CN112074538A - 结合her2和/或aplp2的抗体和双特异性抗原结合分子、其缀合物和用途 - Google Patents

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Abstract

称为人表皮生长因子2(HER2)的蛋白质在乳腺癌细胞中表达，并且其表达与侵袭性肿瘤生长相关。本发明提供了结合于人HER2(单特异性抗体)或APLP2(单特异性抗体)的新颖全长人(IgG)抗体。本发明还提供了新颖双特异性抗体(bsAb)，所述新颖双特异性抗体结合于HER2与APLP2两者并且在存在表达HER2的肿瘤的情况下经由APLP2复合物介导HER2的内化和降解。描述了包含特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域和特异性结合人HER2的第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子以及ADC。所描述的双特异性ADC能够抑制某些表达HER2的肿瘤的生长，并且可用于治疗乳腺癌和使治疗剂靶向表达HER2的肿瘤细胞为所需的和/或在治疗上有益的病症。举例来说，本发明的双特异性抗体可用于治疗乳腺癌，包括具有IHC2+类别的乳腺癌。本发明还包括抑制体内肿瘤生长的抗HER2抗体药物缀合物。

Description

结合HER2和/或APLP2的抗体和双特异性抗原结合分子、其缀 合物和用途
发明领域
本发明涉及对人表皮生长因子受体2(HER2)具特异性的抗体和其抗原结合片段以及其使用方法。本发明还涉及结合HER2和淀粉样蛋白前体样蛋白2(APLP2)的双特异性抗原结合分子和其使用方法。本发明还涉及抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含抗HER2抗体或抗HER2/抗APLP2双特异性抗体或其片段以及治疗剂(例如细胞毒性药物)。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2)为存在于一些癌细胞表面的酪氨酸激酶受体生长促进蛋白并且与侵袭性疾病相关。约五分之一的乳腺癌过表达HER2。为被认为是HER2阳性的，通常通过两种方法中的一种对肿瘤细胞进行测试：免疫组织化学(IHC)或荧光原位杂交(FISH)。IHC测试结果报道为：0、IHC1+、IHC2+或IHC3+。IHC3+的发现被认为是HER2阳性。IHC2+的发现为不明确的并且典型地通过阳性FISH测试来确认。
HER2为乳腺癌中经过临床验证的抗体-药物缀合物(ADC)靶标。为实现最大抗肿瘤效应，ADC必须特异性结合于HER2并且内化至细胞中，其中ADC加工使得毒素释放至胞质液中。虽然已知高程度的肿瘤特异性和表面表达水平为良好ADC靶标的大体特征，但尚未充分探索ADC靶标的运输特性。
举例来说，缀合至有效毒素美登素的靶向HER2的抗体“DM1”(曲妥珠单抗-艾坦辛(Trastuzumab-emtansine)，或T-DM1)被批准用于治疗转移性乳腺癌。然而，HER2的低效溶酶体运输限制T-DM1对表达非常高水平的HER2(IHC 3+，或FISH放大比率>2)的那些患者的功效。大量工作致力于产生高效诱导表达中等HER2水平(IHC2+)的肿瘤的消退的HER2-ADC。这些工作依赖于使用更有效的毒素和/或增强HER2内化。
APLP2为具有基于酪氨酸的内化信号的单次跨膜蛋白(Uniprot Q06481)。已报道多个APLP2同种型(Li,C.等Cancer Res.2006年2月15日；66(4):1990-9；Pandey,P.等Oncotarget.2016年4月12日；7(15):19430-44.doi:10.18632/oncotarget.7103)。APLP2在正常组织中普遍表达并且被报道在某些癌症中过表达(Pandey,P.等Oncotarget.2015年2月10日；6(4):2064-75.)。与在细胞内囊泡中的亚细胞定位一致，APLP2从质膜高效内化并且被靶向用于快速溶酶体降解。已提出的APLP2生物功能为促进溶酶体靶向以及PCSK9和MHC I类的降解(DeVray,R.M.等J Biol Chem.2013年4月12日；288(15):10805-18.doi:10.1074/jbc.M113.453373.2013年2月19日电子出版.；Tuli,A.等J Biol Chem.2009年12月4日；284(49):34296-307.doi:10.1074/jbc.M109.039727.2009年10月6日电子出版)。
使HER2内化和/或向溶酶体运输增强的抗原结合分子将提供需要特异性靶向和杀死表达HER2的细胞的可用疗法。
发明概要
在第一方面中，本发明提供了结合人HER2和人APLP2的双特异性抗体和其抗原结合片段。根据本发明的此方面的双特异性抗体尤其可用于靶向表达HER2和APLP2的细胞(例如乳腺癌细胞)，刺激双特异性抗体的内化，例如在HER2或抗体的降解和溶酶体运输有益或需要的情况下。举例来说，双特异性抗体可将双特异性抗HER2xAPLP2抗体药物缀合物(ADC)引导至特定的表达HER2的细胞(诸如乳腺肿瘤细胞)的溶酶体中，用于释放药物缀合物和所靶向的细胞毒性。本发明还提供了结合于人HER2的抗体和其抗原结合片段。根据本发明的此方面的抗体尤其可用于靶向表达HER2的细胞。本发明还提供了结合于人APLP2的抗体和其抗原结合片段。根据本发明的此方面的抗体尤其可用于靶向表达APLP2和靶抗原(诸如HER2)的细胞，用于通过APLP2将结合分子快速内化至细胞中。
表1中列出了本发明的示例性抗HER2抗体。表1阐述了示例性抗HER2抗体的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2以及LCDR3)的氨基酸和核酸序列标识符。
本发明提供了包含HCVR的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR包含选自表1中所列的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含LCVR的抗体或其抗原结合片段，所述LCVR包含选自表1中所列的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包含与表1中所列的LCVR氨基酸序列中的任一者配对的表1中所列的HCVR氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了包含HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对含于表1中所列的示例性抗HER2抗体中的任一者内。在某些实施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:2/10(例如H4H135050P2)和18/10(例如H4H13055P2)组成的组。
本发明还提供了包含重链CDR1(HCDR1)的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR1包含选自表1中所列的HCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含重链CDR2(HCDR2)的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR2包含选自表1中所列的HCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含重链CDR3(HCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR3包含选自表1中所列的HCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含轻链CDR1(LCDR1)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR1包含选自表1中所列的LCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含轻链CDR2(LCDR2)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR2包含选自表1中所列的LCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含轻链CDR3(LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR3包含选自表1中所列的LCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述HCDR3和LCDR3氨基酸序列对包含与表1中所列的LCDR3氨基酸序列中的任一者配对的表1中所列的HCDR3氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了包含HCDR3/LCDR3氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段，所述HCDR3/LCDR3氨基酸序列对含于表1中所列的示例性抗HER2抗体中的任一者内。在某些实施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:2/10(例如H4H135050P2)和18/10(例如H4H13055P2)组成的组。
本发明还提供了包含六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述六个CDR的集合含于表1中所列的示例性抗HER2抗体中的任一者内。在某些实施方案中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合选自由SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16(例如H4H13050P2)和20-22-24-12-14-16(例如H4H13055P2)组成的组。
在一个相关实施方案中，本发明提供了包含六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述六个CDR的集合含于如表1中所列的示例性抗HER2抗体中的任一者所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内。举例来说，本发明包括包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合的抗体或其抗原结合片段，所述HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合含于选自由SEQ ID NO:2/10(例如H4H135050P2)和18/10(例如H4H13055P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对内。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术为本领域中熟知的并且可用于鉴定本文所公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR边界的示例性惯例包括例如Kabat定义、Chothia定义以及AbM定义。一般地说，Kabat定义是基于序列变异性，Chothia定义是基于结构环区的位置，而AbM定义为Kabat和Chothia方法间的折中方法。参见例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。
本发明还提供了编码抗HER2抗体或其部分的核酸分子。举例来说，本发明提供了编码表1中所列的HCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列的LCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列的HCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的HCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列的HCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的HCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列的HCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的HCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列的LCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的LCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列的LCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的LCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列的LCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的LCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中HCVR包含三个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列集合如表1中所列的示例性抗HER2抗体中的任一者所定义。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中LCVR包含三个CDR的集合(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合如表1中所列的示例性抗HER2抗体中的任一者所定义。
本发明还提供了编码HCVR与LCVR两者的核酸分子，其中HCVR包含表1中所列的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，并且其中LCVR包含表1中所列的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子包含选自表1中所列的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列，以及选自表1中所列的LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。在根据本发明的此方面的某些实施方案中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中HCVR和LCVR均源自表1中所列的相同抗HER2抗体。
本发明还提供了能够表达包含抗HER2抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。举例来说，本发明包括重组表达载体，所述重组表达载体包含任何上文所提到的核酸分子，即，编码如表1中所阐述的HCVR、LCVR和/或CDR序列中的任一者的核酸分子。本发明范畴内还包括此类载体已引入其中的宿主细胞，以及通过在容许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞来产生抗体或其部分以及回收如此产生的抗体和抗体片段的方法。
本发明包括具有经修饰糖基化模式的抗HER2抗体。在一些实施方案中，用于移除不希望的糖基化位点的修饰可为可用的，或抗体缺乏存在于寡糖链上的海藻糖部分，例如以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shields等(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可进行半乳糖基化的修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含特异性结合HER2的重组人抗体或其片段以及药学上可接受的载体。在一个相关方面中，本发明提供了一种组合物，所述组合物为抗HER2抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二治疗剂为有利地与抗HER2抗体组合的任何剂。本文在别处公开了涉及本发明的抗HER2抗体的额外组合疗法和共制剂。
在另一方面中，本发明提供了用于使用本发明的抗HER2抗体靶向/杀死表达HER2的肿瘤细胞的治疗方法，其中治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本发明的抗HER2抗体的药物组合物。在一些情况下，抗HER2抗体(或其抗原结合片段)可用于治疗乳腺癌，或可通过包括但不限于用于增加ADCC的经修饰Fc结构域(参见例如Shield等(2002)JBC 277:26733)、放射免疫疗法、抗体-药物缀合物或用于增加肿瘤消除效率的其他方法的方法进行修饰以更具细胞毒性。
本发明还包括本发明的抗HER2抗体用于制造用于治疗与表达HER2的细胞有关或由其引起的疾病或病症(例如癌症)的药剂的用途。在一个方面中，本发明涉及一种用于医学中的化合物，所述化合物包含如本文所公开的抗HER2抗体或抗原结合片段或双特异性抗HER2xAPLP2抗体。在一个方面中，本发明涉及一种用于医学中的化合物，所述化合物包含如本文所公开的抗体-药物缀合物(ADC)。
在另一方面中，本发明提供了用于诊断应用(诸如成像试剂)的单特异性抗HER2抗体。
在另一方面中，本发明提供了用于使用本发明的抗APLP2抗体或抗体的抗原结合部分使HER2向溶酶体中内化和/或由溶酶体降解增强的治疗方法，其中治疗方法包括施用治疗有效量的包含抗体的药物组合物。
在另一方面中，本发明提供了一种如通过表面等离子体共振或等效分析所测量以小于10nM的KD结合HER2的抗体或其抗原结合片段。在另一方面中，本发明提供了一种如通过FACS分析或等效分析所测量以小于50nM的EC50结合表达HER2的细胞的抗体或其抗原结合片段。在另一方面中，本发明提供了一种结合表达HER2的细胞并且内化至其溶酶体中的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，表达HER2的细胞具有IHC2+类别。
本发明还提供了一种与参考抗体竞争结合于人HER2的抗体或抗原结合片段，所述参考抗体包含如表1中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在另一方面中，本发明提供了一种与参考抗体竞争结合于人HER2的抗体或抗原结合片段，所述参考抗体包含选自由SEQ IDNO:2/10(例如H4H135050P2)和18/10(例如H4H13055P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
此外，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与参考抗体结合于人HER2上的相同表位，所述参考抗体包含如表1中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在另一方面中，抗体或抗原结合片段与参考抗体结合于人HER2上的相同表位，所述参考抗体包含选自由SEQ ID NO:2/10(例如H4H135050P2)和18/10(例如H4H13055P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
本发明还提供了一种结合人HER2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：具有如表1中所阐述的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)；以及具有如表1中所阐述的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR。在另一方面中，分离的抗体或抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:2/10(例如H4H135050P2)和18/10(例如H4H13055P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR。在另一方面中，分离的抗体或抗原结合片段包含分别选自由SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16(例如H4H13050P2)和20-22-24-12-14-16(例如H4H13055P2)组成的组的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。在另一方面中，本发明提供了一种结合人HER2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：(a)重链可变区(HCVR)，所述重链可变区具有选自由SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24组成的组的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区具有选自由SEQ ID NO:12、14、16组成的组的氨基酸序列。在另一方面中，分离的抗体或抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:2/10(例如H4H135050P2)和18/10(例如H4H13055P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
根据另一方面，本发明提供了包含抗HER2抗体或其抗原结合片段以及治疗剂(例如细胞毒性剂)的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，如本文所论述，抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂经由接头共价连接。在各个实施方案中，抗HER2抗体或抗原结合片段可为本文所描述的抗HER2抗体或片段中的任一者。
在另一方面中，本发明提供了结合于人淀粉样蛋白前体样蛋白2(APLP2)的抗体和其抗原结合片段，所述抗体和抗原结合片段对APLP2具有低亲和力。当靶标和APLP2由相同细胞(例如肿瘤细胞)表达时，根据本发明此方面的抗体尤其可用于特定地引导另一靶标(例如HER2)的内化和/或降解。然而，归因于低亲和力，单独此类抗APLP2抗体保持非活性，例如在不存在与靶向臂的缔合的情况下(例如作为双特异性抗体，在由靶向臂结合的靶标与APLP2不由细胞表达的情况下)不能结合。因而，本发明的一个方面提供了对肿瘤相关抗原与肿瘤细胞上的APLP2的亲合力驱动配对有效的双特异性抗原结合分子。因而，本发明的此方面还提供了结合人APLP2和人靶标(例如HER2)的双特异性抗体和其抗原结合片段。根据本发明的此方面的双特异性抗体尤其可用于靶向表达APLP2和HER2的细胞(例如乳腺癌细胞)，刺激双特异性抗体的内化，例如在APLP2或抗体的降解和/或溶酶体运输有益或需要的情况下。举例来说，双特异性抗体可将双特异性抗HER2xAPLP2抗体药物缀合物(ADC)引导至特定的表达HER2的细胞(诸如乳腺肿瘤细胞)的溶酶体中，用于释放药物缀合物和所靶向的细胞毒性。
表2中列出了本发明的示例性抗APLP2抗体。表2阐述了示例性抗APLP2抗体的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2以及LCDR3)的氨基酸和核酸序列标识符。
本发明提供了包含HCVR的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR包含选自表2中所列的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含LCVR的抗体或其抗原结合片段，所述LCVR包含选自表2中所列的LCVR氨基酸序列的氨基酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包含与表2中所列的LCVR氨基酸序列中的任一者配对的表2中所列的HCVR氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了包含HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对含于表2中所列的示例性抗APLP2抗体中的任一者内。在某些实施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:26/10(例如H4xH21362P2)、34/10(例如H4xH21387P2)以及42/10(例如H4xH21371P2)组成的组。
本发明还提供了包含重链CDR1(HCDR1)的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR1包含选自表2中所列的HCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含重链CDR2(HCDR2)的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR2包含选自表2中所列的HCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含重链CDR3(HCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR3包含选自表2中所列的HCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含轻链CDR1(LCDR1)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR1包含选自表2中所列的LCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含轻链CDR2(LCDR2)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR2包含选自表2中所列的LCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含轻链CDR3(LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR3包含选自表2中所列的LCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述HCDR3和LCDR3氨基酸序列对包含与表2中所列的LCDR3氨基酸序列中的任一者配对的表2中所列的HCDR3氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了包含HCDR3/LCDR3氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段，所述HCDR3/LCDR3氨基酸序列对含于表2中所列的示例性抗APLP2抗体中的任一者内。在某些实施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:26/10(例如H4xH21362P2)、34/10(例如H4xH21387P2)以及42/10(例如H4xH21371P2)组成的组。
本发明还提供了包含六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述六个CDR的集合含于表2中所列的示例性抗APLP2抗体中的任一者内。在某些实施方案中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合选自由SEQ ID NO:28-30-32-12-14-16(例如H4xH21362P2)、36-38-40-12-14-16(例如H4xH21387P2)以及44-46-48-12-14-16(例如H4xH21371P2)组成的组。
在一个相关实施方案中，本发明提供了包含六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，所述六个CDR的集合含于如表2中所列的示例性抗APLP2抗体中的任一者所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内。举例来说，本发明包括包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合的抗体或其抗原结合片段，所述HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合含于选自由26/10(例如H4xH21362P2)、34/10(例如H4xH21387P2)以及42/10(例如H4xH21371P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对内。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术为本领域中熟知的并且可用于鉴定本文所公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR边界的示例性惯例包括例如Kabat定义、Chothia定义以及AbM定义。一般地说，Kabat定义是基于序列变异性，Chothia定义是基于结构环区的位置，而AbM定义为Kabat和Chothia方法间的折中方法。参见例如Kabat,"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。
本发明还提供了编码抗APLP2抗体或其部分的核酸分子。举例来说，本发明提供了编码表2中所列的HCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明来还提供了编码表2中所列的LCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表2中所列的HCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的HCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表2中所列的HCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的HCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表2中所列的HCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的HCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表2中所列的LCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的LCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表2中所列的LCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的LCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码表2中所列的LCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的LCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中HCVR包含三个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列集合如表2中所列的示例性抗APLP2抗体中的任一者所定义。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中LCVR包含三个CDR的集合(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合如表2中所列的示例性抗APLP2抗体中的任一者所定义。
本发明还提供了编码HCVR与LCVR两者的核酸分子，其中HCVR包含表2中所列的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，并且其中LCVR包含表2中所列的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子包含选自表2中所列的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列，以及选自表2中所列的LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。在根据本发明此方面的某些实施方案中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中HCVR与LCVR均源自表2中所列的相同抗APLP2抗体。
本发明还提供了重组表达载体，所述重组表达载体能够表达包含抗APLP2抗体的重链或轻链可变区的多肽。举例来说，本发明包括重组表达载体，所述重组表达载体包含任何上文所提到的核酸分子，即，编码如表2中所阐述的HCVR、LCVR和/或CDR序列中的任一者的核酸分子。本发明范围内还包括此类载体已引入其中的宿主细胞，以及通过在容许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞来产生抗体或其部分以及回收如此产生的抗体和抗体片段的方法。
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗APLP2抗体。在一些实施方案中，用于移除不希望的糖基化位点的修饰可为可用的，或抗体缺乏存在于寡糖链上的海藻糖部分，例如以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可进行半乳糖基化的修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含特异性结合APLP2的重组人抗体或其片段以及药学上可接受的载体。在一个相关方面中，本发明提供了一种组合物，所述组合物为抗APLP2抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二治疗剂为有利地与抗APLP2抗体组合的任何剂。本文在别处公开了涉及本发明的抗APLP2抗体的额外组合疗法和共制剂。
在另一方面中，本发明提供了用于使用本发明的抗APLP2抗体靶向/杀死表达APLP2的肿瘤细胞的治疗方法，其中治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本发明的抗APLP2抗体的药物组合物。在一些情况下，抗APLP2抗体(或其抗原结合片段)可用于治疗乳腺癌，或可通过包括但不限于用于增加ADCC的经修饰Fc结构域(参见例如Shield等(2002)JBC 277:26733)、放射免疫疗法、抗体-药物缀合物或用于增加肿瘤消除效率的其他方法的方法进行修饰以更具细胞毒性。
本发明还包括本发明的抗APLP2抗体用于制造用于治疗与表达APLP2的细胞有关或由其引起的疾病或病症(例如癌症)的药剂的用途。在一个方面中，本发明涉及一种用于医学中的化合物，所述化合物包含如本文所公开的抗APLP2抗体或抗原结合片段或双特异性抗APLP2xAPLP2抗体。在一个方面中，本发明涉及一种用于医学中的化合物，所述化合物包含如本文所公开的抗体-药物缀合物(ADC)。
在另一方面中，本发明提供了用于诊断应用(诸如成像试剂)的单特异性抗APLP2抗体。
在另一方面中，本发明提供了用于使用本发明的抗APLP2抗体或抗体的抗原结合部分使APLP2向溶酶体中内化和/或由溶酶体降解增强的治疗方法，其中治疗方法包括施用治疗有效量的包含抗体的药物组合物。
在另一方面中，本发明提供了一种如通过表面等离子体共振或等效分析所测量以大于100nM的KD结合表达APLP2的细胞的抗体或其抗原结合片段。在另一方面中，本发明提供了一种如通过FACS分析所测量以大于100nM的EC50结合表达APLP2的细胞的抗体或其抗原结合片段。在另一方面中，本发明提供了一种在抗体还结合于相同细胞上所表达的HER2的事件中结合表达APLP2的细胞并且内化至其溶酶体中的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种与参考抗体竞争结合于人APLP2的抗体或抗原结合片段，所述参考抗体包含如表2中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在另一方面中，本发明提供了一种与参考抗体竞争结合于人APLP2的抗体或抗原结合片段，所述参考抗体包含选自由SEQID NO:26/10(例如H4xH21362P2)、34/10(例如H4xH21387P2)以及42/10(例如H4xH21371P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
此外，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与参考抗体结合于人APLP2上的相同表位，所述参考抗体包含如表2中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在另一方面中，抗体或抗原结合片段与参考抗体结合于人APLP2上的相同表位，所述参考抗体包含选自由SEQ ID NO:26/10(例如H4xH21362P2)、34/10(例如H4xH21387P2)以及42/10(例如H4xH21371P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
本发明还提供了一种结合人APLP2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：具有如表2中所阐述的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)；以及具有如表2中所阐述的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR。在另一方面中，分离的抗体或抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:26/10(例如H4xH21362P2)、34/10(例如H4xH21387P2)以及42/10(例如H4xH21371P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR。在另一方面中，分离的抗体或抗原结合片段包含分别选自由SEQ ID NO:28-30-32-12-14-16(例如H4xH21362P2)、36-38-40-12-14-16(H4xH21387P2)以及44-46-48-12-14-16(例如H4xH21371P2)组成的组的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。在另一方面中，本发明提供了一种结合人APLP2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：(a)重链可变区(HCVR)，所述重链可变区具有选自由SEQ ID NO:28、30、32、36、38、40、44、46以及48组成的组的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区具有选自由SEQ ID NO:12、14、16组成的组的氨基酸序列。在另一方面中，分离的抗体或抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:26/10(例如H4xH21362P2)、34/10(例如H4xH21387P2)以及42/10(例如H4xH21371P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
根据另一方面，本发明提供了包含抗APLP2抗体或其抗原结合片段以及治疗剂(例如细胞毒性剂)的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，如本文所论述，抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂经由接头共价连接。在各个实施方案中，抗APLP2抗体或抗原结合片段可为本文所描述的抗APLP2抗体或片段中的任一者。
根据另一方面，本发明提供了结合HER2和APLP2的双特异性抗原结合分子(例如抗体)。此类双特异性抗原结合分子在本文中也称为“抗HER2xAPLP2结合蛋白”、“抗HER2/抗APLP2双特异性分子”、“抗APLP2/抗HER2双特异性分子”或“HER2xAPLP2 bsAb”。抗HER2/抗APLP2双特异性分子的抗HER2部分可用于靶向表达HER2(例如乳腺肿瘤)的细胞(例如肿瘤细胞)，而双特异性分子的抗APLP2部分可用于所结合的HER2分子的内化和/或降解，这可使得药物缀合物在适当时释放。HER2和APLP2同时结合于肿瘤细胞(例如乳腺癌细胞)上促进抗HER2xAPLP2结合分子的内化，并且当缀合至药物时，促进药物的内化，这可介导药物对所靶向的肿瘤细胞的细胞毒性。因此，本发明的抗HER2/抗APLP2双特异性分子尤其可用于治疗与表达HER2的肿瘤(例如乳腺癌)有关或由其引起的疾病和病症。
根据本发明此方面的双特异性抗原结合分子包含特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域和特异性结合HER2的第二抗原结合结构域。本发明包括其中每个抗原结合结构域包含与轻链可变区(LCVR)配对的重链可变区(HCVR)的抗HER2/抗APLP2双特异性分子(例如双特异性抗体、双特异性结合分子等)。在本发明的某些示例性实施方案中，抗APLP2抗原结合结构域和抗HER2抗原结合结构域各自包含与共同LCVR配对的不同的独特HCVR。举例来说，如本文实施例2中所说明，双特异性抗体被构建成包含特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域包含与源自抗HER2抗体的LCVR(例如包括于抗HER2抗原结合结构域中的相同LCVR)配对的源自抗APLP2抗体的HCVR；以及特异性结合HER2的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域包含源自抗HER2抗体的HCVR/LCVR。换句话说，在本文所公开的示例性分子中，来自抗APLP2抗体的HCVR与来自抗HER2抗体的LCVR配对形成特异性结合APLP2(但不结合HER2)的抗原结合结构域。在此类实施方案中，第一和第二抗原结合结构域包含独特的抗APLP2和抗HER2 HCVR，但拥有共同的LCVR。例如SEQ ID NO:10中示出了此LCVR的氨基酸序列，并且SEQ ID NO:12-14-16中分别示出了对应CDR(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)的氨基酸序列。可使用基因修饰的小鼠来产生完全人双特异性抗原结合分子，所述完全人双特异性抗原结合分子包含与相同轻链缔合的两条不同重链，所述相同轻链包含源自两个不同人轻链可变区基因区段中的一者的可变结构域。或者，可使可变重链与一条共同的轻链配对并且通过在宿主细胞中重组表达来产生。因而，本发明的抗体可包含与单一重排轻链缔合的免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，轻链包含源自人Vκ1-39基因区段或Vκ3-20基因区段的可变结构域。在其他实施方案中，轻链包含源自经重排具有人Jκ5或人Jκ1基因区段的人Vκ1-39基因区段的可变结构域。
