CN115073591A - 一种可识别asfv外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体及应用 - Google Patents

一种可识别asfv外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

一种可识别ASFV外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体及应用。本发明公开了一种可识别ASFV外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体，包括重链可变区CDR1‑3和轻链可变区CDR1‑3，其中所述重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列如序列表中所示。还公开了本发明抗体在制备用于检测、治疗和/或预防非洲猪瘟病毒产品中的应用。该抗体对于非洲猪瘟病毒具有高亲和力。

Description

一种可识别ASFV外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种可识别ASFV外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体及应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus,ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起的严重急性、出血性、烈性传染病，病死率可达100％。非洲猪瘟病毒是一种核质双链DNA大病毒，在其基因组编码的约200种蛋白质中，有一种由EP402R基因编码的糖蛋白CD2v在ASFV病毒入侵宿主和传播扩散中发挥重要作用。CD2v的包膜段外包含15个潜在的N糖基化位点，包膜内段只有3到4个糖基化位点。在ASFV感染的病毒细胞中，CD2v的存在方式有三种：全长蛋白、N端糖基化片段以及C端非糖基化片段。研究表明CD2v分子的糖基化修饰与ASFV的免疫逃逸密切相关。
北京畜牧兽医研究朱鸿飞教授团队将ASFV Geogia 2007/1株中全长EP402R基因进行密码子优化，连入pET-28a(+)表达原核重组表达载体，用大肠杆菌系统表达，获得CD2v重组蛋白，最后用纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。由于原核蛋白表达系统缺乏真核蛋白表达体系中的糖基化修饰过程，用其筛选的抗体，是否可识别糖基修饰的CD2v分子，还有待于进一步验证。另外，中国检验检疫科学研究院林祥梅教授团队，突破性地实现了CD2v胞外段的真核细胞表达并通过免疫小鼠制备了鼠源多克隆抗体。但由于是多克隆抗体，其特异性较差，并且难以标准化，不同批次的抗体质量差异较大，难以用于需特异性较高的实验和治疗试剂的开发。单克隆抗体无论实在检测试剂的开发还是抗体药物的研发都具有广泛的应用。尽管近几年已经有CD2v的单克隆抗体被鉴定，然而非洲猪瘟病毒在抗体的压力下，具有高突变性，同时病毒自身结构蛋白的糖基化修饰也参与病毒的免疫逃逸。因此，更多的针对不同表位的新的抗体对于治疗是必不可少的。本发明的目的是研发识别单一表位的、与CD2v具有较好亲和力，同时还可以识别糖基化与非糖基化修饰的抗CD2v单克隆抗体。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于利用杂交瘤技术筛选特异性识别CD2v蛋白的单克隆抗体，用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)检测试剂的开发。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种可识别ASFV外膜蛋白糖基化修饰的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：分别如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3；以及分别如SEQ ID NO.10、11、12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3。
进一步地，所述单克隆抗体还包括：分别如SEQ ID NO.4、5、6、7所示氨基酸序列的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4；以及分别如SEQ ID NO.13、14、15、16所示氨基酸序列的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4。
进一步地，所述重链可变区具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体还包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区。
本发明第二方面提供了包含编码上述任一项所述单克隆抗体或其功能片段的核酸分子。
进一步地，编码重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的核酸分子分别如SEQ ID NO.19、20、21所示的核苷酸序列；编码轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的核酸分子分别如SEQ ID NO.28、29、30所示的核苷酸序列。
