CN111995682B

CN111995682B - 抗人SIRPα单克隆抗体及其用途

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Publication number: CN111995682B
Application number: CN202010849001.9A
Authority: CN
Inventors: 陈明久
Original assignee: Boaoxin Biotechnology Nanjing Co ltd
Current assignee: Boaoxin Biotechnology Nanjing Co ltd
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: CN111995682A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗人SIRPα单克隆抗体及其用途，同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法。还提供了包括本发明抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体、药物组合物以及诊断和治疗方法。本发明能特异识别人SIRPα的单克隆抗体，该抗体与人SIRPα结合的亲和力强于现有抗人SIRPα单克隆抗体，序列新颖。

Description

抗人SIRPα单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及了一种高亲和力且具有功能性的抗人SIRPα的单克隆抗体或抗体片段。本发明同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法。还提供了包括本发明抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体、药物组合物以及诊断和治疗方法。

背景技术

信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα)，亦被称为SHPS-1或是SIRPα，是SIRP家族中一个典型的抑制性免疫受体，主要表达于髓系细胞如巨噬细胞、树突状细胞，以及神经细胞膜表面，而在体内的其他细胞则表达较少(Kharitonenkov,A.et al.(1997)."Afamily of proteins that inhibit signaling through tyrosine kinase receptors".Nature.386,181-6)。作为一种跨膜蛋白，其在胞外区总共存在三个免疫球蛋白样结构域，其氨基末酸的结构域可以与CD47相互作用介导信号转导；SIRPα的胞质尾区同激酶类以及衔接蛋白还存在着相当紧密的联系；而其细胞内结构域具有典型的免疫受体酪氨酸抑制性基序，可以被磷酸化，从而发生积聚反应，被与其自身相连的细胞溶质性蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2所激活。通过近端底物的去磷酸化，SHP-1和SHP-2可以调整细胞内的信号通路以及它们下游效应器的功效(Mi,Z.P.et al.(2000)."Expression of a synapse-associated membrane protein,P84/SHPS-1,and its ligand,IAP/CD47,in mouseretina".J.Comp.Neurol.416,335-344；Ohnishi,H.et al.(1999)."Tyrosinephosphorylation and association of BIT with SHP-2induced by neurotrophins".J.Neurochem.72,1402-1408；van den Berg,T.K.et al.(2005)."A Nomenclature forSignal Regulatory Protein Family Members".J.Immunol.175,7788-7789)。

CD47，也称为整联蛋白相关蛋白(IAP)，属于免疫球蛋白超家族的膜蛋白，在各种肿瘤细胞膜上高度表达，具有单个免疫球蛋白样胞外域和五个跨膜区域。CD47是SIRPα的天然配体，CD47-SIRPα信号通路在多种生理机制中发挥作用。其中，以在体内巨噬细胞吞噬过程中发挥的作用为最有特征性的。当巨噬细胞表面的SIRPα在与肿瘤细胞表面的CD47分子结合后，会介导“Don’t eat me”的信号，使肿瘤细胞免于巨噬细胞的吞噬，发生免疫逃逸，进而导致肿瘤进展。在一项研究中，实验人员设计了SIRPα的高亲和力变体，该变体拮抗癌细胞上的CD47并引起癌细胞的吞噬作用增加(Weiskopf K.et al.(2013)."EngineeredSIRPαvariants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies".Science.341(6141):88–91)。另一项研究(在小鼠中)发现抗SIRPα抗体单独或与其他癌症治疗协同作用可帮助巨噬细胞功能并减少癌症的生长和转移(Potential new cancertreatment activates cancer-engulfing cells.Feb 2017；Yanagita T.(2017)."Anti-SIRPαantibodies as a potential new tool for cancer immunotherapy".JCIInsight.2(1):e89140)。

