CN105238759A - 抗驼乳重链IgG3单克隆抗体、含有所述单克隆抗体的试纸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株小鼠骨髓瘤细胞H2H6以及由该细胞产生的抗驼乳IgG3单克隆抗体IgG，其价效达1:102400。本发明还提供含有驼乳重链IgG3抗体的检测试纸，所述试纸包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，抗驼乳IgG3的单克隆抗体由胶体金标记，所述检测试纸采用竞争法制备得到。本发明利用驼乳特异性重链抗体作为免疫原制备单克隆抗体，并制作检测试剂盒/检测试纸；通过对比竞争法与夹心法，本发明的检测试纸检测效果好，具有特异性与灵敏度高、检测时间短的优点；可用于驼乳及其制品中乳源掺假的快速检测。

Description

抗驼乳重链IgG3单克隆抗体、含有所述单克隆抗体的试纸及其应用

【技术领域】

本发明涉及以抗体为特征的生物检测试剂，特别是一种抗驼乳重链IgG₃单克隆抗体，还涉及含有该单克隆抗体的试剂盒及其应用。

【背景技术】

骆驼是我国边疆的主要畜种之一，其身处严酷环境经长期自然选择形成了其它畜种不具备的独特生物学特性。1993年，HamersCasterman等人发现在骆驼血清中存在两种结构的天然IgG抗体，一种为具有两条重链和两条轻链的常规四聚体IgG₁(约170kD)，另一种为仅有两条重链构成的二聚体抗体，称为重链抗体(heavy-chainantibodies,HCAbs)，包括IgG₂(约100kD)和IgG₃(约90kD)亚型。与一般抗体相比，这些重链并不与轻链缔合，它们的重链可变区(VHH)与铰链区间并没有传统免疫球蛋白中的第一稳定区(CH1),可变区直接与铰链区和Fc相连接，重链抗体的VHH还具有不同于VH的特征(见图1)。但是这种二聚体免疫球蛋白仍能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，而且不像单链抗体那样相互粘连聚集成块，因而在骆驼的体液免疫中发挥非常重要的作用。

骆驼是唯一含有重链抗体的哺乳动物，这些重链抗体尽管缺失轻链，但作为抗体其功能是完整的，这表明重链抗体的重链可变区(VHH)单独能够形成完整的抗原结合位点。重链抗体VHH具有分量小、结构稳定、亲和力高、人体免疫原型弱、易表达、易纯化的优点。

驼乳对于大多数人来说较为陌生，但是对于许多国家来说，驼乳是无可替代的营养珍品。驼乳不仅富含人体必需的多种氨基酸，还含有溶菌酶、免疫球蛋白、乳铁蛋白等保护性蛋白和多种生物活性因子，可杀菌抑菌、调节免疫力，在机体抗病机制方面起着重要作用。其中免疫球蛋白是骆驼常乳和初乳中最值得关注的免疫因子，骆驼常乳和初乳中最主要的免疫球蛋白为IgG，而IgM、IgA含量很少。驼乳IgG包括三个亚类，分别为IgG₁、IgG₂和IgG₃。在许多国家不仅饮用驼乳摄取营养，还常用驼乳来辅助治疗腹泻、胃溃疡、糖尿病等疾病，并取得了良好的成绩。因此，近年来驼乳及其制品的开发和研究逐渐兴起。

我国是最早驯养双峰驼的国家之一，也是双峰驼主要分布区域之一。但我国驼乳产业起步较晚，然而随着人们对驼乳的认识加深，驼乳的需求量日渐增加，需求量远大于供应量。由于驼乳不像牛乳那样容易挤出，而且产量较低，因此一方面限制了驼乳企业的发展，另一方面造成了驼乳掺假现象的发生。然而，现有技术中还缺少能够快速、有效地检测驼乳是否掺假的技术。