进一步地，编码重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的核酸分子分别如SEQ IDNO.22、23、24、25所示的核苷酸序列；编码轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的核酸分子分别如SEQ ID NO.31、32、33、34所示的核苷酸序列。
进一步，编码重链的核酸分子如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列；编码轻链的核酸分子如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列。
本发明第三方面提供了包含上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括表达载体或宿主细胞。
进一步地，所述生物材料还包含与所述单克隆抗体的轻链或重链相连的信号肽；优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9或18所示。
进一步地，与重链相连的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，优选地，编码其重链相连的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.27；与轻链相连的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，优选地，编码其轻链相连的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.36。
本发明第四方面提供了一种药物组合物，包含上述任一项所述的单克隆抗体。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，包含上述任一项所述的单克隆抗体。
进一步地，所述试剂盒包括：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)和免疫荧光试剂盒。
本发明第六方面提供了上述任一项所述的单克隆抗体或上述任一项所述的生物材料或上述任一项所述的试剂盒在如下任一项中的用途：
(1)在制备检测糖基化或非糖基化CD2v蛋白的产品中的用途；
(2)在制备检测或诊断非洲猪瘟病毒的产品中的用途；
(3)在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的分离纯化或检测中的用途；
(4)在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒抗体的分离纯化或检测中的用途；
(5)在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒的药物中的用途。
进一步地，所述包括(但不限于)利用酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、免疫印迹、免疫荧光检测法、发光免疫测定法检测抗原抗体结合的产品。
进一步地，所述产品包括试剂、试纸条或试剂盒。
优选的，所述试剂盒包括诊断非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒。
本发明第七方面提供了任一项所述的单克隆抗体或或所述的生物材料在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒的药物中的用途。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明的实验证明，本发明的单克隆抗体不仅能与去糖基化的CD2v蛋白特异结合，还能与糖基化修饰的CD2v蛋白特异结合，亲和力达到10nM级别。进一步实验发现，本发明的单克隆抗体识别单一位点、特异性更强，还可用于免疫荧光的检测。这些结果表明本发明得到的单克隆抗体应用更广泛，可以分别用于不同实验场景下的CD2v蛋白检测分析。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测293T细胞表达CD2v-N-His蛋白实验结果。
图2为ELISA检测单克隆抗体与CD2v-N-His结合特性的实验结果。
图3为ELISA检测单克隆抗体与hCD2-His结合特性的实验结果。
图4为分子互作系统检测单克隆抗体与CD2v抗原亲和力的实验结果。
图5为Western Blot检测单克隆抗体与糖基化和去糖基化全长CD2v蛋白结合情况的实验结果。
图6为ELISA检测单克隆抗体与糖基化和去糖基化CD2v蛋白结合情况的实验结果。
图7为间接免疫荧光实验检测单克隆抗体与293T细胞表达的CD2v-GFP蛋白结合情况的实验结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1CD2v-N-His融合蛋白的真核表达与纯化
1、CD2v-N-His蛋白表达载体的构建与表达
根据GenBank:QGM12912.2 CD2v序列，将信号肽、CD2v蛋白胞外区序列(SEQ IDNO.37)以及6×His标签克隆至pCDNA3.1真核载体中，构建真核重组表达pCDNA3.1-CD2v-N-His，简称pCD2v-N-His载体。
将293T细胞置于Opti-MEM完全培养基中，37℃培养2h，将pCD2v-N-His 1μg加入到200μL jet-pRIME buffer中，涡旋5s，在超净台中放置10min，加入293T细胞并轻轻混匀；在转染后6h，用Opti-MEM培养基取代转染复合物，放置37℃继续培养72-96h，收集细胞上清备用。
