CN110133278A

CN110133278A - 一种用于检测人vegf蛋白表达水平的体外试剂盒

Info

Publication number: CN110133278A
Application number: CN201910268089.2A
Authority: CN
Inventors: 吕鹏辉
Original assignee: Zhejiang Zhongyi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Zhongyi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-04-03
Filing date: 2019-04-03
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2039-04-03
Also published as: CN110133278B

Abstract

本发明提供了一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒，本发明提供的试剂盒中的人源化单克隆抗体能够很好地、特异性与VEGF抗原结合，具有高效检测VEGF相关疾病的辅助诊断作用。

Description

一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒

技术领域

本发明涉及体外检测领域，特别地涉及一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒。

背景技术

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，又称血管通透因子(Vascular permeability factor，VPF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。

血管内皮生长因子家族有多种亚型，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PGF)，通常VEGF指VEGF-A。VEGF-A可促进新生血管形成和使血管通透性增加。

近日，研究表明血管内皮生长因子(VEGF)在调节正常及异常血管发生中具有关键作用(Ferrara等，Endocr.Rev.18:4-25(1997))，甚至VEGF序列单个等位基因的缺失会导致胚胎致死，表明VEGF在血管系统的发育和分化中具有不可代替的作用。一般肿瘤患者确诊时都到了中晚期，早期筛查并对可疑者或无症状患者及时诊断，可以提高肿瘤患者的生存率，延长生存时间。早发现和早治疗是肿瘤筛查的重要意义。VEGF在肿瘤细胞团向实体肿瘤转化过程中开始大量产生，此时多为肿瘤Tis期、T1期，是肿瘤筛查的最佳时期，并可通过现有的临床手段予以确诊。而其他肿瘤标记物多在肿瘤Ⅲ期、Ⅳ期产生，对早期筛查意义不大。

如此，需要开发在动物模型或患者的生物学样品中检测比现有ELISA更高的可测量水平的VEGF，和/或可以测量VEGF的不同同等型的诊断和预后测定法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒，将VEGF抗体包被板制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入样品，再加入HRP标记的酶标液，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在终止液作用下转化为黄色，颜色深浅与VEGF抗原含量成正相关，利用酶标仪测定450nm波长下OD，通过标曲计算VEGF含量。

进一步地，所述试剂盒包含新型人源化VEGF单抗。

进一步地，所述VEGF抗体包括：

包含SEQ ID NO:07的氨基酸序列的CDR-L1，和/或

包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的CDR-L2，和/或

包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的CDR-L3，和/或

包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H1，和/或

包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H2，和/或

包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3。

进一步地，所述抗体为单克隆抗体，

可选地，所述抗体为特异性结合人VEGF的抗体片段，

可选地，所述抗体为包含特异性结合人VEGF抗体片段的融合蛋白，

可选地，所述抗体为鼠源抗体，

可选地，所述抗体为人源化抗体，

可选地，所述抗体为鼠源单克隆抗体。

优选地，所述抗体为人源化单克隆抗体。

9.进一步地，所述抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:23所示或与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列；

可选地，所述抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:25所示或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列；

优选地，所述抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

进一步地，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。

进一步地，所述抗体的生产步骤包括：在培养基中和合适的培养条件下培养含有权利要求1-6所述抗体的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的抗体及其抗体片段。

进一步地，所述试剂盒还包括酶标包被板、标品、标品缓冲剂、酶标液、样品稀释液、TMB显色剂、洗涤液、终止液。

进一步地，所述检测试剂盒可以用于辅助诊断癌症及眼内疾病。

进一步地，所述癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。

本发明提供的试剂盒中的人源化单克隆抗体能够很好地、特异性与VEGF抗原结合，具有高效检测VEGF相关疾病的辅助诊断作用。

具体实施方式

定义

本发明术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体和抗体片段，只要它们表现出特定的抗原结合活性，本发明术语“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分，抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab'、双特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和/或由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗体的类别是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

本发明术语“IgG”是免疫球蛋白G(Immuno globulin G)的缩写。本发明术语“人源化”是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR对应于非人抗体的那些HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。

抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。

本发明术语“结合”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用。除非另有说明，本发明所述“结合力”是指结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示，亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量。

