CN115850496B - Fuca1特异性抗体及其应用 - Google Patents
Fuca1特异性抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供了FUCA1特异性抗体及其应用。所述FUCA1特异性抗体的CDR序列为:H‑CDR1为SEQ ID NO.1,H‑CDR2为SEQ ID NO.2,H‑CDR3为SEQ ID NO.3,L‑CDR1为SEQ ID NO.4,L‑CDR2为SEQ ID NO.5,L‑CDR3为SEQ ID NO.6;或者,H‑CDR1为SEQ ID NO.7,H‑CDR2为SEQ ID NO.8,H‑CDR3为SEQ ID NO.9,L‑CDR1为SEQ ID NO.10,L‑CDR2为SEQ ID NO.11,L‑CDR3为SEQ ID NO.12。本申请的FUCA1特异性抗体可用于肿瘤或者岩藻糖苷贮积症的诊断。
Description
技术领域
本申请属于蛋白领域和生物领域,具体地,本申请提供了FUCA1特异性抗体及其应用。
背景技术
组织岩藻糖苷酶α-L1(FUCA1)的功能为去除糖蛋白中的岩藻糖残基。在人体中,该酶的失活可能导致岩藻糖苷贮积症,并且该酶失活或表达情况与多种癌症,如结直肠癌、乳腺癌、胶质瘤相关。因此,FUCA1相关检测在医疗和生物学研究中有着广泛的用途。
目前,FUCA1的抗体,特别是单克隆抗体报道较少,在灵敏度和特异性上也多有不足,本领域中有研究新型FUCA1单克隆抗体的需求。
发明内容
针对上述需求,一方面,本申请提供了FUCA1特异性抗体,所述FUCA1特异性抗体的CDR序列为:
H-CDR1为SEQ ID NO.1,H-CDR2为SEQ ID NO.2,H-CDR3为SEQ ID NO.3,L-CDR1为SEQ ID NO.4,L-CDR2为SEQ ID NO.5,L-CDR3为SEQ ID NO.6;
或者,H-CDR1为SEQ ID NO.7,H-CDR2为SEQ ID NO.8,H-CDR3为SEQ ID NO.9,L-CDR1为SEQ ID NO.10,L-CDR2为SEQ ID NO.11,L-CDR3为SEQ ID NO.12。
进一步地,所述FUCA1特异性抗体的重链和轻链可变区序列为:
重链可变区:SEQ ID NO.13;轻链可变区:SEQ ID NO.14;
或者,重链可变区:SEQ ID NO.15;轻链可变区:SEQ ID NO.16。
进一步地,所述FUCA1特异性抗体的重链和轻链序列为:
重链:SEQ ID NO.17,轻链:SEQ ID NO.18;
或者,重链:SEQ ID NO.19,轻链:SEQ ID NO.20。
另一方面,本申请提供了上述抗体的制备方法,包括在宿主中表达编码上述抗体的基因。
进一步地,在宿主中表达编码重链可变区和轻链可变区的基因SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22;
或者,在宿主中表达编码重链可变区和轻链可变区的基因SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24。
进一步地,在宿主中表达编码重链和轻链的基因SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26;
或者,在宿主中表达编码重链和轻链的基因SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28。
进一步地,所述宿主选自哺乳动物细胞、细菌、酵母或者昆虫细胞。
另一方面,本申请提供了上述FUCA1特异性抗体在制备检测肿瘤的试剂盒中的应用。
进一步地,所述肿瘤为结直肠癌、乳腺癌或胶质瘤。
另一方面,本申请提供了上述FUCA1特异性抗体在制备诊断岩藻糖苷贮积症的试剂盒中的应用。
进一步地,上述试剂盒为ELISA试剂盒。
附图说明
图1为抗体2B的特异性检测结果;
图2为抗体2-12E-2的特异性检测结果;
图3为抗体灵敏度检测结果。
具体实施方式
实施例1抗体的制备和测序
1在大肠杆菌中表达FUCA1蛋白
在NCBI中选择适合的FUCA1基因和蛋白序列(NM_000147.5Homo sapiens alpha-L-fucosidase 1(FUCA1),transcript variant 1,mRNA;NP_000138.2tissue alpha-L-fucosidase precursor[Homo sapiens])。
委托苏州金唯智公司合成表达载体:质粒:pET-28a(+)、5’酶切位点:BamHI、3’酶切位点:Xhol、表达菌株:BL21(DE3);
取100ng质粒和20ul感受态细胞混合,冰上放置30min;热激45s,冰上放置2min,37℃,200rpm培养1h,2000rpm离心,留少量上清涂Kana抗性平板。
37℃培养箱过夜培养;
第二天挑菌扩大培养,1mM IPTG,37℃诱导4h,SDS-PAGE检测诱导效果;
表达成功后增加摇菌体积,进行蛋白纯化。
2小鼠免疫过程
第一次免疫:重组人FUCA1蛋白(PBS缓冲液,浓度为2mg/ml)100ug和完全弗氏佐剂按照体积比1:1完全混合后,小鼠后足垫皮下注射;
第二次免疫:第一次免疫完成后2周进行第二次免疫,重组人FUCA1蛋白(PBS缓冲液,浓度为2mg/ml)100ug和不完全弗氏佐剂按照体积比1:1完全混合后,小鼠后足垫皮下注射;
第三次免疫:第二次免疫完成后2周进行第三次免疫,重组人FUCA1蛋白(PBS缓冲液,浓度为2mg/ml)100ug和PBS缓冲液按照体积比1:1混匀后,腹腔注射;
第三次免疫完成后10天取小鼠眼周血做效价检测;
加强免疫:融合前三天,重组人FUCA1蛋白(PBS缓冲液,浓度为2mg/ml)100ug和PBS缓冲液按照体积比1:1混匀后,小鼠尾静脉注射。
