CN116390771A - 与蛋白中的谷氨酰胺残基缀合的喜树碱类似物及其用途 - Google Patents

与蛋白中的谷氨酰胺残基缀合的喜树碱类似物及其用途 Download PDF

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Abstract

本文描述了蛋白‑药物缀合物及其组合物，该蛋白‑药物缀合物及其组合物可用于例如治疗部分例如喜树碱类似物和/或衍生物的靶向特异性递送。在某些实施方案中，提供了用于利用转谷氨酰胺酶和1,3‑环加成技术的组合产生蛋白‑药物构建体(例如抗体‑药物缀合物)的特异性且有效方法。提供了喜树碱类似物、抗体‑药物缀合物和包括谷氨酰胺酰基修饰的抗体和喜树碱类似物有效载荷的组合物。

Description

与蛋白中的谷氨酰胺残基缀合的喜树碱类似物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年7月13日提交的美国临时申请系列第63/051,172号和于2021年2月26日提交的美国临时申请系列第63/154,531号的优先权，所述申请的内容通过引用以其整体并入本文。
本公开内容的领域
本公开内容涉及蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、药物组合物及用其治疗疾病的方法。还提供了利用转谷氨酰胺酶和1,3-环加成技术的组合产生蛋白-药物构建体的特异性且有效的方法。更具体地，本公开内容涉及包括喜树碱类似物和衍生物的蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)。
序列表
序列表的正式副本作为ASCII格式序列表的纸质副本经由EFS-Web与说明书同时提交，具有文件名为250298_000244_SL.txt，并且大小为约996千字节，并且于2021年7月12日创建。包含在ASCII格式文档的该纸质副本中的序列表是说明书的一部分，并且通过引用以其整体并入本文。
本公开内容的背景
增生性疾病以异常细胞不受控制的生长和扩散为特征。如果扩散得不到控制，它可能导致死亡。异常增殖，例如，癌症是由外部因素(例如烟草、化学物质、辐射和感染性生物体)和内部因素(遗传突变、免疫系统状况、代谢发生的突变)两者引起的。这些致病因素可能一起或依次作用，启动或促进异常增殖。癌症通过手术、放射、化学疗法、激素和免疫疗法来治疗。然而，对更有效的抗增殖药物存在需求。
理想的抗增殖疗法将使高度细胞毒性剂靶向递送至肿瘤细胞成为可能，并且将不影响正常细胞。由于药物对非癌细胞的作用引起的毒副作用，常规化学疗法治疗是有缺陷的。已经尝试了各种靶向药物递送的方法，包括使用肿瘤靶向探针(诸如抗体或生长因子)与阻止蛋白合成和细胞的毒素诸如假单胞菌或白喉毒素的缀合物。然而，副作用包括由于缀合物的非人类组分引起的免疫系统反应。此外，由于通过肾过滤从循环中消除、以及示意性降解、被网状内皮系统(RES)摄取以及在非靶向器官和组织中累积，药物缀合物的半衰期受到限制。
另一种方法使用被动药物载体，诸如聚合物、脂质体和聚合物胶束，以利用肿瘤组织血管内皮的高渗透性。由于增强的渗透性和保持机制，聚合物药物和大分子在实体瘤内累积。然而，使用这样的靶向递送的障碍包括外来颗粒从血液中快速清除，以及获得具有用于结合肿瘤细胞所需的特异性和选择性的高度标准化、药学上可接受的药物递送系统的技术障碍。
蛋白缀合物，诸如抗体缀合物，利用结合剂的选择性结合将有效载荷递送至受试者组织内的靶。有效载荷可以是能够对靶处采取行动的治疗部分。
数种将接头和有效载荷与抗体缀合的技术是可得的。许多缀合物是通过与抗体中的半胱氨酸或赖氨酸残基的非选择性共价连接来制备的。这种非选择性技术可以导致在不同的位点具有缀合物并且每个抗体具有不同数目缀合物的产物的异质混合物。因此，本领域对提供位点选择性抗体缀合的方法和技术存在需求。
本领域对用于在单一疗法和组合疗法中使用的另外的安全且有效的抗肿瘤靶向剂(其可以与多种抗原结合以提供疾病诸如癌症的增强治疗)存在需求。在某些实施方案中，本公开内容满足需求并且提供其他优点。
呈现前述讨论仅仅是为了提供对本领域所面临的问题性质的更好的理解，并且不应该以任何方式被解释为对现有技术的承认，也不应该将本文中任何参考文献的引用解释为对这样的参考文献构成本申请的“现有技术”的承认。
公开内容的概述
下文描述本公开内容的多种非限制性方面和实施方案。
在一个方面，本公开内容提供了具有根据式(A)的结构的化合物：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元，其中所述基团B’和基团B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040000031
并且所述基团B’和B”中的另一个选自
Figure BDA0004122749040000032
以及/>
Figure BDA0004122749040000033
其中Q是C或N；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是具有结构
Figure BDA0004122749040000034
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000041
k是从1至12的整数；
m是从1至30的整数，并且
n是从1至30的整数。
在另一个方面，本公开内容提供了具有根据式(I)的结构的化合物：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)，
其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是包括基团B’的至少一个加合物的支化单元，其中所述基团B’选自-N3、
Figure BDA0004122749040000042
Figure BDA0004122749040000043
以及/>
Figure BDA0004122749040000044
其中Q是C或N；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头，其中所述基团B’和所述基团B”形成至少一个加合物；
M不存在或者是具有结构
Figure BDA0004122749040000045
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000051
k是从1至12的整数，并且
n是从1至30的整数。
在一种实施方案中，BA是抗体或其抗原结合片段。
在一种实施方案中，BA是抗HER2抗体、抗HER2/HER2双特异性抗体、抗STEAP2抗体、抗MET抗体、抗MET/MET双特异性抗体、抗EGFRVIII抗体、抗MUC16抗体、抗PRLR抗体、抗PSMA抗体、抗FGFR2抗体、抗FOLR1抗体或其抗原结合片段。
在一种实施方案中，BA是包括表1中示出的HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗STEAP2抗体。
在一种实施方案中，BA是抗HER2/HER2双特异性抗体。在一种实施方案中，BA结合HER2蛋白的两个独立表位。
在一种实施方案中，抗HER2/HER2双特异性抗体包括：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性结合人类HER2的第一表位；并且
其中D2特异性结合人类HER2的第二表位。
在一种实施方案中，D1和D2不彼此竞争与人类HER2的结合。
在一种实施方案中，BA是抗MET/MET双特异性抗体。在一种实施方案中，BA结合MET蛋白的两个独立表位。
在一种实施方案中，抗MET/MET双特异性抗体包括：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性结合人类MET的第一表位；并且
其中D2特异性结合人类MET的第二表位。
在一种实施方案中，D1和D2不彼此竞争与人类MET的结合。
在一种实施方案中，BA是包括表3中示出的HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗MET/MET双特异性抗体。
在一种实施方案中，BA是包括D1抗原结合结构域和D2抗原结合结构域的抗MET/MET双特异性抗体，其中D1抗原结合结构域包括SEQ ID NO:2012/2092的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包括SEQ ID NO:2014-2016-2018-2094-2096-2098的一组重链CDR和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，并且其中D2抗原结合结构域包括SEQ ID NO:2036/2092的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包括SEQ ID NO:2038-2040-2042-2094-2096-2098的一组重链CDR和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
在一种实施方案中，BA是抗MET/MET双特异性抗体H4H14639D，所述抗MET/MET双特异性抗体H4H14639D包括来源于H4H13306P2的D1和来源于H4H13312P2的D2。
在一种实施方案中，抗STEAP2包括选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10；SEQ ID NO:18/26；SEQ ID NO:34/42；SEQ ID NO:50/58；SEQ ID NO:66/58；SEQ ID NO:74/58；SEQ ID NO:82/58；SEQ ID NO:90/58；SEQ ID NO:98/58；SEQ IDNO:106/114；SEQ ID NO:122/130；SEQ ID NO:138/146；SEQ ID NO:154/162；SEQ ID NO:170/178；SEQ ID NO:186/194；SEQ ID NO:202/210；SEQ ID NO:218/226；SEQ ID NO:234/242；SEQ ID NO:250/258；SEQ ID NO:266/274；SEQ ID NO:282/290；SEQ ID NO:298/306；SEQ ID NO:314/322；SEQ ID NO:330/338；SEQ ID NO:346/354；SEQ ID NO:362/370；和SEQID NO:378/386。
在一种实施方案中，谷氨酰胺残基Gln天然存在于BA的CH2结构域或CH3结构域中。
在一种实施方案中，谷氨酰胺残基Gln通过修饰一个或更多个氨基酸而引入至BA中。
在一种实施方案中，Gln是Q295或N297Q。
在一种实施方案中，BA靶向选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌或脑癌。
在一种实施方案中，L1包括C1-6烷基、苯基、-NH-、-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、包括2个至4个氨基酸的肽单元或其组合，其中的每一种能够任选地被-S-、-S(O2)-、-C(O)-、-C(O2)-和CO2H中的一个或更多个取代，其中下标u和v独立地是1至8的整数。
在一种实施方案中，L1选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000071
Figure BDA0004122749040000072
其中RA是包括炔烃、叠氮化物、四嗪、反式环辛烯、马来酰亚胺、胺、酮、醛、羧酸、酯、硫醇、磺酸、甲苯磺酸酯、卤化物、硅烷、氰基基团、糖类基团、生物素基团、脂质残基的基团，并且其中下标x、n、p和q独立地是0至12的整数，以及其组合。
在一种实施方案中，B包括基团B’的一个加合物。
在一种实施方案中，-NH-L1-B’选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000073
Figure BDA0004122749040000081
其中所述
Figure BDA0004122749040000082
是附接至所述BA的谷氨酰胺残基的氨基附接点。
在一种实施方案中，基团B’是叠氮化物(-N3)，并且基团B’的加合物包括三唑。
在一种实施方案中，B包括基团B’的两个加合物。
在一种实施方案中，B包括基团B’的三个加合物。
在一种实施方案中，B包括基团B’的至少四个加合物。
在一种实施方案中，B包括选自由以下组成的组的基团：
Figure BDA0004122749040000083
Figure BDA0004122749040000091
其中(B’)包括基团B’的加合物的附接点。
在一种实施方案中，B选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000092
Figure BDA0004122749040000101
在一种实施方案中，-NH-L1-B选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000102
Figure BDA0004122749040000111
其中所述
Figure BDA0004122749040000112
是附接至BA的谷氨酰胺残基的氨基附接点。
在一种实施方案中，基团B’是叠氮化物(-N3)，并且基团B’的加合物包括三唑。
在一种实施方案中，基团B’和基团B”的加合物具有选自以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000113
其中Q是C或N。
在一种实施方案中，M不存在。
在一种实施方案中，M是
Figure BDA0004122749040000114
其中R、R’和R”在每次出现时是氢，即M是/>
Figure BDA0004122749040000121
在一种实施方案中，M是
Figure BDA0004122749040000122
其中R是氢并且R’和R”一起形成5元环，即M是/>
Figure BDA0004122749040000123
在一种实施方案中，n是2。在一种实施方案中，n是4。在一种实施方案中，n是8。在一种实施方案中，n是12。在一种实施方案中，n是16。在一种实施方案中，n是24。
在一种实施方案中，L2具有根据式(L2)的结构：
B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2)，
其中：
B”是能够与所述基团B’共价附接的基团；
SP1不存在或者是第一间隔物单元；
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是第二间隔物单元；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是与所述Dxd共价附接的第三间隔物单元，并且
p是从1至12的整数。
在一种实施方案中，至少一个基团B”选自由以下组成的组：-N3、
Figure BDA0004122749040000124
Figure BDA0004122749040000125
及其组合。
在一种实施方案中，SP1不存在或者选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000126
Figure BDA0004122749040000131
在一种实施方案中，B2不存在或者选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000132
Figure BDA0004122749040000133
在一种实施方案中，SP2不存在或者选自由以下组成的组：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数。
在一种实施方案中，AA是包括2个至4个氨基酸的肽单元，所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和瓜氨酸及其组合。
在一种实施方案中，AA是缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸。
在一种实施方案中，AA选自由以下组成的组：甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGG)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGGG(SEQ ID NO:2113))、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(GGF)、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG(SEQ ID NO:2114))、L-谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(LEVC)和D-谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(DEVC)。
在一种实施方案中，SP3不存在或者选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000134
Figure BDA0004122749040000141
及其组合，其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自/>
Figure BDA0004122749040000142
的基团。
在一种实施方案中，M-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000143
其中R是氢或C1-C4烷基，并且其中
Figure BDA0004122749040000146
表示L2的附接点。
在一种实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000144
在一种实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000145
在一种实施方案中，化合物具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000151
在另一个方面，本公开内容提供了具有根据式(I)的结构的化合物：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)，
其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是支化单元，包括
Figure BDA0004122749040000152
M不存在或者是具有结构
Figure BDA0004122749040000153
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000154
k是从1至12的整数，并且
n是从1至30的整数。
在另一个方面，本公开内容提供了根据式(L2-P)、(L2’-P)或(L2”-P)的化合物：
B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2-P)、
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’-P)、
马来酰亚胺-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2”-P)，
其中：
B”选自由以下组成的组：-N3、
Figure BDA0004122749040000161
Figure BDA0004122749040000162
SP1不存在或者是选自由以下组成的组的第一间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000163
/>
Figure BDA0004122749040000164
SP2不存在或者是选自由以下组成的组的第二间隔物单元：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是选自由以下组成的组的第三间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000165
Figure BDA0004122749040000171
其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自
Figure BDA0004122749040000172
的基团；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000173
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；并且
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000174
并且
p是从1至12的整数。
在一种实施方案中，AA是包括2个至4个氨基酸的肽单元，所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和瓜氨酸及其组合。
在一种实施方案中，AA是缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸。
在一种实施方案中，AA选自由以下组成的组：甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGG)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGGG(SEQ ID NO:2113))、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(GGF)、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG(SEQ ID NO:2114))和谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(EVC)。
在一种实施方案中，化合物具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000181
/>
Figure BDA0004122749040000191
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，化合物具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000201
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，化合物具有根据式(L2-P)、(L2’-P)或(L2”-P)的选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000211
/>
Figure BDA0004122749040000221
/>
Figure BDA0004122749040000231
/>
Figure BDA0004122749040000241
/>
Figure BDA0004122749040000251
/>
Figure BDA0004122749040000261
在另一个方面，本公开内容提供了根据式(II)的抗体-药物缀合物：
Ab-(Gln-NH-L1-B-(SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)k)p)n(II)，
其中Ab是抗体；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元，其中所述基团B’选自-N3、
Figure BDA0004122749040000262
和至少一个基团B”，其中
B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p是根据根据前述实施方案中任一项所述的式(L2-P)的化合物，并且其中式(L2-P)的化合物经由基团B’和基团B”的加合物与抗体共价附接；k是1至12的整数，p是1至30的整数，并且n是1至30的整数。
在一种实施方案中，本公开内容提供了包括抗体和接头-有效载荷的抗体-药物缀合物，其中接头-有效载荷包括以下结构：
Figure BDA0004122749040000271
其中
Figure BDA0004122749040000272
表示直接或通过第二接头或其药学上可接受的盐附接至所述抗体的附接点。
在另一个方面，本公开内容提供了一种组合物，包括根据前述实施方案中任一项所述的化合物的群体，具有约0.5至约30.0的药物-抗体比(DAR)。
在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约1.0至约2.5的DAR。在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约2的DAR。
在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约3.0至约4.5的DAR。在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约4的DAR。
在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约6.5至约8.5的DAR。在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约8的DAR。
在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约10至约14的DAR。在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约12的DAR。
在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约14至约18的DAR。在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约16的DAR。
在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约22至约24.5的DAR。在一种实施方案中，根据本公开内容的组合物具有约24的DAR。
在另一个方面，本公开内容提供了具有根据式(P-I)的结构的化合物：
Figure BDA0004122749040000281
其中R1、R2、R3和R4独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R2和R3形成5元或6元环，
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，化合物是
Figure BDA0004122749040000282
或其药学上可接受的盐。
一种包括抗体、接头和有效载荷的抗体-药物缀合物，其中有效载荷是
Figure BDA0004122749040000283
或其药学上可接受的盐。
一种包括抗体、接头和有效载荷的抗体-药物缀合物，其中有效载荷是
Figure BDA0004122749040000291
或其药学上可接受的盐，其中/>
Figure BDA0004122749040000294
表示附接至接头的附接点。
在一种实施方案中，化合物具有根据式(P2)的结构：
Figure BDA0004122749040000292
其中R是氢或C1-C4烷基，或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，化合物是
Figure BDA0004122749040000293
或其药学上可接受的盐。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，包括根据前述实施方案中任一项所述的化合物以及稀释剂、载体和/或赋形剂。
在一个方面，本发明提供了一种治疗有相应需要的受试者的状况的方法，包括向受试者施用治疗有效量的根据前述实施方案中任一项所述的化合物，或根据前述实施方案中任一项所述的组合物。
在一种实施方案中，状况是癌症。
在一种实施方案中，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌或脑癌。
在一种实施方案中，状况是HER2+乳腺癌。
在一个方面，本发明提供了一种将化合物选择性地递送到细胞中的方法，其中化合物是根据前述实施方案中任一项所述的化合物。
在一个方面，本发明提供了一种用化合物选择性地靶向细胞表面上的抗原的方法，其中化合物是根据前述实施方案中任一项所述的化合物。
在一种实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。
在一种实施方案中，细胞是人类细胞。
在一种实施方案中，细胞是癌细胞。
在一种实施方案中，癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞或脑癌细胞。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(A)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000301
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000311
k和m独立地是1至12的整数，并且n是1至30的整数，
其中：
该方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与化合物L1-B接触，其中支化单元B包括至少一个基团B’，
b)使步骤a)的产物与k或更多当量的化合物L2-(-M-Dxd)m接触，
其中接头L2包括至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040000312
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure BDA0004122749040000313
其中Q是C或N；以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(A)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；
L1是如以上描述的第一接头；B是包括如以上描述的基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；L2是如以上描述的经由如以上描述的至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头；M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000321
其中R、R’和R”如以上描述；Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000322
k和m独立地是1至12的整数，并且n是1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)使化合物L1-B与k或更多当量的化合物L2-(-M-Dxd)m接触，其中所述支化单元B包括所述至少一个基团B’，其中所述接头L2包括能够与所述基团B’共价结合的至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040000323
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure BDA0004122749040000324
其中Q是C或N；
从而产生L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k；
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与步骤a)的L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k产物接触，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n
(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000331
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000332
k是1至12的整数，并且n为1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与化合物L1-B接触，其中支化单元B包括至少一个基团B’，
b)使步骤a)的产物与k或更多当量的化合物L2-M-Dxd接触，其中所述接头L2包括能够与所述基团B’共价附接的至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040000333
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure BDA0004122749040000334
其中Q是C或N；以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；
L1是如以上描述的第一接头；B是包括如以上描述的基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；L2是如以上描述的经由如以上描述的至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头；M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000341
其中R、R’和R”如以上描述；Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000342
k是1至12的整数，并且n为1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)使化合物L1-B与k或更多当量的化合物L2-M-Dxd接触，其中所述支化单元B包括至少一个基团B’，其中所述接头L2包括至少一个基团B”，从而产生L1-B-(-L2-M-Dxd)k，其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040000343
并且所述基团B’和B”中的另一个选自
Figure BDA0004122749040000344
Figure BDA0004122749040000345
其中Q是C或N；
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的结合剂BA(BA-Gln-NH2)与步骤a)的L1-B-(-L2-M-Dxd)k产物接触，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(III)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L2’-P))n(III)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；L2’-P是如以上描述的H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p，并且n是1至30的整数；
SP1不存在或者是选自由以下组成的组的第一间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000351
Figure BDA0004122749040000352
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是选自由以下组成的组的第二间隔物单元：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是选自由以下组成的组的第三间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000353
Figure BDA0004122749040000354
其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自
Figure BDA0004122749040000361
的基团；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000362
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；并且
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000363
p是从1至30的整数；
其中所述方法包括以下步骤：
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与所述L2’-P接触，以及
c)分离所产生的式(III)的化合物。
在一种实施方案中，谷氨酰胺残基Gln天然存在于BA的CH2结构域或CH3结构域中。
在一种实施方案中，其中谷氨酰胺残基Gln通过修饰一个或更多个氨基酸而引入至BA中。
在一种实施方案中，其中Gln是Q295或N297Q。
在一种实施方案中，其中转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶(MTG)。
在一种实施方案中，M不存在，或者M-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000371
其中R是氢或C1-C4烷基，并且其中
Figure BDA0004122749040000373
表示L2的附接点。
在一种实施方案中，化合物L2-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000372
/>
Figure BDA0004122749040000381
/>
Figure BDA0004122749040000391
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，化合物L2-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000392
/>
Figure BDA0004122749040000401
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，化合物L2-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000402
/>
Figure BDA0004122749040000411
/>
Figure BDA0004122749040000421
/>
Figure BDA0004122749040000431
/>
Figure BDA0004122749040000441
/>
Figure BDA0004122749040000451
Figure BDA0004122749040000461
在阅读本公开内容的以下详细描述(包括所附权利要求书)之后，本公开内容的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得明显。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅以彩色制作的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在依请求和支付必要费用后由主管局提供。
图1是显示根据本公开内容的实施方案的Dxd-ADC的两步位点特异性生成的示意图。第一步是一个或更多个第一接头(L1-B’)经由转谷氨酰胺酶(例如，MTG)介导的缀合反应与抗体上的谷氨酰胺残基的缀合。第二步是抗体-L1-B与一个或更多个接头2-有效载荷(L2P)的缀合。
图2A和图2B是显示本公开内容的特定非限制性实施方案的示意图。图2A是根据本公开内容的实施方案的具有2乘以n乘以m的DAR的在位置295处具有谷氨酰胺残基的Dxd-ADC的两步位点特异性生成的示意图。图2B是根据本公开内容的实施方案的具有4乘以n乘以m的DAR的在位置295和位置297处具有谷氨酰胺残基的Dxd-ADC的两步位点特异性生成的示意图。
图3A是显示根据本公开内容的Dxd-ADC的一种特定实施方案的两步位点特异性生成的示意图。第一步是将包括一个叠氮化物部分(-N3)的线性第一接头1(L1-B’)经由MTG介导的缀合反应与抗体的位置295和297处的谷氨酰胺残基缀合，生成具有4个附接至其的含叠氮化物接头的抗体(Ab-(N3)4)。第二步是将Ab-(N3)4经由叠氮化物-环炔1,3环加成反应附接至特定的接头2-有效载荷(L2P)，生成具有4的DAR的Dxd-ADC。图3B描绘了适于在图3A中描绘的本公开内容的实施方案中使用的具有2或4的DAR的ADC和示例性氨基叠氮基接头的示意图。
图4A是显示根据本公开内容的Dxd-ADC的一种特定实施方案的两步位点特异性生成的示意图。第一步是将包括两个叠氮化物部分(-N3)的支化第一接头1(L1-B’)经由MTG介导的缀合反应与抗体的位置295和297处的谷氨酰胺残基缀合，生成具有8个附接至其的含叠氮化物接头的抗体(Ab-(N3)8)。第二步是将Ab-(N3)8经由叠氮化物-环炔1,3环加成反应附接至特定的接头2-有效载荷(L2P)，生成具有8的DAR的Dxd-ADC。图4B描绘了适于在图4A中描绘的本公开内容的实施方案中使用的ADC和示例性支化烷基叠氮化物胺接头的示意图。
图5是显示根据本公开内容的实施方案在抗体-Q295/297上产生具有DAR4至DAR24的位点特异性ADC的三种方法的示意图。
图6是显示根据本公开内容的实施方案在抗体-Q295上产生具有DAR2至DAR12的位点特异性ADC的三种方法的示意图。
图7A是显示用于制备示例性8DAR支化-接头-有效载荷ADC(Ab-AL1-LP39)的两步方法I的示意图。图7B是显示用于制备示例性8DAR支化-接头-有效载荷ADC(Ab-BL2-LP22)的两步方法II的示意图。图7C是显示用于制备具有线性-接头-P的4DAR ADC和具有支化-接头-有效载荷的8DAR ADC的一步方法III的示意图。
图8A(SNU16，FGFR2扩增的胃癌)和图8B(携带SNU16肿瘤的小鼠)示出了肿瘤体积与根据本公开内容的抗FGFR2b Dxd ADC(DAR8)治疗后天数。这些ADC显示出对SNU-16人类胃癌异种移植物的显著抗肿瘤功效。
图9A(SNU16，FGFR2扩增的胃癌)和图9B(携带SNU16肿瘤的小鼠)示出了肿瘤体积与根据本公开内容的抗FGFR2b Dxd ADC(DAR4)治疗后天数。这些ADC显示出对SNU-16人类胃癌异种移植物的显著抗肿瘤功效。
图10是示出本文公开的272种示例性MET×MET双特异性抗体的组分的矩阵。矩阵的每个编号的单元格标识包括“D1”抗原结合结构域和“D2”抗原结合结构域的独特双特异性抗体，其中D1抗原结合结构域包括来自沿Y轴列出的对应抗MET抗体的免疫球蛋白可变结构域(HCVR/LCVR氨基酸序列对)或CDR，并且其中D2抗原结合结构域包括来自沿X轴列出的对应抗MET抗体的免疫球蛋白可变结构域(HCVR/LCVR氨基酸序列对)或CDR。
详细描述
本文公开了本公开内容的详细实施方案；然而，应当理解，所公开的实施方案仅仅是可以以各种形式体现的本公开内容的说明。此外，结合本公开内容的各种实施方案给出的每个实例旨在是说明性的，而不是限制性的。因此，本文公开的特定结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅是作为教导本领域技术人员以不同方式采用本公开内容的代表性基础。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种方法”包括本文描述的和/或对于本领域技术人员而言在阅读本公开内容后将变得明显的一种或更多种方法，和/或类型的步骤。
术语状态、紊乱或状况的“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括：(1)预防、延迟或降低在可能罹患或易患状态、紊乱或状况但尚未经历或表现出状态、紊乱或状况的临床或亚临床症状的受试者中发展状态、紊乱或状况的至少一种临床或亚临床症状的发病率和/或出现的可能性；或者(2)抑制状态、紊乱或状况，即，阻止、降低或延迟疾病的发展或其复发或其至少一种临床或亚临床症状复发；或者(3)缓解疾病，即，引起状态、紊乱或状况或其临床或亚临床症状的至少一种的消退。对待治疗的受试者的益处为在统计学上显著的或至少对患者或对医师为可感知的。在一些实施方案中，治疗包括以间接影响疾病的这样的方式消融细胞的方法。在某些实施方案中，治疗包括在疗法前耗尽免疫细胞作为造血调节方案。
如本文使用的“受试者”或“患者”或“个体”或“动物”是指人类、兽医学动物(例如，猫、犬、牛、马、绵羊、猪等)和疾病的实验动物模型(例如，小鼠、大鼠)。在优选的实施方案中，受试者是人类。
如本文使用的，适用于剂量或量的术语“有效”指在向有相应需要的受试者施用后足以产生期望活性的化合物或药物组合物的量。注意，在施用活性成分的组合时，组合物的有效量可以包括或可以不包括每一种成分单独施用时将有效的量。所需的确切量将根据受试者的物种、年龄和一般状况、被治疗状况的严重程度、采用的一种特定药物或更多种特定药物、施用的模式等因受试者而异。
如结合本公开内容的组合物使用的短语“药学上可接受的盐”是指适于向患者施用的任何盐。合适的盐包括但不限于在Berge等人，”Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.,1977,66:1中公开的那些，该文献通过引用并入本文。盐的实例包括但不限于酸来源的盐、碱来源的盐、有机盐、无机盐、胺盐和碱金属盐或碱土金属盐，包括但不限于钙盐、镁盐、钾盐、钠盐，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。在一些实例中，本文描述的有效载荷(例如，本文描述的利福霉素类似物)包括叔胺，其中叔胺中的氮原子是有效载荷通过其与接头或接头-间隔物键合的原子。在这样的情况下，与有效载荷的叔胺键合在接头-有效载荷分子中产生季胺。季胺上的正电荷可以被反荷离子(例如氯、溴、碘或任何其他合适地带电荷的部分，诸如本文描述的那些)平衡。
范围在本文可以表示为从“约”或“大约”一个特定值，和/或至“约”或“大约”另一个特定值。在表示这样的范围时，另一种实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。
“包括/包含(comprising)”或“包括/包含(containing)”或“包括/包含(including)”意指，至少被指名的化合物、要素、颗粒或方法步骤存在于组合物或物品或方法中，但不排除其他化合物、材料、颗粒或方法步骤的存在，即使其他这样的化合物、材料、颗粒或方法步骤具有与被指名的相同的功能。
本公开内容的化合物包括本文一般描述的化合物，并且通过本文公开的类别、亚类和种类进一步说明。如本文使用的，除非另外指示，否则以下定义应适用。为了本公开内容的目的，化学元素根据元素周期表，CAS版本，Handbook of Chemistry and Physics，第75版来标识。另外地，有机化学的一般原理在以下中描述：“Organic Chemistry”,ThomasSorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和“March’s Advanced OrganicChemistry”，第5版，编著：Smith,M.B.和March,J.,John Wiley&Sons,New York:2001，所述文献的全部内容通过引用特此并入。
如本文使用的，术语“烷基”被赋予其在本领域中的普通含义，并且可以包括饱和脂肪族基团，包括直链烷基基团、支链烷基基团、环烷基(脂环)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有约1-20个碳原子(例如，C1-C20对于直链，C2-C20对于支链)，并且可选地约1-10个碳原子，或约1-6个碳原子。在一些实施方案中，环烷基环在其环结构中具有约3-10个碳原子，其中这样的环是单环或双环的，并且可选地在环结构中具有约5个、6个或7个碳。在一些实施方案中，烷基基团可以是低级烷基基团，其中低级烷基基团包括1-4个碳原子(例如C1-C4对于直链低级烷基)。
如本文使用的，术语“烯基”是指具有一个或更多个双键的如本文定义的烷基基团。
如本文使用的，术语“炔基”是指具有一个或更多个三键的如本文定义的烷基基团。
术语“杂原子”意指氧、硫、氮、磷或硅(包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的可取代氮)中的一种或更多种。
术语“卤素”意指F、Cl、Br或I；术语“卤化物”是指卤素基团或取代基，即-F、-Cl、-Br或-I。
本公开内容的术语“加合物”(例如“基团B’的加合物”)涵盖包括加成反应(例如基团B’的加成反应)的产物的任何部分，与产生该部分所采取的合成步骤无关。
术语“共价附接”意指共价键的形成，即涉及两个原子之间共有一个或更多个电子对的化学键。共价键合可以包括不同的相互作用，包括但不限于σ键合、π-键合、金属对金属键合、抓桥相互作用(agostic interactions)、弯曲键和三中心双电子键。在第一基团被称为与第二基团“能够共价附接”时，这意味着第一基团能够例如通过使用催化剂或在特定的反应条件下与第二基团直接或间接形成共价键。能够彼此共价附接的基团的非限制性实例可以包括例如胺和羧酸(形成酰胺键)、二烯和亲二烯体(经由Diels-Alder反应)以及叠氮化物和炔烃(经由1,3-环加成反应形成三唑)。
如本文描述的，本公开内容的化合物可以包括“任选地取代的”部分。通常，术语“取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，都意味着指定部分的一个或更多个氢被合适的取代基取代。除非另外指示，否则“任选地取代的”基团可以在该基团的每个可取代位置处具有合适的取代基，并且在任何给定结构中的多于一个位置可以被选自特定组的多于一个取代基取代时，该取代基可以在每个位置处相同或不同。本公开内容所设想的取代基组合优选地是那些导致形成稳定或化学上可行的化合物的组合。如本文使用的术语“稳定的”是指在经历允许它们的产生、检测以及在某些实施方案中允许它们的回收、纯化和用于本文公开的一个或更多个目的使用的条件时，基本上没有改变的化合物。
除非另外说明，否则本文描绘的结构也意指包括结构的所有异构体(例如，对映异构体、非对映异构体和几何(或构象))形式；例如，每个不对称中心的R和S构型，(Z)和(E)双键异构体，以及(Z)和(E)构象异构体。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何(或构象)混合物在本公开内容的范围内。
除非另外说明，否则本公开内容的化合物的所有互变异构形式都在本公开内容的范围内。
另外地，除非另外说明，否则本文描绘的结构还意指包括仅在一个或更多个同位素富集的原子的存在方面不同的化合物。例如，除了用氘或氚替代氢，或用11C-或13C-或14C-富集的碳替代碳之外具有本发明结构的化合物在本公开内容的范围内。
还应当理解，提及一个或更多个方法步骤并不排除存在另外的方法步骤或明确标识的那些步骤之间的中间方法步骤。相似地，还应当理解，提及装置或系统中的一个或更多个组件并不排除存在另外的组件或明确标识的那些组件之间的中间组件。
除非另外说明，本公开内容的化合物及其盐的所有结晶形式也在本公开内容的范围内。本公开内容的化合物可以以多种无定形和结晶形式分离，包括但不限于无水、水合、非溶剂化或溶剂化的形式。示例性水合物包括半水合物、一水合物、二水合物等。在一些实施方案中，本公开内容的化合物是无水和非溶剂化的。“无水”意味着该化合物的结晶形式在晶格(crystal lattice)结构中基本上不含结合水，即该化合物不形成结晶水合物。
如本文使用的，“结晶形式”意指是指结晶物质的某种晶格(lattice)构型。同一物质的不同结晶形式通常具有不同的结晶晶格(例如，晶胞)，这导致每种结晶形式特征性的不同的物理特性。在一些情况下，不同的晶格构型具有不同的水或溶剂含量。不同的结晶晶格可以通过固态表征方法诸如X射线粉末衍射(PXRD)来鉴定。其他表征方法，诸如差示扫描量热法(DSC)、热重分析(TGA)、动态蒸汽吸附(DVS)、固态NMR等，进一步帮助鉴定结晶形式以及帮助确定稳定性和溶剂/水含量。
物质的结晶形式包括溶剂化(例如，水合)和非溶剂化(例如，无水)形式两者。水合形式是在结晶晶格中包括水的结晶形式。水合形式可以是化学计量的水合物，其中水以一定的水/分子比，诸如半水合物、一水合物、二水合物等存在于晶格中。水合形式也可以是非化学计量的，其中水含量是可变的，并且取决于外部条件诸如湿度。
在一些实施方案中，本公开内容的化合物是基本上分离的。“基本上分离”意味着特定化合物与杂质至少部分地分离。例如，在一些实施方案中，本公开内容的化合物包括少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约2.5％、少于约1％或少于约0.5％的杂质。杂质通常包括不是基本上分离的化合物的任何东西，包括例如其他结晶形式和其他物质。
某些基团、部分、取代基和原子用波浪线描绘。波浪线可以与一个键或更多个键相交或对一个键或更多个键加帽。波浪线指示基团、部分、取代基或原子通过其键合的原子。例如，被描绘为
Figure BDA0004122749040000531
的丙基基团取代的苯基基团具有以下结构：/>
Figure BDA0004122749040000532
表述“HER2”或“人类表皮生长因子受体2”是指人类表皮生长因子受体家族的成员。该蛋白也称为NEU；NGL；HER2；TKR1；CD340；HER-2；MLN 19；HER-2/neu。HER2可以指以NCBI登录号NP_004439.2示出的氨基酸序列。已经显示该癌基因的扩增或过表达在某些侵袭性类型乳腺癌的发展和进展中起重要作用。近年来，该蛋白已经成为大约30％乳腺癌患者的重要生物标志物和治疗靶。除非明确指定为来自非人类物种，否则本文对蛋白、多肽和蛋白片段的所有提及意图是指相应蛋白、多肽或蛋白片段的人类形式。因此，除非指定为来自非人类物种，例如“小鼠HER2”、“猴HER2”等，否则表述“HER2”意指人类HER2。
短语“结合HER2的抗体”或“抗HER2抗体”包括特异性识别HER2的抗体及其抗原结合片段。
短语“抗HER2/HER2”抗体(例如“抗HER2/HER2双特异性抗体”)包括特异性识别两种不同HER2表位的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，双特异性抗体及其抗原结合片段包括特异性结合人类HER2的第一表位的第一抗原结合结构域(D1)和特异性结合人类HER2的第二表位的第二抗原结合结构域(D2)。
如本文中使用的表述“STEAP2”是指前列腺2(prostate 2)的六次跨膜上皮抗原。STEAP2是在前列腺上皮细胞中高度表达的完整的六次跨膜蛋白，并且是前列腺癌的细胞表面标志物，例如发现STEAP2在LNCaP前列腺细胞系上以显著水平表达(Porkka，等人LabInvest 2002,82:1573–1582)。STEAP2(UniProtKB/Swiss-Prot:Q8NFT2.3)是由位于人类的染色体区域7q21处的STEAP2基因编码的490个氨基酸的蛋白，参见例如，如表1和表2中示出的人类STEAP2的氨基酸序列。
如本文使用的，“结合STEAP2的抗体”或“抗STEAP2抗体”包括特异性识别STEAP2的抗体及其抗原结合片段。
短语“结合MET的抗体”或“抗MET抗体”包括特异性识别MET的抗体及其抗原结合片段。如本文中使用的表述“MET”、“c-Met”等是指人类跨膜受体酪氨酸激酶。
短语“抗MET/MET”抗体(例如“抗MET/MET双特异性抗体”)包括特异性识别两种不同MET表位的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，双特异性抗体及其抗原结合片段包括特异性结合人类MET的第一表位的第一抗原结合结构域(D1)和特异性结合人类MET的第二表位的第二抗原结合结构域(D2)。
本公开内容中使用的所有氨基酸缩写是如37C.F.R.§1.822(B)(J)中示出的被美国专利商标局(the United States Patent and Trademark Office)接受的那些。
术语“蛋白”意指具有经由酰胺键共价连接的多于20个氨基酸的任何氨基酸聚合物。如本文使用的，“蛋白”包括生物治疗蛋白、研究或疗法中使用的重组蛋白、trap蛋白和其他Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、人类抗体、双特异性抗体、抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、scFv融合蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白可以使用基于重组细胞的产生系统来产生，诸如昆虫杆状病毒(bacculovirus)系统、酵母系统(例如毕赤酵母属物种(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如CHO细胞和CHO衍生物如CHO-K1细胞)。
除非明确指定为来自非人类物种，否则本文对蛋白、多肽和蛋白片段的所有提及意图是指相应蛋白、多肽或蛋白片段的人类形式。因此，除非指定为来自非人类物种，例如“小鼠STEAP2”、“猴STEAP2”等，否则表述“STEAP2”意指人类STEAP2。
抗体的氨基酸序列可以使用任何已知的编号方案进行编号，包括由以下描述的那些：Kabat等人，(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegge和Pluckthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)。除非另外指定，否则本文使用的编号方案是Kabat编号方案。然而，编号方案的选择并不意图暗示序列中不存在的差异，并且本领域技术人员可以通过检查一种或更多种抗体的氨基酸序列容易地确认序列位置。除非另外说明，否则在提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人的报道，同上)。
术语“谷氨酰胺酰基修饰的抗体”是指本公开内容的具有从谷氨酰胺侧链至伯胺化合物的至少一个共价连接的抗体。在特定实施方案中，伯胺化合物通过谷氨酰胺侧链上的酰胺连接来连接。在某些实施方案中，谷氨酰胺是内源谷氨酰胺。在其他实施方案中，谷氨酰胺是通过多肽工程化(例如，经由多肽上的氨基酸缺失、插入、取代或突变)而具有反应性的内源谷氨酰胺。在另外的实施方案中，谷氨酰胺是用含酰基供者谷氨酰胺的标签(例如，含谷氨酰胺的肽标签、Q-标签或TGase识别标签)工程化的多肽。
术语“TGase识别标签”是指包括接受者谷氨酰胺残基的氨基酸序列，并且该接受者谷氨酰胺残基在掺入(例如，附加至)多肽序列时，在合适的条件下，被TGase识别，并且通过氨基酸序列内的氨基酸侧链与反应配偶体之间的反应导致TGase的交联。识别标签可以是不天然存在于包括TGase识别标签的多肽中的肽序列。在一些实施方案中，TGase识别标签包括至少一个Gln。在一些实施方案中，TGase识别标签包括氨基酸序列XXQX(SEQ ID NO:1935)，其中X是任何氨基酸(例如，常规氨基酸Leu、Ala、Gly、Ser、Val、Phe、Tyr、His、Arg、Asn、Glu、Asp、Cys、Gln、Ile、Met、Pro、Thr、Lys或Trp或非常规氨基酸)。在一些实施方案中，含酰基供者谷氨酰胺标签包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：LLQGG(SEQ ID NO:1936)、LLQG(SEQ ID NO:1937)、LSLSQG(SEQ ID NO:1938)、gGGLLQGG(SEQ ID NO:1939)、gLLQG(SEQ ID NO:1940)、LLQgSPLAQSHGG(SEQ ID NO:1941)、gLLQGGG(SEQ ID NO:1942)、gLLQGG(SEQ ID NO:1943)、gLLQ(SEQ ID NO:1944)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:1945)、LLQGA(SEQ ID NO:1946)、LLQYQGA(SEQ ID NO:1947)、LLQGSG(SEQ ID NO:1948)、LLQYQG(SEQ IDNO:1949)、LLQLLQG(SEQ ID NO:1950)、SLLQG(SEQ ID NO:1951)、LLQLQ(SEQ ID NO:1952)、LLQLLQ(SEQ ID NO:1953)和LLQGR(SEQ ID NO:1954)。参见例如WO2012059882，该文献全部内容并入本文。
如本文使用的，术语“抗体”意指包括与特定抗原特异性结合或相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链即两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包括重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以还细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区间插着称为框架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL包括3个CDR和4个FR，按以下顺序从氨基末端向羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的实施方案中，抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人类种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可以基于两个或更多个CDR的并列(side-by-side)分析来定义。
如本文使用的术语“抗体”也包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术从例如完整抗体分子中获得，所述标准技术诸如蛋白水解消化或重组基因工程技术，包括操作和表达编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA。这样的DNA是已知的和/或容易从例如，商业来源、DNA文库(包括，例如，噬菌体抗体文库)可得，或者可以合成。可以对DNA进行测序并且如下进行操作：化学或通过使用分子生物学技术，例如，将一个或更多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)诸如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单元。其他工程化分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体(nanobody)(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(small modular immunopharmaceuticals，SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也被涵盖在如本文使用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成，并且通常将包含与一个或更多个框架序列相邻或符合读框(in frame)的至少一个CDR。在具有与VL结构域相关的VH结构域的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体，并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。
可选地，抗体的抗原结合片段可以包含单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以包含被共价连接至至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以存在于本说明书抗体的抗原结合片段中的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(V)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括本文列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或者可以通过完整或部分铰链区或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，这些氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。
此外，本说明书抗体的抗原结合片段可以包括以彼此和/或与一个或更多个单体VH结构域或VL结构域(例如，通过一个或更多个二硫键)非共价缔合的本文列出的可变结构域和恒定结构域构型中的任一种的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
如与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够与单独的抗原或与同一抗原上的不同表位特异性结合。任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，都可以使用本领域可得的常规技术适于在本说明书抗体的抗原结合片段的上下文中使用。
本说明书的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)发挥作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指在存在补体的情况下，本说明书的抗体对表达抗原的细胞的裂解。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且从而导致靶细胞的裂解。CDC和ADCC可以使用本领域熟知且可得的测定来测量。(参见例如美国专利第5,500,362号和第5,821,337号以及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗体的恒定区在抗体固定补体并介导细胞依赖性细胞毒性的能力中是重要的。因此，抗体的同种型可以基于是否期望抗体介导细胞毒性来选择。
在某些实施方案中，本说明书的抗体，例如抗HER2抗体或抗HER2/HER2双特异性抗体或抗MET抗体或抗MET/MET双特异性抗体或抗STEAP2抗体是人类抗体。如本文使用的，术语“人类抗体”意在包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本说明书的人类抗体可以包括不被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，所述氨基酸残基例如在CDR中并且特别是在CDR3中。然而，如本文使用的术语“人类抗体”不意在包括其中来源于另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经被接枝到人类框架序列上的抗体。