本发明术语“同一性”、“相似度”为比对序列并引入间隙以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。可以以本领域技术范围内的各种方式实现为了确定百分比氨基酸序列同一性的目的比对，包括但不限于使用公众可用的计算机软件如BLAST、ALIGN或Mega软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

研究表明VEGF是肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键因子。眼部液体中VEGF浓度与糖尿病性视网膜病和其它缺血相关视网膜病患者中的活跃的血管增殖的存在高度相关性(Aiello etc.，N.Engl.J.Med.331:1480-1487(1994))。日前已有很多研究表明循环VEGF水平与肿瘤负荷相具有强关联性，并提示了VEGF水平为潜在的预后标志物(Gasparini等，J.Natl.Cancer Inst.89:139(1997)；Kohn Cancer 80:2219(1997))。显然，准确测量VEGF对理解其在许多生物学过程(诸如血管疾病、肿瘤、眼内病症等)中的具有潜在的重要作用。

测量内源VEGF水平的能力依赖于灵敏且特异性测定法的可获得性。针对VEGF的基于比色法、化学发光、及荧光测定的酶联免疫吸附测定法(ELISA)已有报道。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：

获得高效价VEGF抗体，具体方法为：

步骤1、小鼠免疫：使用6至8周龄雌性BALB/c小鼠作为实验动物(购自上海灵畅生物科技有限公司)，VEGF-A抗原蛋白(购自广州瑞博奥生物科技有限公司)。

步骤2、将抗原蛋白溶于生理盐水，首次免疫使用50μg人与等体积完全福氏佐剂采用双推法混匀，按1ml/只注射量注射小鼠，腹部皮下多点注射。

步骤3、2周后进行加强免疫，加强免疫使用25μg人VEGF蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液，按0.5ml/只注射量注射小鼠腹腔，加强免疫3次.

步骤4、末次免疫三天后，取小鼠静脉血并分离血清，用ELISA法测定获得抗体的效价，选择抗体效价高的小鼠细胞，用上述小鼠制备单脾细胞悬液。

步骤5、购买骨髓瘤细胞(SP2/0)，培养所述骨髓瘤细胞至对数生长期，洗涤步骤4中获得的脾细胞制备免疫单脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与单脾细胞按1∶6的比例混合在一起。

步骤6、在离心管内用不完全培养液洗1次，转速1200rpm离心8分钟，弃上清，细胞沉淀均匀，38℃预热，加入1ml等温PEG-4000，待混合液出现颗粒状物质后，迅速向其中加入25ml等温不完全培养基终止PEG-4000反应，于30℃静置，之后加入2ml培养基，悬浮沉淀。

步骤7、混匀后补充培养基至离心管内的脾细胞浓度达到2×10⁷/mL，将悬浮液分装入96孔板后培养杂交瘤细胞，待杂交瘤细胞面积长至孔底面积一半以上，吸出悬浮液上清液供抗体检测。

实施例2：

用碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被人VEGF(购自广州瑞博奥生物科技有限公司)，包被量100μL每孔，缓冲液洗涤3次；用含1％BSA的缓冲液阻断并于室温孵育1小时，阻断量250μL/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入100μL上清液样品(A1-A85)以及阳性血清(对照，CK1-5)，室温孵育1小时，孵育完成后缓冲液洗涤3次，每孔加入100μL以比例1/10000稀释在含1％BSA缓冲液里的抗小鼠IgG抗体，所述抗小鼠IgG抗体被辣根过氧化物酶标记，室温孵育1小时，孵育完成后缓冲液洗涤3次，每孔加入100μL比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取OD450nm，根据OD450nm选取能够分泌人VEGF结合抗体的阳性克隆。

实施例3：

实施例2中，共获三个得具有强抗原结合活性的克隆GX-81,NX-06,XY-57，将筛选得到的同时具有强抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆进行核苷酸序列测定，简要地，提取细胞mRNA后合成cDNA第一链，将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆进行DNA测序。测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

经过PCR扩增得到抗体轻链可变区和抗体重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列：

其中GX-81轻链的三个互补决定区GX-81-CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:1；GX-81-CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、GX-81-CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区GX-81-CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、GX-81-CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、GX-81-CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

其中NX-06轻链的三个互补决定区NX-06-CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:7；NX-06-CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:8、NX-06-CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；重链的三个互补决定区NX-06-CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:10、NX-06-CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:11、NX-06-CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

