JP3766575B2

JP3766575B2 - 反応性微粒子を用いた分析方法および分析用容器

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Inventors: 時男嘉納; 幸子唐木; 則子加藤; 裕児高宮
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Publication date: 2006-04-12
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的反応を介して互いに結合するような反応性微粒子を多数反応させて生物学的反応の有無等を分析するための分析方法および分析用容器に関する。本発明は、例えば免疫学的凝集反応による凝集パターンの判定に好適に利用することができる。従って、本発明によれば、例えば各種の血液型の判定や感染症の診断にとって有利な方法と手段を提供することができる。
【０００２】
【従来の技術】
現在、輸血検査や免疫学的検査において、抗原抗体反応を利用した検査手法が広く一般で用いられている。近年の傾向としては、抗原抗体反応を用いた検出手段に、その簡便性と感度の改良に伴い、凝集用粒子による凝集反応を利用した凝集像の判定の自動化が求められるようになってきた。このような凝集反応の検山は色々あるが、その中でも複数個のウェルが形成されたマイクロプレートが比較的に多く利用されるようになってきた。しかしながら、該ウェルによる凝集像の判定では、反応開始から判定可能な状態（凝集パターン形成）となる迄に、約１時間近くの時間が必要であった。そのため、ウェルによる凝集像の判定時間の短縮化が求められるようになってきた。
【０００３】
従来行われていた判定時間の短縮手法としては、例えば、遠心法，磁性粒子法等といった凝集用の粒子に対して外部から力を加えて凝集像形成を促進させる手法の他に、凝集像形成に関与するウェルの凹凸部を狭く浅くして凝集像形成を促進させる手法（特公平１−２１４５４号公報）や毛細管現象を利用した血球と粒子凝集試薬との液量を少量化して凝集像形成を促進させる手法（特開平４−１４５９４７号公報，特開平４−２０８８３６号公報）等の簡便な試みがなされている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、判定時間の短縮化に遠心法を利用しようとする場合、遠心機等の新しい機構をさらに付加せざるを得ず、そのためにシステムの大型化に伴う装置自体の大型化や、遠心による凝集像の破壊が生じる等の問題点がある。これを考慮すると、遠心法は、陽性および陰性パタ一ンの双方の明瞭な判別するための好適な手法とはいえない。また、磁性粒子法も、通常、動物血球等の安価な試薬で高感度な検査を実施している検査項目に、さらに磁性粒子試薬という新たな試薬を導入しなくてはならないため、新たに磁性粒子試薬の開発工程やコスト的な問題等が生じるため、この手法を用いることも実現化には至っていない。
【０００５】
一方、特公平１−２１４５４号公報に記載されているウェルを赤血球血液型オモテ試験に利用すれば、最短で、約３０分間だけ待つことにより、凝集パターン判別可能状態にすることが可能である（図３９を参照されたい）。確かに、ウェルの凝集像形成に関与する凹凸部の幅を狭く、且つ深さを浅くすれば、凝集像形成にかかる時間を短縮できる傾向は有る。しかし、そのような手段を講じたことにより、例え凝集像の形成にかかる時間が短縮できたとしても、その判定に充分な数量の血球や粒子凝集試薬を使用することができない場合には、従来のサイズの凝集パターンに比較して、判定の信頼性が劣ってしまう。また、頻繁に生じる問題ではないが、当該粒子の凝集に近いサイズの異物の混入等により、陽性と陰性のパターンの明確な判別が付き難くなり、かえって判定に支障を生じさせることになりかねない。
【０００６】
また、毛細管現象を利用した手法では、始めに別の容器内で試薬とサンプルと１を均等に混ぜ合わせた後、毛細管現象を利用した凝集反応検出容器に導入す工程が必要であるため、この反応工程の増加に起因して、より煩雑な判定方法となる可能性がある。
【０００７】
以上のように、従来、感度および特異性を低下させずに、３０分以内で凝集パターンを判別可能な状態にすることができる小型のウェルが求められている。本発明の目的は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、従来よりも短時間で且つ簡単に反応性微粒子による分析が可能な分析方法および分析用容器を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、従来の凝集パターンが面状での凝集用粒子の分布として現れるように構成されている点に初めて着日し、点状又は線状の頂部を形成した壁面上で凝集パターンを作ったところ、意外にも短時間で且つ鮮明に判定することが可能になるという発見に基づいて完成されたものであると共に、凝集した粒子が堆積する傾斜面上で粒子の崩落を起こし始める長さ（以下、崩落臨界長と称する）が存在するという発見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