本发明提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含如表2中所阐述的HCVR氨基酸序列中的任一者、LCVR氨基酸序列中的任一者、HCVR/LCVR氨基酸序列对中的任一者、重链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列中的任一者或轻链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列中的任一者。
此外，本发明提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含如本文表2和表3中所阐述的HCVR氨基酸序列中的任一者。特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域还可包含如本文表2中所阐述的LCVR氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含如本文表2中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对中的任一者。本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含如本文表2中所阐述的重链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列中的任一者，和/或如本文表1中所阐述的轻链CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列中的任一者。
根据某些实施方案，本发明提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含具有如本文表2中所阐述的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列的重链可变区(HCVR)。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含具有如本文表1、表2以及表3中所阐述的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列的轻链可变区(LCVR)。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含如本文表1、表2以及表3中所阐述的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)结构域，所述重链CDR3结构域具有如本文表2中所阐述的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及轻链CDR3(LCDR3)结构域，所述轻链CDR3结构域具有如本文表1、表2以及表3中所阐述的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
在某些实施方案中，特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含如本文表2和表3中所阐述的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子，其中特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域包含重链CDR1(HCDR1)结构域，所述重链CDR1结构域具有如本文表2和表3中所阐述的氨基酸，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；重链CDR2(HCDR2)结构域，所述重链CDR2结构域具有如2和3中所阐述的氨基酸，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；重链CDR3(HCDR3)结构域，所述重链CDR3结构域具有如2和3中所阐述的氨基酸，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；轻链CDR1(LCDR1)结构域，所述轻链CDR1结构域具有如本文表1、表2以及表3中所阐述的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；轻链CDR2(LCDR2)结构域，所述轻链CDR2结构域具有如本文表1、表2以及表3中所阐述的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列，以及轻链CDR3(LCDR3)结构域，所述轻链CDR3结构域具有如表1、表2以及表3中所阐述的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明的某些非限制性、示例性抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子包括特异性结合APLP2的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含分别具有如本文表2和3中所阐述的氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。
本发明还提供了一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域包含来自包含如表2和表3中所阐述的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)；以及来自包含如表1、表2和/或表3中所阐述的氨基酸序列的共同轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2以及LCDR3)。
在另一方面中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域包含来自选自由SEQ ID NO:26、34以及42组成的组的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)；以及来自包含选自由SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2以及LCDR3)。
本发明还提供了一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2以及A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2以及A1-LCDR3)，其中A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:28、36以及44组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:30、38以及46组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:32、40以及48组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A1-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在另一方面中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域包含选自由SEQ ID NO:26/10、34/10以及42/10组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR。
在另一方面中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2以及A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2以及A1-LCDR3)，并且其中特异性结合人HER2的第二抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2以及A2-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2以及A2-LCDR3)；其中A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:28、36以及44组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:30、38以及46组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:32、40以及48组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A1-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；并且其中A2-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:4和20组成的组的氨基酸序列；A2-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:6和22组成的组的氨基酸序列；A2-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:8和24组成的组的氨基酸序列；A2-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A2-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A2-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在更多实施方案中，本发明的示例性抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子包括双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域包含HCVR，所述HCVR包含具有选自由SEQ ID NO:28-30-32、36-38-40以及44-46-48组成的组的氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合HER2的第二抗原结合结构域包含重链可变区(HCVR)，所述重链可变区具有选自由SEQ ID NO:2和18组成的组的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合HER2的第二抗原结合结构域包含轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区具有选自由SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合HER2的第二抗原结合结构域包含选自由SEQ ID NO:2/10和18/10组成的组的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性分子，其中特异性结合HER2的第二抗原结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)结构域，所述重链CDR3结构域具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及轻链CDR3(LCDR3)结构域，所述轻链CDR3结构域具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
在某些实施方案中，特异性结合HER2的第二抗原结合结构域包含选自由SEQ IDNO:18/10组成的组的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明还提供了抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子，其中特异性结合HER2的第二抗原结合结构域包含重链CDR1(HCDR1)结构域，所述重链CDR1结构域具有选自由SEQID NO:4和20组成的组的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；重链CDR2(HCDR2)结构域，所述重链CDR2结构域具有选自由SEQ ID NO:6和22组成的组的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；重链CDR3(HCDR3)结构域，所述重链CDR3结构域具有选自由SEQ ID NO:8和24组成的组的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；轻链CDR1(LCDR1)结构域，所述轻链CDR1结构域具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及轻链CDR2(LCDR2)结构域，所述轻链CDR2结构域具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及轻链CDR3(LCDR3)结构域，所述轻链CDR3结构域具有SEQID NO:16的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
本发明的某些非限制性、示例性抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子包括特异性结合HER2的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含分别具有选自由SEQ IDNO:20-22-24-12-14-16组成的组的氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。
在一个相关实施方案中，本发明包括抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子，其中特异性结合HER2的第二抗原结合结构域包含重链和轻链CDR结构域，所述重链和轻链CDR结构域含于选自由SEQ ID NO:18/10组成的组的重链和轻链可变区(HCVR/LCVR)序列内。
在另一方面中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含结合人APLP2的第一抗原结合结构域以及结合人HER2的第二抗原结合结构域，其中第二抗原结合结构域源自本发明的抗HER2抗体中的任一者的抗体或抗原结合片段。在另一方面中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域以及特异性结合人HER2的第二抗原结合结构域。
本发明还提供了一种双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子结合表达人APLP2的人细胞和/或表达食蟹猴APLP2的食蟹猴细胞。在另一方面中，双特异性抗原结合分子结合表达人HER2的人细胞和/或表达食蟹猴HER2的食蟹猴细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子抑制带有人乳腺癌异种移植物的免疫受损小鼠中的肿瘤生长。
在某些实施方案中，通过基于种系序列与亲本抗体序列之间的差异逐步置换亲本的氨基酸残基来制备本发明的抗APLP2抗体、其抗原结合片段以及双特异性抗体。因而，可通过置换CDR的中氨基酸残基以提供甚至更低亲和力的与APLP2的结合来对抗APLP2抗体进行修饰。
在一些实施方案中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人HER2，所述参考抗原结合蛋白包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2以及A2-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2以及A2-LCDR3)，其中A2-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:20组成的组的氨基酸序列；A2-HCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；A2-HCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；A2-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A2-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A2-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人HER2，所述参考抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人APLP2，所述参考抗原结合蛋白包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2以及A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2以及A1-LCDR3)，其中A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:28、36以及44组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:30、38以及46组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:32、40以及48组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A1-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人APLP2，所述参考抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:26、34以及42组成的组的氨基酸序列；以及轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人APLP2，所述参考抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:26、34以及42组成的组的氨基酸序列，以及轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；并且其中第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人HER2，所述参考抗原结合蛋白包含重链可变区(HCVR)，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:2和18组成的组的氨基酸序列，以及轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含抗HER2抗原结合分子或抗HER2/抗APLP2双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载体或稀释剂。本发明还提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用包含抗HER2抗原结合分子或抗HER2/抗APLP2双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌以及卵巢癌。在一些情况下，癌症为乳腺癌。在一些情况下，乳腺癌为IHC2+乳腺癌。
在另一方面中，本发明提供了编码本文所公开的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子的HCVR、LCVR或CDR序列中的任一者的核酸分子，包括包含如本文表1和表2中所阐述的多核苷酸序列的核酸分子，以及包含呈任何功能组合或排列(诸如在表3中找到的组合)形式的如表1和表2中所阐述的多核苷酸序列中的两者或更多者的核酸分子。如同通过在容许产生抗体的条件下培养宿主细胞来产生抗体并且回收所产生的抗体的方法一般，带有本发明的核酸的重组表达载体以及此类载体已引入其中的宿主细胞也由本发明涵盖。
本发明包括抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子，其中上述特异性结合APLP2的抗原结合结构域中的任一者与上述特异性结合HER2的抗原结合结构域中的任一者组合、连接或以其他方式相关联以形成结合APLP2和HER2的双特异性抗原结合分子。
本发明包括具有经修饰糖基化模式的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子。在一些应用中，用于移除不希望的糖基化位点的修饰可为可用的，或抗体缺乏存在于寡糖链上的海藻糖部分，例如以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其他应用中，可进行半乳糖基化的修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
根据另一方面，本发明提供了包含抗HER2xAPLP2抗体或其抗原结合片段以及治疗剂(例如细胞毒性剂)的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，如本文所论述，抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂经由接头共价连接。在各个实施方案中，抗HER2xAPLP2抗体或抗原结合片段可为本文所描述的抗HER2xAPLP2抗体或片段中的任一者。
在一些实施方案中，细胞毒性剂选自澳瑞他汀(auristatin)、美登木素(maytansinoid)、土布来辛(tubulysin)、富山霉素(tomaymycin)、加利车霉素(calicheamicin)或多拉司他汀(dolastatin)衍生物。在一些情况下，细胞毒性剂为选自MMAE或MMAF的澳瑞他汀，或选自DM1或DM4的美登木素。在一些实施方案中，细胞毒性剂为具有如本文所论述的式子的结构的美登木素。
在一些实施方案中，细胞毒性剂为具有以下结构的美登木素：
Figure BDA0002753904480000301
在一些实施方案中，细胞毒性剂为具有以下结构的美登木素：
Figure BDA0002753904480000311
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含抗HER2 x抗APLP2抗原结合蛋白或抗HER2抗体或其片段，以及
Figure BDA0002753904480000312
其中
Figure BDA0002753904480000313
为连接抗体或其片段的键。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含抗HER2 x抗APLP2抗原结合蛋白或抗HER2抗体或其片段，以及
Figure BDA0002753904480000314
其中
Figure BDA0002753904480000315
为连接抗体或其片段的键。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含抗HER2 x抗APLP2抗原结合蛋白或抗HER2抗体或其片段，以及
Figure BDA0002753904480000321
它们的混合物，
其中
Figure BDA0002753904480000322
为连接抗体或其片段的键。
在一些实施方案中，所述键经由半胱氨酸残基的硫组成部分接触抗体或其片段。
在一些实施方案中，所述键经由赖氨酸残基的氮组成部分接触抗体或其片段。
在上文或本文中所论述的抗体-药物缀合物的各个实施方案中的任一者中，抗体-药物缀合物可包含每单位抗HER2 x抗APLP2抗原结合蛋白或抗HER2抗体或其片段1至10单位细胞毒性剂。
在另一方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所公开的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载体。在一个相关方面中，本发明提供了一种组合物，所述组合物其为抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子与第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二治疗剂为有利地与抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子组合的任何剂。本文在别处详细论述了可有利地与抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子组合的示例性剂。
在另一方面中，本发明提供了用于使用本发明的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子靶向/杀死表达HER2的肿瘤细胞的治疗方法，其中治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本发明的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子的药物组合物。
本发明还包括本发明的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子在制造用于治疗与表达HER2的细胞有关或由其引起的疾病或病症的药剂中的用途。
通过阅读随后的具体实施方式，其他实施方案将变得显而易见。
附图简述
图1示出了用抗APLP2、抗HER2或抗GAPDH抗体染色的各种组织的西方墨点。
图2示出了双特异性抗HER2xAPLP2抗体与表达非常低至高水平的HER2的乳腺癌细胞的结合(上部图)以及抗HER2xAPLP2抗体细胞表面结合(MFI/核.APLP2xHER2(H4H25018D)；y轴)与HER2或APLP2总细胞表达(西方墨点(WB)规范化的强度；x轴)的相关性(下部图)。
图3示出了在不存在或存在可溶性HER2(HER2.mmh)和/或APLP2(APLP2.mmh)的情况下双特异性抗HER2xAPLP2抗体与表达HER2的MDA-MB-361细胞的结合。
图4示出了在与对应单特异性抗体结合之后细胞受体APLP2和HER2的溶酶体内化(上部图)以及在添加蛋白质合成抑制剂环己酰胺(CHX)之后APLP2和HER2受体的降解(下部图)。
图5示出了用抗HER2或抗肌动蛋白抗体染色的T47D乳腺癌细胞系与对照抗体、抗HER2抗体或双特异性抗HER2xAPLP2抗体(25014、25018、25020、25017、25019以及25021)一起孵育之后的总溶解产物的西方墨点。
图6示出了乳腺癌细胞单层(上部图和中部图)或乳腺癌细胞球状体(下部图)对双特异性抗HER2xAPLP2抗体(25014、25018、25020)的内化。
图7在体外杀伤曲线中示出了一组乳腺癌细胞系中的同型对照DM1缀合抗体、HER2/T对照DM1缀合抗体、双特异性抗HER2xAPLP2(25018和25019)DM1缀合抗体以及双特异性APLP2x对照DM1缀合抗体。
图8提供了用同型对照DM1缀合抗体、HER2/T对照DM1缀合抗体或双特异性抗HER2xAPLP2(25018或25019)DM1缀合抗体处理的小鼠中的JIMT-1肿瘤体积。
图9提供了用同型对照DM1缀合抗体、HER2/T对照DM1缀合抗体或双特异性抗HER2xAPLP2(25018)DM1缀合抗体处理的小鼠中的MDA-MB-361肿瘤体积。
图10提供了APLP2hu/hu小鼠中双特异性抗HER2xAPLP2抗体(25014、25018、252020)和同型对照抗体的药代动力学型态。
具体实施方式
本文提供了双特异性抗HER2xAPLP2抗体使HER2的内化、溶酶体运输以及降解增加的论证。此外，在体外和体内，与T-DM1相比，双特异性抗HER2xAPLP2抗体药物缀合物(ADC)显著更有效。另外，APLP2臂的低亲和力使得双特异性抗HER2xAPLP-ADC展示缺乏或具有最小HER2表达的细胞的最小内化和细胞毒性。发现APLP2在所测试的大多数乳腺癌细胞系、PDX模型以及患者样品中表达(数据未示出)，表明双特异性抗HER2xAPLP2-ADC可有益于广泛范围的HER2阳性乳腺癌患者，包括被认为是IHC 2+的那些患者。
在详细描述本发明之前，应了解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因而方法和条件可改变。还应了解，本文中所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在具限制性，因为本发明的范围将仅受随附权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域一般技术人员通常所理解相同的含义。术语“约”当用于提到特定所叙述数值时，意味着所述值可与所叙述的值相差不超过1％。举例来说，表述“约100”包括99和101以及其间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然类似或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料均可用于实践或测试本发明，但现描述优选方法和材料。本说明书中提到的所有专利、申请以及非专利公布以全文引用的方式并入本文中。
定义
表述“APLP2”包括人中由APLP2基因编码并且具有如SEQ ID NO:50中所阐述的氨基酸序列的蛋白质。APLP2为普遍表达的并且为葡萄糖和胰岛素稳态的重要调节剂。除非明确指定为来自非人物种，否则本文中所有提到蛋白质、多肽以及蛋白质片段旨在指人型式的相应蛋白质、多肽或蛋白质片段。因此，除非指定为来自非人物种，例如“小鼠APLP2”、“猴APLP2”等，否则表述“APLP2”意指人APLP2。
短语“结合APLP2的抗体”或“抗APLP2抗体”包括特定地识别单个APLP2亚单元(例如ε、δ、γ或ξ)的抗体和其抗原结合片段，以及特定地识别两个APLP2亚单元的二聚复合物(例如γ/ε、δ/ε以及ξ/ξAPLP2二聚体)的抗体和其抗原结合片段。本发明的抗体和抗原结合片段可结合可溶性APLP2和/或细胞表面表达的APLP2。可溶性APLP2包括天然APLP2蛋白以及重组APLP2蛋白变体，诸如单聚和二聚APLP2构建体，所述变体缺乏跨膜结构域或以其他方式未与细胞膜缔合。
表述“细胞表面表达的APLP2”是指一种或多种APLP2蛋白，所述一种或多种APLP2蛋白位于细胞表面/在体外或体内在细胞表面表达，使得APLP2蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的细胞外侧并且可接近抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的APLP2”包括在功能T细胞受体情形中含于细胞的膜中的APLP2蛋白。表述“细胞表面表达的APLP2”包括表达为细胞表面上的均二聚体或异二聚体(例如γ/ε、δ/ε以及ξ/ξAPLP2二聚体)的一部分的APLP2蛋白。表述“细胞表面表达的APLP2”还包括在不存在其他APLP2链类型的情况下单独在细胞的表面表达的APLP2链(例如APLP2-ε、APLP2-δ或APLP2-γ)。“细胞表面表达的APLP2”可包含在通常表达APLP2蛋白的细胞的表面表达的APLP2蛋白或由其组成。或者，“细胞表面表达的APLP2”可包含在表面通常不表达人APLP2但已经历人工工程化从而在表面表达APLP2的细胞的表面表达的APLP2蛋白或由其组成。
表述“HER2”或“人表皮生长因子受体2”是指人表皮生长因子受体家族的成员。已证实此致癌基因的扩增或过表达在某些侵袭型乳腺癌的发展和进展中起重要作用。近年来，蛋白质已变为用于约30％的乳腺癌患者的疗法的重要生物标记物和靶标。以SEQ IDNO:49阐述HER2的氨基酸序列。除非明确指定为来自非人物种，否则本文中所有提到蛋白质、多肽以及蛋白质片段旨在指人型式的相应蛋白质、多肽或蛋白质片段。因此，除非指定为来自非人物种，例如“小鼠HER2”、“猴HER2”等，否则表述“HER2”意指人HER2。
短语“结合HER2的抗体”或“抗HER2抗体”包括特定地识别HER2的抗体和其抗原结合片段。
术语“抗原结合分子”包括抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。
术语“亲合力”是指抗原结合分子达到靶标齿合的阈值以实现它的所需效应的能力。在多个靶抗原和多特异性抗原结合分子的情形中，短语“亲合力驱动结合”或“亲合力驱动配对”是指如下作用机制，其中多特异性抗原结合分子提供至少两个单价结合臂，并且第一结合臂(或多个第一结合臂)以高亲和力结合于第一靶抗原。第二结合臂(或多个第二结合臂)以低亲和力结合第二靶抗原，使得除非两种抗原彼此靠近，诸如存在于相同细胞上，否则第二结合臂不结合第二靶抗原。因此，高亲和力结合于第一靶标抗原使低亲和力臂对第二结合臂的亲合力增加并且介导与第二靶标的结合(Rhoden,J.J.等,2016年5月20日,JBiol Chem.291,11337-11347,于2016年3月28日首次出版doi:10.1074/jbc.M116.714287；Jarantow,S.W.等,2015年10月9日,J Biol Chem.290(41):24689-704.doi:10.1074/jbc.M115.651653.2015年8月10日电子出版)。在一个实例中，HER2 x APLP2双特异性抗体展示高HER2亲和力(例如3-5nM)和低APLP2亲和力(例如145-976nM)。所提出的作用机制提供使用高亲和力HER2臂结合于HER2阳性肿瘤细胞的HER2 x APLP2双特异性抗体(bsAb)。这使低亲和力APLP2臂对APLP2的亲合力增加并且介导与第二靶标的结合从而提供所需的HER2内化。因此，在APLP2内化后，整个复合物(即，APLP2靶标、HER2 x APLP2 bsAb以及HER2靶标)内化用于溶酶体降解。
观测到，HER2xAPLP2 bsAb与靶细胞相互作用的程度由它与HER2的相互作用决定。在不受任一理论约束的情况下，HER2xAPLP2 bsAb的高亲和力HER2臂与HER2受体之间的初始相互作用使bsAb的局部细胞表面浓度增加。随后，bsAb以其低亲和力APLP2臂接触APLP2，因此双受体亲合力使得形成APLP2-HER2xAPLP2 bsAb-HER2复合物；复合物随后经历APLP2介导的内化由细胞表面进入溶酶体区室。
术语“抗体”是指包含至少一个特异性结合于特定抗原(例如HER2或APLP2)或与其相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)以及其多聚体(例如IgM)的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2以及CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变异性区域，其间穿插有称为构架区(FR)的较保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗HER2抗体或抗APLP2抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或可为天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR的并行分析来定义。
术语“抗体”还包括完全抗体分子的抗原结合片段。术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。可使用诸如蛋白水解消化或重组基因工程化技术等任何适合的标准技术例如从完全抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段，重组基因工程化技术涉及编码抗体可变结构域和(任选)恒定结构域的DNA的操纵和表达。此类DNA为已知的和/或为从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)轻易可获得的或可为合成的。可以化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成适合的构型，或引入密码子；形成半胱氨酸残基；修饰、添加或去除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的互补决定区(CDR)，诸如CDR3肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4肽。表述“抗原结合片段”内还涵盖其他工程化分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、双抗体、三抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体(nanobody)(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)以及鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段将典型地包含至少一个可变结构域。可变结构域可具有任何尺寸或氨基酸组成，并且通常将包含至少一个CDR，所述至少一个CDR靠近一个或多个构架序列或与其同框。在具有与VL结构域相关联的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以任何适合的排列相对于彼此定位。举例来说，可变区可为二聚的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单聚VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有共价键联至至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。本发明的抗体的抗原结合片段内可发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型，包括上文所列的示例性构型中的任一者中，可变结构域和恒定结构域可彼此直接键联或可通过完全或部分铰链或接头区键联。铰链区可由至少2(例如5、10、15、20、40、60或更多)个氨基酸组成，这在单个多肽分子中在相邻的可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性键联。此外，本发明抗体的抗原结合片段可包含上文所列的可变结构域和恒定结构域构型中的任一者彼此和/或与一个或多个单聚VH或VL结构域(例如通过一个或多个二硫键)非共价缔合的均二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
就完全抗体分子而言，抗原结合片段可为单特异性或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段将典型地包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合于单独的抗原或相同抗原上的不同表位。任何多特异性抗体模式(包括本文所公开的示例性双特异性抗体模式)均可适合于使用本领域中可用的常规技术在本发明的抗体的抗原结合片段的背景下使用。
本发明的抗体可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)发挥功能。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指本发明的抗体在存在补体的情况下对表达抗原的细胞的溶解。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞以及巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且由此引起靶细胞的溶解。可使用本领域中熟知和可获得的分析来测量CDC和ADCC。(参见例如美国专利号5,500,362和5,821,337以及Clynes等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗体的恒定区在抗体固定补体并且介导细胞依赖性细胞毒性的能力中为重要的。因此，可基于是否需要抗体介导细胞毒性来选择抗体的同型。
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗HER2单特异性抗体或抗HER2/抗APLP2双特异性抗体为人抗体。术语“人抗体”是指具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可例如在CDR和尤其CDR3中包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已接枝至人构架序列上的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体可为重组人抗体。术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、形成或分离的所有人抗体，诸如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)；从重组、组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)；从对于人免疫球蛋白基因来说为转基因动物的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、形成或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体经受体外诱变(或当使用对于人Ig序列来说为转基因动物的动物时，经受体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为虽然源自人种系VH和VL序列并且与其有关，但在体内可能不天然存在于人抗体种系谱内的序列。
人抗体可以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键结合在一起。在第二种形式中，二聚体不经由链间二硫键键联，而是形成由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。这些形式即使在亲和力纯化之后也极难分离。
在各种完整IgG同型中第二种形式频繁出现是归因于但不限于与抗体的铰链区同型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可使第二种形式的出现显著减少(Angal等(1993)Molecular Immunology 30:105)，达到使用人IgG1铰链典型地所观测到的水平。本发明涵盖在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，这可能是例如制备中用于改善所需抗体形式的产率所需的。