关于使用抗SIRPα抗体的抗癌单一疗法或联合疗法进行的研究很少。关于抗SIRPα抗体的大部分工作是有关CD47-SIRPα相互作用的机制研究，并且已使用鼠抗SIRPα抗体进行；例如，鼠12C4和1.23A提高嗜中性粒细胞介导的曲妥珠单抗(trastuzumab)调理的SKBR3细胞的ADCC(Zhao.et al.(2011)."CD47-signal regulatory protein-α(SIRPα)interactions form a barrier for antibody-mediated tumor cell destruction".PNAS.108(45),18342-18347)。WO2015/138600公开了提高西妥昔单抗(cetuximab)的体外吞噬的鼠抗人SIRPα抗体KWAR23及其嵌合Fab片段。WO2018/026600中公开了具有包含N297A突变的人IgG1 Fc部分的人源化KWAR23。WO2013/056352公开了IgG₄ 29AM4-5和其他IgG₄人抗SIRPα抗体。IgG₄ 29AM4-5以8mg/kg每周给药三次，持续四周，降低了注射到NOD严重联合免疫缺陷病(scid)γ(NSG)小鼠右股骨中的原发性人AML细胞的白血病移植(engraftment)。本领域已知的抗SIRPα抗体不适合针对SIRPα的单一疗法或联合疗法，因为它们对人SIRPα不是特异性的，或者它们过于特异性。现有抗体KWAR23，SE5A5，29AM4-5和12C4不是特异性的，因为它们也结合人SIRPγ。与T细胞上表达的SIRPγ结合可能会对T细胞增殖和募集产生负面影响。其他抗SIRPα抗体的特异性也比较有限。

尽管靶向SIRPα的抗体药已被开发和获批，但针对SIRPα靶点开发更高亲和力和其它药理特性的单抗还是十分必要和具有重要医疗价值的。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种抗人SIRPα单克隆抗体及其用途，该抗体具有高亲和力和功能性，其优于现有的抗人SIRPα单克隆抗体。

为了达到上述目的，本发明提供一种抗人SIRPα单克隆抗体，其特征在于，该抗体包含：重链和轻链；

所述的重链和轻链均包括可变区，该可变区包括互补决定区；

所述重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3表示；

所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3表示；

所述的CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示；

所述的CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示；

所述的CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示；

所述的CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示；

所述的CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示；

所述的CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。

重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码所述的抗人SIRPα单克隆抗体；

该核苷酸分子的序列选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；

序列SEQ ID NO：9编码所述的抗体的重链可变区；

序列SEQ ID NO：10编码所述的抗体的第一轻链可变区。

一种表达载体，该表达载体含有所述的核苷酸分子。

一种宿主细胞，该宿主细胞含有所述的表达载体。

一种抗人SIRPα单克隆抗体的制备方法，该制备方法包含如下步骤：

步骤1：制备含有表达所述的抗SIRPα单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；

步骤2：用步骤1的表达载体转染真核宿主细胞；

步骤3：培养步骤2转染的真核宿主细胞；

步骤4：分离纯化，获得所述的抗体。

本发明还涉及包括前述的抗人SIRPα单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

所述的重链和轻链都还包括恒定区，该恒定区为鼠IgG的恒定区，优选地为IgG1的恒定区。

重链恒定区如SEQ ID NO：11所示；轻链恒定区如SEQ ID NO：12所示。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明能特异识别人SIRPα的单克隆抗体，该抗体与人SIRPα结合的亲和力强于现有抗人SIRPα单克隆抗体，序列新颖。

附图说明

图1为捕获ELISA测定抗体对人SIRPα蛋白的结合能力；

图2为间接ELISA测定抗体对人SIRPα蛋白的结合能力；

图3为间接ELISA测定抗体对人SIRPβ蛋白的交叉反应；

图4为参照抗体阻断ELISA；

图5为流式细胞术测评抗体阻断人SIRPα蛋白与细胞膜表面人CD47蛋白的结合；

图6为BIACORE表面等离子体共振法测定小鼠抗SIRPα单克隆抗体亲和力。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

一、抗体的获得：

实施例1通过融合杂交瘤技术获得特异性抗SIRPα的小鼠单克隆抗体

1.1动物免疫

根据文献中(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)通用的方法免疫小鼠。免疫原为C端含有人IgG1 Fc标签的重组人SIRPα(氨基酸Met 1-Arg 370)蛋白(公司自产，所用质粒为CD172-ECD-Fc；载体为pCP；插入氨基酸序列为MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNER)。使用重组人SIRPα带his标签的蛋白(公司自产，所用质粒为SRPA-ECD-His；载体为pCMV-C-His；在EcoR I和Xba I之间插入氨基酸序列为

MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVLVAAGETATL

RCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIR

IGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARA

TPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTA

KVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAE

NQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWL

LVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNER)作为测定血清效价和杂交瘤筛选的检测抗原。简要地，取出适量的福氏佐剂到1.5ml EP管中，振荡器混匀。用PBS配制人SIRPα-Fc抗原蛋白溶液。按照需要量混匀佐剂和蛋白抗原溶液，通过注射器互推充分乳化抗原形成稳定油包水的溶液，而后进行动物注射。根据血清效价测定结果，首次免疫后通常需要进行2到3次加强免疫后才能达到良好的免疫效果。选择血清效价高的免疫小鼠进行腹腔注射，终免后进行细胞融合。

1.2杂交瘤融合和筛选

细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14,ATCC#CRL-1581)处于对数生长期。处死免疫小鼠于无菌环境取脾，根据文献中方法使用PEG化学融合脾B细胞和SP2/0骨髓瘤细胞(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)；Kohler G,and Milstein C,"Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefinedspecificity,"Nature,256:495-497(1975))。融合后的细胞铺96孔细胞培养板，通常7到10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，收集各孔培养上清，以ELISA方法用人SIRPα-Fc蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简述如下，用60μl含有1μg/ml的山羊抗小鼠IgG F(ab’)₂特异性片段(Jackson Immunoresearch Laboratories,Inc.,Cat#115-005-072)的PBS溶液包被酶标板，4摄氏度过夜。而后用含0.05％的吐温20的PBS溶液(即1xPBST)洗板1次后，加入200μl/孔含有5％脱脂奶粉的PBST溶液，置于37摄氏度封闭2小时。再次洗板，加入60μl/孔的杂交瘤上清，37摄氏度孵育40分钟，而后洗板4次。加入100μl/孔的生物素标记人SIRPαFc蛋白溶液(1∶5000稀释在含2.5％脱脂奶粉的PBST中)，37摄氏度孵育40分钟后洗板4次，拍干。而后以100μl/孔加入1：5000稀释在含5％脱脂奶粉的PBST溶液中的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,Cat#016-030-084)，37摄氏度孵育40分钟后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的TMB(InnoReagents,Cat#TMB-S-002)显色底物，室温显色5到15分钟，而后用1M的硫酸溶液终止，测定450纳米处各孔的吸光值。挑出ELISA结合阳性的杂交瘤孔细胞，转移到24孔板中，继续培养。并通过ELISA方法进行第二轮复筛，筛选出特异识别SIRPα抗原且能阻断CD47/SIRPα结合的杂交瘤(结果见表1，其中A2D9D1B1是本发明得到的杂交瘤，该杂交瘤表达本发明所制得的抗人SIRPα单克隆抗体)，通过有限稀释法亚克隆，获得目标单克隆细胞株。而后小量表达生产小鼠单克隆抗体，纯化后的抗体进行下一步的功能测评分析。

表1融合杂交瘤上清检测ELISA数据

二、体外分析方法：

实施例2用于测定SIRPα单克隆抗体功能活性的体外分析方法

2.1基于捕获ELSIA测定抗体的结合能力

用1xPBS配制山羊抗小鼠IgG F(ab')2特异的二抗(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.,Cat#115-005-072)，使其终浓度为2μg/ml，以100μl/孔加液于96孔酶标板，37摄氏度包被2小时。包被结束后，用1xPBST洗板1次后，加入200μl/孔的含有5％脱脂奶粉的PBST溶液置于37摄氏度封闭2小时。再次洗板，加入100μl/孔的稀释抗体溶液以及Benchmark(即KWAR23抗体，公司自产，其重链氨基酸为

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVQQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQDKATITADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCARWGAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；轻链氨基酸为

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPRTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC)后，37摄氏度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入生物素标记人SIRPαFc蛋白溶液(1：10000稀释在含2.5％脱脂奶粉的PBST中)，37摄氏度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.,Cat#016-030-084)，37摄氏度孵育40分钟，而后洗板4次，拍干。添加100μl/孔的ELISA显色底物TMB(InnoReagents,Cat#TMB-S-002)，室温显色5到15分钟，而后用1M的硫酸溶液终止显色，测定450纳米处各孔的吸光值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理。结果如图1。从图中可以看出，本发明的A2D9D1B1单克隆抗体能够识别人SIRPα抗原，且结合活性与Benchmark(缩写为BM)相当。

