는 결과는 주로 CPE 탐지에 기초하고 다른 방법에 의하여 일상적으로 확증되는 것이 아니므로, 부정확한 진단이 발생할 수 있다. 종래의 튜브 방법에 있어서 다른 제한은 튜브의 계속 축적되어 표본당 2 또는 3개 이상의 튜브를 사용하는 것이 어렵다는 점이다. 예를 들어, 1일 40개의 표본은 제 1주간의 분석에만 500개의 튜브를 만들 것이다.
쉘 바이알(shell vial)법이 현재 바이러스 재분리에 있어서 당업자에 의하여 이용되는 가장 진보된 방법이다. 이 방법은 반투명 뚜껑을 갖는 직경 16 밀리미터의 5ml 플라스틱 바이알(쉘 바이알)을 이용한다. 적당한 처치를 거친 후, 둥근 커버슬립(cover slip)이 바이알 내로 삽입된다. 이때, 바이알은 상기 커버슬립 상에 단층(monolayer)으로 성장한 반응성의 셀라인으로 시딩된다. 세포 단층이 약 80% 내지 90%의 컨플루언시에 도달할 경우, 배지는 폐기되고, 단층은 환자의 표본으로 접종되고, 바이알은 배양된다. 이후, 배양된 바이알은 커버 슬립이 제거된 후, CPE이 발생하였는지 여부가 모니터링된다.
쉘 바이알법의 이점은 접종 후 바이알을 원심분리하여 바이러스 재분리가 보강되어, 결과를 얻는데 소요되는 시간을 2-3일 단축할 수 있다는 점이다. 더욱이, 쉘 바이알법을 이용하면, 육안 관찰이 가능한 CPE를 기다릴 필요가 없다. 커버 슬립은 제 2 또는 제 3일째 날에 제거될 수 있으며, 적당한 단일클론 항체들로 착색되고, 항체-항원 착색을 이용하여 결과가 확인될 수 있다.
그러나, 쉘 바이알법은 여러가지 불리한 점들도 갖는다. 커버 슬립들이 증류수에서의 세척 및 살균 과정을 거친 후 세제 및 아세톤으로 여러 번에 걸쳐 세척을 하는 등의 특별한 처치를 요하므로 시간을 소모하는 것이다. 커버 슬립들은 바이알 내부로 수작업에 의하여 삽입될 수도 있다. 더욱이, 면역형광 착색법이 필요한 경우, 절차는 더욱 복잡해지고 시간을 더 소모하게 된다. 쉘 바이알의 배지는 폐기되어야하고 커버 슬립은 특정의 집게를 이용하여 수작업으로 제거되고, 공기-건조되며, 진공 그리스(vacuum grease)를 이용하여 현미경의 슬라이드에 고정된다. 커버 슬립들은 거친 조작으로 인하여 깨지거나 의도하지 않은 방향으로 틀어질 수 있으며 현미경 슬라이드에 단층이 뒤집힌 채로 고정될 수 있으므로, 커버 슬립을 제거하는 일은 지루한 작업이 될 것이다. 만약 시딩된 세포들이 커버 슬립의 바닥에서도 성장하여 커버 슬립이 바이알에 고정되도록 하여 커버 슬립의 제거를 어렵게 만드는 경우, 또 다른 복잡한 결과가 발생할 수 있다. 실제로, 종래의 튜브법에 관하여, 쉘 바이알법을 이용하면, 튜브가 계속 축적됨으로써 표본당 2 또는 3개 이상의 튜브를 사용하는 것이 불가능하다(즉, 1일당 40개의 표본은 주당 500개의 쉘 바이알을 생성한다). 더욱이, 많은 양의 단일클론 항체는 원형의 13mm 커버 슬립을 덮도록 면역형광 착색을 필요로 한다.
96 웰 플레이트법은 동일 셀라인 상에 성장하는 바이러스들의 재분리에 있어서 제한된 경우에만 사용되는 다른 방법이다. 예를 들어, 웰이 LLC-MK2 셀라인으로 시딩되면, 파라인플루엔자 는 물론 인플루엔자의 재분리가 가능하다. 96 웰 플레이트법은 특별한 표본으로 시딩된 셀라인을 접종하는 것이 비교적 용이하다는 점에서 이점을 갖는다. 더욱이 많은 수의 표본들이 동일 플레이트 상에 접종될 수 있으며, 원심분리에 의한 증대(enhancement)가 또한 가능하다. 더욱이, 96 웰 플레이트 법은 적은 양의 배지(쉘 바이알법에서 사용되는 1-1.5 ml 대신 0.3 ml)를 이용하고, 항원-항체 기법은 결과를 확정하는데 이용될 수 있으며, 상기 방법은 또한 CPE의 "판독(read)" 모니터링을 용이하게 한다.
그러나, 96 웰 플레이트법은 단점도 있다. 플레이트는 일반적으로 실용적이지 않은 항원-항체 탐지에도 전체적으로 이용되어야 하며, 전체 플레이트에 대하여 필요 이하로 작은 표본의 수에 대하여도 플레이트 전부가 동일한 날에 이용되어야 한다. 이는 각각의 날에 서로 다른 새로운 세트의 플레이트가 이용되어야 함을 의미한다. 이로 인하여 탐지를 수행한 후 오류가 있는 경우 또는 배양 기간이 지난 후에 이용 가능한 셀이 남지 않는 불리한 상황이 발생한다. 더욱이, 통상적으로 1 또는 2개의 서로 다른 셀라인만이 플레이트마다 이용될 수 있으며, 동일한 타입의 표본이 플레이트 상에 접종될 수 있다.
단일 웰 방법은, 오스트레일리아 혁신(innovation) 특허번호 2001100242에 기술된 바와 같이, 상기 종래의 방법들과 관련된 문제점을 줄이고, 바이러스 분석을 수행하기 위한 대안적이고 효과적이며 경제적인 처리 방법을 제공한다.
평판바닥 웰들은 분석시험에 이용되는 몇몇 이점들을 제공하는 것으로 알려져 있다. 특히, 이들은 예를 들어 원형 또는 곡선바닥 웰들과 비교하여 보다 정확한 분석을 제공한다. 그러나, 간단한 평판바닥 웰들은 웰의 바닥에 메니스커스가 형성되어 웰의 바닥에 걸쳐 용액이 불균일하게 분포하는 단점도 갖는다. 이하에서 기술되는 바와 같이, 이러한 견지에서 문제점들을 해소할 평판바닥 웰을 개발하게 되었다.