即ち、請求項１に係る発明は、生物学的反応により互いに結合し得る反応微粒子群を含む被検液により、反応後に形成される微粒子群を、反応性微粒子が崩落する崩落領域を有する筋状の凹凸部に供給し、前記凹凸部の崩落開始部位の近傍の崩落状態を筋状に沿って観察または画像解析によって判定し、前記判定結果に基づいて生物学的反応の有無等を決定することを特徴とする反応性微粒子を用いてた分析方法である。
【００１０】
また、請求項１に係る発明において、凹凸部は、下向きの凹部、上向きの凸部または上下両方向に取る歩であることが好ましい。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態について、図面を用いて以下に説明する。図１はウェルを有したマイクロプレートを示す平面図であり、図２は図１に示すマイクロプレートをＡ−Ａ’で切った断面図である。図１に示すマイクロプレート１には、上にアクリル等の耐薬品性のフラスチック材料が用いられており、このようなプラスチック材料よりなる基板に８×１２個の同一構成のウェル２がマトリクス状に形成されている。
【００１２】
以下、ウェルの構成について種々説明する。図３は、本発明の第１の実施形態の分析用容器に具備されるウェル２の断面図を示したものである。
【００１３】
図３に示すウェル２は、ほぼ円柱形状となるように形成され、さらに、平坦なウェル底面２ａの中央部と周縁部との中間付近には、小さな上向きの環状凸部３が１本形成される。環状凸部３は、峰部分３ａが尖った逆Ｖ字形状の断面を成しており、その傾斜面３ｂは、凝集または非凝集の各パターンが明確に異なって観察できる程度の長さであって、しかも、凝集粒子が崩落を起こし始めるようなような崩落臨界長よりも短いサイズに設定されている。
【００１４】
上記ウェル２による陰性または陽性時の状態について、図４、５、６および７を参照して以下に説明する。上述したウェル２で凝集陰性を判別する場合、図３に示す断面形状のウェル２内では、血球若しくは粒子反応試薬（以下、凝集粒子と称する）は凝集しないため、凸部傾斜面３ｂに凝集粒子は堆積することなく、凸部下端３ｃの平坦面に崩落する（図４を参照されたい）。特に、凸部の峰部分３ａでは、いち早く非凝集粒子が崩落して峰線に沿い非常に鮮明な１本の環形の筋状パターンを呈するので、凝集の有無を迅速に判定することが可能となる。
【００１５】
その時の図４に示すウェル２を上るから見ると、ウェル底面２ａには凝集粒子による円形の薄膜上に、環状凸部３の峰部分３ａから非凝集の凝集粒子が崩落して露呈された１本の鮮明な環状擬集パターンを形成することができる（図５を参照されたい）。
【００１６】
また、上述したウェル２で凝集陽性を判別する場合、ウェル２内の凝集粒子は凝集物を生じるので、凸部傾斜面３ｂにも凝集粒子が堆積する（図６を参照されたい）。この時の図６に示すウェル２を上方からみると、ウェル底面２ａには一様に堆積した凝集粒子による円形の凝集パターンをみることができる（図７を参照されたい）。
【００１７】
また、第１の実施形態においては、中心側の傾斜面３ｂを形成せずに台地状に高くなるような段差を有する凸部に設計変更してもよい。
【００１８】
図８は、本発明の第２の実施形態である反応用容器に具備されれる１つのウェル２の断面図を示したものである。図８に示すウェル２は、ほぼ円柱形状となるように形成され、さらに、ウェル２のほぼ平坦な底面２ａには、小さな下向きの環状凹部４が１本形成される。
【００１９】
上記ウェル２による陰性および陽性時の状態について、図９および１０を参照して以下に説明する。上述したウェル２で凝集陰性を判別する場合、図８に示す断面形状のウェル２内では、凝集粒子は凝集を行わないため、凸部傾斜面４ｂに凝集粒子は堆積することなく、凸部下端の谷底部分４ａに集中して崩落する（図９を参照されたい）。その時の図９に示すウェル２を上方からみると、ウェル底面２ａには凝集粒子による円形の薄膜上に、環状の凹部傾斜面４ｂによる非凝集部分と、該非凝集部分をニ分するような環、即ち、谷底部分４ａに崩落した凝集粒子によって谷線に沿い暗色の環状凝集部分とからなる凝集パターンをみることができる（図１０を参照されたい）。特に、凸部上端部４ｃでは、いち早く非凝集粒子が崩落して鮮明な２本の環形の筋状パターンを呈するので、その特異なパターンに基づいて凝集の有無を迅速に判定できる。また、上述したウェル２で凝集陽性を判別する場合、ウェル２内の凝集粒子は凝集物を生じるので、凹部傾斜面４ｂにも凝集粒子が堆積する（図１１を参照されたい）。この時の図１１に示すウェル２を上方からみると、ウェル底面２ａには図７と同様、一様に堆積した凝集粒子による円形の凝集パターンをみることができる（図１１および１２を参照されたい）。
