CN110054689A - 一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体的方法。该方法在连续灌服7天含160μg/ml黑灵芝多糖的1640溶液基础上,进行抗原HbA1c两次脾内注射免疫;同时其在最终免疫3日后采集脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞,并与骨髓瘤细胞SP2/0‑Ag14进行细胞融合,融合16小时后补充5×HAT溶液。本发明将传统免疫方法与两次脾内注射免疫相结合,同时联合口腔灌服7天黑灵芝多糖以提高阳性B淋巴细胞数量,有效缩短了单克隆抗体制备时间及抗原用量,采用杂交瘤融合16小时后补充5×HAT溶液,提高了融合率、阳性克隆率及HbA1c单克隆抗体获得效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种快速大量制备血红蛋白β链N末端缬氨酸糖基化(HbA1c)单克隆抗体的方法。
背景技术
血红蛋白β链N末端缬氨酸发生不可逆糖基化反应形成糖化血红蛋白(简称为HbA1c),全血中糖基化血红蛋白占总血红蛋白(HbA1c+HbA0)的百分比反应机体1~3个月平均血糖水平,因此临床上常将HbA1c占全血总血红蛋白的比值作为糖尿病的诊断及临床治疗效果的观察指标。
HbA1c含量的检测目前主要包括两种:一种是基于糖基化与非糖基化血红蛋白所携带的电荷不同,如离子交换层析法、电泳法;另一类是基于糖基化与非糖基化血红蛋白的化学结构不同,如乳胶凝集免疫法、酶免法及亲和层析法,其中HPLC法和免疫学测定是目前糖尿病临床检测中常用的方法。
免疫学中HbA1c的检测采用的单克隆抗体,要求与HbA0不反应,与HbA1C及天然HbA1C反应。在HbA1c制备过程中,决定其功能的为血红蛋白β链N末端缬氨酸糖基化6肽序列VHLTPE。此6肽分子量不足2KD,因分子量小,进行常规免疫很难获得阳性B淋巴细胞,多次免疫血清效价较低,导致单克隆抗体制备周期延长[1][2]。
实施脾内注射可以有效解决抗原分子量小影响免疫效果问题[3],同时在脾内注射前实施佐剂诱导机体增加T淋巴细胞MHCⅡ数量可以显著提高阳性B淋巴细胞数量[4],提高了HbA1c单克隆抗体制备的有效率。
参考文献
1.Parked D C,T cell dependent B cell Activation,Ann Rev Immunol,1993.
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3.梁骥,脾内免疫快速制备单克隆抗体及化疗药联合肿瘤疫苗治疗结肠癌,2013.
4.余强,黑灵芝多糖的免疫调节活性及其作用机制,2014.
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体方法。本发明方法能有效缩短抗体制备时间,提高阳性单克隆抗体的制备率。本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体的方法,其在连续灌服7天含160μg/ml黑灵芝多糖的1640溶液基础上,进行抗原HbA1c两次脾内注射免疫;同时其在最终免疫3日后采集脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞,并与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合,融合16小时后补充5×HAT溶液。
和现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明将传统免疫方法与两次脾内注射免疫相结合,同时联合口腔灌服7天黑灵芝多糖以提高阳性B淋巴细胞数量,可以在提高辅助T淋巴细胞数量条件下,增加MHCⅡ数量,提高配对的阳性B淋巴细胞数量,从而快速大量制备单克隆抗体,有效缩短了单克隆抗体制备时间及抗原用量,实现单克隆抗体工业化生产的需求。采用杂交瘤融合16小时后补充5×HAT溶液,提高了融合率、阳性克隆率及HbA1c单克隆抗体获得效率。
本发明生产的单克隆抗体与HbA1c发生特异性反应,且与HbA0不发生特异性反应,且此方法制备的阳性单克隆数量显著高于传统方法,此方法制备的HbA1c阳性单克隆抗体的周期显著低于传统方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。
本发明采用两次脾内注射联合灌服黑灵芝多糖7天的免疫方法提高阳性B淋巴细胞数量,在最终免疫3日后采集脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞,并与已经公知的骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合。
