CN109476744A - 抗erbb-2抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗原结合蛋白或其抗原结合片段。具体而言，本发明涉及与ERBB2结合的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。也提供了包含生理学上可接受的载体和治疗有效量的抗原结合蛋白或其抗原结合片段的组合物、抗原结合蛋白或其抗原结合片段的用途、用于检测癌症的方法以及当用于所述方法中时的试剂盒。

Description

抗ERBB-2抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月12日提交的新加坡申请号10201603812X的优先权的权益，其内容在此通过引用以其整体并入用于所有目的。
发明领域
本发明一般涉及抗体。具体而言，本发明涉及抗ERBB2抗体及其用途。
背景技术
基于抗体的治疗近年来已成为癌症的重要治疗策略。这种治疗通过介导抗原或受体功能的改变、调节免疫系统或递送与靶向特定抗原的抗体缀合的特定药物起作用。
基于抗体的癌症治疗的基本基础是癌组织表达与正常非癌组织相比可以被过表达、选择性表达或突变的一系列抗原。针对癌组织上的特定抗原的抗体可用于靶向并杀死癌组织。
然而，开发用于癌症的候选治疗性抗体的关键挑战是鉴定适合于基于抗体的治疗的抗原。抗原用于治疗的适合性取决于各种因素，包括但不限于抗原的性质(例如可及性、丰度、癌细胞上的表达位置等)、治疗方法、抗体亲和力和其他药代动力学性质。
ERBB2受体酪氨酸激酶，也称为HER2、HER2/neu和CD340，属于表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族，并且已在多种癌症中检测到ERBB2的过表达。目前，一些抗ERBB2抗体如和可商购获得。然而，这些可获得的抗体是昂贵的并且已经显示与正常细胞结合。这些可获得的抗体的结合在各癌细胞系中也不一致。因此需要开发针对ERBB2的新抗体，其解决了目前可获得的抗ERBB2抗体的缺点。
发明内容
在一个方面，提供了抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含(i)重链可变域，其包含具有氨基酸序列GYTFSNYWIE(SEQ ID NO:3)的VHCDR1；具有氨基酸序列EILPGSDSTNYNEKFKG(SEQ ID NO:4)的VHCDR2和具有氨基酸序列GGSNYGYYFDY(SEQ ID NO:5)的VHCDR3；和(ii)轻链可变域，其包含具有氨基酸序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:6)的VLCDR1、具有氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:7)的VLCDR2和具有氨基酸序列QQYSSYRT(SEQID NO:8)的VLCDR3。
在一个方面，提供了抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其与如本文公开的抗原结合蛋白竞争结合ErbB2受体蛋白激酶。
在一个方面，提供了如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含与其缀合的放射性同位素或细胞毒素。
在一个方面，提供了组合物，其包含生理学上可接受的载体和治疗有效量的如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
在一个方面，提供了如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在一个方面，提供了用于检测受试者中的癌症的方法，该方法包括：使获自所述受试者的样品与如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段在体外接触；检测所述样品中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合；将所述结合与对照样品中的结合水平相关联以确定所述样品中的结合水平，其中所述样品相对于对照样品在结合水平上的增加指示癌症。
在一个方面，提供了当用于如本文公开的方法时的试剂盒，其包含如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段以及使用说明书。
定义
术语“ERBB2酪氨酸激酶受体”和“ERBB2”可互换使用，包括ERBB2酪氨酸激酶受体的变体、同种型、物种同源物和与ERBB2受体酪氨酸激酶具有至少一个共同表位的类似物。雌激素相关受体β(ERBB2)在本领域中也称为分化簇340(CD340)、人表皮生长因子受体2(HER2)或Neu。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其产生对入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下对正常人细胞或组织的选择性损害、破坏或自人体消除它们。
如本文所用的术语“抗原结合蛋白”是指完整抗体、抗体片段(即“抗原结合部分”)和能够结合抗原的其他蛋白质构建体例如结构域或其单链。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，是指具有免疫球蛋白样结构域的分子，包括单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源缀合抗体；单个可变域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、双抗体、TandabsTM等(关于可替代“抗体”形式的总结，参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology,2005,第23卷,第9期,1126-1136)。
“抗体”还指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合部分的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如ERBB2酪氨酸激酶受体)的能力。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段行使。包含在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“人源化抗体”意指其中源自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列源自一个物种并且恒定区序列源自另一物种的抗体，例如其中可变区序列源自小鼠抗体并且恒定区序列源自人抗体的抗体。
术语抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原具有10-7或更小、10-8M或更小、更优选10- 9M或更小、甚至更优选10-10M或更小的KD的抗体。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”可互换使用。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
图1.A19与各种癌细胞系的结合。进行了肿瘤细胞的膜染色和活细胞的FACS染色。将细胞与A19在冰上孵育45分钟，洗涤并用次级FITC染色。通过流式细胞术分析A19的结合，并且结合基于自阴性对照的群体转变。
图2.A)A19的同种型分型。使用Roche同种型分型条进行同种型分型。B)靶抗原的鉴定。在SKOV3膜制备物上进行了IP，然后进行蛋白质印迹。从平行的SDS Page凝胶中切下相应的条带，通过MS鉴定抗原靶标。A19是：IgG1；有2个不同分子量的不同条带；对两个条带进行了同种型分型/免疫沉淀-质谱(IP/MS)。
图3.MS肽覆盖率。将来自MS的肽序列针对受体酪氨酸激酶(Her2，Erbb-2)(顶部序列)和受体酪氨酸-蛋白激酶Erbb-2(底部序列)的同种型4的蛋白质序列作图。
图4.通过交叉探测验证身份。用A19进行免疫沉淀(IP)并用赫赛汀进行免疫印迹。类似地，用赫赛汀进行IP并用A19进行免疫印迹。在两个实验中，检测到相同的抗原，证实A19的抗原靶标是Erbb-2。在两组IP中检测到相同的抗原。使用的细胞系是SKOV3。
图5.通过用siRNA敲减验证身份。使用siRNA进行Erbb-2的敲减。通过蛋白质印迹，Erbb-2的所有三种抗体显示出结合减弱，证实抗原靶标是Erbb-2。使用的细胞系是SKOV3。
图6.聚糖分析。用高碘酸盐处理后，A19的结合被废除。该图显示了39kDa处的肌动蛋白条带(蛋白质结合对照)和单克隆抗体(mAb)A4作为高碘酸盐处理的阳性对照。图6显示A19和赫赛汀结合聚糖。使用的细胞系是SKOV3。
图7.N-联聚糖(N-linked glycan)分析。在通过PNGase酶促去除N-联聚糖后，A19的结合被消除。图7显示A19和赫赛汀与N-联聚糖结合。使用的细胞系是SKOV3。
图8.O-联聚糖分析。用苄基-α-GalNAc在培养中抑制O-联聚糖合成。通过失去TRA-1-60的结合证实了O-联聚糖的丧失。A19的结合与对照相似，证实A19的结合不是与O-联聚糖结合。使用的细胞系是HES-3。图8显示A19和赫赛汀不与O-联聚糖结合。
