JP2023534437A - タンパク質中のグルタミン残基にコンジュゲートされたカンプトテシンアナログおよびその使用 - Google Patents
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Abstract
本明細書には、例えば、治療部分、例えばカンプトテシンアナログおよび/または誘導体の標的に特異的な送達に有用なタンパク薬物コンジュゲート、ならびにその組成物が記載される。ある実施形態では、トランスグルタミナーゼおよび1,3-付加環化技法の組合せを利用してタンパク薬物構築物(例えば、抗体薬物コンジュゲート)を産生する特異的かつ効率的な方法が提供される。カンプトテシンアナログ、抗体薬物コンジュゲート、および、グルタミニルで修飾された抗体とカンプトテシンアナログのペイロードとを含む組成物が、提供される。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2020年7月13日出願の米国仮特許出願第63/051,172号、および2021年2月26日出願の米国仮特許出願第63/154,531号に基づく優先権を主張するものであり、これらの内容はその全体を参照することで本明細書に援用される。
本出願は、2020年7月13日出願の米国仮特許出願第63/051,172号、および2021年2月26日出願の米国仮特許出願第63/154,531号に基づく優先権を主張するものであり、これらの内容はその全体を参照することで本明細書に援用される。
本開示の分野
本開示は、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、医薬組成物、およびそれらを用いる疾患の処置方法に関する。また、トランスグルタミナーゼと1,3-付加環化技法との組合せを利用してタンパク薬物コンジュゲートを産生する特異的かつ効率的な方法も提供される。より具体的には、本開示は、カンプトテシンアナログおよび誘導体を含むタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)に関する。
本開示は、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、医薬組成物、およびそれらを用いる疾患の処置方法に関する。また、トランスグルタミナーゼと1,3-付加環化技法との組合せを利用してタンパク薬物コンジュゲートを産生する特異的かつ効率的な方法も提供される。より具体的には、本開示は、カンプトテシンアナログおよび誘導体を含むタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)に関する。
配列表
配列表の公式の写しは本明細書と同時に、ASCII形式の配列表の紙コピーとして、ファイル名250298_000244_SL.txt、サイズ約996キロバイトで提出され、2021年7月12日に作製された。このASCII形式文書の紙コピーに含まれる配列表は本明細書の一部であり、その全体を参照することで本明細書に援用される。
配列表の公式の写しは本明細書と同時に、ASCII形式の配列表の紙コピーとして、ファイル名250298_000244_SL.txt、サイズ約996キロバイトで提出され、2021年7月12日に作製された。このASCII形式文書の紙コピーに含まれる配列表は本明細書の一部であり、その全体を参照することで本明細書に援用される。
増殖性疾患は、成長が制御されず、異常細胞が蔓延することを特徴とする。蔓延が制御されない場合、死に至る可能性がある。異常増殖、例えば癌は、外的要因(例えば、タバコ、化学製品、放射線、伝染性生物)と内的要因(遺伝的突然変異、免疫系状態、代謝から生じる突然変異)の両方により生じる。これらの原因となる因子は、一体的または連続的に作用して、異常な増殖を開始または促進する場合がある。癌は、手術、放射線、化学療法、ホルモン、および免疫療法により処置される。しかし、さらに有効な増殖防止薬が必要とされている。
理想的な増殖防止療法は、腫瘍細胞を標的とする細胞毒性の高い薬剤の送達を可能にし、正常な細胞は影響を受けずに残る。従来の化学療法による処置は、非癌細胞に対する薬物の効果から生じる毒性副作用が原因で限られている。シュードモナスやジフテリア毒素などの毒素をもって腫瘍標的化プローブ(抗体や成長因子など)のコンジュゲートを使用して、タンパク質および細胞の合成を阻止することを含め、標的とされた薬物輸送に対する様々なアプローチが試みられている。しかし、副作用には、コンジュゲートの非ヒト成分を原因とする免疫系の反応が挙げられる。さらに、薬物コンジュゲートの半減期は、循環から腎濾過を通じての排泄、概略的な(schematic)分解、細網内皮系(RES)による取込み、および非標的器官と組織における蓄積が原因で、限られている。
他のアプローチでは、腫瘍組織の脈管内皮の透過性亢進を利用するためにポリマー、リポソーム、および高分子ミセルなどの受動的薬物担体(passive drug)が使用される。高分子薬物と巨大分子は、浸透性の増強と保持機構により、固形腫瘍内に蓄積する。しかし、かかる標的化送達を使用する障害として、血液からの異物の速やかなクリアランスや、高度に正規化され薬学的に許容可能であり、腫瘍細胞の結合に必要な特異性と選択性を有する薬物送達システムの取得における技術的な障害が挙げられる。
抗体コンジュゲートなどのタンパク質コンジュゲートは、対象の組織内で標的にペイロードを送達するべく、結合剤の選択的な結合を利用する。ペイロードは、標的にて行動をとることが可能な治療部分とすることができる。
リンカーおよびペイロードを抗体にコンジュゲートするための技法がいくつか利用可能である。多くのコンジュゲートは、抗体中でのシステインまたはリシン残基への非選択な共有結合により調製される。この非選択な技法により、異なる部位でのコンジュゲーション、および抗体1つごとに異なる数のコンジュゲーションをもって、生成物の不均質混合物を得ることができる。そのため、当該技術分野では、部位選択的な抗体コンジュゲーションを提供する方法と技法が必要とされる。
当該技術分野ではさらに、単剤療法および併用療法に使用するために、癌などの疾患の処置の向上を提供する、様々な抗原に結合可能である安全で有効な抗腫瘍標的化剤が必要とされる。ある実施形態では、本開示はこの必要性を満たし、その他の利点も提供する。
前述の議論は、単に当該技術分野が直面する課題の性質をより良く理解してもらうために提示されるが、先行技術として認められるものとしても、本明細書中のいずれかの参照の援用が、かかる参照が本出願に対する「先行技術」を構成することを容認するものとしても解釈されるべきではない。
本開示の様々な非限定的な態様と実施形態が後述される。
一態様では、本開示は、式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’および基B’’のうち少なくとも1つは、-N3および
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’および基B’’のうち少なくとも1つは、-N3および
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または構造:
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、
mは、1~30の整数であり、
nは、1~30の整数である、
化合物を提供する。
別の態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’の少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’の少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、基B’と基B’’は少なくとも1つの付加物を形成し、
Mは、存在しないか、または構造:
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、
nは、1~30の整数である、
化合物を提供する。
一実施形態では、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
一実施形態では、BAは、抗HER2抗体、抗HER2/HER2二重特異性抗体、抗STEAP2抗体、抗MET抗体、抗MET/MET二重特異性抗体、抗EGFRVIII抗体、抗MUC16抗体、抗PRLR抗体、抗PSMA抗体、抗FGFR2抗体、抗FOLR1抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントである。
一実施形態では、BAは、表1に明記されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む抗STEAP2抗体である。
一実施形態では、BAは、抗HER2/HER2二重特異性抗体である。一実施形態では、BAは、HER2タンパク質の2つの別個のエピトープを結合する。
一実施形態では、抗HER2/HER2二重特異性抗体は、
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含み、
D1は、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する。
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含み、
D1は、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する。
一実施形態では、D1とD2は、ヒトHER2への結合において互いに競合しない。
一実施形態では、BAは、抗MET/MET二重特異性抗体である。一実施形態では、BAは、METタンパク質の2つの別個のエピトープを結合する。
一実施形態では、抗MET/MET二重特異性抗体は、
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含み、
D1は、ヒトMETの第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトMETの第2のエピトープを特異的に結合する。
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含み、
D1は、ヒトMETの第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトMETの第2のエピトープを特異的に結合する。
一実施形態では、D1とD2は、ヒトMETへの結合において互いに競合しない。
一実施形態では、BAは、表3に明記されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む抗MET/MET二重特異性抗体である。
一実施形態では、BAは、D1抗原結合性ドメインとD2抗原結合性ドメインとを含む抗MET/MET二重特異性抗体であり、D1抗原結合性ドメインは、配列番号2012/2092のHCVR/LCVRアミノ酸配列対、または配列番号2014-2016-2018-2094-2096-2098を含む一組の重鎖および軽鎖CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含み、D2抗原結合性ドメインは、配列番号2036/2092のHCVR/LCVRアミノ酸配列対、または配列番号2038-2040-2042-2094-2096-2098を含む一組の重鎖および軽鎖CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含む。
一実施形態では、BAは、H4H13306P2由来のD1とH4H13312P2由来のD2とを含む抗MET/MET二重特異性抗体H4H14639Dである。
一実施形態では、抗STEAP2は、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/58、74/58、82/58、90/58、98/58、106/114、122/130、138/146、154/162、170/178、186/194、202/210、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、および378/386からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む。
一実施形態では、グルタミン残基Glnは、BAのCH2またはCH3ドメインに自然に存在する。
一実施形態では、グルタミン残基Glnは、1つまたは複数のアミノ酸を修飾することによりBAに導入される。
一実施形態では、Glnは、Q295またはN297Qである。
一実施形態では、BAは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、または脳癌からなる群から選択される癌を標的とする。
一実施形態では、L1は、C1-6アルキル、フェニル、-NH-、-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニット、またはそれらの組合せを含み、これらはそれぞれ、-S-、-S(O2)-、-C(O)-、-C(O2)-、およびCO2Hのうち1つまたは複数により任意選択で置換される場合があり、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数である。
一実施形態では、L1は、
一実施形態では、Bは、基B’の1つの付加物を含む。
一実施形態では、-NH-L1-B’は、
一実施形態では、基B’はアジド(-N3)であり、基B’の付加物はトリアゾールを含む。
一実施形態では、Bは、基B’の2つの付加物を含む。
一実施形態では、Bは、基B’の3つの付加物を含む。
一実施形態では、Bは、基B’の少なくとも4つの付加物を含む。
一実施形態では、Bは、
一実施形態では、Bは、
一実施形態では、-NH-L1-Bは、
一実施形態では、基B’はアジド(-N3)であり、基B’の付加物はトリアゾールを含む。
一実施形態では、基B’および基B’’の付加物は、
一実施形態では、Mは存在しない。
一実施形態では、Mは
一実施形態では、Mは
一実施形態では、nは2である。一実施形態では、nは4である。一実施形態では、nは8である。一実施形態では、nは12である。一実施形態では、nは16である。一実施形態では、nは24である。
一実施形態では、L2は、式(L2):
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2)
による構造を有し、式中、
B’’は、基B’に共有結合可能な基であり、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、またはDxdに共有結合される第3のスペーサユニットであり、
pは、1~12の整数である。
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2)
による構造を有し、式中、
B’’は、基B’に共有結合可能な基であり、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、またはDxdに共有結合される第3のスペーサユニットであり、
pは、1~12の整数である。
一実施形態では、少なくとも1つの基B’’は、-N3、
一実施形態では、SP1は、存在しないか、または
一実施形態では、B2は、存在しないか、または
一実施形態では、SP2は、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択され、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数である。
一実施形態では、AAは、グリシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、グルタミン酸、リシン、フェニルアラニン、およびシトルリン、ならびにそれらの組合せから選択される2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットである。
一実施形態では、AAは、バリン-シトルリン、バリン-アラニン、またはフェニルアラニン-リシンである。
一実施形態では、AAは、グリシン-グリシン-グリシン(GGG)、グリシン-グリシン-グリシン-グリシン(GGGG(配列番号2113))、グリシン-グリシン-フェニルアラニン(GGF)、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン(GGFG(配列番号2114))、L-グルタミン酸-バリン-シトルリン(LEVC)、およびDグルタミン酸-バリン-シトルリン(DEVC)からなる群から選択される。
一実施形態では、SP3は、存在しないか、または、
一実施形態では、M-Dxdは、
一実施形態では、化合物は、
一実施形態では、化合物は、
一実施形態では、化合物は、
別の態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、
Mは、存在しないか、または構造:
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、
nは、1~30の整数である、
化合物を提供する。
別の態様では、本開示は、式(L2-P)、(L2’-P)、または(L2’’-P):
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2-P)、
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’-P)、
マレイミド-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’’-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2-P)、
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’-P)、
マレイミド-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’’-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
SP1は、存在しないか、または
SP2は、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択される第2のスペーサユニットであり、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数であり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
pは、1~12の整数である、
化合物を提供する。
一実施形態では、AAは、グリシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、グルタミン酸、リシン、アラニン、およびシトルリン、ならびにそれらの組合せから選択される2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットである。
一実施形態では、AAは、バリン-シトルリン、バリン-アラニン、またはフェニルアラニン-リシンである。
一実施形態では、AAは、グリシン-グリシン-グリシン(GGG)、グリシン-グリシン-グリシン-グリシン(GGGG(配列番号2113))、グリシン-グリシン-フェニルアラニン(GGF)、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン(GGFG(配列番号2114))、およびグルタミン酸-バリン-シトルリン(EVC)からなる群から選択される。
一実施形態では、化合物は、
一実施形態では、化合物は、
一実施形態では、化合物は、
別の態様では、本開示は、式(II):
Ab-(Gln-NH-L1-B-(SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)k)p)n(II)
による抗体薬物コンジュゲートであって、式中、
Abは抗体であり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
Ab-(Gln-NH-L1-B-(SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)k)p)n(II)
による抗体薬物コンジュゲートであって、式中、
Abは抗体であり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)pは、前述の実施形態のうちいずれかによる式(L2-P)による化合物であり、式(L2-P)の化合物は、基B’および基B’’の付加物を介して抗体に共有結合され、kは、1~12の整数であり、pは、1~30の整数であり、nは、1~30の整数である、
抗体薬物コンジュゲートを提供する。
一実施形態では、本開示は、抗体およびリンカーペイロードを含む抗体薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩を提供し、リンカーペイロードは、
式中、
別の態様では、本開示は、約0.5~約30.0の薬物抗体比(DAR)を有する、前述の実施形態のいずれかによる化合物の集団を含む組成物を提供する。
一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約1.0~約2.5である。一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約2である。
一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約3.0~約4.5である。一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約4である。
一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約6.5~約8.5である。一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約8である。
一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約10~約14である。一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約12である。
一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約14~約18である。一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約16である。
一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約22~約24.5である。一実施形態では、本開示の組成物のDARは、約24である。
別の態様では、本開示は、式(P-I):
式中、R1、R2、R3、およびR4は、独立して水素もしくはC1-C4アルキルであり、またはR2とR3は、5員環もしくは6員環を形成する、
化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
一実施形態では、化合物は、
抗体、リンカー、およびペイロードを含む抗体薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であって、ペイロードは、
抗体、リンカー、およびペイロードを含む抗体薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であって、ペイロードは、
一実施形態では、化合物は、式(P2):
一実施形態では、化合物は、
一態様では、本発明は、前述の実施形態のいずれかによる化合物と、希釈剤、担体、および/または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
一態様では、本発明は、疾病の処置を必要とする対象の疾病を処置する方法であって、前述の実施形態のうちいずれかによる化合物、または前述の実施形態のうちいずれかによる組成物を、治療有効量で対象に投与する工程を含む方法を提供する。
一実施形態では、疾病は癌である。
一実施形態では、癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、または脳癌からなる群から選択される。
一実施形態では、疾病はHER2+乳癌である。
一態様では、本発明は、前述の実施形態のいずれか1つによる化合物を細胞へと選択的に送達する方法を提供する。
一態様では、本発明は、前述の実施形態のうちいずれか1つによる化合物により、細胞表面上で抗原を選択的に標的とする方法を提供する。
一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。
一実施形態では、細胞はヒト細胞である。
一実施形態では、細胞は癌細胞である。
一実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、肝臓癌細胞、または脳癌細胞からなる群から選択される。
一態様では、本開示は、式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
kとmは、独立して1~12の整数であり、nは、1~30の整数であり、
上記方法は、
(a)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を化合物L1-Bと接触させる工程であって、分枝ユニットBは少なくとも1つの基B’を含む、工程と、
(b)工程(a)の生成物を、化合物L2-(-M-Dxd)mのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を、提供する。
一態様では、本開示は、式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
上記方法は、
(a)分枝ユニットBが少なくとも1つの基B’を含む化合物L1-Bを、化合物L2-(-M-Dxd)mのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は、基B’と共有結合可能な少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を、工程(a)のL1-B-(L2-(-M-Dxd)m)k生成物と接触させる工程と、
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を、提供する。
一態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、nは、1~30の整数であり、
上記方法は、
(a)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を化合物L1-Bと接触させる工程であって、分枝ユニットBは少なくとも1つの基B’を含む、工程と、
(b)工程(a)の生成物を、化合物L2-M-Dxdのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は、基B’に共有結合可能な少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を、提供する。
一態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
上記方法は、
(a)分枝ユニットBが少なくとも1つの基B’を含む化合物L1-Bを、化合物L2-M-Dxdのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は少なくとも1つの基B’’を含み、接触によりL1-B-(-L2-M-Dxd)kが産生され、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含む結合剤BA(BA-Gln-NH2)を、工程(a)のL1-B-(L2(M-Dxd)k生成物と接触させる工程と、
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を、提供する。
一態様では、本開示は、式(III):
BA-(Gln-NH-L2’-P))n(III)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L2’-Pは、上述されるH2N-SP1-B2-(SP2-AA-SP3-M-Dxd)pであり、nは、1~30の整数であり、SP1は、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L2’-P))n(III)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L2’-Pは、上述されるH2N-SP1-B2-(SP2-AA-SP3-M-Dxd)pであり、nは、1~30の整数であり、SP1は、存在しないか、または
上記方法は、
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)をL2’-Pと接触させる工程と、
(c)産生された式(III)の化合物を単離する工程と
を含む方法を、提供する。
一実施形態では、グルタミン残基Glnは、BAのCH2またはCH3ドメインに自然に存在する。
一実施形態では、グルタミン残基Glnは、1つまたは複数のアミノ酸を修飾することによりBAに導入される。
一実施形態では、Glnは、Q295またはN297Qである。
一実施形態では、トランスグルタミナーゼは微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)である。
一実施形態では、Mは存在せず、または、M-Dxdは、
一実施形態では、化合物L2-Dxdは、
一実施形態では、化合物L2-Dxdは、
一実施形態では、化合物L2-Dxdは、
これらおよび他の本開示の態様は、添付の特許請求の範囲を含む、以下の本開示の詳細な説明を読むことで当業者に明白となる。
この特許または特許出願のファイルには、色付きで作成された少なくとも1つの図面が包含される。色付きの図面を伴うこの特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求と支払い後に当局により提供されるものとする。
本開示の詳細な実施形態を本明細書に開示する。しかし、開示した実施形態は、単に様々な形で具体化され得る開示を例示するだけであることを理解されたい。加えて、本開示の様々な実施形態に関連して提供される例は、それぞれ例示的なものであり、限定的とは意図されない。そのため、本明細書に開示される特定の構造と機能の詳細は、限定的として解釈されるのではなく、単に本開示を多様に利用するべく当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されたい。
定義
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、本開示が属する分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、本開示が属する分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。
本明細書と添付の特許請求の範囲では、単数形「a」、「an」、および「the」は、前後関係から明らかでない限り、複数形も含む。ゆえに、例えば「方法(a method)」への言及は、本明細書に記載される、および/もしくは本開示を読むことで当業者に明白となる種類の、1つもしくは複数の方法ならびに/または工程を含む。
状態、障害、または疾病に対し「処置する(treat)」または「処置(treatment)」という用語は、(1)状態、障害、もしくは疾病に罹患しているか罹患傾向にあり得るが、依然として状態、障害、もしくは疾病の臨床的または亜臨床的症状を経験も提示もしていない対象で進行する状態、障害、もしくは疾病のうち少なくとも1つの臨床的または亜臨床的症状の発症および/または出現可能性を防止、遅延、または低減すること、(2)状態、障害、または疾病を阻害すること、すなわち、それらの疾患もしくは再発、またはその少なくとも1つの臨床的もしくは亜臨床的症状の進行を阻止、低減、または遅延させること、ならびに/あるいは(3)疾患を緩和すること、すなわち、状態、障害、もしくは疾病、またはその臨床的もしくは亜臨床的症状のうち少なくとも1つの退行を生じさせることを含む。処置されるべき対象が受ける利益は、統計的に有意なもの、または少なくとも患者もしくは医師が知覚可能なものである。いくつかの実施形態では、処置は、疾患に間接的に影響を及ぼすような形で細胞が切除される方法を含む。ある実施形態では、処置は、治療前に造血コンディショニングレジメン(hematopoietic conditioning regimen)として免疫細胞を除去することを含む。
「対象」、「患者」、「個体」、または「動物」は、本明細書で使用するとき、疾患を抱えるヒト、獣医学上の動物(例えばネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど)、および実験動物モデル(例えばマウス、ラット)をいう。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
本明細書で使用するとき、用量または量に適用される「有効な」という用語は、投与を必要とする対象への投与に際して所望の活性を生じさせるのに十分である、化合物または医薬組成物の量をいう。有効成分と併用投与するとき、この併用の有効量は、個々に投与した場合に有効であった各成分の量を含む場合も含まない場合もあることに留意されたい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、処置される疾病の重症度、利用される特定の薬物、投与形態などに応じて、対象間で変動することになる。
「薬学的に許容可能な塩」という句は、本開示の組成物に関して使用するとき、患者への投与に適したいずれかの塩をいう。好適な塩として、参照により本明細書に援用される、Bergeらによる「Pharmaceutical Salts」,J.Pharm.Sci.,1977,66:1に開示されるものが挙げられるが、これに限定されない。塩の例として、酸由来の塩、塩基由来の塩、有機塩、無機塩、アミン塩、およびアルカリもしくはアルカリン土類金属塩が挙げられるがこれらに限定されず、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、塩酸塩、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、pトルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、本明細書に記載のペイロード(例えば、本明細書に記載のリファマイシンアナログ)は第三級アミンを含み、第三級アミン中の窒素原子は、ペイロードをリンカーまたはリンカースペーサに結合させる原子である。このような場合、ペイロードの第三級アミンへの結合により、リンカーペイロード分子に第四級アミンが生じる。第四級アミン上の正電荷は、カウンターイオン(例えば、クロロ、ブロモ、ヨード、または、本明細書に記載のものなどの他のあらゆる好適に荷電された部分)により平衡を保つことができる。
範囲は、本明細書中、「約(about)」または「およそ(approximately)」の1つの特定の数値から、「約(about)」または「およそ(approximately)」の別の特定の数値までとして表すことができる。かかる範囲を表すとき、別の実施形態は、1つの特定の数値から他の特定の数値までを含む。
「含む(comprising)」、「含有する(containing)」、または「備える(including)」とは、少なくとも指定された化合物、要素、粒子、または方法の工程が、組成物、物品、または方法に存在しているが、他の化合物、材料、粒子、または方法の工程が、指定されたものと同じ機能を有する場合であっても、かかる他の化合物、物質、粒子、または方法の工程を除外しないことを意味する。
本開示の化合物は、本明細書全体に記載されるものを含み、本明細書に開示されるクラス、サブクラス、および種によってさらに例示される。本明細書で使用するとき、別段の定めのない限り以下の定義を適用されたい。本開示の目的では、化学元素は、「Periodic Table of the Elements,CAS version,Handbook of Chemistry and Physics,75th Ed」に従い特定される。加えて、有機化学の一般原理は、「Organic Chemistry」,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999、および「March’s Advanced Organic Chemistry」,5th Ed.,Ed.:Smith,M.B.and March,J.,John Wiley&Sons,New York:2001に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用するとき、「アルキル」という用語は、当技術分野ではその通常の意味として与えられ、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル(脂環式)基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基を含む場合がある。ある実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルのバックボーンには約1~20個の炭素原子(例えば、直鎖ではC1-C20、分枝鎖ではC2-C20)、および代替的に約1~10個の炭素原子、または約1~6個の炭素原子がある。いくつかの実施形態では、環が単環式または二環式であるシクロアルキル環の環構造には、約3~10個の炭素原子、および代替的に約5、6、または7個の炭素がある。いくつかの実施形態では、アルキル基は低級アルキル基の場合があり、このときに低級アルキル基は1~4個の炭素原子(例えば、直鎖低級アルキルではC1-C4)を含む。
本明細書で使用するとき、「アルケニル」という用語は、1つまたは複数の二重結合を有する、本明細書に定義されるアルキル基をいう。
本明細書で使用するとき、「アルキニル」という用語は、1つまたは複数の三重結合を有する、本明細書に定義されるアルキル基をいう。
「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄、窒素、リン、もしくはケイ素のうち1つまたは複数を意味する(窒素、硫黄、リン、もしくはケイ素のいずれかの酸化形態、いずれかの塩基性窒素の四級化形態、または複素環の置換可能な窒素を含む)。
「ハロゲン」という用語は、F、Cl、Br、またはIを意味する。「ハロゲン化物」という用語は、ハロゲンラジカルまたは置換基、すなわち-F、-Cl、-Br、または-Iをいう。
「付加物」、例えば本開示の「基B’の付加物」という用語は、付加反応の産物を含むいずれかの部分を産生するために取られる合成工程とは関係がない付加反応、例えば、基B’の付加反応の産物を含むいずれかの部分を包含する。
「共有結合(covalent attachment)」という用語は、共有結合、すなわち2個の原子間で1つまたは複数の電子対の共有に関与する化学結合の形成を意味する。共有結合形成は、σ-結合、π-結合、金属間結合、アゴスティック相互作用、曲がった結合、および三中心二電子結合を含むがこれらに限定されない、様々な相互作用を含む場合がある。第1の基が、第2の基に「共有結合可能」であると言われる場合、このことは、第1の基が、直接的に、または、例えば触媒の使用によるか特定の反応条件下で間接的に、第2の基と共有結合を形成可能であることを意味する。互いに共有結合可能な基の非限定的な例として、例えば、アミンとカルボン酸(アミド結合を形成)、ジエンとジエノフィル(ディールス・アルダー反応による)、およびアジドとアルキン(1,3-付加環化反応によりトリアゾールを形成)が挙げられる。
本明細書で使用するとき、本開示の化合物は「任意選択で置換された」部分を含有する場合がある。概して、「任意選択で」という用語は、それが先行するか否かに関係なく、指定部分の1つまたは複数の水素が、好適な置換基で置換されることを意味する。別段の定めのない限り、「任意選択で置換した」基は、その基の置換可能な位置それぞれに好適な置換基を有する場合があり、所与の構造中の1より多くの位置が、特定の基から選択した1より多くの置換基で置換されるとき、置換基はすべての位置において同じであるか、異なる場合がある。本開示により想定される置換基の組合せは、安定しているか化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものであることが好ましい。「安定した」という用語は、本明細書で使用するとき、本明細書に開示される目的のうち1つまたは複数において産生、検出、ならびにある実施形態では回収、精製、および使用を可能にする条件に晒したとき、実質的に改質されない化合物をいう。
別段の定めのない限り、本明細書中で描かれる構造はまた、当該構造の異性体(例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的(または立体構造的))形態、例えば、各不斉中心に対するR配置とS配置、(Z)と(E)の二重結合異性体、および(Z)と(E)の配座異性体をすべて含むことが意図される。そのため、単一の立体化学異性体のほか、本化合物のエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的(または立体構造的)混合物は、本開示の範囲内にある。
別段の定めのない限り、本開示の化合物の互変異性形態はすべて、本開示の範囲内にある。
加えて、別段の定めのない限り、本明細書中で描かれる構造はまた、1つまたは複数の同位体的に富化された原子の存在下でのみ異なる化合物を含むことが意図される。例えば、重水素もしくはトリチウムによる水素の置換、または11C、13C、もしくは14C-富化炭素による炭素の置換を除き本構造を有する化合物は、本開示の範囲内にある。
1つまたは複数の方法の工程に対する言及は、追加の方法の工程の存在、または明確に特定される工程間に介入する方法の工程を排除しないことも理解されたい。同様に、デバイスまたはシステム中の1つもしくは複数のコンポーネントに対する言及は、追加のコンポーネントの存在、または明確に特定されるコンポーネント間に介入するコンポーネントを排除しないことも理解されたい。
別段の定めのない限り、本開示の化合物およびその塩の結晶形態もすべて、本開示の範囲内にある。本開示の化合物は、無水であるか、水和されるか、溶媒和されないか、または溶媒和される形態を含むがこれらに限定されない様々な非晶質および結晶形態において単離される場合がある。水和物の例として、半水化物、一水和物、二水和物などが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の化合物は無水であり、溶媒和されない。「無水」とは、化合物の結晶形態が結晶格子構造中に結合水を実質的に含有していない、すなわち化合物が結晶性水和物を形成しないことを意味する。
本明細書で使用するとき、「結晶形態」とは、結晶性物質の特定の格子配置を指すことが意図される。同じ物質の異なる結晶形態は、典型的に結晶形態のそれぞれの特徴である様々な物理的性質に起因する、様々な結晶格子(例えば、単位格子)を有する。いくつかの例では、様々な格子配置は様々な水または溶剤含有量を有している。様々な結晶格子は、X線粉末回折(PXRD)などのソリッドステート特徴解析(solid state characterization)法により特定可能である。示差走査熱量測定(DSC)、熱重量分析(TGA)、動的蒸気吸着(DVS)、ソリッドステートNMRなどの他の特徴解析法は、さらに結晶形態の特定を補助するほか、安定性および溶媒/水分含有量の判定を補助する。
物質の結晶形態は、溶媒和形態(例えば水和形態)と不溶媒和形態(例えば無水形態)の両方を含む。水和形態は、結晶格子に水を含む結晶形態である。水和形態は化学量的水和物とすることができ、この場合、水は、半水和物、一水和物、二水和物などに対する特定の水/分子比で格子中に存在する。水和形態はさらに非化学量的とすることができ、この場合、水含有量は様々であり、湿度などの外部条件に左右される。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物は実質的に単離される。「実質的に単離された」とは、特定の化合物が不純物から少なくとも部分的に単離されることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、不純物を約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約2.5%未満、約1%未満、または約0.5%未満含む。不純物は、概して実質的に単離された化合物ではないものをすべて含み、例えば他の結晶形態や他の物質が挙げられる。
特定の基、部分、置換基、および原子は、波線で描かれる。波線は結合を交差するかキャッピングすることができる。波線は、基、部分、置換基、または原子を結合させる原子を示す。例えば、
「HER2」または「ヒト上皮増殖因子受容体2」という表現は、ヒト上皮増殖因子受容体ファミリーの員をいう。タンパク質は、NEU、NGL、HER2、TKR1、CD340、HER-2、MLN 19、HER-2/neuとしても知られる。HER2は、NCBIアクセッション番号NP_004439.2に明記されるアミノ酸配列を指すことができる。この癌遺伝子の増幅または過剰発現は、乳癌の特定の侵襲性種の発症と進行に重要な役割を果たすことが分かっている。近年、タンパク質は、乳房癌患者の約30%に対する治療の重要なバイオマーカおよび標的になっている。本明細書中のタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質フラグメントへの言及はすべて、非ヒト種由来であると明確に特定されていない限り、それぞれヒト種のタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントを指すように意図される。このため、「HER2」という表現は、非ヒト種由来のもの、例えば「マウスHER2」、「サルHER2」などと特定されていない限り、ヒトHER2を意味する。
「HER2を結合する抗体」または「抗HER2抗体」という句は、特異的にHER2を認識する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。
「抗HER2/HER2」抗体、例えば、「抗HER2/HER2二重特異性抗体」という句は、特異的に2つの異なるHER2エピトープを認識する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体およびその抗原結合性フラグメントは、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合する抗原結合性ドメイン(D1)と、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する第2の抗原結合性ドメイン(D2)とを含む。
「STEAP2」という表現は、本明細書で使用するとき、前立腺の6-膜貫通上皮抗原2(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 2)をいう。STEAP2は、前立腺上皮細胞中で高度に発現されるとともに前立腺癌の細胞表面マーカーである一体的な6-多側性膜貫通タンパク質であり、例えばSTEAP2は、LNCaP前立腺細胞株上、有意水準中で発現されることが分かった(Porkkaらによる、Lab Invest 2002,82:1573-1582)。STEAP2(UniProtKB/Swiss-Prot:Q8NFT2.3)は、ヒトの染色体領域7q21に位置するSTEAP2遺伝子によりコードされた490-アミノ酸タンパク質であり、例えば、表1と表2に記載のヒトSTEAP2のアミノ酸配列を参照されたい。
本明細書で使用するとき、「STEAP2を結合する抗体」または「抗STEAP2抗体」は、特異的にSTEAP2を認識する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。
「METを結合する抗体」または「抗MET抗体」という句は、特異的にMETを認識する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。「MET」、「c-MET」などの表現は、本明細書で使用するとき、ヒトの多側性膜受容体(membrane spanning receptor)チロシンキナーゼをいう。
「抗MET/MET」抗体、例えば、「抗MET/MET二重特異性抗体」という句は、特異的に2つの異なるMETエピトープを認識する抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体およびその抗原結合性フラグメントは、ヒトMETの第1のエピトープを特異的に結合する抗原結合性ドメイン(D1)と、ヒトMETの第2のエピトープを特異的に結合する第2の抗原結合性ドメイン(D2)とを含む。
本開示に使用するアミノ酸異常はすべて、米国特許商標局が容認し、37 C.F.R.§ 1 .822(B)(J)に明記されるものである。
「タンパク質」という用語は、アミド結合を介して共有結合される約20個より多くのアミノ酸を有するアミノ酸ポリマーを意味する。本明細書で使用するとき、「タンパク質」として、バイオ医薬品(biotherapeutic)タンパク質、研究や治療に用いる組換えタンパク質、捕捉タンパク質および他のFc融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、ナノボディ、組換え抗体キメラ、scFv融合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどが挙げられる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母菌系(例えば、Pichia sp.)、哺乳動物系(例えば、CHO細胞、CHO-K1細胞のようなCHO誘導体)など、組換え細胞を用いる産生システムを使用して産生することができる。
本明細書中のタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質フラグメントへの言及はすべて、非ヒト種由来であると明確に特定されていない限り、それぞれヒト種のタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントを指すように意図される。このため、「STEAP2」という表現は、非ヒト種由来のもの、例えば「マウスSTEAP2」、「サルSTEAP2」などと特定されていない限り、ヒトSTEAP2を意味する。
抗体のアミノ酸配列は、Kabatら(「Kabat」ナンバリングスキーム)、Al-Lazikaniらによる1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(「Chothia」ナンバリングスキーム)、MacCallumらによる1996,J.Mol.Biol.262:732-745(「Contact」ナンバリングスキーム)、LefrancらによるDev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(「IMGT」ナンバリングスキーム)、HoneggeとPluckthunによるJ.Mol.Biol.,2001,309:657-70(「AHo」ナンバリングスキーム)により記載されるものを含む、あらゆる公知のナンバリングスキームを用いてナンバリングすることができる。別段の定めのない限り、本明細書で使用されるナンバリングスキームはKabatナンバリングスキームである。しかし、ナンバリングスキームの選択は、差異が存在しない配列中で差異を示唆するようには意図されず、当業者は、1つまたは複数の抗体のアミノ酸配列を調べることにより配列の位置を容易に確認することができる。別段の定めのない限り、抗体重鎖定常領域の残基(例えば、上述のKabatらに報告されるもの)に対し言及されるとき、通常は「EUナンバリングスキーム」が使用される。
「グルタミニル修飾抗体」という用語は、グルタミン側鎖から本開示の第一級アミン化合物まで少なくとも1つの共有結合を有する抗体をいう。特定の実施形態では、第一級アミン化合物は、グルタミン側鎖上でアミド連結を介して連結される。ある実施形態では、グルタミンは内在性グルタミンである。他の実施形態では、グルタミンは、ポリペプチドの操作(例えば、ポリペプチド上でアミノ酸の欠失、挿入、置換、または突然変異を介する)により反応性とされる内在性グルタミンである。さらなる実施形態では、グルタミンは、アシルドナーグルタミン含有タグ(例えば、グルタミン含有ペプチドタグ、Q-タグ、またはTGase認識タグ)で操作されるポリペプチドである。
「TGase認識タグ」という用語は、アクセプターグルタミン残基を含むアミノ酸の配列であって、ポリペプチド配列に組み込まれる(例えば、追捕される)と、好適な条件下、TGaseにより認識されて、アミノ酸配列内のアミノ酸側鎖と反応パートナとの反応を介しTGaseによる架橋を生じさせる、配列をいう。認識タグは、TGase認識タグを含むポリペプチドに通常存在しないペプチド配列の場合がある。いくつかの実施形態では、TGase認識タグは少なくとも1つのGlnを含む。いくつかの実施形態では、TGase認識タグは、アミノ酸配列XXQX(配列番号1935)を含み、Xは、いずれかのアミノ酸(例えば、従来のアミノ酸Leu、Ala、Gly、Ser、Val、Phe、Tyr、His、Arg、Asn、Glu、Asp、Cys、Gln、Ile、Met、Pro、Thr、Lys、もしくはTrp、または従来のものでないアミノ酸)である。いくつかの実施形態では、アシルドナーグルタミン含有タグは、LLQGG(配列番号1936)、LLQG(配列番号1937)、LSLSQG(配列番号1938)、gGGLLQGG(配列番号1939)、gLLQG(配列番号1940)、LLQ、gSPLAQSHGG(配列番号1941)、gLLQGGG(配列番号1942)、gLLQGG(配列番号1943)、gLLQ(配列番号1944)、LLQLLQGA(配列番号1945)、LLQGA(配列番号1946)、LLQYQGA(配列番号1947)、LLQGSG(配列番号1948)、LLQYQG(配列番号1949)、LLQLLQG(配列番号1950)、SLLQG(配列番号1951)、LLQLQ(配列番号1952)、LLQLLQ(配列番号1953)、およびLLQGR(配列番号1954)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、その内容全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012059882号を参照されたい。
「抗体」という用語は、本明細書で使用するとき、特定の抗原に特異的に結合するか当該抗原と相互作用する少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含む、抗原結合性分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互接続される4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖、および2つの軽(L)鎖を含む免疫グロブリン分子のほか、それらの多量体(例えば、IgM)を含む。重鎖は、それぞれ重鎖可変領域(本明細書ではHCVRまたはVHと略す)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメインとしてCH1、CH2、CH3を含む。軽鎖は、それぞれ軽鎖可変領域(本明細書ではLCVRまたはVLと略す)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は1つのドメイン(CL1)を含む。VH領域とVL領域は、相補性決定領域(CDR)と称される超可変性領域へとさらに細分され、さらに保存されフレームワーク領域(FR)と称される領域に散在させることができる。VHとVLはそれぞれ、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される3つのCDRと4つのFRで構成される。異なる実施形態では、抗体(またはその抗原結合性部分)のFRは、ヒト生殖細胞系列配列と同一とするか、または自然もしくは人為的に修飾することができる。アミノ酸コンセンサス配列は、2つ以上のCDRの並行解析に基づき定めることができる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用するとき、完全な抗体分子の抗原結合性フラグメントも含む。抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語は、本明細書で使用するとき、複合体を形成するために抗原に特異的に結合する、あらゆる自然発生の、酵素的に入手可能な、合成の、もしくは遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性フラグメントは、例えば、DNAコード化抗体可変領域および任意選択で不変領域の操作と発現に関与するタンパク質分解消化や組換え遺伝子工学技法など、あらゆる好適な標準技法を使用して完全な抗体分子から得ることができる。かかるDNAは公知であり、および/もしくは、例えば商用供給源、DNAライブラリ(例えばファージ抗体ライブラリを含む)から容易に入手可能であり、または合成することができる。DNAは、1つもしくは複数の可変領域および/または定常領域を適切な配置へと配するか、または、コドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、および/もしくは欠失させるために、化学的に配列決定して操作されるか、または分子生物学技法の使用により配列決定して操作され得る。
抗原結合フラグメントの非限定的な例として、(i)Fabフラグメント、(ii)F(ab’)2フラグメント、(iii)Fdフラグメント、(iv)Fvフラグメント、(v)単鎖Fv(scFv)分子、(vi)dAbフラグメント、および(vii)抗体の超可変領域(例えばCDR3ペプチドなどの単離された相補性決定領域(CDR))または制限されたFR3-CDR3-FR4ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小の認識ユニットが挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、ダイアボディ(diabodies)、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)、ミニボディ(minibodies)、ナノボディ(nanobodies)(例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど)、小型モジュラー免疫医薬(small modular immunopharmaceuticals:SMIPs)、およびサメ可変IgNARドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用される「抗原結合性フラグメント」という表現に包含される。
抗体の抗原結合せフラグメントは、典型的に少なくとも1つの可変ドメインを含む。可変ドメインはあらゆるサイズまたはアミノ酸組成のドメインとすることができ、概して1つまたは複数のフレームワーク配列を有するフレームに隣接するか、そのフレーム中にある少なくとも1つのCDRを含む。VLドメインに関連するVHドメインを有する抗原結合性フラグメントでは、VHドメインとVLドメインは、あらゆる好適な配置で互いに対して位置付けることができる。例えば、可変領域は二量体とすることができ、VH-VH、VH-VL、またはVL-VL二量体を含有する。
代替的に、抗体の抗原結合性フラグメントは、単量体VHドメインまたはVLドメインを含有することができる。
ある実施形態では、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも1つの定常領域に共有結合される少なくとも1つの可変ドメインを含有することができる。本明細書の抗体の抗原結合性フラグメント内に見ることができる可変領域と定常領域の非限定的で例示的な配置として、(i)VH-CH1、(ii)VH-CH2、(iii)VH-CH3、(iv)VH-CH1-CH2、(v)VH-CH1-CH2-CH3、(vi)VH-CH2-CH3、(vii)VH-Cl、(viii)VL-CH1、(ix)VL-CH2、(x)VL-CH3、(xi)VL-CH1-CH2、(xii)VL-CH1-CH2-CH3、(xiii)VL-CH2-CH3、および(xiv)VL-CLが挙げられる。本明細書に列記した例示的な配置のいずれかを含む可変領域と定常領域のいずれかの配置では、可変領域と定常領域は、互いに直接連結されるか、完全もしくは部分的なヒンジ領域またはリンカー領域により連結することができる。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中で隣り合う可変領域および/もしくは定常領域間に可動性または半可動性の連結をもたらす、少なくとも2つ(例えば5、10、15、20、40、60以上)のアミノ酸からなり得る。
さらに、本明細書の抗体の抗原結合性フラグメントは、(例えば、ジスルフィド結合により)互いに、および/または1つもしくは複数の単量体VHもしくはVLドメインと共有結合状態にある、本明細書に列記した可変ドメイン配置および定常ドメイン配置のうちいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体(または他の多量体)を含むことができる。
完全な抗体分子と同様に、抗原結合性フラグメントは、単特異性または多重特異性(例えば、二重特異性)とすることができる。抗体の多重特異性抗原結合性フラグメントは、典型的に少なくとも2つの異なる可変ドメインを含み、このときに各可変ドメインは、同じ抗原上で別個の抗原または異なるエピトープに特異的に結合可能である。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体の形式を含む多重特異性抗体の形式は、当該技術分野で利用可能な慣例的技法を用いて、本明細書の抗体の抗原結合性フラグメントの観点で使用に適合させることができる。
本明細書の抗体は、補体依存細胞毒性(CDC)または抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を介して機能することができる。「補体依存性細胞毒性」(CDC)は、補体の存在下で本明細書の抗体による抗原発現細胞の溶解をいう。「抗体依存性細胞性細胞毒性」(ADCC)は、Fc受容体(FcRs)を発現する非特異性細胞傷害性細胞(例えばナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が、標的細胞上で結合された抗体を認識することで標的細胞の溶解を生じさせる細胞媒介性反応をいう。CDCとADCCは、当該技術分野で周知であるとともに利用可能なアッセイを使用して測定可能である(例えば、米国特許第5,500,362号と5,821,337号、およびClynesらによる(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656を参照)。抗体の定常領域は、抗体が補体を固定して細胞依存性細胞毒性を媒介する能力に重要である。ゆえに、抗体のアイソタイプは、抗体による細胞毒性の媒介が望ましいかどうかに基づき選択することができる。
ある実施形態では、本明細書の抗体、例えば、抗HER2抗体、抗HER2/HER2二重特異性抗体、抗MET抗体、抗MET/MET二重特異性抗体、または抗STEAP2抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用するとき、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる可変領域および定常領域を有する抗体を含むように意図される。本明細書のヒト抗体は、例えばCDRと特定のCDR3において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroでの無作為もしくは部位特異的な突然変異誘発、またはin vivoでの体細胞突然変異により導入される突然変異)を含むことができる。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用するとき、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上にグラフとされる抗体を含むようには意図されていない。
抗体は、いくつかの実施形態では組換えヒト抗体とすることができる。「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用するとき、組換え手段により調製、発現、作製、または単離されるヒト抗体すべてを含むように意図されており、かかる抗体としては、宿主細胞(以下に詳述される)へとトランスフェクトされる組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組換えの組合せヒト抗体ライブラリ(以下に詳述される)から単離される抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対しトランスジェニックな動物(例えばマウス)から単離されり抗体(例えば、Taylorらによる(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295を参照)、または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA塩基配列へのスプライシングに関与する他のいずれかの手段により調製、発現、作製、もしくは単離される抗体などがある。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変領域と定常領域を有する。しかし、ある実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、in vitro突然変異誘発(または、ヒトIg配列に対しトランスジェニックな動物の使用時には、in vivo体性突然変異誘発)にかけられ、これにより、組換え抗体のVH領域とVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列VH配列とVL配列から得られこれに関連するが、in vivoでのヒト抗体生殖細胞系列のレパートリー内に通常は存在しない場合がある配列である。
ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する2つの形態で存在することができる。一方の形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合により一体的に保持される約150~160kDaの安定した4つの鎖状構築物を含む。他方の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合により連結されず、共有結合された軽鎖と重鎖(半抗体)で構成される約75~80kDaの分子が形成される。これらの形態は、親和性精製の後でも分離が極めて困難であった。様々な無傷のIgGアイソタイプ中に第2の形態が出現する頻度は、限定されないが抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的な差異に起因する。ヒトIgG4ヒンジのヒンジ領域中の単一アミノ酸置換は、ヒトIgG1ヒンジを使用して通常観察される程度にまで、第2の形態の出現(Angalらによる、(1993)Molecular Immunology 30:105)を大きく低減することができる。本明細書は、所望の抗体形態の収率を改善するのに、例えば産生時に望ましい可能性があるヒンジ領域、CH2領域、またはCH3の領域に、1つまたは複数の突然変異を有する抗体を包含する。
本明細書の抗体は、単離された抗体または精製された抗体とすることができる。「単離された抗体」または「精製された抗体」は、本明細書で使用するとき、その自然環境の少なくとも1つの成分から特定、分離、および/または回収された抗体を意味する。例えば、生物体の少なくとも1つの成分、または抗体が自然に存在するか自然に産生される組織もしくは細胞から、分離または除去される抗体は、本明細書の目的における「単離された抗体」である。例えば、1つの反応または一連の反応の少なくとも1つの成分から精製された抗体は、「精製された抗体」であるか、または抗体の精製に起因する。単離された抗体はまた、組換え細胞内にin situで抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程または単離工程にかけられた抗体である。ある実施形態によれば、単離された抗体は、他の細胞材料および/または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
本明細書に開示される抗体は、抗体が得られる対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークならびに/またはCDR領域に、1つもしくは複数のアミノ酸置換、挿入、および/または欠失を含むことができる。このような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と、例えば公的な抗体配列データベースから利用可能な生殖細胞系列配列とを比較することで容易に確認することができる。本明細書は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかから得られる抗体およびその抗原結合性フラグメントを含み、このとき、1つもしくは複数のフレームワークおよび/またはCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸は、抗体が得られる生殖細胞系列配列の対応する残基へと、別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基へと、または対応する生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換へと突然変異される(かかる配列の変化は、本明細書では総じて「生殖細胞系列突然変異」と称される)。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域から開始して、1つもしくは複数の生殖細胞系列突然変異個別、またはそれらの組合せを含む多数の抗体および抗原結合性フラグメントを容易に産生することができる。ある実施形態では、VHおよび/またはVLドメイン内のフレームワーク残基および/またはCDR残基はすべて、抗体が得られる本来の生殖細胞系列配列に見られる残基に戻って突然変異を受ける。他の実施形態では、特定の残基のみ、例えば、FR1の最初の8つのアミノ酸またはFR4の最後の8つのアミノ酸に見られる突然変異を受けた残基のみ、またはCDR1、CDR2、もしくはCDR3に見られる突然変異を受けた残基のみが、本来の生殖細胞系列配列に戻って突然変異を受ける。他の実施形態では、フレームワーク残基および/またはCDR残基のうち1つまたは複数は、異なる生殖細胞系列配列(すなわち、抗体が本来得られる生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列)の対応する残基へと突然変異される。
さらに、本明細書の抗体は、フレームワーク領域および/またはCDR領域内に2つ以上の生殖細胞系列突然変異のいずれかの組合せを含有することができ、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖細胞系列配列の対応する残基へと突然変異されるが、本来の生殖細胞系列配列と異なる他の特定の残基は、維持されるか、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基へと突然変異される。1つまたは複数の生殖細胞系列突然変異を含有する抗体および抗原結合性フラグメントは、一旦取得されると、結合特異性の改善、結合親和性の増加、拮抗的もしくは作用的な生体特性の改善または増強(場合に応じて)、免疫原性の減少、抗体薬物複合体における薬物抗体比(DAR)の改善など、1つまたは複数の望ましい特性について容易に検査することができる。このように一般的に得られる抗体および抗原結合性フラグメントは、本明細書内に包含される。
「非グリコシル化抗体(aglycosylated antibody)」という用語は、トランスグルタミン化(transglutamination)反応に干渉し得るグリコシル化配列を含まない抗体、例えば、1つまたは複数の重鎖上でN297においてサッカライド基を有さない抗体をいう。特定の実施形態では、抗体重鎖はN297突然変異を有する。言い換えれば、抗体は突然変異すると、Kabatらにより開示されるEUナンバリングシステムにより297位にアスパラギン残基をこれ以上有さなくなる。特定の実施形態では、抗体重鎖は、N297QまたはN297D突然変異を有する。かかる抗体は、グリコシル化配列を取り除くか無能とする部位特異的変異誘発により、または、干渉するグリコシル化部位もしくは他の干渉構造とは別の部位でグルタミン残基を挿入する部位特異的変異誘発により調製することができる。かかる抗体は、天然または人工のソースから単離することもできる。非グリコシル化抗体はまた、T299もしくはS298P、その他の突然変異、またはグリコシル化の欠如をもたらす突然変異の組合せを含む抗体を含む。
「脱グリコシル化抗体」という用語は、トランスグルタミナーゼ媒介型コンジュゲーションを促進するべくサッカライド基が除去される抗体をいう。サッカライドとして、N連結オリゴサッカライドが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、脱グリコシルは残基N297で行われる。いくつかの実施形態では、サッカライド基の除去は、PNGaseを介するがこれに限定されず酵素を用いて成し遂げられる。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中で特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基をいう。1つの抗原は、1より多くのエピトープを有することができる。そのため、様々な抗体が抗原上で様々な領域に結合し、様々な生体作用を有することができる。エピトープは、立体構造的または線形のいずれかとすることができる。立体構造的エピトープは、線形ポリペプチド鎖の様々なセグメントから空間的に並列されたアミノ酸によって産生される。線形エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基により産生されるエピトープである。ある状況では、エピトープは、抗原上にサッカライド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含むことができる。
「コンジュゲートされたタンパク質」または「コンジュゲートされた抗体」という用語は、本明細書で使用するとき、1つまたは複数の化学部分に共有結合により連結されるタンパク質または抗体をいう。化学部分は、本開示のアミン化合物を含むことができる。本開示での使用に適したリンカー(L)およびペイロード(D)は、本明細書中で詳述される。特定の実施形態では、治療部分を含むコンジュゲートされた抗体は、抗体ペイロードコンジュゲート、または抗体リンカーペイロードコンジュゲートとも呼ばれる抗体薬物複合体(ADC)である。
「薬物抗体比」または(DAR)という用語は、本開示の結合剤にコンジュゲートされる治療部分、例えば薬物の平均数である。
「リンカー抗体比」または(LAR)という用語は、下部の事例Iとして表され、いくつかの実施形態では、本開示の結合剤にコンジュゲートされる反応性の第一級アミン化合物の平均数である。かかる結合剤、例えば抗体は、例えば好適なアジドやアルキンを含む第一級アミン化合物とコンジュゲートすることができる。得られる結合剤は、アジドまたはアルキンで官能化され、その後、対応するアジドまたはアルキンを含む治療部分と、1,3-付加環化反応を介して反応することができる。
「薬学的に許容可能な量」という句は、必要とする対象の少なくとも1つの健康問題の作用または症状を処置、減少、軽減、もしくは調節するのに有効または十分な量をいう。例えば、抗体または抗体薬物複合体の薬学的に許容可能な量は、本明細書で提供する抗体または抗体薬物複合体を用いて生体標的を調節するのに有効な量である。好適な薬学的に許容可能な量として、本明細書で提供する抗体または抗体薬物コンジュゲートの約0.001%~最大約10%、その間にあるいずれかの量、例えば約0.01%、約0.02%、約0.03%、約0.04%、約0.05%、約0.06%、約0.07%、約0.08%、約0.09%、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、または約10%が挙げられるが、これらに限定されない。
「反応性pH」という句は、すべての反応成分または反応物が添加された後の反応物のpHをいう。
「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、核酸またはそのフラグメントに対し言及するとき、適切なヌクレオチド挿入または欠失と、別の核酸(またはその相補鎖)との最適なアライメントが行われると、以下に論じるFASTA、BLAST、またはGAPなどの周知の配列同一性アルゴリズムにより測定すると核酸塩基の少なくとも約95%、より好ましくは少なくとも約96%、97%、98%、または99%にヌクレオチド配列同一性が存在することを意味する。基準核酸分子に対し実質的な同一性を有する核酸分子は、ある例では、基準核酸分子によりコードされるポリペプチドと同じか、実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に同様の」という用語は、デフォルトギャップ重量を用いてプログラムgAPやBESTFITなどにより2つのペプチド配列は最良にアライメントされると、少なくとも95%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも98%または99%の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により相違する。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、同様の化学特性(例えば、電荷または疎水性)を有する側鎖(R基)を有している他のアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換である。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変更しない。2つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに相違する場合、配列同一性の割合または類似度は、置換の保存的性質を補正するために上方へ調整することができる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、「Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331」を参照されたい。同様の化学特性を有する側鎖を有しているアミノ酸の群の例には、(1)脂肪族側鎖としてグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2)脂肪族ヒドロキシル側鎖としてセリンおよびトレオニン、(3)アミド含有側鎖としてアスパラギンおよびグルタミン、(4)芳香族側鎖としてフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(5)塩基性側鎖としてリジン、アルギニン、およびヒスチジン、(6)酸性側鎖としてアスパルテートおよびグルタメート、ならびに(7)硫黄含有側鎖としてシステインおよびメチオニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタメート-アスパルテート、およびアスパラギン-グルタミンである。
代替的に、保存的置換は、「Gonnetらによる(1992)Science 256:1443-1445」に開示されるPAM250対数尤度マトリクスに正の値がある変化である。「中程度に保存的な」置換は、PAM250尤度対数マトリクスに負でない値がある変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性とも称され、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられる類似性の測定を用いて類似の配列に一致する。例えば、gCGソフトウェアには、gapやBestfitなどのプログラムが含まれており、これらプログラムをデフォルトパラメータで使用することで、生物体の様々な種に由来する相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間で、または野生型タンパク質とその突然変異蛋白質との間で配列相同性または配列同一性を求めることができる。例えば、gCG Version 6.1を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、gCG Version 6.1中のプログラムである、デフォルトまたは推奨パラメータを用いるFASTAを使用して比較することもできる。FASTA(例えば、FASTA2およびFASTA3)は、クエリ配列と検索配列との間にある最良な重複領域のアライメントと配列同一性割合を提供する(上述のPearson(2000))。本明細書の配列と、様々な生物体の多数の配列を包含するデータベースとを比較したときの別の特定のアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いるコンピュータプログラムBLAST、具体的にBLASTPまたはTBLASTNである。例えば、Altschulらによる(1990)J.Mol.Biol.215:403-410、およびAltschulらによる(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402を参照されたい。
タンパク薬物コンジュゲート化合物
前述の目的などによれば、本開示は、タンパク薬物コンジュゲート化合物、例えば抗体薬物コンジュゲート化合物、その前駆体と中間体、医薬組成物、および処置を必要とする対象の特定の疾患を処置する方法を提供する。本開示によれば、本明細書で提供するタンパク薬物コンジュゲート化合物は、本明細書に記載される治療部分、例えばカンプトテシンアナログ部分に連結される第一級アミン化合物でコンジュゲートされる、グルタミニル修飾結合剤を含む。
前述の目的などによれば、本開示は、タンパク薬物コンジュゲート化合物、例えば抗体薬物コンジュゲート化合物、その前駆体と中間体、医薬組成物、および処置を必要とする対象の特定の疾患を処置する方法を提供する。本開示によれば、本明細書で提供するタンパク薬物コンジュゲート化合物は、本明細書に記載される治療部分、例えばカンプトテシンアナログ部分に連結される第一級アミン化合物でコンジュゲートされる、グルタミニル修飾結合剤を含む。
一態様では、本開示は、本開示による結合剤(例えば、抗体またはそのフラグメント)を含み、1つまたは複数のグルタミン残基を有する化合物を提供し、1つまたは複数のグルタミン残基は、任意選択の第1のリンカー、少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニット、および任意選択の第2のリンカーを介して、1つまたは複数のカンプトテシンアナログ、例えばDxdにコンジュゲートされる。例示的で非限定的な例として、本明細書に記載の式(I)と式(II)が挙げられる。本開示によるタンパク薬物コンジュゲートの特定の実施形態では、結合剤は抗体(例えばモノクローナル抗体)であり、「抗体薬物コンジュゲート」またはADCという用語は、任意選択で使用される。
一態様では、本開示は、式(C):
BA-Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Camp)m)n(C)
による構造を有する化合物を提供し、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は第1の成分、例えば第1の付加環化成分であり、L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、B’’は第2の成分、例えば第2の付加環化成分であり、基B’と基B’’は少なくとも1つの付加物を形成し、Mは、存在しないか、または構造:
BA-Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Camp)m)n(C)
による構造を有する化合物を提供し、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は第1の成分、例えば第1の付加環化成分であり、L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、B’’は第2の成分、例えば第2の付加環化成分であり、基B’と基B’’は少なくとも1つの付加物を形成し、Mは、存在しないか、または構造:
一態様では、本開示は、式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’および基B’’のうち少なくとも1つは、-N3および
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’および基B’’のうち少なくとも1つは、-N3および
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または構造:
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、
mは、1~30の整数であり、
nは、1~30の整数である、
化合物を提供する。
一態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、Bは、基B’の少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、Bは、基B’の少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
化合物を提供する。
リンカーL1
ある実施形態では、リンカーL1は存在しない。
ある実施形態では、リンカーL1は存在しない。
ある実施形態では、リンカーL1は存在し、結合剤BAのグルタミン残基のアミンに共有結合される。
ある実施形態では、リンカーL1は、アルキル(例えば、C1-20アルキル、C1-12アルキル、またはC1-6アルキル)、-NH-、-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、2~4個のアミノ酸を含むペプチドユニット、またはそれらの組合せを含み、これらのそれぞれは、-S-、-S(O2)-、-C(O)-、-C(O2)-、または-CO2Hのうち1または複数により任意選択で置換され、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数である。
ある実施形態では、遊離(コンジュゲートされていない)リンカーL1は、トランスグルタミン化反応を介したグルタミン残基への結合のために第一級アミンを含む。
一実施形態では、リンカーL1は、1つまたは複数のポリエチレングリコール(PEG)ユニットを含む。一実施形態では、L1は、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のPEGユニットを含む。
一実施形態では、リンカーL1はジスルフィド(-S-S-)結合を含む。
一実施形態では、リンカーL1は、-S(O2)-部分を含む。
一実施形態では、L1上の1つまたは複数の炭素は、-CO2Hで置換される。
一実施形態では、リンカーL1は、2~4個のアミノ酸を含むペプチドユニット、2個のアミノ酸を含むペプチドユニット、3個のアミノ酸を含むペプチドユニット、または4個のアミノ酸を含むペプチドユニットを含む。
一実施形態では、リンカーL1は、グリシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、グルタミン酸、およびシトルリン、ならびにそれらの組合せから選択される2個のアミノ酸を含むペプチドユニットを含む。特定の一実施形態では、リンカーL1は、バリン-シトルリンユニットを含む。
一実施形態では、リンカーL1は、
分枝ユニットB
分枝ユニットBは、基B’の少なくとも1つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の1つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の2つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の3つの付加物を含む。
分枝ユニットBは、基B’の少なくとも1つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の1つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の2つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の3つの付加物を含む。
ある実施形態では、Bは、基B’の少なくとも4つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の4つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の5つの付加物を含む。ある実施形態では、Bは、基B’の6つの付加物を含む。
概して、本開示による基B’の付加物は、基B’の付加反応の産物を含む部分を産生するために取られる合成工程とは無関係に、基B’の付加反応の産物を含む部分を包含する。
いくつかの実施形態では、基B’の付加物は、置換されたマレイミドの産物、および例えば、チオール、または置換されたトランス-シクロオクテン、例えば
式中、nは0~12の整数である置換されたトランス-シクロオクテン、および例えばテトラジンの場合がある。
いくつかの実施形態では、基B’の付加物は、アジド部分とアルキン部分との間での1,3-付加環化反応の産物の場合がある。理論に縛られるものではないが、アジド-アルキン付加環化は、1,2,3-トリアゾールを得るための、アジドと末端または内部アルキンとの間での1,3-二極性付加環化である。
より具体的には、-N3、
非限定的な例として、基B’はアジド(-N3)の場合があり、基B’’はアルキン含有基、例えば、
別の非限定的な例として、基B’はアルキン含有部分、例えば、
一実施形態では、基B’および基B’’の付加物は、トリアゾール部分を含む。特定の一実施形態では、基B’および基B’’の付加物は、
上述のように、一実施形態では、Bは、基B’の1つの付加物を含む。
特定の実施形態では、L1-Bは、
式中、
一実施形態では、基B’はアジド(-N3)であり、基B’の付加物はトリアゾールを含む。
本開示の一実施形態によれば、リンカーL1-Bはアジドアミンリンカー(AL)の場合があり、これは、抗体に直接結合するアミン基、PEG含有基礎構造、およびアジド官能基B’(n=1)を含んでいる。
非限定的で例示的なアジドアミンリンカーの基本成分構造を図3Bに示す。例として合成された特定構造を、以下に提供する。
一実施形態では、Bは、基B’の少なくとも2つの付加物を含む。特定の実施形態では、Bは、
特定の実施形態では、Bは、
特定の実施形態では、L1-Bは、
本開示の別の実施形態によれば、リンカーL1-Bは、BA(例えば抗体)に直接結合するアミン基、分枝アルキルPEG含有基礎構造、および2~6個のアジド官能基B’(n=2-6)を含む、分枝アルキルアジドアミンリンカー(BL)の場合がある。
例示的で非限定的な分枝アルキルアジドアミンリンカーの基本成分構造を図4Bに列記する。例として合成された特定構造を、以下に提供する。
リンカーL2
本開示のある実施形態では、L2は、式(L2):
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2)
による構造を有し、式中、
B’’は、基B’に共有結合可能な基であり、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または第3のスペーサユニットであり、
pは、1~12の整数である。
本開示のある実施形態では、L2は、式(L2):
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2)
による構造を有し、式中、
B’’は、基B’に共有結合可能な基であり、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または第3のスペーサユニットであり、
pは、1~12の整数である。
本開示のある実施形態では、L2は、式(L2’):
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2’)
による構造を有し、式中、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または第3のスペーサユニットであり、
pは、1~12の整数である。
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2’)
による構造を有し、式中、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または第3のスペーサユニットであり、
pは、1~12の整数である。
本開示のある実施形態では、L2は、式(L2’’):
マレイミド-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2’’)
による構造を有し、式中、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または第3のスペーサユニットであり、
pは、1~12の整数である。
マレイミド-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2’’)
による構造を有し、式中、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または第3のスペーサユニットであり、
pは、1~12の整数である。
いくつかの実施形態では、リンカーL2は、上述される基B’に共有結合可能な基B’’を含む。
ある実施形態では、基B’’は、-N3、
非限定的な例として、基B’’は、アルキン含有部分、例えば、
別の非限定的な例として、基B’’はアジドの場合がある。
一実施形態では、基B’および基B’’の付加物は、トリアゾール部分を含む。特定の一実施形態では、基B’および基B’’の付加物は、
一実施形態では、第1のスペーサSP1は、存在しない。
別の実施形態では、SP1は、
一実施形態では、分枝ユニットB2は、存在しない。
一実施形態では、本開示の分枝ユニットB2は、後述のB1~B5のうち1つの構造を有する。
一実施形態では、第2のスペーサSP2は、存在しない。
別の実施形態では、SP2は、アルキル(例えば、C1-20アルキル、C1-12アルキル、C1-10アルキル、C1-8アルキル、またはC1-6アルキル)、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O) 、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、またはそれらの組合せからなる群から選択され、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数である。
ある実施形態では、AAは、グリシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、グルタミン酸、リシン、フェニルアラニン、およびシトルリン、ならびにそれらの組合せから選択される2~4個のアミノ酸を含むペプチドユニットである。
一実施形態では、AAは、2個のアミノ酸を含むペプチドユニットである。一実施形態では、AAは、3個のアミノ酸を含むペプチドユニットである。一実施形態では、AAは、4個のアミノ酸を含むペプチドユニットである。
特定の一実施形態では、AAは、バリン-シトルリン、バリン-アラニン、またはフェニルアラニン-リシンである。
別の特定の実施形態では、AAは、グリシン-グリシン-グリシン(GGG)、グリシン-グリシン-グリシン-グリシン(GGGG(配列番号2113))、グリシン-グリシン-フェニルアラニン(GGF)、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン(GGFG(配列番号2114))、およびグルタミン酸-バリン-シトルリン(EVC)からなる群から選択される。
一実施形態では、第3のスペーサSP3は、存在しない。
別の実施形態では、SP3は、
一実施形態では、スペーサSP3は、カンプトテシンアナログ、例えば、DxdまたはM-Dxdに共有結合される。
一実施形態では、リンカーL2は、約1~約12、約1~約10、約1~約8、約1~約6、約1~約4、または約1~約2個の(SP2-AA-SP3)部分を含み、リンカーペイロードL2-Dxdは、約1~約12、約1~約10、約1~約8、約1~約6、約1~約4、または約1~約2個のDxdペイロード分子を含む。
部分M
ある実施形態では、部分Mは存在しない。
ある実施形態では、部分Mは存在しない。
ある実施形態では、Mは存在し、
ある実施形態では、Mは存在し、
一実施形態では、Rは水素である。
一実施形態では、R’は水素である。一実施形態では、R’はC1-C4アルキルである。
一実施形態では、R’’は水素である。一実施形態では、R’’はC1-C4アルキルである。
一実施形態では、R’とR’’は一体となることで5員環を形成する。一実施形態では、R’とR’’は一体となって-(CH2)3-である。
一実施形態では、R’とR’’は一体となることで6員環を形成する。一実施形態では、R’とR’’は一体となって-(CH2)4-である。
一実施形態では、R、R’、およびR’’は、それぞれの出現に水素であり、すなわちMは、
別の実施形態では、Rは水素であり、R’とR’’は一体となることで5員環を形成し、例えばR’とR’’は一体となって-(CH2)3-であり、Mは
ペイロード
ある実施形態では、本開示のペイロードは、カンプトテシンアナログおよび/または誘導体である。
ある実施形態では、本開示のペイロードは、カンプトテシンアナログおよび/または誘導体である。
上述のカンプトテシン(CPT)は、トポイソメラーゼ毒である。これは、1966年、抗癌薬用の天然物に対する系統的スクリーニングにおいて、M.E.WallとM.C.Waniにより発見された。カンプトテシンは、従来の漢方薬中で癌治療として使用される中国固有の木であるカンレンボク(喜樹、幸福な木(Camptotheca,Happy tree))の樹皮と幹から単離された。カンプトテシンは、予備臨床試験で顕著な抗癌活性を呈した。しかし、カンプトテシンの溶解度は低いため、合成および医薬の化学者らは、化学薬品の利益を増大させるべく、結果が良好なカンプトテシンと各種誘導体との多数の合成物を開発した。4つのカンプトテシンアナログとしてトポテカン、イリノテカン、ベロテカン、デルクステカン(Dxd)が承認されており、今日では癌化学療法に使用されている。
トラスツズマブデルクステカン(T-Dxd)は、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)指向性(directed)抗体であるトラスツズマブと、トポイソメラーゼI阻害剤コンジュゲートデルクステカン(Dxd、エクサテカンの誘導体)を含む、抗体薬物コンジュゲートである。これは2019年12月に米国での使用を承認された。下記に示すエクサテカンは、カンプトテシンアナログである。
一実施形態では、本開示のペイロードは、デルクステカン(Dxd)である。
ある実施形態では、本開示のペイロードは、構造P-I:
一実施形態では、R1は水素である。
一実施形態では、R2は水素である。一実施形態では、R2はC1-C4アルキルである。
一実施形態では、R3は水素である。一実施形態では、R3はC1-C4アルキルである。
一実施形態では、R4は水素である。一実施形態では、R4はC1-C4アルキルである。
一実施形態では、R1、R2、R3、およびR4は、それぞれの出現時に水素である。一実施形態では、本開示の化合物は、
一実施形態では、R2とR3は一体となることで5員環を形成する。一実施形態では、R2とR3は一体となって-(CH2)3-である。
一実施形態では、R2とR3は一体となることで6員環を形成する。一実施形態では、R2とR3は一体となって-(CH2)4-である。
一実施形態では、R1は水素であり、R2とR3は一体となることで5員環を形成する。
一実施形態では、本開示の化合物は、式(P-II):
上記で描く化合物P-IIはまた、構造の異性体(例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的(すなわち立体構造的))形態すべてを含むように意図されることが、当業者により理解されるはずである。例えば、各不斉中心におけるR配置とS配置は、本開示の範囲内にある。例として、以下に描く2つの異性体は、本開示の範囲内にある
一実施形態では、本開示の化合物は、
一実施形態では、本開示によるペイロードは、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)を形成するべくコンジュゲートされる。一実施形態では、ペイロードは、部分Mに共有結合される。一実施形態では、ペイロードはM-Dxdである。一実施形態では、M-Dxdは、
本開示はまた、上述の治療有効量の化合物またはその薬学的に許容可能な塩と、1つもしくは複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、本開示による化合物は、以下の構造:
一実施形態では、本開示による化合物は、以下の構造:
一実施形態では、本開示による化合物は、以下の構造:
一実施形態では、本開示による化合物は、以下の構造:
本開示はまた、上述の治療有効量の化合物またはその薬学的に許容可能な塩と、1つもしくは複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
リンカーペイロード(L2P)
別の態様では、本開示は、式(L2-P):
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
別の態様では、本開示は、式(L2-P):
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
SP1は、存在しないか、または
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択される第2のスペーサユニットであり、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数であり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
pは、1~12の整数である、
化合物を提供する。
別の態様では、本開示は、式(L2’-P):
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
SP1は、存在しないか、または
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択される第2のスペーサユニットであり、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数であり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
pは、1~12の整数である、
化合物を提供する。
別の態様では、本開示は、式(L2’’-P):
マレイミド-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’’-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
マレイミド-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’’-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
SP1は、存在しないか、または
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択される第2のスペーサユニットであり、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数であり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
pは、1~12の整数である、
化合物を提供する。
ある実施形態では、本開示によるリンカーペイロードL2-P、L2’-P、L2’’-Pは、
分枝リンカー2-ペイロード(BL2P)
別の態様では、本開示は、1つまたは複数の分枝ユニットを含むL2-Pを提供する。本開示による例示的な分枝ユニットB1-B5は、下記に描く。
本開示による例示的な分枝リンカー2-ペイロード(BL2P)の構造を、下記に提供する。
一実施形態では、本開示による化合物(すなわち、リンカーペイロード)は、
一実施形態では、本開示による化合物(すなわち、リンカーペイロード)は、
別の態様では、本開示は、式(II):
Ab-(Gln-NH-L1-B-(SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)k)p)n(II)
による抗体薬物コンジュゲートを提供し、
式中、Abは抗体であり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、存在しないか、または上述される第1のリンカーであり、Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む上述される分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
Ab-(Gln-NH-L1-B-(SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)k)p)n(II)
による抗体薬物コンジュゲートを提供し、
式中、Abは抗体であり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、存在しないか、または上述される第1のリンカーであり、Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む上述される分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
一実施形態では、本開示による抗体薬物コンジュゲートは、抗体およびリンカーペイロードを含み、リンカーペイロードは、
結合剤
一実施形態では、本明細書に記載のタンパク薬物コンジュゲートの実施形態の有効性は、結合剤がその結合パートナーに結合する選択性に依存する。本開示の一実施形態では、結合剤は、幾分の選択性をもって所与の結合パートナーに結合可能な分子である。一実施形態では、結合剤は、相互作用が治療用途で生じる可能性のある哺乳動物の中にある。代替的な実施形態では、結合剤は、相互作用が診断用途で生じる可能性のあるin vitroである。いくつかの態様では、結合剤は、細胞または細胞集団に結合可能である。
一実施形態では、本明細書に記載のタンパク薬物コンジュゲートの実施形態の有効性は、結合剤がその結合パートナーに結合する選択性に依存する。本開示の一実施形態では、結合剤は、幾分の選択性をもって所与の結合パートナーに結合可能な分子である。一実施形態では、結合剤は、相互作用が治療用途で生じる可能性のある哺乳動物の中にある。代替的な実施形態では、結合剤は、相互作用が診断用途で生じる可能性のあるin vitroである。いくつかの態様では、結合剤は、細胞または細胞集団に結合可能である。
本開示の好適な結合剤として、結合パートナーに結合するタンパク質が挙げられ、このとき結合剤は、1つまたは複数のグルタミン残基を含む。好適な結合剤として、抗体、リンホカイン、ホルモン、成長因子、ウイルス受容体、インターロイキン、または他のあらゆる細胞結合もしくはペプチド結合の分子もしくは物質が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、結合剤は抗体である。ある実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント(Fab、Fab’、およびF(ab)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディなど)から選択される。本明細書中の抗体は、米国特許第6,596,541号と米国特許出願公開第2012/0096572号に記載の方法を使用してヒト化することができ、これらはそれぞれ全体を参照することで援用される。本開示のタンパク薬物コンジュゲート化合物のある実施形態では、BAは、ヒト化モノクローナル抗体である。例えば、BAは、HER2、MET、またはSTEAP2を結合するモノクローナル抗体とすることができる。本開示のタンパク薬物コンジュゲート化合物のある実施形態では、BAは、二重特異性抗体、例えば、抗HER2/HER2二重特異性抗体、または抗MET/MET二重特異性抗体である。
本開示では、抗体は、当業者に適していると見なされるいずれかの抗体とすることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖配列に少なくとも1つのグルタミン残基を含む。ある実施形態では、抗体は、1つまたは複数のgln295残基を含む。ある実施形態では、抗体は2つの重鎖ポリペプチドを含み、それぞれ1つのgln295残基を有する。さらなる実施形態では、抗体は、重鎖295とは別の部位に1つまたは複数のグルタミン残基を含む。かかる抗体は、自然源から単離するか、または1つもしくは複数のグルタミン残基を含むように操作することができる。グルタミン残基を抗体ポリペプチド鎖へと操作するための技法は、当業者の考え得る範囲内にある。ある実施形態では、抗体はグリコシル化されない(aglycosylated)。
抗体は、当業者に既知のいずれかの形態とすることができる。ある実施形態では、抗体は軽鎖を含む。ある実施形態では、軽鎖はκ軽鎖である。ある実施形態では、軽鎖はλ軽鎖である。
ある実施形態では、抗体は重鎖を含む。いくつかの態様では、重鎖はIgAである。いくつかの態様では、重鎖はIgDである。いくつかの態様では、重鎖はIgEである。いくつかの態様では、重鎖はIgGである。いくつかの態様では、重鎖はIgMである。いくつかの態様では、重鎖はIgG1である。いくつかの態様では、重鎖はIgG2である。いくつかの態様では、重鎖はIgG3である。いくつかの態様では、重鎖はIgG4である。いくつかの態様では、重鎖はIgA1である。いくつかの態様では、重鎖はIgA2である。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体フラグメントである。いくつかの態様では、抗体フラグメントは、Fvフラグメントである。いくつかの態様では、抗体フラグメントは、Fabフラグメントである。いくつかの態様では、抗体フラグメントは、F(ab’)2フラグメントである。いくつかの態様では、抗体フラグメントは、Fab’フラグメントである。いくつかの態様では、抗体フラグメントは、scFv(sFv)フラグメントである。いくつかの態様では、抗体フラグメントは、scFv-Fcフラグメントである。
いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。
抗体は、当業者に適していると見なされるいずれかの抗原に対し結合特異性を有することができる。ある実施形態では、抗原は、膜貫通分子(例えば、受容体)または成長因子である。例示的な抗原として、レニンなどの分子、ヒト成長ホルモンやウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質;α1-抗トリプシン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、プロインスリン、濾胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、vmc因子、IX因子、組織因子(TF)、およびヴォン・ヴィレブランド因子などの凝固因子、プロテインCなどの抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、ウロキナーゼ、ヒト尿、またはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)などのプラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子-αおよび-β、エンケファリナーゼ、RANTES(正常に発現および分泌されるT細胞の活性化に際し調節)、ヒトマクロファージ炎症タンパク質(MlP-I-α)、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン;Muellerian阻害物質、レラキシンA鎖、レラキシンB鎖、プロレラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、β-ラクタマーゼなどの微生物タンパク質、DNase、19E、CTLA-4などの細胞毒性Tリンパ球関連抗原(CTLA)、インヒビン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、ホルモンまたは成長因子の受容体、プロテインAまたはD、リウマチ因子、骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、-4、-5、もしくは-6(NT-3、NT4、NT-5、もしくはNT-6)、またはNGF-βなどの神経成長因子といった神経栄養因子、血小板由来成長因子(PDGF)、aFGFやbFGFなどの線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子受容体2(FGFR2)、上皮成長因子(EGF)、TGF-αや、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、もしくはTGF-β5を含むTGB-βなどの形質転換増殖因子(TGF)、インスリン様成長因子-1および-2(IGF-1およびIGF-2)、des(I-3)-IGF-l(脳IGF-l)、インスリン様成長因子結合タンパク質、EpCAM、gD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、STEAP2、CEA、TENB2、EphA受容体、EphB受容体、葉酸受容体、FOLRI、メソテリン、cripto、alphavbeta6、インテグリン、VEGF、VEGFR、EGFR、トランスフェリン受容体、lRTAI、lRTA2、lRTA3、lRTA4、lRTA5、CDタンパク質、例えばCD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CDII、CDI4、CDI9、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CDI52、またはは米国特許出願公開第2008/0171040号もしくは第2008/0305044号に開示されるとともに参照により全体が援用される、1つもしくは複数の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する抗体、エリスロポイエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質(BMP)、インターフェロン-α、-β、-γなどのインターフェロン、コロニー刺激因子(CSF)、例えば、M-CSF、gM-CSF、g-CSF、インターロイキン(IL)、例えばIL-1~IL-10、スーパーオキシドジスムターゼ、T細胞受容体、表面膜タンパク質、解離促進因子、例えばHIVエンベロープの一部などのウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、CDlla、CDllb、CDllc、CDI8、ICAM、VLA-4、VCAMなどのインテグリン、腫瘍関連抗原、例えばAFP、ALK、B7H4、BAGEタンパク質、β-カテニン、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9(炭酸脱水酵素IX)、カスパーゼ-8、CD20、CD40、CD123、CDK4、CEA、CLEC12A、c-キット、cMET、CTLA4、サイクリン-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRVIII、エンドグリン、Epcam、EphA2、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER4、ETV6-AML、Fra-1、FOLR1、gAGEタンパク質(例えば、gAGE-1、-2)、gD2、gD3、globoH、グリプカン-3、gM3、gp100、HER2、HLA/B-raf、HLA/EBNA1、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IGF1R、LGR5、LMP2、MAGEタンパク質(例えば、MAGE-1、-2、-3、-4、-6、-12)、MART-1、メソテリン、mL-IAP、Muc1、Muc16(CA-125)、MET、MUM1、NA17、NGEP、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PDGFR-α、PDGFR-β、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、PLAC1、PRLR、PRAME、PSCA、PSGR、PSMA(FOLH1)、RAGEタンパク質、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、STn、サバイビン、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TNFRSF17、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ、およびウロプラキン-3、ならびに本明細書に列記されるポリペプチドのうちいずれかのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な抗原として、BCMA、SLAMF7、B7H4、gPNMB、UPK3A、LGR5も挙げられるが、これらに限定されない。例示的な抗原として、MUC16、PSMA、STEAP2、HER2も挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗原として、血液標的、例えばCD22、CD30、CD33、CD79a、CD79bも挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療用途または診断用途に特異的な標的である。一実施形態では、結合剤は、腫瘍抗原として定められる抗原と相互作用し、それに結合するように調製され、この抗原として、1種の抗原に特異的な抗原や、特定の種類の腫瘍上で共有されるか、過剰発現されるか、または修飾される抗原が挙げられる。例として、肺癌を有するα-アクチニン-4、黒色腫を有するARTC1、慢性骨髄性白血病を有するBCR-ABL融合タンパク質、黒色腫を有するB-RAF、CLPP、もしくはCdc27、扁平上皮癌を有するCASP-8、および腎細胞癌を有するhsp70-2に加え、以下の共有される腫瘍特異的抗原、例えばBAGE-1、gAGE、gnTV、KK-LC-1、MAGE-A2、NA88-A、TRP2-INT2が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原は、PRLRまたはHER2である。いくつかの実施形態では、抗体は、STEAP2、MUC16、EGFR、EGFRVIII、FGR2、またはPRLRを結合する。
いくつかの実施形態では、抗原はHER2を含む。いくつかの実施形態では、抗原はSTEAP2を含む。いくつかの実施形態では、抗原はMETを含む。いくつかの実施形態では、抗原はEGFRVIIIを含む。いくつかの実施形態では、抗原はMUC16を含む。いくつかの実施形態では、抗原はPRLRを含む。いくつかの実施形態では、抗原はPSMAを含む。いくつかの実施形態では、抗原はFGFR2を含む。
いくつかの実施形態では、BAは、抗HER2抗体、抗STEAP2抗体、抗MET抗体、抗EGFRVIII抗体、抗MUC16抗体、抗PRLR抗体、抗PSMA抗体、もしくは抗FGFR2抗体、抗HER2/HER2二重特異性抗体、抗MET/MET二重特異性抗体、もしくは抗FOLR1抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントである。
いくつかの実施形態では、BAは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、または脳癌からなる群から選択される癌を標的とする。
タンパク薬物コンジュゲートに適した抗HER2抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、抗HER2抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ(2C4)、またはマルゲツキシマブ(MGAH22)である。いくつかの実施形態では、抗体はトラスツズマブである。ある実施形態によれば、本開示によるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、抗HER2抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗HER2抗体は、国際公開第WO2019/212965A1号に記載されるものを含む場合がある。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗HER2抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ(2C4)、またはマルゲツキシマブ(MGAH22)である。いくつかの実施形態では、抗体はトラスツズマブである。ある実施形態によれば、本開示によるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、抗HER2抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗HER2抗体は、国際公開第WO2019/212965A1号に記載されるものを含む場合がある。
いくつかの実施形態では、抗体は抗HER2/HER2二重特異性抗体であり、これは、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合する第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する第2の抗原結合性ドメイン(D2)とを含む。
ある実施形態では、抗HER2/HER2二重特異性抗体のD1ドメインとD2ドメインは、互いに競合しない。HER2への結合においてD1とD2とに競合がないということは、D1とD2が得られるそれぞれの単特異的抗原結合性タンパク質が、ヒトHER2への結合において互いに競合しないことを意味する。例示的な抗原結合性タンパク質競合アッセイが、当該技術分野で知られている。
ある実施形態では、D1とD2は、HER2上で様々な(例えば、重複しないか、部分的に重複する)エピトープに結合する。
非限定的な一実施形態では、本開示は、
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含む二重得意性抗原結合性分子を含んでなるタンパク薬物コンジュゲートを提供し、
D1は、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する。
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含む二重得意性抗原結合性分子を含んでなるタンパク薬物コンジュゲートを提供し、
D1は、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する。
抗HER2/HER2二重特異性抗体は、2つの別個の単特異的抗HER2抗体の抗原結合性ドメインを用いて構築される場合がある。例えば、モノクローナル性単特異的抗HER2抗体の集団は、当該技術分野で公知の標準法を用いて産生される場合がある。こうして産生された個々の抗体は、HER2タンパク質との交差競合(cross-competition)において互いに対となって検査される場合がある。2つの異なる抗HER2抗体が同時にHER2に結合可能である(すなわち、互いに競合しない)場合、第1の抗HER2抗体の抗原結合性ドメインと、第2の非競合的な抗HER2抗体の抗原結合性ドメインは、本開示に従い単一の抗HER2/HER2二重特異性抗体へと操作することができる。
本開示によれば、二重特異性抗原結合性分子は、単一の多機能性ポリペプチドとするか、または、互いに共有結合的もしくは非共有結合的に関連する2つ以上のポリペプチドの多量体とすることができる。本開示により明白となるように、HER2分子における同一でない2つの別個のエピトープを同時に結合する能力を有する抗原結合性構築物は、二重特異性抗原結合性分子と見なされる。本明細書に記載の抗原結合性分子のいずれか、またはその変異体は、当業者に知られるような標準の分子生体技法(例えば、組換えDNAおよびタンパク質発現技法)を用いて構築される場合がある。
別の態様では、本開示は、HER2と薬学的に許容可能な担体を特異的に結合する組換え体ヒト抗体またはそのフラグメントを含んでなる医薬組成物を提供する。非限定的な一実施形態では、抗体は、HER2タンパク質上の2つの別個のエピトープを結合する場合があり、すなわち、抗体はHER2/HER2二重特異性抗体である。関連する態様では、本開示は、抗HER2/HER2抗体と第2の治療剤との組合せである組成物を特徴とする。一実施形態では、第2の治療剤は、抗HER2/HER2抗体と都合よく組み合わされるいずれかの薬剤である。本開示の抗HER2/HER2の二重特異性抗体に関与する、さらなる併用療法薬と共製剤(co-formulations)は、本明細書中の別の場所に開示される。
別の態様では、本開示は、本開示の抗HER2/HER2二重特異性抗体を用いてHER2を発現する腫瘍細胞を標的とする/死滅させる治療方法であって、本開示の抗HER2/HER2抗体を含む医薬組成物を治療有効量で、投与を必要とする対象に投与する工程を含む治療方法を提供する。場合により、抗HER2/HER2抗体(またはその抗原結合性フラグメント)は、乳癌の処置に使用することができるか、または、ADCCを増加させる修飾Fcドメイン(例えば、Shieldらによる(2002)JBC 277:26733を参照)、放射免疫療法、抗体薬物コンジュゲート、もしくは腫瘍切除の効率を上げる他の方法を含むがこれらに限定されない方法により、細胞毒性を増すように修飾される場合がある。
本開示はまた、HER2を発現する細胞に関連するか、それにより生じる疾患または障害(例えば癌)の処置のための薬剤の製造における、本開示の抗HER2の抗体の使用も含む。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗HER2抗体もしくは抗原結合性フラグメント、またはHER2/HER2二重特異性抗体を含む、化合物に関する。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲート(ADC)を含む化合物に関する。
また別の態様では、本開示は、例えば撮像試薬など診断用途の二重特異性抗HER2/HER2抗体を提供する。
タンパク薬物コンジュゲートに適した抗STEAP2抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、前立腺の6-膜貫通上皮抗原2(anti-six-transmembrane epithelial antigen of prostate 2:STEAP2)、すなわち抗STEAP2抗体である。STEAP2は、ゴルジ複合体と細胞膜との間でシャトルとして働き、鉄と銅を還元してそれらの細胞への移入を促進するメタロレダクターゼである。STEAP2は、主に前立腺の上皮細胞に局在化される。STEAP2はまた、正常な心臓、脳、膵臓、卵巣、骨格筋、乳腺、睾丸、子宮、腎臓、肺、気管、結腸、および肝臓にも発現される。STEAP2は、前立腺、膀胱、頚部、肺、結腸、腎臓、乳房、膵臓、胃、子宮、および卵巣腫瘍を含む癌性腫瘍に過剰発現される(Gomes,I.M.らによる2012,Mol.Cancer Res.10:573-587、Challita-Eid-P.M.らによる2003年の国際公開第WO03/087306号、Emtage,P.C.R.による2005年の国際公開第WO2005/079490号)。
いくつかの実施形態では、抗体は、前立腺の6-膜貫通上皮抗原2(anti-six-transmembrane epithelial antigen of prostate 2:STEAP2)、すなわち抗STEAP2抗体である。STEAP2は、ゴルジ複合体と細胞膜との間でシャトルとして働き、鉄と銅を還元してそれらの細胞への移入を促進するメタロレダクターゼである。STEAP2は、主に前立腺の上皮細胞に局在化される。STEAP2はまた、正常な心臓、脳、膵臓、卵巣、骨格筋、乳腺、睾丸、子宮、腎臓、肺、気管、結腸、および肝臓にも発現される。STEAP2は、前立腺、膀胱、頚部、肺、結腸、腎臓、乳房、膵臓、胃、子宮、および卵巣腫瘍を含む癌性腫瘍に過剰発現される(Gomes,I.M.らによる2012,Mol.Cancer Res.10:573-587、Challita-Eid-P.M.らによる2003年の国際公開第WO03/087306号、Emtage,P.C.R.による2005年の国際公開第WO2005/079490号)。
一態様では、好適な抗STEAP抗体は、米国特許出願第2018/0104357号に開示されたものである。本開示による例示的な抗STEAP2抗体は、本明細書中の表1と表2に列記される。表1は、例示的な抗STEAP2抗体の重鎖可変領域(HCVR)と軽鎖可変領域(LCVR)のアミノ酸配列識別子に加え、重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2、HCDR3)と軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2、LCDR3)を明記する。表2は、例示的な抗STEAP2抗体のHCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2 HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3をコードする核酸分子の配列識別子を明記する。
本開示は、表1に列記されるHCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むHCVRを含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
本開示はまた、表1に列記されるLCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むLCVRを含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
本開示はまた、表1に列記されるHCVRアミノ酸配列のうちいずれかが、表1に列記されるLCVRアミノ酸配列のうちいずれかと対になったものを含むHCVRとLCVRアミノ酸配列の対(HCVR/LCVR)を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供する。ある実施形態によれば、本開示は、表1に列記される例示的な抗STEAP2抗体のうちいずれかに含まれるHCVR/LCVRアミノ酸配列を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ある実施形態では、HCVR/LCVRアミノ酸配列の対は、配列番号250/258(例えば、H2M11162N)からなる群から選択される。
本開示はまた、表1に列記される重鎖CDR1(HCDR1)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むHCDR1を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供する。
本開示はまた、表1に列記される重鎖CDR2(HCDR2)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むHCDR2を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供する。
本開示はまた、表1に列記される重鎖CDR3(HCDR3)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むHCDR3を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供する。
本開示はまた、表1に列記される軽鎖CDR1(LCDR1)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むLCDR1を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供する。
本開示はまた、表1に列記される軽鎖CDR2(LCDR2)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むLCDR2を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供する。