本发明的抗体可为分离的抗体。“分离的抗体”是指已从天然环境的至少一种组分鉴定和分离和/或回收的抗体。举例来说，已与有机体的至少一种组分或从抗体天然存在或天然产生的组织分离或移出的抗体为用于本发明目的的“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体为已经受至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
本发明还包括结合HER2的单臂抗体。术语“单臂抗体”是指包含单个抗体重链和单个抗体轻链的抗原结合分子。本发明的单臂抗体可包含如表1中所阐述的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一者。
本文所公开的抗HER2或抗HER2/抗APLP2抗体与衍生出抗体的对应种系序列相比可在重链和轻链可变结构域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。可通过将本文所公开的氨基酸序列与可获自例如公共抗体序列数据库的种系序列相比较来轻易地确定此类突变。本发明包括源自本文所公开的氨基酸序列中的任一者的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生出抗体的种系序列的一个或多个对应残基，或另一人类种系序列的一个或多个对应残基，或一个或多个对应种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域技术人员以本文所公开的重链和轻链可变区序列为起始物质，可容易地产生许多包含一个或多个个别种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有构架区和/或CDR残基均突变回在衍生出抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如仅在FR1的头8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其他实施方案中，一个或多个构架和/或CDR残基中的一者或多者突变为不同种系序列(即，不同于最初衍生出抗体的种系序列的种系序列)的一个或多个对应残基。此外，本发明的抗体可含有构架区和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基保留或突变为不同种系序列的对应残基。在获得含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段后，可容易地测试一种或多种所需特性，诸如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。本发明内涵盖了以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段。
本发明还包括包含具有一个或多个保守取代的本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的变体的抗HER2或抗HER2/抗APLP2抗体。举例来说，本发明包括具有相对于本文表1中所阐述或如本文表2和表3中所描述的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗HER2或抗HER2/抗APLP2抗体。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可结合于抗原上的不同区域并且可具有不同生物效应。表位可为构象或线性的。构象表位通过使来自线性多肽链的不同区段的氨基酸在空间上连接来产生。线性表位为由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
当提到核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上同一”表明当以适当核苷酸插入或缺失与另一核酸(或它的互补链)最佳比对时，如通过如下文所论述的任何熟知序列同一性算法(诸如FASTA、BLAST或Gap)所测量，在至少约95％并且更优选至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子可编码与由参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本上类似的氨基酸序列的多肽。
在应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上类似”意味着当诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空隙权重最佳比对时，两个肽序列拥有至少95％序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％序列同一性。优选地，不同一的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”为氨基酸残基由侧链(R基团)具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的取代。一般来说，保守氨基酸取代将不会基本上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列彼此因保守取代而不同的情况下，可调高序列同一性百分比或相似度以校正取代的保守性。用于进行此调节的手段为本领域技术人员熟知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，所述文献以引用的方式并入本文中。侧链具有类似化学特性的氨基酸组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸以及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸盐和谷氨酸盐，以及(7)含硫的侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守置换为在以引用的方式并入本文中的Gonnet等(1992)Science 256:1443-1445中所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
多肽的序列相似性也称为序列同一性，典型地使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失以及其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配类似序列。举例来说，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit等程序，这些程序可在默认参数情况下用于测定紧密相关的多肽(诸如来自不同物种的有机体的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。还可使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和检索序列之间最佳重叠的区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。当将本发明的序列与含有来自不同有机体的大量序列的数据库相比较时，另一优选算法为计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，所述文献各自以引用的方式并入本文中。
种系突变
与衍生出抗体的对应种系序列相比，本文所公开的抗APLP2抗体可在重链可变结构域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。
本发明还包括抗APLP2抗体和其抗原结合片段，所述抗APLP2抗体和其抗原结合片段源自本文所公开的氨基酸序列中的任一者，其中一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生出抗体的种系序列的一个或多个对应残基，或另一人种系序列的一个或多个对应残基，或一个或多个对应种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)，并且与APLP2抗原具有弱结合或没有可检测的结合。本文在表2中描述了若干识别APLP2的此类示例性抗体。
此外，本发明的抗体可含有构架区和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基保留或突变为不同种系序列的对应残基。在获得含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段后，可测试一种或多种所需特性，诸如改善的结合特异性、弱的或降低的结合亲和力、改善或增强的药代动力学特性、降低的免疫原性等。本发明内涵盖了鉴于本公开的指导以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段。
本发明还包括包含具有一个或多个保守取代的本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的变体的抗APLP2或抗HER2抗体。举例来说，本发明包括具有相对于本文表1、表2以及表3中所阐述的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗APLP2或抗HER2抗体。与衍生出个别抗原结合结构域的对应种系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子在重链和轻链可变结构域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，同时维持或改善与例如APLP2的所需弱结合以至没有可检测的结合。“保守氨基酸取代”为氨基酸残基由侧链(R基团)具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的取代。通常，保守的氨基酸取代将基本上不改变蛋白质一般来说，保守氨基酸取代将不会基本上改变蛋白质的功能特性，即在抗APLP2结合分子的情况下氨基酸取代维持或改善所需弱结合亲和力以至没有可检测的结合亲和力。侧链具有类似化学特性的氨基酸组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸以及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸盐和谷氨酸盐，以及(7)含硫的侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守置换为在Gonnet等(1992)Science 256:1443-1445中所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明还包括抗原结合分子，所述抗原结合分子包含具有与本文所公开的HCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者基本上同一的HCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合域，同时维持或改善对APLP2抗原的所需弱亲和力。当提到氨基酸序列时，术语“基本同一性”或“基本上同一”意味着当诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空隙权重进行最佳比对时，两个氨基酸序列拥有至少95％序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％序列同一性。优选地，不同一的残基位置因保守氨基酸取代而不同。在两个或更多个氨基酸序列彼此因保守取代而不同的情况下，可调高序列同一性百分比或相似度以校正取代的保守性。用于进行此调节的手段为本领域技术人员熟知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。
多肽的序列相似性也称为序列同一性，典型地使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失以及其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配类似序列。举例来说，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit等程序，这些程序可在默认参数情况下用于测定紧密相关的多肽(诸如来自不同物种的有机体的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。还可使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和检索序列之间最佳重叠的区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。当将本发明的序列与含有来自不同有机体的大量序列的数据库相比较时，另一优选算法为计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
在获得含有一个或多个种系突变的抗原结合结构域后，使用一种或多种体外分析测试降低的结合亲和力。虽然典型地通过测试对抗原的高(即强)结合亲和力来筛选识别特定抗原的抗体用于其目的，但本发明的抗体展现弱结合或没有可检测的结合。以此一般方式获得的包含一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子也涵盖于本发明内并且被发现作为亲合力驱动肿瘤疗法为有利的。
可由通过本文所描述的方法对本发明的抗体进一步修饰实现意外的益处，例如改善的药代动力学特性和对患者的低毒性。
抗体的结合特性
在抗体、免疫球蛋白、抗体结合片段或含Fc的蛋白质结合于例如预定抗原(诸如细胞表面蛋白)或其片段的情形中，术语“结合”典型地是指最少两个实体或分子结构之间的相互作用或缔合，诸如抗体-抗原相互作用。
举例来说，当使用抗原作为配体并且使用抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc的蛋白质作为分析物(或抗配体(antiligand))在BIAcore 3000仪器中通过例如表面等离子体共振(SPR)技术测定时，结合亲和力典型地对应于KD值为约10-7M或更小，诸如约10-8M或更小，诸如约10-9M或更小。还常规地使用基于细胞的结合策略，诸如荧光活化细胞分选(FACS)结合分析，并且提供关于细胞表面表达的蛋白质的结合表征数据。FACS数据与诸如放射性配体竞争结合和SPR等其他方法良好地相关(Benedict,CA,J Immunol Methods.1997,201(2):223-31；Geuijen,CA等J Immunol Methods.2005,302(1-2):68-77)。
因此，本发明的抗体或抗原结合蛋白结合于预定抗原或细胞表面分子(受体)，亲和力对应于比它结合于非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力低至少十倍的KD值。根据本发明，抗体亲和力对应于等于非特异性抗原或比非特异性抗原低十倍的KD值可被认为是不可检测的结合，然而此类抗体可与第二抗原结合臂配对以产生本发明的双特异性抗体。
术语“KD”或“KD”(摩尔(M))是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，或抗体或抗体结合片段结合于抗原的解离平衡常数。KD与结合亲和力之间存在反比关系，因此KD值越小，亲和力越高，即越强。因此，术语“更高的亲和力”或“更强的亲和力”与更高的形成相互作用的能力并且因此与更小的KD值有关，而相反地术语“更低的亲和力”或“更弱的亲和力”与更低的形成相互作用的能力并且因此与更大的KD值有关。在一些情况下，特定分子(例如抗体)对其相互作用配偶体分子(例如抗原X)的结合亲和力(或KD)与分子(例如抗体)对另一相互作用配偶体分子(例如抗原Y)的结合亲和力相比更高可表述为通过用较大的KD值(较低或较弱的亲和力)除以较小的KD(较高或更强的亲和力)所确定的结合比率，例如视情况而定表述为结合亲和力大5倍或10倍。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合分子或其缀合物以大于它与APLP2的结合亲和力10倍的结合亲和力(KD值)结合于HER2。因而，双特异性分子对HER2具有与它对APLP2的结合亲和力相比强得多的结合亲和力。在一些情况下，通过37℃下的表面等离子体共振分析或等效分析来测量结合亲和力。
术语“kd”(秒-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数，或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。所述值也称为k解离值。
术语“ka”(M-1x秒-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数，或抗体或抗体结合片段的缔合速率常数。
术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数，或抗体或抗体结合片段的缔合平衡常数。通过用ka除以kd来获得缔合平衡常数。
术语“EC50”或“EC50”是指半数最大有效浓度，半数最大有效浓度包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间一半的反应的抗体浓度。EC50大体上表示观测到最大效应的50％的抗体浓度。在某些实施方案中，EC50值等于如通过例如FACS结合分析所测定本发明抗体给出与表达APLP2或肿瘤相关抗原的细胞的半数最大结合的浓度。因此，在增加的EC50或半数最大有效浓度值的情况下观测到降低或较弱的结合。
在一个实施方案中，减少的结合可定义为实现与半数最大量靶细胞的结合的EC50抗体浓度增加。
双特异性抗原结合分子
本发明的抗体可为单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可对一个靶多肽的不同表位具特异性或可含有对超过一个靶多肽具特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗HER2单特异性抗体或抗HER2/抗APLP2双特异性抗体可键联至另一功能分子(例如另一肽或蛋白质)或与其共表达。举例来说，抗体或其片段可在功能上键联(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以其他方式)至一个或多个其他分子实体，诸如另一抗体或抗体片段以产生具有第二或额外结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本文中使用表述“抗APLP2抗体”或“抗HER2抗体”旨在包括单特异性抗APLP2或抗HER2抗体以及包含APLP2结合臂和HER2结合臂的双特异性抗体两者。因此，本发明包括免疫球蛋白的一个臂结合人APLP2并且免疫球蛋白的另一个臂对人HER2具特异性的双特异性抗体。APLP2结合臂可包含如本文表1、表2以及表3中所阐述的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一者。
在某些实施方案中，APLP2结合臂结合于人APLP2并且诱导APLP2和与其结合的抗体的内化。在某些实施方案中，APLP2结合臂弱结合于人APLP2并且诱导APLP2和与其结合的抗体的内化。在其他实施方案中，在双特异性或多特异性抗体的情形中，APLP2结合臂弱结合于人APLP2并且诱导杀死表达肿瘤相关抗原的细胞。在其他实施方案中，APLP2结合臂与人和食蟹猴(猴)APLP2弱结合或缔合，然而结合相互作用通过本领域中已知的体外分析不可检测。HER2结合臂可包含如本文表1中所阐述的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一者。HER2结合臂可包含如体外亲和力结合分析(诸如本文实施例4中所描述的表面等离子体共振分析)中所测量结合亲和力小于10nM KD的任何抗HER2抗体。
根据某些示例性实施方案，本发明包括特异性结合APLP2和HER2的双特异性抗原结合分子。此类分子在本文中可称为例如“抗APLP2/抗HER2”或“抗APLP2xHER2”或“APLP2xHER2”双特异性分子或其他类似术语(例如抗HER2/抗APLP2)。
除非指定为来自非人物种(例如“小鼠HER2”、“猴HER2”等)，否则术语“HER2”是指人HER2蛋白。人HER2蛋白具有SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列。
前述特异性结合APLP2和HER2的双特异性抗原结合分子可包含如通过体外亲和力结合分析所测量以诸如展现大于约40或50nM的KD的弱结合亲和力结合于APLP2的抗APLP2抗原结合分子。在一些情况下，APLP2结合臂以大于约100nM、大于约200nM、大于约300nM、大于约400nM、大于约500nM或大于约1μM(例如如表面等离子体共振分析中所测量)的KD或EC50结合APLP2。在一些情况下，第一抗原结合结构域特异性结合APLP2(例如以弱亲和力或零可测量亲和力特异性结合人APLP2和食蟹猴APLP2中的任一者或两者)。
如通过体外结合分析所测量，特异性结合APLP2和HER2的双特异性抗原结合分子可以比双特异性抗原结合分子结合于HER2弱超过10倍的结合结合于APLP2。在一些情况下，如通过体外结合分析(诸如表面等离子体共振分析或基于细胞的结合分析(即FACS))所测量，双特异性抗原结合分子以弱超过约20倍或弱25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍或200倍的KD或EC50结合于APLP2。
表述“抗原结合分子”是指包含单独的至少一个互补决定区(CDR)或至少一个互补决定区与一个或多个额外CDR和/或构架区(FR)的组合或由其组成的蛋白质、多肽或分子复合物特异性结合于特定抗原。在某些实施方案中，抗原结合分子为抗体或抗体的片段，如本文在别处定义的所述术语。
表述“双特异性抗原结合分子”是指至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗原结合分子内的每个抗原结合结构域包含单独的至少一个CDR，或至少一个CDR与一个或多个额外CDR和/或FR的组合，特异性结合于特定抗原。在本发明的情形中，第一抗原结合结构域特异性结合第一抗原(例如APLP2)，并且第二抗原结合结构域特异性结合第二独特抗原(例如HER2)。
在本发明的某些示例性实施方案中，双特异性抗原结合分子为双特异性抗体。双特异性抗体的每个抗原结合结构域包含重链可变结构域(HCVR)和轻链可变结构域(LCVR)。在双特异性抗原结合分子包含第一和第二抗原结合结构域(例如双特异性抗体)的情形中，可使用前缀“A1”来指定第一抗原结合结构域的CDR并且可使用前缀“A2”来指定第二抗原结合结构域的CDR。因此，第一抗原结合结构域的CDR在本文中可称为A1-HCDR1、A1-HCDR2以及A1-HCDR3；并且第二抗原结合结构域的CDR在本文中可称为A2-HCDR1、A2-HCDR2以及A2-HCDR3。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域彼此可直接或间接连接以形成本发明的双特异性抗原结合分子。或者，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可各自连接至单独的多聚化结构域。一个多聚化结构域与另一多聚化结构域的缔合有助于两个抗原结合结构域之间的缔合，由此形成双特异性抗原结合分子。“多聚化结构域”为具有与相同或类似结构或构造的第二多聚化结构域缔合的能力的任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸。举例来说，多聚化结构域可为包含免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚化组分的非限制性实例为免疫球蛋白(包含CH2-CH3结构域)的Fc部分，例如选自同型IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4的IgG的Fc结构域，以及每个同型组内的任何同种异型。
本发明的双特异性抗原结合分子将典型地包含两个多聚化结构域，例如各自个别地为单独抗体重链的一部分的两个Fc结构域。第一和第二多聚化结构域可属于相同IgG同型，诸如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。或者，第一和第二多聚化结构域可属于不同IgG同型，诸如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施方案中，多聚化结构域为长度为1个至约200个氨基酸并且含有至少一个半胱氨酸残基的Fc片段或氨基酸序列。在其他实施方案中，多聚化结构域为半胱氨酸残基，或短的含半胱氨酸的肽。其他多聚化结构域包括包含亮氨酸拉链、螺旋-环基序或卷曲螺旋基序或由其组成的肽或多肽。
可使用任何双特异性抗体模式或技术来制备本发明的双特异性抗原结合分子。举例来说，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可在功能上键联(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以其他方式)至一个或多个其他分子实体，诸如具有第二抗原结合特异性的另一抗体或抗体片段以产生双特异性抗原结合分子。可用于本发明情形中的特定示例性双特异性模式包括但不限于例如基于scFv的或双抗体双特异性模式、IgG-scFv融合物、双可变结构域(DVD)-Ig、四体瘤、杵入臼结构、共同的轻链(例如具有杵入臼结构的共同的轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG以及Mab2双特异性模式(关于前述模式的综述，参见例如Klein等2012,mAbs 4:6,1-11，以及其中所引用的参考文献)。
在本发明的双特异性抗原结合分子的情形中，多聚化结构域(例如Fc结构域)与野生型、天然存在的型式的Fc结构域相比可包含一个或多个氨基酸变化(例如插入、缺失或取代)。举例来说，本发明包括在Fc结构域中包含一个或多个修饰从而使得修饰的Fc结构域具有Fc与FcRn之间的修饰的结合相互作用(例如增强或减少)的双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，双特异性抗原结合分子在CH2或CH3区中包含修饰，其中所述修饰使在酸性环境中(例如在pH值在约5.5至约6.0范围内的内体中)Fc结构域对FcRn的亲和力增加。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)以及256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)以及434的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)以及308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254以及256(例如252Y、254T以及256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
本发明还包括包含第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域的双特异性抗原结合分子，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此因至少一个氨基酸而不同，并且其中至少一个氨基酸差异使双特异性抗体与蛋白质A的结合与缺乏所述氨基酸差异的双特异性抗体相比有所减少。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白质A并且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白质A结合的突变，诸如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。第二CH3可还包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。参见例如美国专利号8,586,713。第二CH3内可发现的其他修饰包括：在IgG1抗体的情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(根据IMGT；根据EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)；在IgG2抗体的情况下的N44S、K52N以及V82I(IMGT；根据EU为N384S、K392N以及V422I)；以及在IgG4抗体的情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(根据IMGT；根据EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。
在某些实施方案中，Fc结构域可为源自超过一种免疫球蛋白同型的嵌合组合Fc序列。举例来说，嵌合Fc结构域可包含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4 CH2区的部分或全部CH2序列，以及源自人IgG1、人IgG2或人IgG4的部分或全部CH3序列。嵌合Fc结构域还可含有嵌合铰链区。举例来说，嵌合铰链可包含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上部铰链”序列与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下部铰链”序列的组合。可包括在本文阐述的抗原结合分子中的任一者中的嵌合Fc结构域的特定实例从N端到C端包含：[IgG4 CH1]-[IgG4上部铰链]-[IgG2下部铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG4 CH3]。可包括在本文阐述的抗原结合分子中的任一者中的嵌合Fc结构域的另一实例从N端到C端包含：[IgG1 CH1]-[IgG1上部铰链]-[IgG2下部铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG1 CH3]。2014年8月28日公布的美国公布2014/0243504中描述了可包括在本发明的抗原结合分子中的任一者中的嵌合Fc结构域的这些和其他实例，所述美国公布以全文并入本文中。具有这些一般结构排列的嵌合Fc结构域以及其变体可具有改变的Fc受体结合，这又影响Fc效应功能。
在某些实施方案中，本发明提供了一种抗体重链，其中重链恒定区(CH)区域包含与以下中的任一者至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65或SEQ IDNO:78。在一些实施方案中，重链恒定区(CH)区域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65或SEQ IDNO:78。
在其他实施方案中，本发明提供了一种抗体重链，其中Fc结构域包含与以下中的任一者至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77。在一些实施方案中，Fc结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77。
序列变体
与衍生出个别抗原结合结构域的对应种系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可在重链和轻链可变结构域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。可通过将本文所公开的氨基酸序列与可获自例如公共抗体序列数据库的种系序列相比较来轻易地确定此类突变。本发明的抗原结合分子可包含源自本文所公开的示例性氨基酸序列中的任一者的抗原结合结构域，其中一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生出抗体的种系序列的一个或多个对应残基，或另一人种系序列的一个或多个对应残基，或一个或多个对应种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域技术人员以本文所公开的重链和轻链可变区序列为起始物质，可容易地产生许多包含一个或多个个别种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有构架和/或CDR残基均突变回在最初衍生出抗原结合结构域的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如仅在FR1的头8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其他实施方案中，一个或多个构架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即，不同于最初衍生出抗原结合结构域的种系序列的种系序列)的一个或多个对应残基。此外，抗原结合结构域可在构架区和/或CDR区内含有两个或更多个种系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基保留或突变为不同种系序列的对应残基。在获得含有一个或多个种系突变的抗原结合结构域后，可容易地测试一种或多种所需特性，诸如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。本发明内涵盖以此一般方式获得的包含一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子。
本发明还包括一个或两个抗原结合结构域包含本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的具有一个或多个保守取代的变体的抗原结合分子。举例来说，本发明包括如下抗原结合分子，所述抗原结合分子包含具有相对于本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域。“保守氨基酸取代”为氨基酸残基由侧链(R基团)具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代的取代。一般来说，保守氨基酸取代将不会基本上改变蛋白质的功能特性。侧链具有类似化学特性的氨基酸组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸以及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸盐和谷氨酸盐，以及(7)含硫的侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守置换为在以引用的方式并入本文中的Gonnet等(1992)Science 256:1443-1445中所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明还包括如下抗原结合分子，所述抗原结合分子包含具有与本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者基本上同一的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域。当提到氨基酸序列时，术语“基本同一性”或“基本上同一”意味着当诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空隙权重进行最佳比对时，两个氨基酸序列拥有至少95％序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％序列同一性。优选地，不同一的残基位置因保守氨基酸取代而不同。在两个或更多个氨基酸序列彼此因保守取代而不同的情况下，可调高序列同一性百分比或相似度以校正取代的保守性。用于进行此调节的手段为本领域技术人员熟知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，所述文献以引用的方式并入本文中。
多肽的序列相似性也称为序列同一性，典型地使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失以及其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配类似序列。举例来说，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit等程序，这些程序可在默认参数情况下用于测定紧密相关的多肽(诸如来自不同物种的有机体的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。还可使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和检索序列之间最佳重叠的区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。当将本发明的序列与含有来自不同有机体的大量序列的数据库相比较时，另一优选算法为计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，所述文献各自以引用的方式并入本文中。
pH依赖性结合
本发明包括具有pH值依赖性结合特征的抗HER2抗体以及抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子。举例来说，与中性pH值相比，在酸性pH值下，本发明的抗HER2抗体可展现减少的与HER2结合。或者，与中性pH值相比，在酸性pH值下，本发明的抗HER2抗体可展现增强的与HER2的结合。表述“酸性pH值”包括小于约6.2的pH值，例如约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小。表述“中性pH值”意指约7.0至约7.4的pH值。表述“中性pH值”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35以及7.4的pH值。
在某些情况下，“与中性pH值相比在酸性pH值下减少的结合”按照在酸性pH值下抗体结合于其抗原的KD值与在中性pH值下抗体结合于其抗原的KD值的比率进行表述(或反之亦然)。举例来说，如果抗体或其抗原结合片段展现约3.0或更大的酸性/中性KD比率，那么出于本发明的目的，可认为抗体或其抗原结合片段展现“与中性pH值相比在酸性pH值下减少的与HER2的结合”。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD比率可为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
可例如通过针对与中性pH值相比在酸性pH值下降低(或增强)的与特定抗原的结合对抗体群体进行筛选来获得具有pH值依赖性结合特征的抗体。另外，在氨基酸水平对抗原结合结构域的修饰可产生具有pH值依赖性特征的抗体。举例来说，通过将抗原结合结构域(例如CDR内)的一个或多个氨基酸用组氨酸残基取代，可获得相对于中性pH值在酸性pH值下具有减少的抗原结合的抗体。
包含Fc变体的抗体
根据本发明的某些实施方案，提供了抗HER2抗体和抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子，所述抗HER2抗体和抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子包含含有增强或减少例如与中性pH值相比在酸性pH值下抗体与FcRn受体的结合的一个或多个突变的Fc结构域。举例来说，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗体，其中所述一个或多个突变使在酸性环境中(例如在pH值在约5.5至约6.0范围内的内体中)Fc结构域对FcRn的亲和力增加。此类突变可使得当向动物施用时抗体的血清半衰期增加。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)以及256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)以及434的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)以及308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254以及256(例如252Y、254T以及256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
举例来说，本发明包括抗HER2抗体和抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子，所述抗HER2抗体和抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子包含Fc结构域，所述Fc结构域含有选自由以下组成的组的一对或多对或一组或多组突变：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T以及256E(例如M252Y、S254T以及T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。本发明范围内涵盖了前述Fc结构域突变的所有可能的组合以及本文所公开的抗体可变结构域内的其他突变。
抗体和双特异性抗原结合分子的生物学特征
本发明包括以高亲和力(例如纳摩尔至亚纳摩尔KD值)结合人HER2的抗体和其抗原结合片段。
本发明还包括抑制带有人乳腺癌异种移植物的免疫受损小鼠中的肿瘤生长的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子。(参见例如实施例12和13)。
本发明包括以中等或低亲和力结合人APLP2的抗体和其抗原结合片段，这取决于治疗剂背景和所需的特定靶向特性。举例来说，在其中一个臂结合APLP2并且另一个臂结合靶抗原(例如HER2)的双特异性抗原结合分子的情形中，可能需要靶抗原结合臂以高亲和力结合靶抗原，而抗APLP2臂仅以中等或低亲和力结合APLP2。以此方式，可实现使抗原结合分子优先靶向表达靶抗原的细胞，同时避免一般/未靶向的APLP2结合以及随后与此相关的有害副作用。
本发明包括能够同时结合于人APLP2和人HER2的双特异性抗原结合分子(例如双特异性抗体)。如适合的体外结合分析中所测量，与表达APLP2的细胞相互作用的结合臂可具有弱结合以至没有可检测的结合。可通过荧光活化细胞分选(FACS)评估双特异性抗原结合分子结合表达APLP2和/或HER2的细胞的程度。
本发明还包括如使用FACS结合分析或基本上类似的分析所测定以约1nM与50nM之间的EC50值结合于表达HER2的细胞以及细胞系(例如导管乳腺腺癌T47D细胞)的抗体、其抗原结合片段以及双特异性抗体，FACS结合分析测量抗体与细胞膜结合的抗原的相互作用。在某些实施方案中，如使用FACS结合分析或基本上类似的分析所测定，抗体、其抗原结合片段以及双特异性抗体以约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约小于约15nM、约10nM、约5nM、4nM、约3nM或约2nM、约1nM的EC50值结合于表达HER2的细胞和细胞系(例如T47D细胞)。