其中XY-57轻链的三个互补决定区XY-57-CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:13；XY-57-CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:14、XY-57-CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；重链的三个互补决定区

XY-57-CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:16、XY-57-CDR-H2氨基酸序列如SEQ IDNO:17、XY-57-CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH、抗体重链恒定区序列序列鼠源IgVH，将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接获得LC全长序列；将抗体重链可变区和重链恒定区连接获得VC全长序列。

实施例4：

将实施例3获得的可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体BxB-634(载体骨架pEGFP-N1)中。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293F细胞系，载体骨架pEGFP-N1购自海吉满生物，293F细胞系购自上海斯信生物科技有限公司。接种细胞一天后进行转染，将待转染细胞离心收集并重悬于新鲜的表达培养基中，培养基内细胞密度为1×10⁶细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为54.79μg/mL，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为75μg/mL。将上述混合物放入细胞培养箱培养1小时(培养温度37℃)，补充新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清，检测并获得的鼠源抗人VEGF嵌合单抗(分别获得GX-81-Anti-VEGF,NX-06-Anti-VEGF,XY-57-Anti-VEGF)。

利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测GX-81-Anti-VEGF,NX-06-Anti-VEGF,XY-57-Anti-VEGF鼠源抗人VEGF嵌合单抗与VEGF抗原结合的动力学常数，具体地，分别将GX-81-Anti-VEGF,NX-06-Anti-VEGF,XY-57-Anti-VEGF溶于的醋酸钠缓冲溶液中并偶联到CM芯片上，之后用1M乙醇胺封闭。

结合阶段分别将不同浓度的GX-81-Anti-VEGF,NX-06-Anti-VEGF,XY-57-Anti-VEGF以25μL/min的速度注入5min，解离阶段用PBS缓冲溶液以25μL/min的速度注入10min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore3000软件进行分析计算。GX-81-Anti-VEGF,NX-06-Anti-VEGF,XY-57-Anti-VEGF的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表1所示。

表1.鼠源抗人VEGF嵌合单抗与其抗原结合的动力学常数

表1结果表明GX-81-Anti-VEGF、NX-06-Anti-VEGF均可以与VEGF抗原有效结合，XY-57-Anti-VEGF与VEGF结合作用不强，GX-81-Anti-VEGF与抗原结合速率更高，以下对GX-81-Anti-VEGF、NX-06-Anti-VEGF进行人源化改造。

实施例5：制备人源化VEGF抗体

人源化形式的抗人VEGF抗体参考Molecule Immunol的制备方法制备，选取与鼠源抗人VEGF嵌合单抗非CDR区匹配度最高的人源化模板(Germline数据库)，其中重链可变区的模板为人源IgVH4-11*03，轻链可变区的模板为人源IGKV1-43*02，将鼠源抗体CDR区替换上述人源化模板并的CDR区得到人源化抗体重链可变区和源化抗体轻链可变区.

H-GX-81-Anti-VEGF重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，H-GX-81-Anti-VEGF轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；H-NX-06-Anti-VEGF重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，H-NX-06-Anti-VEGF重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，研究序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表2所示。

表2.重链可变区氨基酸序列及轻链可变区氨基酸序列

序列名称	VH	VL
			H-GX-81-Anti-VEGF-1	SEQ ID NO:19	SEQ ID NO:20
H-GX-81-Anti-VEGF-2	SEQ ID NO:21	SEQ ID NO:22
			H-NX-06-Anti-VEGF-1	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:24
H-NX-06-Anti-VEGF-2	SEQ ID NO:25	SEQ ID NO:26

将人源化的抗人VEGF单抗的重链可变区(SEQ ID NO:19,21,23,25)与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:28)连接，分别得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人VEGF单抗的轻链可变区(SEQ ID NO:20,22,24,26)与人抗体IgG1轻链的恒定区(SEQ ID NO:27)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入BxB-634载体中。

检测人源化VEGF单抗与人VEGF抗原结合的动力学常数，检测方法同实施例4，将待检测人源化VEGF单抗分别溶于的醋酸钠缓冲溶液中并注入偶联到CM芯片上，之后用1M乙醇胺封闭。在结合阶段，将不同测试组的人源化VEGF单抗以25μL/min的速度注入3min，在解离阶段，用PBS缓冲溶液以25μL/min的速度注入10min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore 3000软件来进行分析计算，测试组编号如下：