在一些实施方案中，抗体可以是重组人类抗体。如本文中使用的术语“重组人类抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)、从重组的组合人类抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)、从对于人类免疫球蛋白基因而言是转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过包括将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人类抗体具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这样的重组人类抗体经历体外诱变(或，当使用人类Ig序列的转基因动物时，则经历体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列尽管来源于人类种系VH序列和VL序列并且与人类种系VH和VL序列相关，但可以不天然地存在于体内人类抗体种系库(human antibody germline repertoire)中。
人类抗体可以以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包括大约150kDa-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不经由链间二硫键连接，并且形成包括共价偶联的轻链和重链的约75kDa-80kDa的分子(半抗体)。即使在亲和纯化之后，这些形式也极难分离。第二种形式在多种完整IgG同种型中出现的频率是由于但不限于与抗体铰链区同种型相关的结构差异。人类IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可以将第二种形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30:105)显著降低至通常使用人类IgG1铰链观察到的水平。本说明书涵盖在铰链区、CH2区或CH3区具有一个或更多个突变的抗体，该突变例如在产生中可能是期望的，以改进期望抗体形式的产量。
本说明书的抗体可以是分离的或纯化的抗体。如本文使用的“分离的抗体”或“纯化的抗体”意指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。出于本说明书的目的，例如，已经从生物体的至少一种组分或者从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或取出的抗体是“分离的抗体”。例如，已经从反应或反应序列的至少一种组分中纯化的抗体是“纯化的抗体”或由纯化抗体产生。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体或纯化的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
与抗体来源的对应种系序列相比，本文公开的抗体可以包括重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中的一个或更多个氨基酸取代、插入和/或缺失。这样的突变可以通过将本文公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库可得的种系序列进行比较容易地确定。本说明书包括来源于本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或更多个框架和/或CDR区内的一个或更多个氨基酸被突变为抗体来源于的种系序列的一个或更多个对应残基、或另一个人类种系序列的一个或更多个对应残基、或一个或更多个对应种系残基的保守氨基酸取代(这样的序列变化在本文统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易产生包括一个或更多个个体种系突变或其组合的许多抗体及抗原结合片段。在某些实施方案中，VH结构域和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回在抗体来源于的原始种系序列中存在的残基。在其他实施方案中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或FR4的后8个氨基酸内存在的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内存在的突变残基。在其他实施方案中，一个或更多个框架和/或一个或更多个CDR残基被突变为不同种系序列(即，不同于抗体原始来源于的种系序列的种系序列)的一个或更多个对应残基。
此外，本说明书的抗体可以包含框架和/或CDR区内两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些单独残基被突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基被维持或突变为不同种系序列的对应残基。在获得后，可以容易地测试包含一个或更多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或更多种期望的特性，诸如改进的结合特异性、增加的结合亲和力、改进或增强的拮抗或激动生物学特性(可以根据具体情况而定)、降低的免疫原性、抗体-药物缀合物的改进的药物与抗体比(DAR)等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段被包括在本说明书中。
术语“非糖基化抗体”是指不包括可能干扰转谷氨酰胺反应的糖基化序列的抗体，例如在一个或更多个重链上的N297处不具有糖基团的抗体。在特定实施方案中，抗体重链具有N297突变。换言之，根据Kabat等人公开的EU编号系统，抗体被突变为在位置297处不再具有天冬酰胺残基。在特定实施方案中，抗体重链具有N297Q或N297D突变。这样的抗体可以通过定点诱变以使糖基化序列去除或失效，或者通过定点诱变以在除了任何干扰糖基化位点或任何其他干扰结构之外的位点插入谷氨酰胺残基来制备。这样的抗体也可以从天然或人工来源分离。非糖基化抗体还包括包含T299或S298P或其他突变或导致缺乏糖基化的突变组合的抗体。
术语“去糖基化抗体”是指其中糖基基团被去除以促进转谷氨酰胺酶介导的缀合的抗体。糖包括但不限于N-连接寡糖。在一些实施方案中，在残基N297处进行去糖基化。在一些实施方案中，糖基团的去除是酶促(包括但不限于经由PNGase)完成的。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中称为互补位(paratope)的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体可以与抗原上的不同区域结合，并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链不同区段的空间并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖类、磷酰基团或磺酰基团的部分。
如本文使用的术语“缀合蛋白”或“缀合抗体”是指与一个或更多个化学部分共价连接的蛋白或抗体。化学部分可以包括本公开内容的胺化合物。适于与本公开内容一起使用的接头(L)和有效载荷(D)在本文详细地描述。在特定实施方案中，包括治疗部分的缀合抗体是抗体-药物缀合物(ADC)，也称为抗体-有效载荷缀合物或抗体-接头-有效载荷缀合物。
术语“药物与抗体比”或(DAR)是与本公开内容的结合剂缀合的治疗部分(例如药物)的平均数。
在一些实施方案中，术语“接头抗体比”或(LAR)也表示为小写字母l，是与本公开内容的结合剂缀合的反应性伯胺化合物的平均数。这样的结合剂，例如抗体，可以与包括例如合适的叠氮化物或炔烃的伯胺化合物缀合。用叠氮化物或炔烃官能化的所得结合剂随后可以经由1,3-环加成反应与包括对应叠氮化物或炔烃的治疗部分反应。
短语“药学上可接受量”是指在治疗、降低、减轻或调节有相应需要的受试者中的至少一种健康问题的影响或症状方面有效或足够的量。例如，抗体或抗体-药物缀合物的药学上可接受量是使用本文提供的抗体或抗体-药物缀合物调节生物靶的有效的量。合适的药学上可接受量包括但不限于约0.001％多达至约10％，以及介于两者之间的任何量，诸如约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的本文提供的抗体或抗体-药物-缀合物。
短语“反应pH”是指已经添加所有反应组分或反应物之后反应的pH。
在提及核酸或其片段时，术语“基本上同一性”或“基本上相同”指示，在与另一核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失进行最佳比对时，如下文讨论的，如通过任何熟知的序列同一性算法，诸如FASTA、BLAST或gap测量的，在至少约95％，并且更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本上同一性的核酸分子可以编码与由参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本上相似氨基酸序列的多肽。
在应用于多肽时，术语“基本上相似性”或“基本上相似”意指在诸如通过程序gAP或BESTFIT使用默认空位权重最佳比对时，两个肽序列共有至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被侧链(R基团)具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度，以校正取代的保守性质。用于做出该调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。侧链具有相似化学特性的氨基酸组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可选地，保守替代是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数可能性矩阵中具有正值的任何改变。“中度保守”替代是PAM250对数可能性矩阵中具有非负值的任何改变。
多肽的序列相似性，也称为序列同一性，通常使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配至各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性量度来匹配相似的序列。例如，gCG软件包含程序诸如gap和Bestfit，这些程序可以以默认参数使用，以确定密切相关的多肽诸如来自不同生物体物种的同源多肽之间或者野生型蛋白与其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，gCG 6.1版。多肽序列也可以使用FASTA(gCG6.1版中的程序)使用默认或推荐的参数进行比较。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。在将本说明书序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种特定算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
蛋白-药物缀合物化合物
根据前述目的和其他目的，本公开内容提供了蛋白-药物缀合物化合物，例如抗体-药物缀合物化合物，及其前体和中间体、药物组合物和用于治疗有这样的治疗需要的受试者的某些疾病的方法。根据本公开内容，本文提供的蛋白-药物缀合物化合物包括如本文描述的与连接至治疗部分(例如喜树碱类似物部分)的伯胺化合物缀合的谷氨酰胺酰基修饰的结合剂。
在一个方面，本公开内容提供了包括根据本公开内容的结合剂(例如抗体或其片段)的化合物，该结合剂具有经由任选的第一接头、包括至少一个加合物的支化单元和任选的第二接头与一种或更多种喜树碱类似物例如Dxd缀合的一个或更多个谷氨酰胺残基。说明性非限制性实例包括本文描述的式(I)和式(II)。在根据本公开内容的蛋白-药物缀合物的特定实施方案中，其中结合剂是抗体(例如，单克隆抗体)，任选地使用术语“抗体药物缀合物”或ADC。
在一个方面，本公开内容提供了具有根据式(C)的结构的化合物：
BA-Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Camp)m)n
(C)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；L1不存在或者是第一接头；B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元，其中基团B’是第一组分，例如第一环加成组分；L2是经由至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头，其中B”是第二组分，例如第二环加成组分，并且其中基团B’和基团B”形成至少一个加合物；M不存在或者是具有结构
Figure BDA0004122749040000651
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C20烷基，或者其中R’和R”一起形成环；Camp是喜树碱类似物，并且m和n独立地是1至30的整数。
在一个方面，本公开内容提供了具有根据式(A)的结构的化合物：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元，其中所述基团B’和基团B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040000652
并且所述基团B’和B”中的另一个选自
Figure BDA0004122749040000653
以及/>
Figure BDA0004122749040000654
其中Q是C或N；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是具有结构
Figure BDA0004122749040000661
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000662
k是从1至12的整数；
m是从1至30的整数，并且
n是从1至30的整数。
在一个方面，本公开内容提供了具有根据式(I)的结构的化合物：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；L1不存在或者是第一接头；B是包括基团B’的至少一个加合物的支化单元，其中基团B’选自-N3、
Figure BDA0004122749040000663
其中Q是C或N；L2是经由至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头，其中基团B’和基团B”形成至少一个加合物；M不存在或者是具有结构/>
Figure BDA0004122749040000664
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；Dxd是具有式(P)结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000671
并且k和n独立地是1至30的整数。
接头L1
在某些实施方案中，接头L1不存在。
在某些实施方案中，接头L1存在并且与结合剂BA的谷氨酰胺残基的胺共价附接。
在某些实施方案中，接头L1包括烷基(例如，C1-20烷基或C1-12烷基或C1-6烷基)、-NH-、-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、包括2个至4个氨基酸的肽单元或其组合，其中的每一种能够任选地被-S-、-S(O2)-、-C(O)-、-C(O2)-或CO2H中的一个或更多个取代，其中下标u和v独立地是1至8的整数。
在某些实施方案中，游离(未缀合的)接头L1包括用于经由转谷氨酰胺反应与谷氨酰胺残基附接的伯胺。
在一种实施方案中，接头L1包括一个或更多个聚乙二醇(PEG)单元。在一种实施方案中，L1包括2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个或10个PEG单元。
在一种实施方案中，接头L1包括二硫(-S-S-)键。
在一种实施方案中，接头L1包括-S(O2)-部分。
在一种实施方案中，接头L1上的一个或更多个碳被-CO2H取代。
在一种实施方案中，接头L1包括包含2个至4个氨基酸的肽单元，或包含2个氨基酸的肽单元、包含3个氨基酸的肽单元或包含4个氨基酸的肽单元。
在一种实施方案中，接头L1包括包含2个氨基酸的肽单元，所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和瓜氨酸及其组合。在一种特定实施方案中，接头L1包括缬氨酸-瓜氨酸单元。
在一种实施方案中，接头L1选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000681
Figure BDA0004122749040000682
Figure BDA0004122749040000683
其中RA是包括炔烃、叠氮化物、四嗪、反式环辛烯、马来酰亚胺、胺、酮、醛、羧酸、酯、硫醇、磺酸、甲苯磺酸酯、卤化物、硅烷、氰基基团、糖类基团、生物素基团、脂质残基的基团，并且其中下标x、n、p和q独立地是0至12的整数，以及其组合。
支化单元B
支链单元B包括B’基团的至少一个加合物。在某些实施方案中，B包括基团B’的一个加合物。在某些实施方案中，B包括基团B’的两个加合物。在某些实施方案中，B包括基团B’的三个加合物。
在某些实施方案中，B包括基团B’的至少四个加合物。在某些实施方案中，B包括基团B’的四个加合物。在某些实施方案中，B包括基团B’的五个加合物。在某些实施方案中，B包括基团B’的六个加合物。
通常，根据本公开内容的基团B’的加合物涵盖包括基团B’的加成反应的产物的任何部分，与产生该部分所采取的合成步骤无关。
在一些实施方案中，基团B’的加合物可以是取代的马来酰亚胺和例如硫醇或取代的反式环辛烯，例如：
Figure BDA0004122749040000684
其中n是0至12的整数，和例如四嗪的产物。
在一些实施方案中，基团B’的加合物可以是叠氮化物与炔烃部分之间的1,3-环加成反应的产物。不希望受理论束缚，叠氮化物-炔烃环加成是叠氮化物与末端或内部炔烃之间的1,3-偶极环加成，以给出1,2,3-三唑。
更具体地，选自-N3、
Figure BDA0004122749040000691
其中Q是C或N的基团B’的加合物，可以涵盖选自-N3、/>
Figure BDA0004122749040000692
Figure BDA0004122749040000693
其中Q是C或N的基团B’和基团B”的1,3-环加成加合物，其中基团B”与基团B’互补以形成1,3-环加成加合物。
通过非限制性实例的方式，基团B’可以是叠氮化物(-N3)，并且基团B”可以是含炔烃的基团，例如，
Figure BDA0004122749040000694
通过另一个非限制性实例的方式，基团B’可以是含炔烃的基团，例如，
Figure BDA0004122749040000695
并且基团B”可以是叠氮化物。
在一种实施方案中，基团B’和基团B”的加合物包括三唑部分。在一种特实施方案中，基团B’和基团B”的加合物具有选自以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000696
其中Q是C或N。
如以上所述，在一种实施方案中，B包括基团B’的一个加合物。
在特定实施方案中，L1-B选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000701
其中
Figure BDA0004122749040000702
是附接至BA的谷氨酰胺残基的氨基附接点，并且(B’)是基团B’的加合物。
在一种实施方案中，基团B’是叠氮化物(-N3)，并且基团B’的加合物包括三唑。
根据本公开内容的一种实施方案，接头L1-B可以是叠氮化物胺接头(AL)，其包括与抗体直接附接的胺基团、含PEG的碱基结构和叠氮化物官能团B’(n＝1)。
非限制性示例性叠氮化物胺接头的基本组分结构在图3B中列示出。下文提供了作为实例合成的特定结构。
在一种实施方案中，B包括基团B’的至少两个加合物。在特定实施方案中，B包括：
Figure BDA0004122749040000711
/>
Figure BDA0004122749040000712
其中(B’)包括基团B’的加合物的附接点。
在特定实施方案中，B选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000713
/>
Figure BDA0004122749040000721
在特定实施方案中，L1-B选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000722
/>
Figure BDA0004122749040000731
其中
Figure BDA0004122749040000732
是附接至BA的谷氨酰胺残基的氨基附接点。
根据本公开内容的另一种实施方案，接头L1-B可以是支化烷基叠氮化物胺接头(BL)，包括与BA(例如，抗体)直接附接的胺基团、含支化烷基PEG的基本结构和2个至6个叠氮化物官能团B’(n＝2-6)。
示例性非限制性支化烷基叠氮化物胺接头的基本组分结构在图4B中列出。下文提供了作为实例合成的特定结构。
接头L2
在本公开内容的某些实施方案中，L2具有根据式(L2)的结构：
B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2)，其中：
B”是能够与所述基团B’共价附接的基团；
SP1不存在或者是第一间隔物单元；
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是第二间隔物单元；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是第三间隔物单元；并且
p是从1至12的整数。
在本公开内容的某些实施方案中，L2具有根据式(L2’)的结构：
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2’)
其中：
SP1不存在或者是第一间隔物单元；
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是第二间隔物单元；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是第三间隔物单元；并且
p是从1至12的整数。
在本公开内容的某些实施方案中，L2具有根据式(L2”)的结构：
马来酰亚胺-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2”)，其中：
SP1不存在或者是第一间隔物单元；
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是第二间隔物单元；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是第三间隔物单元；并且
p是从1至12的整数。
在一些实施方案中，如以上描述的，接头L2包括能够与基团B’共价附接的基团B”。
在某些实施方案中，基团B”选自-N3、
Figure BDA0004122749040000751
Figure BDA0004122749040000752
其中Q是C或N。
通过非限制性实例的方式，基团B”可以是含炔烃的基团，例如，
Figure BDA0004122749040000753
Figure BDA0004122749040000754
通过另一个非限制性实例的方式，基团B”可以是叠氮化物。
在一种实施方案中，基团B’和基团B”的加合物包括三唑部分。在一种特实施方案中，基团B’和基团B”的加合物具有选自以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000755
(其中Q是C或N)，或者其位置异构体(regioisomer)。
在一种实施方案中，第一间隔物SP1不存在。
在另一种实施方案中，SP1选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000756
在一种实施方案中，支化单元B2不存在。
在一种实施方案中，根据本公开内容的支化单元B2具有下文描绘的B1-B5之一的结构。
Figure BDA0004122749040000757
Figure BDA0004122749040000761
在一种实施方案中，第二间隔物SP2不存在。
在另一种实施方案中，SP2选自由以下组成的组：烷基(例如，C1-20烷基或C1-12烷基或C1-10烷基或C1-8烷基或C1-6烷基)、(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数。
在某些实施方案中，AA是包括2个至4个氨基酸的肽单元，所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和瓜氨酸及其组合。
在一种实施方案中，AA是包括2个氨基酸的肽单元。在一种实施方案中，AA是包括3个氨基酸的肽单元。在一种实施方案中，AA是包括4个氨基酸的肽单元。
在一种特定实施方案中，AA是缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸。
在另一种特定实施方案中，AA选自由以下组成的组：甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGG)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGGG(SEQ ID NO:2113))、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(GGF)和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG(SEQ ID NO:2114))和谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(EVC)。
在一种实施方案中，第三间隔物SP3不存在。
在另一种实施方案中，SP3选自由以下组成的组：
Figure BDA0004122749040000771
Figure BDA0004122749040000772
及其组合，其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自/>
Figure BDA0004122749040000773
Figure BDA0004122749040000774
的基团。
在一种实施方案中，间隔物SP3与喜树碱类似物例如Dxd或M-Dxd共价附接。
在一种实施方案中，接头L2包括约1个至约12个、或约1个至约10个、或约1个至约8个、或约1个至约6个、或约1个至约4个、或约1个至约2个(SP2-AA-SP3)部分，并且接头-有效载荷L2-Dxd包括约1个至约12个、或约1个至约10个、或约1个至约8个、或约1个至约6个、或约1个至约4个、或约1个至约2个Dxd有效载荷分子。
部分M
在某些实施方案中，部分M不存在。
在某些实施方案中，M存在并且具有结构
Figure BDA0004122749040000775
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或烷基，或者其中R’和R”一起形成环，例如3元至8元环。
在某些实施方案中，M存在并且具有结构
Figure BDA0004122749040000781
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环。
在一种实施方案中，R是氢。
在一种实施方案中，R’是氢。在一种实施方案中，R’是C1-C4烷基。
在一种实施方案中，R”是氢。在一种实施方案中，R”是C1-C4烷基。
在一种实施方案中，R’和R”一起形成5元环。在一种实施方案中，R’和R”一起是-(CH2)3-。
在一种实施方案中，R’和R”一起形成6元环。在一种实施方案中，R’和R”一起是-(CH2)4-。
在一种实施方案中，R、R’和R”在每次出现时是氢，即M是
Figure BDA0004122749040000782
在另一种实施方案中，R是氢并且R’和R”一起形成5元环，例如R’和R”一起是-(CH2)3-，并且M是
Figure BDA0004122749040000783
有效载荷
在某些实施方案中，本公开内容的有效载荷是喜树碱类似物和/或衍生物。
Figure BDA0004122749040000784
以上示出的喜树碱(CPT)是拓扑异构酶毒物。它是1966年由M.E.Wall和M.C.Wani在系统筛选天然产物中的抗癌药物时发现的。它是从喜树(Camptotheca acuminata，Happytree)(一种原产于中国的树，在中国传统医学中用作癌症治疗)树皮和茎中分离出来的。喜树碱在初步临床试验中显示出显著的抗癌活性。然而，它具有低溶解度，因此合成和药物化学家已经开发了喜树碱及各种衍生物的许多合成，以增加该化学品的益处，具有良好的结果。现今，四种喜树碱类似物已被批准并用于癌症化学疗法：拓扑替康、伊立替康、贝洛替康和德鲁替康(deruxtecan，Dxd)。
曲妥珠单抗德鲁替康(T-Dxd)是抗体-药物缀合物，包括人类表皮生长因子受体2(HER2)导向的抗体曲妥珠单抗和拓扑异构酶I抑制剂缀合物德鲁替康(Dxd，依喜替康(exatecan)的衍生物)。于2019年12月在美国被批准使用。如下文示出的，依喜替康是喜树碱类似物。
Figure BDA0004122749040000791
在一种实施方案中，本公开内容的有效载荷是德鲁替康(Dxd)。
在某些实施方案中，本公开内容的有效载荷是具有结构P-I的化合物：
Figure BDA0004122749040000792
其中R1、R2和R3以及R4独立地是氢或烷基，例如，C1-C12烷基或C1-C8烷基或C1-C6烷基或C1-C4烷基，或者其中R2和R3一起形成5元或6元环，
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，R1是氢。
在一种实施方案中，R2是氢。在一种实施方案中，R2是C1-C4烷基。
在一种实施方案中，R3是氢。在一种实施方案中，R3是C1-C4烷基。
在一种实施方案中，R4是氢。在一种实施方案中，R4是C1-C4烷基。
在一种实施方案中，R1、R2和R3以及R4在每次出现时是氢。在一种实施方案中，本公开内容的化合物是
Figure BDA0004122749040000801
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，R2和R3一起形成5元环。在一种实施方案中，R2和R3一起是-(CH2)3-。
在一种实施方案中，R2和R3一起形成6元环。在一种实施方案中，R2和R3一起是-(CH2)4-。
在一种实施方案中，R1是氢，并且R2和R3一起形成5元环。
在一种实施方案中，本公开内容的化合物具有根据式(P-II)的结构：
Figure BDA0004122749040000802
其中R是氢或烷基，例如，C1-C12烷基或C1-C8烷基或C1-C6烷基或C1-C4烷基，
或其药学上可接受的盐。
本领域技术人员应该理解，以上描绘的化合物P-II也意指包括该结构的所有异构体(例如，对映异构体、非对映异构体和几何(或构象))形式。例如，每个不对称中心的R和S构型都在本公开内容的范围内。通过实例的方式，下文描述的两种异构体在本公开内容的范围内：
Figure BDA0004122749040000811
在一种实施方案中，本公开内容的化合物是
Figure BDA0004122749040000812
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，根据本公开内容的有效载荷被缀合以形成蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)。在一种实施方案中，有效载荷与部分M共价附接。在一种实施方案中，有效载荷是M-Dxd。在一种实施方案中，M-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000813
其中R是氢或C1-C4烷基，并且其中
Figure BDA0004122749040000824
表示L2的附接点。
本公开内容还涉及一种药物组合物，包括治疗有效量的如以上描述的化合物或其药学上可接受的盐和一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一种实施方案中，根据本公开内容的化合物具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000821
其中BA是结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)。
在一种实施方案中，根据本公开内容的化合物具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000822
其中BA是结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)。
在一种实施方案中，根据本公开内容的化合物具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000823
其中BA是结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)。
在一种实施方案中，根据本公开内容的化合物具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000831
其中BA是结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)。
本公开内容还涉及一种药物组合物，包括治疗有效量的如以上描述的化合物或其药学上可接受的盐和一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
接头-有效载荷(L2-P)
在另一个方面，本公开内容提供了根据式(L2-P)的化合物：
B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2-P)，其中
B”选自由以下组成的组：-N3、
Figure BDA0004122749040000832
Figure BDA0004122749040000833
SP1不存在或者是选自由以下组成的组的第一间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000834
Figure BDA0004122749040000835
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是选自由以下组成的组的第二间隔物单元：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是选自由以下组成的组的第三间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000841
/>
Figure BDA0004122749040000842
其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自
Figure BDA0004122749040000843
的基团；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000844
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；并且
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000845
并且
p是从1至12的整数。
在另一个方面，本公开内容提供了根据式(L2’-P)的化合物：
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’-P)，
其中：
B”选自由以下组成的组：-N3、
Figure BDA0004122749040000846
Figure BDA0004122749040000851
SP1不存在或者是选自由以下组成的组的第一间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000852
Figure BDA0004122749040000853
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是选自由以下组成的组的第二间隔物单元：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是选自由以下组成的组的第三间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000854
Figure BDA0004122749040000855
其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自
Figure BDA0004122749040000856
的基团；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000857
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；并且
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000861
并且
p是从1至12的整数。
在另一个方面，本公开内容提供了根据式(L2”-P)的化合物：
马来酰亚胺-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2”-P)，
其中：
B”选自由以下组成的组：-N3、
Figure BDA0004122749040000862
Figure BDA0004122749040000863
/>
SP1不存在或者是选自由以下组成的组的第一间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000864
Figure BDA0004122749040000865
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是选自由以下组成的组的第二间隔物单元：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是选自由以下组成的组的第三间隔物单元：
Figure BDA0004122749040000871
Figure BDA0004122749040000872
其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自
Figure BDA0004122749040000873
的基团；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040000874
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；并且
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040000875
并且
p是从1至12的整数。
在某些实施方案中，根据本公开内容的接头-有效载荷L2-P、L2’-P、L2”-P具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040000876
Figure BDA0004122749040000881
/>
Figure BDA0004122749040000891
/>
Figure BDA0004122749040000901
或其药学上可接受的盐。
支化接头2-有效载荷(BL2P)
在另一个方面，本公开内容提供包括一个或更多个支化单元的L2-P。根据本公开内容的示例性支化单元B1-B5在下文描绘。
Figure BDA0004122749040000902
根据本公开内容的示例性支化接头2-有效载荷(BL2P)的结构在下文提供。
Figure BDA0004122749040000911
/>
Figure BDA0004122749040000921
/>
Figure BDA0004122749040000931
/>
Figure BDA0004122749040000941
/>
Figure BDA0004122749040000951
Figure BDA0004122749040000961
在一种实施方案中，根据本公开内容的化合物(即，接头-有效载荷)具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000962
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，根据本公开内容的化合物(即，接头-有效载荷)具有以下结构：
Figure BDA0004122749040000963
或其药学上可接受的盐。
在另一个方面，本公开内容提供了根据式(II)的抗体-药物缀合物：
Ab-(Gln-NH-L1-B-(SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)k)p)n
(II)，
其中Ab是抗体；Gln是谷氨酰胺残基；L1不存在或者是如以上描述的第一接头；B是如以上描述的包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的分支单元，其中基团B’选自-N3、
Figure BDA0004122749040000971
和至少一个基团B”，其中B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p是如以上描述的根据式(L2-P)的化合物，并且其中式(L2-P)化合物经由基团B’和基团B”的加合物与抗体共价附接，k是1至12的整数，并且p和n独立地是1至30的整数。
在一种实施方案中，根据本公开内容的抗体-药物缀合物包括抗体和接头-有效载荷，其中接头-有效载荷包括以下结构：
Figure BDA0004122749040000972
或其药学上可接受的盐，其中
Figure BDA0004122749040000973
表示直接或通过第二接头与结合剂(例如抗体)的附接点。/>
结合剂
在一种实施方案中，本文描述的蛋白-药物缀合物实施方案的有效性取决于结合剂结合其结合配偶体的选择性。在本公开内容的一种实施方案中，结合剂是能够以某种特异性与给定结合配偶体结合的任何分子。在一种实施方案中，结合剂在哺乳动物体内，在那里相互作用可以产生治疗用途。在替代实施方案中，结合剂在体外，在那里相互作用可以产生诊断用途。在一些方面，结合剂能够与细胞或细胞群体结合。
本公开内容的合适结合剂包括与结合配偶体结合的蛋白，其中结合剂包括一个或更多个谷氨酰胺残基。合适的结合剂包括但不限于抗体、淋巴因子、激素、生长因子、病毒受体、白细胞介素或任何其他细胞结合或肽结合分子或物质。
在一种实施方案中，结合剂是抗体。在某些实施方案中，抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(Fab、Fab’和F(ab)2、微抗体、双抗体、三抗体等)。本文中的抗体可以使用美国专利第6,596,541号和美国公布第2012/0096572号中描述的方法进行人源化，这两个专利通过引用以其整体并入本文。在本公开内容的蛋白-药物缀合物化合物的某些实施方案中，BA是人源化单克隆抗体。例如，BA可以是结合HER2、MET或STEAP2的单克隆抗体。在本公开内容的蛋白-药物缀合物化合物的某些实施方案中，BA是双特异性抗体，例如抗HER2/HER2双特异性抗体或抗MET/MET双特异性抗体。
在本公开内容中，抗体可以是被认为适于本领域从业者的任何抗体。在一些实施方案中，抗体在至少一个多肽链序列中包括至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，抗体包括一个或更多个gln295残基。在某些实施方案中，抗体包括两个重链多肽，该两个重链多肽各自具有一个gln295残基。在另外的实施方案中，抗体在除了重链295之外的位点处包括一个或更多个谷氨酰胺残基。这样的抗体可以从天然来源分离或被工程化为包括一个或更多个谷氨酰胺残基。将谷氨酰胺残基工程化为抗体多肽链的技术在本领域从业人员的技术内。在某些实施方案中，抗体是非糖基化的。
抗体可以是本领域技术人员已知的任何形式。在某些实施方案中，抗体包括轻链。在某些实施方案中，轻链是κ轻链。在某些实施方案中，轻链是λ轻链。
在某些实施方案中，抗体包括重链。在一些方面，重链是IgA。在一些方面，重链是IgD。在一些方面，重链是IgE。在一些方面，重链是IgG。在一些方面，重链是IgM。在一些方面，重链是IgG1。在一些方面，重链是IgG2。在一些方面，重链是IgG3。在一些方面，重链是IgG4。在一些方面，重链是IgA1。在一些方面，重链是IgA2。
在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在一些方面，抗体片段是Fv片段。在一些方面，抗体片段是Fab片段。在一些方面，抗体片段是F(ab’)2片段。在一些方面，抗体片段是Fab’片段。在一些方面，抗体片段是scFv(sFv)片段。在一些方面，抗体片段是scFv-Fc片段。
在一种实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是人类抗体。
抗体可以对被认为适于本领域技术人员的任何抗原具有结合特异性。在某些实施方案中，抗原是跨膜分子(例如受体)或生长因子。示例性抗原包括但不限于分子，诸如，肾素；生长激素，包括人类生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子vmc、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子；抗凝血因子诸如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人类尿液或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人类巨噬细胞炎性蛋白(MLP-I-α)；血清白蛋白，诸如人类血清白蛋白；缪勒抑制物质(Muellerian-inhibiting substance)；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，诸如β内酰胺酶；DNA酶；19E；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；蛋白A或蛋白D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3、神经营养因子4、神经营养因子5或神经营养因子6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，诸如NGF-β；血小板源性生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子诸如aFGF和bFGF；成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)、表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-l和胰岛素样生长因子-2(IGF-l和IGF-2)；des(I-3)-IGF-l(脑IGF-l)、胰岛素样生长因子结合蛋白、EpCAM、gD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、STEAP2、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLRI、间皮素、cripto、αvβ6、整联蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体、lRTAI、lRTA2、lRTA3、lRTA4、lRTA5；CD蛋白，诸如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CDII、CDI4、CDI9、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CDI52、或在美国公布第2008/0171040号或美国公布第2008/0305044号中公开的并且通过引用以其整体并入的与一种或更多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、gM-CSF和g-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如HIV包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素(addressins)；调控蛋白；整联蛋白，诸如CDlla、CDllb、CDllc、CDI8、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原诸如AFP、ALK、B7H4、BAGE蛋白、β-联蛋白、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9(碳酸酐酶IX)、胱天蛋白酶-8、CD20、CD40、CD123、CDK4、CEA、CLEC12A、c-kit、cMET、CTLA4、细胞周期蛋白-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRVIII、内皮素、Epcam、EphA2、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER4、ETV6-AML、Fra-1、FOLR1、gAGE蛋白(例如，gAGE-1、gAGE-2)、gD2、gD3、globoH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、gM3、gp100、HER2、HLA/B-raf、HLA/EBNA1、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IGF1R、LGR5、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6和MAGE-12)、MART-1、间皮素、mL-IAP、Muc1、Muc16(CA-125)、MET、MUM1、NA17、NGEP、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PDGFR-α、PDGFR-β、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、PLAC1、PRLR、PRAME、PSCA、PSGR、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、STn、存活蛋白、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TNFRSF17、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿蛋白-3，以及本文列出的任何多肽的片段。
示例性抗原还包括但不限于BCMA、SLAMF7、B7H4、gPNMB、UPK3A和LGR5。示例性抗原还包括但不限于MUC16、PSMA、STEAP2和HER2。
在一些实施方案中，抗原还包括但不限于血液学靶，例如，CD22、CD30、CD33、CD79a和CD79b。
本文的一些实施方案是对治疗或诊断用途特异性的靶。在一种实施方案中，制备结合剂以与定义为肿瘤抗原的抗原相互作用并结合，所述抗原包括对一种类型的肿瘤特异的抗原或在特定类型的肿瘤上共有、过表达或修饰的抗原。实例包括：肺癌的α-肌动蛋白-4、黑素瘤的ARTC1、慢性髓性白血病的BCR-ABL融合蛋白、黑素瘤的B-RAF、CLPP或Cdc27、鳞状细胞癌的CASP-8和肾细胞癌的hsp70-2以及以下共有的肿瘤特异性抗原，例如：BAGE-1、gAGE、gnTV、KK-LC-1、MAGE-A2、NA88-A、TRP2-INT2。在一些实施方案中，抗原是PRLR或HER2。在一些实施方案中，抗体结合STEAP2、MUC16、EGFR、EGFRVIII、FGR2或PRLR。
在一些实施方案中，抗原包括HER2。在一些实施方案中，抗原包括STEAP2。在一些实施方案中，抗原包括MET。在一些实施方案中，抗原包括EGFRVIII。在一些实施方案中，抗原包括MUC16。在一些实施方案中，抗原包括PRLR。在一些实施方案中，抗原包括PSMA。在一些实施方案中，抗原包括FGFR2。
在一些实施方案中，BA是抗HER2抗体、抗STEAP2抗体、抗MET抗体、抗EGFRVIII抗体、抗MUC16抗体、抗PRLR抗体、抗PSMA抗体或抗FGFR2抗体、抗HER2/HER2双特异性抗体、抗MET/MET双特异性抗体或抗FOLR1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，BA靶向选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌或脑癌。
适于蛋白-药物缀合物的抗HER2抗体
在一些实施方案中，抗体是抗HER2抗体。在一些实施方案中，抗体是曲妥珠单抗、帕妥珠单抗(2C4)或马吉妥昔单抗(margetuximab，MGAH22)。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗。根据某些实施方案，根据本公开内容的蛋白-药物缀合物，例如ADC，包括抗HER2抗体。在一些实施方案中，抗HER2抗体可以包括WO 2019/212965 A1中描述的那些。
在一些实施方案中，抗体是抗HER2/HER2双特异性抗体，其包括特异性结合人类HER2的第一表位的第一抗原结合结构域(D1)和特异性结合人类HER2的第二表位的第二抗原结合结构域(D2)。
在某些实施方案中，抗HER2/HER2双特异性抗体的D1结构域和D2结构域彼此是非竞争性的。D1与D2之间对HER2结合的非竞争意味着D1和D2来源于的各自的单特异性抗原结合蛋白对人类HER2结合不彼此竞争。示例性抗原结合蛋白竞争测定是本领域已知的。
在某些实施方案中，D1和D2与HER2上的不同(例如，非重叠或部分地重叠)表位结合。
在一个非限制性实施方案中，本公开内容提供了包括双特异性抗原结合分子的蛋白-药物缀合物，该双特异性抗原结合分子包括：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性结合人类HER2的第一表位；并且
其中D2特异性结合人类HER2的第二表位。
抗HER2/HER2双特异性抗体可以使用两种单独的单特异性抗HER2抗体的抗原结合结构域来构建。例如，单克隆单特异性抗HER2抗体的集合可以使用本领域已知的标准方法产生。因此产生的单独抗体可以成对地彼此测试与HER2蛋白的交叉竞争。如果两种不同的抗HER2抗体能够同时与HER2结合(即，不彼此竞争)，那么根据本公开内容，来自第一抗HER2抗体的抗原结合结构域和来自第二、非竞争性抗HER2抗体的抗原结合结构域可以被工程化为单个抗HER2/HER2双特异性抗体。
根据本公开内容，双特异性抗原结合分子可以是单个多功能多肽，或者它可以是彼此共价或非共价缔合的两个或更多个多肽的多聚体复合物。如本公开内容将明显的，具有同时结合HER2分子的两个单独的、不相同的表位的能力的任何抗原结合构建体被认为是双特异性抗原结合分子。本文描述的任何双特异性抗原结合分子或其变体可以使用如本领域普通技术人员已知的标准分子生物学技术(例如重组DNA和蛋白表达技术)来构建。
在另一个方面，本公开内容提供了一种药物组合物，包括特异性结合HER2的重组人类抗体或其片段和药学上可接受的载体。在一种非限制性实施方案中，抗体可以结合HER2蛋白上的两个单独的表位，即抗体是HER2/HER2双特异性抗体。在一个相关方面，本公开内容特征在于一种组合物，该组合物是抗HER2/HER2抗体和第二治疗剂的组合。在一种实施方案中，第二治疗剂是有利地与抗HER2/HER2抗体组合的任何剂。涉及本公开内容的抗HER2/HER2双特异性抗体的另外的组合疗法和共制剂在本文别处公开。
在另一个方面，本公开内容提供了用于使用本公开内容的抗HER2/HER2双特异性抗体靶向/杀伤表达HER2的肿瘤细胞的治疗方法，其中该治疗方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的包括本公开内容的抗HER2/HER2抗体的药物组合物。在一些情况下，抗HER2/HER2抗体(或其抗原结合片段)可以用于治疗乳腺癌，或者可以通过包括但不限于修饰Fc结构域以增加ADCC(参见例如Shield等人(2002)JBC 277:26733)、放射免疫疗法、抗体-药物缀合物的方法或用于增加肿瘤消融效率的其他方法来修饰以更具细胞毒性。
本公开内容还包括本公开内容的抗HER2抗体在制造用于治疗与表达HER2的细胞相关或由其引起的疾病或紊乱(例如，癌症)的药物中的用途。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗HER2抗体或抗原结合片段或HER2/HER2双特异性抗体的化合物。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗体-药物缀合物(ADC)的化合物。
在又一个方面，本公开内容提供了用于诊断应用诸如例如成像试剂的双特异性抗HER2/HER2抗体。
适于蛋白-药物缀合物的抗STEAP2抗体
在一些实施方案中，抗体是抗前列腺2的六次跨膜上皮抗原(STEAP2)，即抗STEAP2抗体。用作高尔基复合体与质膜之间的穿梭器的STEAP2，是金属还原酶，其还原铁和铜，促进它们进入细胞。STEAP2主要定位于前列腺的上皮细胞。STEAP2也在正常的心、脑、胰腺、卵巢、骨骼肌、乳腺、睾丸、子宫、肾、肺、气管、结肠和肝中表达。STEAP2在癌组织中过表达，包括前列腺、膀胱、子宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和卵巢肿瘤(Gomes，I.M.等人，2012,Mol.Cancer Res.10:573-587；Challita-Eid-P.M.，等人，2003,WO 03/087306；Emtage,P.C.R.,2005,WO 2005/079490)。
在一个方面，合适的抗STEAP抗体是US2018/0104357中公开的那些。根据本公开内容的示例性抗STEAP2抗体在本文的表1和表2中列出。表1示出了示例性抗STEAP2抗体的重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)以及重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2示出了编码示例性抗STEAP2抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸分子的序列标识符。
本公开内容提供了包括HCVR的抗体或其抗原结合片段，该HCVR包括选自表1中列出的HCVR氨基酸序列的任何一种的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了包括LCVR的抗体或其抗原结合片段，该LCVR包括选自表1中列出的LCVR氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了包括HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的抗体或其抗原结合片段，该HCVR和LCVR氨基酸序列对包括表1中列出的HCVR氨基酸序列的任何一个与表1中列出的LCVR氨基酸序列的任何一个配对。根据某些实施方案，本公开内容提供了抗体或其抗原结合片段，其包括表1中列出的示例性抗STEAP2抗体的任何一个内包含的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:250/258组成的组(例如，H2M11162N)。
本公开内容还提供了包括重链CDR1(HCDR1)的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR1(HCDR1)包括选自表1中列出的HCDR1氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本公开内容还提供了包括重链CDR2(HCDR2)的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR2(HCDR2)包括选自表1中列出的HCDR2氨基酸序列的任何一个氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本公开内容还提供了包括重链CDR3(HCDR3)的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR3(HCDR3)包括选自表1中列出的HCDR3氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本公开内容还提供了包括轻链CDR1(LCDR1)的抗体或其抗原结合片段，该轻链CDR1(LCDR1)包括选自表1中列出的LCDR1氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本公开内容还提供了包括轻链CDR2(LCDR2)的抗体或其抗原结合片段，该轻链CDR2(LCDR2)包括选自表1中列出的LCDR2氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本公开内容还提供了包括轻链CDR3(LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，该轻链CDR3(LCDR3)包括选自表1中列出的LCDR3氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本公开内容还提供了包括HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)的抗体或其抗原结合片段，该HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)包括表1中列出的HCDR3氨基酸序列的任何一个与表1中列出的LCDR3氨基酸序列的任何一个配对。根据某些实施方案，本公开内容提供了抗体或其抗原结合片段，其包括表1中列出的示例性抗STEAP2抗体的任何一个内包含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:256/264组成的组(例如，H2M11162N)。
本公开内容还提供了包括被包含在表1中列出的示例性抗STEAP2抗体的任何一种内的一组六个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组选自由SEQID NO:252-254-256-260-262-264组成的组(例如，H2M11162N)。
在一种相关的实施方案中，本公开内容提供了包括被包含在如由表1中列出的示例性抗STEAP2抗体的任何一种定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内的一组六个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗体或其抗原结合片段。例如，本公开内容包括以下抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含被包含在选自由SEQ IDNO:250/258组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对内的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组(例如，H2M11162N)。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域熟知的，并且可以用于鉴定本文公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴定CDR边界的示例性惯例包括，例如，Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般来说，Kabat定义是基于序列可变性，Chothia定义是基于结构环区域的位置，并且AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折中。参见例如，Kabat,"Sequences of Proteins ofImmunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；和Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。公共数据库对于鉴定抗体内的CDR序列也是可得的。
本公开内容还提供了编码抗STEAP2抗体或其部分的核酸分子。例如，本公开内容提供了编码表1中列出的HCVR氨基酸序列的任何一个的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的HCVR核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了编码表1中列出的LCVR氨基酸序列的任何一个的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的LCVR核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了编码表1中列出的HCDR1氨基酸序列的任何一个的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的HCDR1核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了编码表1中列出的HCDR2氨基酸序列的任何一个的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的HCDR2核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了编码表1中列出的HCDR3氨基酸序列的任何一个的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的HCDR3核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了编码表1中列出的LCDR1氨基酸序列的任何一个的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的LCDR1核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了编码表1中列出的LCDR2氨基酸序列的任何一个的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的LCDR2核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了编码表1中列出的LCDR3氨基酸序列的任何一个的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的LCDR3核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本公开内容还提供了编码HCVR的核酸分子，其中HCVR包括一组三个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中列出的示例性抗STEAP2抗体的任何一种定义。
