CN113631191A - 抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与parp抑制剂的组合 - Google Patents

抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与parp抑制剂的组合 Download PDF

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Abstract

一种用于治疗癌症的医药组合物或癌症的治疗方法，其特征在于，抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与PARP抑制剂被组合给药。

Description

抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与PARP抑制剂的 组合
技术领域
本发明涉及一种用于治疗癌症的医药组合物和癌症的治疗方法，其特征在于，特定的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂被组合给药。
背景技术
抗体－药物偶联物(Antibody-Drug Conjugate；ADC)在癌症治疗等中使用，使具有细胞毒活性的药物与抗体结合而成，所述抗体例如与在癌细胞表面表达的抗原结合，通过该结合能使抗原在细胞中内化。ADC通过高效地将药物传递至癌细胞，使药物蓄积于癌细胞内，可以期待杀死癌细胞。
作为用于ADC的药物而有用的药物之一，可列举出吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。PBD通过与DNA小沟的PuGPu序列等结合而显示出细胞毒性。作为源自天然的PBD的安曲霉素(anthramycin)在1965年被首次发现，之后发现了各种源自天然的PBD及其类似物的PBD(非专利文献1～4)。
PBD的通式由下式表示。
Figure BDA0003279539650000011
已知PBD在A、C环部上的取代基的数量、种类、取代部位各不相同，此外，在B、C环部上的不饱和度各不相同。
已知PBD通过形成二聚物结构来大幅提高细胞毒性(非专利文献5、6)，还报道了各种将二聚物PBD进行ADC化的物质(专利文献1～15)。然而，在C2位具有螺环的PBD或其ADC体是未知的。
聚(ADP－核糖)聚合酶(PARP：poly ADP-ribose polymerase)抑制剂是具有通过抑制PARP(特别是PARP－1和PARP－2)来妨碍单链切断的修复的功能的药剂。已知在乳腺癌、卵巢癌等一部分癌症中，双链切断的修复存在异常，PARP抑制剂被认为对于这些癌症有因合成致死引起的抗肿瘤效果(非专利文献7～11)。
作为PARP抑制剂，已知奥拉帕尼(非专利文献12)、鲁卡帕尼(非专利文献13)、尼拉帕利(非专利文献14)以及他拉唑帕尼(非专利文献15)等。
还已知通过联用PARP抑制剂与使用了PBD的ADC，可得到类似于合成致死的效果。例如，在PARP抑制剂显示出有效性的BRCA2敲除的DLD1细胞的异种移植(Xenograft)模型中，确认到奥拉帕尼与ADC的联用效果。然而，在亲代DLD1细胞的异种移植模型中未观察到联用效果(非专利文献16)。此外，关于上述具有螺环的PBD、其抗体－药物偶联物与PARP抑制剂的联用效果是未知的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/173496号
专利文献2：国际公开第2014/130879号
专利文献3：国际公开第2017/004330号
专利文献4：国际公开第2017/004025号
专利文献5：国际公开第2017/020972号
专利文献6：国际公开第2016/036804号
专利文献7：国际公开第2015/095124号
专利文献8：国际公开第2015/052322号
专利文献9：国际公开第2015/052534号
专利文献10：国际公开第2016/115191号
专利文献11：国际公开第2015/052321号
专利文献12：国际公开第2015/031693号
专利文献13：国际公开第2011/130613号
专利文献14：国际公开第2005/040170号
专利文献15：国际公开第2017/137556号
非专利文献
非专利文献1：Angewandte Chemie Internationl Edition 2016,55,2-29
非专利文献2：Chemical Reviews 2010,111,2815-2864
非专利文献3：In Antibiotics III.Springer Verlag,New York,pp.3-11
非专利文献4：Accounts of Chemical Research 1986,19,230
非专利文献5：Journal of the American Chemical Society 1992,114,4939
非专利文献6：Journal of Organic Chemistry 1996,61,8141
非专利文献7：Lord CJ,et al.,Nature(2012)481,287-294.
非专利文献8：Benafif S,et al.,Onco.Targets Ther.(2015)8,519-528.
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发明内容
发明所要解决的问题
本发明提供一种用于治疗癌症的医药，其特征在于，将抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与PARP抑制剂组合给药，还提供一种癌症的治疗方法，其特征在于，将抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与PARP抑制剂组合给药。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果通过抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与PARP抑制剂组合给药，显示出优异的抗肿瘤效果。此外，该偶联物通过与PARP抑制剂组合给药，也对PARP抑制剂不显示敏感性的细胞株和异种移植肿瘤显示出优异的抗肿瘤效果。本发明是基于所述见解而完成的。
即，本发明如下所述。
[1]一种医药组合物，其特征在于，所述医药组合物为包含抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物和/或PARP抑制剂的用于癌症治疗的医药组合物，所述抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与所述PARP抑制剂被组合给药，所述偶联物由下式表示：
Figure BDA0003279539650000041
或者
Figure BDA0003279539650000042
Figure BDA0003279539650000051
或者
Figure BDA0003279539650000052
Figure BDA0003279539650000053
或者
Figure BDA0003279539650000054
或、
Figure BDA0003279539650000061
或者
Figure BDA0003279539650000062
在上述所示的各结构式中，m1为整数1或2，Ab为抗体或该抗体的功能性片段，N297糖链为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或它们的混合物、或N297－(Fuc)SG。
Figure BDA0003279539650000063
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，N297糖链中的L(PEG)表示*－(CH2CH2－O)3－CH2CH2－NH－，在此，右端的氨基经由酰胺键与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧或/和1－6链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧酸键合，左端的星号*表示与所述式中的三唑环上的1位或3位氮原子结合。
[2]根据[1]所述的医药组合物，其特征在于，抗体与在肿瘤细胞表达的抗原结合，被吞入肿瘤细胞内而内化。
[3]根据[1]或[2]所述的医药组合物，其特征在于，抗体具有抗肿瘤效果。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的医药组合物，其中，抗体为抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3抗体、抗FAP抗体、抗CDH11抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7－H3抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4抗体、抗LRRC15抗体、抗DR5抗体、抗CDH3抗体、抗PDPN抗体或抗CD123抗体。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的医药组合物，其特征在于，抗体与CLDN6和/或CLDN9特异性结合。
[6]根据[5]所述的医药组合物，其中，抗体包含：含以下的(a)或(b)所述的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重链，和含以下的(a)或(b)所述的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的轻链，(a)由序列号9所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号10所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号6所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号7所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中一个或两个氨基酸被取代的氨基酸序列形成的CDRL3，或，(b)由序列号15所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号16所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号17所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号13所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号14所述的氨基酸序列形成的CDRL3。
[7]根据[6]所述的医药组合物，其中，抗体包含：含以下的(a)或(b)所述的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重链，和含以下的(a)或(b)所述的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的轻链，(a)由序列号9所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号10所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号6所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号7所述的氨基酸序列或序列号8所述的氨基酸序列形成的CDRL3，或，(b)由序列号15所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号16所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号17所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号13所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号14所述的氨基酸序列形成的CDRL3。
[8]根据[5]～[7]中任一项所述的医药组合物，其中，抗体包含以下的(a)或(b)所述的重链可变区和轻链可变区，(a)由序列号21所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号19所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，或，(b)由序列号25所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号23所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
[9]根据[5]～[8]中任一项所述的医药组合物，其中，包含：由选自由以下的(a)～(e)构成的组中的氨基酸序列形成的重链可变区，和由选自由以下的(f)～(k)构成的组中的氨基酸序列形成的轻链可变区，(a)序列号54所述的氨基酸序列，(b)序列号58所述的氨基酸序列，(c)序列号62所述的氨基酸序列，(d)对于(a)～(c)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，(e)在(a)～(c)的序列中的各CDR序列以外的框架区的序列中、缺失一个或几个氨基酸、取代一个或几个氨基酸或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列，(f)序列号38所述的氨基酸序列，(g)序列号42所述的氨基酸序列，(h)序列号46所述的氨基酸序列，(i)序列号50所述的氨基酸序列，(j)对于(f)～(i)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，以及(k)在(f)～(i)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列中、缺失一个或几个氨基酸、取代一个或几个氨基酸或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列。
[10]根据[9]所述的医药组合物，其中，抗体包含选自由以下的(a)～(e)构成的组中的重链可变区和轻链可变区，(a)由序列号54所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号38所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，(b)由序列号58所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号42所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，(c)由序列号54所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号46所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，(d)由序列号58所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号50所述的氨基酸序列形成的轻链可变区所构成的轻链可变区，以及(e)由序列号62所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号46所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
[11]根据[5]～[10]中任一项所述的医药组合物，其中，抗体为嵌合抗体。
[12]根据[5]～[10]中任一项所述的医药组合物，其中，抗体为人源化抗体。
[13]根据[5]～[12]中任一项所述的医药，其中，抗体包含人IgG1、人IgG2或人IgG4的重链恒定区。
[14]根据[12]或[13]所述的医药组合物，其中，包含选自由以下的(a)～(e)构成的组中的重链和轻链，(a)由序列号52的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号36的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，(b)由序列号56的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号40的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，(c)由序列号52的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号44的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，(d)由序列号56的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号48的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，以及(e)由序列号60的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号44的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
[15]根据[5]所述的医药组合物，其中，抗体与[6]～[10]以及[14]中任一项所述的抗体、在与CLDN6和/或CLDN9的结合上进行竞争，或抗体与[6]～[10]以及[14]中任一项所述的抗体所识别的CLDN6和/或CLDN9上的部位结合。
[16]根据[1]～[4]中任一项所述的医药组合物，其中，抗体与HER2特异性结合。
[17]根据[16]所述的医药组合物，其中，具有抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性和/或补体依赖性细胞毒(CDC)活性。
[18]根据[16]所述的医药组合物，其中，抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含引起ADCC和/或CDC活性的降低的变异。
[19]根据[18]所述的医药组合物，其中，抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，所述重链恒定区中由EU Index所示的234位和235位亮氨酸被丙氨酸取代。
[20]根据[16]或[17]所述的医药组合物，其中，为包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号64所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
[21]根据[16]、[18]以及[19]中任一项所述的医药组合物，其中，为包含由序列号75的氨基酸编号20～139所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号73的氨基酸编号21～127所述的氨基酸序列形成的轻链可变区的抗体。
[22]根据[16]、[18]、[19]以及[21]中任一项所述的医药组合物，其中，为包含由序列号75的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号73的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
[23]根据[16]、[18]、[19]以及[21]中任一项所述的医药组合物，其中，为包含由序列号77的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号76的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
[24]根据[5]～[23]中任一项所述的医药组合物，其中，抗体包括选自由N－连接糖基化、O－连接糖基化、N末端加工、C末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、蛋氨酸的氧化、N末端的蛋氨酸残基的添加、脯氨酸残基的酰胺化以及重链的羧基末端的一个或两个氨基酸残基的缺失构成的组中的一种或两种以上的修饰。
[25]根据[24]所述的医药组合物，其中，在抗体的重链的羧基末端缺失一个或几个氨基酸残基。
[26]根据[24]或[25]所述的医药组合物，其中，在抗体的两条重链双方的羧基末端缺失一个氨基酸残基。
[27]根据[24]～[26]中任一项所述的医药组合物，其中，抗体的重链的羧基末端的脯氨酸残基进一步被酰胺化。
[28]根据[1]～[27]中任一项所述的医药组合物，其中，N297糖链为N297－(Fuc)MSG1。
[29]根据[1]～[28]中任一项所述的医药组合物，其中，m1为整数1。
[30]根据[1]～[29]中任一项所述的医药组合物，其中，抗体―吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数为1～3或3～5。
[31]根据[1]～[30]中任一项所述的医药组合物，其中，PARP抑制剂为奥拉帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕利或者他拉唑帕尼、或它们的药理上可接受的盐。
[32]根据[1]～[31]中任一项所述的医药组合物，其特征在于，在各自不同的制剂中作为有效成分而含有抗体－药物偶联物与PARP抑制剂，抗体－药物偶联物与PARP抑制剂同时或在不同的时间进行给药。
[33]根据[1]～[32]中任一项所述的医药组合物，其中，所述医药组合物用于治疗选自由肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌等)、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌(表层上皮性肿瘤、间质性肿瘤、生殖细胞肿瘤等)、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宫体癌、睾丸癌(精原细胞瘤、非精原细胞瘤)、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌以及它们的转移性形态构成的组中的至少一种癌症。
[34]一种癌症的治疗方法，其特征在于，抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与PARP抑制剂被组合给药，所述偶联物由下式表示：
Figure BDA0003279539650000111
或者
Figure BDA0003279539650000112
Figure BDA0003279539650000121
或者
Figure BDA0003279539650000122
Figure BDA0003279539650000123
或者
Figure BDA0003279539650000124
或、
Figure BDA0003279539650000131
或者
Figure BDA0003279539650000132
在上述所示的各结构式中，m1为整数1或2，Ab为抗体或该抗体的功能性片段，N297糖链为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或它们的混合物、或N297－(Fuc)SG。
Figure BDA0003279539650000133
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，N297糖链中的L(PEG)表示*－(CH2CH2－O)3－CH2CH2－NH－，在此，右端的氨基经由酰胺键与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧或/和1－6链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧酸键合，左端的星号*表示与所述式中的三唑环上的1位或3位氮原子结合。
[35]根据[34]所述的治疗方法，其中，抗体与在肿瘤细胞表达的抗原结合，被吞入肿瘤细胞内而内化。
[36]根据[34]或[35]所述的治疗方法，其特征在于，抗体具有抗肿瘤效果。
[37]根据[34]～[36]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体为抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3抗体、抗FAP抗体、抗CDH11抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7－H3抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗体PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4抗体、抗LRRC15抗体、抗DR5抗体、抗CDH3抗体、抗PDPN抗体或抗CD123抗体。
[38]根据[34]～[37]中任一项所述的治疗方法，其特征在于，抗体与CLDN6和/或CLDN9特异性结合。
[39]根据[38]所述的治疗方法，其中，抗体包含：含以下的(a)或(b)所述的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重链，和含以下的(a)或(b)所述的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的轻链，(a)由序列号9所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号10所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号6所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号7所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中一个或两个氨基酸被取代的氨基酸序列形成的CDRL3，或，(b)由序列号15所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号16所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号17所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号13所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号14所述的氨基酸序列形成的CDRL3。
[40]根据[39]所述的治疗方法，其中，抗体包含：含以下的(a)或(b)所述的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重链，和含以下的(a)或(b)所述的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的轻链，(a)由序列号9所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号10所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号6所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号7所述的氨基酸序列或序列号8所述的氨基酸序列形成的CDRL3，或，(b)由序列号15所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号16所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号17所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号13所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号14所述的氨基酸序列形成的CDRL3。
[41]根据[38]～[40]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体包含以下的(a)或(b)所述的重链可变区和轻链可变区，(a)抗体包含由序列号21所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号19所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，或，(b)抗体包含由序列号25所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号23所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
[42]根据[38]～[41]中任一项所述的治疗方法，其中，包含：由选自由以下的(a)～(e)构成的组中的氨基酸序列形成的重链可变区，和由选自由以下的(f)～(k)构成的组中的氨基酸序列形成的轻链可变区，(a)序列号54所述的氨基酸序列，(b)序列号58所述的氨基酸序列，(c)序列号62所述的氨基酸序列，(d)对于(a)～(c)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，(e)在(a)～(c)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列中、缺失一个或几个氨基酸、取代一个或几个氨基酸或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列，(f)序列号38所述的氨基酸序列，(g)序列号42所述的氨基酸序列，(h)序列号46所述的氨基酸序列，(i)序列号50所述的氨基酸序列，(j)对于(f)～(i)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，以及(k)在(f)～(i)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列中、缺失一个或几个氨基酸、取代一个或几个氨基酸或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列。
[43]根据[42]所述的治疗方法，其中，抗体包含选自由以下的(a)～(e)构成的组中的重链可变区和轻链可变区，(a)由序列号54所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号38所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，(b)由序列号58所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号42所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，(c)由序列号54所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号46所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，(d)由序列号58所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号50所述的氨基酸序列形成的轻链可变区所构成的轻链可变区，以及(e)由序列号62所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号46所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
[44]根据[38]～[43]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体为嵌合抗体。
[45]根据[38]～[43]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体为人源化抗体。
[46]根据[38]～[45]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体包含人IgG1、人IgG2或人IgG4的重链恒定区。
[47]根据[45]或[46]所述的治疗方法，其中，包含选自由以下的(a)～(e)构成的组中的重链和轻链，(a)由序列号52的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号36的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，(b)由序列号56的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号40的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，(c)由序列号52的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号44的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，(d)由序列号56的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号48的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，以及，(e)由序列号60的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号44的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
[48]根据[38]所述的治疗方法，其中，抗体与[39]～[43]以及[47]中任一项所述的抗体、在与CLDN6和/或CLDN9的结合上进行竞争，或抗体与[39]～[43]以及[47]中任一项所述的抗体所识别的CLDN6和/或CLDN9上的部位结合。
[49]根据[34]～[37]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体与HER2特异性结合。
[50]根据[49]所述的治疗方法，其中，具有抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性和/或补体依赖性细胞毒(CDC)活性。
[51]根据[49]所述的治疗方法，其中，抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含引起ADCC和/或CDC活性的降低的变异。
[52]根据[51]所述的治疗方法，其中，抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，所述重链恒定区中由EU Index所示的234位和235位亮氨酸被丙氨酸取代。
[53]根据[49]或[50]所述的治疗方法，其中，抗体包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号64所述的氨基酸序列形成的轻链。
[54]根据[49]、[51]以及[52]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体包含由序列号75的氨基酸编号20～139所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号73的氨基酸编号21～127所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
[55]根据[49]、[51]、[52]以及[54]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体包含由序列号75的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号73的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
[56]根据[49]、[51]、[52]以及[54]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体包含由序列号77的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号76的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
[57]根据[38]～[56]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体包括选自由N－连接糖基化、O－连接糖基化、N末端加工、C末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、蛋氨酸的氧化、N末端的蛋氨酸残基的添加、脯氨酸残基的酰胺化以及重链的羧基末端的一个或两个氨基酸残基的缺失构成的组中的一种或两种以上的修饰。
[58]根据[57]所述的治疗方法，其中，在抗体的重链的羧基末端缺失一个或几个氨基酸残基。
[59]根据[57]或[58]所述的治疗方法，其中，在抗体的两条重链双方的羧基末端缺失一个氨基酸残基。
[60]根据[57]～[59]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体的重链的羧基末端的脯氨酸残基进一步被酰胺化。
[61]根据[34]～[60]中任一项所述的治疗方法，其中，N297糖链为N297－(Fuc)MSG1。
[62]根据[34]～[61]中任一项所述的治疗方法，其中，m1为整数1。
[63]根据[34]～[62]中任一项所述的治疗方法，其中，抗体―吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数为1～3或3～5。
[64]根据[34]～[63]中任一项所述的治疗方法，其中，PARP抑制剂为奥拉帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕利或者他拉唑帕尼、或它们的药理上可接受的盐。
[65]根据[34]～[64]中任一项所述的治疗方法，其中，所述治疗方法用于治疗选自由肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌等)、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌(表层上皮性肿瘤、间质性肿瘤、生殖细胞肿瘤等)、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宫体癌、睾丸癌(精原细胞瘤、非精原细胞瘤)、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌以及它们的转移性形态构成的组中的至少一种癌症。
[66]一种医药组合物，其包含用于与PARP抑制剂联用的[1]所述的抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物。
[67]一种医药组合物，其包含PARP抑制剂，通过与[1]所述的抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物联用，使该偶联物的作用上升。
[68]一种医药组合物，其包含用于与[1]所述的抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物联用的PARP抑制剂。
[69]一种医药组合物，其包含[1]所述的抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物，通过与PARP抑制剂联用，使PARP抑制剂的作用上升。
[70]根据[1]所述的医药组合物，其中，所述吡咯并苯并二氮杂卓衍生物在DNA的小沟中未形成交联。
[71]根据[1]所述的医药组合物，其中，癌症对PARP抑制剂为非敏感性。
[72]根据[1]所述的医药组合物，其中，癌症不依赖于同源重组(HR)依赖性DNA双链断裂(DSB)修复途径。
[73]根据[34]～[64]中任一项所述的治疗方法，其特征在于，在各自不同的制剂中作为有效成分而含有[1]所述的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂，抗体－药物偶联物与PARP抑制剂同时或在不同的时间进行给药。
发明效果
本发明作为癌症的治疗方法和/或抗癌剂是有用的。
附图说明
图1是显示皮下移植了人胰腺癌细胞株CFPAC－1细胞的小鼠中的抗HER2抗体－药物偶联物ADC2和他拉唑帕尼各自的单剂给药组、以及HER2抗体－药物偶联物ADC2与他拉唑帕尼的联合给药组的肿瘤生长抑制效果的图。
图2是显示皮下移植了人乳腺癌株JIMT－1细胞的小鼠中的抗HER2抗体－药物偶联物ADC2和奥拉帕尼各自的单剂给药组、以及HER2抗体－药物偶联物ADC2与奥拉帕尼的联合给药组的肿瘤生长抑制效果的图。
图3是显示皮下移植了人乳腺癌株JIMT－1细胞的小鼠中的抗HER2抗体－药物偶联物ADC2和他拉唑帕尼各自的单剂给药组、以及抗HER2抗体－药物偶联物ADC2与他拉唑帕尼的联合给药组的肿瘤生长抑制效果的图。
图4是显示皮下移植了人咽喉癌细胞株FaDu的小鼠中的抗TROP2抗体－药物偶联物ADC3和奥拉帕尼各自的单剂给药组、以及抗TROP2抗体－药物偶联物ADC3与奥拉帕尼的联合给药组的肿瘤生长抑制效果的图。
图5是显示皮下移植了人咽喉癌细胞株FaDu的小鼠中的抗TROP2抗体－药物偶联物ADC3和他拉唑帕尼各自的单剂给药组、以及抗TROP2抗体－药物偶联物ADC3与他拉唑帕尼的联合给药组的肿瘤生长抑制效果的图。
图6表示人CLDN6的全长氨基酸序列(序列号1)和全长cDNA的碱基序列(序列号2)。
图7表示人CLDN9的全长氨基酸序列(序列号3)和全长cDNA的碱基序列(序列号4)。
图8表示B1抗体轻链的CDRL1～3的氨基酸序列(序列号5～7)。
图9表示人源化B1抗体轻链L4的CDRL3的氨基酸序列(序列号8)。
图10表示B1抗体重链的CDRH1～3的氨基酸序列(序列号9～11)。
图11表示C7抗体轻链的CDRL1～3的氨基酸序列(序列号12～14)。
图12表示C7抗体重链的CDRH1～3的氨基酸序列(序列号15～17)。
图13表示编码B1抗体轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列(序列号18)和B1抗体轻链的可变区的氨基酸序列(序列号19)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图14表示编码B1抗体重链的可变区的cDNA的核苷酸序列(序列号20)和B1抗体重链的可变区的氨基酸序列(序列号21)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图15表示编码C7抗体轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列(序列号22)和C7抗体轻链的可变区的氨基酸序列(序列号23)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图16表示编码C7抗体重链的可变区的cDNA的核苷酸序列(序列号24)和C7抗体重链的可变区的氨基酸序列(序列号25)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图17表示chB1轻链的氨基酸序列(序列号28)和包含编码chB1轻链的氨基酸序列的DNA序列的DNA片段(序列号29)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图18表示chB1轻链的可变区的氨基酸序列(序列号30)和编码chB1轻链可变区的核苷酸序列(序列号31)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图19表示chB1重链的氨基酸序列(序列号32)和编码chB1重链的核苷酸序列(序列号33)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图20表示chB1重链的可变区的氨基酸序列(序列号34)和编码chB1重链的可变区的核苷酸序列(序列号35)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图21表示人源化抗体轻链hL1的氨基酸序列(序列号36)和编码人源化抗体轻链hL1的核苷酸序列(序列号37)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图22表示人源化抗体轻链hL1的可变区的氨基酸序列(序列号38)和编码人源化抗体轻链hL1的可变区的核苷酸序列(序列号39)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图23表示人源化抗体轻链hL2的氨基酸序列(序列号40)和编码人源化抗体轻链hL2的核苷酸序列(序列号41)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图24表示人源化抗体轻链hL2的可变区的氨基酸序列(序列号42)和编码人源化抗体轻链hL2的可变区的核苷酸序列(序列号43)。