본 발명의 1 측면에 따르면, 분석시험에서 이용되는 단일 평판바닥 웰이 제공된다. 상기 웰은:
액체 샘플을 수용하는 개구부; 상기 개구부로부터 연장되는 측벽들 및 챔버 바닥을 가진 메인 챔버; 및
상기 메인 챔버의 챔버 바닥으로부터 연장되고 소정의 상기 액체 샘플을 수용하도록 적용되고, 평판바닥을 가진 서브 챔버를 포함한다.
유리하게는, 이러한 배열이 서브 챔버에 담긴 액체 샘플이 메인 챔버의 측벽들 위로 메니스커스를 형성하지 않도록 한다. 오히려, 서브 챔버에 담긴 액체 샘플은 서브 챔버로부터 메인 챔버로 연장되는 볼록한 표면을 유지할 수 있다. 또한, 상기 배열은 액체 샘플이 머무는 바닥면이 평평하여, 보다 정확한 분석을 제공할 수 있게 한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 웰유닛을 제공한다. 상기 웰유닛은 본 발명에 따른 단일 평판바닥 웰을 하나 이상 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 분석시험을 수행하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 단일 평판바닥 웰을 이용하는 단계 또는 본 발명에 따른 웰유닛을 이용하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 바이러스를 탐지하는 방법을 제공한다. 상기 방법은:
사전선택된 셀라인으로 시딩된 본 원에 기술된 본 발명에 따른 하나 이상의 단일 평판바닥 웰들을 제공하는 단계;
하나 이상의 웰들에 분석될 표본을 접종하는 단계; 및
상기 하나 이상의 웰들에서 하나 이상의 사전선택된 바이러스들을 검사하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 바이러스를 탐지하는 방법을 제공한다. 상기 방법은:
바이러스 접종에 적합한 셀라인으로 시딩된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단일 평판바닥 웰을 제공하는 단계;
탐지될 바이러스를 잠재적으로 포함하는 샘플을 획득하기 위하여 표본을 특이하게 전처리하는 단계;
상기 셀라인에 샘플을 접종하는 단계;
상기 접종된 셀라인을 배양하는 단계;
상기 접종된 셀라인의 샘플 배지를 적어도 하나의 호르몬 및 적어도 하나의 효소가 보충된 세포 배양 배지를 포함하는 바이러스 재분리 배지로 교체하는 단계;
상기 접종된 셀라인을 배양하는 단계; 및
바이러스의 존재여부를 조사하기 위하여 상기 접종된 셀라인을 분석하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단일 평판바닥 웰 또는 웰유닛의 분석시험에서의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 바이러스 탐지 방법에 있어서 본 발명에 따른 단일 평판바닥 웰의 용도가 제공된다. 상기 방법은:
사전선택된 셀라인으로 시딩된 본 원에 기술된 본 발명에 따른 하나 이상의 단일 평판바닥 웰들을 제공하는 단계;
하나 이상의 웰들에 분석될 표본을 접종하는 단계; 및
상기 하나 이상의 웰들에서 하나이상의 사전선택된 바이러스들을 검사하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 바이러스 탐지 방법에 있어서 본 발명에 따른 단일 평판바닥 웰의 용도가 제공된다. 상기 방법은:
바이러스 접종에 적합한 셀라인으로 시딩된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단일 평판바닥 웰을 제공하는 단계;
탐지될 바이러스를 잠재적으로 포함하는 샘플을 획득하기 위하여 표본을 특이하게 전처리하는 단계;
상기 셀라인에 샘플을 접종하는 단계;
상기 접종된 셀라인을 배양하는 단계;
상기 접종된 셀라인의 샘플 배지를 적어도 하나의 호르몬 및 적어도 하나의 효소가 보충된 세포 배양 배지를 포함하는 바이러스 재분리 배지로 교체하는 단계;
상기 접종된 셀라인을 배양하는 단계; 및
바이러스의 존재여부를 조사하기 위하여 상기 접종된 셀라인을 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예들이 첨부된 도면에 제한 없이 도시된다. 도면은:
도 1은 웰을 개략적으로 나타내는 사시도;
도 2는 웰을 개략적으로 나타내는 측단면도;
도 3은 웰의 바닥면을 나타내는 평면도; 및
도 4는 12x8 배열의 전형적인 웰의 구성을 개략적으로 도시한 도면을 포함한다.
메인 챔버 및 서브 챔버는 서브 챔버가 메인 챔버의 바닥으로부터 연장되는 적당한 형태를 취할 수 있다. 단일 평판바닥 웰은 표본을 수용하는 웰의 바닥이 평평한 경우, 임의의 적당한 형태를 취할 수 있다. 웰들은, 예켠대, 원형, 정사각형, 삼각형 또는 육각형의 단면을 가질 수 있다. 또한, 웰들은 길이방향을 따라 횡단면이 일정할 수 있다. 대안적으로, 웰들은 상단 또는 하단부로 갈수록 가늘어지는 형태를 취할 수도 있다. 웰들은 종래의 미량역가 트레이 집합체(micro titre tray assemblies)에서 이용되는 표준 재료를 이용하여 표준 기법에 의하여 형성됨은 자명하다.
바람직하게는, 메인 챔버는 정사각형의 단면을 가지며, 서브 챔버는 원형의 단면을 가진다. 본 실시예에서, 서브 챔버 단면의 원호(arc)는 바람직하게는 메인 챔버의 각각의 측면 모서리로 연장된다. 이러한 특징은 첨부된 도면을 참조하는 경우 보다 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전형적으로 서브 챔버는 전체적으로 30μl의 소정의 체적을 가지고 있어, 서 브 챔버에서의 액체 샘플이 서브 챔버의 개구부로부터 연장되어 볼록한 표면을 갖는 물방울형태를 형성하도록 하고, 또한 액체의 깊이가 실질적으로 서브 챔버를 통하여 일정하도록 하여, 액체 샘플이 웰에 담겨져 있을 경우 웰의 측벽에 메니스커스를 형성하는 단점을 해소하도록 한다.