本公开内容还提供了编码LCVR的核酸分子，其中LCVR包括一组三个CDR(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中列出的示例性抗STEAP2抗体的任何一种定义。
本公开内容还提供了编码HCVR和LCVR二者的核酸分子，其中HCVR包括表1中列出的HCVR氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列，并且其中LCVR包括表1中列出的LCVR氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子包括选自表2中列出的HCVR核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列，以及选自表2中列出的LCVR核酸序列的任何一个的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。在根据本公开内容的这一方面的某些实施方案中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中HCVR和LCVR两者都来源于表1中列出的相同抗STEAP2抗体。
本公开内容还提供了能够表达包括抗STEAP2抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，本公开内容包括包含以上提及的核酸分子的任何一个的重组表达载体，即编码表1中列出的HCVR、LCVR和/或CDR序列的任何一个的核酸分子。本公开内容的范围内还包括已经引入这样的载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞并回收如此产生的抗体和抗体片段来产生抗体或其部分的方法。
本公开内容包括具有修饰的糖基化模式的抗STEAP2抗体。在一些实施方案中，去除不期望的糖基化位点的修饰，或者缺乏寡糖链上存在的岩藻糖部分的抗体，例如，可以可用于增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰，以便修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面，本公开内容提供了一种药物组合物，包括特异性结合STEAP2的重组人类抗体或其片段和药学上可接受的载体。在一个相关方面，本公开内容特征在于一种组合物，该组合物是抗STEAP2抗体和第二治疗剂的组合。在一种实施方案中，第二治疗剂是有利地与抗STEAP2抗体组合的任何剂。涉及本公开内容的抗STEAP2抗体的另外的组合疗法和共制剂在本文别处公开。
在另一个方面，本公开内容提供了用于使用本公开内容的抗STEAP2抗体靶向/杀伤表达STEAP2的肿瘤细胞的治疗方法，其中该治疗方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的包括本公开内容的抗STEAP2抗体的药物组合物。在一些情况下，抗STEAP2抗体(或其抗原结合片段)可以用于治疗前列腺癌，或者可以通过包括但不限于修饰Fc结构域以增加ADCC(参见例如Shield等人(2002)JBC 277:26733)、放射免疫疗法、抗体-药物缀合物的方法或用于增加肿瘤消融效率的其他方法来修饰以更具细胞毒性。
本公开内容还包括本公开内容的抗STEAP2抗体在制造用于治疗与表达STEAP2的细胞相关或由其引起的疾病或紊乱(例如，癌症)的药物中的用途。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗STEAP2抗体或抗原结合片段或STEAP2xCD3双特异性抗体的化合物。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗体-药物缀合物(ADC)的化合物。
在又一个方面，本公开内容提供了用于诊断应用诸如例如成像试剂的单特异性抗STEAP2抗体。
在又另一个方面，本公开内容提供了使用本公开内容的抗CD3抗体或抗体的抗原结合部分刺激T细胞激活的治疗方法，其中治疗方法包括施用治疗有效量的包括抗体的药物组合物。
在另一个方面，本公开内容提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段以如通过FACS分析测量少于50nM的EC50结合表达STEAP2的C4-2细胞。在另一个方面，本公开内容提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段结合表达STEAP2的C4-2细胞并被其内化。
本公开内容还提供了一种抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段与包括如表1中示出的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争与人类STEAP2的结合。在另一个方面，本公开内容提供了一种抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段与包括选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争与人类STEAP2的结合：SEQ ID NO:2/10；SEQ ID NO:18/26；SEQ ID NO:34/42；SEQ ID NO:50/58；SEQ ID NO:66/58；SEQ IDNO:74/58；SEQ ID NO:82/58；SEQ ID NO:90/58；SEQ ID NO:98/58；SEQ ID NO:106/114；SEQ ID NO:122/130；SEQ ID NO:138/146；SEQ ID NO:154/162；SEQ ID NO:170/178；SEQID NO:186/194；SEQ ID NO:202/210；SEQ ID NO:218/226；SEQ ID NO:234/242；SEQ IDNO:250/258；SEQ ID NO:266/274；SEQ ID NO:282/290；SEQ ID NO:298/306；SEQ ID NO:314/322；SEQ ID NO:330/338；SEQ ID NO:346/354；SEQ ID NO:362/370；和SEQ ID NO:378/386。
本公开内容还提供了一种抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与包括如表1中示出的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合人类STEAP2上的同一表位。在另一个方面，抗体或抗原结合片段与包括选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争与人类STEAP2上的同一表位的结合：SEQ ID NO:2/10；SEQ ID NO:18/26；SEQ ID NO:34/42；SEQ ID NO:50/58；SEQ ID NO:66/58；SEQ ID NO:74/58；SEQ ID NO:82/58；SEQ ID NO:90/58；SEQ ID NO:98/58；SEQ ID NO:106/114；SEQ ID NO:122/130；SEQ IDNO:138/146；SEQ ID NO:154/162；SEQ ID NO:170/178；SEQ ID NO:186/194；SEQ ID NO:202/210；SEQ ID NO:218/226；SEQ ID NO:234/242；SEQ ID NO:250/258；SEQ ID NO:266/274；SEQ ID NO:282/290；SEQ ID NO:298/306；SEQ ID NO:314/322；SEQ ID NO:330/338；SEQ ID NO:346/354；SEQ ID NO:362/370；和SEQ ID NO:378/386。
本公开内容还提供了结合人类STEAP2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：具有如表1中示出的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)；和具有如表1中示出的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR。在另一个方面，分离的抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:2/10；SEQ ID NO:18/26；SEQ ID NO:34/42；SEQ ID NO:50/58；SEQ ID NO:66/58；SEQ ID NO:74/58；SEQ ID NO:82/58；SEQ ID NO:90/58；SEQ IDNO:98/58；SEQ IDNO:106/114；SEQ ID NO:122/130；SEQ ID NO:138/146；SEQ ID NO:154/162；SEQ ID NO:170/178；SEQ ID NO:186/194；SEQ ID NO:202/210；SEQ ID NO:218/226；SEQ ID NO:234/242；SEQ ID NO:250/258；SEQ ID NO:266/274；SEQ ID NO:282/290；SEQ ID NO:298/306；SEQ ID NO:314/322；SEQ ID NO:330/338；SEQ ID NO:346/354；SEQ ID NO:362/370；和SEQID NO:378/386。在又另一个方面，分离的抗体或抗原结合片段分别包括选自由以下组成的组的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域：SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16；SEQ IDNO:20-22-24-28-30-32；SEQ ID NO:36-38-40-44-46-48；SEQ ID NO:52-54-56-60-62-64；SEQ ID NO:68-70-72-60-62-64；SEQ ID NO:76-78-80-60-62-64；SEQ ID NO:84-86-88-60-62-64；SEQ ID NO:92-94-96-60-62-64；SEQ ID NO:100-102-104-60-62-64；SEQ IDNO:108-110-112-116-118-120；SEQ ID NO:124-126-128-132-134-136；SEQ ID NO:140-142-144-148-150-152；SEQ ID NO:156-158-160-164-166-168；SEQ ID NO:172-174-176-180-182-184；SEQ ID NO:188-190-192-196-198-200；SEQ ID NO:204-206-208-212-214-216；SEQ ID NO:220-222-224-228-230-232；SEQ ID NO:236-238-240-244-246-248；SEQID NO:252-254-256-260-262-264；SEQ ID NO:268-270-272-276-278-280；SEQ ID NO:284-286-288-292-294-296；SEQ ID NO:300-302-304-308-310-312；SEQ ID NO:316-318-320-324-326-328；SEQ ID NO:332-334-336-340-342-344；SEQ ID NO:348-350-352-356-358-360；SEQ ID NO:364-366-368-372-374-376；和SEQ ID NO:380-382-384-388-390-392。
在另一个方面，本公开内容提供了结合人类STEAP2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括：(a)重链可变区(HCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:202、SEQID NO:218、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:266、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:330、SEQ ID NO:346、SEQ ID NO:362和SEQ ID NO:378；和(b)轻链可变区(LCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10；SEQ IDNO:26；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:114；SEQ ID NO:130；SEQ ID NO:146；SEQID NO:162；SEQ ID NO:178；SEQ ID NO:194；SEQ ID NO:210；SEQ ID NO:226；SEQ ID NO:242；SEQ ID NO:258；SEQ ID NO:274；SEQ ID NO:290；SEQ ID NO:306；SEQ ID NO:322；SEQID NO:338；SEQ ID NO:354；SEQ ID NO:370；和SEQ ID NO:386。在另外的方面，权利要求10的分离的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10；SEQ ID NO:18/26；SEQ ID NO:34/42；SEQ IDNO:50/58；SEQ ID NO:66/58；SEQ ID NO:74/58；SEQ ID NO:82/58；SEQ ID NO:90/58；SEQID NO:98/58；SEQ ID NO:106/114；SEQ ID NO:122/130；SEQ ID NO:138/146；SEQ ID NO:154/162；SEQ ID NO:170/178；SEQ ID NO:186/194；SEQ ID NO:202/210；SEQ ID NO:218/226；SEQ ID NO:234/242；SEQ ID NO:250/258；SEQ ID NO:266/274；SEQ ID NO:282/290；SEQ ID NO:298/306；SEQ ID NO:314/322；SEQ ID NO:330/338；SEQ ID NO:346/354；SEQID NO:362/370；和SEQ ID NO:378/386。
根据另一个方面，本公开内容提供了包括如以上描述的抗STEAP2抗体或其抗原结合片段和治疗剂(例如，抗肿瘤剂，例如喜树碱类似物，例如Dxd)的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段和抗肿瘤剂经由接头共价附接，如以上讨论的。在多种实施方案中，抗STEAP2抗体或抗原结合片段可以是本文描述的抗STEAP2抗体或片段的任何一种。
抗STEAP2抗体的重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表1示出了根据本公开内容的选择的抗STEAP2抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识符。对应的核酸序列标识符在表2中示出。
表1：抗STEAP2抗体的氨基酸序列标识符
Figure BDA0004122749040001141
表2：抗STEAP2抗体的核酸序列标识符
Figure BDA0004122749040001142
Figure BDA0004122749040001151
适于蛋白-药物缀合物的抗MET抗体
在一些实施方案中，抗体是抗MET抗体。根据某些实施方案，根据本公开内容的蛋白-药物缀合物，例如ADC，包括抗MET抗体。在一些实施方案中，抗MET抗体可以包括US2018/0134794中描述的那些。
在一些实施方案中，抗体是抗MET/MET双特异性抗体，其包括特异性结合人类MET的第一表位的第一抗原结合结构域(D1)和特异性结合人类MET的第二表位的第二抗原结合结构域(D2)。在一些实施方案中，抗MET/MET双特异性抗体可以包括US 2018/0134794中描述的那些。
在某些实施方案中，抗MET/MET双特异性抗体的D1结构域和D2结构域彼此是非竞争性的。D1与D2之间对MET结合的非竞争意味着D1和D2来源于的各自的单特异性抗原结合蛋白对人类MET结合不彼此竞争。示例性抗原结合蛋白竞争测定是本领域已知的。
在某些实施方案中，D1和D2与MET上的不同(例如，非重叠或部分地重叠)表位结合。
在一个非限制性实施方案中，本公开内容提供了包括双特异性抗原结合分子的蛋白-药物缀合物，该双特异性抗原结合分子包括：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性结合人类MET的第一表位；并且
其中D2特异性结合人类MET的第二表位。
抗MET/MET双特异性抗体可以使用两种单独的单特异性抗MET抗体的抗原结合结构域来构建。例如，单克隆单特异性抗MET抗体的集合可以使用本领域已知的标准方法产生。因此产生的单独抗体可以成对地彼此测试与MET蛋白的交叉竞争。如果两种不同的抗MET抗体能够同时与MET结合(即，不彼此竞争)，那么根据本公开内容，来自第一抗MET抗体的抗原结合结构域和来自第二、非竞争性抗MET抗体的抗原结合结构域可以被工程化为单个抗MET/MET双特异性抗体。
根据本公开内容，双特异性抗原结合分子可以是单个多功能多肽，或者它可以是彼此共价或非共价缔合的两个或更多个多肽的多聚体复合物。如本公开内容将明显的，具有同时结合MET分子的两个单独的、不相同的表位的能力的任何抗原结合构建体被认为是双特异性抗原结合分子。本文描述的任何双特异性抗原结合分子或其变体可以使用如本领域普通技术人员已知的标准分子生物学技术(例如重组DNA和蛋白表达技术)来构建。
包含特异性结合人类MET的第一表位的第一抗原结合结构域(D1)和特异性结合人类MET的第二表位的第二抗原结合结构域(D2)的双特异性抗原结合分子，在本文可以称为“MET/MET双特异性抗体”、“MET x MET双特异性抗体”、“MET/MET”、“MET x MET”或其他相关术语。在一些实施方案中，人类MET的第一表位包括SEQ ID NO:2109的氨基酸192-204。在一些实施方案中，人类MET的第二表位包括SEQ ID NO:2109的氨基酸305-315和421-455。在一些实施方案中，人类MET的第一表位包括SEQ ID NO:2109的氨基酸192-204；并且人类MET的第二表位包括SEQ ID NO:2109的氨基酸305-315和421-455。
可以包括在本文提供的MET x MET双特异性抗原结合分子中的示例性抗原结合结构域(D1和D2)包括来源于本文公开的抗MET抗体的任何一种的抗原结合结构域。例如，本公开内容包括MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括HCVR，该HCVR包括选自表3中列出的HCVR氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本文还提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括LCVR，该LCVR包括选自表3中列出的LCVR氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似的序列。
本文提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，该HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)包括表3中列出的HCVR氨基酸序列的任何一个与表3中列出的LCVR氨基酸序列的任何一个配对。根据某些实施方案，本发明提供了包括D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，该D1或D2抗原结合结构域包括包含在表3中列出的示例性抗MET抗体的任何一种内的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
本文还提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括重链CDR1(HCDR1)，该重链CDR1(HCDR1)包括选自表3中列出的HCDR1氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似的序列。
还提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括重链CDR2(HCDR2)，该重链CDR2(HCDR2)包括选自表3中列出的HCDR2氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似的序列。
还提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括重链CDR3(HCDR3)，该重链CDR3(HCDR3)包括选自表3中列出的HCDR3氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似的序列。
还提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括轻链CDR1(LCDR1)，该轻链CDR1(LCDR1)包括选自表3中列出的LCDR1氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似的序列。
还提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括轻链CDR2(LCDR2)，该轻链CDR2(LCDR2)包括选自表3中列出的LCDR2氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似的序列。
还提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括轻链CDR3(LCDR3)，该轻链CDR3(LCDR3)包括选自表3中列出的LCDR3氨基酸序列的任何一个的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似的序列。
还提供了MET x MET双特异性抗原结合分子，该MET x MET双特异性抗原结合分子包括D1或D2抗原结合结构域，该D1或D2抗原结合结构域包括HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，该HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)包括表3中列出的HCDR3氨基酸序列的任何一个与表3中列出的LCDR3氨基酸序列的任何一个配对。根据某些实施方案，本公开内容提供了抗体或其抗原结合片段，其包括表3中列出的示例性抗MET抗体的任何一个内包含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
还提供了包括D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，该D1或D2抗原结合结构域包括包含在表3中列出的示例性抗MET抗体的任何一个内的一组六个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
在相关的实施方案中，本公开内容提供了包括D1或D2抗原结合结构域的MET xMET双特异性抗原结合分子，该D1或D2抗原结合结构域包括包含在如由表3中列出的示例性抗MET抗体的任何一种定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内的一组六个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
本文提供的MET x MET双特异性抗原结合分子可以包括来源于表3的抗MET抗体的任何一种的D1抗原结合结构域和来源于表3的任何其他抗MET抗体的D2抗原结合结构域。本公开内容的MET x MET双特异性抗体的非限制性实例描绘于图10中。图10是示出272种示例性MET×MET双特异性抗体的组分的矩阵。矩阵的每个编号的单元格(1至272编号的)标识包括“D1”抗原结合结构域和“D2”抗原结合结构域的独特双特异性抗体，其中D1抗原结合结构域包括来自沿Y轴列出的对应抗MET抗体的免疫球蛋白可变结构域(HCVR/LCVR氨基酸序列对)或CDR，并且其中D2抗原结合结构域包括来自沿X轴列出的对应抗MET抗体的免疫球蛋白可变结构域(HCVR/LCVR氨基酸序列对)或CDR。因此，例如，矩阵中显示的MET x MET双特异性抗原结合分子“10号”包括包含来自示例性抗MET抗体H4H13290P2的HCVR/LCVR对或6-CDR组的D1抗原结合结构域，以及包括来自示例性抗MET抗体H4H13321P2的HCVR/LCVR对或6-CDR组的D2抗原结合结构域。
作为非限制性说明性实例，本公开内容包括包含D1抗原结合结构域和D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，其中D1抗原结合结构域包括SEQ ID NO:2012/2092的HCVR/LCVR氨基酸对，或包括SEQ ID NO:2014-2016-2018-2094-2096-2098的一组重链CDR和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，并且其中D2抗原结合结构域包括SEQ ID NO:2036/2092的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包括SEQ ID NO:2038-2040-2042-2094-2096-2098的一组重链CDR和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。具有这些序列特征的示例性MET x MET双特异性抗体是命名为H4H14639D的双特异性抗体，也称为双特异性抗体No.2076，其包括来源于H4H13306P2的D1和来源于H4H13312P2的D2。
抗MET和MET/MET抗体的重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表3示出了本文描述的选择的抗MET抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识符。(如以上所述的，本公开内容的所有抗MET抗体具有相同的轻链可变区，并且因此也具有相同的轻链CDR序列)。对应的核酸序列标识符在表4中示出。
表3：氨基酸序列标识符
Figure BDA0004122749040001201
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Figure BDA0004122749040001211
表4：核酸序列标识符
Figure BDA0004122749040001212
抗体在本文通常根据以下命名法来提及：Fc前缀(例如，“H4H”)，随后是数字标识符(例如，“13290”、“13291”、“13295”等)，随后是“P2”后缀，如表3和表4中示出的。因此，根据该命名法，抗体在本文可以称为，例如，“H4H13290P2”、“H4H13291P2”、“H4H13295P2”等。本文使用的抗体命名上的前缀指示抗体的特定Fc区同种型。特别地，“H4H”抗体具有人类IgG4 Fc(所有可变区都是完全人类的，如抗体命名中的第一个“H”所示)。如本领域普通技术人员将理解的，具有特定Fc同种型的抗体可以转化为具有不同Fc同种型的抗体(例如，具有小鼠IgG4 Fc的抗体可以转化为具有人类IgG1的抗体，等)，但在任何情况下，由表3和表4中示出的数字标识符指示的可变结构域(包括CDR)将保持不变，并且无论Fc结构域的性质如何，结合特性都预期相同或基本上相似。
抗体缀合
用于与抗体或抗原结合片段的残基缀合的技术和接头是本领域已知的。可以在本方面的上下文中使用的示例性氨基酸附接，例如，赖氨酸(参见例如，US 5,208,020；US2010/0129314；Hollander等人，Bioconjugate Chem.,2008,19:358-361；WO 2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)、半胱氨酸(参见例如，US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；和US 7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见例如，WO 2008/122039；以及Hofer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456)、甲酰甘氨酸(参见例如，Carrico等人，Nat.Chem.Biol.,2007,3:321-322；Agarwal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51，以及Rabuka等人，Nat.Protocols,2012,10:1052-1067)、非天然氨基酸(参见例如，WO 2013/068874和WO 2012/166559)、以及酸性氨基酸(参见例如，WO 2012/05982)。赖氨酸缀合也可以通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)进行。通过在硫醇之间形成碳桥，接头也可以与半胱氨酸残基(包括裂解的链间二硫键的半胱氨酸残基)缀合(参见例如，US9,951,141和US 9,950,076)。接头也可以经由与糖类(参见例如，US 2008/0305497、WO2014/065661和Ryan等人，Food&Agriculture Immunol.,2001,13:127-130)和二硫接头(参见例如，WO 2013/085925、WO 2010/010324、WO 2011/018611和Shaunak等人，Nat.Chem.Biol.,2006,2:312-313)附接而与抗原结合蛋白结合。位点特异性缀合技术也可以用于与抗体或抗原结合蛋白的特定残基直接缀合(参见例如，Schumacher等人，J ClinImmunol(2016)36(增刊1):100)。在下文更详细讨论的特定实施方案中，位点特异性缀合技术包括经由转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺缀合(参见例如，Schibli,Angew Chemie Inter编著2010,49,9995)。
通过赖氨酸和/或半胱氨酸，例如经由马来酰亚胺或酰胺缀合连接的根据本公开内容的有效载荷被包括在本公开内容的范围内。
在一些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物根据两步方法产生，其中步骤1是基于赖氨酸的接头的缀合，例如与NHS-酯接头缀合，并且步骤2是有效载荷缀合反应(例如，1,3-环加成反应)。
在一些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物根据两步方法产生，其中步骤1是基于半胱氨酸的接头的缀合，例如与马来酰亚胺接头缀合，并且步骤2是有效载荷缀合反应(例如，1,3-环加成反应)。
在一些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物根据两步方法产生，其中步骤1是转谷氨酰胺酶介导的位点特异性缀合，并且步骤2是有效载荷缀合反应(例如，1,3-环加成反应)。
步骤1：转谷氨酰胺酶介导的位点特异性缀合
在一些实施方案中，蛋白(例如，抗体)可以根据已知方法被修饰以提供谷氨酰胺酰基修饰的蛋白。用于缀合抗体和伯胺化合物的技术是本领域已知的。本文采用位点特异性缀合技术，经由谷氨酰胺转胺酶使用谷氨酰胺缀合来指导与谷氨酰胺的缀合(参见例如，Schibli,Angew Chemie Inter Ed.2010,49,9995)。
本公开内容的包括伯胺的化合物(例如，接头L1)可以经由基于转谷氨酰胺酶的化学-酶促缀合(参见例如，Dennler等人，Protein Conjugate Chem.2014,25,569-578，以及WO 2017/147542)与结合剂(例如，蛋白，例如，抗体)的一个或更多个谷氨酰胺残基缀合。例如，在存在转谷氨酰胺酶的情况下，抗体的一个或更多个谷氨酰胺残基可以与伯胺接头化合物偶联。简言之，在一些实施方案中，具有谷氨酰胺残基(例如，gln295，即Q295残基)的结合剂在存在酶转谷氨酰胺酶的情况下，用以上描述含伯胺的接头L1处理。在某些实施方案中，结合剂是非糖基化的。在某些实施方案中，结合剂是去糖基化的。
在某些实施方案中，结合剂(例如，蛋白，例如，抗体)在至少一个多肽链序列中包括至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，结合剂包括两个重链多肽，该两个重链多肽各自具有一个gln295残基。在另外的实施方案中，结合剂在除了重链295之外的位点处包括一个或更多个谷氨酰胺残基。
在一些实施方案中，结合剂诸如抗体可以通过定点诱变制备，以在某个位点处插入谷氨酰胺残基，而不会导致抗体功能或结合失效。例如，本文包括如本文描述的携带一个或更多个Asn297Gln(N297Q)突变的抗体。在一些实施方案中，具有gln295残基和/或N297Q突变的抗体在其可变区中包含一个或更多个另外的天然存在的谷氨酰胺残基，其可以被转谷氨酰胺酶接近，并且因此能够与接头或接头-有效载荷缀合。示例性天然存在的谷氨酰胺残基可以存在于，例如，轻链的Q55处。在这样的情况下，经由转谷氨酰胺酶缀合的结合剂例如抗体可以具有高于预期的LAR值(例如，高于4的LAR)。任何这样的抗体都可以从天然或人工来源分离。
在本公开内容的某些实施方案中，接头-抗体比或LAR是每个抗体1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个接头L1分子。在一些实施方案中，LAR是1至8。在一些实施方案中，LAR是1至6。在某些实施方案中，LAR是2至4。在一些情况下，LAR是2至3。在某些情况下，LAR是0.5至3.5。在一些实施方案中，LAR是约1、或约1.5、或约2、或约2.5、或约3、或约3.5。在一些实施方案中，LAR是2。在一些实施方案中，LAR是4。
步骤2：有效载荷缀合反应
在某些实施方案中，根据本公开内容的接头L1包括支化单元B，该支化单元B包括能够在转谷氨酰胺之后进一步反应的至少一个反应性基团B’。在这些实施方案中，谷氨酰胺酰基修饰的蛋白(例如，抗体)能够与反应性有效载荷化合物或反应性接头-有效载荷化合物(例如，如本文公开的L2-P)进一步反应，以形成蛋白-有效载荷缀合物。更具体地，反应性接头-有效载荷化合物L2-P可以包括能够与接头L1的反应性基团B’反应的反应性基团B”。在某些实施方案中，根据本公开内容的反应性基团B’包括能够进行1,3-环加成反应的部分。在某些实施方案中，反应性基团B’是叠氮化物。在某些实施方案中，反应性基团B”包括炔烃(例如，末端炔烃或内部应变炔烃)。在本公开内容的某些实施方案中，反应性基团B’与结合剂和转谷氨酰胺反应条件相容。
在本公开内容的某些实施方案中，接头L1分子包括支化单元B，该支化单元B包括一个反应性基团B’。在本公开内容的某些实施方案中，接头L1分子包括支化单元B，该支化单元B包括多于一个反应性基团B’。
在某些实施方案中，反应性接头-有效载荷L2-P包括一个有效载荷分子(n＝1)。在某些其他实施方案中，反应性接头-有效载荷L2-P包括两个或更多个有效载荷分子(n≥2)。在某些实施方案中，反应性接头-有效载荷L2-P包括1个至12个有效载荷分子、或1个至10个有效载荷分子、或1个至8个有效载荷分子、或1个至6个有效载荷分子、或1个至4个有效载荷分子、或1个至2个有效载荷分子。
在某些实施方案中，反应性接头-有效载荷L2-P包括一个有效载荷分子。在这样的L2-P与BA-L1-B反应时，DAR将约等于BA-L1-B的LAR。例如，如果包括一个有效载荷分子的L2-P与具有4的LAR的BA-L1-B反应(例如，经由Q295和N297Q转谷氨酰胺)，所得蛋白-药物缀合物将具有4的DAR。
在某些实施方案中，反应性接头-有效载荷L2-P包括2个有效载荷分子。在这样的L2-P与BA-L1-B反应时，DAR将是BA-L1-B的LAR的约2倍。例如，如果包括2个有效载荷分子的L2-P与具有4的LAR的BA-L1-B反应(例如，经由Q295和N297Q转谷氨酰胺)，所得蛋白-药物缀合物将具有8的DAR。
例如，如果包括3个有效载荷分子的L2-P与具有8的LAR的BA-L1-B反应(例如，经由包括2个基团B的支化L1-B单元的Q295和N297Q转谷氨酰胺)，所得蛋白-药物缀合物将具有24的DAR。
在本公开内容的某些实施方案中，药物-抗体比或DAR(例如，缩写为小写字母n)是每个抗体约1个至约30个、或约1个至约24个、或约1个至约20个、或约1个至约16个、或约1个至约12个、或约1个至约10个、或约1个至约8个、或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个有效载荷分子。在一些实施方案中，DAR是1至30。在一些实施方案中，DAR是1至24。在一些实施方案中，DAR是1至16。在一些实施方案中，DAR是1至8。在一些实施方案中，DAR是1至6。在某些实施方案中，DAR是2至4。在一些情况下，DAR是2至3。在某些情况下，DAR是0.5至3.5。在某些情况下，DAR是10至14。在某些情况下，DAR是14至18。在某些情况下，DAR是20至24.5。在一些实施方案中，DAR是约1、或约1.5、或约2、或约2.5、或约3、或约3.5。在一些实施方案中，DAR是2。在一些实施方案中，DAR是4。在一些实施方案中，DAR是8。在一些实施方案中，DAR是12。在一些实施方案中，DAR是16。在一些实施方案中，DAR是24。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(A)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040001261
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040001271
k和m独立地是1至12的整数，并且n是1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与化合物L1-B接触，其中支化单元B包括至少一个基团B’，
b)使步骤a)的产物与k或更多当量的化合物L2-(-M-Dxd)m接触，其中接头L2包括至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040001272
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure BDA0004122749040001273
其中Q是C或N；以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(A)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；
L1是如以上描述的第一接头；B是包括如以上描述的基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；L2是如以上描述的经由如以上描述的至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头；M不存在或者是
Figure BDA0004122749040001281
其中R、R’和R”如以上描述；Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040001282
k和m独立地是1至12的整数，并且n是1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)使化合物L1-B与k或更多当量的化合物L2-(-M-Dxd)m接触，其中所述支化单元B包括所述至少一个基团B’，其中所述接头L2包括能够与所述基团B’共价结合的至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040001283
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure BDA0004122749040001284
其中Q是C或N；
从而产生L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k；
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与步骤a)的L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k产物接触，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n
(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；
L2是经由至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040001291
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040001292
k是1至12的整数，并且n为1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与化合物L1-B接触，其中支化单元B包括至少一个基团B’，
b)使步骤a)的产物与k或更多当量的化合物L2-M-Dxd接触，其中所述接头L2包括能够与所述基团B’共价附接的至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040001293
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure BDA0004122749040001294
其中Q是C或N；以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；
L1是如以上描述的第一接头；B是包括如以上描述的基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；L2是如以上描述的经由如以上描述的至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头；M不存在或者是
Figure BDA0004122749040001301
其中R、R’和R”如以上描述；Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040001302
k是1至12的整数，并且n为1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)使化合物L1-B与k或更多当量的化合物L2-M-Dxd接触，其中所述支化单元B包括至少一个基团B’，其中所述接头L2包括至少一个基团B”，从而产生L1-B-(-L2-M-Dxd)k，其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure BDA0004122749040001303
并且所述基团B’和B”中的另一个选自
Figure BDA0004122749040001304
Figure BDA0004122749040001305
其中Q是C或N；
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的结合剂BA(BA-Gln-NH2)与步骤a)的L1-B-(-L2-M-Dxd)k产物接触，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(III)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L2’-P))n(III)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；L2’-P是如以上描述的H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p，并且n是1至30的整数；
SP1不存在或者是选自由以下组成的组的第一间隔物单元：
Figure BDA0004122749040001311
Figure BDA0004122749040001312
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是选自由以下组成的组的第二间隔物单元：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是选自由以下组成的组的第三间隔物单元：
Figure BDA0004122749040001313
Figure BDA0004122749040001314
其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自
Figure BDA0004122749040001321
的基团；
M不存在或者是
Figure BDA0004122749040001322
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；并且
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040001323
p是从1至30的整数；
其中所述方法包括以下步骤：
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与L2’-P接触，以及
c)分离所产生的式(III)的化合物。
在一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n
(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；
L1是如以上描述的第一接头；B是包括如以上描述的至少一个基团B’的支化单元；L2是如以上描述的经由如以上描述的至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头，其中基团B’和基团B”如以上描述形成至少一个加合物；M不存在或者是
Figure BDA0004122749040001331
其中R、R’和R”如以上描述；Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040001332
k是1至12的整数，并且n为1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的结合剂BA(BA-Gln-NH2)与化合物L1-B接触，其中支化单元B包括选自-N3、
Figure BDA0004122749040001333
的至少一个基团B’，从而产生BA-Gln-NH-L1-B；
b)使步骤a)的产物与k或更多当量的化合物L2-M-Dxd接触，其中接头L2包括能够与基团B’共价结合的至少一个基团B”，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在另一个方面，本公开内容提供了一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n
(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；
L1是如以上描述的第一接头；B是包括如以上描述的至少一个基团B’的支化单元；L2是如以上描述的经由如以上描述的至少一个基团B”与支化单元B共价附接的第二接头，其中基团B’和基团B”如以上描述形成至少一个加合物；M不存在或者是
Figure BDA0004122749040001341
其中R、R’和R”如以上描述；Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure BDA0004122749040001342
k是1至12的整数，并且n为1至30的整数，其中：
该方法包括以下步骤：
a)使化合物L1-B(其中支化单元B包括选自-N3、
Figure BDA0004122749040001343
Figure BDA0004122749040001344
的至少一个基团B’)与k或更多当量的化合物L2-M-Dxd接触，其中接头L2包括能够与基团B’共价结合的至少一个基团B”，从而产生L1-B-(-L2-M-Dxd)k；
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的结合剂BA(BA-Gln-NH2)与步骤a)的L1-B-(-L2-M-Dxd)k产物接触，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
在一种实施方案中，谷氨酰胺残基Gln天然存在于BA的CH2结构域或CH3结构域中。在另一种实施方案中，谷氨酰胺残基Gln通过修饰一个或更多个氨基酸而引入至BA中。在一种实施方案中，Gln是Q295或N297Q。
在一种实施方案中，转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶(MTG)。在一种实施方案中，转谷氨酰胺酶是细菌转谷氨酰胺酶(BTG)。
在一种实施方案中，M不存在。在另一种实施方案中，M-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040001351
其中R是氢或C1-C4烷基，并且其中/>
Figure BDA0004122749040001353
表示L2的附接点。/>
在一种实施方案中，化合物L2-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040001352
/>
Figure BDA0004122749040001361
/>
Figure BDA0004122749040001371
/>
Figure BDA0004122749040001381
或其药学上可接受的盐。
在一种实施方案中，化合物L2-Dxd包括任选的支化单元B2。在这样的实施方案中，化合物L2-Dxd包括2个或更多个Dxd单元。
在一种实施方案中，支化单元B2具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040001382
在一种实施方案中，化合物L2-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure BDA0004122749040001383
/>
Figure BDA0004122749040001391
/>
Figure BDA0004122749040001401
/>
Figure BDA0004122749040001411
/>
Figure BDA0004122749040001421
/>
Figure BDA0004122749040001431
/>
Figure BDA0004122749040001441
或其药学上可接受的盐。
治疗制剂和施用
本公开内容提供了包括本公开内容的蛋白-药物缀合物的药物组合物。
在一个方面，本公开内容提供了包括根据本公开内容的蛋白-药物缀合物群体的组合物，所述蛋白-药物缀合物群体具有约0.5至约30.0的药物-抗体比(DAR)。
在一种实施方案中，组合物具有约1.0至约2.5的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约2的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约3.0至约4.5的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约4的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约6.5至约8.5的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约8的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约10至约14的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约12的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约14至约18的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约16的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约20至约24.5的DAR。
在一种实施方案中，组合物具有约24的DAR。
本公开内容的组合物用合适的载体、赋形剂和提供改进的转移、递送、耐受性等的其他试剂配制。许多适当的制剂可见于所有药物化学家都知道的配方集中：Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、胶冻剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(诸如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液carbowax(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含carbowax的半固体混合物。还参见Powell等人”Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)JPharm Sci Technol 52:238-311。
向患者施用的蛋白-药物缀合物的剂量可以根据患者的年龄和大小、靶疾病、状况、施用途径等而变化。合适的剂量通常根据体重或体表面积来计算。在本公开内容的蛋白-药物缀合物用于成人患者中的治疗目的时，通常以约0.01mg/kg至约20mg/kg体重、更优选地约0.02mg/kg至约7mg/kg、约0.03mg/kg至约5mg/kg或约0.05mg/kg至约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本公开内容的蛋白-药物缀合物可以是有利的。根据状况的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。用于施用蛋白-药物缀合物的有效剂量和方案可以凭经验确定；例如，可以通过定期评价监测患者进展，并相应调整剂量。此外，可以使用本领域熟知的方法进行剂量的物种间缩放(例如，Mordenti等人，1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
多种递送系统是已知的，并且可以用于施用本公开内容的药物组合物，例如，包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的内吞中(参见例如，Wu等人，1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径，例如通过输注或快速浓注、通过经由粘膜上皮或粘膜皮层衬里(诸如口腔黏膜、直肠和肠粘膜等)吸收被施用，并且可以与其他生物活性剂一起被施用。施用可以是全身性的或局部的。
本公开内容的药物组合物可以通过标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔递送装置容易在递送本公开内容的药物组合物方面具有应用。这样的笔递送装置可以是可重复使用的或一次性使用的。可重复使用的笔递送装置通常利用包含药物组合物的可更换药筒。在药筒内的全部药物组合物已经被施用并且药筒是空的后，空的药筒可以容易地被弃去并被包含药物组合物的新药筒替代。然后，笔递送装置可以重复使用。在一次性使用的笔递送装置中，不存在可更换的药筒。而是，一次性使用的笔递送装置预先填充(comes prefilled)有保持在装置内的储器(reservoir)中的药物组合物。在储器中的药物组合物被清空后，整个装置就被弃去。
许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置在皮下递送本公开内容的药物组合物方面具有应用。实例包括，但不限于，仅举几个例子，AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPENJUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)。在本公开内容的药物组合物的皮下递送方面具有应用的一次性使用的笔递送装置的实例，包括但不限于，仅举几个例子，SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)。
在某些情况下，药物组合物可以在控制释放系统中递送。在一种实施方案中，可以使用泵(参见，Langer，同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一种实施方案中，可以使用聚合物材料；参见，Medical Applications of ControlledRelease,Langer和Wise(编著),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又另一种实施方案中，控制释放系统可以置于组合物的靶附近，因此仅要求全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,同上，第2卷，第115-138页)。Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中讨论了其他控制释放系统。
可注射制品可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制品可以通过公众已知的方法制备。例如，可注射制品可以通过，例如，将以上描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备。作为注射用水性介质，存在，例如，生理盐水、包含葡萄糖和其他辅助剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，采用了，例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。这样制备的注射剂优选地填充在合适的安瓿中。
有利地，以上描述的用于口服或肠胃外使用的药物组合物以适于符合活性成分剂量的单位剂量制备为剂型。单位剂量的这样的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。在单位剂量中，被包含的前述抗体的量通常是每剂型约5mg至约500mg；特别是在注射形式中，优选的是前述抗体以约5mg至约100mg被包含并且对于其他剂型以约10mg至约250mg被包含。
蛋白-药物缀合物、接头-有效载荷和有效载荷的治疗用途
在另一个方面，本文公开的蛋白-药物缀合物例如ADC尤其可用于治疗、预防和/或改善需要这样治疗的疾病、紊乱或状况。
在一种实施方案中，本发明提供了一种治疗有相应需要的受试者的状况的方法，包括向受试者施用治疗有效量的根据本公开内容的化合物(例如，抗体-药物缀合物、接头-有效载荷和/或有效载荷)，或包括根据本公开内容的任何化合物的组合物。
在一种实施方案中，本文公开的蛋白-药物缀合物，例如ADC，可用于治疗癌症。在一种实施方案中，本文公开的蛋白-药物缀合物，例如ADC，可用于治疗选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌或脑癌。在一种实施方案中，本文公开的蛋白-药物缀合物，例如ADC，可用于治疗HER2+乳腺癌。在一种实施方案中，本文公开的蛋白-药物缀合物，例如ADC，可用于治疗前列腺癌。
在一个方面，本公开内容提供了一种将化合物选择性地递送到细胞中的方法。在一种实施方案中，将化合物选择性地递送到细胞中的方法包括将化合物与靶向抗体连接。在一种实施方案中，化合物是如以上描述的有效载荷。在一种实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一种实施方案中，细胞是人类细胞。在一种实施方案中，细胞是癌细胞。在一种实施方案中，癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞或脑癌细胞。
在某些实施方案中，本公开内容提供了将具有P-I结构的化合物选择性地递送到细胞的方法：
Figure BDA0004122749040001491
其中R1、R2和R3以及R4独立地是氢或烷基，例如，C1-C12烷基或C1-C8烷基或C1-C6烷基或C1-C4烷基，或者其中R2和R3一起形成5元或6元环，或其药学上可接受的盐。
在一个方面，本公开内容提供了一种用化合物选择性地靶向细胞表面上的抗原的方法。在一种实施方案中，用化合物选择性地靶向细胞表面上的抗原的方法包括将化合物与靶向抗体连接。在一种实施方案中，化合物是如以上描述的有效载荷。在一种实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一种实施方案中，细胞是人类细胞。在一种实施方案中，细胞是癌细胞。在一种实施方案中，癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞或脑癌细胞。
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种用具有P-I结构的化合物选择性地靶向细胞表面上的抗原的方法：
Figure BDA0004122749040001492
其中R1、R2和R3以及R4独立地是氢或烷基，例如，C1-C12烷基或C1-C8烷基或C1-C6烷基或C1-C4烷基，或者其中R2和R3一起形成5元或6元环，或其药学上可接受的盐。
抗HER2抗体-药物缀合物
在某些实施方案中，本文公开的蛋白-药物缀合物，例如ADC，尤其可用于治疗、预防和/或改善与HER2表达或活性相关或由HER2表达或活性介导的任何疾病或紊乱，或者可通过结合HER2而不与修饰的LDL竞争或者和/或促进HER2受体内化和/或减少细胞表面受体数目来治疗的任何疾病或紊乱。
本公开内容的蛋白-药物缀合物(和包括其的治疗组合物)尤其可用于治疗其中刺激、激活和/或靶向免疫应答将是有益的任何疾病或紊乱。特别地，本公开内容的包括单特异性抗HER2抗体和双特异性抗HER2/HER2抗体两者的抗HER2蛋白-药物缀合物，可以用于治疗、预防和/或改善与HER2表达或活性或HER2+细胞增殖相关或由其介导的任何疾病或紊乱。实现本公开内容的治疗方法的作用机制包括在存在效应细胞的情况下例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬或通过这些机制中的两种或更多种的组合杀伤表达HER2的细胞。可以使用本公开内容的蛋白-药物缀合物抑制或杀伤的表达HER2的细胞包括例如乳腺肿瘤细胞。
在一种实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物(以及包括其的治疗组合物和剂型)包括双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包括：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性结合人类HER2的第一表位；并且
其中D2特异性结合人类HER2的第二表位。
在以上的一种实施方案中，D1和D2不彼此竞争与人类HER2的结合。
本公开内容的蛋白-药物缀合物可以用于治疗例如在前列腺、膀胱、子宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和/或卵巢中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物用于治疗以下癌症的一种或更多种：前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。根据本公开内容的某些实施方案，抗HER2抗体或抗HER2/HER2双特异性抗体可用于治疗罹患为IHC2+或更多的乳腺癌细胞的患者。根据本公开内容的其他相关实施方案，提供了包括向罹患为IHC2+或更多的乳腺癌细胞的患者施用如本文公开的抗HER2抗体或抗HER2/HER2抗体的方法。本领域已知的分析/诊断方法，诸如肿瘤扫描等，可以用于确定患者是否携带去势抵抗性肿瘤。
在某些实施方案中，本公开内容还包括用于治疗受试者中剩余癌症的方法。术语“剩余癌症”意指在用抗癌疗法治疗后的受试者中一个或更多个癌细胞的存在或持续存在。
本公开内容的蛋白-药物缀合物(和包括其的治疗组合物)尤其可用于治疗其中刺激、激活和/或靶向免疫应答将是有益的任何疾病或紊乱。特别地，本公开内容的包括抗HER2抗体或抗HER2/HER2抗体的蛋白-药物缀合物，可以用于治疗、预防和/或改善与HER2表达或活性或HER2+细胞增殖相关或由HER2表达或活性或HER2+细胞增殖介导的任何疾病或紊乱。实现本公开内容的治疗方法的作用机制包括在存在效应细胞的情况下例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬或通过这些机制中的两种或更多种的组合杀伤表达HER2的细胞。可以使用本公开内容的蛋白-药物缀合物抑制或杀伤的表达HER2的细胞包括例如乳腺肿瘤细胞。
根据某些方面，本公开内容提供了用于治疗与HER2表达相关的疾病或紊乱(例如，乳腺癌)的方法，包括在受试者已被确定患有乳腺癌(例如，IHC2+乳腺癌)之后，向该受试者施用本文别处描述的抗HER2蛋白-药物缀合物或抗HER2/HER2双特异性蛋白-药物缀合物的一种或更多种。例如，本公开内容包括用于治疗乳腺癌的方法，包括在受试者接受激素疗法(例如，抗雄激素治疗)之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间向患者施用包括抗HER2抗体或抗原结合分子或抗HER2/HER2双特异性抗体或抗原结合分子的蛋白-药物缀合物。
在某些实施方案中，本公开内容还包括本公开内容的抗HER2抗体在制造用于治疗与表达HER2的细胞相关或由其引起的疾病或紊乱(例如，癌症)的药物中的用途。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗HER2抗体或抗原结合片段或抗HER2/HER2双特异性抗体或抗原结合片段的蛋白-药物缀合物。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗体-药物缀合物(ADC)的化合物。
抗STEAP2抗体-药物缀合物
在某些实施方案中，本文公开的蛋白-药物缀合物，例如ADC，尤其可用于治疗、预防和/或改善与STEAP2表达或活性相关或由STEAP2表达或活性介导的任何疾病或紊乱，或者可通过结合STEAP2而不与修饰的LDL竞争或者和/或促进STEAP2受体内化和/或减少细胞表面受体数目来治疗的任何疾病或紊乱。
