CN107828739B - 可分泌鼠抗胱抑素c单克隆抗体的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体和用途 - Google Patents

可分泌鼠抗胱抑素c单克隆抗体的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及两株可分泌鼠抗CysC单克隆抗体的杂交瘤细胞，并利用体外无血清培养法培养这两株鼠抗CysC的单克隆抗体的杂交瘤细胞，制备单克隆抗体。本发明还涉及所述单克隆抗体用于检测人血清、血浆或全血中CysC的试剂盒的用途。本发明的单克隆抗体灵敏度高、特异性强、稳定性好，纯度高。

Description

可分泌鼠抗胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞及其分泌的单 克隆抗体和用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及可分泌鼠抗胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体和用途。
背景技术
胱抑素C(cystatin C，CysC)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，是一种小分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13KDa，由120个氨基酸组成，是一种分泌型蛋白质，属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员之一。CysC可由人体内几乎所有的有核细胞产生，其生成量非常稳定，不受年龄、性别、饮食、肌肉量和运动的影响，因此，血清CysC是一种理想的反映肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)的内源性标记物，检测血清或尿液中的CysC浓度能反映早期肾功能损伤。目前，已建立了免疫比浊法、放射免疫、荧光免疫、各种酶免疫测定方法及单向免疫扩散法(RID)等多种CysC检测方法。荧光免疫层析检测技术是在免疫层析技术的基础上，利用荧光分析技术对标记物浓度进行检测的一种新方法。该方法继承了胶体金免疫层析法操作便捷可现场检测的优势，同时利用荧光持续稳定的特性，较好地克服了胶体金免疫层析法测量时间长与结果不稳定两大缺点，具有灵敏度高、特异性强、快速操作简便以及现场快速筛查等特点。
荧光免疫层析检测技术检测CysC的原理是将一种抗CysC单克隆抗体用划线机喷到硝酸纤维素膜表面作为检测线1(T1)用于捕获样本中的CysC，将羊抗兔IgG多克隆抗体喷到硝酸纤维素膜表面作为质控线(C)，可以直接和反应液中荧光标记的兔IgG结合，另外一种抗CysC单克隆抗体用荧光标记，和待测样本中的CysC结合形成抗原-抗体复合物，样本中的CysC抗原越多，检测线上积聚的荧光复合物越多，则荧光信号越强，因此可用来检测CysC的浓度。目前，此种检测技术仍存在诸多的问题，如由于配对的抗体特异性差，导致出现非特异性染色，结果判定为假阳性，或所使用的单克隆抗体亲和力较低，造成荧光信号较弱，无法准确检测。因此，制备出一对灵敏度高、特异性强、亲和力好的抗CysC单克隆抗体显得尤为重要。
鼠源单克隆抗体的生产方法一般分为体内法和体外法两种。体内法即腹水法，腹水法产生抗体产量较高(2～10mg/ml)，但批间差无法控制，而且制备腹水所用的Balb/c小鼠必须达到SPF级，繁殖、饲养要求严格，限制了体外腹水法在生产单克隆抗体方面的应用。体外法即杂交瘤细胞体外培养生产单克隆抗体，体外法生产的抗体纯度高，操作可控性强，易于放大培养。目前在单克隆抗体的生产中，多数仍采用体内腹水法。
体外培养杂交瘤细胞的最终目标是尽可能接近细胞体内生存条件，因此需尽量模拟体内的生存环境。在体外培养细胞的培养基中添加10％～20％血清可向细胞提供激素，转移蛋白和其它营养成分，有利于杂交瘤细胞分泌抗体。但含血清培养基存在很多的缺点，如血清成分复杂，存在其它杂蛋白成分，这对抗体的下游纯化造成很大的障碍，同时血清易受病毒等污染，批与批之间质量难以统一，这就造成了研究与生产过程难以标准化等。基于以上原因，无血清或无蛋白培养基是体外培养杂交瘤细胞的主要发展方向。在使用无血清培养基之前，须对杂交瘤细胞进行低血清/无血清驯化，以使细胞适应此种环境。细胞低血清/无血清驯化过程冗长，在不断驯化过程中，细胞染色体容易丢失，驯化成功率较低。因而，筛选无血清培养基以及优化培养方案，使细胞可以直接适应，不需要进行驯化过程，能够显著缩短培养周期，提高单克隆抗体的生产效率。
发明内容