바람직하게는, 서브 챔버에 대한 메인 챔버의 높이비는 10:1이고, 서브 챔버에 대한 메인 챔버의 너비비는 2:1과 1:1의 사이에 있다. 바람직한 실시예에서, 웰의 높이는 11mm이며, 이때, 메인 챔버의 높이는 10mm이고, 서브 챔버의 높이는 1mm이다. 웰의 너비는 일반적으로 8mm이고 벽의 두께는 약 1mm이고, 서브 챔버의 내부 너비는 약 6mm이다. 이와 같이, 메인 챔버는 일반적으로 약 360μl의 용량을 가지며, 서브 챔버는 일반적으로 약 28.3μl의 용량을 가진다.
이러한 특별한 실시예는 웰들이 웰유닛(well unit)으로 이용되는 경우, 동일한 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 다수의 웰들이 결합되어 개별적으로 이용되지 않는 경우이다. 이와 같이, 본 발명의 대안적인 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 하나 이상의 웰을 포함하는 웰유닛이 제공된다. 예컨대, 웰유닛은 96 또는 48 웰 플레이트 구성 또는 오스트레일리아 혁신 특허번호 2001100242에서 기술된 바와 같은 유닛일 수 있다.
웰들이 플레이트로 삽입될 필요가 있는 몇몇 분석법들에 있어서, 웰들이 삽입되는 웰 플레이트와 잘 물리도록 하기 위한 수단이 제공될 수 있다는 점은 당업자에게 자명하다. 예컨대, 웰들은 웰 플레이트의 받침대 안으로 완전하게 일치하여(friction fit) 들어갈 수 있도록 상기 언급한 바와 같이 태퍼(taper) 형태를 취 할 수 있다. 대안적으로, 웰에는 웰이 삽입될 플레이트의 받침대와 조화하는 리브(rib), 오목부(indentation) 또는 장홈(groove)이 제공될 수 있다.
어떤 경우에는, 웰들이 분석 또는 플레이트의 운반 도중에 웰플레이트로부터 이탈될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 웰들은 칼라 코딩 또는 마킹과 같은 식별 형태를 포함한다. 예컨대, 플레이트에서의 위치(행렬)를 표시하는 마킹을 가질 수 있다.
분석을 보조하기 위하여, 웰은 마킹된 구획이 제공된 평판바닥을 포함할 수도 있다. 예컨대, 각각의 웰의 평판바닥은 평판바닥을 4개의 구역으로 나누는 십자선을 포함할 수 있다. 이와 같이, 1개의 구역의 분석은 전체로서 평판바닥의 분석에 유용한 데이터를 제공한다. 평판바닥을 소정의 개수로 분할하는 것은 이러한 목적에 적합한 것일 수 있다는 점은 자명하다.
본 발명의 웰은 매우 다양한 용도를 갖는다. 대체로, 본 발명의 웰은 분석시험에 있어서 유용하다. 숙련된 자에 있어서, 이러한 분석시험은 효소연결 면역흡착제 분석시험(Enzyme-linked Immunosorbent Assay), 박테리아 세포 배양, PCR 증폭법(amplification), 단백질 결정화(crystallization) 기술, 항바이러스 감염성 테스트(anti-viral susceptibility testing) 및 화학적, 약물적 스크리닝(chemical and drug screening) 기술을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 하나의 실시예에서, 본 발명의 웰들은 바이러스 분석시험에 유용하다.
본 원에서 이용되는 바와 같이, 분석시험에 대한 참조는 미량역가 웰들을 이 용하는 종래의 실험실의 기술들을 참조하는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 본 발명의 제 2측면에서, 바이러스를 탐지하는 방법을 제공한다. 상기 방법은:
사전선택된 셀라인으로 시딩된 본 원에서 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 하나 이상의 단일 평판바닥 웰들을 제공하는 단계;
하나 이상의 웰들에서 분석될 표본을 접종하는 단계; 및
상기 하나 이상의 웰들에서 하나 이상의 사전선택된 바이러스들을 검사하는 단계를 포함한다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 분석시험을 수행하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 원에 기술된 본 발명에 따른 하나 이상의 단일 평판바닥 웰들을 이용하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 상기 분석시험은 바이러스 진단 시험이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 바이러스를 탐지하는 방법을 제공한다. 상기 방법은:
바이러스 접종에 적합한 셀라인으로 시딩된 본 원에 기술된 본 발명에 따른 단일 평판바닥 웰을 제공하는 단계;
탐지될 바이러스를 잠재적으로 포함하는 샘플을 획득하기 위하여 표본을 특별히 전처리하는 단계;
상기 샘플로 셀라인을 접종하는 단계;
상기 접종된 셀라인을 배양하는 단계;
상기 접종된 셀라인의 샘플 배지를 적어도 하나의 호르몬 및 적어도 하나의 효소가 부가된 세포 배양 배지를 포함하는 바이러스 재분리 배지로 교체하는 단계;
상기 접종된 셀라인을 배양하는 단계; 및
바이러스의 존재여부를 조사하기 위하여 상기 배양된 셀라인을 분석하는 단계를 포함한다.
이 방법에서 샘플 배지는 전형적으로 샘플로 접종된 유지 배지(maintenace media)일 것이라는 점은 자명하다.
본 원에서 이용된 바와 같이, "단일 평판-바닥 웰"이라는 용어는, 표본을 수용하는 상기 웰의 바닥이 평평하다면, 그 범위에서 임의의 횡단면 형상을 갖는 단일 웰을 포함한다.
본 발명의 바이러스 분석 측면에서, 단일 평판바닥 웰의 사용은 역형광(inverted fluorescence) 또는 광학 현미경 검사법과 같은 표준 기법을 이용하여, 예컨대 원형 또는 약간 곡선의 바닥을 가진 웰의 바닥에 위치하는 샘플의 검사에 비하여, 바이러스 검사가 보다 정확한 결과를 제공할 수 있게 보장한다.
단일 평판바닥 웰은 분석될 특별한 바이러스 또는 바이러스들의 성장 및 단리의 적합성에 의존하여 결정될 사전선택된 셀라인으로 이미 시딩되어 제공될 수 있다. 예컨대, 셀라인 LLC-MK2는 파라인플루엔자 바이러스들 탐지에 적합하고, 인플루엔자 바이러스들에 대하여는 MDCK; Respiratory syncitial virus(RSV)에 대하여는 HEP-2 및 시토메갈로바이러스(CMV), herpes simplex virus(HSV), Enteroviruses 및 라이노바이러스(rhinovirus)에 대하여는 MRC-5가 적합하다. 숙련된 자는 주어진 바이러스의 성장 및 단리를 위한 적당한 셀라인을 선택할 수 있을 것이다.