图9.A19的体外ADCC活性。当与卵巢癌细胞或乳腺癌细胞一起培养时，A19不表现出ADCC活性。使用ADCC报告基因生物测定法(Promega)测量ADCC活性作为NFAT途径的倍数诱导。图9显示嵌合A19不引发ADCC。
图10.裸A19的生物活性。将A19以不同剂量掺标入SKOV3中，并在第2天(T2)和第5天(T5)通过Cell Titre Glow(CTG)测量存活率。在T2和T5时在不同剂量的A19下细胞的存活率与对照相当。使用的细胞系是SKOV3。图10显示裸A19在体外对细胞生长没有影响。
图11.裸A19的生物活性。将A19以0至5mg/ml的各种剂量掺标入SKOV3中，并实时监测生长。针对A19的所有剂量，生长没有差异。使用的细胞系是SKOV3。图11显示裸A19在体外对细胞生长没有影响。
图12.A19内化到细胞中。A19与染料(pHRodo,ThermoFisher Scientific)缀合，当抗体复合物进入细胞至酸性环境时，该染料发出明亮的荧光。虚线直方图表示未用抗体处理的细胞，而阴影直方图表示用抗体处理的细胞。阴性对照由pHRodo染料(未与任何抗体缀合)组成，而mAb2448是已知的mAb，其内化到细胞中(阳性对照)。使用的细胞系是SKOV3。图12显示嵌合A19内化到细胞中。
图13.A19内化到细胞中。在T＝5分钟时A19的免疫染色显示抗体在细胞周围形成亮环。1小时后，抗体内化到细胞中，如通过细胞内A19的间断和散射染色所观察到的。使用的细胞系是SKOV3。
图14.A19可用作抗体-药物缀合物(ADC)。A19通过次级mAb或通过链霉亲和素-生物素亲和力与毒素皂草素缀合。作为ADC，A19在体外杀伤细胞。使用的细胞系是SKOV3。图14显示嵌合A19可用作ADC。
图15.作为ADC的A19杀伤高度表达Erbb-2的细胞。在各种癌细胞中，SKOV3和SKBR3表达高水平的Erbb2。A19-ADC在体外仅对SKOV3和SKBR3有作用。图15显示对其他癌症观察到ADC，并且对高度表达Erbb-2的细胞系观察到显著的ADC效应，同时对COLO205有轻微效应。
图16.A19-ADC以剂量依赖性方式杀伤细胞。作为ADC，A19以剂量依赖性方式在体外杀伤SKOV3。应注意，使用的剂量是裸A19的1/1000。使用的细胞系是SKOV3。图16显示A19作为ADC起作用。裸A19(5mg/ml)对细胞增殖没有影响。
图17.A19-ADC在体内抑制肿瘤生长。每隔1周腹膜内施用三剂A19-ADC(37.5ug/剂)。在2个月内跟踪肿瘤大小。将细胞注射到小鼠的右侧(皮下)。图17显示A19在体内作为ADC起作用，尽管缀合是次优的。使用的细胞系是SKOV3。MCF7没有动物模型。
图18.A19和赫赛汀之间的竞争性结合。A19和赫赛汀各自分别与Alexafluor 488和APC缀合。单个染色剂显示抗体与细胞结合(对于A19为Q1，对于赫赛汀为Q3)。当将抗体一起孵育时，它们不会相互竞争(Q2)。图18显示嵌合A19不与赫赛汀结合相同的表位。使用的细胞系是SKOV3。
图19.单克隆抗体(mAb)检测到的同种型。所有3种mAb均检测到各种Erbb-2同种型。3种mAb可能共同的同种型是上条带或同种型4。图19显示A19的抗原靶标是Erbb-2/Her2。
图20.A19的可变基因序列和蛋白质序列。显示了A19重链(SEQ ID NO:9)和轻链(SEQ ID NO:10)的可变基因序列和A19重链(SEQ ID NO:1)和轻链(SEQ ID NO:2)的蛋白质序列。
具体实施方式
在第一方面，本发明涉及抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含(i)重链可变域，其包含具有氨基酸序列GYTFSNYWIE(SEQ ID NO:3)的VHCDR1；具有氨基酸序列EILPGSDSTNYNEKFKG(SEQ ID NO:4)的VHCDR2和具有氨基酸序列GGSNYGYYFDY(SEQ ID NO:5)的VHCDR3；和(ii)轻链可变域，其包含具有氨基酸序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:6)的VLCDR1、具有氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:7)的VLCDR2和具有氨基酸序列QQYSSYRT(SEQID NO:8)的VLCDR3。
在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含重链和轻链CDR区，其与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的同一性。
在优选的实施方案中，如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段的重链可变区可包含SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列。
在一个实施方案中，如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可包含重链可变区，其包含与SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段的轻链可变区可包含SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可包含轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是考虑到空位的数量和每个空位的长度的情况下序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同源性＝相同位置的数量/位置总数x100)，需要引入空位以用于两个序列的最佳比对。
在一个实施方案中，如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源缀合抗体；单个可变域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、单链抗体、缺少铰链区的单价抗体、微抗体(minibody)、双抗体和TandabsTM。
在进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段是多克隆抗体或单克隆抗体。在优选的实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段是单克隆抗体。
在进一步优选的实施方案中，所述单克隆抗体是A19。所述单克隆抗体可以是人源化的。
本发明的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以与ERBB2受体蛋白激酶结合。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以结合ERBB2受体蛋白激酶的一种或多种同种型。ERBB2受体蛋白激酶的同种型的实例包括同种型1、2、3、4、5和6。在一些实施方案中，所述同种型可以是截短的。在其他实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以与ERBB2受体蛋白激酶的截短的同种型4结合。在进一步的实施方案中，所述截短的同种型4不包含任何疏水区。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段结合ERBB2受体蛋白激酶上的聚糖。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段结合ERBB2受体蛋白激酶上的胞外聚糖。
如本文所用，聚糖是指可以是单糖的同聚物或异聚物的多糖。聚糖包括N-联聚糖和O-联聚糖。N-联聚糖是其单糖与天冬酰胺侧链中的氮连接的聚糖。O-联聚糖是其单糖在丝氨酸或苏氨酸氨基酸残基上连接的聚糖。
在优选的实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以与ERBB2受体蛋白激酶上的N-联聚糖结合。在进一步优选的实施方案中，N-联聚糖可位于ERBB2受体蛋白激酶的氨基酸位置66、124、187、259、530、571和629中的一个或多个。
在另一方面，本发明涉及抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其与如本文公开的抗原结合蛋白竞争结合ERBB2受体蛋白激酶的相同表位。关于结合的竞争可以指结合亲和力或结合机制。例如与如本文公开的抗原结合蛋白竞争结合ERBB2受体蛋白激酶的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以因以至少相同的亲和力或更高的亲和力结合相同的ERBB2表位而竞争。还可以通过降低结合亲合力来实现竞争性结合。
在另一方面，本发明涉及与治疗部分缀合的如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，所述治疗部分例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)，放射性毒素或放射性同位素。