CK 1	GX-81-Anti-VEGF
		CK 2	NX-06-Anti-VEGF
测试组1	H-GX-81-Anti-VEGF-1
		测试组2	H-GX-81-Anti-VEGF-2
测试组3	H-NX-06-Anti-VEGF-1
		测试组4	H-NX-06-Anti-VEGF-2

人源化VEGF单抗的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表3所示。

表3.人源化VEGF单抗与其抗原结合的动力学常数

由表3结果可见，四组人源化VEGF单抗与其抗原结合能力很强，其中以测试组H-GX-81-Anti-VEGF-2、H-NX-06-Anti-VEGF-1与抗原结合能力更为突出。

实施例6：

为了确定H-GX-81-Anti-VEGF-2、H-NX-06-Anti-VEGF-1单抗的热稳定性，将H-GX-81-Anti-VEGF-2、H-NX-06-Anti-VEGF-1样品置于40℃高温条件下，在第2周和第4周分别取样进行SE-HPLC检测以观察热稳定性，测试采用色谱法，流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液,0.1mol/L硫酸钠缓冲液,pH6.7；流速为0.6mL/min；色谱柱温度为27℃；样品池温度:4℃；检测波长280nm；用缓冲液稀释样品至2mg/mL上样，上样体积为20μL，用面积归一化法计算主峰比例处理数据，结果如表4所示，

表4.人源化VEGF单抗热稳定性测试结果

热稳定性测试表明2条氨基酸序列均显示出了很好且相当的稳定性。

实施例7：

上述2条氨基酸序列(H-GX-81-Anti-VEGF-2，H-NX-06-Anti-VEGF-1)均可分别用于制备检测试剂盒，具体方法为，将抗体包被板制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入样品，再加入HRP标记的酶标液，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在终止液作用下转化为黄色，颜色深浅与VEGF含量成正相关，利用酶标仪测定450nm波长下OD，通过标曲计算VEGF含量，本试剂盒采用新型人源化VEGF单抗，与人VEGF结合能力更强，结合速率更高，可用于快速、准确的VEGF含量检测，为辅助诊断VEGF相关疾病提供更灵敏、准确的数据，试剂盒具体地包括下表所述成分，详见表5。

表5.人VEGF高灵敏检测试剂盒

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 浙江众意生物科技有限公司

<120> 一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> GX-81-CDR-L1

<400> 1

Ile Gln Met Pro Ala Leu Gly Gly Tyr Ile Asn Ala Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> GX-81-CDR-L2

<400> 2

Pro Tyr Thr Asp His Trp Ile His

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> GX-81-CDR-L3

<400> 3

Asp Cys Glu His Val Tyr Cys Asn Leu

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> GX-81-CDR-H1

<400> 4

His Pro Pro Gly Gly Cys Gln Asn Asp Ile Leu

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> GX-81-CDR-H2

<400> 5

Asp Arg Asp Tyr Ser Cys Trp

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> GX-81-CDR-H3

<400> 6

Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<221> UNSURE

<223> NX-06-CDR-L1

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Ile Gln Met Pro Ala Leu Gly Gly Tyr Ile Asn

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<221> UNSURE

<223> NX-06-CDR-L2

<400> 8

Tyr Thr Asp His Trp Ile His

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<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> NX-06-CDR-L3

<400> 9

Gly Arg Pro Asn Asp Cys Glu His

1 5

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> NX-06-CDR-H1

<400> 10

Pro Met Cys Lys His Ser Pro Asp Cys Tyr Arg Trp Glu

1 5 10

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> NX-06-CDR-H2

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Gln Ile Asn Glu Glu Phe Phe Leu

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> NX-06-CDR-H3

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His Ser Pro Asp Val Phe Gly Asp Cys Tyr Arg

1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> XY-57-CDR-L1

<400> 13

Glu Leu Trp His Leu Lys Gly Gln Ala Cys Phe

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> XY-57-CDR-L2

<400> 14

Gly Arg Arg Lys Pro

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

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<400> 15

His Lys Ala Met Trp His Pro His Trp

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

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Ile Ala Gly Pro Tyr Glu Asp Asp Asp Ile Arg