基于上述现有技术的问题，本发明的目的是提供一对可分泌鼠抗CysC单克隆抗体的杂交瘤细胞，并利用体外无血清培养法培养这两株抗CysC的单克隆抗体的杂交瘤细胞，制备单克隆抗体。通过此种方法制备出的单克隆抗体可用于检测人血清、血浆或全血中CysC的试剂盒。
本发明采用经典的杂交瘤单克隆抗体技术，以重组人CysC抗原(四川迈克生物新材料技术有限公司)作为免疫原，免疫2只Balb/C小鼠，血清筛选后选取抗体效价较好的小鼠取脾用于细胞融合，融合后经有限稀释法克隆、筛选出2株能稳定分泌鼠抗CysC单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明采用体外无血清培养可分泌鼠抗CysC单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备抗CysC单克隆抗体。
上述体外无血清培养包括以下几个步骤：细胞复苏,培养传代，无血清培养，收集培养上清，纯化，得到鼠抗CysC单克隆抗体。
本发明制备的鼠抗CysC单克隆抗体用于检测样品中胱抑素C的检测试剂盒的用途。
上述样品是人血清、血浆或全血。
本发明还提供一种用于检测样品中胱抑素C的检测试剂盒。
上述胱抑素C的检测试剂盒，包含鼠抗CysC单克隆抗体。
上述样品是人血清、血浆或全血。
本发明所述试剂盒为荧光免疫层析试剂盒。
上述荧光免疫层析试剂盒包含PVC底板、加样孔、吸水纸、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜分布检测线、质控线，所述检测线包被鼠抗胱抑素C单克隆抗体1，所述质控线包被有羊抗兔IgG多克隆抗体、抗生物素或抗亲和素标记的蛋白。
上述质控线包被有羊抗兔IgG多克隆抗体。
采用本发明制备的鼠抗CysC单克隆抗体杂交瘤细胞及体外无血清法制备的鼠抗CysC单克隆抗体与传统的体内腹水法制备的抗体相比较，得到的抗体灵敏度高、特异性强、稳定性好，纯度高。将制备的抗体应用于荧光免疫层析检测技术平台，检测人血清、血浆或全血中CysC的浓度，并且试剂盒的抗体使用量较传统的体内腹水法少，能够有效地降低试剂盒的成本。
附图说明
图1本发明两株抗体效价测定曲线图
图2体外无血清培养与腹水制备三批次鼠抗CysC单克隆抗体(CysC-1)效价比较
图3体外无血清培养与腹水制备三批次鼠抗CysC单克隆抗体(CysC-2)效价比较
图4试剂盒检测卡示意图，1为PVC底板，2为吸水纸，3为硝酸纤维素膜，4.羊抗兔IgG多克隆抗体，5为鼠抗胱抑素C单克隆抗体1(CysC-1)，6为玻璃纤维素膜
图5 40例同一人血清、血浆、全血样本检测结果
图6 47例血浆样本比对结果
图7 19例血清样本比对结果
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1杂交瘤细胞株的制备与筛选
⑴CysC抗原免疫小鼠
将重组人CysC抗原(四川迈克生物新材料技术有限公司)用生理盐水稀释至2.0mg/ml，与弗氏完全佐剂(Sigma公司，货号SLBF-9338V)等体积混合，用1ml注射器乳化为油状乳液，直至滴入水中的油状乳液不分散方可停止乳化。将该乳液以100ul/只的剂量四肢腋窝皮下施给BALB/c小鼠(成都达硕实验动物中心，6周龄雌性，2只)。第一次免疫14天后增强免疫，取抗原与弗氏不完全佐剂(Sigma公司，货号SLBM9367V)等体积混合后乳化，免疫剂量为50ul/只，以后每隔一周增强免疫一次，每次免疫之前采尾血，分离血清，用间接ELISA法测定效价。免疫5次后，2只小鼠血清效价均大于1：106，即可用于融合。融合前3天，取重组人CysC抗原用生理盐水稀释至2.0mg/ml，再与生理盐水等体积混合尾静脉追加免疫，剂量为50ul/只。
⑵杂交瘤细胞系的制备
①饲养细胞的制备
以正常的10周龄BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c取眼血拉颈处死，0.1％新洁尔灭浸泡1分钟，转入75％酒精浸泡1分钟，超净台内无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基础培养液3ml，后以滴管取出，再加入7mlRPMI1640基础培养液反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟留沉淀，用已加入20％新生牛血清的RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为3-5×105个/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2培养。
②免疫脾细胞的制备
小鼠追加免疫三天后，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，剪碎、研磨、过滤后得到分散的脾细胞，1000rpm离心5分钟留沉淀，RPMI1640基础培养液重悬，3％乙酸稀释计数。