金标免疫层析技术是以胶体金作为示踪标记物或显色剂应用于抗原抗体特异性免疫反应的一种免疫分析技术，具备操作简单、特异敏感、可单份测定、成本低、不需要仪器的特点。金标免疫层析试纸条通常包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和底板。其中，样品垫置于试纸条的前端，用于进样；金标结合垫是胶体金标记过的待测物的受体的承载体，测试液经样品垫流经时，胶体金结合物从金标结合垫上释放并与测试液中的待测物特异性结合形成免疫复合物，随测试液一起流向硝酸纤维素膜；硝酸纤维素膜是金标免疫层析试纸条的结果显示区域，其一般有两条线：捕获线(或称测试线)和控制线。捕获线上包被待测物的另一特异性抗体，而控制线上包抗胶体金标记物中抗体的羊抗鼠IgG，即抗金标结合垫上胶体金标记过的受体的抗体；吸收垫通常置于试纸条末端。

目前，胶体金免疫层系技术已经广泛应用于食品、药品、生物医学等许多领域的检测。

【发明内容】

本发明利用驼乳重链抗体的特点，从驼乳中获得重链抗体IgG₃，以驼乳IgG₃抗体为免疫原制作小鼠抗驼乳IgG的单克隆抗体，筛选小鼠抗驼乳IgG₃单克隆抗体，研制可以检测驼乳IgG₃抗体水平的试剂盒，为检测驼乳制品提供快速的检测方法。

为了实现上述目的，本发明提供一株小鼠骨髓瘤细胞H2H6，所述细胞株于2015年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11099。

本发明还提供抗驼乳IgG3单克隆抗体IgG，所述单克隆抗体是由前述的小鼠骨髓瘤细胞产生的。优选地，所述单克隆抗体为IgG2b亚类，其价效达1:102400。

本发明还提供所述单克隆抗体在检测驼乳制品中驼乳含量水平的应用。

本发明还提供含有驼乳重链IgG3抗体的检测试纸，所述试纸包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜包被上述的抗驼乳IgG3的单克隆抗体。

在本发明中，优选地，所述抗驼乳IgG3的单克隆抗体由胶体金标记。

特别优选地，所述检测试纸采用竞争法制备得到。

本发明首次利用驼乳特异性重链抗体作为免疫原制备单克隆抗体，并制作检测试剂盒/检测试纸；通过对比竞争法与夹心法，本发明的检测试纸检测效果好，具有特异性与灵敏度高、检测时间短的优点；本发明的试剂价格低廉，实验操作方便，无需特殊的仪器设备，可以满足有关研究单位，质监部门批量检测相关乳品质量的需要；本发明的检测试纸可用于驼乳及其制品中乳源掺假的快速检测。

本发明涉及的小鼠骨髓瘤细胞H2H6于2015年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11099

【附图说明】

图1为常规抗体与骆驼重链抗体结构图，其中A：常规抗体IgG，B：骆驼重链抗体，C：纳米抗体(VHH)。

图2为纯化驼乳IgG3电泳图，其中M：marker，1：驼乳中层澄清液，2：纯化驼乳IgG3。

图3为杂交瘤技术制备单克隆抗体的线路流程。

图4为纯化抗驼乳IgG3单克隆抗体IgG电泳图；其中M：marker，1～9：纯化抗驼乳IgG₃单克隆抗体(1:：H2H6，2：H11E8，3：G1C7，4：F1B3，5：F11A4，6：B8F10，7：B12G11，8：B5E11，9：A12C2)。

图5为竞争法试纸检测驼乳以及牛乳；其中1：检测驼乳(阳性)，2：检测牛乳(阴性)。

图6为竞争法试纸检测驼乳与牛乳的混合样品；其中1：牛乳，2：驼乳:牛乳＝1:9，3：驼乳:牛乳＝3:7，4：驼乳:牛乳＝5:5，5：驼乳:牛乳＝7:3，6：驼乳:牛乳＝9:1，7：驼乳。