图25表示人源化抗体轻链hL3的氨基酸序列(序列号44)和编码人源化抗体轻链hL3的核苷酸序列(序列号45)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图26表示人源化抗体轻链hL3的可变区的氨基酸序列(序列号46)和编码人源化抗体轻链hL3的可变区的核苷酸序列(序列号47)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图27表示人源化抗体轻链hL4的氨基酸序列(序列号48)和编码人源化抗体轻链hL4的核苷酸序列(序列号49)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图28表示人源化抗体轻链hL4的可变区的氨基酸序列(序列号50)和编码人源化抗体轻链hL4的可变区的核苷酸序列(序列号51)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图29表示人源化抗体重链hH1的氨基酸序列(序列号52)和编码人源化抗体重链hH1的核苷酸序列(序列号53)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图30表示人源化抗体重链hH1的可变区的氨基酸序列(序列号54)和编码人源化抗体重链hH1的可变区的核苷酸序列(序列号55)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图31表示人源化抗体重链hH2的氨基酸序列(序列号56)和编码人源化抗体重链hH2的核苷酸序列(序列号57)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图32表示人源化抗体重链hH2的可变区的氨基酸序列(序列号58)和编码人源化抗体重链hH2的可变区的核苷酸序列(序列号59)。
图33表示人源化抗体重链hH3的氨基酸序列(序列号60)和编码人源化抗体重链hH3的核苷酸序列(序列号61)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图34表示人源化抗体重链hH3的可变区的氨基酸序列(序列号62)和编码人源化抗体重链hH3的可变区的核苷酸序列(序列号63)。氨基酸序列中的下划线表示CDR序列。
图35表示利用流式细胞仪得到的B1抗体和C7抗体与人CLDN6和家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9的结合能力。
图36表示利用Mab－ZAP得到的B1抗体和C7抗体的抗体内化活性能力。
图37表示利用流式细胞仪得到的人源化抗CLDN6抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4以及H3L3与CLDN6和家族分子的结合能力。
图38表示曲妥珠单抗轻链的氨基酸序列(序列号64)和重链的氨基酸序列(序列号65)。
图39表示曲妥珠单抗突变体的轻链的氨基酸序列(序列号73)和重链的氨基酸序列(序列号75)。
图40是表示作为人嵌合化抗CLDN6抗体chB1的重链的chB1＿H与作为人源化抗体重链的hH1、hH2以及hH3的氨基酸序列的比较的图。“·”表示与chB1＿H相同的氨基酸残基，记载有氨基酸残基的部位表示经取代的氨基酸残基。
图41是表示作为人嵌合化抗CLDN6抗体chB1的轻链的chB1＿L与作为人源化抗体轻链的hL1、hL2、hL3以及hL4的氨基酸序列的比较的图。“·”表示与chB1＿L相同的氨基酸残基，记载有氨基酸残基的部位表示经取代的氨基酸残基。
图42是显示皮下移植了人卵巢癌细胞株OV－90的小鼠中的抗CLDN6抗体－药物偶联物ADC1和尼拉帕利各自的单剂给药组、以及抗CLDN6抗体－药物偶联物ADC1与尼拉帕利的联合给药组的肿瘤生长抑制效果的图。
具体实施方式
1.抗体－药物偶联物
本发明中使用的抗体－药物偶联物为经由连接子部分在能识别肿瘤细胞中表达的抗原或能与该抗原结合的抗体上结合了抗肿瘤性化合物的抗肿瘤性药物。
本发明的偶联物优选由下式表示：
Figure BDA0003279539650000231
m1为整数1或2(优选为1)，D表示药物，L表示连结N297糖链与D的连接子，Ab表示抗体或该抗体的功能性片段，N297糖链表示与所述抗体的Asn297的侧链结合的糖链。N297糖链也可以为重构的糖链。
＜药物＞
本发明的药物D优选为抗肿瘤性化合物。就本抗肿瘤性化合物而言，本发明的抗体－药物偶联物的连接子的一部分或全部在肿瘤细胞内被切断，抗肿瘤性化合物部分游离，从而表现出抗肿瘤效果。作为本发明的药物D，可列举出包含由下式所示的结构的PBD衍生物。
Figure BDA0003279539650000232
作为本发明的药物D，可列举出在DNA的小沟中未形成交联(crosslink)的PBD衍生物，但并不限定于此。
本发明的抗体－药物偶联物中的药物、即PBD衍生物优选为选自以下的组中的任一个：
Figure BDA0003279539650000241
在此，式中，星号*表示与L结合。
如下述部分结构I(a)或I(b)所示，本发明的PBD衍生物在11’位存在手性碳(asymmetric carbon)，因此存在光学异构体。
Figure BDA0003279539650000242
因此，上述本发明的PBD衍生物分别包含光学异构体和光学异构体的以任意比例的混合物。PBD衍生物的11’位绝对构型可以通过结晶性的产物或中间体或者它们的衍生物的X射线晶体结构分析、Mosher法等NMR来确定。此时，也可以使用以具有已知构型的不对称中心的试剂衍生而得到的结晶性的产物或中间体来确定绝对构型。立体异构体可以通过根据期望使用常规的光学拆分法或分离法分离所合成的本发明的化合物来得到。
本发明的抗体－药物偶联物、其游离药物或者其制造中间体有时也存在立体异构体或者源自手性碳原子的光学异构体、几何异构体、互变异构体或d型、l型、阻转异构体等光学异构体，但这些异构体、光学异构体以及它们的混合物均包含在本发明中。
作为本发明的PBD衍生物的部分结构，优选上述I(a)。优选为选自以下的组中的任一个。
Figure BDA0003279539650000251
在此，式中，星号*表示与L结合。
＜连接子结构＞
本发明的连接子L为连结N297糖链与D的连接子。
所述连接子L由下式表示。
－Lb－La－Lp－NH－B－CH2－O(C＝O)－*
星号*表示与药物D的N10’位氮原子结合，Lb表示将La与N297糖链或重构的N297糖链结合的间隔子。
B表示苯基或杂芳基，优选1，4－苯基、2，5－吡啶基、3，6－吡啶基、2，5－嘧啶基、2，5－噻吩基，更优选1，4－苯基。
Lp表示在活体内或靶细胞内能切断的由氨基酸序列形成的连接子。Lp通过例如酯酶、肽酶等酶的作用被切断。
Lp为由2～7个(优选为2～4个)氨基酸构成的肽残基。即，由2～7个氨基酸通过肽键结合而成的寡肽残基构成。
Lp在N末端与Lb－La－的La的羰基结合，在C末端与连接子的－NH－B－CH2－O(C＝O)－部分中的氨基(－NH－)形成酰胺键。通过所述酯酶等酶将Lp的C末端与－NH－之间的键切断。
构成Lp的氨基酸没有特别限定，例如为L－或D－氨基酸，优选为L－氨基酸。此外，除了α－氨基酸以外，还可以为β－丙氨酸、ε－氨基己酸、γ－氨基丁酸等结构的氨基酸，进而，还可以为例如经N－甲基化的氨基酸等非天然型的氨基酸。
Lp的氨基酸序列没有特别限定，作为构成的氨基酸，可列举出甘氨酸(Gly；G)、缬氨酸(Val；V)、丙氨酸(Ala；A)、苯丙氨酸(Phe；F)、谷氨酸(Glu；E)、异亮氨酸(Ile；I)、脯氨酸(Pro；P)、瓜氨酸(Cit)、亮氨酸(Leu；L)、丝氨酸(Ser；S)、赖氨酸(Lys；K)以及天冬氨酸(Asp；D)等。其中，优选甘氨酸(Gly；G)、缬氨酸(Val；V)、丙氨酸(Ala；A)、瓜氨酸(Cit)。
这些氨基酸可以重复，具有包含任意选择的氨基酸的氨基酸序列。此外，可以根据氨基酸的种类来控制药物游离的模式。
作为连接子Lp的具体例子，可列举出－GGVA－、－GG－(D－)VA－、－VA－、－GGFG－、－GGPI－、－GGVCit－、－GGVK－、－GG(D－)PI－、－GGPL－、－EGGVA、－PI－、－GGF－、－DGGF－、(D－)D－GGF－、－EGGF－、－SGGF－、－KGGF－、－DGGFG－、－GGFGG－、－DDGGFG－、－KDGGFG－、－GGFGGGF－。
在此，上述的『(D－)V』表示D－缬氨酸，『(D－)P』表示D－脯氨酸，『(D－)D』表示D－天冬氨酸。
连接子Lp优选以下－GGVA－、－GG－(D－)VA－、－VA－、－GGFG－、－GGPI－、－GGVCit－、－GGVK－、－GG(D－)PI－、－GGPL－。
连接子Lp更优选以下－GGVA－、－GGVCit－、－VA－。
La表示选自以下的组中的任一个：－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)n3－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)n3－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－NH－C(＝O)－(CH2CH2O)n3－CH2CH2－C(＝O)－、－(CH2)n4－O－C(＝O)－。
在此，式中，n2表示整数1～3(优选1或2)，n3表示整数1～5(优选整数2～4，更优选2或4)，n4表示整数0～2(优选0或1)。
La优选表示选自以下的组中的任一个：－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)2－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－NH－C(＝O)－(CH2CH2O)4－CH2CH2－C(＝O)－、－CH2－OC(＝O)－以及－OC(＝O)－。
La更优选为－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－或－C(＝O)－(CH2CH2)2－C(＝O)－。
Lb间隔子没有特别限定，可列举出例如下式所示的间隔子。
(Lb-1)
Figure BDA0003279539650000271
或者
Figure BDA0003279539650000272
(Lb-2)
Figure BDA0003279539650000273
或者
Figure BDA0003279539650000274
(Lb-3)
Figure BDA0003279539650000275
或者
Figure BDA0003279539650000276
上述所示的Lb的各结构式中，星号*表示与La的左端的－(C＝O)或－(CH2)n4结合，波浪线表示与Ab的N297糖链或重构的N297糖链结合。
上述所示的Lb(Lb－1、Lb－2或Lb－3)的各结构式中，通过叠氮基与DBCO的点击反应(click reaction)形成的三唑环部位具有几何异构结构，在一个Lb中，以这两种结构中的任一者或以它们的混合物的形式存在。即，本发明的抗体－药物偶联物一个分子中存在两个或四个(m1为1或2)『－L－D』，且两个或四个『－L－D』各自的L中各个Lb(Lb－1、Lb－2或Lb－3)以这两种结构中的任一者或两者混合存在。
L优选由－Lb－La－Lp－NH－B－CH2－O(C＝O)－*表示，B为1，4－苯基，Lp表示选自以下的组中的任一个：－GGVA－、－GG－(D－)VA－、－VA－、－GGFG－、－GGPI－、－GGVCit－、－GGVK－、－GGPL－，La表示选自以下的组中的任一个：－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)2－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－NH－C(＝O)－(CH2CH2O)4－CH2CH2－C(＝O)－、－CH2－OC(＝O)－、－OC(＝O)－，Lb表示上述所示的Lb中的任意结构式。
L更优选为选自以下的组中的任一个：－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GG－(D－)VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－(CH2CH2)2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGPI－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGFG－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVCit－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVK－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGPL－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)2－CH2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－NH－C(＝O)－(CH2CH2O)4－CH2CH2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z2－OC(＝O)－GGVA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z3－CH2－OC(＝O)－GGVA－NH－B－CH2－OC(＝O)－。
在此，Z1表示上述Lb的以下所示的结构式：
Figure BDA0003279539650000281
或者
Figure BDA0003279539650000282
Z2表示上述Lb的以下所示的结构式：
Figure BDA0003279539650000283
或者
Figure BDA0003279539650000284
Z3表示上述Lb的以下所示的结构式：
Figure BDA0003279539650000291
或者
Figure BDA0003279539650000292
B为1，4－苯基。
L最优选为以下的任一个：－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－(CH2CH2)2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVCit－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－、－Z1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)2－CH2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－以及－Z1－C(＝O)－CH2CH2－NH－C(＝O)－(CH2CH2O)4－CH2CH2－C(＝O)－VA－NH－B－CH2－OC(＝O)－。
在此，B为1，4－苯基，Z1为上述Lb的以下所示的结构式：
Figure BDA0003279539650000293
或者
Figure BDA0003279539650000294
＜游离药物＞
本发明的抗体－药物偶联物的游离药物为选自以下的组中的一个。
Figure BDA0003279539650000295
本发明的游离药物在本发明的抗体－药物偶联物转移至肿瘤细胞内后，抗体－药物偶联物中的连接子L部分被切断而生成。确认到该游离药物的抗肿瘤细胞效果。
＜抗体＞
本发明中，“癌”与“肿瘤”用作相同的含义。
本发明中，“基因”是指包含编码蛋白质的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸或者核苷酸序列、或其互补链，例如，作为包含编码蛋白质的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列或其互补链的多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、RNA等包含在“基因”的含义中。作为“CLDN6基因”，可列举出例如包含编码CLDN6蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA、mRNA、cDNA、cRNA等。
本发明中，“核苷酸”、“多核苷酸”或“核苷酸序列”与“核酸”含义相同，例如DNA、RNA、探针、寡核苷酸、多核苷酸、引物等也包含在“核苷酸”或“核苷酸序列”的含义中。
本发明中，无区别地使用“多肽”、“肽”、“蛋白质”。
本发明中，“CLDN6”与CLDN6蛋白质用作相同的含义。
本发明中，“细胞”也包含动物个体内的细胞、培养细胞。
本发明中，“细胞毒活性”是指以某种形式对细胞引起病理性变化，不仅限于直接的外伤，也指引起DNA的切断、碱基的二聚物的形成、染色体的切断、细胞分裂装置的损伤、各种酶活性的降低等所有的细胞的结构、功能上的损伤。
本发明中，“抗体的功能性片段”也称为“抗体的抗原结合片段”，是指具有与抗原的结合活性的抗体的部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异抗体(diabody)、线状抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体等。此外，将F(ab’)2在还原条件下进行处理后的抗体的可变区的单价片段、即Fab’也包含在抗体的抗原结合片段中。但是，只要具有与抗原的结合能力，就不限定于这些分子。此外，这些抗原结合片段不仅包含将抗体蛋白质的全长分子用适当的酶处理后的分子，也包含使用经基因工程改造的抗体基因而在适当的宿主细胞中产生的蛋白质。
本发明的功能性片段包含保持受到在IgG重链的Fc区中良好地保存的N连接型糖链引起的修饰的天冬酰胺(Asn297)及其周边的氨基酸，且具有与抗原的结合能力的功能性片段。
本发明中，“抗原决定基”是指特定的抗体(例如抗CLDN6抗体)所结合的抗原的部分肽或部分立体结构(例如CLDN6的部分肽或部分立体结构)。作为所述部分肽(例如CLDN6的部分肽)的抗原决定基可以通过免疫测定法等本领域技术人员公知的方法来决定。
本发明中的“CDR”是指互补决定区(CDR：Complementarity determiningregion)。已知抗体分子的重链和轻链分别有三处CDR。CDR也被称为高变区(hypervariableregion)，在抗体的重链和轻链的可变区内是一级结构的变异性特别高的部位，在重链和轻链的多肽链的一级结构上分别分离于三处。本说明书中，对于抗体的CDR，从重链氨基酸序列的氨基末端侧起将重链的CDR记为CDRH1、CDRH2、CDRH3，从轻链氨基酸序列的氨基末端侧起将轻链的CDR记为CDRL1、CDRL2、CDRL3。这些部位在立体结构上相互靠近，决定与要结合的抗原的特异性。
本发明中，“在严格的条件下杂交”是指在市售的杂交溶液ExpressHybHybridization Solution(Clontech公司)中在68℃下杂交；或在如下条件或与其同等的条件下进行杂交：在使用固定有DNA的过滤器在0.7－1.0M的NaCl存在下、在68℃下进行杂交后，使用0.1－2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度SSC包含150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)，在68℃下清洗，由此能进行鉴定的条件。
本发明中，“1～几个”是指1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个或1～2个。
本发明中，有时将识别或结合CLDN6或者CLDN6及CLDN9的抗体分别标记为“抗CLDN6抗体”、“抗CLDN6/CLDN9抗体”。所述抗体中包含嵌合化抗体、人源化抗体、人抗体等。有时将识别或结合CLDN6及CLDN9的抗体标记为“抗CLDN6抗体”。
本发明的抗体－药物偶联物中使用的抗体是指免疫球蛋白，是含有与抗原免疫特异性结合的抗原结合部位的分子。作为本发明的抗体，可以是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY中的任一类，优选IgG。此外，作为亚类(subclass)，可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2中的任一种，优选IgG1、IgG2、IgG4。在使用IgG1或IgG4的情况下，可以通过取代恒定区的氨基酸残基的一部分来调整效应物(effector)功能(参照WO88/07089，WO94/28027，WO94/29351)。
此外，在使用IgG1作为本发明的抗体的同种型(isotype)的情况下，可以通过取代恒定区的氨基酸残基的一部分来调整效应物功能。作为减少或减弱效应物功能的IgG1的突变体，可列举出IgG1 LALA(IgG1－L234A、L235A)、IgG1 LAGA(IgG1－L235A、G237A)等，优选IgG1 LALA。需要说明的是，所述L234A、L235A表示由EU index(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.63,No.1(May 15,1969),pp.78-85)特定的234位、235位亮氨酸被丙氨酸取代，G237A表示由EU index特定的237位甘氨酸被丙氨酸取代。
本发明的抗体优选为能以肿瘤细胞作为靶点的抗体。
本发明的抗体－药物偶联物结合了发挥抗肿瘤效果的化合物，因此虽然优选抗体本身具有抗肿瘤效果，但不是必须的。出于在肿瘤细胞中特异性/选择性地发挥抗肿瘤性化合物的细胞毒性的目的，重要且优选的是，抗体或抗体－药物偶联物具有内化并转移至肿瘤细胞内的性质。从发挥抗肿瘤效果方面考虑，抗体或抗体－药物偶联物具有内化并转移至肿瘤细胞内的性质，对于利用药物对肿瘤细胞进行特异性/选择性伤害方面是重要且优选的。抗体的抗肿瘤活性是指对肿瘤细胞的细胞毒活性、抗细胞效应。可以使用公知的体外(in vitro)或体内(In vivo)的评价系统来确认抗肿瘤活性。抗体的内化能力可以使用公知的评价系统来测定。
作为这样的抗体，可列举出针对肿瘤相关抗原的抗体，可举例示出抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3(Delta likeprotein3：δ样蛋白3)抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7－H3(CD276)抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体(WO201315206等)、抗G250抗体、抗MUC1抗体(WO2011012309等)、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4(癌胚抗原5T4；也称为TPBG和滋养层糖蛋白)抗体、抗LRRC15(Leucine-rich repeat-containing protein 15：富含亮氨酸重复蛋白15)抗体、抗DR5抗体、抗CDH3(cadherin 3：钙粘着蛋白3)抗体、抗PDPN(podoplanin：平足蛋白)抗体或抗CD123抗体，但并不限定于此。
作为本发明的抗体，优选抗CLDN6抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗CD98抗体、抗TROP2抗体，进一步优选抗CLDN6抗体、抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体、曲妥珠单抗突变体2)。
以下，对本发明中使用的抗CLDN6抗体进行说明。
1.CLDN6和CLDN9
CLDN6为属于Claudin家族的包含220个氨基酸的四次跨膜型蛋白质，在细胞内具有N末端和C末端。
人CLDN6的氨基酸序列和DNA序列在公共数据库中公开，可以根据例如NP_067018(序列号1)、NM_021195(序列号2(均为NCBI)等登录号进行参照。
关于人CLDN6蛋白质的氨基酸序列(以下称为“CLDN6氨基酸序列”)，细胞外区包括包含序列表的序列号1的氨基酸编号29～81的细胞外结构域(EC1)和包含氨基酸编号138～160的细胞外结构域(EC2)。
CLDN9为属于Claudin家族的包含217个氨基酸的四次跨膜型蛋白质，在细胞内具有N末端和C末端。CLDN9与CLDN6具有高度同源性。
人CLDN9的氨基酸序列和DNA序列在公共数据库中公开，可以根据例如NP_066192(序列号3)、NM_020982(序列号4)(均为NCBI)等登录号进行参照。
2.抗CLDN6抗体
作为本发明的抗CLDN6抗体的一个例子，可列举出识别包含从序列表的序列号1所示的CLDN6的N末端起第29～81号的氨基酸序列以及第138～160号的氨基酸序列的两个细胞外区的高级结构，且具有内化活性的抗CLDN6抗体。
本发明的抗CLDN6抗体是能以肿瘤细胞作为靶点的抗体，即具备能识别肿瘤细胞的特性、能与肿瘤细胞结合的特性、以及被吞入肿瘤细胞内而内化的特性等。因此，本发明的抗CLDN6抗体与具有抗肿瘤活性的化合物经由连接子而结合，从而能形成抗体－药物偶联物。
本发明的抗CLDN6抗体可以具有抗肿瘤活性。
(1)本发明的抗CLDN6抗体具有以下(a)和(b)的特性。
(a)识别或结合CLDN家族。
本发明的抗体识别CLDN家族。换言之，本发明的抗体与CLDN家族结合。本发明的抗体优选与CLDN6结合，更优选与CLDN6特异性结合。进而，本发明的抗体可以识别CLDN9或与CLDN9结合。
本发明中，“特异性识别”即“特异性结合”是指不是非特异性吸附的结合。作为结合是否为特异性的判定基准，可列举出例如解离常数(Dissociation Constant：以下称为“KD”)。本发明的优选的抗体对CLDN6和/或CLDN9的KD值为1×10－5M以下、5×10－6M以下、2×10－6M以下或1×10－6M以下、更优选为5×10－7M以下、2×10－7M以下或1×10－7M以下。
本发明的抗原与抗体的结合可以通过ELISA法、RIA法、Surface PlasmonResonance(表面等离子体共振，以下称为“SPR”)解析法等来测定或判定。细胞表面上表达的抗原与抗体的结合可以通过流式细胞仪法等来测定。
(b)具有通过与CLDN6和/或CLDN9结合而在CLDN6和/或CLDN9表达细胞中内化的活性。
(2)根据上述(1)所述的抗体，其中，CLDN6和/或CLDN9为人CLDN6和/或人CLDN9。
本发明的抗CLDN6单克隆抗体可以通过使用杂交瘤的方法等来得到。作为抗CLDN6单克隆抗体的例子，可列举出小鼠抗CLDN6抗体B1和C7。需要说明的是，本发明中，有时也将所述“B1”记为“B1抗体”，将所述“C7”记为“C7抗体”。
B1抗体的重链可变区的碱基序列记载于序列表的序列号20，氨基酸序列记载于序列号21。此外，B1抗体的轻链可变区的碱基序列记载于序列表的序列号18，氨基酸序列记载于序列号19。
B1抗体的CDRH1的氨基酸序列记载于序列号9，CDRH2的氨基酸序列记载于序列号10，CDRH3的氨基酸序列记载于序列号11，CDRL1的氨基酸序列记载于序列号5，CDRL2的氨基酸序列记载于序列号6，CDRL3的氨基酸序列记载于序列号7。
C7抗体的重链可变区的碱基序列记载于序列表的序列号24，氨基酸序列记载于序列号25。此外，C7抗体的轻链可变区的碱基序列记载于序列表的序列号22，氨基酸序列记载于序列号23。
C7抗体的CDRH1的氨基酸序列记载于序列号15，CDRH2的氨基酸序列记载于序列号16，CDRH3的氨基酸序列记载于序列号17，CDRL1的氨基酸序列记载于序列号12，CDRL2的氨基酸序列记载于序列号13，CDRL3的氨基酸序列记载于序列号14。
作为本发明的抗CLDN6抗体，可列举出与B1抗体或C7抗体结合于同一抗原决定基的抗体。如果该抗体结合于B1抗体或C7抗体所结合的部分肽或部分立体结构，则可以判定为该抗体与B1抗体或C7抗体结合于同一抗原决定基。此外，通过确认该抗体在B1抗体或C7抗体与CLDN6的结合中存在竞争(即该抗体妨碍B1抗体或C7抗体与CLDN6的结合)，即使未决定具体的抗原决定基的序列或结构，也可以判定为该抗体与抗CLDN6抗体结合于同一抗原决定基。在确认到抗原决定基相同的情况下，可强烈期待该抗体具有与B1抗体或C7抗体同等的抗原结合能力、生物活性和/或内化活性。
除了上述针对CLDN6的单克隆抗体以外，本发明的抗体还包含出于降低针对人的异种抗原性等目的而经人工修饰的基因重组型抗体，例如，嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、人抗体等。这些抗体可以使用已知的方法来制造。
(1)嵌合抗体
作为嵌合抗体，可列举出抗体的可变区和恒定区互为异种的抗体，例如将源自小鼠或大鼠的抗体的可变区与源自人的恒定区接合而成的嵌合抗体。
作为本发明的嵌合抗体所举例示出的源自小鼠抗人CLDN6抗体B1抗体的嵌合抗体为包含如下重链和轻链的抗体，可以具有任意源自人的恒定区，所述重链包含由序列号21所示的氨基酸序列形成的重链可变区，所述轻链包含序列号19所示的轻链可变区。
作为源自小鼠抗人CLDN6抗体B1抗体的嵌合抗体的具体例子，可列举出源自小鼠抗人CLDN6抗体B1抗体的嵌合抗体chB1抗体(以下也记为“chB1”)。可列举出chB1抗体的氨基酸序列包含具有由序列表的序列号32的第20～471号氨基酸残基形成的氨基酸序列的重链和具有由序列表的序列号28的21～234形成的氨基酸序列的轻链的抗体。
需要说明的是，序列表的序列号32所示的重链序列中，由第1～19号氨基酸残基形成的氨基酸序列为信号序列，由第20～141号氨基酸残基形成的氨基酸序列为重链可变区，由第142～471号残基形成的氨基酸序列为重链恒定区。此外，序列表的序列号28所示的轻链序列中，由第1～20号氨基酸残基形成的氨基酸序列为信号序列，由第21～127号氨基酸残基形成的氨基酸序列为轻链可变区，由第128～234号氨基酸残基形成的氨基酸序列为轻链恒定区。
chB1抗体的重链和轻链的可变区的氨基酸序列记载于序列表的序列号34、序列号30。
chB1抗体的重链氨基酸序列由序列表的序列号33所示的核苷酸序列编码。由序列表的序列号33所示的核苷酸序列的第1～57号核苷酸形成的核苷酸序列编码chB1抗体重链的信号序列，由序列表的序列号33所示的核苷酸序列的第58～423号核苷酸形成的核苷酸序列编码chB1抗体的重链可变区，由序列表的序列号33所示的核苷酸序列的第424～1413号核苷酸形成的核苷酸序列编码chB1抗体的重链恒定区。
chB1抗体的重链可变区的碱基序列记载于序列表的序列号35。
chB1抗体的轻链氨基酸序列由序列表的序列号29所示的核苷酸序列编码。由序列表的序列号29所示的核苷酸序列的第26～85号核苷酸形成的核苷酸序列编码chB1抗体轻链的信号序列，由序列表的序列号29所示的核苷酸序列的第86～406号核苷酸形成的核苷酸序列编码chB1抗体的轻链可变区，由序列表的序列号29所示的核苷酸序列的第407～727号核苷酸形成的核苷酸序列编码chB1抗体的轻链恒定区。
chB1抗体的轻链可变区的碱基序列记载于序列表的序列号31。
(2)人源化抗体
作为人源化抗体，可列举出仅将互补决定区(CDR；complementarity determiningregion)掺入源自人的抗体的抗体(参照Nature(1986)321,p.522-525)，通过CDR移植法将CDR的序列和一部分框架的氨基酸残基都移植于人抗体中的抗体(WO90/07861号)；以及维持对抗原的结合能力并且改变了一部分CDR的氨基酸序列的抗体。
CDR的氨基酸序列可以通过Kabat的定义、Chothia的定义、Abm的定义、IMGT等公知的方法来决定，但本发明中的CDR可以通过任意方法来定义。
其中，作为源自B1抗体或C1抗体的人源化抗体，只要保持B1抗体或C1抗体的所有6种CDR序列并具有CLDN6结合活性，就不限定于特定的人源化抗体，而且，只要改变了1～几个(优选1～2个，更优选1个)CDR的氨基酸序列的人源化抗体突变体也识别CLDN6蛋白质或具有该抗体的CLDN6蛋白质结合活性，就不限定于特定的人源化抗体。
作为本发明的抗CLDN6人源化抗体或其功能性片段，可列举出例如：包含具有可变区的重链和具有可变区的轻链，识别本发明的CLDN6蛋白质或保持该抗体的CLDN6蛋白质结合活性的抗体或该抗体的功能性片段等，其中，所述重链所具有的可变区包含：由序列表的序列号9所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的1～几个(优选1～2个)氨基酸被取代了的氨基酸序列形成的CDRH1；由序列表的序列号10所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的1～几个(优选1～2个)氨基酸被取代了的氨基酸序列形成的CDRH2；以及由序列表的序列号11所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的1～几个(优选1～2个)氨基酸被取代了的氨基酸序列形成的CDRH3，所述轻链所具有的可变区包含：由序列表的序列号5所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的1～几个(优选1～2个)氨基酸被取代了的氨基酸序列形成的CDRL1；由序列表的序列号6所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的1～几个(优选1～2个)氨基酸被取代了的氨基酸序列形成的CDRL2；以及由序列表的序列号7所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的1～几个(优选1～2个)氨基酸被取代了的氨基酸序列形成的CDRL3。
作为上述抗CLDN6人源化抗体或其功能性片段的CDR的氨基酸取代的例子，优选列举出上述CDRL3的1～几个(优选1～2个)氨基酸取代，可举例示出将序列表的序列号7的氨基酸编号4号和5号氨基酸取代后的序列表的序列号8所示的CDRL3。
作为上述具有CDRH的人源化抗体的重链可变区，可举例示出：序列表的序列号54所示的氨基酸序列、序列表的序列号58所示的氨基酸序列以及序列表的序列号62所示的氨基酸序列；作为上述具有CDRL的人源化抗体的轻链可变区，可举例示出：序列表的序列号38所示的氨基酸序列、序列表的序列号42所示的氨基酸序列、序列表的序列号46所示的氨基酸序列以及序列表的序列号50所示的氨基酸序列。
作为包含上述重链可变区和轻链可变区的组合的人源化抗体，可优选举例示出：包含由序列表的序列号54所示的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列表的序列号38所示的氨基酸序列形成的轻链可变区而形成的人源化抗体；包含由序列表的序列号58所示的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列表的序列号42所示的氨基酸序列形成的轻链可变区而形成的人源化抗体；包含由序列表的序列号54所示的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列表的序列号46所示的氨基酸序列形成的轻链可变区而形成的人源化抗体；包含由序列表的序列号58所示的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列表的序列号50所示的氨基酸序列形成的轻链可变区而形成的人源化抗体；以及包含由序列表的序列号62所示的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列表的序列号46所示的氨基酸序列形成的轻链可变区而形成的人源化抗体。
作为包含上述重链可变区和轻链可变区的组合而形成的人源化抗体的全长序列，可举例示出：包含由序列表的序列号52的氨基酸编号20～471所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号36的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H1L1)；包含由序列表的序列号56的氨基酸编号20～471所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号40的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H2L2)；包含由序列表的序列号52的氨基酸编号20～471所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号44的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H1L3)；包含由序列表的序列号56的氨基酸编号20～471所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号48的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H2L4)；或包含由序列表的序列号60的氨基酸编号20～471所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号44的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H3L3)。
需要说明的是，序列表的序列号52、56或60所示的重链氨基酸序列中，由第1～19号氨基酸残基形成的氨基酸序列为信号序列，由第20～141号氨基酸残基形成的氨基酸序列为重链可变区，由第142～471号氨基酸残基形成的氨基酸序列为重链恒定区。
此外，序列表的序列号36、40、44或48所示的轻链氨基酸序列中，由第1～20号氨基酸残基形成的氨基酸序列为信号序列，由第21～127号氨基酸残基形成的氨基酸序列为轻链可变区，由第128～234号氨基酸残基形成的氨基酸序列为轻链恒定区。
如下文所述，上述人源化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3的重链的羧基末端可以缺失1或2个氨基酸，该缺失体也包含在本发明中。
作为缺失体的重链，可列举出包含序列表的序列号52、56、60的氨基酸编号第20～470号所记载的氨基酸序列的重链。
作为所述缺失体，可举例示出：包含由序列表的序列号52的氨基酸编号20～470所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号36的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H1L1)；包含由序列表的序列号56的氨基酸编号20～470所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号40的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H2L2)；包含由序列表的序列号52的氨基酸编号20～470所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号44的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H1L3)；包含由序列表的序列号56的氨基酸编号20～470所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号48的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H2L4)；或包含由序列表的序列号60的氨基酸编号20～470所示的氨基酸序列形成的重链和由序列表的序列号44的氨基酸编号21～234所示的氨基酸序列形成的轻链而形成的人源化抗体(H3L3)。
与包含上述重链可变区和轻链可变区的组合而形成的抗体或包含上述重链和轻链的组合而形成的抗体的氨基酸序列的同一性或同源性为80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、最优选99％以上的抗体只要具有与CLDN6的结合活性，就也包含在本发明的抗体中。
此外，与包含上述重链可变区和轻链可变区的组合而形成的抗体或具有由与包含上述重链和轻链的组合而形成的抗体的CDR相同的氨基酸序列构成的CDR，且除去该抗体的CDR的氨基酸序列后的氨基酸序列的同一性或同源性为80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、最优选99％以上的抗体只要具有与CLDN6的结合活性，就也包含在本发明的抗体中。
而且，通过组合在重链或轻链的氨基酸序列中取代、缺失或添加了1～几个氨基酸残基的氨基酸序列，也可以选择与上述的各抗体具有同等生物活性的抗体。此外，作为本说明书中的氨基酸的取代，优选保守的氨基酸取代(WO2013154206)。
保守的氨基酸取代是指在与氨基酸侧链相关的氨基酸组内发生的取代。所述氨基酸取代优选在不使具有原始氨基酸序列的物质的特性降低的范围内进行。
两种氨基酸序列间的同源性可以通过使用Blast算法版本2.2.2(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)的系统内定参数(default parameter)来决定。Blast算法也可以通过在网络上访问www.ncbi.nlm.nih.gov/blast来使用。
(3)人抗体
作为本发明的抗体，还可列举出与CLDN6和/或CLDN9结合的人抗体。抗CLDN6和/或CLDN9人抗体是指仅具有源自人染色体的抗体的基因序列的人抗体。就抗CLDN6人抗体而言，还已知可以通过公知的方法来得到(Nature Genetics(1997)16,p.133-143、Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448、Animal Cell Technology:Basic and AppliedAspects,vol.10,p.69-73、Kluwer Academic Publishers,1999.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727、Investigative Ophthalmology&VisualScience.(2002)43(7),p.2301-2308、Briefings in Functional Genomics andProteomics(2002),1(2),p.189-203、Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
以下，对本发明中使用的抗HER2抗体进行说明。
本发明的抗HER2抗体具有以下的特性。
(1)一种抗HER2抗体，其特征在于，具有以下的特性。
(a)与HER2特异性结合。
(b)具有通过与HER2结合而内化于HER2表达细胞的活性。
(2)根据上述(1)所述的抗体，其与HER2的细胞外结构域结合。
(3)根据上述(1)或(2)所述的抗体，其中，所述抗体为单克隆抗体。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的抗体，其具有抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性和/或补体依赖性细胞毒(CDC)活性。
(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其为小鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
(6)根据上述(1)～(3)以及(5)中任一项所述的抗体，其中，重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含引起ADCC和/或CDC活性降低的变异。
(7)根据上述(6)所述的抗体，其中，重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，由EUIndex所示的234位和235位亮氨酸被丙氨酸取代。
(8)根据上述(1)～(5)中任一项所述的抗体，其为包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号64所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
(9)根据上述(1)～(3)以及(5)～(7)中任一项所述的抗体，其为包含由序列号75的氨基酸编号20～139所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号73的氨基酸编号21～127所述的氨基酸序列形成的轻链可变区的抗体。