本開示はまた、表1に列記される軽鎖CDR3(LCDR3)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むLCDR3を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供する。
本開示はまた、表1に列記されるHCDR3アミノ酸配列のうちいずれかが、表1に列記されるLCDR3アミノ酸配列のうちいずれかと対になったものを含むHCDR3とLCDR3アミノ酸配列の対(HCDR3/LCDR3)を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントも提供する。ある実施形態によれば、本開示は、表1に列記される例示的な抗STEAP2抗体のうちいずれかに含まれるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ある実施形態では、HCDR3/LCDR3アミノ酸配列の対は、配列番号256/264(例えば、H2M11162N)からなる群から選択される。
本開示はまた、表1に列記される例示的な抗STEAP2抗体のうちいずれかに含まれる6つ一組のCDR(すなわち、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ある実施形態では、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3アミノ酸配列のセットは、配列番号252-254-256-260-262-264(例えば、H2M11162N)からなる群から選択される。
関連する実施形態では、本開示は、表1に列記される例示的な抗STEAP2抗体のうちいずれかにより定められるHCVR/LCVRアミノ酸配列に含まれる6つ一組のCDR(すなわち、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。例えば、本開示は、配列番号250/258(例えば、H2M11162N)からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対に含まれるHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3アミノ酸配列を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。HCVRおよびLCVRのアミノ酸配列内のCDRを特定する方法と技法は当該技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定のHCVRおよび/またはLCVRアミノ酸配列内のCDRを特定するために使用できる。CDRの境界を特定するために使用できる例示的な慣例法として、例えばKabat定義、Chothia定義、およびAbM定義が挙げられる。一般論として、Kabat定義は配列の変異性に基づき、Chothia定義は構造的なループ領域の位置に基づき、AbM定義はKabat手法とChothia手法との間での妥協案である。例えば、Kabatの「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991);Al-LazikaniらによるJ.Mol.Biol.273:927-948(1997);およびMartinらによるProc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)を参照されたい。抗体内のCDR配列を特定するために公的データベースも利用可能である。
本開示はまた、抗STEAP2抗体またはその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、表1に列記されるHCVRアミノ酸配列のうちいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるHCVR核酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含む。
本開示はまた、表1に列記されるLCVRアミノ酸配列のうちいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるLCVR核酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含む。
本開示はまた、表1に列記されるHCDR1アミノ酸配列のうちいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるHCDR1核酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含む。
本開示はまた、表1に列記されるHCDR2アミノ酸配列のうちいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるHCDR2核酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含む。
本開示はまた、表1に列記されるHCDR3アミノ酸配列のうちいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるHCDR3核酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含む。
本開示はまた、表1に列記されるLCDR1アミノ酸配列のうちいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるLCDR1核酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含む。
本開示はまた、表1に列記されるLCDR2アミノ酸配列のうちいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるLCDR2核酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含む。
本開示はまた、表1に列記されるLCDR3アミノ酸配列のうちいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるLCDR3核酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含む。
本開示はまた、HCVRをコードする核酸分子を提供し、HCVRは3つ一組のCDR(すなわち、HCDR1-HCDR2-HCDR3)を含み、HCDR1-HCDR2-HCDR3アミノ酸配列のセットは、表1に列記される例示的な抗STEAP2抗体のうちいずれかにより定められるものである。
本開示はまた、LCVRをコードする核酸分子を提供し、LCVRは3つ一組のCDR(すなわち、LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含み、LCDR1-LCDR2-LCDR3アミノ酸配列のセットは、表1に列記される例示的な抗STEAP2抗体のうちいずれかにより定められるものである。
本開示はまた、HCVRとLCVRの両方をコードする核酸分子を提供し、HCVRは、表1に列記されるHCVRアミノ酸配列のうちいずれかのアミノ酸配列を含み、LCVRは、表1に列記されるLCVRアミノ酸配列のうちいずれかのアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、核酸分子は、表2に列記されるHCVRアミノ酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、それに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列と、表2に列記されるLCVRアミノ酸配列のうちいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、または、それに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列とを含む。本開示のこの態様によるある実施形態では、核酸分子はHCVRとLCVRをコードし、HCVRとLCVRは、ともに表1に列記される同じ抗STEAP2抗体から得られる。
本開示はまた、抗STEAP2の抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現可能な組換え発現ベクターを提供する。例えば、本開示は、上述の核酸分子、すなわち、表1に列記されるHCVR、LCVR、および/またはCDR配列のうちいずれかをコードする核酸分子のうちいずれかを含んでなる、組換え発現ベクターを含む。本開示の範囲内にはさらに、このようなベクターが導入された宿主細胞のほか、この宿主細胞を抗体または抗体フラグメントの産生を許容する条件下で培養することで抗体またはその部分を産生し、そうして産生された抗体および抗体フラグメントを回収する方法も、含まれる。
本開示は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗STEAP2抗体を含む。いくつかの実施形態では、例えば、依存性細胞の細胞毒性(ADCC)機能を増加させるために、不要なグリコシル化部位を除去する修飾、またはオリゴサッカライド鎖に存在するフコース部分を欠く抗体が有用な場合がある(Shieldらによる(2002)JBC 277:26733を参照)。他の出願では、ガラクトシル化の修飾は、補体依存細胞毒性(CDC)を修飾するために行うことができる。
別の態様では、本開示は、STEAP2と薬学的に許容可能な担体を特異的に結合する組換え体ヒト抗体またはそのフラグメントを含んでなる医薬組成物を提供する。関連する態様では、本開示は、抗STEAP2抗体と第2の治療剤との組合せである組成物を特徴とする。一実施形態では、第2の治療剤は、抗STEAP2抗体と都合よく組み合わされるいずれかの薬剤である。本開示の抗STEAP2を含む、さらなる併用療法薬と共製剤は、本明細書中の別の場所に開示される。
別の態様では、本開示は、本開示の抗STEAP2を用いてSTEAP2を発現する腫瘍細胞を標的とする/死滅させる治療方法であって、本開示の抗STEAP2抗体を含む医薬組成物を治療有効量で、投与を必要とする対象に投与する工程を含む治療方法を提供する。場合により、抗STEAP2抗体(またはその抗原結合性フラグメント)は、前立腺癌の処置に使用することができるか、または、ADCCを増加させる修飾Fcドメイン(例えば、Shieldらによる(2002)JBC 277:26733を参照)、放射免疫療法、抗体薬物コンジュゲート、もしくは腫瘍切除の効率を上げる他の方法を含むがこれらに限定されない方法により、細胞毒性を増すように修飾される場合がある。
本開示はまた、STEAP2を発現する細胞に関連するか、それにより生じる疾患または障害(例えば癌)の処置のための薬剤の製造における、本開示の抗STEAP2の抗体の使用も含む。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗STEAP2抗体もしくは抗原結合性フラグメント、またはSTEAP2xCD3二重特異性抗体を含む、化合物に関する。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲート(ADC)を含む化合物に関する。
また別の態様では、本開示は、例えば撮像試薬など診断用途の二重特異性抗STEAP2抗体を提供する。
また別の態様では、本開示は、本開示の抗体の抗CD3抗体または抗原結合性部分を使用してT細胞活性化を刺激するための治療方法であって、抗体を含む医薬組成物を治療有効量で投与する工程を含む治療方法を提供する。
別の態様では、本開示は、FACS解析により測定したときに50nM未満のEC50をもって、STEAP2を発現するC4-2細胞を結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。別の態様では、本開示は、STEAP2を発現するC4-2細胞を結合し、当該細胞により内在化される、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
本開示は、ヒトSTEAP2への結合において、表1に明記されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む参照抗体と競合する、抗体または抗原結合性フラグメントをさらに提供する。別の態様では、本開示は、ヒトSTEAP2への結合において、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/58、74/58、82/58、90/58、98/58、106/114、122/130、138/146、154/162、170/178、186/194、202/210、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、および378/386からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む参照抗体と競合する、抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
本開示は、ヒトSTEAP2上で、表1に明記されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む参照抗体と同じエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。別の態様では、抗体または抗原結合性フラグメントは、ヒトSTEAP2上で、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/58、74/58、82/58、90/58、98/58、106/114、122/130、138/146、154/162、170/178、186/194、202/210、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、および378/386からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む参照抗体と同じエピトープに結合する。
本開示は、ヒトSTEAP2を結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントをさらに提供し、抗体または抗原結合性フラグメントは、表1に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)の相補性決定領域(CDR)と、表1に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)のCDRとを含む。別の態様では、単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/58、74/58、82/58、90/58、98/58、106/114、122/130、138/146、154/162、170/178、186/194、202/210、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、および378/386からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対の重鎖CDRと軽鎖CDRを含む。また別の態様では、単離された抗体または抗原結合性フラグメントは、それぞれ配列番号4-6-8-12-14-16、20-22-24-28-30-32、36-38-40-44-46-48、52-54-56-60-62-64、68-70-72-60-62-64、76-78-80-60-62-64、84-86-88-60-62-64、92-94-96-60-62-64、100-102-104-60-62-64、108-110-112-116-118-120、124-126-128-132-134-136、140-142-144-148-150-152、156-158-160-164-166-168、172-174-176-180-182-184、188-190-192-196-198-200、204-206-208-212-214-216、220-222-224-228-230-232、236-238-240-244-246-248、252-254-256-260-262-264、268-270-272-276-278-280、284-286-288-292-294-296、300-302-304-308-310-312、316-318-320-324-326-328、332-334-336-340-342-344、348-350-352-356-358-360、364-366-368-372-374-376、および380-382-384-388-390-392からなる群から選択される、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3ドメインを含む。
別の態様では、本開示は、ヒトSTEAP2を結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、抗体または抗原結合性フラグメントは、(a)配列番号2、18、34、50、66、74、82、90、98、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、および378からなる群から選択されるアミノ酸配列を選択する重鎖可変領域(HCVR)と、(b)配列番号10、26、42、58、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、および386からなる群から選択されるアミノ酸配列を選択する軽鎖可変領域(LCVR)とを含む。さらなる態様では、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/58、74/58、82/58、90/58、98/58、106/114、122/130、138/146、154/162、170/178、186/194、202/210、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、および378/386からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含む、請求項10に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
別の態様によれば、本開示は、上述される抗STEAP2抗体またはその抗原結合性フラグメントと、治療剤(例えば抗腫瘍剤、例えばカンプトテシンアナログ、例えばDxd)とを含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合性フラグメント、および抗腫瘍剤は、上記で論じられるようにリンカーを介して共有結合される。様々な実施形態では、抗STEAP2抗体または抗原結合性フラグメントは、本明細書に記載の抗STEAP2抗体またはフラグメントのうちいずれかとすることができる。
重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸、および抗STEAP2抗体の核酸配列
表1は、重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列識別子、および本開示による選択された抗STEAP2抗体のCDRを記載する。対応する核酸配列識別子は、表2に記載する。
タンパク薬物コンジュゲートに適した抗MET抗体
いくつかの実施形態では、抗体は抗MET抗体である。ある実施形態によれば、本開示によるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、抗MET抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗MET抗体は、米国特許出願第2018/0134794号に記載のものを含む場合がある。
いくつかの実施形態では、抗体は抗MET/MET二重特異性抗体であり、これは、ヒトMETの第1のエピトープを特異的に結合する第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、ヒトMETの第2のエピトープを特異的に結合する第2の抗原結合性ドメイン(D2)とを含む。いくつかの実施形態では、抗MET/MET二重特異性抗体は、米国特許出願第2018/0134794号に記載のものを含む場合がある。
ある実施形態では、抗MET/MET二重特異性抗体のD1ドメインとD2ドメインは、互いに競合しない。METへの結合においてD1とD2とに競合がないということは、D1とD2が得られるそれぞれの単特異的抗原結合性タンパク質が、ヒトMETへの結合において互いに競合しないことを意味する。例示的な抗原結合性タンパク質競合アッセイが、当該技術分野で知られている。
ある実施形態では、D1とD2は、MET上で様々な(例えば、重複しないか、部分的に重複する)エピトープに結合する。
非限定的な一実施形態では、本開示は、
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含む二重得意性抗原結合性分子を含んでなるタンパク薬物コンジュゲートを提供し、
D1は、ヒトMETの第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトMETの第2のエピトープを特異的に結合する。
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含む二重得意性抗原結合性分子を含んでなるタンパク薬物コンジュゲートを提供し、
D1は、ヒトMETの第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトMETの第2のエピトープを特異的に結合する。
抗MET/MET二重特異性抗体は、2つの別個の単特異的抗MET抗体の抗原結合性ドメインを用いて構築される場合がある。例えば、モノクローナル性単特異的抗MET抗体の集団は、当該技術分野で公知の標準法を用いて産生される場合がある。こうして産生された個々の抗体は、METタンパク質との交差競合において互いに対となって検査される場合がある。2つの異なる抗MET抗体が同時にMETに結合可能である(すなわち、互いに競合しない)場合、第1の抗MET抗体の抗原結合性ドメインと、第2の非競合的な抗MET抗体の抗原結合性ドメインは、本開示に従い単一の抗MET/MET二重特異性抗体へと操作することができる。
本開示によれば、二重特異性抗原結合性分子は、単一の多機能性ポリペプチドとするか、または、互いに共有結合的もしくは非共有結合的に関連する2つ以上のポリペプチドの多量体とすることができる。本開示により明白となるように、MET分子における同一でない2つの別個のエピトープを同時に結合する能力を有する抗原結合性構築物は、二重特異性抗原結合性分子と見なされる。本明細書に記載の抗原結合性分子のいずれか、またはその変異体は、当業者に知られるような標準の分子生体技法(例えば、組換えDNAおよびタンパク質発現技法)を用いて構築される場合がある。
二重特異性抗原結合性分子は、ヒトMETの第1のエピトープを特異的に結合する第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、ヒトMETの第2のエピトープを特異的に結合する第2の抗原結合性ドメイン(D2)を含んでおり、本明細書では「MET/MET二重特異性抗体」、「MET×MET二重特異性抗体」、「MET/MET」、「MET×MET」、または他の関連する専門用語と称される場合がある。いくつかの実施形態では、ヒトMETの第1のエピトープは、配列番号2109のアミノ酸192~204を含む。いくつかの実施形態では、ヒトMETの第2のエピトープは、配列番号2109のアミノ酸305~315および421~455を含む。いくつかの実施形態では、ヒトMETの第1のエピトープは、配列番号2109のアミノ酸192~204を含み、ヒトMETの第2のエピトープは、配列番号2109のアミノ酸305~315および421~455を含む。
本明細書で提供されるMET×MET二重特異性抗原結合性分子に含めることのできる例示的な抗原結合性ドメイン(D1とD2)は、本明細書に開示される抗MET抗体のうちいずれかに由来する抗原結合性ドメインを含む。例えば、本開示は、表3に列記されるHCVRアミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むHCVRを含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子を含む。
本明細書にはまた、表3に列記されるLCVRアミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むLCVRを含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子も提供される。
本明細書には、表3に列記されるHCVRアミノ酸配列のうちいずれかが表3に列記されるLCVRアミノ酸配列のうちいずれかと対をなすものを含むHCVRおよびLCVRアミノ酸配列の対(HCVR/LCVR)を含むD1またはD2二重特異性抗原結合性分子を含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子が提供される。ある実施形態によれば、本発明は、表3に列記される例示的な抗MET抗体のうちいずれかに含まれるHCVR/LCVRアミノ酸配列の対を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子を提供する。
本明細書にはまた、表3に列記される重鎖CDR1(HCDR1)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むHCDR1を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子も提供される。
さらに、表3に列記される重鎖CDR2(HCDR2)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むHCDR2を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子も提供される。
さらに、表3に列記される重鎖CDR3(HCDR3)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むHCDR3を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子も提供される。
さらに、表3に列記される軽鎖CDR1(LCDR1)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むLCDR1を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子も提供される。
さらに、表3に列記される軽鎖CDR2(LCDR2)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むLCDR2を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子も提供される。
さらに、表3に列記される軽鎖CDR3(LCDR3)アミノ酸配列のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれに対し少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に同様の配列を含むLCDR3を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子も提供される。
本明細書には、表3に列記されるHCDR3アミノ酸配列のうちいずれかが表3に列記されるLCDR3アミノ酸配列のうちいずれかと対をなすものを含むHCDR3およびLCDR3アミノ酸配列の対(HCDR3/LCDR3)を含むD1またはD2二重特異性抗原結合性分子を含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子が提供される。
ある実施形態によれば、本開示は、表3に列記される例示的な抗MET抗体のうちいずれかに含まれるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
ある実施形態によれば、本開示は、表3に列記される例示的な抗MET抗体のうちいずれかに含まれるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列を含んでなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
さらに、表3に列記される例示的な抗MET抗体のうちいずれかに含まれる6つ一組のCDR(すなわち、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子も提供される。
関連する実施形態では、本開示は、表3に列記される例示的な抗MET抗体のうちいずれかにより定められるHCVR/LCVRアミノ酸配列に含まれる6つ一組のCDR(すなわち、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含むD1またはD2抗原結合性ドメインを含んでなる、MET×MET二重特異性抗原結合性分子を提供する。
本明細書で提供されるMET×MET二重特異性抗原結合性分子は、表3の抗MET抗体のうちいずれかから得られるD1抗原結合性ドメインと、表3の他の抗MET抗体のいずれかから得られるD2抗原結合性ドメインとを含む場合がある。本開示のMET×MET二重特異性抗体の非限定的な例は、図10に描く。図10は、272の例示的なMET×MET二重特異性抗体の成分を例示するマトリックスの図である。マトリックスにおける番号付きの細胞(番号1~272)は、それぞれ「D1」抗原結合性ドメインを含む固有の二重特異性抗体、および「D2」抗原結合性ドメインを含む固有の二重特異性抗体を特定しており、D1抗原結合性ドメインは、Y軸に沿って列記される対応する抗MET抗体からの免疫グロブリン可変ドメイン(HCVR/LCVRアミノ酸配列対)またはCDRを含み、D2抗原結合性ドメインは、X軸に沿ってされる対応する抗MET抗体からの免疫グロブリン可変ドメイン(HCVR/LCVRアミノ酸配列対)またはCDRを含む。このため、例えばマトリックスに示されるMET×MET二重特異性抗原結合性分子「番号10」は、例示的な抗MET抗体H4H13290P2のHCVR/LCVR対または6-CDRセットを含むD1抗原結合性のドメインと、例示的な抗MET抗体H4H13321P2のHCVR/LCVR対または6-CDRセットを含むD2抗原結合性ドメインとを含む。
非限定的で例示的な例として、本開示は、D1抗原結合性ドメインとD2抗原結合性ドメインとを含むMET×MET二重特異性抗原結合性分子を含み、D1抗原結合性ドメインは、配列番号2012/2092のHCVR/LCVRアミノ酸配列の対、または配列番号2014-2016-2018-2094-2096-2098を含む一組の重鎖および軽鎖CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含み、D2抗原結合性ドメインは、配列番号2036/2092のHCVR/LCVRアミノ酸配列の対、または配列番号2038-2040-2042-2094-2096-2098を含む一組の重鎖および軽鎖CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含む。これらの配列特徴を有する例示的なMET×MET二重特異性抗体は、H4H14639Dとして設計され、二重特異性抗体番号2076とも称される二重特異性抗体であり、H4H13306P2由来のD1とH4H13312P2由来のD2とを含む。
抗METおよびMET/MET抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列と核酸配列
表3は、重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列識別子、および本明細書に開示される選択された抗MET抗体のCDRを記載する(上述のように、本開示の抗MET抗体はすべて同じ軽鎖可変領域を有し、そのため同じ軽鎖CDR配列も有する)。対応する核酸配列識別子は、表4に記載する。
抗体は、典型的に、表3と表4に示すように、Fc接頭辞(例えば「H4H」)、続いて数値識別子(例えば、「13290」、「13291」、「13295」など)、最後に「P2」接尾辞という命名法により本明細書で言及される。このため、本命名法により、抗体は本明細書中で、例えば「H4H13290P2」、「H4H13291P2」、「H4H13295P2」などと称される場合がある。本明細書中で使用される抗体名称中の接頭辞は、抗体の特定のFc領域アイソタイプを示す。具体的に、「H4H」抗体は、ヒトIgG4 Fc(抗体名称において最初に「H」が示すように、可変領域はすべて完全にヒトである)を有する。当業者が認識するように、特定のFcアイソタイプを有する抗体は、異なるFcアイソタイプを有する抗体へと変換できるが(例えば、マウスIgG4 Fcを有する抗体は、ヒトIgG1などを有する抗体に変換できる)、いずれの場合も、表3と表4に示す数値識別子により示される可変ドメイン(CDRを含む)は同じままとなり、結合特性はFcドメインの性質に関係なく同一または実質的に類似であると予測される。
抗体コンジュゲーション
抗体または抗原結合性フラグメントの残基にコンジュゲートするための技法とリンカーは、当該技術分野で公知である。本態様の観点で使用可能である例示的なアミノ酸結合、例えば、リシン(例えば、米国特許第5,208,020号明細書、米国特許出願第2010/0129314号明細書、HollanderらによるBioconjugate Chem.,2008,19:358-361、国際公開第WO2005/089808号、米国特許第5,714,586号明細書、米国特許出願第2013/0101546号明細書、および米国特許出願第2012/0585592号明細書を参照)、システイン(例えば、米国特許出願第2007/0258987号明細書、国際公開第WO2013/055993号、国際公開第WO2013/055990号、国際公開第WO2013/053873号、国際公開第WO2013/053872号、国際公開第WO2011/130598号、米国特許出願第2013/0101546号明細書、および米国特許第7,750,116号明細書を参照)、セレノシステイン(selenoysteine)(例えば、国際公開第2008/122039号、およびHoferらによるProc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456を参照)、ホルミルグリシン(例えば、CarricoらによるNat.Chem.Biol.,2007,3:321-322、AgarwalらによるProc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51、およびRabukaらによるNat.Protocols,2012,10:1052-1067)、非天然アミノ酸(例えば、国際公開第WO2013/068874号、および国際公開第WO2012/166559号を参照)、ならびに酸性アミノ酸(例えば、国際公開第WO2012/05982号を参照)。リシンのコンジュゲーションはさらに、NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)を介して進めることができる。リンカーはさらに、チオール間に炭素架橋を形成することにより、切断された鎖間ジスルフィド結合のシステイン残基を含むシステイン残基へとコンジュゲートすることができる(例えば、米国特許第9,951,141号明細書、および米国特許第9,950,076号明細書を参照)。リンカーはさらに、炭水化物(例えば、米国特許第2008/0305497号明細書、国際公開第WO2014/065661号、およびRyanらによるFood & Agriculture Immunol.,2001,13:127-130を参照)とジスルフィドリンカー(例えば、国際公開第WO2013/085925号、国際公開第WO2010/010324号、国際公開第WO2011/018611号、およびShaunakらによるNat.Chem.Biol.,2006,2:312-313を参照)への結合を介して抗原結合性タンパク質へとコンジュゲートすることができる。部位特異的コンジュゲーション技法はさらに、抗体または抗原結合性のタンパク質の特定の残基へのコンジュゲーションを対象とすることにも利用できる(例えば、SchumacherらによるJ Clin Immunol(2016)36(Suppl 1):100を参照)。下記により詳細に論じられる特異的な実施形態では、部位特異的コンジュゲーション技法として、トランスグルタミナーゼを介したグルタミンコンジュゲーションが挙げられる(例えば、SchibliによるAngew Chemie Inter Ed.2010,49,9995を参照)。
抗体または抗原結合性フラグメントの残基にコンジュゲートするための技法とリンカーは、当該技術分野で公知である。本態様の観点で使用可能である例示的なアミノ酸結合、例えば、リシン(例えば、米国特許第5,208,020号明細書、米国特許出願第2010/0129314号明細書、HollanderらによるBioconjugate Chem.,2008,19:358-361、国際公開第WO2005/089808号、米国特許第5,714,586号明細書、米国特許出願第2013/0101546号明細書、および米国特許出願第2012/0585592号明細書を参照)、システイン(例えば、米国特許出願第2007/0258987号明細書、国際公開第WO2013/055993号、国際公開第WO2013/055990号、国際公開第WO2013/053873号、国際公開第WO2013/053872号、国際公開第WO2011/130598号、米国特許出願第2013/0101546号明細書、および米国特許第7,750,116号明細書を参照)、セレノシステイン(selenoysteine)(例えば、国際公開第2008/122039号、およびHoferらによるProc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456を参照)、ホルミルグリシン(例えば、CarricoらによるNat.Chem.Biol.,2007,3:321-322、AgarwalらによるProc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51、およびRabukaらによるNat.Protocols,2012,10:1052-1067)、非天然アミノ酸(例えば、国際公開第WO2013/068874号、および国際公開第WO2012/166559号を参照)、ならびに酸性アミノ酸(例えば、国際公開第WO2012/05982号を参照)。リシンのコンジュゲーションはさらに、NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)を介して進めることができる。リンカーはさらに、チオール間に炭素架橋を形成することにより、切断された鎖間ジスルフィド結合のシステイン残基を含むシステイン残基へとコンジュゲートすることができる(例えば、米国特許第9,951,141号明細書、および米国特許第9,950,076号明細書を参照)。リンカーはさらに、炭水化物(例えば、米国特許第2008/0305497号明細書、国際公開第WO2014/065661号、およびRyanらによるFood & Agriculture Immunol.,2001,13:127-130を参照)とジスルフィドリンカー(例えば、国際公開第WO2013/085925号、国際公開第WO2010/010324号、国際公開第WO2011/018611号、およびShaunakらによるNat.Chem.Biol.,2006,2:312-313を参照)への結合を介して抗原結合性タンパク質へとコンジュゲートすることができる。部位特異的コンジュゲーション技法はさらに、抗体または抗原結合性のタンパク質の特定の残基へのコンジュゲーションを対象とすることにも利用できる(例えば、SchumacherらによるJ Clin Immunol(2016)36(Suppl 1):100を参照)。下記により詳細に論じられる特異的な実施形態では、部位特異的コンジュゲーション技法として、トランスグルタミナーゼを介したグルタミンコンジュゲーションが挙げられる(例えば、SchibliによるAngew Chemie Inter Ed.2010,49,9995を参照)。
リシンおよび/またはシステインにより、例えば、マレイミドまたはアミドのコンジュゲーションを介して連結される本開示のペイロードは、本開示の範囲内に含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のタンパク薬物コンジュゲーションは、2工程のプロセスにより産生され、工程1は、リシン系リンカー、例えばNHS-エステルリンカーのコンジュゲーションであり、工程2は、ペイロードコンジュゲーション反応(例えば、1,3-付加環化反応)である。
いくつかの実施形態では、本開示のタンパク薬物コンジュゲーションは、2工程のプロセスにより産生され、工程1は、システイン系リンカー、例えばマレイミドリンカーのコンジュゲーションであり、工程2は、ペイロードコンジュゲーション反応(例えば、1,3-付加環化反応)である。
いくつかの実施形態では、本開示のタンパク薬物コンジュゲーションは、2工程のプロセスにより産生され、工程1は、トランスグルタミナーゼ媒介型の部位特異的コンジュゲーションであり、工程2は、ペイロードコンジュゲーション反応(例えば、1,3-付加環化反応)である。
工程1:トランスグルタミナーゼ媒介型の部位特異的コンジュゲーション
いくつかの実施形態では、タンパク質(例えば、抗体)は、グルタミニル修飾タンパク質を提供するために公知の方法に従い修飾される場合がある。抗体および第一級アミン化合物をコンジュゲートするための技法は、当該技術分野で公知である。部位特異的コンジュゲーション技法は、トランスグルタミナーゼを介したグルタミンコンジュゲーションを用いたグルタミンへのコンジュゲーションを対象とするために、本明細書で利用される(例えば、SchibliによるAngew Chemie Inter Ed.2010,49,9995を参照)。
いくつかの実施形態では、タンパク質(例えば、抗体)は、グルタミニル修飾タンパク質を提供するために公知の方法に従い修飾される場合がある。抗体および第一級アミン化合物をコンジュゲートするための技法は、当該技術分野で公知である。部位特異的コンジュゲーション技法は、トランスグルタミナーゼを介したグルタミンコンジュゲーションを用いたグルタミンへのコンジュゲーションを対象とするために、本明細書で利用される(例えば、SchibliによるAngew Chemie Inter Ed.2010,49,9995を参照)。
本開示の第一級アミンを含む化合物(例えば、リンカーL1)は、トランスグルタミナーゼを利用した化学酵素コンジュゲーションを介して結合剤(例えば、タンパク質、例えば抗体)の1つまたは複数のグルタミン残基へとコンジュゲートすることができる(例えば、DennlerらによるProtein Conjugate Chem.2014,25,569-578、および国際公開第WO2017/147542号を参照)。例えば、トランスグルタミナーゼの存在下で、抗体の1つまたは複数のグルタミン残基は、第一級アミンリンカー化合物に結合できる。簡潔に説明すると、いくつかの実施形態では、グルタミン残基(例えば、gln295、すなわちQ295残基)を有する結合剤は、酵素トランスグルタミナーゼの存在下で上述の第一級アミン含有リンカーL1で処理される。ある実施形態では、結合剤はグリコシル化されない(aglycosylated)。ある実施形態では、結合剤は脱グリコシル化される。
ある実施形態では、結合剤(例えば、タンパク質、例えば抗体)は、少なくとも1つのポリペプチド鎖配列に少なくとも1つのグルタミン残基を含む。ある実施形態では、結合剤は2つの重鎖ポリペプチドを含み、それぞれ1つのgln295残基を有する。さらなる実施形態では、結合剤は、重鎖295とは別の部位に1つまたは複数のグルタミン残基を含む。
いくつかの実施形態では、抗体などの結合剤は、抗体の機能または結合を損なうことなく1つの部位にグルタミン残基を挿入する部位特異的変異誘発により調製できる。例えば本明細書には、本明細書に記載されるAsn297Gln(N297Q)突然変異を有する抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、gln295残基および/またはN297Q突然変異を有する抗体は、自然に生じる追加の1つまたは複数のグルタミン残基をその可変領域に含有し、そこでは、トランスグルタミナーゼへのアクセスが可能となるため、リンカーまたはリンカーペイロードへのコンジュゲーションが可能になる。例示的な自然に生じるグルタミン残基は、例えば、軽鎖のQ55に見ることができる。このような場合、トランスグルタミナーゼを介してコンジュゲートされる結合剤、例えば抗体は、予想よりも高いLAR値(例えば、4を超えるLAR)を有する可能性がある。このような抗体はいずれも、天然ソースまたは人工ソースから単離できる。
本開示のある実施形態では、リンカーと抗体との比、すなわちLARは、抗体1つに対し1、2、3、4、5、6、7、または8つのリンカーL1分子である。いくつかの実施形態では、LARは1~8である。いくつかの実施形態では、LARは1~6である。ある実施形態では、LARは2~4である。場合により、LARは2~3である。ある場合では、LARは0.5~3.5である。いくつかの実施形態では、LARは、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、または約3.5である。いくつかの実施形態では、LARは2である。いくつかの実施形態では、LARは4である。
工程2:ペイロードコンジュゲーション反応
ある実施形態では、本開示のリンカーL1は、トランスグルタミン化後にさらなる反応を可能とする少なくとも1つの反応基B’を含む分枝ユニットBを含む。これらの実施形態では、グルタミニル修飾タンパク質(例えば、抗体)は、タンパク質ペイロードコンジュゲートを形成するために、反応性ペイロード化合物または反応性リンカーペイロード化合物(例えば、本明細書に開示されるL2-P)とのさらなる反応を可能とする。より具体的に、反応性リンカーペイロード化合物L2-Pは、リンカーL1の反応基B’と反応可能な反応基B’’を含む場合がある。ある実施形態では、本開示の反応基B’は、1,3-付加環化反応を受けることが可能な部分を含む。ある実施形態では、反応基B’はアジドである。ある実施形態では、反応基B’’は、アルキン(例えば、末端アルキン、または張り詰めた(strained alkyne)内部アルキン)を含む。本開示のある実施形態において、反応基B’は、結合剤とトランスグルタミン化反応条件に適合する。
ある実施形態では、本開示のリンカーL1は、トランスグルタミン化後にさらなる反応を可能とする少なくとも1つの反応基B’を含む分枝ユニットBを含む。これらの実施形態では、グルタミニル修飾タンパク質(例えば、抗体)は、タンパク質ペイロードコンジュゲートを形成するために、反応性ペイロード化合物または反応性リンカーペイロード化合物(例えば、本明細書に開示されるL2-P)とのさらなる反応を可能とする。より具体的に、反応性リンカーペイロード化合物L2-Pは、リンカーL1の反応基B’と反応可能な反応基B’’を含む場合がある。ある実施形態では、本開示の反応基B’は、1,3-付加環化反応を受けることが可能な部分を含む。ある実施形態では、反応基B’はアジドである。ある実施形態では、反応基B’’は、アルキン(例えば、末端アルキン、または張り詰めた(strained alkyne)内部アルキン)を含む。本開示のある実施形態において、反応基B’は、結合剤とトランスグルタミン化反応条件に適合する。
本開示のある実施形態では、リンカーL1分子は、1つの反応基B’を含む分枝ユニットBを含む。本開示のある実施形態では、リンカーL1分子は、1つより多くの反応基B’を含む分枝ユニットBを含む。
ある実施形態では、反応性リンカーペイロードL2-Pは、1個のペイロード分子(n=1)を含む。他の特定の実施形態では、反応性リンカーペイロードL2-Pは、2個以上のペイロード分子(n≧2)を含む。ある実施形態では、反応性リンカーペイロードL2-Pは、1~12個のペイロード分子、1~10個のペイロード分子、1~8個のペイロード分子、1~6個のペイロード分子、1~4個のペイロード分子、または1~2個のペイロード分子を含む。
ある実施形態では、反応性リンカーペイロードL2-Pは、1個のペイロード分子を含む。かかるL2-PがBA-L1-Bと反応すると、DARはBA-L1-BのLARとほぼ同等となる。例えば、1個のペイロード分子を含むL2-Pが、(例えば、Q295およびN297Qトランスグルタミン化を介して)4のLARを有するBA-L1-Bと反応する場合、得られるタンパク薬物コンジュゲートは、4のDARを有することになる。
ある実施形態では、反応性リンカーペイロードL2-Pは、2個のペイロード分子を含む。かかるL2-PがBA-L1-Bと反応すると、DARはBA-L1BのLARの約2倍となる。例えば、2個のペイロード分子を含むL2-Pが、(例えば、Q295およびN297Qトランスグルタミン化を介して)4のLARを有するBA-L1-Bと反応する場合、得られるタンパク薬物コンジュゲートは、8のDARを有することになる。
例えば、3個のペイロード分子を含むL2-Pが、(例えば、2個の基Bを含む分枝L1-BユニットのQ295およびN297Qトランスグルタミン化を介して)8のLARを有するBA-L1-Bと反応する場合、得られるタンパク薬物コンジュゲートは、24のDARを有することになる。
本開示のある実施形態では、薬物と抗体との比、すなわちDAR(例えば、小文字nで省略される)は、抗体1つに対し約1~約30、約1~約24、約1~約20、約1~約16、約1~約12、約1~約10、約1~約8、または約1、2、3、4、5、6、または8個のペイロード分子である。いくつかの実施形態では、DARは1~30である。いくつかの実施形態では、DARは1~24である。いくつかの実施形態では、DARは1~16である。いくつかの実施形態では、DARは1~8である。いくつかの実施形態では、DARは1~6である。ある実施形態では、DARは2~4である。場合により、DARは2~3である。ある場合では、DARは0.5~3.5である。ある場合では、DARは10~14である。ある場合では、DARは14~18である。ある場合では、DARは20~24.5である。いくつかの実施形態では、DARは、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、または約3.5である。いくつかの実施形態では、DARは2である。いくつかの実施形態では、DARは4である。いくつかの実施形態では、DARは8である。いくつかの実施形態では、DARは12である。いくつかの実施形態では、DARは16である。いくつかの実施形態では、DARは24である。
一態様では、本開示は、式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
kとmは、独立して1~12の整数であり、nは、1~30の整数であり、
上記方法は、
(a)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を化合物L1-Bと接触させる工程であって、分枝ユニットBは少なくとも1つの基B’を含む、工程と、
(b)工程(a)の生成物を、化合物L2-(-M-Dxd)mのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を提供する。
一態様では、本開示は、式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
上記方法は、
(a)分枝ユニットBが少なくとも1つの基B’を含む化合物L1-Bを、化合物L2-(-M-Dxd)mのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は、基B’と共有結合可能な少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を、工程(a)のL1-B-(L2-(-M-Dxd)m)k生成物と接触させる工程と、
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を提供する。
一態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、nは、1~30の整数であり、
上記方法は、
(a)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を化合物L1-Bと接触させる工程であって、分枝ユニットBは少なくとも1つの基B’を含む、工程と、
(b)工程(a)の生成物を、化合物L2-M-Dxdのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は、基B’に共有結合可能な少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を提供する。
一態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
上記方法は、
(a)分枝ユニットBが少なくとも1つの基B’を含む化合物L1-Bを、化合物L2-M-Dxdのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は少なくとも1つの基B’’を含み、接触によりL1-B-(-L2-M-Dxd)kが産生され、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含む結合剤BA(BA-Gln-NH2)を、工程(a)のL1-B-(L2(M-Dxd)k生成物と接触させる工程と、
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を提供する。
一態様では、本開示は、式(III):
BA-(Gln-NH-L2’-P))n(III)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L2’-Pは、上述されるH2N-SP1-B2-(SP2-AA-SP3-M-Dxd)pであり、nは、1~30の整数であり、
SP1は、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L2’-P))n(III)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L2’-Pは、上述されるH2N-SP1-B2-(SP2-AA-SP3-M-Dxd)pであり、nは、1~30の整数であり、
SP1は、存在しないか、または
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択される第2のスペーサユニットであり、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数であり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
pは、1~30の整数であり、
上記方法は、
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)をL2’-Pと接触させる工程と、
(c)産生された式(III)の化合物を単離する工程と
を含む方法を提供する。
一態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される少なくとも1つの基B’を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、基B’と基B’’は、上述される少なくとも1つの付加物を形成し、Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される少なくとも1つの基B’を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、基B’と基B’’は、上述される少なくとも1つの付加物を形成し、Mは、存在しないか、または
上記方法は、
(a)トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくとも1つのグルタミン残基Gln(BA-Gln-NH2)を含む結合剤BAを化合物L1-Bと接触させる工程であって、分枝ユニットBは、-N3、
(b)工程(a)の生成物を、化合物L2-M-Dxdのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は、基B’と共有結合可能な少なくとも1つの基B’’を含む、工程と、
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される少なくとも1つの基B’を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、基B’と基B’’は、上述される少なくとも1つの付加物を形成し、Mは、存在しないか、または
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される少なくとも1つの基B’を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、基B’と基B’’は、上述される少なくとも1つの付加物を形成し、Mは、存在しないか、または
上記方法は、
(a)分枝ユニットBが、-N3、
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含む結合剤BA(BA-Gln-NH2)を、工程(a)のL1-B-(L2(M-Dxd)k生成物と接触させる工程と、
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法を提供する。
一実施形態では、グルタミン残基Glnは、BAのCH2またはCH3ドメインに自然に存在する。別の実施形態では、グルタミン残基Glnは、1つまたは複数のアミノ酸を修飾することによりBAに導入される。一実施形態では、Glnは、Q295またはN297Qである。
一実施形態では、トランスグルタミナーゼは微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)である。一実施形態では、トランスグルタミナーゼは細菌トランスグルタミナーゼ(BTG)である。
一実施形態では、Mは存在しない。別の実施形態では、M-Dxdは、
一実施形態では、化合物L2-Dxdは、
一実施形態では、化合物L2-Dxdは、任意選択の分枝ユニットB2を包含する。かかる実施形態では、化合物L2-Dxdは、2つ以上のDxdユニットを含む。
一実施形態では、分枝ユニットB2は、
一実施形態では、化合物L2-Dxdは、
治療製剤および投与
本開示は、本開示のタンパク薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
本開示は、本開示のタンパク薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
一態様では、本開示は、約0.5~約30.0の薬物抗体比(DAR)を有する、本開示のタンパク薬物コンジュゲートの集団を含む組成物を提供する。
一実施形態では、組成物のDARは、約1.0~約2.5である。
一実施形態では、組成物のDARは、約2である。
一実施形態では、組成物のDARは、約3.0~約4.5である。
一実施形態では、組成物のDARは、約4である。
一実施形態では、組成物のDARは、約6.5~約8.5である。
一実施形態では、組成物のDARは、約8である。
一実施形態では、組成物のDARは、約10~約14である。
一実施形態では、組成物のDARは、約12である。
一実施形態では、組成物のDARは、約14~約18である。
一実施形態では、組成物のDARは、約16である。
一実施形態では、組成物のDARは、約20~約24.5である。
一実施形態では、組成物のDARは、約24である。
本開示の組成物は、輸送、送達、忍容性などを改善する好適な担体、賦形剤、および他の薬剤とともに製剤化される。多数の適切な製剤は、すべての薬剤師に公知の処方集である「Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA」で見ることができる。これらの製剤として、例えば、粉体、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、小胞を含有する(陽イオン性または陰イオン性)脂質(LIPOFECTIN(商標),Life Technologies,Carlsbad,CAなど)、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンcarbowax(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固形ゲル、carbowaxを含有する半固形混合物が挙げられる。また、Powellらによる「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311も参照されたい。
患者に投与されるタンパク薬物コンジュゲートの用量は、患者の年齢や大きさ、標的の疾患、条件、投与経路などに応じて変動する場合がある。好適な用量は、典型的に体重や体表面積により算出される。本開示のタンパク薬物コンジュゲートを成人患者への治療目的に使用する場合、本開示のタンパク薬物コンジュゲートを約0.01~約20mg/kg、より好ましくは約0.02~0.07、約0.03~約5、または約0.05~約3mg/kgの単回用量で静脈内投与することが、都合の良い場合がある。疾病の重症度に応じて、処置の頻度と期間を調整できる。タンパク薬物コンジュゲートを投与するのに有効な投与量とスケジュールは経験に基づき決定される場合があり、例えば、患者進行は定期評価によりモニタリングされ、用量が適宜調整される。さらに、投与量の種間のスケーリングは、当該技術分野で公知の方法(例えば、Mordentiらによる1991年のPharmaceut.Res.8:1351)を用いて実行できる。
様々な送達システムが公知であり、これらを使用して、本開示の医薬組成物、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、突然変異ウイルスを発現可能な組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシスを封入したものを投与することができる(例えば、Wuらによる1987年のJ.Biol.Chem.262:4429-4432を参照)。導入方法として、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、いずれかの都合の良い経路、例えば注入もしくはボーラス注入、上皮もしくは粘膜皮膚の内膜(例えば口腔粘膜、直腸、腸管粘膜など)を介した吸収により投与されてよく、他の生体活性の薬剤とともに投与されてよい。投与は全身投与または局所投与とすることができる。
本開示の医薬組成物は、標準の針およびシリンジを用いて皮下または静脈内で送達可能である。加えて、皮下送達では、ペン送達デバイスが本開示の医薬組成物の送達に容易に適用される。かかるペン送達デバイスは再使用可能または使い捨て可能とすることができる。再使用可能なペン送達デバイスでは、一般に医薬組成物を含有する交換可能カートリッジが利用される。カートリッジ内の医薬組成物がすべて投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは速やかに破棄され、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。その後、ペン送達デバイスを再使用できる。使い捨て可能なペン送達デバイスには、交換可能カートリッジはない。代わりに、使い捨て可能なペン送達デバイスは、デバイス内のリザーバに保持された医薬組成物を事前に充填される。医薬組成物が放たれてリザーバが空になると、デバイスすべてが破棄される。
多数の再使用可能なペン送達デバイスとオートインジェクタ送達デバイスは、本開示の医薬組成物の皮下送達に適用される。例として、わずかであるが、AUTOPEN(商標)(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONIC(商標)ペン(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25(商標)ペン、HUMALOG(商標)ペン、HUMALIN 70/30(商標)ペン(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPEN(商標)I、II、およびIII(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR(商標)(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BD(商標)ペン(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN(商標)、OPTIPEN PRO(商標)、OPTIPEN STARLET(商標)、OPTICLIK(商標)(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨て可能なペン送達デバイスの例として、わずかであるが、SOLOSTAR(商標)ペン(Sanofi-Aventis)、FLEXPEN(商標)(Novo Nordisk)、KWIKPEN(商標)(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)、HUMIRATMペン(Abbott Labs,Abbott Park IL)が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の状況では、医薬組成物は制御放出システム中で送達できる。一実施形態では、ポンプが使用されてよい(上述のLanger;Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201を参照)。別の実施形態では、高分子材料が使用できる(Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Floridaを参照)。また別の実施形態では、制御放出システムは、組成物の標的付近に配することができるので、必要なのは全身投与のみである(例えば、Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138を参照)。他の制御放出システムは、Langer,1990,Science 249:1527-1533による論評で論じられている。
