CN104119440B - 针对胱抑素c的单克隆抗体、杂交瘤细胞株制备及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对胱抑素C的单克隆抗体、杂交瘤细胞株制备及其用途。具体地，本发明公开了制备所述的单克隆抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够高特异性地结合胱抑素C，其具有很高的亲和力。本发明抗体的检测灵敏度极高，可达1.2ng/ml。本发明抗体可应用到ELISA，化学发光法等免疫检测方法中，检测人血清或尿液中胱抑素C蛋白(Cystatin C)的含量，具有很好的应用前景。

Description

针对胱抑素C的单克隆抗体、杂交瘤细胞株制备及其用途

技术领域

本发明涉及检测领域，尤其涉及针对胱抑素C的单克隆抗体、杂交瘤细胞株制备及其用途。

背景技术

随着生活水平的提高和生活节奏的加快，人们的生活方式、饮食结构近年来均发生了很大变化。在这种改变的影响下，肾脏疾病的发病率逐年增加，已成为威胁世界公共健康的最主要疾病之一。正常人群肾病发病率约6.1-10%，我国约有1亿肾病患者。肾脏作为人体主要的代谢和排泄器官之一，体内大部分物质要经过肾小球滤过和肾小管重吸收的作用。早期诊断是实现肾脏疾病早期治疗的关键，在肾脏疾病的发生早期，可以通过尿液中生物标志物蛋白含量的检测确定疾病发生的部位及程度。

胱抑素C(Cystatin C,Cys C)属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员之一，位于人类第20号染色体，是由120个氨基酸组成的非糖基化蛋白，分子量13.3KDa。Cys C广泛存在于人类的体液中，特别是在脑脊液和精液中浓度最高。所有的有核细胞均可产生，生成速度稳定，不受炎症、胆红素、溶血、甘油三酯的影响，且与性别、年龄、肌肉量无关。

胱抑素C是近年来发现被广泛运用于临床的肾脏功能评价指标，由于其血清浓度与肾小球滤过率密切相关[Royakkers AA,van Suijlen JD,Hofstra LS,Kuiper MA,Bouman CS,Spronk PE,Schultz MJ:Serum cystatin C–A useful endogenous marker ofrenal function in intensive care unit patients at risk for or with acuterenal failure?Curr Med Chem2007;14:2314–2317.]，因此其作为肾小球滤过功能指标的临床诊断价值已得到充分肯定。因胱抑素C在体内代谢途径，有人尝试研究尿液胱抑素C对于肾脏疾病诊断的临床意义，近年来已有大量文献相继报道了尿液胱抑素C作为肾脏损伤的标志物之一，在不同类型肾脏疾病诊断中的评价及应用突显了该指标的诊断价值。2002年FDA网上公布了26个在检验医学有重大突破的全新检测项目，血清CysC测定便是其中之一。2008年美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMEA)也把尿液胱抑素C列为七个反映肾损伤的生物标志物之一[Frank D.et al.Urinary clusterin,cystatin C,β2-microglobulin and total protein as markers to detect drug-induced kidneyinjury,Nature Biotechnology,2010(28):463–469.]。

特定的结合反应，例如抗原-抗体反应，己经广泛用于检测生物样品中存在的各种物质的免疫测试中。常用的技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)和胶体金免疫层析等。

酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay，ELISA)是一种敏感性高、特异性强、重复性好的免疫学检测方法，其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观，既可以做定性研究也可以做定量分析。其中，具备针对所检测目标的单克隆抗体是ELISA实验，尤其是双抗夹心法ELISA实验能否开展的关键条件。ELISA对目标抗原检测的灵敏度、特异性主要取决于其中所应用的抗体的性质和质量。

胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的一种独特的免疫诊断技术，具有免疫反应和色谱层析的特定，与GC-MS比较，胶体金层析技术具有特异性强、灵敏度高、简单快速、易于操作、结果容易判读、无需任何仪器设各等优点。

虽然本领域虽然有一些检测检测胱抑素C的方法，因此其灵敏度和准确度还难以令人满意。因此本领域急需开发准确、特异性强、快速、灵敏地检测胱抑素C的抗体(尤其是可成对使用的单克隆抗体)和方法。