【００２０】
また、第２の実施形態においては、中心側の傾斜面４ｂを形成せずに台地状に低くなるような段差を有する凸部に設計変更してもよい。
【００２１】
図１３は、本発明の第３の実施形態である反応用容器に具備されるウェル２の断面図を示したものである。図１３に示すウェル２は、ほぼ円柱形状となるように形成され、さらに、ウェル２のほぼ平坦なウェル底面２ａには、小さな上向きの円錐状凸部５が２個形成される。
【００２２】
また、第３の実施形態においては、点状の底部を有するように傾斜した凹部であってもよく、この場合には、非凝集の凝集粒子の崩落し始める凹部頂面近傍の傾斜において小径の環状パターンが観察される。
【００２３】
上述した実施形態における筋状パターンとは、非凝集粒子の崩落によって露呈する容器表面が２本以上の線状パターンを形成することをいう。従って、独立した２本以上の線状凹凸部（凸部および／または凹部）或いは一筆書き（例えば、蛇行状、螺旋状等）のように連続した１本の線状凹凸部であり得る。また、筋状パターンは、一部が交叉したり断続的であってもよい。
【００２４】
上記ウェル２による陰性および陽性時の状態について、図１４、１５、１６および１７を参照して以下に説明する。上述したウェル２で凝集陰性を判別する場合、図１３に示す断面形状のウェル２内では、凝集粒子は凝集を行なわないため、凸部傾斜面５ｂに凝集粒子は堆積することなく、凸部下端５ｃの平坦部に崩落する（図１４を参照されたい）。その時の図１４に示すウェル２を上方からみると、ウェル底面２ａには凝集粒子による円形の薄膜上に、２個の円錐状凸部５の部分による２個の小円形の非凝集部分を形成した凝集パターンをみることができる（図１５を参照されたい）。
【００２５】
特に、凸部頂点部分５ａでは、いち早く非凝集粒子が崩落して極めて鮮明な２個の小円形のドット状パターンを呈するので、凝集の有無を極めて短時間に判定することができる。
【００２６】
また、上述したウェル２で凝集陽性を判別する場合、ウェル２内の凝集粒子は凝集物を生じるので、凸部傾斜面５ｂにも凝集粒子が堆積する（図１６を参照されたい）。この時の図１５に示すウェル２を上方からみると、ウェル底面２ａには図７、図１２と同様、一様に堆積した凝集粒子による円形の凝集パターンをみることができる（図１７を参照されたい）。
【００２７】
以上で説明した凝集粒子の分布用の凸部および／または凹部は、凝集した凝集粒子が自重により崩落を起こし始めるような上記崩落臨界レベルに達しない程度であって、且つ非凝集の凝集粒子が崩落し始めたことを確認できる程度の傾斜面を有する溝をウェル底面に形成することによって完成される。係る傾斜面の構成は、使用する凝集粒子の特徴（直径、形状、比重、材質等）、ウェル表面または凝集粒子表面の物理化学的状態、反応時の液体の特性（粘性、比重等）によって、適宜実験的に設定可能である。図１８に示すウェル２は、本発明の第４の実施形態を示すものであり、図１８は１個のウェル２の断面図を示しており、図１９は図１８に示したウェル２ａ底面のー部をさらに拡大した図を示したものである。
【００２８】
図１８に示すウェル２の外観は、ほぼ円柱形状となるように形成され、さらに、ウェル底面２ａに同心円状の複数の相似した凸形状からなる溝６を規則的な間隔で水平面上に形成することにより、上向きの凸部と下向きの凹部との両方を連続的に交互に設けて、図１９に示すような鋸歯波形状の断面形状を形成している。
【００２９】
前述した溝６は、凝集陰性時、凝集粒子が速やかに谷底部分６ｃに堆積でき、また凝集陽性時、凝集粒子が落下時に各傾斜面６ｂに留まり、重力等によって崩落しないような深さ，幅及び角度であることが好ましい。ここでは、一般的な天然または人工の凝集粒子（直径約２〜８μｍ）について、内径（Ｄ）が６ｍｍのウェル底面の溝は、深さ（ｈ）を０．１〜０．１５ｍｍの範囲に設定し、溝幅（ｄ）を０．３〜１．０ｍｍの範囲、好ましくは（ｄ）を０．４〜０．６ｍｍの範囲に設定し、傾斜角度（θ）を水平に対して５〜６０°、好ましくは１０〜４５°、特に好ましくは２０〜３５°に設定し、溝数はウェルの大きさに応じて適宜決定して構わない。また、傾斜の長さは、直径１〜２５μｍの凝集粒子については、０．０５〜１．５ｍｍ、直径２〜１０μｍの凝集粒子については０．１〜０．７ｍｍ、直径３〜８μｍの凝集粒子については０．１５〜０．５ｍｍが好ましい。ここでの溝数は複数であるものとする。
【００３０】