③骨髓瘤细胞的制备
小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(中国科学院细胞库)经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取6大瓶(75cm2)制成细胞悬液，1000rpm离心5分钟留沉淀，用RPMI1640基础培养液重悬、计数，按0.5-2×105个/ml的细胞浓度进行分瓶培养(一般情况每1-2天更换一次15-30ml完全1640培养基)。
④细胞融合及HAT选择培养杂交瘤
将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:8的比例混合，在50ml锥形离心管内用RPMI1640基础培养液洗1次，1000rpm离心5分钟留沉淀。将细胞混匀，缓慢加入1.2ml50％的PEG4000融合，融合1分钟后加入30ml的RPMI1640基础培养液终止细胞融合。700rpm/min离心5分钟后重悬于含有1％HAT与20％新生牛血清的1640培养基中，平均滴入30套96孔细胞培养板。37℃，5％CO2培养，次日补加含有1％HAT与20％新生牛血清的1640培养基至孔满。5天后半换培养基，7天后再次半换培养基。
⑤阳性细胞株的筛选
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释重组人CysC抗原(四川迈克生物新材料技术有限公司)至2.5ug/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl，用于检测细胞培养上清。放置于冰箱中2-8℃过夜，第二天抛弃孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01MpH7.2的PBS 150ul/孔，37℃封闭2小时，拍干，真空封装待用。脾细胞融合后第九天，取细胞上清100ul于上述96孔检测板中，37℃孵育40分钟，ELISA洗板机洗五次后加入5000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30分钟同上洗板后，每孔加入100μL显色液(含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液)，37℃孵育10分钟，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，测450nm吸收值。以融合时小鼠血清稀释至100倍为阳性对照，RPMI1640完全培养液作为阴性对照，阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，样本OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆四次，使其达到100％单克隆，转入24孔继续培养，待细胞长满80％时转入细胞瓶扩大培养，待细胞长满细胞瓶80％时分瓶传代，传代的细胞生长至对数期时，用适量无血清RPMI-1640培养基分散细胞瓶内细胞，收集细胞悬液于锥形离心管中，记录细胞悬液体积V，取适量细胞悬液进行细胞计数，得到细胞悬液密度(个/ml)，其余1000rpm离心5min后弃上清液，根据细胞密度和离心前体积算出沉淀的细胞数，向细胞沉淀中加入适量冻存液调整细胞密度至4-8×106个/ml，然后分装于无菌冻存管中，每只冻存管加细胞液0.5ml。细胞融合共获得2株能稳定分泌鼠抗CysC单克隆抗体的杂交瘤细胞株CysC-1与杂交瘤细胞株CysC-2，且分别分泌的抗体以双抗体夹心法检测CysC抗原可配对，并于2017年9月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)，杂交瘤细胞株CysC-1保藏编号为CCTCC NO：C2017187，杂交瘤细胞株CysC-2保藏编号为CCTCC NO：C2017188。
实施例2单克隆抗体的制备
(1)复苏可分泌鼠抗CysC单克隆抗体的杂交瘤细胞并传代培养