本发明使用的融合剂为聚乙二醇(又称PEG),融合方法与通常的方法相同。骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞以1:10进行混合,选择浓度为45%,分子量为5000的PEG进行融合。杂交瘤融合使用含20%FBS的完全培养基饲养层细胞培养,融合后16小时补充5×HAT选择培养基培养,融合后第10-14天,采用极限稀释法,对目标抗体产生细胞株进行检测及单克隆化筛选,计算获得的阳性克隆率(%),见下式:
阳性克隆率(%)=(阳性孔/融合孔)×100%
获得产生目标抗体的单克隆细胞株的方法,主要采用间接ELISA法,选择产生目标抗体的杂交瘤细胞,所产生的抗体与N末端缬氨酸糖基化序列(Glu-VHLTPEEKSA)的多肽或蛋白质抗原发生特异性反应,且与血红蛋白β链N末端缬氨酸未糖基化序列(VHLTPEEKSA)的多肽或蛋白质抗原不发生特异性反应。
具体来说,杂交瘤单克隆细胞培养上清中的单克隆抗体与固相化处理后的纯化HbA1c抗原发生反应,之后与标记有抗IgG的抗体发生反应,通过间接ELISA法筛选出可以产生抗HbA1c抗体的单克隆杂交瘤细胞。获得的杂交瘤细胞进一步培养,筛选纯化产生抗HbA1c抗体的单克隆细胞,获得的阳性HbA1c抗体的单克隆细胞经腹腔注射及腹水回收提取大量抗HbA1c的单克隆抗体。
以下是对本发明的具体实施措施及详细数据的描述,描述过程中未详细描述各种过程和方法,这些过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实例1抗HbA1c和HbA0单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
a使用由非专利文献(Jan-Olof Jeppsson,Uwe Kobold,John Barr,et al.ClinChem Lab Med,40(1):78-99,2002)所述的氨基酸序列且由GL Biochem合成纯化的抗原HbA1c和HbA0)采用离子色谱法制备。将1mg合成多肽抗原HbA1c(Glu-VHLTPEEKSA-P-KLH)与1ml pH7.2PBS溶液均匀混合稀释成浓度为1mg/ml抗原溶液。
b使用由非专利文献(余强,黑灵芝多糖的免疫调节活性及其作用机制,2014.)所述的黑灵芝多糖最佳有效量(160μg/ml),将此浓度配制到1640溶液中。选择12只体重(18-22g)、周龄(8w)及性别(雌性)均差异不显著的Balb/c小鼠,随机分为四组即传统组A1c组、传统A0c组、黑灵芝多糖A1c组和黑灵芝多糖A0c组,每组各3只重复。传统组的免疫程序为:第0d皮下注射50μg抗原(含CFA)+第14d皮下注射80微克抗原(含IFA)+28d腹腔注射100微克抗原(含PBS)+35d血清抗体效价检测。黑灵芝多糖A1c组和黑灵芝多糖A0c组的免疫程序为:于免疫前7天进行灌服,200μl/次,1次/天,连续灌服7天。于第8天分别进行脾内注射HbA1c和HbA0抗原,20μg/只;于第22天分别进行脾内二次注射HbA1c和HbA0抗原,20μg/只,同时皮下注射抗原(含IFA)50μg/只;于第30天进行尾静脉血清抗体水平检测,ELISA检测结果显示HbA1c(+)、HbA0(-),血清效价水平在1:1000以上时将小鼠处死,采集脾脏并用淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞,将分离的脾淋巴细胞与小鼠的细胞SP2/0以50%PEG介导条件下融合。融合后的细胞及培养液(20%FBS+1640培养液)以40μl/孔铺板到含80μl/孔饲养层96孔板中,培养16h后加入80μl/孔5×HAT选择培养基进行筛选,培养第7-8天全部更换为200μl含2%HT+20%FBS+1640的培养基进行克隆培养,待克隆大小为孔面积的1/8以上进行检测。融合后第7天将HAT筛选培养基更换为HT培养基,同时计算融合率(96孔板中融合孔占整板的比例),比较黑灵芝多糖改进组(黑灵芝多糖+常规操作)与常规单抗制备组(常规操作)免疫结果及融合结果,见表1。
表1黑灵芝多糖改进组与常规单抗制备组免疫结果及融合结果比较
实例2抗HbA1c和HbA0单克隆抗体的ELISA检测及鉴定
a分别将由PBS稀释后终浓度为1μg/ml的HbA1c、HbA0和天然HbA1c溶液加入到96孔酶标板的小孔中,4℃过夜放置一晚,第二天将HbA1c、HbA0和天然HbA1c溶液包被的96孔酶标板用洗液(含0.05%Tween的PBS缓冲液)清洗两次,然后用封闭液(1%BSA)室温封闭酶标板两个小时,封闭结束后将封闭液倒掉,在吸水纸上拍干,贴上封闭纸放置到-20℃保存。
b融合后第10-14d,将实例1获得的杂交瘤细胞以每孔分别取100μl细胞上清液加入到96孔酶标板,室温孵育1小时,将上清液倒掉,用洗液(含有0.05%Tween的PBS缓冲液)在洗板机上洗涤3个循环后,取下96孔酶标板于吸水纸上拍干,然后加入100μlHRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG抗体到96孔酶标板的小孔中,室温孵育1小时,用洗液洗涤2次,加入100μl TMB显色液(3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺)室温显色3min,50μl1M的HCl终止反应后,于450nm波长吸光度检测,挑取与阳性的克隆对照孔吸光度值最的单克隆孔,并进行进一步的亚克隆筛选,融合后初次检测结果,见表2。通过对四组融合后HbA0和HbA1融合阳性率比较可知,黑灵芝多糖A1c组获得的抗HbA1c(+)且HbA0(-)且天然HbA1c(+)融合孔阳性率最高,黑灵芝多糖A0c组获得的抗HbA0(+)且HbA1c(-)且天然HbA1c(-)融合孔阳性率最高。