(10)根据上述(1)～(3)、(5)～(7)以及(9)中任一项所述的抗体，其为包含由序列号75的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号73的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
(11)根据上述(1)～(3)、(5)～(7)以及(9)中任一项所述的抗体，其为包含由序列号77的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号76的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
(12)根据上述(1)～(11)中任一项所述的抗体，其中，在重链羧基末端缺失1个或2个氨基酸。
(13)根据上述(1)～(5)、(8)以及(12)中任一项所述的抗体，其包含由序列号65的氨基酸编号1～449所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号64的氨基酸编号1～214所述的氨基酸序列形成的轻链。
(14)根据上述(1)～(3)、(5)～(7)、(9)、(10)以及(12)中任一项所述的抗体，其包含由序列号75的氨基酸编号20～468所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号73的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
(15)根据上述(1)～(3)、(5)～(7)、(9)、(11)以及(12)中任一项所述的抗体，其包含由序列号77的氨基酸编号20～468所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号76的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
(16)一种抗体，其由包括下述工序的该抗体的制造方法得到：培养通过含有编码上述(1)～(15)中任一项所述的抗体的多核苷酸的表达载体被转化后的宿主细胞的工序；以及从由该工序得到的培养物中选取目标抗体的工序。
需要说明的是，本申请中，将曲妥珠单抗的重链恒定区(序列号65)的由EU Index所示的234位和235位亮氨酸被丙氨酸取代的抗体称为曲妥珠单抗突变体或曲妥珠单抗突变体2。
本发明的抗体也包括抗体的修饰体。该修饰体是指对本发明的抗体实施化学或生物学修饰而得到的修饰体。化学修饰体包括化学部分与氨基酸骨架的键合、N－连接或O－连接碳水化合物链的化学修饰体等。生物学修饰体包括经翻译后修饰(例如N－连接糖基化或O－连接糖基化、N末端或C末端的加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、蛋氨酸的氧化)的修饰体、通过使用原核生物宿主细胞来表达而在N末端添加了蛋氨酸残基的修饰体等。此外，为了可以检测或分离本发明的抗体或抗原而标记的标记体，例如酶标记体、荧光标记体、亲和标记体也包含在该修饰体的含义中。这样的本发明的抗体的修饰体对于改善抗体的稳定性和血中滞留性、降低抗原性、检测或分离抗体或抗原等有用。
此外，通过调节与本发明的抗体结合的糖链修饰(糖基化、脱岩藻糖化等)，可以增强抗体依赖性细胞毒活性。作为抗体的糖链修饰的调节技术，已知有WO1999/54342、WO2000/61739、WO2002/31140、WO2007133855、WO2013120066等，但并不限定于此。本发明的抗体也包含调节了该糖链修饰的抗体。
该修饰可以在抗体或其功能性片段的任意位置或在期望的位置实施，也可以在一个或两个以上的位置进行相同或两种以上的不同的修饰。
本发明中，“抗体片段的修饰体”的含义中也包含“抗体的修饰体的片段”。
一旦分离抗体基因后，在将其导入适当的宿主中来制作抗体的情况下，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。作为抗体基因的具体例子，可列举出将本说明书中记载的抗体的编码重链序列等的基因与编码轻链序列等的基因组合而成的基因。在转化宿主细胞时，重链序列基因等和轻链序列基因等可以插入同一表达载体中，也可以插入不同的表达载体中。
在将真核细胞用作宿主的情况下，可以使用动物细胞、植物细胞、真核微生物。特别是，作为动物细胞，可列举出哺乳类细胞，例如作为猴子的细胞的COS细胞(Cell(1981)23,p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶缺陷株(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126-4220)、FreeStyle 293F细胞(Invitrogen公司)。
在使用原核细胞的情况下，可列举出例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
通过将目标抗体基因通过转化导入这些细胞中，在体外培养转化后的细胞，从而得到抗体。在该培养中，有时产量会根据抗体的序列而不同，可以从具有同等结合活性的抗体中选择以产量为指标容易作为医药生产的抗体。由此，本发明的抗体也包括通过下述抗体的制造方法得到的抗体，所述制造方法的特征在于，其包括：培养上述转化后的宿主细胞的工序；以及从由该工序得到的培养物中选取目标抗体或该抗体的功能性片段的工序。
上述抗体基因优选为包含以下(a)～(e)中任一项所述的多核苷酸的多核苷酸。
(a)编码B1或者C7抗体、chB1抗体、人源化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、曲妥珠单抗及其突变体中的任一种抗体的重链氨基酸序列的多核苷酸与编码轻链氨基酸序列的多核苷酸的组合。
(b)编码B1或者C7抗体、chB1抗体以及人源化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、曲妥珠单抗及其突变体中的任一种抗体的包含CDRH1～CDRH3的重链氨基酸序列的多核苷酸与编码包含CDRL1～CDRL3的轻链氨基酸序列的多核苷酸的组合。
(c)编码B1或者C7抗体、chB1抗体以及人源化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、曲妥珠单抗及其突变体中的任一种抗体的包含重链可变区的氨基酸序列的重链氨基酸序列的多核苷酸与编码包含轻链可变区的氨基酸序列的轻链氨基酸序列的多核苷酸的组合。
(d)与由与(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸互补的多核苷酸构成的核苷酸在严格的条件下杂交，且编码与CDLN6或HER2结合的抗体的氨基酸序列的多核苷酸。
以及(e)编码在(a)～(c)中任一项所述的多核苷酸中取代、缺失、添加或插入1～50个、1～45个、1～40个、1～35个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、1～8个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或者2个或1个氨基酸而成的多肽的氨基酸序列，且编码与CLDN6或HER2结合的抗体的氨基酸序列的多核苷酸。
本发明包括编码本发明的抗体或其功能性片段或其修饰体的核苷酸、插入该基因的重组载体以及导入了该基因或该载体的细胞。
此外，本发明也包括抗体或其功能性片段或其修饰体的制造方法，所述制造方法包括培养所述细胞的工序、以及从该培养物中回收抗体或其功能性片段或其修饰体的工序。
需要说明的是，已知在哺乳类培养细胞中生产的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失(Journal of Chromatography A,705:129-134(1995))，还已知相同的重链羧基末端的甘氨酸、赖氨酸这两个氨基酸残基缺失，新位于羧基末端的脯氨酸残基被酰胺化(Analytical Biochemistry，360:75-83(2007))。但是，这些重链序列的缺失和修饰不对抗体的抗原结合能力和效应物功能(补体的活化、抗体依赖性细胞毒作用等)造成影响。因此，本发明的抗体还包含受到该修饰的抗体和该抗体的功能性片段、还包含在重链羧基末端缺失一个或两个氨基酸的缺失体以及被酰胺化的该缺失体(例如羧基末端部位的脯氨酸残基被酰胺化的重链)等。但是，只要保持抗原结合能力和效应物功能，本发明的抗体的重链的羧基末端的缺失体并不限定于上述种类。构成本发明的抗体的两条重链可以是选自由全长和上述缺失体构成的组中的重链的任一种，也可以组合任两种。各缺失体的量比可能受到产生本发明的抗体的哺乳类培养细胞的种类和培养条件的影响，但作为本发明的抗体的主要成分，可列举出两条重链两者中羧基末端的一个氨基酸残基缺失的情况。
所得到的抗体可以精制至均匀。抗体的分离、精制使用通常的蛋白质中使用的分离、精制方法即可。若适当选择、组合例如柱色谱法、过滤器过滤、超滤、盐析、渗析、制备用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等，则能分离、精制抗体(Strategies for ProteinPurification and Characterization:A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshaket al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies:A LaboratoryManual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不限定于此。
＜N297糖链＞
近年来，报道了通过酶促反应等重构不均匀的抗体的糖蛋白并均匀导入具有官能团的糖链的方法(ACS Chemical Biology 2012,7,110，ACS Medicinal ChemistryLetters 2016,7,1005，Bioconjugate Chemistry 2015,26,2233，Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,2361-2367，US2016361436)。
本发明的糖链的重构首先利用水解酶切除添加至蛋白质(抗体等)中的不均匀的糖链而仅仅留下末端的GlcNAc，制备添加了GlcNAc的均匀蛋白质部分(以下称为“受体”)。接着，准备另行制备的任意的糖链(以下称为“供体”)，使用糖基转移酶连结该受体和供体。由此，可以合成具有任意糖链结构的均匀的糖蛋白。
本发明中，“糖链”是指两个以上单糖通过糖苷键结合的结构单元。有时将具体的单糖、糖链以缩写形式表示，例如“GlcNAc－”、“MSG－”。在结构式中用这些缩写描述的情况下，除了具有特别定义的情况以外，还原末端上归属于与其他结构单元的糖苷键的氧原子或氮原子并不包含在表示该糖链的缩写中。
本发明中，除了另有规定的情况以外，为了方便起见，在作为糖链的基本单元的单糖的记载中，在其环结构中与构成环的氧原子结合且与羟基(或归属于糖苷键的氧原子)直接结合的碳原子记为1位(仅唾液酸中为2位)。实施例化合物的名称以化学结构整体来标记，未必适用该规则。
本发明中，在以符号(例如GLY、SG、MSG、GlcNAc等)来记载糖链的情况下，除了另有定义的情况以外，连还原末端的碳都包含在该符号中，但归属于N－或O－糖苷键中的N或O不包含在该符号中。
本发明中，只要没有特别的记载，氨基酸的侧链中与糖链连结的情况的部分结构就用括号表示侧链部分，例如“(SG－)Asn”这样的记载。
本发明的抗体―药物偶联物由下式表示：
Figure BDA0003279539650000461
抗体Ab或其功能性片段从N297糖链或重构的N297糖链与L结合，优选从Ab的重构的糖链与L结合。
本发明的Ab的糖链为N连接型糖链、O连接型糖链，优选N连接型糖链。
N连接型糖链通过N糖苷键与抗体的氨基酸侧链结合，O连接型糖链通过O糖苷键与抗体的氨基酸侧链结合。
已知IgG在其重链的Fc区中的第297号天冬酰胺残基(以下称为“Asn297或N297”)中具有高度保守的N连接型糖链，有助于抗体分子的活性、动态等(Biotechnol.Prog.，2012,28,608-622，Anal.Chem.,2013,85,715-736)。
IgG的恒定区中的氨基酸序列高度保守，在Edelman et al.,(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.63,No.1(May 15,1969),p.78-85)中，各氨基酸以Eu编号(Eu INDEX)特定。例如，Fc区中添加N连接型糖链的Asn297相当于Eu编号中的297位，即使在因分子片段化、区域缺损导致实际的氨基酸位置发生变化的情况下，也可以通过以Eu编号表示而唯一地特定氨基酸。
本发明的抗体－药物偶联物中，优选抗体或其功能性片段从与其Asn297的侧链结合的糖链(以下称为“N297糖链”)与L结合，更优选抗体或其功能性片段从所述N297糖链与L结合，该N297糖链为重构的糖链。
SGP为Sialyl GlycoPeptide(唾液酸糖肽)的简称，是N连接型复合糖链的代表。SGP可以从鸡蛋的蛋黄中根据例如WO2011/0278681所述的方法分离、精制而得到。此外，市售(东京化成(株)、(株)伏见制药所)有SGP的精制品，可以购入。市售有仅由在SG的糖链部分中缺失了一个还原末端的GlcNAc的糖链(以下称为“SG(10)”)构成的二唾液酸八糖(东京化成(株))等。
本发明中，将仅在SG(10)的β－Man的支链中的任一者缺失了非还原末端的唾液酸的糖链结构称为MSG(9)，将仅在支链的1－3糖链具有唾液酸的糖链记为MSG1，将仅在支链的1－6糖链具有唾液酸的糖链记为MSG2。
本发明的重构的糖链为N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或者N297－(Fuc)MSG1与N297－(Fuc)MSG2的混合物、或N297－(Fuc)SG，优选为N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或N297－(Fuc)SG，更优选为N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)MSG2。
N297－(Fuc)MSG1由以下的结构式或序列式表示。
Figure BDA0003279539650000481
上式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示*－(CH2CH2－O)3－CH2CH2－NH－，右端的氨基经由酰胺键与N297糖链的β－Man支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧酸键合，左端的星号*表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为整数2～10，优选为整数2～5。
N297－(Fuc)MSG2由以下的结构式或序列式表示。
Figure BDA0003279539650000482
上式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示*－(CH2CH2－O)3－CH2CH2－NH－，右端的氨基经由酰胺键与N297糖链的β－Man的支链的1－6链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧酸键合，左端的星号*表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为整数2～10，优选为整数2～5。
N297－(Fuc)SG由以下的结构式或序列式表示。
Figure BDA0003279539650000491
上式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示*－(CH2CH2－O)3－CH2CH2－NH－，右端的氨基经由酰胺键与N297糖链的β－Man支链的1－3链侧和1－6链侧双方的非还原末端的唾液酸的2位羧酸键合，左端的星号*表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为整数2～10，优选为整数2～5。
在本发明的抗体－药物偶联物中的抗体的N297糖链为N297－(Fuc)MSG1或者N297－(Fuc)MSG2或它们的混合物的情况下，抗体为二聚物，因此抗体―药物偶联物为结合了两个药物连接子(－L－D)的分子(上述m1＝1)(参照图1)。
例如，实施例19：ADC1是N297糖链为N297－(Fuc)MSG1的情况。
在本发明的抗体－药物偶联物的抗体的N297糖链为N297－(Fuc)SG的情况下，抗体为二聚物，因此抗体－药物偶联物为结合了4个药物连接子(－L－D)的分子(上述m1＝2)。
N297糖链优选为N297－(Fuc)MSG1或者N297－(Fuc)MSG2或N297－(Fuc)SG，更优选为N297－(Fuc)MSG1或者N297－(Fuc)MSG2，最优选为N297－(Fuc)MSG1。
在本发明的抗体－药物偶联物中的抗体的N297糖链为N297－(Fuc)MSG1或者N297－(Fuc)MSG2或N297－(Fuc)SG的情况下，可以获得均匀品质的ADC。
本发明提供包括以下i)～iii)工序的糖链重构抗体或该抗体的功能性片段的制造方法。
i)培养上述宿主细胞(例如动物细胞(CHO细胞等))，从所得到的培养物中选取目标抗体的工序；ii)用水解酶处理工序i)中得到的抗体，制造N297糖链为(Fucα1,6)GlcNAc的抗体((Fucα1,6)GlcNAc－抗体)的工序(图3A)；优选还包括：通过包括利用羟基磷灰石柱对该反应液进行精制的工序来对(Fucα1,6)GlcNAc－抗体进行精制的工序；以及iii)在糖基转移酶存在下使(Fucα1,6)GlcNAc－抗体与糖链供体分子反应，合成在唾液酸中导入了叠氮基的糖链重构抗体的工序，所述糖链供体分子是在MSG(9)或SG(10)的唾液酸的2位羧酸的羰基处导入具有叠氮基的PEG连接子－(N3－L(PEG))，且将还原末端进行噁唑啉化而得到的。
此外，由所述制造方法得到的糖链重构抗体或者其功能性片段或它们的修饰体也包含在本发明中。
所述本抗体―药物偶联物的制造中间体具有DBCO(Dibenzocyclooctyne：二苯并环辛炔)等与叠氮基反应的炔烃结构(参照实施例2－1、化合物3－14)。因此，通过使该制造中间体与在所述i)～iii)工序中得到的糖链的唾液酸中导入了具有叠氮基的PEG连接子的MSG1型、MSG2型或SG型糖链重构抗体或该抗体的功能性片段反应，可以制造本发明的抗体―药物偶联物。
本发明的N297糖链中，还原末端的添加了岩藻糖的GlcNAc－(Fucα1，6)GlcNAc)源自动物细胞所产生的抗体，相较于此，非还原末端侧的糖链优选为重构成与上述MSG(MSG1、MSG2)或SG同样的糖链结构。均利用与其非还原末端的唾液酸2位结合的羧酸与L(PEG)结合。
这样的具有MSG(MSG1、MSG2)或SG型N297糖链的糖链重构抗体可以依照例如WO2013/120066等中记载的方法，利用如图3所示的方法进行制造。在依照公知的方法使用动物细胞作为宿主，产生抗体作为基因重组蛋白的情况下(上述工序i)，虽然N297糖链具有添加了岩藻糖的N连接型糖链结构作为基本结构，但得到具有由非还原末端的结构、构成糖进行了各种修饰后的各种结构形成的糖链的抗体或其片段的混合物(图3A的IV)。如此，动物细胞所产生的抗体通过EndoS等水解酶进行处理，还原末端的壳二糖结构的GlcNAcβ1－4GlcNAc之间的糖苷键被水解，可得到具有仅具有(Fucα1,6)GlcNAc作为N297糖链的单一糖链结构的抗体分子(称为“(Fucα1,6)GlcNAc－抗体”，参照图2的A)(图3A)(上述工序ii))。
作为用于N297糖链的水解反应的酶，可以使用Endo S或保持其水解活性的突变酶等。
将由上述的水解反应得到的(Fucα1,6)GlcNAc－抗体作为糖链受体分子，使用EndoS D233Q或EndoS D233Q/Q303L突变体之类的糖基转移酶(WO2017010559等)，使其与MSG(MSG1，MSG2)或SG型糖链供体分子反应，由此可以得到具有包含上述结构的MSG(MSG1、MSG2)或SG型N297糖链的抗体(参照图2的B)(图3B)(上述工序iii)－1，iii)－2)。
在抗体－药物偶联物中的每一分子抗体的药物结合数m1为1的情况下，采用具有MSG(MSG1，MSG2)的糖链供体分子作为糖链。这样的糖链可以市售的monosialo-Asn free(1S2G/1G2S－10NC－Asn，(株)糖链工程研究所，以下称为“(MSG－)Asn”)为原料，依照实施例3所述的方法分离并采用(MSG－)Asn1或(MSG2－)Asn，也可以不分离而采用混合物。
在抗体－药物偶联物中的每一分子抗体的药物结合数m1为2的情况下，在该糖转移反应中使用具有SG(10)的糖链供体分子作为糖链。这样的SG(10)糖链可以使用例如由SGP通过水解等而获得的糖链，也可以使用市售的二唾液酸八糖(东京化成工业(株))之类的SG(10)糖链。
供体分子中所含的MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖链在其唾液酸的2位具有包含叠氮基的PEG连接子(N3－L(PEG))。
供体分子中所含的MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖链的还原末端的GlcNAc优选使用以利用例如2－氯－1，3－二甲基－1H－苯并咪唑－3－鎓－氯化物处理进行噁唑啉化之类的形式活化后的物质(J.Org.Chem.,2009,74(5),2210-2212)。
作为在糖转移反应中使用的酶(糖基转移酶)，只要具有使复合型糖链转移成N297糖链的活性即可采用各种酶，优选将EndoS的第233号Asp取代为Gln，由此抑制了水解反应的变异体EndoS D233Q。使用EndoS D233Q的糖转移反应记载于WO2013/120066等中。此外，也可以利用对EndoS D233Q进一步施加变异后的EndoS D233Q/Q303L之类的变异体酶(WO2017010559)。
就抗体的糖链重构(糖水解和糖链转移反应)后的抗体的精制操作而言，出于与在反应中使用的低分子化合物及酶的分离的目的，这样的精制通常可以使用凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等，也可以进一步使用羟基磷灰石柱进行追加精制。即，本发明提供一种抗体－药物偶联物的制造方法，从抗体的糖水解后的反应液中精制中间体的工序中还包括利用羟基磷灰石柱进行的精制工序。根据糖链重构报告例(JACS.2012,134,12308-12318.，Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,2361-2367)，仅使用蛋白A柱(亲和色谱柱)将用水解酶处理抗体后的反应液进行精制，但判明了该精制方法无法完全除去水解酶(EndoS等)，残留酶造成影响，会对下一次糖转移反应造成影响。在此，对精制法进行了研究，其结果是，将用水解酶处理抗体后的反应液按照蛋白A柱、羟基磷灰石柱(CHT柱，Bio-RadLaboratories,Inc.)的顺序进行精制，由此残留酶的影响消失，提高了下一次糖链转移反应的反应效率。
本发明的抗体－药物偶联物最优选为选自以下的组中的一种抗体－药物偶联物。
Figure BDA0003279539650000531
或者
Figure BDA0003279539650000532
Figure BDA0003279539650000533
或者
Figure BDA0003279539650000534
Figure BDA0003279539650000541
或者
Figure BDA0003279539650000542
Figure BDA0003279539650000543
或者
Figure BDA0003279539650000544
上述所示的各结构式中，m1表示整数1或2(优选m1为整数1)，抗体Ab为抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3抗体、抗FAP抗体、抗CDH11抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7－H3抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4抗体、抗LRRC15抗体、抗DR5抗体、抗CDH3抗体、抗PDPN抗体或抗CD123抗体(优选为所述抗CLDN6抗体或抗HER2抗体)，N297糖链表示N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或者它们的混合物或N297－(Fuc)SG(优选N297－(Fuc)MSG1)中的任一个，L(PEG)表示*－(CH2CH2－O)3－CH2CH2－NH－，右端的氨基经由酰胺键与N297糖链的β－Man支链的1－3链侧或/和1－6链侧(优选1－3链侧)的非还原末端的唾液酸的2位羧酸键合，左端的星号表示与所述结构式中的三唑环上的1位或3位氮原子结合。
为了方便起见，作为上述最优选的抗体－药物偶联物，记载有在一分子偶联物中具有2个或4个(m2＝1或2)“N297糖链与L中的Lb的三唑环上的1位氮原子结合的『－(N297糖链)－L－D』(『(N297糖链)－(N1Lb)L－D』)，或者具有2个或4个(m2＝1或2)“与3位氮原子结合的『－(N297糖链)－L－D』(『(N297糖链)－(N3Lb)L－D』)”的结构，但也包括在一分子偶联物中具有『(N297糖链)－(N1Lb)L－D』(在m2＝1的情况下为1个，在m2＝2的情况下为1、2、3个)与『(N297糖链)－(N3Lb)L－D』(在m2＝1的情况下为1个，在m2＝2的情况下为3、2、1个)这两者的抗体－药物偶联物。即，一分子偶联物中仅存在『(N297糖链)－(N1Lb)L－D』或『(N297糖链)－(N3Lb)L－D』中的任一者或混合存在这两者。
本发明的抗体－药物偶联物、其游离药物或者其制造中间体有时也存在立体异构体或者源自手性碳原子的光学异构体、几何异构体、互变异构体或d型、l型、阻转异构体等光学异构体，这些异构体、光学异构体以及它们的混合物均包含在本发明中。
本发明的抗体－药物偶联物显示强的肿瘤活性(体内抗肿瘤活性、体外抗细胞活性)、良好的体内动态以及物性，且安全性高，因此作为医药品是有用的。
本发明的抗体－药物偶联物中，药物与一分子抗体的结合数是影响其有效性、安全性的重要因素。抗体－药物偶联物的制造是规定反应的原料/试剂的使用量等反应条件以使药物的结合数成为固定数量而实施的，但与低分子化合物的化学反应不同，通常得到结合有不同数量的药物而成的混合物。药物与一分子抗体的结合数可以平均值、即平均药物结合数(DAR：Drug to Antibody Ratio药物与抗体比率)来确定。吡咯并苯并二氮杂卓衍生物与抗体分子的结合数可以控制，作为每一个抗体的平均药物结合数(DAR)，可以结合1～10个范围的吡咯并苯并二氮杂卓衍生物，优选1～8个，更优选1～5个。
本发明的抗体－药物偶联物中，在抗体从抗体的重构的糖链与L结合的情况下，抗体药物偶联物的每一分子抗体的药物结合数m2为整数1或2。在该糖链为N297糖链，糖链为N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或N297－(Fuc)MSG1与N297－(Fuc)MSG2的混合物的情况下，m2为1，DAR为1～3的范围(优选1.0～2.5的范围，更优选1.2～2.2或者1.6～2.2的范围)。在N297糖链为N297－(Fuc)SG的情况下，m2为2，DAR为3～5的范围(优选3.2～4.8的范围，更优选3.5～4.2的范围)。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据本申请实施例的记载来设计使抗体与所需数量的药物结合的反应，可以获得控制了吡咯并苯并二氮杂卓衍生物的结合数的抗体。
需要说明的是，本发明的抗体－药物偶联物、游离药物或制造中间体通过放置于大气中或者进行重结晶，吸收水分，有时会附着吸附水或者形成水合物，这样的含水的化合物和盐也包含在本发明中。
在本发明的抗体－药物偶联物、游离药物或制造中间体具有氨基等碱性基团的情况下，可以根据需要制成医药上可接受的盐。作为这样的盐，可列举出例如盐酸盐、氢碘酸盐等氢卤酸盐；硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐等低级烷磺酸盐；苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等芳基磺酸盐；甲酸、乙酸、苹果酸、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；以及鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐等氨基酸盐。
在本发明的抗体－药物偶联物、游离药物或制造中间体具有羧基等酸性基团的情况下，通常可以形成碱加成盐。作为医药上可接受的盐，例如可列举出钠盐、钾盐、锂盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铵盐等无机盐；二苄胺盐、吗啉盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N－甲基葡萄糖胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、环己胺盐、二环己胺盐、N、N’－二苄基乙二胺盐、二乙醇胺盐、N－苄基－N－(2－苯基乙氧基)胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐等有机胺盐等。
本发明的抗体－药物偶联物、游离药物或制造中间体有时通过吸收空气中的水分等而以水合物的形式存在。作为本发明的溶剂合物，只要是医药上可接受的溶剂合物就没有特别限定，具体而言，优选水合物、乙醇合物、2－丙醇合物等。此外，在本发明的抗体－药物偶联物、游离药物或制造中间体中存在氮原子的情况下，可以形成N－氧化物，这些溶剂合物和N－氧化物也包含在本发明的范围中。
此外，本发明也包括被各种放射性或非放射性同位素标记的化合物。构成本发明的抗体－药物偶联物、游离药物或制造中间体的一个以上的原子也可以含有非天然比例的原子同位素。作为原子同位素，例如可列举出：氘(2H)、氚(3H)、碘－125(125I)或碳－14(14C)等。此外，本发明化合物也可以用例如氚(3H)、碘－125(125I)或碳－14(14C)之类的放射性同位素进行放射性标记。放射性标记后的化合物作为治疗或预防剂、研究试剂(例如分析试剂)以及诊断剂(例如体内诊断显像剂)是有用的。本发明的抗体－药物偶联物的所有同位素变体无论是否为放射性，都包含在本发明的范围内。
[制造方法]
R法：抗体的制备
糖链重构抗体可以依照例如WO2013/120066等所述的方法，利用图3所示的方法进行制造。
上述糖链重构抗体的制备中，抗体水溶液的浓缩、浓度测定、缓冲液交换可以根据以下的共通操作A～C来进行。
(共通操作A：抗体水溶液的浓缩)
在Amicon Ultra(30000～50000MWCO,Millipore Co.)的容器内加入抗体或抗体－药物偶联物溶液，通过使用离心机(Allegra X-15R,Beckman Coulter,Inc.)的离心操作(在2000G～4000G下离心5～20分钟)，对抗体和后述的抗体－药物偶联物溶液进行浓缩。
(共通操作B：抗体的浓度测定)
使用UV测定器(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific Inc.)，根据制造商规定的方法进行抗体浓度的测定。此时，按每种抗体使用不同的280nm吸光系数(1.3mLmg－ 1cm－1～1.8mLmg－1cm－1)。
(共通操作C：抗体的缓冲液交换)
在抗体水溶液中加入缓冲溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)、磷酸缓冲液(pH6.0)等)，使用共通操作A来进行浓缩。进行几次该操作后，使用共通操作B进行抗体浓度的测定，使用缓冲溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)、磷酸缓冲液(pH6.0)等)将抗体浓度调整为10mg/mL。
S法：偶联
本制造法是通过SPAAC反应(应变促进叠氮炔环加成：strain-promoted alkyneazide cycloaddition:JACS.2004,126,15046-15047)使上述糖链重构抗体与制造中间体(2)结合，制造抗体－药物偶联物的方法。
Figure BDA0003279539650000581
式中Ab表示糖链重构抗体，La’、Lp’、B’与La、Lp、B意义相同，J表示以下所示的任一结构式，式中，星号表示与La’结合。
Figure BDA0003279539650000582
J－La’－Lp’－NH－B’－CH2－O(C＝O)－PBD可以通过实施例2－1～2－6所述的方法等来合成。
通过将抗体Ab的缓冲溶液(醋酸钠溶液、磷酸钠、硼酸钠溶液等或它们的混合物)与在适当的溶剂(二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N－甲基－2－吡啶酮(NMP)、丙二醇(PG)等或它们的混合物)中溶解化合物(2)而形成的溶液混合，进行SPAAC反应。
相对于抗体1摩尔，化合物(2)为2摩尔～过量摩尔，优选为1摩尔～30摩尔，相对于抗体的缓冲液，有机溶剂的比率优选为1～200％v/v。反应温度为0℃～37℃，优选为10℃～25℃，反应时间为1～150小时，优选为6小时～100小时。反应时的pH优选为5～9。
抗体－药物偶联物可以通过上述共通操作A～C和后述的共通操作D～F进行缓冲液交换、精制、抗体浓度以及每一分子抗体的药物平均结合数的测定，进行抗体－药物偶联物化合物(ADC)的鉴定。
共通操作D：抗体－药物偶联物的精制
利用市售的包含山梨糖醇(Sorbitol)(5％)的醋酸缓冲液(10mM，pH5.5；本说明书中称为ABS)使NAP－25柱平衡化。在该NAP－25柱中装入抗体－药物偶联物反应水溶液(约1.5～2.5mL)，利用制造商规定的量的缓冲液洗脱，由此分取出抗体组分。将该分取组分再次装入NAP－25柱中，重复2～3次利用缓冲液洗脱的凝胶过滤精制操作，由此得到除去了未结合的药物连接子、二甲基亚砜、丙二醇的抗体－药物偶联物。根据需要，通过共通操作A和C来调制抗体－药物偶联物溶液的浓度。
共通操作E：抗体－药物偶联物的抗体浓度的测定
抗体－药物偶联物的结合药物浓度可以使用下述所示的Lambert－Beer定律(朗伯比尔定律)进行计算。
以下表示使用Lambert－Beer定律的式(I)。
Figure BDA0003279539650000591
在此，A280表示抗体－药物偶联物水溶液在280nm下的吸光度，ε280表示抗体－药物偶联物在280nm下的摩尔吸光系数，C(mol·L－1)表示抗体－药物偶联物的摩尔浓度。
根据上述式(I)，抗体－药物偶联物的摩尔浓度C(mol·L－1)由下式(II)求出。
Figure BDA0003279539650000592
进而，通过两边乘以抗体－药物偶联物的摩尔质量MW(g·mol－1)，可以求出抗体－药物偶联物的重量浓度C’(mg·mL－1)(式(III))。
Figure BDA0003279539650000601
以下，记载了用于上式中而适用于本实施例的各值。
吸光度A280使用抗体－药物偶联物水溶液在280nm下的UV吸光度的实测值。摩尔质量MW(g·mol－1)使用由抗体的氨基酸序列求出的抗体分子量的计算推定值作为抗体－药物偶联物的摩尔质量的近似值。光程长l(cm)在1cm下测定。
抗体药物偶联物的摩尔吸光系数ε280可以根据以下的式(IV)求出。
ε280＝抗体摩尔吸光系数εAb，280+药物摩尔吸光系数εDL，280x药物结合数 式(IV)
在此，εAb，280表示在280nm下的抗体的摩尔吸光系数，εDL，280表示在280nm下的药物的摩尔吸光系数。
εAb，280可以根据抗体的氨基酸序列通过已知的计算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)来推定。实施例中，曲妥珠单抗的摩尔吸光系数使用εAb，280＝215400(计算推定值)。CLDN6抗体的摩尔吸光系数使用εAb，280＝221340(计算推定值)，TROP2抗体的摩尔吸光系数使用εAb，280＝226400(计算推定值)，CD98抗体的摩尔吸光系数使用εAb，280＝240400(计算推定值)，LPS抗体的摩尔吸光系数使用εAb，280＝230300(计算推定值)，曲妥珠单抗突变体的摩尔吸光系数使用εAb，280＝215057(计算推定值)。
εDL，280使用根据每次利用UV测定得到的实测值计算出的值。即，使用通过测定使偶联物前体(药物)溶解为某摩尔浓度的溶液的吸光度，应用Lambert－Beer定律、式(I)而得到的值。
(共通操作F：抗体－药物偶联物的每一分子抗体的药物平均结合数的测定)
抗体－药物偶联物的每一分子抗体的药物平均结合数可以通过使用以下方法的高效液相色谱法(HPLC)分析来求出。
[F－1.HPLC分析用样品的制备(抗体－药物偶联物的还原)]
将抗体－药物偶联物溶液(约1mg/mL，60μL)与二硫苏糖醇(DTT)水溶液(100mM，15μL)混合。通过将混合物在37℃下保温(incubate)30分钟，将切断抗体－药物偶联物的L链和H链之间的二硫键的样品用于HPLC分析。
[F－2.HPLC分析]
在下述的测定条件下进行HPLC分析。
HPLC系统：Agilent 1290HPLC系统(Agilent Technologies)
检测器：紫外吸光度计(测定波长：280nm，329nm)
柱：BEH Phenyl(2.1×50mm，1.7μm，Waters Acquity)
柱温：75℃
流动相A：0.1％三氟醋酸(TFA)、15％异丙醇水溶液
流动相B：0.075％TFA、15％异丙醇乙腈溶液
梯度程序：14％－36％(0分钟－15分钟)，36％－80％(15－17分钟)，80％－14％(17分钟―17.1分钟)，14％－14％(17.1分钟―23分钟)
样品注入量：5μL
[F－3.数据解析]
〔F－3－1〕相对于未与药物结合的抗体的H链(H0)，与药物结合的H链(与一个药物结合的H链：H1，与两个药物结合的H链：H2)的疏水性与所结合的药物的数量成比例地增加，保留时间变长，因此按照L0、H0、H1、H2的顺序被洗脱。通过与L0和H0的保留时间比较，可以将检测峰分配给L0、H0、H1、H2中的任一个。此外，药物的结合也可以通过药物的特征性的329nm的波长吸收来确认。
〔F－3－2〕药物连接子有UV吸收，因此，根据药物连接子的结合数使用L链、H链以及药物连接子的摩尔吸光系数并根据下式进行峰面积值的修正。
Figure BDA0003279539650000611
在此，各抗体的L链和H链的摩尔吸光系数(280nm)可以使用通过已知的计算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)，根据各抗体的L链和H链的氨基酸序列来推定出的值。曲妥珠单抗的情况下，根据其氨基酸序列，作为H链的摩尔吸光系数，使用81290作为推定值。同样地，CLDN6抗体的情况下，使用77280作为H链的摩尔吸光系数；TROP2抗体的情况下，使用68990作为H链的摩尔吸光系数；CD98抗体的情况下，使用78500作为H链的摩尔吸光系数；LPS抗体的情况下，使用77470作为H链的摩尔吸光系数；曲妥珠单抗突变体的情况下，使用81488作为H链的摩尔吸光系数；药物连接子的摩尔吸光系数(280nm)使用作为偶联物前体的化合物(1)的实测的摩尔吸光系数(280nm)。
〔F－3－3〕根据下式计算相对于峰面积修正值合计的各链峰面积比(％)。
Figure BDA0003279539650000621
AHi：Hi各峰面积修正值
〔F－3－4〕根据下式计算抗体－药物偶联物的每一分子抗体的药物平均结合数。
药物平均结合数＝(H0峰面积比x0+H1峰面积比x1+H2峰面积比x2)/100x2
2.PARP抑制剂
本发明中，“PARP抑制剂”是指具有通过抑制PARP(聚腺苷5’二磷酸(ADP)核糖聚合酶)来妨碍单链切断的修复的功能的药剂(Benafif S,et al.,Onco.Targets Ther.(2015)8,519-528.)(Fong PC,et al.,N.Engl.J.Med.(2009)361,123-134.)(Gelmon KA,et al.,Lancet Oncol.(2011)12,852-861.)。PARP存在多个亚型(subtype)，但本发明中的PARP抑制剂优选抑制PARP－1和PARP－2。本发明中的PARP抑制剂只要是具有通过抑制PARP来妨碍单链切断的修复的功能的药剂就没有限定，优选可列举出：奥拉帕尼(Olaparib)(MenearKA,et al.,J.Med.Chem.(2008)51,6581-6591.)、鲁卡帕尼(Rucaparib)(Gillmore AT,etal.,Org.Process Res.Dev.(2012)16,1897-1904.)、尼拉帕利(Niraparib)(Jones P,etal.,J.Med.Chem.(2009)52,7170-7185.)、他拉唑帕尼(Talazoparib)(Shen Y,et al.,Clin.Cancer Res.(2013)19(18),5003-15.)，维利帕尼(Veliparib)、帕米帕利(Pamiparib)及氟唑帕利(Fluzoparib)、以及它们的药理上可接受的盐，更优选可列举出：奥拉帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕利及他拉唑帕尼、以及它们的药理上可接受的盐。
本发明中的PARP抑制剂的“药理上可接受的盐”可以是酸加成盐和碱加成盐中的任一种，优选为酸加成盐，可列举出例如樟脑磺酸盐(camsylate salt)、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐以及乙磺酸盐等低级烷磺酸盐；对甲苯磺酸盐(p-toluenesulfonic acid salt)和苯磺酸盐等芳基磺酸盐；磷酸盐、硝酸盐、高氯酸盐以及硫酸盐等无机酸盐；盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐以及氢氟酸盐等氢卤酸盐；乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐以及马来酸盐等有机酸盐；以及鸟氨酸盐、谷氨酸盐以及天冬氨酸盐等氨基酸盐。
此外，PARP抑制剂及其药理上可接受的盐有时也以溶剂合物的形式存在，这些溶剂合物也包含在本发明中的PARP抑制剂及其药理上可接受的盐中。
3.医药
以下，对特征在于本发明的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂被组合给药的医药组合物和治疗方法(也包括预防)进行说明。
可以是，本发明的医药组合物和治疗方法的特征在于，在各自不同的制剂中作为有效成分而含有抗体－药物偶联物与PARP抑制剂，抗体－药物偶联物与PARP抑制剂同时或在不同的时间进行给药，也可以是，本发明的医药组合物和治疗方法的特征在于，在单一的制剂中作为有效成分而含有抗体－药物偶联物与PARP抑制剂来进行给药。
本发明的医药组合物和治疗方法可以用于治疗癌症，优选可以用于治疗选自由乳腺癌、胃癌(有时也称为胃腺癌)、大肠癌(有时也称为结肠直肠癌，包括结肠癌和直肠癌)、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、食道癌、头颈癌(包括唾液腺癌和咽喉癌)、食管胃结合部腺癌、胆道癌(包括胆管癌)、Paget病、胰腺癌、卵巢癌、子宫肉瘤、尿路上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道间质瘤、消化道间质瘤、宫颈癌、鳞状细胞癌、腹膜癌、肝癌、肝细胞癌、子宫体癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、阴茎癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、骨肉瘤以及黑色素瘤构成的组中的至少一种癌症，更优选可以用于治疗选自由乳腺癌、胃癌、大肠癌、肺癌、食道癌、唾液腺癌、食管胃结合部腺癌、胆道癌、Paget病、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌以及子宫肉瘤构成的组中的至少一种癌症。
就本发明中使用的抗体－药物偶联物中、特别优选具有何种抗体的抗体－药物偶联物而言，可以通过检查癌症的种类、肿瘤标志物来确定。例如，作为本发明的抗CLDN6抗体－药物偶联物所适用的癌症的种类，可列举出：肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌等)、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌(表层上皮性肿瘤、间质性肿瘤、生殖细胞肿瘤等)、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌等、子宫体癌、睾丸癌(精原细胞瘤、非精原细胞瘤)、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌以及它们的转移性形态等，作为抗HER2抗体－药物偶联物所适用的癌症的种类，可列举出：肺癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、胃肠间质肿瘤、宫颈癌、食道癌、鳞状细胞癌、腹膜癌、肝癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌或阴茎癌以及它们的转移性形态等，但只要是在作为治疗对象的癌细胞中表达抗体－药物偶联物中的抗体能识别的蛋白质的癌细胞，就并不限定于此。