在超净工作台中，取10ml完全1640培养基到25cm2一次性细胞瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育30min。从液氮罐中取出鼠抗CysC单克隆抗体的杂交瘤细胞株CysC-1与杂交瘤细胞株CysC-2，立即放入到37℃水浴锅中水浴，待融化后，立即以1000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀细胞用5ml已预热的完全1640培养基重悬后，转入细胞瓶中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。首次复苏培养过夜后，观察培养液颜色变化情况和瓶内细胞生长情况，若细胞生长超过细胞瓶底面积的70％且细胞性状及贴壁良好，在超净工作台内弃上清，用5ml完全1640培养基分散细胞瓶内细胞，并进行细胞计数，按0.5-2×105个/ml的细胞密度进行分瓶培养(一般1-2天更换一次5-10ml完全1640培养基)。细胞生长超过细胞瓶壁面积的70％且细胞性状及贴壁良好(一般2-3天)，弃上清使用适量完全1640培养基分散细胞瓶内细胞，计数，按0.5-2×105个/ml的细胞浓度进行分瓶培养。
(2)采用体外无血清培养制备单克隆抗体
当细胞数量达到需求量时,收集细胞沉淀,进行无血清培养级体外培养，无血清培养基中添加8nML-Gln(L-谷氨酰胺)(Thermo fisher，货号：25030081)，0.4％Cholesterol(胆固醇)(Thermo fisher，货号：12531018)。具体如下:待复苏传代的细胞数量达到5～6×106个后，收集细胞，利用台盼兰染色法计算细胞活率，活率需达到90％以上，利用125ml摇瓶进行无血清悬浮培养，培养体积为30ml，细胞起始培养密度为2～5×106个/ml，培养条件优化为温度37℃，8％，125rpm。当培养细胞活率降低到20％或更低时，收集细胞培养上清，测定上清效价，收集培养上清，经纯化后得到鼠抗CysC单克隆抗体，计算抗体产量。
实施例3效价检测
(1)杂交瘤细胞培养上清效价检测
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释重组人CysC抗原(四川迈克生物新材料技术有限公司)至2.5ug/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl。放置于冰箱中2-8℃过夜，第二天抛弃孔中液体，ELISA洗板机洗三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01M pH7.2的PBS，150ul/孔，37℃封闭2小时弃液体，拍干，用于检测杂交瘤细胞培养上清效价、无血清培养上清、纯化后的抗体效价。杂交瘤细胞培养上清效价检测第一孔为原倍上清培养液，从第二孔至第四孔以0.01MpH7.2的PBS缓冲液10倍逐级稀释，第四孔至第十孔以2倍逐级稀释。第十一孔以融合时小鼠血清稀释至100倍作阳性对照，第十二孔以RPMI 1640完全培养液作阴性对照，每孔样本体积为100ul。37℃孵育40分钟，ELISA洗板机洗五次后加入5000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育10分钟，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，测450nm吸收值。阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，当OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。检测值最低阳性孔所对应的稀释比例即为杂交瘤细胞培养上清效价，杂交瘤细胞株CysC-1培养上清效价大于1：3200，杂交瘤细胞株CysC-2培养上清效价大于1：6400。
(2)体外无血清培养杂交瘤细胞上清效价检测
ELISA检测方法同上⑴。稀释方法不同，具体为：第一孔为原倍培养上清，以0.01MpH7.2的PBS缓冲液从第二孔至第六孔10倍逐级稀释，从第七孔至第十一孔以2倍逐级稀释。检测值最低阳性孔所对应的稀释比例即为体外无血清培养上清效价，杂交瘤细胞株CysC-1与杂交瘤细胞株CysC-2体外无血清培养上清效价均大于1：8*105。
(3)纯化体外无血清培养法得到的抗体效价
先将本发明的两株鼠抗CysC单克隆抗体(四川迈克生物新材料技术有限公司，记作A)以0.01M pH7.2的PBS缓冲液统一稀释为1mg/ml，后再稀释10倍作为初始第一孔，从第二孔开始至第十一孔作5倍逐级稀释，每孔加样体积为100ul。37℃孵育50分钟，ELISA洗板机洗五次后加入12000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司)100μL，37℃孵育1h同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，检测450nm吸收值。阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效。抗体效价判定标准：以LOG(稀释度)为横坐标，以抗体OD值为纵坐标作曲线，曲线方程为y＝min+(max-min)/(1+10^((logEC50-x)×Hillslope))，通过sigmaplot数据处理软件拟合曲线，取中值效价＝10logEC50。结果显示利用无血清培养的方法得到的两株鼠抗CysC单克隆抗体的中值效价均大于1×105。表1为本发明两株抗体效价检测数据，图1为本发明两株抗体效价测定曲线图。
