CN111748037B - 一种抗ErbB2抗体及其在治疗乳腺癌中的应用 - Google Patents

一种抗ErbB2抗体及其在治疗乳腺癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种特异性结合ErbB2的抗体，所述抗体能够以更高的亲和力结合ErbB2蛋白，并且具有抑制ErbB2高表达的SK‑BR3乳腺癌细胞增殖同时能够抑制调蛋白β诱导的ErbB2低表达的MCF‑7乳腺癌细胞增殖等生物学活性。

Description

一种抗ErbB2抗体及其在治疗乳腺癌中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的涉及抗ErbB2抗体及其在治疗多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤中的应用。
背景技术
近年全球临床癌症的发病率中，乳腺癌居于女性恶性肿瘤发病率首位，在全球癌症发病率中也仅次于肺癌，显然乳腺癌是危害女性健康的第一大恶性肿瘤，而外科手术是治疗乳腺癌的主要手段，化疗与放疗为公认的辅助治疗方法。但近年来，随着靶向治疗与抗肿瘤方法的研究不断深入，分子病理和基因分型的发展，针对乳腺癌的单抗药物得到迅速发展。其中曲妥珠单抗((商品名赫赛汀，Herceptin)是第一个用于治疗ErbB2阳性转移性乳腺癌的抗体药物。
ErbB2，表皮生长因子受体2(又名Neu、HER2、CD340或p185)，属于表皮生长因子受体(EGFR/ErbB)家族，主要定位在细胞膜上，少量表达在细胞质中。其膜外区包括I、II、III、IV四个结构域，膜内区的多个环状结构使其具有酪氨酸激酶活性。ErbB2的活化形式有两种：一种是配体非依赖的同源二聚体，另一种是配体依赖的异源二聚体，从而激活以P13K-PKB/Akt、MAPK途径为主的下游相关通路，从而对细胞的增殖、分化、迁移、粘附、转化、存活产生多效应影响，其中异源二聚体产生的信号更强，是二聚体中最重要的信号转导途径。临床研究表明，25％-30％乳腺癌患者的癌组织中有ErbB2基因的过度表达，此类ErbB2过表达的乳腺癌生长速度快、侵袭性强，易发生早期转移。对放、化疗不敏感，易复发。故无病生存期短，预后差。而ErbB2抗体可以通过作用于肿瘤表面的ErbB2，阻止其同/异源二聚化，进而阻断P13K/AKT及MAPK信号通路和/或能显著下调ErbB2的表达，逆转细胞的恶性表型；并通过招募表达IgG Fc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)以杀伤肿瘤细胞，从而达到抑制增殖，抗存活的效果。
虽然目前已有曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等ErbB2抗体应用于临床治疗乳腺癌，但是这些抗体的生物学活性有待进一步提高。
发明内容
基于上述发现，本发明的首要目的在于提供一种新的、亲和力较高且ErbB2抗体。
本发明提供以下技术方案：
一种人源化抗ErbB2抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区序列为SEQ ID NO:5。
本发明所述ErbB2抗体重轻链可变区各有3个互补决定区(CDR)。所述ErbB2抗体的重链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；轻链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8。
本发明所述ErbB2抗体的重链和轻链进一步包含恒定区，所述抗体轻链恒定区包含人源κ、λ链序列,进一步优选为κ链。所述抗体重链恒定区包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM，进一步优选为IgG1。
在一些实施方案中，所述ErbB2抗体能够以高亲和力结合ErbB2，使用Biacore分析，抗ErbB2抗体以2.13nM或更小的KD结合ErbB2。
在一些实施方案中，所述ErbB2抗体能够抑制ErbB2高表达的SK-BR3乳腺癌细胞增殖。
在一些实施方案中，所述ErbB2抗体能够抑制调蛋白β诱导的ErbB2低表达的MCF-7乳腺癌细胞增殖。
本发明提供一种治疗乳腺癌的方法，其特征在于：使用本发明所述的抗ErbB2抗体且乳腺癌患者为ErbB2阳性。
本发明所述的ErbB2抗体可应用于制备治疗和/或预防乳腺癌的药物中，所述乳腺癌患者为ErbB2阳性
本文所用术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(抗原结合部分)或其单链同源物。“抗体”包含至少一条重(H)链和一条轻(L)链。每条重链均由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2以及CH3组成。每条轻链均由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区、其中夹杂着称为框架区(FR)或连接(J)区(分别存重链和轻链中的JH或JL)的更加保守的区域。