선택한 분석시험 방법에서, 본 원에서 기술된 시딩된 단일 평판바닥 웰들은 즉각적인 사용(즉, 형식을 사용할 준비)에 적합한 형태로 제공될 수 있다는 점을 이해할 수 있다. 당업자는 형식을 사용할 준비에 있어서 사전선택된 셀라인이 대개 약 80% 내지 90%의 컨플루언시로 제공된다는 점을 이해할 것이다. 또한, 이러한 사전선택된 셀라인의 저장 안정성은 제공된 특정한 셀라인에 의존할 것이라는 점도 자명하다.
대안적으로, 시딩된 단일 평판바닥 웰은 장기 저장을 위하여 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예컨대, 시딩된 평판바닥 웰들은 세포의 장기 저장을 위한 표준 기술을 이용하여 냉동된 상태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되지는 않으나 세포 냉각 처리에 있어서, 세포들은 단일 평판바닥 웰들에서 적당한 컨플루언시로 성장될 수 있으며, 성장 배지는 적당한 저장 배지로 교체될 수 있을 것이다. 이 단계 이후, 세포들은 냉각 처리과정을 거치며, 종국적으로 -70-80℃에서 저장된다. 저장 배지는 냉동보존제(cryopresevative)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 저장 배지에 추가된 냉동보존제는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나 DMSO 및/ 또는 혈청을 포함할 수 있다. 당업자는 적당한 냉동보존제 및 이들의 용도에 대하여 익숙할 것이다. 모든 셀라인들이 냉동 처리과정에서 살아남는 것은 아니며 당업자는 이 점에 있어서 어느 셀라인들이 적당하고 부적당한지 인식할 것이다.
이후, 냉동된 형식으로 제공된 셀라인들은 적당한 해동 처리과정을 거치고, 저장 배지는 바이러스 재분리 배지로 교체될 것이다. 이후, 일단 해동된 세포들은 본 원에서 기술된 발명의 방법에서 이용되기 이전에 대개 80% 내지 90%의 컨플루언시까지 성장될 것이다.
셀라인으로 시딩된 대상(subject) 평판바닥 웰에 대한 참조는 바이러스 진단 시험에서의 이용에 제공되기 이전에 사전선택된 셀라인으로 사전 시딩된 웰에 대한 참조로서 이해될 것이다. 대안적으로, 시딩된 웰은 바이러스 진단 시험에서 이용에 제공된 후에 실제로 시딩된다. 웰들을 시딩하는 단계는 성장 배지에서 희석된 사전선택된 셀라인을 웰들에 두는 단계, 세포들을 CO2 인큐베이터안에서 세포들이 약 80% 내지 90%의 컨플루언시에 이르기까지 배양하고는 단계 및 상기 성장 배지를 유지 배지로 교체하는 단계 등의 하위 단계를 포함할 수 있다.
다수의 웰들이 특정한 바이러스의 성장 및 단리에 대하여 직접적으로 비교될 경우, 각각의 배지 체적은 동일하여야 한다는 점은 자명하다.
어떤 실시예들에서, 복수의 웰들은 사전선택된 세포주로 시딩되어, 예컨대 12x8 배열의 96 웰 플레이트 또는 6x8 배열의 48 웰 플레이트의 웰배열을 제공한다. 대안적으로, 더 큰 배열을 원하는 경우, 14x8 배열과 같은 웰배열이 제공될 수 있다. 제공되는 웰의 숫자는 특별히 제한되지 아니한다. 만약 그러한 배열들이 제공된 경우, 서로 다른 셀들이 일반적으로 배열의 서로 다른 열에 시딩될 것이며, 탐지될 바이러스에 다시 의존할 것이라는 점은 자명하다.
본 발명의 사전 시딩된 단일 평판바닥 웰들은 적당히 실링되어 운반이 가능하고 오염과 증발이 방지되도록 제공될 수 있다는 점은 자명하다. 예컨대, 복수의 웰들의 경우, 실링은 웰들의 전체 배열을 덮을 표준 48 또는 96 웰 플레이트 커버등의 형태를 취할 것이다. 대안적으로 단일 평판바닥 웰의 경우에, 실링은 각각의 웰을 실링하는 적당한 캡(cap)의 형태를 취할 수 있다. 다른 대안적인 예에서, 실링은 적당한 실링막(sealing membrane)일 수 있다.
본 원에서 기술된 본 발명에 따른 복수의 웰들 또는 단일 평판바닥 웰 중 어느 하나의 웰에 있어서 커버는 이용에 도움이 되는 마킹을 포함할 수 있다. 예컨대, 커버는 그 안에 포함된 셀라인을 나타내는 기호 또는 문자를 포함할 수 있다.
하나 이상의 셀들에서 분석될 표본을 접종하는 단계는 알려진 절차에 따라서 수행된다. 예를 들어, 이 절차는 일반적으로 적당한 양의 유지 배지를 접종할 유지 배지로부터 제거하는 단계 및 일반적으로 약 200μl 내지 300μl 양의 표본 상청액(supernatant)를 각각의 웰에 넣는 단계를 포함할 것이다. 이때, 상기 웰들은 예컨대, 이용되는 원심분리 타입에 의존하여 약 50분 내지 60분 동안 35℃에서 4000rpm으로 원심분리/배양될 수 있다.
원심분리기로부터 제거된 후, 접종원은 예컨대, 진공 흡인에 의하여 웰로부터 제거되고, 적당한 유지 배지 또는 바이러스 재분리 배지로 교체될 수 있다. 이는, 바람직하게는, 호르몬 및 효소가 보충된 세포 배양 배지를 포함한다.
본 원에서 이용되는 "분석될 표본"이라는 용어는 바이러스로 감염될 수 있거나 될 수 없는 대상으로부터 얻어진 샘플 표본들을 포함한다. 그러므로, 샘플은 탐지 가능한 바이러스를 포함할 수 있거나 바이러스가 없을 수 있다. 적당한 샘플들은 타액, 소변, 분(faeces), 뇌척수액(CSF), 기관지 폐포 세척액(bronchial alveolar lavage) 및 나소파린길 아스퍼레이트(nasopharyngeal aspirate)와 같은 호흡기액, 및 구강, 비강, 인후, 피부 및 생식기로부터 채취한 스웹(swab)으로 얻을 수 있다. 샘플 표본은 셀라인 및 바이러스와 친화적인 적당한 배지로 희석되어 이용에 제공될 수 있다.