图7为检测试纸结构示意图。

图8为检测试纸使用说明图。

图9为试纸条检测结果说明图。

【具体实施方式】

通过以下实施例非限制性地解释本发明的技术方案。

实施例1

1.驼乳重链抗体IgG₃纯化

(1)样品处理：取驼乳化冻，高速低温离心机12000rpm4℃离心60min，去掉上层脂肪和下层沉淀；取出中层的液体，取其中不超过0.1mL用于SDS-PAGE电泳。

(2)驼乳IgG₃分离纯化：

①取澄清的中层液与PBS按体积比1：5稀释；

②预处理ProteinGaogaroseFF柱，用10mLProteinGaogaroseFF胶装柱，用0.02MpH7.0的磷酸盐缓冲液平衡5倍体积；

③按其操作步骤上样，用至少10倍体积的平衡缓冲液清洗柱子，去除杂质；

④用0.2MpH3.6的柠檬酸缓冲液洗脱，收集IgG₃洗脱峰，并用1MpH9.0Tris-HCl中和所收集的样品；

⑤纯化的IgG₃样品用10mMpH7.4PBS透析，4℃保存备用。

(3)纯化驼乳IgG₃进行SDS-PAGE电泳。电泳结果可见分子量43kDa左右IgG₃的重链抗体，如图2所示。

2.小鼠抗驼乳IgG₃单克隆抗体免疫

通过杂交瘤技术制备单克隆抗体的线路流程如图3所示。

(1)小鼠免疫：

①第一天，取抗原(纯化的驼乳IgG₃)用生理盐水稀释至0.2mg/ml，取750μl经过稀释的抗原溶液与750μl弗氏完全佐剂混合，乳化，腹腔注射3只小鼠；

②第三十一天，抗原用生理盐水稀释至0.2mg/ml，取750μl抗原与750μl福氏不完全佐剂混合，乳化，腹腔注射3只小鼠；

③第四十五天，抗原用生理盐水稀释至0.1mg/ml，取1500μl抗原直接腹腔注射3只小鼠；

④第五十九天，取50μg抗原尾静脉注射1只小鼠，三天后进行细胞融合。

(2)ELISA：

①包被：将抗原用pH9.6的碳酸缓冲液稀释为5μg/ml，加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；

②封闭：将包被液弃去，每孔加入100μl封闭液(5wt％脱脂奶粉)，22℃放置1h；

③加入样本：弃去封闭液，加入样品，每孔100μl加入酶标板，37℃放置1h；

④洗涤：用PBS-T洗3次，每次间隔5分钟，拍干；

⑤加入二抗：酶标羊抗鼠，稀释至工作浓度，每孔100μl加入酶标板，37℃放置1小时；

⑥洗涤：用PBS-T洗3次，每次间隔5分钟，拍干；

⑦加入TMB显色底物：每孔100μl加入酶标板，37℃放置5min；

⑧加入终止液：每孔加入2MH₂SO₄100μl；

⑨读数：酶标仪OD450nm读数。

(3)细胞融合：

①SP2/0的收集：选择生长状态良好的SP2/0细胞(保持细胞处于对数生长期，融合前两天换液)，用弯头吸管将细胞吹下，收集于50ml离心管中，1200rpm离心5min。弃去上清，用20mlRPMI1640培养基(购买自美国Gibco公司)将细胞重悬。

②脾细胞的收集：小鼠摘眼球取血(37℃放置1小时后8000rpm离心10min，吸出上清即为血清，可作为阳性对照，分装冻存于-20℃)，颈椎脱臼处死，放入75vol％乙醇中消毒5min。小鼠转入超净台中，左侧向上，将皮肤剪一小口，从开口处拉开皮肤暴露腹膜，用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏放入筛网中研磨脾脏，用15mlRPMI1640培养基冲洗筛网收集脾细胞，1200rpm离心5min，弃去上清，用10mlRPMI1640培养基将细胞重悬。