发明内容

本发明的目的是提供提供一种制备胱抑素C单克隆抗体方法和具有分泌抗胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一目的是提供检测胱抑素C的免疫检测试剂、免疫检测板和试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种胱抑素C单克隆抗体，所述的抗体与胱抑素C亲和力为1.0×10^-10M至2.0×10^-9M。

在另一优选例中，所述的抗体由杂交瘤细胞株S-56-14CCTCC NO:C201334、或S-386-12CCTCC NO:C201335产生。

在另一优选例中，所述S-56-14抗体的亲合力为1.41x10^-9M，所述S-386-12抗体的亲合力为3.31x10^-10M。

在另一优选例中，所述的抗体为IgG1型抗体。

在本发明第二方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)本发明第一方面所述的单克隆抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在本发明第三方面，提供了一种杂交瘤细胞株，它是选自下组的产生胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株：

(a)S-56-14CCTCC NO:C201334；

(b)S-386-12CCTCC NO:C201335；

(c)细胞株(a)或(b)的衍生细胞株。

在本发明第四方面，提供了一种本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备检测样品中胱抑素C的试剂、检测板或试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

在本发明第五方面，提供了一种检测生物样品中是否存在胱抑素C的方法，包括步骤：

(1)将样品与本发明第一方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成“抗原胱抑素C-抗体复合物”，其中形成复合物就表示样品中存在胱抑素C。

在另一优选例中，所述的生物样品包括尿液样品、血清样品。

在另一优选例中，在步骤(1)中，将样品与两种针对胱抑素C的抗体接触，并且在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。

在本发明第六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明第一方面所述的免疫球蛋白或本发明第二方面所述的免疫偶联物。

在另一优选例中，所述的测试条还含有抗原点样区。

在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。

在本发明第七方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有一容器以及位于容器内的本发明第一方面所述的免疫偶联物，或者所述的试剂盒含有本发明第六方面所述的检测板。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了表达载体pET30a(+)的示意图。

图2显示了胱抑素C PCR序列(360bp)SEQ ID NO：1。

图3显示了pMD-18T-cysC阳性克隆鉴定。各泳道如下：

泳道1-5:克隆1-5；

泳道6：DNA分子量Marker；

泳道7：:胱抑素C PCR产物作为阳性对照

图4显示了pET30a-cysC阳性克隆鉴定。各泳道如下：

泳道1-6:克隆1-6；

泳道6：DNA分子量Marker；

泳道7：胱抑素C PCR产物作为阳性对照

图5显示了pET30a-cysC诱导表达，纯化结果。各泳道如下：泳道1：蛋白分子量Marker；

泳道2：pET30a-cysC诱导前菌体；

泳道3：pET30a-cysC IPTG(1mM)诱导后菌体；

泳道4：诱导后菌体超声破碎后沉淀；

泳道5：纯化穿透样品；

泳道6:40mM咪唑洗脱样品；

泳道7:100mM咪唑洗脱样品；

泳道8:300mM咪唑洗脱样品。

图6显示了抗胱抑素C单克隆抗体S-56-14和S-386-12SDS-PAGE检测结果。各泳道如下：

泳道1：蛋白分子量Marker

泳道2：S-56-14腹水

泳道3：S-56-14穿透样品

泳道4：纯化后S-56-14

泳道5：蛋白分子量Marker

泳道6：S-386-12腹水

泳道7：S-386-12穿透样品

泳道8：纯化后S-386-12。

图7显示了S-56-14和S-386-12对原核表达胱抑素C进行免疫印迹的结果。

图8显示了间接ELISA测定S-56-14和S-386-12的滴度。其中，#2是s-56-14；#7是s-386-12

图9显示了双抗夹心ELISA结果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一对特异性和灵敏度非常高的胱抑素C单克隆抗体。基于此，本发明人开发了相应的免疫检测试剂、试剂盒和检测方法。

具体地，本发明提供了一对可配对的胱抑素C单克隆抗体。具体涉及一种制备胱抑素C蛋白的方法，所述蛋白与天然人胱抑素C蛋白非常接近，用该蛋白免疫动物可获得可灵敏的识别人体中天然胱抑素C蛋白的抗体。本发明的单克隆抗体的胱抑素C检测范围是1.5～100ng/mL，灵敏度是1.2ng/mL。可以应用到ELISA，化学发光法等免疫检测方法中，检测人血清或尿液中胱抑素C蛋白的含量，具有很好的应用前景。