此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”或“抗体药物缀合物(ADC)”。包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括单甲基瑞奥西汀E(monomethyl auristatin E，MMEA-1)、mertansine(DM-1)和皂草素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二氨基铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(前称道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。可以与本发明的抗体缀合的治疗性细胞毒素的其他实例包括倍癌霉素(duocarmycins)、卡利奇霉素、美登素和瑞奥西汀(auristatin)及其衍生物。
在优选的实施方案中，所述细胞毒素选自由以下组成的组：单甲基瑞奥西汀E(MMEA-1)、mertansine(DM-1)和皂草素。
可以使用本领域可获得的接头技术将细胞毒素与本发明的抗体缀合。已经用于将细胞毒素与抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。
本发明的抗体还可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射性药物，也称为放射性免疫缀合物。可以与抗体缀合以在诊断上或治疗上使用的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域建立了制备放射性免疫缀合物的方法。放射性免疫缀合物的实例是可商购的，包括Zevalin.TM.(IDEC Pharmaceuticals)和Bexxar.TM.(CorixaPharmaceuticals)，并且类似方法可用于使用本发明的抗体制备放射性免疫缀合物。
本发明的抗体缀合物可以用于修饰给定的生物学反应，并且药物部分不被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可以包括例如酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应修饰剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
在一些实施方案中，包含与其缀合的放射性同位素或细胞毒素的抗原结合蛋白或抗原结合片段在与ERBB2受体酪氨酸激酶结合后内化到细胞中。包含与其缀合的放射性同位素或细胞毒素的抗原结合蛋白或抗原结合片段的内化释放放射性同位素或细胞毒素并可能引发细胞死亡。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)引发细胞死亡。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含生理学上可接受的载体和治疗有效量的如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
组合物可包括本发明的(例如两种或更多种不同的)抗原结合蛋白、其抗原结合片段、抗体或免疫缀合物或双特异性分子中的一种或组合。例如本发明的药物组合物可包含与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性物)的组合。
本发明的药物组合物还可以联合治疗施用，即与其他试剂联合施用。在一些实施方案中，本发明的组合物可包含选自由以下组成的组的其他活性药物成分：贝伐单抗、卡铂、紫杉醇或吉非替尼。在其他实施方案中，本发明的组合物可以与化疗一起施用。
如本文所用的，“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。优选地，所述载体适用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，可将活性化合物即抗体、免疫缀合物或双特异性分子包被在材料中以保护所述化合物免受酸和其他可使所述化合物失活的天然条件的作用。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本发明的药物组合物中的用途。补充的活性化合物也可以掺入所述组合物中。
本发明的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”或“生理学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不期望的毒理学作用的盐。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸以及衍生自无毒有机酸的那些，所述无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，所述有机酸例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括衍生自碱金属或碱土金属以及衍生自无毒有机胺的那些，所述碱金属或碱土金属例如钠、钾、镁、钙等，所述无毒有机胺例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。可例如通过使用包衣材料例如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂例如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
本发明的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径施用。如技术人员所理解的，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。本发明抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“胃肠外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本发明的抗体可以通过非胃肠外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。
在一方面，本发明涉及如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
通常应理解，癌症治疗包括抑制癌细胞生长、阻抑癌细胞增殖、引发细胞死亡和激活宿主对癌细胞的免疫应答中的一种或多种。
可使用如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段治疗的优选癌症包括通常对免疫治疗有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，本发明包括可使用本发明的抗体抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。
可以使用本发明的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)以及所述癌症的组合。
在一些实施方案中，所述癌症可以选自表达如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段所结合的表位的癌症。
在优选的实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、宫颈癌和胰腺癌。
在其他实施方案中，本文公开的药物可以与另外的活性药物成分一起施用。
在又其他实施方案中，本文公开的药物可以与化疗一起施用。
另外的活性药剂或化疗可以与如本文公开的药物、组合物、抗原结合蛋白或其抗原结合片段分开、同时或序贯施用。如本文所用，序贯地是指在施用所述药物、组合物、抗原结合蛋白或其抗原结合片段之前或之后施用另外的活性药剂或化疗。可在施用所述药物、组合物、抗原结合蛋白或其抗原结合片段之前和/或之后立即、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用另外的活性药剂或化疗。
在另一方面，提供了用于检测受试者中的癌症的方法，该方法包括：使获自所述受试者的样品与如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段在体外接触；检测所述样品中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合；将所述结合与对照样品中的结合水平相关联以确定所述样品中的结合水平，其中所述样品相对于对照样品在结合水平上的增加指示癌症。
在一些实施方案中，所述对照样品来自相同的受试者。在一些实施方案中，所述对照样品来自不同的受试者。
在一些实施方案中，在本文公开的方法中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以结合ERBB2受体蛋白激酶。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段可包含可检测标签。
如本文所用，可检测标签包括荧光标签、化学发光标签、磷光标签和发色标签。所述标签可以是组成型可检测的，或者可以在与细胞或底物结合时是可检测的。可检测标签的实例包括但不限于Alexa染料、FITC、TRITC、PE、德克萨斯红、染料、GFP、YFP、RFP、CFP、APC、R-PE、探针、SYTOX绿、碘化丙啶、生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。在优选的实施方案中，所述可检测标签选自生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、FITC、PE或染料。