③细胞融合：将脾细胞与SP2/0细胞混匀，1200rpm离心5min，弃去上清，将细胞弹松，吸1ml预热的融合剂(PEG1000)，在1min内逐滴加入，再放置37℃水浴中反应1min，然后加入终止液(在2分min内加入15mlRPMI1640培养基，并轻轻搅拌细胞)，1200rpm离心5min，弃去上清，加入25ml预热的HAT培养基(购买自美国Gibco公司)，将细胞重悬，轻轻混匀(用吸管从底部吸起细胞，在液面顶部轻轻盘旋滴入)，用吸管将细胞悬浮液加入预先接种饲养细胞的96孔板中，每孔1滴，铺2或3块板，置孵箱中培养(37℃，5vol％CO₂)。

④融合板的检测：

a.融合后第3天观察96孔板，看融合细胞的生长状况、有无污染，保证细胞正常生长。

b.融合后第三天和第七天换液两次，用吸管将融合板中的培养上清吸光，弃去，然后每孔补加5滴新鲜的HAT培养基，置孵箱中培养(37℃，5vol％CO₂)。

c.第二次换液后2到4天进行抗体检测，将孔板中的上清每孔吸出100μl加入包被好的96孔酶标板，并作相应的编号，ELISA检测上清中是否有特异性抗体。

d.选择ELISA结果为阳性的孔，对应细胞培养板上的细胞进行第一次克隆，将细胞吸出计数、稀释，以理论值每滴一个细胞加入预先接种饲养细胞的96孔板中，置孵箱中培养(37℃，5vol％CO₂)。

e.克隆4天后，用显微镜观察，并对有克隆细胞的孔进行标记，第七天换液一次，换液后4到6天(观察细胞生长情况而定)，进行抗体检测，将孔板中的上清每孔吸出100μl加入包被好的96孔酶标板，并作相应的编号，ELISA检测上清中是否有特异性抗体。

f.选择ELISA结果为阳性的孔，对应细胞培养板上的细胞进行克隆，方法与第一次相同，分别进行三次克隆。

g.用弯头吸管将细胞吹打制成悬液，1000转离心10min。弃去上清，用冻存液将细胞重悬，分装入冻存管中，管壁作好标记。将细胞放入程序4℃冰箱中1h，转入液氮罐口悬挂30min，放入液氮冻存。

(4)单抗生产

①将移去细胞混悬液的培养瓶中继续加入RPMI1640完全培养基，置孵箱中培养(37℃，5vol％CO₂)。

②待细胞基本布满瓶底，细胞状态良好时收集细胞。将细胞用弯头吸管吹打制成悬液，1000转离心10min，弃去上清，用生理盐水将细胞重悬，腹腔注射入鼠体内，每只小鼠注射0.5ml。

③腹水的收集和保存：

a.小鼠接种杂交瘤细胞后需注意每天观察小鼠状态；

b.在小鼠濒死前颈椎脱臼处死，用手术剪剪开皮肤，撕开皮肤暴露腹膜，再在腹膜上剪一小口，用滴管将腹水吸出；

c.腹水3000转离心10分钟，吸取上清，分装冻存于-70℃，并取少量ELISA检测腹水效价。单抗亚类以及效价见表1；

表1单克隆抗体腹水亚类及效价

3.抗驼乳IgG₃单克隆抗体的纯化

(1)纯化方法

①样品处理：取抗驼乳IgG₃单克隆抗体小鼠腹水，按体积比1：1加入0.02MpH7.0磷酸盐缓冲液，高速低温离心机10000rpm离心4℃10分钟，去掉脂肪和沉淀；