上記ウェル２による陰性および陽性時の状態について、図１９、２０、２１および２２を参照して以下に説明する。上述したウェル２で凝集陰性を判別する場合、図１８に示す断面形状のウェル２内では、凝集粒子は凝集を行わないため、複数の傾斜面６ｂの凸部分には凝集粒子は堆積することなく、凸部下端の谷底部分６ｃに崩落する（図１９を参照されたい）。その時の図１９に示すウェルを上方からみると、ウェル底面２ｃには環状凸部の部分による非凝集部分と、該非凝集部分を２分するような環、即ち、谷底部分６ｃに崩落した凝集粒子による凝集部分とからなる筋状の複数の凝集パターンをみることができる（図２０を参照されたい）。特に、凸部の峰部分６ａの峰線状には、いち早く非凝集粒子が崩落したことによる明色の筋状パターンが現れるばかりでなく、谷底部分６ｃの谷線上には集中して堆積した非凝集粒子による暗色の筋状パターンが生じてくるので、その相乗効果により最も明瞭な環状パターンを迅速に得ることができる。
【００３１】
また、上述したウェル２で凝集陽性を判別する場合、ウェル２内の凝集粒子は凝集物を生じるので、凸部の傾斜面６ｂにも凝集粒子が堆積する（図２１を参照されたい）。この時の図２１に示すウェル２を上方からみると、ウェル底面２ａには図７、図１２、図１７と同様、一様に堆積した凝集粒子による円形の凝集パターンをみることができる（図２２を参照されたい）。
【００３２】
上述した構成のウェルを用いると、使用する粒子の数量自体は従来と同程度であっても、全ての粒子が凝集パターンを形成し終わる迄の時間を短くすることができるので、検査時間の短縮化につながる。
【００３３】
また、ウェル底面に複数の同心円状の凝集ポイントがあることにより、凝集有無の確認が容易になって凝集像判定精度が向上する。
【００３４】
本発明のウェル底面の形状は、特に前述したような断面形状のものに限定されるものではなく、種々の変更、又は変形が可能である。
【００３５】
また、従来は、凝集法によるサンフル中の抗原および抗体の定量的な測定には、以下のような手法がとられていた。即ち、サンフルを倍々希釈して、希釈したサンプル毎にウェル内で凝集が起こるか起こらないかを判定し、その時、どの程度の希釈で凝集が生じたかを判別することにより、サンプル内に存在する抗原や抗体の量がどの程度であるかを判別していた。なお、定量の精度は、希釈倍率の粗さで決まっていたため、精度の高い測定をしようとすると、細かい倍率での希釈を行っていた。しかしながら、凝集限界の倍率迄サンプルを薄めるには、多数の希釈サンプルを作成する必要があるので、その判定のための希釈容器も多数必要となる。そのため、前述した本発明に係る粒子凝集パターンの検出原理を用いると、一般にウェル底面の傾斜面の傾斜角度の程度により判別精度を色々変化させることができ、例えば傾斜を緩くして弱い凝集反応でも検出できるようにしたり、また傾斜を急にして強い凝集反応でも検出しにくくしたりするなどの調節を行なうことができるので、このような性質を利用すると凝集力の強弱に関係なく、定量的な測定を行うことができる。
【００３６】
ここでは、後述するような断面形状の反応容器を用いることにより、希釈サンプル及びサンプル作成に係る凝集判定容器も減らすことができると共に、より精度の高い定量的な測定が行える。
【００３７】
以下に、ウェル底面の溝毎に溝部の深さ、幅、傾斜角度等の変化を付けることにより、異なる凝集力価の検体をパターンとして捕えることに関する例について、図２３、２４、２５、２６、２７および２８を参照して説明する。
【００３８】
図２３は、ウェルの中心部に向かうに従い、ウェルに刻んだ溝の深さが浅くなるように（且つ、角度はー定で）設定した容器を示しており、ウェル底面を図２３のような溝にすることにより、中心部に近い程、溝部の斜面上に堆積する粒子量を少なくして、周辺部に行くにつれて多くすることができる。
【００３９】
この場合、同じ凝集力を有した凝集粒子が堆積したとしても、斜面が浅い中心部程、粒子凝集パターンは安定し、周辺に行くに従い、崩れて、溝部に堆積して陰性化し易くなる。
【００４０】
また、判定としては、凝集力価の強弱に関係なく、力価が弱いと微小な変化でも図２４に示すように周辺部の溝から粒子が堆積し、筋状の部分が検出され、力価が強いと、図２４に示すように検出される溝の数は少ない。
【００４１】
本発明は、このように、通常、定量化しにくい境界領域の凝集パターンを精度よく判定することができる。
【００４２】
以下の図２５、２６、２７および２８も同機の原理に基づいてなされたものであり、図２５に示すウェル底面の溝は、深さー定で、溝幅をウェル中央から徐々に広くした場合を示している。
【００４３】
ウェル底面を図２５のような溝にすることにより、凝集力価の強弱に関係なく、微小な変化でも図２５に示すような凝集パターンとして表すことができる。