2.2间接ELISA测定抗体的结合能力

用1x carbonate/bicarbonate buffer配制人SIRPα-Fc抗原，使其终浓度为2μg/ml，以100μl/孔加液于96孔酶标板，37摄氏度包被2小时。包被结束后，用1xPBST洗板4次后，加入200μl/孔的含有5％脱脂奶粉的PBST溶液置于37摄氏度封闭2小时。再次洗板，加入100μl/孔的梯度稀释抗体溶液后，37摄氏度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Fcγ特定片段(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.,Cat#115-035-071)，37摄氏度孵育40分钟，而后洗板4次，拍干。添加100μl/孔的ELISA显色底物TMB，室温显色3到10分钟，而后用1M的硫酸溶液终止显色，测定450纳米处各孔的吸光值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，结果如图2。从图中可以看出，本发明的A2D9D1B1单克隆抗体能够识别人SIRPα蛋白。

2.3间接ELISA测定抗体与人SIRPβ的交叉反应能力

用1x carbonate/bicarbonate buffer配制人SIRPβ-ECD-His抗原(公司自产，所用质粒为SIRPβ-ECD-His；载体为pCMV-C-His；在EcoR I和Xba I之间插入氨基酸序列为

MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCEDELQVIQPEKSVSVAAGESATLRCAMTSLIPVGPIMWFRGAGAGRELIYNQKEGHFPRVTTVSELTKRNNLDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAVRATPEHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPAGDSVSYSIHSTARVVLTRGDVHSQVICEIAHITLQGDPLRGTANLSEAIRVPPTLEVTQQPMRAENQANVTCQVSNFYPRGLQLTWLENGNVSRTETASTLIENKDGTYNWMSWLLVNTCAHRDDVVLTCQVEHDGQQAVSKSYALEISAHQKEHGSDITHEAALAPTAPLHHHHHHHHHH)，使其终浓度为2μg/ml，以100μl/孔加液于96孔酶标板，37摄氏度包被2小时。包被结束后，用1xPBST洗板4次后，加入200μl/孔的含有5％脱脂奶粉的PBST溶液置于37摄氏度封闭2小时。再次洗板，加入100μl/孔的梯度稀释抗体溶液以及BM后，37摄氏度孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Fcγ特定片段，37摄氏度孵育40分钟，而后洗板4次，拍干。添加100μl/孔的ELISA显色底物TMB，室温显色3到10分钟，而后用1M的硫酸溶液终止显色，测定450纳米处各孔的吸光值。使用GraphPadPrism软件进行数据处理，结果如图3。从图中可以看出，本发明的A2D9D1B1单克隆抗体能够与人SIRPβ抗原发生交叉反应，且结合活性与Benchmark接近。

2.4SIRPα抗体阻断活性检测

2.4.1参照抗体阻断ELISA

通过竞争ELISA方法测评SIRPα抗体阻断参照抗体/SIRPα抗原结合的阻断能力。简述如下，用1xPBS配制参照抗体(BM)，使其终浓度为2μg/ml,以100μl/孔加液于96孔酶标板，4摄氏度包被过夜。次日，用PBST洗板1次后，加入200μl/孔的含5％脱脂奶粉的PBST溶液置于37摄氏度封闭2小时，再次洗板4次。把SIRPα抗体或对照抗体梯度稀释在含有生物素标记的人SIRPαFc蛋白溶液中，配好后室温预孵40分钟。而后把已孵育的抗体和SIRPαFc biotin的溶液以100μl/孔加到包被好参照抗体的板上，37摄氏度孵育40分钟后，再次洗板4次。而后以100μl/孔加入1：10000稀释在含5％脱脂奶粉的PBST溶液中的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37摄氏度孵育40分钟后洗板4次,拍干。添加TMB显色和1M硫酸终止反应，测定450纳米处的吸收值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，得出抗体阻断参照抗体/SIRPα结合的IC₅₀浓度值，结果如图4。从图中可以看出，本发明的A2D9D1B1单克隆抗体能够特异性阻断SIRPα蛋白结合其参照抗体Benchmark，且其阻断能力与Benchmark相当，提示本发明的A2D9D1B1单克隆抗体结合抗原的表位和Benchmark相近。