대상물은 바이러스에 감염된 임의의 동물 종(species)일 수 있다. 예컨대, 대상물은 조류, 어류 또는 포유류일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 대상물은 포유류이다. 적당한 포유류는 양, 소, 돼지, 사슴 등과 같은 사육동물들, 개, 고양이, 토끼, 기니피그 등과 같은 애완동물들, 쥐, 래트, 원숭이 등과 같은 실험동물, 동물원에 가둔 포획동물들 및 사람을 포함한다. 바람직한 포유류는 사람이다. 다른 실시예들에서, 대상물은 조류, 특히 닭, 칠면조와 같은 사육된 가금류일 수 있다. 바이러스 탐지에 적당한 샘플을 얻기 위한 표본의 특별한 전처리 방법들은 당업자에게 잘 알려진 바이나, 초음파 분해처리 및 원심분리를 포함할 수 있으며 이에 제한되지는 않는다.
본 원에서 이용된 바와 같이, "바이러스 재분리 배지" 또는 "바이러스 재분리 배지들"이란 용어들은 바이러스 성장 및 단리에 이용되는 배지 또는 배지들을 말한다. 예컨대, 바이러스 재분리 배지는 유지 배지를 포함한다. 호르몬과 효소가 투여된 세포 배양 배지는 셀라인 반응성을 최대로 유지함은 물론 세포벽에 바이러스가 부착하는 것을 돕고, 어떤 경우에는 결과를 얻는데 걸리는 시간을 감소시킴으로써 바이러스 재분리를 유리하게 최적화한다는 사실이 본 발명의 발명자에 의하여 발견되었다.
세포 배양 배지에 첨가된 효소는 제한이 없으며, 당업자는 적당한 효소들을 인지할 수 있을 것이다. 몇몇 실시예들에서, "효소"란 용어는 단백질 분해효소를 말한다. 이들 실시예들에서, 효소는 바람직하게는 세린(sering) 또는 아스파르테이트 프로테아제(asparatate protease)이다. 대표적인 효소들은 트립신, 키모트립신 또는 펩신을 포함한다. 바람직한 실시예들에서 효소는 트립신이다.
세포 배양 배지에 첨가된 호르몬은 제한이 없으며, 당업자는 적당한 효소들을 인지할 수 있을 것이다. 몇몇 실시예들에서, "호르몬"이란 용어는 코르티코스테로이드, 바람직하게는, 글루코코르티코이드를 말한다. 더욱 바람직하게는, 호르몬은 덱사메사손(dexamethasone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 초산코르티손(cortisone acetate), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 베타메타손(betamethasone), 트리암시놀론(triamcinolone), 베클로메타손(beclomethasone), 초산플루드로코르티손(fludrocortisone acetate), 초산 디옥시코르티코스테론(deoxycorticosterone acetate(DOCA)), 및 알도스테론(aldosterone)으로부터 선택된다. 바람직한 실시예에서, 호르몬은 덱사메사손이다. 호르몬은 합성 또는 천연산 중 어느 하나일 수 있다.
호르몬 과 효소의 조합이 가장 바람직한 실시예이나, 대안적으로 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 및 덱스트란(dextran)도 유용한 것으로 밝혀졌다.
배양 배지에 첨가된 효소의 양은 바람직하게는 1μg/ml 내지 5μg/ml의 범위 내이며, 바람직하게는 약 2.5μg/ml이다. 배양 배지 내의 호르몬의 농도는 바람직 하게는 10-4M 내지 10-6M의 범위 내이며, 바람직하게는 10-5M이다. 그러나, 바람직한 덱사메타손 및 트립신의 경우, 약 10-5M 농도에서 약 2.5μg/ml의 트립신 및 덱사메타손이 보충된 세포 배양 배지가 최적의 결과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 방법에 관한 특별한 실시예는 약 10-5M 농도에서 약 2.5μg/ml의 트립신 및 덱사메타손이 보충된 세포 배양 배지들을 포함하는 바이러스 재분리 배지를 이용한다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지들은 특별히 제한되지는 않는다. 예컨대, 세포 배양 배지들은 배지-199, DMEM, RPMI-1640 또는 MEM-EAGLE을 포함할 수 있다. 그러나, 쉽게 알 수 있듯, 세포의 성장을 지원할 수 있고 용이하게 당업자가 이용할 수 있는 다양한 다른 배지들이 있다. 그러나, 바람직한 실시예에 따라서, 세포 배양 배지는 MEM-EAGLE이다.
세포 배양 배지는 세포 및 바이러스 성장을 지원할 수 있는 첨가제가 보충될 수 있으며, 상기 첨가제는 당업자에게 알려진 바이다. 특정 셀라인 및/또는 바이러스들은 최적의 성장 및 생장력(viability)을 위하여 특정의 첨가제들을 필요로 할 수 있다. 대표적인 첨가제들은 L-글루타민, 아미노산, 항생제, 혈청, HBSS(Hanks balanced salts), D-글루코스와 같은 당류, 무기염류, 비타민, 페닐레드(phenyl red), HEPES와 같은 완충액, 및 트윈(Tween)80과 같은 계면활성제를 포함한다.
상기 바이러스 재분리 배지는 종래의 튜브 방식 및 쉘 바이알법과 같은 바이러스를 식별하는 종래의 분석 처리과정에서 이용될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 재분리 배지는 본 원에서 기술된 방법 발명에서 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 이용되는 바이러스 재분리 배지는 세포 배양에 적합한 다수의 서로 다른 바이러스들의 재분리에 이용될 수 있다. 당업자에게 상기 바이러스들은 파라인플루엔자 1,2,3,4(PI 1,2,3,4), 인플루엔자 A,B(Inf A,B), RSV 바이러스(respiratory syncitial virus), 아데노바이러스(AD), 라이노바이러스(RH), 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 및 에코바이러스(echovirus), 콕사키바이러스(coxakievirus), 장바이러스(enterovirus) 및 폴리오바이러스(poliovirus)로 구성된 장내바이러스(enterovirus) 군의 바이러스들과 같은 호흡기 바이러스, 및 HSV바이러스 (herpes simplex virus) 1,2, VZV바이러스(varicella zoster virus), 풍진바이러스(rubella), 볼거리(mumps), 홍역(measles), 로타바이러스 및 폴리오마바이러스와 같은 비호흡기 바이러스를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니라는 점은 자명하다.