3细胞融合
得到小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞后,RPMI-1640培养基各清洗2次,然后按照数量比1:5混合骨髓瘤细胞和淋巴细胞,得到细胞混合物;将所述细胞混合物放到50ml离心管中,用RPMI-1640基础培养基40ml重悬,然后在1000rpm条件下离心5min,弃上清,摇动离心管使细胞均匀,缓慢加入1ml50%PEG,反应90秒,然后加入10mlRPMI-1640培养基终止PEG,把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10min,在1000rpm条件下离心5min,弃上清后加入HATRPMI-1640完全培养基重悬细胞;
融合的细胞辅到96孔板中,每孔100μl;然后将细胞培养板放到CO2培养箱中培养,融合10天后,取细胞培养上清,ELISA检测阳性孔后做半固体培养挑单克隆。
4单克隆抗体的获得和测序
吹打阳性孔中细胞,取10ul计数为N,根据有限稀释法在离心管中加入PBS缓冲液,取100μl细胞悬液到离心管中,吹匀后取30ul,加入500ulRPMI-1640完全培养基,吹匀后接种到半固体培养基上,6-8天后挑选肉眼可见的单克隆细胞株接种到96孔板上,然后筛选出阳性单克隆细胞株。
对腹水进行纯化处理的操作具体如下:
将蛋白质A琼脂糖凝胶介质装入镍离子亲和层析柱,将腹水与PBS按照体积比1:1等量混合后缓慢上样,待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱,即得本申请FUCA1单克隆抗体。委托百英生物公司进行抗体测序。
实施例2抗体的特异性和灵敏度检测
特异性:
Elisa检测两个抗体的特异性,抗原为重组人全长FUCA1蛋白,铺板浓度梯度设置为2ug/ml(不加人血清的阳性对照),2ug/ml,1ug/ml,0.2ug/ml,0.04ug/ml,0.008ug/ml,0。
将2B和2-12E-2单克隆细胞培养上清和人血清1:1混合均匀后孵育0.5h,加入酶标板37℃继续孵育1h,每孔上样量为100ul。
二抗为标记HRP的羊抗鼠,孵育0.5h后加TMB显色。
从图1、2结果来看,加入人血清后抗体效价没有明显降低,且与抗原浓度成正相关,说明人血清中没有抗体非特异识别的物质来影响检测,抗体特异性较好。
灵敏度:
夹心法Elisa检测抗体识别重组人FUCA1蛋白的灵敏度,其中2B为捕获抗体无标记,2-12E-2为检测抗体,标记HRP。
将捕获抗体2B包被到酶标板中,然后加入10倍梯度稀释的重组人FUCA1蛋白,37℃孵育1h后加入检测抗体2-12E-2,继续孵育1h后加入TMB显色。
从图3结果来看,2B和2-12E-2用传统夹心ELisa检测抗原的灵敏度可以达到2ng/ml左右。
Claims (9)
1.FUCA1特异性抗体,其特征在于,所述FUCA1特异性抗体的CDR序列为:
H-CDR1为SEQ ID NO.1, H-CDR2为SEQ ID NO.2, H-CDR3为SEQ ID NO.3, L-CDR1为SEQ ID NO.4, L-CDR2为SEQ ID NO.5, L-CDR3为SEQ ID NO.6;
或者,H-CDR1为SEQ ID NO.7, H-CDR2为SEQ ID NO.8, H-CDR3为SEQ ID NO.9, L-CDR1为SEQ ID NO.10, L-CDR2为SEQ ID NO.11, L-CDR3为SEQ ID NO.12。
2.根据权利要求1所述的FUCA1特异性抗体,其特征在于,其中所述FUCA1特异性抗体的重链和轻链可变区序列为:
重链可变区:SEQ ID NO.13;轻链可变区:SEQ ID NO.14;
或者,重链可变区:SEQ ID NO.15;轻链可变区:SEQ ID NO.16。
3.根据权利要求2所述的FUCA1特异性抗体,其特征在于,其中所述FUCA1特异性抗体的重链和轻链序列为:
重链:SEQ ID NO.17,轻链:SEQ ID NO.18;
或者,重链:SEQ ID NO.19,轻链:SEQ ID NO.20。
4.根据权利要求1-3任一项所述的FUCA1特异性抗体的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括在宿主中表达编码根据权利要求1-3任一项所述的FUCA1特异性抗体的基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,其中在宿主中表达编码重链可变区和轻链可变区的基因SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22;
或者,在宿主中表达编码重链可变区和轻链可变区的基因SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,其中在宿主中表达编码重链和轻链的基因SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26;
或者,在宿主中表达编码重链和轻链的基因SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28。
7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法,其特征在于,其中所述宿主选自哺乳动物细胞、细菌、酵母或者昆虫细胞。
8.根据权利要求1-3任一项所述的FUCA1特异性抗体在制备诊断岩藻糖苷贮积症的试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其中所述试剂盒为ELISA试剂盒。
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