【００４４】
また、図２７に示すウェル底面の溝は、溝幅一定で、溝の深さをウェル４１央の浅い状態から徐々に深い状態にした場合を示している。
【００４５】
ウェル底面を図２７のような溝にすることにより、凝集力価の強弱に関係なく、微小な変化でも図２８に示すような凝集パターンとして表すことができる。
【００４６】
このようにして得た凝集パターンは、画像処理等を行なうと１つのウェルで力価を数値化することができるだけでなく、溝の深さや幅、傾斜角度をウェル内で変化（即ち、中央部に向かって順次深くなる、若しくは角度が鋭角になる、またはその逆である）させたり、種々組み合わせたりすることにより、弱い抗体が血球若しくは粒子で形成させ得る薄膜状に堆積する凝集塊が、溝底部に崩落し始める溝の位置から、通常の凝集法では検出、定量できない程度の力価の弱い抗体の凝集力価を１つのウェル内で比較定量することができる。
【００４７】
また、図２３〜２８に示すウェルであると凝集力価を定量比較することができ、さらに、このようにして得た凝集パターンを画像処理する等をして、１つのウェルで力価を数値化することができる。
【００４８】
以上の理由から、凝集力価の弱い抗体の検出（通常、血液型ウラ試験）には図２３〜２８に示すウェルを使用するのが好適である。
【００４９】
本発明においては、凝集像を形成させるウェル底面の溝が従来よりも浅いことにより、判別可能な状態の凝集パターンを早く形成することができ、また溝を複数設けたことにより、判定に拘わる検出単位を増やすことができて、感度特異性の向上も望める。
【００５０】
以上のように１ウェルに対してウェル底面に、複数種類の溝の角度や深さを設けることにより、通常より少ないウェル数で凝集力価の定量を決定することが可能となる。
【００５１】
また、例えば、現状、ある検体の凝集力価を決定する場合は、その検体を順次、段階的に希釈した希釈系列を作成し、その希釈したサンプル液の数だけのウェルを用いて各々凝集反応を行い、どの希釈段階で凝集が陰性化したかにより、力価を決定しているのに対して、上述したように、１つのウェルの中で力価の定量を行うことができれば、多数の希釈系列を作成しなくても、より少ないウェル数で力価を決定できる。
【００５２】
また、ウェル底面の全微分をＣＣＤカメラによる画像解析装置で行うことによって、より定量的に数値化したデータを提供することもできると共に、信頼性の高い判定も可能となる。
【００５３】
さらに、凝集反応を行う部分の周辺に血球量モニター用の平坦部を設けると、血球濃度の異なる検体に対して測定値を補正することもできるようになる。また、ウェル底面の平面形状については、上記実施形態のものに限られるものではなく、図２９、３０および３１に示す四角形状にしてもよい。
【００５４】
特に、図３１に示すウェルの形状は、複数個の四角錐を規則的に配置することにより、凝集陰性時の凝集粒子は四角錐の点状の凸部には堆積しないで、全て傾斜面上を崩落してウェル底面に凝集粒子による格子状の凝集パターンを形成させたり、また前述した形状をそのまま反転させることもできる。
【００５５】
また、図１３に示す上向きの円錐状凸部も、実施形態のものに限られず、図示していないが、例えば上向きの四角錐状凸部や、上向きの円柱形状凸部を斜めに切断した形状にすることもできる。
【００５６】
また、ウェルの溝の形状についても、上記実施形態に限られるものではなく、図３２、３３に示すように、一方向のみに傾斜した形状にすることもでき、これによって、傾斜側から観察または画像解析すると、縞状のパターンを形成することができる。
【００５７】
また、図３４、３５に示すように、適宜の平坦部を介在させて凸部と凹部とを交互に配置するようにして崩落条件を多様化させることにより、凝集粒子の崩落特性に依存せずに、常に明瞭な線状パターンを得ることができる。なお、図３４では、凸部と凹部とを連続させた連続斜面と段差面の両方を混在させているので、連続斜面に関しては崩落臨界長よりも長くならないように設計するのが好ましい。
【００５８】
また、図３４、３５に示した構成のように、点状の収束部分を有するように傾斜した凸部と凹部を交互に一組以上形成してもよい。
【００５９】
また、傾斜面に図３６に示すような微細な階段状に刻まれた滑り止め用の微小段差７（深さは２〜５０μｍである。特公昭６１−４４２６８号公報を参照されたい）を複数形成することにより、凝集陽性時の凝集粒子が傾斜面８上を崩落するのを妨げて、径斜面の長さを比較的長く設計したい場合や凝集粒子が崩落し易い場合等でも、凝集パターンの安定度をより高めることもできる。
【００６０】
なお、上記微細な階段状の溝同上の間隔が短ければ、弱い凝集の場合でもより安定度を高めることができる。
【００６１】
また、各溝の頂部又は谷部は、同一の高さにー致させることで、凝集パターンの時間変化を一致させることができる。