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<210> 17

<211> 6

<212> PRT

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<220>

<221> UNSURE

<223> XY-57-CDR-H2

<400> 17

Trp Gly Lys Thr Ser Ser

1 5

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> XY-57-CDR-H3

<400> 18

Val Lys Val Leu Thr Asp Gly Ile Pro Pro Thr Glu

1 5 10

<210> 19

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> H-GX-81-Anti-VEGF-1 VH

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly His

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Ile Ser Cys Met Tyr Glu His Pro Pro Gly Gly

20 25 30

Cys Gln Asn Asp Ile Leu Val Pro Lys Gly Ser Phe Pro Thr Thr Asp

35 40 45

Gln Gly Ser Arg Ile Ala Lys Asp Arg Asp Tyr Ser Cys Trp Arg Pro

50 55 60

Glu Phe Phe Gly Leu His Thr Phe Thr Gly Trp Asn Val Glu Gly Asp

65 70 75 80

Trp Trp His Ala Ile Tyr Asn Pro Ala Lys Gln Gln Phe Asn Trp Phe

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Phe Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> H-GX-81-Anti-VEGF-1 VL

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Asp Leu Thr Ala His

1 5 10 15

Met Gly Phe Cys Ser Gln Ile Lys Tyr Ile Gln Met Pro Ala Leu Gly

20 25 30

Gly Tyr Ile Asn Ala Pro Arg Ala Pro Glu Gly Glu Leu Met Ile Ser

35 40 45

Lys Asn Val Ala Trp Cys Phe Pro Tyr Thr Asp His Trp Ile His Phe

50 55 60

Arg Gly Val Ile Asp Leu Thr Tyr Lys Pro Met Leu Met Ala Glu Arg

65 70 75 80

Met Val Thr Gly Arg Pro Asn Asp Cys Glu His Val Tyr Cys Asn Leu

85 90 95

Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> H-GX-81-Anti-VEGF-2 VH

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Ile Ser Cys Met Tyr Glu His Pro Pro Gly Gly

20 25 30

Cys Gln Asn Asp Ile Leu Val Pro Lys Gly Ser Phe Pro Thr Thr Asp

35 40 45

Gln Gly Ser Arg Ile Ala Lys Asp Arg Asp Tyr Ser Cys Trp Arg Pro

50 55 60

Glu Phe Phe Gly Leu His Thr Phe Thr Gly Trp Asn Val Glu Gly Asp

65 70 75 80

Trp Trp His Ala Ile Tyr Met Leu Ala Lys Trp Gln Phe Asn Trp Phe

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> H-GX-81-Anti-VEGF-2 VL

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Asp Gly Pro Ser Ser Leu Asp Leu Thr Ala His

1 5 10 15

Met Gly Phe Cys Ser Gln Ile Lys Tyr Ile Gln Met Pro Ala Leu Gly

20 25 30

Gly Tyr Ile Asn Ala Pro Arg Ala Pro Glu Gly Glu Leu Cys Ile Ser

35 40 45

Lys Asn Val Ala Trp Cys Phe Pro Tyr Thr Asp His Trp Ile His Phe

50 55 60

Arg Gly Val Ile Asp Leu Leu Tyr Lys Pro Met Leu Met Ala Glu Arg

65 70 75 80

Met Asp Thr Gly Arg Pro Asn Asp Cys Glu His Val Tyr Cys Asn Leu

85 90 95

Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg

100 105

<210> 23

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> H-NX-06-Anti-VEGF-1 VH

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Pro Gly Asn Met Glu Arg Thr Gln

1 5 10 15

Ser Lys Pro Asn Thr Met Glu Ile Asn Val Met Gln Pro Met Cys Lys

20 25 30

His Ser Pro Asp Cys Tyr Arg Trp Glu Met Val Glu Lys Lys Arg Tyr

35 40 45

Asn Trp Pro Asp Asn Ala Glu Gly Arg Leu Leu Tyr His Gln Ile Asn

50 55 60

Glu Glu Phe Phe Leu Asp Trp Leu Pro Trp Tyr Asn Glu Phe Trp Trp

65 70 75 80

Lys Lys Asn Arg His Cys Ser Ser Val Met Phe Ala Lys Tyr Pro His

85 90 95

Tyr Tyr Gly His Ser Pro Asp Val Phe Gly Asp Cys Tyr Arg Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Tyr Val Glu Ile Arg