本发明包括以弱(即低)亲和力或甚至零可检测亲和力结合人APLP2的抗体、其抗原结合片段以及双特异性抗体。根据某些实施方案，本发明包括如通过表面等离子体共振所测量以大于约100nM的KD结合人APLP2(例如在37℃下)的抗体和抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，如通过表面等离子体共振(例如mAb捕获或抗原捕获模式)或基本上类似的分析所测量，本发明的抗体或抗原结合片段以大于约大于约110nM、至少120nM、大于约130nM、大于约140nM、大于约150nM、至少160nM、大于约170nM、大于约180nM、大于约190nM、大于约200nM、大于约250nM、大于约300nM、大于约400nM、大于约500nM、大于约600nM、大于约700nM、大于约800nM、大于约900nM或大于约1μM的KD或零可检测亲和力结合APLP2。
本发明包括以弱(即低)亲和力或甚至零可检测亲和力结合猴(即食蟹猴)APLP2的抗体、其抗原结合片段以及双特异性抗体。
本发明包括如通过如本文实施例3所定义的分析模式或基本上类似的分析所测量结合于表达人HER2的细胞(例如T47D细胞)并且由其内化的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子。本发明包括对结合于人HER2具特异性的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，如通过如本文实施例3所定义的分析模式或基本上类似的分析所测量，本发明的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子结合HEK293细胞中瞬时表达的人HER2。在某些实施方案中，如通过如本文实施例3所定义的分析模式或基本上类似的分析所测量，本发明的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子不结合HEK293细胞中瞬时表达的人HER1、人HER2或人HER4。
本发明包括能够抑制表达HER2(例如JIMT-1)的肿瘤生长的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子(参见例如实施例10)。举例来说，根据某些实施方案，提供了抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子，其中如例如如本文实施例10中所阐述使用标准卡板测量法在受试者中所检测，当在肿瘤植入后46天时测量时，与施用同型对照双特异性抗体的动物相比，例如以约0.1mg/kg或约0.01mg/kg的剂量)单次施用使得肿瘤尺寸减小。
本发明还包括抑制体内HER2阳性乳腺癌异种移植模型中的肿瘤生长的抗HER2抗体药物缀合物(参见例如实施例12和13，或在基本上类似的分析中)。在某些实施方案中，提供了抗HER2抗体与化合物I的药物缀合物，其中在肿瘤植入之后第13天以10、20或40mg/kg施用的一个剂量抑制体内HER2阳性乳腺癌异种移植模型中的肿瘤生长。在某些实施方案中，提供了抗HER2抗体与化合物I的药物缀合物，其中在植入之后第14天以5或20mg/kg施用的一个剂量抑制体内HER2阳性乳腺癌异种移植模型中的JIMT-1和/或MDA-MB-361肿瘤生长。在某些实施方案中，提供了抗HER2抗体与化合物I的药物缀合物，其中在植入之后第17天以150μg/kg施用的一个剂量抑制体内HER2阳性乳腺癌异种移植模型中的JIMT-1和/或MDA-MB-361肿瘤生长。在其他实施方案中，提供了抗HER2抗体与化合物II的药物缀合物，其中在植入之后第29天以至少2.5mg/kg施用的一个剂量抑制体内HER2阳性乳腺癌异种移植模型中的JIMT-1和/或MDA-MB-361肿瘤生长。
表位定位和相关技术
APLP2和/或HER2上与本发明的抗原结合分子结合的表位可由APLP2或HER2蛋白的3个或更多个(例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)氨基酸的单个相邻序列组成。或者，表位可由APLP2或HER2的多个非相邻氨基酸(或氨基酸序列)组成。本发明的抗体可与单个APLP2链(例如APLP2-ε、APLP2-δ或APLP2-γ)内所含的氨基酸相互作用，或可与两个或更多个不同APLP2链上的氨基酸相互作用。术语“表位”是指与抗体分子的可变区中称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可结合于抗原上的不同区域并且可具有不同生物效应。表位可为构象或线性的。构象表位通过使来自线性多肽链的不同区段的氨基酸在空间上连接来产生。线性表位为由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
可使用本领域技术人员已知的各种技术来确定抗体的抗原结合结构域是否“与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断分析(诸如Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)所描述的常规交叉阻断分析)、丙氨酸扫描突变分析、肽墨点分析(Reineke,2004,MethodsMol Biol 248:443-463)以及肽裂解分析。此外，可采用诸如表位切除、表位提取以及抗原的化学修饰等方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。可用于鉴定与抗体的抗原结合结构域相互作用的多肽内的氨基酸的另一方法为通过质谱法检测的氢/氘交换。一般地说，氢/氘交换法涉及对所关注的蛋白质进行氘标记，随后使抗体结合于氘标记的蛋白质。接着，将蛋白质/抗体复合物转移至水中以允许在除由抗体保护的残基(这些残基仍为氘标记的)外的所有残基处发生氢-氘交换。在抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，由此揭示对应于与抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记的残基。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。还可将抗原/抗体复合物的X-射线晶体照像术用于表位定位目的。
本发明还包括与本文所描述的特定示例性抗体(例如包含如本文表1中所阐述的氨基酸序列中的任一者的抗体)中的任一者结合于相同表位的抗HER2抗体。同样地，本发明还包括与本文所描述的特定示例性抗体(例如包含如本文表1中所阐述的氨基酸序列中的任一者的抗体)中的任一者竞争结合于HER2的抗HER2抗体。
本发明还包括如下双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含以低亲和力或可检测结合亲和力特异性结合人APLP2和/或食蟹猴APLP2的第一抗原结合结构域，以及特异性结合人HER2的第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域与本文所描述的特定示例性APLP2特异性抗原结合结构域(例如包含如本文表2中所阐述的氨基酸序列中的任一者的抗体)中的任一者结合于APLP2上的相同表位，和/或其中第二抗原结合结构域与本文所描述的特定示例性HER2特异性抗原结合结构域中的任一者结合于HER2上的相同表位。
同样地，本发明还包括如下双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含特异性结合人APLP2的第一抗原结合结构域和特异性结合人HER2的第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域与本文所描述的特定示例性APLP2特异性抗原结合结构域中的任一者竞争结合于APLP2，和/或其中第二抗原结合结构域与本文所描述的特定示例性HER2特异性抗原结合结构域中的任一者竞争结合于HER2。
通过使用本领域中已知的常规方法可容易地确定特定抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合结构域与本发明的参考抗原结合分子结合于相同表位还是关于结合发生竞争。举例来说，为确定测试抗体是否与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合于HER2(或APLP2)上的相同表位，首先允许参考双特异性分子结合于HER2蛋白(或APLP2蛋白)。接着，评估测试抗体结合于HER2(或APLP2)分子的能力。如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合之后能够结合于HER2(或APLP2)，那么可得出以下结论：测试抗体结合于HER2(或APLP2)的不同于参考双特异性抗原结合分子的表位。另一方面，如果测试抗体在参考双特异性抗原结合分子饱和结合之后不能结合于HER2(或APLP2)分子，那么测试抗体可结合于HER2(或APLP2)的与由本发明的参考双特异性抗原结合分子结合的表位相同的表位。然后可进行额外的常规实验(例如肽突变和结合分析)以确认所观测的测试抗体缺乏结合是否事实上归因于与参考双特异性抗原结合分子结合于相同的表位或者是否空间阻断(或另一现象)引起了所观测的结合的缺乏。可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中可用的任何其他定量或定性抗体结合分析来进行此类别的实验。根据本发明的某些实施方案，如果如在竞争结合分析中所测量，例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗原结合蛋白将另一者的结合抑制了至少50％，但优选为75％、90％或甚至99％，那么两种抗原结合蛋白结合于相同(或重叠)的表位(参见例如Junghans等,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。或者，如果抗原中大体上所有减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变均减少或消除另一者的结合，那么两种抗原结合蛋白被认为结合于相同的表位。如果仅减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一者的结合，那么两种抗原结合蛋白被认为具有“重叠表位”。
为确定抗体或其抗原结合结构域是否与参考抗原结合分子竞争结合，以两种方向进行上文所描述的结合方法：在第一种方向中，允许参考抗原结合分子在饱和条件下结合于HER2蛋白(或APLP2蛋白)，随后评估测试抗体与HER2(或APLP2)分子的结合。在第二种方向中，允许测试抗体在饱和条件下结合于HER2(或APLP2)分子，随后评估参考抗原结合分子与HER2(或APLP2)分子的结合。如果在两种方向中，仅第一(饱和)抗原结合分子能够结合于HER2(或APLP2)分子，那么得出以下结论：测试抗体和参考抗原结合分子竞争结合于HER2(或APLP2)。如本领域技术人员将了解，与参考抗原结合分子竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合于相同的表位，而是可能通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参考抗体的结合。
抗原结合结构域的制备和双特异性分子的构建
可通过本领域中已知的任何抗体产生技术来制备对特定抗原具特异性的抗原结合结构域。在获得对两种不同抗原(例如APLP2和HER2)具特异性的两种不同抗原结合结构域后，可使其相对于彼此适当排列以使用常规方法产生本发明的双特异性抗原结合分子。(本文在别处提供了可用于构建本发明的双特异性抗原结合分子的示例性双特异性抗体模式的论述)。在某些实施方案中，本发明的多特异性抗原结合分子的个别组分(例如重链和轻链)中的一者或多者源自嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。用于制备此类抗体的方法为本领域中熟知的。举例来说，可使用VELOCIMMUNETM技术制备本发明的双特异性抗原结合分子的重链和/或轻链中的一者或多者。使用VELOCIMMUNETM技术(或任何其他人抗体产生技术)，最初分离具有人可变区和小鼠恒定区的针对特定抗原(例如APLP2或HER2)的高亲和力嵌合抗体。针对包括亲和力、选择性、表位等所需特征对抗体进行表征和选择。将小鼠恒定区用所需人恒定区置换以产生可合并至本发明的双特异性抗原结合分子中的完全人重链和/或轻链。
可使用基因工程化动物来制备人双特异性抗原结合分子。举例来说，可使用基因修饰小鼠，基因修饰小鼠不能重排以及表达内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列，其中小鼠仅表达由在内源性小鼠κ基因座处可操作地连接至小鼠κ恒定基因的人免疫球蛋白序列编码的一个或两个人轻链可变结构域。可使用此类基因修饰小鼠来分离重链和轻链可变区以产生完全人双特异性抗原结合分子。因而，完全人双特异性抗原结合分子包含与相同轻链缔合的两条不同重链。(参见例如US2011/0195454)。完全人的是指在抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域的每个多肽的整个长度上包含由源自人序列的DNA编码的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域。在一些情况下，完全人序列源自对人来说内源的蛋白质。在其他情况下，完全人蛋白质或蛋白质序列包含每个组分序列源自人序列的嵌合序列。虽然不受任一理论约束，但通常对嵌合蛋白或嵌合序列进行设计以例如与任何野生型人免疫球蛋白区或结构域相比使组分序列接点中免疫原性表位的形成减至最少。
双特异性抗原结合分子可使用一条重链来构建，所述一条重链具有修饰的Fc结构域，从而消除它与蛋白质A的结合，因此实现产生异二聚蛋白质的纯化方法。参见例如美国专利号8,586,713。因而，双特异性抗原结合分子包含第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域因至少一个氨基酸而彼此不同，并且其中至少一个氨基酸差异使双特异性抗体与蛋白质A的结合与缺乏所述氨基酸差异的双特异性抗体相比有所减少。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白质A并且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白质A结合的突变/修饰，诸如H95R修饰(通过IMGT外显子编号；通过EU编号为H435R)。第二CH3可还包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。
生物等效物
本发明涵盖具有不同于本文所公开的示例性分子但保留结合APLP2和/或HER2的能力的氨基酸序列的抗原结合分子。当与亲本序列相比时，此类变体分子可包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，但展现大体上等效于所描述的双特异性抗原结合分子的生物活性。
本发明包括生物等效于本文所阐述的示例性抗原结合分子中的任一者的抗原结合分子。如果例如两种抗原结合蛋白或抗体为当在类似实验条件下以相同摩尔剂量(单个剂量或多个剂量)施用时吸收速率和程度不显示显著差异的药物等效物或药物替代物，那么它们被认为是生物等效的。如果一些抗原结合蛋白在它们的吸收程度方面为等效的，但在它们的吸收速率方面不等效，而又可被认为是生物等效的，因为此类在吸收速率方面的差异为有意的并且在标记中被反映出来，在例如长期使用后不是达到有效体内药物浓度所必需的，并且对于所研究的特定药物产品来说被认为在医学上不重要，那么它们将被认为是等效物或药物替代物。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在它们的安全性、纯度以及效力方面不存在临床上有意义的差异，那么它们为生物等效的。
在一个实施方案中，如果患者可在参考产品与生物产品之间转换一次或多次而与未进行此类转换的持续疗法相比没有预期的有害作用风险增加，包括临床上显著的免疫原性变化或有效性减弱，那么两种抗原结合蛋白为生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白均通过针对一种或多种使用条件的一种或多种常用作用机制(在此类机制已知的情况下)起作用，那么它们为生物等效的。
生物等效性可通过体内和/或体外方法来证实。生物等效性测量包括例如(a)在人或其他哺乳动物中进行的随时间变化在血液、血浆、血清或其他生物流体中测量抗体或其代谢产物的浓度的体内测试；(b)与人体内生物利用率数据相关并且适当预示人体内生物利用率的体外测试；(c)在人或其他哺乳动物中进行的随时间变化测量抗体(或其靶标)的适当急性药理学效应的体内测试；以及(d)确定抗原结合蛋白的安全性、功效或生物利用率或生物等效性的完全受控的临床试验。
可通过例如形成残基或序列的各种取代或去除生物活性不需要的末端或内部残基或序列来构建本文所阐述的示例性双特异性抗原结合分子的生物等效变体。举例来说，可去除不为生物活性所必需的半胱氨酸残基或用其他氨基酸置换以防止在复原后形成不必要或不恰当的分子内二硫键。在其他情形中，生物等效抗原结合蛋白可包括本文所阐述的示例性双特异性抗原结合分子的变体，所述变体包含修饰分子的糖基化特征的氨基酸变化，例如消除或移除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施方案，提供了结合于人APLP2但不结合于来自其他物种的APLP2的抗原结合分子。还提供了结合于人HER2但不结合于来自其他物种的HER2的抗原结合分子。本发明还包括结合于人APLP2并且结合于来自一个或多个非人物种的APLP2的抗原结合分子；和/或结合于人HER2并且结合于来自一个或多个非人物种的HER2的抗原结合分子。
根据本发明的某些示例性实施方案，提供了结合于人APLP2和/或人HER2并且视情况而定可结合或不结合于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼、食蟹猴、狨、恒河猴或黑猩猩APLP2和/或HER2中的一者或多者的抗原结合分子。举例来说，在本发明的一个特定示例性实施方案中，提供了包含结合人APLP2和食蟹猴APLP2的第一抗原结合结构域以及特异性结合人HER2的第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子。
抗体-药物缀合物(ADC)
本发明提供了抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含与诸如细胞毒性剂、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等治疗剂部分缀合的抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段。还提供了缀合至治疗剂部分的抗HER2抗体或其抗原结合片段。一般地说，ADC包含：A-[L-P]y，其中A为抗原结合分子，例如抗HER2 x抗APLP2抗体或其片段(例如包含选自表1或表2中所列的HCDR3氨基酸序列中的任一者的至少一个HCDR3的片段)，L为接头，P为有效负荷或治疗剂部分(例如细胞毒性剂)，并且y为1至30的整数。
在各个实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含表3中所阐述的具有表3中所阐述的SEQ ID NO的氨基酸序列(例如具有HCVR1-HCVR2-LCVR SEQ ID NO:2-26-10；2-34-10；2-42-10；18-26-10；18-34-10；或18-42-10)的HCVR臂和相同LCVR臂或两个特定HCVR/LCVR对(例如SEQID NO:2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的CDR。在一些情况下，抗HER2 x抗APLP2抗体或片段包含具有表1和表2中所阐述的SEQ ID NO的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16和28-30-32-12-14-16)的HC-CDR和LC-CDR。在另一实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ IDNO2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂。
在各个实施方案中，ADC包含抗HER2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR或特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10或18/10)的CDR。在一些情况下，抗HER2抗体或片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、20-22-24-12-14-16)的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，抗HER2抗体或片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR，或特定氨基酸序列对(例如SEQ ID NO:2/10以及18/10)。
细胞毒性剂包括对细胞的生长、活力或繁殖有害的任何剂，包括但不限于微管蛋白相互作用剂和DNA损害剂。可缀合至根据本公开此方面的抗HER2抗体的适合的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例包括例如1-(2氯乙基)-1,2-二甲磺酰基酰肼、1,8-二羟基-双环[7.3.1]三癸-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-去氢睾酮、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素D、鹅膏蕈碱、氨基喋呤、蛇形菌素(anguidine)、蒽环类、安曲霉素(anthramycin)(AMC)、澳瑞他汀、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、丁酸、加利车霉素(例如加利车霉素γ1)、喜树碱、洋红霉素(carminomycin)、卡莫司汀(carmustine)、西马多丁(cemadotin)、顺铂、秋水仙碱、考布他汀(combretastatin)、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、更生霉素(dactinomycin)、柔红比星(daunorubicin)、达卡巴嗪(decarbazine)、二乙酰氧基戊基多柔比星(diacetoxypentyldoxorubicin)、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌素二酮、地索拉唑(disorazole)、多拉司他汀(例如多拉司他汀10)、多柔比星、多卡霉素(duocarmycin)、棘霉素(echinomycin)、伊斯罗宾(eleutherobin)、吐根碱、埃博霉素(epothilone)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、雌莫司汀(estramustines)、溴化乙锭、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶、格尔德霉素(geldanamycin)、短杆菌素D、糖皮质素、伊立替康(irinotecan)、纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂、来普霉素(leptomycin)、环氧长春碱、利多卡因(lidocaine)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、美登木素、二氯甲基二乙胺、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、甲基叶酸、甲氨蝶呤、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、N8-乙酰基亚精胺、鬼臼毒素、普鲁卡因(procaine)、普萘洛尔(propranolol)、蝶啶、嘌呤霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、根霉素、链脲佐菌素、太利苏霉素(tallysomycin)、紫杉醇、替诺泊苷(tenoposide)、丁卡因(tetracaine)、噻替派(thioepa)氮芥苯丁酸、托马霉素(tomaymycin)、拓扑替康(topotecan)、土布来辛、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨以及前述任一者的衍生物。
根据某些实施方案，缀合至抗HER2抗体的细胞毒性剂为美登木素(诸如DM1或DM4)、托马霉素衍生物或多拉司他汀衍生物。根据某些实施方案，缀合至抗HER2抗体的细胞毒性剂为澳瑞他汀，诸如MMAE、MMAF或其衍生物。本公开范围内涵盖本领域中已知的其他细胞毒性剂，包括例如蛋白质毒素，诸如篦麻毒素、艰难梭菌(C.difficile)毒素、假单胞菌属外毒素、篦麻毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、榄香胺素(bryodin)、肥皂草素、商陆属毒素(即，商陆毒素(phytolaccatoxin和phytolaccigenin))以及其他毒素，诸如Sapra等,Pharmacol.&Therapeutics,2013,138:452-469中所阐述的那些毒素。
在某些实施方案中，细胞毒性剂为美登木素，例如美登素的衍生物。适合的美登木素包括DM1、DM4或其衍生物、立体异构体或同位素体。适合的美登木素还包括但不限于WO2014/145090A1、WO 2015/031396A1、US 2016/0375147A1以及US 2017/0209591A1中所公开的那些美登木素，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，美登木素具有以下结构：
Figure BDA0002753904480000721
其中A为任选取代的亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施方案中，美登木素具有以下结构：
Figure BDA0002753904480000722
其中A为任选取代的亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施方案中，美登木素具有以下结构：
Figure BDA0002753904480000731
其中n为1-12的整数并且R1为烷基。
在一些实施方案中，美登木素为：
Figure BDA0002753904480000732
Figure BDA0002753904480000741
Figure BDA0002753904480000751
Figure BDA0002753904480000761
在一些实施方案中，美登木素为：
Figure BDA0002753904480000762
在一些实施方案中，美登木素为：
Figure BDA0002753904480000771
本文还提供了包含缀合至一种或多种放射性核素的抗HER2抗体的抗体-放射性核素缀合物(ARC)。可用于本公开此方面的情形中的示例性放射性核素包括但不限于例如225Ac、212Bi、213Bi、131I、186Re、227Th、222Rn、223Ra、224Ra以及90Y。
在本文所提供的某些实施方案中，提供包含经由接头分子缀合至细胞毒性剂(例如以上公开的细胞毒性剂中的任一者)的抗MET抗体或抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白的ADC。接头为键联、连接或键合本文所描述的抗体或抗原结合蛋白与治疗剂部分(例如细胞毒性剂)的任何基团或部分。可例如在Antibody-Drug Conjugates andImmunotoxins；Phillips,G.L.编；Springer Verlag:New York,2013；Antibody-DrugConjugates；Ducry,L.编；Humana Press,2013；Antibody-Drug Conjugates；Wang,J.,Shen,W.-C.以及Zaro,J.L.编；Springer International Publishing,2015中找到适合的接头，这些参考文献各自的内容以全文引用的方式并入本文中。通常，适合用于本文所描述的抗体缀合物的结合剂接头为足够稳定以开发抗体的循环半衰期并且同时能够在抗原介导的缀合物内化之后释放有效负荷的结合剂接头。接头可为可裂解或不可裂解的。可裂解接头包括在内化之后通过细胞内代谢裂解，例如经由水解、还原或酶促反应裂解的接头。不可裂解接头包括在内化之后经由抗体的溶酶体降解释放所附着的有效负荷的接头。适合的接头包括但不限于酸不稳定性接头、水解不稳定性接头、酶促可裂解接头、还原不稳定性接头、自分解接头以及不可裂解接头。适合的接头还包括但不限于是或包含肽、葡萄糖苷酸、琥珀酰亚胺-硫醚、聚乙二醇(PEG)单元、腙、mal-己酰基单元、二肽单元、缬氨酸-瓜氨酸单元以及对氨基苯甲基(PAB)单元的接头。
可使用本领域中已知的任何接头分子或接头技术来形成或构建本公开的ADC。在某些实施方案中，接头为可裂解接头。根据其他实施方案，接头为不可裂解接头。可用于本公开情形中的示例性接头包括包含例如MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、val-gly(缬氨酸-甘氨酸)、蛋白酶可裂解接头中的二肽位点、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、蛋白酶可裂解接头中的二肽位点，PAB(对氨基苯甲氧基羰基)、SPP(4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯)、SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸N-琥珀酰亚胺酯)、SIAB((4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯)以及它们的变体和组合或由其组成的接头。例如US 7,754,681和Ducry,Bioconjugate Chem.,2010,21:5-13以及其中引用的参考文献中提供了可用于本公开情形中的接头的额外实例，所述参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，接头在生理条件下为稳定的。在某些实施方案中，接头为可裂解的，例如在存在酶的情况下或在特定pH值范围或值下能够至少释放有效负荷部分。在一些实施方案中，接头包含酶可裂解部分。说明性酶可裂解部分包括但不限于肽键、酯键、腙以及二硫键。在一些实施方案中，接头包含组织蛋白酶可裂解接头。
在一些实施方案中，接头包含不可裂解部分。
适合的接头还包括但不限于化学键合至单一结合剂(例如抗体)的两个半胱氨酸残基的接头。此类接头可用以模拟抗体的因缀合过程而断裂的二硫键。
在一些实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸。适合的氨基酸包括天然、非天然、标准、非标准、蛋白原性、非蛋白原性以及L-α-氨基酸或D-α-氨基酸。在一些实施方案中，接头包含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或瓜氨酸、其衍生物或它们的组合。在某些实施方案中，氨基酸的一个或多个侧链键联至下文所描述的侧链基团。在一些实施方案中，接头包含缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案中，接头包含赖氨酸、缬氨酸以及瓜氨酸。在一些实施方案中，接头包含赖氨酸、缬氨酸以及丙氨酸。在一些实施方案中，接头包含缬氨酸和丙氨酸。
在一些实施方案中，接头包含自分解基团。自分解基团可为技术人员已知的任何此类基团。在特定实施方案中，自分解基团为对氨基苯甲基(PAB)或其衍生物。可用衍生物包括对氨基苯甲氧基羰基(PABC)。技术人员将认识到自分解基团能够执行从有效负荷释放接头的剩余原子的化学反应。
在一些实施方案中，接头为：
Figure BDA0002753904480000791
其中
Figure BDA0002753904480000792
为连接抗体或抗原结合蛋白(例如经由赖氨酸残基)的键并且
Figure BDA0002753904480000793
为连接细胞毒性剂(例如DM1)的键。在一些实施方案中，接头为：
Figure BDA0002753904480000794
其中
Figure BDA0002753904480000795
为连接抗体或抗原结合蛋白(例如经由赖氨酸残基)的键并且
Figure BDA0002753904480000796
为连接细胞毒性剂(例如DM1)的键。在某些实施方案中，接头为：
Figure BDA0002753904480000801
在某些实施方案中，接头为：
Figure BDA0002753904480000802
在一些实施方案中，接头源自4-反-环己烷羧基琥珀酸马来酰亚胺基甲酯：
Figure BDA0002753904480000803
在一些实施方案中，接头为：
Figure BDA0002753904480000804
其中
Figure BDA0002753904480000805
为连接抗体或抗原结合蛋白(例如经由赖氨酸残基)的键并且
Figure BDA0002753904480000806
为连接细胞毒性剂(例如具有下式的化合物)的键：
Figure BDA0002753904480000811
本公开包含接头通过在抗体或抗原结合分子内特定氨基酸处的连接将抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体连接至药物或细胞毒素的ADC。可用于此方面情形中的示例性氨基酸连接，例如赖氨酸(参见例如US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander等,Bioconjugate Chem.,2008,19:358-361；WO 2005/089808；US 5,714,586；以及US 2013/0101546)、半胱氨酸(参见例如US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；以及US 7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见例如WO 2008/122039；以及Hofer等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456)、甲酰基甘氨酸(参见例如Carrico等,Nat.Chem.Biol.,2007,3:321-322；Agarwal等.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51以及Rabuka等,Nat.Protocols,2012,10:1052-1067)、非天然氨基酸(参见例如WO 2013/068874和WO2012/166559)以及酸性氨基酸(参见例如WO 2012/05982)。接头还可经由连接至碳水化合物(参见例如(US 2008/0305497、WO 2014/065661以及Ryan等,Food&AgricultureImmunol.,2001,13:127-130)和二硫化物接头(参见例如WO 2013/085925、WO 2010/010324、WO 2011/018611以及Shaunak等,Nat.Chem.Biol.,2006,2:312-313)缀合至抗原结合蛋白。还可采用位点特异性缀合技术来引导与抗体或抗原结合蛋白的特定残基的缀合(参见例如Schumacher等J Clin Immunol(2016)36(增刊1):100)。位点特异性缀合技术包括但不限于经由转谷氨酰胺酶进行的谷氨酰胺缀合(参见例如Schibli,Angew ChemieInter Ed.2010,49,9995)。
根据某些实施方案，本公开提供了ADC，其中如本文所描述的抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体缀合至如国际专利公布WO2014/145090中所阐述的接头-药物组合物(例如化合物“7”，在本文中也称为“M0026”并且在下文展示)，所述国际专利公布的公开内容以全文引用的方式并入本文中：
Figure BDA0002753904480000821
本文还提供了包含本文所公开的抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体的抗体-药物缀合物，其中所述抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体缀合至细胞毒性剂。在某些实施方案中，细胞毒性剂为美登木素。在某些实施方案中，美登木素为具有下式的化合物：
Figure BDA0002753904480000822
其中n为1-12的整数并且R1为烷基。在某些实施方案中，美登木素为
Figure BDA0002753904480000831
在某些实施方案中，细胞毒性剂为美登木素，并且美登木素经由不可裂解接头共价连接至抗体。在某些实施方案中，细胞毒性剂为美登木素，并且美登木素经由可裂解接头共价连接至抗体。
在一个实施方案中，抗体缀合至：
Figure BDA0002753904480000832
其中
Figure BDA0002753904480000833
为连接抗体的键。
在一个实施方案中，抗体缀合至：
Figure BDA0002753904480000834
其中
Figure BDA0002753904480000841
为连接抗体的键。
在一个实施方案中，抗体缀合至：
Figure BDA0002753904480000842
其中
Figure BDA0002753904480000843
为连接抗体的键。
在一个实施方案中，抗体缀合至：
Figure BDA0002753904480000844
其中
Figure BDA0002753904480000845
为连接抗体的键。
在一些实施方案中，缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab为如本文所描述的抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体；
L为接头；
Pay为细胞毒性剂；并且
n为1-10的整数。
在一些实施方案中，Ab为表1或表3中所描述的抗体或抗原结合蛋白中的任一者。
在一些实施方案中，有效负荷为美登木素。
在一些实施方案中，Pay为：
Figure BDA0002753904480000851
其中R1为烷基。
在一些实施方案中，Pay为：
Figure BDA0002753904480000852
在一些实施方案中，Pay为：
Figure BDA0002753904480000861
在一些实施方案中，n为2至5的整数。
在一些实施方案中，-L-Pay为：
Figure BDA0002753904480000862
其中
Figure BDA0002753904480000863
为连接抗体的键。
在一些实施方案中，-L-Pay为：
Figure BDA0002753904480000864
其中
Figure BDA0002753904480000865
为连接抗体的键。
在一些实施方案中，-L-Pay为
Figure BDA0002753904480000871
其中
Figure BDA0002753904480000872
为连接抗体的键。
在一些实施方案中，-L-Pay为：
Figure BDA0002753904480000873
其中
Figure BDA0002753904480000874
为连接抗体的键。
在一些实施方案中，-L-Pay为：
Figure BDA0002753904480000875
其中
Figure BDA0002753904480000876
为连接抗体的键。
本发明提供了抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含抗HER2抗体或其抗原结合片段以及治疗剂(“Pay”)(例如细胞毒性剂)，诸如但不限于DM1。在一些实施方案中，抗HER2抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂(诸如但不限于DM1)经由接头(“L”)(诸如但不限于SMCC)共价连接。在各个实施方案中，ADC包含
抗HER2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR、特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10或18/10)的CDR和/或具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、20-22-24-12-14-16)的氨基酸序列的CDR，以及
美登木素，任选为DM1，
任选其中抗HER2抗体或其抗原结合片段和美登木素经由接头(例如SMCC)共价连接。
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR、特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10或18/10)的CDR和/或具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、20-22-24-12-14-16)的氨基酸序列的CDR，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段缀合至
Figure BDA0002753904480000881
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR、特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10或18/10)的CDR和/或具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、20-22-24-12-14-16)的氨基酸序列的CDR，以及
Figure BDA0002753904480000891
其中
Figure BDA0002753904480000892
为连接抗HER2抗体或其抗原结合片段的键。
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR、特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10或18/10)的CDR和/或具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、20-22-24-12-14-16)的氨基酸序列的CDR，以及
Figure BDA0002753904480000893
其中
Figure BDA0002753904480000901
为连接抗HER2抗体或其抗原结合片段的键。