2.4.2流式细胞术测评抗体阻断SIRPα蛋白与细胞膜表面CD47蛋白的结合

把SIRPα抗体或对照抗体梯度稀释在含有生物素标记的人SIRPαFc蛋白溶液中，配好后室温预孵40分钟。收集处于对数生长期的膜表面过表达人CD47蛋白的293F细胞(公司内部构建，用lipofectamine 3000转染试剂转染表达人的CD47全长蛋白至293F细胞中，载体为pCMV-T-P，在EcoR I和Xba I插入的序列为

MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRNN)，用PBS洗细胞2次后用FACS缓冲液(含2％胎牛血清的PBS溶液)重悬细胞。调节密度，以1x10⁵个细胞/孔铺板于96孔U底板中，300g离心5分钟，倾去上清，而后把已孵育的抗体和人SIRPαFc biotin的溶液以100μl/孔加到膜表面过表达人CD47的293F的细胞板上。4摄氏度孵育40分钟后，300g离心5分钟，倾去上清。再用FACS缓冲液洗细胞2次，添加100μL/孔SA-PE(Jackson Immunoresearch,Cat#016-110-084，1∶500稀释)，4摄氏度孵育40分钟后，300g离心5分钟，倾去上清。再用FACS缓冲液洗细胞2次。而后每孔加100μL的FACS缓冲液重悬，吹匀细胞后上机检测。使用BD公司Canto II型号流式细胞仪测定每孔细胞的平均荧光强度MFI值。使用GraphPad Prism软件进行数据处理，得出抗体结合细胞的EC₅₀浓度值(即达到该抗体最大荧光结合信号50％时对应的抗体浓度值)，结果如图5。从图中可以看出，本发明的A2D9D1B1单克隆抗体可特异性阻断人SIRPα蛋白结合细胞膜表面的人CD47配体，其阻断能力略优于Benchmark，提示本发明的A2D9D1B1是略优于参照抗体具有SIRPα/CD47阻断活性的功能抗体。

2.5BIACORE表面等离子体共振法测定小鼠抗SIRPα单克隆抗体的亲和力实验流程如下：

1)平衡：将10×缓冲液(HBS-EP)用超纯水稀释至1×，将左侧进样管Tube A插入运行1×缓冲液瓶中，右侧进样管插入新鲜的超纯水中。打开Biacore T200Control Software2.0，装载偶联有anti-mouse IgG antibody蛋白的CM5芯片，运行两遍“Prime”程序，运行完毕后，仪器自动转入Standby模式，过夜平衡芯片与缓冲液；

2)捕获量优化：使用优化后的浓度在芯片上流经本发明的鼠抗A2D9D1B1；

3)亲和力测定：分别配制200nM，100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM的人SIRPα-his抗原溶液。编辑亲和力测定程序，捕获流速为10μl/min，设置捕获时间，捕获通道，蛋白的进样流速为30μl/min，结合时间120s，解离时间600s，选取合适的样品槽，将分析物按程序中设定的位置摆放于样品槽，运行程序；

4)通过Biacore T200 Evaluation Software2.0，计算鼠抗A1E7F8G7对人SIRPα-his抗原的结合速率常数K_a(1/Ms)，解离速率常数K_d(1/s)，亲和力常数K_D(M)。

本研究测评了本发明的A2D9D1B1单克隆抗体对人SIRPα-his抗原的亲和力，具体数据如下表和下图。Biacore亲和力测评数据表明：鼠抗A2D9D1B1对人SIRPα-his抗原的亲和力常数K_D为1.25E-09,而Benchmark为2.94E-09,显示A2D9D1B1的亲和力比Benchmark强约2.4倍。

表2抗SIRPα小鼠单克隆抗体的亲和力Biacore测评

实施例3抗SIRPα小鼠单克隆抗体的结合活性

根据实施例2中描述的分析方法，测评SIRPα抗体的结合活性总结如下表3。其中SIRPαBenchmark作为对照。从表3可知，本发明的抗人SIRPα单克隆抗体与人SIRPα抗原的结合活性比Benchmark略优，同时可以和SIRPβ抗原发生交叉反应。