본 발명의 방법에서, 접종된 세포들은 알려진 조건을 이용하여 분석될 표본으로 배양될 수 있다. 예를 들어, 접종된 세포들은 바이러스로 세포를 감염시키는 시간, 45분 내지 90분, 특히 60분간, 37℃에서 배양될 수 있다. 배양은 인큐베이터에서 수행될 수 있거나 원심분리(centrifugation)로 수행될 수 있다.
바이러스는 면역형광법, 착색법, CPE 가시화등과 같은 면역 탐지 기법, 및 PCR(polymerase chain reaction), 역전사 효소 PCR(RT-PCR) 및 핵산 서열기반 증폭기술(NASBA)등과 같은 통상적으로 이용되는 분자 기법과 같은 당해 기술분야에서 알려진 통상의 탐지 방법을 이용하여 탐지될 수 있다.
검사를 위한 웰들을 준비하기 위하여, 종래의 방법론에 따른 다수의 세척 단계들이 일반적으로 이용된다. 예를 들어, 유지 배지가 일반적으로 제거되고 웰 내의 세포들은 공기 건조된다. 이후, 상기 웰들은, 예컨대, 차가운 메탄올-아세톤 혼합물(1:2비율)로 채워지고, -25℃에서 15분간 고정된다. 상기 혼합물이 제거된 후, 웰들은 다시 공기 건조된다. 이후, 탐지될 바이러스에 따라 특정 단일클론 항체들이 각각의 웰에 첨가되고, 웰들은 필요에 따라 배양된다. 이후, 상기 단일클론 항체들은 폐기되며, 웰들은 다시 세척된다. 이러한 과정이 2차 항체에 있어서 반복될 수 있다.
마지막 공기 건조가 끝난 후, 형광 봉입제(mounting medium) 1-2방울을 웰 및 면역형광 조사할 내용물에 떨어뜨린다.
이하, 본 발명의 실시예들을 도시한 첨부 도면들을 참조하여 기술한다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따라서 이용될 평판바닥 웰(10)의 특별히 바람직한 실시예는 단면이 정사각형인 메인 챔버(11), 및 단면이 원형인 서브 챔버(12)를 포함한다. 상기 서브 챔버(12)는 상기 메인 챔버(11)의 챔버 바닥(13)으로부터 연장되어 나온다. 따라서, 서브 챔버의 개구부(14)는 메인 챔버의 챔버 바닥(13)에 의하여 한정된다. 서브 챔버(12)의 외벽(15)의 원호는 메인 챔버(11)의 각각의 벽(16)의 외측까지 연장된다(도 3을 참조).
메인 챔버(11)의 벽들(16) 중 어느 하나의 벽은 웰(10)이 놓일 웰 플레이트(도시되지 않음)의 맞물리는 부분을 수용하기 위한 장홈(17)을 포함한다. 이는 플레이트 내에 웰(10)이 단단히 고정되도록 하고 플레이트로부터 웰들(10)이 이탈되 는 것과 관련된 문제를 해결한다.
서브 챔버(12)는 액체 샘플을 수용하여 서브 챔버의 개구부(14)로부터 연장되는 볼록한 표면을 유리하게 갖는 물방울 형태를 취하도록 소정의 체적을 가진다. 이는 웰에 담겨져서 웰의 측벽에 메니스커스를 형성하는 액체 샘플에 비하여, 액체의 깊이가 실질적으로 서브 챔버 전체에 걸쳐 실질적으로 일정하도록 한다. 메니스커스를 형성하는 경우, 메니스커스를 형성하는 웰의 측면상의 액체 깊이는 실질적으로 메니스커스의 최저 지점인 웰의 중심부의 액체 깊이보다 클 것이다.
바람직하게는, 메인 챔버의 높이(Y) 10mm 및 서브 챔버의 높이(Z) 1mm를 포함하는 웰의 높이(X)는 11mm이다. 웰의 너비(W)는 일반적으로 8mm이며, 벽의 두께(T)는 약 1mmd이다. 따라서, 내부 너비(Wi)는 약 6mm이다. 메인 챔버는 전형적으로 약 360μl, 서브 챔버는 약 28.3μl의 용량을 갖는다.
도 4는 탐지될 바이러스의 목록, 관련 셀라인 및 각각의 라인의 제거일수를 포함하여, 전형적인 12x8 웰 플레이트 구성(즉, 2x6x8)의 예를 보여준다. 플레이트는 본 발명에 따른 96개의 개별 평판바닥 웰들로 이루어진다.
도 4에서 보는 바와 같이, 플레이트는 다음 순서에 따라 서로 다른 셀라인으로 시딩된다:
열 1-3 LLC-MK2
열 4,5 MDCK
열 6 Hep2
열 7 A549
열 8 RK13
열 9-12 MRC-5
이러한 방식으로 설치된 플레이트는 파라인플루엔자 1,2,3,4(PI 1,2,3,4), 인플루엔자 A,B(Inf A,B), RSV 바이러스(respiratory syncitial virus), 아데노바이러스(AD), 라이노바이러스(RH), 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 및 에코바이러스(echovirus), 콕사키바이러스(coxakievirus), 장바이러스(enterovirus) 및 폴리오바이러스(poliovirus)로 구성된 장내바이러스(enterovirus) 군의 바이러스들과 같은 호흡기 바이러스, 및 HSV바이러스 (herpes simplex virus) 1,2, VZV바이러스(varicella zoster virus)와 같은 비호흡기 바이러스의 선택을 허용할 것이나 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 예에서, 6x8 웰 플레이트의 구성은 다음 순서로 시딩된 셀라인으로 구성될 수 있다:
열 1-3 A 549
열 4-6 MRC-5
이는 예컨대, CMV, HSV1,2, VZV, AD, 및 장내바이러스군의 바이러스들과 같은 바이러스들의 탐지를 가능하게 할 것이다.