本公开内容的蛋白-药物缀合物(和包括其的治疗组合物)尤其可用于治疗其中刺激、激活和/或靶向免疫应答将是有益的任何疾病或紊乱。特别地，本公开内容的抗STEAP2蛋白-药物缀合物可以用于治疗、预防和/或改善与STEAP2表达或活性或STEAP2+细胞增殖相关或由STEAP2表达或活性或STEAP2+细胞增殖介导的任何疾病或紊乱。实现本公开内容的治疗方法的作用机制包括在存在效应细胞的情况下例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬或通过这些机制中的两种或更多种的组合杀伤表达STEAP2的细胞。可以使用本公开内容的蛋白-药物缀合物抑制或杀伤的表达STEAP2的细胞包括例如前列腺肿瘤细胞。
本公开内容的蛋白-药物缀合物可以用于治疗例如在前列腺、膀胱、子宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和/或卵巢中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物用于治疗以下癌症的一种或更多种：前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。本领域已知的分析/诊断方法，诸如肿瘤扫描等，可以用于确定患者是否携带去势抵抗性肿瘤。
在某些实施方案中，本公开内容还包括用于治疗受试者中剩余癌症的方法。术语“剩余癌症”意指在用抗癌疗法治疗后的受试者中一个或更多个癌细胞的存在或持续存在。
根据某些方面，本公开内容提供了用于治疗与STEAP2表达相关的疾病或紊乱(例如，前列腺癌)的方法，包括在受试者已被确定患有前列腺癌之后，向该受试者施用本文别处描述的抗STEAP2蛋白-药物缀合物的一种或更多种。例如，本公开内容包括用于治疗前列腺癌的方法，包括在受试者接受激素疗法(例如，抗雄激素疗法)之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间向患者施用包括抗STEAP2抗体或抗原结合分子的蛋白-药物缀合物。
在某些实施方案中，本公开内容还包括本公开内容的抗STEAP2抗体在制造用于治疗与表达STEAP2的细胞相关或由其引起的疾病或紊乱(例如，癌症)的药物中的用途。在一个方面，本公开内容涉及用于在医学中使用的包括如本文公开的抗STEAP2抗体或抗原结合片段的蛋白-药物缀合物。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗体-药物缀合物(ADC)的化合物。
抗MET抗体-药物缀合物
在某些实施方案中，本文公开的蛋白-药物缀合物，例如ADC，尤其可用于治疗、预防和/或改善与MET表达或活性相关或由MET表达或活性介导的任何疾病或紊乱，或者可通过结合MET而不与修饰的LDL竞争或者和/或促进MET受体内化和/或减少细胞表面受体数目来治疗的任何疾病或紊乱。
本公开内容的蛋白-药物缀合物(和包括其的治疗组合物)尤其可用于治疗其中刺激、激活和/或靶向免疫应答将是有益的任何疾病或紊乱。特别地，本公开内容的抗MET或抗MET/MET双特异性蛋白-药物缀合物可以用于治疗、预防和/或改善与MET表达或活性或MET+细胞增殖相关或由MET表达或活性或MET+细胞增殖介导的任何疾病或紊乱。实现本公开内容的治疗方法的作用机制包括在存在效应细胞的情况下例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬或通过这些机制中的两种或更多种的组合杀伤表达MET的细胞。可以使用本公开内容的蛋白-药物缀合物抑制或杀伤的表达MET的细胞包括例如肺肿瘤细胞。
本公开内容的蛋白-药物缀合物可以用于治疗例如在前列腺、膀胱、子宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和/或卵巢中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本公开内容的蛋白-药物缀合物用于治疗以下癌症的一种或更多种：前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。本领域已知的分析/诊断方法，诸如肿瘤扫描等，可以用于确定患者是否携带去势抵抗性肿瘤。
在某些实施方案中，本公开内容还包括用于治疗受试者中剩余癌症的方法。术语“剩余癌症”意指在用抗癌疗法治疗后的受试者中一个或更多个癌细胞的存在或持续存在。
根据某些方面，本公开内容提供了用于治疗与MET表达相关的疾病或紊乱(例如，肺癌)的方法，包括在受试者已被确定患有肺癌之后，向该受试者施用本文别处描述的抗MET或抗MET/MET双特异性蛋白-药物缀合物的一种或更多种。例如，本公开内容包括用于治疗肺癌的方法，包括在受试者接受激素疗法(例如，抗雄激素疗法)之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间向患者施用包括抗MET或抗MET/MET双特异性抗体或抗原结合分子的蛋白-药物缀合物。
例如，本公开内容的抗MET抗体-药物缀合物和MET x MET双特异性抗体-药物缀合物可用于治疗表达(或过表达)MET的肿瘤。例如，抗MET抗体-药物缀合物和MET x MET双特异性抗体-药物缀合物可以用于治疗在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨、皮肤和附件、结缔组织、脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝和泌尿道以及特殊感觉器官诸如眼睛中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，抗MET抗体-药物缀合物和MET x MET双特异性抗体-药物缀合物用于治疗下列癌症的一种或更多种：急性骨髓性白血病、成人T细胞白血病、星形细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌(例如，具有MET扩增的胃癌)、胶质母细胞瘤、头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌[HNSCC])、卡波西肉瘤、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌[NSCLC])、淋巴瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、黑素瘤、间皮瘤、MFH/纤维肉瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌和肾母细胞瘤。
在某些实施方案中，本公开内容还包括本公开内容的抗MET抗体-药物缀合物或MET x MET双特异性抗体-药物缀合物在制造用于治疗与表达MET的细胞相关或由表达MET的细胞引起的疾病或紊乱(例如，癌症)的药物中的用途。在一个方面，本公开内容涉及用于在医学中使用的包括如本文公开的抗MET抗体-药物缀合物或MET x MET双特异性抗体-药物缀合物的蛋白-药物缀合物。在一个方面，本公开内容涉及一种用于在医学中使用的包括如本文公开的抗体-药物缀合物(ADC)的化合物。
组合疗法和制剂
本公开内容提供了包括组合施用药物组合物与一种或更多种另外的治疗剂的方法，该药物组合物包括本文描述的示例性蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和有效载荷的任何一种。可以与本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和有效载荷组合或者与其组合施用的示例性另外的治疗剂包括，例如，HER2拮抗剂(例如，抗HER2抗体[例如，曲妥珠单抗]或HER2的小分子抑制剂或抗HER2抗体-药物缀合物或抗HER2/HER2双特异性抗体或抗HER2/HER2双特异性抗体-药物缀合物)、EGFR拮抗剂(例如，抗EGFR抗体[例如，西妥昔单抗或帕尼单抗]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼或埃罗替尼])、另一个EGFR家族成员诸如HER2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如，抗ErbB2、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、EGFRvIII的拮抗剂(例如，特异性结合EGFRvIII的抗体)、cMET拮抗剂(例如，抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如，抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如，维罗非尼、索拉非尼、gDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如，抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如，抗PDGFR-β抗体)、VEGF拮抗剂(例如，VEGF-Trap，参见例如，US 7,087,411(在本文也称为“VEGF抑制融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼))、DLL4拮抗剂(例如，US 2009/0142354中公开的抗DLL4抗体)、Ang2拮抗剂(例如，US 2011/0027286中公开的抗Ang2抗体，诸如H1H685P)、FOLH1(PSMA)拮抗剂、PRLR拮抗剂(例如，抗PRLR抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如，抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如，抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如，抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如，抗CA9抗体)、uroplakin拮抗剂(例如，抗uroplakin抗体)等。
可以有益地与本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和有效载荷组合施用的其他剂包括细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或与其各自受体结合的抗体。本公开内容的药物组合物(例如，包括抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2蛋白-药物缀合物(例如，本文公开的抗体-药物缀合物)的药物组合物也可以作为治疗方案的一部分施用，该治疗方案包括选自以下的一种或更多种治疗组合：”ICE”:异环磷酰胺(例如，
Figure BDA0004122749040001561
)、卡铂(例如，
Figure BDA0004122749040001562
)、依托泊苷(例如，/>
Figure BDA0004122749040001563
Figure BDA0004122749040001564
VP-16)；”DHAP”:地塞米松(例如，/>
Figure BDA0004122749040001565
)、阿糖胞苷(cytarabine)(例如，/>
Figure BDA0004122749040001566
阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、ara-C)、顺铂(例如，/>
Figure BDA0004122749040001567
-AQ)；和”ESHAP”:依托泊苷(例如，/>
Figure BDA0004122749040001568
Figure BDA0004122749040001569
VP-16)、甲泼尼龙(例如，/>
Figure BDA00041227490400015610
)、高剂量阿糖胞苷、顺铂(例如，/>
Figure BDA00041227490400015611
-AQ)。
本公开内容还包括治疗组合，包括本文提及的蛋白-药物缀合物(例如抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和有效载荷的任何一种以及以下的抑制剂：HER2、VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1(PSMA)、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、uroplakin中的一种或更多种或前述细胞因子中的任何一种，其中抑制剂是适配体、反义分子、核酶、siRNA、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如，Fab片段；F(ab’)2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他工程化分子，诸如双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体和最小识别单元)。本公开内容的抗原结合分子也可以与抗病毒药物、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇和/或NSAID组合施用和/或共配制。本公开内容的抗原结合分子也可以作为治疗方案的一部分施用，该治疗方案也包括放射治疗和/或常规化学疗法。
一种或更多种另外的治疗活性组分可以在施用本公开内容的抗原结合分子之前立即、同时或之后不久施用；(为了本公开内容的目的，这样的施用方案被认为是抗原结合分子与另外治疗活性组分“组合”的施用)。
本公开内容包括药物组合物，其中本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷与本文别处描述的一种或更多种另外的治疗活性组分的一种或更多种共配制。
施用方案
根据本公开内容的某些实施方案，可以在确定的时间过程中向受试者施用多剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。根据本公开内容的这一方面的方法包括向受试者顺序施用多剂量的本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。如本文使用的，“顺序施用”意味着在不同的时间点，例如在由预定间隔(例如，小时、天、周或月)分隔的不同天数，向受试者施用每个剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。本公开内容包括了方法，该方法包括向患者顺序施用单个初始剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷，随后是一个或更多个第二剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷，以及任选地随后是一个或更多个第三剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本公开内容的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷施用的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量都可以包含相同量的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2或抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷，但通常可以在施用频率方面彼此不同。然而，在某些实施方案中，在治疗过程期间，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中包含的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷的量彼此不同(例如，酌情上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时以“负荷剂量”施用两个或更多个(例如2个、3个、4个或5个)剂量，随后是以不太频繁基础施用的随后剂量(例如，“维持剂量”)。
在本公开内容的一种示例性实施方案中，每个第二剂量和/或第三剂量在紧接前一剂量之后1周至26周(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)施用。如本文中使用的短语“紧接前一剂量”意指在多次施用的序列中，在顺序中在施用下一个剂量之前向患者施用的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷的剂量，没有中间剂量。
根据本公开内容的这一方面的方法可以包括向患者施用任何数目的第二剂量和/或第三剂量的蛋白-药物缀合物(例如，抗HER2、抗HER2/HER2双特异性、抗MET、抗MET/MET双特异性或抗STEAP2抗体-药物缀合物)、接头-有效载荷和/或有效载荷。例如，在某些实施方案中，仅向患者施用单个第二剂量。在其他实施方案中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第二剂量。同样，在某些实施方案中，仅向患者施用单个第三剂量。在其他实施方案中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施方案中，每个第二剂量可以以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，每个第二剂量可以在紧接前一剂量之后1周至2周向患者施用。相似地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，每个第三剂量可以以与其他第三剂量相同的频率施用。例如，每个第三剂量可以在紧接前一剂量之后2周至4周向患者施用。可选地，向患者施用第二剂量和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中改变。在临床检查后，医生也可以根据个体患者的需要在治疗过程期间调整施用频率。
实施例
以下实施例示出了本说明书的具体方面。这些实施例不应被解释为限制性的，因为这些实施例仅仅提供了对实施方案及其各个方面的具体理解和实践。
缩写
Figure BDA0004122749040001591
/>
Figure BDA0004122749040001601
/>
Figure BDA0004122749040001611
大多数起始材料从
Figure BDA0004122749040001612
等商购可得。
根据对应的参考文献合成了以下化合物。
Figure BDA0004122749040001613
一般方法
实施例1：喜树碱衍生物(有效载荷)的合成
表5：根据本公开内容的示例性喜树碱类似物有效载荷P1-P4
Figure BDA0004122749040001621
有效载荷P1甲磺酸依喜替康从MCE商购获得。有效载荷P2和P3如WO2015155998中描述合成，通过引用并入本文，并且喜树碱衍生物有效载荷P4如方案1A中描述并且根据实施例1A-1E概述的合成步骤合成：
方案1：喜树碱衍生物(有效载荷)P3和P4的合成
Figure BDA0004122749040001631
实施例1A：9H-芴-9-基甲基N-[2-(2-羟基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基]氨基甲酸酯(P4-2)的合成
Figure BDA0004122749040001632
/>
向Fmoc-Gly-Pro-OH P4-1(0.10g,0.26mmol)在无水DMF(1mL)中的混合物中添加四乙酸铅(0.14g,0.31mmol)。将所得混合物在RT搅拌30分钟；反应进程通过LCMS监测。将所得混合物过滤通过硅藻土，并且滤液用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并且在真空中浓缩。剩余物通过硅胶柱色谱(在石油醚中的0-10％乙酸乙酯)纯化，以给出作为白色固体的化合物P4-2(50mg,53％收率)，并且未获得乙酸酯中间体。ESI m/z:389(M+23)+.1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.90(d,J＝7.4Hz,2H),7.73(d,J＝7.5Hz,2H),7.47-7.37(m,3H),7.33(t,J＝7.3Hz,2H),5.86(br s,1H),5.48(d,J＝4.0Hz,0.25H),5.39(d,J＝4.0Hz,0.75H),4.33-4.18(m,3H),3.96(d,J＝6.0Hz,1.5H),3.75(d,J＝6.0Hz,0.5H),3.59-3.33(m,1H),3.22-3.11(m,1H),2.00-1.59(m,4H)ppm。
实施例1B：2-{[1-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙酰基)吡咯烷-2-基]氧基}乙酸苄基酯(P4-3)的合成
Figure BDA0004122749040001633
向化合物P4-2(0.30g,0.82mmol)在DCM(25mL)中的溶液中添加三甲基氯硅烷(TMSCl)(0.27g,2.5mmol)。将反应混合物在RT搅拌3小时；反应进程通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物用DCM(25mL)稀释。向溶液中添加乙醇酸苄基酯(0.27g,1.6mmol)和DIPEA(0.21g,1.6mmol)，并且将反应混合物在RT搅拌1小时；反应的完成通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(0.05％)中的0-100％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的化合物P4-3(0.11g,25％收率，具有>99％的纯度，和50mg，具有75％的纯度)。ESI m/z:537.3(M+Na)+.1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.91-7.89(m,2H),7.74-7.69(m,2H),7.63-7.48(m,1H),7.42-7.25(m,9H),5.51-5.09(m,2H),4.35-4.21(m,5H),4.00-3.77(m,2H),3.52-3.38(m,2H),3.30-3.18(m,1H),2.19-1.64(m,4H)ppm。
实施例1C：2-{[1-(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙酰基)吡咯烷-2-基]氧基}乙酸(P4-4)的合成
Figure BDA0004122749040001641
在氮气保护下向化合物P4-3(89mg,0.17mmol)在甲醇(3mL)和THF(7mL)中的溶液中添加在碳上的湿润的钯(10％ Pd,20mg)。将混合物脱气并且在氢气球压力下在RT搅拌2小时，并且反应的完成通过LCMS监测。将反应混合物过滤通过硅藻土，并且将滤液在真空中浓缩。剩余物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(0.05％)中的0-100％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的化合物P4-4(36mg，49％收率)。ESI m/z:447.1(M+Na)+。
实施例1D：9H-芴-9-基甲基N-{2-[2-({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)吡咯烷-1-基]-2-氧代乙基}氨基甲酸酯(P4-5)
Figure BDA0004122749040001651
向化合物P4-4(63mg,0.15mmol)和甲磺酸依喜替康(66mg,0.12mmol)在DMF(2mL)中的混合物中添加HATU(61mg,0.16mmol)和DIPEA(46mg,0.36mmol)，并且将混合物在RT搅拌2小时；反应的完成通过LCMS监测。反应混合物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为黄色固体的化合物P4-5(45mg，44％收率)。ESI m/z:842.3(M+H)+。
实施例1E：2-{[1-(2-氨基乙酰基)吡咯烷-2-基]氧基}-N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]乙酰胺(P4)
Figure BDA0004122749040001652
向化合物P4-5(45mg,54μmol)在DCM(4mL)中的溶液中添加二乙胺(20mg,0.27mmol)，并且将混合物在RT搅拌过夜。反应的完成通过LCMS监测。将反应混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过硅胶快速色谱(在DCM中的0-10％甲醇)纯化，以给出作为无色油状物的化合物P4(9.5mg，28％收率)。ESI m/z:620.3(M+H)+。下文表6提供了根据本公开内容的有效载荷P1-P3的细胞毒性和ADME(吸收、分布、代谢和排泄)数据。
表6.有效载荷的细胞毒性和ADME结果。
Figure BDA0004122749040001661
/>
Figure BDA0004122749040001662
这里“-v”代表没有维拉帕米，并且“+v”代表具有维拉帕米。维拉帕米是已知的P-糖蛋白抑制剂，并且可以具有阻断P-糖蛋白调节的外排的功能。
实施例2：接头2-有效载荷
实施例2A：线性接头2-有效载荷(LL2P)
下文表7提供了根据本公开内容的示例性线性接头-2有效载荷(LL2P)的结构。
表7.线性接头2-有效载荷(LL2P)的结构
Figure BDA0004122749040001663
/>
Figure BDA0004122749040001671
/>
Figure BDA0004122749040001681
/>
Figure BDA0004122749040001691
下文表8提供了根据本公开内容的示例性线性接头2-有效载荷(LL2P)的化学特性。
表8.接头2-有效载荷(LL2P)的化学特性
Figure BDA0004122749040001692
/>
Figure BDA0004122749040001701
*内酯和开环产物的混合物。MW和m/z的值是对应内酯的数据。
实施例2B：支化接头2-有效载荷(BL2P)
下文表9提供了根据本公开内容的示例性支化单元B1-B5的结构。
表9.支化单元B1-B5的结构
Figure BDA0004122749040001711
下文表10提供了根据本公开内容的示例性支化接头-2有效载荷(BL2P)的结构。
表10.支化接头2-有效载荷(BL2P)的结构
Figure BDA0004122749040001712
/>
Figure BDA0004122749040001721
/>
Figure BDA0004122749040001731
/>
Figure BDA0004122749040001741
/>
Figure BDA0004122749040001751
下文表11提供了根据本公开内容的示例性支化接头2-有效载荷(BL2P)的化学特性。
表11.支化接头2-有效载荷(BL2P)的化学特性
Figure BDA0004122749040001752
/>
Figure BDA0004122749040001761
Figure BDA0004122749040001771
实施例3：vcPAB-氨基甲酸酯接头-有效载荷的合成
接头-有效载荷LP1和LP2如下文方案2以及在实施例3A-3C中(对于LP1)和2D(对于LP2)中描述合成。起始材料L1-1(CAS 2226472-26-8)和L2-3(CAS 2226472-28-0)根据WO2018089373A2合成，该文献以其整体通过引用并入本文。
方案2.vcPAB-氨基甲酸酯接头-有效载荷的合成
Figure BDA0004122749040001772
实施例3A：N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(L1-2)
Figure BDA0004122749040001781
向化合物L1-1(0.17g,0.33mmol)在DMF(10mL)中的溶液中依次添加DIPEA(0.13g,1.0mmol)和vcPAB(0.13g,0.34mmol)，并且将反应混合物在RT搅拌1小时。反应的完成通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在水中的0-80％乙腈)直接纯化，以给出作为无色油状物的化合物L1-2(0.18g，70％收率)。ESI m/z:791.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.91(s,1H),8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.61(t,J＝5.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,2H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),5.98(t,J＝5.6Hz,1H),5.42(s,2H),5.10(br s,1H),),4.43(s,2H),4.39-4.37(m,1H),4.30-4.21(m,2H),3.87(d,J＝14.8Hz,1H),3.75(d,J＝14.8Hz,1H),3.62-3.58(m,2H),3.50-3.46(m,12H),3.43(t,J＝6.0Hz,2H),3.27-3.22(m,2H),3.06-2.92(m,2H),2.41-2.32(m,2H),2.26-2.05(m,3H),1.99-1.66(m,6H),1.62-1.55(m,3H),1.44-1.35(m,3H),0.89(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H)ppm。
实施例3B：{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基碳酸酯(L1-3)
Figure BDA0004122749040001782
将化合物L1-2(80mg,0.10mmol)、DMAP(12mg,0.10mmol)和DIPEA(26mg,0.20mmol)在无水DMF(5mL)中的悬浮液在RT搅拌10分钟，然后再添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(61mg,0.20mmol)。将反应混合物在RT搅拌2小时。反应的完成通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在水中的0-80％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的化合物L1-3(53mg，55％收率)。ESI m/z:956.3(M+H)+。
实施例3C：{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP1)
Figure BDA0004122749040001791
向化合物L1-3(16mg,17μmol)和P3(12mg,17μmol)在干燥DMF(2mL)中的黄色溶液中添加DIPEA(6.5mg,51μmol)，并且将澄清的反应溶液在RT搅拌2小时。反应的完成通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-60％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的接头-有效载荷LP1(15mg，作为TFA盐，63％收率)。ESI m/z:698.8(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.80(t,J＝6.8Hz,1H),8.50(d,J＝9.2Hz,1H),8.12(d,J＝7.2Hz,1H),7.87(d,J＝8.8Hz,1H),7.79(d,J＝10.8Hz,1H),7.62-7.58(m,3H),7.42(t,J＝6.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,2H),6.53(br s,1H),5.98(t,J＝5.2Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.46-5.37(m,3H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J＝6.4Hz,2H),4.41-4.35(m,1H),4.29-4.21(m,2H),4.02(s,2H),3.87(d,J＝14.4Hz,1H),3.75(d,J＝14.8Hz,1H),3.63-3.58(m,4H),3.50-3.48(m,12H),3.46-3.41(m,2H),3.27-3.24(m,2H),3.23-3.12(m,2H),3.07-2.91(m,2H),2.47-2.45(m,0.5H),2.41-2.33(m,4.5H),2.25-2.04(m,5H),1.99-1.69(m,9H),1.63-1.54(m,3H),1.44-1.33(m,3H),0.88-0.82(m,9H)ppm。(未观察到TFA的质子)。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-74(TFA),-111(Ar-F)ppm。
实施例3D：{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-4-氧代丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP2)
Figure BDA0004122749040001801
遵循制备LP1的程序(除了用L2-3取代L1-3之外)，在通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％甲醇)的纯化之后获得作为白色固体的作为内酯产物(LP2，如上图)和开环产物(LP2-RO，如下图)的混合物的接头-有效载荷LP2(12mg，46％收率)。
Figure BDA0004122749040001802
内酯LP2：HPLC纯度：67％，保留时间：7.41min,ESI m/z:507.3(M/3+H)+,760.5(M/2+H)+；开环产物LP2-RO：HPLC纯度：33％，保留时间：6.61min,ESI m/z:513.3(M/3+H)+,769.5(M/2+H)+。
内酯产物和开环产物混合物1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.80(t,J＝6.4Hz,1H),8.50(d,J＝8.8Hz,1H),8.12(d,J＝7.2Hz,1H),7.87(d,J＝8.4Hz,1H),7.80-7.75(m.2H),7.69-7.67(m,1H),7.63-7.58(m,3H),7.51-7.46(m,3H),7.45-7.33(m,3H),7.32-7.26(m,4H),6.53(s,1H),5.98(t,J＝6.0Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.42(s,4H),5.21(s,2H),5.03(d,J＝14.0Hz,1H),4.93(s,2H),4.63(d,J＝6.8Hz,2H),4.41-4.35(m,1H),4.25-4.21(m,1H),4.02(s,2H),3.62-3.57(m,5H),3.48-3.45(m,12H),3.31-3.28(m,2H),3.23-3.14(m,2H),3.11-3.07(m,2H),3.05-2.98(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.60-2.55(m,1H),2.46-2.44(m,1H),2.39(s,3H),2.35-2.33(m,1H),2.26-2.15(m,3H),2.03-1.94(m,2H),1.88-1.67(m,4H),1.63-1.57(m,1H),1.46-1.33(m,2H),0.88-0.81(m,9H)ppm。19FNMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
接头-有效载荷LP16和LP17如下文方案3以及在实施例3E-3F中(对于LP16)和3G(对于LP17)中描述合成。
方案3.LP16和LP17的合成。
Figure BDA0004122749040001811
实施例3E：{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP16-1)
Figure BDA0004122749040001821
向有效载荷P3(0.11g,0.15mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(39mg,0.30mmol)和Fmoc-vcPAB-PNP(CAS:863971-53-3,77mg,0.10mmol)，并且将反应混合物在室温搅拌1小时，直到混合物变得澄清并且P根据LCMS被完全消耗。所得溶液通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-70％乙腈)分离，以给出作为浅黄色固体的Fmoc-LP16-1(98mg，ESI m/z：494(MDXD+H)+,714.2(M–MDXD+H)+，将其溶解在无水DMF(4.5mL)中。向溶液中缓慢添加二乙胺(0.5mL)，并且将反应混合物在室温搅拌2小时，直到根据LCMS完全去除Fmoc。将挥发物在真空中去除，并且剩余物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-40％乙腈)纯化，以给出LP16-1(TFA盐，45mg，自P3的41％收率)。ESI m/z：493.1(M/2+H)+。1HNMR(400MHz,DMSOd6)δ10.20(s,1H),8.80(t,J＝6.8Hz,1H),8.68(d,J＝7.6Hz,1H),8.50(d,J＝8.8Hz,1H),8.09-8.01(m,3H),7.79(d,J＝10.8Hz,1H),7.58(d,J＝8.4Hz,2H),7.41(t,J＝6.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.29(d,J＝8.4Hz,2H),6.53(s,1H),6.05(t,J＝5.6Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.54-5.45(m,2H),5.42-5.41(m,2H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J＝6.4Hz,2H),4.55-4.50(m,1H),4.02(s,2H),3.69-3.61(m,3H),3.24-3.12(m,1H),3.08-2.94(m,2H),2.40(s,3H),2.23-2.18(m,2H),2.14-2.03(m,1H),1.90-1.81(m,2H),1.78-1.68(m,1H),1.64-1.53(m,1H),1.47-1.36(m,2H),0.96(d,J＝3.2Hz,3H),0.94(d,J＝3.2Hz,,3H),0.87(t,J＝7.6Hz,3H)ppm。(未显示TFA的质子)。在-111,-73ppm的19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ。
实施例3F：{4-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP16)
Figure BDA0004122749040001831
向LP16-1(16mg,15μmol)在无水DMF(1mL)中的溶液中添加DIPEA(4mg,29μmol)，直到pH值在8.0与9.0之间，并且然后将化合物If(CAS 1314378-14-7,9mg,15μmol)在无水DMF(1mL)中的溶液添加到反应溶液中。将混合物在室温搅拌1小时，直到起始材料根据LCMS被完全消耗。所得溶液通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)分离，以给出作为白色固体的LP16f(18mg,ESI m/z:728.3(M/2+H)+)，将其溶解在无水DMF(1.9mL)中。向溶液中添加二乙胺(0.1mL)，并且将黄色反应溶液在室温搅拌半小时，直到根据LCMS完全去除Fmoc。将所得溶液在真空中浓缩，并且剩余物通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.01％)中的10％-95％乙腈)纯化，以给出作为浅黄色固体的接头-有效载荷LP16(6mg,34％收率)。ESI m/z:616.9(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.03(s,1H),8.80(d,J＝6.8Hz,1H),8.51(d,J＝9.2Hz,1H),8.41(s,1H),8.15(d,J＝6.8Hz,1H),7.90(d,J＝8.8Hz,1H),7.79(d,J＝6.8Hz,1H),7.60(d,J＝8.0Hz,2H),7.42(t,J＝6.4Hz,1H),7.32(s,1H),7.27(d,J＝8.0Hz,2H),6.56-6.50(m,1H),6.05-6.01(m,1H),5.63-5.58(m,1H),5.43(s,4H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J＝6.8Hz,2H),4.42-4.35(m,1H),4.23(t,J＝7.6Hz,1H),4.02(s,2H),3.63-3.58(m,4H),3.53-3.49(m,12H),3.46-3.43(m,2H),3.18-3.15(m,2H),3.06-2.93(m,2H),2.79-2.76(m,2H),2.42-2.36(m,5H),2.24-2.12(m,2H),2.03-1.93(m,1H),1.89-1.81(m,2H),1.74-1.65(m,1H),1.65-1.54(m,1H),1.48-1.31(m,3H),0.89-0.82(m,9H)ppm。19F NMR(400MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
实施例3G：{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-{1-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP17)
Figure BDA0004122749040001841
向LP16-1(30mg,30μmol)在无水DMF(1.5mL)中的黄色溶液中添加DIPEA(8mg,62μmol)和Ia(CAS:756525-99-2,commercial,16mg,30μmol)，并且将反应混合物在室温搅拌1小时，直到起始材料根据LCMS被完全消耗。所得混合物通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为浅黄色固体的LP17(TFA盐，15mg，38％收率)。ESI m/z:692.4(M/2+H)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.79(t,J＝6.8Hz,1H),8.50(d,J＝8.4Hz,1H),8.11(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(t,J＝6.0Hz,1H),7.87(d,J＝8.8Hz,1H),7.79(d,J＝10.8Hz,1H),7.59(d,J＝8.4Hz,2H),7.41(t,J＝6.0Hz,1H),7.32(s,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,2H),7.00(s,2H),6.52(br s,1H),5.98(t,J＝6.0Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.43-5.41(m,4H),5.21(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J＝6.8Hz,2H),4.43-4.34(m,1H),4.25-4.21(m,1H),4.02(s,2H),3.61-3.57(m,6H),3.49-3.48(m,12H),3.21-3.12(m,4H),3.05-2.91(m,4H),2.49-2.39(m,5H),2.33(t,J＝7.2Hz,2H),2.22-2.14(m,2H),2.02-1.94(m,1H),1.89-1.80(m,2H),1.75-1.65(m,1H),1.65-1.54(m,1H),1.49-1.32(m,2H),0.87-0.82(m,9H)ppm。(未显示TFA的质子)。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111,-73ppm。
接头-有效载荷LP1、LP2、LP13、LP14、LP15、LP19、LP20、LP21以及LP22如下文方案4和实施例3H-3AR中描述合成。
方案4.线性vcPAB-接头-P3 LP1、LP2、LP13-LP15和LP19-LP22的合成
Figure BDA0004122749040001861
实施例3H：(4R)-4-氨基-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸甲酯(DEvcPAB)
Figure BDA0004122749040001871
向vcPAB(0.25g,0.95mmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加DIPEA(0.37g,2.9mmol)和HATU(0.25g,0.95mmol)，并且将混合物在室温搅拌10分钟，然后添加Boc-DGlu(OMe)-OH(0.40g,1.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌3小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在水中的0-70％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的Boc-DEvcPAB(0.35g,ESI m/z:623.4(M+H)+)，将其溶解在DCM(5mL)中。向溶液中添加TFA(1.5mL)，并且将反应混合物在室温搅拌3小时，直到Boc完全去除，这通过LCMS监测。将挥发物在真空中去除，并且将剩余物通过反相快速色谱(在水中的10％-40％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的DEvcPAB(0.27g,48％收率)。ESI m/z:523.4(M+H)+。
实施例3I：(4S)-4-氨基-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸甲酯(LEvcPAB)
Figure BDA0004122749040001872
遵循与DEvcPAB相似的程序(除了使用Boc-LGlu(OMe)-OH替代Boc-DGlu(OMe)-OH之外)，获得作为浅黄色固体的中间体LEvcPAB(0.18g,49％收率)。ESI m/z:523.3(M+H)+,545.3(M+Na)+。
实施例3J：LP#-2的一般程序和LP13-2、LP16-2、LP1-2和LP2-2的合成
向LP13-1、LP16-1、LP1-1或LP2-1(1.0当量)在DMF(0.25mM)中的溶液中添加DIPEA(3.3当量)和HATU(1.0当量)，并且将混合物在室温搅拌10分钟，然后加入vcPAB或EvcPAB(1.1-1.5当量)。将反应混合物在室温搅拌3小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在水中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的接头LP#-2(LP13-2、LP16-2、LP1-2或LP2-2)。
实施例3K：(9H-芴-9-基)甲基N-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸酯(LP13-2)
Figure BDA0004122749040001881
遵循所述一般程序，使用vcPAB(0.85g,2.2mmol)和LP13-1(0.60g,1.5mmol)，获得作为白色固体的化合物LP13-2(1.0g，87％收率)。ESI m/z:761.3(M+H)+,783.3(M+Na)+。
实施例3L：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸甲酯(LP14-2)
Figure BDA0004122749040001882
遵循所述一般程序，从LP14-1(0.19g,0.37mmol)和DEvcPAB(0.14g,0.34mmol)开始，在通过反相快速色谱(在水中的0-70％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头LP14-2(0.20g,66％收率)。ESI m/z:904.4(M+H)+。
实施例3M：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸甲酯(LP15-2)
Figure BDA0004122749040001891
遵循所述一般程序，从LP13-1(0.45g,1.1mmol)和LEvcPAB(0.65g,1.2mmol)开始，在通过反相快速色谱(在水中的0-100％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头LP15-2(0.70g,69％收率)。ESI m/z:904.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.94(s,1H),8.15-8.07(m,2H),7.91-7.87(m,2H),7.78(d,J＝8.8Hz,1H),7.69(d,J＝7.2Hz,2H),7.55-7.52(m,2H),7.41(t,J＝7.6Hz,2H),7.35-7.30(m,3H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),6.00-5.93(m,1H),5.42(bs,1H),4.42(s,2H),4.39-4.34(m,2H),4.31-4.27(m,2H),4.24-4.16(m,2H),3.60-3.56(m,5H),3.47(s,3H),3.36-3.34(m,2H),3.14-3.10(m,2H),3.04-3.00(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.44-2.38(m,2H),2.35-2.29(m,4H),2.00-1.95(m,1H),1.92-1.86(m,1H),1.77-1.66(m,2H),1.61-1.55(m,1H),1.46-1.34(m,2H),1.25-1.18(m,1H),0.87-0.80(m,6H)ppm。
实施例3N：N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(LP1-2)
Figure BDA0004122749040001892
遵循所述一般程序，从LP1-1和vcPAB(3.3g,8.0mmol)开始，在通过反相快速色谱(在水中的0-100％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头LP1-2(4.3g,68％收率)。ESIm/z:791.5(M+H)+。
实施例3O：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-[1-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]丁酸甲酯(LP19-2)
Figure BDA0004122749040001901
遵循所述一般程序，从DEvcPAB(0.17g,0.34mmol)和LP16-1(0.17g,0.34mmol)开始，获得作为浅黄色固体的接头LP19-2(0.18g，53％收率)。ESI m/z:993.5(M+H)+。
实施例3P：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}丁酸甲酯(LP20-2)
Figure BDA0004122749040001902
遵循所述一般程序，从DEvcPAB(0.28g,0.54mmol)和LP1-1(0.25g,0.48mmol)开始，获得作为浅黄色固体的化合物LP20-2(0.20g，44％收率)。ESI m/z:934.5(M+H)+。
实施例3Q：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-[1-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]丁酸甲酯(LP21-2)
Figure BDA0004122749040001903
遵循所述一般程序，从LEvcPAB(0.20g,0.38mmol)和LP16-1(0.19g,0.39mmol)开始，获得作为白色固体的化合物LP21-2(0.20g，53％收率)。ESI m/z:992.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.94(s,1H),8.13(d,J＝7.2Hz,1H),8.08(d,J＝7.6Hz,1H),7.89(d,J＝7.2Hz,2H),7.77(d,J＝8.4Hz,1H),7.70(d,J＝7.6Hz,2H),7.54(d,J＝8.4Hz,2H),7.44-7.39(m,2H),7.35-7.31(m,3H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),5.98(brs,1H),5.41(br s,1H),4.43(s,2H),4.39-4.33(m,2H),4.31-4.29(m,2H),4.23-4.17(m,2H),3.63-3.57(m,6H),3.50-3.46(m,12H),3.41(t,J＝6.0Hz,2H),3.16-3.10(m,2H),3.10-3.00(m,1H),2.99-2.89(m,1H),2.40-2.30(m,4H),2.02-1.87(m,2H),1.78-1.55(m,3H),1.48-1.32(m,2H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H)ppm。(未显示苄醇的质子。)
实施例3R：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}丁酸甲酯(LP22-2)
Figure BDA0004122749040001911
遵循所述一般程序，从LEvcPAB(0.10g,0.19mmol)和LP1-1(81mg,0.19mmol)开始，获得作为白色固体的化合物LP22-2(0.11g，63％收率)。ESI m/z:934.5(M+H)+。
实施例3S：LP#-3的一般程序
向LP#-2(1.0当量)在DMF(0.15mM)中的溶液中添加DMAP(1.0当量)、DIPEA(3.0当量)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(3.0当量)，并且将反应混合物在室温搅拌1小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在水中的0-60％乙腈)纯化，以给出作为浅黄色固体的LP#-3。
实施例3T：{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基碳酸酯(LP13-3)
Figure BDA0004122749040001912
遵循所述一般程序，从LP13-2(0.50g,0.66mmol)开始，获得作为浅黄色油状物的接头LP13-3(0.40g,68％收率)，将其在空气中固化。ESI m/z:926.5(M+H)+,948.4(M+Na)+。
实施例3U：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙氧基]乙氧基}丙酰氨基)丁酸甲酯(LP14-3)
Figure BDA0004122749040001921
遵循所述一般程序，从LP14-2(0.20g,0.22mmol)开始，获得作为白色固体的接头LP14-3(0.18g,77％收率)。ESI m/z:1069.2(M+H)+。
实施例3V：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙氧基]乙氧基}丙酰氨基)丁酸甲酯(LP15-3)
Figure BDA0004122749040001922
遵循所述一般程序，从LP15-2(0.70g,0.77mmol)开始，获得作为浅黄色固体的接头LP15-3(0.50g,61％收率)。ESI m/z:1069.5(M+H)+。
实施例3W：{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基碳酸酯(LP1-3)
Figure BDA0004122749040001931
遵循所述一般程序，从LP1-2(2.3g,2.9mmol)开始，获得作为浅黄色固体的接头LP1-3(1.9g,69％收率)。ESI m/z:978.5(M+Na)+。
实施例3X：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-[1-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]丁酸甲酯(LP19-3)
Figure BDA0004122749040001932
遵循所述一般程序，从LP19-2(0.18g,0.18mmol)开始，获得作为浅黄色固体的接头LP19-3(0.18g,86％收率)。ESI m/z:1157.5(M+H)+。
实施例3Y：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}丁酸甲酯(LP20-3)
Figure BDA0004122749040001933
遵循所述一般程序，从LP20-2(0.20g,0.21mmol)开始，获得作为黄色固体的接头LP20-3(0.20g,85％收率)。ESI m/z:1099.6(M+H)+。
实施例3Z：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-[1-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]丁酸甲酯(LP21-3)
Figure BDA0004122749040001941
遵循所述一般程序，从LP21-2(0.20g,0.20mmol)开始，获得作为浅黄色固体的接头LP21-3(0.19g,81％收率)。ESI m/z:1157.4(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.11(s,1H),8.32(d,J＝8.8Hz,2H),8.17(d,J＝7.2Hz,1H),8.09(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(d,J＝7.6Hz,2H),7.77(d,J＝8.4Hz,1H),7.69(d,J＝7.2Hz,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.57(d,J＝9.2Hz,2H),7.44-7.40(m,4H),7.35-7.31(m,3H),5.99(br s,1H),5.42(br s,1H),5.25(s,2H),4.42-4.36(m,2H),4.29(d,J＝6.8Hz,2H),4.23-4.17(m,2H),3.61-3.57(m,6H),3.50-3.46(m,12H),3.41(t,J＝6.0Hz,2H),3.16-3.11(m,2H),3.12-3.00(m,1H),3.00-2.89(m,1H),2.40-2.30(m,4H),2.01-1.88(m,2H),1.80-1.56(m,3H),1.50-1.33(m,2H),0.87(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H)ppm。
实施例3AA：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}丁酸甲酯(LP22-3)
Figure BDA0004122749040001942
遵循所述一般程序，从LP08b-2(0.10g,0.11mmol)开始，获得作为白色固体的接头LP08b-3(71mg,60％收率)。ESI m/z:550.5(M/2+H)+。
实施例3AB：LP1、LP2以及LP#-4的一般程序
向LP#-3(1.0-1.2当量)在DMF(0.15mM)中的溶液中添加HOBt(0.5当量)、DIPEA(3.0当量)和有效载荷P(1.0当量)，并且将反应混合物在室温搅拌2小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱直接纯化，以给出作为白色固体的LP1、LP2或LP#-4。
实施例3AC：{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP1)
Figure BDA0004122749040001951
遵循所述一般程序，从有效载荷P3(0.85g,1.2mmol)和LP1-3(1.2g,1.2mmol)开始，在通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.1％)中的5％-60％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP1(1.1g,62％收率，甲酸盐)。ESI m/z:699.0(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.00(s,1H),8.80(t,J＝6.4Hz,1H),8.51(d,J＝8.8Hz,1H),8.13(d,J＝7.6Hz,1H),7.90(d,J＝8.8Hz,1H),7.79(d,J＝10.8Hz,1H),7.65-7.50(m,3H),7.43(t,J＝6.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.27(d,J＝8.8Hz,2H),6.54(s,1H),5.98(t,J＝5.2Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.41(s,4H),5.21(s,2H),4.92(s,2H),4.62(d,J＝6.4Hz,2H),4.43-4.33(m,1H),4.31-4.17(m,2H),4.01(s,2H),3.86(d,J＝14.4Hz,1H),3.75(d,J＝14.8Hz,1H),3.67-3.46(m,15H),3.44-3.39(m,2H),3.27-3.10(m,4H),3.06-2.90(m,2H),2.47-2.32(m,5H),2.26-1.64(m,14H),1.63-1.52(m,3H),1.47-1.32(m,3H),0.90-0.80(m,9H)ppm。19FNMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
实施例3AD：{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-4-氧代丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP2)
Figure BDA0004122749040001961
遵循所述一般程序，从有效载荷P3(10mg,17μmol)和LP2-3(CAS 2226472-28-0,根据WO2018089373合成,18mg,17μmol)开始，在通过制备型HPLC(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的5％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP2(12mg,46％收率)。ESIm/z:513.4(M/3+H)+,在HPLC中Rt＝6.63min(E-开环形式,34％)；507.4(M/3+H),760.5(M/2+H),在HPLC中Rt＝7.45min(内酯形式,64％)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,1H),8.80(t,J＝6.4Hz,1H),8.50(d,J＝8.8Hz,1H),8.12(d,J＝7.2Hz,1H),7.87(d,J＝8.4Hz,1H),7.80-7.75(m.2H),7.69-7.67(m,1H),7.63-7.58(m,3H),7.51-7.46(m,3H),7.45-7.33(m,3H),7.32-7.26(m,4H),6.53(s,1H),5.98(t,J＝6.0Hz,1H),5.63-5.57(m,1H),5.42(s,4H),5.21(s,2H),5.03(d,J＝14.0Hz,1H),4.93(s,2H),4.63(d,J＝6.8Hz,2H),4.41-4.35(m,1H),4.25-4.21(m,1H),4.02(s,2H),3.62-3.57(m,5H),3.48-3.45(m,12H),3.31-3.28(m,2H),3.23-3.14(m,2H),3.11-3.07(m,2H),3.05-2.98(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.60-2.55(m,1H),2.46-2.44(m,1H),2.39(s,3H),2.35-2.33(m,1H),2.26-2.15(m,3H),2.03-1.94(m,2H),1.88-1.67(m,4H),1.63-1.57(m,1H),1.46-1.33(m,2H),0.88-0.81(m,9H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
实施例3AE：(9H-芴-9-基)甲基N-{2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸酯(LP13-4)
Figure BDA0004122749040001971
遵循所述一般程序，从LP13-3(0.10g,0.11mmol)和有效载荷P3(77mg,0.11mmol)开始，在通过反相快速色谱(在水中的0-100％乙腈10分钟，并且然后100％乙腈5分钟)纯化之后获得作为浅黄色油状物的化合物LP13-4(0.12g,78％收率)。ESI m/z:684.0(M/2+H)+。
实施例3AF：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸甲酯(LP14-4)
Figure BDA0004122749040001972
遵循所述一般程序，从LP14-3(0.12g,0.11mmol)和有效载荷P3(64mg,0.11mmol)开始，在通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-60％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的化合物LP14-4(0.13g,78％收率)。ESI m/z:755.7(M/2+H)+。
