CN104459120A - 一种家蚕核型多角体病毒免疫胶体金试纸条及检测方法 - Google Patents

一种家蚕核型多角体病毒免疫胶体金试纸条及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种家蚕核型多角体病毒免疫胶体金检测试纸条及检测方法，具体涉及一种免疫层析技术检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金诊断试纸条及其制备方法，属于病毒疫病诊断技术领域；本发明所述的免疫胶体金试纸条包括：标记抗原BmNPV-Lef4抗体的胶体金垫和包被的硝酸纤维膜，其中硝酸纤维膜上部检测线包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纤维膜下部的质控线包被羊抗鼠IgG；该胶体金试纸条用于检测家蚕核型多角体病毒，与传统的胶体金检测方法相比，在胶体金检测试纸条制备时采用了双抗体夹心法，并对两种病毒抗体的浓度配比进行了调试，能够有效地保证检测结果的特异性、灵敏度和稳定性，其检测灵敏度高，检测方法简便，也是首次应用于家蚕核型多角体病毒检测中。

Description

一种家蚕核型多角体病毒免疫胶体金试纸条及检测方法
技术领域
本发明涉及一种家蚕核型多角体病毒免疫胶体金检测试纸条及检测方法，具体涉及一种免疫层析技术检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金诊断试纸条及其制备方法，属于病毒疫病诊断技术领域。 
背景技术
家蚕是重要的经济昆虫，所产蚕丝是丝绸原料的主要来源，在人类经济生活与历史文化中均具有重要的地位。然而高发的蚕病直接影响蚕茧的产量及质量，制约了养蚕业的健康和持续发展。蚕病分传染性蚕病和非传染性蚕病，以传染性蚕病危害为重。常见的传染性蚕病主要是僵病、脓病、软化病等三种。这些病的共同特点是潜伏期长、发病快、来势猛、范围广、危害性大，一般会导致减产10～20%，严重时高达80～90%，甚至颗粒无收，给蚕农带来极大的损失。而家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NuclearPolyhedrosisVirus，BmNPV）病是养蚕生产上最常见的、危害最严重的一类蚕病，家蚕患此病的后期常流出脓汁，内含大量的多角体病毒，俗称脓病。
目前在实际工作中用于检测该病毒的检测试剂盒几乎未见，而实验室常采用的检测技术也多为常规PCR检测，而PCR检测方法存在用时太长、成本高、操作复杂以及不易临场即时检测等多种问题。与之相比，免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique，ICG)作为一种以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体反应的一种新型的免疫标记技术，是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术，具有多项优点，如操作简便，不需要花费时间做培训；整个检测过程耗时短，生产和使用成本低；免疫胶体金试纸条稳定性好，无需冷藏；检测对象种类丰富，不仅用于查血、尿等，还用于查细菌、病毒等；适用于基层单位和养殖户在现场做检测和诊断。近年来，该技术在医学、动植物检疫、食品安全监测等领域得到了广泛的应用。而到目前为止，该技术在家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的检测中尚未见报道，而且由于家蚕的血淋巴和组织采集方便，特别血淋巴不易凝固，可以直接采集家蚕血淋巴用于胶体金检测中，可极大地减少操作步骤和使用成本，更便于蚕农和一线技术人员的掌握和使用，因而该诊断胶体金试纸条具有较好的应用前景。
发明内容
 本发明的目的在于弥补现有技术不足，提供一种快速检测家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的免疫胶体金检测方法，并提供一种用于快速检测BmNPV的免疫胶体金试纸条。采用本发明的检测试纸条检测BmNPV，检测时间短，成本低，检测结果特异，结果易判断，实用性更强，非常适合基层使用。
本发明采取以下技术方案：
一种检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述免疫胶体金试纸条包括：标记抗原BmNPV-Lef4抗体的胶体金垫和包被的硝酸纤维膜，其中硝酸纤维膜上部检测线包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纤维膜下部的质控线包被羊抗鼠IgG。
其中兔抗BmNPV-Lef4的浓度为1～2mg/mL，羊抗鼠IgG浓度为0.5～1mg/mL。
本发明还提供一种家蚕核型多角体病毒的快速检测方法，其特征在于，所述的检测方法采用检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条，具体操作如下：
（1）    检测样品的采集：称取20～50mg家蚕组织置于150～250μL PBS缓冲液中，
进行研磨匀浆；然后，3000～5000rpm/min离心2min，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蚕血淋巴置于离心管中待用。