术语

如本文所用，本发明的“抗原”是指胱抑素C。

抗体

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

本发明还包括具有所述的抗胱抑素C单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗胱抑素C单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗胱抑素C单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗胱抑素C单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')₂片段；抗体重链；抗体轻链。

杂交瘤细胞株

本发明还提供了可生产本发明抗胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的抗胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株

在获得生产本发明的抗胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。

单克隆抗体的制备

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

本发明提供了一种胱抑素C的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

标记的免疫球蛋白

在本发明的一个优选例中，所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗胱抑素C的单克隆抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单克隆抗体。

本发明的抗胱抑素C单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。

检测板及其材料

本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。

本发明检测胱抑素C的免疫检测板，包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的胱抑素C单克隆抗体或多克隆抗体，优选被胶体金标记的胱抑素C单克隆抗体，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；

在一个优选的方案中：层析材料上预包被胶体金标记的胱抑素C单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/ml胶体金标记的胱抑素C单克隆抗体溶液进行预包被的，包被量为50μl/cm²；优选的浓度为0.5或1.5mg/ml，50μl/cm²；

检测方法与结果判定

平放检测板，将试样滴在滤样纸上，试样约120μl，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。

阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；

阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；

无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。

试剂盒

本发明还提供了一种指含有本发明的单克隆抗体或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明的优点：

(1)本发明的抗胱抑素C单克隆抗体的特异性很高，且效价高；

(2)本发明的胱抑素C单克隆抗体可成对用于间接ELISA法。灵敏度极高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

胱抑素C表达载体的构建

根据GenBank(收录号：CAA36497.1)提供的人胱抑素C的基因序列，设计合成一对特异性引物,以人肾小管上皮细胞(HK-2)反转录的cDNA为模板特异性扩增出Cys C的27-146AA基因片段，基因序列如SEQ ID NO：1所示(图2)。PCR产物直接与市售的pMD-18Tsimple(购自takara公司)连接，转化Top10感受态细胞(购自北京天跟生物技术有限公司)，用菌落PCR的方法挑选阳性克隆。

PCR引物为：

正向引物：5'TCCAGTCCCGGCAAGCC3'(SEQ ID NO：2)

反向引物：5'GGCGTCCTGACAGGTGGA3'(SEQ ID NO：3)

将得到的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测是否出现分子量在360bp左右的条带，结果如图3所示。克隆出的基因经测序(华大基因)不含有义突变。

测序正确的克隆于LB培养至OD600到2.0时，用质粒小提试剂盒(购自北京天跟生物技术有限公司)抽提质粒，抽提的质粒和表达载体pET30a(+)(上海生化细胞所抗体中心平台提供)分别进行kpnⅠ&xhoⅠ双酶切。双酶切产物割胶回收后进行连接，连接产物转化Top10感受态细胞，用菌落PCR的方法挑选阳性克隆。将得到的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测是否出现分子量在360bp左右的条带，结果如图4所示。克隆出的基因经测序(华大基因)不含有义突变。

实施例2

重组胱抑素C蛋白的表达与纯化

测序正确的克隆转入常规的大肠杆菌BL21(DE3)plysS(购自北京天跟生物技术有限公司)表达菌株，在LB培养基，37℃，200rpm培养至OD600=0.8左右，加入终浓度1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。诱导表达的菌液离心后弃去上清，沉淀用PBS重悬。超声破碎后，用Ni Sepharose6fast flow(购自GE Healthcare)对蛋白进行亲和纯化，分别用40mM，100mM和300mM咪唑洗脱样品。各个洗脱样品用SDS-PAGE电泳图检测，如图5所示，300mM和100mM洗脱样品均含有目的蛋白胱抑素C，纯度大于90%。将这两个洗脱样品透析于1xPB缓冲液中，冷冻保存。

实施例3

动物免疫

用纯化的胱抑素C蛋白免疫Balb/c小鼠(中国科学院上海实验动物中心),0.1mg每只每次，肌肉多点注射。免疫程序：0，3，6周三次免疫，融合前三天取0.1mg蛋白腹腔注射，做回忆刺激。