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR、特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10或18/10)的CDR和/或具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、20-22-24-12-14-16)的氨基酸序列的CDR，以及
Figure BDA0002753904480000902
其中
Figure BDA0002753904480000903
为连接抗HER2抗体或其抗原结合片段的键。
在各个实施方案中，ADC包含抗HER2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR或特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10或18/10)的CDR。在一些情况下，抗HER2抗体或片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16、20-22-24-12-14-16)的氨基酸序列的CDR。在一些情况下，抗HER2抗体或片段包含具有表1中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:2、18以及10)的氨基酸序列的HCVR和LCVR，或特定氨基酸序列对(例如SEQ ID NO:2/10以及18/10)。
在各个实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含表3中所阐述的具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如具有HCVR1-HCVR2-LCVR SEQ ID NO:2-26-10；2-34-10；2-42-10；18-26-10；18-34-10；或18-42-10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂或两个特定HCVR/LCVR对(例如SEQID NO:2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的CDR。在一些情况下，抗HER2 x抗APLP2抗体或片段包含具有表1和表2中所阐述的SEQ ID NO的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16和28-30-32-12-14-16)的HC-CDR和LC-CDR。在另一实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ IDNO2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂。
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段以及治疗剂(“Pay”)(例如细胞毒性剂)，诸如但不限于DM1。在一些实施方案中，抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段和细胞毒性剂(诸如但不限于DM1)经由接头(“L”)(诸如但不限于SMCC)共价连接。在各个实施方案中，ADC包含
抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如具有HCVR1-HCVR2-LCVR SEQ ID NO:2-26-10；2-34-10；2-42-10；18-26-10；18-34-10；或18-42-10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂、两个特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)、具有表1和表2中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16和28-30-32-12-14-16)的氨基酸序列的HC-CDR和LC-CDR和/或具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂的CDR，以及
美登木素，任选为DM1，
任选其中抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段和美登木素经由接头(例如SMCC)共价连接。
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如具有HCVR1-HCVR2-LCVR SEQ ID NO:2-26-10；2-34-10；2-42-10；18-26-10；18-34-10；或18-42-10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂、两个特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)、具有表1和表2中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16和28-30-32-12-14-16)的氨基酸序列的HC-CDR和LC-CDR和/或具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂的CDR，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段缀合至
Figure BDA0002753904480000921
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如具有HCVR1-HCVR2-LCVR SEQ ID NO:2-26-10；2-34-10；2-42-10；18-26-10；18-34-10；或18-42-10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂、两个特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)、具有表1和表2中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16和28-30-32-12-14-16)的氨基酸序列的HC-CDR和LC-CDR和/或具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂的CDR，以及
Figure BDA0002753904480000931
其中
Figure BDA0002753904480000932
为连接抗HER2x抗APLP2抗体或其抗原结合片段的键。
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如具有HCVR1-HCVR2-LCVR SEQ ID NO:2-26-10；2-34-10；2-42-10；18-26-10；18-34-10；或18-42-10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂、两个特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)、具有表1和表2中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16和28-30-32-12-14-16)的氨基酸序列的HC-CDR和LC-CDR和/或具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂的CDR，以及
Figure BDA0002753904480000941
其中
Figure BDA0002753904480000942
为连接抗HER2x抗APLP2抗体或其抗原结合片段的键。
在一些实施方案中，ADC包含抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2 x抗APLP2抗体或其抗原结合片段包含具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如具有HCVR1-HCVR2-LCVR SEQ ID NO:2-26-10；2-34-10；2-42-10；18-26-10；18-34-10；或18-42-10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂、两个特定HCVR/LCVR对(例如SEQ ID NO:2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)、具有表1和表2中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16和28-30-32-12-14-16)的氨基酸序列的HC-CDR和LC-CDR和/或具有表3中所阐述的SEQ ID NO(例如SEQ ID NO2/10和26/10；2/10和34/10；2/10和42/10；18/10和26/10；18/10和34/10；或18/10和42/10)的氨基酸序列的HCVR臂和相同LCVR臂的CDR，以及
Figure BDA0002753904480000943
其中
Figure BDA0002753904480000944
为连接抗HER2x抗APLP2抗体或其抗原结合片段的键。
可使用本领域一般技术人员已知的缀合条件制备本文所描述的抗体药物缀合物(参见例如Doronina等Nature Biotechnology 2003,21,7,778，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，通过使本文所描述的抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体与包含所需接头和细胞毒性剂的化合物接触来制备抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体药物缀合物，其中所述接头例如在抗体或抗原结合蛋白的所需残基处具有与抗体或抗原结合蛋白反应的部分。
在一些实施方案中，本文提供了用于制备抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括使本文所描述的抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体与具有以下式A1的化合物：
Figure BDA0002753904480000951
和水性稀释剂接触。
在一些实施方案中，式A1化合物以化学计量过量存在。在一些实施方案中，式A1化合物以5-6倍化学计量过量存在。在一些实施方案中，水性稀释剂包含HEPES。在一些实施方案中，水性稀释剂包含DMA。
在一些实施方案中，式A1化合物为式A2或A3的化合物：
Figure BDA0002753904480000961
在一些实施方案中，式A2的化合物为A3立体异构纯的。在一些实施方案中，式A1化合物包含式A1或A2的化合物，其中A1或A2的化合物以超过50％的非对映异构体过量存在。在某些实施方案中，非对映异构体过量为超过70％。在某些实施方案中，非对映异构体过量为超过90％。在某些实施方案中，非对映异构体过量为超过95％。结构A1、A2以及A3个别地称为或统称为SMCC-DM1。
术语“非对映异构体过量”是指所需单一非对映异构体的摩尔分数与组合物中其余非对映异构体之间相比的差异。如下计算非对映异构体过量：(单一非对映异构体的量)-(其他非对映异构体的量)/1。举例来说，含有90％的1以及10％的2、3、4或它们的混合物的组合物具有80％[(90-10)/1]的非对映异构体过量。含有95％的1以及5％的2、3、4或它们的混合物的组合物具有90％[(95-5)/1]的非对映异构体过量。含有99％的1以及1％的2、3、4或其混合物的组合物具有98％[(99-1)/1]的非对映异构体过量。可类似地对1、2、3或4中的任一者计算非对映异构体过量。
在一些实施方案中，如下制备式A1化合物，通过在存在硅胶和稀释剂的情况下使式(a)的化合物：
Figure BDA0002753904480000971
与式(b)的化合物
Figure BDA0002753904480000972
接触。在一些实施方案中，稀释剂包含有机溶剂和水。
本文还提供了通过以下方法制备的产物：
(i)在存在硅胶和稀释剂的情况下使式(a)的化合物：
Figure BDA0002753904480000981
与式(b)的化合物：
Figure BDA0002753904480000982
接触以合成中间物；以及
(ii)使本文所描述的抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体与中间物和水性稀释剂接触。
在一些实施方案中，本文提供了用于制备抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括使本文所描述的抗HER2 x抗APLP2双特异性抗原结合蛋白或抗HER2抗体与具有下式B的化合物和水性稀释剂接触：
Figure BDA0002753904480000983
Figure BDA0002753904480000991
其中LG为离去基。
在一些实施方案中，式B化合物以化学计量过量存在。在一些实施方案中，式B化合物以5-6倍化学计量过量存在。在一些实施方案中，水性稀释剂包含HEPES。在一些实施方案中，水性稀释剂包含DMA。在一些实施方案中，-C(O)-LG为酯，例如NHS或五氟苯酯。
在一些实施方案中，式B化合物为称为化合物I的式B1化合物：
Figure BDA0002753904480000992
B1(化合物I)。
在一些实施方案中，式C化合物称为化合物II：
Figure BDA0002753904480000993
C(化合物II)
药物与抗体比(DAR)为缀合至抗体或抗原结合片段的药物的平均数目，药物与抗体比对ADC的功效、效力以及药代动力学具有重要影响。在各个实施方案中，DAR为每个抗体1、2、3、4、5、6、7或8个药物分子。在一些实施方案中，DAR为1至4。在某些实施方案中，DAR为2至4。在一些情况下，DAR为2至3。在某些情况下，DAR为3至4。在一些实施方案中，DAR为1至10、1至20或1至30(即，每个抗体或其抗原结合片段1至30个药物分子)。
治疗性制剂和施用
本发明提供了包含本发明的抗原结合分子的药物组合物。本发明的药物组合物被配制成具有适合的载体、赋形剂以及提供改善的转移、递送、耐受性等的其他剂。在所有药物化学工作者已知的配方书(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany,Easton,PA)中可找到许多适当的制剂。这些制剂包括例如粉末、糊状物、软膏、果冻、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(诸如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊状物、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶以及含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等"Compendium ofexcipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
向患者施用的抗原结合分子的剂量可根据患者的年龄和体型大小、目标疾病、条件、施用途径等改变。典型地根据体重或体表面积计算优选剂量。当本发明的双特异性抗原结合分子在成人患者中用于治疗目的时，通常以每千克体重约0.01至约20mg、更优选每千克体重约0.02至约7、约0.03至约5或约0.05至约3mg的单一剂量静脉内施用本发明的双特异性抗原结合分子可为有利的。根据疾患的严重程度，可对治疗的频率和持续时间进行调整。可根据经验确定用于施用双特异性抗原结合分子的有效剂量和时间表；例如可通过周期性评估监测患者进展，并且相应地调整剂量。此外，可使用本领域中的熟知方法进行剂量的种间比例调节(例如Mordenti等,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
各种递送系统为已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如于脂质体、微粒、微胶囊中的封装物、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外以及经口途径。可通过任何方便的途径，例如通过输注或快速注射、通过经上皮或粘膜皮肤内衬(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收来施用组合物并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可为全身的或局部的。
本发明的药物组合物可用标准针头和注射器进行皮下或静脉内递送。此外，相对于皮下递送，笔式递送装置已容易地应用于递送本发明的药物组合物。此类笔式递送装置可为可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常利用含有药物组合物的可替换药筒。在已施用药筒内的所有药物组合物并且药筒空掉后，可轻易地将空药筒弃去并且用含有药物组合物的新药筒代替。然后笔式递送装置可再次使用。在一次性笔式递送装置中，没有可替换的药筒。相反地，一次性笔式递送装置预填充有保持在装置内的储集器中的药物组合物。在将储集器内的药物组合物清空后，将整个装置弃去。
许多可重复使用的笔式和自动注射器递送装置已应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II以及III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，仅举几个例子。应用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，仅举几个例子。
在某些情况下，可在控制释放系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一实施方案中，可使用聚合物材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在另一实施方案中，可将控制释放系统放在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,1984,MedicalApplications of Controlled Release,同上,第2卷,第115-138页)。Langer,1990,Science 249:1527-1533进行的综述中论述了其他控制释放系统。
可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内以及肌肉内注射、点滴输注等的剂型。这些可注射制剂可通过公众已知的方法来制备。举例来说，可例如通过将上文所描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备可注射制剂。作为用于注射的水性介质，有例如生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等张溶液等，这些水性介质可与诸如以下的适当增溶剂组合使用：醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，有已采用的例如芝麻油、大豆油等，这些油性介质可与诸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。因此制备的注射物优选填充于适当的安瓿中。
有利地，将上文所描述的用于口腔或肠胃外用途的药物组合物制备成呈适合于符合活性成分的剂量的单位剂量形式的剂型。此类呈单位剂量形式的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射物(安瓿)、栓剂等。所含的上述抗体的量通常为每一呈单位剂量形式的剂型约5至约500mg；尤其在注射物形式中，优选以约5至约100mg含有上述抗体，而对于其他剂型则为约10至约250mg。
抗原结合分子的治疗用途
本发明包括了包括向有需要的受试者施用包含抗HER2抗体或其抗原结合片段或特异性结合APLP2和HER2的双特异性抗原结合分子的治疗组合物的方法。治疗组合物可包含如本文所公开的抗体或双特异性抗原结合分子中的任一者以及药学上可接受的载体或稀释剂。表述“有需要的受试者”意指展现癌症的一种或多种症状或标志(例如表达肿瘤或罹患本文以下所提到的癌症中的任一者的受试者)或以其他方式将受益于抑制或降低HER2活性或消耗HER2+细胞(例如乳腺癌细胞)的人或非人动物。
本发明的抗体和双特异性抗原结合分子(以及包含本发明的抗体和双特异性抗原结合分子的治疗组合物)尤其可用治疗刺激、活化和/或靶向免疫反应将有益的任何疾病或病症。特别地，本发明的抗HER2抗体或抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子可用于治疗、预防和/或改善与HER2表达或活性或HER2+细胞增殖相关或由其介导的任何疾病或病症。用于实现本发明的治疗方法的作用机制包括在存在效应细胞的情况下例如通过CDC、凋亡、ADCC、噬菌作用或通过这些机制两种或更多种的组合杀死表达HER2的细胞。可使用本发明的双特异性抗原结合分子抑制或杀死的表达HER2的细胞包括例如乳腺肿瘤细胞。
可使用本发明的抗原结合分子来治疗例如在前列腺、膀胱、宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和/或卵巢中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，使用本发明的双特异性抗原结合分子来治疗以下癌症中的一者或多者：前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌以及卵巢癌。根据本发明的某些实施方案，抗HER2抗体或抗HER2/抗APLP2双特异性抗体可用于治疗具有IHC2+或更甚的乳腺癌细胞的患者。根据本发明的其他相关实施方案，提供了包括向具有IHC2+或更甚的乳腺癌细胞的患者施用如本文所公开的抗HER2抗体或抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子的方法。可使用本领域中已知的分析/诊断方法(诸如肿瘤扫描等)来确定患者是否具有去势抗性肿瘤。
本发明还包括用于治疗受试者的残余癌症的方法。术语“残余癌症”意指在用抗癌疗法治疗之后受试者中存在或存留一个或多个癌细胞。
根据某些方面，本发明提供了用于治疗与HER2表达相关的疾病或病症(例如乳腺癌)的方法，所述方法包括在已确定受试者患有乳腺癌(例如和IHC2+乳腺癌)之后向受试者施用本文在别处描述的抗HER2或双特异性抗原结合分子中的一者或多者。举例来说，本发明包括用于治疗乳腺癌的方法，所述方法包括在受试者已接受激素疗法(例如抗雄激素疗法)之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间时向患者施用抗HER2抗体或抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子。
组合疗法和制剂
本发明提供了包括施用包含本文所描述的示例性抗体和双特异性抗原结合分子中的任一者与一种或多种额外治疗剂的组合的药物组合物的方法。可与本发明的抗原结合分子组合或组合施用的示例性额外治疗剂包括例如EGFR拮抗剂(例如抗EGFR抗体[例如西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR的小分子抑制剂[例如吉非替尼(gefitinib)或埃罗替尼(erlotinib)])、诸如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4等另一EGFR家族成员的拮抗剂(例如抗ErbB2、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、EGFRvIII的拮抗剂(例如特异性结合EGFRvIII的抗体)、cMET拮抗剂(例如抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如维罗非尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如抗PDGFR-β抗体)、VEGF拮抗剂(例如VEGF-Trap，参见例如US 7,087,411(本文中也称为“VEGF抑制融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗剂(例如US 2009/0142354中所公开的抗DLL4抗体，诸如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如US 2011/0027286中所公开的抗Ang2抗体，诸如H1H685P)、FOLH1(PSMA)拮抗剂、PRLR拮抗剂(例如抗PRLR抗体)、HER1或HER2拮抗剂(例如抗HER1抗体或抗HER2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如抗CA9抗体)、尿路斑块蛋白(uroplakin)拮抗剂(例如抗尿路斑块蛋白抗体)等。可有利地与本发明的抗原结合分子组合施用的其他剂包括细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和结合于诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18等细胞因子或其相应受体的抗体。本发明的药物组合物(例如包含如本文所公开的抗APLP2/抗HER2双特异性抗原结合分子的药物组合物)还可作为包含一种或多种治疗剂组合的治疗方案的一部分而施用，所述一种或多种治疗剂组合选自：“ICE”：异环磷酰胺(例如
Figure BDA0002753904480001051
)、卡铂(例如
Figure BDA0002753904480001052
)、依托泊苷(例如
Figure BDA0002753904480001053
VP-16)；“DHAP”：地塞米松(dexamethasone)(例如
Figure BDA0002753904480001054
)、阿糖胞苷(例如Cytosar-
Figure BDA0002753904480001055
胞嘧啶阿拉伯糖苷、ara-C)、顺铂(例如
Figure BDA0002753904480001056
-AQ)；以及“ESHAP”：依托泊苷(例如
Figure BDA0002753904480001057
VP-16)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)(例如
Figure BDA0002753904480001058
)、高剂量阿糖胞苷、顺铂(例如
Figure BDA0002753904480001059
-AQ)。
本发明还包括包含本文提到的抗原结合分子中的任一者以及一个或多个VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1(PSMA)、PRLR、HER1、HER2、TMPRSS2、MSLN、CA9、尿路斑块蛋白或上述细胞因子中的任一者抑制剂的治疗剂组合，其中抑制剂为适配体、反义分子、核糖酶、siRNA、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他工程化分子，诸如双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体以及最小识别单元)。还可将本发明的抗原结合分子与抗病毒剂、抗生素、止痛剂、皮质类固醇和/或NSAID组合施用和/或共配制。本发明的抗原结合分子还可作为还包括放射治疗和/或常规化学疗法的治疗方案的一部分而施用。
可在即将施用本发明的抗原结合分子之前、在施用本发明的抗原结合分子同时或在施用本发明的抗原结合分子之后不久施用一种或多种额外治疗活性组分；(出于本公开的目的，此类施用方案被认为是施用抗原结合分子“与另一治疗活性组分的组合”)。
本发明包括药物组合物，其中本发明的抗原结合分子与如本文别处所描述的一种或多种额外治疗活性组分中的一者或多者共配制。
施用方案
根据本发明的某些实施方案，可历经确定的时间过程向受试者施用多个剂量的抗原结合分子(例如抗HER2抗体或特异性结合HER2和APLP2的双特异性抗原结合分子)。根据本发明此方面的方法包括依序向受试者施用多个剂量的本发明的抗原结合分子。短语“依序施用”意味着在不同时间点，例如在相隔预定间隔(例如数小时、数天、数周或数月)的不同天向受试者施用每个剂量的抗原结合分子。本发明包括如下方法，所述方法包括依序向患者施用单个初始剂量的抗原结合分子，随后施用一个或多个二级剂量的抗原结合分子，并且任选随后施用一个或多个三级剂量的抗原结合分子。
术语“初始剂量”、“二级剂量”以及“三级剂量”是指施用本发明的抗原结合分子的时间顺序。因此，“初始剂量”为在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“二级剂量”为初始剂量之后施用的剂量；并且“三级剂量”为二级剂量之后施用的剂量。初始、二级以及三级剂量可全部含有相同量的抗原结合分子，但就施用频率来说通常可彼此不同。然而，在某些实施方案中，在治疗过程期间，初始、二级和/或三级剂量中所含的抗原结合分子的量彼此不同(例如适当时上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如2个、3个、4个或5个)剂量作为“加载剂量”，随后为不太频繁地施用的后续剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的一个示例性实施方案中，在紧挨着的前一剂量之后1至26(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周时施用每个二级和/或三级剂量。在多次施用的顺序中，短语“紧挨着的前一剂量”为在施用顺序中没有中间剂量的紧接着剂量之前向患者施用的抗原结合分子的剂量。
根据本发明此方面的方法可包括向患者施用任何数目的二级和/或三级剂量的抗原结合分子(例如抗HER2抗体或特异性结合HER2和APLP2的双特异性抗原结合分子)。举例来说，在某些实施方案中，仅向患者施用单个二级剂量。在其他实施方案中，向患者施用两个或更多(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)个二级剂量。同样地，在某些实施方案中，仅向患者施用单个三级剂量。在其他实施方案中，向患者施用两个或更多(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)个三级剂量。
在涉及多个二级剂量的实施方案中，可以与其他二级剂量相同的频率施用每个二级剂量。举例来说，可在紧挨着的前一剂量之后1至2周时向患者施用每个二级剂量。类似地，在涉及多个三级剂量的实施方案中，可以与其他三级剂量相同的频率施用每个三级剂量。举例来说，可在紧挨着的前一剂量之后2至4周时向患者施用每个三级剂量。或者，在治疗方案的过程中向患者施用二级和/或三级剂量的频率可改变。还可在治疗过程期间在临床检查之后由医师根据个别患者的需要调整施用频率。
抗体的诊断用途
还可使用本发明的抗HER2抗体来检测和/或测量样品中的HER2或表达HER2的细胞，例如用于诊断目的。举例来说，可使用抗HER2抗体或其片段来诊断以HER2的异常表达(例如过表达、低表达、缺乏表达等)为特征的疾患或疾病。用于HER2的示例性诊断分析可包括例如使从患者获得的样品与本发明的抗HER2抗体接触，其中将抗HER2抗体用可检测标记或报告分子标记。或者，可将未标记的抗HER2抗体与本身被可检测标记的第二抗体组合用于诊断应用中。可检测标记或报告分子可为放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，诸如异硫氰酸荧光素或罗丹明(rhodamine)；或酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。本发明的抗HER2抗体的另一示例性诊断用途包括用于受试者中的肿瘤细胞的非侵入性鉴定和跟踪(例如正电子发射断层扫描(PET)成像)的目的的89Zr标记(诸如89Zr-去铁敏标记)的抗体。(参见例如Tavare,R.等Cancer Res.2016年1月1日；76(1):73-82；以及Azad,BB.等Oncotarget.2016年3月15日；7(11):12344-58。)可用于检测或测量样品中的HER2的特定示例性分析包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)以及荧光活化细胞分选(FACS)。
可用于根据本发明的HER2诊断分析中的样品包括从患者可获得的在正常或病理学条件下含有可检测量的HER2蛋白或其片段的任何组织或流体样品。通常，将测量从健康患者(例如未患与异常HER2水平或活性相关的疾病或病状的患者)获得的特定样品中的HER2水平以最初建立基线或标准HER2水平。然后，可将此基线HER2水平与在从疑似患有HER2相关疾病(例如含有表达HER2的细胞的肿瘤)或疾患的个体获得的样品中测量的HER2水平相比较。
虽然已参考许多实施方案特定地展示和描述了本发明，但本领域技术人员应了解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下在形式和细节中对本文所公开的各个实施方案作出改变，并且本文所公开的各个实施方案不旨在充当对权利要求书的范围的限制。
实施例
公布以下实施例，以便为本领域一般技术人员提供对如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制本发明人视为其发明的内容的范围。已努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有指示，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度以摄氏度计，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例1：抗HER2、抗APLP2以及抗HER2xAPLP2抗体的产生
通过分别用人HER2的细胞外结构域(氨基酸序列NP_004439.2(SEQ ID NO:51)的T23-T652的氨基酸)或人APLP2的细胞外结构域(氨基酸序列NP_001633.1(SEQ ID NO:52)的氨基酸G32-S692)对小鼠(例如包含编码人免疫球蛋白重链和人κ轻链可变区的DNA的工程化小鼠)进行免疫来获得抗HER2或抗APLP2抗体。分别以SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50阐述人HER2和人APLP2抗原的氨基酸序列。
在免疫之后，从每个小鼠收获脾细胞并且(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留其活力并且形成杂交瘤细胞，并且针对人HER2特异性进行筛选，或(2)使用人HER2片段或人APLP2片段作为结合和鉴定反应性抗体的分选试剂进行B细胞(抗原阳性B细胞)分选(如US2007/0280945A1)。
最初分离具有人可变区和小鼠恒定区的针对人HER2或人APLP2的嵌合抗体。通过标准分子克隆方法重组构建包含抗HER2特异性结合结构域和抗APLP2特异性结合结构域的双特异性抗体并且使其在CHO细胞中表达，其中抗HER2抗原结合结构域和抗APLP2抗原结合结构域各自包含与共同轻链可变区(LCVR)配对的不同的独特重链可变区(HCVR)。在例示的双特异性抗体中，使用来自抗HER2抗体的重链、来自抗APLP2抗体的重链以及抗HER2与抗APLP2抗体共同的轻链构建分子(参见例如SEQ ID NO:10)，并且使其在CHO细胞中表达。在一些情况下，可使用来自抗HER2抗体的重链；来自抗APLP2抗体的重链；以及来自抗HER2抗体的轻链、来自抗APLP2抗体的轻链或已知与多个重链臂(例如诸如Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1)混杂或有效配对的另一抗体轻链构建双特异性抗体(参见例如US 2011/0195454)。
针对包括亲和力、选择性等的所需特征对抗体进行表征和选择。
必要时，将小鼠恒定区用所需人恒定区(例如野生型人CH或修饰的人CH(例如IgG1、IgG2或IgG4同型))以及轻链恒定区(CL)置换，以产生完全人抗HER2、完全人抗APLP2抗体或完全人双特异性抗HER2xAPLP2抗体。虽然所选恒定区可根据特定用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶标特异性特征存在于可变区中。以“H4”或“H4H”开始的抗体名称命名或ID编号表示完全人抗体。通过B细胞分选法鉴定抗体并且用以“P”或“P2”结尾的抗体ID编号来命名。用以“D”结尾的抗体ID编号命名双特异性抗体。
下文阐述的实施例中详细描述了根据此实施例的方法产生的示例性抗HER2、抗APLP2以及抗HER2xAPLP2抗体的某些生物特性。
实施例2：抗体的表征
实施例2.1抗HER2抗体的表征
抗HER2抗体的重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表1阐述了编码被选择用于产生本文所公开的双特异性抗HER2xAPLP2抗体的抗HER2抗体的重链或轻链可变区(分别为HCVR或LCVR)或重链或轻链CDR(分别为HCDR和LCDR)的核酸(NA)序列以及其(括号中)氨基酸(AA)序列的序列标识符。
表1：抗HER2序列标识符
Figure BDA0002753904480001111
实施例2.2抗APLP2抗体的表征
抗APLP2抗体的重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表2阐述了编码被选择用于产生本文所公开的双特异性抗HER2xAPLP2抗体的抗APLP2抗体的重链或轻链可变区(分别为HCVR或LCVR)或重链或轻链CDR(分别为HCDR和LCDR)的核酸(NA)序列以及其(括号中)氨基酸(AA)序列的序列标识符。
表2：抗APLP2序列标识符
Figure BDA0002753904480001112
实施例2.3抗HER2xAPLP2抗体的表征
抗HER2xAPLP2抗体的重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
本文描述了结合HER2和APLP2的双特异性抗原结合分子；此类双特异性抗原结合分子在本文中也称为双特异性“抗HER2/抗APLP2”或“抗HER2xAPLP2”抗体、抗原结合蛋白或分子。抗HER2/抗APLP2双特异性分子的抗HER2部分可用于靶向表达人表皮生长因子受体2(HER2)的肿瘤细胞，并且双特异性分子的抗APLP2部分可用于介导HER2向溶酶体中的内化并且介导HER2降解。
以下实施例中描述了由对人HER2和人APLP2的细胞外部分具有不同结合亲和力的抗HER2和抗APLP2结合臂组成的双特异性抗体(参见以上实施例1至实施例2)。制造如2014年8月28日公布的美国专利申请公布号US20140243504A1中所阐述的具有野生型κCL和修饰(嵌合)的IgG4 CH结构域的例示双特异性抗体。
表3中阐述了所构建的各种抗HER2xAPLP2双特异性抗体的抗原结合结构域的组成部分的概述。
表3：
Figure BDA0002753904480001121
表3中所列的轻链为双特异性抗体的HER2靶向臂与APLP2靶向臂共同拥有的。表1阐述了用于构建表3中表征的双特异性抗体的抗HER2臂(即HCVR源自H4H13050P2或H4H13055P2)的各个重链可变区以及其对应CDR的核酸和氨基酸序列标识符。表2阐述了此实施例的双特异性抗体的抗APLP2臂的的各个重链可变区以及其对应CDR的核酸和氨基酸序列标识符。
实施例2.4对照抗体的表征
下文的实施例中提到的同型对照抗体为与不相关抗原(即FelD1(猫过敏反应)抗原)相互作用而与人APLP2或HER2没有交叉反应性的同型匹配(修饰的IgG4)抗体。
下文的实施例中提到的HER2/T对照抗体为源自称为曲妥珠单抗的抗体的重组制备的抗HER2抗体。
通过本文所描述的相同方法用源自上文提到的同型对照抗体的结合于FelD1的第一重链臂以及源自H4H13055P亲本抗体的结合于APLP2第二重链臂构建称为H4H28697D的双特异性抗FelD1xAPLP2。
实施例3：结合于可溶性截短人HER2或APLP2蛋白的Biacore KD
使用Biacore 4000仪器使用实时表面等离子体共振生物传感器测定HER2和APLP2结合于纯化的抗HER2 x APLP2双特异性抗体和亲本抗体的平衡解离常数(KD值)。首先通过使用单克隆小鼠抗人类Fc抗体(GE，目录号BR-1008-39)的胺偶联衍生得到Biacore传感器表面以捕获抗HER2 x APLP2双特异性单克隆抗体。在37℃下在0.01M Hepes pH 7.4、0.15MNaCl、1mM CaCl2、0.5mm MgCl2以及0.05％v/v表面活性剂吐温-20(Tween-20)(HBS-P操作缓冲液)中进行所有结合研究。将不同浓度的试剂(含在存在C端myc-myc-六聚组氨酸标签的情况下表达的人HER2细胞外结构域(hHER2-MMH；SEQ ID NO:53)或在存在C端myc-myc-六聚组氨酸标签的情况下表达的人APLP2细胞外结构域(hAPLP2-MMH；SEQ ID NO:54)的HBS-P操作缓冲液(在300nM至3.7nM范围内，3倍稀释)以30μL/分钟的流速注射在捕获了抗HER2 xAPLP2双特异性抗体的表面上持续4分钟，并且针对它们在HBS-P操作缓冲液中的解离监测10分钟。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件用1:1结合模型对实时传感器图进行拟合来测定动力学缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。如下由动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：
Figure BDA0002753904480001141
并且
Figure BDA0002753904480001142
表4和表5中示出了hHER2-MMH或hAPLP2-MMH在37℃下结合于本发明的不同抗HER2x APLP2双特异性抗体以及它们的亲本抗体的结合动力学参数。如表4中所示，在37℃下，hHER2-MMH以在3.37nM至5.15nM范围内的KD值结合于本发明的所有抗HER2 x APLP2双特异性抗体。hHER2-MMH以4.11nM和5.20nM的KD值结合于所有抗HER2亲本抗体。抗APLP2亲本抗体中无一者展现与hHER2-MMH的结合。如表5A中所示，在37℃下，hAPLP2-MMH以在145nM至976nM范围内的KD值结合于本发明的所有抗HER2 x APLP2双特异性抗体。hAPLP2-MMH以在145nM至899nM范围内的KD值结合于所有抗APLP2亲本抗体。抗HER2亲本抗体中无一者展现与hAPLP2-MMH的结合。如表5B中所示，在25℃下，hAPLP2-MMH以在8.5nM至17.2nM范围内的KD值结合于本发明的所有抗HER2 x APLP2双特异性抗体。hAPLP2-MMH以在11.2nM至21.7nM范围内的KD值结合于所有抗APLP2亲本抗体。
表4：抗HER2 x APLP2双特异性抗体和亲本抗体在37℃下结合于hHER2-MMH的结合动力学参数.