【００６２】
一方、異なる高さにすれば、多様な反応結果を凝集パターンの形成速度に基づいて判定できる。
【００６３】
また、上述したマイクロプレートは実施形態で参照したものに限定されず、例えば、検査項目が少ない場合、８×１２個のウェルを有するマイクロプレートでは無駄が多すぎるため、８個のウェルを縦一列に形成したモジュール状のプレートや、１個のウェルのみの容器（特開平１−１０９２４６号公報を参照されたい）を用いることもでき、それによって効率的な検査を行うことができる。
【００６４】
以上のように、ウェルの溝の深さ及び溝幅は、容器底面において筋状の凝集像が形成できるだけでなく、凝集陰性時に堆積した血球や粒子凝集試薬が、反応条件下の濃度で光学的手法または肉眼で筋状に観察できるだけの広さおよび深さを有するものであれば特に限定されない。
【００６５】
また、マイクロプレートを構成する材料についても、実施形態で述べたアクリル等の耐薬品性のプラスチック材料に限定されるものではなく、例えば材料にガラスを用いることもできる。
【００６６】
また、本発明は、血球凝集による反応に限らず、凝集パターンを形成する任意の凝集反応にも適用することができる。
【００６７】
本発明の分析方法または分析用容器によれば、上述した凹凸部を設けることによって、非凝集の凝集粒子が崩落し始める部分を判定用に利用できるようになり、これによって、凝集または非凝集の違いに伴なう凝集粒子の転がり易さの違いをパターン形成過程の初期に鮮明なパターンの差として表現でき、常に迅速且つ識別容易な凝集パターンを得ることができる。多数（好ましくは４個以上）の筋状、点状ないし環状パターンは、肉眼での判定を容易にする点で重要である。本発明における複数（例えば、２以上、好ましくは４以上）の凹部および／または凸部の配置の高さは、傾斜面上でもよいが、この場合には、個々の凹部および／または凸部で独立して凝集パターンが形成される必要があるので、高位置の凹部および／または凸部から低位置の凹部および／または凸部への凝集粒子が流れ込まないような設定にする。このように、傾斜面上に複数の凹部および／または凸部を配置させた場合には、凝集と非凝集の明度差に高低差が現われるので、凝集粒子の数量を分析すべき項目によって変更する必要がある場合やサンプル自身の凝集粒子（例えば、赤血球）のように粒子量が未知ないし変動する場合に、何れかの凹部および／または凸部が最良の粒子量でもって沈降して最良のＳ／Ｎ比で判定することができ、粒子量に応じたデータ補正を不要にすることもできる。とはいえ、本発明における複数（例えば、２以上、好ましくは４以上）の凹部および／または凸部の高さは、水平面上がより好ましい。何故ならば、水平面上に沈降する凝集粒子の数量が個々の凹部および／または凸部において均一であるために、個々の凹部および／または凸部において展開される凝集と非凝集の明度差が全て最大のものとなるので、凹部および／または凸部の個数が多いほど肉眼観察のような巨視的な判定を容易にするからである。凝集粒子の数量非凝集粒子が容器表面を覆っている場合と覆っていない場合とで異なる明度の差は、本発明の方法および容器によって、最も強調されるので、肉眼での識別が容易であるばかりでなく、ＣＣＤ等の画像取込み手段で撮像した容器底面の画像データを微分解析等の演算により画素別の明度差で比較する自動測定においても定量的判定の精度を向上させる。なお、容器の凹凸部において、非凝集の凝集粒子が崩落し始める崩落初期部位が長いおよび／または多いほど、より感度の低い
測定手段で判定できる。しかし、崩落初期部位が短い／または少ない場合でも、局所領域を測定できるような分解能を有する測定装置（高密度ＣＣＤ、レーザ顕微鏡等）を用いたり、拡大用レンズにより肉眼観察すれば、同様の作用効果を享受することができる。
【００６８】
【実施例】
以下に本発明のウェルを用いた実施例について図面を用いて説明する。
【００６９】
本発明の実施例に係るウェルは、図１８〜２０の示したものと同様の構成を有するものであり、直径約６ｍｍのアクリル製のウェル底面に対して鋸状に凹部と凸部が連続した凹凸部からなる傾斜した溝を形成している。更に、溝は、深さ（ｈ）が０．１ｍｍ、幅（ｄ）が０．２ｍｍ、傾斜角度が３０°、傾斜面の傾斜方向の長さが０．１７ｍｍ、溝数が４個（即ち、峰線が４本、谷線が４本）となっている。一方、比較例として使用したものは、特公平１−２１４５４に記載のウェルであり、直径約６ｍｍのアクリル製のウェルに対して同心円状に直角に落ち込んだ、傾斜のない段差を設けることにより、凝集パターンを形成する部分を直径約４ｍｍに縮小した第２の縮小形ウェルを中央に設けた構成を有する（図３９を参照されたい）。この第２の縮小形ウェルの底面の形状は、従来の一般的なウェルと同様に下向きに凹んだ略円錐形であり、Ｖ字上に傾斜した断面を有するものであり（特公昭６１−４４２６８号を参照されたい）、底面の傾斜部分は、深さ（ｈ）が約１ｍｍ、幅（ｄ）が約２ｍｍ、傾斜角度が約３０°、傾斜面の傾斜方向の長さが約１．７ｍｍとなっている。