表1本发明两株抗体效价检测数据
酶标板孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
稀释度 10 50 250 1250 6250 31250 156250 781250 3906250 19531250 97656250
LOG 1 1.699 2.3979 3.0969 3.7959 4.4949 5.1938 5.8928 6.5918 7.2907 7.9897
CysC-1(OD) 2.9631 2.8341 2.6607 2.5281 1.9213 1.1048 0.4752 0.1968 0.0946 0.066 0.0634
CysC-2(OD) 3.0319 3.0108 3.0173 2.7953 2.2494 1.0947 0.3617 0.1364 0.0788 0.0636 0.0612
阳性对照 2.620 2.501
阴性对照 0.060 0.067
实施例4无血清培养和传统腹水法制备抗体效价比较
利用实施例3(1)中的方法同时稀释三批次无血清培养上清和传统腹水法制备的抗体，比较不同方式制备抗体的中值效价。结果表明，对于两株鼠抗CysC单克隆抗体(CysC-1与CysC-2)，无血清培养制备的抗体平均中值效价(1×105)明显高于腹水法制备的抗体平均中值效价(1×104)，同时利用腹水法制备的两株三批次抗体中值效价差别较大,即抗体批间差较大。图2，图3与表2列出了不同制备方式得到两株抗体的效价测定及效价测定曲线图。
表2体外无血清培养与腹水制备鼠抗CysC单克隆抗体中值效价检测
实施例5鼠抗CysC单克隆抗体的用途
(1)本发明的两株鼠抗CysC单克隆抗体(CysC-1与CysC-2)能应用于荧光免疫层析检测技术平台中检测人血清、血浆或全血中CysC的浓度。将待测样本加入反应液(荧光标记的鼠抗胱抑素C单克隆抗体2，即CysC-2和兔IgG)混匀，样本中的CysC抗原和反应液中CysC-2结合形成抗原-抗体复合物，将混合样本滴加到试剂盒加样孔中，在层析作用下沿着硝酸纤维素膜向前扩散，复合物被固定在检测线上的鼠抗胱抑素C单克隆抗体1，即CysC-1所捕获，质控区包被有羊抗兔IgG多克隆抗体，可以直接和反应液中荧光标记的兔IgG结合。样本中的CysC抗原越多，检测线上积聚的荧光复合物越多，荧光复合物数量与荧光信号值呈相关性，经仪器测定即可计算出样本中CysC的浓度。标记、包被、划膜间距优选方案见下表3-5。图4为该试剂盒中检测卡的示意图。
表3标记浓度
表4包被浓度
表5划膜间距
替代方案：表3中兔IgG多克隆抗体可被生物素或亲和素标记的蛋白替代，相应的表5中羊抗兔IgG多克隆抗体可被抗生物素或抗亲和素标记的蛋白替代。
(2)利用本发明制备的2株鼠抗CysC单克隆抗体(CysC-1与CysC-2)杂交瘤细胞所分泌的配对单克隆抗体制备的试剂盒的干扰能力分析：分别向阴性和阳性血清样本中以10％的体积比添加干扰物质甘油三酯，枸橼酸钠，肝素钠，EDTA-2K，血红蛋白，EDTA-2Na，胆红素。取3μL混合样本到标记反应液中，充分混匀5s～10s。吸取90μL混匀后的样本，滴到试剂盒的加样孔中，室温放置3分钟。将试剂盒放置于仪器的检测位，仪器自动检测并报告测定结果。各重复测定三次，计算平均值，再分别计算相对干扰率，相对干扰率应在±20.00％范围内。结果表明当样本中的血红蛋白≤7.70g/L、胆红素≤1200μmol/L、甘油三酯≤35.2mmol/L、肝素钠≤600U/L、EDTA-2Na≤8g/L、EDTA-2Ka≤8g/L、枸橼酸钠≤12g/L对检测结果无明显影响，相对干扰率均在±20.00％范围内。
表6抗干扰能力检测
(3)采用本发明制备的试剂盒，并使用实施例5(1)所述检测方法分别检测40例同一人血清、血浆和全血样本，结果表明利用本发明制备的2株鼠抗CysC单克隆抗体杂交瘤细胞所分泌的配对单克隆抗体(CysC-1与CysC-2)制备的试剂盒检测三种样本CysC的浓度值，一致性较好，见图5。采用商业化胶乳比浊试剂盒(迈克生物股份有限公司)和本发明两株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体制备的试剂盒同时检测47例血浆和19例血清样本，见图6与图7，结果表明，采用本发明制备的单克隆抗体制备的试剂盒与商业化胶乳比浊试剂盒(迈克生物股份有限公司)检测CysC的浓度值，一致性较好；从上述47例血浆中随机挑选17例样本，同时采用商业化比对试剂盒(广州万孚生物技术股份有限公司与南京基蛋生物科技股份有限公司)检测血浆中CysC的浓度值。