2、真核表达的CD2v-N-His蛋白纯化
将上述收集表达的CD2v蛋白培养上清经NTA-Ni亲和层析柱进行纯化，向纯化前细胞培养上清液与纯化后收集的穿出液、洗杂液、洗脱液中加入5×Loading Buffer(含或不含巯基乙醇)，并煮沸10min，经12％SDS-PAGE分析纯化结果。洗脱获得的CD2v-N蛋白，在还原(reducing)条件下经SDS-PAGE电泳分析。结果显示在55-110kDa左右处出现弥散的目的条带(图1)。后将纯化的CD2v-N-His蛋白在变性条件下，用糖苷酶PNGase F(NEB BioLabs，#P0711S)或Endo H(NEB BioLabs，#P0702S)，酶切去糖基化(反应体系见表1-3)。SDS-PAGE分析结果显示CD2v蛋白具有不同程度的糖基化，经去糖后，其分子量明显变小，而且条带较为单一(图1)。说明55-110kDa左右处出现弥散的目的条带均为CD2v-N-His蛋白，具有较高纯度。
a.去糖基化修饰(PNGase F酶)
表1蛋白去糖反应体系
Figure BDA0003722315280000041
50℃孵育10min。
b.去糖基化修饰(Endo H酶)
表2蛋白变性反应体系
Figure BDA0003722315280000051
100℃加热反应10min；
表3蛋白去糖反应体系：
Figure BDA0003722315280000052
37℃孵育1h。
实施例2单克隆抗体的筛选与制备
1、CD2v-N-His蛋白免疫Balb/c小鼠
首次免疫：将0.25mL弗氏完全佐剂和100μg CD2v-N-His蛋白(0.25mL)乳化成油包水状态，分五点在Balb/c小鼠背部皮下注射，0.1mL/只，时间：1个月。
加强免疫：将0.25mL弗氏不完全佐剂和100μg CD2v-N-His蛋白(0.25mL)乳化成油包水状态，分五点在Balb/c小鼠背部皮下注射，0.1mL/只，时间：15天。
第二次加强免疫：将0.25mL弗氏不完全佐剂和100μg CD2v-N-His蛋白(0.25mL)乳化成油包水状态，分五点在Balb/c小鼠背部皮下注射，0.1mL/只，时间：15天。
Balb/c小鼠血清效价测定：
包被：抗原用包被液稀释横向包被，每孔加入100μL抗原进行包被，4℃包被过夜；洗板：用全自动洗板机洗板，3次洗液为1×PBST；封闭：每孔加入200μL用PBS配制4％脱脂牛奶进行封闭，37℃封闭1h；洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；加样：血清样品用稀释，竖向加入血清稀释样品，每孔加入100μL稀释好的血清样品，空白对照孔加入100μLPBS，37℃孵育1h；洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；二抗：用PBS按1:5000稀释二抗(Goat anti-mouse IgG-HRP，赛默飞，#A16072)，每孔加入100μL稀释好的二抗，37℃孵育40min；洗板：用全自动洗板机洗板5次，洗液为1×PBST；显色：配置好TMB显色液，每孔加入100μL TMB显色液，室温避光显色90s；终止：每孔加入100μL终止液进行终止，并用酶标仪检测每孔在OD450处的吸光值。
2、杂交瘤细胞融合
加强免疫：融合前三天对Balb/c小鼠进行加强免疫，腹腔注射0.5mL 100μg/只CD2v-N-His蛋白。
制备滋养层细胞：脱颈处死正常Balb/c小鼠，75％酒精浸泡皮肤进行消毒，无菌剥离皮肤，注射器抽取6mL 1640培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液，计数，调整细胞浓度至2×105个/mL，加入96孔板，0.1mL/孔，置37℃，5.0％CO2孵箱备用。
50％PEG制备：取10mL试管，称取PEG 0.7g溶于0.7mL无血清1640培养液中，加盖，白胶布密封，插入注射器针头，放入加有100mL烧杯中。利用电磁炉煮沸，计时30min，拔出针头再煮2min，置室温备用。
细胞融合：
取已免疫Balb/c小鼠，摘眼球放血(取血清留作阳性对照)后，脱颈处死小鼠，75％酒精浸泡皮肤消毒，无菌取脾，挤压出脾细胞，加入20mL 1640培养液于平皿，10mL吸管吹散脾细胞团块，将细胞悬液移至50mL离心管，洗一遍。
取骨髓瘤细胞于另一离心管，1200rpm/min离心4min弃上清，分别加入40mL 1640培养液进行计数，根据计数结果调整细胞比例：脾细胞∶骨髓瘤细胞＝6∶1。
混合两种细胞后，1200rpm/min离心4min弃上清，弹散管底细胞，离心管置于37℃水浴中，1min内缓慢加入50％PEG 1mL(边加边轻轻搅动)，静置40s，1min内加入1mL1640培养液(边加边轻轻搅动)，随后以相同的方法在2min内加入5mL 1640培养液，2min内加入10mL 1640培养液。将上述细胞悬液800rpm/min离心5min，弃上清，轻轻弹散管底细胞，加入含20％FBS的1640培养液，混匀后加入已铺滋养层的96孔板中(2×106个/mL)，置于37℃，5.0％CO2孵箱中培养。
换液：5天换液，20％FBS 1640培养液+HT，筛选前每天换液一次，共换3次，第8天进行筛选。
3、抗原阳性细胞的筛选
取单克隆细胞株上清，利用ELISA的方法进行阳性克隆筛选，具体操作步骤同血清效价测定。首轮筛选的阳性克隆转入24孔板进行培养，复测后挑选阳性克隆进行亚克隆。
4、杂交瘤细胞克隆化
制备滋养层细胞：步骤同“细胞融合”实验中制备滋养层细胞。
将24孔板中待做克隆的杂交瘤细胞用加样器反复吹打混匀后，取少数细胞悬液至另一无菌试管中，进行准确计数。