【００７０】
［血液型オモテ試験］
本実施例の血液型オモテ試験には、マイクロプレートに実施形態で述べたのと同様のものを用い、抗体（以下、抗体試薬原液と称する）に血液型判定用モノクローナル抗体抗Ａ，抗Ｂと、血液型判定用ポリクローナル抗体抗Ｄとを用いて行う。
【００７１】
また、抗原には、Ａ型（Ｒｈ＋）、Ｂ地（Ｒｈ＋）、Ｏ型（Ｒｈ＋）、ＡＢ型（Ｒｈ＋）、Ａ型（Ｒｈ−）のヒト生赤血球が用いられており、夫々の血球については生理食塩水で希釈をして１．５％に調製した血球浮遊液を作る。
【００７２】
始めに、抗原である前記各血球浮遊液と３種類の前記抗体とを、抗原抗体反応させるために、当該プレート上にマトリクス状に形成された各ウェルに、５倍に希釈した各種抗体試薬原液を各列に２５μＬづつ添加する（５行（抗原の種類の数）×３列（抗体の種類の数））。
【００７３】
抗体の添加が終了した各ウェルには、さらに各抗原を各行２５μＬづつ添加して（５行（抗原の種類の数）×３列（抗体の種類の数））、各種反応溶液を作製し、各種反応溶液の反応を促進させるためにプレートミキサーで軽く攪拌した後で静置させる。
【００７４】
次いで、静置開始から約５分後には、各反応溶液が陰性であるか陽性であるかの確認が各ウェルの沈降パターンの差によって見られるようになり、さらに静置開始後約１０〜１５分後には、肉眼によって陰性であるか陽性であるかの判別が凝集パターンから確定することができる。
【００７５】
図３７は、上述した赤血球血液型オモテ試験を行った際の反応例（反応開始から約１５分後）を既略図として示したものであり、図のように陽性の場合には血球がウェル底面に一様に広がり、陰性の場合には血球が同心円状（即ち、渦巻き状）に沈降すれば、肉眼でも明らかに陽性および陰性パターンの識別が容易にできることが分かる。
【００７６】
このウェルによれば、凝集が生じた場合にはウェル全体が暗くなり、凝集が生じなかった場合にはウェル全体が明るくなるので、肉眼で判定する際に一目瞭然となる。一方、図３８は、図３９に示した従来の迅速化のためのウェルを用いて反応開始から３５分後に得られる反応例であり、縮小された底面について、凝集が生じた場合には縮小されたウェルの底面全体が暗くなり、凝集が生じなかった場合には非凝集の凝集粒子が充分にウェル中央に崩落した場合に始めてウェル中心に丸い暗点が観察されるので、肉眼で判定する際に充分に凝集粒子が崩落するまでの間は陽性か陰性かを区別できず、最短でも反応開始から約３０分経過しないと判定の予想ができなかった。このように、この実施例では、従来技術に係る縮小形ウェルの径斜面に関する傾斜方向の長さに対して、本発明に係るウェル上の溝の傾斜面に関する傾斜方向の長さを１０分の１にしたことによって、肉眼でも凝集か非凝集かの予測判定を５分以内に行なえる程度に明瞭なパターンの違いが得られ、１０〜１５分程度で凝集パターンの形成が終了し、且つ一目瞭然なパターンの違いが得られる。なお、図３９に示すウェルは、垂直且つ円錐状の凹部であるため、非凝集の凝集粒子が崩落し始めるような傾斜部位を有さず、本発明のような鮮明なパターンは観察されない。
【００７７】
以上のように、反応開始から凝集パターンの判定可能状態になるまでに係る時間を、従来の６０分から約１５〜２０分程度に短縮することができる。
【００７８】
上述したのと同様の実験を、それぞれの濃度を変えて、赤血球１．６％，抗体１６倍希釈についても行なったところ、１０分で凝集パターンの差が出現開始した。
【００７９】
【発明の効果】
本発明は、例えば抗原抗体反応のような、凝集反応を用いて反応の有無を検出する検出系において、従来よりも短時間で反応結果を判定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウェルを有するマイクロプレートを示す平面図。
【図２】図１のマイクロプレートを線Ａ−Ａ’で切った断面図。
【図３】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの断面図。
【図４】凝集陰性の場合の図３のウェルの断面図。
【図５】凝集陰性の場合の図３のウェルの底面を示す図。
【図６】凝集陽性の場合の図３のウェルの断面図。
【図７】凝集陽性の場合の図３のウェルの底面を示す図。
【図８】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの断面図。
【図９】凝集陰性の場合の図８のウェルの断面図。
【図１０】凝集陰性の場合の図８のウェルの底面を示す図。
【図１１】凝集陽性の場合の図９のウェルの断面図。