表3 SIRPα抗体的结合活性

实施例4功能性阻断实验(参照2.4的分析方法)，得到抗体功能性实验测评数据

表4抗SIRPα小鼠单克隆抗体的功能性测评结果

表4中抗体对Benchmark/人SIRPα-Fc的竞争ELISA实验表明，本发明的A2D9D1B1抗体可特异阻断SIRPα结合其Benchmark，其阻断能力与Benchmark相当；同时抗体对人CD47细胞/人SIRPα-Fc的细胞阻断FACS实验表明，A2D9D1B1抗体可特异性阻断人SIRPα蛋白结合人CD47蛋白，其阻断能力略优于Benchmark，表明本发明的A2D9D1B1是结合表位相似于Benchmark并能阻断SIRPα/CD47结合的功能性抗体。

实施例5DNA克隆和测序，抗SIRPα小鼠单克隆抗体的可变区测序

使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit(Vazyme，catalog#RC101)从培养的小鼠单克隆细胞株中提取总RNA。过程简述如下，离心收集1.5x10⁶的细胞到1.5ml离心管中，吸干上清。向细胞沉淀中加入500μl Buffer RL1，并吹打混匀。将处理好的细胞转移到gDNA-Filter Columns中(gDNA-Filter Columns已放入收集管中)，13,000g室温离心2min，保留收集管内上清液。加入1.6倍体积Buffer RL2，轻柔混匀。混合液转移至RNAPure Columns中，13,000g室温离心1min，弃废液。向RNAPure Columns中加入500μlBuffer RW1，13,000g室温离心1min，弃废液。加入700μl Buffer RW2，13,000g室温离心1min，弃废液。再加入700μl Buffer RW2，13,000g室温离心1min，弃废液。13,000g离心2min，以彻底去RNAPure Columns中残留的Buffer RW2。将吸附柱转移至新的RNase-freeCollection Tubes 1.5ml离心管中，向吸附柱中央部位悬空滴加50μl的RNase-freeddH2O。室温放置2min，13,000g室温离心1min，洗脱RNA。

紧接着，选用Takara的逆转录cDNA试剂盒(catalog#6210A)把总RNA变为CDNA。实验体系配制如下，5μl总RNA+0.5μl Oligo(dT)Primer+0.5μl Random 6mers+1.0μl dNTPMixture+3.0μl RNase-free ddH₂O(共10μl)。先置于65摄氏度5min预变性，而后放冰上2min。进一步加入4μl 5x PrimeScript II Buffer+0.5μl RNase Inhibitor+1.0μlPrimeScript II RTase+4.5μl RNase-free ddH₂O(共20μl体系)，配好后混匀，使用PCR仪运行40摄氏度50min后，转70摄氏度运行10min，完成cDNA合成。

cDNA进一步在3’端加Poly G，反应体系配制如下：5μl cDNA+33.5μl ddH₂O+5μl10x TdT Buffer+5μl CoCl+1μl dGTP+0.5μl Terminal TransPerase(共50μl体系)，配好后混匀，使用PCR仪运行37摄氏度30min后，转70摄氏度10min，完成Poly G加尾。

进一步，以加尾的cDNA为模板进行抗体可变区的基因扩增。对于扩增抗体重链可变区序列，选用诺唯赞的试剂盒(catalog#P525-03)，配制PCR反应体系：25μl 2x PhantaMax Master Mix(Dye Plus)+2.0μl BSJ-Pri3AntisenseP-mIgG1(核苷酸序列为GCATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTT)+2.0μl BSJ-Pri1 Universal C1(核苷酸序列为AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCATCCCCCCCCCCCCCCCC)+1.25μl加Poly G尾的cDNA+19.75μl ddH₂O(共50μl体系)。对于扩增抗体轻链可变区序列，先用Takara的试剂盒(catalog#R010A)，配制PCR反应体系：10μl 5x PrimeSTAR Buffer+0.5μl PrimeSTAR+1.25μl BSJ-Pri1Universal C1(核苷酸序列为AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCATCCCCCCCCCCCCCCCC)+1.25μlBSJ-Pri19(核苷酸序列为GCACACGACTGAGGCACCTCCAGATGTT)+4μl aberrant-L-R2(核苷酸序列为TCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGC)+4μl dNTP+1.25μl加Poly G尾的cDNA+27.75μl ddH₂O(共50μl体系)。

抗体重链可变区PCR扩增的温度循环如下：

98℃*5min+(98℃*10s+62℃*10s+72℃*1min)*2Cycle+(98℃*10s+60℃*10s+72℃*1min)*4Cycles+(98℃*10s+58℃*10s+72℃*1min)*10Cycles+(98℃*10s+56℃*10s+72℃*1min)*20Cycles+72℃*10min+4℃*∞