可以在选自流式细胞术、组织切片或免疫组织化学的测定中检测所述可检测标签。
在一些实施方案中，在如本文公开的方法中，检测的癌症可以选自表达如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段所结合的表位的癌症。
在优选的实施方案中，在如本文公开的方法中，所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、宫颈癌和胰腺癌。
在另一方面，提供了当用于如本文公开的方法时的试剂盒，其包含如本文公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段以及使用说明书。
本文说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被广泛地理解而不受限制。另外，本文使用的术语和表述已被用作描述而非限制的术语，并且无意使用排除所示和所述特征的任何等同物或其部分的这些术语和表述，但认识到的是，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解的是，尽管已经通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的其中体现的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。
在本文中广泛和一般地描述了本发明。落入通用公开内容中的每个较窄种类和亚属群组也构成本发明的一部分。这包括具有从该属中去除任何主题的附带条件或负面限制的本发明的一般描述，无论是否在本文中具体记载了被移除的材料。
其他实施方案在所附权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什群组的任何单个成员或成员亚组的形式描述。
实验部分
通过参考具体实施例将更详细地进一步描述本发明的非限制性实例和比较实例，所述具体实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
材料和方法
流式细胞术分析
使用胰蛋白酶(Invitrogen,USA)收获细胞以获得在10μL冰冷的含1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,USA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS,Invitrogen,USA)中的2×105个细胞的单细胞悬浮液。将细胞于4℃在100μL含有单克隆抗体A19或5μg纯化的mAb的杂交瘤培养上清液中孵育45分钟。然后用冰冷的1％BSA/PBS洗涤细胞，并以1:500稀释度与同异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白(DAKO,丹麦)在黑暗中孵育15分钟。然后用冰冷的1％BSA/PBS洗涤细胞，并重悬于200μL1％BSA/PBS中用于在FACScalibur流式细胞仪(BD Biosciences,USA)上进行分析。
同种型分型
用来自Roche的小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(Roche,#11493027001)进行同种型分型。该方案根据制造商的说明书进行。简而言之，用150μl杂交瘤培养上清液重悬管中的沉淀。在加入isostrip之前，通过涡旋将溶液充分混合。孵育10分钟后分析结果。
膜蛋白提取
将贴壁细胞在PBS(Invitrogen,USA)中刮擦并以3000rpm离心5分钟。将细胞在冰冷的PBS(Invitrogen,USA)中洗涤，并以3000rpm离心5分钟。将得到的沉淀重悬在均质缓冲液混合物(BioVision,USA)中，并使用Misonix Sonicator 3000在以下条件下超声处理：总共5分钟的处理时间，其由5秒脉冲开启和10秒脉冲关闭的重复循环组成。将得到的匀浆物转移到1.5mL微量离心管中，并在4℃以700g离心10分钟以除去碎片。然后收集上清液并在4℃以10000g离心30分钟。弃去所得上清液，收集含有膜蛋白提取物的沉淀用于后续分析。
免疫沉淀(IP)
将膜蛋白用含2％Triton的PBS溶解。使用Phynexus仪器(Phynexus Inc,California,USA)进行免疫沉淀，Phynexus仪器装载有蛋白质G tip(Phynexus Inc,#PTR92-05-02)。自动程序允许与A19或赫赛汀、溶解的蛋白质样品和洗涤缓冲液序贯孵育。在最后步骤进行低pH洗脱，并在使用前中和洗脱的样品。
SDS PAGE凝胶和蛋白质印迹
在加入5X样品上样染料后，将样品在95℃煮沸，并使用4-12％梯度NuPAGE Bis-Tris凝胶和1X MOPS缓冲液(#NP001)(均来自Life Technologies)进行SDS-PAGE。将蛋白质在100-120V下分离1-2小时。一式两份制备样品，一组用于蛋白质印迹转移到PVDF膜上，另一组用于银染色。用5％低脂牛奶封闭膜印迹30分钟，然后在4℃与来自初级抗体(1：3)与封闭缓冲液的稀释培养上清液孵育过夜。用含0.1％Tween的PBS洗涤印迹，并在室温与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠或抗人Ig(1:10000,DAKO)一起孵育1小时。最后，使用化学发光ECL prime蛋白质印迹(prime Western blotting)检测试剂(GE Healthcare,#RPN2232)使印迹显色。在使用质谱法(LC/MS-MS)进行抗原靶标鉴定之前，切下对应于蛋白质印迹的银染凝胶上的蛋白质条带并用胰蛋白酶消化。对于靶标验证，将A19和针对Erbb-2的商业抗体(赫赛汀/Abcam)以1:100稀释用于IP，1:1000稀释用于蛋白质印迹。
siRNA敲减
为了验证靶抗原的身份，使用RNAiMAX，根据制造商提供的转染方案，用针对Erbb-2的siRNA(Ambion,#103546)进行靶抗原的敲减。siRNA阴性对照用作加扰对照(scrambled control)。简言之，将1×105个SKOV3细胞接种到6孔板中并使其贴壁过夜。将Lipofectamine的主混合物与加扰siRNA和Erbb-2siRNA(1:1)的主混合物混合，并在室温静置20分钟。从6孔板中吸出培养基，并用3ml/孔的新鲜培养基替换。将200μL混合物逐滴加入各孔中并均匀分布在整个孔中。将细胞在37℃孵育48小时。通过刮擦收获细胞并用含2％Triton的PBS裂解。用DC蛋白质测定(Bio-Rad Laboratories)定量总蛋白质浓度，并如前所述进行蛋白质印迹。
高碘酸盐
通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜上。将膜用100mM乙酸钠(Merck,德国)pH 4.5冲洗两次，随后在黑暗中用100mM偏高碘酸钠(Sigma-Aldrich,USA)孵育两次，每次15分钟。向对照中加入乙酸钠代替偏高碘酸钠。孵育后，将膜用100mM乙酸钠冲洗4次，然后用PBS冲洗。然后将膜与0.5M硼氢化钠(Sigma-Aldrich,USA)在室温下孵育30分钟。孵育后，用PBS冲洗膜一次，并于室温在含5％牛奶的PBS-吐温中封闭30分钟。此后，用初级抗体探测印迹并通过化学发光检测。
PNGase消化
根据制造商的方案(New England Biolabs)进行PNGase消化。简言之，首先将10-20μg糖蛋白在1x糖蛋白变性缓冲液中于95℃变性10分钟。然后将变性的蛋白质与1μl唾液酸酶在37℃孵育。随后，加入1x G7反应缓冲液和10％NP-40，并与2μl PNGase F在37℃孵育1小时。随后在SDS-PAGE上分离消化的蛋白质并转移至蛋白质印迹。
hESC中的O-联糖基化的抑制
人胚胎干细胞系HES-3获自ES Cell International(ESI,新加坡,http://escellinternational)。将细胞在37℃、5％CO2下于基质胶涂覆的培养皿上培养，将培养皿每天补充来自永生化小鼠饲养细胞ΔE-MEF的条件培养基(CM)。用于培养hESC的培养基是KNOCKOUT(KO)培养基，其含有85％KO–DMEM(DMEM,Dulbecco改良的Eagle培养基)，补充有15％KO血清替代物、1mM L-谷氨酰胺、25U/ml青霉素、25U/ml链霉素、1％非必需氨基酸(NEAA)、0.1mM 2-巯基乙醇和5ng/mL重组人成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)(Invitrogen,Carlsbad,CA,http://www.invitrogen.com)。为了传代hESC，简言之，一旦培养物达到汇合，用细胞切割器(Invitrogen)将细胞机械切割成小方形细胞片，使用细胞刮刀从培养皿中刮下并转移到新鲜的基质胶涂覆的培养皿中。将培养皿与基质胶(Becton Dickinsonand Company,Franklin Lakes,NJ,http://www.bd.com)在4℃预孵育过夜或在室温下预孵育至少4小时。将细胞以1:6或1:8的比例(取决于汇合度)传代。