115 120

<210> 24

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> H-NX-06-Anti-VEGF-1 VL

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Asp Gly Pro Ser Ser Leu Asp Leu Thr Ala His

1 5 10 15

Met Gly Phe Cys Ser Gln Ile Lys Tyr Ile Gln Met Pro Ala Leu Gly

20 25 30

Gly Tyr Ile Asn Ala Pro Arg Ala Pro Glu Gly Glu Leu Cys Ile Ser

35 40 45

Lys Asn Val Ala Trp Cys Phe Tyr Thr Asp His Trp Ile His Arg Gly

50 55 60

Val Ile Asp Leu Leu Tyr Lys Pro Met Leu Met Ala Glu Arg Met Asp

65 70 75 80

Thr Gly Arg Pro Asn Asp Cys Glu His Val Tyr Cys Asn Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

100

<210> 25

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> H-NX-06-Anti-VEGF-2 VH

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Pro Gly Asn Met Glu Arg Thr Gln

1 5 10 15

Ser Lys Pro Asn Thr Met Glu Ile Asn Val Met Gln Pro Met Cys Lys

20 25 30

His Ser Pro Asp Cys Tyr Arg Trp Glu Met Val Glu Lys Lys Arg Tyr

35 40 45

Asn Trp Pro Asp Asn Ala Glu Gly Arg Leu Leu Tyr His Gln Ile Asn

50 55 60

Glu Glu Phe Phe Leu Asp Trp Leu Pro Trp Tyr Asn Glu Phe Trp Trp

65 70 75 80

Lys Lys Asn Arg His Cys Ser Ser Val Met Phe Ala Lys Tyr Pro His

85 90 95

Tyr Tyr Gly His Ser Pro Asp Val Phe Gly Asp Cys Tyr Arg Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Tyr Val Glu Ile Arg

115 120

<210> 26

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> H-NX-06-Anti-VEGF-2 VL

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Asp Gly Pro Ser Ser Leu Asp Leu Thr Ala His

1 5 10 15

Met Gly Phe Cys Ser Gln Ile Lys Tyr Ile Gln Met Pro Ala Leu Gly

20 25 30

Gly Tyr Ile Asn Ala Pro Arg Ala Pro Glu Gly Glu Leu Cys Ile Ser

35 40 45

Lys Asn Val Ala Trp Cys Phe Tyr Thr Asp His Trp Ile His Arg Gly

50 55 60

Val Ile Asp Leu Leu Tyr Lys Pro Met Leu Met Ala Glu Arg Met Asp

65 70 75 80

Thr Gly Arg Pro Asn Asp Cys Glu His Val Tyr Cys Asn Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

100

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 28

<211> 329

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

35 40 45

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

50 55 60

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

Claims

1.一种用于检测人VEGF蛋白表达水平的体外试剂盒，其特征在于，将VEGF抗体包被板制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入样品，再加入HRP标记的酶标液，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在终止液作用下转化为黄色，颜色深浅与VEGF抗原含量成正相关，利用酶标仪测定450nm波长下OD，通过标曲计算VEGF含量，所述检测试剂盒包含新型人源化VEGF单抗，所述VEGF抗体包括：

包含SEQ ID NO:07的氨基酸序列的CDR-L1，和/或

包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的CDR-L2，和/或

包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的CDR-L3，和/或

包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H1，和/或

包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H2，和/或

包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体，

可选地，所述抗体为特异性结合人VEGF的抗体片段，

可选地，所述抗体为鼠源抗体，

可选地，所述抗体为人源化抗体，

可选地，所述抗体为鼠源单克隆抗体。

优选地，所述抗体为人源化单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:23所示或与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列；

可选地，所述抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:25所示或与SEQID NO:26的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列；

4.根据权利要求1-5所述任一试剂盒，其特征在于，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-6所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体的生产步骤包括：在培养基中和合适的培养条件下培养含有权利要求1-6所述抗体的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的抗体及其抗体片段。

6.根据权利要求1-5所述任一试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标包被板、标品、标品缓冲剂、酶标液、样品稀释液、TMB显色剂、洗涤液、终止液。

7.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒可以用于辅助诊断癌症及眼内疾病。

8.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。