表2黑灵芝多糖改进组与常规单抗制备组中HbA0和HbA1融合阳性率比较
实例3抗HbA1c和HbA0单克隆抗体杂交瘤细胞的克隆化培养
实例2中所获得的阳性杂交瘤细胞MC经过有限稀释法稀释后挑选阳性单克隆实施克隆化培养。具体方法如下:分别将实例2获得的阳性抗HbA0抗体的杂交瘤细胞和阳性抗HbA1c抗体的杂交瘤细胞进行计数,经过梯度稀释制备为浓度为1个/200μl的单细胞悬液,将200μl单细胞悬液加入到96孔细胞培养板的小孔中,于37℃5%二氧化碳培养箱中培养,培养约9d左右选择单克隆孔上清液进行间接ELISA检测,设置阴性对照(PBS)和阳性对照(HbA1c单抗,购自日本富士公司),挑选吸光度(OD)值高于阳性对照孔且为单克隆的杂交瘤细胞进行连续3次稀释传代,最终选择吸光度(OD)值高于阳性对照孔,细胞形态完整、大小均匀、生长状态正常且经0.4%台盼蓝染色活细胞率达98%以上的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养、建系及冻存。
实例5抗HbA1c和HbA0单克隆抗体的腹水生产
首先,确定Pristane预刺激时间表;其次,选择10-12周龄健康的Balb/c雌性鼠,在计划注射细胞前10-14d用Pristane预刺激小鼠,于小鼠下腹部中线右侧注射0.5ml/只;第三,杂交瘤单克隆细胞腹腔接种前1-2d用新鲜1640培养基(含有10%FBS)传代杂交瘤细胞保证其处于对数期,同时用0.4%台盼蓝染色确定注射当天杂交瘤细胞活力在95%以上;第四,在Pristane腹腔注射第7-10d,将实例4最终获得细胞活力95%以上且处于对数期的杂交瘤细胞悬液加入15ml离心管中,200g离心5min,弃后用D-PBS重悬调整细胞含量为0.6-1.2x106个/ml,在重悬后1h内尽快腹腔注射,用带有21号针头的无菌注射器实行腹腔注射0.5ml/只;第五,对于杂交瘤细胞注腹腔射24h内的小鼠,注意观察健康状况,同时于杂交瘤细胞注射后7-10d观察并无菌收集腹水,对每次获得的腹水合并后经1500g离心10min,去除上层油脂同时将离心后的腹水上清转移到50ml离心管中,以1:1000的比例加入硫柳汞,混匀后保存于4℃。
本发明获得的单克隆HbA1c抗体,经过与HbA0及天然HbA1c包被的抗原进行酶联免疫反应(ELISA)检测可知,与传统的杂交瘤融合方法相比,实施黑灵芝多糖联合脾内注射方法可显著提升HbA0(+)且HbA1c(-)且天然HbA1c(-)融合孔阳性率,并经3次有限稀释最终获得HbA0(+)且HbA1c(-)且天然HbA1c(-)的单克隆抗体。
本发明获得的单克隆抗体与血红蛋白β链N末端缬氨酸糖基化序列(Glu-VHLTPEEKSA)的多肽或蛋白质抗原发生特异性反应,且与血红蛋白β链N末端缬氨酸未糖基化序列(VHLTPEEKSA)的多肽或蛋白质抗原不发生特异性反应。
本发明获得的单克隆抗体,经过酶联免疫反应与已知的HbA0抗原不反应,且与天然糖化血红蛋白抗原反应。
N末端具有氨基酸序列VHLTPEEKSA的N末端缬氨酸未被修饰的多肽主要包括血红蛋白(Hb),Hb的β链上N末端具有氨基酸序列(VHLTPEEKSA)的多肽HbA0以及N末端含有序列(VHLTPEEKSA)的寡肽。N末端具有序列(VHLTPEEKSA)的N末端缬氨酸被糖基化修饰的多肽或蛋白质,可以举出为HbA1c。
因此,本发明的抗体的优选方式,是与N末端具有序列(VHLTPEEKSA)的N末端缬氨酸发生糖基化修饰的多肽或HbA1c发生反应,与含有序列VHLTPEEKSA的N末端缬氨酸未发生糖基化修饰的多肽或蛋白质如Hb、HbA0不发生反应的抗体。
本发明方法中的HbA1c的测定方法适用于通常的免疫学测定方法中的任意一种,包括竞争性ELISA法、双抗体Elisa夹心法、免疫层析法及乳胶凝胶法等,本抗体适用于任意HbA1C的免疫学测定。
Claims (1)
1.一种快速大量制备HbA1c单克隆抗体的方法,其特征在于,其在连续灌服7天含160μg/ml黑灵芝多糖的1640溶液基础上,进行抗原HbA1c两次脾内注射免疫;同时其在最终免疫3日后采集脾脏利用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞,并与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合,融合16小时后补充5×HAT溶液。
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