实施例3AG：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸甲酯(LP15-4)
Figure BDA0004122749040001981
遵循所述一般程序，从LP15-3(0.50g,0.47mmol)和P3(0.22g,0.38mmol)开始，获得作为白色固体的化合物LP15-4(0.40g,56％收率)。ESI m/z:755.5(M/2+H)+。
实施例3AH：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-[1-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]丁酸甲酯(LP19-4)
Figure BDA0004122749040001991
/>
遵循所述一般程序，从LP19-3(80mg,69μmol)和有效载荷P3(40mg,69μmol)开始，获得作为白色固体的化合物LP19-4(70mg,64％收率)。ESI m/z:799.5(M/2+H)+。
实施例3AI：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}丁酸甲酯(LP20-4)
Figure BDA0004122749040001992
遵循所述一般程序，从LP20-3(95mg,86μmol)和有效载荷P3(58mg,0.10mmol)开始，获得作为浅黄色固体的化合物LP20-4(60mg,45％收率)。ESI m/z:770.6(M/2+H)+。
实施例3AJ：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-[1-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]丁酸甲酯(LP21-4)
Figure BDA0004122749040002001
遵循所述一般程序，从LP21-3(58mg,50μmol)和有效载荷P3(35mg,50μmol)开始，获得作为白色固体的化合物LP21-4(51mg,64％收率)。ESI m/z:799.8(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(s,1H),8.80(t,J＝6.4Hz,1H),8.51(d,J＝8.4Hz,1H),8.16(d,J＝7.6Hz,1H),8.09(d,J＝7.6Hz,1H),7.88(d,J＝7.6Hz,2H),7.78(d,J＝10.8Hz,2H),7.69(d,J＝7.2Hz,2H),7.58(d,J＝8.8Hz,2H),7.44-7.39(m,3H),7.34-7.31(m,4H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),6.53(br s,1H),5.99(br s,1H),5.62-5.57(m.1H),5.42(s,2H),5.46-5.37(m.1H),5.20(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J＝5.6Hz,2H),4.41-4.33(m,2H),4.30-4.28(m,2H),4.22-4.16(m,2H),4.02(s,2H),3.63-3.57(m,8H),3.50-3.46(m,12H),3.40(t,J＝6.0Hz,2H),3.26-3.18(m,1H),3.15-3.10(m,3H),3.07-2.99(m,1H),2.99-2.90(m,1H),2.42-2.30(m,7H),2.21-2.14(m,2H),1.97-1.82(m,4H),1.77-1.59(m,3H),1.54-1.32(m,2H),0.88-0.82(m,9H)ppm。
实施例3AK：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}丁酸甲酯(LP22-4)
Figure BDA0004122749040002011
遵循所述一般程序，从LP22-3(80mg,73μmol)和有效载荷P3(43mg,73μmol)开始，在通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-60％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的化合物LP22-4(60mg,60％收率)。ESI m/z:770.5(M/2+H)+。
实施例3AL：{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP13)
Figure BDA0004122749040002012
向LP13-4(0.12g,84μmol)在无水DMF(1.8mL)中的溶液中添加二乙胺(0.2mL)，并且将混合物在室温搅拌1小时，直到根据LCMS完全去除Fmoc。所得溶液通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈，10分钟)直接分离，以给出作为浅黄色固体的LP13(50mg,52％收率)。ESI m/z:573.0(M/2+H)+。
实施例3AM：(4R)-4-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸(LP14)
Figure BDA0004122749040002021
向化合物LP14-4(0.10g,66μmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加哌啶(56mg,0.66mmol)，并且将混合物在室温搅拌2小时，直到去除Fmoc，这通过LCMS监测。向反应混合物中添加氢氧化锂水溶液(0.2mM,1mL)和THF(3mL)，并且将混合物在室温再搅拌1小时，直到甲酯根据LCMS完全水解。在过滤之后，所得混合物通过至pH 5.0的PBS缓冲液(pH 3.0)酸化，并且然后在真空中浓缩。剩余物通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.01％)中的10％-95％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的接头-有效载荷LP14(40mg，47％收率)。ESI m/z:637.5(M/2+H)+。
实施例3AN：(4S)-4-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸(LP15)
Figure BDA0004122749040002022
遵循与LP14相似的程序(除了用LP15-4取代LP14-4之外)，在通过制备型HPLC(TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP15(50mg,14％收率)。ESI m/z:637.4(M/2+H)+。
实施例3AO：(4R)-4-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸(LP19)
Figure BDA0004122749040002031
遵循与LP14相似的程序(除了用LP19-4(60mg,38μmol)取代LP14-4之外)，在通过制备型HPLC(TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP19(12mg,24％收率)。ESI m/z:681.5(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.80(s,1H),8.81(t,J＝6.4Hz,1H),8.52(d,J＝8.8Hz,1H),8.19-8.13(m,2H),8.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.81-7.75(m,3H),7.61(d,J＝6.4Hz,2H),7.43(t,J＝6.0Hz,1H),7.31(s,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),6.55(br s,1H),6.04-5.99(m,1H),5.64-5.57(m,1H),5.43-5.40(m,2H),5.20(s,2H),4.93(s,2H),4.63(d,J＝6.4Hz,2H),4.40-4.32(m,2H),4.23-4.19(m,1H),4.02(s,2H),3.63-3.60(m,4H),3.59-3.57(m,4H),3.56-3.54(m,3H),3.51-3.49(m,5H),3.01-2.95(m,4H),2.44-2.41(m,1H),2.39(s,3H),2.31-2.28(m,1H),2.26-2.21(m,3H),2.20-2.15(m,2H),2.09-2.01(m,2H),1.90-1.82(m,4H),1.78-1.72(m,2H),1.66-1.61(m,1H),1.50-1.41(m,2H),1.40-1.35(m,1H),0.90-0.82(m,11H)ppm。(未显示COOH的质子)19FNMR(376MHz,DMSOd6)δ-73.70,-111.28ppm。
实施例3AP：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}丁酸(LP20)
Figure BDA0004122749040002041
向化合物LP20-4(60mg,39μmol)在水(1mL)和THF(3mL)中的溶液中添加氢氧化锂水溶液(0.12M,1mL)，并且将反应混合物在室温搅拌2小时，直到甲酯完全水解，这通过LCMS监测。混合物通过PBS缓冲液(pH 4.0)酸化至pH 6.0，并且然后在真空中浓缩。剩余物通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的LP20(15mg,25％收率)。ESI m/z:763.5(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.78(s,1H),8.80(t,J＝6.8Hz,1H),8.51(t,J＝8.8Hz,1H),8.18-8.12(m,2H),8.07(d,J＝6.0Hz,1H),7.78(d,J＝11.2Hz,1H),7.63-7.59(m,3H),7.43(t,J＝6.0Hz,1H),7.32-7.22(m,4H),7.11-6.96(m,1H),6.61-6.45(br s,1H),6.02-5.96(m,1H),5.63-5.57(m,1H),5.44-5.38(m,3H),5.20(s,2H),4.92(s,2H),4.63(d,J＝6.0Hz,2H),4.40-4.33(m,2H),4.29-4.25(m,1H),4.24-4.18(m,1H),4.01(s,2H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.63-3.60(m,2H),3.57-3.55(m,1H),3.51-3.47(m,8H),3.27-3.21(m,4H),3.17-3.12(m,1H),3.03-2.99(m,1H),2.97-2.93(m,1H),2.44-2.41(m,1H),2.39(br s,3H),2.28-2.14(m,7H),2.08-1.99(m,2H),1.94-1.81(m,6H),1.80-1.71(m,5H),1.63-1.54(m,3H),1.40-1.33(m,4H),0.90-0.81(m,11H)ppm。(未显示酸和TFA的质子)。19F NMR(400MHz,DMSOd6)δ-73.86,-111.30ppm。
实施例3AQ：(4S)-4-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸(LP21)
Figure BDA0004122749040002051
遵循与LP14相似的程序(除了用LP21-4(45mg,28μmol)取代LP14-4之外)，在通过制备型HPLC(TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP21(10mg,26％收率)。ESI m/z:681.4(M/2+H)+.1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.05(s,1H),8.81(t,J＝7.2Hz,1H),8.52(d,J＝8.4Hz,1H),8.19(d,J＝7.6Hz,1H),8.09(d,J＝8.0Hz,1H),7.81-7.68(m,5H),7.58(d,J＝8.4Hz,2H),7.43(t,J＝6.8Hz,1H),7.32(s,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),6.54(brs,1H),6.03-5.97(m,1H),5.63-5.57(m,1H),5.48-5.42(m,3H),5.21(s,2H),4.92(s,2H),4.63(d,J＝6.4Hz,2H),4.42-4.31(m,2H),4.22-4.17(m,1H),4.02(s,2H),3.62-3.55(m,8H),3.51-3.48(m,12H),3.20-3.12(m,2H),3.05-2.89(m,5H),2.40(s,3H),2.26-2.21(m,2H),2.20-2.12(m,2H),2.02-1.95(m,1H),1.90-1.80(m,3H),1.74-1.63(m,2H),1.59-1.54(m,1H),1.49-1.31(m,2H),0.88-0.82(m,9H)ppm。(未显示COOH的质子)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-73,-111ppm。
实施例3AR：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}丁酸(LP22)
Figure BDA0004122749040002061
遵循与LP20相似的程序(除了用LP22-4(60mg,39μmol)取代LP20-4之外)，在通过制备型HPLC(TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP22(15mg,26％收率)。ESI m/z:763.5(M/2+H)+.1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.78(br s,1H),8.80(t,J＝6.8Hz,1H),8.51(t,J＝8.8Hz,1H),8.18-8.12(m,2H),8.07(d,J＝6.0Hz,1H),7.78(d,J＝11.2Hz,1H),7.63-7.59(m,3H),7.43(t,J＝6.0Hz,1H),7.32-7.22(m,4H),7.11-6.96(m,1H),6.61-6.45(br s,1H),6.02-5.96(m,1H),5.63-5.57(m,1H),5.43-5.40(m,2H),5.20(s,2H),4.92(s,2H),4.63(d,J＝6.0Hz,2H),4.40-4.33(m,2H),4.29-4.25(m,1H),4.23-4.18(m,1H),4.01(s,2H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.63-3.60(m,2H),3.57-3.55(m,1H),3.51-3.47(m,8H),3.46-3.45(m,2H),3.27-3.21(m,4H),3.17-3.13(m,1H),3.03-2.99(m,1H),2.97-2.93(m,1H),2.46-2.41(m,1H),2.39(s,3H),2.36-2.31(m,1H),2.27-2.16(m,7H),2.09-2.00(m,1H),2.00-1.81(m,7H),1.80-1.68(m,4H),1.62-1.54(m,3H),1.40-1.35(m,3H),0.90-0.81(m,11H)ppm。(未显示COOH的质子)19FNMR(376MHz,DMSOd6)δ-73.86,-111.30ppm。
实施例4：肽接头-有效载荷的合成
接头-有效载荷LP3、LP4、LP7/LP7’和LP9如下文方案5和实施例4A-4F描述合成。
起始材料L3-2(CAS 1353016-71-3)和L4-2(CAS 1425803-45-7)从Accela商购获得。
方案5：肽接头-有效载荷的合成
Figure BDA0004122749040002071
实施例4A：2-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)乙酸(L3-3)
Figure BDA0004122749040002072
向肽L3-1(Gly-Gly-Gly-OH,0.34g,1.8mmol)在DMF(13mL)中的悬浮液中添加L3-2(0.50g,1.8mmol)在THF(6mL)和DIPEA(0.69g,5.4mmol)中的溶液，并且将混浊混合物在RT搅拌20小时。过滤混合物，并且澄清滤液溶液在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在水中的0-20％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的化合物L3-3(0.13g,21％收率)。ESIm/z:354.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ12.6(s,1H),8.20(t,J＝5.6Hz,1H),8.15(t,J＝6.0Hz,1H),7.82(t,J＝5.6Hz,1H),4.35-4.31(m,1H),3.94(d,J＝14.8Hz,1H),3.83-3.73(m,7H),2.29-2.06(m,3H),1.99-1.93(m,1H),1.91-1.71(m,3H),1.63-1.56(m,2H),1.46-1.37(m,1H)ppm。
实施例4B：2-[2-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)乙酰胺基]-N-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]乙酰胺(LP3)
Figure BDA0004122749040002081
向化合物L3-3(9.0mg,25μmol)在无水DMF(14mL)中的黄色溶液中添加DIPEA(9.0mg,70μmol)和HATU(10mg,26μmol)，并且将混合物在RT搅拌30分钟，然后添加有效载荷P3(15mg,22μmol)。将反应混合物在RT搅拌2小时，直到根据LCMS大部分起始材料被消耗。所得混合物通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为浅黄色固体的接头-有效载荷LP3(8.0mg，36％收率，TFA盐)。ESI m/z:915.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.68(t,J＝6.6Hz,1H),8.51(d,J＝8.8Hz,1H),8.25-8.12(m,3H),7.86-7.75(m,2H),7.31(s,1H),6.53(s,1H),5.59(s,1H),5.43(s,2H),5.20(s,2H),4.63(d,J＝6.5Hz,2H),4.31(m,1H),4.01(s,2H),3.92(d,J＝14.9Hz,1H),3.75(m,9H),3.18(s,2H),2.40(s,3H),2.26-2.02(m,5H),1.96-1.70(m,6H),1.63-1.53(m,2H),1.39(d,J＝8.7Hz,1H),0.87(t,J＝7.3Hz,3H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-74(TFA),-111(Ar-F)ppm。
实施例4C：(2S)-2-{2-[2-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-4-氧代丁酰胺基)乙酰胺基]乙酰胺基}-3-苯基丙酸(L4-3)
Figure BDA0004122749040002082
向化合物L4-2(0.28g,0.69mmol)和肽L4-1(Gly-Gly-Phe-OH,0.19g,0.69mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加DIPEA(0.37mL,2.1mmol)，并且将反应混合物在RT搅拌1小时。反应的完成通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的化合物L4-3(0.31g，78％收率)。ESI m/z:567.0(M+H)+。
实施例4D：4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-N-{[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基]氨基甲酰基]-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}-4-氧代丁酰胺(LP4)
Figure BDA0004122749040002091
遵循制备LP3的程序(除了用L4-3取代L3-3之外)，在通过制备型HPLC(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的具有和没有开环内酯LP4-RO的接头-有效载荷LP4(14mg,56％收率)。
内酯：HPLC纯度：75％，保留时间：7.93min,ESI m/z:1128.3(M+H)+,564.8(M/2+H)+；开环产物：HPLC纯度：20％，保留时间：6.94min,ESI m/z:1169.4(M+Na)+,1146.3(M+H)+.1HNMR(400MHz,DMSOd6)δ8.62(s,1H),8.50(d,J＝8.8Hz,1H),8.28(s,1H),8.18-7.91(m,3H),7.78(d,J＝11.5Hz,1H),7.70-7.58(m,2H),7.50-7.38(m,3H),7.29(m,3H),7.24-7.11(m,5H),6.51(s,1H),5.58(s,1H),5.41(s,1H),5.19(s,1H),4.99(d,J＝13.8Hz,1H),4.62(d,J＝6.1Hz,2H),4.46(s,1H),4.01(s,2H),3.70(m,3H),3.56(m,3H),3.22-3.06(m,2H),2.99(m,2H),2.75(m,1H),2.67(m,1H),2.38(m,3H),2.33(m,4H),2.17(m,2H),2.07(m,2H),1.95-1.70(m,2H),0.86(t,J＝7.2Hz,3H)ppm。
实施例4E：2-(环辛-2-炔-1-基氧基)-N-{[({[({2-[2-({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)吡咯烷-1-基]-2-氧代乙基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}甲基]氨基甲酰基]甲基}乙酰胺(非对映异构体1，LP7和非对映异构体2，LP7’)
Figure BDA0004122749040002101
遵循与LP3相似的程序(除了用P4取代P3之外)，在通过在制备型HPLC(在碳酸氢铵(8mM)与氨(0.05％v)的水溶液中的0-100％乙腈)纯化之后分离获得作为白色固体的非对映异构体LP7(具有和没有开环内酯产物，3.0mg，7％收率)和LP7’(具有和没有开环内酯产物，4.0mg，9.3％收率)。
LP7:内酯：HPLC纯度：11％，保留时间：6.87min,ESI m/z:955.3(M+H)+，开环产物：HPLC纯度：89％，保留时间：5.91min,ESI m/z:996.5(M+Na)+1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.71-8.57(m,1H),8.30-8.13(m,2H),7.99-7.70(m,3H),7.32-6.67(m,2H),5.63-5.48(m,1H),5.43-5.01(m,5H),4.36-4.27(m,1H),4.21-3.68(m,10H),2.40-2.24(m,4H),2.14-1.33(m,22H),1.14-0.97(m,2H),0.89-0.84(m,3H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111,-112ppm。
LP7’:内酯：HPLC纯度：21％，保留时间：6.98min,ESI m/z:955.3(M+H)+，开环产物：HPLC纯度：79％，保留时间：6.02min,ESI m/z:996.5(M+Na)+1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.60-8.55(m,1H),8.31-7.69(m,5H),7.32-7.21(m,1H),6.66-6.53(m,1H),5.64-5.56(m,1H),5.43-5.09(m,5H),4.32-4.30(m,1H),4.16-4.02(m,2H),3.98-3.89(m,2H),3.82-3.55(m,6H),2.40-2.31(m,4H),2.22-1.36(m,22H),1.15-0.98(m,2H),0.89-0.84(m,3H)ppm。19FNMR(376MHz,DMSOd6)δ-111,-112ppm。
实施例4F：2-[2-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)乙酰胺基]-N-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]乙酰胺(LP9)
Figure BDA0004122749040002111
向化合物L3-3(实施例4A)(9.0mg,25μmol)在无水DMF(14mL)中的黄色溶液中添加DIPEA(9.0mg,70μmol)和HATU(10mg,26μmol)，并且将混合物在室温搅拌30分钟，然后添加有效载荷P(15mg,22μmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，直到根据LCMS大部分起始材料被消耗。所得混合物通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为浅黄色固体的接头-有效载荷LP9(8.0mg，36％收率，TFA盐)。ESI m/z:915.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.68(t,J＝6.6Hz,1H),8.51(d,J＝8.8Hz,1H),8.25-8.12(m,3H),7.86-7.75(m,2H),7.31(s,1H),6.53(s,1H),5.59(s,1H),5.43(s,2H),5.20(s,2H),4.63(d,J＝6.5Hz,2H),4.31(m,1H),4.01(s,2H),3.92(d,J＝14.9Hz,1H),3.75(m,9H),3.18(s,2H),2.40(s,3H),2.26-2.02(m,5H),1.96-1.70(m,6H),1.63-1.53(m,2H),1.39(d,J＝8.7Hz,1H),0.87(t,J＝7.3Hz,3H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-74(TFA),-111(Ar-F)ppm。
实施例5：酸敏感接头-有效载荷的合成
接头-有效载荷LP8如方案6描述并且如下文进一步描述合成。
起始材料L2-1(CAS 1427004-19-0)从Accela商购获得。
方案6：酸敏感接头-有效载荷的合成
Figure BDA0004122749040002121
1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-4-氧代丁酰胺基)-N-{2-[2-({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)吡咯烷-1-基]-2-氧代乙基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(LP8)
Figure BDA0004122749040002122
向有效载荷P4(6.2mg,10μmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中添加化合物L2-1(6.5mg,10μmol)和DIPEA(3.9mg,30μmol)，并且将反应混合物在RT搅拌2小时。反应的完成通过LCMS监测。所得混合物通过制备型HPLC(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的5％-95％乙腈)直接纯化，以给出作为黄色固体的接头-有效载荷LP8(内酯开环产物，3.0mg，26％收率)。
内酯：HPLC纯度：80％，保留时间：8.12min,ESI m/z:577.6(M/2+H)+；开环产物：HPLC纯度：20％，保留时间：6.91min,ESI m/z:586.7(M/2+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.74-7.67(m,2H),7.63-7.58(m,1H),7.56-7.52(m,1H),7.44-7.36(m,3H),7.32-7.20(m,4H),6.60-6.44(m,1H),5.56-5.49(m,1H),5.34(s,2H),5.28-5.16(m,1H),5.11-5.06(m,1H),4.98-4.92(m,1H),4.10-3.91(m,2H),3.75-3.74(m,1H),3.55-3.50(m,3H),3.40-3.37(m,13H),3.22-3.16(m,5H),3.02-2.99(m,3H),2.54-2.48(m,2H),2.31(d,J＝2.8Hz,2H),2.22-2.11(m,4H),1.96-1.88(m,4H),1.82-1.72(m,2H),1.67-1.64(m,2H),1.01(t,J＝7.2Hz,2H),0.92(t,J＝7.2Hz,2H),0.82-0.76(m,3H)ppm。19FNMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
实施例6：葡萄糖接头-有效载荷的合成
接头-有效载荷LP5以及LP6如下文方案7A-7B和实施例6A-6N描述合成。
方案7A：葡萄糖接头-有效载荷L5和L6的合成
Figure BDA0004122749040002131
方案7B：葡萄糖接头-有效载荷L5、L6和L12的合成
Figure BDA0004122749040002141
实施例6A：N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺(L5-1)
Figure BDA0004122749040002142
向乙二胺(0.71g,12mmol)在DMF(2.0mL)中的溶液中缓慢添加DIPEA(0.30g,2.4mmol)和化合物L3-2(0.33g,1.2mmol)在DMF(3.0mL)中的溶液，并且将混合物在RT搅拌30min。反应的完成通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(0.8mM)中的0-100％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的化合物L5-1(0.18g，68％收率)。ESI m/z:225.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.74-7.63(m,1H),4.28(t,J＝5.8Hz,1H),3.88-3.73(m,2H),3.11-3.00(m,4H),2.58(t,J＝6.4Hz,2H),2.27-2.06(m,3H),1.94-1.71(m,4H),1.66-1.54(m,2H),1.45-1.33(m,1H)ppm。
实施例6B：(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-(羟甲基)苯氧基]环氧乙烷-2-羧酸甲酯(L5-3)
Figure BDA0004122749040002151
/>
向化合物L5-2(根据WO2018182341A1合成的，该文献通过引用以其整体并入本文)(0.11g,0.23mmol)和HATU(96mg,0.25mmol)在无水DMF(4mL)中的混合物中添加化合物L5-1(51mg,0.23mmol)和DIPEA(89mg,0.69mmol)，并且将反应混合物在RT搅拌2小时，直到L5-2被完全消耗，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的化合物L5-3(0.14g,90％收率)。ESI m/z:691.4(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06-8.04(m,1H),7.64-7.59(m,1H),7.50-7.47(m,1H),7.22-7.18(m,1H),7.01-6.98(m,1H),5.44-5.28(m,5H),4.68(s,2H),4.30-4.21(m,2H),4.10-4.06(m,1H),3.93-3.88(m,1H),3.75(s,3H),3.67-3.48(m,2H),2.21-2.07(m,15H),1.93-1.79(m,3H),1.70-1.38(m,3H)ppm。
实施例6C：(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-{[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]甲基}苯氧基]环氧乙烷-2-羧酸甲酯(L5-4)
Figure BDA0004122749040002152
在氮气下在0℃向化合物L5-3(0.14g,0.20mmol)在DMF(2.0mL)中的溶液中添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(55mg,0.18mmol)和DIPEA(26mg,0.20mmol)。将反应混合物在0℃搅拌30min，并且然后在RT搅拌3小时。反应混合物用水(10mL)稀释并且用乙酸乙酯(20mL×3)提取。合并的有机溶液用盐水(10mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并且在真空中浓缩。剩余物通过快速色谱法(在石油醚中的40％-60％乙酸乙酯)纯化，以给出作为无色油状物的化合物L5-4(85mg,49％收率)。ESI m/z:856.0(M+H)+。
实施例6D：(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯氧基]环氧乙烷-2-羧酸甲酯(L5-5)
Figure BDA0004122749040002161
向化合物L5-4(17mg,20μmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中添加P3(12mg,20μmol)、HOBt(2.7mg,20μmol)和DIPEA(5.1mg,40μmol)。将反应混合物在RT搅拌16小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为黄色固体的化合物L5-5(13mg,20％收率)。ESI m/z:649.0(M/2+H)+。
实施例6E：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯氧基]-3,4,5-三羟基环氧乙烷-2-羧酸(LP5)
Figure BDA0004122749040002171
向化合物L5-5(13mg,10μmol)在甲醇(2mL)中的混合物中添加氢氧化锂水溶液(0.1M,2mL)，并且将混合物在RT搅拌1小时。反应的完成通过LCMS监测。在用至pH 4的HCl(1N)水溶液猝灭之后，所得混合物通过反相快速色谱(在TFA(0.01％)水溶液中的5％-95％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的接头-有效载荷LP5(5mg，43％收率)。ESI m/z:1156.3(M+H)+。
实施例6F：[(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-(羟甲基)苯氧基]环氧乙烷-2-基]乙酸甲酯(L6-3)
Figure BDA0004122749040002172
遵循制备L5-3的程序(除了用L6-2取代L5-2之外)，获得作为白色固体的化合物L6-3(0.10g,80％收率)。ESI m/z:705.3(M+H)+。
实施例6G：[(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-{[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]甲基}苯氧基]环氧乙烷-2-基]乙酸甲酯(L6-4)
Figure BDA0004122749040002173
遵循制备L5-4的程序(除了用L6-3取代L5-3之外)，获得作为白色固体的化合物L6-4(62mg,50％收率)。ESI m/z:870.3(M+H)+。
实施例6H：[(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12.14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯氧基]环氧乙烷-2-基]乙酸甲酯(L6-5)
Figure BDA0004122749040002181
遵循制备L5-5的程序(除了用L6-4取代L5-4之外)，获得作为白色固体的化合物L6-5(30mg,66％收率)。ESI m/z:655.7(M/2+H)+。
实施例6I：[3-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)环氧乙烷-2-基]氧基}苯基]甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP6)
Figure BDA0004122749040002182
遵循制备LP5的程序(除了用L6-5取代L5-5之外)，获得作为白色固体的接头-有效载荷LP6(9mg,34％收率)。ESI m/z:1142.3(M+H)+。
实施例6J：2-({2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基]乙酰胺基]乙酰胺基}甲氧基)乙酸苄基酯(GP-2)
Figure BDA0004122749040002191
向化合物GP-1(CAS:1599440-07-9，根据WO 2014057687合成的，0.20g，0.42mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加二乙胺(0.15g,2.1mmol)，并且将反应混合物在室温搅拌过夜，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱法(在碳酸氢铵水溶液(0.05％)中的0-100％乙腈)直接分离，以给出白色固体(0.1g,ESI m/z:253.1)，将其添加到Fmoc-甘氨酸(0.14g,0.48mmol)和HATU(0.23g,0.59mmol)在DMF(5mL)中的混合物中，随后添加DIPEA(0.15g,0.59mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的化合物GP-2(0.14g,64％收率)。ESI m/z:554.3(M+Na)+。
实施例6K：2-({2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙酰胺基]乙酰胺基}甲氧基)乙酸(GP-3)
Figure BDA0004122749040002192
在氮保护下向化合物GP-2(0.10g,0.19mmol)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液中添加钯碳(0.10g)。将反应混合物在氢气球下在室温搅拌4小时，这通过LCMS监测。将所得混合物过滤通过硅藻土并且滤液在真空中浓缩，以给出作为白色固体的化合物GP-3(56mg,65％收率)。ESI m/z(弱):464.0(M+Na)+。
实施例6L：2-氨基-N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)乙酰胺(Gly-P3)
Figure BDA0004122749040002193
向化合物GP-3(41mg,93μmol)在无水DMF(5mL)中的溶液中依次添加HATU(39mg,0.10mmol)、依喜替康(甲磺酸盐,41mg,93μmol)和DIPEA(36mg,0.28mmol)，并且将反应混合物在室温搅拌2小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)分离，以给出作为白色固体的Fmoc-Gly-P3(50mg,63％收率,ESI m/z:859.0)，将其溶解在DMF(5mL)中。向溶液中添加二乙胺(20mg,0.27mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)分离，以给出作为白色固体的Gly-P3(TFA盐,40mg,来自依喜替康的57％收率)。ESI m/z:637.3(M+H)+。
实施例6M：(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-{[({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基]氧基]甲基}苯氧基]环氧乙烷-2-羧酸甲酯(LP12-5)
Figure BDA0004122749040002201
遵循与LP10-5相似的程序(除了用Gly-P3取代P3之外)，获得作为黄色固体的化合物LP12-5(23mg,39％收率)。ESI m/z:860.5(M–MDXD+H)+,677.4(M/2+H)+。
实施例6N：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-({2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙基}氨基甲酰基)-4-{[({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯氧基]-3,4,5-三羟基环氧乙烷-2-羧酸(LP12)
Figure BDA0004122749040002211
遵循与LP10相似的程序(除了用LP12-5取代LP10-5之外)，获得作为白色固体的接头-有效载荷LP12(3mg,27％收率)。ESI m/z:607.4(M/2+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.72(t,J＝6.5Hz,1H),8.62-8.49(m,2H),8.19(t,J＝5.1Hz,1H),7.98-7.90(m,1H),7.82-7.71(m,2H),7.53(t,J＝6.0Hz,1H),7.47-7.41(m,1H),7.37-7.28(m,2H),6.56(s,1H),5.69-5.55(m,2H),5.43(s,2H),5.20(s,3H),4.99(s,2H),4.89(d,J＝5.9Hz,1H),4.63(d,J＝6.8Hz,2H),4.31-4.23(m,1H),4.01(s,2H),3.87(d,J＝14.8Hz,1H),3.78-3.61(m,4H),3.29-3.12(m,5H),2.39(s,3H),2.26-2.10(m,4H),2.06-1.96(m,2H),1.94-1.78(m,4H),1.77-1.65(m,2H),1.61-1.42(m,3H),1.38-1.18(m,6H),0.90-0.83(m,3H)ppm。(未显示酸的质子)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111.3ppm。
实施例7：支化接头-P有效载荷(BL2P)的合成
实施例7A：支化接头关键中间体II的合成
关键中间体II如方案8以及下文实施例7A-7B中描述合成。方案9提供了合成中使用的商业起始材料。
方案8.支化接头关键中间体II的合成
Figure BDA0004122749040002221
表12.商购OSu材料Ib、Ic和Ih：
Figure BDA0004122749040002222
实施例7B：中间体II的一般程序
向活性酯I(1.0当量)在DMF(0.4M)中的溶液中添加DIPEA(3.0当量)和支化胺II-1(1.0当量)。将所得混合物在室温搅拌3小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱法(在水中的0-70％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的II-2，将其溶解在THF(0.5M)中。向溶液中添加水(VH2O:VTHF＝1:1)和氢氧化锂水合物(II-2的4当量)。将反应混合物在室温搅拌3小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱法(在水中的0-70％乙腈)直接分离，以给出作为白色固体的化合物II-3，将其溶解在水(0.1M)中。向溶液中添加乙腈(V乙腈:VH2O＝1:1)、五氟苯酚(II-3的2.0当量)和DIC(II-3的2.0当量)，并且将反应混合物在室温搅拌3小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在水中的10％-99％乙腈)直接纯化，以给出作为无色油状物的关键中间体II。
表13.起始材料II#-1和支化-接头中间体II
Figure BDA0004122749040002231
实施例7C：中间体II3f的合成方案9.支化接头中间体II3f的合成
Figure BDA0004122749040002241
2,3,4,5,6-五氟苯基1-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-12-[2-氧代-2-(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)乙基]-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酸酯(II3f)
Figure BDA0004122749040002242
向II3-1(2.6g,7.0mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中添加氢氧化钠水溶液(1.4M,20mL)，并且将反应混合物在室温搅拌4小时，这通过LCMS监测。所得混合物用稀释的盐酸水溶液(1.0M,50mL x 3)、水(100mL)和盐水(100mL)洗涤。有机溶液经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩，以给出作为无色油状物的II3f-1(2.2g,粗制)。ESI m/z:309.3(M+H)+。
向II3f-1(0.10g,粗制)在DMF(10mL)中的溶液中添加Fmoc-OSu(CAS:82911-69-1,0.11g,0.32mmol)和DIPEA(0.13g,1.0mmol)，并且将混合物在室温搅拌1小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.03％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的II3f-2(0.15g,90％收率)。ESI m/z:531.3(M+H)+。
向II3f-2(50mg,94μmol)在DCM(10mL)中的混合物中添加五氟苯酚(35mg,0.19mmol)和DIC(24mg,0.19mmol)，并且将反应混合物在室温搅拌2小时，这通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，以给出作为无色油状物的II3f(56mg,69％收率)，该无色油状物直接使用而无进一步纯化。ESI m/z:863.2(M+H)+。
实施例7D：支化接头-P3的合成
方案10.线性vcPAB接头-P(LP1、LP2、LP20、LP22、LP24)和支化vcPAB接头-P(LP24-31、LP36-38、LP41)的合成
Figure BDA0004122749040002251
实施例7E：LP24-LP42的一般程序
向中间体II(1当量)在DMF(3mM)中的溶液中添加DIPEA(10当量)和氨基接头-有效载荷(2-3当量，除了对于LP41为4.0当量之外)，并且将反应混合物在室温搅拌1小时，直到氨基接头-有效载荷被完全消耗，这通过LCMS监测。所得混合物通过制备型HPLC纯化，以提供作为白色固体的支化接头-有效载荷。
实施例7F：{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-(3-{2-[2-(2-{N-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基}乙酰胺基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP24)
Figure BDA0004122749040002261
遵循所述一般程序，从LP13(42mg,32μmol)和中间体II2b(10mg,16μmol)开始，在通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的5％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的支化接头-有效载荷LP24(20mg,44％收率)。ESI m/z:850.8(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.0(s,2H),8.81-8.78(m,2H),8.64(d,J＝5.6Hz,1H),8.50(d,J＝9.2Hz,2H),8.25(d,J＝4.8Hz,1H),8.13(d,J＝7.2Hz,2H),7.88(d,J＝8.8Hz,2H),7.78(d,J＝10.4Hz,2H),7.58(d,J＝8.4Hz,4H),7.42(t,J＝6.0Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J＝8.4Hz,4H),6.03-5.96(m,2H),5.62-5.57(m,2H),5.46-5.36(m,6H),5.24-5.14(m,4H),4.92(s,4H),4.63(d,J＝6.4Hz,4H),4.42-4.35(m,2H),4.27-4.22(m,3H),4.14(d,J＝14.4Hz,1H),4.02-3.99(m,6H),3.94(d,J＝14.0Hz,1H),3.87(s,2H),3.63-3.57(m,9H),3.51-3.46(m,8H),3.25-3.18(m,6H),3.18-3.05(m,2H),3.02-2.98(m,2H),2.98-2.89(m,2H),2.47-2.45(m,2H),2.41-2.35(m,8H),2.23-2.12(m,8H),2.03-1.91(m,4H),1.86-1.76(m,8H),1.76-1.63(m,4H),1.63-1.51(m,5H),1.45-1.32(m,6H),0.88-0.81(m,18H)ppm。(未显示CF3COOH的质子)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111,-74ppm。
实施例7G：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-(2-{N-[({2-[2-(2-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基}乙酰胺基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸(LP25)
Figure BDA0004122749040002271
遵循所述一般程序，从LP13(24mg,19μmol)和中间体II2b(4.0mg,6.4μmol)开始，在通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的支化接头-有效载荷LP25(6mg,33％收率)。ESI m/z:936.7(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.79(br s,2H),8.80(t,J＝6.4Hz,2H),8.69(br s,1H),8.51(d,J＝8.4Hz,2H),8.33-8.26(m,2H),8.18-8.14(m,2H),8.12-8.06(m,2H),7.78(d,J＝11.2Hz,2H),7.63-7.59(m,4H),7.43(t,J＝6.0Hz,2H),7.30(s,2H),7.27(d,J＝8.0Hz,4H),6.53(br s,2H),6.08-6.01(m,2H),5.62-5.57(m,2H),5.48-5.44(m,4H),5.41(s,4H),5.19(s,4H),4.92(s,4H),4.63(d,J＝6.4Hz,4H),4.37-4.31(m,4H),4.27-4.11(m,5H),4.03-3.98(m,6H),3.96-3.91(m,1H),3.86(s,2H),3.64-3.60(m,4H),3.53-3.49(m,2H),3.47-3.42(m,10H),3.25-3.18(m,8H),3.15-3.10(m,2H),3.04-2.92(m,5H),2.38(s,8H),2.21-2.11(m,12H),2.07-1.98(m,4H),1.88-1.75(m,13H),1.67-1.61(m,2H),1.57-1.53(m,2H),1.47-1.34(m,6H),0.89-0.81(m,20H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)-71.08,-111.30ppm。
实施例7H：{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{1-[2-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-N-{[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲基}-4-氧代丁酰胺基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP26)
Figure BDA0004122749040002291
遵循所述一般程序，从LP16(6.0mg,4.8μmol)和中间体II2c(2.0mg,1.6μmol)开始，在通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.01％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为浅黄色固体的支化接头-有效载荷LP26(5mg,65％收率)。ESI m/z:717.3(M/4+H)+(E环开放形式，Rt＝6.38分钟，14％)；950.2(M/3+H)+,712.9(M/4+H)+(内酯形式，Rt＝7.10min，86％)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.99(s,2H),8.80(t,J＝6.8Hz,2H),8.68-8.64(m,1H),8.50(d,J＝8.8Hz,2H),8.20(t,J＝6.4Hz,1H),8.13(d,J＝7.6Hz,2H),7.88(d,J＝8.4Hz,2H),7.78(d,J＝10.8Hz,2H),7.69(d,J＝7.6Hz,1H),7.61-7.57(m,5H),7.50-7.41(m,5H),7.37-7.26(m,9H),6.53(s,2H),5.98(t,J＝5.6Hz,2H),5.62-5.57(m,2H),5.45-5.36(m,8H),5.19(s,4H),5.01(d,J＝14.4Hz,1H),4.92(s,4H),4.63(d,J＝6.0Hz,4H),4.41-4.35(m,2H),4.23(t,J＝8.0Hz,2H),4.02(s,4H),3.95-3.81(m,3H),3.62-3.56(m,8H),3.47-3.44(m,24H),3.22-3.17(m,6H),3.05-2.98(m,2H),2.93-2.88(m,2H),2.64-2.58(m,2H),2.39-2.35(m,8H),2.22-2.11(m,6H),2.00-1.82(m,9H),1.79-1.53(m,9H),1.49-1.31(m,6H),0.86-0.81(m,18H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
实施例7I：(9H-芴-9-基)甲基N-[1-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)-2-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基]氨基甲酸酯(LP27f)
Figure BDA0004122749040002301
遵循所述一般程序，从LP13(67mg,58μmol)和中间体II3f(16mg,19μmol)开始，在通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.05％)中的0-100％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的化合物LP27f(21mg,39％收率)。ESI m/z:1392.2(M/2+H)+。
实施例7J：{4-[(2S)-2-[(2S)-2-{3-[2-(2-{1-氨基-12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺基}乙氧基)乙氧基]丙酰氨基}-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸酯(LP27)
Figure BDA0004122749040002311
向化合物LP27f(21mg,7.5μmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加二乙胺(3mg,38μmol)，并且将混合物在室温搅拌2小时，直到根据LCMS完全去除Fmoc。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)分离，以给出作为白色固体的LP27(12mg,60％收率)。ESI m/z:1280.9(M/2+H)+,854.3(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.02(s,1H),8.84-8.77(m,2H),8.51(d,J＝9.0Hz,2H),8.24-8.14(m,3H),8.10-8.04(m,2H),7.91(d,J＝9.0Hz,2H),7.78(d,J＝11.1Hz,2H),7.63-7.55(m,3H),7.46-7.40(m,2H),7.32-7.24(m,4H),6.53(s,2H),6.05-5.99(m,2H),5.65-5.55(m,3H),5.43(dd,J＝11.8,1.3Hz,6H),5.19(s,3H),4.92(s,3H),4.70-4.55(m,3H),4.40-4.35(m,2H),4.26-4.20(m,2H),4.01(s,3H),3.70-3.37(m,42H),3.25-3.21(m,5H),3.16(s,6H),3.05-2.98(m,3H),2.97-2.89(m,4H),2.69-2.62(m,3H),2.42-2.30(m,9H),2.22-2.11(m,5H),2.00-1.92(m,3H),1.88-1.79(m,4H),1.74-1.65(m,3H),1.63-1.54(m,3H),1.49-1.27(m,7H),0.91-0.78(m,11H)ppm。(未显示TFA的质子)。
实施例7K：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{3-[2-(2-{12-[({2-[2-(2-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}丁酸(LP28)
Figure BDA0004122749040002321
遵循所述一般程序，从LP14(17mg,13μmol)和中间体II3b(4.0mg,5.0μmol)开始，在通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的支化接头-有效载荷LP28(TFA盐,5mg,34％收率)。ESI m/z:995.2(M/3+H)+.1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.82(s,2H),8.81(t,J＝6.4Hz,2H),8.52(d,J＝8.8Hz,2H),8.19-8.14(m,4H),8.07(d,J＝8.4Hz,2H),7.78(d,J＝10.8Hz,2H),7.61(d,J＝8.4Hz,4H),7.43(t,J＝5.6Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J＝8.4Hz,4H),6.48(br s,2H),6.01(br s,2H),5.63-5.57(m,2H),5.43-5.40(m,4H),5.21-5.16(m,4H),4.93(s,4H),4.63(d,J＝6.4Hz,4H),4.42-4.33(m,4H),4.30-4.25(m,2H),4.24-4.19(m,2H),4.02(s,4H),3.90-3.85(m,2H),3.48-3.73(m,2H),3.69(br s,4H),3.64-3.60(m,8H),3.58-3.55(m,6H),3.52-3.50(m,8H),3.29-3.24(m,8H),3.03-3.00(m,2H),2.97-2.94(m,2H),2.40-2.37(m,8H),2.26-2.15(m,14H),2.09-2.00(m,6H),1.93-1.81(m,12H),1.79-1.70(m,8H),1.66-1.55(m,6H),1.49-1.34(m,8H),0.90-0.81(m,20H)ppm。(未显示COOH和TFA的质子)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-71.08,-111.30ppm。
实施例7L：(4R)-4-[3-(2-{2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-4-氧代丁酰胺基)-12-[({2-[2-(2-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸(LP30)
Figure BDA0004122749040002341
遵循所述一般程序，从LP14(16mg,12μmol)和中间体II3c(4.0mg,4.3μmol)开始，在通过制备型HPLC(在水中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的支化接头-有效载荷LP30(5mg,37％收率)。ESI m/z:786.4(M/4+H)+(均为E环开放形式，Rt＝5.65min，34％)；781.8(M/4+H)+(单E环开放形式，Rt＝5.95min，43％)；777.3(M/4+H)+，1036.2(M/3+H)+(内酯形式，Rt＝6.32min，19％)。
实施例7M：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{3-[2-(2-{12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-1-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}丁酸(LP31f)
Figure BDA0004122749040002351
遵循所述一般程序，从LP15(28mg,22μmol)和中间体II3f(7.0mg,8.8μmol)开始，在通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的化合物LP31f(20mg,75％收率)。ESI m/z:761.0(M/4+H)+(内酯形式)。
实施例7N：(4S)-4-{3-[2-(2-{1-氨基-12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸(LP31)
Figure BDA0004122749040002361
向化合物LP31f(20mg,6.6μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加哌啶(6.0mg,66μmol)，并且将反应混合物在室温搅拌1小时，直到根据LCMS完全去除Fmoc。混合物通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的LP31(TFA盐，13mg，70％收率)。ESI:940.5(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.05(br s,2H),8.80(t,J＝7.2Hz,2H),8.51(d,J＝8.8Hz,2H),8.19(d,J＝7.2Hz,2H),8.09(d,J＝8.4Hz,2H),7.80-7.75(m,7H),7.58(d,J＝8.4Hz,4H),7.42(t,J＝5.6Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J＝8.8Hz,4H),7.12-6.98(s,1H),6.53(br s,2H),6.04-6.58(m,2H),5.62-5.57(m,2H),5.46-5.40(m,6H),5.21-5.16(m,4H),4.92(s,4H),4.62(d,J＝6.4Hz,4H),4.40-4.32(m,4H),4.19(d,J＝7.6Hz,2H),4.01(s,4H),3.63-3.55(m,18H),3.50-3.46(m,10H),3.27-3.26(m,2H),3.02-2.92(m,8H),2.45-2.31(m,16H),2.26-2.15(m,10H),2.00-1.95(m,2H),1.91-1.80(m,8H),1.73-1.66(m,4H),1.61-1.56(m,2H),1.46-1.31(m,6H),0.89-0.80(m,22H)ppm。(未显示COOH和TFA的质子)。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-73.74,-111.29ppm。