实施例4

血清抗体效价检测：

采用间接ELISA的方法对血清效价进行检测:包被原核表达的胱抑素C蛋白5ug/mL,100uL/孔；小鼠血清1/1000起始，作1/10梯度稀释，稀释好的抗血清每孔加100ul，37℃孵育2h；加入标记HRP的羊抗鼠抗体(上海中科英沐生物科技有限公司)，每孔100ul，37℃孵育1h；最后加入显色底物。经测定#5小鼠血清效价在10⁶以上，选择#5小鼠进行细胞融合实验。

实施例5

杂交瘤细胞的构建

取免疫后小鼠脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞SP2/0采用聚乙二醇(PEG)常规融合法做融合。取1×10⁷SP2/0细胞与5×10⁷脾细胞(按1：5比例)混合于50ml离心管中，加入DMEM无血清培养液，离心，1500rpm，3min，弃上清。振松沉淀细胞，逐滴加入50%(v/v)PEG(分子量1500)1ml，边加边摇晃，1min内加完。静置90秒，让PEG继续作用。然后在2.5min内逐滴加入37℃预温的无血清DMEM培养液10ml，静置5min，终止PEG的作用。融合后细胞悬液离心，1000rpm，3min。弃上清，沉淀细胞轻轻打匀，加入25ml完全培养液(DMEM+10%FBS)，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，50μl/孔，置37℃，5%CO2培养箱内培养。第二天，加入含2×HAT(Sigma-Aldrich)的完全培养液，100μl/孔，杀死未融合的骨髓瘤细胞。

采用ELISA的方法筛选与胱抑素C具有特异性结合的杂交瘤，经过三次有限稀释法克隆化筛选到两株杂交瘤细胞株，分别命名为S-56-14和S-386-12，效价(OD值)及亚型鉴定见表1。

表1两株杂交瘤细胞株的抗体效价及亚型鉴定

Clone	Ab效价(OD450±SD)	Ig subclass
			S-56-14	2.527±0.012	IgG1,κ
S-386-12	2.733±0.083	IgG1,κ

本发明的产生胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株S-56-14，于2013年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC.C201334。

本发明的产生胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株S-386-12，于2013年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC.C201335。

实施例6

单克隆抗体的制备

6.1腹水制备

取经产F1代小鼠，于腹腔注射0.5ml降植烷(pristane)。7-10天后,再次腹腔注射0.5ml1×10⁶杂交瘤细胞。每天观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。

6.2单抗的纯化

上述获得的单抗腹水，采用Protein G亲和层析的纯化方法:预装Protein G-Sepharose4B(购自GE Healthcare)柱子，并用约50ml PB平衡；取2ml腹水，经0.45μm的滤膜过滤，20mM PB缓冲液稀释，最后过柱，20mM、pH=7.0的PB缓冲液洗脱未结合于柱的蛋白，测蛋白浓度，直至洗脱液内无蛋白为止；用100mM pH=2.7glycine洗脱结合在柱上的抗体，同时洗脱下来的液体用1M pH=9.0Tris-HCl中和，使其pH值为中性；收集洗脱液，测蛋白浓度。将上述溶液装入透析袋中，对10mM、pH=7.4的PBS缓冲液透析，每4小时换液一次，换液3次，透析后的单克隆抗体用BCA法测定浓度后分装，-70°C冰箱保存。

纯化后的S-56-14和S-386-12单抗进行SDS-PAGE检测。结果如图6所示。

此外，进行胱抑素C的免疫印迹检测，具体步骤如下：

(1)原核表达胱抑素C蛋白上样量2ug，进行SDS-PAGE电泳；

(2)转膜：300mA恒流，40min；封闭：5%脱脂奶粉室温，3h；

(3)杂交：一抗纯化的两株抗体S-56-14和S-386-12均以1:2000稀释，4℃，过夜；二抗标记HRP的羊抗鼠抗体(上海中科英沐生物科技有限公司)，1:1000稀释37℃1h；

显色结果见图7。

实施例7

抗体的亲和力测定

采用间接ELISA的方法测定两株单抗的滴度(亲和力)：包被原核表达的胱抑素C蛋白5ug/mL,100uL/孔，4℃过夜；每孔加入含2%BSA的PBS200uL，37℃，2h进行封闭；纯化后单抗1/1000起始，作1/2梯度稀释，稀释好的单抗每孔加100ul，37℃孵育，2h；加入标记HRP的羊抗鼠抗体(上海中科英沐生物科技有限公司)，1:2000稀释，每孔100ul，37℃孵育，1h；最后加入显色底物，用2M浓硫酸终止反应，测量450nm下的吸光值。纯化的两株抗体S-56-14和S-386-12滴度均在200万以上。用ELISA作图。