（2）滴2～3滴步骤（1）中的上清液或血淋巴，滴到样品孔（S孔）中，等待2～5min后即可观察结果。
如分别在C（质控线）和T（检测线）处出现沉淀线，表明样品为BmNPV阳性；如果仅有C线出现，表明样品为BmNPV阴性；如果没有条带出现，表明该胶体金检测试纸条为不合格品。
所述检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
1. 首先选择家蚕核型多角体病毒高度保守的早期核心基因Lef4（GenBank: AY033655.1）进行克隆、表达和纯化，获得外源蛋白BmNPV-Lef4。
2. 制备BmNPV-Lef4抗原的多克隆抗体：
以纯化的蛋白BmNPV-Lef4为抗原，弗氏佐剂为乳化剂，按照常规方法免疫新西兰大白兔，制备BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein A抗体纯化试剂盒进行纯化，获得BmNPV-Lef4的多克隆抗体，置于-80℃保存待用。
3. 制备小鼠腹水抗体（单克隆抗体）：
（1）小鼠免疫：以纯化的蛋白BmNPV-Lef4与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，在腹腔、皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，剂量为每只40μg；以后每隔2周以弗氏不完全佐剂乳化相同剂量的抗原BmNPV-Lef4注射小鼠，连续2次；最后一次免疫采用不加佐剂的抗原进行小鼠腹腔注射，抗原剂量80μg，3天后取脾细胞融合。
 （2）细胞融合与单抗筛选：取小鼠脾脏，制备细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以4:1～10:1的比例混合，在体积分数为50%的聚乙二醇（PEG）作用下融合，用含HAT、20%FCS的培养液在37℃，5%二氧化碳培养箱中进行培养；14天后，换以HT培养液培养。当杂交瘤细胞长满孔底面积1/10时，用间接ELISA检测杂交瘤细胞上清液，筛选抗体阳性孔，以有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行单克隆化培养，筛选出检测为阳性的细胞株即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；给BALB/c小鼠腹腔注射0.15mL降植烷，一周后腹腔接种5×105个杂交瘤细胞，9～12天有明显腹水产生，用针头穿刺收集腹水，离心，取上清液即为腹水抗体，分装、-80℃下冻存；用间接ELISA测定腹水单抗效价。
4．制备BmNPV免疫胶体金检测试纸条：
（1）标记抗原BmNPV-Lef4抗体的胶体金垫制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，制备完成后以最适蛋白用量将步骤3中制备的鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体加入胶体金边加边搅拌10min，室温放置20min；在溶液中加入BSA，混匀，1200rpm/min离心20min；去上清，用制备的胶体金标记抗体铺在玻璃纤维膜上，真空干燥，制成胶体金垫。
（2）检测线和质控线抗体的包被：喷膜仪在硝酸纤维膜NC膜上部划线，以兔抗BmNPV-Lef4包被检测线；以羊抗鼠IgG包被硝酸纤维膜NC膜下部的质控线。
（3）试纸组装：硝酸纤维素膜(已包被IgG)、金标垫、玻璃纤维膜(样品垫)及吸水垫按先后顺序粘于背板上。
其中步骤（1）中制备的胶体金粒径为20～50nm的胶体金；其中每1mL胶体金溶液加入的鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体为15-25μL；加入的BSA的浓度为10%，BSA在溶液中的终浓度为1%；胶体金标记抗体按1mL铺20cm2 的比例铺在玻璃纤维膜上。
其中步骤（2）中所述的兔抗BmNPV-Lef4浓度为1～2mg/mL，羊抗鼠IgG浓度为0.5～1mg/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点：
一是与常规的PCR检测方法相比，采用本发明的检测方法检测家蚕核型多角体病毒所需时间短，操作简便；
二是本发明避免了采用传统PCR检测方法、电镜鉴定方法等所涉及的仪器设备、试剂等较为昂贵的问题；
三是检测试纸条易保存，可4℃冰箱中放置2年左右，有利于基层实验室和养殖户可随时开展检测工作，实用性更强，选择了特异性基因、制备了特异性抗体、首次制备了应用于家蚕病毒检测的胶体金试剂盒。
四是选择的病毒基因组为保守序列，因而制备的多克隆抗体和单克隆抗体针对性强，检测结果特异，不易造成假阳性
五是与传统的胶体金检测方法相比，在胶体金检测试纸条制备时采用了双抗体夹心法，并对两种病毒抗体的浓度配比进行了调试，能够有效地保证检测结果的特异性、灵敏度和稳定性，其检测灵敏度能够与常规PCR方法相媲美。病原不同、基因特异，抗原、抗体均是首次制备，也是首次应用于家蚕核型多角体病毒检测中。
附图说明
图1为家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金检测试纸条结构图；