在几个实施方式中，癌症不依赖于同源重组(HR)依赖性DNA双链断裂(DSB)修复途径。不依赖于DSB修复途径是指，DSB修复途径可以是野生型或突变型(HR的功能缺失或降低)中的任一种。作为能在HR中发挥功能的基因，可列举出BRCA1、BRCA2、BLM、RBBP8、DNA聚合酶δ(POLD1～4)、POLH、DNA2、EME1、ERCC1、EXO1、FANCM、GEN1、MRE11、MUS81、NBS1、PALB2、PCNA、RAD50、RAD51、RAD51AP1、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54、RAD54B、RM11、RM12、RPA、RTEL1、SLX1、SLX2、SLX4、TOP2A、XPF、XRCC2、XRCC3等。优选的是，癌症不依赖于BRCA1或BRCA2。
通过本发明的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂组合给药，无论DSB修复途径有无变异，都显示出细胞增殖抑制效果。
在某种实施方式中，癌症对PARP抑制剂为非敏感性，或者癌症对PARP抑制剂为非敏感性且不依赖于同源重组(HR)依赖性DNA双链断裂(DSB)修复途径。
在其他实施方式中，一种用于治疗癌症的医药组合物或癌症的治疗方法，其特征在于，将包含在DNA小沟中未形成交联的PBD衍生物的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂组合给药，癌症对PARP抑制剂为非敏感性，或者不依赖于同源重组(HR)依赖性DNA双链断裂(DSB)修复途径，或者对PARP抑制剂为非敏感性且不依赖于同源重组(HR)依赖性DNA双链断裂(DSB)修复途径。
本发明的医药组合物和治疗方法优选可以用于哺乳动物，更优选可以用于人。
本发明的医药组合物和治疗方法的抗肿瘤效果例如可以通过制作将癌细胞移植到被检动物中的模型，测定因施予本发明的医药组合物和治疗方法而引起的肿瘤体积的减少、寿命延长效果来进行确认。而且，通过与本发明中使用的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂各自单独给药时的抗肿瘤效果进行比较，能确认本发明中使用的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂的联用效果。
此外，本发明的医药组合物和治疗方法的抗肿瘤效果在临床试验中可以通过实体瘤临床疗效评价标准(RECIST：Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)评价法、WHO评价法、Macdonald评价法、体重测定以及其他方法来进行确认，可以通过完全缓解(Complete response；CR)、部分缓解(Partial response；PR)、疾病进展(Progressivedisease；PD)、客观缓解率(Objective Response Rate；ORR)、缓解持续时间(Duration ofresponse；DoR)、无进展生存期(Progression－Free Survival；PFS)、总生存期(OverallSurvival；OS)等指标来进行判定。
通过上述方法，关于本发明的医药组合物和治疗方法的抗肿瘤效果，可以确认相对于现有的癌症治疗用医药组合物和治疗方法的优越性。
本发明的医药组合物和治疗方法能延缓癌细胞的成长、抑制增殖，进而破坏癌细胞。通过这些作用，在癌症患者中实现从因癌症引起的症状的解放、QOL(quality of life：生活质量)的改善，维持癌症患者的生命而实现治疗效果。即使在未达到破坏癌细胞的情况下，也能通过抑制、控制癌细胞的增殖，从而实现癌症患者的更高的QOL，并且实现更长期的生存。
本发明的医药组合物除了对患者应用全身疗法以外，还可以局部地应用于癌组织而期待治疗效果。
本发明的医药组合物可以含有一种以上的药学上适合性的成分来给药。药学上适合性的成分可以根据本发明中使用的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂的给药量、给药浓度等，从本领域中通常使用的制剂添加物等中适当选择来应用。例如，本发明中使用的抗体－药物偶联物可以作为包含组氨酸缓冲剂等缓冲剂、蔗糖或海藻糖等赋形剂以及聚山梨酯80或20等表面活性剂的医药组合物来给药。本发明中使用的包含抗体－药物偶联物的医药组合物优选可以用作注射剂，更优选可以用作水性注射剂或冻干注射剂，进一步更优选用作冻干注射剂。
在本发明中使用的包含抗体－药物偶联物的医药组合物为水性注射剂的情况下，优选可以用适当的稀释液稀释后，滴注给药至静脉内。作为稀释液，可列举出葡萄糖溶液、生理盐水等，优选可列举出葡萄糖溶液，更优选可列举出5％葡萄糖溶液。
本发明中使用的包含抗体－药物偶联物的医药组合物为冻干注射剂的情况下，优选可以利用注射用水溶解后，用适当的稀释液稀释需要量后，滴注给药至静脉内。作为稀释液，可列举出葡萄糖溶液、生理盐水等，优选可列举出葡萄糖溶液，更优选可列举出5％葡萄糖溶液。
作为用于将本发明的医药组合物给药而可以使用的导入途径，例如，可列举出静脉内、皮内、皮下、肌内以及腹腔内的途径，优选可列举出静脉内的途径。
医药组合物的组成和浓度也根据给药方法而变化，就本发明的医药组合物中所含的抗体－药物偶联物而言，在抗体－药物偶联物对抗原的亲和性、即对抗原的解离常数(Kd值)方面，亲和性越高(Kd值越低)，即使是少量的给药量也可以发挥药效。因此，在决定抗体－药物偶联物的给药量时，也可以基于抗体－药物偶联物与抗原的亲和性的状况来设定给药量。在将本发明的抗体－药物偶联物对人进行给药时，例如，将约0.001～100mg/kg一次给药或以1～180天一次的间隔多次给药即可。
本发明的PARP抑制剂可以按1～7天1～2次的间隔对人进行给药，优选的是，可以按一天一次或一天两次的间隔进行给药。此外，在本发明中使用的PARP抑制剂可以按每次0.1mg～3000mg的给药量进行给药，优选的是，可以按每次0.25mg～600mg的给药量进行给药。
在本发明中使用的PARP抑制剂为奥拉帕尼或其药理上可接受的盐的情况下，优选的是，可以按一天两次的间隔每次口服给药100mg、150mg、200mg或300mg的给药量。
在本发明中使用的PARP抑制剂为鲁卡帕尼或其药理上可接受的盐的情况下，优选的是，可以按一天两次的间隔每次口服给药200mg、250mg、300mg、400mg、500mg或600mg的给药量。
在本发明中使用的PARP抑制剂为尼拉帕利或其药理上可接受的盐的情况下，优选的是，可以按一天一次的间隔每次口服给药100mg、200mg或300mg的给药量。
在本发明中使用的PARP抑制剂为他拉唑帕尼或其药理上可接受的盐的情况下，优选的是，可以按一天一次的间隔每次口服给药0.25mg、0.5mg或1mg的给药量。
本发明的医药组合物和治疗方法还可以包含本发明的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂以外的癌症治疗剂。本发明的医药组合物和治疗方法也可以与其他癌症治疗剂联用而给药，由此可以增强抗肿瘤效果。出于这样的目的而使用的其他癌症治疗剂可以与本发明的医药组合物同时、分别或连续地给药于个体，也可以改变各自的给药间隔来给药。作为这样的癌症治疗剂，只要是具有抗肿瘤活性的药剂就没有限定，例如，可列举出选自由伊立替康(Irinotecan、CPT－11)、顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、氟尿嘧啶(Fluorouracil、5－FU)、吉西他滨(Gemcitabine)、卡培他滨(Capecitabine)、阿霉素(Doxorubicin)、表阿霉素(Epirubicin)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、丝裂霉素C(Mitomycin C)、替加氟(Tegafur)/吉美嘧啶(Gimeracil)/奥替拉西(Oteracil)配合剂、西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、瑞格非尼(Regorafenib)、三氟胸苷(Trifluridine)/盐酸替吡嘧啶(Tipiracil)配合剂、吉非替尼(Gefitinib)、埃罗替尼(Erlotinib)、阿法替尼(Afatinib)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、培美曲塞(Pemetrexed)、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗以及拉帕替尼构成的组中的至少一种。
本发明的医药组合物和治疗方法也可以与放射线疗法组合使用。例如，癌症患者在接受利用本发明的医药组合物的治疗前和/或后、或者同时接受放射线疗法。
本发明的医药组合物和治疗方法也可以作为与外科手术组合的辅助化疗而使用。本发明的医药组合物可以在外科手术之前出于缩小肿瘤的目的而给药(称为术前辅助化疗或新辅助化疗)，也可以在外科手术后出于防止肿瘤复发的目的而给药(称为术后辅助化疗或辅助化疗)。
实施例
通过以下所示的例子对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于此。此外，这些在任何意义上都不是限定解释。
参考例1：抗HER2抗体曲妥珠单抗
抗HER2抗体参照US5821337进行制作。将曲妥珠单抗的轻链和重链的氨基酸序列示于序列号64和序列号65。
参考例2：抗TROP2抗体hRS7
抗TROP2抗体参照WO2003/074566、WO2015/098099(参考例1)进行制作。将hRS7的轻链和重链的氨基酸序列示于序列号68和序列号69。
〔制造中间体(药物连接子)的合成〕
实施例1
[实施例1－1：中间体1]
Figure BDA0003279539650000691
工序1：(6S)－6－(羟甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚烷－5－羧酸苄酯(1－2)
在5－苄基6－甲基(6S)－5－氮杂螺[2.4]庚烷－5，6－二羧酸酯(1－1)(104mmol，WO2012087596)的四氢呋喃(500mL)溶液中，在0℃下一点点地加入硼氢化锂(4.30g，178mmol)。在0℃下搅拌30分钟后，在室温下搅拌2小时。在0℃下加入水(180mL)、2N盐酸(186mL)，减压蒸馏除去。将所得到的残渣用乙酸乙酯提取4次，将有机层用饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去，将所得到的残渣(1－2)(27.9g，90％)直接用于下一步反应中。
工序2：(6S)－6－({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚烷－5－羧酸苄酯(1－3)
在上述工序1所得到的化合物(1－2)(27.9g，107mmol)与咪唑(14.5g，214mmol)的二氯甲烷(300mL)溶液中，在室温下加入叔丁基二甲基氯硅烷(24.2g，160mmol)，在室温下搅拌18小时。将反应溶液用饱和柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗，用无水硫酸钠进行干燥后，减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～50：50(v/v)]进行精制，得到目标产物(1－3)(32.5g，81％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.39-7.34(5H,m),5.23-5.11(2H,m),4.10-3.48(4H,m),3.16-3.14(1H,m),2.15-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m),0.91-0.88(9H,m),0.65-0.55(4H,m),0.08-0.01(6H,m).
MS(APCI)m/z:376(M+H)+
工序3：(6S)－6－({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚烷(1－4)
在上述工序2所得到的化合物(1－3)(32.5g，86.5mmol)的乙醇(400mL)溶液中，在室温下加入7.5％钯碳催化剂(54％水分，5.00g)，在室温、氢气气氛下搅拌6小时。硅藻土过滤反应溶液，减压蒸馏除去滤液，得到目标产物(1－4)(21.3g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ:3.79-3.77(1H,m),3.71-3.69(1H,m),3.65-3.60(1H,m),3.01-2.98(2H,m),1.81-1.71(2H,m),0.90(9H,s),0.65-0.57(4H,m),0.08(3H,s),0.07(3H,s).
MS(APCI，ESI)m/z:242(M+H)+
工序4：[(6S)－6－({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基](5－甲氧基－2－硝基－4－{[三(丙烷－2－基)甲硅烷基]氧基}苯基)甲酮(1－5)
在5－甲氧基－2－硝基－4－{三(丙烷－2－基)甲硅烷基]氧基}苯甲酸(52.2g，141mmol，US20150283262)与1－羟基苯并三唑一水合物(23.8g，155mmol)的二氯甲烷(500mL)溶液中，在冰冷却下加入N，N’－二环己基碳二亚胺(35.0g，170mmol)。将反应混合物在室温下搅拌。羧酸消失后，在－60℃下缓慢滴入上述工序3所得到的化合物(1－4)(34.1g，141mmol)与三乙胺(29.4mL，212mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液。将反应溶液在室温下搅拌一晩后，在反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿提取反应混合物。将有机层用水和饱和盐水清洗，用无水硫酸镁进行干燥。在减压蒸馏除去而得到的残渣中加入乙酸乙酯和二乙醚，通过过滤而除去固体成分，减压蒸馏除去滤液，将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～25：75(v/v)]进行精制，得到目标产物(1－5)(55.0g，66％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.72-7.66(1H,m),6.80-6.73(1H,m),4.53-4.49(1H,m),4.04-3.95(1H,m),3.91-3.88(3H,m),3.59-3.54(1H,m),3.36-3.25(0.5H,m),3.01-2.96(1.5H,m),2.24-2.20(0.3H,m),2.09-2.05(0.7H,m),2.00-1.97(0.7H,m),1.69-1.67(0.3H,m),1.32-1.24(3H,m),1.12-1.05(18H,m),0.93-0.91(6H,m),0.79-0.77(3H,m),0.71-0.62(2H,m),0.57-0.40(2H,m),0.12-0.10(4H,m),0.11-0.15(2H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:593(M+H)+
工序5：(2－氨基－5－甲氧基－4－{[三(丙烷－2－基)甲硅烷基]氧基}苯基)[(6S)－6－({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基]甲酮(1－6)
在上述工序4所得到的化合物(1－5)(55.0g，92.8mmol)的乙醇(300mL)溶液中，在氮气气氛下加入7.5％钯碳(10.0g)。立即将氮气球替换成氢气球，将反应混合物在氢气气氛下、室温下剧烈搅拌。原料消失后，过滤反应混合物，减压蒸馏除去滤液，将所得到的目标产物(1－6)(52.2g，100％)直接用于下一步反应中。
1H-NMR(CDCl3)δ:6.71(1H,s),6.25(1H,s),4.55-4.28(2H,m),3.97(1H,m),3.75-3.62(3H,m),3.70(3H,s),3.09-3.07(1H,m),2.24-2.19(1H,m),1.81-1.68(1H,m),1.27-1.22(3H,m),1.09-1.05(18H,m),0.90(9H,s),0.65-0.46(4H,m),0.07-0.03(6H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:563(M+H)+
工序6：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－[4－({[(2－{[(6S)－6－({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基]羰基}－4－甲氧基－5－{[三(丙烷－2－基)甲硅烷基]氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(1－7)
在上述工序5所得到的化合物(1－6)(18.6g，33.0mmol)和三乙胺(6.26mL，45.2mmol)的THF(300mL)溶液中，在乙醇－冰浴上缓慢添加三光气(4.22g，14.2mmol)。添加后，在冰冷却的反应混合物中缓慢滴入N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－[4－(羟甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(11.4g，30.2mmol，WO2011130598)与三乙胺(6.26mL，45.2mmol)的四氢呋喃(100mL)、N，N－二甲基甲酰胺(30mL)混合溶液。滴入后，撤去冰浴，将反应混合物在氮气气氛、40℃下搅拌。原料消失后，在反应混合物中加入水，用乙酸乙酯提取反应混合物。将有机层用饱和盐水清洗，用无水硫酸钠进行干燥。过滤后，将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～40：60(v/v)]进行精制，得到目标产物(1－7)(23.5g，74％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.99(1H,m),8.58(1H,s),7.80(1H,s),7.55-7.53(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.77-6.75(2H,m),5.94-5.87(1H,m),5.40-5.38(1H,m),5.33-5.29(1H,m),5.23-5.21(1H,m),5.13(1H,m),5.10(2H,m),4.69-4.64(1H,m),4.62-4.52(2H,m),4.06-4.03(1H,m),3.98(1H,m),3.76-3.65(6H,m),3.04(1H,m),2.28-2.26(1H,m),2.18-2.13(1H,m),1.46(3H,m),1.32-1.25(3H,m),1.11-1.09(18H,m),0.99-0.84(15H,m),0.65-0.40(4H,m),0.08-0.00(6H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:966(M+H)+
工序7：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－[4－({[(2－{[(6S)－6－(羟甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基]羰基}－4－甲氧基－5－{[三(丙烷－2－基)甲硅烷基]氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(1－8)
在上述工序6所得到的化合物(1－7)(23.5g，24.3mmol)的四氢呋喃(50mL)、甲醇(50mL)、水(44mL)溶液中，在室温下加入醋酸(200mL)。将反应混合物在室温下搅拌。原料消失后，用乙酸乙酯提取反应混合物。将有机层用水和饱和盐水清洗，用无水硫酸钠进行干燥。过滤后，将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～0：100(v/v)]进行精制，得到目标产物(1－8)(18.0g，87％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.64-8.62(1H,m),8.50(1H,m),7.69(1H,m),7.55-7.53(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.79-6.75(3H,m),5.91-5.89(1H,m),5.39(1H,m),5.32-5.29(1H,m),5.23-5.21(1H,m),4.68-4.54(4H,m),4.31(1H,m),4.06-4.04(1H,m),3.81-3.79(3H,m),3.76(3H,s),3.63-3.61(1H,m),3.13-3.11(1H,m),2.16-2.13(1H,m),1.87-1.81(2H,m),1.46-1.43(3H,m),1.30-1.24(3H,m),1.12-1.08(18H,m),0.98-0.91(6H,m),0.63-0.45(4H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:852(M+H)+
工序8：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－5’－桥氧基－8’－{[三(丙烷－2－基)甲硅烷基]氧基}－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(1－9)
在二甲基亚砜(3.75mL，52.8mmol)的二氯甲烷(300mL)溶液中，在氮气气氛、－78℃下缓慢滴入草酰氯(2.17mL，25.3mmol)。滴入后，将反应混合物在－78℃下搅拌。在反应混合物中缓慢滴入上述工序7所得到的化合物(1－8)(18.0g，21.1mmol)的二氯甲烷(50.0mL)溶液。在反应溶液中，在－78℃下加入三乙胺(14.6mL，105mmol)。添加后，撤去制冷剂浴，缓慢升温至室温。原料消失后，在反应混合物中加入水，用氯仿(200mL)提取反应混合物。将有机层用水和饱和盐水清洗，用无水硫酸镁进行干燥。过滤后，将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～0：60(v/v)]进行精制，得到目标产物(1－9)(16.5g，92％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.51-8.36(1H,m),7.54-7.38(2H,m),7.22-7.07(3H,m),6.73-6.64(1H,m),5.94-5.87(2H,m),5.33-5.22(3H,m),5.09(1H,m),4.97(1H,m),4.64-4.58(4H,m),4.02-4.00(1H,m),3.86-3.83(3H,m),3.75-3.70(1H,m),3.61-3.54(2H,m),3.38-3.29(1H,m),2.40(1H,m),2.16-2.14(1H,m),1.74-1.71(1H,m),1.44(3H,m),1.18-1.16(3H,m),1.05-1.00(18H,m),0.97-0.92(6H,m),0.72-0.60(4H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:850(M+H)+
工序9：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7’－甲氧基－5’－桥氧基－8’－{[三(丙烷－2－基)甲硅烷基]氧基}－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(1－10)
在上述工序8所得到的化合物(1－9)(12.0g，14.1mmol)和2，6－二甲基吡啶(6.58mL，56.5mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液中，在氮气气氛、0℃下缓慢滴入三氟甲烷磺酸叔丁基二甲基硅烷酯(9.73mL，42.3mmol)。在冰冷却下搅拌10分钟后，撤去冰浴，在室温下搅拌。原料消失后，在反应混合物中加入水，用氯仿提取反应混合物。用水和饱和盐水清洗，用无水硫酸钠进行干燥。过滤后，将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～25：75(v/v)]进行精制，得到目标产物(1－10)(8.12g，60％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.67-8.45(1H,m),7.50-7.44(2H,m),7.19(1H,s),7.13(2H,m),6.95(2H,m),6.62-6.57(2H,m),6.01(1H,m),5.95-5.86(1H,m),5.33-5.13(3H,m),4.82(1H,m),4.65-4.54(3H,m),4.03-4.01(1H,m),3.84-3.82(3H,m),3.73-3.66(1H,m),3.50-3.48(1H,m),3.27(1H,m),2.37-2.33(1H,m),2.19-2.13(1H,m),1.54-1.43(3H,m),1.22-1.13(3H,m),1.10-1.00(18H,m),0.97-0.91(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.59(4H,m),0.19-0.09(6H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:964(M+H)+
工序10：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－8’－羟基－7’－甲氧基－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(1－11)
在上述工序9所得到的化合物(1－10)(8.12g，8.42mmol)的N，N－二甲基甲酰胺(90mL)、水(2mL)溶液中，加入醋酸锂(0.611g，9.26mmol)，在室温下搅拌。原料消失后，在反应混合物中加入水，用乙酸乙酯提取反应混合物。将有机层用水和饱和盐水清洗，用无水硫酸钠进行干燥。过滤后，将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～0：100(v/v)]进行精制，得到目标产物(1－11)(5.48g，81％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,20.9℃)δ:8.76-8.60(1H,m),7.45-7.44(2H,m),7.21(1H,s),7.10-7.09(2H,m),6.81-6.74(1H,m),6.65(1H,s),6.23(1H,s),6.01-5.99(1H,m),5.95-5.84(1H,m),5.41-5.20(2H,m),5.16(1H,m),4.84(1H,m),4.67-4.54(4H,m),4.05-4.03(1H,m),3.87(3H,s),3.71(1H,m),3.55-3.51(1H,m),3.26(1H,m),2.35(1H,m),2.18-2.12(1H,m),1.55-1.42(4H,m),0.97-0.92(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.61(4H,m),0.20-0.06(6H,m)
MS(APCI，ESI)m/z:808(M+H)+
1H-NMR(500MHz,CDCl3,27℃)δ:8.76(1H,s),7.43(2H,brd),7.20(1H,s),7.08(2H,d,J＝8.3Hz),7.00(1H,br),6.66(1H,s),6.44(1H,s),6.00(1H,H-11’,d,J11’,11’a＝9.2Hz),5.89(1H,m),5.53(1H,brd),5.30(1H,d,J＝17.2Hz),5.20(1H,d,J＝10.3Hz),5.15(1H,d,JABq＝12.5Hz),4.85(1H,d,JABq＝12.5Hz),4.66(1H,m),4.60-4.52(2H,m),4.07(1H,m),3.84(3H,s),3.71(1H,H-3’β,d,Jgem＝11.7Hz),3.53(1H,H-11’a,m),3.26(1H,H-3’α,d,Jgem＝11.7Hz),2.35(1H,H-1’β,dd,J1’β,11’a＝8.30Hz,Jgem＝13.1Hz),2.14(1H,m),1.54(1H,H-1’α,d,Jgem＝13.1Hz),1.41(3H,d,J＝6.90Hz),0.95(3H,d,J＝6.80Hz),0.92(3H,d,J＝6.80Hz),0.81(9H,s),0.80-0.70(1H,m),0.70-0.59(3H,m),0.2-0.06(6H,m)
根据由selective 1D ROESY光谱所得到的相关(下图)对化合物(1－11)的11’位绝对构型进行分析。在1’α－H与11’－H、3’α－H与11’－H以及1’β－H与3’β－H之间认为相关，因此可知11’位的绝对构型为S构型。
Figure BDA0003279539650000751
因此，可知化合物(1－11)、与其具有相同的绝对构型的化合物(1－9)和化合物(1－10)、使用化合物(1－11)合成的化合物(3－11)、化合物(3－12)、化合物(3－13)及药物连接子1(化合物(3－14))、化合物(4－9)、化合物(4－10)、化合物(4－11)及药物连接子2(化合物(4－12))、以及化合物(6－10)、化合物(6－11)、化合物(6－12)及药物连接子4(化合物(6－13))中的11’位的绝对构型为S构型。此外，利用同样的合成方法得到的化合物(5－9)、化合物(5－10)及药物连接子3(化合物(5－11))的11’位的绝对构型确定为S构型。
[实施例1－2：中间体2]
Figure BDA0003279539650000761
工序1：N－[4－(11，12－二脱氢二苯并[b，f]氮杂环辛四烯－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰甘氨酸(2－2)
在甘氨酰甘氨酸(0.328g，2.49mmol)、N，N－二异丙基乙胺(0.433mL，2.49mmol)的N，N－二甲基甲酰胺(20mL)溶液中，在室温下加入1－{[4－(11，12－二脱氢二苯并[b，f]氮杂环辛四烯－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]氧基}吡咯烷－2，5－二酮(2－1)(1.00g，2.49mmol，Click Chemistry Tools)、水(10mL)，在室温下搅拌一晩。减压蒸馏除去，将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)的分配有机层]进行精制，得到目标产物(0.930g，89％)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:12.58(1H,s),8.14-8.12(1H,m),8.08-8.07(1H,m),7.69-7.68(1H,m),7.62-7.61(1H,m),7.53-7.45(3H,m),7.40-7.29(3H,m),5.05-5.01(1H,m),3.73-3.72(2H,m),3.66-3.60(3H,m),2.66-2.60(1H,m),2.33-2.24(1H,m),2.08-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:420[(M+H)+].
实施例2
[实施例2－1：药物连接子1]
Figure BDA0003279539650000771
工序1：(2R，11aS)－2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－8－羟基－7－甲氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－2，3－二氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5，11(10H，11aH)－二酮(3－2)
在(2R，11aS)－8－(苄氧基)－2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7－甲氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－2，3－二氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5，11(10H，11aH)－二酮(3－1)(25.5g，41.6mmol，WO2016149546)的四氢呋喃(150mL)、乙醇(150mL)溶液中，在氮气气氛下加入5％钯碳(54％水分，10.0g)后，将反应溶液在氢气气氛、室温下搅拌三天。在反应溶液中加入氯仿，硅藻土过滤后，减压蒸馏除去滤液。将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～50：50(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－2)(19.4g，89％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),6.01(1H,s),5.45-5.43(1H,m),4.69-4.67(1H,m),4.60-4.55(1H,m),4.23-4.21(1H,m),3.96(3H,s),3.76-3.68(2H,m),3.63-3.61(1H,m),3.56-3.53(1H,m),2.88-2.83(1H,m),2.03-2.00(1H,m),1.00-0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.02(9H,s).
MS(APCI，ESI)m/z:523(M+H)+
工序2：(2R，11aS)－8－[(5－溴代戊基)氧基]－2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7－甲氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－2，3－二氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5，11(10H，11aH)－二酮(3－3)
在上述工序1所得到的化合物(3－2)(10.8g，20.7mmol)的N，N－二甲基甲酰胺(30mL)溶液中，在室温下加入1，5－二溴戊烷(23.8g，103mmol)、碳酸钾(3.43g，24.8mmol)。在室温下搅拌3小时后，在反应溶液中加入水，用乙酸乙酯提取。将所得到的有机层用饱和盐水清洗，用硫酸钠进行干燥后，减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝90：10(v/v)～50：50(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－3)(14.5g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.52-5.49(1H,m),4.63-4.62(1H,m),4.58-4.55(1H,m),4.24-4.22(1H,m),4.07-4.04(2H,m),3.92(3H,s),3.82-3.64(3H,m),3.56-3.53(1H,m),3.45-3.43(2H,m),2.86-2.84(1H,m),2.04-2.00(1H,m),1.97-1.87(4H,m),1.66-1.62(2H,m),1.01-0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.04(9H,s)
MS(APCI，ESI)m/z:673[81Br,(M+H)+],671[79Br,(M+H)+].
工序3：(2R，11aS)－8－[(5－溴代戊基)氧基]－2－羟基－7－甲氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－2，3－二氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5，11(10H，11aH)－二酮(3－4)
在上述工序2所得到的化合物(3－3)(21.5mmol)的四氢呋喃(40mL)溶液中，在0℃下加入1mol/L的氟化四丁基铵四氢呋喃溶液(28.0mL，28.0mmol)。在室温下搅拌30分钟后，在反应溶液中加入水，用乙酸乙酯提取，将所得到的有机层用饱和盐水清洗。用硫酸钠进行干燥后，减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[氯仿：甲醇＝97.5：2.5(v/v)～92.5：7.5(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－4)(11.3g，94％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.53-5.50(1H,m),4.69-4.64(2H,m),4.32-4.30(1H,m),4.10-4.00(2H,m),3.91(3H,s),3.88-3.75(2H,m),3.73-3.64(2H,m),3.45-3.44(2H,m),2.99-2.96(1H,m),2.15-2.09(1H,m),1.99-1.85(5H,m),1.68-1.62(2H,m),1.01-0.95(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI，ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
工序4：(11aS)－8－[(5－溴代戊基)氧基]－7－甲氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－2，5，11(3H，10H，11aH)－三酮(3－5)
使在上述工序3所得到的化合物(3－4)(11.3g，20.2mmol)、四丁基溴化铵(0.325g，1.01mmol)、溴化钾(0.240g，2.02mmol，)溶解于饱和碳酸氢钠水溶液(60mL)、二氯甲烷(60mL)中，在0℃下加入nor－AZADO(0.0279g，0.202mmol)、次氯酸钠五水合物(2.03g，27.2mmol)，在0℃下搅拌30分钟。由于原料残留，因此在0℃下加入次氯酸钠五水合物(1.00g，13.4mmol)，在0℃下搅拌15分钟。进而在0℃下加入次氯酸钠五水合物(0.300g，4.03mmol)，在0℃下搅拌15分钟，用TLC(薄层色谱法)确认到原料消失。在反应溶液中加入硫代硫酸钠水溶液，用氯仿提取，将所得到的有机层用硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去，将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝75：25(v/v)～40：60(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－5)(9.74g，87％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.33(1H,s),7.24(1H,s),5.56-5.53(1H,m),4.71-4.69(1H,m),4.66-4.63(1H,m),4.27-4.22(1H,m),4.12-4.02(2H,m),3.93-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.69-3.67(1H,m),3.61-3.56(1H,m),3.46-3.44(2H,m),2.82-2.77(1H,m),1.97-1.89(4H,m),1.68-1.64(2H,m),1.05-0.93(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI，ESI)m/z:557[81Br,(M+H)+],555[79Br,(M+H)+].
工序5：(11aS)－8－[(5－溴代戊基)氧基]－7－甲氧基－5，11－二桥氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－2－基三氟甲磺酸酯(3－6)
在上述工序4所得到的化合物(3－5)(9.74g，17.5mmol)的二氯甲烷(160mL)溶液中，在－40℃下加入2，6－二甲基吡啶(8.17mL，70.1mmol)，在－40℃下搅拌10分钟。在－40℃下在反应溶液中加入三氟甲磺酸酐(8.85mL，52.6mmol)，在－40℃下搅拌30分钟。在反应溶液中加入10％柠檬酸水溶液，用氯仿提取，将所得到的有机层用硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去，将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝95：5→70：35]进行精制后，用NH2硅胶色谱法[己烷：乙酸乙酯＝95：5(v/v)～65：35(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－6)(7.10g，59％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.32(1H,s),7.24(1H,s),7.15-7.14(1H,m),5.56-5.53(1H,m),4.70-4.68(1H,m),4.66-4.63(1H,m),4.11-4.01(2H,m),3.94-3.90(4H,m),3.84-3.75(1H,m),3.73-3.68(1H,m),3.46-3.44(2H,m),3.18-3.14(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.69-1.61(2H,m),1.02-0.92(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI，ESI)m/z:689[81Br,(M+H)+],687[79Br,(M+H)+].
工序6：(11aS)－8－[(5－溴代戊基)氧基]－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5，11(10H，11aH)－二酮(3－7)
在上述工序5所得到的化合物(3－6)(2.00g，2.91mmol)、4－甲氧基苯基硼酸(0.884g，5.82mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(0.336g，0.291mmol)、碳酸钠(1.23g，11.6mmol)的混合物中，在室温下加入甲苯(20mL)、乙醇(10mL)、水(10mL)。将反应溶液在室温下搅拌30分钟后，用乙酸乙酯提取反应溶液，用水、饱和盐水清洗。将有机层用硫酸钠进行干燥后，减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝90：10(v/v)～50：50(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－7)(1.71g，91％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.38-7.37(3H,m),7.33(1H,s),7.25(1H,s),6.89-6.88(2H,m),5.56-5.54(1H,m),4.71-4.68(1H,m),4.65-4.62(1H,m),4.09-4.04(2H,m),3.96-3.91(4H,m),3.85-3.66(5H,m),3.46-3.45(2H,m),3.16-3.12(1H,m),1.99-1.94(4H,m),1.69-1.64(2H,m),1.00-0.98(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI，ESI)m/z:647[81Br,(M+H)+],645[79Br,(M+H)+].