Figure BDA0002753904480001143
Figure BDA0002753904480001151
*NB表明在实验条件下，hHER2-MMH试剂未结合至所捕获的抗体
表5A：抗HER2 x APLP2双特异性抗体和亲本抗体在37℃下结合于hAPLP2-MMH的结合动力学参数.
Figure BDA0002753904480001152
*NB表明在实验条件下，hAPLP2-MMH试剂未结合至所捕获的抗体
注意，两种双特异性抗体(H4H25018D和H4H25019D)以在100至200nM范围内的低亲和力结合于APLP2，而它们对HER2的结合亲和力小于10nM(分别为4.21和5.15nM)。两种双特异性抗体(H4H25014D和H4H25017D)以在200至300nM范围内的适度低亲和力结合于APLP2，而它们对HER2的结合亲和力仍然小于10nM，甚至小于5nM(分别为3.37和4.85nM)。最后，两种双特异性抗体(H4H25020D和H4H25021D)对APLP2展现在800nM至1μM范围内的非常低的结合亲和力，并且对HER2仍展现小于10nM(分别为4.20和5.15nM)的强结合亲和力。参见表4与表5。
表5B：抗HER2 x APLP2双特异性抗体和亲本抗体在25℃下结合于hAPLP2-MMH的结合动力学参数
Figure BDA0002753904480001161
实施例4：癌细胞系和正常原代培养物中HER2和APLP2的相对表达
为测定十一(11)种癌细胞系[MDA-MB-468(ATCC，目录号HTB-132)、T47D(ATCC，目录号HTB-133)、过表达转基因HER2和Cas9的T7D、MCF7(ATCC，目录号HTB-22)、JIMT-1(DSMZ，目录号ACC589)、BT483(ATCC，目录号HTB-121)、MDA-MB-361(ATCC，目录号HTB-27)、MDA-MB-231(ATCC，目录号HTB-26)、MDA-MB-453(ATCC，目录号HTB-131)、SK-BR3(ATCC，目录号HTB-30)以及NCI-N87(ATCC，目录号CRL5822)以及两(2)种正常原代培养物[正常肺上皮细胞(NLE；ATCC，目录号PCS-300-010)和正常乳腺上皮细胞(NBE；ATCC细胞PCS-600-010)]中HER2和APLP2的相对表达，进行了西方墨点分析。对于所述分析，将细胞于其适当培养基中以1x106个细胞/孔涂铺于6-孔细胞培养板上，表6中描述了每种细胞系/培养物的适当培养基，并且在37℃下在5％CO2中孵育过夜。
表6：所测试的每种细胞类型的培养基组成
Figure BDA0002753904480001171
在孵育之后，将细胞用含DPBS的培养基(DPBS/CM)洗涤一次，并且放置于冰上。随后，将DPBS/CM用150uL的溶解缓冲液[由13mL 1xRIPA缓冲液(Boston Bioproducts，目录号BP-116)、200uL蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher，目录号1861280)、5mL 4x利姆里(Laemmli)(Invitrogen，目录号NP0007)以及2mL 10x还原剂(Invitrogen，目录号NP0009)组成]替换。随后刮掉细胞，然后将样品转移至用有一个洞/孔的膜覆盖的1.2mL深96孔板。将板在50％功率下超声处理十次(每次1秒)。在超声处理之后，将板在80℃的水浴中煮10分钟。随后将样品冷冻。随后将样品解冻并且将20uL的每种样品加载至楔形4-12％TRIS-甘氨酸凝胶(Invitrogen，目录号XP04125BOX)中并且在150V下运行1-1.5小时。然后使用iBlot2干式转印系统(ThermoFisher，目录号IB21001)将凝胶转移至PVDF膜(ThermoFisher，目录号IB24001)中。然后在室温下用含5％牛乳(BioRad，目录号170-6404)的TRIS缓冲盐水(TBS；ThermoFisher，目录号28376)将膜封闭1-3小时。然后将含第一抗体[兔抗HER2抗体(Dako，目录号A048529)或小鼠抗APLP2抗体(Millipore，目录号MABN782)]的含有含2.5％牛乳和0.1％吐温(Sigma，目录号P8074)的TBS的溶液添加至膜中并且在4℃下孵育过夜。然后，在室温下将膜用TBS洗涤3次持续5分钟。之后，则将含抗兔HRP抗体(Promega，#W401B)或抗小鼠HRP抗体(Promega，目录号W402B)以及抗肌动蛋白HRP抗体(Santa Cruz，目录号sc-47779)的含有含2.5％牛乳和0.1％吐温的TBS的溶液添加至膜中并且在室温下孵育1小时。然后，在室温下将膜用含有0.1％吐温的TBS洗涤2次持续5分钟，然后在室温下用TBS再洗涤2次持续5分钟。然后用ECL检测试剂(GE healthcare，目录号RPN2106)使墨点显影并且用Azure C300成像器成像。使用ImageJ软件进行条带定量(平均荧光强度减去背景)。对于定量，测定HER2/肌动蛋白和APLP2/肌动蛋白比率并且随后针对最高值进行规范化，对于HER2/肌动蛋白最高值为SK-BR-3而对于APLP2/肌动蛋白则为JIMT-1。(参见图1。)
表7中示出了在十一(11)种癌细胞系和两(2)种正常原代培养物中相对于肌动蛋白水平的HER2和APLP2表达水平。
表7：由十一(11)种癌细胞系和两(2)种正常原代培养物产生的与肌动蛋白相比的HER2和APLP2的相对表达
细胞系 规范化的APLP2/肌动蛋白 规范化的HER2/肌动蛋白
正常肺 19％ 1％
正常乳腺 27％ 1％
MDA-MB-231 86％ 2％
MDA-MB-468 65％ 0.1％
MCF7 42％ 17％
T47D 100％ 36％
BT483 49％ 43％
JIMT-1 95％ 50％
MDA-MB-361 86％ 66％
MDA-MB-453 33％ 70％
SKBR3 44％ 86％
T47D/HER2 85％ 84％
N87 39％ 100％
实施例5：双特异性抗HER2xAPLP2抗体与表达HER2的细胞的结合由抗HER2臂介导并且取决于抗HER2臂
为测试本文所描述的双特异性抗HER2xAPLP2分子结合于表达各种水平的HER2细胞系的能力，进行了高容量成像分析。对于所述分析，使用了8种癌细胞系[MDA-MB-468(ATCC,HTB-132)、T47D(ATCC,HTB-133)、MCF-7(ATCC,HTB-22)、JIMT-1(DSMZ,ACC589)、BT-483(ATCC,HTB-121)、MDA-MB-361(ATCC,HTB-27)、MDA-MB-453(ATCC,HTB-131)以及SK-BR-3(ATCC,HTB-30)]以及2种正常原代培养物[正常肺上皮细胞(NLE；
Figure BDA0002753904480001191
目录号PCS-300-010)和正常乳腺上皮细胞(NBE；
Figure BDA0002753904480001192
目录号PCS-600-010)]。将细胞于它们的适当培养基中以2.5x105个细胞/孔涂铺于胶原蛋白包被的黑色壁96孔光学板(Greiner，目录号655936)上，表6中描述了每种细胞系/培养物的适当培养基，并且在37℃下在5％CO2中孵育过夜。
第二天，在4℃下将细胞与10ug/mL的Alexa647标记(Thermo，目录号A37573)的双特异性抗HER2 x APLP2分子(H4H25014D、H4H25018D、H4H25020D、H4H25017D、H4H25019D以及H4H25021D)一起在50μL的DMEM中孵育1小时。之后，将细胞用冷DMEM+10％FBS洗涤两次。向冷DMEM+10％FBS中添加100μL的由含8％多聚甲醛(Electron Microcopy Sciences，目录号15710)+0.15％皂苷(Sigma，目录号S4521)+20ug/ml Hoechst(Lifetech，#H3569)的DPBS/CM组成的溶液，并且在室温下孵育20分钟以固定细胞并且在将细胞的核染色的同时将细胞透性化。之后，将溶液用DPBS/CM替换。使用Image XpressMicro自动显微镜(MolecularDevices)测量双特异性抗体与每种细胞类型的结合。荧光标记的APLP2xHER2双特异性抗体与细胞的结合(表8)与实施例4中所测定的HER2表达水平成正。(还参见图2。)
表8：双特异性抗HER2xAPLP2双特异性抗体以不同的亲和力结合于8种癌细胞系和2种正常原代培养物。使用MetaXpress软件(Molecular Devices)测定每种条件下抗体结合的信号(Alexa647的平均强度荧光)除以核信号。针对展示最高抗体结合信号的细胞系对值进行规范化。
Figure BDA0002753904480001201
Figure BDA0002753904480001211
为测试本文所描述的双特异性抗HER2xAPLP2结合蛋白的各个臂与表达HER2与APLP2两者的细胞的结合的贡献，使用MDA-MB-361(ATCC，目录号HTB-27)乳腺癌细胞系进行了竞争结合分析。对于所述分析，将细胞于它们的适当培养基(先前实施例中所描述)中以2.5x105个细胞/孔涂铺于胶原蛋白包被的黑色壁96孔光学板(Greiner，目录号655936)上，并且在37℃下在5％CO2中孵育过夜。第二天，将细胞在4℃下放置于冷冻机中持续30分钟。在4℃下制备67μM的Alexa647(Thermo，目录号A37573)标记的双特异性抗HER2xAPLP2抗体(H4H25014D、H4H25018D、H4H25020D、H4H25017D、H4H25019D或H4H25021D)或零抗体(空白)于含有10％FBS的DMEM中的溶液。在333mM的浓度下向每种抗体溶液中添加单独PBS、单独的在存在C端myc-myc-六聚组氨酸标签的情况下表达的人HER2细胞外结构域(hHER2-MMH；SEQID NO:53)、单独的在存在C端myc-myc-六聚组氨酸标签的情况下表达的人APLP2细胞外结构域(hAPLP2-MMH；SEQ ID NO:54)或hHER2-MMH与hAPLP2-MMH的组合。在孵育并且移除培养基之后，在4℃下将50μL/孔的双特异性抗体和可溶性蛋白质溶液添加至细胞中持续30分钟。随后在4℃下将细胞用150μL/孔的含有10％FBS的DMEM洗涤10分钟。在此洗涤之后，将50μL的固定缓冲液[含有9mL含PBS的培养基(PBS/CM)、3mL的16％多聚甲醛(ElectronMicroscopy Sciences，目录号15710)以及10μg/ml的Hoechst(最终浓度)；(Lifetech，目录号H3569)]添加至每个孔中并且在室温下孵育20分钟。然后移除固定缓冲液，添加100uL的DPBS/CM并且使其在图像采集之前在室温下孵育约20分钟。使用Image XpressMicro自动显微镜(Molecular Devices)测量双特异性抗体与每种细胞类型的结合。使用MetaXpress软件(Molecular Devices)分析所获得的数据。针对不存在双特异性抗体(称为空白)时所获得的信号对双特异性抗体的结合信号进行规范化。
虽然可溶性hHER2-MMH的存在显著抑制每种所测试的双特异性抗HER2xAPLP2抗体与MDA-MB-361乳腺癌细胞的结合，但在可溶性hAPLP2-MMH情况下未见到此类效应。(参见下表9，以及图3)。
表9：在存在或不存在可溶性HER2和APLP2试剂的情况下抗HER2xAPLP2双特异性抗体与MDA-MB-361乳腺癌细胞系的结合
Figure BDA0002753904480001231
这些数据表明，本文所描述的双特异性抗HER2xAPLP2抗体的结合主要由抗HER2臂(不是抗APLP2臂)介导。因此，预期具有所描述的特性(包括较低程度的与APLP2的结合)的双特异性抗原结合分子将特异性地结合于表达APLP2与HER2两者的细胞，然而将减少与仅表达APLP2的细胞的结合。
实施例6：APLP2，而非HER2，快速内化和降解
基于在根据表6的培养基中培养的T47D细胞对APLP2和HER2抗体在T47D细胞(ATCC，HTB-133)上内化的能力进行测试。将T47D细胞于培养基中以50,000个细胞/孔涂铺于胶原蛋白包被的96孔光学板(Greiner，目录号655936)上并且在37℃下在5％CO2中孵育过夜。第二天，在37C下将细胞与1mg/ml荧光素标记的右旋糖酐一起孵育60min。将CF594标记的抗APLP2(R&D MAB49451)或抗HER2(HER2/T对照)抗体在67nM下与右旋糖酐一起孵育5、10、20、30、45或60min，此后将细胞洗涤一次并且在存在暖(37℃)培养基的情况下孵育10分钟。随后，在室温下将细胞用含4％PFA的DPBS+钙/镁(CM)固定10min并且用DPBS/CM洗涤两次。
使用LSM780蔡司共聚焦显微镜(Zeiss Confocal Microscope)进行采集。使用蔡司Zen软件分析所采集的图像。通过共聚焦栈中抗体像素与荧光右旋糖酐像素的共定位来定量内化抗体向溶酶体的运输。表10中示出了抗体与溶酶体共定位的时间(分钟)量。
表10：抗APLP2和抗HER2抗体向溶酶体中的内化
Figure BDA0002753904480001241
Figure BDA0002753904480001251
另外，基于T47D细胞对APLP2和HER2的降解速率进行测试。对于所述分析，将T47D细胞以106个细胞/孔涂铺于6孔板(Corning#3516)中。允许细胞在37℃下在5％CO2中在由RPMI 1640+10％FBS+1mM丙酮酸钠+10mM HEPES+10ug/mL胰岛素+5mL青霉素/链霉素/谷氨酰胺组成的培养基中生长过夜。第二天，将细胞用50ug/ml环己酰亚胺(Sigma#C4859-1ML)处理0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5以及5.5小时。在孵育之后，将细胞用1ml的DPBS/CM洗涤一次，并且随后放置于冰上，然后将DPBS/CM用800uL的溶解缓冲液[1x RIPA(BostonBioproducts，目录号BP-116)+蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher，1861280)替换，将细胞刮掉并且将溶解产物转移至1.5ml艾本德管(Eppendorf tube)。随后，将样品用25个脉冲进行超声处理，在50％功率下每个脉冲1秒。随后，将样品在-20℃下冷冻。随后将样品解冻并且将52ul的每个样品与20ul 4x利姆里(Invitrogen，NP0007)+8uL 10x还原剂(Invitrogen，目录号NP0009)]混合。将样品在95℃下煮10分钟，在室温下在14000RPM下离心10分钟。将40uL的每个样品加载至三个楔形4-20％TRIS-甘氨酸凝胶(Invitrogen，XP04125BOX)中并且在150V下运行。然后使用iBlot2干式转印系统(ThermoFisher，IB21001)将凝胶转移至两个PVDF膜(ThermoFisher，IB24001)中。然后在室温下用含5％牛乳(BioRad，目录号170-6404)的TBS将膜封闭3小时。然后将含原代抗体、兔抗HER2抗体(Dako，目录号A048529)或兔抗APLP2抗体(abcam，目录号ab140624)的含2.5％牛乳+0.1％吐温(Sigma，目录号P8074)的TRIS缓冲盐水(TBS；ThermoFisher，目录号28376)添加至膜中并且在4℃下孵育过夜。然后，在室温下将膜用TBS洗涤3次持续5分钟。之后，将含抗兔HRP抗体(Promega，#W4011)和抗肌动蛋白HRP抗体(Santa Cruz，目录号sc-47779)的含2.5％牛乳+0.1％吐温的TBS添加至膜中并且在室温下孵育1小时。然后在室温下将膜用TBS+0.1％吐温洗涤2次持续5分钟，然后在室温下用TBS再洗涤2次持续5分钟。然后用ECL检测试剂(GE healthcare，目录号RPN2106)使墨点显影并且用Azure C300成像器成像。使用ImageJ进行条带定量(平均荧光强度减去背景)。表11概述了针对未接触CHX的细胞规范化的环己酰亚胺(CHX)处理之后的HER2、APLP或T47D细胞。
表11：T47D细胞中的APLP2和HER2周转.
Figure BDA0002753904480001261
如表10中所示，与HER2相比，APLP2的溶酶体运输显著更快。如表11中所示，APLP2，而非HER2，经历快速周转。在5.5小时之后观察到环己酰亚胺处理仅诱导22％HER2降解，而在相同量的时间中观察到94％APLP2降解。在仅1.5小时内百分之八十八的APLP2降解(还参见图4)。
实施例7：细胞表面表达的HER2在结合双特异性抗HER2xAPLP2抗体之后的降解
基于T47D细胞对双特异性抗HER2xAPLP2结合蛋白或适当结合蛋白对照降解HER2的能力进行了测试，与表7中所列的乳腺肿瘤细胞系相比，T47D细胞表达较低水平的HER2。对于所述分析，将T47D细胞以25,000个细胞/孔涂铺于胶原蛋白包被的96孔光学板(Greiner，目录号655936)中。将细胞在37℃下在5％CO2中在由RPMI 1640+10％FBS+1mM丙酮酸钠+10mM HEPES+10ug/mL胰岛素+5mL青霉素/链霉素/谷氨酰胺组成的培养基中孵育。第二天，将双特异性抗HER2xAPLP2结合蛋白(H4H25018D、H4H25019D、H4H25014D、H4H25020D、H4H25017D以及H4H25021D)、单特异性抗HER2结合蛋白(HER2/T对照和H4H13055P)或同型对照结合蛋白以10μg/mL的最终浓度添加至细胞中。将结合蛋白在细胞上在37℃下在5％CO2中孵育4小时。在孵育之后，将细胞在冰上用100μL的含钙和镁的DPBS溶液(DPBS/CM)洗涤一次，此后将DPBS/CM溶液用80μL的溶解缓冲液[6500uL 1x RIPA(Boston Bioproducts，目录号BP-116)、65uL蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher，1861280)、2500uL的4x利姆里(Invitrogen，NP0007)以及1000μL 10x还原剂(Invitrogen，目录号NP0009)]替换。在添加缓冲液之后，在4℃下将板在回转式板振荡器(ScientificIndustries，SI 0401)上在中速(约1250RPM)下孵育30分钟。随后，将样品在-20℃下冷冻。随后将样品解冻，在4℃下在4000RPM下离心10分钟，然后转移至PCR板并且在热循环器中在85℃下煮10分钟。然后在4℃下将样品在4000RPM下离心10秒。将40μL的每个样品加载至楔形4-12％TRIS-甘氨酸凝胶(Invitrogen，XP04125BOX)中并且在150V下运行。然后使用iBlot2干式转印系统(ThermoFisher，IB21001)将凝胶转移至PVDF膜(ThermoFisher，IB24001)中。然后在室温下用含5％牛乳(BioRad，目录号170-6404)的TRIS缓冲盐水(TBS；ThermoFisher，目录号28376)将膜封闭1-3小时。在4℃下将膜与原代兔抗HER2抗体(Dako，目录号A048529)一起在含有2.5％牛乳+0.1％吐温(Sigma，目录号P8074)的TBS中孵育过夜。随后，在室温下将膜用TBS洗涤3次持续5分钟。之后，将含抗兔HRP抗体(Promega，#W401B)和抗肌动蛋白HRP抗体(Santa Cruz，目录号sc-47779)的含2.5％牛乳+0.1％吐温的TBS添加至膜中并且在室温下孵育1小时。然后在室温下将膜用TBS+0.1％吐温洗涤2次持续5分钟，然后在室温下用TBS再洗涤2次持续5分钟。然后用ECL检测试剂(GE healthcare，目录号RPN2106)使墨点显影并且用Azure C300成像器成像。使用ImageJ进行条带定量(平均荧光强度减去背景)。
如表12中所示，双特异性抗HER2xAPLP2结合蛋白(H4H25018D、H4H25019D、H4H25014D、H4H25020D、H4H25017D以及H4H25021D)诱导HER2降解，并且在T47D细胞上剩余约12％至38％的HER2表达。相比之下，单特异性抗HER2抗体、HER2/T对照以及H4H13055P(其中衍生出测试抗体H4H25014D、H4H25020D以及H4H25021D的抗HER2结合臂)诱导HER2降解，并且在T47D细胞上分别剩余约73％和90％的HER2表达。同型对照不诱导任何HER2降解。还参见图5。
表12：由双特异性抗HER2xAPLP2分子引起的T47D细胞上的HER2降解
Figure BDA0002753904480001281
最值得注意的是，含有H4xH21387P2 APLP2臂并且对APLP2具有100与200nM之间的结合亲和力的两种抗APLP2xHER2双特异性抗体H4H25018D和H4H25019D与其他双特异性抗体相比在T47D细胞中最高效地诱导HER2降解，并且细胞展现小于20％的剩余HER2表达。由单特异性抗体(HER2/T和H4H13055P亲本抗体)引起HER2降解的效率比双特异性抗体H4H25018D和H4H25019D低超过50％。
实施例8：APLP2臂对APLP2的亲和力调节双特异性抗HER2xAPLP2抗体内化的效率
对双特异性抗HER2xAPLP2抗体的子集在MDA-MB-361细胞单层或MDA-MB-361肿瘤球状体上内化的能力进行了测试。对于所述分析，将MDA-MB-361细胞(ATCC，目录号HTB-27)于含有10％FBS的DMEM中分别以25,000个细胞/孔涂铺于胶原蛋白包被的96孔光学板(Greiner，目录号655936)上或以1,000个细胞/孔涂铺于
Figure BDA0002753904480001292
96孔黑色透明圆底超低附着球状体微板(Corning#4520)上，并且在37℃下在5％CO2中孵育过夜(对于细胞)或三天(对于肿瘤球状体)。在孵育之后，将细胞用冷(4℃)培养基孵育30分钟，并且将球状体用暖(37℃)培养基孵育3小时，各个培养基含有10μg/mL的Alexa647(Thermo，目录号A37573)标记的抗HER2xAPLP2结合蛋白(H4H25014D、H4H25018D或H4H25020D)。之后，将细胞用冷(4℃)培养基洗涤一次或两次。
在洗涤之后，在室温下将细胞放置于基础上皮细胞培养基(ATCC，目录号PCS-600-030)中，然后在1-2分钟后在蔡司转盘共聚焦显微镜(Zeiss Spinning Disc ConfocalMicroscope)上开始实时图像采集。将球状体用4％PFA 0.075％皂苷+10μg/ml Hoechst固定，随后用DPBS洗涤。在蔡司转盘共聚焦显微镜上采集来自球状体中心的共聚焦图像。使用蔡司Zen软件分析所采集的图像。表13中按每分钟示出了双特异性抗体内化至MDA-MB-361细胞中的量(以任意单位表示)。
表13：由MDA-MB-361细胞内化的双特异性抗HER2xAPLP2抗体的量
Figure BDA0002753904480001291
Figure BDA0002753904480001301
Figure BDA0002753904480001311
如表13中所示，含有相同HER2臂和不同APLP2臂的三种双特异性抗HER2xAPLP2抗体由细胞内化并且穿透至肿瘤球状体的中心。参见图6。含有H4xH21387P2 APLP2臂的H4H25018D展示最快的内化速率(表13)以及由存在增加的细胞内囊泡(箭头)数目证实的比H4H24020D更高效的内化。参见图6(下部图)。在不希望受理论限制的情况下，此数据表明双特异性抗HER2xAPLP2结合蛋白的内化可取决于APLP2臂的内化动力学以及使双特异性抗HER2xAPLP2结合蛋白使用HER2臂结合于细胞表面并且随后使用APLP2臂内化的作用机制。
实施例9：产生和表征药物缀合的抗HER2xAPLP2结合蛋白
使用了两种药物缀合方法。在第一种方法中，在周围温度下使50mM HEPES、150mMNaCl，pH 8.0以及10-15％(v/v)DMA中之抗体(10-20mg/mL)经由赖氨酸与5-6倍过量的SMCC-DM1或(化合物I)缀合2小时。(还参见如2017年11月15日提交的PCT国际申请号PCT/US2017/061757中的包括使本文所描述的抗体或双特异性抗原结合蛋白与具有式B的化合物接触的方法。)在第二种方法中，在37℃下将50mM HEPES、150mM NaCl，pH 7.5中的抗体(10mg/mL)用1mM二硫苏糖醇处理30分钟。在凝胶过滤(G-25，pH 4.5乙酸钠)之后，将马来酰亚胺基接头有效负荷衍生物化合物II(还参见来自WO2016160615的化合物60)(1.2当量/SH基团)DMSO(10mg/ml)添加至经还原的抗体中并且用1M HEPES(pH 7.4)将混合物调节至pH7.0以缀合至经还原的链间半胱氨酸。
通过尺寸排阻色谱法或彻底超滤将每种缀合物纯化，然后进行无菌过滤。通过UV光谱分析测定蛋白质浓度。尺寸排阻HPLC确定所用的所有缀合物为>95％单聚的。根据Hamblett等(American Association for Cancer Research.2004年10月15日；10(20):7063-70)通过UV针对接头有效负荷加载值(药物与抗体比率；DAR值)和/或通过质谱法使用天然相较于缀合物的质量差对所有缀合的抗体进行分析。表14中概括了结果。
表14：抗体药物缀合物中的每一者的产率百分比和有效负荷与抗体比率
Figure BDA0002753904480001331
对于第一种缀合方法，为确定接头-有效负荷加载于抗体上，将缀合物去糖基化，并且通过LC-MS进行分析。简单来说，将50μg的缀合物用milli-Q水稀释到1mg/mL的最终浓度。将十μL的PNG酶F溶液[通过添加150μL的PNG酶F储备物(New England Biolabs，目录号P0704L)和850μL的milli-Q水并且充分混合来制备PNG酶F溶液]添加至稀释的缀合物溶液中，然后在37℃下孵育过夜。将5μL的各个样品注射至LC-MS(Waters Synat G2-Si)上并且历时25分钟用0.1mL/分钟的梯度流动相20-40％洗脱(流动相A：0.1％v/v甲酸/H2O；流动相B：0.1％v/v甲酸/乙腈)。在80℃下在Waters Acquity BEH C4柱(1.0x50mM，1.7μM)上实现LC分离。使用Masslynx软件将质谱谱图反卷积并且使用以下等式计算药物与抗体比率(DAR)。
根据分布峰强度(PI)的药物(Dn)相对百分比(％)：
Dn％＝PIn/∑(PI0+PI1+PI2……+PIi)×100(n＝0,1,2,3,…,i)
平均DAR计算：
DAR＝∑(1×D1％+2×D2％+3×D3％+……+i×Di％)
对于第二种缀合方法，为确定接头-有效负荷加载于抗体上，将缀合物去糖基化，还原并且通过LC-MS进行分析。简单来说，将50μg的缀合物用milli-Q水稀释到1mg/mL的最终浓度。将十μL的PNG酶F溶液[通过添加150μL的PNG酶F储备物(New England Biolabs，目录号P0704L)以及850μL的milli-Q水并且充分混合来制备PNG酶F溶液]添加至稀释的缀合物溶液中，然后在37℃下孵育过夜。将2.4μL的0.5M TCEP添加至样品中，使得所得材料具有20mM的最终TCEP浓度并且然后将其在50℃下孵育30分钟。将10μL的各个样品注射至LC-MS(Waters Synat G2-Si)上并且历时25分钟用0.1mL/分钟的梯度流动相20-40％洗脱(流动相A：0.1％v/v甲酸/H2O；流动相B：0.1％v/v甲酸/乙腈)。在80℃下在Waters Acquity BEHC4柱(1.0X50mM，1.7μM)上实现LC分离。
将质谱谱图反卷积以鉴定由轻链(L)加上接头-有效负荷值＝0和1以及重链(H)加上接头-有效负荷值＝0、1、2以及3表示的轻链和重链峰。由各种物质的强度，针对均二聚体或异二聚体抗体缀合物，使用以下方程计算药物与抗体比率(DAR)。计算中使用各个反卷积峰的强度。
Figure BDA0002753904480001341
实施例10：SMCC-DM1、化合物I缀合的抗HER2xAPLP2结合蛋白或化合物II缀合的抗HER2xAPLP2结合蛋白的体外细胞毒性
为比较与SMCC-DM1、化合物I或化合物II毒素缀合的双特异性HER2 x APLP2抗体药物缀合物(ADC)的IC50，进行了体外细胞毒性分析。对用降低的ADC浓度处理6天的JIMT-1细胞进行分析并且在处理之后通过对核计数来测量细胞活力。对于所述分析，将JIMT-1(DSMZ，目录号ACC589)以3x103个细胞/孔接种于胶原蛋白包被的96孔光学板(Greiner，目录号655936)上并且在37℃下在5％CO2中在含有DMEM、10％FBS以及10ug/mL胰岛素的培养基中生长过夜。第二天，双特异性抗HER2xAPLP2 ADC(H4H25018D-SMCC-DM1、H4H25019D-SMCC-DM1、H4H25018D-化合物I、H4H25019D-化合物I、H4H25018D-化合物II、H4H25019D-化合物II)或与SMCC-DM1、化合物I或化合物II缀合的非结合对照抗体以在于DMEM和10％FBS中66.67nM至0.01nM范围内的最终浓度添加至细胞中并且然后孵育6天。在孵育之后，将110uL的核染色剂[50mL的8％多聚甲醛加0.15％皂苷(Sigma，目录号S4521)和20ug/mLHoechst(Lifetech，目录号H3569)]添加至每个孔中并且在室温下孵育15-25分钟。随后移除培养基和染色剂并且将孔用含钙和镁的DPBS(DPBS/CM)洗涤一次。在洗涤之后，将孔放置于DPBS/CM中。然后在ImageXpressMicro自动显微镜(Molecular Devices)上使用10X物镜使每个孔九个区域成像。使用MetaXpress软件(Molecular Devices)由所采集的图像对核进行定量。在10点反应曲线(GraphPad Prism)上由双相衰减方程确定IC50值。所有IC50值以nM浓度表示。
表15：与DM1、化合物I或化合物II缀合的HER2 x APLP2双特异性ADC和对照的细胞毒性.