实施例7O：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{3-[2-(2-{12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺基}乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}丁酸(LP32)
Figure BDA0004122749040002371
遵循所述一般程序，从II3b(5.0mg,6.9μmol)和LP15(22mg,17μmol)开始，在通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP32(12mg,62％收率)。ESI m/z:995.5(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(br s,2H),8.80(t,J＝6.4Hz,2H),8.51(d,J＝9.2Hz,2H),8.19(d,J＝7.2Hz,2H),8.09(d,J＝8.0Hz,2H),8.02(t,J＝6.0Hz,2H),7.80-7.75(m,4H),7.58(d,J＝8.4Hz,4H),7.43(d,J＝6.0Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J＝8.0Hz,4H),6.53(s,2H),6.01(br s,2H),5.62-5.57(m,2H),5.46-5.40(m,8H),5.19(s,4H),4.92(s,4H),4.62(d,J＝6.4Hz,4H),4.40-4.32(m,4H),4.29-4.25(s,1H),4.19(d,J＝7.2Hz,2H),4.01(s,4H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.63-3.57(m,8H),3.51-3.45(s,22H),3.27-3.22(m,10H),3.16(s,4H),3.05-3.00(m,3H),2.96-2.92(m,2H),2.68-2.64(m,2H),2.38(s,8H),2.24-2.15(m,10H),1.97-1.90(m,4H),1.86-1.81(m,6H),1.72-1.67(m,4H),1.61-1.55(m,4H),1.45-1.35(m,6H),1.25-1.21(m,2H),0.89-0.81(m,22H)ppm。(未显示COOH的质子)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111.29ppm。
实施例7P：(4S)-4-[3-(2-{2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-4-氧代丁酰胺基)-12-[({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)甲基]-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酸(LP34)
Figure BDA0004122749040002381
遵循所述一般程序，从II3c(2.8mg,3μmol)和LP15(12mg,9μmol)开始，在通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP34(4mg,43％收率)并且回收LP15(3mg)。ESI m/z:629.3(M/5+H)+，786.5(M/4+H)+(均为E环开放形式，Rt＝5.70min，4％)；1042.2(M/3+H)+,781.8(M/4+H)+(单E环开放形式，Rt＝5.98min，28％)；1036.1(M/3+H)+，777.4(M/4+H)+(Rt＝6.33min，65％)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(s,2H),8.80(t,J＝6.4Hz,2H),8.50(d,J＝8.0Hz,2H),8.18(d,J＝9.6Hz,2H),8.08(d,J＝8.0Hz,2H),8.00(d,J＝5.6Hz,2H),7.80-7.74(m,4H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.62-7.57(m,4H),7.50-7.41(m,6H),7.37-7.26(m,10H),6.53(s,2H),5.98(t,J＝5.6Hz,2H),5.64-5.57(m,2H),5.44-5.41(m,7H),5.20(s,4H),5.02(d,J＝14.4Hz,1H),4.92(s,4H),4.63(d,J＝6.0Hz,4H),4.41-4.32(m,4H),4.21-4.17(m,2H),4.02(s,4H),3.62-3.58(m,8H),3.58-3.46(m,16H),3.26-3.22(m,6H),3.19-3.15(m,4H),3.11-3.00(m,4H),2.96-2.91(m,2H),2.67-2.61(m,2H),2.41-2.38(m,11H),2.25-2.13(m,13H),2.03-1.93(m,4H),1.88-1.78(m,8H),1.74-1.53(m,10H),1.48-1.32(m,6H),0.88-0.81(m,18H)ppm。(未显示COOH的质子)。
实施例7Q：(4R)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-(3-{3-[2-({2-[2-(2-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)乙氧基]-2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]丙氧基}丙酰胺基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸(LP36)
Figure BDA0004122749040002401
遵循所述一般程序，从II4b(3.0mg,4.1μmol)和LP14(13mg,10μmol)开始，在通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP36(TFA盐,5mg,38％收率)。ESI m/z:970.8(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ12.07(br s,2H),9.80(s,2H),8.81(t,J＝6.4Hz,2H),8.51(d,J＝8.8Hz,2H),8.16(t,J＝6.8Hz,4H),8.08(d,J＝7.6Hz,2H),7.93(d,J＝5.2Hz,2H),7.78(d,J＝10.8Hz,2H),7.63-7.59(m,4H),7.44(t,J＝5.6Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,1H),7.30(s,2H),7.27(d,J＝8.4Hz,4H),6.54(s,2H),6.00(t,J＝5.6Hz,2H),5.63-5.57(m,2H),5.46-5.40(m,8H),5.19(m,4H),4.92(s,4H),4.63(d,J＝6.4Hz,4H),4.41-4.32(m,4H),4.29-4.25(m,1H),4.23-4.19(m,2H),4.01(s,4H),3.90-3.85(m,1H),3.79-3.74(m,1H),3.63-3.60(m,4H),3.59-3.55(m,6H),3.52-3.49(m,2H),3.46-3.42(m,8H),3.21-3.16(m,6H),3.05-2.89(m,6H),2.40-2.36(m,8H),2.33-2.28(m,6H),2.26-2.13(m,12H),2.09-2.01(m,4H),1.92-1.80(m,8H),1.79-1.70(m,6H),1.64-1.55(m,4H),1.46-1.34(m,6H),0.89-0.81(m,23H)ppm。(未显示TFA的质子)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-75,-111ppm。
实施例7R：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-(3-{3-[2-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)乙氧基]-2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]丙氧基}丙酰胺基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸(LP37)
Figure BDA0004122749040002411
遵循所述一般程序，从II4b(3.0mg,4.1μmol)和LP15(13mg,10μmol)开始，在通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP37(TFA盐,4mg,31％收率)。ESI m/z:970.6(M/3+H)+。
实施例7S：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-(3-{3-[2-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)乙氧基]-2-[3-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]丙氧基}丙酰胺基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸(LP38)
Figure BDA0004122749040002421
/>
遵循所述一般程序，从II4Ab(6.0mg,6.9μmol)和LP15(22mg,17μmol)开始，在通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.05％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP38(6.5mg,31％收率)。ESI m/z:1024.3(M/3+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(s,2H),8.80(t,J＝6.4Hz,2H),8.51(d,J＝8.4Hz,2H),8.19(d,J＝6.0Hz,2H),8.09(d,J＝7.6Hz,2H),7.93(t,J＝4.8Hz,2H),7.79(s,1H),7.78-7.73(m,4H),7.64-7.61(m,1H),7.58(d,J＝8.4Hz,4H),7.43(d,J＝5.6Hz,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J＝8.4Hz,4H),6.53(s,2H),6.01(br s,2H),5.62-5.57(m,2H),5.46-5.40(m,8H),5.19(s,4H),4.92(s,4H),4.62(d,J＝6.4Hz,4H),4.40-4.32(m,4H),4.29-4.25(m,1H),4.19(d,J＝7.6Hz,2H),4.01(s,4H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.63-3.55(m,17H),3.47(s,12H),3.27-3.23(m,4H),3.21-3.17(m,6H),3.04-3.00(m,2H),2.96-2.92(m,2H),2.38(s,8H),2.36-2.29(m,10H),2.25-2.14(m,12H),1.99-1.94(m,2H),1.90-1.81(m,8H),1.76-1.67(m,6H),1.61-1.55(m,4H),1.46-1.35(m,6H),0.89-0.81(m,22H)ppm。(未显示COOH的质子)19FNMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
实施例7T：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-(3-{2-[2-(3-{3-[2-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)乙氧基]-2-{[2-({2-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酰基)乙氧基]甲基}-2-[3-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]丙氧基}丙酰胺基)乙氧基]乙氧基}丙酰胺基)丁酸(LP41)
Figure BDA0004122749040002441
遵循所述一般程序，从II5Ab(5.0mg,4.8μmol)和LP15(24mg,19μmol,4当量)开始，在通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.1％)中的10％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的接头-有效载荷LP41(7.1mg,33％收率)。ESI m/z:1107.6(M/4+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(br s,3H),8.80(t,J＝6.8Hz,3H),8.50(d,J＝8.8Hz,3H),8.20(d,J＝6.4Hz,3H),8.09(d,J＝7.6Hz,3H),7.94-7.90(m,3H),7.77(d,J＝10.8Hz,6H),7.58(d,J＝8.4Hz,6H),7.42(d,J＝6.4Hz,3H),7.30(s,3H),7.27(d,J＝8.4Hz,6H),6.52(s,3H),6.01(br s,3H),5.62-5.57(m,3H),5.46-5.40(m,13H),5.20-5.16(m,6H),4.92(s,6H),4.62(d,J＝6.0Hz,6H),4.40-4.32(m,6H),4.19(t,J＝7.6Hz,3H),4.01(s,6H),3.89-3.84(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.64-3.51(m,30H),3.47(s,15H),3.40-3.36(m,9H),3.26-3.24(m,3H),3.21-3.17(m,9H),3.03-3.00(m,3H),2.96-2.91(m,3H),2.43-2.41(m,3H),2.38(s,9H),2.36-2.28(m,15H),2.25-2.20(m,9H),2.18-2.14(m,6H),1.98-1.94(m,3H),1.87-1.81(m,9H),1.74-1.70(m,3H),1.60-1.56(m,3H),1.43-1.35(m,6H),0.88-0.79(m,33H)ppm。(未显示COOH的质子)19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111ppm。
方案11.LP39的合成
Figure BDA0004122749040002451
实施例7U：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{3-[3-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-甲氧基-4-氧代丁基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[3-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]丙氧基]丙酰胺基}丁酸甲酯(LP39-1)
Figure BDA0004122749040002461
/>
向化合物II4Ab(0.13g,0.15mmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加DIPEA(58mg,0.45mmol)和LEvcPAB(78mg,0.15mmol)，并且将反应混合物在室温搅拌3小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-65％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的化合物LP39-1。ESI m/z:784.5(M/2+H)+。
实施例7V：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{3-[3-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-甲氧基-4-氧代丁基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[3-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]丙氧基]丙酰胺基}丁酸甲酯(LP39-2)
Figure BDA0004122749040002462
向化合物LP39-1(0.15g,92μmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加DMAP(11mg,92μmol)、DIPEA(36mg,0.28mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(85mg,0.28mmol)，并且将反应混合物在室温搅拌3小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在水中的0-65％乙腈)直接分离，以给出作为白色固体的化合物LP39-2(0.10g，57％收率)。ESI m/z:950.0(M/2+H)+。
实施例7W：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{3-[3-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-甲氧基-4-氧代丁基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[3-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]丙氧基]丙酰胺基}丁酸甲酯(LP39-3)
Figure BDA0004122749040002471
向化合物LP39-2(65mg,34μmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加DIPEA(22mg,0.17mmol)和有效载荷P3(50mg,86μmol)，并且将反应混合物在室温搅拌1小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-65％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的化合物LP39-3(44mg,85％收率)。ESI m/z:927.2(M/3+H)+。
实施例7X：(4S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-4-{3-[3-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3-羧丙基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[3-(2-{2-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺基]丙氧基]丙酰胺基}丁酸(LP39)
Figure BDA0004122749040002481
向LP39-3(50mg,18μmol)在THF(2mL)中的溶液中添加氢氧化锂水溶液(0.08M,2mL)，并且将反应混合物在室温搅拌1小时，这通过LCMS监测。混合物通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.1％)中的10-95％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的LP39(13mg,26％收率)。ESI m/z:917.7(M/3+H)+。1HNMR(400MHz,DMSOd6)δ10.03(s,2H),8.79(t,J＝9.2Hz,2H),8.50(d,J＝9.2Hz,2H),8.17(d,J＝6.8Hz,2H),8.07(d,J＝5.2Hz,2H),7.80-7.75(m,4H),7.74-7.70(m,1H),7.58(t,J＝8.4Hz,4H),7.45-7.40(m,2H),7.30(s,2H),7.27(d,J＝7.6Hz,4H),6.52(s,2H),6.01-6.95(m,2H),5.64-5.56(m,2H),5.46-5.39(m,8H),5.21-5.16(m,4H),4.92(s,4H),4.62(d,J＝5.6Hz,4H),4.40-4.32(m,4H),4.30-4.25(m,1H),4.22-4.16(m,2H),4.01(s,4H),3.90-3.84(m,1H),3.78-3.72(m,1H),3.64-3.55(m,10H),3.47(s,4H),3.43-3.39(m,3H),3.26-3.23(m,3H),3.17-3.12(m,2H),3.05-3.00(m,2H),2.96-2.91(m,2H),2.38(s,9H),2.35-2.30(m,5H),2.26-2.15(m,12H),2.00-1.95(m,2H),1.89-1.80(m,7H),1.73-1.66(m,5H),1.62-1.52(m,5H),1.47-1.31(m,6H),0.90-0.79(m,21H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-73.16,-111.30ppm。
方案12.不对称支化肽接头-有效载荷LP23的合成
Figure BDA0004122749040002501
实施例7Y：(2S)-2-[2-(2-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙酰胺基)乙酰胺基]-3-苯基丙酸(LP23-1)
Figure BDA0004122749040002511
遵循与LP9-2相似的程序(除了用Id取代Ib之外)，在通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-50％乙腈)纯化之后获得作为无色油状物的接头LP23-1(88mg,53％收率)。ESI m/z:691.4(M+H)+。
实施例7Z：1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-{[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(LP23-2)
Figure BDA0004122749040002512
遵循与LP9相似的程序(除了用LP23-1取代LP9-2之外)，获得作为浅黄色固体的接头-有效载荷LP23-2(47mg,46％收率)。ESI m/z:494.4(MDxd+1)+。
实施例7AA：(2S)-2-(2-{2-[(2R)-6-叠氮基-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酸(LP23-4)
Figure BDA0004122749040002513
向化合物LP23-3(CAS:159610-89-6,0.39g,1.0mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液中添加HATU(0.38g,1.0mmol)，并且将溶液在室温搅拌5分钟，然后添加LP01-1(0.30g,1.0mmol)和DIPEA(0.26g,2.0mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，这通过LCMS监测。然后所得溶液通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-90％乙腈)纯化，以提供作为白色固体的化合物LP23-4(0.50g,76％收率)。ESI m/z:656.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ12.77(s,1H),8.18-8.12(m,2H),8.00(d,J＝5.2Hz,1H),7.90(d,J＝7.6Hz,2H),7.73(t,J＝6.8Hz,2H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),7.44-7.40(m,2H),7.35-7.31(m,2H),7.29-7.19(m,5H),4.47-4.40(m,1H),4.34-4.20(m,3H),4.04-3.98(m,1H),3.77-3.64(m,4H),3.31(t,J＝6.8Hz,2H),3.07-3.02(m,1H),2.91-2.85(m,1H),1.75-1.65(m,1H),1.60-1.50(m,3H),21.42-1.28(m,2H)ppm。
实施例7AB：(9H-芴-9-基)甲基N-[(1R)-5-叠氮基-1-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基]氨基甲酰基]-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基]戊基]氨基甲酸酯(LP23-5)
Figure BDA0004122749040002521
遵循与LP9相似的程序(除了用LP23-4取代LP9-2之外)，获得作为浅黄色固体的接头-化合物LP23-5(60mg,64％收率)。ESI m/z：未检测到任何质量。
实施例7AC：1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-[(1R)-1-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基]氨基甲酰基]-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)-5-[4-({[14-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基]氨基甲酰基]-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基]氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛[d][1,2,3]三唑-1-基]戊基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(LP23)
Figure BDA0004122749040002531
在室温将LP23-5(45mg,38μmol)和LP23-2(47mg,38μmol)在DMSO(3mL)中的黄色溶液搅拌48小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-50％乙腈)直接纯化，以给出浅黄色固体(60mg,ESI m/z:494,Rt＝1.88min.)，将其溶解在DMF(1.8mL)中。向溶液中添加二乙胺(0.2mL)，并且将反应混合物在室温搅拌半小时，直到根据LCMS完全去除Fmoc。混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-50％乙腈)分离，以给出浅黄色固体(30mg,ESI m/z:494,Rt＝1.63min.)，将20mg的该浅黄色固体溶解在无水DMF(4mL)中。向其中添加DIPEA(2.3mg,18μmol)和Id(4.7mg,8.9μmol)在无水DMF(1mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌6小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的粗制LP23(62％纯度)，该粗制LP23通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.01％)中0-100％乙腈)进一步纯化，以给出作为白色固体的纯的LP23(2.5mg,3.5％收率)。ESI m/z:887.6(M/3+H)+。1HNMR(400MHz,DMSOd6)δ8.63(t,J＝6.8Hz,2H),8.50(d,J＝9.2Hz,2H),8.33-8.27(m,2H),8.18-8.09(m,4H),8.05-7.95(m,3H),7.81-7.75(m,3H),7.59(t,J＝6.0Hz,1H),7.31(s,2H),7.26-7.14(m,10H),7.09(s,0.5H),6.97(s,0.5H),6.52(brs,2H),5.62-5.57(m,2H),5.41(s,4H),5.19(s,4H),4.75-4.72(m,1H),4.64(d,J＝6.4Hz,4H),4.52-4.43(m,2H),4.30-4.18(m,4H),4.02(s,4H),3.88-3.84(m,1H),3.79-3.76(m,3H),3.73-3.68(m,9H),3.62-3.56(m,4H),3.51-3.49(m,12H),3.48-3.46(m,14H),3.27-3.23(m,4H),3.19-3.09(m,3H),3.04-2.99(m,2H),2.96-2.90(m,1H),2.81-2.72(m,4H),2.63-2.60(m,2H),2.39-2.37(m,8H),2.22-2.13(m,5H),2.08-1.97(m,3H),1.93-1.80(m,9H),1.78-1.69(m,6H),1.61-1.47(m,6H),1.31-1.24(m,6H),1.10-1.02(m,1H),0.87(t,J＝7.6Hz,,6H)ppm。19FNMR(400MHz,DMSOd6)-73(TFA),-111(Ar-F)ppm。
方案13.支化肽接头-有效载荷LP35的合成
Figure BDA0004122749040002541
实施例7AD：(2S)-2-[2-(2-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}乙酰胺基)乙酰胺基]-N-({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)-3-苯基丙酰胺(LP35-2)
Figure BDA0004122749040002551
向LP01f(74mg,70μmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加二乙胺(26mg,0.35mmol)。将混合物在室温搅拌2小时，直到根据LCMS完全去除Fmoc。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)分离，以给出白色固体(58mg,ESI m/z:841.4(M+H)+)，将其溶解在DMF(5mL)中。向溶液中依次添加化合物LP35-1(28mg,69μmol)、DIPEA(18mg,0.14mmol)和HATU(40mg,0.10mmol)，并且将反应混合物在室温搅拌4小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的0-100％乙腈)分离，以给出白色固体(54mg,ESI m/z:729.3(M–MDxd+H)+)，将其溶解在DMF(5mL)中。向溶液中添加二乙胺(16mg,0.22mmol)，并且将混合物在室温搅拌2小时，直到根据LCMS完全去除Fmoc。所得混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的LP35-2(40mg,从LP01f的57％收率)。ESI m/z:1000.5(M+H)+,500.8(M/2+H)+。
实施例7AE：1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-(2-{2-[2-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)乙氧基]乙氧基}乙基)-12-{[(2-{2-[2-({[({[(1S)-1-[({[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酰基]甲基}-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺(LP35)
Figure BDA0004122749040002561
遵循与LP24相似的一般程序(除了从LP35-2(40mg,40μmol)和中间体II3b(16mg,20μmol)开始之外)，在通过制备型HPLC(在TFA水溶液(0.05％)中的5％-95％乙腈)纯化之后获得作为白色固体的支化接头-有效载荷LP35(12mg,24％收率)。ESI m/z:812.7(M/3+H)+。1HNMR(400MHz,DMSOd6)δ8.64(t,J＝6.6Hz,2H),8.52(d,J＝8.7Hz,2H),8.31(t,J＝5.9Hz,2H),8.19-8.09(m,4H),8.05-7.98(m,3H),7.77(d,J＝10.9Hz,2H),7.65-7.56(m,2H),7.31(s,2H),7.29-7.12(m,8H),6.53(s,2H),5.65-5.56(m,3H),5.42(s,3H),5.20-5.15(m,3H),4.70-4.60(m,3H),4.50-4.44(m,2H),4.30-4.22(m,2H),4.02(s,3H),3.86(d,J＝14.8Hz,2H),3.78-3.66(m,9H),3.63-3.55(m,6H),3.53-3.40(m,27H),3.27-3.19(m,6H),3.15(s,4H),3.09-3.00(m,2H),2.81-2.72(m,2H),2.70-2.63(m,2H),2.42-2.32(m,8H),2.25-2.11(m,6H),2.09-1.97(m,3H),1.94-1.68(m,9H),1.63-1.51(m,3H),1.43-1.34(m,2H),1.29-1.20(m,3H),0.87(t,J＝7.3Hz,6H)ppm。19F NMR(376MHz,DMSOd6)δ-111.24ppm。(无TFA信号)
实施例8：猝灭的接头-有效载荷qLP18、qLP29、qLP33、qLP40、qLP42猝灭的接头-有效载荷的一般合成
向接头-有效载荷(1当量)在DMF(1-5mM)中的溶液中添加氨基叠氮化物AL1(1-1.5当量)。将反应混合物在室温搅拌1-3小时，直到接头-有效载荷完全猝灭，这通过LCMS监测。然后混合物通过反相快速色谱纯化，以给出作为白色固体的猝灭的接头-P。
表13：猝灭的接头-有效载荷的化学特性
Figure BDA0004122749040002571
实施例9：用于转谷氨酰胺酶生物缀合的示例性接头L1-B
根据本公开内容的一种实施方案，接头L1-B可以是叠氮化物胺接头(AL)，其包括与抗体直接附接的胺基团、含PEG的基本结构和叠氮化物官能团(B’,n＝1)。
将两个叠氮化物胺接头与具有酶促去糖基化的WT Fc结构域的抗体或具有N297D突变的抗体的Q295残基缀合，产生可用于进一步修饰的具有两个附接点和两个叠氮化物官能团的叠氮基官能化抗体(DAR＝2n)。四个叠氮化物胺接头与Fc结构域中具有N297Q突变的抗体的Q295残基和Q297残基缀合，产生可用于进一步修饰的具有四个附接点和四个叠氮化物官能团的叠氮基官能化抗体(DAR＝4n)。非限制性示例性叠氮化物胺接头的基本组分结构在图3B中示出。作为实例合成的特定结构在下文表14中提供。
表14：作为实例合成的氨基-叠氮基接头
Figure BDA0004122749040002581
根据本公开内容的另一种实施方案，接头L1可以是支化烷基叠氮化物胺接头(BL)，包含与抗体直接附接的胺基团、含支化烷基PEG的基本结构和2个至6个叠氮化物官能团(n＝2-6)。
将两个支化烷基叠氮化物胺接头与具有酶促去糖基化的WT Fc结构域的抗体或具有N297D突变的抗体的Q295残基缀合，产生可用于进一步修饰的具有两个附接点和4-12个叠氮化物官能团(2乘以n，其中n是每个支化BL1接头上叠氮化物的数目)的叠氮基官能化抗体。四个支化烷基叠氮化物胺接头与Fc结构域中具有N297Q突变的抗体的Q295残基和Q297残基缀合，产生可用于进一步修饰的具有四个附接点和8-24个叠氮化物官能团(4乘以n)的叠氮基官能化抗体。可能的支化烷基叠氮化物胺接头的基本组分结构在图4B中列出。作为实例合成的特定结构在表15中提供。
表15：作为实例合成的支化接头
Figure BDA0004122749040002591
Figure BDA0004122749040002601
氨基-叠氮基接头AL1(CAS:134179-38-7)、AL2(CAS:951671-92-4)、AL3(CAS:957486-82-7)和AL4(CAS:857891-82-8)商购获得。氨基-四嗪接头AL10(CAS:2055646-21-2)在WO2016209062中报道，通过引用并入本文。支化接头BL7(CAS:2253947-15-6)在WO2018218004中报道，通过引用并入本文。
实施例10：AL5接头的合成
氨基-叠氮基接头AL5如下文方案14和实施例10A-10D描述合成。
方案14：氨基-叠氮基接头AL5的合成
Figure BDA0004122749040002602
实施例10A：(2S)-2-(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙烷磺酰胺基)-6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酸甲酯(AL5-3)
Figure BDA0004122749040002603
向H-Lys(Fmoc)-OMe·HCl(AL5-1,CAS:201009-98-5)(0.38g,1.0mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加三乙胺(0.30g,3.0mmol)、DMAP(0.12g,1.0mmol)和化合物AL5-2(CAS:134019-73-1)(0.25g,1.0mmol)。将反应物在室温搅拌4小时；反应完成通过LCMS监测。将混合物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为黏性油状物的化合物AL5-3(0.30g,50％收率)。ESI m/z:612.3(M+Na)+。
实施例10B：(2S)-2-(2-氨基乙烷磺酰胺基)-6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酸甲酯(AL5-4)
Figure BDA0004122749040002611
向化合物AL5-3(0.30g,0.51mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加TFA(2mL)，并且将反应混合物在RT搅拌4小时，直到完全去除Boc，这通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)纯化，以给出作为黏性油状物的化合物AL5-4(0.20g,80％收率)。ESI m/z:490.1(M+H)+。
实施例10C：(2S)-2-[2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)乙烷磺酰胺基]-6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酸甲酯(AL5-6)
Figure BDA0004122749040002612
向化合物AL5-5(0.12g,0.41mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加化合物HATU(0.16g,0.42mmol)和DIPEA(0.11g,0.85mmol)，并且将反应混合物在RT搅拌10分钟，然后添加化合物AL5-4(0.20g,0.41mmol)。将反应混合物在RT搅拌2小时。所得混合物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为无色油状物的化合物AL5-6(0.25g，80％收率)。ESI m/z:763.3(M+H)+。
实施例10D：(2S)-6-氨基-2-[2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)乙烷磺酰胺基]己酸(AL5)
Figure BDA0004122749040002621
向化合物AL5-6(25mg,33μmol)在乙醇(0.5mL)中的溶液中添加氢氧化锂水溶液(0.33M,0.5mL)，并且将反应混合物在RT搅拌2小时，这通过LCMS监测。反应用至pH 7的盐酸水溶液(1M)猝灭，并且所得混合物通过反相快速色谱(在甲酸水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)直接分离，以给出作为无色油状物的氨基-叠氮基接头AL5(5.0mg,28％收率)。ESI m/z:527.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.20(s,1H),7.90-7.80(m,2H),7.50-7.40(m,1H),3.80-3.10(m,27H),3.10-3.05(m,1H),2.80-2.75(m,1H),2.35-2.30(m,1H),1.80-1.50(m,2H),1.45-1.40(m,1H)ppm。(未显示酸质子。没有醛质子指示接头不是甲酸盐形式)。
实施例11：AL6接头的合成
氨基-叠氮基接头AL6如下文方案15和实施例11A-11B描述合成。
方案15：氨基-叠氮基接头AL6的合成
Figure BDA0004122749040002622
实施例11A：N-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙基}-5-(1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基)戊烷-1-磺酰胺(AL6-3)
Figure BDA0004122749040002623
在0℃向氨基-PEG2-叠氮化物(AL6-2)(0.41g,2.4mmol)在THF(30mL)中的溶液中添加三乙胺(0.36g,3.6mmol)，随后是化合物AL6-1(0.83g,2.6mmol,CAS:63345-34-6)。将反应混合物在30℃搅拌12小时；这通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制AL6-3(0.91g)，其用于下一步骤而无进一步纯化。ESI m/z:454.2(M+H)+。
实施例11B：5-氨基-N-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙基}戊烷-1-磺酰胺(AL6)
Figure BDA0004122749040002631
在0℃向化合物AL6-3(0.90g,1.9mmol)在乙醇(10mL)中的溶液中添加水合肼(85％,2.2g,38mmol)，并且将反应混合物在30℃搅拌2小时，这通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在甲酸水溶液(0.225％)中的10％-30％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的氨基-叠氮基接头AL6(0.18g，在从AL6-2的2个步骤中20％收率，甲酸盐)。ESI m/z:324.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.43(br s,1H),3.63-3.58(m,2H),3.57-3.51(m,4H),3.45(t,J＝5.8Hz,2H),3.41-3.36(m,2H),3.08(t,J＝5.9Hz,2H),3.03-2.95(m,2H),2.75-2.64(m,2H),1.69-1.57(m,2H),1.56-1.46(m,2H),1.44-1.33(m,2H)ppm。
实施例12：AL7接头的合成
氨基-叠氮基接头AL7如下文方案16和实施例12A-12B描述合成。
方案16：氨基-叠氮基接头AL7的合成
Figure BDA0004122749040002632
实施例12A：N-[4-({3-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}磺酰基)丁基]氨基甲酸叔丁基酯(AL7-3)
Figure BDA0004122749040002633
在25℃向化合物AL7-2(14mg,69μmol,CAS:1312309-63-9)在DCM(1.5mL)中的溶液中添加HATU(29mg,76μmol)。将所得混合物在25℃搅拌2小时，然后添加碳酸铯(49mg,0.15mmol)和化合物AL7-1(21mg,83μmol,CAS:1862014-38-7)。然后将反应混合物在25℃搅拌16小时。反应的完成通过LCMS监测。将所得混合物用DCM(8.0mL)稀释并用水(4.0mL)猝灭。两相混合物用至pH 5的硫酸氢钾水溶液(0.5M)酸化。分离有机溶液，并且用水(4.0mL)和盐水(4.0mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。剩余物通过反相快速色谱(在乙酸水溶液(0.4％)中的0-45％乙腈)纯化，以给出作为黄色固体的化合物AL7-3(15mg，45％收率)。ESI m/z:438.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.64(br s,1H),3.82-3.76(m,2H),3.75-3.66(m,6H),3.51-3.41(m,4H),3.16(br d,J＝6.9Hz,2H),2.66-2.59(m,2H),1.92-1.83(m,2H),1.65(quin,J＝7.3Hz,2H),1.45(s,9H)ppm。
实施例12B：N-(4-氨基丁烷磺酰基)-3-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙酰胺(AL7)
Figure BDA0004122749040002641
向化合物AL7-3(8.0mg,18μmol)在DCM(1.5mL)中的溶液中添加TFA(0.3μL,4.1μmol)，并且将反应混合物在20℃搅拌2小时，直到完全去除Boc，这通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在甲酸水溶液(0.225％)中的8％-28％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的氨基-叠氮基接头AL7(6.0mg，86％收率，甲酸盐)。ESIm/z:338.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ3.63-3.59(m,2H),3.57-3.53(m,4H),3.51-3.46(m,4H),2.97(br s,2H),2.79(br s,2H),2.20(t,J＝7.2Hz,2H),1.60(br s,4H)ppm。
实施例13：AL8接头的合成
氨基-叠氮基接头AL8如下文方案17和实施例13A-13C描述合成。
方案17：氨基-叠氮基接头AL8的合成
Figure BDA0004122749040002651
实施例13A：(2R)-2-氨基-3-[(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙基)二硫烷基(sulfanyl)]-3-甲基丁酸(AL8-2)
Figure BDA0004122749040002652
向化合物AL8-1(1.0g,1.8mmol,CAS:535943-48-7)在甲醇(20mL)中的溶液中添加L-青霉胺(0.78g,5.2mmol,CAS:1113-41-3)，并且将反应混合物在25℃搅拌18小时。反应的完成通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在甲酸水溶液(0.225％)中的15％-35％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的化合物AL8-2(0.52g，80％收率，甲酸盐)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ6.97(br t,J＝5.6Hz,1H),3.27(s,1H),3.21-3.12(m,2H),2.77(t,J＝6.9Hz,2H),1.45(s,3H),1.37(s,9H),1.24(s,3H)ppm。
实施例13B：(2R)-2-{3-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-[(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙基]二硫烷基]-3-甲基丁酸(AL8-4)
Figure BDA0004122749040002653
向化合物AL8-2(0.20g,0.54mmol,甲酸盐)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(0.14g,1.1mmol)和化合物AL8-3(0.20g,0.67mmol,CAS:1312309-64-0)，并且将反应混合物在25℃搅拌2小时。反应的完成通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在甲酸水溶液(0.225％)中的40％-60％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的化合物AL8-4(0.20g，73％收率)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.20-8.07(m,1H),6.91(br t,J＝5.4Hz,1H),4.50(d,J＝9.0Hz,1H),3.63-3.57(m,4H),3.56-3.52(m,2H),3.51-3.48(m,2H),3.39(br s,2H),3.18-3.12(m,2H),2.79-2.67(m,2H),2.48-2.36(m,2H),1.37(s,9H),1.35(s,3H),1.29(s,3H)ppm。
实施例13C：(2R)-3-[(2-氨基乙基)二硫烷基]-2-{3-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙酰胺基}-3-甲基丁酸(AL8)
Figure BDA0004122749040002661
向化合物AL8-4(0.25g,0.49mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液中添加TFA(2.0mL)，并且将反应混合物在25℃搅拌1小时，这通过TLC监测。将混合物在真空中浓缩，以给出作为TFA盐的粗制接头AL8(0.20g)。将粗制盐(45mg,86μmol)溶解在DMF(1mL)和甲醇(1mL)的溶剂混合物中，并且使所得溶液经历反相快速色谱(在氨水溶液(0.05％)中的12％-32％乙腈)，以提供作为白色固体的AL8(12mg,33％收率,铵盐)。ESI m/z:410.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,D2O)δ4.44(s,1H),3.82(t,J＝5.7Hz,2H),3.76-3.65(m,6H),3.55-3.47(m,2H),3.36(t,J＝6.4Hz,2H),3.09-2.95(m,2H),2.71-2.54(m,2H),1.46(s,3H),1.41(s,3H)ppm。
用于AL8 TFA盐的1H NMR(400MHz,DMSOd6):δ8.25-8.16(m,1H),7.88(br s,3H),4.56(d,J＝9.3Hz,1H),3.63-3.48(m,8H),3.43-3.36(m,2H),3.12-3.00(m,2H),2.93-2.87(m,2H),2.47-2.38(m,2H),1.37(s,3H),1.31(s,3H)ppm。
实施例14：AL9接头的合成
氨基-叠氮基接头AL9如下文方案18和实施例14A-14C描述合成。
方案18：氨基-叠氮基接头AL9的合成
Figure BDA0004122749040002671
实施例14A：N-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁基酯(AL9-2)
Figure BDA0004122749040002672
向vcPAB(0.60g,1.6mmol,CAS:159857-79-1)在DMF(5mL)中的溶液中添加HATU(0.60g,1.6mmol)、DIPEA(0.61g,4.7mmol)和AL9-1(0.41g,1.7mmol,CAS:1260092-44-1)，并且将反应混合物在25℃搅拌12小时。反应的完成通过LCMS监测。将混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在水中的0-35％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的化合物AL9-2(0.85g,86％收率)。ESI m/z:495.3(M–Boc+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ9.89(s,1H),8.10(d,J＝7.4Hz,1H),7.86(d,J＝8.5Hz,1H),7.54(d,J＝8.4Hz,2H),7.22(d,J＝8.4Hz,2H),6.70(br s,1H),6.02-5.91(m,1H),5.40(s,2H),5.08(t,J＝5.6Hz,1H),4.42(d,J＝5.4Hz,2H),4.26-4.20(m,1H),3.62-3.53(m,3H),3.07-2.88(m,6H),2.03-1.91(m,1H),1.68(br d,J＝8.9Hz,1H),1.63-1.50(m,1H),1.36(s,13H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.82(d,J＝6.8Hz,3H)ppm。
实施例14B：N-[2-(2-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[4-(叠氮基甲基)苯基]氨基甲酰基}-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁基酯(AL9-3)
Figure BDA0004122749040002681
向化合物AL9-2(0.40g,0.67mmol)在甲苯(18mL)和DMF(2mL)中的溶液中添加DBU(0.26g,1.7mmol)和DPPA(0.46g,1.7mmol)。将混合物在25℃搅拌12小时。反应的完成通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过快速硅胶色谱(在DCM中的0-12％甲醇)纯化，以给出作为白色固体的化合物AL9-3(0.32g,61％收率)。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.03(s,1H),8.14(br d,J＝6.8Hz,1H),7.87(br d,J＝8.8Hz,1H),7.63(d,J＝8.5Hz,2H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),6.78-6.66(m,1H),6.02-5.93(m,1H),5.41(s,2H),4.37(s,2H),4.24(br t,J＝7.6Hz,1H),3.63-3.52(m,3H),3.08-2.88(m,6H),2.01-1.92(m,1H),1.72-1.65(m,1H),1.65-1.59(m,1H),1.36(s,13H),0.86(br d,J＝6.8Hz,3H),0.83(br d,J＝6.6Hz,3H)ppm。
实施例14C：(2S)-2-[(2S)-2-[3-(2-氨基乙氧基)丙酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-N-[4-(叠氮基甲基)苯基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺(AL9)
Figure BDA0004122749040002682
向盐酸盐在二噁烷(4N,5mL)中的溶液中添加化合物AL9-3(0.17g,0.21mmol)，并且将所得溶液在25℃搅拌2小时，直到完全去除Boc，这通过LCMS监测。混合物通过反相快速色谱(在氨水溶液(0.05％)中的34％-74％乙腈)直接纯化，以给出作为白色固体的接头AL9(68mg,61％收率)。ESI m/z:520.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.04(s,1H),8.16(brd,J＝7.4Hz,1H),7.90(br d,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝8.5Hz,2H),7.31(d,J＝8.5Hz,2H),6.06-5.94(m,1H),5.42(s,2H),4.44-4.33(m,3H),4.24(br dd,J＝6.8,8.6Hz,1H),3.65-3.54(m,2H),3.07-2.90(m,2H),2.68-2.65(m,2H),2.46-2.34(m,4H),2.00-1.93(m,1H),1.81-1.21(m,6H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H)ppm。
实施例15：支化接头BL1和BL2的合成
支化接头BL1和BL2如下文方案19和实施例15A-15F描述合成。
方案19：支化接头BL1和BL2的合成
Figure BDA0004122749040002691
实施例15A：1-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-12-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酸乙酯(BL1-2)
Figure BDA0004122749040002692
向化合物BL1-1(CAS:101187-40-0)(0.29g,1.0mmol)在乙腈(50mL)中的溶液中添加溴乙酸乙酯(0.37g,2.2mmol)和碳酸钠(0.27g,2.5mmol)，并且将反应混合物在50℃搅拌16小时。反应完成通过TLC(Rf＝0.6,在DCM中的10％甲醇)监测。在冷却至RT之后，过滤混合物并且滤液在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制产物BL1-2(0.40g,86％粗制收率)，其用于下一步骤而无进一步纯化。ESI m/z:465.1(M+H)+。
实施例15B：1-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-12-(羧甲基)-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酸(BL1-3)
Figure BDA0004122749040002693
向粗制化合物BL1-2(0.23g,0.50mmol,以上获得)在甲醇(5mL)中的溶液中添加氢氧化钠水溶液(2M,5mL)。将反应混合物在RT搅拌4小时。在真空中去除甲醇，并且剩余水性溶液用盐酸盐水溶液(1N)酸化至pH 3。所得混合物用DCM(10mL×3)提取，并且合并的有机溶液经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩，以给出作为无色油状物的粗制产物BL1-3(81mg,40％收率)。ESI m/z:409.1(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ3.55-3.35(m,17H),3.08-3.06(m,4H),1.37(s,9H)ppm。
实施例15C：N-{1-[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]-2-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]甲基}-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基}氨基甲酸叔丁基酯(BL1-5)
Figure BDA0004122749040002701
向化合物BL1-3(75mg,0.18mmol)和2-叠氮基乙胺BL1-4(47mg,0.55mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加HATU(0.21g,0.55mmol)和DIPEA(0.14g,1.1mmol)，并且将反应混合物在RT搅拌4小时，这通过LCMS监测。所得混合物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的30％-90％乙腈)直接纯化，以给出作为无色油状物的化合物BL1-5(63mg，64％收率)。ESI m/z:545.3(M+H)+。
实施例15D：1-氨基-N-(2-叠氮基乙基)-12-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]甲基}-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺，TFA盐(BL1)
Figure BDA0004122749040002702
向化合物BL1-5(0.10g,0.18mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加TFA(3mL)，并且将反应混合物在RT搅拌1小时。将挥发物在真空中去除，并且剩余物通过反相快速色谱(在TFA水溶液(0.01％)中的0-100％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的支化接头BL1(25mg，31％收率，TFA盐)。ESI m/z:445.2(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ8.48(br s,2H),7.88(br s,3H),3.63-3.50(m,16H),3.42-3.38(m,4H),3.34-3.28(m,4H),3.05-2.95(m,4H)ppm。
实施例15E：N-{1-[(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酰基]-2-{[(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酰基]甲基}-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基}氨基甲酸叔丁基酯(BL2-5)
Figure BDA0004122749040002711
遵循与BL1-5相似的程序(除了用化合物BL2-4取代BL1-4之外)，获得作为无色油状物的化合物BL2-5(0.27g,74％收率)。ESI m/z:809.5(M+H)+。
实施例15F：1-氨基-N-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)-12-{[(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酰基]甲基}-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十四烷-14-酰胺(BL2)
Figure BDA0004122749040002712
遵循与BL1相似的程序(除了用BL2-5取代BL1-5之外)，在通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％乙腈)纯化之后获得作为无色油状物的支化接头BL2(94mg,39％收率)。ESI m/z:709.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ8.02(t,J＝5.6Hz,2H),3.60(t,J＝4.4Hz,4H),3.57-3.45(m,26H),3.45-3.37(m,8H),3.34(t,J＝6.0Hz,2H),3.28-3.20(m,4H),3.15(s,4H),2.70-2.60(m,4H)ppm。
实施例16：支化接头BL3的合成
支化接头BL3如下文方案20和实施例16A-16D描述合成。
方案20：氨基-叠氮基接头BL3的合成
Figure BDA0004122749040002721
实施例16A：N-[1,3-双(2-叠氮基乙氧基)-2-[(2-叠氮基乙氧基)甲基]丙烷-2-基]氨基甲酸叔丁基酯(BL3-3)
Figure BDA0004122749040002722
在-2℃至2℃向2-叠氮基乙醇(BL3-2)(1.1g,13mmol)在甲苯(6mL)中的溶液中添加DIPEA(1.9g,15mmol)和TFAA(3.7g,13mmol)，并且将反应混合物在0℃搅拌2小时。向所得混合物中添加DIPEA(1.9g,15mmol)、甲苯(6mL)和化合物BL3-1(CAS:146651-71-0)(0.24g,1.1mmol)，并且将反应混合物在40℃搅拌72小时。然后反应用吡啶(0.2mL)猝灭并且用乙酸乙酯(100mL)稀释。有机溶液用柠檬酸水溶液(1M)、碳酸氢钠水溶液(10％)、水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。剩余物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的化合物BL3-3(30mg，6.4％收率)。ESI m/z:451.0(M+Na)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ3.78(s,6H),3.66(t,J＝5.0Hz,6H),3.34(t,J＝5.0Hz,6H),1.43(s,9H)ppm。
实施例16B：1,3-双(2-叠氮基乙氧基)-2-[(2-叠氮基乙氧基)甲基]丙烷-2-胺(BL3-4)
Figure BDA0004122749040002723
向化合物BL3-3(56mg,0.13mmol)在DCM(4mL)中的溶液中添加TFA(1mL)，并且将反应混合物在RT搅拌2小时，直到完全去除Boc，这通过LCMS监测。将混合物在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制化合物BL3-4(43mg,100％粗制收率)，其用于下一步骤而无进一步纯化。ESI m/z:329.1(M+H)+。
实施例16C：N-(14-{[1,3-双(2-叠氮基乙氧基)-2-[(2-叠氮基乙氧基)甲基]丙烷-2-基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基)氨基甲酸叔丁基酯(BL3-6)
Figure BDA0004122749040002731