传代后4天，将培养中的hESC掺标入含优化量的苄基-α-GalNac的CM中并孵育24小时。对于阴性对照，用CM或具有相同体积的作为抑制剂的DMSO的CM喂养hESC。将细胞用胰蛋白酶消化并在1％BSA/PBS中重悬为单细胞悬浮液。如前所述进行流式细胞术分析。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定
使用报告基因生物测定法(Promega；ADCC报告基因生物测定法,#G7010)测量ADCC活性。根据制造商的方案进行ADCC生物测定。简言之，将细胞以每孔5,000个细胞接种在96孔透明底部黑色组织培养板(Corning；#3904)中的低4％IgG血清(Promega；#G711A)培养基中。将初级抗体的系列稀释液在一式三份孔中在37℃、5％CO2孵育约15分钟。孵育后，将工程化的效应细胞以每孔约150,000个细胞加入孔中。超过5小时后(或如结果中所示)，将Bio-GloTM萤光素酶测定底物(Promega；#G719A和#G720A)加入孔中，并使用酶标仪(Tecan)测量发光。
CellTiter-(CTG)发光细胞存活率测定
将细胞接种(1000个细胞/90μL/孔)到96孔板(黑色透明平底)的培养基中，并在37℃、5％CO2孵育过夜。相应地制备具有不同浓度的mAb或与毒素缀合的mAb的储备液，并以10μL的体积加入培养物中。将培养物在37℃、5％CO2再孵育72小时。使用CellTiter-(CTG)发光细胞存活率测定试剂盒(Promega)，基于ATP的存在测量代谢活性细胞。将CTG底物以100μL的体积加入到每个孔中，并于室温在摇床上在黑暗中孵育15分钟。使用TECANM2000测量发光。
实时监测细胞增殖
使用实时分析仪(Roche)随时间连续监测细胞生长。基于细胞阻抗监测细胞的贴壁。首先将细胞培养基(40μL)加载到96孔E板上以测量背景阻抗。然后将细胞以1,000个细胞/50μL/孔铺板并在正常细胞培养条件下生长过夜。相应地制备具有不同浓度的mAb或与毒素缀合的mAb的储备液，并以10μL的体积掺标入培养物中。所有实验均在每处理条件至少3个孔中进行。
抗体药物缀合物(ADC)
将初级mAb与合适的次级抗体缀合物：mAb-ZAP或HUM-ZAP(Advanced TargetingSystems)在室温以1：1的摩尔比复合15分钟，然后掺标入培养物中。或者，在与链霉亲和素皂草素(1：1摩尔比)孵育之前，使用EZ-LinkTM磺基(Sulfuno)-NHS-生物素试剂盒(ThermoFisher Scientific)将mAb生物素化。
mAb的生物素化
使用EZ-LinkTM磺基-NHS-生物素试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将mAb生物素化。简言之，将50μL生物素试剂加入1ml mAb(2mg/ml，在PBS中)中，并在室温孵育30分钟。通过透析除去未反应的生物素。
内化研究
在使用前，将生物素化的mAb与等摩尔的红色抗生物素蛋白(ThermoFisher Scientific,#P35362)在黑暗中于冰上孵育5分钟。向细胞中加入5μg缀合的mAb，并在黑暗中和室温孵育2小时，然后通过FL2-H通道在FACS Calibur上分析。内化的实时视频捕获在DeltaVision(GE Healthcare Life Sciences)上进行。
免疫荧光
将细胞用胰蛋白酶消化，以2000个细胞/孔接种在两个24孔板(板1和板2)上，并在37℃、5％CO2的培养箱中放置过夜。将两个细胞板通过用新鲜冷培养基洗涤两次预冷，并用1ml冷培养基加满。然后将初级抗体加入孔中(终浓度为4μg/ml)。对于第1个板，在冰上进行孵育5分钟。对于第2个板，在37℃孵育1小时以促进内化。在初级mAb孵育后，将两个板用冷PBS洗涤两次，随后用4％多聚甲醛/PBS固定15分钟。用冷PBS洗涤细胞两次，并用0.5％Triton-X/PBS透化10分钟。将细胞再次洗涤两次并用10％胎牛血清/PBS封闭10分钟。将细胞再次用PBS洗涤两次，并与抗小鼠488和DAPI(Thermo Fisher Scientific)在黑暗中孵育30分钟。用PBS洗掉过量的染料，并在成像前向每个孔中加入500μl 1％BSA/PBS。
体内模型
如前所述，通过将生物素化的A19与链霉亲和素皂草素(Advanced TargetingSystems)缀合来制备抗体药物缀合物。对于动物模型，采用占先模型。以在100μL体积的PBS/基质胶(1：1体积；BD MatrigelTM基质胶,#354234)中的5×106个SKOV3细胞，每只裸小鼠于右侧被皮下注射。在第0、7和14天腹膜内施用药物(每剂量37.5μg)。在70天内监测肿瘤大小。
mAb与荧光团的缀合
根据制造商的方案，使用LYNX Rapid Conjugation(AbD Serotec)将抗体A19和赫赛汀分别与Alexafluor 488和别藻蓝蛋白(APC)缀合。简言之，每100μg荧光团使用100-150μg抗体。向抗体样品中每10μL抗体加入1μl的修饰剂试剂并轻轻混合。将混合的抗体-修饰剂样品直接加到LYNX上，通过轻轻地上下抽吸溶液两次将冻干物(lyophilized)重悬。将样品在室温下孵育3小时。孵育后，所用的每10μl抗体加入1μl猝灭剂。最终样品在使用前静置30分钟。
竞争测定
将5μg缀合的mAb单独或双重与SKOV3的单细胞悬浮液(0.5×106个细胞/100μl1％BSA/PBS)在冰上孵育30分钟。洗涤细胞并重悬于200μl缓冲液中。分别通过FL1-H和FL4-H通道在FACS Calibur上分析A19和赫赛汀的结合。
结果
实验数据表明A19与各种癌细胞系结合，并且A19的同种型是IgG1。从免疫沉淀/质谱，显示A19的抗原靶标为Erbb-2。A19与两种同种型结合。图3中的上条带被鉴定为受体酪氨酸激酶的同种型4，而下条带被鉴定为受体酪氨酸-蛋白激酶Erbb2。与A19的蛋白质序列相比，肽覆盖率(来自MS)是：(1)39％(对于受体酪氨酸激酶的同种型4)。(2)14％(对于受体酪氨酸-蛋白激酶Erbb-2)。
用A19进行免疫沉淀(IP)并用赫赛汀进行免疫印迹。类似地，用赫赛汀进行IP并用A19进行免疫印迹。在两个实验中，检测到相同的抗原，证实A19的抗原靶标是Erbb-2。
使用siRNA进行Erbb-2的敲减。所有条件(LP、SC和KD)下的蛋白质负荷均归一化，如肌动蛋白条带所证实的。抗Erbb-2和赫赛汀的结合在KD泳道中减少，但在其他2个对照中没有减少，证实了Erbb-2的敲减。还观察到A19的结合减少，证实A19的抗原靶标确实是Erbb-2。
对于高碘酸盐测定，使用偏高碘酸钠通过打开邻位二醇的糖环，产生2个醛基来氧化糖蛋白的碳水化合物部分，所述醛基通过还原剂硼氢化钠还原为羟基。用高碘酸盐处理后，赫赛汀和A19的结合被废除。这表明A19与Erbb-2上的聚糖结合。
在通过PNGase酶促去除N-联聚糖后，赫赛汀和A19的结合被废除。这表明A19与Erbb-2上的N-联聚糖结合。
用苄基-α-GalNAc在培养中抑制O-联聚糖合成。O-联聚糖的丧失通过抑制后TRA-1-60结合的丧失得到证实。赫赛汀和A19与苄基-α-GalNAc处理的细胞的结合与对照相似，证实A19不与O-联聚糖结合。
分离来自A19小鼠杂交瘤的可变基因并克隆到含有人IgG1恒定基因的多启动子单表达载体中。然后将这些载体转染到DG44中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞系中用于生产。使用ADCC报告基因生物测定法(Promega)测试嵌合A19的ADCC活性。当与卵巢癌细胞或乳腺癌细胞一起培养时，赫赛汀表现出ADCC活性。然而，当与卵巢癌细胞或乳腺癌细胞一起培养时，A19不表现出ADCC活性。作为裸抗体，A19对SKOV3的增殖没有影响，对SKOV3的增殖没有影响。
当细胞与pHRodo染料(阴性对照)一起孵育时，荧光没有变化。当细胞与阳性对照mAb 2448(与pHRodo缀合)一起孵育时，观察到荧光增加。类似地，与缀合pHRodo的A19孵育的细胞显示荧光增加，表明mAb内化到细胞中。
免疫荧光染色证实A19内化到细胞中。当与单独的A19或皂草素-毒素一起孵育时，细胞的存活率是相当的。作为ADC，A19在体外杀伤细胞并杀伤高度表达Erbb-2的细胞。
基于A19的结合和通过流式细胞术分析，SKOV3和SKBR3表达高水平的Erbb-2。其他4种细胞系表达中等或低水平的Erbb-2(与SKOV3和SKBR3相比)。当与A19-ADC孵育时，COLO205、MCF-7、CAMA-1和BT474的存活率仍然很高。另一方面，当与A19-ADC孵育时，SKOV3和SKBR3的存活率显著降低，表明作为ADC，A19杀伤高度表达Erbb-2的细胞。
通过实时监测，A19-ADC以剂量依赖性方式杀伤细胞。应注意的是，使用的剂量是裸A19的1/1000。
通过mAb的生物素化产生A19-ADC并与链霉亲和素-皂草素缀合。虽然这种缀合是次优的，但A19-ADC能够在体内抑制肿瘤生长。相反，在其他2个对照组(仅皂草素或A19)中，未观察到肿瘤抑制。
当A19和赫赛汀与细胞一起孵育时，它们不会相互竞争。这表明A19和赫赛汀结合不同的表位。所有3种mAb(A19、赫赛汀和商业抗体)检测各种Erbb-2同种型。3种mAb可能共有的同种型是上条带或同种型4。