本文所用术语“单克隆抗体”指从许多基本上同源的抗体群中获得的抗体，即除了可能以少量存在的自然产牛的突变外，包含该抗体群的单独抗体是相同的。
本文所用术语“多克降抗体”指具有异质抗体群的抗体组合物。多克降抗体通常源自经免疫动物或源白选定人的收集的血清。
本文所用术语“CDR区”或“互补决定区”，是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。CDR区序列可以由Kabat、Chothia方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的CDR，包括但不限于Kabat定义、Chothia定义中的任一者来定义。具体地，本发明提供的CDR序列根据Kabat定义。
本文所用术语“人源化抗体”通常是指一种嵌合抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。例如，可以使用CDR移植及其变体；包括“重塑”、“高度加成”、“贴面”、表面重建等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
本文所用术语“KD”堤指特定抗体一抗原相互作用的解离平衡常数或抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，根据本发明的抗体以100nM或更优亲和力(KD)结合抗原，如使用表面等离子体共振测定、细胞结合测定或平衡透析测定测量的。在具体的实施方案中，抗体以2.13nM或更优亲和力结合ErbB2，如通过表面等离子体共振测定或细胞细胞结合测定测量的。在其它实施方案中，当使用重组ErbB2作为分析物以及使用抗体作为配体，在BIACORE3000仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术进行测定时，抗体以约小于10-7M，如约小于10-8M、10-9M或甚平更低的亲和力结合抗原ErbB2。
有益效果
本发明的有益效果主要体现在：所述抗体能够以更高的亲和力结合ErbB2蛋白，抑制ErbB2高表达的SK-BR3乳腺癌细胞增殖同时能够抑制调蛋白β诱导的ErbB2低表达的MCF-7乳腺癌细胞增殖。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1小鼠抗体亚型鉴定
图2抗ErbB2抗体Hu3-7B4抑制SK-BR3细胞增殖
图3抗ErbB2抗体Hu3-7B4抑制调蛋白β诱导的MCF-7细胞增殖
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.抗ErbB2抗体制备及纯化
使用重组人ErbB2胞外结构域(ErbB2-ECD)蛋白作为免疫原，选取与SP2/0同源的Balb/c健康雌性小鼠作为免疫动物。将免疫抗原溶于PBS，与等体积的弗氏佐剂混合均匀，形成油包水乳剂。初次免疫采用皮下多点免疫，免疫剂量为100μg/只。初次免疫7-10天后，使用不完全弗氏佐剂与免疫抗原等体积混合乳化，以同样的途径和剂量免疫小鼠。之后每隔7-10天加强免疫数次，使小鼠血清的抗体效价达一万以上。在最后一次加强免疫一周之后进行眼球取血，ELISA测定血清效价。若小鼠血清效价未达到一万，必须继续加强免疫数次。效价达一万以上的小鼠，融合前三天进行冲击免疫，取不加佐剂抗原，尾静脉注射。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，采用PEG法将其与骨髓瘤SP2/0细胞株融合，SP2/0细胞与脾细胞的数量比常为1:3～1:5。将融合后的细胞加HAT铺板，按100μl/孔将细胞悬液加到若干块96孔细胞培养板中，保证每孔细胞量约为4×104个细胞/孔，置于37℃细胞培养箱中培养。融合第四天，添加HAT培养基继续培养。在细胞融合12天左右，吸取培养上清，采用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。利用有限稀释法筛选单克隆化阳性杂交瘤细胞株，同时将阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，冻存保种。将最终筛选出的阳性杂交瘤细胞株命名为3-7B4。
实施例2.小鼠抗ErbB2抗体亚型鉴定