②预处理ProteinGaogaroseFF柱，用10mLProteinGaogaroseFF胶装柱，用0.02MpH7.0的磷酸盐平衡缓冲液平衡至少5倍体积；

③按其操作步骤上样，用至少10倍体积的平衡缓冲液清洗柱子，去除杂质；

④用0.1MpH2.7的甘氨酸缓冲液洗脱，收集IgG洗脱峰，并用1MpH9.0Tris-HCl中和所收集的样品；

⑤纯化的IgG样品用10mMpH7.4PBS透析，4℃保存备用。

(2)纯化的抗驼乳IgG₃单克隆抗体IgG进行SDS-PAGE电泳，结果如图4。

4.采用金标免疫层析法进行抗驼乳IgG₃的单克隆抗体的筛选

(1)竞争法：

①筛选方法：

a.包被：将纯化好的抗驼乳IgG₃的单克隆抗体用10mMpH7.4PBS缓冲液稀释到0.3～0.5mg/mL，包被到硝酸纤维素(NC)膜上，烘干。

b.标记：用pH8.0的胶体金标记驼乳IgG₃抗体，加入1vol％BSA作为稳定剂，10000rpm离心4℃30分钟，沉淀用含重量体积比0.1％蔗糖和1％BSA的复溶液分散，烘干固化在玻璃纤维垫(金标垫)上。

c.装配：将吸水纸、NC膜、金标垫、样品垫等装配到一起(如图5和7所示)，切割成3.5～4mm宽的试条。

d.筛选：检测纯化的驼乳IgG₃样品或者驼乳样品，用牛乳样品作为阴性对照，阴性结果检测线有显色，阳性结果检测线没有显色或者有很浅的显色(如图5)。筛选出有明显阴阳性反应的抗驼乳IgG₃单克隆抗体，如表2。其中，编号为H2H6的单克隆抗体即为本发明的保藏编号为CGMCCNo.11099的小鼠骨髓瘤细胞H2H6分泌的单克隆抗体。

表2抗驼乳IgG₃单抗竞争法反应

采用竞争法，样品中的驼乳或驼乳中的IgG₃与固定在硝酸纤维素膜上的抗驼乳IgG₃单克隆抗体竞争胶体金标记的抗体。当样品垫滴入样品后，样品沿着试纸通过毛细作用泳动，溶解金标垫上干燥的胶体金标记的抗驼乳IgG₃的抗体。

若待测样品中不存在驼乳或驼乳IgG₃，则胶体金标记的抗驼乳IgG₃的抗体会泳动到检测线和硝酸纤维膜上的抗驼乳IgG₃单克隆抗体发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，在检测线处形成红色线条(阴性反应)。

若待测样品中存在驼乳或驼乳IgG₃，则胶体金标记的抗驼乳IgG₃单克隆抗体会和样品中的驼乳或驼乳IgG₃发生免疫反应而不会向前移动，因此没有或只有较少胶体金标记的抗驼乳IgG₃单克隆抗体与硝酸纤维膜上包被的抗驼乳IgG₃单克隆抗体结合，因此检测线不显色或显色较浅(阳性或弱阳性反应)。

③竞争法检测驼乳与牛乳的混合样品

a.混合样品：将驼乳与牛乳按照体积比1:9、3:7、5:5、7:3、9:1分别混合，得到混合样品。

b.检测：将混合样品分别离心2000rpm2分钟，吸取10～15μL中层的乳清进行检测。

c.检测结果如图6所示。由图6可知，检测样品中的驼乳含量为1μg即可检测到阳性反应。

(2)夹心法

①筛选方法：

a.包被：将纯化好的抗驼乳IgG₃的单克隆抗体用10mMpH7.4PBS缓冲液稀释到1.0～2.0mg/mL，包被到NC膜上，烘干。

b.标记：用pH8.0的胶体金标记抗驼乳IgG₃单克隆抗体，加入1vol％BSA作为稳定剂，10000rpm离心4℃30分钟，沉淀用含蔗糖和BSA的复溶液分散，固化在玻璃纤维垫上。

c.配对：将不同的抗驼乳IgG₃单克隆抗体分别包被、标记，并且两两配对。

d.筛选：检测纯化的驼乳IgG₃抗体或者驼乳样品，用牛乳IgG或牛乳样品作为阴性对照，阴性结果检测线没显色，阳性结果检测线有显色。筛选出有明显阴阳性反应的抗驼乳IgG₃单克隆抗体对。