图2为实施例中家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金检测试纸条
图3为实施例中家蚕核型多角体病毒免疫胶体金检测试纸条的灵敏度和特异性评价结果图。
具体实施方式
  下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆：实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1．材料
家蚕核型多角体病毒、鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体(命名为BMlef4)、兔抗家蚕核型多角体病毒多克隆抗体由本实验室自行制备与保存。柠檬酸三钠、氯金酸(HAuCl4·4H2O)购自Sigma公司；BSA购自Promega公司；硝酸纤维膜(NC)、玻璃纤维纸购自Millipore公司；羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
2．BmNPV免疫胶体金试纸条的制备
（1） 首先选择家蚕核型多角体病毒高度保守的早期核心基因Lef4（GenBank: AY033655.1）进行克隆、表达和纯化，获得外源蛋白BmNPV-Lef4。
（2） BmNPV-Lef4抗原的多克隆抗体的制备：
以纯化的蛋白BmNPV-Lef4为抗原，弗氏佐剂为乳化剂，按照常规方法免疫新西兰大白兔，制备BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein A抗体纯化试剂盒进行纯化，获得BmNPV-Lef4的多克隆抗体，置于-80℃保存待用。
（3）小鼠腹水抗体（单克隆抗体）的制备：
A．小鼠免疫：以纯化的蛋白BmNPV-Lef4与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，在腹腔、皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，剂量为每只40μg；以后每隔2周以弗氏不完全佐剂乳化相同剂量的抗原BmNPV-Lef4注射小鼠，连续2次；最后一次免疫采用不加佐剂的抗原进行小鼠腹腔注射，抗原剂量80μg，3天后取脾细胞融合。
 B. 细胞融合与单抗筛选：取小鼠脾脏，制备细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以4:1～10:1的比例混合，在体积分数为50%的聚乙二醇（PEG）作用下融合，用含HAT、20%FCS的培养液在37℃，5%二氧化碳培养箱中进行培养；14天后，换以HT培养液培养。当杂交瘤细胞长满孔底面积1/10时，用间接ELISA检测杂交瘤细胞上清液，筛选抗体阳性孔，以有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行单克隆化培养，筛选出检测为阳性的细胞株即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；给BALB/c小鼠腹腔注射0.15mL降植烷，一周后腹腔接种5×105个杂交瘤细胞，9～12天有明显腹水产生，用针头穿刺收集腹水，离心，取上清液即为腹水抗体，分装、-80℃下冻存；用间接ELISA测定腹水单抗效价。
（4）BmNPV免疫胶体金检测试纸条的制备：
A. 标记抗原BmNPV-Lef4抗体的胶体金垫制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，制备完成后以最适蛋白用量将步骤3中制备的鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体加入胶体金边加边搅拌10min，室温放置20min；在溶液中加入BSA，混匀，1200rpm/min离心20min；去上清，用制备的胶体金标记抗体铺在玻璃纤维膜上，真空干燥，制成胶体金垫。
B. 检测线和质控线抗体的包被：喷膜仪在硝酸纤维膜NC膜上部划线，以兔抗BmNPV-Lef4包被检测线；以羊抗鼠IgG包被硝酸纤维膜NC膜下部的质控线。
其中步骤A中制备的胶体金粒径为20～50nm的胶体金；其中每1mL胶体金溶液加入的鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体为15-25μL；加入的BSA的浓度为10%，BSA在溶液中的终浓度为1%；胶体金标记抗体按1mL铺20cm2 的比例铺在玻璃纤维膜上。
其中步骤B中所述的兔抗BmNPV-Lef4浓度为1～2mg/mL，羊抗鼠IgG浓度为0.5～1mg/mL。
C．试纸条的组装：在干燥室内，按照底板上划定的样品垫、金标垫、硝酸纤维膜及吸水纸的尺寸，裁定符合要求的材料和制备相关的金标垫；取已包被的NC膜放置在塑料PVC底板的中部粘贴，在NC膜检测线一侧将金标垫紧靠硝酸纤维素膜下边缘粘住，在NC膜C线一侧搭连吸水纸，吸水纸一部分粘在PVC底板上、盖好塑料PVC盖，完成免疫胶体金试纸条的组装，如图1所示。
3．BmNPV免疫胶体金检测试纸条的使用步骤
（1）检测样品的采集：称取50mg家蚕组织置于200μl PBS缓冲液中，进行研磨匀浆；然后，3000～5000rpm/min离心2min，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蚕血淋巴置于离心管中待用。