向化合物BL3-5(53mg,0.14mmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加HATU(69mg,0.18mmol)，并且将混合物在RT搅拌5分钟。向搅拌的溶液中依次添加粗制化合物BL3-4(43mg)(其在以上获得)在DMF(1mL)中的溶液和DIPEA(50mg,0.39mmol)。将所得混合物在RT搅拌1小时。反应的完成通过LCMS监测。反应溶液通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％乙腈)直接纯化，以给出作为无色油状物的化合物BL3-6(65mg，2个步骤中73％收率)。ESI m/z:676.4(M+H)+。
实施例16D：1-氨基-N-[1,3-双(2-叠氮基乙氧基)-2-[(2-叠氮基乙氧基)甲基]丙烷-2-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(BL3)
Figure BDA0004122749040002732
向化合物BL3-6(65mg,96μmol)在DCM(4mL)中的溶液中添加TFA(1mL)，并且将反应混合物在RT搅拌2小时，直到完全去除Boc，这通过LCMS监测。将挥发物在真空中去除，并且剩余物通过反相快速色谱(在碳酸氢铵水溶液(10mM)中的0-100％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的支化接头BL3(44mg，79％收率)。ESI m/z:576.3(M+H)+。1H NMR(500MHz,DMSOd6)δ7.25(s,1H),3.69(s,6H),3.56-3.60(m,8H),3.47-3.52(m,12H),3.44(t,J＝5.5Hz,4H),3.35-3.37(m,6H),2.76(t,J＝5.5Hz,2H),2.35(t,J＝6.5Hz,2H)ppm。
实施例17：支化接头BL4、BL5和BL6的合成
支化接头BL4、BL5和BL6如下文方案21和实施例17A-17H描述合成。
方案21：氨基-叠氮基接头BL4、BL5和BL6的合成
Figure BDA0004122749040002741
实施例17A：3-[2-(1-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-3-(2-羧基乙氧基)丙氧基]丙酸(BL4-3)
Figure BDA0004122749040002742
向化合物BL4-1(0.15g,0.64mmol,CAS:1020112-73-5)在DMF(5mL)中的溶液中添加DIPEA(0.16g,1.3mmol)和Boc-N-酰胺基-PEG4-NHS酯(BL4-2)(0.37g,0.80mmol,CAS:859230-20-9)，并且将反应混合物在25℃搅拌1小时，反应完成通过LCMS监测。将反应混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过制备型HPLC(在氢氧化氨水溶液(0.05％体积)中的20％-40％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的化合物BL4-3(0.15g，39％收率)。ESI m/z:605.2(M+Na)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.71(d,J＝8.1Hz,1H),6.75(br s,1H),4.01-3.88(m,1H),3.58(t,J＝6.3Hz,6H),3.52-3.44(m,14H),3.39-3.36(m,4H),3.09-3.02(m,2H),2.43(t,J＝6.3Hz,3H),2.32(t,J＝6.4Hz,2H),1.37(s,9H)ppm。
实施例17B：N-(14-{[1,3-双({2-[(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酰基]乙氧基})丙烷-2-基]氨基甲酰基}-3,6,9,12--四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁基酯(BL4-5)
Figure BDA0004122749040002751
向化合物BL4-3(75mg,0.13mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(0.10g,0.77mmol)、HATU(0.15g,0.39mmol)和化合物BL2-4(70mg,0.32mmol)，并且将反应混合物在25℃搅拌12个小时。反应的完成通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过制备型HPLC(在甲酸水溶液(0.225％)中的33％-53％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的化合物BL4-5(50mg，40％收率)。ESI m/z:983.6(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ4.13(quin,J＝5.4Hz,2H),3.76-3.68(m,12H),3.66-3.58(m,19H),3.56-3.46(m,12H),3.22(t,J＝5.6Hz,4H),2.54(t,J＝6.1Hz,8H),2.47(t,J＝6.3Hz,4H),1.44(s,13H)ppm。
实施例17C：1-氨基-N-[1,3-双({2-[(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酰基]乙氧基})丙烷-2-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(BL4)
Figure BDA0004122749040002752
将化合物BL4-5(30mg,31μmol)在盐酸盐在甲醇(4M,5mL)的溶液中的混合物在25℃搅拌1小时，直到完全去除Boc，这通过TLC监测(通过乙酸乙酯洗脱)。然后将反应混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过制备型HPLC(在氢氧化氨水溶液(0.05％)中的35％-55％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的支化接头BL4(15mg，33％收率)。ESI m/z:883.5(M+H)+.1HNMR(400MHz,MeODd4)δ4.17-4.08(m,2H),3.80-3.69(m,20H),3.67-3.61(m,19H),3.52-3.44(m,8H),3.15(br d,J＝4.3Hz,4H),2.58(t,J＝6.0Hz,8H),2.49(t,J＝5.9Hz,4H)ppm。
实施例17D：N-(14-{[1,3-双(2-{[2-(2-叠氮基乙氧基)乙基]氨基甲酰基}乙氧基)丙烷-2-基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁基酯(BL5-5)
Figure BDA0004122749040002761
遵循与BL4-5相似的程序(除了用BL5-4取代BL2-4之外)，获得作为无色油状物的接头-化合物BL5-5(0.10g,61％收率)。ESI m/z:807.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ7.90(t,J＝5.5Hz,2H),7.72(d,J＝8.3Hz,1H),6.78-6.70(m,1H),3.96-3.88(m,1H),3.62-3.54(m,10H),3.52-3.42(m,16H),3.41-3.35(m,10H),3.26-3.18(m,4H),3.10-3.02(m,2H),2.38-2.27(m,6H),1.37(s,9H)ppm。
实施例17E：1-氨基-N-[1,3-双(2-{[2-(2-叠氮基乙氧基)乙基]氨基甲酰基}乙氧基)丙烷-2-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(BL5)
Figure BDA0004122749040002762
向化合物BL5-5(0.10g,0.12mmol)在DCM(2mL)中的溶液中添加TFA(2mL)。将混合物在25℃搅拌1小时。反应完成通过TLC监测(用乙酸乙酯洗脱)。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过制备型HPLC(在氨水溶液(0.05％)中的35％-55％乙腈)纯化，以给出作为无色油状物的支化接头BL5(40mg，45％收率)。ESI m/z:707.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.98(br d,J＝8.0Hz,1H),6.64(br s,2H),4.22(td,J＝4.6,8.8Hz,1H),3.80-3.37(m,40H),2.89(t,J＝5.1Hz,2H),2.51(t,J＝6.0Hz,2H),2.45(t,J＝5.9Hz,4H)ppm。
实施例17F：3-[2-(1-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-3-(2-羧乙氧基)-2-[(2-羧乙氧基)甲基]丙氧基]丙酸(BL6-3)
Figure BDA0004122749040002771
遵循BL4-3相似的程序(除了用BL6-1(CAS:174362-95-9)取代BL4-1之外)，获得作为白色固体的化合物BL6-3(75mg,22％收率)。ESI m/z:685.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ3.78-3.59(m,26H),3.52(t,J＝5.6Hz,2H),3.24(t,J＝5.6Hz,2H),2.50(t,J＝6.3Hz,2H),2.41(t,J＝6.7Hz,6H),1.44(s,9H)ppm。
实施例17G：N-(14-{[1,3-双(2-{[2-(2-叠氮基乙氧基)乙基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[(2-{[2-(2-叠氮基乙氧基)乙基]氨基甲酰基}乙氧基)甲基]丙烷-2-基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁基酯(BL6-5)
Figure BDA0004122749040002772
遵循BL4-5相似的程序(除了用BL5-4取代BL2-4以及用BL6-3取代BL4-3之外)，获得作为黄色油状物的化合物BL6-5(8mg,9％收率)。ESI m/z:1022.4(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ3.72-3.49(m,40H),3.43-3.35(m,12H),3.26-3.18(m,2H),2.50-2.41(m,8H),1.44(s,9H)ppm。
实施例17H：1-氨基-N-[1,3-双(2-{[2-(2-叠氮基乙氧基)乙基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[(2-{[2-(2-叠氮基乙氧基)乙基]氨基甲酰基}乙氧基)甲基]丙烷-2-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(BL6)
Figure BDA0004122749040002781
遵循与BL5相似的程序(除了用BL6-5取代BL5-5之外)，获得作为无色油状物的支化接头BL6(4mg,55％收率)。ESI m/z:921.6(M+H)+。1HNMR(400MHz,MeCNd3)δ6.90(br s,3H),6.83(br s,1H),3.67-3.55(m,30H),3.52(br t,J＝5.6Hz,6H),3.40-3.32(m,10H),2.95(br s,2H),2.47-2.40(m,4H),2.39-2.32(m,12H)ppm。
实施例18：环糊精接头BL10的合成
环糊精接头BL10如下文方案22和实施例18A-18I描述合成。
方案22：环糊精接头BL10的合成
Figure BDA0004122749040002791
化合物BL10-1根据J.Org.Chem.,1995,60(15),4786-97合成。
实施例18A：(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13R,15R,16R,18R,20R,21R,23R,25R,26R,28R,30R,31S,32R,33S,34R,35S,36R,37S,38R,39S,40R,41S,42R)-33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十(乙酰氧基)-5,10,15,20,25,30-六({[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基})-32-(丙-2-烯-1-基氧基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31-基乙酸酯(BL10-2)
Figure BDA0004122749040002801
向化合物BL10-1(0.38g,0.22mmol)在吡啶(3mL)中的溶液中添加乙酸酐(3mL)，并且将反应混合物在80℃搅拌16小时。将反应混合物在真空中浓缩，并且棕色剩余物通过硅胶快速色谱(在石油醚中的0-100％乙酸乙酯)纯化，以给出作为白色固体的化合物BL10-2(0.41g,85％收率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.77(tdd,J＝5.7,10.9,16.8Hz,1H),5.57-5.34(m,5H),5.24-4.92(m,8H),4.78-4.60(m,5H),4.30-3.53(m,26H),3.16(dd,J＝2.9,9.9Hz,1H),2.15-1.91(m,33H),0.93-0.79(m,54H),0.10-0.03(m,36H)ppm。
实施例18B：(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十(乙酰氧基))-32-{3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丙氧基}-5,10,15,20,25,30-六({[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基})-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31-基乙酸酯(BL10-3)
Figure BDA0004122749040002802
向化合物BL10-2(8.2g,3.8mmol)在甲醇(150mL)中的溶液中添加半胱胺盐酸盐(4.3g,38mmol)，并且将反应混合物脱气并用氮气吹扫3次，并且然后在氮气保护下在紫外光(λ＝365nm)照射下在20℃搅拌24小时。然后将反应混合物在真空中浓缩，并且将剩余物溶解在DCM(100mL)中。溶液用饱和氯化铵水溶液(30mL)和水(30mL)连续洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。粗制产物通过硅胶快速色谱(在DCM中的0-20％甲醇)纯化，以给出作为白色固体的化合物BL10-3(1.5g，18％收率)。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ5.55-5.28(m,6H),5.20-5.00(m,6H),4.63-4.43(m,5H),4.28-4.15(m,4H),4.14-4.05(m,2H),4.02-3.59(m,20H),3.52-3.41(m,1H),3.32-3.09(m,2H),2.93-2.81(m,1H),2.79-2.68(m,1H),2.54(br t,J＝6.7Hz,2H),2.17-1.94(m,33H),1.87-1.59(m,2H),0.96-0.74(m,54H),0.12-0.08(m,36H)ppm。
实施例18C：(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-十(乙酰氧基)-5,10,15,20,25,30-六({[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基})-42-{3-[(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙氧基}-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31-基乙酸酯(BL10-4)
Figure BDA0004122749040002811
向化合物BL10-3(1.2g,0.54mmol)在二噁烷(20mL)中的溶液中添加FmocOSu(CAS:82911-69-1)(0.20g,0.59mmol)和三乙胺(0.16g,1.6mmol)，并且将反应混合物脱气并用氮气吹扫3次，然后在氮气保护下在20℃搅拌16小时。所得混合物用DCM(100mL)稀释，并且用饱和氯化铵水溶液(20mL)和水(20mL)连续洗涤。有机溶液经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。剩余物通过硅胶快速色谱(在DCM中的0-10％甲醇)纯化，以给出作为白色固体的化合物BL10-4(1.3g，99％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(d,J＝7.6Hz,2H),7.55(d,J＝7.6Hz,2H),7.38-7.31(m,2H),7.30-7.23(m,2H),5.52-5.29(m,6H),5.21(br d,J＝8.8Hz,1H),5.14-4.92(m,6H),4.80-4.55(m,5H),4.34(br d,J＝7.1Hz,2H),4.25-3.76(m,19H),3.72-3.53(m,7H),3.45-3.25(m,3H),3.08(dd,J＝2.8,9.9Hz,1H),2.66-2.43(m,4H),2.11-1.88(m,33H),1.72(br d,J＝4.9Hz,2H),0.94-0.72(m,54H),0.07-0.06(m,36H)ppm。
实施例18D：(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-十(乙酰氧基)-42-{3-[(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙氧基}-5,10,15,20,25,30-六(羟甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31-基乙酸酯(BL10-5)
Figure BDA0004122749040002821
向化合物BL10-4(1.3g,0.53mmol)在THF(15mL)和吡啶(15mL)中的溶液中添加吡啶氢氟酸盐(70％,3.7g,26mmol)，并且将反应混合物在20℃搅拌48小时。将所得混合物倒入饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)中，并且然后用DCM(100mL×2)提取。合并的有机溶液经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。粗制产物通过硅胶快速色谱(在DCM中的0-15％甲醇)纯化，以给出作为白色固体的化合物BL10-5(0.74g，75％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3+D2O)δ7.74(d,J＝7.6Hz,2H),7.58(d,J＝7.6Hz,2H),7.41-7.34(m,2H),7.32-7.25(m,2H),5.53-5.35(m,6H),5.25(br s,1H),5.13-4.93(m,6H),4.86-4.68(m,5H),4.47-4.30(m,2H),4.25-4.15(m,1H),4.11-3.91(m,12H),3.89-3.57(m,13H),3.51(br s,1H),3.36(br d,J＝5.9Hz,2H),3.28(br d,J＝12.0Hz,1H),2.69-2.43(m,4H),2.14-1.90(m,33H),1.81-1.64(m,2H)ppm。
实施例18E：(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-十(乙酰氧基)-42-{3-[(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙氧基}-5,10,15,20,25,30-六[(甲烷磺酰氧基)甲基]-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31-基乙酸酯(BL10-6)
Figure BDA0004122749040002831
向化合物BL10-5(0.10g,56μmol)在DCM(2mL)中的溶液中添加甲烷磺酰氯(0.15g,1.4mmol)和吡啶(0.16g,2.0mmol)，并且将反应混合物在15℃搅拌3个小时。将所得混合物倒入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)中，并且用DCM(10mL×2)提取。合并的有机溶液用盐酸水溶液(1.0N,10mL)和水(10mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。剩余物通过硅胶快速色谱(在DCM中的0-70％乙酸乙酯)纯化，以给出作为白色固体的化合物BL10-6(98mg，78％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝7.6Hz,2H),7.57(br d,J＝7.3Hz,2H),7.42-7.33(m,2H),7.32-7.25(m,2H),5.56-5.36(m,5H),5.33-5.22(m,2H),5.11-4.95(m,6H),4.91-4.75(m,5H),4.70-4.31(m,14H),4.28-4.13(m,6H),3.93-3.79(m,5H),3.73(brt,J＝9.0Hz,1H),3.63(br s,1H),3.48(br d,J＝9.8Hz,1H),3.36(br d,J＝6.4Hz,2H),3.29-3.17(m,2H),3.15-2.98(m,18H),2.70-2.42(m,4H),2.11-1.90(m,33H),1.81-1.64(br s,2H)ppm。
实施例18F：(1R,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13S,15S,16S,18S,20S,21S,23S,25S,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34S,35R,36S,37R,38S,39S,40R,41S,42R)-32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-十(乙酰氧基)-5,10,15,20,25,30-六(叠氮基甲基)-42-{3-[(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙氧基}-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31-基乙酸酯(BL10-7)
Figure BDA0004122749040002841
向化合物BL10-6(0.33g,0.15mmol)在无水DMSO(3mL)中的溶液中添加叠氮化钠(0.29g,4.4mmol)，并且将反应混合物在70℃搅拌16小时。将所得混合物倒入水(20mL)中并且用DCM(20mL×2)萃取。合并的有机溶液经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩，以给出黄色胶状物(0.31g)，将其溶解在二噁烷(3mL)中。向溶液中添加FmocOSu(73mg,0.22mmol)和三乙胺(55mg,0.55mmol)，并且将混合物脱气并用氮气吹扫3次，然后在氮气保护下在15℃搅拌16个小时。将所得混合物用饱和氯化铵水溶液(20mL)猝灭，并且用DCM(10mL×2)提取。合并的有机溶液经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩。剩余物通过硅胶快速色谱(在DCM中的0-3％甲醇)纯化，以给出作为白色固体的粗制产物(0.17g)，该粗制产物通过制备型TLC(SiO2,用在DCM中的6.25％乙醇洗脱)进一步纯化，以给出作为白色固体的化合物BL10-7(0.13g,41％收率)。HRMS ESI m/z:1924.6212(M+H)+(计算的1924.6086),1946.6057(M+Na)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝7.6Hz,2H),7.60(br d,J＝7.3Hz,2H),7.45-7.36(m,2H),7.36-7.29(m,2H),5.53-5.35(m,5H),5.28(br s,1H),5.12-4.97(m,5H),4.96-4.74(m,6H),4.40(br d,J＝7.1Hz,2H),4.24(br d,J＝6.6Hz,1H),4.12-3.91(m,6H),3.88-3.48(m,21H),3.40(br d,J＝5.9Hz,2H),3.27(br dd,J＝2.9,10.0Hz,1H),2.71-2.47(m,4H),2.11-1.95(m,33H),1.78(br s,2H)ppm。
实施例18G：(1S,3R,5R,6S,8R,10R,11S,13R,15R,16S,18R,20R,21S,23R,25R,26S,28R,30R,31R,32R,33R,34R,35R,36R,37R,38R,39R,40R,41S,42R)-42-{3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丙氧基}-5,10,15,20,25,30-六(叠氮基甲基)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41-十一醇(BL10-8)
Figure BDA0004122749040002851
向化合物BL10-7(0.11g,57μmol)在甲醇(5mL)中的溶液中添加甲酸钠(0.12g,2.3mmol)，并且将反应混合物在20℃搅拌16小时。所得混合物通过添加离子交换树脂Amberlyst(R)15(氢形式)至pH 6.0中和。将混合物过滤以除去树脂，并且将滤液在真空中浓缩。剩余物用蒸馏水(40mL)处理，并且用MTBE(20mL×3)洗涤。将水相冻干，以给出白色剩余物(52mg)，将其悬浮到乙腈(AR级，4mL)中。将白色悬浮液在超声波中研磨10分钟，以5000rpm离心15分钟，并且倾析以收集白色固体。将该过程重复3次。将所得白色固体溶解在蒸馏水(20mL)中，并且然后冻干以给出作为白色固体的化合物BL10-8(34mg,47％收率)。ESI m/z:1240.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSOd6+D2O)δ4.99(br s,1H),4.83(br s,5H),3.76(br d,J＝10.5Hz,7H),3.70-3.58(m,13H),3.53-3.42(m,6H),3.39-3.24(m,12H),2.91(brt,J＝6.5Hz,2H),2.66-2.59(m,2H),2.55-2.51(m,2H),1.75-1.60(m,2H)ppm。
实施例18H：9H-芴-9-基甲基N-[14-({2-[(3-{[(1S,3R,5R,6S,8R,10R,11S,13R,15R,16S,18R,20R,21S,23R,25R,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34R,35R,36R,37R,38R,39R,40R,41R,42R)-5,10,15,20,25,30-六(叠氮基甲基)-31,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十一烷羟基-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-32-基]氧基}丙基]硫烷基]乙基}氨基甲酰基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基]氨基甲酸酯(BL10-10)
Figure BDA0004122749040002861
向活性酯BL10-9(9.0mg,15μmol)和化合物BL10-8(19mg,15μmol)在DMF(0.3mL)中的溶液中添加DIPEA(6.0mg,46μmol)，并且将反应混合物在25℃搅拌1小时。所得混合物通过反相快速色谱(在乙酸水溶液(0.5％)中的0-70％乙腈)直接纯化两次，以给出作为白色固体的化合物BL10-10(6.7mg，24％收率)。1H NMR(400MHz,DMSOd6+D2O)δ7.89-7.83(m,2H),7.69-7.60(m,2H),7.44-7.37(m,2H),7.35-7.27(m,2H),5.04(br s,1H),4.86(br s,5H),4.30-4.18(m,3H),3.77-3.76(m,20H),3.61-3.51(m,10H),3.50-3.42(m,12H),3.36(br d,J＝5.8Hz,14H),3.28-3.08(m,6H),2.29(br t,J＝6.4Hz,2H),1.77-1.63(m,2H)ppm。
实施例18I：1-氨基-N-{2-[(3-{[(1S,3R,5R,6S,8R,10R,11S,13R,15R,16S,18R,20R,21S,23R,25R,26S,28R,30R,31S,32R,33R,34R,35R,36R,37R,38R,39R,40R,41R,42R)-5,10,15,20,25,30-六(叠氮基甲基)-31,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-十一烷羟基-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-十二氧杂庚环[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26]四十二烷-32-基]氧基}丙基]硫烷基]乙基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(BL10)
Figure BDA0004122749040002871
向化合物BL10-10(6.7mg,3.9μmol)在DMF(0.2mL)中的溶液中添加哌啶(3.3mg,39μmol)，并且将反应混合物在25℃搅拌1小时，直到完全去除Fmoc，这通过LCMS监测。所得混合物用蒸馏水(10mL)稀释并冻干。剩余的灰白色固体通过反相快速色谱(在乙酸水溶液(0.5％)中的0-70％乙腈)纯化，以给出作为白色固体的环糊精-接头BL10(2.1mg，36％收率)。ESI m/z:1488.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,MeODd4)δ5.06(d,J＝3.2Hz,1H),4.94(br d,J＝2.4Hz,5H),4.02-3.84(m,1H),4.03-3.72(m,21H),3.71-3.49(m,24H),3.47-3.34(m,9H),3.48(br s,1H),2.99(t,J＝5.1Hz,2H),2.69-2.61(m,4H),2.47(t,J＝6.0Hz,2H),1.91-1.84(m,2H)ppm。
实施例19：葡萄糖接头BL11的合成
葡萄糖接头BL11如下文方案23和实施例19A-19F描述合成。
方案23：葡萄糖接头BL11的合成
Figure BDA0004122749040002881
化合物BL11-1根据Org.Biomol.Chem.,2007,5(21),3477-3485合成。
实施例19A：2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三(丙-2-烯-1-基氧基)-6-[(丙-2-烯-1-基氧基)甲基]噁烷-2-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙烷-1-胺(BL11-2)
Figure BDA0004122749040002882
在0℃向化合物BL11-1(0.60g,1.2mmol)在THF(10mL)和水(1.5mL)中的溶液中添加三甲基膦(在THF中的1M,1.8mL,1.8mmol)，并且将反应混合物在0℃搅拌1小时，这通过TLC(用在石油醚中的25％乙酸乙酯洗脱)监测。然后将所得混合物倒入冰水(20mL)中并且搅拌2分钟。水性混合物用乙酸乙酯(30mL×3)提取。合并的有机溶液用盐水(20mL×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的粗制产物BL11-2(0.55g,87％收率)，其用于下一步骤而无进一步纯化。ESI m/z:472.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.11-5.82(m,4H),5.34-5.22(m,4H),5.22-5.06(m,4H),4.42-3.96(m,10H),3.76-3.58(m,9H),3.55-3.47(m,2H),3.44-3.29(m,3H),3.27-3.16(m,1H),2.96-2.76(m,2H)ppm。
实施例19B：9H-芴-9-基甲基N-{2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三(丙-2-烯-1-基氧基)-6-[(丙-2-烯-1-基氧基)甲基]噁烷-2-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸酯(BL11-3)
Figure BDA0004122749040002891
在氮气下，在0℃向化合物BL11-2(0.50g,1.1mmol)和DIPEA(0.41g,3.2mmol)在DCM(5mL)中的溶液中在15分钟内分批添加FmocOSu(0.43g,1.3mmol)。将混合物在20℃搅拌1小时；这通过LCMS监测。将所得混合物倒入水(20mL)中并且搅拌2分钟。水性混合物用乙酸乙酯(30mL×3)提取。合并的有机溶液用盐水(20mL×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并且在真空中浓缩。剩余物通过硅胶快速色谱(在石油醚中的0-50％乙酸乙酯)纯化，以给出作为浅黄色油状物的化合物BL11-3(0.55g，71％收率)。ESI m/z:716.3(M+Na)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.61(d,J＝7.5Hz,2H),7.44-7.37(m,2H),7.35-7.28(m,2H),6.02-5.83(m,4H),5.42(br s,1H),5.31-5.20(m,4H),5.19-5.09(m,4H),4.40-4.01(m,12H),3.75-3.54(m,11H),3.43-3.30(m,5H),3.25-3.15(m,1H)ppm。
实施例19C：9H-芴-9-基甲基N-{2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三({3-[(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙氧基})-6-({3-[(2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙氧基}甲基)噁烷-2-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸酯(BL11-5)
Figure BDA0004122749040002892
向装在石英烧瓶中的化合物BL11-3(0.20g,0.29mmol)在甲醇(8mL)中的溶液中添加Boc-半胱胺BL11-4(1.0g,5.8mmol)。将反应混合物脱气并用氩吹扫30分钟，并且然后在氮气保护下在紫外光(λ＝254nm)照射下在20℃搅拌12小时，这通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过硅胶快速色谱(在石油醚中的0-80％乙酸乙酯)纯化，以给出作为黄色油状物的化合物BL11-5(0.30g,67％收率)。ESI m/z:1425.9(M+Na)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.62(d,J＝7.5Hz,2H),7.44-7.38(m,2H),7.35-7.29(m,2H),5.04(br s,3H),4.40(br d,J＝6.8Hz,2H),4.28-4.20(m,2H),4.02-3.47(m,20H),3.41(br d,J＝4.8Hz,2H),3.35-3.15(m,11H),3.13-3.00(m,1H),2.70-2.54(m,15H),1.94-1.75(m,7H),1.45(s,36H)ppm。
实施例19D：9H-芴-9-基甲基N-{2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三({3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丙氧基})-6-({3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丙氧基}甲基)噁烷-2-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸酯(BL11-6)
Figure BDA0004122749040002901
向化合物BL11-5(0.11g,78μmol)在DCM(1.5mL)中的溶液中添加TFA(1.7g,15mmol)，并且将反应混合物在20℃搅拌1小时，直到完全去除Boc，这通过LCMS监测。将挥发物在真空中去除，以给出作为浅黄色油状物的粗制产物BL11-6(90mg,93％收率,TFA盐)。ESI m/z:1002.4(M+H)+。
实施例19E：9H-芴-9-基甲基N-{2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三({3-[(2-叠氮基乙基)硫烷基]丙氧基})-6-({3-[(2-叠氮基乙基)硫烷基]丙氧基}甲基)噁烷-2-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸酯(BL11-7)
Figure BDA0004122749040002902
在20℃向化合物BL11-6(60mg,48μmol,TFA盐)在甲醇(1mL)和水(0.5mL)中的溶液中依次添加五水合硫酸铜(0.48g,1.9μmol)、三乙胺(39mg,0.39mmol)和三氟甲磺酰叠氮化物(42mg,0.24mmol)在DCM(5mL)中的溶液。将反应混合物在20℃搅拌半小时。反应的完成通过LCMS监测。所得混合物用甘氨酸(0.5g)猝灭并且在20℃搅拌半个小时。过滤混合物，并且将滤液在DCM(30mL)与盐水(15mL)之间分配。有机溶液经无水硫酸钠干燥并且在真空中浓缩，以给出作为黄色油状物的化合物BL11-7(50mg,84％收率)，其用于下一步骤而无进一步纯化。ESI m/z:1128.4(M+Na)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝7.5Hz,2H),7.62(d,J＝7.2Hz,2H),7.44-7.38(m,2H),7.36-7.30(m,2H),5.46-5.40(m,1H),5.38-5.32(m,1H),4.40(br d,J＝6.8Hz,2H),4.27-4.18(m,2H),4.01-3.35(m,31H),3.23-3.18(m,2H),3.09(q,J＝7.3Hz,5H),2.68-2.59(m,8H),2.26-2.19(m,1H),2.06-1.97(m,2H),1.92-1.81(m,8H)ppm。
实施例19F：2-[2-(2-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三({3-[(2-叠氮基乙基)硫烷基]丙氧基})-6-({3-[(2-叠氮基乙基)硫烷基]丙氧基}甲基)噁烷-2-基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙烷-1-胺(BL11)
Figure BDA0004122749040002911
向化合物BL11-7(45mg,41μmol)在DMF(0.2mL)中的溶液中添加哌啶(35mg,0.41mmol)，并且将反应混合物在20℃搅拌0.2小时，这通过LCMS监测。将所得混合物在真空中浓缩，并且剩余物通过反相快速色谱(在甲酸水溶液(0.225％)中的40％-60％乙腈)纯化，以给出作为黄色油状物的葡萄糖接头BL11(18mg，45％收率，甲酸盐)。ESI m/z:884.5(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.52(s,1H),4.26(d,J＝7.8Hz,1H),4.06-3.97(m,1H),3.95-3.58(m,19H),3.52-3.44(m,8H),3.31-3.17(m,3H),3.12-3.06(m,1H),3.01(t,J＝4.9Hz,2H),2.78-2.64(m,18H),1.96-1.75(m,8H)ppm。
实施例20：ADC缀合
该实施例显示了根据本公开内容的实施方案的通常是有效载荷与抗体或其抗原结合片段的位点特异性缀合的方法。该方法包括图2中示出的两步方法。第一步是微生物转谷氨酰胺酶(MTG)介导的接头1(L1-B’)诸如双叠氮基烷基取代胺(BL7)或叠氮化物-PEG3-胺(AL1)与抗体的附接，其中使用过量的胺试剂以避免抗体链的潜在交联。第二步将炔烃连接的有效载荷接头有效载荷(L2P)与N3-加标签的缀合物经由应变(strain)促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)附接。向抗体中添加的L2P分子的数目取决于缀合位点的数目和L1(AL,n＝1；BL,n≥2)内叠氮化物官能团(n)的数目。对于分别具有酶促去糖基化或具有N297D Fc突变并且然后用AL或BL接头叠氮化物官能化的WT Fc结构域的抗体，预期的DAR＝2乘以n乘以m，其中n是每个L1接头上叠氮化物官能团B’的数目，并且m是L2P有效载荷的数目。对于具有N297Q Fc突变然后用AL或BL接头叠氮基官能化的抗体，预期的DAR＝4×(n)×(m)。
所有亲本抗体(Ab)，含2个、4个或8个叠氮基基团(Ab-(N3)n)的叠氮基官能化抗体、作为具体实例生成的最终ADC和对应的接头-有效载荷(L2P)，以及其ADC的ES-MS结果和DAR值总结在表16中。
表16：根据本公开内容的实施方案的抗体、抗体-接头和ADC
Figure BDA0004122749040002921
ESI-MS应根据以下近似：
对于叠氮基官能化抗体(即没有LP1)；MW＝MWAb+(#缀合位点)(MWL1-18)
对于ADC；MW＝MWAb+(#缀合位点)(MWL1-18)+(DAR)(MWLP1)
MWAL1＝218.3g/mol、MWBL7＝325.4g/mol、MWLP1＝1396.5g/mol
下文表17，提供了使用根据本公开内容的两步法生成的ADC的结构。
表17：根据本公开内容的ADC的结构
Figure BDA0004122749040002931
Figure BDA0004122749040002941
下文表18，提供了出于比较目的的使用半胱氨酸缀合方法生成的ADC的结构。
表18：比较ADC的结构
Figure BDA0004122749040002942
实施例20A：步骤1：制备包含2个、4个或8个叠氮基基团的位点特异性叠氮基官能化抗体药物缀合物(参见表19)。
将包含N297Q突变的抗HER2人类IgG抗体或同种型对照抗体与150摩尔当量的叠氮基-PEG3-胺(AL1,MW 218.26g/mol)或双叠氮基烷基取代胺(BL7,MW 325.38g/mL)混合。将所得溶液与转谷氨酰胺酶(25U/mL；每mg抗体1U mTG，Zedira,Darmstadt,Germany)混合，产生在1-20mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物在25℃-37℃孵育4-24小时，同时温和地摇动，同时通过ESI-MS监测。在完成后，过量的胺和mTG通过尺寸排阻色谱(SEC)或蛋白A柱色谱去除。缀合物通过UV-Vis、SEC和ESI-MS进行表征。叠氮基接头附接的抗体导致分别具有AL1和BL7的DAR＝4缀合物的质量增加804Da或1232Da。缀合物单体纯度根据SEC>99％。
实施例20B：步骤2：经由叠氮基官能化抗体与含炔烃的接头-有效载荷之间的1,3-环加成(“点击”)反应制备表19的位点特异性缀合物。
通过将在PBS(pH 7.4)中的叠氮基官能化抗体(1-20mg/mL)与溶解在有机溶剂诸如DMSO或DMA(10mg/mL)中以使反应混合物包含5％-15％的有机溶剂(v/v)的≥6摩尔当量的接头-有效载荷在25℃-37℃孵育1-48小时同时温和地摇动，制备位点特异性抗体药物缀合物。反应通过ESI-MS监测。在完成后，过量量的接头-有效载荷和蛋白聚集体通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC和ESI-MS表征。缀合物单体纯度根据SEC>99％。
实施例20C：抗HER2 Ab-[AL1-LP1]4和抗HER2 Ab-[(BL7)-(LP1)2]4的制备
在图4A中示出的特定实例中，将包含N297Q突变的非糖基化抗HER2人类IgG抗体与150摩尔当量的双叠氮基-烷基取代的胺(BL7,MW 325.38g/moL)混合。将所得溶液与微生物转谷氨酰胺酶(25U/mL；每mg抗体1UmTG，Zedira,Darmstadt,Germany)混合，产生在8.6mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物在37℃孵育22小时，同时温和地摇动，同时通过ESI-MS监测。在完成后，过量的胺和mTG通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。缀合物通过UV-Vis、SEC和ESI-MS进行表征。叠氮基接头附接的抗体，导致DAR＝4缀合物的质量增加1232Da。将在PBS(pH7.4)中的位点特异性抗体叠氮基缀合物(8.6mg/mL)与在10mg/mL的DMA中的20摩尔当量的接头-有效载荷(LP1)混合以使反应混合物包含12％有机溶剂(v/v)，并且将溶液在32℃放置36小时，同时温和地摇动。反应通过ESI-MS监测。在完成后，过量量的接头-有效载荷和蛋白聚集体通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC和ESI-MS表征。缀合物单体纯度根据SEC为99.8％。药物附接的抗体导致DAR＝8缀合物的质量增加11185Da。
实施例20D：抗HER2/HER2双特异性抗体-药物缀合物BIS1和BIS2-Ab-[(BL7)-(LP1)2]4的制备
在以上实施例18A-18C中相似描述的条件下合成包括抗HER2双特异性抗体的两种抗体-药物缀合物，其中抗体结合HER2的两个不同表位，以形成BIS1和BIS2(表20)。两种双特异性抗体(抗HER2/HER2 Ab1和抗HER2/HER2 Ab2)各自具有结合HER2的单独表位的两个结合结构域。在该实施例中，根据如以上描述的程序，抗体被酶促去糖基化，以用BL7接头在两个重链Fc Q295谷氨酰胺残基处实现位点特异性叠氮基官能化。两种双特异性抗体-药物缀合物BIS1和BIS2的观察到的DAR(基于细胞毒性剂)在表20中提供。
表20.抗体药物缀合物DAR
Figure BDA0004122749040002961
实施例21：ADC缀合：三种方法
在抗体Q295/297位点上生成DAR4 ADC至DAR24 ADC的位点特异性ADC缀合描绘于图5中并且在抗体Q295位点上生成DAR2 ADC至DAR12 ADC的位点特异性ADC缀合描绘于图6。本公开内容描绘了将支化接头-有效载荷附接至抗体Q295/297位点的三种示例性方法。
方法I和II包括抗体-药物缀合的两步方法。第一步是微生物转谷氨酰胺酶(MTG)介导的小分子胺例如AL1或BL2与mAb-Q位点的附接，其中过量的胺试剂用于避免抗体链的潜在交联(WO2017/147542，通过引用以其整体并入本文)。第二步是将炔烃连接的接头有效载荷(L2P)与N3-加标签的缀合物经由例如应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC，又名无铜点击化学)附接。在反应性基团(RG)是DIBAC或COT部分的情况下，经由[2+3]环加成与叠氮基官能化抗体进行缀合。这一方法提供了位点特异性和化学计量的缀合物。向抗体中添加的L2P分子的数目取决于缀合位点的数目和L1(例如，对于AL,n＝1；对于BL,n≥2)内叠氮化物官能团的数目(n)。
方法I是将小分子胺接头L1(例如，AL1)与抗体Q295/297位点缀合以生成抗体-叠氮基标签(Ab-N3)，然后该抗体-叠氮基标签(Ab-N3)与炔烃栓系的线性接头-有效载荷(LL2P)共价反应(例如，经由“点击”环加成)以生成4DAR ADC(图5中的方法A)以及与炔烃栓系的支化接头-有效载荷(BL2P)共价反应(例如，经由“点击”环加成)以生成8DAR ADC(图5中的方法B)。
方法II是将小分子支化叠氮基胺(例如，BL2)与抗体Q295/297位点缀合以生成抗体支化叠氮基标签(Ab-branch-2N3)，然后该支化叠氮基标签(Ab-branch-2N3)与线性接头-有效载荷共价反应(例如，经由“点击”环加成)以生成8DARADC(图5中的方法C)以及与炔烃栓系的支化接头-2有效载荷共价反应(例如，经由“点击”环加成)以生成16DARADC或与支化栓系的-3有效载荷共价反应(例如，经由“点击”环加成)以生成24DAR ADC(图5中的方法D)。相似地，抗体Q295位点上与线性或支化接头-有效载荷的位点特异性ADC缀合可以生成DAR2 ADC至DAR12 ADC(图6)。
在方法III的缀合中，在单步MTG介导的反应中，使用≥20摩尔当量的胺试剂实现MTG介导的胺支化接头-有效载荷与抗体Q295/297位点的附接。
对于具有酶促去糖基化或具有N297D Fc突变并且然后用AL或BL接头叠氮基官能化的WT Fc结构域的抗体，2Fc上每个叠氮基标签的预期的DAR＝2n。对于用AL或BL接头叠氮基官能化的具有N297Q Fc突变的抗体，2Fc上每个叠氮基标签的预期的DAR＝4n。对于与具有m×有效载荷(Pm)的每个接头-有效载荷缀合的抗体，对于N297D突变抗体的预期的ADC-DAR＝(2n×m)(图6)和对于N297Q突变抗体的预期的ADC-DAR＝(4n×m)(图5)。
经由2步缀合(图5中的方法A、B、C、D)缀合的所有ADC总结于表21中并且经由1步缀合(图5中的方法E)缀合的ADC总结于表22中。
以两步制备位点特异性缀合物的一般程序
实施例21A：步骤1：制备包含2个、4个或8个叠氮基基团的位点特异性叠氮基官能化抗体药物缀合物。
将在BupH缓冲液(pH 7.4)中的包含N297Q突变或N297D突变的非糖基化人类抗体IgG(IgG1、IgG4等)与>＝150摩尔当量的叠氮基-PEG3-胺(AL1)或双叠氮基-烷基取代胺(BL2)混合。将所得溶液与转谷氨酰胺酶(25U/mL；每mg抗体1U mTG，Zedira,Darmstadt,Germany；或10U/mL；每mg抗体5.5U MTG，Modernist Pantry-ACTIVATI包含来自Ajinomoto,Japan的麦芽糖糊精)混合导致在0.5-20mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物在25℃-37℃孵育24小时，同时温和地摇动，同时通过ESI-MS监测。在完成后，过量的胺和mTG通过尺寸排阻色谱(SEC)或蛋白A柱色谱去除。缀合物通过UV-Vis、SEC和ESI-MS进行表征。与抗体附接的叠氮基接头导致分别具有AL1以及BL2的4DAR缀合物的质量增加804Da或1232Da，以及8DAR抗体-BL2-(叠氮化物)8缀合物的质量增加2768Da。缀合物的单体纯度根据SEC>99％。
实施例21B：步骤2：经由叠氮基官能化抗体与含炔烃的接头-有效载荷之间的[2+3]点击反应制备位点特异性缀合物。
具有人类IgG(IgG1、IgG4等)的位点特异性抗体药物缀合物通过叠氮基官能化抗体与炔烃官能化接头-有效载荷之间的[2+3]叠氮化物-炔烃“点击”反应制备。将在PBS(pH7.4)中的叠氮基官能化抗体(1-20mg/mL)与溶解在有机溶剂诸如DMSO或DMA(10mg/mL)中以使反应混合物包含5％-15％的有机溶剂(v/v)的≥6摩尔当量的接头-有效载荷(LP)在25℃-37℃孵育1-48小时同时温和地摇动。反应通过ESI-MS监测。在完成后，过量量的LP和有机溶剂通过用BupH(pH 7.4)脱盐柱去除并且蛋白聚集体(如果有的话)通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC和ESI-MS表征。缀合物的单体纯度根据SEC>99％。
实施例21C：来自方法I的代表性8DAR ADC通过Ab-LP39 ADC举例说明(图7A)。
将包含N297Q突变的非糖基化抗Her2人类IgG抗体与>200摩尔当量的叠氮基-dPEG3-胺(AL1,MW 218.26g/moL)混合。将所得溶液与微生物转谷氨酰胺酶(10U/mL；每mg抗体5,5U mTG，Modernist Pantry-ACTIVA TI包含来自Ajinomoto,Japan的麦芽糖糊精)混合导致在5mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物在37℃孵育24小时，同时温和地摇动，同时通过ESI-MS监测。在完成后，过量的胺和mTG通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。缀合物通过UV-Vis、SEC和ESI-MS进行表征。与抗体附接的叠氮基接头导致质量增加808Da，指示具有4个叠氮基标签的4AL1与抗体缀合(Ab-4AL1)。将在PBS(pH 7.4)中的该位点特异性抗体叠氮基缀合物(2.1mg/mL)与在2mM的DMSO中的15摩尔当量的接头-有效载荷(LP39)混合以使反应混合物包含5％有机溶剂(v/v)，并且将溶液在32℃放置36小时，同时温和地摇动。反应通过ESI-MS监测。在完成后，过量量的接头-有效载荷和蛋白聚集体通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC和ESI-MS表征。缀合物的单体纯度根据SEC为99.8％。与抗体附接的药物导致DAR8缀合物的质量增加11003Da，指示8个LP与抗体缀合。
实施例21D：来自方法I的代表性8DAR ADC通过Ab-LP22 ADC举例说明(图7B)。
将包含N297Q突变的非糖基化抗Her2人类IgG抗体与>200摩尔当量的BL2(MW＝708.8g/mol)混合。将所得溶液与微生物转谷氨酰胺酶(10U/mL；每mg抗体5.5U mTG，Modernist Pantry-ACTIVATI包含来自Ajinomoto,Japan的麦芽糖糊精)混合导致在5mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物在37℃孵育24小时，同时温和地摇动。在完成后，过量的胺和MTGase通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。缀合物通过UV-Vis、SDS-PAGE、SEC和ESI-MS进行表征。缀合物的单体纯度根据SEC为96.11％。与抗体附接的叠氮基接头导致质量增加2768Da，指示4BL2与具有8个叠氮基标签的抗体缀合(Ab-2BL2)。将在BupH(pH 7.4)中的位点特异性抗体叠氮基缀合物(1.492mg/mL)与在2mM的DMSO中的15摩尔当量的接头-有效载荷(LP22)混合以使反应混合物包含5％有机溶剂(v/v)，并且将溶液在25℃放置72小时，同时温和地摇动。反应通过SDS-PAGE监测。在完成后，过量量的接头-有效载荷通过用BupH(pH 7.4)脱盐柱去除。与抗体缀合物附接的药物显示DAR8缀合物的质量增加12200Da，指示8个LP与抗体缀合。
下文描绘了方法II中缀合中使用的示例性支化叠氮化物试剂BL12。
Figure BDA0004122749040003001
实施例21E：以一步制备位点特异性缀合物的一般程序
将在BupH缓冲液(pH 7.4)中的非糖基化人类抗体IgG(IgG1、IgG4等)与15-30摩尔当量的氨基-接头-有效载荷混合。将所得溶液与MTG(Modernist Pantry-ACTIVATI包含来自Ajinomoto,Japan的麦芽糖糊精)(10U/mL；每mg抗体5.5U MTG)混合，导致在0.5-5mg/mL的最终抗体浓度，并且然后将溶液在37℃孵育24h，同时温和地摇晃。在反应完成后，过量的胺和MTG通过尺寸排阻色谱(SEC)去除，以生成直接缀合的接头-有效载荷ADC。该产物通过超离心浓缩，并且通过SDS-PAGE、SEC和LC-MS表征。ADC的MS结果包括4×LP缀合物的另外的质量增加(指示4DAR ADC)，或者8×LP缀合物的另外的质量增加(指示8DAR ADC)。
实施例21F：来自方法III的代表性4DAR ADC以通过Ab-LP21 ADC举例说明，该Ab-LP21 ADC由抗体与线性接头-有效载荷的一步缀合而缀合(图7C)。
在具体实例中，在0.5mL BupH(pH 7.4)中的非糖基化抗体(1mg)用30摩尔当量的LP08(在DMSO中浓度为20mM)处理。将所得溶液与MTG(Modernist Pantry-ACTIVA TI包含来自Ajinomoto,Japan的麦芽糖糊精)(10U/mL；每mg抗体5.5U MTG)混合，导致在5mg/mL的最终抗体浓度，并且然后将溶液在37℃孵育24小时，同时温和地摇晃。在反应完成后，过量的接头有效载荷(LP)通过尺寸排阻层析(SEC,
Figure BDA0004122749040003002
200Increase10/300GL)去除。将该产物通过超离心浓缩，并且通过SDS-PAGE、SEC和LC-MS表征。缀合物的单体纯度根据SEC为98.8％。向抗体的四个位点添加的氨基接头-有效载荷，导致4DAR抗体-LP缀合物增加5380Da。/>
实施例21G：来自方法III的代表性8DAR ADC通过Ab-LP27 ADC举例说明(图7C)，该Ab-LP27 ADC由抗体与支化线性接头-有效载荷的一步缀合而缀合。
使用关于用于制备4DAR ADC(实施例21F)的一步缀合描述的相同方法，将氨基支化接头-有效载荷(LP27)与抗体的四个位点缀合，导致8DAR缀合物增加10187.2Da。
表21.来自2步(图5中的方法A、B、C、D)缀合的ADC用于靶向Her2、FGFR2和非结合对照
Figure BDA0004122749040003011
/>
Figure BDA0004122749040003021
表22.来自1步(图5中的方法E)缀合的ADC
Figure BDA0004122749040003031
实施例21H：步骤1的代表性程序：使用支化(BL)接头制备包含8个叠氮基基团的位点特异性叠氮基官能化抗体药物缀合物(表23)。
将包含N297Q突变的抗Her2人类IgG抗体或同种型对照抗体与20-100摩尔当量的双叠氮基烷基取代胺(BL2,MW 708.82g/mL或BL12,MW 550.66)混合。将所得溶液与转谷氨酰胺酶(每mg抗体1U mTG，Millipore-Sigma)混合，产生在1-20mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物在25℃-37℃孵育4-24小时，同时温和地摇动，同时通过ESI-MS监测。在完成后，过量的胺和mTG通过尺寸排阻色谱(SEC)或蛋白A柱色谱去除。缀合物通过UV-Vis、SEC和ESI-MS进行表征。与抗体附接的叠氮基接头导致分别具有BL2和BL12的DAR4缀合物的质量增加2777Da或2145Da。缀合物的单体纯度根据SEC>99％。
实施例21I：步骤2的代表性程序：经由叠氮基官能化抗体与含炔烃的接头-有效载荷之间的[2+3]点击反应使用支化(BL)接头制备包含8个叠氮基基团的位点特异性缀合物叠氮基官能化抗体药物缀合物(表23)。
通过将在PBS(pH 7.4)中的叠氮基官能化抗体(1-20mg/mL)与溶解在有机溶剂诸如DMSO或DMA(10mg/mL)中以使反应混合物包含5％-15％的有机溶剂(v/v)的10-20摩尔当量的接头-有效载荷在25℃-37℃孵育1-48小时同时温和地摇动，制备位点特异性抗体药物缀合物。反应通过ESI-MS监测。在完成后，过量的接头-有效载荷和蛋白聚集体通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC和ESI-MS表征。缀合物的单体纯度根据SEC>99％。
实施例21J：抗HER2 ADC的合成
在特定实例中，将包含N297Q突变的非糖基化抗Her2人类IgG抗体与82摩尔当量的双叠氮基-烷基取代的胺(BL2,MW 708.82g/mL)混合。将所得溶液与微生物转谷氨酰胺酶(每mg抗体1U mTG，Millipore-Sigma)混合，产生在7.9mg/mL的最终抗体浓度。将反应混合物在37℃孵育30小时，同时温和地摇动，同时通过ESI-MS监测。在完成后，过量的胺和mTG通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将缀合物通过UV-Vis、SEC和ESI-MS进行表征。与抗体附接的叠氮基接头，导致DAR4缀合物的质量增加2777Da。
将在PBS(pH 7.4)中的位点特异性抗体叠氮基缀合物(2.3mg/mL)与在10mg/mL的DMA中的13摩尔当量的接头-有效载荷(LP1)混合以使反应混合物包含12％有机溶剂(v/v)，并且将溶液在26℃放置27小时，同时温和地摇动。反应通过ESI-MS监测。在完成后，过量的接头-有效载荷和蛋白聚集体通过尺寸排阻色谱(SEC)去除。将纯化的缀合物浓缩、无菌过滤，并且通过UV-Vis、SEC和ESI-MS表征。缀合物单体纯度根据SEC为99.9％。与抗体附接的药物，导致DAR8缀合物的质量增加11175Da。
表23.mAb、叠氮基-Ab缀合物和ADC的列表
Figure BDA0004122749040003041
/>
Figure BDA0004122749040003051
实施例22：ADC的表征
实施例22A：用于ADC完整性和纯度分析的SDS-PAGE
在一种方法中，SDS-PAGE运行条件包括非还原和还原样品(1-2μg)以及PrecisionPlus蛋白双色标准品(Bio-rad,500μl,Cat#1610374)，每通道装载在(1.0mm×10个孔)Novex 4％-20％无Tris-Glycine凝胶中，并且在180V、300mA运行80分钟。非还原样品使用
Figure BDA0004122749040003052
LDS样品缓冲液(4×)(Thermo Fisher Scientific,Cat#1887691)制备，并且还原样品用包含10％样品还原剂(10X)(Thermo Fisher Scientific,Cat#1769410)的SDS样品缓冲液(4×)制备。
SDS-PAGE上的抗体和ADC的分子量在非还原和还原条件下确定。在非还原条件下，由于质量改变的百分比相对小，质量位移可能不明显。然而，重链的质量从裸抗体到叠氮基官能化的抗体增加，并且到ADC缀合物进一步增加。
实施例22B：用于ADC分析和纯化的尺寸排阻色谱(SEC)
为了确定抗体药物缀合物的纯度，进行尺寸排阻色谱。分析SEC实验使用ThermoUltiMateTM3000仪器，在XBridge蛋白BEH SEC柱(Waters,
Figure BDA0004122749040003061
3.5μm,7.8mm×300mm)上运行，并且每个样品(30-40μg，20μL)使用PBS pH 7.4与15％2-丙醇以0.5mL/min的流量运行，并且使用Thermo DAD-3000RS快速分离二极管阵列检测器在λ280nm处监测。
ADC通过尺寸排阻色谱(SEC)纯化，并且通过超离心浓缩。为了将抗体药物缀合物与反应混合物分离，使用来自GE Healthcare的
Figure BDA0004122749040003062
仪器，在/>
Figure BDA0004122749040003063
200增加10/300GL(1.0×30cm)柱上，以0.6mL/min的流量，用在pH 7.4的BupH洗脱，进行制备型SEC纯化，并且在λ280nm处监测。为了浓缩产物，在Allegra x-12r离心机中使用/>
Figure BDA0004122749040003064
Ultra-4离心过滤器(Ultracel-10K)，并且在每次浓缩之后搅拌溶液以避免高度聚集。
实施例22C：用于ADC分析的RP-HPLC
通过RP-HPLC对ADC样品进行完整质量测定，以确定LP是否已完全缀合，并且也用于计算平均DAR。
将每个样品用二硫苏糖醇(DTT,0.5M)处理，并且然后在37℃孵育30min，然后RP-HPLC分析。RP-HPLC使用Thermo UltiMateTM3000仪器在XBridge蛋白BEH C4柱(
Figure BDA0004122749040003065
2.5μm,4.6×100mm；Cat No.186009137)上进行，并且将柱烘箱加热至65℃。每个测试样品(10-20μg,10μL)使用下文表24中示出的不同梯度的流动相A(100％ddH2O与0.1％ TFA)和流动相B(80％ ACN,20％ IPA与0.1％ TFA)装载并且以1mL/min的流量运行，并且使用ThermoDAD-3000RS快速分离二极管阵列检测器在λ280nm处监测。
表24：用于ADC分析的RP-HPLC梯度
时间(min) 流量(ml/min) A％ B％
0.00 1.00 80 20
15.00 1.00 50 50
16.00 1.00 5 95
18.00 1.00 5 95
18.10 1.00 80 20
24.00 1.00 80 20
实施例22D：用于抗体和ADC的完整质量分析的LC-ESI-MS
ADC样品的完整质量的测量通过LC-ESI-MS进行，以确定有效载荷分布谱并且计算平均DAR。将每个测试样品(0.5-1μg)用以下装载到Waters蛋白BEH C4柱(
Figure BDA0004122749040003071
1.7μm,2.1mm×50mm；Cat No.186004495)上：不同梯度的流动相A(ddH2O与0.1％ FA)和流动相B(ACN与0.1％ FA)(如下文表25中示出的)，在0.25μL/min的流量，并且在λ280nm处监测。然后将产物洗脱，并且质谱通过Thermo Q EXACTIVE HF-X获得。
表25：用于抗体和ADC的完整质量分析的LC-ESI-MS梯度
Figure BDA0004122749040003072
实施例23：肿瘤系中的体外细胞毒性测定