注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内の注射や点滴における投与形態を含む場合がある。これらの注射可能な調製物は、公知の方法により調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、従来注射に使用される滅菌の水性媒体もしくは油性媒体中で、上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化することにより調製され得る。注射用の水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコースや他の助剤を含有する等張液などがあり、これらはアルコール(例えば、エタノール)、多価アルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン界面活性剤(例えば、ポリソルベート80、HCO-50(硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン(50mol)付加物))などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用されてよい。油性媒体としては、例えばゴマ油や大豆油などが利用されており、安息香酸ベンジルやベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用されてよい。こうして調製された注射剤は、適切なアンプルに充填するのが好ましい。
都合の良いことに、上述の経口または非経口用の医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量で剤形へと調製される。単位用量中のこのような剤形として、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射(アンプル)、坐薬などが挙げられる。中に含まれる前述の抗体の量は通常、単位用量中で剤形1つにつき約5~約500mgである。特に、注射の形態では、前述の抗体は約5~約100mg、他の剤形では約10~約250mgで含まれることが好ましい。
タンパク薬物コンジュゲート、リンカーペイロード、およびペイロードの治療用途
別の態様では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、とりわけ処置が必要な疾患、障害、もしくは疾病の処置、予防、および/または軽快に有用である。
別の態様では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、とりわけ処置が必要な疾患、障害、もしくは疾病の処置、予防、および/または軽快に有用である。
一実施形態では、本発明は、疾病の処置を必要とする対象の疾病を処置する方法であって、本開示による化合物(例えば、抗体薬物コンジュゲート、リンカーペイロード、および/またはペイロード)、または本開示によるいずれかの化合物を含む組成物を治療有効量で対象に投与する工程を含む方法を提供する。
一実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、癌の処置に有用である。一実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、または脳癌からなる群から選択される癌の処置に有用である。一実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、HER2+乳癌の処置に有用である。一実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、前立腺癌の処置に有用である。
一態様では、本開示は、化合物を細胞へと選択的に送達する方法を提供する。一実施形態では、化合物を細胞へと選択的に送達する方法は、化合物と標的とされた抗体とを連結する工程を含む。一実施形態では、化合物は、上述されるペイロードである。一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は癌細胞である。一実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、肝臓癌細胞、または脳癌細胞からなる群から選択される。
ある実施形態では、本開示は、構造P-I:
一態様では、本開示は、化合物により細胞表面上の抗原を選択的に標的とする方法を提供する。一実施形態では、化合物により細胞表面上の抗原を選択的に標的とする方法は、化合物と標的とされた抗体とを連結する工程を含む。一実施形態では、化合物は、上述されるペイロードである。一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は癌細胞である。一実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、肝臓癌細胞、または脳癌細胞からなる群から選択される。
ある実施形態では、本開示は、構造P-I:
抗HER2抗体薬物コンジュゲート
ある実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、とりわけ、HER2の発現もしくは活性に関連するか媒介される、あるいは、修飾LDLと競合することなくHER2を結合することにより、ならびに/またはHER2受容体の内在化を促進させる、および/もしくは細胞表面受容体の数を減らすことにより処置可能である、いずれかの疾患または障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用である。
ある実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、とりわけ、HER2の発現もしくは活性に関連するか媒介される、あるいは、修飾LDLと競合することなくHER2を結合することにより、ならびに/またはHER2受容体の内在化を促進させる、および/もしくは細胞表面受容体の数を減らすことにより処置可能である、いずれかの疾患または障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用である。
本開示のタンパク薬物コンジュゲート(およびそれを含む治療用組成物)は、免疫応答の刺激、活性化、および/または標的化が有益となるいずれかの疾患または障害を処置するのにとりわけ有用である。具体的に、本開示の単特異性抗HER2抗体と二重特異性抗HER2/HER2抗体の両方を含む抗HER2タンパク薬物コンジュゲートは、HER2の発現もしくは活性、またはHER2+細胞の増殖に関連するか媒介されるいずれかの疾患もしくは障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用とすることができる。本開示の治療方法を達成する作用機序は、エフェクター細胞の存在下でHER2を発現する細胞を、例えば、CDC、アポトーシス、ADCC、食作用、またはこれら機序のうち2つ以上の組合せにより死滅させることを含む。本開示のタンパク薬物コンジュゲートを用いて阻害または死滅させることのできる、HER2を発現する細胞として、例えば乳房腫瘍細胞が挙げられる。
一実施形態では、本開示のタンパク薬物コンジュゲート(およびそれを含む治療用組成物と剤形)は、
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含む二重特異性抗原結合性分子を含んでなり、
D1は、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する。
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含む二重特異性抗原結合性分子を含んでなり、
D1は、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する。
上記の一実施形態では、D1とD2は、ヒトHER2への結合において互いに競合しない。
本開示のタンパク薬物コンジュゲートは、例えば前立腺、膀胱、子宮頚部、肺、結腸、腎臓、乳房、膵臓、胃、子宮、および/または卵巣に生じる原発性および/または転移性腫瘍を処置するために使用できる。ある実施形態では、本開示のタンパク薬物コンジュゲートは、前立腺癌、膀胱癌、子宮頚癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌、および卵巣癌のうち1つまたは複数を処置するのに使用される。本開示のある実施形態によれば、抗HER2抗体または抗HER2/HER2二重特異性抗体は、IHC2+以上である乳癌細胞に罹患した患者を処置するのに有用である。本開示の他の関連実施形態によれば、IHC2+以上である乳癌細胞に罹患した患者に、本明細書に開示される抗HER2抗体または抗HER2/HER2抗体を投与する工程を含む方法が、提供される。腫瘍スキャンニングなどの当該技術分野で公知の解析/診断法を、患者に去勢抵抗性である腫瘍があるかどうかを確認するのに使用できる。
ある実施形態では、本開示はまた、対象に残存する癌を処置する方法を含む。「残存する癌」という用語は、抗癌治療による処置後、対象に1つまたは複数の癌細胞が存在または残存することを意味する。
本開示のタンパク薬物コンジュゲート(およびそれを含む治療用組成物)は、免疫応答の刺激、活性化、および/または標的化が有益となるいずれかの疾患または障害を処置するのにとりわけ有用である。具体的に、本開示の抗HER2抗体または抗HER2/HER2抗体を含むタンパク薬物コンジュゲートは、HER2の発現もしくは活性、またはHER2+細胞の増殖に関連するか媒介されるいずれかの疾患もしくは障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用とすることができる。本開示の治療方法を達成する作用機序は、エフェクター細胞の存在下でHER2を発現する細胞を、例えば、CDC、アポトーシス、ADCC、食作用、またはこれら機序のうち2つ以上の組合せにより死滅させることを含む。本開示のタンパク薬物コンジュゲートを用いて阻害または死滅させることのできる、HER2を発現する細胞として、例えば乳房腫瘍細胞が挙げられる。
ある態様によれば、本開示は、HER2発現に関連する疾患または障害(例えば、乳癌)を処置する方法であって、対象が乳癌(例えば、IHC2+乳癌)を患っていると判定した後、本明細書中で別記される抗HER2タンパク薬物コンジュゲートまたは抗HER2/HER2二重特異性タンパク薬物コンジュゲートのうち1つまたは複数を対象に投与する工程を含む方法を、提供する。例えば、本開示は、乳癌を処置する方法であって、対象がホルモン療法(例えば、抗アンドロゲン治療法)を受けた後1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、4週間、2か月、4か月、6か月、8か月、1年以上で、抗HER2抗体もしくは抗原結合性分子、または抗HER2/HER2二重特異性抗体もしくは抗原結合性分子を含むタンパク薬物コンジュゲートを、患者に投与する工程を含む方法を含む。
ある実施形態では、本開示はまた、HER2を発現する細胞に関連するか、それにより生じる疾患または障害(例えば癌)の処置のための薬剤の製造における、本開示の抗HER2の抗体の使用も含む。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗HER2抗体もしくは抗原結合性フラグメント、またはHER2/HER2二重特異性抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含む、タンパク薬物コンジュゲートに関する。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲート(ADC)を含む化合物に関する。
抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート
ある実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、とりわけ、STEAP2の発現もしくは活性に関連するか媒介される、あるいは、修飾LDLと競合することなくSTEAP2を結合することにより、ならびに/またはSTEAP2受容体の内在化を促進させる、および/もしくは細胞表面受容体の数を減らすことにより処置可能である、いずれかの疾患または障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用である。
ある実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、とりわけ、STEAP2の発現もしくは活性に関連するか媒介される、あるいは、修飾LDLと競合することなくSTEAP2を結合することにより、ならびに/またはSTEAP2受容体の内在化を促進させる、および/もしくは細胞表面受容体の数を減らすことにより処置可能である、いずれかの疾患または障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用である。
本開示のタンパク薬物コンジュゲート(およびそれを含む治療用組成物)は、免疫応答の刺激、活性化、および/または標的化が有益となるいずれかの疾患または障害を処置するのにとりわけ有用である。具体的に、本開示のHER2またはHER2HER2をSTEAP2タンパク薬物コンジュゲートは、HER2の発現もしくは活性、またはHER2+細胞の増殖に関連するか媒介されるいずれかの疾患もしくは障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用とすることができる。本開示の治療方法を達成する作用機序は、エフェクター細胞の存在下でSTEAP2を発現する細胞を、例えば、CDC、アポトーシス、ADCC、食作用、またはこれら機序のうち2つ以上の組合せにより死滅させることを含む。本開示のタンパク薬物コンジュゲートを用いて阻害または死滅させることのできる、STEAP2を発現する細胞として、例えば前立腺腫瘍細胞が挙げられる。
本開示のタンパク薬物コンジュゲートは、例えば前立腺、膀胱、子宮頚部、肺、結腸、腎臓、乳房、膵臓、胃、子宮、および/または卵巣に生じる原発性および/または転移性腫瘍を処置するために使用できる。ある実施形態では、本開示のタンパク薬物コンジュゲートは、前立腺癌、膀胱癌、子宮頚癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌、および卵巣癌のうち1つまたは複数を処置するのに使用される。腫瘍スキャンニングなどの当該技術分野で公知の解析/診断法を、患者に去勢抵抗性である腫瘍があるかどうかを確認するのに使用できる。
ある実施形態では、本開示はまた、対象に残存する癌を処置する方法を含む。「残存する癌」という用語は、抗癌治療による処置後、対象に1つまたは複数の癌細胞が存在または残存することを意味する。
ある態様によれば、本開示は、STEAP2発現に関連する疾患または障害(例えば、前立腺癌)を処置する方法であって、対象が前立腺癌を患っていると判定された後、本明細書中で別記される抗STEAP2タンパク薬物コンジュゲートのうち1つまたは複数を対象に投与する工程を含む方法を提供する。例えば、本開示は、前立腺癌を処置する方法であって、対象がホルモン療法(例えば、抗アンドロゲン治療法)を受けた後1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、4週間、2か月、4か月、6か月、8か月、1年以上で、抗STEAP抗体もしくは抗原結合性分子を含むタンパク薬物コンジュゲートを、患者に投与する工程を含む方法を含む。
ある実施形態では、本開示はまた、STEAP2を発現する細胞に関連するか、それにより生じる疾患または障害(例えば癌)の処置のための薬剤の製造における、本開示の抗STEAP2抗体の使用も含む。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗STEAP2抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含むタンパク薬物コンジュゲートに関する。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲート(ADC)を含む化合物に関する。
抗MET抗体薬物コンジュゲート
ある実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、とりわけ、METの発現もしくは活性に関連するか媒介される、あるいは、修飾LDLと競合することなくMETを結合することにより、ならびに/またはMET受容体の内在化を促進させる、および/もしくは細胞表面受容体の数を減らすことにより処置可能である、いずれかの疾患または障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用である。
ある実施形態では、本明細書に開示されるタンパク薬物コンジュゲート、例えばADCは、とりわけ、METの発現もしくは活性に関連するか媒介される、あるいは、修飾LDLと競合することなくMETを結合することにより、ならびに/またはMET受容体の内在化を促進させる、および/もしくは細胞表面受容体の数を減らすことにより処置可能である、いずれかの疾患または障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用である。
本開示のタンパク薬物コンジュゲート(およびそれを含む治療用組成物)は、免疫応答の刺激、活性化、および/または標的化が有益となるいずれかの疾患または障害を処置するのにとりわけ有用である。具体的に、本開示の抗METまたは抗MET/METタンパク薬物コンジュゲートは、METの発現もしくは活性、またはMET+細胞の増殖に関連するか媒介されるいずれかの疾患もしくは障害を処置、予防、および/または軽快するのに有用とすることができる。本開示の治療方法を達成する作用機序は、エフェクター細胞の存在下でMETを発現する細胞を、例えば、CDC、アポトーシス、ADCC、食作用、またはこれら機序のうち2つ以上の組合せにより死滅させることを含む。本開示のタンパク薬物コンジュゲートを用いて阻害または死滅させることのできる、METを発現する細胞として、例えば肺腫瘍細胞が挙げられる。
本開示のタンパク薬物コンジュゲートは、例えば前立腺、膀胱、子宮頚部、肺、結腸、腎臓、乳房、膵臓、胃、子宮、および/または卵巣に生じる原発性および/または転移性腫瘍を処置するために使用できる。ある実施形態では、本開示のタンパク薬物コンジュゲートは、前立腺癌、膀胱癌、子宮頚癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌、および卵巣癌のうち1つまたは複数を処置するのに使用される。腫瘍スキャンニングなどの当該技術分野で公知の解析/診断法を、患者に去勢抵抗性である腫瘍があるかどうかを確認するのに使用できる。
ある実施形態では、本開示はまた、対象に残存する癌を処置する方法を含む。「残存する癌」という用語は、抗癌治療による処置後、対象に1つまたは複数の癌細胞が存在または残存することを意味する。
ある態様によれば、本開示は、MET発現に関連する疾患または障害(例えば、肺癌)を処置する方法であって、対象が肺癌を患っていると判定された後、本明細書中で別記される抗METもしくは抗MET/METタンパク薬物コンジュゲートのうち1つまたは複数を対象に投与する工程を含む方法を提供する。例えば、本開示は、肺癌を処置する方法であって、対象がホルモン療法(例えば、抗アンドロゲン治療法)を受けた後1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、4週間、2か月、4か月、6か月、8か月、1年以上で、抗METもしくは抗MET/MET二重特異性抗体または抗原結合性分子を含むタンパク薬物コンジュゲートを、患者に投与する工程を含む方法を含む。
例えば、本開示の抗MET抗体薬物コンジュゲート、およびMET×MET二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、METを発現(または過剰発現)する腫瘍の処置に有用である。例えば、抗MET抗体薬物コンジュゲート、およびMET×MET二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、脳および髄膜、口腔咽頭、肺および気管支樹、胃腸管、男性および女性生殖器、筋肉、骨、皮膚および付属器官、結合組織、脾臓、免疫系、細胞と骨髄を形成する血液、肝臓および尿路、眼などの特殊な感覚器に生じる原発性および/または転移性腫瘍を処置するのに使用され得る。ある実施形態では、抗MET抗体薬物コンジュゲート、およびMET×MET二重特異性抗体薬物コンジュゲートは、急性骨髄性白血病、成人T細胞性白血病、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、肝内胆管癌、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌(例えば、MET増幅を伴う胃癌)、膠芽腫、頭頸部癌(例えば、頭頸部扁平上皮癌[HNSCC])、カポジ肉腫、腎臓癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌(例えば、非小細胞肺癌[NSCLC])、リンパ腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、黒色腫、中皮腫、MFH/線維肉腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、小細胞肺癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、およびウィルムス腫瘍のうち1つまたは複数を処置するのに使用される。
ある実施形態では、本開示はまた、METを発現する細胞に関連するか、それにより生じる疾患または障害(例えば癌)の処置のための薬剤の製造における、本開示の抗MET抗体薬物コンジュゲートまたはMET×MET二重特異性抗体薬物コンジュゲートの使用も含む。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗MET抗体薬物コンジュゲートまたはMET×MET二重特異性抗体薬物コンジュゲートを含む、タンパク薬物コンジュゲートに関する。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲート(ADC)を含む化合物に関する。
併用療法と製剤
本開示は、本明細書に記載の例示的なタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、およびペイロードのうちいずれかを含む医薬組成物を、1つまたは複数の追加の治療剤と組合せて投与する工程を含む方法を、提供する。本開示のタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、およびペイロードと組み合わされるか、それと組み合わせて投与され得る例示的な追加の治療剤としては、例えば、HER2アンタゴニスト(例えば、抗HER2抗体[例えば、トラスツズマブ]またはHER2もしくは抗HER2抗体薬物コンジュゲートの小分子阻害剤、あるいは抗HER2/HER2二重特異性抗体または抗HER2/HER2二重特異性抗体薬物コンジュゲート)、EGFRアンタゴニスト(例えば、抗EGFRの抗体[例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ]またはEGFRの小分子阻害剤[例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ])、HER2/ErbB2、ErbB3、ErbB4などの別のEGFRファミリーメンバーのアンタゴニスト(例えば、抗ErbB2、抗ErbB3、もしくは抗ErbB4抗体、またはErbB2、ErbB3、もしくはErbB4活性の小分子阻害剤)、EGFRvIIIのアンタゴニスト(例えば、EGFRvIIIを特異的に結合する抗体)、cMETアンタゴニスト(例えば、抗cMET抗体)、IGF1Rアンタゴニスト(例えば、抗IGF1R抗体)、B-raf阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、gDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α阻害剤(例えば、抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β阻害剤(例えば、抗PDGFR-β抗体)、VEGFアンタゴニスト(例えば、VEGF-Trap、例えば米国特許第7,087,411号明細書を参照(本明細書では「VEGFを阻害する融合タンパク質」とも称される))、抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ)、VEGF受容体の小分子キナーゼ阻害剤(例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、またはパゾパニブ))、DLL4アンタゴニスト(例えば、米国特許第2009/0142354号明細書に開示される抗DLL4抗体)、Ang2アンタゴニスト(例えば、H1H685Pなどの米国特許第2011/0027286号明細書に開示される抗Ang2抗体)、FOLH1(PSMA)アンタゴニスト、PRLRアンタゴニスト(例えば、抗PRLR抗体)、STEAP1もしくはSTEAP2アンタゴニスト(例えば、抗STEAP1抗体もしくは抗STEAP2抗体)、TMPRSS2アンタゴニスト(例えば、抗TMPRSS2抗体)、MSLNアンタゴニスト(例えば、抗MSLN抗体)、CA9アンタゴニスト(例えば、抗CA9抗体)、ウロプラキンアンタゴニスト(例えば、抗ウロプラキン抗体)などが挙げられる。
本開示は、本明細書に記載の例示的なタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、およびペイロードのうちいずれかを含む医薬組成物を、1つまたは複数の追加の治療剤と組合せて投与する工程を含む方法を、提供する。本開示のタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、およびペイロードと組み合わされるか、それと組み合わせて投与され得る例示的な追加の治療剤としては、例えば、HER2アンタゴニスト(例えば、抗HER2抗体[例えば、トラスツズマブ]またはHER2もしくは抗HER2抗体薬物コンジュゲートの小分子阻害剤、あるいは抗HER2/HER2二重特異性抗体または抗HER2/HER2二重特異性抗体薬物コンジュゲート)、EGFRアンタゴニスト(例えば、抗EGFRの抗体[例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ]またはEGFRの小分子阻害剤[例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ])、HER2/ErbB2、ErbB3、ErbB4などの別のEGFRファミリーメンバーのアンタゴニスト(例えば、抗ErbB2、抗ErbB3、もしくは抗ErbB4抗体、またはErbB2、ErbB3、もしくはErbB4活性の小分子阻害剤)、EGFRvIIIのアンタゴニスト(例えば、EGFRvIIIを特異的に結合する抗体)、cMETアンタゴニスト(例えば、抗cMET抗体)、IGF1Rアンタゴニスト(例えば、抗IGF1R抗体)、B-raf阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、gDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α阻害剤(例えば、抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β阻害剤(例えば、抗PDGFR-β抗体)、VEGFアンタゴニスト(例えば、VEGF-Trap、例えば米国特許第7,087,411号明細書を参照(本明細書では「VEGFを阻害する融合タンパク質」とも称される))、抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ)、VEGF受容体の小分子キナーゼ阻害剤(例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、またはパゾパニブ))、DLL4アンタゴニスト(例えば、米国特許第2009/0142354号明細書に開示される抗DLL4抗体)、Ang2アンタゴニスト(例えば、H1H685Pなどの米国特許第2011/0027286号明細書に開示される抗Ang2抗体)、FOLH1(PSMA)アンタゴニスト、PRLRアンタゴニスト(例えば、抗PRLR抗体)、STEAP1もしくはSTEAP2アンタゴニスト(例えば、抗STEAP1抗体もしくは抗STEAP2抗体)、TMPRSS2アンタゴニスト(例えば、抗TMPRSS2抗体)、MSLNアンタゴニスト(例えば、抗MSLN抗体)、CA9アンタゴニスト(例えば、抗CA9抗体)、ウロプラキンアンタゴニスト(例えば、抗ウロプラキン抗体)などが挙げられる。
本開示のタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、およびペイロードと組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤としては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18などのサイトカイン、またはそれらの各受容体に結合する、小分子サイトカイン阻害剤や抗体を含むサイトカイン阻害剤が挙げられる。本開示の医薬組成物(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2タンパク薬物コンジュゲート(例えば、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲート)を含む医薬組成物)はまた、「ICE」:イホスファミド(例えば、Ifex(登録商標))、カルボプラチン(例えば、Paraplatin(登録商標))、エトポシド(例えば、Etopophos(登録商標)、Toposar(登録商標)、VePesid(登録商標)、VP-16);「DHAP」:デキサメタゾン(例えば、Decadron(登録商標))、シタラビン(例えば、Cytosar-U(登録商標)、サイトシンアラビノサイド、ara-C)、シスプラチン(例えば、Platinol(登録商標)-AQ);および「ESHAP」:エトポシド(例えば、Etopophos(登録商標)、Toposar(登録商標)、VePesid(登録商標)、VP-16)、メチルプレドニゾロン(例えば、Medrol(登録商標))、高用量シタラビン、シスプラチン(例えば、Platinol(登録商標)-AQ)から選択される1つまたは複数の治療上の組合せを含む、治療レジメンの一部として投与される場合がある。
本開示はまた、本明細書で言及したタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、およびペイロードのうちいずれかと、HER2、VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1(PSMA)、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、ウロプラキンの1つもしくは複数、または前述のサイトカインのいずれかとを含む治療用の組合せを含み、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、siRNA、ペプチボディ、ナノボディ、または抗体フラグメント(例えば、Fabフラグメント;F(ab’)2フラグメント;Fdフラグメント;Fvフラグメント;scFv;dAbフラグメント;またはダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、最小認識ユニットなどの他の操作分子)である。本開示の抗原結合性分子は、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、および/またはNSAIDと組み合わせて投与、および/または同時投与される場合もある。本開示の抗原結合性分子は、放射線療法および/または従来の化学療法をさらに含む処置レジメンのの一部として投与される場合もある。
追加の治療上活性な成分は、本開示の抗原結合性分子の投与の直前、同時、または直後に投与されてよい(本開示の目的では、かかる投与レジメンは、追加の治療上活性な成分と「組み合わせた」抗原結合性分子の投与とみなされる)。
本開示は、本開示のタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードが、本明細書で別記される1または複数の追加の治療上活性な成分と同時投与される医薬組成物を含む。
投与レジメン
本開示のある実施形態によれば、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの複数回用量は、所定の期間にわたり対象に投与される場合がある。本開示のこの態様による方法は、本開示のタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの複数回用量を対象に連続投与する工程を含む。本明細書で使用するとき、「連続投与」とは、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの各用量が、様々な時点、例えば、所定の間隔(例えば、数時間、数日、数週間、数か月)を空けて異なる日に対象に投与されることを意味する。本開示は、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの単回初回用量、続いてタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの1つもしくは複数の2回目用量、そして任意選択でタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの1つもしくは複数の3回目用量を、患者に連続投与する工程を含む方法を含む。
本開示のある実施形態によれば、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの複数回用量は、所定の期間にわたり対象に投与される場合がある。本開示のこの態様による方法は、本開示のタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの複数回用量を対象に連続投与する工程を含む。本明細書で使用するとき、「連続投与」とは、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの各用量が、様々な時点、例えば、所定の間隔(例えば、数時間、数日、数週間、数か月)を空けて異なる日に対象に投与されることを意味する。本開示は、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの単回初回用量、続いてタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの1つもしくは複数の2回目用量、そして任意選択でタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの1つもしくは複数の3回目用量を、患者に連続投与する工程を含む方法を含む。
「初回用量」、「2回目用量」、および「3回目用量」という用語は、本開示のタンパク質薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの、一続きの投与を指す。このため、「初回用量」は、処置レジメンの開始時に投与される用量であり(「ベースライン用量」とも称される)、「2回目用量」は初回用量の後に投与される用量であり、「3回目用量」は2回目用量の後に投与される用量である。初回用量、2回目用量、および3回目用量はすべて、タンパク質薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードを同量で含有しているが、一般的に投与頻度の観点では互いに量が異なる場合もある。しかし、ある実施形態では、初回用量、2回目用量、および/または3回目用量に含まれるタンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの量は、処置期間中に互いに変動する(例えば、適宜上方または下方調整される)。ある実施形態では、2つ以上の(例えば、2、3、4、または5つの)用量が、処置レジメンの開始時に「負荷用量」として投与され、続いて後の用量は頻度を少なくして投与される(例えば、「維持用量」)。
本開示の例示的な一実施形態では、2回目用量および/または3回目用量は、それぞれ直前用量の後1~26週間(例えば、1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2週間以上)で投与される。「直前用量」という句は、本明細書で使用するとき、一連の複数回投与において、間に投与を行うことなく次の用量の投与前に患者に投与されるタンパク質薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、および/またはペイロードの用量を意味する。
本開示のこの態様による方法は、タンパク薬物コンジュゲート(例えば、抗HER2、抗HER2/HER2二重特異性、抗MET、抗MET/MET二重特異性、または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート)、リンカーペイロード、ならびに/またはペイロードの2回目用量および/もしくは3回目用量を任意数で患者に投与する工程を含む場合がある。例えば、ある実施形態では、2回目用量は患者に1回しか投与されない。他の実施形態では、2回目用量は患者に2回以上(例えば、2、3、4、5、6、7、または8回以上)投与される。同様に、ある実施形態では、3回目用量は患者に1回しか投与されない。他の実施形態では、3回目用量は患者に2回以上(例えば、2、3、4、5、6、7、または8回以上)投与される。
複数回の2回目用量を伴う実施形態では、2回目用量は、それぞれ他の2回目用量と同じ頻度で投与される場合がある。例えば、2回目用量は、それぞれ直前用量の後1~2週間で患者に投与される場合がある。同様に、複数回の3回目用量を伴う実施形態では、3回目用量は、それぞれ他の3回目用量と同じ頻度で投与される場合がある。例えば、3回目用量は、それぞれ直前用量の後2~4週間で患者に投与される場合がある。代替的に、2回目用量および/または3回目用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの期間にわたり変動する可能性がある。投与頻度も、臨床検査後に患者個別の必要性に応じて医師により処置期間中に調整される場合がある。
以下の実施例は、本明細書の具体的な態様を例示する。本実施例は、単に実施形態とその様々な態様を具体的に理解かつ実施させるものにすぎず、限定的なものと解釈されるべきではない。
出発材料の大半は、Sigma-Aldrich(登録商標)、J&K(登録商標)、ChemExpress(登録商標)などから市販で入手可能である。以下の化合物は、対応する参考文献に従い合成した。
一般法
実施例1:カンプトテシン誘導体(ペイロード)
実施例1:カンプトテシン誘導体(ペイロード)
ペイロードP1であるメチル酸エクサテカンをMCEから市販で入手した。ペイロードP2とP3は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第WO2015155998号に記載のとおり合成し、カンプトテシン誘導体であるペイロードP4はスキーム1A2記載のとおりに、かつ実施例1A~1Eに概説される合成工程により合成した。
実施例1A:9H-フルオレン-9-イルメチルN-[2-(2-ヒドロキシピロリジン-1-イル)-2-オキソエチル]カルバメート(P4-2)の合成
Fmoc-Gly-Pro-OH P4-1(0.10g、0.26mmol)の乾燥DMF(1mL)混合物に、酢酸鉛(0.14g、0.31mmol)を添加した。得られた混合物を室温で30分間撹拌し、反応の進行状況をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物をセライトに通して濾過し、濾液を酢酸エチルで希釈し、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中、0~10%の酢酸エチル)により精製することで化合物P4-2(50mg、53%の収率)を白色固形物として得たが、アセテート中間体は得られなかった。ESI m/z:389(M+23)+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.90(d,J=7.4Hz,2H),7.73(d,J=7.5Hz,2H),7.47-7.37(m,3H),7.33(t,J=7.3Hz,2H),5.86(br s,1H),5.48(d,J=4.0Hz,0.25H),5.39(d,J=4.0Hz,0.75H),4.33-4.18(m,3H),3.96(d,J=6.0Hz,1.5H),3.75(d,J=6.0Hz,0.5H),3.59-3.33(m,1H),3.22-3.11(m,1H),2.00-1.59(m,4H)ppm。
実施例1B:ベンジル2-{[1-(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}アセチル)ピロリジン-2-イル]オキシ}アセテート(P4-3)の合成
化合物P4-2(0.30g、0.82mmol)のDCM(25mL)溶液に、クロロトリメチルシラン(TMSCl)(0.27g、2.5mmol)を添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌し、反応の進行状況をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣をDCM(25mL)で希釈した。溶液にグリコール酸ベンジル(0.27g、1.6mmol)とDIPEA(0.21g、1.6mmol)を添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌し、反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(0.05%)中、0~100%のアセトニトリル)により精製することで、化合物P4-3(純度99%超で0.11g、25%の収率、および純度75%で50mg)を白色固形物として得た。ESI m/z:537.3(M+Na)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.91-7.89(m,2H),7.74-7.69(m,2H),7.63-7.48(m,1H),7.42-7.25(m,9H),5.51-5.09(m,2H),4.35-4.21(m,5H),4.00-3.77(m,2H),3.52-3.38(m,2H),3.30-3.18(m,1H),2.19-1.64(m,4H)ppm。
実施例1C:2-{[1-(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}アセチル)ピロリジン-2-イル]オキシ}酢酸(P4-4)の合成
化合物P4-3(89mg、0.17mmol)のメタノール(3mL)とTHF(7mL)溶液に、湿潤パラジウム炭素(10%Pd、20mg)を窒素保護下で添加した。混合物を脱気し、水素バルーン圧下、室温で2時間撹拌し、反応の完了をLCMSによりモニタリングした。反応混合物をセライトに通して濾過し、濾液を真空下で濃縮した。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(0.05%)中、0~100%のアセトニトリル)により精製することで、化合物P4-4(36mg、49%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:447.1(M+Na)+。
実施例1D:9H-フルオレン-9-イルメチルN-{2-[2-({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)ピロリジン-1-イル]-2-オキソエチル}カルバメート(P4-5)
化合物P4-4(63mg、0.15mmol)とメチル酸エクサテカン(66mg、0.12mmol)とのDMF(2mL)混合物に、HATU(61mg、0.16mmol)とDIPEA(46mg、0.36mmol)を添加し、混合物を室温で2時間撹拌し、反応の完了をLCMSによりモニタリングした。反応混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物P4-5(45mg、44%の収率)を黄色固形物として得た。ESI m/z:842.3(M+H)+。
実施例1E:2-{[1-(2-アミノアセチル)ピロリジン-2-イル]オキシ}-N-[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]アセトアミド(P4)
化合物P4-5(45mg、54μmol)のDCM(4mL)溶液にジエチルアミン(20mg、0.27mmol)を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(DCM中、0~10%のメタノール)により精製することで、化合物P4(9.5mg、28%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:620.3(M+H)+。下記の表6は、本開示によるペイロードP1~P3の細胞毒性とADME(吸収、分布、代謝、排泄)データを提供する。
表中、「-v」はベラパミルを含まないことを表し、「+v」はベラパミルを含むことを表す。ベラパミルは、P糖タンパク質の阻害剤として知られており、P糖タンパク質媒介型流出を妨げる機能を有する場合がある。
実施例2:リンカー2-ペイロード
実施例2A:線形リンカー2-ペイロード(LL2P)
下記の表7は、本開示による例示的な線形リンカー2-ペイロード(LL2P)の構造を提供する。
下記の表8は、本開示による例示的な線形リンカー2-ペイロード(LL2P)の化学特性を提供する。
*ラクトンと開環生成物との混合物。MWとm/zの値は、対応するラクトンのデータである。
実施例2B:分枝リンカー2-ペイロード(BL2P)
下記の表9は、本開示による例示的な分枝ユニットB1~B5の構造を提供する。
下記の表10は、本開示による例示的な分枝リンカー2-ペイロード(BL2P)の構造を提供する。
下記の表11は、本開示による例示的な分枝リンカー2-ペイロード(BL2P)の化学特性を提供する。
実施例3:vcPAB-カルバメートリンカーペイロードの合成
リンカーペイロードLP1とLP2は、スキーム22、および下記の実施例3A~3C(LP1)と2D(LP2)に記載のとおりに合成した。出発材料L1-1(CAS2226472-26-8)とL2-3(CAS2226472-28-0)は、全体を参照により援用される国際公開第WO2018089373A2号に従い合成した。
実施例3A:N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(L1-2)
化合物L1-1(0.17g、0.33mmol)のDMF(10mL)溶液にDIPEA(0.13g、1.0mmol)とvcPAB(0.13g、0.34mmol)を連続添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~80%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物L1-2(0.18g、70%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:791.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.91(s,1H),8.11(d,J=8.4Hz,1H),7.89(d,J=8.8Hz,1H),7.61(t,J=5.6Hz,1H),7.55(d,J=8.4Hz,2H),7.23(d,J=8.4Hz,2H),5.98(t,J=5.6Hz,1H),5.42(s,2H),5.10(br s,1H),),4.43(s,2H),4.39-4.37(m,1H),4.30-4.21(m,2H),3.87(d,J=14.8Hz,1H),3.75(d,J=14.8Hz,1H),3.62-3.58(m,2H),3.50-3.46(m,12H),3.43(t,J=6.0Hz,2H),3.27-3.22(m,2H),3.06-2.92(m,2H),2.41-2.32(m,2H),2.26-2.05(m,3H),1.99-1.66(m,6H),1.62-1.55(m,3H),1.44-1.35(m,3H),0.89(d,J=6.8Hz,3H),0.83(d,J=6.8Hz,3H)ppm。
実施例3B:{4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチル4-ニトロフェニルカーボネート(L1-3)
化合物L1-2(80mg、0.10mmol)、DMAP(12mg、0.10mmol)、およびDIPEA(26mg、0.20mmol)の乾燥DMF(5mL)懸濁液を室温で10分間撹拌してから、ビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(61mg、0.20mmol)を添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~80%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物L1-3(53mg、55%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:956.3(M+H)+。
実施例3C:{4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP1)
化合物L1-3(16mg、17μmol)とP3(12mg、17μmol)の乾燥DMF(2mL)黄色溶液にDIPEA(6.5mg、51μmol)を添加し、透明になった反応溶液を室温で2時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~60%のアセトニトリル)により直接精製することで、リンカーペイロードLP1(TFA塩として15mg、63%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:698.8(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.80(t,J=6.8Hz,1H),8.50(d,J=9.2Hz,1H),8.12(d,J=7.2Hz,1H),7.87(d,J=8.8Hz,1H),7.79(d,J=10.8Hz,1H),7.62-7.58(m,3H),7.42(t,J=6.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.28(d,J=8.4Hz,2H),6.53(br s,1H),5.98(t,J=5.2Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.46-5.37(m,3H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J=6.4Hz,2H),4.41-4.35(m,1H),4.29-4.21(m,2H),4.02(s,2H),3.87(d,J=14.4Hz,1H),3.75(d,J=14.8Hz,1H),3.63-3.58(m,4H),3.50-3.48(m,12H),3.46-3.41(m,2H),3.27-3.24(m,2H),3.23-3.12(m,2H),3.07-2.91(m,2H),2.47-2.45(m,0.5H),2.41-2.33(m,4.5H),2.25-2.04(m,5H),1.99-1.69(m,9H),1.63-1.54(m,3H),1.44-1.33(m,3H),0.88-0.82(m,9H)ppm。(TFAのプロトンは観察されなかった)。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-74(TFA),-111(Ar-F)ppm。
実施例3D:{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサエン(hexaen)-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP2)
L1-3をL2-3に置き換えてLP1の作製手順に従い、リンカーペイロードLP2(12mg、46%の収率)を、逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のメタノール)による精製後、ラクトン生成物(LP2、上記図)と開環生成物(LP2-RO、下記図)との混合物を白色固形物として得た。
ラクトンLP2:HPLC純度:67%、保持時間:7.41分、ESI m/z:507.3(M/3+H)+、760.5(M/2+H)+;開環生成物LP2-RO:HPLC純度:33%、保持時間:6.61分、ESI m/z:513.3(M/3+H)+、769.5(M/2+H)+。
ラクトン生成物と開環生成物との混合物 1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.80(t,J=6.4Hz,1H),8.50(d,J=8.8Hz,1H),8.12(d,J=7.2Hz,1H),7.87(d,J=8.4Hz,1H),7.80-7.75(m,2H),7.69-7.67(m,1H),7.63-7.58(m,3H),7.51-7.46(m,3H),7.45-7.33(m,3H),7.32-7.26(m,4H),6.53(s,1H),5.98(t,J=6.0Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.42(s,4H),5.21(s,2H),5.03(d,J=14.0Hz,1H),4.93(s,2H),4.63(d,J=6.8Hz,2H),4.41-4.35(m,1H),4.25-4.21(m,1H),4.02(s,2H),3.62-3.57(m,5H),3.48-3.45(m,12H),3.31-3.28(m,2H),3.23-3.14(m,2H),3.11-3.07(m,2H),3.05-2.98(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.60-2.55(m,1H),2.46-2.44(m,1H),2.39(s,3H),2.35-2.33(m,1H),2.26-2.15(m,3H),2.03-1.94(m,2H),1.88-1.67(m,4H),1.63-1.57(m,1H),1.46-1.33(m,2H),0.88-0.81(m,9H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
リンカーペイロードLP16とLP17は、スキーム3、および下記の実施例3E~3F(LP16)と3G(LP17)に記載のとおりに合成した。
実施例3E:{4-[(2S)-2-[(2S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP16-1)
ペイロードP3(0.11g、0.15mmol)のDMF(2mL)溶液にDIPEA(39mg、0.30mmol)とFmoc-vcPAB-PNP(CAS:863971-53-3、77mg、0.10mmol)を添加し、反応混合物を透明になるまで室温で1時間撹拌し、PはLCMSにより完全に消費した。得られた溶液を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~70%のアセトニトリル)により分離することで、Fmoc-LP16-1(98mg、ESI m/z:494(MDXD+H)+、714.2(M-MDXD+H)+を淡黄色固形物として得て、これを乾燥DMF(4.5mL)に溶解した。この溶液にジエチルアミン(0.5mL)をゆっくり添加し、FmocがLCMSにより完全に除去されるまで反応混合物を室温で2時間撹拌した。揮発物を真空下で除去し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~40%のアセトニトリル)により精製することで、LP16-1(TFA塩、45mg、P3から41%の収率)を得た。ESI m/z:493.1(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.20(s,1H),8.80(t,J=6.8Hz,1H),8.68(d,J=7.6Hz,1H),8.50(d,J=8.8Hz,1H),8.09-8.01(m,3H),7.79(d,J=10.8Hz,1H),7.58(d,J=8.4Hz,2H),7.41(t,J=6.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.29(d,J=8.4Hz,2H),6.53(s,1H),6.05(t,J=5.6Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.54-5.45(m,2H),5.42-5.41(m,2H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J=6.4Hz,2H),4.55-4.50(m,1H),4.02(s,2H),3.69-3.61(m,3H),3.24-3.12(m,1H),3.08-2.94(m,2H),2.40(s,3H),2.23-2.18(m,2H),2.14-2.03(m,1H),1.90-1.81(m,2H),1.78-1.68(m,1H),1.64-1.53(m,1H),1.47-1.36(m,2H),0.96(d,J=3.2Hz,3H),0.94(d,J=3.2Hz,,3H),0.87(t,J=7.6Hz,3H)ppm。(TFAのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δat -111,-73ppm。
実施例3F:{4-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-アミノ-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド)-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP16)
LP16-1(16mg、15μmol)の無水DMF(1mL)溶液に、pH値が8.0~9.0の間になるまでDIPEA(4mg、29μmol)を添加した後、化合物If(CAS1314378-14-7、9mg、15μmol)の無水DMF(1mL)溶液を反応溶液に添加した。出発材料がLCMSにより完全に消費するまで、混合物を室温で1時間撹拌した。得られた溶液を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により分離することで、LP16f(18mg、ESI m/z:728.3(M/2+H)+)を白色固形物として得て、これを無水DMF(1.9mL)に溶解した。この溶液にジエチルアミン(0.1mL)を添加し、黄色くなった反応溶液を、FmocがLCMSにより完全に除去されるまで室温で30分間撹拌した。得られた溶液を真空下で濃縮し、残渣を分取HPLC(ギ酸水溶液(0.01%)中、10~95%のアセトニトリル)により精製することで、リンカーペイロードLP16(6mg、34%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:616.9(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.03(s,1H),8.80(d,J=6.8Hz,1H),8.51(d,J=9.2Hz,1H),8.41(s,1H),8.15(d,J=6.8Hz,1H),7.90(d,J=8.8Hz,1H),7.79(d,J=6.8Hz,1H),7.60(d,J=8.0Hz,2H),7.42(t,J=6.4Hz,1H),7.32(s,1H),7.27(d,J=8.0Hz,2H),6.56-6.50(m,1H),6.05-6.01(m,1H),5.63-5.58(m,1H),5.43(s,4H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J=6.8Hz,2H),4.42-4.35(m,1H),4.23(t,J=7.6Hz,1H),4.02(s,2H),3.63-3.58(m,4H),3.53-3.49(m,12H),3.46-3.43(m,2H),3.18-3.15(m,2H),3.06-2.93(m,2H),2.79-2.76(m,2H),2.42-2.36(m,5H),2.24-2.12(m,2H),2.03-1.93(m,1H),1.89-1.81(m,2H),1.74-1.65(m,1H),1.65-1.54(m,1H),1.48-1.31(m,3H),0.89-0.82(m,9H)ppm。19F NMR(400MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
実施例3G:{4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-{1-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)プロパンアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP17)
LP16-1(30mg、30μmol)の無水DMF(1.5mL)黄色溶液に、DIPEA(8mg、62μmol)とIa(CAS:756525-99-2、市販、16mg、30μmol)を添加し、出発材料がLCMSにより完全に消費するまで反応混合物を室温で1時間撹拌した。得られた混合物を分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、LP17(TFA塩、15mg、38%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:692.4(M/2+H)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.79(t,J=6.8Hz,1H),8.50(d,J=8.4Hz,1H),8.11(d,J=8.0Hz,1H),8.02(t,J=6.0Hz,1H),7.87(d,J=8.8Hz,1H),7.79(d,J=10.8Hz,1H),7.59(d,J=8.4Hz,2H),7.41(t,J=6.0Hz,1H),7.32(s,1H),7.28(d,J=8.4Hz,2H),7.00(s,2H),6.52(br s,1H),5.98(t,J=6.0Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.43-5.41(m,4H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J=6.8Hz,2H),4.43-4.34(m,1H),4.25-4.21(m,1H),4.02(s,2H),3.61-3.57(m,6H),3.49-3.48(m,12H),3.21-3.12(m,4H),3.05-2.91(m,4H),2.49-2.39(m,5H),2.33(t,J=7.2Hz,2H),2.22-2.14(m,2H),2.02-1.94(m,1H),1.89-1.80(m,2H),1.75-1.65(m,1H),1.65-1.54(m,1H),1.49-1.32(m,2H),0.87-0.82(m,9H)ppm。(TFAのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111,-73ppm。
リンカーペイロードLP1、LP2、LP13、LP14、LP15、LP19、LP20、LP21、およびLP22は、スキーム4、および下記の実施例3H~3ARに記載のとおりに合成した。
実施例3H:メチル(4R)-4-アミノ-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタノエート(DEvcPAB)
vcPAB(0.25g、0.95mmol)のDMF(3mL)溶液にDIPEA(0.37g、2.9mmol)とHATU(0.25g、0.95mmol)を添加し、混合物を室温で10分間撹拌してからBoc-DGlu(OMe)-OH(0.40g、1.1mmol)を添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~70%のアセトニトリル)により精製することでBoc-DEvcPAB(0.35g、ESI m/z:623.4(M+H)+)を白色固形物として得て、これをDCM(5mL)に溶解した。溶液にTFA(1.5mL)を添加し、Bocが完全に除去されるまで反応混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発物を真空下で除去し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、10~40%のアセトニトリル)により精製することで、DEvcPAB(0.27g、48%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:523.4(M+H)+。
実施例3I:メチル(4S)-4-アミノ-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタノエート(LEvcPAB)
Boc-DGlu(OMe)-OHの代わりにBoc-LGlu(OMe)-OHを用いる以外、DEvcPABと同様の手順に従い、中間体LEvcPAB(0.18g、49%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:523.3(M+H)+,545.3(M+Na)+。
実施例3J:LP#-2の一般手順と、LP13-2、LP16-2、LP1-2、およびLP2-2の合成
LP13-1、LP16-1、LP1-1、またはLP2-1(1.0当量)のDMF(0.25mM)溶液にDIPEA(3.3当量)とHATU(1.0当量)を添加し、混合物を室温で10分間撹拌してから、vcPABまたはEvcPAB(1.1~1.5当量)を添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、リンカーLP#-2(LP13-2、LP16-2、LP1-2、またはLP2-2)を白色固形物として得た。
実施例3K:(9H-フルオレン-9-イル)メチルN-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバメート(LP13-2)
vcPAB(0.85g、2.2mmol)とLP13-1(0.60g、1.5mmol)を用いる一般手順に従い、化合物LP13-2(1.0g、87%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:761.3(M+H)+,783.3(M+Na)+。
実施例3L:メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタノエート(LP14-2)