마지막으로 14x8 웰들의 구성은 적당한 셀라인들을 이용하여 궁극적으로 PI 1,2,3,4; Inf A,B; RSV; AD; RH; ENT(echo, cox, ent, polio);HSV1,2; VZV; 풍진; 볼거리; 홍역; 로타바이러스; 폴리오바이러스 및 기타 병원체-바이러스들과 같은 병원체의 탐지를 가능하게 할 것이다.
웰들의 개별적인 특성으로 인하여, 셀라인들을 제거하는 일은 당면 특정 바이러스 탐지에 적절한 타임스케쥴에 의하여 선택적일 수 있다. 특히, PI 1-4의 탐지를 원한다면, A행, 예컨대 웰 A1 내지 A3가 2일째 날 제거된다. 유사하게, Inf A,B의 탐지를 원하는 경우, 웰 A4 내지 A5가 2일째 날 제거된다. 그러나, 장내바이러스의 탐지가 필요한 경우, 적당한 날(1-3)에 웰 A11이 제거된다. 개개의 웰들의 특별한 성질은 이러한 선택적 제거 및 바이러스 탐지를 용이하게 한다.
이하, 본 발명의 제 1측면의 키트(kit)를 이용하여 이어지는 특별한 절차를 참조하여 설명하기로 한다. 상기 절차의 여러 단계들은 선택적일 수 있으며, 본 발명에 대하여 어떤 방식으로든 제한되는 것으로 해석되어서는 아니될 것이다.
진공 및 멸균한 유리 파스테르 피펫을 이용하여, 접종될 모든 웰들로부터 배지가 흡인된다. 파스테르 피펫의 폐기에는 날카로운 폐기물을 담는 대용량의 용기(sharps container)가 유리하게 이용된다.
일회용 피펫을 이용하여, 웰 플레이트에서 적당한 수의 웰들이 웰당 대략 150 내지 200μl의 표본으로 접종된다. 남은 시료는 70℃ 하에 저장한다. 이 때, 뚜껑을 다시 덮고, 플레이트 내에 접종된 웰에 날짜를 기입한다.
이후, 디지털 저울에 플레이트의 무게를 재어 균형판 또는 카드를 이용하여 모든 플레이트들이 동일 중량(+/- 0.5g)이 될 때까지 균형을 조절하고 원심분리기를 로 균형을 맞출 수 있다. 원심분리기는 약 37℃에서 60분간 3500rpm으로 동작한다. 진공 및 멸균 파스테르 피펫을 이용하여, 이후 각 표본은 각각의 웰로부터 흡인되고, 각각의 표본에 대하여 새로운 일회용 피펫을 이용하여, 각각의 웰은 바이 러스 재분리 배지(BAC)로 채워진다.
이후, 플레이트를 CO2 인큐베이터 내에 조심스럽게 넣고 37℃에서 마지막 표본의 접종 후 7일째 날까지 배양함으로써, 상기 표본들은 5% CO2 인큐베이터에서 37℃의 습윤 환경에서 배양된다.
특정 단일클론 항체들을 이용하여, 면역형광 착색법이 단일 웰들의 특정 바이러스의 탐지에 유리하게 이용된다. 일반적으로, 연속되는 절차는 다음과 같다:
진공 흡인관을 이용하여, 적당한 웰(들)로부터 배지가 제거되고, 특별한 집게를 이용하여 플레이트로부터 웰들이 제거되어 다른 홀더로 이동된다. 이후, 이들은 3분간 공기 건조된다. 이후, 300μl의 차가운 아세톤-메탄올 혼합물(2:1)이 각각의 웰에 첨가되고 -20℃에서 15분간 고정된다. 이후, 고정제(fixative)는 폐기되고 샘플은 다시 2-3분간 공기 건조된다. 이후, 특정 단일클론 항체(1차)가 각각의 웰에 첨가되고, 커버 플레이트가 제자리에 놓여 지고 샘플들은 37℃에서 30분간 배양된다. 이후, 상기 샘플들은 인큐베이터로부터 제거되고 각각의 웰은 인산 완충 식염수(PBS)로 채워진다. 이후 상기 PBS는 버려진다. 이러한 절차는 4회 이상 반복된다. 샘플은 다시 3분간 공기 건조되고, 이후 1차 항체에 대하여 특이적인 2차 항체가 각각의 웰에 첨가된다. 이후, 샘플을 다시 배양한 후 상기 언급된 PBS를 이용한 반복 처리를 하고, 마지막으로 증류수로 이중 세척을 한다. 이후, 특별히 준비된 적은 양(한 방울)의 봉입제가 첨가되고 형광 현미경 하에서 결과를 관찰한다. 1단계 면역형광 착색법이 이용될 수도 있다.
명세서 및 하기 청구항 전반에 걸쳐, 문맥상 다른 것을 요구하지 않는 한, "포함한다"라는 단어 및 "포함하는"과 같은 이의 변화형은 언급된 완전체(integer) 또는 완전체 그룹 또는 단계들을 포함하는 의미로 이해될 것이지 그 밖의 다른 완전체 또는 완전체 그룹 또는 단계들을 배제하는 의미는 아니다.
당업자에게 있어서, 본 원에 기술된 발명이 본 명세서에 특별히 기술된 것과 다른 형태로 변형 및 변경이 용이하다는 점은 자명하다. 본 발명은 그러한 모든 변형 및 변경물을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서, 개별적으로 또는 총체적으로, 참조되거나 표시된 모든 단계, 특징, 구성 및 합성물, 그리고 상기 단계 또는 특징들의 2 이상의 모든 조합형태를 포함한다.

Claims (15)

  1. (i) 액체 샘플을 수용하는 개구부; 상기 개구부로부터 연장되는 측벽들 및 챔버 바닥을 가진 메인 챔버; 및
    (ii) 상기 메인 챔버의 챔버 바닥으로부터 연장되고 소정의 상기 액체 샘플을 수용하도록 적용되고, 평판바닥을 가진 서브 챔버를 포함하는 분석시험에서 이용하기 적합한 단일 평판바닥 웰.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 메인 챔버는 정사각형의 단면을 가지고, 상기 서브 챔버는 원형의 단면을 가지는 것을 특징으로 하는 단일 평판바닥 웰.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 웰에는 웰이 삽입될 웰 플레이트에 용이하게 맞물리게 하는 수단이 제공되는 것을 특징으로 하는 단일 평판바닥 웰.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 웰이 가늘어져서 상기 웰 플레이트의 받침대에 마찰 맞춤(friction fit)이 제공되는 것을 특징으로 하는 단일 평판바닥 웰.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 웰에는 상기 웰 플레이트의 받침대와 조화하는 리브(rib), 오목부(indentation) 또는 장홈(groove)이 제공되는 것을 특징으로 하는 단일 평판바닥 웰.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 웰은 식별을 위한 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 단일 평판바닥 웰.