序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 抗ERBB-2抗体及其用途
<130> 9869SG4402
<160> 12
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 1
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 2
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 3
Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 4
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 5
Gly Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 6
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 7
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 8
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
1 5
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的核苷酸序列
<400> 9
caggtgaagc tgcaggagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt aactactgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtgatag tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagaggaggg 300
tcgaactacg ggtactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的核苷酸序列
<400> 10
gacattctga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcccctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120
gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctct ccattagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atcggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaatcaaacg g 321
<210> 11
<211> 1240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 11
Met Pro Arg Gly Ser Trp Lys Pro Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met
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Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg
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His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr
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Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu
50 55 60
Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro
65 70 75 80
Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn
85 90 95
Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr
100 105 110
Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg
115 120 125
Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro
130 135 140
Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys
145 150 155 160
Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala
165 170 175
Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu
180 185 190
Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly
195 200 205
Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln
210 215 220
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys
225 230 235 240
Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu
245 250 255
Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly
260 265 270
Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr
275 280 285
Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn
290 295 300
Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser
305 310 315 320
Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg
325 330 335
Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys
340 345 350
Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly
355 360 365
Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val
370 375 380
Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp
385 390 395 400
Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile
405 410 415
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420 425 430
Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser
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Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr
450 455 460
Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His
465 470 475 480
Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys
485 490 495
His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln
500 505 510
Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu
515 520 525
Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His
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Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr
545 550 555 560
Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys
565 570 575
Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp
580 585 590
Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys
595 600 605
Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp
610 615 620
Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile
625 630 635 640
Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe
645 650 655
Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met
660 665 670
Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser
675 680 685
Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu
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Leu Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr
705 710 715 720
Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala
725 730 735
Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile
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755 760 765
Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln
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Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly
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Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys
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Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp
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Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly
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Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser
1055 1060 1065
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
1070 1075 1080
Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser
1085 1090 1095
Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val
1100 1105 1110
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro
1115 1120 1125
Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
1130 1135 1140
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
1145 1150 1155
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1160 1165 1170
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
1175 1180 1185
Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
1190 1195 1200
Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
1205 1210 1215
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1220 1225 1230
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1235 1240
<210> 12
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的肽序列
<400> 12
Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu
1 5 10 15
Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu
20 25 30
Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln
35 40 45
Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val
50 55 60
Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr
85 90 95
Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu
100 105 110
Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn
115 120 125
Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His
130 135 140
Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg
145 150 155 160
Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly
165 170 175
Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly
180 185 190
Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu
195 200 205
Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala
210 215 220
Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala
225 230 235 240
Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu
245 250 255
Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn
260 265 270
Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His
275 280 285
Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys
290 295 300
Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu
305 310 315 320
Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly
325 330 335
Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp
340 345 350
Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln
355 360 365
Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala
370 375 380
Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val
385 390 395 400
Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln
405 410 415
Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly
420 425 430
Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His
435 440 445
Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu
450 455 460
His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala
465 470 475 480
Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr
485 490 495
Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu
500 505 510
Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg
515 520 525
His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val
530 535 540
Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr
545 550 555 560
Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro
565 570 575
Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala
580 585 590
Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser
595 600

Claims (37)

1.一种抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含(i)重链可变域，其包含具有氨基酸序列GYTFSNYWIE(SEQ ID NO:3)的VHCDR1；具有氨基酸序列EILPGSDSTNYNEKFKG(SEQ ID NO:4)的VHCDR2和具有氨基酸序列GGSNYGYYFDY(SEQ ID NO:5)的VHCDR3；和(ii)轻链可变域，其包含具有氨基酸序列KASQDVGTAVA(SEQ ID NO:6)的VLCDR1、具有氨基酸序列WASTRHT(SEQ ID NO:7)的VLCDR2和具有氨基酸序列QQYSSYRT(SEQ ID NO:8)的VLCDR3。
2.如权利要求1所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含与(i)和(ii)的重链和轻链CDR区具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的重链和轻链CDR区。
3.如权利要求1所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQID NO:1中所述的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQID NO:2中所述的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合蛋白选自由以下组成的组：单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源缀合抗体；单个可变域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、单链抗体、缺少铰链区的单价抗体、微抗体、双抗体和TandabsTM。
8.如权利要求7所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是A19。
10.如权利要求8或9所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是人源化的。
11.如权利要求1至10中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与ERBB2受体蛋白激酶结合。
12.如权利要求11所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与ERBB2受体蛋白激酶的同种型4结合。
13.如权利要求12所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与ERBB2受体蛋白激酶的截短同种型4结合。
14.如权利要求13所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述截短的同种型4不包含任何疏水区。
15.如权利要求11至14中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与ERBB2受体蛋白激酶上的聚糖结合。
16.如权利要求15所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与ERBB2受体蛋白激酶上的N-联聚糖结合。
17.如权利要求16所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与位于ERBB2受体蛋白激酶的氨基酸位置66、124、187、259、530、571和629中的一个或多个处的N-联聚糖结合。
18.一种抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其与如权利要求1至17中任一项所述的抗原结合蛋白竞争结合ERBB2受体蛋白激酶。
19.如权利要求1至18中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含与其缀合的放射性同位素或细胞毒素。
20.如权利要求19所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述抗体与选自由单甲基瑞奥西汀E(MMEA-1)、mertansine(DM-1)和皂草素组成的组的细胞毒素缀合。
21.如权利要求19或20所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中包含与其缀合的放射性同位素或细胞毒素的所述抗原结合蛋白或抗原结合片段在与ERBB2受体酪氨酸激酶结合后内化到细胞中。
22.一种组合物，其包含生理学上可接受的载体和治疗有效量的如权利要求1至21中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述组合物包含选自贝伐单抗、卡铂、赫赛汀或紫杉醇的另外的活性药物成分。
24.如权利要求1至21中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、宫颈癌和胰腺癌。
26.如权利要求24或25所述的用途，其中所述药物与另外的活性药物成分一起施用。
27.如权利要求24或25所述的用途，其中所述药物与化疗一起施用。
28.如权利要求26或27所述的用途，其中所述另外的药剂或化疗待分开、同时或序贯施用。
29.一种用于检测受试者中的癌症的方法，该方法包括：使获自所述受试者的样品与如权利要求1至21中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段在体外接触；检测所述样品中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合；将所述结合与对照样品中的结合水平相关联以确定所述样品中的结合水平，其中所述样品相对于对照样品在结合水平上的增加指示癌症。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述对照样品来自相同的受试者。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述对照样品来自不同的受试者。
32.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段结合ERBB2受体蛋白激酶。
33.如权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含可检测标签。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述可检测标签选自生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、FITC、PE或Cy染料。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中在选自流式细胞术、组织切片或免疫组织化学的测定中检测所述可检测标签。
36.如权利要求29至35中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、宫颈癌和胰腺癌。
37.用于权利要求29至36中任一项的方法时的试剂盒，其包含如权利要求1至21中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段以及使用说明书。
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