LP14-1(0.19g、0.37mmol)とDEvcPAB(0.14g、0.34mmol)から始まる一般手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~70%のアセトニトリル)による精製後、リンカーLP14-2(0.20g、66%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:904.4(M+H)+。
実施例3M:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタノエート(LP15-2)
LP13-1(0.45g、1.1mmol)とLEvcPAB(0.65g、1.2mmol)から始まる一般手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~100%のアセトニトリル)による精製後、リンカーLP15-2(0.70g、69%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:904.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.94(s,1H),8.15-8.07(m,2H),7.91-7.87(m,2H),7.78(d,J=8.8Hz,1H),7.69(d,J=7.2Hz,2H),7.55-7.52(m,2H),7.41(t,J=7.6Hz,2H),7.35-7.30(m,3H),7.23(d,J=8.4Hz,2H),6.00-5.93(m,1H),5.42(bs,1H),4.42(s,2H),4.39-4.34(m,2H),4.31-4.27(m,2H),4.24-4.16(m,2H),3.60-3.56(m,5H),3.47(s,3H),3.36-3.34(m,2H),3.14-3.10(m,2H),3.04-3.00(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.44-2.38(m,2H),2.35-2.29(m,4H),2.00-1.95(m,1H),1.92-1.86(m,1H),1.77-1.66(m,2H),1.61-1.55(m,1H),1.46-1.34(m,2H),1.25-1.18(m,1H),0.87-0.80(m,6H)ppm。
実施例3N:N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]-1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP1-2)
LP1-1とvcPAB(3.3g、8.0mmol)から始まる一般手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~100%のアセトニトリル)による精製後、リンカーLP1-2(4.3g、68%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:791.5(M+H)+。
実施例3O:メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-[1-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]ブタノエート(LP19-2)
DEvcPAB(0.17g、0.34mmol)とLP16-1(0.17g、0.34mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP19-2(0.18g、53%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:993.5(M+H)+。
実施例3P:メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}ブタノエート(LP20-2)
DEvcPAB(0.28g、0.54mmol)とLP1-1(0.25g、0.48mmol)から始まる一般手順に従い、化合物LP20-2(0.20g、44%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:934.5(M+H)+。
実施例3Q:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-[1-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]ブタノエート(LP21-2)
LEvcPAB(0.20g、0.38mmol)とLP16-1(0.19g、0.39mmol)から始まる一般手順に従い、化合物LP21-2(0.20g、53%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:992.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.94(s,1H),8.13(d,J=7.2Hz,1H),8.08(d,J=7.6Hz,1H),7.89(d,J=7.2Hz,2H),7.77(d,J=8.4Hz,1H),7.70(d,J=7.6Hz,2H),7.54(d,J=8.4Hz,2H),7.44-7.39(m,2H),7.35-7.31(m,3H),7.23(d,J=8.4Hz,2H),5.98(brs,1H),5.41(br s,1H),4.43(s,2H),4.39-4.33(m,2H),4.31-4.29(m,2H),4.23-4.17(m,2H),3.63-3.57(m,6H),3.50-3.46(m,12H),3.41(t,J=6.0Hz,2H),3.16-3.10(m,2H),3.10-3.00(m,1H),2.99-2.89(m,1H),2.40-2.30(m,4H),2.02-1.87(m,2H),1.78-1.55(m,3H),1.48-1.32(m,2H),0.86(d,J=6.8Hz,3H),0.83(d,J=6.8Hz,3H)ppm。(ベンジルアルコールのプロトンは明らかにならなかった)
実施例3R:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}ブタノエート(LP22-2)
LEvcPAB(0.10g、0.19mmol)とLP1-1(81mg、0.19mmol)から始まる一般手順に従い、化合物LP22-2(0.11g、63%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:934.5(M+H)+。
実施例3S:LP#-3の一般手順
LP#-2(1.0当量)のDMF(0.15mM)溶液に、DMAP(1.0当量)、DIPEA(3.0当量)、およびビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(3.0当量)を添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~60%のアセトニトリル)により精製することで、LP#-3を淡黄色オイルとして得た。
実施例3T:{4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチル4-ニトロフェニルカーボネート(LP13-3)
LP13-2(0.50g、0.66mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP13-3(0.40g、68%の収率)を淡黄色オイルとして得て、大気中で固化した。ESI m/z:926.5(M+H)+,948.4(M+Na)+。
実施例3U:メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタノエート(LP14-3)
LP14-2(0.20g、0.22mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP14-3(0.18g、77%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1069.2(M+H)+。
実施例3V:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタノエート(LP15-3)
LP15-2(0.70g、0.77mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP15-3(0.50g、61%の収率)を淡黄色オイルとして得た。ESI m/z:1069.5(M+H)+。
実施例3W:{4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチル4-ニトロフェニルカーボネート(LP1-3)
LP1-2(2.3g、2.9mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP1-3(1.9g、69%の収率)を淡黄色オイルとして得た。ESI m/z:978.5(M+Na)+。
実施例3X メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-[1-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]ブタノエート(LP19-3)
LP19-2(0.18g、0.18mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP19-3(0.18g、86%の収率)を淡黄色オイルとして得た。ESI m/z:1157.5(M+H)+。
実施例3Y:メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}ブタノエート(LP20-3)
LP20-2(0.20g、0.21mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP20-3(0.20g、85%の収率)を黄色固形物として得た。ESI m/z:1099.6(M+H)+。
実施例3Z:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-[1-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]ブタノエート(LP21-3)
LP21-2(0.20g、0.20mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP21-3(0.19g、81%の収率)を淡黄色オイルとして得た。ESI m/z:1157.4(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.11(s,1H),8.32(d,J=8.8Hz,2H),8.17(d,J=7.2Hz,1H),8.09(d,J=8.0Hz,1H),7.89(d,J=7.6Hz,2H),7.77(d,J=8.4Hz,1H),7.69(d,J=7.2Hz,2H),7.65(d,J=8.4Hz,2H),7.57(d,J=9.2Hz,2H),7.44-7.40(m,4H),7.35-7.31(m,3H),5.99(br s,1H),5.42(br s,1H),5.25(s,2H),4.42-4.36(m,2H),4.29(d,J=6.8Hz,2H),4.23-4.17(m,2H),3.61-3.57(m,6H),3.50-3.46(m,12H),3.41(t,J=6.0Hz,2H),3.16-3.11(m,2H),3.12-3.00(m,1H),3.00-2.89(m,1H),2.40-2.30(m,4H),2.01-1.88(m,2H),1.80-1.56(m,3H),1.50-1.33(m,2H),0.87(d,J=6.8Hz,3H),0.83(d,J=6.8Hz,3H)ppm。
実施例3AA:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}ブタノエート(LP22-3)
LP08b-2(0.10g、0.11mmol)から始まる一般手順に従い、リンカーLP08b-3(71mg、60%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:550.5(M/2+H)+。
実施例3AB:LP1、LP2、およびLP#-4の一般手順
LP#-3(1.0~1.2当量)のDMF(0.15mM)溶液に、HOBt(0.5当量)、DIPEA(3.0当量)、およびペイロードP(1.0当量)を添加し、反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィーにより直接精製することで、LP1、LP2、またはLP#-4を白色固形物として得た。
実施例3AC:{4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP1)
ペイロードP3(0.85g、1.2mmol)とLP1-3(1.2g、1.2mmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(ギ酸水溶液(0.1%)中、5~60%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP1(1.1g、62%の収率、ギ酸塩)を白色固形物として得た。ESI m/z:699.0(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.00(s,1H),8.80(t,J=6.4Hz,1H),8.51(d,J=8.8Hz,1H),8.13(d,J=7.6Hz,1H),7.90(d,J=8.8Hz,1H),7.79(d,J=10.8Hz,1H),7.65-7.50(m,3H),7.43(t,J=6.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.27(d,J=8.8Hz,2H),6.54(s,1H),5.98(t,J=5.2Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.41(s,4H),5.21(s,2H),4.92(s,2H),4.62(d,J=6.4Hz,2H),4.43-4.33(m,1H),4.31-4.17(m,2H),4.01(s,2H),3.86(d,J=14.4Hz,1H),3.75(d,J=14.8Hz,1H),3.67-3.46(m,15H),3.44-3.39(m,2H),3.27-3.10(m,4H),3.06-2.90(m,2H),2.47-2.32(m,5H),2.26-1.64(m,14H),1.63-1.52(m,3H),1.47-1.32(m,3H),0.90-0.80(m,9H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
実施例3AD:{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP2)
ペイロードP3(10mg、17μmol)とLP2-3(CAS 2226472-28-0、国際公開第WO2018089373号に従い合成、18mg、17μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、5~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP2(12mg、46%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:513.4(M/3+H)+,Rt=HPLC中で6.63分(E-開環形態、34%);507.4(M/3+H),760.5(M/2 +H),Rt=HPLC中で7.45分(ラクトン形態、64%)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.80(t,J=6.4Hz,1H),8.50(d,J=8.8Hz,1H),8.12(d,J=7.2Hz,1H),7.87(d,J=8.4Hz,1H),7.80-7.75(m。2H),7.69-7.67(m,1H),7.63-7.58(m,3H),7.51-7.46(m,3H),7.45-7.33(m,3H),7.32-7.26(m,4H),6.53(s,1H),5.98(t,J=6.0Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.42(s,4H),5.21(s,2H),5.03(d,J=14.0Hz,1H),4.93(s,2H),4.63(d,J=6.8Hz,2H),4.41-4.35(m,1H),4.25-4.21(m,1H),4.02(s,2H),3.62-3.57(m,5H),3.48-3.45(m,12H),3.31-3.28(m,2H),3.23-3.14(m,2H),3.11-3.07(m,2H),3.05-2.98(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.60-2.55(m,1H),2.46-2.44(m,1H),2.39(s,3H),2.35-2.33(m,1H),2.26-2.15(m,3H),2.03-1.94(m,2H),1.88-1.67(m,4H),1.63-1.57(m,1H),1.46-1.33(m,2H),0.88-0.81(m,9H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
実施例3AE:(9H-フルオレン-9-イル)メチルN-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバメート(LP13-4)
LP13-3(0.10g、0.11mmol)とペイロードP3(77mg、0.11mmol)から始まる一般手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中で10分間、0~100%のアセトニトリル、次いで5分間、100%のアセトニトリル)による精製後、化合物LP13-4(0.12g、78%の収率)を淡黄色オイルとして得た。ESI m/z:684.0(M/2+H)+。
実施例3AF:メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタノエート(LP14-4)
LP14-3(0.12g、0.11mmol)とペイロードP3(64mg、0.11mmol)から始まる一般手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~60%のアセトニトリル)による精製後、化合物LP14-4(0.13g、78%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:755.7(M/2+H)+。
実施例3AG:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタノエート(LP15-4)
LP15-3(0.50g、0.47mmol)とP3(0.22g、0.38mmol)から始まる一般手順に従い、化合物LP15-4(0.40g、56%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:755.5(M/2+H)+。
実施例3AH:メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-[1-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]ブタノエート(LP19-4)
LP19-3(80mg、69μmol)とペイロードP3(40mg、69μmol)から始まる一般手順に従い、化合物LP19-4(70mg、64%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:799.5(M/2+H)+。
実施例3AI:メチル(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}ブタノエート(LP20-4)
LP20-3(95mg、86μmol)とペイロードP3(58mg、0.10mmol)から始まる一般手順に従い、化合物LP20-4(60mg、45%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:770.6(M/2+H)+。
実施例3AJ:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-[1-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド]ブタノエート(LP21-4)
LP21-3(58mg、50μmol)とペイロードP3(35mg、50μmol)から始まる一般手順に従い、化合物LP21-4(51mg、64%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:799.8(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(s,1H),8.80(t,J=6.4Hz,1H),8.51(d,J=8.4Hz,1H),8.16(d,J=7.6Hz,1H),8.09(d,J=7.6Hz,1H),7.88(d,J=7.6Hz,2H),7.78(d,J=10.8Hz,2H),7.69(d,J=7.2Hz,2H),7.58(d,J=8.8Hz,2H),7.44-7.39(m,3H),7.34-7.31(m,4H),7.27(d,J=8.4Hz,2H),6.53(br s,1H),5.99(br s,1H),5.62-5.57(m。1H),5.42(s,2H),5.46-5.37(m。1H),5.20(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J=5.6Hz,2H),4.41-4.33(m,2H),4.30-4.28(m,2H),4.22-4.16(m,2H),4.02(s,2H),3.63-3.57(m,8H),3.50-3.46(m,12H),3.40(t,J=6.0Hz,2H),3.26-3.18(m,1H),3.15-3.10(m,3H),3.07-2.99(m,1H),2.99-2.90(m,1H),2.42-2.30(m,7H),2.21-2.14(m,2H),1.97-1.82(m,4H),1.77-1.59(m,3H),1.54-1.32(m,2H),0.88-0.82(m,9H)ppm。
実施例3AK:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}ブタノエート(LP22-4)
LP22-3(80mg、73μmol)とペイロードP3(43mg、73μmol)から始まる一般手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~60%のアセトニトリル)による精製後、化合物LP22-4(60mg、60%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:770.5(M/2+H)+。
実施例3AL:{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパンアミド}-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP13)
LP13-4(0.12g、84μmol)の無水DMF(1.8mL)溶液にジエチルアミン(0.2mL)を添加し、FmocがLCMSにより完全に除去されるまで混合物を室温で1時間撹拌した。得られた溶液を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中で10分間、0~100%のアセトニトリル)により直接分離することで、LP13(50mg、52%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:573.0(M/2+H)+。
実施例3AM:(4R)-4-{3-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパンアミド}-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(LP14)
化合物LP14-4(0.10g、66μmol)のDMF(3mL)溶液にピペリジン(56mg、0.66mmol)を添加し、Fmocが除去されるまで混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応混合物に水酸化リチウム水溶液(0.2mM、1mL)とTHF(3mL)を添加し、メチルエステルがLCMSにより完全に加水分解されるまで混合物を室温でさらに1時間撹拌した。濾過後、得られた混合物をPBSバッファー(pH3.0)により酸性化してpH5.0とした後、真空下で濃縮した。残渣を分取HPLC(TFA水溶液(0.01%)中、10~95%のアセトニトリル)により精製することで、リンカーペイロードLP14(40mg、47%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:637.5(M/2+H)+。
実施例3AN:(4S)-4-{3-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパンアミド}-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(LP15)
LP14-4をLP15-4に置き換える以外LP14と同様の手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP15(50mg、14%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:637.4(M/2+H)+。
実施例3AO:(4R)-4-(1-アミノ-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(LP19)
LP14-4をLP19-4(60mg、38μmol)に置き換える以外LP14と同様の手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP19(12mg、24%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:681.5(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.80(s,1H),8.81(t,J=6.4Hz,1H),8.52(d,J=8.8Hz,1H),8.19-8.13(m,2H),8.08(d,J=8.4Hz,1H),7.81-7.75(m,3H),7.61(d,J=6.4Hz,2H),7.43(t,J=6.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.27(d,J=8.4Hz,2H),6.55(br s,1H),6.04-5.99(m,1H),5.64-5.57(m,1H),5.43-5.40(m,2H),5.20(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J=6.4Hz,2H),4.40-4.32(m,2H),4.23-4.19(m,1H),4.02(s,2H),3.63-3.60(m,4H),3.59-3.57(m,4H),3.56-3.54(m,3H),3.51-3.49(m,5H),3.01-2.95(m,4H),2.44-2.41(m,1H),2.39(s,3H),2.31-2.28(m,1H),2.26-2.21(m,3H),2.20-2.15(m,2H),2.09-2.01(m,2H),1.90-1.82(m,4H),1.78-1.72(m,2H),1.66-1.61(m,1H),1.50-1.41(m,2H),1.40-1.35(m,1H),0.90-0.82(m,11H)ppm。(COOHのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-73.70,-111.28ppm。
実施例3AP:(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}ブタン酸(LP20)
化合物LP20-4(60mg、39μmol)の水(1mL)とTHF(3mL)溶液に水酸化リチウム水溶液(0.12M、1mL)を添加し、メチルエステルが完全に加水分解されるまで反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。pH6.0になるまで混合物をPBSバッファー(pH4.0)により酸性化した後、真空下で濃縮した。残渣を分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)により精製することで、LP20(15mg、25%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:763.5(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.78(s,1H),8.80(t,J=6.8Hz,1H),8.51(t,J=8.8Hz,1H),8.18-8.12(m,2H),8.07(d,J=6.0Hz,1H),7.78(d,J=11.2Hz,1H),7.63-7.59(m,3H),7.43(t,J=6.0Hz,1H),7.32-7.22(m,4H),7.11-6.96(m,1H),6.61-6.45(br s,1H),6.02-5.96(m,1H),5.63-5.57(m,1H),5.44-5.38(m,3H),5.20(s,2H),4.92(s,2H),4.63(d,J=6.0Hz,2H),4.40-4.33(m,2H),4.29-4.25(m,1H),4.24-4.18(m,1H),4.01(s,2H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.63-3.60(m,2H),3.57-3.55(m,1H),3.51-3.47(m,8H),3.27-3.21(m,4H),3.17-3.12(m,1H),3.03-2.99(m,1H),2.97-2.93(m,1H),2.44-2.41(m,1H),2.39(br s,3H),2.28-2.14(m,7H),2.08-1.99(m,2H),1.94-1.81(m,6H),1.80-1.71(m,5H),1.63-1.54(m,3H),1.40-1.33(m,4H),0.90-0.81(m,11H)ppm。(酸とTFAのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(400MHz,DMSOd6)δ-73.86,-111.30ppm。
実施例3AQ:(4S)-4-(1-アミノ-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(LP21)
LP14-4をLP21-4(45mg、28μmol)に置き換える以外LP14と同様の手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP21(10mg、26%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:681.4(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.05(s,1H),8.81(t,J=7.2Hz,1H),8.52(d,J=8.4Hz,1H),8.19(d,J=7.6Hz,1H),8.09(d,J=8.0Hz,1H),7.81-7.68(m,5H),7.58(d,J=8.4Hz,2H),7.43(t,J=6.8Hz,1H),7.32(s,1H),7.27(d,J=8.4Hz,2H),6.54(brs,1H),6.03-5.97(m,1H),5.63-5.57(m,1H),5.48-5.42(m,3H),5.21(s,2H),4.92(s,2H),4.63(d,J=6.4Hz,2H),4.42-4.31(m,2H),4.22-4.17(m,1H),4.02(s,2H),3.62-3.55(m,8H),3.51-3.48(m,12H),3.20-3.12(m,2H),3.05-2.89(m,5H),2.40(s,3H),2.26-2.21(m,2H),2.20-2.12(m,2H),2.02-1.95(m,1H),1.90-1.80(m,3H),1.74-1.63(m,2H),1.59-1.54(m,1H),1.49-1.31(m,2H),0.88-0.82(m,9H)ppm。(COOHのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-73,-111ppm。
実施例3AR:(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}ブタン酸(LP22)
LP20-4をLP22-4(60mg、39μmol)に置き換える以外LP20と同様の手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP22(15mg、26%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:763.5(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.78(br s,1H),8.80(t,J=6.8Hz,1H),8.51(t,J=8.8Hz,1H),8.18-8.12(m,2H),8.07(d,J=6.0Hz,1H),7.78(d,J=11.2Hz,1H),7.63-7.59(m,3H),7.43(t,J=6.0Hz,1H),7.32-7.22(m,4H),7.11-6.96(m,1H),6.61-6.45(br s,1H),6.02-5.96(m,1H),5.63-5.57(m,1H),5.43-5.40(m,2H),5.20(s,2H),4.92(s,2H),4.63(d,J=6.0Hz,2H),4.40-4.33(m,2H),4.29-4.25(m,1H),4.23-4.18(m,1H),4.01(s,2H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.63-3.60(m,2H),3.57-3.55(m,1H),3.51-3.47(m,8H),3.46-3.45(m,2H),3.27-3.21(m,4H),3.17-3.13(m,1H),3.03-2.99(m,1H),2.97-2.93(m,1H),2.46-2.41(m,1H),2.39(s,3H),2.36-2.31(m,1H),2.27-2.16(m,7H),2.09-2.00(m,1H),2.00-1.81(m,7H),1.80-1.68(m,4H),1.62-1.54(m,3H),1.40-1.35(m,3H),0.90-0.81(m,11H)ppm。(COOHのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-73.86,-111.30ppm。
実施例4:ペプチドリンカーペイロードの合成
リンカーペイロードLP3、LP4、LP7/LP7’、およびLP9を、スキーム5、および下記の実施例4A~4Fに記載のとおりに合成した。
出発材料L3-2(CAS1353016-71-3)とL4-2(CAS1425803-45-7)はAccelaから市販で入手した。
実施例4A:2-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]アセトアミド}アセトアミド)酢酸(L3-3)
ペプチドL3-1(Gly-Gly-Gly-OH、0.34g、1.8mmol)のDMF(13mL)懸濁液に、L3-2(0.50g、1.8mmol)のTHF(6mL)とDIPEA(0.69g、5.4mmol)溶液を添加し、濁った混合物を室温で20時間撹拌した。混合物を濾過し、透明な濾液を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~20%のアセトニトリル)により精製することで、化合物L3-3(0.13g、21%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:354.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ12.6(s,1H),8.20(t,J=5.6Hz,1H),8.15(t,J=6.0Hz,1H),7.82(t,J=5.6Hz,1H),4.35-4.31(m,1H),3.94(d,J=14.8Hz,1H),3.83-3.73(m,7H),2.29-2.06(m,3H),1.99-1.93(m,1H),1.91-1.71(m,3H),1.63-1.56(m,2H),1.46-1.37(m,1H)ppm。
実施例4B:2-[2-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]アセトアミド}アセトアミド)アセトアミド]-N-[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]アセトアミド(LP3)
化合物L3-3(9.0mg、25μmol)の乾燥DMF(14mL)黄色溶液にDIPEA(9.0mg、70μmol)とHATU(10mg、26μmol)を添加し、混合物を室温で30分間撹拌してからペイロードP3(15mg、22μmol)を添加した。出発材料の大半がLCMSにより消費されるまで、反応混合物を室温で2時間撹拌した。得られた混合物を分取HPLC(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、リンカーペイロードLP3(8.0mg、36%の収率、TFA塩)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:915.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.68(t,J=6.6Hz,1H),8.51(d,J=8.8Hz,1H),8.25-8.12(m,3H),7.86-7.75(m,2H),7.31(s,1H),6.53(s,1H),5.59(s,1H),5.43(s,2H),5.20(s,2H),4.63(d,J=6.5Hz,2H),4.31(m,1H),4.01(s,2H),3.92(d,J=14.9Hz,1H),3.75(m,9H),3.18(s,2H),2.40(s,3H),2.26-2.02(m,5H),1.96-1.70(m,6H),1.63-1.53(m,2H),1.39(d,J=8.7Hz,1H),0.87(t,J=7.3Hz,3H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-74(TFA),-111(Ar-F)ppm。
実施例4C:(2S)-2-{2-[2-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)アセトアミド]アセトアミド}-3-フェニルプロパン酸(L4-3)
化合物L4-2(0.28g、0.69mmol)とペプチドL4-1(Gly-Gly-Phe-OH、0.19g、0.69mmol)のDMF(10mL)溶液にDIPEA(0.37mL、2.1mmol)を添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物L4-3(0.31g、78%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:567.0(M+H)+。
実施例4D:4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサン-10-イン-2-イル}-N-{[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]-2-フェニルエチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}-4-オキソブタンアミド(LP4)
L3-3をL4-3に置き換える以外LP3の作製手順に従い、分取HPLC(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のアセトニトリル)による精製後、開環ラクトンLP4-RO(14mg、56%の収率)を含むリンカーペイロードと、含まないリンカーペイロードLP4を白色固形物として得た。
ラクトン:HPLC純度:75%,保持時間:7.93分、ESI m/z:1128.3(M+H)+,564.8(M/2+H)+;開環生成物:HPLC純度:20%,保持時間:6.94分、ESI m/z:1169.4(M+Na)+,1146.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.62(s,1H),8.50(d,J=8.8Hz,1H),8.28(s,1H),8.18-7.91(m,3H),7.78(d,J=11.5Hz,1H),7.70-7.58(m,2H),7.50-7.38(m,3H),7.29(m,3H),7.24-7.11(m,5H),6.51(s,1H),5.58(s,1H),5.41(s,1H),5.19(s,1H),4.99(d,J=13.8Hz,1H),4.62(d,J=6.1Hz,2H),4.46(s,1H),4.01(s,2H),3.70(m,3H),3.56(m,3H),3.22-3.06(m,2H),2.99(m,2H),2.75(m,1H),2.67(m,1H),2.38(m,3H),2.33(m,4H),2.17(m,2H),2.07(m,2H),1.95-1.70(m,2H),0.86(t,J=7.2Hz,3H)ppm。
実施例4E:2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)-N-{[({[({2-[2-({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)ピロリジン-1-イル]-2-オキソエチル}カルバモイル)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}アセトアミド(ジアステレオマー1、LP7と、ジアステレオマー2、LP7’)
P3をP4に置き換える以外LP3の手順に従い、分取HPLC(アンモニア(0.05%v)を含む重炭酸アンモニウム水溶液(8mM)中、0~100%のアセトニトリル)による精製後、ジアステレオマーLP7(開環ラクトン生成物を含むものと含まないもの、3.0mg、7%の収率)とLP7’(開環ラクトン生成物を含むものと含まないもの、4.0mg、9.3%の収率)を白色固形物として別々に得た。
LP7:ラクトン:HPLC純度:11%,保持時間:6.87分、ESI m/z:955.3(M+H)+,開環生成物:HPLC純度:89%,保持時間:5.91分、ESI m/z:996.5(M+Na)+ 1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.71-8.57(m,1H),8.30-8.13(m,2H),7.99-7.70(m,3H),7.32-6.67(m,2H),5.63-5.48(m,1H),5.43-5.01(m,5H),4.36-4.27(m,1H),4.21-3.68(m,10H),2.40-2.24(m,4H),2.14-1.33(m,22H),1.14-0.97(m,2H),0.89-0.84(m,3H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111,-112ppm。
LP7’:ラクトン:HPLC純度:21%,保持時間:6.98分、ESI m/z:955.3(M+H)+,開環生成物:HPLC純度:79%,保持時間:6.02分、ESI m/z:996.5(M+Na)+ 1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.60-8.55(m,1H),8.31-7.69(m,5H),7.32-7.21(m,1H),6.66-6.53(m,1H),5.64-5.56(m,1H),5.43-5.09(m,5H),4.32-4.30(m,1H),4.16-4.02(m,2H),3.98-3.89(m,2H),3.82-3.55(m,6H),2.40-2.31(m,4H),2.22-1.36(m,22H),1.15-0.98(m,2H),0.89-0.84(m,3H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111,-112ppm。
実施例4F:2-[2-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]アセトアミド}アセトアミド)アセトアミド]-N-[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]アセトアミド(LP9)
化合物L3-3(実施例4A)(9.0mg、25μmol)の乾燥DMF(14mL)黄色溶液に、DIPEA(9.0mg、70μmol)とHATU(10mg、26μmol)を添加し、混合物を室温で30分間撹拌してから、ペイロードP(15mg、22μmol)を添加した。出発材料の大半がLCMSにより消費されるまで、反応混合物を室温で2時間撹拌した。得られた混合物を分取HPLC(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、リンカーペイロードLP9(8.0mg、36%の収率、TFA塩)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:915.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.68(t,J=6.6Hz,1H),8.51(d,J=8.8Hz,1H),8.25-8.12(m,3H),7.86-7.75(m,2H),7.31(s,1H),6.53(s,1H),5.59(s,1H),5.43(s,2H),5.20(s,2H),4.63(d,J=6.5Hz,2H),4.31(m,1H),4.01(s,2H),3.92(d,J=14.9Hz,1H),3.75(m,9H),3.18(s,2H),2.40(s,3H),2.26-2.02(m,5H),1.96-1.70(m,6H),1.63-1.53(m,2H),1.39(d,J=8.7Hz,1H),0.87(t,J=7.3Hz,3H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-74(TFA),-111(Ar-F)ppm。
実施例5:酸感受性リンカーペイロードの合成
リンカーペイロードLP8を、スキーム6、および以下に記載するように合成した。
出発材料L2-1(CAS1427004-19-0)はAccelaから市販で入手した。
1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-N-{2-[2-({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)ピロリジン-1-イル]-2-オキソエチル}-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP8)
ペイロードP4(6.2mg、10μmol)のDMF(1.0mL)溶液に化合物L2-1(6.5mg、10μmol)とDIPEA(3.9mg、30μmol)を添加し、反応混合物を室温で2時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、5~95%のアセトニトリル)により直接精製することで、リンカーペイロードLP8(ラクトン開環生成物を含むもの、3.0mg、26%の収率)を黄色固形物として得た。
ラクトン:HPLC純度:80%,保持時間:8.12分、ESI m/z:577.6(M/2+H)+;開環生成物:HPLC純度:20%,保持時間:6.91分、ESI m/z:586.7(M/2+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.74-7.67(m,2H),7.63-7.58(m,1H),7.56-7.52(m,1H),7.44-7.36(m,3H),7.32-7.20(m,4H),6.60-6.44(m,1H),5.56-5.49(m,1H),5.34(s,2H),5.28-5.16(m,1H),5.11-5.06(m,1H),4.98-4.92(m,1H),4.10-3.91(m,2H),3.75-3.74(m,1H),3.55-3.50(m,3H),3.40-3.37(m,13H),3.22-3.16(m,5H),3.02-2.99(m,3H),2.54-2.48(m,2H),2.31(d,J=2.8Hz,2H),2.22-2.11(m,4H),1.96-1.88(m,4H),1.82-1.72(m,2H),1.67-1.64(m,2H),1.01(t,J=7.2Hz,2H),0.92(t,J=7.2Hz,2H),0.82-0.76(m,3H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
実施例6:グルコースリンカーペイロードの合成
リンカーペイロードLP5とLP6を、下記のスキーム7A~7B、および実施例6A~6Nに記載するように合成した。
実施例6A:N-(2-アミノエチル)-2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド(L5-1)
エチレンジアミン(0.71g、12mmol)のDMF(2.0mL)溶液にDIPEA(0.30g、2.4mmol)と、化合物L3-2(0.33g、1.2mmol)のDMF(3.0mL)溶液をゆっくり添加し、混合物を室温で30分間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(0.8mM)中、0~100%のアセトニトリル)により精製することで、化合物L5-1(0.18g、68%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:225.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.74-7.63(m,1H),4.28(t,J=5.8Hz,1H),3.88-3.73(m,2H),3.11-3.00(m,4H),2.58(t,J=6.4Hz,2H),2.27-2.06(m,3H),1.94-1.71(m,4H),1.66-1.54(m,2H),1.45-1.33(m,1H)ppm。
実施例6B:メチル(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-トリス(アセチルオキシ)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン-2-カルボキシレート(L5-3)
化合物L5-2(全体を参照により本明細書に援用される国際公開第WO2018182341A1号に従い合成)(0.11g、0.23mmol)とHATU(96mg、0.25mmol)の乾燥DMF(4mL)混合物に化合物L5-1(51mg、0.23mmol)とDIPEA(89mg、0.69mmol)を添加し、L5-2が完全に消費するまで反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物L5-3(0.14g、90%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:691.4(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06-8.04(m,1H),7.64-7.59(m,1H),7.50-7.47(m,1H),7.22-7.18(m,1H),7.01-6.98(m,1H),5.44-5.28(m,5H),4.68(s,2H),4.30-4.21(m,2H),4.10-4.06(m,1H),3.93-3.88(m,1H),3.75(s,3H),3.67-3.48(m,2H),2.21-2.07(m,15H),1.93-1.79(m,3H),1.70-1.38(m,3H)ppm。
実施例6C:メチル(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-トリス(アセチルオキシ)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-{[(4-ニトロフェノキシカルボニル)オキシ]メチル}フェノキシ]オキサン-2-カルボキシレート(L5-4)
化合物L5-3(0.14g、0.20mmol)のDMF(2.0mL)溶液に、ビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(55mg、0.18mmol)とDIPEA(26mg、0.20mmol)を、窒素下、0℃で添加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌後、室温で3時間撹拌した。反応混合物を(10mL)で希釈し、酢酸エチル(20mLで3回)で抽出した。組み合わせた有機溶液をブライン(10mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中、40~60%の酢酸エチル)により精製することで、化合物L5-4(85mg、49%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:856.0(M+H)+。
実施例6D:メチル(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-トリス(アセチルオキシ)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェノキシ]オキサン-2-カルボキシレート(L5-5)
化合物L5-4(17mg、20μmol)のDMF(1.0mL)溶液にP3(12mg、20μmol)、HOBt(2.7mg、20μmol)、およびDIPEA(5.1mg、40μmol)を添加した。反応混合物を室温で16時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物L5-5(13mg、20%の収率)を黄色固形物として得た。ESI m/z:649.0(M/2+H)+。
実施例6E:(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェノキシ]-3,4,5-トリヒドロキシオキサン-2-カルボン酸(LP5)
化合物L5-5(13mg、10μmol)のメタノール(2mL)混合物に水酸化リチウム水溶液(0.1M、2mL)を添加し、混合物を室温で1時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。HCl水溶液(1N)でクエンチしてpH4にした後、得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、5~95%のアセトニトリル)により精製することで、リンカーペイロードLP5(5mg、43%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1156.3(M+H)+。
実施例6F:[(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-トリス(アセチルオキシ)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-(ヒドロキシメチル)フェノキシ]オキサン-2-イル]メチルアセテート(L6-3)
L5-2をL6-2に置き換える以外L5-3の作製手順に従い、化合物L6-3(0.10g、80%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:705.3(M+H)+。
実施例6G:[(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-トリス(アセチルオキシ)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-{[(4-ニトロフェノキシカルボニル)オキシ]メチル}フェノキシ]オキサン-2-イル]メチルアセテート(L6-4)
L5-3をL6-3に置き換える以外L5-4の作製手順に従い、化合物L6-4(62mg、50%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:870.3(M+H)+。
実施例6H:[(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-トリス(アセチルオキシ)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェノキシ]オキサン-2-イル]メチルアセテート(L6-5)
L5-4をL6-4に置き換える以外L5-5の作製手順に従い、化合物L6-5(30mg、66%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:655.7(M/2+H)+。
実施例6I:[3-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]オキシ}フェニル]メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP6)
L5-5をL6-5に置き換える以外LP5の作製手順に従い、リンカーペイロードLP6(9mg、34%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1142.3(M+H)+。
実施例6J:ベンジル2-({2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)アセトアミド]アセトアミド}メトキシ)アセテート(GP-2)
化合物GP-1(CAS:1599440-07-9、国際公開第WO2014057687号に従い合成、0.20g、0.42mmol)のDMF(5mL)溶液にジエチルアミン(0.15g、2.1mmol)を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(0.05%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接分離することで白色固形物(0.1g、ESI m/z:253.1)を得て、これをFmoc-グリシン(0.14g、0.48mmol)とHATU(0.23g、0.59mmol)のDMF(5mL)混合物に添加し、続いてDIPEA(0.15g、0.59mmol)を添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物GP-2(0.14g、64%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:554.3(M+Na)+。
実施例6K:2-({2-[2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)アセトアミド]アセトアミド}メトキシ)酢酸(GP-3)
化合物GP-2(0.10g、0.19mmol)の酢酸エチル(10mL)溶液にパラジウム炭素(0.10g)を窒素保護下で添加した。反応混合物を水素バルーン下、室温で4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物をセライトに通して濾過し、濾液を真空下で濃縮することで、化合物GP-3(56mg、65%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z(weak):464.0(M+Na)+。
実施例6L:2-アミノ-N-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)アセトアミド(Gly-P3)
化合物GP-3(41mg、93μmol)の乾燥DMF(5mL)溶液に、HATU(39mg、0.10mmol)、エクサテカン(メシレート、41mg、93μmol)、およびDIPEA(36mg、0.28mmol)を連続添加し、反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により分離することでFmoc-Gly-P3(50mg、63%の収率、ESI m/z:859.0)を白色固形物として得て、これをDMF(5mL)に溶解した。この溶液にジエチルアミン(20mg、0.27mmol)を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により分離することで、Gly-P3(TFA塩、40mg、エクサテカンから57%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:637.3(M+H)+。
実施例6M:メチル(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-トリス(アセチルオキシ)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-{[({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)オキシ]メチル}フェノキシ]オキサン-2-カルボキシレート(LP12-5)
P3をGly-P3に置き換える以外LP10-5と同様の手順に従い、化合物LP12-5(23mg、39%の収率)を黄色固形物として得た。ESI m/z:860.5(M-MDXD+H)+,677.4(M/2+H)+。
実施例6N:(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-({2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エチル}カルバモイル)-4-{[({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)オキシ]メチル}フェノキシ]-3,4,5-トリヒドロキシオキサン-2-カルボン酸(LP12)
LP10-5をLP12-5に置き換える以外LP10と同様の手順に従い、リンカーペイロードLP12(3mg、27%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:607.4(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.72(t,J=6.5Hz,1H),8.62-8.49(m,2H),8.19(t,J=5.1Hz,1H),7.98-7.90(m,1H),7.82-7.71(m,2H),7.53(t,J=6.0Hz,1H),7.47-7.41(m,1H),7.37-7.28(m,2H),6.56(s,1H),5.69-5.55(m,2H),5.43(s,2H),5.20(s,3H),4.99(s,2H),4.89(d,J=5.9Hz,1H),4.63(d,J=6.8Hz,2H),4.31-4.23(m,1H),4.01(s,2H),3.87(d,J=14.8Hz,1H),3.78-3.61(m,4H),3.29-3.12(m,5H),2.39(s,3H),2.26-2.10(m,4H),2.06-1.96(m,2H),1.94-1.78(m,4H),1.77-1.65(m,2H),1.61-1.42(m,3H),1.38-1.18(m,6H),0.90-0.83(m,3H)ppm。(酸のプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111.3ppm。
実施例7:分枝リンカーペイロード(BL2P)の合成
実施例7A:分枝リンカー主要中間体IIの合成
主要中間体IIを、下記のスキーム8と実施例7A~7Bに記載するように合成した。スキーム9は、合成に利用した市販の出発材料を提供する。
実施例7B:中間体IIの一般手順
活性エステルI(1.0当量)のDMF(0.4M)溶液に、DIPEA(3.0当量)と分枝アミンII-1(1.0当量)を添加した。得られた混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~70%のアセトニトリル)により直接精製することでII-2を白色固形物として得て、これをTHF(0.5M)に溶解した。この溶液に水(VH2O:VTHF=1:1)と水酸化リチウム水和物(4当量のII-2)を添加した。反応混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~70%のアセトニトリル)により精製することで、化合物II-3を白色固形物として得て、これを水(0.1M)に溶解した。この溶液にアセトニトリル(Vacetonitrile:VH2O=1:1)、ペンタフルオロフェノール(2.0当量のII-3)、およびDIC(2.0当量のII-3)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、10~99%のアセトニトリル)により直接精製することで、主要中間体IIを無色のオイルとして得た。
実施例7C:中間体II3fの合成
2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェニル1-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)-12-[2-オキソ-2-(2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェノキシ)エチル]-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-オエート(II3f)
II3-1(2.6g、7.0mmol)のメタノール(20mL)溶液に水酸化ナトリウム水溶液(1.4M、20mL)を添加し、反応混合物を室温で4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を塩酸塩水溶液(1.0M、50mLで3回)、水(100mL)、およびブライン(100mL)で洗浄した。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮することで、II3f-1(2.2g、粗製)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:309.3(M+H)+
II3f-1(0.10g、粗製)のDMF(10mL)溶液にFmoc-OSu(CAS:82911-69-1、0.11g、0.32mmol)とDIPEA(0.13g、1.0mmol)を添加し、混合物を室温で1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.03%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、II3f-2(0.15g、90%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:531.3(M+H)+。
II3f-2(50mg、94μmol)のDCM(10mL)混合物にペンタフルオロフェノール(35mg、0.19mmol)とDIC(24mg、0.19mmol)を添加し、反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮することでII3f(56mg、69%の収率)を無色のオイルとして得て、これをさらに精製することなく直接使用した。ESI m/z:863.2(M+H)+。