工序7：(11aS)－8－[(5－溴代戊基)氧基]－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－1，11a－二氢－5H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5－酮(3－8)
将在上述工序6所得到的化合物(3－7)(0.789g，1.22mmol)溶解于乙醇(10mL)、四氢呋喃(10mL)中，在0℃下加入2.0M的硼氢化锂四氢呋喃溶液(6.11mL，12.2mmol)，在0℃下搅拌3小时。在反应溶液中加入水，用氯仿提取，将所得到的有机层用硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去，将所得到的残渣溶解于二氯甲烷(10mL)、乙醇(20mL)、水(10mL)中，在室温下加入硅胶(4g)，在室温下搅拌4天。通过过滤除去硅胶，加入水，用氯仿提取，将所得到的有机层用硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去，将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝60：40(v/v)～25：75(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－8)(0.496g，81％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.90-7.89(1H,m),7.53(1H,s),7.40-7.40(1H,m),7.35-7.34(2H,m),6.92-6.90(2H,m),6.83-6.81(1H,m),4.43-4.40(1H,m),4.13-4.06(2H,m),3.96(3H,s),3.84(3H,s),3.61-3.57(1H,m),3.47-3.36(3H,m),2.00-1.92(4H,m),1.67-1.63(2H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:501[81Br,(M+H)+],499[79Br,(M+H)+].
工序8：(11aS)－8－[(5－溴代戊基)氧基]－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－1，10，11，11a－四氢－5H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5－酮(3－9)
在上述工序7所得到的化合物(3－8)(0.496g，0.992mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中，在0℃下加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.421g，1.99mmol)。在室温下搅拌2小时后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿提取。将有机层用硫酸钠进行干燥，减压蒸馏除去后，将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝60：40(v/v)～25：75(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－9)(0.426g，86％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.53-7.53(2H,m),7.32-7.30(2H,m),6.89-6.87(2H,m),6.05(1H,s),4.33-4.27(2H,m),4.00-3.98(2H,m),3.86(3H,s),3.82(3H,s),3.57-3.55(2H,m),3.42-3.38(3H,m),2.76-2.72(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.65-1.62(2H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:503[81Br,(M+H)+],501[79Br,(M+H)+].
工序9：(11aS)－8－[(5－溴代戊基)氧基]－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－11，11a－二氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－10(5H)－羧酸丙－2－烯－1－基酯(3－10)
在上述工序8所得到的化合物(3－9)(0.426g，0.849mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中，在0℃下加入吡啶(0.102mL，1.27mmol)、氯甲酸烯丙酯(0.374mL，3.54mmol)，在0℃下搅拌15分钟。在反应溶液中加入10％柠檬酸水溶液，用氯仿提取，将所得到的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液清洗后，用硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去，将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝90：10(v/v)～50：50(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－10)(0.465g，94％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.38(1H,s),7.31-7.29(2H,m),7.26-7.25(1H,m),6.89-6.87(2H,m),6.71(1H,s),5.80-5.78(1H,m),5.14-5.11(2H,m),4.65-4.62(1H,m),4.39-4.26(3H,m),4.03-4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.82(3H,s),3.66-3.64(1H,m),3.46-3.44(2H,m),3.30-3.27(1H,m),2.72-2.68(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.68-1.60(2H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:587[81Br,(M+H)+],585[79Br,(M+H)+].
工序10：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7’－甲氧基－8’－{[5－({(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－10－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基}氧基)戊基]氧基}－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(3－11)
在实施例1－1工序10所得到的化合物(1－11)(0.130g，0.161mmol)与上述工序9所得到的化合物(3－10)(0.104g，0.177mmol)的N，N－二甲基甲酰胺(3mL)溶液中，在室温下加入碳酸钾(0.0266g，0.193mmol)，在室温下搅拌一晩。将反应溶液用乙酸乙酯稀释，用水、饱和盐水清洗后，用硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去后，将所得到的残渣用NH2－硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝70：30(v/v)～0：100(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－11)(0.184g，87％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.76(1H,s),7.58-7.56(2H,m),7.39(1H,s),7.32-7.30(2H,m),7.26-7.24(2H,m),7.19-7.17(3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68-6.66(1H,m),6.37(1H,s),5.99-5.93(3H,m),5.34-5.20(6H,m),4.66-4.01(11H,m),3.90(3H,s),3.89(3H,s),3.78-3.54(9H,m),3.31-3.28(2H,m),2.73-2.69(1H,m),2.38-2.35(1H,m),2.19-2.13(1H,m),1.82-1.80(2H,m),1.46-1.29(6H,m),0.98-0.90(6H,m),0.83(9H,s),0.69-0.63(4H,m),0.19-0.16(6H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:1312(M+H)+
工序11：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－{[5－({(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－10－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基}氧基)戊基]氧基}－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(3－12)
在上述工序10所得到的化合物(3－11)(0.1837g，0.140mmol)与醋酸(0.048mL，0.840mmol)的四氢呋喃(5.00mL)溶液中，在室温下加入1mol/L的氟化四丁基铵四氢呋喃溶液(0.700mL，0.700mmol)，在室温下搅拌3小时。将反应溶液用乙酸乙酯稀释，将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗后，用硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去后，将所得到的残渣用硅胶色谱法[氯仿：甲醇＝99.5：0.5(v/v)～95：5(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－12)(0.178g，定量)。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.86(1H,s),7.60-7.59(2H,m),7.39(1H,s),7.32-7.20(7H,m),6.90-6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68(1H,s),6.38(1H,s),5.90-5.87(3H,m),5.39-5.22(6H,m),4.72-4.02(11H,m),3.90(3H,s),3.88(3H,s),3.83(3H,s),3.70-3.63(6H,m),3.32-3.29(3H,m),2.73-2.69(1H,m),2.43-2.40(1H,m),2.12-2.06(1H,m),1.77-1.74(2H,m),1.39-1.25(6H,m),0.96-0.89(6H,m),0.73-0.66(4H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:1198(M+H)+
工序12：L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－[(5－{[(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基]氧基}戊基)氧基]－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(3－13)
在上述工序11所得到的化合物(3－12)(0.140mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液中，在室温下加入吡咯烷(0.0579mL,0.700mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(0.0162g,0.0140mmol)，在室温下搅拌15分钟。减压蒸馏除去后，将所得到的残渣用硅胶色谱法[氯仿：甲醇＝99.5：0.5(v/v)～92.5：7.5(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－13)(0.143g,99％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:9.12(1H,s),7.94-7.92(1H,m),7.57-7.53(4H,m),7.33-7.31(2H,m),7.20-7.18(3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.36(1H,s),6.07(1H,s),5.91-5.88(1H,m),5.47-5.44(1H,m),5.21-5.13(1H,m),4.66-4.58(3H,m),4.32(1H,s),4.03-3.49(17H,m),3.38-3.29(4H,m),3.15-3.14(1H,m),2.77-2.73(1H,m),2.57(2H,s),2.43-2.40(1H,m),2.32-2.27(1H,m),1.81-1.39(8H,m),0.98-0.96(3H,m),0.85-0.83(3H,m),0.75-0.62(4H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:1030(M+H)+
工序13：N－[4－(11，12－二脱氢二苯并[b，f]氮杂环辛四烯－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰甘氨酰基－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－[(5－{[(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基]氧基}戊基)氧基]－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(3－14)
在实施例1－2工序1所得到的化合物(2－2)(0.0640g,0.153mmol)、N－乙氧基羰基－2－乙氧基－1，2－二氢喹啉(0.0446g,0.180mmol)的混合物中，在室温下加入二氯甲烷(2mL)，在室温下搅拌15分钟。在反应溶液中加入上述工序12所得到的化合物(3－13)(0.143g,0.139mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液，在室温下搅拌五小时后，减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶色谱法[氯仿：甲醇＝99.5：0.5(v/v)～92.5：7.5(v/v)]进行精制，得到目标产物(3－14)(0.103g,52％)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.93(1H,s),8.21-8.16(2H,m),8.07-8.04(1H,m),7.83-7.64(2H,m),7.60-7.55(3H,m),7.51-7.28(10H,m),7.19-7.16(2H,m),7.10-7.04(1H,m),6.92-6.90(2H,m),6.76-6.70(1H,m),6.39(1H,s),5.77-5.75(1H,m),5.21-5.18(1H,m),5.03-4.99(1H,m),4.82-4.79(1H,m),4.37-4.35(1H,m),4.21-4.20(2H,m),4.02-3.24(26H,m),3.16-3.13(1H,m),2.79-2.59(2H,m),2.39-2.28(2H,m),2.05-1.97(2H,m),1.91-1.77(4H,m),1.57-1.54(3H,m),1.28-1.23(3H,m),0.85-0.80(6H,m),0.67-0.61(4H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:1431(M+H)+
[实施例2－2：药物连接子2]
Figure BDA0003279539650000851
工序1：(2R，11aS)－8－(3－溴代丙氧基)－2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7－甲氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－2，3－二氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5，11(10H，11aH)－二酮(4－1)
使实施例2－1工序1所得到的化合物(3－2)(5.06g，9.67mmol)和1，3－二溴丙烷(4.93mL，48.4mmol)与实施例2－1工序2同样地反应，得到目标产物(4－1)(4.85g，78％)。
MS(APCI，ESI)m/z:645[81Br,(M+H)+],643[79Br,(M+H)+].
工序2：(2R，11aS)－8－(3－溴代丙氧基)－2－羟基－7－甲氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－2，3－二氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5，11(10H，11aH)－二酮(4－2)
使上述工序1所得到的化合物(4－1)(4.85g，7.54mmol)与实施例2－1工序3同样地反应，得到目标产物(4－2)(4.05g，定量)。
MS(APCI，ESI)m/z:531[81Br,(M+H)+],529[79Br,(M+H)+].
工序3：(11aS)－8－(3－溴代丙氧基)－7－甲氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－2，5，11(3H，10H，11aH)－三酮(4－3)
使上述工序2所得到的化合物(4－2)(7.54mmol)与实施例2－1工序4同样地反应，得到目标产物(4－3)(3.73g，93％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.29(1H,s),5.56-5.53(1H,m),4.72-4.69(1H,m),4.67-4.61(1H,m),4.23-4.17(3H,m),3.97-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.74-3.56(4H,m),2.82-2.77(1H,m),2.43-2.38(2H,m),1.06-0.94(2H,m),0.08-0.00(9H,m).
工序4：(11aS)－8－(3－溴代丙氧基)－7－甲氧基－5，11－二桥氧基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－2－基三氟甲磺酸酯(4－4)
使上述工序3所得到的化合物(4－3)(3.73g，7.08mmol)与实施例2－1工序5同样地反应，得到目标产物(4－4)(3.27g，70％)。
MS(APCI，ESI)m/z:661[81Br,(M+H)+],659[79Br,(M+H)+].
工序5：(11aS)－8－(3－溴代丙氧基)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基－10－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5，11(10H，11aH)－二酮(4－5)
使上述工序4所得到的化合物(4－4)(3.27g，4.96mmol)与实施例2－1工序6同样地反应，得到目标产物(4－5)(2.49g，81％)。
MS(APCI，ESI)m/z:619[81Br,(M+H)+],617[79Br,(M+H)+].
工序6：(11aS)－8－(3－溴代丙氧基)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－1，11a－二氢－5H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5－酮(4－6)
使上述工序5所得到的化合物(4－5)(2.49g，4.04mmol)与实施例2－1工序7同样地反应，得到目标产物(4－6)(1.59g，84％)。
MS(APCI，ESI)m/z：473[81Br，(M+H)+]，471[79Br，(M+H)+].
工序7：(11aS)－8－(3－溴代丙氧基)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－1，10，11，11a－四氢－5H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－5－酮(4－7)
使上述工序6所得到的化合物(4－6)(1.59g，3.38mmol)与实施例2－1工序8同样地反应，得到目标产物(4－7)(1.39g，87％)。
MS(APCI，ESI)m/z:475[81Br,(M+H)+],473[79Br,(M+H)+].
工序8：(11aS)－8－(3－溴代丙氧基)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－11，11a－二氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－10(5H)－羧酸丙－2－烯－1－基酯(4－8)
使上述工序7所得到的化合物(4－7)(1.40g，2.95mmol)与实施例2－1工序9同样地反应，得到目标产物(4－8)(0.885g，54％)。
MS(APCI，ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
工序9：N－{[(丙－2－烯－1－基)氧基]羰基}－L－缬氨酰基－N－[4－({[(11’S,11’aS)－11’－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7’－甲氧基－8’－(3－{[(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－10－{[(丙－2－烯－1－基)氧基]羰基}－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基]氧基}丙氧基)－5’－桥氧基－11’，11’a－二氢－1’H，3’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－羰基]氧基}甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(4－9)
使上述工序8所得到的化合物(4－8)(0.0381g，0.0683mmol)和实施例1－1工序10所得到的化合物(1－11)(0.0552g，0.0683mmol)与实施例2－1工序10同样地反应，得到目标产物(4－9)(0.0712g，81％)。
MS(APCI，ESI)m/z：1284(M+H)+.
工序10：N－{[(丙－2－烯－1－基)氧基]羰基}－L－缬氨酰基－N－[4－({[(11’S,11’aS)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－(3－{[(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－10－{[(丙－2－烯－1－基)氧基]羰基}－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基]氧基}丙氧基)－5’－桥氧基－11’，11’a－二氢－1’H，3’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－羰基]氧基}甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(4－10)
使上述工序9所得到的化合物(4－9)(0.0712g，0.0554mmol)与实施例2－1工序11同样地反应，得到目标产物(4－10)(0.0671g，定量)。
MS(APCI，ESI)m/z：1170(M+H)+.
工序11：L－缬氨酰基－N－[4－({[(11’S,11’aS)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－(3－{[(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基]氧基}丙氧基)－5’－桥氧基－11’，11’a－二氢－1’H，3’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－羰基]氧基}甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(4－11)
使上述工序10所得到的化合物(4－10)(0.0571mmol)与实施例2－1工序12同样地反应，得到目标产物(4－11)(0.0574g，99％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:9.16(1H,s),7.93-7.91(1H,m),7.55-7.52(1H,m),7.50-7.47(3H,m),7.35-7.32(2H,m),7.21(1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.40(1H,s),6.08(1H,s),5.90-5.87(1H,m),5.37-5.34(1H,m),4.73-4.53(3H,m),4.23-4.08(5H,m),3.89(3H,s),3.82(3H,s),3.78-3.72(5H,m),3.57-3.51(3H,m),3.38-3.30(3H,m),2.76-2.71(1H,m),2.36-2.24(4H,m),1.78-1.42(6H,m),1.00-0.98(3H,m),0.87-0.84(3H,m),0.74-0.62(4H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:1002(M+H)+.
工序12：N－[4－(11，12－二脱氢二苯并[b，f]氮杂环辛四烯－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰甘氨酰基－L－缬氨酰基－N－[4－({[(11’S,11’aS)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－(3－{[(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基]氧基}丙氧基)－5’－桥氧基－11’，11’a－二氢－1’H，3’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－羰基]氧基}甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(4－12)
使上述工序11所得到的化合物(4－11)(0.189g，0.189mmol)和实施例1－2工序1所得到的化合物(2－2)(0.087g，0.207mmol)与实施例2－1工序13同样地反应，得到目标产物(4－12)(0.169g，64％)。
MS(APCI，ESI)m/z：1402(M+H)+.
[实施例2－3：药物连接子3]
Figure BDA0003279539650000901
工序1：二甲基(6S，6’S)－5，5’－{1，5－戊二基双[氧基(5－甲氧基－2－硝基苯－4，1－二基)羰基]}双(5－氮杂螺[2.4]庚烷－6－羧酸酯)(5－2)
在4，4’－[1，5－戊二基双(氧基)]双(5－甲氧基－2－硝基苯甲酸)(5－1)(5.41g，10.9mmol，Journal of Medicinal Chemistry 2004，47，1161)的二氯甲烷(50mL)溶液中，在0℃下加入草酰氯(5.63mL，65.7mmol)，滴入N，N－二甲基甲酰胺(0.0844mL，1.09mmol)。将反应溶液升温至室温，搅拌2小时。将减压蒸馏除去而得到的残渣溶解于二氯甲烷(100mL)，在氮气气氛、－40℃下滴入至(6S)－5－氮杂螺[2.4]庚烷－6－羧酸甲酯盐酸盐(4.28g，24.1mmol，Tetrahedron Letters 2012.53.3847)与三乙胺(6.07mL，43.8mmol)的二氯甲烷溶液(100mL)。将反应溶液升温至0℃搅拌2小时。在反应混合物中加入1N盐酸(100mL)，将有机层用水、饱和盐水清洗，用无水硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去，得到目标产物(5－2)(8.40g，定量)。
MS(APCI，ESI)m/z:769(M+H)+.
工序2：{1，5－戊二基双[氧基(5－甲氧基－2－硝基苯－4，1－二基)]}双{[(6S)－6－(羟甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基]甲酮}(5－3)
在上述工序1所得到的化合物(5－2)(8.40g，10.9mmol)的四氢呋喃(100mL)溶液中加入硼氢化锂(714mg，32.8mmol)，在0℃下搅拌30分钟，升温至室温搅拌1小时。在0℃下加入1N盐酸后，用乙酸乙酯提取，用饱和盐水清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下蒸馏除去溶剂，得到目标产物(5－3)(7.70g，99％)。
MS(APCI，ESI)m/z:713(M+H)+.
工序3：戊烷－1，5－二基双[氧基(5－甲氧基－2－硝基苯－4，1－二基)羰基(6S)－5－氮杂螺[2.4]庚烷－5，6－二基甲烷二基]二乙酸酯(5－4)
使上述工序2所得到的化合物(5－3)(7.70g，10.8mmol)溶解于吡啶(20mL)和醋酸酐(10mL，105.9mmol)，在室温下搅拌。减压蒸馏除去，得到目标产物(5－4)(8.38g，97％)。
MS(APCI，ESI)m/z:797(M+H)+.
工序4：1，5－戊二基双[氧基(2－氨基－5－甲氧基苯－4，1－二基)羰基(6S)－5－氮杂螺[2.4]庚烷－5，6－二基甲烷二基]二乙酸酯(5－5)
在上述工序3所得到的化合物(5－4)(8.28g，10.4mmol)的N，N－二甲基甲酰胺(100mL)溶液中加入5％钯碳(54％水分，1.00g)后，在氢气气氛、室温下将反应溶液剧烈搅拌6小时。硅藻土过滤后，将减压蒸馏除去滤液而得到的残渣用硅胶柱色谱法[氯仿：甲醇＝100：0(v/v)～90：10(v/v)]进行精制，得到目标产物(5－5)(5.05g，66％)。
MS(APCI，ESI)m/z:737(M+H)+.
工序5：{(6S)－5－[4－({5－[4－({(6S)－6－[(乙酰氧基)甲基]－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基}羰基)－5－氨基－2－甲氧基苯氧基]戊基}氧基)－5－甲氧基－2－{[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]氨基}苯甲酰基]－5－氮杂螺[2.4]庚－6－基}甲基乙酸酯(单烯丙氧基羰基体)(5－6)
在上述工序4所得到的化合物(5－5)(5.05g，6.85mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入吡啶(1.10mL，13.7mmol)，在氮气气氛、－78℃下加入氯甲酸烯丙酯(0.725mL，6.85mmol)，搅拌2小时。将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝70：30(v/v)～100：0(v/v)，氯仿：甲醇＝100：0(v/v)～90：10(v/v)]进行精制，得到作为目标产物的单烯丙氧基羰基体(5－6)(2.63g，47％)。
MS(APCI，ESI)m/z:821(M+H)+.
工序6：N－[(2－丙烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[2－({(6S)－6－[(乙酰氧基)甲基]－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基}羰基)－5－({5－[4－({(6S)－6－[(乙酰氧基)甲基]－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基}羰基)－2－甲氧基－5－{[(2－丙烯－1－基氧基)羰基]氨基}苯氧基]戊基}氧基)－4－甲氧基苯基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(5－7)
使上述工序5所得到的单烯丙氧基羰基体(5－6)(2.00g，2.44mmol)和N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－[4－(羟甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(1.10g，2.92mmol，WO2011130598)与实施例1－1工序6同样地反应，得到目标产物(5－7)(2.64g，89％)。
MS(APCI，ESI)m/z:1224(M+H)+.
工序7：N－[(2－丙烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－[4－({[(2－{[(6S)－6－(羟甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基]羰基}－5－{[5－(4－{[(6S)－6－(羟甲基)－5－氮杂螺[2.4]庚－5－基]羰基}－2－甲氧基－5－{[(2－丙烯－1－基氧基)羰基]氨基}苯氧基)戊基]氧基}－4－甲氧基苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]－L－丙氨酸酰胺(5－8)
在上述工序6所得到的化合物(5－7)(2.64g，2.16mmol)的甲醇(10mL)溶液中加入碳酸钾(1.49g，10.8mmol)，在室温下搅拌3小时。在反应混合物中加入饱和氯化铵水溶液(100mL)，用乙酸乙酯提取。将有机层用无水硫酸钠进行干燥。减压蒸馏除去，得到目标产物(5－8)(2.21g，90％)。
MS(APCI，ESI)m/z:1140(M+H)+.
工序8：N－[(2－丙烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－8’－{[5－({(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－5’－桥氧基－10’－[(2－丙烯－1－基氧基)羰基]－5’，10’，11’，11a’－四氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－8’－基}氧基)戊基]氧基}－7’－甲氧基－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(5－9)
在上述工序7所得到的化合物(5－8)(2.03g，1.78mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入戴斯－马丁氧化剂(1.59g，3.74mmol)，在室温下搅拌一晩。在反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)，用氯仿提取。将有机层用无水硫酸钠进行干燥。将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[氯仿：甲醇＝100：0(v/v)～90：10(v/v)]进行精制，得到目标产物(5－9)(2.05g，定量)。
MS(APCI，ESI)m/z:1136(M+H)+.
工序9：L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－[(5－{[(11a’S)－7’－甲氧基－5’－桥氧基－5’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－8’－基]氧基}戊基)氧基]－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(5－10)
使上述工序8所得到的化合物(5－9)(2.05g，1.80mmol)与实施例2－1工序12同样地反应，得到目标产物(5－10)(1.02g，60％)。
MS(APCI，ESI)m/z:950(M+H)+.
工序10：N－[4－(11，12－二脱氢二苯并[b，f]氮杂环辛四烯－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰甘氨酰基－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－[(5－{[(11a’S)－7’－甲氧基－5’－桥氧基－5’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－8’－基]氧基}戊基)氧基]－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(5－11)
将上述工序9所得到的化合物(5－10)(0.710g，0.747mmol)和实施例1－2工序1所得到的化合物(2－2)(0.313g，0.747mmol)溶解于二氯甲烷(1.5mL)与甲醇(0.1mL)的混合溶剂中。加入4－(4，6－二甲氧基－1，3，5－三嗪－2－基)－4－甲基吗啉鎓氯化物(0.264g，0.897mmol)，在室温下搅拌1小时。将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[氯仿：甲醇＝100：0(v/v)～80：20(v/v)]进行精制，得到目标产物(5－11)(0.671g，66％)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.91(1H,s),8.32(1H,s),8.23-7.91(3H,m),7.81-7.19(14H,m),7.04(1H,m),6.80-6.62(3H,m),5.77-5.75(1H,m),5.20(1H,m),5.01(1H,m),4.79(1H,m),4.46-4.35(1H,m),4.04(4H,m),3.86-3.38(18H,m),3.22-3.15(2H,m),2.67-2.63(1H,m),2.46-2.23(3H,m),2.09-1.91(2H,m),1.80-1.78(5H,m),1.57(3H,m),1.27(3H,s),1.11-1.04(1H,m),0.87-0.79(6H,m),0.63-0.55(6H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:1351(M+H)+.
[实施例2－4：药物连接子4]
Figure BDA0003279539650000941
工序1：(6S)－5－[4－(苄基氧基)－5－甲氧基－2－硝基苯甲酰基]－5－氮杂螺[2.4]庚烷－6－羧酸甲酯(6－2)
在4－(苄基氧基)－5－甲氧基－2－硝基苯甲酸(6－1)(6.07g，20.0mmol，Tetrahedron 1995，51，5617)、N，N－二甲基甲酰胺(1.08mL，13.9mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中，在冰冷却下用5分钟滴入草酰氯(3.43mL，40.0mmol)。在室温下，将反应溶液搅拌5小时后，减压蒸馏除去，将所得到的残渣溶解于二氯甲烷(20mL)中，减压蒸馏除去。将该操作重复3次后，使残渣悬浮于二氯甲烷(5mL)中，向其中加入过量的二乙醚和己烷，过滤，在减压下进行干燥，由此得到粗制酰基氯。使所得到的酰基氯溶解于二氯甲烷中，冷却至－40℃(干冰－乙腈浴)，缓慢加入(6S)－5－氮杂螺[2.4]庚烷－6－羧酸甲酯盐酸盐(4.22g，22.0mmol，Tetrahedron Letters 2012.53.3847)、三乙胺(3.36mL，24.2mmol)。用一晚将反应混合物升温至室温。在反应混合物中加入1N盐酸，用二氯甲烷提取反应混合物。将有机层用水、饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和盐水清洗，用无水硫酸钠干燥。将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0～50：50]进行精制，得到目标产物(6－2)(6.55g，80％)。
MS(APCI，ESI)m/z:441(M+H)+
工序2：(11a’S)－8’－(苄基氧基)－7’－甲氧基－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’，11’(10’H，11a’H)－二酮(6－3)
在上述工序1所得到的化合物(6－2)(6.55g，16.0mmol)的乙醇(150mL)、四氢呋喃(150mL)溶液中，在氮气气氛下加入雷尼镍(7.00g)。在反应混合物中加入肼一水合物(7mL)，缓慢升温至50℃。在50℃下搅拌2小时后加入雷尼镍(3.00g)、肼一水合物(3mL)，搅拌1小时。在反应混合物中加入THF(100mL)，硅藻土过滤。将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0～25：75]进行精制，得到目标产物(6－3)(4.42g，73％)。
MS(APCI，ESI)m/z:379(M+H)+
工序3：(11a’S)－8’－(苄基氧基)－7’－甲氧基－10’－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’，11’(10’H，11a’H)－二酮(6－4)
在上述工序2所得到的化合物(6－3)(10.0g，26.4mmol)的四氢呋喃(150mL)溶液中，在－40℃下缓慢滴入2.6mol/L的正丁基锂正己烷溶液(12.0mL，31.8mmol)。在－40℃下将反应溶液搅拌15分钟后，缓慢滴入2－(氯甲氧基)乙基三甲基硅烷(5.57mL，31.7mmol)。在室温下将反应溶液搅拌3小时后，加入水，用乙酸乙酯提取。将有机层用水和饱和盐水清洗，用无水硫酸钠进行干燥。将减压蒸馏除去而得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0～30：70]进行精制，得到目标产物(6－4)(11.8g，88％)。
MS(APCI，ESI)m/z:509(M+H)+
工序4：(11a’S)－8’－羟基－7’－甲氧基－10’－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’，11’(10’H，11a’H)－二酮(6－5)
在上述工序3所得到的化合物(6－4)(18.7g，36.8mmol)的四氢呋喃(50mL)、乙醇(100mL)溶液中，在氮气气氛下加入5％的钯碳催化剂(5.00g)。立即将氮气球替换成氢气球，在氢气气氛下将反应混合物搅拌6小时。在反应混合物中加入氯仿稀释，进行硅藻土过滤后，减压蒸馏除去滤液，将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0～25：75]进行精制，得到目标产物(6－5)(15.1g，98％)。
MS(APCI，ESI)m/z：419(M+H)+
工序5：(11a’S)－8’－[(5－溴代戊基)氧基]－7’－甲氧基－10’－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’，11’(10’H，11a’H)－二酮(6－6)
使上述工序4所得到的化合物(6－5)(2.77g，6.62mmol)与实施例2－1工序2同样地反应，得到目标产物(6－6)(3.31g，88％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),5.55(1H,m),4.65(1H,m),4.24-4.23(1H,m),4.11-4.03(2H,m),3.93(3H,s),3.85-3.78(1H,m),3.72-3.69(2H,m),3.46-3.39(3H,m),2.47-2.44(1H,m),2.25-2.22(1H,m),1.95-1.91(4H,m),1.67-1.59(1H,m),1.03-0.95(2H,m),0.90-0.85(1H,m),0.70-0.66(4H,m),0.05(9H,s).
工序6：(11a’S)－8’－[(5－溴代戊基)氧基]－7’－甲氧基－1’，11a’－二氢－5’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’－酮(6－7)
使上述工序5所得到的化合物(6－6)(3.31g，5.83mmol)与实施例2－1工序7同样地反应，得到目标产物(6－7)(1.11g，45％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.81(1H,m),7.53(1H,s),6.82(1H,s),4.13-4.06(2H,m),3.97(3H,s),3.88-3.83(1H,m),3.69(1H,m),3.52-3.39(3H,m),2.55-2.52(1H,m),2.06-1.89(5H,m),1.67-1.63(2H,m),0.76-0.72(4H,m).
工序7：(11a’S)－8’－[(5－溴代戊基)氧基]－7’－甲氧基－1’，10’，11’，11a’－四氢－5’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’－酮(6－8)
使上述工序6所得到的化合物(6－7)(2.56g，6.08mmol)与实施例2－1工序8同样地反应，得到目标产物(6－8)(1.15g，45％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.60(1H,s),6.07(1H,s),4.11-4.04(1H,m),3.99(2H,m),3.87-3.84(1H,m),3.85(3H,s),3.73(1H,m),3.58-3.53(2H,m),3.47-3.42(3H,m),2.03-1.78(6H,m),1.65-1.63(2H,m),0.77-0.56(4H,m).
工序8：(11a’S)－8’－[(5－溴代戊基)氧基]－7’－甲氧基－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－羧酸丙－2－烯－1－基酯(6－9)
使上述工序7所得到的化合物(6－8)(1.15g，2.72mmol)与实施例2－1工序9同样地反应，得到目标产物(6－9)(1.14g，82％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.23(1H,s),6.69(1H,s),5.79(1H,s),5.13-5.10(2H,m),4.68-4.66(1H,m),4.48-4.45(2H,m),4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.76(1H,m),3.54-3.37(3H,m),2.39(1H,m),1.95-1.90(4H,m),1.68-1.61(3H,m),1.44(1H,m),0.75-0.66(4H,m).
工序9：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7’－甲氧基－8’－{[5－({(11a’S)－7’－甲氧基－5’－桥氧基－10’－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－5’，10’，11’，11a’－四氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－8’－基}氧基)戊基]氧基}－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(6－10)
使上述工序8所得到的化合物(6－9)(0.374g，0.737mmol)和实施例1－1工序10所得到的化合物(1－11)(0.452g，0.56mmol)与实施例2－1工序10同样地反应，得到目标产物(6－10)(0.589g，65％)。
MS(APCI，ESI)m/z：1234(M+H)+
工序10：N－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－{[5－({(11a’S)－7’－甲氧基－5’－桥氧基－10’－[(丙－2－烯－1－基氧基)羰基]－5’，10’，11’，11a’－四氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－8’－基}氧基)戊基]氧基}－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(6－11)
使上述工序9所得到的化合物(6－10)(0.589g，0.477mmol)与实施例2－1工序11同样地反应，得到目标产物(6－11)(0.382g，71％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.90(1H,s),7.55(2H,m),7.25-7.21(2H,m),6.74(2H,m),6.38(1H,s),5.90-5.87(5H,m),5.33-5.09(8H,m),4.66-4.60(8H,m),3.98-3.91(10H,m),3.77-3.30(12H,m),2.42-2.36(2H,m),1.77-1.39(6H,m),0.91-0.70(14H,m).