【図１２】凝集陽性の場合の図９のウェルの底面を示す図。
【図１３】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの断面図。
【図１４】凝集陰性の場合の図１３のウェルの断面図。
【図１５】凝集陰性の場合の図１３のウェルの底面を示す図。
【図１６】凝集陽性の場合の図１３のウェルの断面図。
【図１７】凝集陽性の場合の図１３のウェルの底面を示す図。
【図１８】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの断面図。
【図１９】凝集陰性の場合の図１８のウェルの断面図。
【図２０】凝集陰性の場合の図１８のウェルの底面を示す図。
【図２１】凝集陽性の場合の図１８のウェルの断面図。
【図２２】凝集陽性の場合の図１８のウェルの底面を示す図。
【図２３】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの断面図。
【図２４】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面を示す図。
【図２５】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの断面図。
【図２６】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面を示す図。
【図２７】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの断面図。
【図２８】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面を示す図。
【図２９】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面を示す図。
【図３０】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面を示す図。
【図３１】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面を示す図。
【図３２】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面の溝パターンを示す図。
【図３３】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面の溝パターンを示す図。
【図３４】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面の溝パターンを示す図。
【図３５】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面の溝パターンを示す図。
【図３６】本発明の好ましい態様である分析用容器に具備されるウェルの底面の溝パターンを示す図。
【図３７】本発明の反応用容器を用いて赤血球血液型オモテ試験を行なった場合に得られる結果を示す図。
【図３８】従来の反応用容器を用いて赤血球血液型オモテ試験を行なった場合に得られる結果を示す図。
【図３９】従来の分析用容器に具備されるウェルの断面図。
【符号の説明】
１．マイクロプレート２．ウェル

Claims

生物学的凝集反応により互いに結合し得る凝集反応性微粒子群を含む被検液により、反応後に形成される微粒子群の分布像に基づいて生物学的凝集反応を分析する分析方法において、
前記凝集反応後の凝集反応性微粒子群を、底面に逆Ｖ字形状の断面を有する凸部を四以上備えた反応容器に供給し、
前記凝集反応性微粒子が、前記凸部の頂部において崩落しているか否かを観察又は画像解析によって判定し、
前記判定結果に基づいて生物学的凝集反応の有無を決定することを特徴とする、凝集反応性微粒子を用いた分析方法。
前記凸部の頂部は、前記凸部の最上点から0.05〜1.5ｍｍの長さの領域である、請求項１に記載の分析方法。
凝集した微粒子が崩落を起こし始める長さより短い長さを有する傾斜面から成り逆Ｖ字形状の断面を有する凸部を底面に四以上備えたことを特徴とする、請求項１又は２に記載の分析方法に用いるための分析用容器。
前記凸部の頂部が、線状であることを特徴とする、請求項３に記載の分析用容器。
前記凸部の頂部が、点状であることを特徴とする、請求項３に記載の分析用容器。
前記分析用容器の底面に、さらに凹部を四以上備えたことを特徴とする、請求項３〜５の何れか一項に記載の分析用容器。
前記傾斜面の長さおよび／または傾斜角度が異なる、複数の凸部を備えたことを特徴とする、請求項３〜６の何れか一項に記載の分析用容器。
前記傾斜面の長さは、0.05〜0.7ｍｍである、請求項３〜７の何れか一項に記載の分析用容器。