图6、图7中A为商业化CysC测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)(迈克生物股份有限公司)，B为本发明CysC-1与CysC-2杂交瘤细胞所分泌的2株配对单克隆抗体制备的试剂盒。表7中B为本发明CysC-1与CysC-2杂交瘤细胞所分泌的2株配对单克隆抗体制备的试剂盒，C为CysC检测试剂盒(干式免疫荧光法)(南京基蛋生物科技股份有限公司)，D为CysC检测试剂(免疫荧光层析法)(广州万孚生物技术股份有限公司)，结果表明本发明杂交瘤细胞所分泌的2株配对单克隆抗体CysC-1与CysC-2制备的试剂盒与商业化的胶乳比浊试剂盒临床相关性最高(R值越高，相关性越高)，优于现有的免疫层析法商业化试剂盒。
表7三种免疫层析法试剂盒与商业化胶乳比浊法试剂盒检测17例血浆样本的相关性
(4)将本发明的2株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体制备的试剂盒置37℃环境10天后，测定浓度为2.00mg/L(允许浓度偏差为±25％)的企业内部控制物，重复测定3次，计算每次测定值的相对偏差(Bi)，3次结果均符合产品技术要求，即判为合格。如果大于等于1次的结果不符合要求，应重新连续测试20次，并计算每次测定值的相对偏差(B)，如果大于等于19次测定的结果符合产品技术要求，即判为合格。计算公式为：式中：B--相对偏差；xi—每次测定值；T--企业内部控制物标示值。未放置于37℃环境中的试剂盒测定的企业内部控制物作为对照组。结果表明，经过放置37℃环境10天后，利用本发明2株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体制备的试剂盒测定企业内部控制物的准确度相对偏差在±20.00％范围内，试剂盒稳定性满足要求。
表8试剂盒稳定性检测

Claims (13)

1.可分泌鼠抗胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCC NO：C2017187。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞可分泌鼠抗胱抑素C单克隆抗体1。
3.可分泌鼠抗胱抑素C单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCC NO：C2017188。
4.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞可分泌鼠抗胱抑素C单克隆抗体2。
5.根据权利要求2或4所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1或3所述杂交瘤细胞采用体外无血清培养制备。
6.根据权利要求5所述的杂交瘤细胞，其特征在于，所述体外无血清培养包括以下几个步骤：细胞复苏，培养传代，无血清培养，收集培养上清，纯化，得到鼠抗胱抑素C单克隆抗体。
7.根据权利要求2或4所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体制备用于检测样品中胱抑素C的试剂盒的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述样品是人血清、血浆或全血。
9.用于检测样品中胱抑素C的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2或4所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述样品是人血清、血浆或全血。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为荧光免疫层析试剂盒。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用的检测卡包含PVC底板、吸水纸、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜分布检测线、质控线，所述检测线包被鼠抗胱抑素C单克隆抗体1，所述质控线包被有羊抗兔IgG多克隆抗体、抗生物素或抗亲和素标记的蛋白。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述质控线包被有羊抗兔IgG多克隆抗体。
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