工序11：L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－[(5－{[(11a’S)－7’－甲氧基－5’－桥氧基－5’，10’，11’，11a’－四氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－8’－基]氧基}戊基)氧基]－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(6－12)
使上述工序10所得到的化合物(6－11)(0.382g，0.341mmol)与实施例2－1工序12同样地反应，得到目标产物(6－12)(0.200g，62％)。
MS(APCI，ESI)m/z：952(M+H)+
工序12：N－[4－(11，12－二脱氢二苯并[b，f]氮杂环辛四烯－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰甘氨酰基－L－缬氨酰基－N－{4－[({[(11’S,11a’S)－11’－羟基－7’－甲氧基－8’－[(5－{[(11a’S)－7’－甲氧基－5’－桥氧基－5’，10’，11’，11a’－四氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－8’－基]氧基}戊基)氧基]－5’－桥氧基－11’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－10’(5’H)－基]羰基}氧基)甲基]苯基}－L－丙氨酸酰胺(6－13)
使上述工序11所得到的化合物(6－12)(0.0560g，0.0588mmol)和实施例1－2工序1所得到的化合物(2－2)(0.022g，0.053mmol)与实施例2－1工序13同样地反应，得到目标产物(6－13)(0.0500g，63％)。
MS(APCI，ESI)m/z：1354(M+H)+
〔糖链供体的合成〕
实施例3：[N3－PEG(3)]－MSG1－Ox
Figure BDA0003279539650000991
工序1：(MSG1－)Asn
将作为市售品的monosialo-Asn free(1S2G/1G2S－10NC－Asn，(株)糖链工程研究所制)(称为“(MSG－)Asn”)(500mg)在以下的条件下用反相HPLC进行分离精制，分离为以第一主峰洗脱出的(MSG1－)Asn(保留时间15～19min左右)和以第二主峰洗脱出的(MSG2－)Asn(保留时间21～26min左右)。将0.1％甲酸水溶液用作洗脱液，装置使用ELS-PDA触发分取系统(日本分光株式会社制)，柱使用Inertsil ODS-3(10um，30Φ×250mm，GLSciences公司制)，流速为30mL/min。分取出在洗脱中UV检测(210nm)出的最初的峰，进行冻干，得到目标产物(238mg)。
工序2：MSG1
使上述工序1所得到的化合物(229mg)溶解于200mM磷酸缓冲溶液(pH6.25)(1145μL)中，加入EndoM(东京化成工业(株)制，1U/mL))水溶液(100μL)，在35℃下保温6天。反应结束后，使用VIVASPIN 15R(Hydrosart膜，30K，6000xG)对反应液进行超滤，用反相HPLC对所得到的透过液进行分离精制。将0.1％三氟醋酸水溶液用作洗脱液，装置使用ELS-PDA触发分取系统(日本分光株式会社制)，柱使用Inertsil ODS-3(GL Sciences公司制)。分取出在洗脱中UV检测(210nm)出的目标产物的峰，进行冻干，得到目标产物(117mg)。
工序3：[N3－PEG(3)]－MSG1
在5ml采样管((株)Ina Optica)中加入11－叠氮基－3，6，9－三氧杂十一烷－1－胺(0.108mL，0.541mmol)和上述工序2所得到的MSG1(117mg，0.068mmol)的水溶液(1.2mL)，搅拌1小时后，进行冻干。在冻干后的5ml采样管中加入O－(7－氮杂苯并三唑－1－基)－N，N，N’，N’－四甲基脲六氟磷酸盐(103mg，0.27mmol)的N，N－二甲基甲酰胺溶液(1.2mL)和二异丙基乙胺(0.046mL，0.27mmol)，在37℃下搅拌3小时。反应结束后，将反应液转移至预先加入了二乙醚(20ml)的离心管(50ml)中。利用小型离心机(日立工机，CF16RX)使固体物质沉淀，除去上清液。进而，加入二乙醚(10ml)，进行离心分离操作后，进行倾析。接着，反复进行两次加入乙腈(10mL)，进行离心分离后，进行倾析的操作后，在减压下进行干燥，得到粗产物。将所得到的固体物质用与上述工序2同样的条件用反相HPLC进行精制，得到目标产物(94.2mg)。
工序4：[N3－PEG(3)]－MSG1－Ox
在5mL采样管((株)Ina Optica制)中加入上述工序3合成的化合物(100mg)、2－氯－1，3－二甲基－1H－苯并咪唑－3－鎓－氯化物(伏见制药所制，56mg，0.257mmol)的水溶液(520μl)。在冰冷却后的反应液中加入磷酸三钾(165mg，0.78mmol)的水溶液(520μl)，在冰冷却下搅拌3小时。使用Amicon Ultra(Ultracell30K，Merck Millipore制)对所得到的反应液进行超滤，除去固体物质。用凝胶过滤色谱法对该透过液进行精制。装置使用Purif-Rp2(昭光Scientific制)，柱使用HiPrep 26/10Desalting(GE Healthcare制)，流动相使用0.03％NH3水溶液，流速为10mL/min，级分体积为10mL。收集在洗脱中UV检测(220nm)出的包含目标产物的馏分，加入1N氢氧化钠水溶液(104μl，0.104mmol)进行冻干，得到目标产物(84mg)。
实施例4：[N3－PEG(3)]－MSG－Ox
Figure BDA0003279539650001011
工序1：(MSG－)Asn的制备
使作为市售品的1S2G/1G2S－10NC－Asn－Fmoc((株)糖链工程研究所制)(称为“Fmoc－(MSG－)Asn”)(1000mg)溶解于乙醇/水(1/1)(10mL)，加入1N氢氧化钠水溶液(1.75mL，4当量)，在室温下搅拌3小时。反应结束后，使用Amicon Ultra(30K，Millipore公司制)对反应液进行超滤，除去固体物质，在所得到的透过液中加入1N盐酸(832μl，1.9当量)。使用高速浓缩装置V-10(Biotage公司制)，除去溶剂。加入乙腈，使用高速浓缩装置V-10(Biotage公司制)除去溶剂后，用反相HPLC进行分离精制。将0.1％三氟醋酸水溶液和0.1％三氟醋酸乙腈溶液作为洗脱液，装置使用Purif-Rp2(昭光Scientific制)，柱使用Inertsil ODS-3(GLSciences制)。收集在洗脱中UV检测(220nm)出的包含目标产物的馏分，进行冻干。当再次溶解于纯水中时，用pH试纸确认为酸性，因此加入18％氨水(150μl)，用pH试纸确认为碱性，再次进行冻干。将所得到的目标产物(840mg)直接用于下一步反应中。
工序2：MSG的合成
使工序1所得到的化合物(840mg)溶解于200mM磷酸缓冲溶液(pH6.25)(6000μL)中，加入EndoM(东京化成工业(株)制，1U/mL))水溶液(200μL)，在28℃下保温26小时。由于反应未结束，因此加入EndoM(东京化成工业(株)制，1U/mL))水溶液(50μL)，在28℃下保温2小时后，在室温下放置直至反应结束。反应结束后，使用Amicon Ultra(30K，Millipore公司制)对反应液进行超滤。在所得到的透过液中加入三氟醋酸(80μl)，用反相HPLC进行分离精制。将0.1％三氟醋酸水溶液和0.1％三氟醋酸乙腈溶液作为洗脱液，装置使用Purif-Rp2(昭光Scientific制)，柱使用Inertsil ODS-3(GL Sciences制)。收集在洗脱中UV检测(220nm)出的包含目标产物的馏分，进行冻干。出于除去残留的三氟醋酸的目的，再次溶解于纯水中，得到无色固体的目标化合物(618mg)。
ESI-MS:C66H110N4O49:[M+H]+理论值1743.62,实际值1743.63
工序3：[N3－PEG(3)]－MSG的合成
使用上述工序2所得到的化合物(120mg)，根据与实施例3工序3同样的方法得到目标产物(88.6mg)。
ESI-MS:C73H124N8O51:[M+2H]2+理论值965.37,实际值965.37
工序4：[N3－PEG(3)]－MSG－Ox的合成
使用上述工序3所得到的合成的化合物(100mg)，根据与实施例3工序4同样的方法得到目标产物(88mg)。
实施例5：[N3－PEG(3)]2－SG(10)－Ox
Figure BDA0003279539650001031
工序1：[N3－PEG(3)]2－SG(10)
在5ml采样管((株)Ina Optica)中加入11－叠氮基－3，6，9－三氧杂十一烷－1－胺(0.096mL，0.485mmol)、二唾液酸八糖(50mg，0.24mmol)的水溶液(0.5mL)，搅拌1小时后，进行冻干。在冻干后的5ml采样管中加入O－(7－氮杂苯并三唑－1－基)－N，N，N’，N’－四甲基脲六氟磷酸盐(92mg，0.24mmol)的N，N－二甲基甲酰胺溶液(0.6mL)和二异丙基乙胺(0.042mL，0.24mmol)，在37℃下搅拌4小时。反应结束后，将反应液转移至预先加入了二乙醚(20ml)的离心管(50ml)中。利用小型离心机(日立工机，CF16RX)使固体物质沉淀，除去上清液。加入二乙醚(20ml)进行倾析。接着，加入乙腈(20mL)进行倾析后，在减压下进行干燥，得到粗产物。将所得到的固体物质溶解于适量的0.2％三氟醋酸水溶液中，用反相HPLC进行分离精制。将0.1％三氟醋酸水溶液和0.1％三氟醋酸乙腈溶液作为洗脱液，装置使用Purif-Rp2(昭光Scientific制)，柱使用Inertsil ODS-3(GL Sciences制)。收集在洗脱中UV检测(220nm)出的包含目标产物的馏分，进行冻干，得到目标产物(42mg)。
工序2：[N3－PEG(3)]2－SG(10)－Ox
在5mL采样管((株)Ina Optica制)中加入上述工序1合成的化合物(40mg)、2－氯－1，3－二甲基－1H－苯并咪唑－3－鎓－氯化物(伏见制药所制，17.9mg，0.083mmol)的水溶液(200μl)。在冰冷却后的反应液中加入磷酸三钾(52.6mg，0.25mmol)的水溶液(200μl)，在冰冷却下搅拌2小时。使用Amicon Ultra(Ultracell30K，Merck Millipore制)对所得到的反应液进行超滤，除去固体物质。用凝胶过滤色谱法对该透过液进行精制。装置使用Purif-Rp2(昭光Scientific制)，柱使用HiPrep 26/10Desalting(GEHealthcare制)，流动相使用0.03％－NH3水溶液，流速为10mL/min，级分体积为10mL。收集在洗脱中UV检测(220nm)出的包含目标产物的馏分，加入1N氢氧化钠水溶液(33μl，0.033mmol)进行冻干，得到目标产物(34mg)。
实施例6：小鼠抗CLDN6抗体B1产生杂交瘤(218B1)和小鼠抗CLDN6抗体C7产生杂交瘤(218C7)
6－1.小鼠的免疫与杂交瘤的获取
1－1)用于小鼠免疫的细胞的准备
将2×106个或者5×106个NOR－P1细胞(人胰腺癌细胞株，RIKEN RCB－2139)在RPMI－1640(Roswell Park Memorial Institute－1640)10％FBS(胎牛血清)(+)培养基(10ml或者20ml)中培养5天后回收，用PBS(磷酸缓冲生理盐水)清洗两次，再悬浮于PBS(300μl)中。
1－2)对小鼠的免疫
对于BALB/c小鼠(12周龄)，以约1周的间隔用NOR－P1细胞(2×106个)对腹腔内进行第1～5次免疫。从第5次免疫起约2周后，用NOR－P1细胞(5×106个)对腹腔内进行免疫。从第6次免疫起约3周后用NOR－P1细胞(2×106个)对腹腔内进行免疫。以约2周的间隔用2×106个NOR－P1细胞对腹腔内进行第8～10次免疫。在第10次免疫起约3周后(第11次)及其3天后(第12次，最终免疫)用5×106个NOR－P1细胞对腹腔内进行免疫。脾脏细胞在最终免疫起3天后摘出。
1－3)免疫后的小鼠的脾脏细胞的准备
摘出免疫后的小鼠的脾脏，研磨并悬浮于RPMI1640 10％FBS(+)培养基中。使细胞悬浮液通过细胞过滤器(70μm，BD Falcon公司)后，在室温下以1500rpm离心5分钟而废弃上清液。加入Tris－NH4Cl溶液(20mM Tris－HCl pH7.2，77.6mM NH4Cl；20mL)，在室温下处理5分钟。加入PBS(20mL)，以1500rpm在室温下离心5分钟。将上清液废弃后，加入RPMI1640 FBS(+)培养基(10ml)。
1－4)骨髓瘤细胞的准备
将P3U1细胞(小鼠骨髓瘤细胞株)在RPMI1640 FBS(+)培养基中培养5天后回收，再悬浮于RPMI1640 FBS(+)培养基(20ml)中。
1－5)细胞融合
将脾脏细胞和骨髓瘤细胞以5：1的比例混合，以1500rpm在室温下离心5分钟。用RPMI1640 FBS(－)培养基(10ml)清洗2次后，进行离心分离(1500rpm，5分钟)。将所得到的沉淀组分的细胞组充分松散后，一边搅拌一边用约1分钟缓慢加入聚乙二醇－1500(PEG－1500；1ml)。搅拌3分30秒钟后，在室温下静置30秒钟。然后，用1分钟在该细胞液中加入RPMI培养基10％Low IgG FBS(+)(10ml)。将该细胞悬浮液离心分离(1500rpm，5分钟)，将所得到的沉淀组分的细胞缓慢地松散后，缓慢地悬浮于HAT培养基(包含10％Low IgG FBS、HATMedia Supplement、5％BriClone的RPMI1640培养基；200ml)中。将该悬浮液以200μl/孔分别分配至96孔培养板中，在37℃、5％CO2的恒温箱中培养6天。
1－6)杂交瘤的筛选/探针的准备
出于测定抗体的内化和免疫毒素活性的目的而制作作为重组复合蛋白质的DT3C。所述DT3C为使白喉毒素(DT)的催化区域和链球菌蛋白质G的抗体结合区域在基因工程上融合而成的蛋白质。DT3C与抗体的Fc部分特异性结合，若被吞入细胞内，则通过抑制蛋白质合成来诱导细胞死亡。通过使用该系统，可以同时观察到抗体的内化和免疫毒素引起的细胞杀伤效果(Yamaguchi，M.et al.，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 454(2014)600－603)。
1－7)基于DT3C的杂交瘤的筛选
在96孔板中加入4μg/ml的DT3C(25μl)，再加入工序1－5中获得的杂交瘤的培养上清液(25μl)，在室温下保温30分钟。接种2×105个/ml(RPMI培养基10％Low IgG FBS(+))的NOR－P1细胞(50μl)，在37℃、CO2恒温箱内培养3天。通过培养后的显微镜观察，将显示出使用阴性对照抗体时的附着细胞数的约25％以下的附着细胞数的孔判定为阳性。对所筛选出的纯系进行1～2次亚克隆，建立8株单克隆的杂交瘤细胞株。
6－2：杂交瘤产生的抗体所结合的抗原的鉴定
对实施例6－1中制备出的杂交瘤产生的抗体中的两个纯系218B1和218C7进行抗原的鉴定。
2－1)使用218B1抗体和218C7抗体对生物素标记后的细胞表面蛋白质进行免疫沉淀
除去2×106个NTERA－2细胞(人睾丸癌细胞株，ATCC CRL－1973)的培养上清液，用PBS清洗2次。将EZ－Link Sulfo－NHS－Biotin(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)以0.1mg/ml的浓度悬浮于PBS中。除去PBS后，加入Biotin/PBS溶液，在振荡器上培养30分钟后，用100mM甘氨酸/PBS溶液(25ml)清洗2次，然后用PBS(10ml)清洗1次。将清洗后的细胞再悬浮于200μl的溶解缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris－HCl pH7.4，1％DDM，蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor)，Complete EDTA free(Roche公司)1粒/50ml)中，在4℃下处理30分钟。离心分离(13000rpm，20分钟，4℃)而制备出细胞溶解液。将蛋白G琼脂糖凝胶(蛋白G琼脂糖凝胶4Fast Flow(GE Healthcare公司))的缓冲液置换为溶解缓冲液，将所得到的蛋白G琼脂糖凝胶/溶解缓冲液(50％浆液；30μl)加入细胞溶解液中，在4℃下旋转30分钟后，在4℃下离心1分钟，回收上清液。在该上清液中加入218B1抗体或218C7抗体(约3μg)，在4℃下旋转30分钟后，加入蛋白G琼脂糖凝胶/溶解缓冲液(50％浆液；60μl)，在4℃下旋转1小时。用溶解缓冲液(1ml)将蛋白G琼脂糖凝胶清洗六次后，再悬浮于1×SDS样品缓冲液(BioRad公司)中。在100℃下处理悬浮液5分钟后，回收溶液，制成用于SDS－PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)的样品。
2－2)SDS－PAGE和蛋白质印迹
使用SuperSep Ace 5－20％(Wako公司)将2－1)中制备出的SDS－PAGE样品在50mV下堆叠(stacking)30分钟后，在200mV下电泳1小时后，在12mV下从凝胶向膜(membrane)印迹(blotting)47分钟。将膜用PBS－T(PBS(－)－0.02％Tween 20)清洗后，进行封闭1小时。将膜用PBS－T用5分钟清洗3次后，与链霉亲和素－辣根过氧化物酶偶联物(GE Healthcare公司；用PBS－T稀释为2000倍使用)反应1小时。将膜用PBS－T用5分钟清洗2次后，使用增强化学发光(enhanced chemiluminecscence，ECL)法检测目标条带。在使用218B1抗体和218C7抗体的任意情况下，无论有无添加DTT，都检测到分子量18kDa的条带。
2－3)细胞蛋白质的使用218B1抗体和218C7抗体对免疫沉淀产物进行质量分析
回收2×107个NTERA－2细胞，用PBS清洗两次。使用细胞刮刀回收细胞，以1500rpm离心5分钟。除去上清液后，再悬浮于2ml的溶解缓冲液中，在4℃下处理30分钟。进行离心分离(13000rpm，20分钟，4℃)而制备出细胞溶解液。将蛋白G琼脂糖凝胶/溶解缓冲液(50％浆液；180μl)加入细胞溶解液中，在4℃下旋转30分钟后在4℃下离心1分钟，回收上清液。在该上清液中加入218B1抗体(约9μg)，在4℃下旋转30分钟后，加入蛋白G琼脂糖凝胶/溶解缓冲液(50％浆液；180μl)，在4℃下旋转1小时。用溶解缓冲液(1ml)将蛋白G琼脂糖凝胶清洗六次后，再悬浮于1×SDS样品缓冲液中。在100℃下将悬浮液处理5分钟后，回收溶液，制成用于SDS－PAGE的样品。以与2－2)同样的方法进行SDS－PAGE，将电泳凝胶进行CBB(coomassie brilliant blue：考马斯亮蓝)染色。从电泳凝胶切出相当于18kDa的部分，供于质量分析。质量分析的结果判明，该凝胶片包含Claudin－6。
2－4)FACS解析
根据质量分析可以预测218B1抗体和218C7抗体的抗原为Claudin－6，因此基于cDNA基因转移进行了强制表达分析。FACS解析的结果显示人Claudin－6表达CHO－K1细胞中，218B1抗体和218C7抗体表现出强阳性反应，因此显示出218B1抗体和218C7抗体的抗原为Claudin－6。
2－5)从杂交瘤培养上清液中精制抗体
将小鼠抗CLDN6抗体B1产生杂交瘤(218B1)和小鼠抗CLDN6抗体C7产生杂交瘤(218C7)在包含10％的Fetal Bovine Serum(胎牛血清)、Ultra－Low IgG(Thermo FisherScientific)的Hybridoma－SFM(Thermo Fisher Scientific)中培养。通过离心来回收培养上清液，用0.45μm的过滤器(Corning公司制)进行过滤。在rProtein A亲和色谱法(4～6℃下)的一步工序中，从培养上清液中精制抗体。rProtein A亲和色谱法精制后的缓冲液置换工序在4～6℃下实施。首先将培养上清液应用于填充有用PBS平衡化的MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司制)的柱中。培养液全部进入柱后，用柱容量2倍以上的PBS清洗柱。接着，用2M精氨酸盐酸盐溶液(pH4.0)进行洗脱，收集包含抗体的组分。通过渗析该组分(Thermo Scientific公司，Slide－A－Lyzer Dialysis Cassette)进行与PBS(－)的液体置换。最后，用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量UF10K，Sartorius公司，4℃下)进行浓缩，将IgG浓度调制为1mg/mL以上。用Minisart－Plusfilter(Sartorius公司)进行过滤，制成精制样品。
实施例7：小鼠抗CLDN6抗体B1和C7的体外评价
7－1：利用流式细胞仪进行小鼠抗CLDN6抗体的结合能力评价
利用流式细胞仪法对实施例6中制作出的小鼠抗CLDN6抗体的人CLDN6和家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9结合性进行评价。将从Origene公司购买的human CLDN3/pCMV6－Entry、human CLDN4/pCMV6－Entry、human CLDN6/pCMV－Entry、human CLDN9/pCMV6－Entry或pCMV6－Entry使用Lipofectamine(脂质体)2000(Thermo Fisher Scientific)一次性导入至293T细胞(Thermo Fisher Scientific HCL4517)中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晩后，制备出细胞悬浮液。将导入基因后的293T细胞悬浮液离心，除去上清液后，将小鼠抗CLDN6抗体(克隆号为B1、C7)、或小鼠IgG1对照抗体(R&D Systems)以最终浓度30μg/mL、10μg/mL、3.3μg/mL、1.1μg/mL的方式加入并进行悬浮，在4℃下静置1小时。用包含5％的胎牛血清(Hyclone)的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline)(Sigma-Aldrich)(以下，称为含有5％FBS的PBS)清洗2次后，加入用含有5％FBS的PBS稀释500倍后的FLUORESCEIN－CONJUGATED GOAT IGG FRACTION TO MOUSE IGG(WHOLEMOLECULE)(MP BIOMEDICALS)并进行悬浮，在4℃下静置1小时。用含有5％FBS的PBS清洗2次后，用流式细胞仪(FC500；Beckman Coulter)进行检测。数据分析通过FlowJo(TreeStar)进行。需要说明的是，用含有0.25％Tween20的PBS对细胞进行破膜(permeabilization)后，使用小鼠抗FLAG抗体(Sigma－Aldrich)来进行各基因转移的确认。将结果示于图11。图11的图表中，纵轴表示显示抗体结合量的FITC(fluorescein isothiocyanate：异硫氰酸荧光素)的荧光强度，横轴表示抗体浓度。制作出的小鼠抗CLDN6抗体与人CLDN6和人CLDN9以相同的程度进行结合，不与人CLDN3、人CLDN4结合。小鼠对照IgG1未与任何细胞结合。
7－2：抗体内化活性
小鼠抗CLDN6抗体B1和C7的内化活性使用结合了抑制蛋白质合成的毒素(皂草素)的抗小鼠IgG试剂Mab－ZAP(ADVANCED TARGETING SYSTEMS)进行评价。该评价中，取决于小鼠抗CLDN6抗体的内化活性，Mab－ZAP被吞入细胞内，抑制蛋白质合成的皂草素被释放到细胞内，由此抑制细胞增殖。
将作为人CLDN6阳性细胞的人绒毛膜癌株的JEG-3(ATCC HTB-36)、作为人CLDN6阳性细胞的人卵巢癌株的NIH：OVCAR-3(ATCC HTB-161)、或作为人CLDN6阴性细胞的人胰腺癌株的BxPC－3(ATCC CRL-1687)以2×103cells/well接种到96孔细胞培养用微孔板中，在37℃、5％CO2的条件下培养一晩。第二天，添加将小鼠抗CLDN6抗体或小鼠IgG1抗体(R&DSystems)以最终浓度成为1nM的方式与Mab-ZAP(最终浓度：0.5nM)、或未结合毒素的亲和纯化山羊抗小鼠IgG,与Fcγ片段特异性反应(Jackson ImmunoResearch)(最终浓度：0.5nM)混合而成的混合溶液，在37℃、5％CO2的条件下培养5天。生存细胞数通过使用了CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(发光细胞活力测定)(Promega)的ATP活性的定量来进行测定。因添加抗CLDN6抗体引起的细胞增殖抑制作用由将未添加混合溶液的孔的值设为100％的相对生存率来求出。将结果示于图12。小鼠抗CLDN6抗体(B1、C7)对于人CLDN6阳性细胞株JEG－3和NIH：OVCAR－3观察到细胞增殖抑制效果。另一方面，对于人CLDN6阴性细胞株BxPC－3未观察到细胞增殖抑制效果。此外，小鼠IgG1抗体对任意细胞株均未观察到细胞增殖抑制效果。该结果认为，制作出的抗CLDN6抗体(B1、C7)具有内化活性，适合用作抗体―药物偶联物用的抗体。
实施例8：编码小鼠抗CLDN6抗体B1和C7的可变区的cDNA的核苷酸序列的确定
8－1：编码B1抗体的可变区的cDNA的核苷酸序列的确定
8－1－1：B1抗体产生杂交瘤的总RNA的制备
为了扩增编码B1抗体的可变区的cDNA，由B1抗体产生杂交瘤使用TRIzol Reagent(Ambion公司)制备总RNA。
8－1－2：利用5’－RACE PCR编码B1抗体的轻链可变区的cDNA的扩增和序列的确定
编码轻链可变区的cDNA的扩增使用实施例8－1－1制备出的总RNA的约1μg和SMARTer RACE 5’/3’Kit(套组)(Clontech公司)进行实施。作为用于利用PCR扩增编码B1抗体的轻链基因的可变区的cDNA的引物，使用UPM(附属于Universal Primer A Mix:SMARTerRACE 5’/3’Kit)和由公知的小鼠轻链的恒定区的序列设计出的引物。
将利用5’－RACE PCR扩增的编码轻链的可变区的cDNA克隆到质粒中，接着，实施编码轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列的序列分析。
将所确定的编码B1抗体的轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列示于序列号18，将氨基酸序列示于序列号19。
8－1－3：利用5’－RACE PCR编码B1抗体的重链可变区的cDNA的扩增和序列的确定
编码重链可变区的cDNA的扩增使用实施例8－1－1制备出的总RNA的约1μg和SMARTer RACE 5’/3’Kit(Clontech公司)进行实施。作为用于利用PCR扩增编码LB1抗体的重链基因的可变区的cDNA的引物，使用UPM(附属于Universal Primer A Mix：SMARTerRACE 5’/3’Kit)和由公知的小鼠重链的恒定区的序列设计出的引物。
将利用5’－RACE PCR扩增的编码重链的可变区的cDNA克隆到质粒中，接着，实施编码重链的可变区的cDNA的核苷酸序列的序列分析。将所确定的编码B1抗体的重链的可变区的cDNA的核苷酸序列示于序列号20，将氨基酸序列示于序列号21。
8－2：编码C7抗体的可变区的cDNA的核苷酸序列的确定
以与实施例8－1同样的方法实施。将所确定的编码C7抗体的轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列示于序列号22，将氨基酸序列示于序列号23。将编码重链的可变区的cDNA的核苷酸序列示于序列号24，将氨基酸序列示于序列号25。
实施例9：嵌合化抗CLDN6抗体chB1的制作
9－1：嵌合化抗CLDN6抗体chB1的表达载体的构建
9－1－1：嵌合化和人源化轻链表达载体pCMA－LK的构建
使用In－Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)将用限制酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3－TOPO/LacZ(Invitrogen公司)而得到的约5.4kb的片段和序列号26所示的包含人轻链信号序列及编码人κ链恒定区的DNA序列的DNA片段进行结合，制作出pcDNA3.3/LK。通过从pcDNA3.3/LK中除去新霉素表达单元来构建pCMA－LK。
9－1－2：嵌合化和人源化IgG1LALA型重链表达载体pCMA－G1LALA的构建
使用In－Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)将用XbaI和PmeI消化pCMA－LK并除去了轻链信号序列及人κ链恒定区的DNA片段和序列号27所示的包含人重链信号序列及编码人IgG1LALA恒定区的DNA序列的DNA片段进行结合，构建pCMA－G1LALA。
9－1－3：嵌合化chB1重链表达载体的构建
合成了序列号33所示的chB1重链的核苷酸序列的核苷酸编号36～440所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In－Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)，在用限制酶BlpI切断pCMA－G1LALA的部位插入合成的DNA片段，由此构建chB1重链表达载体。将chB1重链的氨基酸序列示于序列号32。
9－1－4：嵌合化chB1轻链表达载体的构建
合成了序列号29所示的包含编码chB1轻链的DNA序列的DNA片段(GENEART公司)。使用In－Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)，将合成的DNA片段和用XbaI和PmeI消化pCMA－LK并除去了轻链信号序列及人κ链恒定区的DNA片段进行结合，由此构建chB1轻链表达载体。将chB1轻链的氨基酸序列示于序列号28。
9－2：嵌合化抗CLDN6抗体chB1的生产和精制
9－2－1：嵌合化抗体chB1的生产
FreeStyle 293F细胞(Invitrogen公司)按照手册进行传代、培养。将对数生长期的1.2×109个FreeStyle 293F细胞(Invitrogen公司)接种到3L Fernbach ErlenmeyerFlask(CORNING公司)中，用FreeStyle293表达培养基(Invitrogen公司)稀释，调制成2.0×106细胞/mL。在40mL的Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen公司)中加入0.24mg的重链表达载体、0.36mg的轻链表达载体以及1.8mg的聚乙烯亚胺(Polyscience#24765)并平稳搅拌，再放置5分钟后，添加至FreeStyle 293F细胞中。在37℃、8％CO2恒温箱中以90rpm振荡培养4小时后，添加600mL的EX－CELL VPRO培养基(SAFC Biosciences公司)、18mL的GlutaMAX I(GIBCO公司)以及30mL的Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司)，在37℃、8％CO2恒温箱中以90rpm振荡培养7天，用Disposable Capsule Filter(一次性胶囊过滤器)(Advantec#CCS－045－E1H)对所得到的培养上清液进行过滤。将获得的嵌合化抗CLDN6抗体命名为“chB1”。
9－2－2：嵌合化抗体chB1的精制
利用rProtein A亲和色谱法的一步工序从实施例9－2－1所得到的培养上清液中精制抗体。将培养上清液应用于填充有用PBS平衡化的MabSelectSuRe的柱(GE HealthcareBioscience公司制)后，用柱容量的2倍以上的PBS清洗柱。接着，用2M精氨酸盐酸盐溶液(pH4.0)进行洗脱，收集包含抗体的组分。通过渗析该组分(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)来进行与PBS(－)的缓冲液置换。用Centrifugal UFFilter Device VIVASPIN20(截留分子量UF10K，Sartorius公司)浓缩抗体，将IgG浓度调制为1mg/mL以上。最后，用Minisart-Plus filter(Sartorius公司)进行过滤，制成精制样品。
实施例10：人源化抗CLDN6抗体的制作
10－1：抗CLDN6抗体的人源化体设计
10－1－1：嵌合化抗体chB1的可变区的分子模拟
chB1的可变区的分子模拟利用了作为同源建模(Homology modeling)而公知的方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))。以对chB1的重链和轻链的可变区具有高的序列同一性的Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))中注册的结构(PDB ID:1XIW)作为模板，使用市售的蛋白质立体结构分析程序BioLuminate(Schrodinger公司制)进行。
10－1－2：人源化氨基酸序列的设计
chB1通过CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))而人源化。Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))中既定的人的gamma链亚组1和kappa链亚组1的共有序列与chB1的框架区具有高的同一性，因此分别被选作重链和轻链的受体。应转移至受体上的供体残基通过参考由Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))提供的基准等分析三维模型来选择。需要说明的是，CDRL3富含疏水性氨基酸，因此也设计了在CDRL3中导入变异的人源化轻链。
10－2：chB1重链的人源化
将设计出的3种重链命名为hH1、hH2以及hH3。将hH1的重链全长氨基酸序列记载于序列号52。将编码序列号52的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号53。将hH2的重链全长氨基酸序列记载于序列号56。将编码序列号56的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号57。将hH3的重链全长氨基酸序列记载于序列号60。将编码序列号60的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号61。
10－3：chB1轻链的人源化