実施例7D:分枝リンカー-P3の合成
実施例7E:LP24-LP42の一般手順
中間体II(1当量)のDMF(3mM)溶液に、DIPEA(10当量)とアミノリンカーペイロード(2~3当量、LP41では4.0当量を除く)を添加し、アミノリンカーペイロードが完全に消費するまで反応混合物を室温で1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLCにより精製することで、分枝リンカーペイロードを白色固形物として得た。
実施例7F:{4-[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2-{N-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド}アセトアミド)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)-3-メチルブタンアミド]ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP24)
LP13(42mg、32μmol)と中間体II2b(10mg、16μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、5~95%のアセトニトリル)による精製後、分枝リンカーペイロードLP24(20mg、44%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:850.8(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.0(s,2H),8.81-8.78(m,2H),8.64(d,J=5.6Hz,1H),8.50(d,J=9.2Hz,2H),8.25(d,J=4.8Hz,1H),8.13(d,J=7.2Hz,2H),7.88(d,J=8.8Hz,2H),7.78(d,J=10.4Hz,2H),7.58(d,J=8.4Hz,4H),7.42(t,J=6.0Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J=8.4Hz,4H),6.03-5.96(m,2H),5.62-5.57(m,2H),5.46-5.36(m,6H),5.24-5.14(m,4H),4.92(s,4H),4.63(d,J=6.4Hz,4H),4.42-4.35(m,2H),4.27-4.22(m,3H),4.14(d,J=14.4Hz,1H),4.02-3.99(m,6H),3.94(d,J=14.0Hz,1H),3.87(s,2H),3.63-3.57(m,9H),3.51-3.46(m,8H),3.25-3.18(m,6H),3.18-3.05(m,2H),3.02-2.98(m,2H),2.98-2.89(m,2H),2.47-2.45(m,2H),2.41-2.35(m,8H),2.23-2.12(m,8H),2.03-1.91(m,4H),1.86-1.76(m,8H),1.76-1.63(m,4H),1.63-1.51(m,5H),1.45-1.32(m,6H),0.88-0.81(m,18H)ppm。(CF3COOHのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111,-74ppm。
実施例7G:(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-(2-{N-[({2-[2-(2-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド}アセトアミド)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタン酸(LP25)
LP13(24mg、19μmol)と中間体II2b(4.0mg、6.4μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、分枝リンカーペイロードLP25(6mg、33%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:936.7(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.79(br s,2H),8.80(t,J=6.4Hz,2H),8.69(br s,1H),8.51(d,J=8.4Hz,2H),8.33-8.26(m,2H),8.18-8.14(m,2H),8.12-8.06(m,2H),7.78(d,J=11.2Hz,2H),7.63-7.59(m,4H),7.43(t,J=6.0Hz,2H),7.30(s,2H),7.27(d,J=8.0Hz,4H),6.53(br s,2H),6.08-6.01(m,2H),5.62-5.57(m,2H),5.48-5.44(m,4H),5.41(s,4H),5.19(s,4H),4.92(s,4H),4.63(d,J=6.4Hz,4H),4.37-4.31(m,4H),4.27-4.11(m,5H),4.03-3.98(m,6H),3.96-3.91(m,1H),3.86(s,2H),3.64-3.60(m,4H),3.53-3.49(m,2H),3.47-3.42(m,10H),3.25-3.18(m,8H),3.15-3.10(m,2H),3.04-2.92(m,5H),2.38(s,8H),2.21-2.11(m,12H),2.07-1.98(m,4H),1.88-1.75(m,13H),1.67-1.61(m,2H),1.57-1.53(m,2H),1.47-1.34(m,6H),0.89-0.81(m,20H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)-71.08,-111.30ppm。
実施例7H:{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{1-[2-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサン-10-イン-2-イル}-N-{[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-イル)カルバモイル]メチル}-4-オキソブタンアミド)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP26)
LP16(6.0mg、4.8μmol)と中間体II2c(2.0mg、1.6μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(ギ酸水溶液(0.01%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、分枝リンカーペイロードLP26(5mg、65%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:717.3(M/4+H)+(E-開環形態、Rt=6.38分、14%);950.2(M/3+H)+,712.9(M/4+H)+(ラクトン形態、Rt=7.10分、86%)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,2H),8.80(t,J=6.8Hz,2H),8.68-8.64(m,1H),8.50(d,J=8.8Hz,2H),8.20(t,J=6.4Hz,1H),8.13(d,J=7.6Hz,2H),7.88(d,J=8.4Hz,2H),7.78(d,J=10.8Hz,2H),7.69(d,J=7.6Hz,1H),7.61-7.57(m,5H),7.50-7.41(m,5H),7.37-7.26(m,9H),6.53(s,2H),5.98(t,J=5.6Hz,2H),5.62-5.57(m,2H),5.45-5.36(m,8H),5.19(s,4H),5.01(d,J=14.4Hz,1H),4.92(s,4H),4.63(d,J=6.0Hz,4H),4.41-4.35(m,2H),4.23(t,J=8.0Hz,2H),4.02(s,4H),3.95-3.81(m,3H),3.62-3.56(m,8H),3.47-3.44(m,24H),3.22-3.17(m,6H),3.05-2.98(m,2H),2.93-2.88(m,2H),2.64-2.58(m,2H),2.39-2.35(m,8H),2.22-2.11(m,6H),2.00-1.82(m,9H),1.79-1.53(m,9H),1.49-1.31(m,6H),0.86-0.81(m,18H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
実施例7I:(9H-フルオレン-9-イル)メチルN-[1-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)-2-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-イル]カルバメート(LP27f)
LP13(67mg、58μmol)と中間体II3f(16mg、19μmol)から始まる一般手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.05%)中、0~100%のアセトニトリル)による精製後、化合物LP27f(21mg、39%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1392.2(M/2+H)+。
実施例7J:{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{1-アミノ-12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド}エトキシ)エトキシ]プロパンアミド}-3-メチルブタンアミド]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド]フェニル}メチルN-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバメート(LP27)
化合物LP27f(21mg、7.5μmol)のDMF(5mL)溶液にジエチルアミン(3mg、38μmol)を添加し、FmocがLCMSにより完全に除去されるまで混合物を室温で2時間撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により分離することでLP27(12mg、60%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1280.9(M/2+H)+,854.3(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.02(s,1H),8.84-8.77(m,2H),8.51(d,J=9.0Hz,2H),8.24-8.14(m,3H),8.10-8.04(m,2H),7.91(d,J=9.0Hz,2H),7.78(d,J=11.1Hz,2H),7.63-7.55(m,3H),7.46-7.40(m,2H),7.32-7.24(m,4H),6.53(s,2H),6.05-5.99(m,2H),5.65-5.55(m,3H),5.43(dd,J=11.8,1.3Hz,6H),5.19(s,3H),4.92(s,3H),4.70-4.55(m,3H),4.40-4.35(m,2H),4.26-4.20(m,2H),4.01(s,3H),3.70-3.37(m,42H),3.25-3.21(m,5H),3.16(s,6H),3.05-2.98(m,3H),2.97-2.89(m,4H),2.69-2.62(m,3H),2.42-2.30(m,9H),2.22-2.11(m,5H),2.00-1.92(m,3H),1.88-1.79(m,4H),1.74-1.65(m,3H),1.63-1.54(m,3H),1.49-1.27(m,7H),0.91-0.78(m,11H)ppm。(TFAのプロトンは明らかにならなかった)
実施例7K:(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{3-[2-(2-{12-[({2-[2-(2-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド}エトキシ)エトキシ]プロパンアミド}ブタン酸(LP28)
LP14(17mg、13μmol)と中間体II3b(4.0mg、5.0μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、分枝リンカーペイロードLP28(TFA塩、5mg、34%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:995.2(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.82(s,2H),8.81(t,J=6.4Hz,2H),8.52(d,J=8.8Hz,2H),8.19-8.14(m,4H),8.07(d,J=8.4Hz,2H),7.78(d,J=10.8Hz,2H),7.61(d,J=8.4Hz,4H),7.43(t,J=5.6Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J=8.4Hz,4H),6.48(br s,2H),6.01(br s,2H),5.63-5.57(m,2H),5.43-5.40(m,4H),5.21-5.16(m,4H),4.93(s,4H),4.63(d,J=6.4Hz,4H),4.42-4.33(m,4H),4.30-4.25(m,2H),4.24-4.19(m,2H),4.02(s,4H),3.90-3.85(m,2H),3.48-3.73(m,2H),3.69(br s,4H),3.64-3.60(m,8H),3.58-3.55(m,6H),3.52-3.50(m,8H),3.29-3.24(m,8H),3.03-3.00(m,2H),2.97-2.94(m,2H),2.40-2.37(m,8H),2.26-2.15(m,14H),2.09-2.00(m,6H),1.93-1.81(m,12H),1.79-1.70(m,8H),1.66-1.55(m,6H),1.49-1.34(m,8H),0.90-0.81(m,20H)ppm。(COOHとTFAのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-71.08,-111.30ppm。
実施例7L:(4R)-4-[3-(2-{2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-12-[({2-[2-(2-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド]エトキシ}エトキシ)プロパンアミド]-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(LP30)
LP14(16mg、12μmol)と中間体II3c(4.0mg、4.3μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(水中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、分枝リンカーペイロードLP30(5mg、37%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:786.4(M/4+H)+(両方のE-開環形態、Rt=5.65分、34%);781.8(M/4+H)+(単一のE-開環形態、Rt=5.95分、43%);777.3(M/4+H)+,1036.2(M/3+H)+(ラクトン形態、Rt=6.32分、19%)。
実施例7M:(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{3-[2-(2-{12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-1-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド}エトキシ)エトキシ]プロパンアミド}ブタン酸(LP31f)
LP15(28mg、22μmol)と中間体II3f(7.0mg、8.8μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、化合物LP31f(20mg、75%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:761.0(M/4+H)+(ラクトン形態)。
実施例7N:(4S)-4-{3-[2-(2-{1-アミノ-12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド}エトキシ)エトキシ]プロパンアミド}-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(LP31)
化合物LP31f(20mg、6.6μmol)のDMF(2mL)溶液にピペリジン(6.0mg、66μmol)を添加し、FmocがLCMSにより完全に除去されるまで反応混合物を室温で1時間撹拌した。混合物を分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)により直接精製することで、LP31(TFA塩、13mg、70%の収率)を白色固形物として得た。ESI:940.5(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.05(br s,2H),8.80(t,J=7.2Hz,2H),8.51(d,J=8.8Hz,2H),8.19(d,J=7.2Hz,2H),8.09(d,J=8.4Hz,2H),7.80-7.75(m,7H),7.58(d,J=8.4Hz,4H),7.42(t,J=5.6Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J=8.8Hz,4H),7.12-6.98(s,1H),6.53(br s,2H),6.04-6.58(m,2H),5.62-5.57(m,2H),5.46-5.40(m,6H),5.21-5.16(m,4H),4.92(s,4H),4.62(d,J=6.4Hz,4H),4.40-4.32(m,4H),4.19(d,J=7.6Hz,2H),4.01(s,4H),3.63-3.55(m,18H),3.50-3.46(m,10H),3.27-3.26(m,2H),3.02-2.92(m,8H),2.45-2.31(m,16H),2.26-2.15(m,10H),2.00-1.95(m,2H),1.91-1.80(m,8H),1.73-1.66(m,4H),1.61-1.56(m,2H),1.46-1.31(m,6H),0.89-0.80(m,22H)ppm。(COOHとTFAのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-73.74,-111.29ppm。
実施例7O:(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{3-[2-(2-{12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド}エトキシ)エトキシ]プロパンアミド}ブタン酸(LP32)
II3b(5.0mg、6.9μmol)とLP15(22mg、17μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(ギ酸水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP32(12mg、62%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:995.5(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(br s,2H),8.80(t,J=6.4Hz,2H),8.51(d,J=9.2Hz,2H),8.19(d,J=7.2Hz,2H),8.09(d,J=8.0Hz,2H),8.02(t,J=6.0Hz,2H),7.80-7.75(m,4H),7.58(d,J=8.4Hz,4H),7.43(d,J=6.0Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J=8.0Hz,4H),6.53(s,2H),6.01(br s,2H),5.62-5.57(m,2H),5.46-5.40(m,8H),5.19(s,4H),4.92(s,4H),4.62(d,J=6.4Hz,4H),4.40-4.32(m,4H),4.29-4.25(s,1H),4.19(d,J=7.2Hz,2H),4.01(s,4H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.63-3.57(m,8H),3.51-3.45(s,22H),3.27-3.22(m,10H),3.16(s,4H),3.05-3.00(m,3H),2.96-2.92(m,2H),2.68-2.64(m,2H),2.38(s,8H),2.24-2.15(m,10H),1.97-1.90(m,4H),1.86-1.81(m,6H),1.72-1.67(m,4H),1.61-1.55(m,4H),1.45-1.35(m,6H),1.25-1.21(m,2H),0.89-0.81(m,22H)ppm。(COOHのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111.29ppm。
実施例7P:(4S)-4-[3-(2-{2-[1-(4-{2-アザトリシクロ[10.4.0.04,9]ヘキサデカ-1(12),4(9),5,7,13,15-ヘキサン-10-イン-2-イル}-4-オキソブタンアミド)-12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)メチル]-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド]エトキシ}エトキシ)プロパンアミド]-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}ブタン酸(LP34)
II3c(2.8mg、3μmol)とLP15(12mg、9μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(ギ酸水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP34(4mg、43%の収率)を白色固形物として得て、LP15(3mg)を回収した。ESI m/z:629.3(M/5+H)+,786.5(M/4+H)+(両方のE-開環形態、Rt=5.70分、4%);1042.2(M/3+H)+,781.8(M/4+H)+(単一のE-開環形態、Rt=5.98分、28%);1036.1(M/3+H)+,777.4(M/4+H)+(Rt=6.33分、65%)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(s,2H),8.80(t,J=6.4Hz,2H),8.50(d,J=8.0Hz,2H),8.18(d,J=9.6Hz,2H),8.08(d,J=8.0Hz,2H),8.00(d,J=5.6Hz,2H),7.80-7.74(m,4H),7.67(d,J=8.4Hz,1H),7.62-7.57(m,4H),7.50-7.41(m,6H),7.37-7.26(m,10H),6.53(s,2H),5.98(t,J=5.6Hz,2H),5.64-5.57(m,2H),5.44-5.41(m,7H),5.20(s,4H),5.02(d,J=14.4Hz,1H),4.92(s,4H),4.63(d,J=6.0Hz,4H),4.41-4.32(m,4H),4.21-4.17(m,2H),4.02(s,4H),3.62-3.58(m,8H),3.58-3.46(m,16H),3.26-3.22(m,6H),3.19-3.15(m,4H),3.11-3.00(m,4H),2.96-2.91(m,2H),2.67-2.61(m,2H),2.41-2.38(m,11H),2.25-2.13(m,13H),2.03-1.93(m,4H),1.88-1.78(m,8H),1.74-1.53(m,10H),1.48-1.32(m,6H),0.88-0.81(m,18H)ppm。(COOHのプロトンは明らかにならなかった)
実施例7Q:(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-(3-{3-[2-({2-[2-(2-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)エトキシ]-2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]プロポキシ}プロパンアミド)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタン酸(LP36)
II4b(3.0mg、4.1μmol)とLP14(13mg、10μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP36(TFA塩、5mg、38%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:970.8(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ12.07(br s,2H),9.80(s,2H),8.81(t,J=6.4Hz,2H),8.51(d,J=8.8Hz,2H),8.16(t,J=6.8Hz,4H),8.08(d,J=7.6Hz,2H),7.93(d,J=5.2Hz,2H),7.78(d,J=10.8Hz,2H),7.63-7.59(m,4H),7.44(t,J=5.6Hz,2H),7.36(d,J=8.4Hz,1H),7.30(s,2H),7.27(d,J=8.4Hz,4H),6.54(s,2H),6.00(t,J=5.6Hz,2H),5.63-5.57(m,2H),5.46-5.40(m,8H),5.19(m,4H),4.92(s,4H),4.63(d,J=6.4Hz,4H),4.41-4.32(m,4H),4.29-4.25(m,1H),4.23-4.19(m,2H),4.01(s,4H),3.90-3.85(m,1H),3.79-3.74(m,1H),3.63-3.60(m,4H),3.59-3.55(m,6H),3.52-3.49(m,2H),3.46-3.42(m,8H),3.21-3.16(m,6H),3.05-2.89(m,6H),2.40-2.36(m,8H),2.33-2.28(m,6H),2.26-2.13(m,12H),2.09-2.01(m,4H),1.92-1.80(m,8H),1.79-1.70(m,6H),1.64-1.55(m,4H),1.46-1.34(m,6H),0.89-0.81(m,23H)ppm。(TFAのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-75,-111ppm。
実施例7R:(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-(3-{3-[2-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)エトキシ]-2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]プロポキシ}プロパンアミド)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタン酸(LP37)
II4b(3.0mg、4.1μmol)とLP15(13mg、10μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP37(TFA塩、4mg、31%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:970.6(M/3+H)+。
実施例7S:(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-(3-{3-[2-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)エトキシ]-2-[3-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エトキシ}エトキシ)プロパンアミド]プロポキシ}プロパンアミド)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタン酸(LP38)
II4Ab(6.0mg、6.9μmol)とLP15(22mg、17μmol)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(ギ酸水溶液(0.05%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP38(6.5mg、31%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1024.3(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(s,2H),8.80(t,J=6.4Hz,2H),8.51(d,J=8.4Hz,2H),8.19(d,J=6.0Hz,2H),8.09(d,J=7.6Hz,2H),7.93(t,J=4.8Hz,2H),7.79(s,1H),7.78-7.73(m,4H),7.64-7.61(m,1H),7.58(d,J=8.4Hz,4H),7.43(d,J=5.6Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J=8.4Hz,4H),6.53(s,2H),6.01(br s,2H),5.62-5.57(m,2H),5.46-5.40(m,8H),5.19(s,4H),4.92(s,4H),4.62(d,J=6.4Hz,4H),4.40-4.32(m,4H),4.29-4.25(m,1H),4.19(d,J=7.6Hz,2H),4.01(s,4H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.63-3.55(m,17H),3.47(s,12H),3.27-3.23(m,4H),3.21-3.17(m,6H),3.04-3.00(m,2H),2.96-2.92(m,2H),2.38(s,8H),2.36-2.29(m,10H),2.25-2.14(m,12H),1.99-1.94(m,2H),1.90-1.81(m,8H),1.76-1.67(m,6H),1.61-1.55(m,4H),1.46-1.35(m,6H),0.89-0.81(m,22H)ppm。(COOHのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
実施例7T:(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-(3-{2-[2-(3-{3-[2-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)エトキシ]-2-{[2-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.02,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバモイル)エトキシ]メチル}-2-[3-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エトキシ}エトキシ)プロパンアミド]プロポキシ}プロパンアミド)エトキシ]エトキシ}プロパンアミド)ブタン酸(LP41)
II5Ab(5.0mg、4.8μmol)とLP15(24mg、19μmol、4当量)から始まる一般手順に従い、分取HPLC(ギ酸水溶液(0.1%)中、10~95%のアセトニトリル)による精製後、リンカーペイロードLP41(7.1mg、33%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1107.6(M/4+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(br s,3H),8.80(t,J=6.8Hz,3H),8.50(d,J=8.8Hz,3H),8.20(d,J=6.4Hz,3H),8.09(d,J=7.6Hz,3H),7.94-7.90(m,3H),7.77(d,J=10.8Hz,6H),7.58(d,J=8.4Hz,6H),7.42(d,J=6.4Hz,3H),7.30(s,3H),7.27(d,J=8.4Hz,6H),6.52(s,3H),6.01(br s,3H),5.62-5.57(m,3H),5.46-5.40(m,13H),5.20-5.16(m,6H),4.92(s,6H),4.62(d,J=6.0Hz,6H),4.40-4.32(m,6H),4.19(t,J=7.6Hz,3H),4.01(s,6H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.64-3.51(m,30H),3.47(s,15H),3.40-3.36(m,9H),3.26-3.24(m,3H),3.21-3.17(m,9H),3.03-3.00(m,3H),2.96-2.91(m,3H),2.43-2.41(m,3H),2.38(s,9H),2.36-2.28(m,15H),2.25-2.20(m,9H),2.18-2.14(m,6H),1.98-1.94(m,3H),1.87-1.81(m,9H),1.74-1.70(m,3H),1.60-1.56(m,3H),1.43-1.35(m,6H),0.88-0.79(m,33H)ppm。(COOHのプロトンは明らかにならなかった)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
実施例7U:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{3-[3-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-メトキシ-4-オキソブチル]カルバモイル}エトキシ)-2-[3-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エトキシ}エトキシ)プロパンアミド]プロポキシ]プロパンアミド}ブタノエート(LP39-1)
化合物II4Ab(0.13g、0.15mmol)のDMF(3mL)溶液にDIPEA(58mg、0.45mmol)とLEvcPAB(78mg、0.15mmol)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~65%のアセトニトリル)により精製することで、化合物LP39-1を白色固形物として得た。ESI m/z:784.5(M/2+H)+。
実施例7V:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{3-[3-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-メトキシ-4-オキソブチル]カルバモイル}エトキシ)-2-[3-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エトキシ}エトキシ)プロパンアミド]プロポキシ]プロパンアミド}ブタノエート(LP39-2)
化合物LP39-1(0.15g、92μmol)のDMF(5mL)溶液に、DMAP(11mg、92μmol)、DIPEA(36mg、0.28mmol)、およびビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(85mg、0.28mmol)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~65%のアセトニトリル)により直接分離することで、化合物LP39-2(0.10g、57%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:950.0(M/2+H)+。
実施例7W:メチル(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{3-[3-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-メトキシ-4-オキソブチル]カルバモイル}エトキシ)-2-[3-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エトキシ}エトキシ)プロパンアミド]プロポキシ]プロパンアミド}ブタノエート(LP39-3)
化合物LP39-2(65mg、34μmol)のDMF(3mL)溶液にDIPEA(22mg、0.17mmol)とペイロードP3(50mg、86μmol)を添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~65%のアセトニトリル)により精製することで、化合物LP39-3(44mg、85%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:927.2(M/3+H)+。
実施例7X:(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-4-{3-[3-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]オキシ}メチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}-3-カルボキシプロピル]カルバモイル}エトキシ)-2-[3-(2-{2-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]エトキシ}エトキシ)プロパンアミド]プロポキシ]プロパンアミド}ブタン酸(LP39)
LP39-3(50mg、18μmol)のTHF(2mL)溶液に水酸化リチウム水溶液(0.08M、2mL)を添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。混合物を分取HPLC(ギ酸水溶液(0.1%)中、10~95%のアセトニトリル)により精製することで、LP39(13mg、26%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:917.7(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.03(s,2H),8.79(t,J=9.2Hz,2H),8.50(d,J=9.2Hz,2H),8.17(d,J=6.8Hz,2H),8.07(d,J=5.2Hz,2H),7.80-7.75(m,4H),7.74-7.70(m,1H),7.58(t,J=8.4Hz,4H),7.45-7.40(m,2H),7.30(s,2H),7.27(d,J=7.6Hz,4H),6.52(s,2H),6.01-6.95(m,2H),5.64-5.56(m,2H),5.46-5.39(m,8H),5.21-5.16(m,4H),4.92(s,4H),4.62(d,J=5.6Hz,4H),4.40-4.32(m,4H),4.30-4.25(m,1H),4.22-4.16(m,2H),4.01(s,4H),3.90-3.84(m,1H),3.78-3.72(m,1H),3.64-3.55(m,10H),3.47(s,4H),3.43-3.39(m,3H),3.26-3.23(m,3H),3.17-3.12(m,2H),3.05-3.00(m,2H),2.96-2.91(m,2H),2.38(s,9H),2.35-2.30(m,5H),2.26-2.15(m,12H),2.00-1.95(m,2H),1.89-1.80(m,7H),1.73-1.66(m,5H),1.62-1.52(m,5H),1.47-1.31(m,6H),0.90-0.79(m,21H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-73.16,-111.30ppm。
実施例7Y:(2S)-2-[2-(2-{1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド}アセトアミド)アセトアミド]-3-フェニルプロパン酸(LP23-1)
IbをIdに置き換える以外LP9-2と同様の手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~50%のアセトニトリル)による精製後、リンカーLP23-1(88mg、53%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:691.4(M+H)+。
実施例7Z:1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-N-{[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]-2-フェニルエチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP23-2)
LP9-2をLP23-1に置き換える以外LP9と同様の手順に従い、リンカーペイロードLP23-2(47mg、46%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:494.4(MDxd+1)+。
実施例7AA:(2S)-2-(2-{2-[(2R)-6-アジド-2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)ヘキサンアミド]アセトアミド}アセトアミド)-3-フェニルプロパン酸(LP23-4)
化合物LP23-3(CAS:159610-89-6、0.39g、1.0mmol)の乾燥DMF(5mL)溶液にHATU(0.38g、1.0mmol)を添加し、溶液を室温で5分間撹拌してから、LP01-1(0.30g、1.0mmol)とDIPEA(0.26g、2.0mmol)を添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。次いで、得られた溶液を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~90%のアセトニトリル)により精製することで、化合物LP23-4(0.50g、76%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:656.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ12.77(s,1H),8.18-8.12(m,2H),8.00(d,J=5.2Hz,1H),7.90(d,J=7.6Hz,2H),7.73(t,J=6.8Hz,2H),7.56(d,J=8.4Hz,1H),7.44-7.40(m,2H),7.35-7.31(m,2H),7.29-7.19(m,5H),4.47-4.40(m,1H),4.34-4.20(m,3H),4.04-3.98(m,1H),3.77-3.64(m,4H),3.31(t,J=6.8Hz,2H),3.07-3.02(m,1H),2.91-2.85(m,1H),1.75-1.65(m,1H),1.60-1.50(m,3H),21.42-1.28(m,2H)ppm。
実施例7AB:(9H-フルオレン-9-イル)メチルN-[(1R)-5-アジド-1-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]-2-フェニルエチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)ペンチル]カルバメート(LP23-5)
LP9-2をLP23-4に置き換える以外LP9と同様の手順に従い、化合物LP23-5(60mg、64%の収率)を淡黄色固形物として得た。ESI m/z:いずれの質量も検出されず。
実施例7AC:1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-N-[(1R)-1-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]-2-フェニルエチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)-5-[4-({[14-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]-2-フェニルエチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-イル]カルバモイル}メトキシ)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-シクロオクタ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル]ペンチル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(LP23)
LP23-5(45mg、38μmol)とLP23-2(47mg、38μmol)のDMSO(3mL)黄色溶液を室温で48時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~50%のアセトニトリル)により直接精製することで淡黄色固形物(60mg、ESI m/z:494、Rt=1.88分)を得て、これをDMF(1.8mL)に溶解した。この溶液にジエチルアミン(0.2mL)を添加し、FmocがLCMSにより完全に除去されるまで反応混合物を室温で30分間撹拌した。混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~50%のアセトニトリル)により分離することで淡黄色固形物(30mg、ESI m/z:494、Rt=1.63分)を得て、このうち20mgを乾燥DMF(4mL)に溶解した。これにDIPEA(2.3mg、18μmol)と、Id(4.7mg、8.9μmol)の乾燥DMF(1mL)溶液を添加した。反応混合物を室温で6時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで粗製LP23(62%純度)を白色固形物として得て、これをさらに分取HPLC(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により精製することで、純粋なLP23(2.5mg、3.5%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:887.6(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.63(t,J=6.8Hz,2H),8.50(d,J=9.2Hz,2H),8.33-8.27(m,2H),8.18-8.09(m,4H),8.05-7.95(m,3H),7.81-7.75(m,3H),7.59(t,J=6.0Hz,1H),7.31(s,2H),7.26-7.14(m,10H),7.09(s,0.5H),6.97(s,0.5H),6.52(brs,2H),5.62-5.57(m,2H),5.41(s,4H),5.19(s,4H),4.75-4.72(m,1H),4.64(d,J=6.4Hz,4H),4.52-4.43(m,2H),4.30-4.18(m,4H),4.02(s,4H),3.88-3.84(m,1H),3.79-3.76(m,3H),3.73-3.68(m,9H),3.62-3.56(m,4H),3.51-3.49(m,12H),3.48-3.46(m,14H),3.27-3.23(m,4H),3.19-3.09(m,3H),3.04-2.99(m,2H),2.96-2.90(m,1H),2.81-2.72(m,4H),2.63-2.60(m,2H),2.39-2.37(m,8H),2.22-2.13(m,5H),2.08-1.97(m,3H),1.93-1.80(m,9H),1.78-1.69(m,6H),1.61-1.47(m,6H),1.31-1.24(m,6H),1.10-1.02(m,1H),0.87(t,J=7.6Hz,,6H)ppm。19F NMR(400MHz,DMSOd6)-73(TFA),-111(Ar-F)ppm。
実施例7AD:(2S)-2-[2-(2-{3-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパンアミド}アセトアミド)アセトアミド]-N-({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)-3-フェニルプロパンアミド(LP35-2)
LP01f(74mg、70μmol)のDMF(5mL)溶液にジエチルアミン(26mg、0.35mmol)を添加した。FmocがLCMSにより完全に除去されるまで混合物を室温で2時間撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により分離することで白色固形物(58mg、ESI m/z:841.4(M+H)+)を得て、これをDMF(5mL)に溶解した。この溶液に化合物LP35-1(28mg、69μmol)、DIPEA(18mg、0.14mmol)、およびHATU(40mg、0.10mmol)を連続添加し、反応混合物を室温で4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、0~100%のアセトニトリル)により分離することで白色固形物(54mg、ESI m/z:729.3(M-MDxd+H)+)を得て、これをDMF(5mL)に溶解した。この溶液にジエチルアミン(16mg、0.22mmol)を添加し、FmocがLCMSにより完全に除去されるまで混合物を室温で2時間撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、LP35-2(40mg、LP01fから57%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1000.5(M+H)+,500.8(M/2+H)+。
実施例7AE:1-[2-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシ)アセトアミド]-N-(2-{2-[2-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]-2-フェニルエチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)エトキシ]エトキシ}エチル)-12-{[(2-{2-[2-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-エチル-18-フルオロ-10-ヒドロキシ-19-メチル-5,9-ジオキソ-8-オキサ-4,15-ジアザヘキサシクロ[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]テトラコサ-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-ヘプタン-23-イル]カルバモイル}メトキシ)メチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]-2-フェニルエチル]カルバモイル}メチル)カルバモイル]メチル}カルバモイル)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]メチル}-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド(LP35)
LP35-2(40mg、40μmol)と中間体II3b(16mg、20μmol)から始まる以外LP24と同様の手順に従い、分取HPLC(TFA水溶液(0.05%)中、5~95%のアセトニトリル)による精製後、分枝リンカーペイロードLP35(12mg、24%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:812.7(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.64(t,J=6.6Hz,2H),8.52(d,J=8.7Hz,2H),8.31(t,J=5.9Hz,2H),8.19-8.09(m,4H),8.05-7.98(m,3H),7.77(d,J=10.9Hz,2H),7.65-7.56(m,2H),7.31(s,2H),7.29-7.12(m,8H),6.53(s,2H),5.65-5.56(m,3H),5.42(s,3H),5.20-5.15(m,3H),4.70-4.60(m,3H),4.50-4.44(m,2H),4.30-4.22(m,2H),4.02(s,3H),3.86(d,J=14.8Hz,2H),3.78-3.66(m,9H),3.63-3.55(m,6H),3.53-3.40(m,27H),3.27-3.19(m,6H),3.15(s,4H),3.09-3.00(m,2H),2.81-2.72(m,2H),2.70-2.63(m,2H),2.42-2.32(m,8H),2.25-2.11(m,6H),2.09-1.97(m,3H),1.94-1.68(m,9H),1.63-1.51(m,3H),1.43-1.34(m,2H),1.29-1.20(m,3H),0.87(t,J=7.3Hz,6H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111.24ppm。(TFAシグナルは認めず)
実施例8:クエンチされたリンカーペイロードqLP18、qLP29、qLP33、qLP40、qLP42
クエンチされたリンカーペイロードの一般的な合成
リンカーペイロード(1当量)のDMF(1~5mM)溶液にアミノアジドAL1(1~1.5当量)を添加した。リンカーペイロードが完全にクエンチされるまで反応混合物を室温で1~3時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。次いで、混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィーにより精製することで、クエンチされたリンカー-Pを白色固形物として得た。
実施例9:トランスグルタミナーゼのバイオコンジュゲーションにおける例示的なリンカーL1-B
本開示の一実施形態に従い、リンカーL1-Bをアジドアミンリンカー(AL)としてもよく、これは、抗体に直接結合するアミン基、PEG含有塩基構造、およびアジド官能基(B’、n=1)を含んでいる。
2つのアジドアミンリンカーを、酵素的に脱グリコシル化されたWT Fcドメインを有する抗体、すなわちN297D突然変異を有する抗体のQ295残基にコンジュゲートすることで、さらなる修飾に利用可能な、2つの結合と2つのアジド官能基を有するアジド官能化抗体を得る(DAR=2n)。4つのアジドアミンリンカーを、FcドメインにN297Q突然変異を有する抗体のQ295残基とQ297残基にコンジュゲートすることで、さらなる修飾に利用可能な、4つの結合と4つのアジド官能基を有するアジド官能化抗体を得る(DAR=4n)。非限定的なアジドアミンリンカーの塩基成分構造を図3Bに示す。例として合成される具体的な構造を下記の表14に提供する。
本開示の別の実施形態に従い、リンカーL1を分枝アルキルアジドアミンリンカー(BL)としてもよく、この中には、塩基構造を含有する抗体分枝アルキルPEGに直接結合するアミン基、および2~6個のアジド官能基がある(n=2~6)。
2つの分枝アルキルアジドアミンリンカーを、WT Fcドメインを有する抗体、すなわちN297D突然変異を有する抗体のQ295残基にコンジュゲートすることで、さらなる修飾に利用可能な、2つの結合と4~12個(2×n、このときnは、分枝BL1リンカーそれぞれのアジドの数である)のアジド官能基を有するアジド官能化抗体を得る。4つの分枝アルキルアジドアミンリンカーを、FcドメインにN297Q突然変異を有する抗体のQ295残基とQ297残基にコンジュゲートすることで、さらなる修飾に利用可能な、4つの結合と8~24個(4×n)のアジド官能基を有するアジド官能化抗体を得る。候補となる分枝アルキルアジドアミンリンカーの塩基成分構造を図4Bに列記する。例として合成される具体的な構造を下記の表15に提供する。
アミノ-アジドリンカーAL1(CAS:134179-38-7)、AL2(CAS:951671-92-4)、AL3(CAS:957486-82-7)、およびAL4(CAS:857891-82-8)は市販で入手した。アミノ-テトラジンリンカーAL10(CAS:2055646-21-2)は、参照により本明細書に援用される国際公開第WO2016209062号で報告された。分枝リンカーBL7(CAS:2253947-15-6)は、参照により本明細書に援用される国際公開第WO2018218004号で報告された。
実施例10:AL5リンカーの合成
アミノ-アジドリンカーAL5は、下記のスキーム14と実施例10A~10Dに記載するように合成した。
実施例10A:メチル(2S)-2-(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エタンスルホンアミド)-6-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサノエート(AL5-3)
H-Lys(Fmoc)-OMe・HCl(AL5-1、CAS:201009-98-5)(0.38g、1.0mmol)のDCM(10mL)溶液に、トリエチルアミン(0.30g、3.0mmol)、DMAP(0.12g、1.0mmol)、および化合物AL5-2(CAS:134019-73-1)(0.25g、1.0mmol)を添加した。反応物を室温で4時間撹拌し、反応の完了をLCMSによりモニタリングした。混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物AL5-3(0.30g、50%の収率)を粘性のオイルとして得た。ESI m/z:612.3(M+Na)+。
実施例10B:メチル(2S)-2-(2-アミノエタンスルホンアミド)-6-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサノエート(AL5-4)
化合物AL5-3(0.30g、0.51mmol)のDCM(10mL)溶液にTFA(2mL)を添加し、Bocが完全に除去されるまで反応混合物を室温で4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により精製することで、化合物AL5-4(0.20g、80%の収率)を粘性のオイルとして得た。ESI m/z:490.1(M+H)+。
実施例10C:メチル(2S)-2-[2-(1-アジド-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド)エタンスルホンアミド]-6-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサノエート(AL5-6)
化合物AL5-5(0.12g、0.41mmol)のDMF(10mL)溶液に、化合物HATU(0.16g、0.42mmol)とDIPEA(0.11g、0.85mmol)を添加し、反応混合物を室温で10分間撹拌してから、化合物AL5-4(0.20g、0.41mmol)を添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物AL5-6(0.25g、80%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:763.3(M+H)+.。
実施例10D:(2S)-6-アミノ-2-[2-(1-アジド-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド)エタンスルホンアミド]ヘキサン酸(AL5)
化合物AL5-6(25mg、33μmol)のエタノール(0.5mL)溶液に水酸化リチウム水溶液(0.33M、0.5mL)を添加し、反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。反応物をヒドロクロリド水溶液(1M)でクエンチしてpH7とし、得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(ギ酸水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により直接分離することで、アミノ-アジドリンカーAL5(5.0mg、28%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:527.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.20(s,1H),7.90-7.80(m,2H),7.50-7.40(m,1H),3.80-3.10(m,27H),3.10-3.05(m,1H),2.80-2.75(m,1H),2.35-2.30(m,1H),1.80-1.50(m,2H),1.45-1.40(m,1H)ppm。(酸のプロトンは明らかにならなかった。アルデヒドのプロトンはいずれも、リンカーがギ酸塩形態でなかったことを示さなかった)
実施例11:AL6 リンカーの合成
アミノ-アジドリンカーAL6を、下記のスキーム15、および実施例11A~11Bに記載するように合成した。
実施例11A:N-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エチル}-5-(1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-2-イル)ペンタン-1-スルホンアミド(AL6-3)
アミノ-PEG2-アジド(AL6-2)(0.41g、2.4mmol)のTHF(30mL)溶液に、トリエチルアミン(0.36g、3.6mmol)、続いて化合物AL6-1(0.83g、2.6mmol、CAS:63345-34-6)を0℃で添加した。反応混合物を30℃で12時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮することで粗製のAL6-3(0.91g)を黄色のオイルとして得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ESI m/z:454.2(M+H)+。
実施例11B:5-アミノ-N-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エチル}ペンタン-1-スルホンアミド(AL6)
化合物AL6-3(0.90g、1.9mmol)のエタノール(10mL)溶液にヒドラジン水和物(85%、2.2g、38mmol)を0℃で添加し、反応混合物を30℃で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(ギ酸水溶液(0.225%)中、10~30%のアセトニトリル)により精製することで、アミノ-アジドリンカーAL6(0.18g、2工程でAL6-2から20%の収率、ギ酸塩)を白色固形物として得た。ESI m/z:324.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.43(br s,1H),3.63-3.58(m,2H),3.57-3.51(m,4H),3.45(t,J=5.8Hz,2H),3.41-3.36(m,2H),3.08(t,J=5.9Hz,2H),3.03-2.95(m,2H),2.75-2.64(m,2H),1.69-1.57(m,2H),1.56-1.46(m,2H),1.44-1.33(m,2H)ppm。
実施例12:AL7リンカーの合成
アミノ-アジドリンカーAL7を、下記のスキーム16および実施例12A~12Bに記載するように合成した。
実施例12A:tert-ブチルN-[4-({3-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパンアミド}スルホニル)ブチル]カルバメート(AL7-3)
化合物AL7-2(14mg、69μmol、CAS:1312309-63-9)のDCM(1.5mL)溶液にHATU(29mg、76μmol)を25℃で添加した。得られた混合物を25℃で2時間撹拌してから、炭酸セシウム(49mg、0.15mmol)と化合物AL7-1(21mg、83μmol、CAS:1862014-38-7)を添加した。次いで、反応混合物を25℃で16時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物をDCM(8.0mL)で希釈し、水(4.0mL)でクエンチした。二相混合物を重炭酸カリウム水溶液(0.5M)で酸性化してpH5とした。有機溶液を分離し、水(4.0mL)とブライン(4.0mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(酢酸水溶液(0.4%)中、0~45%のアセトニトリル)により精製することで、化合物AL7-3(15mg、45%の収率)を黄色固形物として得た。ESI m/z:438.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.64(br s,1H),3.82-3.76(m,2H),3.75-3.66(m,6H),3.51-3.41(m,4H),3.16(br d,J=6.9Hz,2H),2.66-2.59(m,2H),1.92-1.83(m,2H),1.65(quin,J=7.3Hz,2H),1.45(s,9H)ppm。
実施例12B:N-(4-アミノブタンスルホニル)-3-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパンアミド(AL7)
化合物AL7-3(8.0mg、18μmol)のDCM(1.5mL)溶液にTFA(0.3μL、4.1μmol)を添加し、Bocが完全に除去されるまで反応混合物を20℃で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(ギ酸水溶液(0.225%)中、8~28%のアセトニトリル)により精製することで、アミノ-アジドリンカーAL7(6.0mg、86%の収率、ギ酸塩)を白色固形物として得た。ESI m/z:338.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ3.63-3.59(m,2H),3.57-3.53(m,4H),3.51-3.46(m,4H),2.97(br s,2H),2.79(br s,2H),2.20(t,J=7.2Hz,2H),1.60(br s,4H)ppm。