为了测试本公开内容的抗HER2或抗STEAP2抗体药物缀合物(ADC)杀伤人类细胞系的能力，进行体外细胞毒性测定。使用CellTiter-Glo 2.0测定试剂盒(Promega,Cat#g9243)评价ADC、同种型对照ADC和参考游离有效载荷的体外细胞毒性，其中使用ATP存在的数量确定培养物中活细胞的数目。
为了测定，将Calu-3、SK-BR-3、NCI-H1975、C42或C42/STEAP2 KO(敲除)细胞以1000个细胞/孔接种在聚-D-赖氨酸包被的白色96孔生物涂层板(Corning#356693)中的完全生长培养基中，并且在37℃在5％ CO2中生长过夜。在稀释培养基(Optimem+0.1％ BSA)中制备抗HER2 ADC或同种型对照ADC的三倍系列稀释液，并且以范围为100nM至0.015nM的最终浓度添加至细胞中(根据DAR(药物抗体比)校正浓度，并且根据有效的有效载荷浓度给药)。在100％ DMSO中制备游离有效载荷的三倍系列稀释液，转移至新鲜稀释培养基中，并且然后以0.2％的最终恒定DMSO浓度和范围为100nM至0.015nM的最终有效载荷浓度添加至细胞中。每个稀释系列中的最后一个孔(未处理的孔)用作空白对照，仅包含培养基(ADC)或培养基加0.2％ DMSO(有效载荷)，并且绘制为3倍系列稀释的延续。6天后，向每个孔中添加100μL CellTiter glo 2.0，将板在轨道振荡器上混合2分钟，并且将板在室温孵育10分钟。在Envision光度计(PerkinElmer)上测量相对光单位(RLU)，并且将细胞存活力表示为未处理(100％活)细胞的百分比。IC50值使用10点剂量响应曲线(GraphPad Prism)上的四参数逻辑方程确定。还遵循如下方式确定每种测试项目的最大杀伤百分比：100-最小存活力百分比。运行了两个独立的实验(分别在下文示出的表26和表27)并且报道了每个测试项目的IC50值和最大杀伤百分比。
如表26和表27中示出的，经由谷氨酰胺缀合的抗HER2 ADC以范围为68.5pM至86.1pM的IC50值和范围为82.2％至93.3％的最大％杀伤值杀伤高表达HER2的SK-BR-3细胞。经由半胱氨酸缀合的抗HER2 ADC以147pM的IC50值和90.9％的最大％杀伤值杀伤SK-BR-3细胞。在第二个实验中，经由谷氨酰胺缀合的抗HER2 ADC以范围为183pM至431pM的IC50值和范围为89.6％至95.3％的最大％杀伤值杀伤高表达HER2的Calu-3和SK-BR-3细胞。经由半胱氨酸缀合的抗HER2 ADC以分别为1.16nM和1.38nM的IC50值和分别为85.9％和94.2％的最大％杀伤值杀伤SK-BR-3和Calu-3细胞。所有抗HER2 ADC以>100nM的IC50值在低表达HER的NCI-H1975细胞中是弱细胞毒性的，并且所有非结合对照ADC以≥40.1nM的IC50值在所有测试的细胞中是弱细胞毒性的。未缀合的抗HER2抗体以≥12.8nM的IC50值和少于或等于48.5％的最大百分比值在所有测试的细胞系中也是弱细胞毒性的。从ADC释放的游离Dxd有效载荷以范围为787pM至11.8nM的IC50值和范围为96.1％至98.2％的最大％杀伤值杀伤细胞。
表26：抗HER2 ADC在SK-BR-3和NCI-H1975细胞中的细胞毒性
Figure BDA0004122749040003091
表27：抗HER2 ADC在SK-BR-3、Calu-3和NCI-H1975细胞中的细胞毒性
Figure BDA0004122749040003092
/>
Figure BDA0004122749040003101
下文表28总结了根据本公开内容制备的抗STEAP2 ADC在C4-2和C4-2/STEAP2 KO细胞中的细胞毒性的数据。
表28：抗STEAP2 ADC在C4-2和C4-2/STEAP2 KO细胞中的细胞毒性
Figure BDA0004122749040003102
如表28中示出的，经由N297Q缀合的抗STEAP2 ADC以31.5nM和32.2nM的IC50值和54.8％和58.4％的最大％杀伤值杀伤C4-2细胞；而这些相同的ADC以>100nM的IC50值在C4-2/STEAP2 KO细胞中是弱细胞毒性的。非结合对照ADC和未缀合的抗STEAP2抗体以>100nM的IC50值在两种测试细胞系中也是弱细胞毒性的。从ADC释放的游离Dxd有效载荷以分别为2.54nM和3.43nM的IC50值和分别为81.7％和98.9％的最大％杀伤值杀伤C4-2和C4-2/STEAP2 KO细胞。
实施例24：基于SKBR3细胞的测定
使用SK-BR-3人类乳腺腺癌(human breast adenocarcinoma)(胸腔积液)细胞系进行抗增殖测定。细胞在补充有10％ FBS、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的McCoy’5a培养基中生长。在添加ADC前一天，将细胞1000/孔接种在96孔板中的80μl完全生长培养基中，并且在37℃5％ CO2孵育过夜。ADC在测定培养基(Opti-MEM+0.1％ BSA)中以1:3连续稀释10个点。测试ADC的浓度覆盖1nM至～1000nM的范围，并且还从基于细胞杀伤效力的不同浓度开始，以便看到EC50覆盖，留下最后一个孔(第10个)作为空白(无ADC或化合物)。从50μM开始，化合物在DMSO中以1:3连续稀释10个点(每种化合物的起始浓度根据EC50而不同)，留下最后一个孔作为空白(仅包含DMSO)。将10μl DMSO稀释的化合物转移至96孔深孔稀释板中的990μl测定培养基(Opti-MEM+0.1％ BSA)中。将20μl测定培养基稀释的ADC和化合物添加至细胞中。细胞在37℃5％ CO2孵育6天(144小时)。通过将100μl CTG试剂/孔来自Promega,目录号G7573的
Figure BDA0004122749040003111
添加至细胞，在室温摇动10min来显影板，用白色黏合剂底部密封件密封，并且用Envision读取发光。杀伤％＝[1-(T144样品-T144空白)/(T144DMSO-T144空白)]×100％。这里，T144是来自在时间144小时的数据。有效载荷化合物的溶液制备如下：从工作浓度开始，化合物在DMSO中以1:3连续稀释10个点(每种化合物的起始浓度根据EC50而不同)，留下最后一个孔作为空白(仅包含DMSO)。将10μl DMSO稀释的化合物转移至96孔深孔稀释板中的990μl测定培养基(Opti-MEM+0.1％ BSA)中。将20μl测定培养基稀释的ADC和化合物添加至细胞中。
ADC和对照ADC的EC50值，以及游离有效载荷(DXD和P3)总结于表21以及表23中。
实施例25：体内FGFR2 ADC功效研究
本实验测量了根据公开内容的FGFR2b抗体-药物缀合物(ADC)对SNU-16胃癌异种移植物生长的影响。
表29：FGFR2 ADC：
Figure BDA0004122749040003121
实验程序
为了评价FGFR2b Dxd ADC对SNU16异种移植物(人类胃癌异种移植物)的抗肿瘤活性，将5×106个与Matrigel(BD Biosciences)混合的SNU-16细胞(ATCC)皮下植入雄性BALB/c SCID小鼠(6-8周龄，Jackson Laboratory)的侧腹。在肿瘤达到200mm3-250 mm3的平均体积之后，将小鼠随机分到治疗组(每组n＝6只)。所有ADC均经由皮下注射施用。在实验过程中，每周两次测量肿瘤体积。计算每个治疗组的肿瘤生长(从治疗开始到实验结束的肿瘤体积改变)的平均值(平均值+/-标准差)。从与同种型对照组的比较来计算肿瘤生长减少百分比，并且从与治疗开始时的肿瘤体积的比较来计算实验结束时肿瘤消退百分比。来自利用具有不同DAR的ADC的两个独立实验的结果显示在表30中。
表30：BALB/c SCID小鼠中SNU-16异种移植物生长的抑制
Figure BDA0004122749040003131
如表30以及图8A以及图8B中示出的，结果显示FGFR2b Dxd ADC以剂量依赖的方式诱导SNU-16肿瘤异种移植物的完全消退。
实施例26：体内HER2 ADC功效研究
这个实验比较了N87异种移植物中的曲妥珠单抗-GGFG-DxD(比较物抗HER2 ADC对照)和曲妥珠单抗-vcPAB-G-DxD(根据本发明的抗HER2ADC)。
表30：HER2 ADC
Figure BDA0004122749040003141
实验程序：
在HER2 IHC 3+N87细胞系异种移植物模型中评价曲妥珠单抗比较物抗体的抗肿瘤功效。通过将与Matrigel 1:1混合的5×106个细胞皮下植入雌性SCID小鼠的右侧腹来建立肿瘤。植入后大约7天，在治疗开始之前，肿瘤生长至～250mm3。将小鼠随机分为6组，并且用单剂量的测试ADC或对照ADC治疗。监测肿瘤生长，持续治疗后70天。
实验结果：
在携带HER2 IHC 3+N87细胞系异种移植物的SCID小鼠中进行的该研究，评价了与DxD比较物LP或与根据本公开内容的LP1通过反式谷氨酰胺酶化学和支化叠氮基接头BL7缀合的曲妥珠单抗比较物抗体的活性。设计了5mg/kg的单剂量以使裸曲妥珠单抗在N87异种移植物中的影响最小化，该N87异种移植物对HER2信号传导成瘾。相对于裸对照ab治疗的肿瘤，用对照-比较物-Dxd LP或对照-LP1 ADC治疗的异种移植物的生长没有显著延迟。然而，在研究过程中，在5mg/kg ADC剂量，在用曲妥珠单抗-比较物-Dxd LP和曲妥珠单抗-根据公开内容的LP1治疗的肿瘤中观察到完全的肿瘤消退。在该研究中，两种测试ADC的影响无法区分。
表31：曲妥珠单抗-GGFG-Dxd和曲妥珠单抗-TG-LP1介导的N87异种移植物的肿瘤消退。
Figure BDA0004122749040003151
Figure BDA0004122749040003161
该研究显示，与曲妥珠单抗抗体缀合的根据本公开内容的LP1 Dxd接头有效载荷同与相同抗体缀合的先导DxD比较物接头有效载荷至少一样有效。
实施例27：体内STEAP2 ADC功效研究
该实验评价了STEAP2细胞系异种移植模型中STEAP2 ADC的功效。
表32：STEAP2 ADC
Figure BDA0004122749040003162
实验程序：
为了评价STEAP2 Dxd ADC对C4-2异种移植物的活性，通过将与Matrigel 1:1混合的7.5×106个C4-2细胞皮下植入雄性SCID小鼠的右侧腹来建立肿瘤。植入后15天，在治疗开始之前，肿瘤生长至约200mm3。根据肿瘤体积将小鼠随机分为8组，并且用单剂量的测试ADC或对照ADC治疗。监测肿瘤生长，持续治疗后50天。
实验结果：
相对于对照剂评价STEAP2 Dxd ADC的体内功效(表33)。相对于媒介物治疗的肿瘤，对照Dxd ADC部分地延迟肿瘤生长。单剂量3mg/kg STEAP2 Dxd ADC引起对肿瘤生长的持久抑制。在10mg/kg的STEAP2Dxd ADC引起肿瘤完全消退，并且在研究期间没有观察到肿瘤再生长。随着肿瘤生长，C4-2肿瘤引起小鼠体重减轻。在研究过程中，在3mg/kg或10mg/kg的STEAP2 Dxd ADC分别引起部分和完全挽救体重减轻。
表33：抗STEAP2 ADC介导的C4-2异种移植物相对于对照的消退(治疗后30天)。
Figure BDA0004122749040003171
如以上示出的，根据本公开内容的抗STEAP2 ADC显示出对STEAP2阳性C4-2细胞系异种移植物的显著的抗肿瘤功效。
实施例28：体内PRLR ADC功效研究
该实验评价了T47D细胞系异种移植模型中抗PRLR ADC的功效。有效载荷DM1的结构提供如下：
Figure BDA0004122749040003172
接头-有效载荷M1(mcc-DM1)根据WO2015/031396(PCT/US14/52757)制备，该WO2015/031396(PCT/US14/52757)通过引用以其整体并入本文。如WO2015/031396中描述的，接头-有效载荷M1与非靶向对照抗体或抗PRLR抗体的赖氨酸残基缀合。
表34：PRLR ADC
Figure BDA0004122749040003173
/>
Figure BDA0004122749040003181
SD＝单剂量
实验程序：
命名为T47DvII的致瘤T47D细胞先前经由体内传代生成。通过将与Matrigel 1:1混合的10×106个T47DvII细胞皮下植入先前植入90天缓慢释放雌激素药丸(InnovativeResearch of America)的雌性SCID小鼠的右侧腹来建立T47D肿瘤。植入后大约20天，在治疗开始之前，肿瘤生长至100mm3-200 mm3。将小鼠随机分为7组，并且用单剂量的测试ADC或对照ADC治疗。监测肿瘤生长，持续治疗后45天。
实验结果：
将PRLR DXd ADC的单剂量体内功效与PRLR DM1 ADC的单剂量体内功效进行比较(表35)。相对于媒介物治疗的肿瘤，对照DM1 ADC和对照DXd ADC都没有延迟肿瘤生长。单剂量的10mg/kg PRLR DM1 ADC引起肿瘤显著消退。然而，用5mg/kg和10mg/kg PRLR Dxd ADC观察到更大的肿瘤消退。没有观察到与治疗相关的体重改变；在研究过程中，观察到所有组增加大约10-15％的体重。
表35：抗PRLR ADC介导的T47D异种移植物相对于对照的消退(治疗后45天)。
Figure BDA0004122749040003191
如以上示出的，抗PRLR ADC显示出对PRLR阳性T47D细胞系异种移植物的显著的抗肿瘤功效。
实施例29：体内MET ADC功效研究
该实验评价了EBC1异种移植物中抗MET ADC的功效。该实施例中利用的抗MET/MET双特异性抗体描述于US2018/0134794中，该US2018/0134794通过引用以其整体并入本文。
表36：MET ADC
Figure BDA0004122749040003192
实验程序：
在EBC1 NSCLC异种移植物中评价抗MET双特异性MET/MET Dxd ADC的抗肿瘤功效。通过将5×106个细胞皮下植入雄性SCID小鼠的右侧腹来建立肿瘤。肿瘤生长至～130mm3，然后治疗开始。将小鼠随机分为6组，并且用单剂量的测试ADC或对照ADC治疗。监测肿瘤生长，持续治疗后21天。
实验结果：
在EBC1肿瘤异种移植模型中评价MET/MET Dxd ADC的活性(表37)。这里比较了在1mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg剂量的MET/MET Dxd ADC的单次施用。1mg/kg MET/MET Dxd ADC的施用显示相对于相应对照ADC的肿瘤生长延迟。用在2.5mg/kg和5mg/kg的MET/MET DxdADC治疗介导了肿瘤异种移植物的显著且持久的消退。
表37：MET/MET Dxd ADC介导的EBC1异种移植物相对于对照的消退(治疗后21天)。
Figure BDA0004122749040003201
如以上示出的，MET ADC显示出对MET扩增的NSCLC细胞系异种移植物的显著的抗肿瘤功效。
实施例30：体内EGFRvIII ADC功效研究
该实验评价了U251/EGFRvIII异种移植物模型中抗EGFRvIII ADC的功效。
表38：EGFRvIII ADC
Figure BDA0004122749040003202
Figure BDA0004122749040003211
实验程序：
在转染表达EGFRvIII的U251胶质母细胞瘤细胞系异种移植物模型中评价EGFRvIII Dxd ADC的抗肿瘤功效，因为体外培养后靶的内源表达损失。通过将与Matrigel1:1混合的10×106个细胞皮下植入雄性SCID小鼠的右侧腹来建立U251/EGFRvIII。植入后大约30天，在治疗开始之前，肿瘤生长至～150mm3。将小鼠随机分为8组，并且用单剂量的测试ADC或对照ADC治疗。监测肿瘤生长，持续治疗后70天。
实验结果：
在携带U251/EGFRvIII异种移植物的小鼠中的研究评价了在0.5mg/kg、1mg/kg或3mg/kg ADC的单剂量后EGFRvIII Dxd ADC的活性(表39)。相对于媒介物对照治疗的肿瘤，用对照Dxd ADC治疗的异种移植物的生长仅轻微延迟。然而，在用EGFRvIII Dxd ADC治疗的肿瘤中观察到肿瘤生长的显著延迟。较高的ADC剂量导致更持久的抗肿瘤活性。所有抗EGFRvIII治疗组均存活直到给药后约70天完成研究。在研究过程中，观察到所有组增加大约10％-15％的体重。
表39：EGFRvIII Dxd ADC介导的U251/EGFRvIII异种移植物相对于对照的消退(治疗后27天)。
Figure BDA0004122749040003212
Figure BDA0004122749040003221
EGFRvIII Dxd ADC显示对EGFRvIII转染的多形性胶质母细胞瘤细胞系异种移植物的显著的抗肿瘤功效。
由于可以对以上描述的主题进行各种改变，而不偏离本公开内容的范围和精神，因此意图将以上描述中包含的或在所附权利要求中定义的所有主题解释为本公开内容的描述性和说明性的。本公开内容的许多修改和变化鉴于以上教导是可能的。因此，本描述意图涵盖落入所附权利要求范围内的所有这样的替代、修改和变化。
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料通过引用以其整体特此并入，就像物理上存在于本说明书中一样。

Claims (107)

1.一种化合物，具有根据式(A)的结构：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元，其中所述基团B’和基团B”中的一个选自-N3和
Figure FDA0004122749030000011
并且所述基团B’和B”中的另一个选自
Figure FDA0004122749030000012
以及/>
Figure FDA0004122749030000013
其中Q是C或N；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是具有结构
Figure FDA0004122749030000014
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000015
k是从1至12的整数；
m是从1至30的整数，并且
n是从1至30的整数。
2.一种化合物，具有根据式(I)的结构：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)，其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是包括基团B’的至少一个加合物的支化单元，其中所述基团B’选自-N3、
Figure FDA0004122749030000021
Figure FDA0004122749030000022
以及/>
Figure FDA0004122749030000023
其中Q是C或N；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头，其中所述基团B’和所述基团B”形成至少一个加合物；
M不存在或者是具有结构
Figure FDA0004122749030000024
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000025
k是从1至12的整数，并且
n是从1至30的整数。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述BA是抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述BA是抗HER2抗体、抗STEAP2抗体、抗MET抗体、抗EGFRVIII抗体、抗MUC16抗体、抗PRLR抗体、抗PSMA抗体、抗FGFR2抗体、抗FOLR1抗体、抗HER2/HER2双特异性抗体、抗MET/MET双特异性抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述BA是抗HER2/HER2双特异性抗体。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述抗HER2/HER2双特异性抗体包括：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性结合人类HER2的第一表位；并且
其中D2特异性结合人类HER2的第二表位。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中D1和D2不彼此竞争与人类HER2的结合。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中所述BA是包括表1中示出的HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗STEAP2抗体。
9.根据权利要求7所述的化合物，其中所述抗STEAP2包括选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10；SEQ ID NO:18/26；SEQ ID NO:34/42；SEQ ID NO:50/58；SEQ ID NO:66/58；SEQ ID NO:74/58；SEQ ID NO:82/58；SEQ ID NO:90/58；SEQ ID NO:98/58；SEQ ID NO:106/114；SEQ ID NO:122/130；SEQ ID NO:138/146；SEQ ID NO:154/162；SEQ ID NO:170/178；SEQ ID NO:186/194；SEQ ID NO:202/210；SEQ ID NO:218/226；SEQ ID NO:234/242；SEQ ID NO:250/258；SEQ ID NO:266/274；SEQ ID NO:282/290；SEQID NO:298/306；SEQ ID NO:314/322；SEQ ID NO:330/338；SEQ ID NO:346/354；SEQ IDNO:362/370；和SEQ ID NO:378/386。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中所述BA是抗MET/MET双特异性抗体。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述抗MET/MET双特异性抗体包括：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性结合人类MET的第一表位；并且
其中D2特异性结合人类MET的第二表位。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中D1和D2不彼此竞争与人类MET的结合。
13.根据权利要求1-4和10-12中任一项所述的化合物，其中所述BA是包括表3示出的HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗MET/MET双特异性抗体。
14.根据权利要求1-4和10-13中任一项所述的化合物，其中所述BA是包括D1抗原结合结构域和D2抗原结合结构域的抗MET/MET双特异性抗体，其中所述D1抗原结合结构域包括SEQ ID NO:2012/2092的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包括SEQ ID NO:2014-2016-2018-2094-2096-2098的一组重链CDR和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，并且其中所述D2抗原结合结构域包括SEQ ID NO:2036/2092的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包括SEQ ID NO:2038-2040-2042-2094-2096-2098的一组重链CDR和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
15.根据权利要求1-4和10-13中任一项所述的化合物，其中所述BA是抗MET/MET双特异性抗体H4H14639D，所述抗MET/MET双特异性抗体H4H14639D包括来源于H4H13306P2的D1和来源于H4H13312P2的D2。
16.根据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中所述谷氨酰胺残基Gln天然存在于所述BA的CH2结构域或CH3结构域中。
17.根据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中所述谷氨酰胺残基Gln通过修饰一个或更多个氨基酸而引入至所述BA中。
18.根据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中所述Gln是Q295或N297Q。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中所述BA靶向选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌或脑癌。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的化合物，其中L1包括C1-6烷基、苯基、-NH-、-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、包括2个至4个氨基酸的肽单元或其组合，其中的每一种能够任选地被-S-、-S(O2)-、-C(O)-、-C(O2)-和CO2H中的一个或更多个取代，其中下标u和v独立地是1至8的整数。
21.根据权利要求1所述的化合物，其中L1选自由以下组成的组：
Figure FDA0004122749030000051
Figure FDA0004122749030000052
和/>
Figure FDA0004122749030000053
其中RA是包括炔烃、叠氮化物、四嗪、反式环辛烯、马来酰亚胺、胺、酮、醛、羧酸、酯、硫醇、磺酸、甲苯磺酸酯、卤化物、硅烷、氰基基团、糖类基团、生物素基团、脂质残基的基团，并且其中下标x、n、p和q独立地是0至12的整数，以及其组合。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中B包括基团B’的一个加合物。
23.根据权利要求22所述的化合物，其中-NH-L1-B’选自由以下组成的组：
Figure FDA0004122749030000054
Figure FDA0004122749030000061
其中所述
Figure FDA0004122749030000062
是附接至所述BA的谷氨酰胺残基的氨基附接点。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中所述基团B’是叠氮化物(-N3)，并且所述基团B’的加合物包括三唑。
25.根据权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中B包括基团B’的两个加合物。
26.根据权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中B包括基团B’的三个加合物。
27.根据权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中B包括基团B’的至少四个加合物。
28.根据权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中B包括选自由以下组成的组的基团：
Figure FDA0004122749030000063
Figure FDA0004122749030000071
Figure FDA0004122749030000072
其中(B’)包括所述基团B’和所述基团B”的加合物的附接点。
29.根据权利要求28所述的化合物，其中B选自由以下组成的组：
Figure FDA0004122749030000073
Figure FDA0004122749030000081
30.根据权利要求1所述的化合物，其中-NH-L1-B选自由以下组成的组：
Figure FDA0004122749030000082
Figure FDA0004122749030000091
其中所述
Figure FDA0004122749030000092
是附接至所述BA的谷氨酰胺残基的氨基附接点。
31.根据权利要求30所述的化合物，其中所述基团B’是叠氮化物(-N3)，并且所述基团B’和所述基团B”的加合物包括三唑。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的化合物，其中所述基团B’和所述基团B”的加合物具有选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA0004122749030000093
其中Q是C或N。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的化合物，其中M不存在。
34.根据权利要求1-32中任一项所述的化合物，其中M是
Figure FDA0004122749030000101
其中R、R’和R”在每次出现时是氢，即M是/>
Figure FDA0004122749030000102
35.根据权利要求1-32中任一项所述的化合物，其中M是
Figure FDA0004122749030000103
其中R是氢并且R’和R”一起形成5元环，即M是/>
Figure FDA0004122749030000104
36.根据权利要求1-35中任一项所述的化合物，其中n是2。
37.根据权利要求1-35中任一项所述的化合物，其中n是4。
38.根据权利要求1-35中任一项所述的化合物，其中n是8。
39.根据权利要求1-35中任一项所述的化合物，其中n是12。
40.根据权利要求1-35中任一项所述的化合物，其中n是16。
41.根据权利要求1-35中任一项所述的化合物，其中n是24。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的化合物，其中L2具有根据式(L2)的结构：
B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3)p(L2)，
其中：
B”是能够与所述基团B’共价附接的基团；
SP1不存在或者是第一间隔物单元；
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是第二间隔物单元；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是与所述Dxd共价附接的第三间隔物单元，并且
p是从1至12的整数。
43.根据权利要求42所述的化合物，其中所述至少一个基团B”选自由以下组成的组：-N3、
Figure FDA0004122749030000111
以及它们的组合。
44.根据权利要求42或43中任一项所述的化合物，其中SP1不存在或者选自由以下组成的组：
Figure FDA0004122749030000112
C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的化合物，其中B2不存在或者选自由以下组成的组：
Figure FDA0004122749030000113
Figure FDA0004122749030000114
46.根据权利要求42-44中任一项所述的化合物，其中SP2不存在或者选自由以下组成的组：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数。
47.根据权利要求42-45中任一项所述的化合物，其中AA是包括2个至4个氨基酸的肽单元，所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和瓜氨酸及其组合。
48.根据权利要求47所述的化合物，其中AA是缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸。
49.根据权利要求47所述的化合物，其中AA选自由以下组成的组：甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGG)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGGG(SEQ ID NO:2113))、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(GGF)、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG(SEQ ID NO:2114))、L-谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(LEVC)和D-谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(DEVC)。
50.根据权利要求42-49中任一项所述的化合物，其中SP3不存在或者选自由以下组成的组：
Figure FDA0004122749030000121
Figure FDA0004122749030000122
及其组合，其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自/>
Figure FDA0004122749030000123
的基团。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的化合物，其中所述M-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA0004122749030000124
其中R是氢或C1-C4烷基，并且其中
Figure FDA0004122749030000125
表示L2或L2’的附接点。
52.根据权利要求1或2所述的化合物，具有结构：
Figure FDA0004122749030000131
53.根据权利要求1或2所述的化合物，具有结构：
Figure FDA0004122749030000132
54.根据权利要求1或2所述的化合物，具有结构：
Figure FDA0004122749030000133
55.一种化合物，具有根据式(I)的结构：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)，其中：
BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是支化单元，包括
Figure FDA0004122749030000141
M不存在或者是具有结构
Figure FDA0004122749030000142
的部分，其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000143
k是从1至12的整数，并且
n是从1至30的整数。
56.一种化合物，所述化合物是根据式(L2-P)、(L2’-P)或(L2”-P)的化合物：
B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2-P)、
H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2’-P)、
马来酰亚胺-N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p(L2”-P)，
其中：
B”选自由以下组成的组：-N3、
Figure FDA0004122749030000144
Figure FDA0004122749030000151
SP1不存在或者是选自由以下组成的组的第一间隔物单元：
Figure FDA0004122749030000152
Figure FDA0004122749030000153
SP2不存在或者是选自由以下组成的组的第二间隔物单元：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是选自由以下组成的组的第三间隔物单元：
Figure FDA0004122749030000154
Figure FDA0004122749030000155
其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自
Figure FDA0004122749030000156
的基团；
M不存在或者是
Figure FDA0004122749030000157
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；并且
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000161
并且
p是从1至12的整数。
57.根据权利要求56所述的化合物，其中AA是包括2个至4个氨基酸的肽单元，所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和瓜氨酸及其组合。
58.根据权利要求57所述的化合物，其中AA是缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸。
59.根据权利要求57所述的化合物，其中AA选自由以下组成的组：甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGG)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(GGGG(SEQ ID NO:2113))、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(GGF)、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFG(SEQ ID NO:2114))和谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(EVC)。
60.根据权利要求56所述的化合物，其中所述化合物具有根据式(L2-P)的选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA0004122749030000162
/>
Figure FDA0004122749030000171
/>
Figure FDA0004122749030000181
或其药学上可接受的盐。
61.根据权利要求56所述的化合物，其中所述化合物具有根据式(L2’-P)或(L2”-P)的选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA0004122749030000182
/>
Figure FDA0004122749030000191
或其药学上可接受的盐。
62.根据权利要求56中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有根据式(L2-P)、(L2’-P)或(L2”-P)的选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA0004122749030000192
/>
Figure FDA0004122749030000201
/>
Figure FDA0004122749030000211
/>
Figure FDA0004122749030000221
/>
Figure FDA0004122749030000231
/>
Figure FDA0004122749030000241
Figure FDA0004122749030000251
63.一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物是根据式(II)的抗体-药物缀合物：
Ab-(Gln-NH-L1-B-(SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)k)p)n(II)，
其中Ab是抗体；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1不存在或者是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元，其中所述基团B’选自-N3、
Figure FDA0004122749030000252
其中
B”-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p是根据根据权利要求55-60中任一项所述的式(L2-P)的化合物，并且其中式(L2-P)的化合物经由所述基团B’和所述基团B”的加合物与抗体共价附接；k是1至12的整数，p是1至30的整数，并且n是1至30的整数。
64.一种抗体-药物缀合物，包括抗体和接头-有效载荷，其中所述接头-有效载荷包括以下结构：
Figure FDA0004122749030000253
Figure FDA0004122749030000261
其中
Figure FDA0004122749030000262
表示直接或通过第二接头附接至所述抗体的附接点，
或其药学上可接受的盐。
65.一种组合物，包括根据权利要求1-61中任一项所述的化合物的群体，具有约0.5至约30.0的药物-抗体比(DAR)。
66.根据权利要求64所述的组合物，具有约1.0至约2.5的DAR。
67.根据权利要求66所述的组合物，具有约2的DAR。
68.根据权利要求64所述的组合物，具有约3.0至约4.5的DAR。
69.根据权利要求68所述的组合物，具有约4的DAR。
70.根据权利要求64所述的组合物，具有约6.5至约8.5的DAR。
71.根据权利要求70所述的组合物，具有约8的DAR。
72.根据权利要求64所述的组合物，具有约10至约14的DAR。
73.根据权利要求72所述的组合物，具有约12的DAR。
74.根据权利要求64所述的组合物，具有约14至约18的DAR。
75.根据权利要求74所述的组合物，具有约16的DAR。
76.根据权利要求64所述的组合物，具有约22至约24.5的DAR。
77.根据权利要求76所述的组合物，具有约24的DAR。
78.一种化合物，具有根据式(P-I)的结构：
Figure FDA0004122749030000263
其中R1、R2、R3和R4独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R2和R3形成5元或6元环，
或其药学上可接受的盐。
79.根据权利要求64所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0004122749030000271
或其药学上可接受的盐。
80.一种抗体-药物缀合物，包括抗体、接头和有效载荷，其中所述有效载荷是根据权利要求79所述的化合物。
81.一种抗体-药物缀合物，包括抗体、接头和有效载荷，其中所述有效载荷是
Figure FDA0004122749030000272
或其药学上可接受的盐，
其中
Figure FDA0004122749030000273
表示附接至所述接头的附接点。
82.一种化合物，具有根据式(P2)的结构：
Figure FDA0004122749030000274
其中R是氢或C1-C4烷基，或其药学上可接受的盐。
83.根据权利要求80所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0004122749030000281
或其药学上可接受的盐。
84.一种药物组合物，包括根据权利要求78-83中任一项所述的化合物，以及稀释剂、载体和/或赋形剂。
85.一种治疗有相应需要的受试者的状况的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-61或78-83中任一项所述的化合物，或根据权利要求64-71或84中任一项所述的组合物。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述状况是癌症。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌或脑癌。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中所述状况是HER2+乳腺癌。
89.一种将化合物选择性地递送到细胞中的方法，其中所述化合物是根据权利要求78-83中任一项所述的化合物。
90.一种用化合物选择性地靶向细胞表面上的抗原的方法，其中所述化合物是根据权利要求78-83中任一项所述的化合物。
91.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。
93.根据权利要求89-92中任一项所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞或脑癌细胞。
95.一种产生具有根据式(A)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是
Figure FDA0004122749030000291
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000292
k和m独立地是1至12的整数，并且n是1至30的整数，其中：
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与化合物L1-B接触，其中所述支化单元B包括所述至少一个基团B’，
b)使步骤a)的产物与k或更多当量的化合物L2-(-M-Dxd)m接触，其中所述接头L2包括至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure FDA0004122749030000293
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure FDA0004122749030000301
其中Q是C或N；以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
96.一种产生具有根据式(A)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k)n(A)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；
L1是根据以上描述的第一接头；B是包括根据以上描述的基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；L2是经由根据以上描述的至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的根据以上描述的第二接头；M不存在或者是
Figure FDA0004122749030000302
其中R、R’和R”根据以上描述；Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000303
k和m独立地是1至12的整数，并且n是1至30的整数，其中：
所述方法包括以下步骤：
a)使化合物L1-B与k或更多当量的化合物L2-(-M-Dxd)m接触，其中所述支化单元B包括所述至少一个基团B’，其中所述接头L2包括能够与所述基团B’共价结合的至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure FDA0004122749030000304
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure FDA0004122749030000305
其中Q是C或N；
从而产生L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k；
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与步骤a)的L1-B-(-L2-(-M-Dxd)m)k产物接触，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
97.一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n
(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；
Gln是谷氨酰胺残基；
L1是第一接头；
B是包括基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；
L2是经由至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的第二接头；
M不存在或者是
Figure FDA0004122749030000311
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；
Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000312
k是1至12的整数，并且n为1至30的整数，其中：
所述方法包括以下步骤：
a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与化合物L1-B接触，其中所述支化单元B包括所述至少一个基团B’，
b)使步骤a)的产物与k或更多当量的化合物L2-M-Dxd接触，其中所述接头L2包括能够与所述基团B’共价附接的至少一个基团B”，
其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure FDA0004122749030000321
并且所述基团B’和B”中的另一个选自/>
Figure FDA0004122749030000322
其中Q是C或N；以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
98.一种产生具有根据式(I)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L1-B-(-L2-M-Dxd)k)n(I)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；
L1是根据以上描述的第一接头；B是包括根据以上描述的基团B’和基团B”的至少一个加合物的支化单元；L2是经由根据以上描述的至少一个基团B”与所述支化单元B共价附接的根据以上描述的第二接头；M不存在或者是
Figure FDA0004122749030000323
其中R、R’和R”根据以上描述；Dxd是包括根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000324
k是1至12的整数，并且n为1至30的整数，其中：
所述方法包括以下步骤：
a)使化合物L1-B与k或更多当量的化合物L2-M-Dxd接触，其中所述支化单元B包括至少一个基团B’，其中所述接头L2包括至少一个基团B”，从而产生L1-B-(-L2-M-Dxd)k，其中所述基团B’和B”中的一个选自-N3和
Figure FDA0004122749030000331
并且所述基团B’和B”中的另一个选自
Figure FDA0004122749030000332
Figure FDA0004122749030000333
其中Q是C或N；
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的结合剂BA(BA-Gln-NH2)与步骤a)的L1-B-(-L2-M-Dxd)k产物接触，以及
c)分离所产生的式(I)的化合物。
99.一种产生具有根据式(III)的结构的化合物的方法：
BA-(Gln-NH-L2’-P))n(III)，
其中BA是抗体或其抗原结合片段；Gln是谷氨酰胺残基；L2’-P是根据以上描述的H2N-SP1-B2-(-SP2-AA-SP3-M-Dxd)p，并且n是1至30的整数；
SP1不存在或者是选自由以下组成的组的第一间隔物单元：
Figure FDA0004122749030000334
Figure FDA0004122749030000335
B2不存在或者是支化单元；
SP2不存在或者是选自由以下组成的组的第二间隔物单元：C1-6烷基、-(CH2-CH2-O)v-、-NH-、-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-NH-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-或其组合；其中下标u和v独立地是1至8的整数；
AA不存在或者是包括2个至4个氨基酸的肽单元；
SP3不存在或者是选自由以下组成的组的第三间隔物单元：
Figure FDA0004122749030000336
Figure FDA0004122749030000341
其中Rc在每次出现时独立地不存在或者是选自
Figure FDA0004122749030000342
的基团；
M不存在或者是
Figure FDA0004122749030000343
其中R、R’和R”在每次出现时独立地是氢或C1-C4烷基，或者其中R’和R”一起形成5元或6元环；并且
Dxd是具有根据式(P)的结构的抗肿瘤剂：
Figure FDA0004122749030000344
/>
p是从1至30的整数；
其中所述方法包括以下步骤：
b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使包括至少一个谷氨酰胺残基Gln的BA(BA-Gln-NH2)与所述L2’-P接触，以及
c)分离所产生的式(III)的化合物。
100.根据权利要求95-98中任一项所述的方法，其中所述谷氨酰胺残基Gln天然存在于所述BA的CH2结构域或CH3结构域中。
101.根据权利要求95-98中任一项所述的方法，其中所述谷氨酰胺残基Gln通过修饰一个或更多个氨基酸而引入至所述BA中。
102.根据权利要求95-98中任一项所述的方法，其中所述Gln是Q295或N297Q。
103.根据权利要求95-98中任一项所述的方法，其中所述转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶(MTG)。
104.根据权利要求95-103中任一项所述的方法，其中M不存在，或者其中所述M-Dxd具有选自由以下组成的组的结构
Figure FDA0004122749030000351
其中R是氢或C1-C4烷基，并且其中
Figure FDA0004122749030000352
表示L2的附接点。
105.根据权利要求95-104中任一项所述的方法，其中所述化合物L2-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA0004122749030000353
/>
Figure FDA0004122749030000361
/>
Figure FDA0004122749030000371
或其药学上可接受的盐。
106.根据权利要求95-104中任一项所述的方法，其中所述化合物L2-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA0004122749030000372
/>
Figure FDA0004122749030000381
或其药学上可接受的盐。
107.根据权利要求95-104中任一项所述的方法，其中所述化合物L2-Dxd具有选自由以下组成的组的结构：
Figure FDA0004122749030000382
/>
Figure FDA0004122749030000391
/>
Figure FDA0004122749030000401
/>
Figure FDA0004122749030000411
/>
Figure FDA0004122749030000421
/>
Figure FDA0004122749030000431
/>
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230287138A1 (en) * 2022-01-12 2023-09-14 Regneron Pharmaceuticals, Inc. Protein-drug conjugates comprising camptothecin analogs and methods of use thereof
WO2023138682A1 (zh) * 2022-01-24 2023-07-27 北京桦冠生物技术有限公司 缀合物及其用途
WO2023172968A1 (en) * 2022-03-09 2023-09-14 Merck Patent Gmbh Anti-gd2 antibodies, immunoconjugates and therapeutic uses thereof
WO2023217064A1 (zh) * 2022-05-09 2023-11-16 同宜医药（苏州）有限公司 一种喜树碱衍生物，基于其的抗体-药物偶联物和药物组合物，及其应用
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024067811A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Beigene, Ltd. Ligand-drug conjugate of exatecan analogue, and medical use thereof
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
CA2008368C (en) 1989-01-24 2003-04-08 Jeffrey Greve Soluble molecule related to but distinct from icam-1
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20070258987A1 (en) 2000-11-28 2007-11-08 Seattle Genetics, Inc. Recombinant Anti-Cd30 Antibodies and Uses Thereof
WO2003087306A2 (en) 2002-04-05 2003-10-23 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 98p4b6 useful in treatment and detection of cancer
WO2005079490A2 (en) 2004-02-13 2005-09-01 Nuvelo, Inc. Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express steap2 polypeptides
AR048098A1 (es) 2004-03-15 2006-03-29 Wyeth Corp Conjugados de caliqueamicina
AU2005249490B2 (en) 2004-06-01 2010-07-29 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
ES2731432T3 (es) 2007-05-23 2019-11-15 Ventana Med Syst Inc Transportadores poliméricos para inmunohistoquímica e hibridación in situ
KR20100137585A (ko) 2008-04-30 2010-12-30 이뮤노젠 아이엔씨 강력한 복합체 및 친수성 링커
JP5622117B2 (ja) 2008-07-21 2014-11-12 ポリテリクスリミテッド 生体分子を接合するための新規な試薬及び方法
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
DK2889624T3 (en) 2009-08-10 2018-12-10 Ucl Business Plc Reversible covalent bonding of functional molecules
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2012005982A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Reporter for rna polymerase ii termination
EP3960865A1 (en) 2010-08-02 2022-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
EP3170821B1 (en) 2011-05-27 2021-09-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
US8815226B2 (en) 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
EA028457B1 (ru) 2011-10-14 2017-11-30 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины
WO2013055990A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
EA029046B1 (ru) 2011-10-14 2018-02-28 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины и промежуточные соединения для их получения, способы их синтеза
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
KR20140139480A (ko) 2011-12-05 2014-12-05 이제니카 바이오테라퓨틱스, 인크. 항체-약물 접합체 및 관련 화합물, 조성물, 및 방법
DK2907824T3 (en) * 2012-10-11 2018-07-23 Daiichi Sankyo Co Ltd ANTIBODY-drug conjugate
HUE038285T2 (hu) 2012-10-23 2018-10-29 Synaffix Bv Módosított antitest, antitest-konjugátum és eljárás ezek elõállítására
CN105517577A (zh) * 2013-06-21 2016-04-20 先天制药公司 多肽的酶促偶联
AU2014311361B2 (en) 2013-08-26 2018-11-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
KR102351755B1 (ko) 2014-04-10 2022-01-14 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항her3 항체-약물 콘주게이트
EP3148592A2 (en) 2014-06-02 2017-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates, their preparation and their therapeutic use
KR101757977B1 (ko) 2015-06-26 2017-07-13 아주대학교산학협력단 바이오 잉크의 제조방법 및 3d 프린터 적용
MA43094B1 (fr) 2016-01-25 2020-10-28 Regeneron Pharma Dérivés de maytansinoïde, leurs conjugués, et procédés d'utilisation
US11786603B2 (en) 2016-02-26 2023-10-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Optimized transglutaminase site-specific antibody conjugation
EA201990781A9 (ru) 2016-09-23 2019-11-27 Анти-steap2 антитела, конъюгаты антитело-лекарственное средство и биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связывают steap2 и cd3, и их применение
JP7330101B2 (ja) 2016-11-08 2023-08-21 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド ステロイド及びそのタンパク質コンジュゲート
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
WO2018182341A1 (ko) 2017-03-29 2018-10-04 주식회사 레고켐 바이오사이언스 피롤로벤조디아제핀 이량체 전구체 및 이의 리간드-링커 접합체 화합물
WO2018218004A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Linkers for antibody drug conjugates
WO2019212965A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, and bispecific antigen-binding molecules that bind her2 and/or aplp2, conjugates, and uses thereof
JP2021523147A (ja) * 2018-05-09 2021-09-02 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド 抗ｍｓｒ１抗体及びその使用方法
JP2021524740A (ja) * 2018-05-18 2021-09-16 グリコトープ ゲーエムベーハー 抗ｍｕｃ１抗体
MX2021005822A (es) * 2018-11-20 2021-07-15 Regeneron Pharma Derivados de bis-octahidrofenantreno carboxamida y conjugados de proteinas de los mismos para usarse como agonistas de lxr.
WO2020245229A1 (en) * 2019-06-03 2020-12-10 Synaffix B.V. Acetal-based cleavable linkers
CN110974975B (zh) * 2019-12-12 2023-10-20 成都百利多特生物药业有限责任公司 一种快速释放的抗体药物偶联物
IL295312A (en) * 2020-02-28 2022-10-01 Regeneron Pharma Bispecific antigen binding molecules that bind her2 and methods of using them

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