取200个细胞悬浮于10mL培养液中(约2个细胞/0.1mL)接种96孔培养板0.1mL每孔，共1块。取100个细胞悬浮于10mL培养液中(约1个细胞/0.1mL)接种96孔培养板0.1mL每孔，共2块。将培养板置于37℃，5.0％CO2孵箱中培养，5天左右在显微镜下观察到细胞克隆。确定单克隆细胞株，适时换液，检测，取阳性单克隆细胞株转入24孔板扩大培养。重复操作至克隆达到100％阳性率即为克隆化。
细胞换液原则：
15天，20％FBS 1640培养液+HAT；
15天，20％FBS 1640培养液+HT；
之后，10％FBS 1640培养液。
5、单克隆抗体大量制备
于Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，注射后一周可使用。
收取对数生长期的杂交瘤细胞，用生理盐水洗涤两次，1500rpm/min离心5min。台盼蓝染色计数，重新用生理盐水配成3×106个/mL的细胞悬液。
给注射了石蜡油的Balb/c小鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射0.5mL。接种后7-12天可见小鼠腹部明显膨大，此时可由腹腔抽取腹水。抽取的腹水3000rpm/min离心30min，收集上清，后经Protein A色谱柱纯化，获得后续实验用抗体。
实施例3候选抗体亚型鉴定
包被：捕获抗体(250×)使用包被缓冲液稀释成1×，酶联免疫板中每孔加入100μL进行包被，4℃包被过夜；洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；封闭：每孔加入250μL封闭缓冲液，室温封闭2h；洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；加样：每孔加入50μL分析缓冲液，然后加入50μL样品，室温孵育1h；洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；二抗：用分析缓冲液将检测抗体(250×)稀释至1×，每孔加入100μL检测抗体，室温孵育1h；洗板：用全自动洗板机洗板5次，洗液为1×PBST；显色：每孔加入100μL显色液，室温孵育15min；终止：每孔加入100μL终止液进行终止，用酶标仪检测各孔在OD450处的吸光值。
利用抗体亚型鉴定试剂盒(赛默飞，#A38550)测定候选抗体的亚型，结果显示：8G1，重链为IgG1类抗体，其轻链为kappa亚型。
实施例4候选抗体8G1与抗原的结合检测
包被：包被液稀释抗原至2μg/mL，酶联板中每孔加入100μL稀释后抗原，4℃包被过夜；洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；封闭：每孔加入200μL PBS配制的4％脱脂牛奶进行封闭，37℃封闭1h；洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；加样：用PBS稀释样品，每孔加入100μL样品，空白对照孔加100μL PBS，37℃孵育1h；洗板：用全自动洗板机洗板3次，洗液为1×PBST；二抗：用PBS按1:5000稀释二抗(Goat anti-mouse IgG-HRP，赛默飞，#A16072)，每孔加入100μL稀释好的二抗，37℃孵育40min；洗板：用全自动洗板机洗板5次，洗液为1×PBST；显色：配置好的TMB显色液，每孔加入100μL TMB，室温避光显色1min；终止：每孔加入100μL终止液进行终止，用酶标仪检测各孔在OD450处的吸光值。
单克隆抗体与抗原CD2v的结合特性如图2所示：
利用ELISA检测候选抗体8G1与非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的结合特性。结果显示，候选抗体8G1能识别并结合CD2v，且具有浓度依赖性，EC50值如表4所示。
表4候选抗体与CD2v的结合能力检测(EC50值)
Figure BDA0003722315280000081
实施例5ELISA实验分析8G1抗体特异性：
文献显示CD2V与CD2分子结构上高度同源，因此我们选用hCD2分子，检测筛选获得的8G1单克隆抗体与CD2分子结合情况。方法参见实施例4，具体如下：
包被人hCD2(His标签)蛋白(购自北京义翘神州股份有限公司，#10982-H08H)2μg/mL，加入分别加入0.1μg/mL 8G1，二抗用Goat anti-mouse IgG-HRP(赛默飞，#A16072)(1:5000)。图3结果表明，单克隆抗体8G1仅与CD2v分子有特异的结合，而与hCD2分子没有结合，表明筛选的抗体具有较好特异性。
实施例6利用Octet分子互作系统测定候选抗体8G1的亲和力
设定样品板分布，其中候选抗体的浓度为200nM，抗原浓度从800nM开始倍比稀释至12.5nM；
设定程序，如表5所示：
表5设定程序
Figure BDA0003722315280000082
Figure BDA0003722315280000091
选择探针的类型及位置，启动程序进行分析。
单克隆抗体与抗原CD2v的亲和力测定结果如图4所示：
利用ForteBio公司的Octet分子互作系统对候选抗体8G1进行亲和力测定。结果显示：8G1的KD值为2.35×10-8M，如表6所示。
表6 8G1与CD2v蛋白结合的动力学常数
Figure BDA0003722315280000092
实施例7 8G1抗体用于Western blot检测293T细胞中CD2v-HA蛋白的表达
细胞铺板：在六孔板中铺1×105个细胞/孔，待第二天细胞生长到70％左右进行转染；