细胞系 HER2表达 所测试的ADC IC<sub>50</sub>(nM)
JIMT-1 中 同型对照-SMCC-DM1 15
JIMT-1 中 H4H25018D-SMCC-DM1 0.07
JIMT-1 中 H4H25019D-SMCC-DM1 0.13
JIMT-1 中 同型对照-化合物I >67
JIMT-1 中 H4H25018D-化合物I 0.2
JIMT-1 中 H4H25019D-化合物I 0.75
JIMT-1 中 同型对照-化合物II 32.5
JIMT-1 中 H4H25018D-化合物II 0.3
JIMT-1 中 H4H25019D-化合物II 0.9
如表15中所示，与DM1缀合的双特异性抗HER2xAPLP2结合蛋白(H4H25018D-SMCC-DM1和H4H25019D-SMCC-DM1)均展现杀伤作用，IC50值分别为0.07nM和0.13nM。与化合物I或化合物II缀合的H4H25018D和H4H25019D显示与其相应DM1缀合物类似的IC50值。与SMCC-DM1、化合物I或化合物II缀合的非结合对照抗体展现不太高效的杀伤作用，IC50值介于15与>67nM之间。
实施例11：与单特异性抗HER2抗体相比双特异性抗HER2xAPLP2 ADC对表达HER2的细胞展现更大的靶向细胞毒性实验1
为测试本发明的HER2 x APLP2双特异性抗体药物缀合物(ADC)杀死生物分析细胞的能力，进行了体外细胞毒性分析。对用降低的ADC浓度处理6天的具有不同HER2表达水平的细胞进行分析并且在处理之后通过对核计数来测量细胞活力。对于所述分析，将MDA-MB-231(ATCC，HTB-26)、MDA-MB-468(ATCC，目录号HTB-132)、MCF7(ATCC，目录号HTB-22)、T47D细胞(ATCC，HTB-133)、JIMT-1(DSMZ，ACC589)、MDA-MB-361(ATCC，目录号HTB-27)、MDA-MB-453(ATCC，目录号HTB-131)或SKBR3(ATCC，HTB-30)以3x103个细胞/孔接种于胶原蛋白包被的96孔光学板(Greiner，目录号655936)上并且在37℃下在5％CO2中在根据表6的培养基中培养过夜。第二天，将双特异性抗HER2xAPLP2 ADC(H4H25018D-SMCC-DM1和H4H25019D-SMCC-DM1)、双特异性抗FelD1xAPLP2 ADC(H4H28697D-SMCC-DM1)、HER2/T对照Ab-SMCC-DM1或同型对照-SMCC-DM1以在于DMEM和10％FBS中66.67nM至0.01nM范围内的最终浓度添加至细胞中并且然后孵育6天。在孵育之后，将110uL的核染色剂[50mL的8％多聚甲醛加0.15％皂苷(Sigma，目录号S4521)和20ug/mL Hoecsht(Lifetech，目录号H3569)]添加至每个孔中并且在室温下孵育15-25分钟。随后移除培养基和染色剂并且将孔用含钙和镁的DPBS(DPBS/CM)洗涤一次。在洗涤之后，将孔放置于DPBS/CM中。然后在Image XpressMicro自动显微镜(Molecular Devices)上使用10X物镜使每个孔九个区域成像。使用MetaXpress软件(Molecular Devices)由所采集的图像对核进行定量。在10点反应曲线(GraphPad Prism)上由双相衰减方程确定IC50值。所有IC50值以nM浓度表示。表16A中概括了数据。还参见图7。
表16A：HER2 x APLP2双特异性ADC、FELD1 x APLP2双特异性ADC以及对照对具有不同HER2表达的细胞系的细胞毒性.
Figure BDA0002753904480001371
Figure BDA0002753904480001381
如表16A和图7中所示，在表达非常低HER2水平的MDA-MB-231和MDA-MB468细胞中，抗HER2xAPLP2结合蛋白ADC H4H25018D-DM1和H4H25019D-SMCC-DM1展现IC50值为5-9nM的杀伤作用。在相同细胞中，HER2/T对照-SMCC-DM1 ADC展现IC50值为10-25nM的不太高效的杀伤作用。同型对照-SMCC-DM1 ADC展现IC50值为18-35nM的不太高效的杀伤作用。
在表达低HER2水平的MCF-7和T47D细胞中，抗HER2xAPLP2结合蛋白ADC双特异性ADC H4H25018D-SMCC-DM1和H4H25019D-SMCC-DM1展现IC50值为2nM的杀伤作用。在相同细胞中，HER2/T对照-SMCC-DM1 ADC展现IC50值为10-40nM的不太高效的杀伤作用。同型对照-SMCC-DM1 ADC展现IC50值为30-50nM的不太高效的杀伤作用。
在表达中HER2水平的JIMT-1、MDA-MB-361以及MDA-MB-453细胞中，抗HER2xAPLP2结合蛋白ADC H4H25018D-SMCC-DM1和H4H25019D-SMCC-DM1展现IC50值在0.03与0.8nM之间的杀伤作用。在相同细胞中，HER2/T对照-SMCC-DM1 ADC和抗FelD1 x APLP2 ADC(H4H28697D-SMCC-DM1)展现IC50值分别为0.25-5nM和2-5nM的不太高效的杀伤作用。同型对照-SMCC-DM1 ADC展现IC50值为8-30nM的不太高效的杀伤作用。
在表达高HER2水平的SK-BR-3细胞中，抗HER2xAPLP2结合蛋白ADC H4H25018D-SMCC-DM1和H4H25019D-SMCC-DM1均展现杀伤作用，IC50值分别为0.02nM与0.03nM。在相同细胞中，HER2/T对照-SMCC-DM1 ADC展现IC50值为0.1nM的不太高效的杀伤作用。同型对照-SMCC-DM1 ADC展现IC50值为10nM的不太高效的杀伤作用。
在所测试的所有细胞系中，与HER2对照Ab-SMCC-DM1 ADC相比，抗HER2xAPLP2结合蛋白ADC H4H25018D-SMCC-DM1和H4H25019D-SMCC-DM1诱导更有效的细胞杀伤作用。抗HER2xAPLP2结合蛋白ADC未像它们杀死具有较高HER2水平的细胞那样高效杀死表达非常低HER2水平的细胞。双特异性抗FELD1xAPLP2结合蛋白几乎不诱导对表达中HER2水平的细胞系的杀伤作用，表明单独APLP2臂不足以驱动高效细胞杀伤作用。
实验2
为测试包含不同APLP2臂的本发明HER2 x APLP2双特异性抗体药物缀合物(ADC)杀死生物分析细胞的能力，进行了体外细胞毒性分析。对用降低的ADC浓度处理6天的具有不同HER2表达水平的细胞进行分析，并且在处理之后通过用细胞效价发光(PromegaG7571)测量ATP产生来测量细胞活力。
对于所述分析，将MDA-MB-231(ATCC，目录号HTB-26)、MCF7(ATCC，目录号HTB-22)、T47D(ATCC，目录号HTB-133)、ZR75-1(ATCC，目录号CRL1500)、JIMT1(DSMZ，ACC589)、MDA-MB-361(ATCC，目录号HTB-27)、MDA-MB-453(ATCC，目录号HTB-131)、SKBR3(ATCC，目录号HTB-30)或N87(ATCC，CRL5822)以3x103个细胞/孔接种于胶原蛋白包被的96孔光学板(Greiner，目录号655936)上。
将MDA-MB-231、MDA-MB-361以及MDA-MB-453细胞在含有DMEM和10％FBS的培养基中培养。将MCF-7在含有MEM、10％FBS以及10ug/mL胰岛素的培养基中培养。将T47D细胞在含有RPMI1640、10％FBS、谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES以及10ug/mL胰岛素的培养基中培养。将SKBR3在含有含10％FBS的麦考伊培养基(McCoy)的培养基中培养。将ZR75-1和N87在含有RPMI1640、10％FBS的培养基中培养。将JIMT1细胞在含有DMEM、10％FBS以及10ug/mL胰岛素的培养基中培养。
第二天，将HER2 x APLP2双特异性ADC(H4H25014D-DM1、H4H25018D-DM1以及H4H25020D-DM1)、外源性靶标x APLP2 ADC(H4H28695D-DM1、H4H28697D-DM1以及H4H28696D-DM1)、HER2对照Ab-DM1或同型对照-DM1以在于DMEM和10％FBS中66.67nM至0.01nM范围内的最终浓度添加至细胞中并且然后孵育6天。在孵育之后，将100uL的细胞效价发光溶液(Promega，目录号G7571)添加至每个孔中并且在室温下在回转式振荡器(400RPM)中孵育5分钟。在Spectramax M3读板仪(Molecular Devices)中定量发光。在10点反应曲线(GraphPad Prism)上由双相衰减方程确定IC50值。所有IC50值以nM浓度表示。
如表16B中所示，在表达高HER2水平的细胞系(SKBR3和N87)中，HER2-ADC和三种HER2 x APLP2双特异性ADC以类似程度诱导高效的细胞杀伤作用，IC50值在0.004-0.05nM范围内，而同型对照-ADC诱导低效细胞杀伤作用，IC50值为7nM。在表达中HER2水平的细胞系(MDAMB453、MDAMB361、JIMT1以及ZR751)中，与展现IC50 0.06-3nM的IC50值的杀伤作用的具有适度和弱APLP2臂的HER2 x APLP2双特异性ADC H4H25014D和H4H25020D相比，具有强APLP2臂的HER2 x APLP2双特异性ADC H4H25018D诱导IC50值在0.04-0.15nM范围内的更高效的细胞杀伤作用。在表达中HER2水平的细胞系(MDAMB453、MDAMB361、JIMT1以及ZR751)中，与三种双特异性抗体中的任一者相比，HER2-ADC诱导不太高效的细胞杀伤作用。在这些细胞中，同型对照-ADC诱导IC50值在1-30nM范围内的低效细胞杀伤作用。在表达低HER2水平的细胞系(T47D和MCF7)中，同型对照-ADC、HER2-ADC以及具有适度和弱APLP2臂的HER2 xAPLP2双特异性ADC诱导IC50值在10-70nM范围内的低效细胞杀伤作用。与其他ADC相比，具有强APLP2臂的HER2 x APLP2双特异性ADC展现略微更有效的杀伤作用，然而，效应有限，IC50值在3.5-5nM范围内。在表达非常低HER2水平的细胞系(MDAMB231)中，ADC中无一者诱导高效杀伤作用。在所测试的所有细胞系中，适度或弱单价APLP2-ADC诱导低效细胞杀伤作用，此与IC50值>6nM的同型对照-ADC重叠，而强单价APLP2-ADC展现IC50值>2nM的有限杀伤效应。
表16B：具有不同APLP2臂的HER2 x APLP2双特异性ADC、外源性靶标x APLP2双特异性ADC以及对照对具有不同HER2表达的细胞系的细胞毒性.
Figure BDA0002753904480001411
Figure BDA0002753904480001421
Figure BDA0002753904480001431
总之，HER2xAPLP2-ADC在高HER2表达细胞中与HER2-ADC一样高效，而在中HER2表达细胞中更高效地杀伤所测试的细胞系。在表达稍高于正常细胞中的HER2表达的低HER2水平的细胞中，HER2xAPLP2-ADC展现有限的细胞杀伤作用以至没有细胞杀伤作用。在所测试的任何细胞系中单价APLP2-ADC不足以诱导高效细胞杀伤作用。
实施例12：在JIMT-1肿瘤消退的体内模型中与单特异性抗HER2抗体相比双特异性抗HER2xAPLP2 ADC展现更大的靶向细胞毒性
为进一步测试示例性双特异性抗HER2xAPLP2双特异性抗体药物缀合物(ADC)的功效，进行了体内异种移植肿瘤研究。对于所述分析，使用8周龄雌性SCID小鼠(TaconicBiosciences；n＝70)。将JIMT-1(DSMZ，ACC589)细胞与基质胶(Corning，目录号354234)混合并且将150uL的含有5x106个细胞的细胞和基质胶悬浮液注射至SCID小鼠中。三周后，以10mg/kg(每个处理组n＝6)向基于肿瘤尺寸随机化的SCID小鼠皮下施用双特异性抗HER2xAPLP2 ADC(H4H25018D-SMCC-DM1和H4H25019D-SMCC-DM1)、HER2对照-SMCC-DM1以及同型对照-SMCC-DM1。在第一剂量后33天时，向所有组施用第二剂量。从第一次ADC施用后第1天到第83天使用卡尺(Roboz，目录号RS6466)每周两次测量每个小鼠的异种移植物尺寸。表17A中示出了所测量的每个时间点每个处理组的平均肿瘤尺寸。
表17A：用抗HER2 x APLP2-SMCC-DM1 ADC和对照-SMCC-DM1 ADC处理之后的JIMT-1异种移植肿瘤尺寸
Figure BDA0002753904480001441
接受双特异性抗HER2xAPLP2 H4H25018D-SMCC-DM1 ADC的小鼠观测到显著并且持续的JIMT-1异种移植物尺寸减小，达到平均尺寸小于16mm3。接受双特异性抗HER2 x APLP2H4H25019D-SMCC-DM1 ADC的小鼠观测到显著的JIMT-1异种移植物尺寸减小，达到77mm3的最低平均尺寸，但异种移植物的尺寸随后再次增长至437mm3。接受HER2/T对照-SMCC-DM1ADC的小鼠观测到JIMT-1异种移植物尺寸减小，达到140mm3的最低平均尺寸，但异种移植物的尺寸随后再次增长至大于1600mm3。接受同型对照-SMCC-DM1 ADC的小鼠在每次测量中观测到它们的JIMT-1异种移植物尺寸增加，达到1933mm3的平均尺寸。参见图8。
在类似实验中，将JIMT-1(DSMZ，ACC589)细胞与基质胶(Corning，目录号354234)混合，并且将150uL的含有5x106个细胞的细胞和基质胶悬浮液注射至SCID小鼠中。在植入之后11和25天时，以10mg/kg(每个处理组n＝6)向基于肿瘤尺寸随机化的SCID小鼠皮下施用抗HER2 x APLP2双特异性ADC(H4H25014D-DM1、H4H25018D-DM1以及H4H25020D-DM1)、抗APLP2 x不相关Ab对照ADC(H4H28695D-DM1、H4H28696D-DM1以及H4H28697D-DM1)、HER2对照-DM1以及同型对照-DM1。在植入后第11天、第13天、第16天、第19天、第23天、第25天、第30天、第33天、第37天、第44天、第48天、第53天、第56天、第59天、第68天以及第74天时使用卡尺(Roboz，目录号RS6466)测量每个小鼠的异种移植物尺寸。表17B中示出了所测量的每个时间点每个处理组的平均肿瘤尺寸。
接受抗HER2 x APLP2双特异性ADC H4H25018D-DM1的小鼠展现显著的JIMT-1异种移植物尺寸减小，达到93mm3的平均尺寸。接受抗HER2 x APLP2双特异性ADC H4H25014D-DM1和H4H25020D-DM1的小鼠展现JIMT1异种移植物的肿瘤停滞，所述JIMT1异种移植物保持接近于预处理的200mm3平均尺寸持续30天。相比之下，接受同型对照-DM1 ADC或HER2对照-DM1 ADC的小鼠在每次测量中观测到它们的JIMT-1异种移植物尺寸增加，到第30天时达到超过400mm3的平均尺寸并且在第53天超过1000mm3。接受抗APLP2 x不相关Ab对照ADC的小鼠观测到它们的JIMT-1异种移植物尺寸在几乎没有肿瘤停滞的情况下到第30天增加至283-366mm3的平均尺寸并且在第53天超过800mm3。
Figure BDA0002753904480001461
实施例13：在MDA-MB-361肿瘤消退的体内模型中与单特异性抗HER2抗体相比双特异性抗Her2xAPLP2 ADC展现更大的靶向细胞毒性
为进一步测试示例性双特异性抗HER2xAPLP2抗体药物缀合物(ADC)的功效，进行了体内异种移植肿瘤研究。简单来说，为6周龄雌性SCID小鼠(Taconic Biosciences；n＝60)皮下植入雌激素球粒(每个球粒0.72mg；Innovative Research of America，目录号NE-121)。第二天，将MDA-MB-361细胞(ATCC，HTB-27)与基质胶(Corning，目录号354234)混合，并且将150μL的含有5x106个细胞的细胞加基质胶悬浮液注射至SCID小鼠中。十二天后，以10mg/kg(每个处理组n＝7)向基于肿瘤尺寸随机化的SCID小鼠皮下施用双特异性抗HER2xAPLP2 ADC(H4H25018D-SMCC-DM1)、HER2/T对照-SMCC-DM1以及同型对照-DM1。从ADC施用后第1天到第95天使用卡尺(Roboz，目录号RS6466)测量每个小鼠的异种移植物尺寸。
表18中示出了所测量的每个时间点每个处理组的肿瘤尺寸的平均值(AVG)和标准偏差(SD)。
表18：用双特异性抗HER2xAPLP2-SMCC-DM1 ADC和对照-DMI处理进行处理之后的MDA-MB-361异种移植肿瘤尺寸
Figure BDA0002753904480001471
Figure BDA0002753904480001481
SD＝标准偏差
接受双特异性抗HER2xAPLP2 H4H25018D-SMCC-DM1 ADC的小鼠观测到显著并且持续的MDA-MB-361异种移植物尺寸减小。接受HER2对照-SMCC-DM1 ADC的小鼠观测到MDA-MB-361异种移植物尺寸减小，达到83mm3的最低平均尺寸，但异种移植物的尺寸随后再次增长至大于744mm3。接受同型对照-SMCC-DM1 ADC的小鼠在每次测量中观测到它们的MDA-MB-361异种移植尺寸增加，达到2041mm3的平均尺寸。
实施例13：抗HER2 x APLP2双特异性抗体(bsAb)在人源化APLP2小鼠中的药代动力学评估
在关于人APLP2而不是小鼠APLP2的表达为纯合子的小鼠(APLP2hu/hu小鼠)中进行3种抗HER2 x APLP2双特异性抗体(H4H25018D、H4H25014D、H4H25020D)以及hIgG4P二价非结合同型对照的药代动力学的评估。每组5个小鼠的队列接受单一皮下(SC)5mg/kg剂量的每种抗体。在给药后6小时以及1、2、3、4、7、10、14、21以及30天时收集血液样品。将血液加工成血清并且在80℃下冷冻直到进行分析。使用GyroLab xPlore平台(Gyros)测量H4H25018D、H4H25014D、H4H25020D以及同型对照抗体的血清浓度。
Gyros技术使用具有激光诱导的荧光检测的自动化免疫分析的亲和力流穿模式。将样品加载至压缩盘上，压缩盘含有多个径向排列的纳升级别亲和力捕获柱。通过离心力和毛细管力控制液体流。
简单来说，将在包含含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水的缓冲液(抗体稀释缓冲液)中稀释至100μg/mL的生物素化小鼠抗人IgG4/IgG1特异性单克隆抗体捕获在GyrolabBioaffy 200压缩盘上，所述压缩盘含有预加载有链霉亲和素包被的珠粒(DynospheresTM)的亲和柱。在此分析中用于校准的标准物为浓度在0.488至2000ng/mL范围内的H4H25018D、H4H25014D、H4H25020D或同型对照抗体。在含有0.1％NMS的包含含0.5％BSA的PBS的缓冲液(稀释缓冲液)中制备标准物和血清样品的连续稀释液。在室温下将单份的以1:50稀释的血清样品以及双份的标准物捕获至压缩盘上的抗人IgG4/IgG1特异性mAb包被的亲和柱上。通过添加0.5μg/mL的在Rexxip F缓冲液(Gyros，目录号P0004825)中稀释的Alexa-647-缀合的小鼠抗人κ单克隆抗体来检测H4H25018D、H4H25014D、H4H25020D或同型对照抗体，通过GyroLab xPlore仪器以反应单位(RU)记录所得荧光信号。用于校准的相应抗体标准物的最低浓度在分析的动态范围内并且定义为分析的检测下限(LLOQ)[0.02μg/mL]。由在GyrolabEvaluator软件中使用5参数逻辑曲线拟合构建的标准曲线通过内插法来确定样品浓度。报道2次重复实验的平均浓度。
使用
Figure BDA0002753904480001491
软件6.3版(Certara,L.P.,Princeton,NJ)以及血管外给药模型通过非区隔分析(NCA)确定PK参数。使用每种抗体的相应平均浓度值，在线性内插和均匀加权的情况下使用线性梯形法则来确定所有PK参数，包括在血清中观测的最大浓度(C最大)、所观测的估计半衰期(t1/2)以及浓度相较于达到最后可测量浓度的时间的曲线下面积(AUC最后)。
在APLP2hu/hu小鼠中施用抗HER2 x APLP2双特异性Ab之后，H4H25018D、H4H25014D、H4H25020D全部在血清中展现不同的抗体最大浓度(C最大)。H4H25020D具有47μg/mL的C最大浓度，而H4H25014D展现低1.3的35μg/mL的浓度并且H4H25018D展现12μg/mL的最低C最大；比H4H25020D低3倍。与同型对照抗体相比，H4H25020D、H4H25014D以及H4H25018D全部展现较低的C最大浓度(分别为1.7、2.3、6.5倍)。与同型对照抗体相比，H4H25018D、H4H25014D、H4H25020D全部展现更快的药物清除，暗示靶标介导的清除。H4H25018D和H4H25020D的PK的特征为快速抗体清除，抗体浓度分别在第21天和第30天不可检测。另外，与T1/2为4天的H4H25014D或T1/2为约11天的同型对照相比，H4H25018D与H4H25020D均具有不良半衰期(T1/2)，分别为1.6天和1.8天。与同型对照抗体(1070d*μg/mL)相比，H4H25018D、H4H25020D以及H4H25014D全部展现较低的药物暴露(AUC；分别为34、212、234d*μg/mL)。H4H25014D和同型对照的平均终末抗体浓度分别为0.67μg/mL和13.1μg/mL。
表19中提供了总抗HER2 x APLP2双特异性抗体浓度的数据的概述，表20中描述了平均PK参数并且图10中示出了相较于时间的平均总抗体浓度。
表19：在APLP2hu/hu小鼠中单次5mg/kg皮肤下注射H4H25018D、H4H25014D、H4H25020D或同型对照mAb之后随时间推移血清中的总IgG的平均浓度(±SEM)
Figure BDA0002753904480001501
Figure BDA0002753904480001511
缩写：时间＝单剂量注射后的时间(天)；d＝研究的天数；SEM＝标准平均误差；BLQ＝低于定量极限。
表20：药代动力学参数的概述
Figure BDA0002753904480001512
PK参数是由平均浓度与时间曲线得来。T1/2和AUC最后是基于直到第30天(如果适用)的浓度。示出了所有剂量组的每个PK参数的平均值±SEM值。缩写：AUC最后＝给药时到最后可测量浓度的曲线下面积；t1/2＝终末消除半衰期；C最大＝峰值浓度；d＝天；t最大＝观测到C最大的时间；SEM＝标准平均误差。
本发明的范围不受本文所描述的特定实施方案限制。实际上，除本文所描述的那些以外，由前述描述和附图，本发明的各种修改型式对本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改型式旨在属于随附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
A·佩雷·贝
J·安德列夫
T·波托奇
X·段
<120> 结合HER2和/或APLP2的抗体和双特异性抗原结合分子、其缀合物和用途
<130> 09108.419WO1/10419WO01
<140> TBD
<141> 2019-04-29
<150> 62/664,924
<151> 2018-04-30
<150> 62/728,622
<151> 2018-09-07
<150> 62/825,144
<151> 2019-03-28
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
caggttcagc tggtgcagtc tggacctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttccc aactttggga tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgcccctt acaatgttgc cacaaactat 180
gcaccgaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctat 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagatggggg 300
gctgggtaca tgggctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asn Phe
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ala Pro Tyr Asn Val Ala Thr Asn Tyr Ala Pro Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Ala Gly Tyr Met Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ggttacacct ttcccaactt tggg 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Pro Asn Phe Gly
1 5
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
atcgcccctt acaatgttgc caca 24
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Ile Ala Pro Tyr Asn Val Ala Thr
1 5
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
gcgagatggg gggctgggta catgggctac tactactacg gtatggacgt c 51
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Ala Arg Trp Gly Ala Gly Tyr Met Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
cagagcatta gcagctat 18
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
gctgcatcc 9
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Ala Ala Ser
1
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 387
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtcatt acttctggag ttggatccgc 120
caacaccccg ggaagggcct ggaatggatt ggttacatct tttacagtgg gagcacccac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgactttcc atttcagtgg acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaggc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattattg tgcgagagaa 300
gagggggatt acaatttttg ggatgttgat tatgtccccg gccactttga ctactggggc 360
cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 387
<210> 18
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
His Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Glu Gly Asp Tyr Asn Phe Trp Asp Val Asp Tyr Val
100 105 110
Pro Gly His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
ggtggctcca tcagcagtgg tcattacttc 30
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly His Tyr Phe
1 5 10
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
atcttttaca gtgggagcac c 21
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 23
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
gcgagagaag agggggatta caatttttgg gatgttgatt atgtccccgg ccactttgac 60
tac 63
<210> 24
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Ala Arg Glu Glu Gly Asp Tyr Asn Phe Trp Asp Val Asp Tyr Val Pro
1 5 10 15
Gly His Phe Asp Tyr
20
<210> 25
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc acctatgtca tgagttgggt ccgtcaggct 120
ccagggaagg ggccggagtg ggtctcaggt attagtggta gaactggtac cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactatat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gtcccgtata 300
acagcagctg gccgaggtta ctactactac tacggtatgg acgtctgggg ccgagggacc 360
acggtcaccg tctcctca 378
<210> 26
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Arg Thr Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ile Thr Ala Ala Gly Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
ggattcacct ttagcaccta tgtc 24
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Val
1 5
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
attagtggta gaactggtac caca 24
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Ile Ser Gly Arg Thr Gly Thr Thr
1 5
<210> 31
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
gcgtcccgta taacagcagc tggccgaggt tactactact actacggtat ggacgtc 57
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Ala Ser Arg Ile Thr Ala Ala Gly Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 33
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactg 60
tcctgtgtag cctctggatt cacctttgct gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggaaa catagactat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag aactgaggac acggccttat attactgtgc aaaagtccgt 300
atagttgtgg ctggttatta ctactactac tatggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcctca 378
<210> 34
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Ile Val Val Ala Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
ggattcacct ttgctgatta tgcc 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Ala
1 5
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
attagttgga atagtggaaa cata 24
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Ile
1 5
<210> 39
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
gcaaaagtcc gtatagttgt ggctggttat tactactact actatggtat ggacgtc 57
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Ala Lys Val Arg Ile Val Val Ala Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 41
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
caggttcagc tggtgcagtc tggagttgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc gactatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgaatg gatgggatgg atcagcgctc acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaaac tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgaa cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagacggaac 300
tggaaatact ttgactactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 42
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala His Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Trp Lys Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
ggttacacct ttaccgacta tggt 24
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Gly
1 5
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
atcagcgctc acaatggtaa caca 24
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Ile Ser Ala His Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
gcgagacgga actggaaata ctttgactac 30
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Ala Arg Arg Asn Trp Lys Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 1255
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1000 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr
1010 1015 1020
Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly
1025 1030 1035
Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg
1040 1045 1050
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu
1055 1060 1065
Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser
1070 1075 1080
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser
1100 1105 1110
Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val
1115 1120 1125
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
1145 1150 1155
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
1190 1195 1200
Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
1205 1210 1215
Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
1220 1225 1230
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
<210> 50
<211> 763
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Met Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Val Gly Leu Thr Ala Pro Ala Leu Ala Leu Ala Gly
20 25 30
Tyr Ile Glu Ala Leu Ala Ala Asn Ala Gly Thr Gly Phe Ala Val Ala
35 40 45
Glu Pro Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Lys Leu Asn Met His Val Asn
50 55 60
Ile Gln Thr Gly Lys Trp Glu Pro Asp Pro Thr Gly Thr Lys Ser Cys
65 70 75 80
Phe Glu Thr Lys Glu Glu Val Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Met Tyr Pro
85 90 95
Glu Leu Gln Ile Thr Asn Val Met Glu Ala Asn Gln Arg Val Ser Ile
100 105 110
Asp Asn Trp Cys Arg Arg Asp Lys Lys Gln Cys Lys Ser Arg Phe Val
115 120 125
Thr Pro Phe Lys Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Val Leu Leu
130 135 140
Val Pro Glu Lys Cys Gln Phe Phe His Lys Glu Arg Met Glu Val Cys
145 150 155 160
Glu Asn His Gln His Trp His Thr Val Val Lys Glu Ala Cys Leu Thr
165 170 175
Gln Gly Met Thr Leu Tyr Ser Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Val
180 185 190
Asp Gln Phe His Gly Thr Glu Tyr Val Cys Cys Pro Gln Thr Lys Ile
195 200 205
Ile Gly Ser Val Ser Lys Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu
210 215 220
Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Val Tyr Lys Ser Glu Phe
225 230 235 240
Pro Thr Glu Ala Asp Leu Glu Asp Phe Thr Glu Ala Ala Val Asp Glu
245 250 255
Asp Asp Glu Asp Glu Glu Glu Gly Glu Glu Val Val Glu Asp Arg Asp
260 265 270
Tyr Tyr Tyr Asp Thr Phe Lys Gly Asp Asp Tyr Asn Glu Glu Asn Pro
275 280 285
Thr Glu Pro Gly Ser Asp Gly Thr Met Ser Asp Lys Glu Ile Thr His
290 295 300
Asp Val Lys Ala Val Cys Ser Gln Glu Ala Met Thr Gly Pro Cys Arg
305 310 315 320
Ala Val Met Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Leu Ser Lys Gly Lys Cys Val
325 330 335
Arg Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser
340 345 350
Glu Asp Tyr Cys Met Ala Val Cys Lys Ala Met Ile Pro Pro Thr Pro
355 360 365
Leu Pro Thr Asn Asp Val Asp Val Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Asp Asp
370 375 380
Asn Glu His Ala Arg Phe Gln Lys Ala Lys Glu Gln Leu Glu Ile Arg
385 390 395 400
His Arg Asn Arg Met Asp Arg Val Lys Lys Glu Trp Glu Glu Ala Glu
405 410 415
Leu Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Glu Arg Gln Thr Leu Ile Gln
420 425 430
His Phe Gln Ala Met Val Lys Ala Leu Glu Lys Glu Ala Ala Ser Glu
435 440 445
Lys Gln Gln Leu Val Glu Thr His Leu Ala Arg Val Glu Ala Met Leu
450 455 460
Asn Asp Arg Arg Arg Met Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ala Ala Leu Gln
465 470 475 480
Ser Asp Pro Pro Arg Pro His Arg Ile Leu Gln Ala Leu Arg Arg Tyr
485 490 495
Val Arg Ala Glu Asn Lys Asp Arg Leu His Thr Ile Arg His Tyr Gln
500 505 510
His Val Leu Ala Val Asp Pro Glu Lys Ala Ala Gln Met Lys Ser Gln
515 520 525
Val Met Thr His Leu His Val Ile Glu Glu Arg Arg Asn Gln Ser Leu
530 535 540
Ser Leu Leu Tyr Lys Val Pro Tyr Val Ala Gln Glu Ile Gln Glu Glu