采用ELISA法鉴定实施例1得到的抗ErbB2单克隆抗体的亚型(试剂盒购自Proteintech)。试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例2中纯化的抗NSE抗体样品E1-7E2、E2-4F6分别加入样品孔中，每孔50μl，无需孵育。将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，每孔50μl，轻轻混匀后，孵育1h。扣去孔中液体加入1XPBST洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。加入显色液，每孔100μl，室温避光显色15min。加入100μl终止液，终止显色反应。通过酶标仪检测450nm处的OD值，结果如图1所示，我们得到的抗ErbB2单克隆抗体3-7B4的重链亚型均为IgG1，轻链均为Kappa。
实施例3.抗体人源化
将实施例1中获得的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，取适量细胞用TRNzol-A+裂解后，每1ml TRNzol-A+加入200μl氯仿，漩涡振荡15秒，放置3分钟。13000rpm，4℃离心10分钟，细胞溶液分为三层：上层无色水相、中层和下层黄色有机相，将溶有RNA的水相转移至离心管中，向水相中加入等体积异丙醇，混匀，室温静置25分钟。13000rpm，4℃离心10分钟，弃去废液得到沉于底部的RNA沉淀。用75％乙醇洗涤RNA沉淀两次后，用DEPC水溶解RNA。随后用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TRANS，AT311-02)反转录试剂盒合成cDNA第一条链。根据实施例2中小鼠抗体亚型的鉴定结果设计特异性引物(5’端含有用于与真核表达载体发生同源重组的同源臂序列)，以cDNA为模板进行抗体可变区基因的PCR扩增，从而分别获得小鼠抗体轻链与重链可变区的基因片段。抗体的人源化改造，首先利用目前有效的公共数据库(即NCBI的Blast for IgG以及MRC的V-base),将该抗体的VH结构域和VK结构域的氨基酸序列与所有已知的人种系VH结构域和VK结构域的氨基酸序列进行比对。通过观察构架区内氨基酸的比对结果，确定了高度同源的人种系VH结构域和VK结构域。在此框架结构的基础上，应用计算机模型分析鼠抗ErbB2抗体3-7B4的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠抗体对应框架氨基酸残基。用反复的方法转换或突变小鼠构架，使之与相对应的人种系构架相匹配。将合成VH结构域和VK结构域克隆至特化的哺乳动物表达载体中，该表达载体使相应的结构域能够在完整的人IgG1或κ抗体骨架中表达。将ⅠgG1构建体与κ构建体共转染至293F细胞中，进行人源化抗体的小批量制备。将瞬时转染的上清液通过蛋白A或G树脂，获得纯化的ErbB2抗体。最终，将人源化改造后的抗体命名为Hu3-7B4，且抗体Hu3-7B4的VH链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，VL链氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；其中重链高变区VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；轻链高变区VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
实施例4.人源化抗体的亲和力测定
将人Fc抗体捕获抗体(AHC)通过氨基偶联的方式包被在CM5芯片表面，参照氨基偶联试剂盒和人抗捕获试剂盒说明书，准备芯片活化缓冲液EDC/NHS、AHC和封闭用的乙醇胺，选择Biacore3000系统中的包被程序，将AHC氨基偶联在CM5芯片表面。将实施例2中获得的人源化ErbB2抗体Hu3-7B4抗体捕获于芯片表面。用HBS-EP+缓冲液将抗体稀释至2μg/mL，设置流速为10μL/min，包被至响应值达300RU。ErbB2-ECD抗原设置7个不同浓度梯度，用HBS-EP缓冲液依次进行2倍梯度稀释，浓度从200nM到3.125nM。设置ErbB2-ECD抗原的流速为50μL/min，结合时间为3min。设置HBS-EP+缓冲液流速为50μL/min，解离时间为10min。使用3MMgCl2作为再生缓冲液，按照再生程序对芯片进行再生。以抗人HER2/ErbB2的人源化抗休Herceptin为阳性对照(其序列参照PDB:1N8Z),按照相同的步骤对照抗体进行亲和力测定。结果如表一所示：本发明的抗体亲和力明显优于对照抗体Herceptin。
表一
抗体 Kon(1/Ms) Kdis(1/s) K<sub>D</sub>(nM)
Hu3-7B4 1.16x10<sup>5</sup> 2.47x10<sup>-5</sup> 2.13
Herceptin 2.16x10<sup>5</sup> 9.72x10<sup>-5</sup> 4.50
实施例5.抗ErbB2抗体Hu3-7B4抑制SK-BR3细胞增殖