结果如图8。S-56-14抗体的亲合力为1.41x10^-9M，所述S-386-12抗体的亲合力为3.31x10^-10M。

实施例8

单克隆抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)

具体步骤如下：

(1)称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，于上液中加入0.2mL新配的0.1MNaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。

(2)将上述溶液装入透析袋中，置于1mM pH=4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4℃过夜。

(3)加20μL0.2M pH=9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入5mg S-386-12单克隆抗体(抗体透析于1mL0.01M碳酸盐缓冲液中)，室温避光轻轻搅拌2小时。加入0.1mL新配的4mg/mL NaBH₄液，混匀，再置4℃2小时。

(4)将上述液装入透析袋中，置于0.15M PBS(pH=7.4)透析，4℃过夜。最后得到的酶标记单抗定为S-386-12-HRP。

实施例9

单克隆抗体夹心ELISA实验

用碳酸盐缓冲液(pH=9.6)包被S-56-14抗体，稀释到1-10ug/mL(优选4ug/mL)，每孔100uL，4℃过夜；每孔加入含2%BSA的PBS封闭液200uL，37℃，2h；用洗涤液(含0.05%吐温的PBS)洗两遍；加入商品化试剂盒的胱抑素C标准品(Human Cystatin C ELISA，biovendor)，起始浓度100ng/mL,以1/2梯度稀释9个梯度，每孔加入100ul，37℃，2h；用洗涤液洗三遍；加入HRP-S-386-12，稀释400倍，每孔加100uL，37℃孵育，1h；洗涤液洗四遍；最后加入显色底物，用2M浓硫酸终止反应，测量450nm下的吸光值。用Curve Expert1.3软件绘制成曲线，如图9。

结果表明S-56-14和S-386-12可以配对，配对建立的双抗夹心ELISA可以检测1.5～100ng/mL的胱抑素C抗原，2-25ng/mL具有很好的线性关系，灵敏度是1.2ng/mL。可以应用到ELISA，化学发光法等免疫检测方法中，检测人血清或尿液中胱抑素C蛋白的含量，具有很好的应用前景。

实施例10

试剂盒

试剂盒包括一容器及容器内的本发明的检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有胱抑素C单克隆抗体杂交瘤细胞株S-56-14CCTCC.C201334所产生单克隆抗体(免疫球蛋白)。

菌种保藏

本发明的产生胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株S-56-14，于2013年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC.C201334。

本发明的产生胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株S-386-12，于2013年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC.C201335。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种胱抑素C单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体与胱抑素C亲和力为1.0×10^-10M至2.0×10^-9M，并且所述的抗体由杂交瘤细胞株S-56-14 CCTCC NO:C201334、或S-386-12CCTCC NO:C201335产生。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体可用于制备检测样品中胱抑素C的试剂、检测板或试剂盒。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的由杂交瘤细胞株S-56-14 CCTCC NO:C201334产生的抗体的亲和力为1.41x10^-9M，所述的由杂交瘤细胞株S-386-12 CCTCC NO:C201335产生的抗体的亲和力为3.31x10^-10M。

4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为IgG1型抗体。

5.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：

(a)权利要求1所述的单克隆抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

6.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，它是选自下组的产生胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞株：

(a)S-56-14 CCTCC NO:C201334；

(b)S-386-12 CCTCC NO:C201335。

7.一种权利要求1-4中任一所述的单克隆抗体或权利要求5所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备检测样品中胱抑素C的试剂、检测板或试剂盒。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

9.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括基片和测试条，所述的测试条含有权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求5所述的免疫偶联物。

10.如权利要求9所述的检测板，其特征在于，所述的基片为支撑板。

11.如权利要求9所述的检测板，其特征在于，所述的测试条还含有抗原点样区。

12.如权利要求9所述的检测板，其特征在于，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。

13.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器以及位于容器内的权利要求1所述的单克隆抗体，或者所述的试剂盒含有权利要求9所述的检测板。