545 550 555 560
Ile Asp Glu Leu Leu Gln Glu Gln Arg Ala Asp Met Asp Gln Phe Thr
565 570 575
Ala Ser Ile Ser Glu Thr Pro Val Asp Val Arg Val Ser Ser Glu Glu
580 585 590
Ser Glu Glu Ile Pro Pro Phe His Pro Phe His Pro Phe Pro Ala Leu
595 600 605
Pro Glu Asn Glu Asp Thr Gln Pro Glu Leu Tyr His Pro Met Lys Lys
610 615 620
Gly Ser Gly Val Gly Glu Gln Asp Gly Gly Leu Ile Gly Ala Glu Glu
625 630 635 640
Lys Val Ile Asn Ser Lys Asn Lys Val Asp Glu Asn Met Val Ile Asp
645 650 655
Glu Thr Leu Asp Val Lys Glu Met Ile Phe Asn Ala Glu Arg Val Gly
660 665 670
Gly Leu Glu Glu Glu Arg Glu Ser Val Gly Pro Leu Arg Glu Asp Phe
675 680 685
Ser Leu Ser Ser Ser Ala Leu Ile Gly Leu Leu Val Ile Ala Val Ala
690 695 700
Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Ser Leu Val Met Leu Arg Lys Arg Gln
705 710 715 720
Tyr Gly Thr Ile Ser His Gly Ile Val Glu Val Asp Pro Met Leu Thr
725 730 735
Pro Glu Glu Arg His Leu Asn Lys Met Gln Asn His Gly Tyr Glu Asn
740 745 750
Pro Thr Tyr Lys Tyr Leu Glu Gln Met Gln Ile
755 760
<210> 51
<211> 630
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
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100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255
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260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
485 490 495
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500 505 510
Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
565 570 575
Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
580 585 590
Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
595 600 605
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
610 615 620
Arg Ala Ser Pro Leu Thr
625 630
<210> 52
<211> 661
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Gly Tyr Ile Glu Ala Leu Ala Ala Asn Ala Gly Thr Gly Phe Ala Val
1 5 10 15
Ala Glu Pro Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Lys Leu Asn Met His Val
20 25 30
Asn Ile Gln Thr Gly Lys Trp Glu Pro Asp Pro Thr Gly Thr Lys Ser
35 40 45
Cys Phe Glu Thr Lys Glu Glu Val Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Met Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Asp Asn Trp Cys Arg Arg Asp Lys Lys Gln Cys Lys Ser Arg Phe
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Pro Glu Lys Cys Gln Phe Phe His Lys Glu Arg Met Glu Val
115 120 125
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130 135 140
Thr Gln Gly Met Thr Leu Tyr Ser Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly
145 150 155 160
Val Asp Gln Phe His Gly Thr Glu Tyr Val Cys Cys Pro Gln Thr Lys
165 170 175
Ile Ile Gly Ser Val Ser Lys Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu
180 185 190
Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Val Tyr Lys Ser Glu
195 200 205
Phe Pro Thr Glu Ala Asp Leu Glu Asp Phe Thr Glu Ala Ala Val Asp
210 215 220
Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Glu Gly Glu Glu Val Val Glu Asp Arg
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Tyr Asp Thr Phe Lys Gly Asp Asp Tyr Asn Glu Glu Asn
245 250 255
Pro Thr Glu Pro Gly Ser Asp Gly Thr Met Ser Asp Lys Glu Ile Thr
260 265 270
His Asp Val Lys Ala Val Cys Ser Gln Glu Ala Met Thr Gly Pro Cys
275 280 285
Arg Ala Val Met Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Leu Ser Lys Gly Lys Cys
290 295 300
Val Arg Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu
305 310 315 320
Ser Glu Asp Tyr Cys Met Ala Val Cys Lys Ala Met Ile Pro Pro Thr
325 330 335
Pro Leu Pro Thr Asn Asp Val Asp Val Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Asp
340 345 350
Asp Asn Glu His Ala Arg Phe Gln Lys Ala Lys Glu Gln Leu Glu Ile
355 360 365
Arg His Arg Asn Arg Met Asp Arg Val Lys Lys Glu Trp Glu Glu Ala
370 375 380
Glu Leu Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Glu Arg Gln Thr Leu Ile
385 390 395 400
Gln His Phe Gln Ala Met Val Lys Ala Leu Glu Lys Glu Ala Ala Ser
405 410 415
Glu Lys Gln Gln Leu Val Glu Thr His Leu Ala Arg Val Glu Ala Met
420 425 430
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Met Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ala Ala Leu
435 440 445
Gln Ser Asp Pro Pro Arg Pro His Arg Ile Leu Gln Ala Leu Arg Arg
450 455 460
Tyr Val Arg Ala Glu Asn Lys Asp Arg Leu His Thr Ile Arg His Tyr
465 470 475 480
Gln His Val Leu Ala Val Asp Pro Glu Lys Ala Ala Gln Met Lys Ser
485 490 495
Gln Val Met Thr His Leu His Val Ile Glu Glu Arg Arg Asn Gln Ser
500 505 510
Leu Ser Leu Leu Tyr Lys Val Pro Tyr Val Ala Gln Glu Ile Gln Glu
515 520 525
Glu Ile Asp Glu Leu Leu Gln Glu Gln Arg Ala Asp Met Asp Gln Phe
530 535 540
Thr Ala Ser Ile Ser Glu Thr Pro Val Asp Val Arg Val Ser Ser Glu
545 550 555 560
Glu Ser Glu Glu Ile Pro Pro Phe His Pro Phe His Pro Phe Pro Ala
565 570 575
Leu Pro Glu Asn Glu Asp Thr Gln Pro Glu Leu Tyr His Pro Met Lys
580 585 590
Lys Gly Ser Gly Val Gly Glu Gln Asp Gly Gly Leu Ile Gly Ala Glu
595 600 605
Glu Lys Val Ile Asn Ser Lys Asn Lys Val Asp Glu Asn Met Val Ile
610 615 620
Asp Glu Thr Leu Asp Val Lys Glu Met Ile Phe Asn Ala Glu Arg Val
625 630 635 640
Gly Gly Leu Glu Glu Glu Arg Glu Ser Val Gly Pro Leu Arg Glu Asp
645 650 655
Phe Ser Leu Ser Ser
660
<210> 53
<211> 658
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hHER2-MMH
<400> 53
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
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100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255
Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
485 490 495
His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
500 505 510
Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
515 520 525
Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
530 535 540
Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
545 550 555 560
Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
565 570 575
Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
580 585 590
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595 600 605
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
610 615 620
Arg Ala Ser Pro Leu Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
625 630 635 640
Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His
645 650 655
His His
<210> 54
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hAPLP2-MMH
<400> 54
Gly Tyr Ile Glu Ala Leu Ala Ala Asn Ala Gly Thr Gly Phe Ala Val
1 5 10 15
Ala Glu Pro Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Lys Leu Asn Met His Val
20 25 30
Asn Ile Gln Thr Gly Lys Trp Glu Pro Asp Pro Thr Gly Thr Lys Ser
35 40 45
Cys Phe Glu Thr Lys Glu Glu Val Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Met Tyr
50 55 60
Pro Glu Leu Gln Ile Thr Asn Val Met Glu Ala Asn Gln Arg Val Ser
65 70 75 80
Ile Asp Asn Trp Cys Arg Arg Asp Lys Lys Gln Cys Lys Ser Arg Phe
85 90 95
Val Thr Pro Phe Lys Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Val Leu
100 105 110
Leu Val Pro Glu Lys Cys Gln Phe Phe His Lys Glu Arg Met Glu Val
115 120 125
Cys Glu Asn His Gln His Trp His Thr Val Val Lys Glu Ala Cys Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Met Thr Leu Tyr Ser Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly
145 150 155 160
Val Asp Gln Phe His Gly Thr Glu Tyr Val Cys Cys Pro Gln Thr Lys
165 170 175
Ile Ile Gly Ser Val Ser Lys Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu
180 185 190
Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Val Tyr Lys Ser Glu
195 200 205
Phe Pro Thr Glu Ala Asp Leu Glu Asp Phe Thr Glu Ala Ala Val Asp
210 215 220
Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Glu Gly Glu Glu Val Val Glu Asp Arg
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Tyr Asp Thr Phe Lys Gly Asp Asp Tyr Asn Glu Glu Asn
245 250 255
Pro Thr Glu Pro Gly Ser Asp Gly Thr Met Ser Asp Lys Glu Ile Thr
260 265 270
His Asp Val Lys Ala Val Cys Ser Gln Glu Ala Met Thr Gly Pro Cys
275 280 285
Arg Ala Val Met Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Leu Ser Lys Gly Lys Cys
290 295 300
Val Arg Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu
305 310 315 320
Ser Glu Asp Tyr Cys Met Ala Val Cys Lys Ala Met Ile Pro Pro Thr
325 330 335
Pro Leu Pro Thr Asn Asp Val Asp Val Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Asp
340 345 350
Asp Asn Glu His Ala Arg Phe Gln Lys Ala Lys Glu Gln Leu Glu Ile
355 360 365
Arg His Arg Asn Arg Met Asp Arg Val Lys Lys Glu Trp Glu Glu Ala
370 375 380
Glu Leu Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Glu Arg Gln Thr Leu Ile
385 390 395 400
Gln His Phe Gln Ala Met Val Lys Ala Leu Glu Lys Glu Ala Ala Ser
405 410 415
Glu Lys Gln Gln Leu Val Glu Thr His Leu Ala Arg Val Glu Ala Met
420 425 430
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Met Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ala Ala Leu
435 440 445
Gln Ser Asp Pro Pro Arg Pro His Arg Ile Leu Gln Ala Leu Arg Arg
450 455 460
Tyr Val Arg Ala Glu Asn Lys Asp Arg Leu His Thr Ile Arg His Tyr
465 470 475 480
Gln His Val Leu Ala Val Asp Pro Glu Lys Ala Ala Gln Met Lys Ser
485 490 495
Gln Val Met Thr His Leu His Val Ile Glu Glu Arg Arg Asn Gln Ser
500 505 510
Leu Ser Leu Leu Tyr Lys Val Pro Tyr Val Ala Gln Glu Ile Gln Glu
515 520 525
Glu Ile Asp Glu Leu Leu Gln Glu Gln Arg Ala Asp Met Asp Gln Phe
530 535 540
Thr Ala Ser Ile Ser Glu Thr Pro Val Asp Val Arg Val Ser Ser Glu
545 550 555 560
Glu Ser Glu Glu Ile Pro Pro Phe His Pro Phe His Pro Phe Pro Ala
565 570 575
Leu Pro Glu Asn Glu Asp Thr Gln Pro Glu Leu Tyr His Pro Met Lys
580 585 590
Lys Gly Ser Gly Val Gly Glu Gln Asp Gly Gly Leu Ile Gly Ala Glu
595 600 605
Glu Lys Val Ile Asn Ser Lys Asn Lys Val Asp Glu Asn Met Val Ile
610 615 620
Asp Glu Thr Leu Asp Val Lys Glu Met Ile Phe Asn Ala Glu Arg Val
625 630 635 640
Gly Gly Leu Glu Glu Glu Arg Glu Ser Val Gly Pro Leu Arg Glu Asp
645 650 655
Phe Ser Leu Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly
660 665 670
Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His
675 680 685
His
<210> 55
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 56
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 69
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 69
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 70
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 71
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 71
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 72
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc序列
<400> 72
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 73
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 74
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 75
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc序列
<400> 75
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 76
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc序列
<400> 76
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 77
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc序列
<400> 77
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 78
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CH序列
<400> 78
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325

Claims (49)

1.一种双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含结合人APLP2的第一抗原结合结构域以及结合人HER2的第二抗原结合结构域。
2.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合结构域结合表达人HER2的人细胞。
3.如权利要求1或权利要求2所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域以低亲和力结合于APLP2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的每一者为完全人抗原结合结构域。
5.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子结合细胞上所表达的人APLP2与人HER2两者并且诱导所述细胞中的APLP2内化和/或HER2降解。
6.如权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗体不由表达人APLP2但不表达人HER2的细胞内化。
7.如权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗体为完全人抗体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域以低亲和力结合于APLP2，并且所述第二抗原结合结构域以高亲和力结合于HER2，使得所述第二抗原结合结构域对HER2的亲和力使所述第一抗原结合结构域对APLP2的亲合力增加。
9.如权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中如通过表面等离子体共振或等效分析所测量，所述第一抗原结合结构域以约100nM至约1μM的KD结合人APLP2。
10.如权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中如通过表面等离子体共振或等效分析所测量，所述第一抗原结合结构域以约100nM至约200nM的KD结合人APLP2。
11.如权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中如通过表面等离子体共振或等效分析所测量，所述第一抗原结合结构域以约200nM至约800nM的KD结合人APLP2。
12.如权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中如通过表面等离子体共振或等效分析所测量，所述第一抗原结合结构域以约800nM至约1μM的KD结合人APLP2。
13.如权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中如通过表面等离子体共振或等效分析所测量，所述第二抗原结合结构域以小于10nM的KD结合人HER2。
14.如权利要求1-13中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中如通过表面等离子体共振或等效分析所测量，所述第二抗原结合结构域以约3nM至约5nM的KD结合人HER2。
15.如权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域以约100nM至约1μM的KD结合人，并且所述第二抗原结合结构域以小于10nM的KD结合人，其中KD通过表面等离子体共振或等效分析测量。
16.如权利要求1-15中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域源自包含如表2中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗体或抗原结合片段，并且所述第二抗原结合结构域源自包含如表1中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗体或抗原结合片段。
17.如权利要求1-16中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含如表2中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人APLP2。
18.如权利要求1-17中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述参考抗体包含选自由SEQ ID NO:26/10、34/10以及42/10组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
19.如权利要求1-18中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含如表2中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合于人APLP2上的相同表位。
20.如权利要求1-19中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含选自由SEQ ID NO:26/10、34/10以及42/10组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合于人APLP2上的相同表位。
21.如权利要求1-20中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子抑制带有人乳腺癌异种移植物的免疫受损小鼠中的肿瘤生长。
22.如权利要求1-21中任一项所述的双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子为双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
23.如权利要求1-22中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人HER2的所述第二抗原结合结构域包含来自选自由SEQ ID NO:2和18组成的组的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)，
特异性结合人HER2的所述第二抗原结合结构域包含来自选自由SEQ ID NO:2和18组成的组的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)；以及来自包含由SEQ ID NO:10组成的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2以及LCDR3)。
24.如权利要求1-23中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人HER2的所述第二抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2以及A2-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2以及A2-LCDR3)，其中A2-HCDR1包含选自由SEQID NO:4和20组成的组的氨基酸序列；A2-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:6和22组成的组的氨基酸序列；A2-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:8和24组成的组的氨基酸序列；A2-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A2-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A2-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人HER2的所述第二抗原结合结构域包含SEQ ID NO:18/10的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR。
26.如权利要求1-25中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的所述第一抗原结合结构域包含来自包含如表2中所阐述的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)以及来自包含如表2中所阐述的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2以及LCDR3)。
27.如权利要求1-26中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的所述第一抗原结合结构域包含来自选自由SEQ ID NO:26、34以及42组成的组的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)，以及来自包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2以及LCDR3)。
28.如权利要求1-27中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的所述第一抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2以及A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2以及A1-LCDR3)，
其中A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:28、36以及44组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:30、38以及46组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ IDNO:32、40以及48组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A1-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
29.如权利要求1-28中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的所述第一抗原结合结构域包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:26/10、34/10以及42/10。
30.如权利要求1-29中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的所述第一抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2以及A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2以及A1-LCDR3)，并且其中特异性结合人HER2的所述第二抗原结合结构域包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2以及A2-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2以及A2-LCDR3)；
其中A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO:28、36以及44组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:30、38以及46组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ IDNO32、40以及48组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A1-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；并且
其中A2-HCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；A2-HCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；A2-HCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；A2-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A2-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A2-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
31.如权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人APLP2的所述第一抗原结合结构域包含HCVR，所述HCVR包含具有SEQ ID NO:36-38-30的氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3。
32.如权利要求1-31中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人HER2，所述参考抗原结合蛋白包含三个重链互补决定区(A2-HCDR1、A2-HCDR2以及A2-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A2-LCDR1、A2-LCDR2以及A2-LCDR3)，其中A2-HCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；A2-HCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；A2-HCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；A2-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A2-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A2-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人HER2，所述参考抗原结合蛋白包含含有SEQ IDNO:18的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)，以及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
34.如权利要求1-33中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人APLP2，所述参考抗原结合蛋白包含三个重链互补决定区(A1-HCDR1、A1-HCDR2以及A1-HCDR3)和三个轻链互补决定区(A1-LCDR1、A1-LCDR2以及A1-LCDR3)，其中A1-HCDR1包含选自由SEQ ID NO28、36以及44组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR2包含选自由SEQ ID NO:30、38以及46组成的组的氨基酸序列；A1-HCDR3包含选自由SEQ ID NO:32、40以及48组成的组的氨基酸序列；A1-LCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；A1-LCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；并且A1-LCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
35.如权利要求1-34中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人APLP2，所述参考抗原结合蛋白包含含有选自由SEQ ID NO:26、34以及42组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)，以及含有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
36.如权利要求1-35中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人APLP2，所述参考抗原结合蛋白包含含有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)，以及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)；并且其中所述第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争结合于人HER2，所述参考抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)，以及含有SEQ ID NO:10的氨基酸的轻链可变区(LCVR)。
37.一种抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含如权利要求1-36中任一项所述的双特异性抗原结合分子和细胞毒性剂，任选其中所述双特异性抗原结合分子和所述细胞毒性剂经由接头共价连接，任选其中所述细胞毒性剂为美登木素，任选其中所述美登木素为DM1或DM4，任选其中所述接头为SMCC，并且任选其中所述细胞毒性剂为DM1并且所述接头为SMCC。
38.一种分离的抗APLP2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含如表2中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争结合于人APLP2。
39.如权利要求38所述的抗APLP2抗体或其抗原结合片段，其中如通过表面等离子体共振或等效分析所测量，所述第一抗原结合结构域以约100nM至约1μM的KD结合人APLP2，任选其中所述第一抗原结合结构域以约100nM至约200nM的KD结合人APLP2，任选其中所述第一抗原结合结构域以约200nM至约800nM的KD结合人APLP2，任选其中如通过表面等离子体共振或等效分析所测量，所述第一抗原结合结构域以约800nM至约1μM的KD结合人APLP2。
40.如权利要求38或权利要求39所述的抗APLP2抗体或抗原结合片段，其中所述参考抗体包含选自由SEQ ID NO:26/10、34/10以及42/10组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
41.如权利要求38-40中任一项所述的抗APLP2抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含如表2中所阐述的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合于人APLP2上的相同表位。
42.一种抗体-药物缀合物(ADC)，所述抗体-药物缀合物包含如权利要求38-41中任一项所述的抗APLP2抗体或抗原结合片段以及细胞毒性剂，其中所述双特异性抗原结合分子和所述细胞毒性剂经由接头共价连接。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含如1-36所述的双特异性抗原结合分子、如权利要求38-42中任一项所述的分离的抗APLP2抗体或其抗原结合片段或如权利要求37或权利要求42所述的ADC以及药学上可接受的载体或稀释剂。
44.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求43所述的药物组合物。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌以及卵巢癌。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌，任选为IHC2+乳腺癌。
47.如权利要求43所述的药物组合物在治疗与HER2的表达相关的疾病或病症中的用途。
48.如权利要求47所述的用途，其中所述疾病或病症为癌症。
49.如1-36所述的双特异性抗原结合分子、如权利要求38-42中任一项所述的分离的抗APLP2抗体或其抗原结合片段或如权利要求37或权利要求42所述的ADC在制造用于治疗癌症的药剂中的用途，任选其中所述癌症为乳腺癌。
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