利用MTT实验测定实施例2中获得的抗ErbB2抗体Hu3-7B4对SK-BR3细胞增殖的影响。将状态良好、处于对数生长期的ErbB2高表达的乳腺癌细胞株SK-BR3消化后，按每孔4000～6000个细胞分别接种于96孔板，次日加入浓度梯度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的抗ErbB2单抗Hu3-7B4、阳性对照Herceptin或阴性对照IgG1，每孔l00μl，每个浓度设3个重复孔。同时设置空白对照孔，即加不含抗体的完全培养基。37℃孵育，期间每隔24h于倒置显微镜观察不同浓度处理条件下的细胞状态。5％CO2，37℃孵育72h后，每孔加入100μl MTT溶液(5mg/mL)，4h后终止培养，小心吸取孔内培养液。每孔中加入100μl二甲基亚砜，至摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪570nm检测各孔的吸光度值。结果如图2所示，抗ErbB2抗体Hu3-7B4、Herceptin对ErbB2高表达的乳腺癌细胞株SK-BR3均有明显的生长抑制作用，表明Hu3-7B4能够抑制乳腺癌细胞生长且生物活性不弱于阳性对照Herceptin。
实施例6抗ErbB2抗体Hu3-7B4抑制调蛋白β诱导的MCF-7细胞增殖
利用MTT实验测定实施例2中获得的抗ErbB2抗体Hu3-7B4对调蛋白β诱导的MCF-7细胞增殖的影响。将状态良好、处于对数生长期的ErbB2低水平表达的乳腺癌细胞株MCF-7消化后，按每孔4000～6000个细胞分别接种于96孔板，次日每孔中加入50μl 2nM的调蛋白β，再向实验孔中分别加入浓度梯度为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的抗ErbB2单抗Hu3-7B4、阳性对照Herceptin或阴性对照IgG1，每孔l00μl，每个浓度设3个重复孔。同时设置空白对照孔，即加不含抗体的完全培养基。37℃孵育，期间每隔24h于倒置显微镜观察不同浓度处理条件下的细胞状态。5％CO2，37℃孵育72h后，每孔加入100μl MTT溶液(5mg/mL)，4h后终止培养，小心吸取孔内培养液。每孔中加入100μl二甲基亚砜，至摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪570nm检测各孔的吸光度值。结果如图3所示，抗ErbB2抗体Hu3-7B4对调蛋白β诱导的ErbB2低水平表达的乳腺癌细胞株MCF-7有明显的生长抑制作用，而Herceptin对MCF-7乳腺癌细胞株无明显的生长抑制作用。表明Hu3-7B4对调蛋白β诱导的MCF-7细胞生长有明显的抑制作用且生物活性明显优于阳性对照Herceptin。
序列表
<110> 北京岳昊科技发展有限公司
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1 5

Claims (6)

1.一种抗ErbB2抗体或其抗原结合片段，由重链和轻链组成，其特征在于：所述抗体其重链包含如SEQ ID NO:2所示的VH-CDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的VH-CDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:4所示的VH-CDR3氨基酸序列；轻链包含如SEQ ID NO:6所示的VL-CDR1氨基酸序列、如SEQ ID NO:7所示的VL-CDR2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:8所示的VL-CDR3氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗ErbB2抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述重链包含如SEQ ID No:1所示的重链可变区；所述轻链包含如SEQ ID No:5所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1-2任一项所述的抗ErbB2抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体还包含选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和包含选自kappa或Lambda亚型的轻链恒定区。
4.原核或真核细胞系中复制的表达载体，其特征在于：其编码权利要求1-2任一项所示的抗体。
5.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求 1-2任一项所述的抗体和其药学可接受载体。
6.权利要求1-2任一项的抗ErbB2抗体在制备用于治疗ErbB2阳性乳腺癌的药物中的用途。
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