②筛选结果：

当使用纯化的驼乳IgG₃抗体为检测样品时，找到了两对检测驼乳IgG₃的单克隆抗体对，如表3；当使用驼乳为检测样品时，尽管这两个单抗的配对有反应，但与驼乳IgG₃抗体作为样品的检测结果相比，反应比较弱，显色也比较慢(表现为弱阳性)。可见，采用夹心法制备的检测试纸对于以驼乳或驼乳混合物为检测样品时，灵敏度和有效性均不如采用竞争法原理制备的检测试纸。

产生这种情况的原因可能是：

a.由于驼乳中的酪蛋白、脂肪等大分子或其他成分对硝酸纤维素膜产生了封闭作用，减弱了反应的强度；

b.使用纯化的IgG3抗体为检测样品，由于浓度和纯度均较高，有效反应量约5μg，而驼乳样品中的IgG3抗体浓度较低，有效反应量约1μg。

表3夹心法单抗配对结果

将竞争法和夹心法的筛选结果进行比对，夹心法的筛选结果显示，当使用驼乳IgG₃抗体为检测样品找到两对检测驼乳IgG₃的单克隆抗体对，而使用驼乳为检测样品时，这两个单抗的配对还是有反应的，但是相比驼乳IgG₃抗体作为样品的检测结果，反应比较弱，显色也比较慢。与之相比，竞争法的结果较好。因此，本发明最终选择竞争法制作驼乳IgG₃金标检测试纸。

5.驼乳IgG₃金标检测试纸

试纸结构如图7所示。

(1)样本要求：

①使用乳液的乳清作为检测样本。将乳液样品于3000rpm离心10分钟，去掉上层的脂肪和下层的沉淀，中层的液体为乳清。

②检测时尽量使用新鲜的样本，如样本不能及时测定，可置2℃～8℃一周内进行检测，长期保存需在-20℃冷冻，忌反复冻融。

③冻存样本解冻后应充分混匀，检测前样本必须恢复至室温。

(2)检测方法：

①检测试纸条、待检样品和其他检测用材料等测试前需平衡至室温并编号。

②打开试条包装筒，取出试条，在样品垫区域上滴加待测样品20μL乳清，如图8-1所示。

③待样品吸收后，再逐滴滴加1～2滴样品稀释液于稀释液垫上，如图8-2所示。

④计时15分钟读取检测结果，超过15分钟检测结果无效。

(3)检测结果的解释

①检测线没有显色，表明检测样品为驼乳，如图9-1所示。

②检测线显色，表明检测样品不是驼乳纯品，可能为掺水或掺其他乳的混合物，如图9-2所示。

③通过观察检测线的深度判断驼乳含量，颜色越深表明驼乳含量越少，如图9-3所示。

Claims (7)

1.一株分泌抗驼乳IgG₃单克隆抗体IgG的小鼠骨髓瘤细胞H2H6，所述细胞株于2015年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11099。

2.抗驼乳IgG₃单克隆抗体IgG，所述单克隆抗体是由权利要求1所述的小鼠骨髓瘤细胞产生的。

3.根据权利要求2所述的抗驼乳IgG₃单克隆抗体IgG，其特征在于所述单克隆抗体为IgG2b亚类，其价效达1:102400。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在检测驼乳制品中驼乳含量水平的应用。

5.含有驼乳重链IgG₃抗体的检测试纸，所述试纸包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其特征在于所述硝酸纤维素膜包被如权利要求2所述的抗驼乳IgG₃单克隆抗体的抗体IgG。

6.如权利要求4所述的检测试纸，其特征在于所述抗驼乳IgG₃单克隆抗体的抗体由胶体金标记，固化在金标结合垫上。

7.如权利要求4所述的检测试纸，其特征在于所述检测试纸采用竞争法制备得到。