  7. 제6항에 있어서,
    평판바닥에는 분석을 보조하기 위하여 적용된 표시부(marked division)들이 제공되는 것을 특징으로 하는 단일 평판바닥 웰.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 웰은 바이러스 재분리 배지 내에 사전선택된 셀라인으로 시딩되고, 상기 시딩된 웰은 냉각된 채이거나 이용할 준비가 된 채로 제공되는 것을 특징으로 하는 단일 평판바닥 웰.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단일 평판바닥 웰 중 하나 이상의 웰을 포함하는 웰유닛(well unit).
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단일 평판바닥 웰 또는 제9항에 따른 웰유닛을 이용하는 단계를 포함하는 분석시험을 수행하는 방법.
  11. (i) 사전선택된 셀라인으로 시딩된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단일 평판바닥 웰들을 제공하는 단계;
    (ii) 하나 이상의 웰들에 분석될 표본을 접종하는 단계; 및
    (iii) 상기 하나 이상의 웰들에서 하나 이상의 사전선택된 바이러스들을 검사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 탐지 방법.
  12. (i) 바이러스 접종에 적합한 셀라인으로 시딩된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단일 평판바닥 웰을 제공하는 단계;
    (ii) 탐지될 바이러스를 잠재적으로 포함하는 샘플을 획득하기 위하여 표본을 특이하게 전처리하는 단계;
    (iii) 상기 셀라인에 샘플을 접종하는 단계;
    (iv) 상기 접종된 셀라인을 배양하는 단계;
    (v) 상기 접종된 셀라인의 샘플 배지를 적어도 하나의 호르몬 및 적어도 하나의 효소가 보충된 세포 배양 배지를 포함하는 바이러스 재분리 배지로 교체하는 단계;
    (vi) 상기 (v)단계로부터 얻은 접종된 셀라인을 배양하는 단계; 및
    (vii) 바이러스의 존재여부를 조사하기 위하여 상기 (vi)단계로부터 얻은 셀라인을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 탐지 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단일 평판바닥 웰, 또는 제9항에 따른 웰유닛의 분석시험에서의 용도.
  14. (i) 사전선택된 셀라인으로 시딩된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단일 평판바닥 웰들을 제공하는 단계;
    (ii) 하나 이상의 웰들에 분석될 표본을 접종하는 단계; 및
    (iii) 상기 하나 이상의 웰들에서 하나 이상의 사전선택된 바이러스들을 검사하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 탐지 방법에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단일 평판바닥 웰의 용도.
  15. (i) 바이러스 접종에 적합한 셀라인으로 시딩된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단일 평판바닥 웰을 제공하는 단계;
    (ii) 탐지될 바이러스를 잠재적으로 포함하는 샘플을 획득하기 위하여 표본을 특이하게 전처리하는 단계;
    (iii) 상기 셀라인에 샘플을 접종하는 단계;
    (iv) 상기 접종된 셀라인을 배양하는 단계;
    (v) 상기 접종된 셀라인의 샘플 배지를 적어도 하나의 호르몬 및 적어도 하 나의 효소가 보충된 세포 배양 배지를 포함하는 바이러스 재분리 배지로 교체하는 단계;
    (vi) 상기 (v)단계로부터 얻은 접종된 셀라인을 배양하는 단계; 및
    (vii) 바이러스의 존재여부를 조사하기 위하여 상기 (vi)단계로부터 얻은 셀라인을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 탐지 방법에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단일 평판바닥 웰의 용도.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101895531B1 (ko) 2017-04-06 2018-09-05 고신대학교 산학협력단 암 세포주에 대한 화학 감수성 검사 키트를 이용한 검사방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7833780B2 (en) * 2005-03-10 2010-11-16 Robert Alexander Viral diagnostic method and well for use in same
EP2163306A1 (en) 2008-09-12 2010-03-17 F. Hoffmann-la Roche AG Multi-well plate with tailored chambers
TW201623604A (zh) * 2014-09-25 2016-07-01 住友電木股份有限公司 培養容器

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4599314A (en) * 1983-06-14 1986-07-08 Hsc Research Development Corporation Multiple vessel specimen tray with lid for releasably adhering vessel covers
JPS6251977A (ja) 1985-09-02 1987-03-06 Terumo Corp 組織培養プレ−ト
JPS6269979A (ja) * 1985-09-20 1987-03-31 Terumo Corp メニスカス制御用器具およびこれを備えた光透過型検査用装置
JPS6274299A (ja) * 1985-09-26 1987-04-06 Yoshio Numazaki ウイルス分離用プレ−ト
US5180555A (en) * 1988-02-16 1993-01-19 Bio Merieux Microbiological analysis cup or the like
FR2627191B1 (fr) * 1988-02-16 1991-10-11 Api System Cupule d'analyse microbiologique ou similaire
US5098661A (en) * 1988-11-16 1992-03-24 Medical Laboratory Automation, Inc. Coded cuvette for use in testing apparatus
TW328526B (en) * 1996-09-17 1998-03-21 Interlego Ag A toy building set
RU7874U1 (ru) * 1998-01-22 1998-10-16 Товарищество с ограниченной ответственностью - Научно-производственное предприятие "Аквапаст" Диагностическое средство
JP3766575B2 (ja) * 2000-01-18 2006-04-12 オリンパス株式会社 反応性微粒子を用いた分析方法および分析用容器
AU2001100242A4 (en) 2000-08-08 2001-08-30 Robert Alexander Micro titre tray assembly and viral diagnostic kit including same
US6571525B2 (en) * 2001-08-01 2003-06-03 J. David Coleman Construction block
US7833780B2 (en) * 2005-03-10 2010-11-16 Robert Alexander Viral diagnostic method and well for use in same

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101895531B1 (ko) 2017-04-06 2018-09-05 고신대학교 산학협력단 암 세포주에 대한 화학 감수성 검사 키트를 이용한 검사방법

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