（2）滴2～3滴步骤3（1）中的上清液，滴到图1所示样品孔（S孔）中，等待2～5min后即可观察结果。如分别在C（质控线）和T（检测线）处出现沉淀线，表明样品为BmNPV阳性；如果仅有C线出现，表明样品为BmNPV阴性；如果没有条带出现，表明该胶体金检测试纸条为不合格品。
利用本发明所述的免疫胶体金检测试纸条检测家蚕核型多角体病毒，经过检测使用，结果表明家蚕核型多角体病毒免疫胶体金检测试纸条具有较好的特异性和灵敏度（图2）。

Claims (9)

1.一种检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述免疫胶体金试纸条
包括：标记抗原BmNPV-Lef4抗体的胶体金垫和包被的硝酸纤维膜，其中硝酸纤维膜上部检测线包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纤维膜下部的质控线包被羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的一种检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条，其特征在于，
其中所述兔抗BmNPV-Lef4的浓度为1～2mg/mL，羊抗鼠IgG浓度为0.5～1mg/mL。
3.一种家蚕核型多角体病毒的快速检测方法，其特征在于，所述的检测方法采用检测家蚕核
型多角体病毒的免疫胶体金试纸条，具体操作如下：
检测样品的采集：称取家蚕组织置于PBS缓冲液中，
进行研磨匀浆；然后，离心，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蚕血淋巴置于离心管中待用；
取2～3滴步骤（1）中的上清液或血淋巴，滴到样品孔（S孔）中，等待2～5min
后即可观察结果；如分别在C（质控线）和T（检测线）处出现沉淀线，表明样品为BmNPV阳性；如果仅有C线出现，表明样品为BmNPV阴性；如果没有条带出现，表明该胶体金检测试纸条为不合格品。
4. 根据权利要求3所述的一种家蚕核型多角体病毒的快速检测方法，其特征在于，步骤（1）中家蚕组织与PBS缓冲液的比例为20～50mg：150～250μL。
5. 如权利要求1或3所述检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
（1）首先选择家蚕核型多角体病毒高度保守的早期核心基因Lef4进行克隆、表达和纯化，获得外源蛋白BmNPV-Lef4；
（2）制备BmNPV-Lef4抗原的多克隆抗体：
以纯化的蛋白BmNPV-Lef4为抗原，弗氏佐剂为乳化剂，按照常规方法免疫新西兰大白兔，制备BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein A抗体纯化试剂盒进行纯化，获得BmNPV-Lef4的多克隆抗体，置于-80℃保存待用；
（3）制备小鼠腹水抗体，即鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体：
以纯化的蛋白BmNPV-Lef4为抗原免疫BALB/c小鼠，制备筛选单克隆抗体； 
（4）制备BmNPV免疫胶体金检测试纸条：
A. 标记抗原BmNPV-Lef4抗体的胶体金垫制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，制备完成后将步骤（3）中制备的鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体加入胶体金，边加边搅拌后，室温放置；在溶液中加入BSA，混匀，离心；去上清，将制备的胶体金标记抗体铺在玻璃纤维膜上，真空干燥，制成胶体金垫；
B．检测线和质控线抗体的包被：喷膜仪在硝酸纤维膜上部划线，以兔抗BmNPV-Lef4包被检测线；以羊抗鼠IgG包被硝酸纤维膜NC膜下部的质控线；
C．试纸组装：已包被IgG的硝酸纤维素膜、金标垫、玻璃纤维膜即样品垫和吸水纸按先后顺序粘于背板上。
6. 根据权利要求5所述的检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）的A中制备的胶体金粒径为20～50nm的胶体金；室温放置20min，加入的BSA的浓度为10%，BSA在溶液中的终浓度为1%。
7. 根据权利要求5所述的检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）的A中胶体金标记抗体按1mL铺20cm2 的比例铺在玻璃纤维膜上。
8. 根据权利要求5所述的检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）的A中每1mL胶体金溶液加入的鼠抗家蚕核型多角体病毒单克隆抗体为15-25μL。
9. 根据权利要求5所述的检测家蚕核型多角体病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）的B中所述的兔抗BmNPV-Lef4浓度为1～2mg/mL，羊抗鼠IgG浓度为0.5～1mg/mL。
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