実施例13:AL8リンカーの合成
アミノ-アジドリンカーAL8を、下記のスキーム17および実施例13A~13Cに記載するように合成した。
実施例13A:(2R)-2-アミノ-3-[(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)ジスルファニル]-3-メチルブタン酸(AL8-2)
化合物AL8-1(1.0g、1.8mmol、CAS:535943-48-7)のメタノール(20mL)溶液にL-ペニシラミン(0.78g、5.2mmol、CAS:1113-41-3)を添加し、反応混合物を25℃で18時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(ギ酸水溶液(0.225%)中、15~35%のアセトニトリル)により精製することで、化合物AL8-2(0.52g、80%の収率、ギ酸塩)を白色固形物として得た。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ6.97(br t,J=5.6Hz,1H),3.27(s,1H),3.21-3.12(m,2H),2.77(t,J=6.9Hz,2H),1.45(s,3H),1.37(s,9H),1.24(s,3H)ppm。
実施例13B:(2R)-2-{3-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパンアミド}-3-[(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)ジスルファニル]-3-メチルブタン酸(AL8-4)
化合物AL8-2(0.20g、0.54mmol、ギ酸塩)のDMF(2mL)溶液に、DIPEA(0.14g、1.1mmol)と化合物AL8-3(0.20g、0.67mmol、CAS:1312309-64-0)を添加し、反応混合物を25℃で2時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(ギ酸水溶液(0.225%)中、40~60%のアセトニトリル)により精製することで、化合物AL8-4(0.20g、73%の収率)を無色のオイルとして得た。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.20-8.07(m,1H),6.91(br t,J=5.4Hz,1H),4.50(d,J=9.0Hz,1H),3.63-3.57(m,4H),3.56-3.52(m,2H),3.51-3.48(m,2H),3.39(br s,2H),3.18-3.12(m,2H),2.79-2.67(m,2H),2.48-2.36(m,2H),1.37(s,9H),1.35(s,3H),1.29(s,3H)ppm。
実施例13C:(2R)-3-[(2-アミノエチル)ジスルファニル]-2-{3-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパンアミド}-3-メチルブタン酸(AL8)
化合物AL8-4(0.25g、0.49mmol)のDCM(2.0mL)溶液にTFA(2.0mL)を添加し、反応混合物を25℃で1時間撹拌し、これをTLCによりモニタリングした。混合物を真空下で濃縮することで、粗製のリンカーAL8(0.20g)をTFA塩として得た。粗製の塩(45mg、86μmol)を、DMF(1mL)の溶媒とメタノール(1mL)との混合物に溶解し、得られた溶液を逆相フラッシュクロマトグラフィー(アンモニア水溶液(0.05%)中、12~32%のアセトニトリル)にかけることで、AL8(12mg、33%の収率、アンモニウム塩)を白色固形物として得た。ESI m/z:410.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,D2O)δ4.44(s,1H),3.82(t,J=5.7Hz,2H),3.76-3.65(m,6H),3.55-3.47(m,2H),3.36(t,J=6.4Hz,2H),3.09-2.95(m,2H),2.71-2.54(m,2H),1.46(s,3H),1.41(s,3H)ppm。
AL8 TFA塩での1H NMR(400MHz,DMSOd6):δ8.25-8.16(m,1H),7.88(br s,3H),4.56(d,J=9.3Hz,1H),3.63-3.48(m,8H),3.43-3.36(m,2H),3.12-3.00(m,2H),2.93-2.87(m,2H),2.47-2.38(m,2H),1.37(s,3H),1.31(s,3H)ppm。
実施例14:AL9リンカーの合成
アミノ-アジドリンカーAL9を、下記のスキーム18および実施例14A~14Cに記載するように合成した。
実施例14A:tert-ブチルN-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(カルバモイルアミノ)-1-{[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]カルバモイル}ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}エトキシ)エチル]カルバメート(AL9-2)
vcPAB(0.60g、1.6mmol、CAS:159857-79-1)のDMF(5mL)溶液に、HATU(0.60g、1.6mmol)、DIPEA(0.61g、4.7mmol)、およびAL9-1(0.41g、1.7mmol、CAS:1260092-44-1)を添加し、反応混合物を25℃で12時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。混合物を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(水中、0~35%のアセトニトリル)により精製することで、化合物AL9-2(0.85g、86%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:495.3(M-Boc+H)+.。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.89(s,1H),8.10(d,J=7.4Hz,1H),7.86(d,J=8.5Hz,1H),7.54(d,J=8.4Hz,2H),7.22(d,J=8.4Hz,2H),6.70(br s,1H),6.02-5.91(m,1H),5.40(s,2H),5.08(t,J=5.6Hz,1H),4.42(d,J=5.4Hz,2H),4.26-4.20(m,1H),3.62-3.53(m,3H),3.07-2.88(m,6H),2.03-1.91(m,1H),1.68(br d,J=8.9Hz,1H),1.63-1.50(m,1H),1.36(s,13H),0.86(d,J=6.8Hz,3H),0.82(d,J=6.8Hz,3H)ppm。
実施例14B:tert-ブチルN-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(アジドメチル)フェニル]カルバモイル}-4-(カルバモイルアミノ)ブチル]カルバモイル}-2-メチルプロピル]カルバモイル}エトキシ)エチル]カルバメート(AL9-3)
化合物AL9-2(0.40g、0.67mmol)のトルエン(18mL)とDMF(2mL)溶液に、DBU(0.26g、1.7mmol)とDPPA(0.46g、1.7mmol)を添加した。混合物を25℃で12時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー(DCM中、0~12%のメタノール)により精製することで、化合物AL9-3(0.32g、61%の収率)を白色固形物として得た。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.03(s,1H),8.14(br d,J=6.8Hz,1H),7.87(br d,J=8.8Hz,1H),7.63(d,J=8.5Hz,2H),7.31(d,J=8.4Hz,2H),6.78-6.66(m,1H),6.02-5.93(m,1H),5.41(s,2H),4.37(s,2H),4.24(br t,J=7.6Hz,1H),3.63-3.52(m,3H),3.08-2.88(m,6H),2.01-1.92(m,1H),1.72-1.65(m,1H),1.65-1.59(m,1H),1.36(s,13H),0.86(br d,J=6.8Hz,3H),0.83(br d,J=6.6Hz,3H)ppm。
実施例14C:(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-アミノエトキシ)プロパンアミド]-3-メチルブタンアミド]-N-[4-(アジドメチル)フェニル]-5-(カルバモイルアミノ)ペンタンアミド(AL9)
ヒドロクロリドのジオキサン(4N、5mL)溶液に化合物AL9-3(0.17g、0.21mmol)を添加し、Bocが完全に除去されるまで得られた溶液を25℃で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(アンモニア水溶液(0.05%)中、34~74%のアセトニトリル)により直接精製することで、リンカーAL9(68mg、61%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:520.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(s,1H),8.16(br d,J=7.4Hz,1H),7.90(br d,J=8.4Hz,1H),7.63(d,J=8.5Hz,2H),7.31(d,J=8.5Hz,2H),6.06-5.94(m,1H),5.42(s,2H),4.44-4.33(m,3H),4.24(br dd,J=6.8,8.6Hz,1H),3.65-3.54(m,2H),3.07-2.90(m,2H),2.68-2.65(m,2H),2.46-2.34(m,4H),2.00-1.93(m,1H),1.81-1.21(m,6H),0.86(d,J=6.8Hz,3H),0.83(d,J=6.8Hz,3H)ppm。
実施例15:分枝リンカーBL1とBL2の合成
分枝リンカーBL1とBL2を、下記のスキーム19および実施例15A~15Fに記載するように合成した。
実施例15A:エチル1-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-12-(2-エトキシ-2-オキソエチル)-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-オエート(BL1-2)
化合物BL1-1(CAS:101187-40-0)(0.29g、1.0mmol)のアセトニトリル(50mL)溶液に、ブロモ酢酸エチル(0.37g、2.2mmol)と炭酸ナトリウム(0.27g、2.5mmol)を添加し、反応混合物を50℃で16時間撹拌した。反応の完了をTLC(Rf=0.6、DCM中10%のメタノール)によりモニタリングした。室温に降温後、混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮することで、粗製生成物BL1-2(0.40g、86%の粗製収率)を黄色のオイルとして得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ESI m/z:465.1(M+H)+。
実施例15B:1-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-12-(カルボキシメチル)-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-オイック酸(oic acid)(BL1-3)
粗製化合物BL1-2(0.23g、0.50mmol、上記で得たもの)のメタノール(5mL)溶液に水酸化ナトリウム水溶液(2M、5mL)を添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。メタノールを真空下で除去し、残余の水溶液をヒドロクロリド水溶液(1N)で酸性化してpH3とした。得られた混合物をDCM(10mLで3回)で抽出し、組み合わせた有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮することで、粗製生成物BL1-3(81mg、40%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:409.1(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ3.55-3.35(m,17H),3.08-3.06(m,4H),1.37(s,9H)ppm。
実施例15C:tert-ブチルN-{1-[(2-アジドエチル)カルバモイル]-2-{[(2-アジドエチル)カルバモイル]メチル}-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-イル}カルバメート(BL1-5)
化合物BL1-3(75mg、0.18mmol)と2-アジドエタンアミンBL1-4(47mg、0.55mmol)のDMF(5mL)溶液に、HATU(0.21g、0.55mmol)とDIPEA(0.14g、1.1mmol)を添加し、反応混合物を室温で4時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、30~90%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物BL1-5(63mg、64%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:545.3(M+H)+。
実施例15D:1-アミノ-N-(2-アジドエチル)-12-{[(2-アジドエチル)カルバモイル]メチル}-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド、TFA塩(BL1)
化合物BL1-5(0.10g、0.18mmol)のDCM(10mL)溶液にTFA(3mL)を添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。揮発物を真空下で除去し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(TFA水溶液(0.01%)中、0~100%のアセトニトリル)により精製することで、分枝リンカーBL1(25mg、31%の収率、TFA塩)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:445.2(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ8.48(br s,2H),7.88(br s,3H),3.63-3.50(m,16H),3.42-3.38(m,4H),3.34-3.28(m,4H),3.05-2.95(m,4H)ppm。
実施例15E:tert-ブチルN-{1-[(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]-2-{[(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]メチル}-5,8,11-トリオキサ-2-アザトリデカン-13-イル}カルバメート(BL2-5)
BL1-4をBL2-4に置き換える以外、化合物BL1-5と同様の手順に従い、化合物BL2-5(0.27g、74%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:809.5(M+H)+。
実施例15F:1-アミノ-N-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)-12-{[(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]メチル}-3,6,9-トリオキサ-12-アザテトラデカン-14-アミド(BL2)
BL1-5をBL2-5に置き換える以外BL1と同様の手順に従い、逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のアセトニトリル)による精製後、リンカーBL2(94mg、39%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:709.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.02(t,J=5.6Hz,2H),3.60(t,J=4.4Hz,4H),3.57-3.45(m,26H),3.45-3.37(m,8H),3.34(t,J=6.0Hz,2H),3.28-3.20(m,4H),3.15(s,4H),2.70-2.60(m,4H)ppm。
実施例16:分枝リンカーBL3の合成
分枝リンカーBL3を、下記のスキーム20および実施例16A~16Dに記載するように合成した。
実施例16A:tert-ブチルN-[1,3-ビス(2-アジドエトキシ)-2-[(2-アジドエトキシ)メチル]プロパン-2-イル]カルバメート(BL3-3)
2-アジドエタノール(BL3-2)(1.1g、13mmol)のトルエン(6mL)溶液に、DIPEA(1.9g、15mmol)とTFAA(3.7g、13mmol)を-2℃~2℃で添加し、反応混合物を0℃で2時間撹拌した。得られた混合物にDIPEA(1.9g、15mmol)、トルエン(6mL)、および化合物BL3-1(CAS:146651-71-0)(0.24g、1.1mmol)を添加し、反応混合物を40℃で72時間撹拌した。次いで、反応物をピリジン(0.2mL)でクエンチし、酢酸エチル(100mL)で希釈した。有機溶液をクエン酸水溶液(1M)、重炭酸ナトリウム水溶液(10%)、水、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のアセトニトリル)により精製することで、化合物BL3-3(30mg、6.4%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:451.0(M+Na)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ3.78(s,6H),3.66(t,J=5.0Hz,6H),3.34(t,J=5.0Hz,6H),1.43(s,9H)ppm。
実施例16B:1,3-ビス(2-アジドエトキシ)-2-[(2-アジドエトキシ)メチル]プロパン-2-アミン(BL3-4)
化合物BL3-3(56mg、0.13mmol)のDCM(4mL)溶液にTFA(1mL)を添加し、Bocが完全に除去されるまで反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。混合物を真空下で濃縮することで、粗製化合物BL3-4(43mg、100%の粗製収率)を黄色のオイルとして得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ESI m/z:329.1(M+H)+。
実施例16C:tert-ブチルN-(14-{[1,3-ビス(2-アジドエトキシ)-2-[(2-アジドエトキシ)メチル]プロパン-2-イル]カルバモイル}-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-イル)カルバメート(BL3-6)
化合物BL3-5(53mg、0.14mmol)のDMF(3mL)溶液にHATU(69mg、0.18mmol)を添加し、混合物を室温で5分間撹拌した。撹拌溶液に、前述で得た粗製化合物BL3-4(43mg)のDMF(1mL)溶液とDIPEA(50mg、0.39mmol)を連続添加した。得られた混合物を室温で1時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。反応溶液を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のアセトニトリル)により直接精製することで、化合物BL3-6(65mg、2工程で73%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:676.4(M+H)+。
実施例16D:1-アミノ-N-[1,3-ビス(2-アジドエトキシ)-2-[(2-アジドエトキシ)メチル]プロパン-2-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(BL3)
化合物BL3-6(65mg、96μmol)のDCM(4mL)溶液にTFA(1mL)を添加し、Bocが完全に除去されるまで反応混合物を室温で2時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発物を真空下で除去し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(重炭酸アンモニウム水溶液(10mM)中、0~100%のアセトニトリル)により精製することで、分枝リンカーBL3(44mg、79%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:576.3(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ7.25(s,1H),3.69(s,6H),3.56-3.60(m,8H),3.47-3.52(m,12H),3.44(t,J=5.5Hz,4H),3.35-3.37(m,6H),2.76(t,J=5.5Hz,2H),2.35(t,J=6.5Hz,2H)ppm。
実施例17:分枝リンカーBL4、BL5、およびBL6の合成
分枝リンカーBL4、BL5、およびBL6を、下記のスキーム21および実施例17A~17Hに記載するように合成した。
実施例17A:3-[2-(1-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド)-3-(2-カルボキシエトキシ)プロポキシ]プロパン酸(BL4-3)
化合物BL4-1(0.15g、0.64mmol、CAS:1020112-73-5)のDMF(5mL)溶液に、DIPEA(0.16g、1.3mmol)とBoc-N-アミド-PEG4-NHSエステル(BL4-2)(0.37g、0.80mmol、CAS:859230-20-9)を添加し、反応混合物を25℃で1時間撹拌し、反応の完了をLCMSによりモニタリングした。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣を分取HPLC(水酸化アンモニア水溶液(0.05%vol.)中、20~40%のアセトニトリル)により精製することで、化合物BL4-3(0.15g、39%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:605.2(M+Na)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.71(d,J=8.1Hz,1H),6.75(br s,1H),4.01-3.88(m,1H),3.58(t,J=6.3Hz,6H),3.52-3.44(m,14H),3.39-3.36(m,4H),3.09-3.02(m,2H),2.43(t,J=6.3Hz,3H),2.32(t,J=6.4Hz,2H),1.37(s,9H)ppm。
実施例17B:tert-ブチルN-(14-{[1,3-ビス({2-[(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]エトキシ})プロパン-2-イル]カルバモイル}-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-イル)カルバメート(BL4-5)
化合物BL4-3(75mg、0.13mmol)のDMF(2mL)溶液に、DIPEA(0.10g、0.77mmol)、HATU(0.15g、0.39mmol)、および化合物BL2-4(70mg、0.32mmol)を添加し、反応混合物を25℃で12時間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を分取HPLC(ギ酸水溶液(0.225%)中、33~53%のアセトニトリル)により精製することで、化合物BL4-5(50mg、40%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:983.6(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ4.13(quin,J=5.4Hz,2H),3.76-3.68(m,12H),3.66-3.58(m,19H),3.56-3.46(m,12H),3.22(t,J=5.6Hz,4H),2.54(t,J=6.1Hz,8H),2.47(t,J=6.3Hz,4H),1.44(s,13H)ppm。
実施例17C:1-アミノ-N-[1,3-ビス({2-[(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバモイル]エトキシ})プロパン-2-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(BL4)
化合物BL4-5(30mg、31μmol)のヒドロクロリド溶液のメタノール(4M、5mL)混合物を、Bocが完全に除去されるまで25℃で1時間撹拌し、これをTLC(酢酸エチルにより溶出)によりモニタリングした。次いで、応混合物を真空下で濃縮し、残渣を分取HPLC(水酸化アンモニア水溶液(0.05%)中、35~55%のアセトニトリル)により精製することで、分枝リンカーBL4(15mg、33%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:883.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ4.17-4.08(m,2H),3.80-3.69(m,20H),3.67-3.61(m,19H),3.52-3.44(m,8H),3.15(br d,J=4.3Hz,4H),2.58(t,J=6.0Hz,8H),2.49(t,J=5.9Hz,4H)ppm。
実施例17D:tert-ブチルN-(14-{[1,3-ビス(2-{[2-(2-アジドエトキシ)エチル]カルバモイル}エトキシ)プロパン-2-イル]カルバモイル}-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-イル)カルバメート(BL5-5)
BL2-4をBL5-4に置き換える以外BL4-5と同様の手順に従い、化合物BL5-5(0.10g、61%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:807.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.90(t,J=5.5Hz,2H),7.72(d,J=8.3Hz,1H),6.78-6.70(m,1H),3.96-3.88(m,1H),3.62-3.54(m,10H),3.52-3.42(m,16H),3.41-3.35(m,10H),3.26-3.18(m,4H),3.10-3.02(m,2H),2.38-2.27(m,6H),1.37(s,9H)ppm。
実施例17E:1-アミノ-N-[1,3-ビス(2-{[2-(2-アジドエトキシ)エチル]カルバモイル}エトキシ)プロパン-2-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(BL5)
化合物BL5-5(0.10g、0.12mmol)のDCM(2mL)溶液にTFA(2mL)を添加した。混合物を25℃で1時間撹拌した。反応の完了をTLC(酢酸エチルにより溶出)によりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を分取HPLC(アンモニア水溶液(0.05%)中、35~55%のアセトニトリル)により精製することで、分枝リンカーBL5(40mg、45%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:707.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.98(br d,J=8.0Hz,1H),6.64(br s,2H),4.22(td,J=4.6,8.8Hz,1H),3.80-3.37(m,40H),2.89(t,J=5.1Hz,2H),2.51(t,J=6.0Hz,2H),2.45(t,J=5.9Hz,4H)ppm。
実施例17F:3-[2-(1-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド)-3-(2-カルボキシエトキシ)-2-[(2-カルボキシエトキシ)メチル]プロポキシ]プロパン酸(BL6-3)
BL4-1をBL6-1(CAS:174362-95-9)に置き換える以外BL4-3と同様の手順に従い、化合物BL6-3(75mg、22%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:685.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ3.78-3.59(m,26H),3.52(t,J=5.6Hz,2H),3.24(t,J=5.6Hz,2H),2.50(t,J=6.3Hz,2H),2.41(t,J=6.7Hz,6H),1.44(s,9H)ppm。
実施例17G:tert-ブチルN-(14-{[1,3-ビス(2-{[2-(2-アジドエトキシ)エチル]カルバモイル}エトキシ)-2-[(2-{[2-(2-アジドエトキシ)エチル]カルバモイル}エトキシ)メチル]プロパン-2-イル]カルバモイル}-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-イル)カルバメート(BL6-5)
BL2-4をBL5-4に置き換え、BL4-3をBL6-3に置き換える以外、BL4-5と同様の手順に従い、化合物BL6-5(8mg、9%の収率)を黄色のオイルとして得た。ESI m/z:1022.4(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ3.72-3.49(m,40H),3.43-3.35(m,12H),3.26-3.18(m,2H),2.50-2.41(m,8H),1.44(s,9H)ppm。
実施例17H:1-アミノ-N-[1,3-ビス(2-{[2-(2-アジドエトキシ)エチル]カルバモイル}エトキシ)-2-[(2-{[2-(2-アジドエトキシ)エチル]カルバモイル}エトキシ)メチル]プロパン-2-イル]-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(BL6)
BL5-5をBL6-5に置き換える以外BL5と同様の手順に従い、分枝リンカーBL6(4mg、55%の収率)を無色のオイルとして得た。ESI m/z:921.6(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeCNd3)δ6.90(br s,3H),6.83(br s,1H),3.67-3.55(m,30H),3.52(br t,J=5.6Hz,6H),3.40-3.32(m,10H),2.95(br s,2H),2.47-2.40(m,4H),2.39-2.32(m,12H)ppm。
実施例18:シクロデキストリンリンカーBL10の合成
シクロデキストリンリンカーBL10を、下記のスキーム22および実施例18A~18Iに記載するように合成した。
化合物BL10-1を、J.Org.Chem.,1995,60(15),4786-97に従い合成した。
実施例18A:(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13R,15R,16R,18R,20R,21R,23R,25R,26R,28R,30R,31S,32R,33S,34R,35S,36R,37S,38R,39S,40R,41S,42R)-33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-デカキス(アセチルオキシ)-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス({[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]メチル})-32-(プロパ-2-エン-1-イルオキシ)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-31-イルアセテート(BL10-2)
化合物BL10-1(0.38g、0.22mmol)のピリジン(3mL)溶液に無水酢酸(3mL)を添加し、反応混合物を80℃で16時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、茶色の残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中、0~100%の酢酸エチル)により精製することで、化合物BL10-2(0.41g、85%の収率)を白色固形物として得た。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.77(tdd,J=5.7,10.9,16.8Hz,1H),5.57-5.34(m,5H),5.24-4.92(m,8H),4.78-4.60(m,5H),4.30-3.53(m,26H),3.16(dd,J=2.9,9.9Hz,1H),2.15-1.91(m,33H),0.93-0.79(m,54H),0.10-0.03(m,36H)ppm。
実施例18B:(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-デカキス(アセチルオキシ)-32-{3-[(2-アミノエチル)スルファニル]プロポキシ}-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス({[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]メチル})-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-31-イルアセテート(BL10-3)
化合物BL10-2(8.2g、3.8mmol)のメタノール(150mL)溶液に、システアミンヒドロクロリド(4.3g、38mmol)を添加し、反応混合物を脱気し、窒素で3回パージし、次いでUV光(λ=365nm)を照射しながら窒素保護下、20℃で24時間撹拌した。次いで反応混合物を真空下で濃縮し、残渣をDCM(100mL)に溶解した。溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液(30mL)と水(30mL)で連続洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。粗製生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(DCM中、0~20%のメタノール)により精製することで、化合物BL10-3(1.5g、18%の収率)を白色固形物として得た。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ5.55-5.28(m,6H),5.20-5.00(m,6H),4.63-4.43(m,5H),4.28-4.15(m,4H),4.14-4.05(m,2H),4.02-3.59(m,20H),3.52-3.41(m,1H),3.32-3.09(m,2H),2.93-2.81(m,1H),2.79-2.68(m,1H),2.54(br t,J=6.7Hz,2H),2.17-1.94(m,33H),1.87-1.59(m,2H),0.96-0.74(m,54H),0.12-0.08(m,36H)ppm。
実施例18C:(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-デカキス(アセチルオキシ)-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス({[(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ]メチル})-42-{3-[(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロポキシ}-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-31-イルアセテート(BL10-4)
化合物BL10-3(1.2g、0.54mmol)のジオキサン(20mL)溶液に、FmocOSu(CAS:82911-69-1)(0.20g、0.59mmol)とトリエチルアミン(0.16g、1.6mmol)を添加し、反応混合物を脱気し、窒素で3回パージしてから、窒素保護下、20℃で16時間撹拌した。得られた混合物をDCM(100mL)で希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液(20mL)と水(20mL)で連続洗浄した。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(DCM中、0~10%のメタノール)により精製することで、化合物BL10-4(1.3g、99%の収率)を白色固形物として得た。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(d,J=7.6Hz,2H),7.55(d,J=7.6Hz,2H),7.38-7.31(m,2H),7.30-7.23(m,2H),5.52-5.29(m,6H),5.21(br d,J=8.8Hz,1H),5.14-4.92(m,6H),4.80-4.55(m,5H),4.34(br d,J=7.1Hz,2H),4.25-3.76(m,19H),3.72-3.53(m,7H),3.45-3.25(m,3H),3.08(dd,J=2.8,9.9Hz,1H),2.66-2.43(m,4H),2.11-1.88(m,33H),1.72(br d,J=4.9Hz,2H),0.94-0.72(m,54H),0.07-0.06(m,36H)ppm。
実施例18D:(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-デカキス(アセチルオキシ)-42-{3-[(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロポキシ}-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス(ヒドロキシメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-31-イルアセテート(BL10-5)
化合物BL10-4(1.3g、0.53mmol)のTHF(15mL)およびピリジン(15mL)溶液にフッ化水素ピリジン(70%,3.7g、26mmol)を添加し、反応混合物を20℃で48時間撹拌した。得られた混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(100mL)に注ぎ入れた後、DCM(100mLで2回)で抽出した。組み合わせた有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。粗製生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(DCM中、0~15%のメタノール)により精製することで、化合物BL10-5(0.74g、75%の収率)を白色固形物として得た。1H NMR(400MHz,CDCl3+D2O)δ7.74(d,J=7.6Hz,2H),7.58(d,J=7.6Hz,2H),7.41-7.34(m,2H),7.32-7.25(m,2H),5.53-5.35(m,6H),5.25(br s,1H),5.13-4.93(m,6H),4.86-4.68(m,5H),4.47-4.30(m,2H),4.25-4.15(m,1H),4.11-3.91(m,12H),3.89-3.57(m,13H),3.51(br s,1H),3.36(br d,J=5.9Hz,2H),3.28(br d,J=12.0Hz,1H),2.69-2.43(m,4H),2.14-1.90(m,33H),1.81-1.64(m,2H)ppm。
実施例18E:(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-デカキス(アセチルオキシ)-42-{3-[(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロポキシ}-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス[(メタンスルホニルオキシ)メチル]-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-31-イルアセテート(BL10-6)
化合物BL10-5(0.10g、56μmol)のDCM(2mL)溶液に、メタンスルホニルクロリド(0.15g、1.4mmol)とピリジン(0.16g、2.0mmol)を添加し、反応混合物を15℃で3時間撹拌した。得られた混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液(10mL)に注ぎ入れ、DCM(10mLで2回)で抽出した。組み合わせた有機溶液をヒドロクロリド水溶液(1.0N、10mL)と水(10mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(DCM中、0~70%の酢酸エチル)により精製することで、化合物BL10-6(98mg、78%の収率)を白色固形物として得た。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J=7.6Hz,2H),7.57(br d,J=7.3Hz,2H),7.42-7.33(m,2H),7.32-7.25(m,2H),5.56-5.36(m,5H),5.33-5.22(m,2H),5.11-4.95(m,6H),4.91-4.75(m,5H),4.70-4.31(m,14H),4.28-4.13(m,6H),3.93-3.79(m,5H),3.73(br t,J=9.0Hz,1H),3.63(br s,1H),3.48(br d,J=9.8Hz,1H),3.36(br d,J=6.4Hz,2H),3.29-3.17(m,2H),3.15-2.98(m,18H),2.70-2.42(m,4H),2.11-1.90(m,33H),1.81-1.64(br s,2H)ppm。
実施例18F:(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-デカキス(アセチルオキシ)-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス(アジドメチル)-42-{3-[(2-{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロポキシ}-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-31-イルアセテート(BL10-7)
化合物BL10-6(0.33g、0.15mmol)の乾燥DMSO(5mL)溶液にアジ化ナトリウム(0.29g、4.4mmol)を添加し、反応混合物を70℃で16時間撹拌した。得られた混合物を水(20mL)に注ぎ入れ、DCM(20mLで2回)で抽出した。組み合わせた有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮することで黄色のガム(0.31g)を得て、これをジオキサン(3mL)に溶解した。この溶液にFmocOSu(73mg、0.22mmol)とトリエチルアミン(55mg、0.55mmol)を添加し、混合物を脱気し、窒素で3回パージしてから、窒素保護下、15℃で16時間撹拌した。得られた混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液(20mL)でクエンチし、DCM(10mLで2回)で抽出した。組み合わせた有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(DCM中、0~3%のメタノール)により精製することで、粗製生成物(0.17g)を白色固形物として得て、これをさらに分取TLC(SiO2、DCM中6.25%のエタノールで溶出)により精製することで、化合物BL10-7(0.13g、41%の収率)を白色固形物として得た。HRMS ESI m/z:1924.6212(M+H)+(calcd.1924.6086),1946.6057(M+Na)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J=7.6Hz,2H),7.60(br d,J=7.3Hz,2H),7.45-7.36(m,2H),7.36-7.29(m,2H),5.53-5.35(m,5H),5.28(br s,1H),5.12-4.97(m,5H),4.96-4.74(m,6H),4.40(br d,J=7.1Hz,2H),4.24(br d,J=6.6Hz,1H),4.12-3.91(m,6H),3.88-3.48(m,21H),3.40(br d,J=5.9Hz,2H),3.27(br dd,J=2.9,10.0Hz,1H),2.71-2.47(m,4H),2.11-1.95(m,33H),1.78(br s,2H)ppm。
実施例18G:(1S,3R,5R,6S,8R,10R,11S,13R,15R,16S,18R,20R,21S,23R,25R,26S,28R,30R,31R,32R,33R,34R,35R,36R,37R,38R,39R,40R,41S,42R)-42-{3-[(2-アミノエチル)スルファニル]プロポキシ}-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス(アジドメチル)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-ウンデコール(BL10-8)
化合物BL10-7(0.11g、57μmol)のメタノール(5mL)溶液にナトリウムメチラート(0.12g、2.3mmol)を添加し、反応混合物を20℃で16時間撹拌した。得られた混合物をイオン交換樹脂Amberlyst(登録商標)15(水素形態)の添加により中和し、pH6.0とした。混合物を濾過して樹脂を除去し、濾液を真空下で濃縮した。残渣を蒸留水(40mL)で処理してMTBE(20mLで3回)で洗浄した。水相を凍結乾燥することで白色の残渣(52mg)を得て、これをアセトニトリル(ARグレード、4mL)に入れて懸濁した。白色懸濁液を超音波で10分間トリチュレートし、5000rpmで15分間遠心分離し、デカントすることで白色固形物を回収した。このプロセスを3回繰り返した。得られた白色固形物を蒸留水(20mL)に溶解した後、凍結乾燥することで化合物BL10-8(34mg、47%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1240.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6+D2O)δ4.99(br s,1H),4.83(br s,5H),3.76(br d,J=10.5Hz,7H),3.70-3.58(m,13H),3.53-3.42(m,6H),3.39-3.24(m,12H),2.91(br t,J=6.5Hz,2H),2.66-2.59(m,2H),2.55-2.51(m,2H),1.75-1.60(m,2H)ppm。
実施例18H:9H-フルオレン-9-イルメチルN-[14-({2-[(3-{[(1S,3R,5R,6S,8R,10R,11S,13R,15R,16S,18R,20R,21S,23R,25R,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34R,35R,36R,37R,38R,39R,40R,41R,42R)-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス(アジドメチル)-31,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ウンデカヒドロキシ-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11。213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-32-イル]オキシ}プロピル)スルファニル]エチル}カルバモイル)-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカン-1-イル]カルバメート(BL10-10)
活性エステルBL10-9(9.0mg、15μmol)と化合物BL10-8(19mg、15μmol)のDMF(0.3mL)溶液にDIPEA(6.0mg、46μmol)を添加し、反応混合物を25℃で1時間撹拌した。得られた混合物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(酢酸水溶液(0.5%)中、0~70%のアセトニトリル)により2回、直接精製することで、化合物BL10-10(6.7mg、24%の収率)を白色固形物として得た。1H NMR(400MHz,DMSOd6+D2O)δ7.89-7.83(m,2H),7.69-7.60(m,2H),7.44-7.37(m,2H),7.35-7.27(m,2H),5.04(br s,1H),4.86(br s,5H),4.30-4.18(m,3H),3.77-3.76(m,20H),3.61-3.51(m,10H),3.50-3.42(m,12H),3.36(br d,J=5.8Hz,14H),3.28-3.08(m,6H),2.29(br t,J=6.4Hz,2H),1.77-1.63(m,2H)ppm。
実施例18I:1-アミノ-N-{2-[(3-{[(1S,3R,5R,6S,8R,10R,11S,13R,15R,16S,18R,20R,21S,23R,25R,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34R,35R,36R,37R,38R,39R,40R,41R,42R)-5,10,15,20,25,30-ヘキサキス(アジドメチル)-31,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-ウンデカヒドロキシ-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-ドデカオキサヘプタシクロ[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]ドテトラコンタン-32-イル]オキシ}プロピル)スルファニル]エチル}-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-アミド(BL10)
化合物BL10-10(6.7mg、3.9μmol)のDMF(0.2mL)溶液にピペリジン(3.3mg、39μmol)を添加し、Fmocが完全に除去されるまで反応混合物を25℃で1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を蒸留水(10mL)で希釈し、凍結乾燥した。残余のオフホワイト固形物を逆相フラッシュクロマトグラフィー(酢酸水溶液(0.5%)中、0~70%のアセトニトリル)により精製することで、シクロデキストリン-リンカーBL10(2.1mg、36%の収率)を白色固形物として得た。ESI m/z:1488.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ5.06(d,J=3.2Hz,1H),4.94(br d,J=2.4Hz,5H),4.02-3.84(m,1H),4.03-3.72(m,21H),3.71-3.49(m,24H),3.47-3.34(m,9H),3.48(br s,1H),2.99(t,J=5.1Hz,2H),2.69-2.61(m,4H),2.47(t,J=6.0Hz,2H),1.91-1.84(m,2H)ppm。
実施例19:グルコースリンカーBL11の合成
グルコースリンカーBL11を、下記のスキーム23および実施例19A~19Fに記載するように合成した。
化合物BL11-1を、Org.Biomol.Chem.,2007,5(21),3477-3485に従い合成した。
実施例19A:2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリス(プロパ-2-エン-1-イルオキシ)-6-[(プロパ-2-エン-1-イルオキシ)メチル]オキサン-2-イル]オキシ}エトキシ)エトキシ]エタン-1-アミン(BL11-2)
化合物BL11-1(0.60g、1.2mmol)のTHF(10mL)および水(1.5mL)溶液に、トリメチルホスフィン(THF中で1M、1.8mL、1.8mmol)を0℃で添加し、反応混合物を0℃で1時間撹拌し、これをTLC(石油エーテル中、25%の酢酸エチルで溶出)によりモニタリングした。次いで、得られた混合物を氷水(20mL)に注ぎ入れ、2分間撹拌した。混合物水溶液を酢酸エチル(30mLで3回)で抽出した。組み合わせた有機溶液をブライン(20mLで3回)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮することで、粗製生成物BL11-2(0.55g、87%の収率)を黄色のオイルとして得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ESI m/z:472.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.11-5.82(m,4H),5.34-5.22(m,4H),5.22-5.06(m,4H),4.42-3.96(m,10H),3.76-3.58(m,9H),3.55-3.47(m,2H),3.44-3.29(m,3H),3.27-3.16(m,1H),2.96-2.76(m,2H)ppm。
実施例19B:9H-フルオレン-9-イルメチルN-{2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリス(プロパ-2-エン-1-イルオキシ)-6-[(プロパ-2-エン-1-イルオキシ)メチル]オキサン-2-イル]オキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバメート(BL11-3)
化合物BL11-2(0.50g、1.1mmol)とDIPEA(0.41g、3.2mmol)のDCM(5mL)溶液に、FmocOSu(0.43g、1.3mmol)を窒素雰囲気下、0℃で15分かけて少量ずつ添加した。混合物を20℃で1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を水(20mL)に注ぎ入れ、2分間撹拌した。混合物水溶液を酢酸エチル(30mLで3回)で抽出した。組み合わせた有機溶液をブライン(20mLで3回)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中、0~50%の酢酸エチル)により精製することで、化合物BL11-3(0.55g、71%の収率)を淡黄色のオイルとして得た。ESI m/z:716.3(M+Na)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J=7.5Hz,2H),7.61(d,J=7.5Hz,2H),7.44-7.37(m,2H),7.35-7.28(m,2H),6.02-5.83(m,4H),5.42(br s,1H),5.31-5.20(m,4H),5.19-5.09(m,4H),4.40-4.01(m,12H),3.75-3.54(m,11H),3.43-3.30(m,5H),3.25-3.15(m,1H)ppm。
実施例19C:9H-フルオレン-9-イルメチルN-{2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリス({3-[(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロポキシ})-6-({3-[(2-{[(tert-ブトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロポキシ}メチル)オキサン-2-イル]オキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバメート(BL11-5)
化合物BL11-3(0.20g、0.29mmol)のメタノール(8mL)溶液を石英フラスコに入れたものに、Boc-システアミンBL11-4(1.0g、5.8mmol)を添加した。反応混合物を脱気し、アルゴンで30分間パージし、UV光(λ=254nm)を照射しながら窒素保護下、20℃で12時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中、0~80%の酢酸エチル)により精製することで、化合物BL11-5(0.30g、67%の収率)を黄色のオイルとして得た。ESI m/z:1425.9(M+Na)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J=7.5Hz,2H),7.62(d,J=7.5Hz,2H),7.44-7.38(m,2H),7.35-7.29(m,2H),5.04(br s,3H),4.40(br d,J=6.8Hz,2H),4.28-4.20(m,2H),4.02-3.47(m,20H),3.41(br d,J=4.8Hz,2H),3.35-3.15(m,11H),3.13-3.00(m,1H),2.70-2.54(m,15H),1.94-1.75(m,7H),1.45(s,36H)ppm。
実施例19D:9H-フルオレン-9-イルメチルN-{2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリス({3-[(2-アミノエチル)スルファニル]プロポキシ})-6-({3-[(2-アミノエチル)スルファニル]プロポキシ}メチル)オキサン-2-イル]オキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバメート(BL11-6)
化合物BL11-5(0.11g、78μmol)のDCM(1.5mL)溶液にTFA(1.7g、15mmol)を添加し、Bocが完全に除去されるまで反応混合物を20℃で1時間撹拌し、これをLCMSによりモニタリングした。揮発物を真空下で除去することで、粗製生成物BL11-6(90mg、93%の収率、TFA塩)を淡黄色のオイルとして得た。ESI m/z:1002.4(M+H)+。
実施例19E:9H-フルオレン-9-イルメチルN-{2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリス({3-[(2-アジドエチル)スルファニル]プロポキシ})-6-({3-[(2-アジドエチル)スルファニル]プロポキシ}メチル)オキサン-2-イル]オキシ}エトキシ)エトキシ]エチル}カルバメート(BL11-7)
化合物BL11-6(60mg、48μmol、TFA塩)のメタノール(1mL)および水(0.5mL)溶液に、20℃で硫酸銅五水和物(0.48g、1.9μmol)、トリエチルアミン(39mg、0.39mmol)、およびトリフルオロメタンスルホニルアジド(42mg、0.24mmol)のDCM(5mL)を連続添加した。反応混合物を20℃で30分間撹拌した。反応の完了をLCMSによりモニタリングした。得られた混合物をグリシン(0.5g)でクエンチし、20℃で30分間撹拌した。混合物を濾過し、濾液をDCM(30mL)とブライン(15mL)に分けた。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮することで、化合物BL11-7(50mg、84%の収率)を黄色のオイルとして得て、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。ESI m/z:1128.4(M+Na)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J=7.5Hz,2H),7.62(d,J=7.2Hz,2H),7.44-7.38(m,2H),7.36-7.30(m,2H),5.46-5.40(m,1H),5.38-5.32(m,1H),4.40(br d,J=6.8Hz,2H),4.27-4.18(m,2H),4.01-3.35(m,31H),3.23-3.18(m,2H),3.09(q,J=7.3Hz,5H),2.68-2.59(m,8H),2.26-2.19(m,1H),2.06-1.97(m,2H),1.92-1.81(m,8H)ppm。
実施例19F:2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリス({3-[(2-アジドエチル)スルファニル]プロポキシ})-6-({3-[(2-アジドエチル)スルファニル]プロポキシ}メチル)オキサン-2-イル]オキシ}エトキシ)エトキシ]エタン-1-アミン(BL11)
化合物BL11-7(45mg、41μmol)のDMF(0.2mL)溶液にピペリジン(35mg、0.41mmol)を添加し、反応混合物を20℃で0.2次感覚はんし、これをLCMSによりモニタリングした。得られた混合物を真空下で濃縮し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー(ギ酸水溶液(0.225%)中、40~60%のアセトニトリル)により精製することで、グルコース-リンカーBL11(18mg、45%の収率、ギ酸塩)を黄色のオイルとして得た。ESI m/z:884.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.52(s,1H),4.26(d,J=7.8Hz,1H),4.06-3.97(m,1H),3.95-3.58(m,19H),3.52-3.44(m,8H),3.31-3.17(m,3H),3.12-3.06(m,1H),3.01(t,J=4.9Hz,2H),2.78-2.64(m,18H),1.96-1.75(m,8H)ppm。
実施例20:ADCコンジュゲーション
本実施例では、本開示の一実施形態による部位特異的コンジュゲーション、概して抗体またはその抗原結合性フラグメントへのペイロードのコンジュゲーションのための方法を実証する。この方法は、図2に示す2工程のプロセスを含む。第1の工程は、ビスアジド-アルキル置換アミン(BL7)やアジド-PEG3アミン(AL1)などのリンカー1(L1-B’)の抗体への微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)媒介型結合であり、ここでは過剰量のアミン試薬を使用して、抗体鎖に起こり得る架橋結合を回避した。第2の工程では、歪み促進型アジド-アルキン付加環化(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition:SPAAC)を介して、アルキンが連結したペイロードリンカーペイロード(L2P)を、N3タグを付けたコンジュゲートに結合した。抗体に添加したL2P分子の数は、コンジュゲーション部位の数、およびL1内のアジド官能基の数(n)(AL、n=1;BL、n≧2)に左右される。WT Fcドメインを有する抗体が、酵素的に脱グリコシル化されたか、またはN297D Fc突然変異を有しており後にALもしくはBLリンカーで官能化された場合、予想されるDARは2×n×mであり、このときnは各L1リンカー上のアジド官能基B’の数であり、mはL2Pペイロードの数である。抗体がN297Q Fc突然変異を有しており後にALまたはBLリンカーで官能化される場合、予想されるDARは4×(n)×(m)である。
すべての親抗体(Ab)、2、4、または8個のアジド基(Ab-(N3)n)を含有するアジド官能化抗体、具体例として生成される最終ADC、および対応するリンカーペイロード(L2P)のほか、それらのES-MS結果とADCのDAR値も、表16に要約する。
下記の表17では、本開示の2工程方法を用いて生成したADCの構造を提供する。
下記の表18では、比較目的のためにシステインコンジュゲーション法を用いて生成したADCの構造を提供する。
実施例20A:工程1:2、4、または8個のアジド基を含有する部位特異的アジド官能化された抗体薬物コンジュゲートの作製(表19を参照)。
N297Q突然変異またはアイソタイプ対照抗体を含有する抗HER2ヒトIgG抗体を、150モル当量のアジド-PEG3-アミン(AL1、MW 218.26g/mol)またはビスアジド-アルキル置換アミン(BL7、MW 325.38g/mL)と混合した。得られた溶液をトランスグルタミナーゼ(25U/mL;抗体1mgにつき1UのmTG、Zedira,Darmstadt,Germany)と混合し、抗体の最終濃度は1~20mg/mLになった。反応混合物を軽く振盪しながら25~37℃で4~24時間インキュベートし、ESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のアミンとmTGを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)またはプロテインAカラムクロマトグラフィーにより除去した。コンジュゲートを、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。アジドリンカーが結合した抗体は、AL1およびBL7を有するDAR=4のコンジュゲートにおいて質量をそれぞれ804Daまたは1232Daに増加させた。コンジュゲートモノマーの純度は、SECにより99%超であった。
実施例20B:工程2:アジド官能化抗体とアルキン含有リンカーペイロードの間での1,3-付加環化(「クリック」)反応を介した表19の部位特異的コンジュゲートの作製。
アジド官能化抗体(1~20mg/mL)をPBS(pH7.4)中、DMSOやDMAなどの有機溶媒(10mg/mL)に溶解した6モル当量のリンカーペイロードにより、25~37℃で1~48時間、軽く振盪しながらインキュベートして、5~15%有機溶媒(v/v)を含有する反応混合物を得ることにより、部位特異的抗体薬物コンジュゲートを調製した。反応をESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のリンカーペイロードとタンパク質集合体をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。精製したコンジュゲートを濃縮し、滅菌濾過し、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。コンジュゲートモノマーの純度は、SECにより99%超であった。