转染：2μg pCDNA3.1-CD2v-HA质粒与200μL jetPRIME buffer混合，涡旋震荡10s，加入4μL jetPRIME reagent试剂，涡旋1s，室温静置10min，将上述混合物加到六孔板中，4h后换液。
实验分组：空白对照组(不转染质粒)，对照组(转染质粒)，去糖基化修饰组(转染质粒+10μg/mL衣霉素处理24h；Sigma，#T7765)；在转染后36h收取细胞提取总蛋白，采用Bradford方法蛋白定量，调齐蛋白样品浓度；进行SDS-PAGE电泳；将蛋白转印PVD F膜；5％脱脂牛奶室温封闭1h；一抗孵育：8G1抗体和mouse anti-HA-tag抗体(购自MBL公司，#M132-3)用1×TBST配制的5％脱脂牛奶稀释成1μg/mL，4℃过夜，1×TBST清洗PVDF膜10min，重复3次；二抗孵育：用1×TBST配制的5％脱脂牛奶按1:1000比例稀释二抗(Goat anti-mouseIgG-HRP，赛默飞，#A16072)，室温孵育1h，1×TBST清洗PVDF膜10min，重复3次；显影：ECL(购自GE，#RPN2106)显色，显影液需现配现用。
单克隆抗体与293T细胞表达的CD2v蛋白Western blot结果如图5所示：
为了确证候选抗体的功能，利用293T细胞转染CD2v-HA蛋白质粒进行瞬时表达，并采用衣霉素处理抑制其糖基化修饰，收取细胞裂解液进行Western blot。结果显示抗体8G1既能识别43kDa的去糖基化修饰的CD2v-HA蛋白，又能很好的识别95kDa糖基化修饰的CD2v全长蛋白。
实施例8ELISA实验分析8G1抗体与糖基化或去糖基化CD2V-N-His蛋白结合实验：
分别使用PNGase F、Endo H和PNGase F+Endo H，处理消化CD2v-N-His蛋白，具体去糖基化方法参见实施例1。分别包被真核表达的糖基化CD2v-N-His蛋白，以及经PNGaseF、Endo H和PNGase F+Endo H分别消化过的蛋白，各100μL(2μg/mL)，4℃包被过夜；进行后续ELISA实验(方法参见实施例4)。分别加入0.1μg/mL 8G1，二抗用Goat anti-mouse IgG-HRP(赛默飞，#A16072)(1:5000)。图6结果表明，单克隆抗体8G1不仅可以与糖基化修饰的CD2v分子有特异的结合，而且还可与去糖基化修饰的蛋白结合，具有较好的识别抗原能力。
实施例9 8G1抗体用于免疫荧光实验分析293T细胞表达CD2v-GFP蛋白情况
为进一步确证候选抗体的功能，构建了CD2v-GFP质粒，利用293T细胞进行瞬时表达CD2v-GFP蛋白，并用8G1单克隆抗体进行间接免疫荧光检测。
所述间接免疫荧光步骤如下：
将CD2v-GFP质粒转染293T细胞，转染36h后，使用4％多聚甲醛4℃固定24h；吸净皿中4％多聚甲醛固定液，用2mL 50nM NH4Cl洗细胞三次；用1mL透化液(1％BSA+0.1％TritonX-100/PBS缓冲液)室温透化20min；吸净透化液，在玻底皿的中间部分加入100μL封闭缓冲液，室温孵育1h；一抗孵育：用抗体稀释液(1％BSA+0.3％Triton X-100)稀释8G1单克隆抗体至1μg/mL，吸净封闭液，在玻底皿的中间加入100μL一抗，4℃孵育过夜；用2mL含0.1％TritonTMX-100的PBS缓冲液洗三次，每次5min；二抗孵育：用抗体稀释液将荧光二抗(F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG(H+L),Alexa Fluor 594，购自赛默飞，#A-11020)按说明书进行稀释，在玻底皿的中间部分加入100μL二抗，避光室温孵育1h；用2mL含0.1％TritonTMX-100的PBS缓冲液洗三次，每次5min；滴入两滴含DAPI的防猝灭封片剂，直接在荧光显微镜下观察。
8G1单克隆抗体与293T细胞表达的CD2v-GFP蛋白结合的免疫荧光实验结果如图7所示：
结果显示：CD2v-GFP蛋白自带的绿荧光与8G1单克隆抗体与二抗结合所发出的红荧光有较好的共定位，表明8G1单克隆抗体均能识别293T表达的CD2v-GFP蛋白。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种可识别ASFV外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体及应用
<130> P220016
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<170> PatentIn version 3.5
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
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cgattcacca tctccagaga caatgccaag aacaccctgt acctgcaaat gagcagtctg 60
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tggggccaag gcaccactct cacagtctcc cca 33
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gaagtgctgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