抗体轻链可变区PCR扩增的温度循环如下：

98℃*5min+(98℃*10s+64℃*10s+72℃*1min)*2Cycle+(98℃*10s+62℃*10s+72℃*1min)*6Cycles+(98℃*10s+60℃*10s+72℃*1min)*12Cycles+(98℃*10s+58℃*10s+72℃*1min)*16Cycles+72℃*10min+4℃*∞

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH的约500bp，Vkappa轻链约500bp)，用TIANGEN的凝胶DNA回收试剂盒(catalog#DP209-03)进行DNA的抽提。简述如下：凝胶称重，加入等倍体积溶液PN，而后50摄氏度孵育10min直到凝胶完全溶解。将所得的溶液移至CA2吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置至少2min，12,000rpm室温离心30sec，弃去废液。加入600μl的漂洗液PW到柱中，而后12,000rpm室温离心30sec，弃去废液。再次加入600μl的漂洗液PW到柱中，静置5min，12,000rpm室温离心30sec，弃去废液。并再次12,000rpm室温离心2min，去除柱中液体残留，并室温放置至少2min以彻底晾干残留液体。吸附柱放到一个干净的离心管，加入35μl的洗脱缓冲液EB，室温放置至少2min。12,000rpm离心2min，获得制备的DNA样品。纯化的PCR产物经测序获得抗体的可变区序列如表5所示，SIRPα小鼠单克隆抗体的氨基酸全长序列如表6所示，SIRPα小鼠单克隆抗体的核苷酸序列如表7所示。

表5 SIRPα小鼠单克隆抗体的可变区氨基酸序列和CDR区

表6 SIRPα小鼠单克隆抗体的氨基酸全长序列

表7 SIRPα小鼠单克隆抗体的编码DNA序列

综上所述，本发明的能特异识别人SIRPα的单克隆抗体A2D9D1B1，该抗体与人SIRPα结合的亲和力更强，序列新颖，且能特异阻断人SIRPα和人CD47结合，是新的抗人SIRPα的单克隆功能抗体。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 博奥信生物技术（南京）有限公司

<120> 抗人SIRPα单克隆抗体及其用途

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asn Tyr Leu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ala

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Asp Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Tyr Ala Ile His

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Val Ile Trp Thr Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Asn Tyr Leu Arg Tyr

1 5

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Ala Ser Asp Leu Glu Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Gln Asn Asn Asp Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 9

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgcagt tgaaggaatc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acttgcactg tctctgggtt ttcattaagc agctatgcta tacactgggt tcgccagcct 120

ccaggcaagg gtctggagtg gctgggagta atatggactg gtggaagcac aatttataat 180

tcggctctca tgtccagact gaacatcagt aaagacaact ccaagagcca agttttcttg 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtatt actgtgccag aggtaactac 300

cttcgttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca 342

<210> 10

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctggggca gagggccacc 60

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccga cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 240

cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcaac aaaataatga tgatccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

<210> 11

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 13

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300

gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360

cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420

gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480

gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540

agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600

aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660

aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720

agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780

aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840

tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900

acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960

tctcctggta aatga 975

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60

ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120

tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180

agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgactaagga cgagtatgaa 240

cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

Claims

1.一种抗人SIRPα单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含：重链和轻链；

所述的CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示；

所述的CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示；

所述的CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示；

所述的CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示；

所述的CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示；

所述的CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述的抗人SIRPα单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的抗人SIRPα单克隆抗体，其特征在于，所述的重链和轻链都包括恒定区，重链恒定区如SEQ ID NO：11所示；轻链恒定区如SEQ ID NO：12所示。

4.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1~3任一项所述的抗人SIRPα单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列包括SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10；

序列SEQ ID NO：9编码所述的抗体的重链可变区；

序列SEQ ID NO：10编码所述的抗体的轻链可变区。

6.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有如权利要求4或5所述的核苷酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体。

8.一种抗人SIRPα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

步骤1：制备含有表达如权利要求1所述的抗人SIRPα单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；

步骤2：用步骤1的表达载体转染真核宿主细胞；

步骤3：培养步骤2转染的真核宿主细胞；

步骤4：分离纯化，获得所述的抗体。

9.包括权利要求1所述的抗人SIRPα单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。