将设计出的4种轻链命名为hL1、hL2、hL3以及hL4。将hL1的轻链全长氨基酸序列记载于序列号36。将编码序列号36的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号37。将hL2的轻链全长氨基酸序列记载于序列号40。将编码序列号40的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号41。将hL3的轻链全长氨基酸序列记载于序列号44。将编码序列号44的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号45。将hL4的轻链全长氨基酸序列记载于序列号48。将编码序列号48的氨基酸序列的核苷酸序列记载于序列号49。
10－4：利用重链和轻链的组合进行人源化抗体的设计
将包含hH1和hL1的抗体称为“H1L1抗体”或“H1L1”。将包含hH2和hL2的抗体称为“H2L2抗体”或“H2L2”。将包含hH1和hL3的抗体称为“H1L3抗体”或“H1L3”。将包含hH2和hL4的抗体称为“H2L4抗体”或“H2L4”。将包含hH3和hL3的抗体称为“H3L3抗体”或“H3L3”。
10－5：人源化抗CLDN6抗体的制作
10－5－1：人源化重链表达载体的构建
10－5－1－1：hH1表达载体的构建
合成序列号53所示的hH1的核苷酸序列的核苷酸编号36～440所示的DNA片段(GENEART公司)。以与实施例9－1－3同样的方法构建hH1表达载体。
10－5－1－2：hH2表达载体的构建
合成序列号57所示的hH2的核苷酸序列的核苷酸编号36～440所示的DNA片段(GENEART公司)。以与实施例9－1－3同样的方法构建hH2表达载体。
10－5－1－3：hH3表达载体的构建
合成序列号61所示的hH2的核苷酸序列的核苷酸编号36～440所示的DNA片段(GENEART公司)。以与实施例9－1－3同样的方法构建hH3表达载体。
10－5－2：人源化轻链表达载体的构建
10－5－2－1：hL1表达载体的构建
合成序列号37所示的hL1的核苷酸序列的核苷酸编号37～402所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In－Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech公司)，在用限制酶BsiWI切断pCMA－LK的部位插入合成的DNA片段，由此构建hL1表达载体。
10－5－2－2：hL2表达载体的构建
合成序列号41所示的hL2的核苷酸序列的核苷酸编号37～402所示的DNA片段(GENEART公司)。以与实施例10－5－2－1同样的方法构建hL2表达载体。
10－5－2－3：hL3表达载体的构建
合成序列号45所示的hL3的核苷酸序列的核苷酸编号37～402所示的DNA片段(GENEART公司)。以与实施例10－5－2－1同样的方法构建hL3表达载体。
10－5－2－4：hL4表达载体的构建
合成序列号49所示的hL4的核苷酸序列的核苷酸编号37～402所示的DNA片段(GENEART公司)。以与实施例10－5－2－1同样的方法构建hL4表达载体。
10－5－3：人源化抗体的制备
10－5－3－1：人源化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4以及H3L3的生产
以与实施例9－2－1同样的方法生产。通过与实施例10－4所示的重链和轻链的组合相对应的重链表达载体和轻链表达载体的组合，生产H1L1、H2L2、H1L3、H2L4以及H3L3。
10－5－3－2：人源化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4以及H3L3的两步精制
利用rProtein A亲和色谱法和陶瓷羟基磷灰石的两步工序对实施例10－5－3－1所得到的培养上清液进行精制。将培养上清液应用于填充有用PBS平衡化的MabSelectSuRe的柱(GE Healthcare Bioscience公司制)后，用柱容量的2倍以上的PBS清洗柱。接着，用2M精氨酸盐酸盐溶液(pH4.0)洗脱抗体。通过渗析包含抗体的组分(Thermo Scientific公司,Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)进行与PBS的缓冲液置换，用5mM磷酸钠/50mM MES/pH7.0的缓冲液稀释5倍后，应用于用5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0的缓冲液平衡化的陶瓷羟基磷灰石柱(日本Bio－Rad，Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column)中。利用氯化钠实施线性浓度梯度洗脱，收集包含抗体的组分。通过渗析该组分(ThermoScientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)进行与HBSor(25mM组氨酸/5％山梨醇，pH6.0)的缓冲液置换。用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截留分子量UF10K，Sartorius公司)浓缩抗体，将IgG浓度调制为50mg/mL。最后，用Minisart-Plusfilter(Sartorius公司)进行过滤，制成精制样品。
实施例11：利用流式细胞仪进行人源化抗CLDN6抗体的结合能力评价
利用流式细胞仪法对实施例10中制作出的人源化抗CLDN6抗体的人CLDN6和家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9结合性进行评价。使用以与实施例7－1同样的方法一时性地进行了基因转移的293T细胞。在导入了人CLDN6或人CLDN9基因的细胞中以最终浓度为100nM、20nM、4nM、0.8nM的方式加入人源化抗CLDN6抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4以及H3L3，或人IgG1对照抗体(CALBIOCHEM)并进行悬浮，在4℃下静置30分钟。在导入了人CLDN3、人CLDN4基因或空载体的细胞中以最终浓度为100nM的方式加入人源化抗CLDN6抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4以及H3L3并进行悬浮，在4℃下静置30分钟。用包含5％的胎牛血清(Hyclone)的杜氏磷酸盐缓冲液(Sigma－Aldrich)(以下，称为含有5％FBS的PBS)清洗后，加入用含有5％FBS的PBS稀释150倍后的FITC AffiniPureF(ab’)2Fragment Goat Anti-Human IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)并进行悬浮，在4℃下静置30分钟。用含有5％FBS的PBS清洗后，用流式细胞仪(FC500；Beckman Coulter)进行检测。数据解析通过FlowJo(TreeStar)进行，计算出表示抗体的结合量的FITC的平均荧光强度(MFI)。将结果示于图13。图13的图表中，横轴表示抗体浓度，纵轴表示MFI。制作出的人源化抗CLDN6抗体与人CLDN6和人CLDN9以相同的程度进行结合，不与人CLDN3、人CLDN4结合。人对照IgG1未与任何细胞结合。
〔糖链重构抗体的制备〕
实施例12：糖链变换1(T－SG)
Figure BDA0003279539650001171
工序1：(Fucα1，6)GlcNAc－曲妥珠单抗的制备
利用共通操作C将参考例3中制备出的曲妥珠单抗溶液22mg/mL的(25mM组氨酸溶液(pH6.0)、5％山梨醇溶液)(45.5mL)分两次进行与50mM磷酸缓冲液(pH6.0)的缓冲液交换。在所得到的28.1mg/mL的曲妥珠单抗溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0)(18mL)和28.0mg/mL的同溶液(18mL)中分别加入2.0mg/mL野生型EndoS溶液(PBS)1.26mL、1.27mL，在37℃下保温4小时。使用Experion电泳工作站(BIO－RAD制)确认反应的进行情况。反应结束后，根据以下的方法进行利用亲和色谱法的精制和利用羟基磷灰石柱的精制。
(1)利用亲和色谱法的精制
精制装置：AKTA pure150(GE Healthcare制)
柱：HiTrap rProtein A FF(5mL)(GE Healthcare制)
流速：5mL/min(进料(charge)时为1.25mL/min)
将上述得到的反应液分多次进行精制。连结两根柱，在与柱结合时，向柱上部添加反应液，以1.25mL/min通入结合缓冲液(20mM磷酸缓冲液(pH6.0))2CV，进一步以5mL/min通入结合缓冲液5CV。在中间清洗时，通入清洗溶液(20mM磷酸缓冲液(pH7.0)、0.5M氯化钠溶液)15CV。在洗脱时，通入洗脱缓冲液(ImmunoPure IgG Eution buffer，PIERCE制)6CV。用1M Tris缓冲液(pH9.0)立即中和洗脱液。使用微量分光光度计Xpose(Trinean制)和Experion电泳工作站(BIO－RAD制)对在洗脱期间UV检测(280nm)出的馏分进行确认。利用共通操作C对包含目标产物的馏分进行与5mM磷酸缓冲液50mM 2－吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH6.8)的缓冲液交换。
(2)利用羟基磷灰石色谱法的精制
精制装置：AKTA avant25(GE Healthcare制)
柱：Bio-Scale Mini CHT Type I Cartridge(5mL)(BIO－RAD制)
流速：5mL/min(进料时为1.25mL/min)
连结两根柱，将上述(1)所得到的溶液分多次进行精制。向柱上部添加溶液，以1.25mL/min通入A液(5mM磷酸缓冲液50mM－吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH6.8))2CV，进一步以5mL/min通入A液3CV。然后，使用A液和B液(5mM磷酸缓冲液50mM－吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH6.8)、2M氯化钠溶液)进行洗脱。洗脱条件为A液：B液＝100：0～0：100(15CV)。进而，通入清洗溶液(500mM磷酸缓冲液(pH6.5))5CV。
使用共通操作C对包含目标产物的馏分进行缓冲液交换，得到25.5mg/mL的(Fucα1，6)GlcNAc－曲妥珠单抗溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(35mL)。
工序2：曲妥珠单抗[SG－(N3)2]2的制备
在上述工序1所得到的23.9mg/mL(Fucα1，6)GlcNAc－曲妥珠单抗溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(3.37mL)中加入实施例5工序2中合成的化合物(12.9mg)的50mM磷酸缓冲液(pH6.0)溶液(0.258mL)、4.90mg/mL的EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(0.328mL)，在30℃下保温4.5小时。进行两组上述的操作。使用Experion电泳工作站(BIO－RAD制)确认反应的进行情况。反应结束后，与上述工序1同样地进行利用亲和色谱法的精制和利用羟基磷灰石色谱法的精制，然后使用共通操作C对包含目标产物的馏分进行与磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)的缓冲液交换，得到10.0mg/mL的曲妥珠单抗[SG－(N3)2]2溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0))(15.5mL)。
实施例13：糖链变换2(T－MSG)
Figure BDA0003279539650001191
工序1：曲妥珠单抗[MSG－N3]2
进行5组下述的操作。使用实施例12工序1所得到的化合物(20mg/mL，15.0mL)，使用实施例4工序4所得到的化合物(25.5mg)作为糖链供体，在30℃下保温3小时，进行与实施例12工序2同样的操作。合并5组而得到14.4mg/mL曲妥珠单抗[MSG－N3]2溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0))(93.5mL)。
实施例14：糖链变换3(T－MSG1)
Figure BDA0003279539650001192
工序1：曲妥珠单抗[MSG1－N3]2
进行两组下述的操作。使用实施例12工序1所得到的化合物(25.5mL，7.8mL)，使用实施例3工序4所得到的化合物(25.5mg)作为糖链供体，在30℃下保温3小时，进行与实施例12工序2同样的操作。合并两组而得到10.6mg/mL曲妥珠单抗[MSG1－N3]2溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0))(31mL)。
实施例15：糖链变换4(CLDN6－MSG1(H1L1))
Figure BDA0003279539650001201
工序1：(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6抗体(H1L1)
使用实施例10中制备出的抗CLDN6抗体(H1L1)溶液ca.37.7mg/mL(25mM组氨酸溶液(pH6.0)、5％山梨醇溶液)(2.5mL)，进行与实施例12工序1同样的操作，得到19.2mg/mL的(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6抗体(H1L1)溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(4.8mL)。
工序2：抗CLDN6抗体(H1L1)－[MSG1－N3]2
使用上述工序1所得到的19.2mg/mL(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6(H1L1)抗体溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(4.8mL)，使用实施例3工序4所得到的化合物(25.5mg)作为糖链供体，进行与实施例12工序2同样的操作，由此得到10.2mg/mL抗CLDN6抗体(H1L1)－[MSG1－N3]2溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0))(7.2mL)。
实施例16：糖链变换5(CLDN6－MSG1(H2L2))
工序1：(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6抗体(H2L2)
使用实施例10中制备出的抗CLDN6抗体(H2L2)溶液ca.20mg/mL(25mM组氨酸溶液(pH6.0)、5％山梨醇溶液)(6mL)，进行与实施例12工序1同样的操作，得到21.84mg/mL的(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6抗体(H2L2)溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(5.7mL)。
工序2：抗CLDN6抗体(H2L2)－[MSG1－N3]2
使用上述工序1所得到的21.8mg/mL(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6(H2L2)抗体溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(5.7mL)，使用实施例3工序4所得到的化合物(25.5mg)作为糖链供体，进行与实施例12工序2同样的操作，由此得到10.2mg/mL抗CLDN6抗体(H2L2)－[MSG1－N3]2溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0))(11.1mL)。
实施例17：糖链变换6(CLDN6－MSG1(H1L3))
工序1：(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6抗体(H1L3)
使用实施例10中制备出的抗CLDN6抗体(H1L3)溶液ca.39.4mg/mL(25mM组氨酸溶液(pH6.0)，5％山梨醇溶液)(3mL)，进行与实施例12工序1同样的操作，得到39.2mg/mL的(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6抗体(H1L3)溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(4.5mL)。
工序2：抗CLDN6抗体(H1L3)－[MSG1－N3]2
使用上述工序1所得到的39.2mg/mL(Fucα1，6)GlcNAc－抗CLDN6(H1L3)抗体溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(4.5mL)，使用实施例3工序4所得到的化合物(25.5mg)作为糖链供体，进行与实施例12工序2同样的操作，由此得到9.83mg/mL抗CLDN6抗体(H1L3)－[MSG1－N3]2溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0))(7.2mL)。
实施例18：糖链变换7(TROP2－MSG1)
工序1：(Fucα1，6)GlcNAc－抗Trop2抗体
使用参考例2中制备出的抗Trop2抗体溶液ca.20mg/mL(25mM组氨酸溶液(pH6.0)，5％山梨醇溶液)(6mL)，进行与实施例12工序1同样的操作，得到21.69mg/mL的(Fucα1，6)GlcNAc－抗Trop2抗体溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(3.3mL)。
工序2：抗Trop2抗体－[MSG1－N3]2
使用上述工序1所得到的21.69mg/mL(Fucα1，6)GlcNAc－抗Trop2抗体溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(3.35mL)，使用实施例3工序4所得到的化合物(25.5mg)作为糖链供体，进行与实施例12工序2同样的操作，由此得到10.3mg/mL的抗Trop2抗体－[MSG1－N3]2溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0))(6.4mL)。
〔ADC的合成〕
将ADC1～ADC6的制备方法示于实施例19～23。实施例19～23的反应式中的R基均为下式所示的基团。
Figure BDA0003279539650001221
(如上式所示，实施例19～23各工序1中得到的化合物具有三唑环的几何异构体，混合包含以上述R所示的两种结构的药物连接子而保持。)
实施例19：ADC1
Figure BDA0003279539650001231
工序1：抗体与药物连接子的偶联
在实施例15工序2所得到的抗体的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)溶液(10.2mg/mL，2.50mL)中，在室温下加入1，2－丙二醇(2.29mL)、包含实施例2－1工序13所得到的化合物(3－14)10mM的二甲基亚砜溶液(0.206mL；相对于一分子抗体为12当量)，使用管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)，在室温下反应48小时。
精制操作：使用共通操作D对上述溶液进行精制，得到具有目标化合物的溶液14.5mL。
特性评价：使用共通操作E、F得到下述的特性值。
抗体浓度：1.54mg/mL，抗体产量：22.3mg(89％)，每一分子抗体的药物平均结合数(n)：1.9
实施例20：ADC2
Figure BDA0003279539650001241
工序1：抗体与药物连接子的偶联
在实施例14工序1所得到的抗体的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中，在室温下加入1，2－丙二醇(0.917mL)、包含实施例2－1工序13所得到的化合物(3－14)10mM的二甲基亚砜溶液(0.0825mL；相对于一分子抗体为12当量)，使用管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)，在室温下反应2天。
精制操作：使用共通操作D对上述溶液进行精制，得到具有目标化合物的溶液6.00mL。
特性评价：使用共通操作E、F得到下述的特性值。
抗体浓度：1.41mg/mL，抗体产量：8.45mg(85％)，每一分子抗体的药物平均结合数(n)：1.9
实施例21：ADC3
Figure BDA0003279539650001251
工序1：抗体与药物连接子的偶联
在实施例18工序2所得到的抗体的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)溶液(10mg/mL，1.00mL)中，在室温下加入1，2－丙二醇(0.917mL)、包含实施例2－1工序13所得到的化合物(3－14)10mM的二甲基亚砜溶液(0.0825mL；相对于一分子抗体为12当量)，使用管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)，在室温下反应2天。
精制操作：使用共通操作D对上述溶液进行精制，得到具有目标化合物的溶液6.00mL。
特性评价：使用共通操作E、F得到下述的特性值。
抗体浓度：1.47mg/mL，抗体产量：8.8mg(88％)，每一分子抗体的药物平均结合数(n)：1.9
实施例22：ADC4
Figure BDA0003279539650001261
工序1：抗体与药物连接子的偶联
在实施例16工序2所得到的抗体的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)溶液(9.96mg/mL，2.50mL)中，在室温下加入1，2－丙二醇(2.29mL)、包含实施例2－1工序13所得到的化合物(3－14)10mM的二甲基亚砜溶液(0.206mL；相对于一分子抗体为12当量)，使用管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)，在室温下反应48小时。
精制操作：使用共通操作D对上述溶液进行精制，得到具有目标化合物的溶液14.5mL。
特性评价：使用共通操作E、F得到下述的特性值。
抗体浓度：1.52mg/mL，抗体产量：22.0mg(88％)，每一分子抗体的药物平均结合数(n)：1.9
实施例23：ADC5
Figure BDA0003279539650001271
工序1：抗体与药物连接子的偶联
在实施例17工序2所得到的抗体的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)溶液(9.83mg/mL，2.50mL)中，在室温下加入1，2－丙二醇(2.29mL)、包含实施例2－1工序13所得到的化合物(3－14)10mM的二甲基亚砜溶液(0.206mL；相对于一分子抗体为12当量)，使用管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)，在室温下反应48小时。
精制操作：使用共通操作D对上述溶液进行精制，得到具有目标化合物的溶液14.5mL。
特性评价：使用共通操作E、F得到下述的特性值。
抗体浓度：1.45mg/mL，抗体产量：21.0mg(84％)，每一分子抗体的药物平均结合数(n)：1.9
〔吡咯并苯并二氮杂卓衍生物的合成〕
实施例24：吡咯并苯并二氮杂卓衍生物A
根据下述方案合成药物1。
Figure BDA0003279539650001281
工序1：化合物7－1
使实施例1－1工序5所得到的化合物(1－6)(4.59g，8.15mmol)与实施例2－1工序9同样地反应，得到目标产物(7－1)(4.86g，92％)。
MS(APCI，ESI)m/z:647(M+H)+
工序2：化合物7－2
使上述工序1所得到的化合物(7－1)(4.86g，7.51mmol)与实施例1－1工序7同样地反应，得到目标产物(7－2)(3.42g，86％)。
MS(APCI，ESI)m/z:533(M+H)+
工序3：化合物7－3
使上述工序2所得到的化合物(7－2)(6.68g，12.5mmol)与实施例1－1工序8同样地反应，得到目标产物(7－3)(6.44g，97％)。
MS(APCI，ESI)m/z:531(M+H)+
工序4：化合物7－4
使上述工序3所得到的化合物(7－3)(3.24g，6.10mmol)与实施例1－1工序9同样地反应，得到目标产物(7－4)(3.86g，98％)。
MS(APCI，ESI)m/z:645(M+H)+
工序5：化合物7－5
使上述工序4所得到的化合物(7－4)(4.49g，6.96mmol)与实施例1－1工序10同样地反应，得到目标产物(7－5)(3.24g，95％)。
MS(APCI，ESI)m/z:489(M+H)+
工序6：化合物7－6
使上述工序5所得到的化合物(7－5)(0.080g，0.164mmol)与实施例2－1工序10同样地反应，得到目标产物(7－6)(0.160g，98％)。
MS(APCI，ESI)m/z:993(M+H)+
工序7：化合物7－7
使上述工序6所得到的化合物(7－6)(160mg，0.161mmol)与实施例2－1工序11同样地反应，得到目标产物(7－7)(141mg，定量)。
MS(APCI，ESI)m/z:879(M+H)+
工序8：(11a’S)－7’－甲氧基－8’－[(5－{[(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基]氧基}戊基)氧基]－1’，11a’－二氢－5’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’－酮(7－8)
使上述工序7所得到的化合物(7－7)(141mg，0.161mmol)与实施例2－1工序12同样地反应，得到目标产物(7－8)(109.8mg，99％)。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:7.92-7.91(1H,m),7.45(1H,s),7.39-7.37(2H,m),7.33(1H,s),7.29(1H,s),6.92-6.89(2H,m),6.85(1H,s),6.56-6.54(1H,m),6.31(1H,s),4.19-4.12(2H,m),4.05-3.99(1H,m),3.95-3.93(2H,m),3.82-3.79(4H,m),3.76(3H,s),3.66(3H,s),3.52-3.46(3H,m),3.30-3.21(2H,m),2.78-2.74(1H,m),2.45-2.42(1H,m),2.06-2.05(1H,m),1.89-1.82(4H,m),1.60-1.58(2H,m),0.80-0.63(4H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:693(M+H)+
实施例27：吡咯并苯并二氮杂卓衍生物B
Figure BDA0003279539650001301
工序1：化合物8－1
在实施例2－4工序1所得到的化合物(6－2)(6.49g，14.7mmol)的四氢呋喃(147mL)溶液中，在0℃下加入硼氢化锂(0.642g，29.5mmol)，在室温下搅拌2小时。在反应溶液中加入1N盐酸，用乙酸乙酯提取。将所得到的有机层用饱和盐水清洗，用硫酸镁进行干燥后，减压蒸馏除去。所得到的残渣(6.94g，定量)不进行精制而在下一工序中使用。
MS(APCI，ESI)m/z：413(M+H)+
工序2：化合物8－2
使上述工序1所得到的化合物(8－1)(4.50g，11.0mmol)与实施例1工序8同样地反应，得到目标产物(8－2)(1.94g，43％)。
MS(APCI，ESI)m/z：411(M+H)+
工序3：化合物8－3
在上述工序2所得到的化合物(8－2)(1.94g，4.73mmol)的四氢呋喃(25mL)、乙酸乙酯(25mL)、甲醇(25mL)的混合溶液中，在氮气气氛下加入5％钯碳(54％水分，1.0g)后，在氢气气氛、室温下将反应溶液搅拌22小时。硅藻土过滤反应溶液后，减压蒸馏除去滤液。将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝80：20(v/v)～0：100(v/v)]进行精制，得到目标产物(8－3)(1.20g，93％)。
MS(APCI，ESI)m/z:275(M+H)+
工序4：化合物8－4
使24工序5所得到的化合物(7－5)(0.300g，0.614mmol)与实施例2－1工序2同样地反应，得到目标产物(8－4)(0.388g，99％)。
MS(APCI，ESI)m/z:639[81Br,(M+H)+],637[79Br,(M+H)+].
工序5：化合物8－5
使上述工序4所得到的化合物(8－4)(0.203g,0.318mmol)和上述工序3所得到的化合物(0.131g，0.478mmol)与实施例2－1工序10同样地反应，得到目标产物(8－5)(0.0880g，33％)。
MS(APCI，ESI)m/z：831(M+H)+
工序6：化合物8－6
使上述工序5所得到的化合物(8－5)(0.0880g，0.106mmol)与实施例2－1工序11同样地反应，得到目标产物(8－6)(0.0500g，66％)。
MS(APCI，ESI)m/z：717(M+H)+
工序7：(11a’S)－7’－甲氧基－8’－[(5－{[(11a’S)－7’－甲氧基－5’－桥氧基－5’，11a’－二氢－1’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－8’－基]氧基}戊基)氧基]－1’，10’，11’，11a’－四氢－5’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’－酮(8－7)
使上述工序6所得到的化合物(8－6)(0.0500g，0.0698mmol)与实施例2－1工序12同样地反应，得到目标产物(8－7)(0.0330g，77％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.80(1H,m),7.58(1H,s),7.52(1H,s),6.81(1H,s),6.05(1H,s),4.17-3.97(5H,m),3.94(3H,s),3.87(1H,m),3.84(3H,s),3.72-3.68(3H,m),3.51-3.45(5H,m),2.54-2.51(1H,m),2.03-1.90(6H,m),1.75-1.68(2H,m),0.66(8H,m).
MS(APCI，ESI)m/z:615(M+H)+
实施例28：吡咯并苯并二氮杂卓衍生物C
Figure BDA0003279539650001321
工序1：化合物(9－1)
使实施例2－1工序1所得到的化合物(3－2)(5.00g,9.66mmol)与实施例2－1工序3同样地反应，得到目标产物(9－1)(3.95g,100％)。
MS(APCI,ESI)m/z:409(M+H)+
工序2：化合物(9－2)
在上述工序1所得到的化合物(9－1)(3.95g,9.67mmol)的二氯甲烷(97mL)溶液中，加入咪唑(1.65g,24.2mmol)、三异丙基氯硅烷(2.46mL,11.6mmol)以及二甲基甲酰胺(5mL)，在室温下搅拌21小时。在反应溶液中加入水，用氯仿提取，将所得到的有机层用水清洗，减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～20：80(v/v)]进行精制，得到目标产物(9－2)(4.78g,87％)。
MS(APCI,ESI)m/z:565(M+H)+
工序3：化合物(9－3)
使上述工序2所得到的化合物(9－2)(4.78g,8.43mmol)与实施例2－1工序4同样地反应，得到目标产物(9－3)(2.36g,50％)。
MS(APCI,ESI)m/z:563(M+H)+
工序4：化合物(9－4)
使上述工序3所得到的化合物(9－3)(1.53g,2,72mmol)与实施例2－1工序5同样地反应，得到目标化合物(9－4)(1.27g,69％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.31(2H,s),7.15(1H,m),5.52(1H,m),4.65(1H,m),4.57(1H,m),3.95-3.89(1H,m),3.87(3H,s),3.75-3.58(2H,m),3.18-3.14(1H,m),1.33-1.25(3H,m),1.10(18H,m),1.00-0.96(2H,m),0.03(9H,s).
工序5：化合物(9－5)
使上述工序4所得到的化合物(9－4)(0.519g,0.747mmol)与实施例2－1工序6同样地反应，得到目标化合物(9－5)(0.511g，定量)。
MS(APCI,ESI)m/z:653[(M+H)+]
工序6：化合物(9－6)
使上述工序5所得到的化合物(9－5)(0.178g,0.272mmol)与实施例2－1工序7同样地反应，得到目标化合物(9－6)(0.094g,68％)。
MS(APCI,ESI)m/z:507[(M+H)+]
工序7：化合物(9－7)
使用上述工序6所得到的化合物(9－6)(0.063g,0.124mmol)，与实施例2－1工序8同样地反应，得到目标化合物(9－7)(0.046g,72％)。
MS(APCI,ESI)m/z:509[(M+H)+]
工序8：化合物(9－8)
使用上述工序7所得到的化合物(10－7)(0.046g,0.090mmol)，与实施例2－1工序9同样地反应，得到目标化合物(9－8)(0.03g,56％)。
MS(APCI,ESI)m/z:593[(M+H)+]
工序9：化合物(9－9)
使上述工序8所得到的化合物(10－8)(0.030g,0.050mmol)与实施例2－1工序10同样地反应，得到目标化合物(9－9)(0.015g,0.034mmol)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.39-7.25(4H,m),6.92-6.78(3H,m),6.03-5.92(1H,m),5.86-5.68(1H,m),5.20-5.07(2H,m),4.66-4.57(1H,m),4.52-4.40(1H,m),4.40-4.27(1H,m),4.27-4.16(1H,m),3.95(3H,s),3.82(3H,s),3.66-3.59(1H,m),3.32-3.21(1H,m),2.74-2.64(1H,m).