実施例20c:抗HER2 Ab-[AL1-LP1]4と抗HER2 Ab-[(BL7)-(LP1)2]4の調製
図4Aに示す具体例では、N297Q突然変異を伴う非グリコシル化抗HER2ヒトIgG抗体を、150モル当量のビスアジド-アルキル置換アミン(BL7、MW 325.38g/mol)と混合した。得られた溶液を微生物トランスグルタミナーゼ(25U/mL;抗体1mgにつき1UのmTG、Zedira,Darmstadt,Germany)と混合し、抗体の最終濃度は8.6mg/mLになった。反応混合物を軽く振盪しながら37℃で22時間インキュベートし、ESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のアミンとmTGを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。コンジュゲートを、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。アジドリンカーが結合した抗体は、DAR=4のコンジュゲートにおいて質量を1232Daに増加させた。PBS(pH7.4)中の部位特異的抗体アジドコンジュゲート(8.6mg/mL)を、20モル当量のリンカーペイロード(LP1)と10mg/mLのDMA中で混合させて、12%の有機溶媒(v/v)を含有する反応混合物を得て、この溶液を32℃で36時間静置させつつ、軽く振盪させた。反応をESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のリンカーペイロードとタンパク質集合体をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。精製したコンジュゲートを濃縮し、滅菌濾過し、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。コンジュゲートモノマーの純度は、SECにより99.8%であった。薬物が結合した抗体は、DAR=8のコンジュゲートにおいて質量を11185Daに増加させた。
実施例20D:抗HER2/HER2二重特異性抗体薬物コンジュゲートBIS1およびBIS2-Ab-[(BL7)-(LP1)2]4の調製
抗体がHER2の2つ別個のエピトープを結合する、抗HER2二重特異性抗体を含む2つの抗体薬物コンジュゲートを、上述の実施例18A~18Cに記載したのと同様の条件下で合成し、BIS1とBIS2を形成した(表20)。2つの二重特異性抗体(抗HER2/HER2 Ab1と抗HER2/HER2 Ab2)は、それぞれHER2の別個のエピトープを結合する2つの結合ドメインを有する。本実施例では、上述の手順に従い抗体を酵素的に脱グリコシル化して、部位特異的アジド官能化を、BL7リンカーを有する2つの重鎖Fc Q295グルタミン残基において成し遂げた。2つの二重特異性抗体薬物コンジュゲートBIS1とBIS2で観察したDAR(細胞毒性薬に基づく)を表20に提供する。
実施例21:ADCコンジュゲーション:3つの手法
DAR4~DAR24のADCを生成するための抗体Q295/297部位上での部位特異的ADCコンジュゲーションを図5に表し、DAR2~DAR12のADCを生成するための抗体Q295上でのコンジュゲーションを図6に表す。本開示は、抗体Q295/297部位に分枝リンカーペイロードを結合する3つの例示的な手法を表す。
手法IとIIは、抗体薬物コンジュゲーションにおける2工程プロセスを含む。第1の工程は、少分子アミン、例えばAL1またはBL2の、mAb-Q部位への微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)媒介型結合であり、ここでは過剰量のアミン試薬を使用して、抗体鎖の起こり得る架橋を回避した(全体が参照により本明細書に援用される国際公開第WO2017/147542号)。第2の工程は、例えば歪み促進型アジド-アルキン付加環化(SPAAC、銅触媒を含まないクリック反応(aka copper-free click chemistry))を介して、N3タグを付けたコンジュゲートに、アルキンを連結したリンカーペイロード(L2P)を結合することである。反応基(RG)がDIBACまたはCOT部分である場合、[2+3]付加環化を介してアジド官能化抗体によりコンジュゲーションを行う。本プロセスでは、部位特異的および化学量的コンジュゲートを提供する。抗体に添加したL2P分子の数は、コンジュゲーション部位の数、およびL1内のアジド官能基の数(n)(例えば、ALでn=1、BLでn≧2)に左右される。
手法Iでは、抗体Q295/297部位に対し小分子アミンリンカーL1(例えば、AL1)をコンジュゲートして抗体アジドタグ(Ab-N3)を生成し、これをアルキンテザー(alkyne-tethered)直鎖リンカーペイロード(LL2P)と(例えば、「クリック」付加環化を介して)共有結合的に反応させることで4DARのADCを生成し(図5の方法A)、および前述のタグをアルキンテザー分枝リンカーペイロード(BL2P)と反応させることで8DARのADCを生成した(図5の方法B)。
手法IIでは、抗体Q295/297部位に対し小分子分枝アジド-アミン(例えば、BL2)をコンジュゲートして抗体分枝アジドタグ(Ab-分枝-2N3)を生成し、これを直鎖リンカーペイロードと(例えば、「クリック」付加環化を介して)共有結合的に反応させることで8DARのADCを生成し(図5の方法C)、および前述のタグをアルキンテザー分枝リンカー2ペイロードと反応させることで16DARのADCを生成、もしくは分枝テザー3ペイロードと反応させることで24DARのADCを生成した(図5の方法D)。同様に、直鎖または分枝リンカーペイロードによる抗体Q295部位上での部位特異的ADCコンジュゲーションでは、DAR2~DAR12のADCを生成できた(図6)。
手法IIIのコンジュゲーションでは、抗体Q295/297部位へのアミン分枝リンカーペイロードのMTG媒介型結合を、20モル当量以上のアミン試薬を単一工程のMTG媒介型反応に使用することで達成した。
WT Fcドメインを有する抗体が酵素的に脱グリコシル化されるか、またはN297D Fc突然変異を有して後にALまたはBLリンカーでアジド官能化された場合、2つのFc上のアジドタグ1つにつき予想されるDARは2nである。N297Q Fc突然変異を有する抗体をALまたはBLリンカーでアジド官能化した場合、2つのFc上のアジドタグ1つにつき予想されるDARは4nである。m倍のペイロード(Pm)を有するリンカーペイロードそれぞれで抗体をコンジュゲートした場合、予想されるADC-DARは、N297D突然変異抗体で(2n×m)(図6)、N297Q突然変異抗体で(4n×m)(図5)である。
2工程のコンジュゲーション(図5の方法A、B、C、D)を介してコンジュゲートされたADCをすべて表21に要約し、1工程のコンジュゲーション(図5の方法E)を介してコンジュゲートされたADCを表22に要約した。
部位特異的コンジュゲートを2工程で作製するための一般手順
実施例21A:工程1:2、4、または8個のアジド基を含有する部位特異的アジド官能化された抗体薬物コンジュゲートの作製。
BupH緩衝液(pH7.4)中の、N297Q突然変異またはN297D突然変異を伴う非グリコシル化ヒト抗体IgG(IgG1、IgG4など)を、150モル当量以上のアジド-PEG3-アミン(AL1)またはビスアジド-アルキル置換アミン(BL2)と混合した。得られた溶液をトランスグルタミナーゼ(25U/mL;抗体1mgにつき1UのmTG、Zedira,Darmstadt,Germany;または10U/mL;抗体1mgにつき5.5UのMTG、Modernist Pantry-ACTIVA TIが日本の味の素株式会社のマルトデキストリンを含有している)と混合して、抗体の最終濃度を0.5~20mg/mLとした。反応混合物を軽く振盪しながら25~37℃で24時間インキュベートし、ESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のアミンとmTGを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)またはプロテインAカラムクロマトグラフィーにより除去した。コンジュゲートを、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。抗体に結合したアジドリンカーは、AL1およびBL2を有する4DARのコンジュゲートにおいて質量をそれぞれ804Daまたは1232Daに増加させ、8DARの抗体BL2-(アジド)8コンジュゲートにおいては2768Daに増加させた。コンジュゲートのモノマーの純度は、SECにより99%超であった。
実施例21B:工程2:アジド官能化抗体とアルキン含有リンカーペイロードの間での[2+3]クリック反応を介した部位特異的コンジュゲートの作製。
ヒトIgG(IgG1、IgG4など)を有する部位特異的抗体薬物コンジュゲートを、アジド官能化抗体とアルキン官能化リンカーペイロードとの間での[2+3]アジド-アルキン「クリック」反応により調製した。PBS(pH7.4)中のアジド官能化抗体(1~20mg/mL)を、軽く振盪しながら25~37℃で1~48時間、DMSOやDMAなどの有機溶媒(10mg/mL)に溶解した6モル当量以上のリンカーペイロード(LP)でインキュベートし、5~15%の有機溶媒(v/v)を含有する反応混合物を得た。反応をESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のLPと有機溶媒を、BupH(pH7.4)でカラムを脱塩することにより除去し、タンパク質集合体(もしあれば)をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。精製したコンジュゲートを濃縮し、滅菌濾過し、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。コンジュゲートのモノマーの純度は、SECにより99%超であった。
実施例21C:手法Iの代表的な8DARのADCをAb-LP39 ADCとともに例証する(図7A)。
N297Q突然変異を伴う非グリコシル化抗Her2ヒトIgG抗体を、200モル当量を超えるアジド-dPEG3-アミン(AL1、MW 218.26g/moL)と混合した。得られた溶液を微生物トランスグルタミナーゼ(10U/mL;抗体1mgにつき5,5UのmTG、Modernist Pantry-ACTIVA TIは日本の味の素株式会社のマルトデキストリンを含有している)と混合し、抗体の最終濃度を5mg/mLにした。反応混合物を軽く振盪しながら37℃で24時間インキュベートし、ESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のアミンとmTGを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。コンジュゲートを、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。抗体に結合したアジドリンカーは質量を808Daに増加させたため、4つのアジドタグを有する4つのAL1は抗体(Ab4AL1)に対しコンジュゲートされたことが認められる。このPBS(pH7.4)中の部位特異的抗体アジドコンジュゲート(2.1mg/mL)を、15モル当量のリンカーペイロード(LP39)と2mMのDMSO中で混合させて、5%の有機溶媒(v/v)を含有する反応混合物を得て、この溶液を32℃で36時間静置させつつ、軽く振盪させた。反応をESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のリンカーペイロードとタンパク質集合体をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。精製したコンジュゲートを濃縮し、滅菌濾過し、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。コンジュゲートのモノマーの純度は、SECにより99.8%であった。抗体に結合した薬物はDAR8コンジュゲートにおいて質量を11003Daに増加させたため、8つのLPが抗体にコンジュゲートされたことが認められる。
実施例21D:手法Iの代表的な8DARのADCをAb-LP22 ADCとともに例証する(図7B)。
N297Q突然変異を伴う非グリコシル化抗Her2ヒトIgG抗体を、200モル当量を超えるBL2(MW=708.8g/moL)と混合した。得られた溶液を微生物トランスグルタミナーゼ(10U/mL;抗体1mgにつき5.5UのmTG、Modernist Pantry-ACTIVA TIは日本の味の素株式会社のマルトデキストリンを含有している)と混合し、抗体の最終濃度を5mg/mLにした。反応混合物を軽く振盪しながら37℃で24時間インキュベートした。完了後、過剰量のアミンとMTGaseを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。コンジュゲートを、UV-Vis、SDS-PAGE、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。コンジュゲートのモノマーの純度は、SECにより96.11%であった。抗体に結合したアジドリンカーは質量を2768Daに増加させたため、4つのBL2が、8つのアジドタグを有する抗体(Ab-2BL2)にコンジュゲートされたことが認められる。BupH(pH7.4)中の部位特異的抗体アジドコンジュゲート(1.492mg/mL)を、15のモル当量のリンカーペイロード(LP22)と2mMのDMSO中で混合することで、5%の有機溶媒(v/v)を含有する反応混合物を得て、この溶液を25℃で72時間静置させながら軽く振盪した。反応をSDS-PAGEによりモニタリングした。完了後、過剰量のリンカーペイロードを、BupH(pH7.4)でカラムを脱塩することにより除去した。抗体コンジュゲートに結合した薬物では、DAR8コンジュゲートにおいて12200Daの質量増加を認めたため、8つのLPが抗体にコンジュゲートされたことが認められる。
手法IIのコンジュゲーションに使用した例示的な分枝アジド試薬BL12を下記に表す。
実施例21E:部位特異的コンジュゲートを1工程で作製するための一般手順
BupH緩衝液(pH7.4)中の非グリコシル化ヒト抗体IgG(IgG1、IgG4など)を、15~30モル当量のアミノ-リンカーペイロードと混合する。得られた溶液をMTG(Modernist Pantry-ACTIVA TIは日本の味の素株式会社のマルトデキストリンを含有している)(10U/mL;抗体1mgにつき5.5UのMTG)と混合して、抗体の濃度を0.5~5mg/mLとし、次いでこの溶液を軽く振盪しながら37℃で24時間インキュベートした。反応の完了後、過剰量のアミンとMTGをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去して、直接コンジュゲートされたリンカーペイロードADCを生成した。この生成物を超遠心分離で濃縮し、SDS-PAGE、SEC、およびLC-MSで特徴解析した。ADCのMS結果として、LPコンジュゲートの質量がさらに4倍増加したこと、すなわち4DARのADCが認められ、または、LPコンジュゲートの質量がさらに8倍増加したこと、すなわち8DARのADCが認められた。
実施例21F:直鎖リンカーペイロードによる抗体の1工程のコンジュゲーションからコンジュゲートされる、AbLP21 ADCにより例証された手法IIIの代表的な4DARのADC(図7C)。
特定の例では、0.5mLのBupH(pH7.4)中の非グリコシル化抗体(1mg)を、30モル当量のLP08(DMSO中で濃度20mM)で処理した。得られた溶液をMTG(Modernist Pantry-ACTIVA TIは日本の味の素株式会社のマルトデキストリンを含有している)(10U/mL;抗体1mgにつき5.5UのMTG)と混合して、抗体の濃度を5mg/mLとし、次いでこの溶液を軽く振盪しながら37℃で24時間インキュベートした。反応完了の完了後、過剰量のリンカーペイロード(LP)をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC、Superdex(登録商標)200 Increase 10/300 GL)により除去した。この生成物を超遠心分離で濃縮し、SDS-PAGE、SEC、およびLC-MSで特徴解析した。コンジュゲートのモノマーの純度は、SECにより98.8%であった。アミノ-リンカーペイロードを抗体の4つの部位に添加すると、4DARの抗体LPコンジュゲートで質量は5380Daに増加した。
実施例21G:抗体と分枝直鎖リンカーペイロードとの1工程のコンジュゲーションからコンジュゲートされた、Ab-LP27 ADCで例証される手法IIIの代表的な8DARのADC(図7C)
4DARのADC(実施例21F)を作製する1工程のコンジュゲーションに記載したのと同じ方法を使用して、アミノ分枝リンカーペイロード(LP27)を抗体の4つの部位にコンジュゲートすると、8DARのコンジュゲートで10187.2Daの増加を認めた。
実施例21H:工程1の代表手順:分枝(BL)リンカーを使用した、8つのアジド基を含有する部位特異的なアジド官能化抗体薬物コンジュゲートの作製(表23)。
N297Q突然変異を伴う抗Her2ヒトIgG抗体、またはアイソタイプ対照抗体を、20~100モル当量のビスアジド-アルキル置換アミン(BL2、MW708.82g/mL、またはBL12、MW550.66)と混合した。得られた溶液をトランスグルタミナーゼ(抗体1mgにつき1UのmTG、Millipore-Sigma)と混合し、抗体の最終濃度は1~20mg/mLになった。反応混合物を軽く振盪しながら25~37℃で4~24時間インキュベートし、ESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のアミンとmTGを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)またはプロテインAカラムクロマトグラフィーにより除去した。コンジュゲートを、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。抗体に結合したアジドリンカーは、BL2およびBL12を有するDAR4コンジュゲートにおいて質量をそれぞれ2777Daまたは2145Daに増加した。コンジュゲートのモノマーの純度は、SECにより99%超であった。
実施例21I:工程2の代表手順:アジド官能化抗体とアルキン含有リンカーペイロードとの間での[2+3]クリック反応を介し分枝(BL)リンカーを使用した、8つのアジド基を含有する部位特異的なアジド官能化抗体薬物コンジュゲートの作製(表23)。
アジド官能化抗体(1~20mg/mL)をPBS(pH7.4)中、DMSOやDMAなどの有機溶媒(10mg/mL)に溶解した10~20モル当量のリンカーペイロードにより、25~37℃で1~48時間、軽く振盪しながらインキュベートして、5~15%有機溶媒(v/v)を含有する反応混合物を得ることにより、部位特異的抗体薬物コンジュゲートを調製した。反応をESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のリンカーペイロードとタンパク質集合体をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。精製したコンジュゲートを濃縮し、滅菌濾過し、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。コンジュゲートのモノマーの純度は、SECにより99%超であった。
実施例21J:抗HER2 ADCの合成
具体例では、N297Q突然変異を伴う非グリコシル化抗HER2ヒトIgG抗体を、82モル当量のビスアジド-アルキル置換アミン(BL2、MW708.82g/mL)と混合した。得られた溶液を微生物トランスグルタミナーゼ(抗体1mgにつき1UのmTG、Millipore-Sigma)と混合し、抗体の最終濃度は7.9mg/mLになった。反応混合物を軽く振盪しながら37℃で30時間インキュベートし、ESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のアミンとmTGを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。コンジュゲートを、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。抗体に結合したアジドリンカーは、DAR4のコンジュゲートにおいて質量を2777Daに増加させた。PBS(pH7.4)中の部位特異的抗体アジドコンジュゲート(2.3mg/mL)を、13モル当量のリンカーペイロード(LP1)と10mg/mLのDMA中で混合させて、12%の有機溶媒(v/v)を含有する反応混合物を得て、この溶液を26℃で27時間静置させつつ、軽く振盪させた。反応をESI-MSによりモニタリングした。完了後、過剰量のリンカーペイロードとタンパク質集合体をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。精製したコンジュゲートを濃縮し、滅菌濾過し、UV-Vis、SEC、およびESI-MSで特徴解析した。コンジュゲートモノマーの純度は、SECにより99.9%であった。抗体に結合した薬物は、DAR8のコンジュゲートにおいて質量を11175Daに増加させた。
実施例22:ADCの特徴解析
実施例22A:ADCの完全性と純度を解析するためのSDS-PAGE
1つの方法では、SDS-PAGE実行条件は、非還元および還元試料(1~2μg)を含み、これとともに、Precision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-rad,500μl,Cat#1610374)を、レーンごとに(1.0mm×10ウェル)Novex 4~20% No Tris-Glycine Gel中で充填し、180V、300mAで80分間行う。非還元試料はNuPAGER LDS Sample Buffer(4倍)(Thermo Fisher Scientific,Cat#1887691)を用いて調製し、還元試料は10%試料還元剤(10倍)を含有するSDS試料緩衝液(4倍)(Thermo Fisher Scientific,Cat#1769410)を用いて調製する。
SDS-PAGEでの抗体およびADCの分子量を、非還元条件と還元条件下で求める。質量変化の割合が比較的少なかったため、質量の推移は非還元条件下では明らかでない場合がある。しかし、重鎖の質量はネイキッド抗体からアジド官能化抗体まで増加し、さらにADCコンジュゲートまで増加する。
実施例22B:ADCの解析と精製におけるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
抗体薬物コンジュゲートの純度を求めるためにサイズ排除クロマトグラフィーを行う。分析SEC実験は、Thermo UltiMate(商標)3000を使用して、XBridge Protein BEH SEC Column(Waters,200Å,3.5μm,7.8mm×300mm)上で実行し、各試料(30~40μg、20μL)は0.5mL/分の流速で、15%の2-プロパノールを含むpH7.4のPBSを使用して実行し、Thermo DAD-3000 RS Rapid Separation Diode Array Detectorを用いてλ280nmでモニタリングする。
ADCをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製し、超遠心分離を用いて濃縮する。反応混合物から抗体薬物コンジュゲートを分離するために、GE HealthcareのAKTA機器を使用し、Superdex(登録商標)200 increase 10/300 GL(1.0×30cm)カラム上、0.6mL/分の流速で分取SEC精製を行い、BupHによりpH7.4で溶出させ、λ280nmでモニタリングする。生成物を濃縮するために、Amicon(登録商標)Ultra-4 Centrifugal Filters(Ultracel-10K)をAllegra x-12r遠心分離機中で使用し、それぞれの濃縮後に溶液を撹拌することで高度の凝集を回避する。
実施例22C:ADC解析におけるRP-HPLC
ADC試料における無傷の質量をRP-HPLCにより実行し、LPが完全にコンジュゲートされるかどうかを求め、これを使用して平均DARを算出した。
各試料はジチオスレイトール(DTT、0.5M)で処理した後、37℃で30分間インキュベートしてからRP-HPLC解析を行った。Thermo UltiMate(商標)3000機器を使用して、XBridge Protein BEH C4カラム(300Å、2.5μm、4.6×100mm、Cat No.186009137)上でRP-HPLC解析を行い、カラムオーブンを65℃に加温した。各試験試料(10~20μg、10μL)を充填し、1mL/分の流速で、下記の表24に示す異なる勾配の移動相A(0.1%TFAを含む100%ddH2O)と移動相B(80%ACN、0.1%TFAを有する20%IPA)を用いて実行し、Thermo DAD-3000 RS Rapid Separation Diode Array Detectorを用いてλ280nmでモニタリングした。
実施例22D:抗体およびADCのインタクト質量を解析するためのLC-ESI-MS
ADC試料のインタクト質量をLC-ESI-MSにより測定し、ペイロードの分布プロファイルを求めて平均DARを算出した。各試験試料(0.5~1μg)を、Waters Protein BEH C4 Column(300Å、1.7μm、2.1mm×50mm、Cat No.186004495)上に、異なる勾配の移動相A(0.1%FAを有するddH2O)と移動相B(0.1%FAを有するACN)(下記の表25に示すもの)を用いて、0.25μL/分の流速で充填し、λ280nmでモニタリングした。次いで、生成物を溶出し、Thermo Q EXACTIVE HF-Xにより質量スペクトルを取得した。
実施例23:腫瘍系統に対するin vitro細胞毒性試験
本開示の抗HER2または抗STEAP2抗体薬物コンジュゲート(ADC)がヒト細胞株を死滅させられるかを調べるべく、in vitro細胞毒性試験を行った。ADC、アイソタイプ対照ADC、および基準の遊離ペイロードにおけるin vitro細胞毒性を、CellTiter-Glo 2.0 Assay Kit(Promega,Cat#g9243)を用いて評価し、その中に存在するATPの分量を用いて培養物中で生存可能な細胞数を求めた。
本アッセイでは、Calu-3、SK-BR-3、NCI-H1975、C42、またはC42/STEAP2 KO(ノックアウト)細胞を、1000個の細胞/ウェルで、ポリ-D-リシンを被覆した96ウェルのBiocoatプレート(Corning #356693)中の完全成長培地に蒔き、5%CO2、37℃で一晩成長させた。抗HER2 ADCまたはアイソタイプ対照ADCの3倍段階希釈を希釈培地(Optimem+0.1%BSA)中で調製し、100nM~0.015nMの範囲の最終濃度で細胞に添加した(濃度はDAR(薬物抗体比)のために調整し、有効なペイロード濃度に基づき投与した)。遊離ペイロードの3倍段階希釈を100%DMSO中で調製し、新たな希釈培地に移した後、0.2%の最終定常DMSO濃度、および100nM~0.015nMの範囲の最終ペイロード濃度で細胞に添加した。各段階希釈における残りのウェル(未処理のウェル)は、培地(ADC)のみを含有するか、培地と0.2%DMSO(ペイロード)を含有するブランク対照として使用し、3倍段階希釈の継続としてプロットした。6日後、100μLのCellTiter glo 2.0を各ウェルに添加し、プレートをオービタルシェーカー上で2分間混合し、室温で10分間インキュベートした。相対発光量(RLU)をEnvisionの照度計(PerkinElmer)で測定し、細胞生存率は未処理(100%生存可能)の細胞の割合として表した。IC50値は、10点の用量応答曲線(GraphPad Prism)上、4つのパラメータのロジスティック方程式を用いて求めた。死滅が最大の%も、被験物質ごとに100-生存率が最小の割合として求めた。2つの独立実験を行い(それぞれ、下記に示す表26と表27)、各被験物質のIC50値と死滅が最大の%を報告する。
表26と表27に示すように、グルタミンを介してコンジュゲートされた抗HER2 ADCは、SK-BR-3細胞を発現する高HER2を死滅させ、IC50値は68.5pM~86.1pMの範囲、死滅が最大の%値は82.2%~93.3%の範囲であった。システインを介してコンジュゲートされた抗HER2 ADCはSK-BR-3細胞を死滅させ、IC50値は147pM、死滅が最大の%値は90.9%であった。第2の実験では、グルタミンを介してコンジュゲートされた抗HER2 ADCは、Calu-3およびSK-BR-3細胞を発現する高HER2を死滅させ、IC50値は183pM~431pMの範囲であり、死滅が最大の%値は89.6%~95.3%の範囲であった。システインを介してコンジュゲートされた抗HER2 ADCは、SK-BR-3とCalu-3細胞を死滅させ、IC50値はそれぞれ1.16nMと1.38nM、死滅が最大の%値はそれぞれ85.9%と94.2%であった。抗HER2 ADCはすべて、NCI-H1975細胞を発現する低HERで細胞毒性が弱く、IC50値が100nMを超えていたが、非結合性対照ADCは被験細胞すべてで細胞毒性が弱く、IC50値は40.1nM以上であった。また、コンジュゲートされていない抗HER2抗体は被験系統すべてにおいて細胞毒性が弱く、IC50値は12.8nM以上、最大パーセント値は48.5%以下であった。ADCから放たれた遊離Dxdペイロードは細胞を死滅させ、IC50値は787pM~11.8nMの範囲、死滅が最大の%値は96.1%~98.2%の範囲であった。
以下の表28では、C4-2およびC4-2/STEAP2 KO細胞における、本開示に従い調製した抗STEAP2 ADCの細胞毒性のデータを要約する。
表28に示すように、N297Qを介してコンジュゲートされた抗STEAP2 ADCは、C4-2細胞を死滅させ、IC50値は31.5nMおよび32.2nM、死滅が最大の%は54.8%および58.4%であったが、これらの同じADCはC4-2/STEAP2 KO細胞で細胞毒性が弱く、IC50値は100nMを超えていた。また、非結合性の対照ADCとコンジュゲートされた抗STEAP2抗体は両被験細胞で細胞毒性が弱く、IC50値は100nMを超えていた。ADCから放出された遊離DxdペイロードはC4-2とC4-2/STEAP2 KO細胞の両方を死滅させ、IC50値はそれぞれ2.54nMおよび3.43nM、死滅が最大の%はそれぞれ81.7%および98.9%であった。
実施例24:SKBR3細胞を用いたアッセイ
SK-BR-3ヒト乳腺腺癌(胸膜滲出液)細胞株を使用して抗増殖アッセイを行った。細胞を、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを補足したMcCoyの5a培地で成長させた。ADC添加の1日前に細胞を96ウェルプレート中の80ul完全成長培地に1000/ウェルで蒔き、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。ADCをアッセイ培地(Opti-MEM+0.1%BSA)中10点で、1:3に段階希釈した。試験を行うADCの濃度の範囲は1nM~約1000nMをカバーし、またEC50を確認するために細胞死滅効力に基づき様々な濃度から始めても同じ範囲をカバーしており、最後のウェル(10番目)はブランク(ADCも化合物もない)のままである。化合物を先ず50nM50uM(各化合物の出発濃度はEC50に応じて異なる)から始めてDMSO中10点で1:3に段階希釈し、最後のウェルはブランク(DMSOしか含んでいない)のままであった。10ulのDMSO希釈化合物を、96ウェルのディープウェル希釈プレート中の990ulアッセイ培地(Opti-MEM+0.1%BSA)に移した。20ulのアッセイ培地で希釈したADCと化合物を細胞に添加した。細胞を37℃、5%CO2で6日間(144時間)インキュベートした。100ulのCTG試薬/ウェルを、Promegaの細胞CellTiter-Glo(登録商標)(Cat.No G7573)に添加することでプレートを発育させ(developed)、室温で10分間浸透させ、白色で粘着性の底部シールで封をして、発光をEnvisionで読み取った。死滅の%=[1-(T144sample-T144blank)/(T144DMSO-T144blank)]×100%。ここで、T144は144時間でのデータである。ペイロード化合物の溶液を次のように調製する。化合物を先ず作動濃度(各化合物の出発濃度はEC50に応じて異なる)から始めてDMSO中10点で1:3に段階希釈し、最後のウェルはブランク(DMSOしか含んでいない)のままであった。10ulのDMSO希釈化合物を、96ウェルのディープウェル希釈プレート中の990ulアッセイ培地(Opti-MEM+0.1%BSA)に移した。20ulのアッセイ培地で希釈したADCと化合物を細胞に添加する。
ADCと対照ADCに加え、遊離ペイロード(DXDとP3)のEC50値を表21と表23に要約した。
実施例25:FGFR2 ADCのin vivo有効性試験
本実験では、SNU-16胃癌異種移植片の増殖に対する、本開示によるFGFR2b抗体薬物コンジュゲート(ADC)の効果を測定した。
実験手順
SNU16異種移植片(ヒト胃癌異種移植片)に対するFGFR2b Dxd ADCの抗腫瘍活性を評価するべく、Matrigel(BD Biosciences)と混合した5×106のSNU-16細胞(ATCC)を、オスのBALB/c SCIDマウス(6~8週齢、Jackson Laboratory)の側腹部皮下に植え込んだ。腫瘍の平均体積が200~250mm3に達した後、マウスを処置群に無作為割付けした(1群につきn=6匹のマウス)。ADCはすべて皮下注射で投与した。腫瘍体積は実験期間にわたり週2回測定した。腫瘍成長(処置開始時から実験終了までの変化)の平均(平均+/-標準偏差)を処置群ごとに算出した。腫瘍成長の減少率を、アイソタイプ対照群との比較により算出し、実験の終了時の腫瘍の退縮率を、処置の開始時の腫瘍体積との比較により算出した。DARの異なるADCを利用した2つの別個の実験の結果を表30に示す。
表30、図8A、および図8Bに示すように、この結果から、FGFR2b Dxd ADCは用量に依存してSNU-16腫瘍異種移植片の完全な退縮を誘導することが実証される。
実施例26:HER2 ADCのin vivo有効性試験
本実験では、N87異種移植片に対しトラスツズマブ-GGFG-DxD(対照薬の抗HER2 ADC対照)とトラスツズマブ-vcPAB-G-DxD(本発明の抗HER2 ADC)とを比較した。
実験手順:
HER2 IHC 3+N87細胞株異種移植片モデルにおけるトラスツズマブ対照薬抗体の抗腫瘍有効性を評価した。メスのSCIDマウスの右側腹部の皮下にのMatrigelと1:1で混合した5×106細胞を植え込んで腫瘍を確立させた。処置開始前、すなわち植込み後7日間、腫瘍を約250mm3に成長させた。マウスを6つの群の無作為割付けし、試験ADCまたは対照ADCを単回投与した。腫瘍成長を処置後70日間モニタリングした。
実験結果:
本試験は、HER2 IHC 3+N87細胞株異種移植片を有するSCIDマウスに対して実施し、DxD対照薬LP、またはトランスグルタミナーゼ化学作用および分枝アジドリンカーBL7を介してコンジュゲートされた本開示のLP1のうちいずれかにコンジュゲートさせたトラスツズマブ対照薬抗体の活性を評価した。HER2シグナル伝達中毒を及ぼすN87異種移植片におけるネイキッドトラスツズマブの効果を最小限にするべく1回量を5mg/kgにデザインした。対照薬-Dxd LPまたは対照LP1 ADCを投与した異種移植片の成長は、ネイキッド対照abを投与した腫瘍と比較して有意な遅延はなかった。しかし、試験期間にわたり5mg/kgのADC用量でトラスツズマブ対照薬-Dxd LPおよび本開示のトラスツズマブ-LP1を投与した腫瘍には、完全な腫瘍退縮は観察されなかった。2つの試験ADCの効果は、本試験で鑑別不能であった。
本試験では、トラスツズマブ抗体にコンジュゲートされる本開示によるLP1 Dxdリンカーペイロードが、同じ抗体にコンジュゲートされる前述のDxD対照薬リンカーペイロードと少なくとも同等の有効性であったことを実証する。
実施例27:STEAP2 ADCのin vivo有効性試験
本実験では、STEAP2細胞株異種移植片モデルに対するSTEAP2 ADC有効性を評価した。
実験手順:
C4-2異種移植片に対するSTEAP2 Dxd ADCの活性を評価するべく、オスのSCIDマウスの右脇腹の皮下にMatrigelと1:1で混合した7.5×106のC4-2細胞を植え込むことで、腫瘍を確立させた。処置開始前、すなわち植込み後15日間、腫瘍を約200mm3に成長させた。マウスを腫瘍体積に基づき8つの群に無作為割付けし、試験ADCまたは対照ADCを単回投与した。腫瘍成長を処置後50日間モニタリングした。
実験結果:
STEAP2 Dxd ADCのin vivo有効性を対照薬剤と比較して評価した(表33)。対照Dxd ADCは、ビヒクルを投与した腫瘍と比較して部分的に腫瘍成長を遅らせた。3mg/kgのSTEAP2 Dxd ADCを単回投与することで、腫瘍成長が持続的に阻害された。10mg/kgのSTEAP2 Dxd ADCでは完全な腫瘍退縮が生じ、試験期間中に腫瘍再成長は観察されなかった。C4-2腫瘍は、成長につれてマウスに体重減少を生じさせる。3または10mg/kgのSTEAP2 Dxd ADCでは、試験期間中に体重減少がそれぞれ部分的および完全に救済される。
上記で示すように、本開示による抗STEAP2 ADCは、STEAP2陽性C4-2細胞株異種移植片に対して有意な抗腫瘍有効性を実証した。
実施例28:PRLR ADCのin vivo有効性試験
本実験では、T47D細胞株異種移植片モデルに対する抗PRLR ADC有効性を評価した。ペイロードDM1の構造を以下に示す。
リンカーペイロードM1(mcc-DM1)を、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第WO2015/031396号(国際出願PCT/US14/52757)に従い調製した。リンカーペイロードM1を、非標的対照抗体または国際公開第WO2015/031396号に記載される抗PRLR抗体のいずれかのリシン残基にコンジュゲートさせた。
実験手順:
T47DvIIと名付けられた腫瘍形成性T47D細胞を予めin vivo継代で生成した。事前に90日間持続放出エストロゲン(estroge)ペレット(Innovative Research of America)を植え込んだメスのSCIDマウスの右脇腹の皮下に、Matrigelと1:1で混合した10×106のT47DvII細胞を植え込むことで、T47D腫瘍を確立させた。処置開始前、すなわち植込み後20日間、腫瘍を100~200mm3に成長させた。マウスを7つの群に無作為割付けし、試験ADCまたは対照ADCを単回投与した。腫瘍成長を処置後45日間モニタリングした。
実験結果:
PRLR DXd ADCの単回投与によるin vivo有効性を、PRLR DM1 ADCと比較した(表35)。対照DM1でも対照DXd ADCでも、ビヒクルを投与した腫瘍と比較して腫瘍成長に遅れは認められなかった。10mg/kgのPRLR DM1 ADCを単回投与すると、腫瘍の有意な退縮が生じた。しかし、5mg/kgと10mg/kgのPRLR Dxd ADCで、より大きな腫瘍退縮を観察した。処置に関連する体重変化は観察されなかった。全群において試験期間中に約10~15%の体重増加を観察した。
上記で示すように、抗PRLR ADCは、PRLR陽性T47D細胞株異種移植片に対して有意な抗腫瘍有効性を実証した。
実施例29:MET ADCのin vivo有効性試験
本実験では、EBC1異種移植片における抗MET ADC有効性を評価した。
本実施例で利用した抗MET/MET二重特異性抗体は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願第2018/0134794号に記載されている。
実験手順:
抗MET二重特異性MET/MET Dxd ADCの抗腫瘍有効性を、EBC1 NSCLC異種移植片に対して評価した。オスのSCIDマウスの右側腹部の皮下に5×106細胞を植え込んで腫瘍を確立させた。処置開始の前に腫瘍を約130mm3に成長させた。マウスを6つの群に無作為割付けし、試験ADCまたは対照ADCを単回投与した。腫瘍成長を処置後21日間モニタリングした。
実験結果:
MET/MET Dxd ADCの活性を、EBC1腫瘍異種移植片モデルに対して評価した(表37)。ここでは、MET/MET Dxd ADCの単回投与を、1、2.5、および5mg/kgの投与と比較した。1mg/kgのMET/MET Dxd ADCの投与では、それぞれの対照ADCと比較して腫瘍成長の遅れを認めた。2.5および5mg/kgのMET/MET Dxd ADCでの処置は、腫瘍異種移植片の有意で持続的な退縮を媒介した。
上記で示すように、MET ADCは、METで増幅されたNSCLC細胞株異種移植片に対して有意な抗腫瘍有効性を実証した。
実施例30:EGFRvIII ADCのin vivo有効性試験
本実験では、U251/EGFRvIII異種移植片モデルにおける抗EGFRvIII ADC有効性を評価した。
実験手順:
標的の内在的な発現がin vitro培養後に喪失すると、EGFRvIIIを発現するようにトランスフェクトされたU251膠芽腫細胞株異種移植片モデルに対して、EGFRvIII Dxd ADCの抗腫瘍有効性を評価した。オスのSCIDマウスの右側腹部の皮下にMatrigelと1:1で混合した10×106細胞を植え込んで、U251/EGFRvIIIを確立させた。処置開始前、すなわち植込み後30日間、腫瘍を約150mm3に成長させた。マウスを8つの群に無作為割付けし、試験ADCまたは対照ADCを単回投与した。腫瘍成長を処置後70日間モニタリングした。
実験結果:
U251/EGFRvIII異種移植片を有するマウスに対する試験では、0.5、1、または3mg/kgのADCの単回投与後のEGFRvIII Dxd ADCの活性を評価した(表39)。対照Dxd ADCを投与した異種移植片の成長は、ビヒクル対照と比較してわずかにしか遅れなかった。しかし、腫瘍成長の有意な遅延を、EGFRvIII Dxd ADCを投与した腫瘍で観察した。より高量のADC用量では、より持続的な抗腫瘍活性が生じた。抗EGFRvIII処置群はすべて、投薬後約70日で試験を完了するまで生存した。全群において試験期間中に約10~15%の体重増加を観察した。
EGFRvIII Dxd ADCは、EGFRvIIIがトランスフェクトされた多形膠芽腫細胞株異種移植片に対して有意な抗腫瘍有効性を実証する。
本開示の範囲と趣旨から逸脱することなく上記の発明特定事項に様々な変更を行うことができるため、上記の説明に含まれる、または添付の特許請求の範囲に定義されるすべての発明特定事項は、本開示を表し例示するものと解釈されることが意図される。上記の教示に照らして、本開示に対して多くの修正と改変が可能である。したがって、本明細書は、添付の特許請求の範囲内にあるこのような変更、修正、および改変をすべて包含するように意図される。
本明細書で引用される特許、特許出願、刊行物、試験方法、文献、その他の資料はすべて、あたかも本明細書で物理的に存在するかのごとく、その全体を参照により本明細書で援用される。
Claims (107)
- 式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’および基B’’のうち少なくとも1つは、-N3および
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または構造:
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、
mは、1~30の整数であり、
nは、1~30の整数である、
化合物。 - 式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’の少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、基B’と基B’’は少なくとも1つの付加物を形成し、
Mは、存在しないか、または構造:
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、
nは、1~30の整数である、
化合物。 - 前記BAが、抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記BAが、抗HER2抗体、抗STEAP2抗体、抗MET抗体、抗EGFRVIII抗体、抗MUC16抗体、抗PRLR抗体、抗PSMA抗体、抗FGFR2抗体、抗FOLR1抗体、抗HER2/HER2二重特異性抗体、抗MET/MET二重特異性抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントである、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記BAが、抗HER2/HER2二重特異性抗体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記抗HER2/HER2二重特異性抗体が、
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含み、
D1は、ヒトHER2の第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトHER2の第2のエピトープを特異的に結合する、
請求項5に記載の化合物。 - D1とD2が、ヒトHER2への結合において互いに競合しない、請求項6に記載の化合物。
- 前記BAが、表1に明記されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む抗STEAP2抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記抗STEAP2が、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/58、74/58、82/58、90/58、98/58、106/114、122/130、138/146、154/162、170/178、186/194、202/210、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、および378/386からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項7に記載の化合物。
- 前記BAが、抗MET/MET二重特異性抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記抗MET/MET二重特異性抗体が、
第1の抗原結合性ドメイン(D1)と、
第2の抗原結合性ドメイン(D2)と
を含み、
D1は、ヒトMETの第1のエピトープを特異的に結合し、
D2は、ヒトMETの第2のエピトープを特異的に結合する、
請求項10に記載の化合物。 - D1とD2が、ヒトMETへの結合において互いに競合しない、請求項11に記載の化合物。
- 前記BAが、表3に明記されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む抗MET/MET二重特異性抗体である、請求項1から4、および請求項10から12のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記BAが、D1抗原結合性ドメインとD2抗原結合性ドメインとを含む抗MET/MET二重特異性抗体であり、D1抗原結合性ドメインは、配列番号2012/2092のHCVR/LCVRアミノ酸配列対、または配列番号2014-2016-2018-2094-2096-2098を含む一組の重鎖および軽鎖CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含み、D2抗原結合性ドメインは、配列番号2036/2092のHCVR/LCVRアミノ酸配列対、または配列番号2038-2040-2042-2094-2096-2098を含む一組の重鎖および軽鎖CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含む、請求項1から4、および請求項10から13のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記BAが、H4H13306P2由来のD1とH4H13312P2由来のD2とを含む抗MET/MET二重特異性抗体H4H14639Dである、請求項1から4、および請求項10から13のいずれか一項に記載の化合物。
- グルタミン残基Glnが、前記BAのCH2またはCH3ドメインに自然に存在する、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
- グルタミン残基Glnが、1つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより前記BAに導入される、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
- Glnが、Q295またはN297Qである、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記BAが、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、または脳癌からなる群から選択される癌を標的とする、請求項1から18のいずれか一項に記載の化合物。
- L1が、C1-6アルキル、フェニル、-NH-、-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、2~4個のアミノ酸を含むペプチドユニット、またはそれらの組合せを含み、これらのそれぞれは、-S-、-S(O2)-、-C(O)-、-C(O2)-、およびCO2Hのうち1つまたは複数により任意選択で置換され、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数である、請求項1から19のいずれか一項に記載の化合物。
- L1が、
- Bが、基B’の1つの付加物を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の化合物。
- -NH-L1-B’が、
- 前記基B’がアジド(-N3)であり、前記基B’の付加物はトリアゾールを含む、請求項23に記載の化合物。
- Bが、基B’の2つの付加物を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の化合物。
- Bが、基B’の3つの付加物を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の化合物。
- Bが、基B’の少なくとも4つの付加物を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の化合物。
- Bが、
- Bが、
- -NH-L1-Bが、
- 前記基B’がアジド(-N3)であり、前記基B’および基B’’の付加物がトリアゾールを含む、請求項30に記載の化合物。
- 前記基B’および基B’’の付加物は、
- Mが存在しない、請求項1から32のいずれか一項に記載の化合物。
- Mは
- Mは
- nが2である、請求項1から35のいずれか一項に記載の化合物。
- nが4である、請求項1から35のいずれか一項に記載の化合物。
- nが8である、請求項1から35のいずれか一項に記載の化合物。
- nが12である、請求項1から35のいずれか一項に記載の化合物。
- nが16である、請求項1から35のいずれか一項に記載の化合物。
- nが24である、請求項1から35のいずれか一項に記載の化合物。
- L2が、式(L2):
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2)
による構造を有し、式中、
B’’は、基B’に共有結合可能な基であり、
SP1は、存在しないか、または第1のスペーサユニットであり、
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または第2のスペーサユニットであり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、またはDxdに共有結合される第3のスペーサユニットであり、pは、1~12の整数である、
請求項1から41のいずれか一項に記載の化合物。 - 少なくとも1つの基B’’は、-N3、
- SP1が、存在しないか、または、
- B2が、存在しないか、または、
- SP2が、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択され、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数である、請求項42から44のいずれか一項に記載の化合物。
- AAが、グリシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、グルタミン酸、リシン、フェニルアラニン、およびシトルリン、ならびにそれらの組合せから選択される2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットである、請求項42から45のいずれか一項に記載の化合物。
- AAが、バリン-シトルリン、バリン-アラニン、またはフェニルアラニン-リシンである、請求項47に記載の化合物。
- AAが、グリシン-グリシン-グリシン(GGG)、グリシン-グリシン-グリシン-グリシン(GGGG(配列番号2113))、グリシン-グリシン-フェニルアラニン(GGF)、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン(GGFG(配列番号2114))、L-グルタミン酸-バリン-シトルリン(LEVC)、およびD-グルタミン酸-バリン-シトルリン(DEVC)からなる群から選択される、請求項47に記載の化合物。
- SP3が、存在しないか、または、
- M-Dxdが、
-
-
-
- 式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、
Mは、存在しないか、または構造:
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、
nは、1~30の整数である、
化合物。 - 式(L2-P)、(L2’-P)、または(L2’’-P):
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2-P)、
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’-P)、
マレイミド-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’’-P)
による化合物であって、式中、
B’’は、-N3、
SP1は、存在しないか、または
SP2は、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択される第2のスペーサユニットであり、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数であり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
pは、1~12の整数である、
化合物。 - AAが、グリシン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、グルタミン酸、リシン、アラニン、およびシトルリン、ならびにそれらの組合せから選択される2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットである、請求項56に記載の化合物。
- AAが、バリン-シトルリン、バリン-アラニン、またはフェニルアラニン-リシンである、請求項57に記載の化合物。
- AAが、グリシン-グリシン-グリシン(GGG)、グリシン-グリシン-グリシン-グリシン(GGGG(配列番号2113))、グリシン-グリシン-フェニルアラニン(GGF)、グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン(GGFG(配列番号2114))、およびグルタミン酸-バリン-シトルリン(EVC)からなる群から選択される、請求項57に記載の化合物。
-
- 式(L2’-P)による構造、または
-
- 式(II):
Ab-(Gln-NH-L1-B-(SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)k)p)n(II)
による抗体薬物コンジュゲートであって、式中、
Abは抗体であり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、存在しないか、または第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、基B’は、-N3、
B’’-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)pは、請求項55から60のうちいずれかによる式(L2-P)による化合物であり、式(L2-P)の化合物は、基B’および基B’’の付加物を介して抗体に共有結合され、kは、1~12の整数であり、pは、1~30の整数であり、nは、1~30の整数である、
抗体薬物コンジュゲート。 - 抗体とリンカーペイロードとを含む抗体薬物コンジュゲートであって、前記リンカーペイロードが、
式中、
- 約0.5~約30.0の薬物抗体比(DAR)を有する、請求項1から61のいずれか一項に記載の化合物の集団を含む組成物。
- 約1.0~約2.5のDARを有する、請求項64に記載の組成物。
- 約2のDARを有する、請求項66に記載の組成物。
- 約3.0~約4.5のDARを有する、請求項64に記載の組成物。
- 約4のDARを有する、請求項68に記載の組成物。
- 約6.5~約8.5のDARを有する、請求項64に記載の組成物。
- 約8のDARを有する、請求項70に記載の組成物。
- 約10~約14のDARを有する、請求項64に記載の組成物。
- 約12のDARを有する、請求項72に記載の組成物。
- 約14~約18のDARを有する、請求項64に記載の組成物。
- 約16のDARを有する、請求項74に記載の組成物。
- 約22~約24.5のDARを有する、請求項64に記載の組成物。
- 約24のDARを有する、請求項76に記載の組成物。
- 式(P-I):
-
- 抗体、リンカー、およびペイロードを含む抗体薬物コンジュゲートであって、前記ペイロードは請求項79に記載の化合物である、抗体薬物コンジュゲート。
- 抗体、リンカー、およびペイロードを含む抗体薬物コンジュゲートであって、前記ペイロードは、
- 式(P2):
-
- 請求項78から83のいずれか一項に記載の化合物と、希釈剤、担体、および/または賦形剤とを含む医薬組成物。
- 疾病の処置を必要とする対象の疾病を処置する方法であって、請求項1から61、もしくは請求項78から83のいずれか一項に記載の化合物、または請求項64から71もしくは84のいずれか一項に記載の組成物を、治療有効量で前記対象に投与する工程を含む方法。
- 前記疾病が癌である、請求項85に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、または脳癌からなる群から選択される、請求項86に記載の方法。
- 前記疾病がHER2+乳癌である、請求項86または87に記載の方法。
- 請求項78から83のいずれか一項に記載の化合物を細胞へと選択的に送達する方法。
- 請求項78から83のいずれか一項に記載の化合物により、細胞表面上で抗原を選択的に標的とする方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項89または90に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項89から91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が癌細胞である、請求項89から92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、肝臓癌細胞、または脳癌細胞からなる群から選択される、請求項93に記載の方法。
- 式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
kとmは、独立して1~12の整数であり、nは、1~30の整数であり、
前記方法は、
(a)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を化合物L1-Bと接触させる工程であって、分枝ユニットBは少なくとも1つの基B’を含む、工程と、
(b)工程(a)の生成物を、化合物L2-(-M-Dxd)mのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法。 - 式(A):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
前記方法は、
(a)分枝ユニットBが少なくとも1つの基B’を含む化合物L1-Bを、化合物L2-(-M-Dxd)mのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は、基B’と共有結合可能な少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を、工程(a)のL1-B-(L2-(-M-Dxd)m)k生成物と接触させる工程と、
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法。 - 式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、式中、
BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、
Glnは、グルタミン残基であり、
L1は、第1のリンカーであり、
Bは、基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、
L2は、少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される第2のリンカーであり、
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
kは、1~12の整数であり、nは、1~30の整数であり、
前記方法は、
(a)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)を化合物L1-Bと接触させる工程であって、分枝ユニットBは少なくとも1つの基B’を含む、工程と、
(b)工程(a)の生成物を、化合物L2-M-Dxdのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は、基B’に共有結合可能な少なくとも1つの基B’’を含み、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法。 - 式(I):
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L1は、上述される第1のリンカーであり、Bは、上述される基B’および基B’’のうち少なくとも1つの付加物を含む分枝ユニットであり、L2は、上述される少なくとも1つの基B’’を介して分枝ユニットBに共有結合される、上述される第2のリンカーであり、Mは、存在しないか、または
前記方法は、
(a)分枝ユニットBが少なくとも1つの基B’を含む化合物L1-Bを、化合物L2-M-Dxdのk個以上の等価物と接触させる工程であって、リンカーL2は少なくとも1つの基B’’を含み、接触によりL1-B-(-L2-M-Dxd)kが産生され、基B’およびB’’のうち1つは、-N3および
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含む結合剤BA(BA-Gln-NH2)を、工程(a)のL1-B-(L2(M-Dxd)k生成物と接触させる工程と、
(c)産生された式(I)の化合物を単離する工程と
を含む方法。 - 式(III):
BA-(Gln-NH-L2’-P))n(III)
による構造を有する化合物を産生する方法であって、
式中、BAは、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、Glnは、グルタミン残基であり、L2’-Pは、上述されるH2N-SP1-B2-(SP2-AA-SP3-M-Dxd)pであり、nは、1~30の整数であり、
SP1は、存在しないか、または
B2は、存在しないか、または分枝ユニットであり、
SP2は、存在しないか、または、C1-6アルキル、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、もしくはそれらの組合せからなる群から選択される第2のスペーサユニットであり、下付き文字uとvは、独立して1~8の整数であり、
AAは、存在しないか、または2~4つのアミノ酸を含むペプチドユニットであり、
SP3は、存在しないか、または
Mは、存在しないか、または
Dxdは、式(P):
pは、1~30の整数であり、
前記方法は、
(b)トランスグルタミナーゼの存在下、少なくとも1つのグルタミン残基Glnを含むBA(BA-Gln-NH2)をL2’-Pと接触させる工程と、
(c)産生された式(III)の化合物を単離する工程と
を含む方法。 - グルタミン残基Glnが、前記BAのCH2またはCH3ドメインに自然に存在する、請求項95から98のいずれか一項に記載の方法。
- グルタミン残基Glnが、1つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより前記BAに導入される、請求項95から98のいずれか一項に記載の方法。
- Glnが、Q295またはN297Qである、請求項95から98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスグルタミナーゼが微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)である、請求項95から98のいずれか一項に記載の方法。
- Mが存在せず、または、M-Dxdが
- 前記化合物L2-Dxdが、
- 前記化合物L2-Dxdが、
- 前記化合物L2-Dxdが、
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