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ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attactaatg gtggtagtta caactactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccattt attactgtgc aagaagtaac 300
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Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe
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Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe
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Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn
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Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr
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Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr
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Pro Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile
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Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn
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Trp Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn
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Asn Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr
180 185 190

Claims (10)

1.一种可识别ASFV外膜蛋白糖基化修饰的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含：分别如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3；以及分别如SEQ ID NO.10、11、12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括：分别如SEQID NO.4、5、6、7所示氨基酸序列的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4；以及分别如SEQID NO.13、14、15、16所示氨基酸序列的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区。
5.包含编码权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或其功能片段的核酸分子。
6.包含权利要求5中所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料包括表达载体或宿主细胞。
7.如权利要求6所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含与所述单克隆抗体的轻链或重链相连的信号肽；优选的，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9或18所示。
8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体。
9.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或权利要求5-6所述的生物材料在如下任一项中的用途：
(1)在制备检测糖基化或非糖基化CD2v蛋白的产品中的用途；
(2)在制备检测或诊断非洲猪瘟病毒的产品中的用途；
(3)在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的分离纯化或检测中的用途；
(4)在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒抗体的分离纯化或检测中的用途；
(5)在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒的药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述产品包括试剂、试纸条或试剂盒；优选的，所述试剂盒包括诊断非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒。
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