MS(APCI,ESI)m/z:437[(M+H)+]
工序10：化合物(9－10)
使实施例7工序5所得到的化合物(7－5)(0.131g,0.268mmol)与实施例2－2工序1同样地反应，得到目标产物(9－10)(0.086g,52％)。
MS(APCI,ESI)m/z:611[81Br,(M+H)+],609[79Br,(M+H)+]
工序11：化合物(9－11)
使用上述工序10所得到的化合物(10－10)(0.015g,0.034mmol)和上述工序9所得到的化合物(10－9)(0.030g,0.048mmol)，与实施例2－1工序10同样地反应，得到目标化合物(9－11)(0.032g,96％)。
MS(APCI，ESI)m/z：965[(M+H)+]
工序12：化合物(9－12)
使上述工序11所得到的化合物(9－11)(0.031g,0.032mmol)与实施例2－1工序11同样地反应，得到目标产物(9－12)(0.026g,95％)。
MS(APCI，ESI)m/z：851[(M+H)+]
工序13：(11a’S)－7’－甲氧基－8’－(3－{[(11aS)－7－甲氧基－2－(4－甲氧基苯基)－5－桥氧基－5，10，11，11a－四氢－1H－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓－8－基]氧基}丙氧基)－1’，11a’－二氢－5’H－螺[环丙烷－1，2’－吡咯并[2，1－c][1，4]苯并二氮杂卓]－5’－酮(9－13)
使上述工序12所得到的化合物(10－12)(0.026g,0.030mmol)与实施例2－1工序12同样地反应，得到目标产物(9－13)(0.018g,88％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.80(1H,m),7.54-7.51(3H,m),7.33-7.29(2H,m),6.91-6.85(3H,m),6.14(1H,s),4.35-4.17(6H,m),3.95(3H,s),3.85(3H,s),3.82(3H,s),3.76-3.25(5H,m),2.79-2.69(1H,m),2.52(1H,m),2.45-2.35(1H,m),2.03-1.96(1H,m),1.28-1.23(2H,m),0.78-0.69(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z:665[(M+H)+]
实施例29：细胞增殖抑制试验(1)
将从ATCC(美国模式培养物集存库：American Type Culture Collection)获得的人肺癌细胞株Calu－6用于评价。用包含10％的胎牛血清(GE Healthcare)、MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)以及丙酮酸钠(Thermo Fisher Scientific)的MEM(Thermo Fisher Scientific；以下称为EMEM培养基)调制成1.25×104Cells/mL，在96孔细胞培养用微孔板中各添加80μL。添加细胞后，在37℃、5％CO2下培养一晩。
第二天，在微孔板上各添加10μL用EMEM培养基稀释成100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、3.13pM、1.56pM、0.78pM的吡咯并苯并二氮杂卓衍生物A、B或C。在未添加吡咯并苯并二氮杂卓衍生物的孔中各添加10μL EMEM培养基。进而，在微孔板中各添加10μL用EMEM培养基调制成2μM的奥拉帕尼。在未添加奥拉帕尼的孔中各添加10μL EMEM培养基。然后，在37℃、5％CO2下将微孔板培养6天。培养后，将微孔板从恒温箱取出，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)，用平板混合器(Plate mixer)进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用酶标仪(PerkinElmer)测量出发光量。
添加衍生物A、B或C的孔的活细胞率由下式计算出。
活细胞率(％)＝a÷b×100
a：添加衍生物A、B或C的孔的发光量的平均值
b：添加培养基的孔的发光量的平均值
IC50值由下式计算出。
IC50(nM)＝antilog((50－d)×(LOG10(b)－LOG10(a))÷(d－c)+LOG10(b))
a：衍生物A、B或C的浓度a
b：衍生物A、B或C的浓度b
c：添加浓度a的衍生物A、B或C时的活细胞率
d：添加浓度b的衍生物A、B或C时的活细胞率
a、b是夹着活细胞率50％的两点且a＞b。
此外，同时添加衍生物A、B或C和奥拉帕尼2μM的孔的活细胞率由下式计算出。
活细胞率(％)＝a÷b×100
a：同时添加衍生物A、B或C和奥拉帕尼2μM的孔的发光量的平均值
b：添加奥拉帕尼2μM的孔的发光量的平均值
IC50值由下式计算出。
IC50(nM)＝antilog((50－d)×(LOG10(b)－LOG10(a))÷(d－c)+LOG10(b))
a：衍生物A、B或C的浓度a
b：衍生物A、B或C的浓度b
c：添加浓度a的衍生物A、B或C和奥拉帕尼2μM时的活细胞率
d：添加浓度b的衍生物A、B或C和奥拉帕尼2μM时的活细胞率
a、b是夹着活细胞率50％的两点且a＞b。
对于Calu－6细胞，奥拉帕尼2μM未显示出增殖抑制效果(增殖抑制率小于10％)。另一方面，衍生物A、B或C在单独添加时分别显示出IC50值6.8pM、119.8pM、113.0pM的增殖抑制效果，在同时添加奥拉帕尼2μM时分别显示出IC50值4.3pM、79.4pM、89.4pM的增殖抑制效果。联用时，与单独使用各药剂相比，显示出优异的增殖抑制效果。
实施例30：细胞增殖抑制试验(2)
将从ATCC(美国模式培养物集存库)获得的人咽喉癌细胞株FaDu用于评价。用包含10％的胎牛血清(GE Healthcare)、MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)以及丙酮酸钠(Thermo Fisher Scientific)的MEM(Thermo Fisher Scientific；以下，称为EMEM培养基)调制成6.25×103Cells/mL，在96孔细胞培养用微孔板中各添加80μL。添加细胞后，在37℃、5％CO2下培养一晩。
第二天，在微孔板上各添加10μL用EMEM培养基稀释成100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、3.13pM、1.56pM、0.78pM的吡咯并苯并二氮杂卓衍生物A、B或C。在未添加吡咯并苯并二氮杂卓衍生物的孔中各添加10μL EMEM培养基。进而，在微孔板中各添加10μL用EMEM培养基调制成1μM的奥拉帕尼。在未添加奥拉帕尼的孔中各添加10μL EMEM培养基。然后，在37℃、5％CO2下将微孔板培养6天。培养后，将微孔板从恒温箱取出，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)，用平板混合器搅拌。在室温下静置10分钟后，用酶标仪(PerkinElmer)测量出发光量。
添加衍生物A、B或CD的孔的活细胞率由下式计算出。
活细胞率(％)＝a÷b×100
a：添加衍生物A、B或C的孔的发光量的平均值
b：添加培养基的孔的发光量的平均值
IC50值由下式计算出。
IC50(nM)＝antilog((50－d)×(LOG10(b)－LOG10(a))÷(d－c)+LOG10(b))
a：衍生物A、B或C的浓度a
b：衍生物A、B或C的浓度b
c：添加浓度a的衍生物A、B或C时的活细胞率
d：添加浓度b的衍生物A、B或C时的活细胞率
a、b是夹着活细胞率50％的两点且a＞b。
此外，同时添加衍生物A、B或C和奥拉帕尼1μM的孔的活细胞率由下式计算出。
活细胞率(％)＝a÷b×100
a：同时添加衍生物A、B或C和奥拉帕尼1μM的孔的发光量的平均值
b：添加奥拉帕尼1μM的孔的发光量的平均值
IC50值由下式计算出。
IC50(nM)＝antilog((50－d)×(LOG10(b)－LOG10(a))÷(d－c)+LOG10(b))
a：衍生物A、B或C的浓度a
b：衍生物A、B或C的浓度b
c：添加浓度a的衍生物A、B或C和奥拉帕尼1μM时的活细胞率
d：添加浓度b的衍生物A、B或C和奥拉帕尼1μM时的活细胞率
a、b是夹着活细胞率50％的两点且a＞b。
对于FaDu细胞，奥拉帕尼1μM未显示增殖抑制效果(增殖抑制率小于10％)。另一方面，衍生物A、B或C在单独添加时分别显示出IC50值8.6pM、123.2pM、73.2pM的增殖抑制效果，在同时添加奥拉帕尼1μM时分别显示出IC50值4.4pM、71.9pM、44.5pM的增殖抑制效果。联用时，与单独使用各药剂相比，显示出优异的增殖抑制效果。
实施例31：细胞增殖抑制试验(3)
将从ATCC(美国模式培养物集存库)获得的人咽喉癌细胞株FaDu用于评价。用包含10％的胎牛血清(GE Healthcare)、MEM非必需氨基酸溶液(Thermo Fisher Scientific)以及丙酮酸钠(Thermo Fisher Scientific)的MEM(Thermo Fisher Scientific；以下，称为EMEM培养基)调制成6.25×103Cells/mL，在96孔细胞培养用微孔板中各添加80μL。添加细胞后，在37℃、5％CO2下培养一晩。
第二天，在微孔板上各添加10μL用EMEM培养基稀释成100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、3.13pM、1.56pM、0.78pM的吡咯并苯并二氮杂卓衍生物A、B或C。在未添加吡咯并苯并二氮杂卓衍生物的孔中各添加10μL EMEM培养基。进而，在微孔板中各添加10μL用EMEM培养基调制成2nM的他拉唑帕尼。在未添加他拉唑帕尼的孔中各添加10μL EMEM培养基。然后，在37℃、5％CO2下将微孔板培养6天。培养后，将微孔板从恒温箱取出，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)，用平板混合器搅拌。在室温下静置10分钟后，用酶标仪(PerkinElmer)测量出发光量。
添加衍生物A、B或C的孔的活细胞率由下式计算出。
活细胞率(％)＝a÷b×100
a：添加衍生物A、B或C的孔的发光量的平均值
b：添加培养基的孔的发光量的平均值
IC50值由下式计算出。
IC50(nM)＝antilog((50－d)×(LOG10(b)－LOG10(a))÷(d－c)+LOG10(b))
a：衍生物A、B或C的浓度a
b：衍生物A、B或C的浓度b
c：添加浓度a的衍生物A、B或C时的活细胞率
d：添加浓度b的衍生物A、B或C时的活细胞率
a、b是夹着活细胞率50％的两点且a＞b。
此外，同时添加衍生物A、B或C和他拉唑帕尼2nM的孔的活细胞率由下式计算出。
活细胞率(％)＝a÷b×100
a：同时添加衍生物A、B或C和他拉唑帕尼2nM的孔的发光量的平均值
b：添加他拉唑帕尼2nM的孔的发光量的平均值
IC50值由下式计算出。
IC50(nM)＝antilog((50－d)×(LOG10(b)－LOG10(a))÷(d－c)+LOG10(b))
a：衍生物A、B或C的浓度a
b：衍生物A、B或C的浓度b
c：添加浓度a的衍生物A、B或C和他拉唑帕尼2nM时的活细胞率
d：添加浓度b的衍生物A、B或C和他拉唑帕尼2nM时的活细胞率
a，b是夹着活细胞率50％的两点且a＞b。
对于FaDu细胞，他拉唑帕尼2nM未显示增殖抑制效果(增殖抑制率小于10％)。另一方面，衍生物A、B或C在单独添加时分别显示出IC50值7.7pM、121.2pM、83.1pM的增殖抑制效果，在同时添加他拉唑帕尼2nM时分别显示出IC50值4.7pM、82.1pM、51.2pM的增殖抑制效果。联用时，与单独使用各药剂相比，显示出优异的增殖抑制效果。
实施例32：细胞增殖抑制试验(4)
将从ATCC(美国模式培养物集存库)购入的人卵巢癌株SK－OV－3细胞用于评价。用包含10％的胎牛血清(GE Healthcare)的McCoy‘s 5A(Modified)培养基(Thermo FisherScientific；以下，称为McCoy’s 5A培养基)调制成1.25×104Cells/mL，在96孔细胞培养用微孔板中各添加80μL。添加细胞后，在37℃、5％CO2下培养一晩。
第二天，在微孔板上各添加10μL用McCoy’s 5A培养基稀释成100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、3.13pM、1.56pM、0.78pM的吡咯并苯并二氮杂卓衍生物A。在未添加吡咯并苯并二氮杂卓衍生物A的孔中各添加10μL McCoy’s 5A培养基。进而，在微孔板中各添加10μL用McCoy’s 5A培养基调制成5nM的他拉唑帕尼。在未添加他拉唑帕尼的孔中各添加10μLMcCoy’s 5A培养基。然后，在37℃、5％CO2下将微孔板培养6天。培养后，将微孔板从恒温箱取出，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter-Glo Luminescent CellViability Assay(Promega)，用平板混合器搅拌。在室温下静置10分钟后，用酶标仪(PerkinElmer)测量出发光量。
添加衍生物A的孔的活细胞率由下式计算出。
活细胞率(％)＝a÷b×100
a：添加衍生物A的孔的发光量的平均值
b：添加培养基的孔的发光量的平均值
IC50值由下式计算出。
IC50(nM)＝antilog((50－d)×(LOG10(b)－LOG10(a))÷(d－c)+LOG10(b))
a：衍生物A的浓度a
b：衍生物A的浓度b
c：添加浓度a的衍生物A时的活细胞率
d：添加浓度b的衍生物A时的活细胞率
a，b是夹着活细胞率50％的两点且a＞b。
此外，同时添加衍生物A和他拉唑帕尼5nM的孔的活细胞率由下式计算出。
活细胞率(％)＝a÷b×100
a：同时添加衍生物A和他拉唑帕尼5nM的孔的发光量的平均值
b：添加他拉唑帕尼5nM的孔的发光量的平均值
IC50值由下式计算出。
IC50(nM)＝antilog((50－d)×(LOG10(b)－LOG10(a))÷(d－c)+LOG10(b))
a：衍生物A的浓度a
b：衍生物A的浓度b
c：添加浓度a的衍生物A和他拉唑帕尼5nM时的活细胞率
d：添加浓度b的衍生物A和他拉唑帕尼5nM时的活细胞率
a、b是夹着活细胞率50％的两点且a＞b。
对于SK－OV－3细胞，他拉唑帕尼5nM未显示增殖抑制效果(增殖抑制率小于10％)。另一方面，衍生物A在单独添加时显示出IC50值8.1pM的增殖抑制效果，在同时添加他拉唑帕尼5nM时显示出IC50值4.6pM的增殖抑制效果。联用时，与单独使用各药剂相比，显示出优异的增殖抑制效果。
实施例33：抗肿瘤试验(1)
小鼠：将5－6周龄的雌BALB/c裸鼠(日本Charles river公司)供于实验。
测定/计算公式：在所有研究中，用电子式数显卡尺(CD－15CX，Mitutoyo Corp.)在一周内测量两次肿瘤的长径和短径，计算出肿瘤体积(mm3)。计算式如下所示。
肿瘤体积(mm3)＝1/2×长径(mm)×[短径(mm)]2
抗CLDN6抗体－药物偶联物ADC1、抗HER2抗体－药物偶联物ADC2以及抗TROP2抗体－药物偶联物ADC3用ABS缓冲液(10mM醋酸缓冲液(pH5.5)、5％山梨醇)稀释，尾静脉内给药10mL/kg的液量。将奥拉帕尼用二甲基亚砜(DMSO)溶解，用10％2－羟丙基－β－环糊精(SIGMA－ALDRICH)/杜氏磷酸缓冲液稀释后，腹腔内给药10mL/kg的液量。将他拉唑帕尼用DMSO溶解，用10％N，N－二甲基乙酰胺/5％Kolliphor HS15(SIGMA－ALDRICH)/杜氏磷酸缓冲液稀释，口服给药10mL/kg的液量。将尼拉帕利用DMSO溶解，用0.5％甲基纤维素稀释，口服给药10mL/kg的液量。以上的方法在实施例34～37中通用。
将从ATCC(美国模式培养物集存库)购入的人胰腺癌细胞株CFPAC－1悬浮于生理盐水中，将5.0×106cells皮下移植到雌裸鼠的右体侧部，在移植10天后实施随机分组(Day0)。ADC2在Day0以0.2mg/kg的剂量进行给药。他拉唑帕尼以0.8mg/kg的剂量从Day0起给药5天。设定各自的单剂给药组、联合给药组以及作为对照组的无药物处理(Notreatment)组。
将ADC2与他拉唑帕尼的联用效果示于图1。图中，横轴表示细胞移植后的天数，纵轴表示肿瘤体积。他拉唑帕尼单剂给药的试验最终日(Day35)的肿瘤生长抑制率(TumorGrowth Inhibition，TGI)为17％。基于ADC2的单剂给药的TGI为94％。另一方面，在ADC2和他拉唑帕尼的联合给药中，观察到比他拉唑帕尼单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.005。根据Dunnett检验计算出。以下相同。)。此外，观察到比ADC2单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.05)，肿瘤生长抑制率为(TGI，99％)。此外，在任意的单剂和联合给药组中，未观察到体重减轻等特别明显的结果。
实施例34：抗肿瘤试验(2)
将从DSMZ(德国微生物菌种保藏中心：Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH)购入的人乳腺癌株JIMT－1细胞悬浮于生理盐水中，将5×106cells皮下移植到雌裸鼠的右体侧部，在移植10天后实施随机分组(Day0)。抗HER2抗体－药物偶联物ADC2在Day0以0.2mg/kg的剂量进行给药。就PARP抑制剂而言，将奥拉帕尼以50mg/kg的剂量或将他拉唑帕尼以0.8mg/kg的剂量从Day0起给药5天。设定各自的单剂给药组、ADC2与PARP抑制剂的联合给药组以及作为对照组的ABS缓冲液给药组。
将ADC2与奥拉帕尼的联用效果示于图2。图中，横轴表示细胞移植后的天数，纵轴表示肿瘤体积。在奥拉帕尼单剂给药时未观察到肿瘤生长抑制效果。基于ADC2的单剂给药的试验最终日(Day43)的肿瘤生长抑制率(Tumor Growth Inhibition，TGI)为75％。另一方面，在ADC2和奥拉帕尼的联合给药中，观察到比奥拉帕尼单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.005)。此外，观察到比ADC2单剂给药的肿瘤生长抑制率更高(TGI，82％)、更强的联用效果。此外，在任意的单剂和联合给药组中，未观察到体重减轻等特别明显的结果。
将ADC2与他拉唑帕尼的联用效果示于图3。图中，横轴表示细胞移植后的天数，纵轴表示肿瘤体积。在他拉唑帕尼单剂给药时未观察到肿瘤生长抑制效果。基于ADC2的单剂给药的试验最终日(Day43)的肿瘤生长抑制率(Tumor Growth Inhibition，TGI)为75％。另一方面，在ADC2和他拉唑帕尼的联合给药中，观察到比他拉唑帕尼单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.005)。此外，观察到比ADC2单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.05)，肿瘤生长抑制率为(TGI，91％)。此外，在任意的单剂和联合给药组中，未观察到体重减轻等特别明显的结果。
实施例35：抗肿瘤试验(3)
将从ATCC(美国模式培养物集存库)获得的人咽喉癌细胞株FaDu悬浮于生理盐水中，将3.0×106cells皮下移植到雌裸鼠的右体侧部，在移植10天后实施随机分组(Day0)。抗TROP2抗体－药物偶联物ADC3在Day0以0.2mg/kg的剂量进行给药。就PARP抑制剂而言，将奥拉帕尼以50mg/kg的剂量或将他拉唑帕尼以0.8mg/kg的剂量从Day0起给药5天。设定各自的单剂给药组、ADC3与PARP抑制剂的联合给药组以及作为对照组的ABS缓冲液给药组。
将ADC3与奥拉帕尼的联用效果示于图4。图中，横轴表示细胞移植后的天数，纵轴表示肿瘤体积。在奥拉帕尼单剂给药的试验最终日(Day25)的肿瘤生长抑制率(TumorGrowth Inhibition，TGI)为7％。基于ADC3的单剂给药的试验最终日的肿瘤生长抑制率(Tumor Growth Inhibition，TGI)为67％。另一方面，在ADC3和奥拉帕尼的联合给药中，观察到比奥拉帕尼单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.005)。此外，观察到比ADC3单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.05)，肿瘤生长抑制率为(TGI，76％)。此外，在任意的单剂和联合给药组中，未观察到体重减轻等特别明显的结果。
将ADC3与他拉唑帕尼的联用效果示于图5。图中，横轴表示细胞移植后的天数，纵轴表示肿瘤体积。在他拉唑帕尼单剂给药的试验最终日(Day25)的肿瘤生长抑制率(TumorGrowth Inhibition，TGI)为33％。基于ADC3的单剂给药的试验最终日的肿瘤生长抑制率(Tumor Growth Inhibition，TGI)为67％。另一方面，在ADC3和他拉唑帕尼的联合给药中，观察到比他拉唑帕尼单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.005)。此外，观察到比ADC3单剂给药更显著优异的肿瘤生长抑制效果(P＜0.005)，肿瘤生长抑制率为(TGI，83％)。此外，在任意的单剂和联合给药组中，未观察到体重减轻等特别明显的结果。
实施例36：抗肿瘤试验(4)
将从ATCC(美国模式培养物集存库)购入的人卵巢癌细胞株OV－90悬浮于基质胶(CORNING)中，将2.5×106cells皮下移植到雌裸鼠的右体侧部，在移植18天后实施随机分组(Day0)。抗CLDN6抗体－药物偶联物ADC1在Day0以0.3mg/kg的剂量进行给药。尼拉帕利以75mg/kg的剂量从Day0起给药5天。设定各自的单剂给药组、联合给药组以及作为对照组的无药物处理(No treatment)组。
将ADC1与尼拉帕利的联用结果示于图42。图中，横轴表示细胞移植后的天数，纵轴表示肿瘤体积。基于尼拉帕利单剂给药的Day21时的肿瘤生长抑制率(Tumor GrowthInhibition，TGI)为1％，在Day21时未观察到体重减轻等明显的结果。ADC1单剂给药组与ADC1和尼拉帕利的联合给药组的Day21时的TGI均为96％，在Day21时未观察到体重减轻等明显的结果。另一方面，在Day53时，在ADC1和尼拉帕利的联合给药中，与ADC1单剂给药相比，观察到肿瘤生长抑制效果。在Day53时，未观察到因ADC1单剂给药与ADC1和尼拉帕利的联合给药引起的体重减轻等明显的结果。
需要说明的是，本实施例中使用的ADC1使用抗CLDN6(H1L1)抗体，根据与实施例15和实施例19同样的方法进行制作。
实施例37：抗肿瘤试验(5)
将从ATCC(美国模式培养物集存库)购入的人卵巢癌细胞株OV－90悬浮于基质胶(CORNING)中，将2.5×106cells皮下移植到雌裸鼠的右体侧部，在移植13～18天后实施随机分组(Day0)。抗CLDN6抗体－药物偶联物ADC1在Day0以0.2mg/kg的剂量进行给药。就PARP抑制药而言，将奥拉帕尼以50mg/kg的剂量或将他拉唑帕尼以0.8mg/kg的剂量从Day0起给药5天。设定各自的单剂给药组、ADC1与PARP抑制药的联合给药组以及作为对照组的无药物处理(No treatment)组。
实施例38：曲妥珠单抗突变体－[MSG1－N3]2或曲妥珠单抗突变体2－[MSG1－N3]2
工序1：(Fucα1，6)GlcNAc－曲妥珠单抗突变体的制备
在曲妥珠单抗突变体(轻链：序列号73，重链：序列号75)溶液ca.22.3mg/mL(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(2.69mL)中加入7.7mg/mL野生型EndoS溶液(PBS)0.156mL，在37℃下保温4小时。使用Experion电泳工作站(BIO－RAD制)确认反应的进行情况。反应结束后，根据以下的方法进行利用亲和色谱法的精制和利用羟基磷灰石柱的精制。
(1)利用亲和色谱法的精制
精制装置：AKTA avant(GE Healthcare制)
柱：HiTrap rProtein A FF(5mL)(GE Healthcare制)
流速：5mL/min(进料时为1.25mL/min)
将上述所得到的反应液分多次进行精制。在与柱结合时，向柱上部添加反应液，以1.25mL/min通入结合缓冲液(20mM磷酸缓冲液(pH6.0))4CV(柱体积：Column Volume)，进一步以5mL/min通入结合缓冲液5CV。在中间清洗时，通入清洗溶液(20mM磷酸缓冲液(pH7.0)、0.5M氯化钠溶液)15CV。在洗脱时，通入洗脱缓冲液(ImmunoPure IgG Eution buffer，PIERCE制)6CV。用1M Tris缓冲液(pH9.0)立即中和洗脱液。利用共通操作C对包含目标产物的馏分进行与5mM磷酸缓冲液50mM－吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH6.8)的缓冲液交换。
(2)利用羟基磷灰石色谱法的精制
精制装置：AKTA avant(GE Healthcare制)
柱：Bio-Scale Mini CHT Type I Cartridge(5mL)(BIO－RAD制)
流速：5mL/min(进料时为1.25mL/min)
向柱上部添加上述(1)所得到的溶液，以1.25mL/min通入A液(5mM磷酸缓冲液50mM－吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH6.8))4CV，进一步以5mL/min通入A液3CV。然后，使用A液和B液(5mM磷酸缓冲液50mM－吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH6.8)，2M氯化钠溶液)进行洗脱。洗脱条件为A液：B液＝100：0～0：100(15CV)。进而，通入清洗溶液(500mM磷酸缓冲液(pH6.5))5CV。
使用共通操作C对包含目标产物的馏分进行缓冲液交换，得到6.08mg/mL的(Fucα1，6)GlcNAc－曲妥珠单抗突变体溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(6.10mL)。
工序2：曲妥珠单抗突变体－[MSG1－N3]2的制备
使用上述工序1所得到的6.08mg/mL(Fucα1，6)GlcNAc－曲妥珠单抗突变体溶液(50mM磷酸缓冲液(pH6.0))(6.10mL)，加入实施例3工序4中合成的化合物(9.78mg)的50mM磷酸缓冲液(pH6.0)溶液(0.200mL)、5.80mg/mL的EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(0.128mL)，在30℃下保温3小时。使用Experion电泳工作站(BIO－RAD制)确认反应的进行情况。反应结束后，与上述工序1同样地进行利用亲和色谱法的精制和利用羟基磷灰石色谱法的精制，然后使用共通操作C对包含目标产物的馏分进行与磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)的缓冲液交换，得到10.2mg/mL的曲妥珠单抗突变体－[MSG1－N3]2溶液(磷酸缓冲生理盐水(pH6.0))(3.65mL)。
通过使用曲妥珠单抗突变体2(轻链：序列号76,重链：77)，进行与实施例38的工序1和2同样的操作来得到曲妥珠单抗突变体2－[MSG1－N3]2。
实施例39：ADC6
工序1：抗体与药物连接子的偶联
在实施例38工序2所得到的曲妥珠单抗突变体－[MSG1－N3]2的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，0.40mL)中，在室温下加入1，2－丙二醇(0.767mL)、实施例2－1工序13所得到的化合物(3－14)的10mM二甲基亚砜溶液(0.033mL；相对于一分子抗体为12当量)，使用管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)，在室温下反应48小时。
精制操作：使用后述的共通操作D对上述溶液进行精制，得到具有目标化合物的溶液7.00mL。
特性评价：使用共通操作E、F得到下述的特性值。
抗体浓度：0.48mg/mL，抗体产量：3.39mg(85％)，每一分子抗体的平均药物结合数(n)：1.7。
实施例40：ADC7
工序1－1：抗体与药物连接子的偶联(ADC7)
在实施例38所得到的曲妥珠单抗突变体2－[MSG1－N3]2的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，0.50mL)中，在室温下加入1，2－丙二醇(0.486mL)、实施例2－1工序13所得到的化合物(3－14)的10mM二甲基亚砜溶液(0.014mL；相对于一分子抗体为4当量)，使用管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)，在室温下反应40小时。
精制操作：使用后述的共通操作D对上述溶液进行精制，得到具有目标化合物的溶液2.50mL。
特性评价：使用共通操作E、F得到下述的特性值。
抗体浓度：1.12mg/mL，抗体产量：2.80mg(56％)，每一分子抗体的平均药物结合数(n)：1.8。
产业上的可利用性
通过使用本发明的抗体－药物偶联物、抗体和/或PBD衍生物等，可以治疗或预防各种癌症。
序列表自由文本
序列号1：人CLDN6的氨基酸序列
序列号2：编码人CLDN6的氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列
序列号3：人CLDN9的氨基酸序列
序列号4：编码人CLDN9的氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列
序列号5：B1抗体轻链的CDRL1的氨基酸序列
序列号6：B1抗体轻链的CDRL2的氨基酸序列
序列号7：B1抗体轻链的CDRL3的氨基酸序列
序列号8：人源化B1抗体轻链L4的CDRL3的氨基酸序列
序列号9：B1抗体重链的CDRH1的氨基酸序列
序列号10：B1抗体重链的CDRH2的氨基酸序列
序列号11：B1抗体重链的CDRH3的氨基酸序列
序列号12：C7抗体轻链的CDRL1的氨基酸序列
序列号13：C7抗体轻链的CDRL2的氨基酸序列
序列号14：C7抗体轻链的CDRL3的氨基酸序列
序列号15：C7抗体重链的CDRH1的氨基酸序列
序列号16：C7抗体重链的CDRH2的氨基酸序列
序列号17：C7抗体重链的CDRH3的氨基酸序列
序列号18：编码B1抗体轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列
序列号19：B1抗体轻链的可变区的氨基酸序列
序列号20：编码B1抗体重链的可变区的cDNA的核苷酸序列
序列号21：B1抗体重链的可变区的氨基酸序列
序列号22：编码C7抗体轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列
序列号23：C7抗体轻链的可变区的氨基酸序列
序列号24：编码C7抗体重链的可变区的cDNA的核苷酸序列
序列号25：C7抗体重链的可变区的氨基酸序列
序列号26：包含人轻链信号序列和编码人κ链恒定区的DNA序列的DNA片段
序列号27：包含人重链信号序列和编码人IgG1LALA恒定区的DNA序列的DNA片段
序列号28：chB1轻链的氨基酸序列
序列号29：包含编码chB1轻链的氨基酸序列的DNA序列的DNA片段
序列号30：chB1轻链的可变区的氨基酸序列
序列号31：编码chB1轻链可变区的核苷酸序列
序列号32：chB1重链的氨基酸序列
序列号33：编码chB1重链的核苷酸序列
序列号34：chB1重链的可变区的氨基酸序列
序列号35：编码chB1重链的可变区的核苷酸序列
序列号36：人源化抗体轻链hL1的氨基酸序列
序列号37：编码人源化抗体轻链hL1的核苷酸序列
序列号38：人源化抗体轻链hL1的可变区的氨基酸序列
序列号39：编码人源化抗体轻链hL1的可变区的核苷酸序列
序列号40：人源化抗体轻链hL2的氨基酸序列
序列号41：编码人源化抗体轻链hL2的核苷酸序列
序列号42：人源化抗体轻链hL2的可变区的氨基酸序列
序列号43：编码人源化抗体轻链hL2的可变区的核苷酸序列
序列号44：人源化抗体轻链hL3的氨基酸序列
序列号45：编码人源化抗体轻链hL3的核苷酸序列
序列号46：人源化抗体轻链hL3的可变区的氨基酸序列
序列号47：编码人源化抗体轻链hL3的可变区的核苷酸序列
序列号48：人源化抗体轻链hL4的氨基酸序列
序列号49：编码人源化抗体轻链hL4的核苷酸序列
序列号50：人源化抗体轻链hL4的可变区的氨基酸序列
序列号51：编码人源化抗体轻链hL4的可变区的核苷酸序列
序列号52：人源化抗体重链hH1的氨基酸序列
序列号53：编码人源化抗体重链hH1的核苷酸序列
序列号54：人源化抗体重链hH1的可变区的氨基酸序列
序列号55：编码人源化抗体重链hH1的可变区的核苷酸序列
序列号56：人源化抗体重链hH2的氨基酸序列
序列号57：编码人源化抗体重链hH2的核苷酸序列
序列号58：人源化抗体重链hH2的可变区的氨基酸序列
序列号59：编码人源化抗体重链hH2的可变区的核苷酸序列
序列号60：人源化抗体重链hH3的氨基酸序列
序列号61：编码人源化抗体重链hH3的核苷酸序列
序列号62：人源化抗体重链hH3的可变区的氨基酸序列
序列号63：编码人源化抗体重链hH3的可变区的核苷酸序列
序列号64：曲妥珠单抗轻链的氨基酸序列
序列号65：曲妥珠单抗重链的氨基酸序列
序列号66：抗LPS抗体(h#1G5－H1L1)轻链的氨基酸序列
序列号67：抗LPS抗体(h#1G5－H1L1)重链的氨基酸序列
序列号68：抗TROP2抗体(hRS7)轻链的氨基酸序列
序列号69：抗TROP2抗体(hRS7)重链的氨基酸序列
序列号70：抗CD98抗体(hM23－H1L1)轻链的氨基酸序列
序列号71：抗CD98抗体(hM23－H1L1)重链的氨基酸序列
序列号72：编码曲妥珠单抗突变体轻链的核苷酸序列
序列号73：曲妥珠单抗突变体轻链的氨基酸序列
序列号74：编码曲妥珠单抗突变体重链的核苷酸序列
序列号75：曲妥珠单抗突变体重链的氨基酸序列
序列号76：曲妥珠单抗突变体2轻链的氨基酸序列
序列号77：曲妥珠单抗突变体2重链的氨基酸序列。
序列表
<110> 第一三共株式会社
<120> 抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与PARP抑制剂的组合
<130> SAP-860-PCT
<141> 2020-03-26
<150> JP 2019061761
<151> 2019-03-27
<160> 77
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人CLDN6的氨基酸序列
<400> 1
Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val
20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu
85 90 95
Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser
115 120 125
Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile
130 135 140
Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly
180 185 190
Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val
210 215 220
<210> 2
<211> 663
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人CLDN6的氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列
<400> 2
atggcctctg ccggaatgca gatcctggga gtcgtcctga cactgctggg ctgggtgaat 60
ggcctggtct cctgtgccct gcccatgtgg aaggtgaccg ctttcatcgg caacagcatc 120
gtggtggccc aggtggtgtg ggagggcctg tggatgtcct gcgtggtgca gagcaccggc 180
cagatgcagt gcaaggtgta cgactcactg ctggcgctgc cacaggacct gcaggctgca 240
cgtgccctct gtgtcatcgc cctccttgtg gccctgttcg gcttgctggt ctaccttgct 300
ggggccaagt gtaccacctg tgtggaggag aaggattcca aggcccgcct ggtgctcacc 360
tctgggattg tctttgtcat ctcaggggtc ctgacgctaa tccccgtgtg ctggacggcg 420
catgccatca tccgggactt ctataacccc ctggtggctg aggcccaaaa gcgggagctg 480
ggggcctccc tctacttggg ctgggcggcc tcaggccttt tgttgctggg tggggggttg 540
ctgtgctgca cttgcccctc gggggggtcc cagggcccca gccattacat ggcccgctac 600
tcaacatctg cccctgccat ctctcggggg ccctctgagt accctaccaa gaattacgtc 660
tga 663
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人CLDN9的氨基酸序列
<400> 3
Met Ala Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Val Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val
20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu
85 90 95
Val Ala Ile Thr Gly Ala Gln Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Glu Gly
100 105 110
Ala Lys Ala Arg Ile Val Leu Thr Ala Gly Val Ile Leu Leu Leu Ala
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala
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<210> 4
<211> 654
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人CLDN9的氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列
<400> 4
atggcttcga ccggcttaga actgctgggc atgaccctgg ctgtgctggg ctggctgggg 60
accctggtgt cctgcgccct gcccctgtgg aaggtgaccg ccttcatcgg caacagcatc 120
gtggtggccc aggtggtgtg ggagggcctg tggatgtcct gcgtggtgca gagcacgggc 180
cagatgcagt gcaaggtgta cgactcactg ctggctctgc cgcaggacct gcaggccgca 240
cgtgccctct gtgtcattgc cctcctgctg gccctgcttg gcctcctggt ggccatcaca 300
ggtgcccagt gtaccacgtg tgtggaggac gaaggtgcca aggcccgtat cgtgctcacc 360
gcgggggtca tcctcctcct cgccggcatc ctggtgctca tccctgtgtg ctggacggcg 420
cacgccatca tccaggactt ctacaacccc ctggtggctg aggccctcaa gcgggagctg 480
ggggcctccc tctacctggg ctgggcggcg gctgcactgc ttatgctggg cggggggctc 540
ctctgctgca cgtgcccccc gccccaggtc gagcggcccc gcggacctcg gctgggctac 600
tccatcccct cccgctcggg tgcatctgga ctggacaaga gggactacgt gtga 654
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> B1抗体轻链的CDRL1的氨基酸序列
<400> 5
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> B1抗体轻链的CDRL2的氨基酸序列
<400> 6
Phe Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> B1抗体轻链的CDRL3的氨基酸序列
<400> 7
Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化B1抗体轻链L4的CDRL3的氨基酸序列
<400> 8
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> B1抗体重链的CDRH1的氨基酸序列
<400> 9
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> B1抗体重链的CDRH2的氨基酸序列
<400> 10
Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> B1抗体重链的CDRH3的氨基酸序列
<400> 11
Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> C7抗体轻链的CDRL1的氨基酸序列
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> C7抗体轻链的CDRL2的氨基酸序列
<400> 13
Ser Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> C7抗体轻链的CDRL3的氨基酸序列
<400> 14
Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> C7抗体重链的CDRH1的氨基酸序列
<400> 15
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> C7抗体重链的CDRH2的氨基酸序列
<400> 16
Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> C7抗体重链的CDRH3的氨基酸序列
<400> 17
Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 321
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码B1抗体轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列
<400> 18
gatatccaga tgacacagac tgcatcctcc ctgtctgcct ctcttggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctacttc acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacacat tattctctca ccattactaa cctggaacaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatccgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaaac tggaaatcaa a 321
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> B1抗体轻链的可变区的氨基酸序列
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 366
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码B1抗体重链的可变区的cDNA的核苷酸序列
<400> 20
gaggtccagc ttcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gcagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggaggt gttaatccta atagtggtga tactagctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagacccggg 300
gggtacgacg tgggttacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 21
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> B1抗体重链的可变区的氨基酸序列
<400> 21
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Gln Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 321
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码C7抗体轻链的可变区的cDNA的核苷酸序列
<400> 22
gatatccaga tgacacagac tgcatcctcc ctgtctgcct ctcttggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactcc acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacacat tattctctca ccattactca cctggaacaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatccgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaaac tggaaatcaa a 321
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> C7抗体轻链的可变区的氨基酸序列
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr His Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 366
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码C7抗体重链的可变区的cDNA的核苷酸序列
<400> 24
gaggtccagc ttcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gcagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggaggt gttaatccta atagtggtga tactagctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagacccggg 300
gggtacgacg tgggttacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 25
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_特征
<223> C7抗体重链的可变区的氨基酸序列
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Gln Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 449
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_特征
<223> 包含编码人轻链信号序列和人κ链恒定区的DNA序列的DNA片段
<400> 26
gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60
gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120
cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180
cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240
gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300
cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360
cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420
ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449
<210> 27
<211> 1137
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_特征
<223> 包含编码人重链信号序列和人IgG1LALA恒定区的DNA序列的DNA片段
<400> 27
ccagcctccg gactctagag ccaccatgaa acacctgtgg ttcttcctcc tgctggtggc 60
agctcccaga tgggtgctga gccaggtgca attgtgcagg cggttagctc agcctccacc 120
aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 180
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 240
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 300
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 360
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 420
gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaag ccgcgggggg accctcagtc 480
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 540
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 600
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 660
cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 720
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 780
ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 840
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 900
tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 960
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1020
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1080
ctctccctgt ctcccggcaa atgagatatc gggcccgttt aaacggggga ggctaac 1137
<210> 28
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> chB1轻链的氨基酸序列
<400> 28
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr
85 90 95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr
100 105 110
Pro Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 29
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 包含编码chB1轻链的氨基酸序列的DNA序列的DNA片段
<400> 29
ccagcctccg gactctagag ccaccatggt gctgcagacc caggtgttca tcagcctgct 60
gctgtggatc agcggcgcct acggcgacat ccagatgacc cagacagcca gcagcctgag 120
cgccagcctg ggcgatagag tgaccatcag ctgcagagcc agccaggaca tcaacaacta 180
cctgaactgg tatcagcaga aacccgacgg caccgtgaag ctgctgatct acttcaccag 240
cagactgcac agcggcgtgc ccagcagatt ttctggcagc ggctctggca cccactacag 300
cctgaccatc accaacctgg aacaggaaga tatcgctacc tacttctgtc agcaaggcta 360
ccccctgccc tggacctttg gcggcggaac aaagctggaa atcaagcggg ccgtggccgc 420
tccctccgtg ttcatctttc cacccagcga cgagcagctg aagtccggca cagctagcgt 480
cgtgtgcctg ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa 540
tgccctgcag agcggcaaca gccaggaaag cgtgaccgag caggacagca aggactccac 600
ctactccctg agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta 660
cgcctgcgaa gtgacccacc agggcctgtc tagccccgtg accaagagct tcaaccgggg 720
cgagtgttga gtttaaacgg gggaggctaa ct 752
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> chB1轻链的可变区的氨基酸序列
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码chB1轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列
<400> 31
gacatccaga tgacccagac agccagcagc ctgagcgcca gcctgggcga tagagtgacc 60
atcagctgca gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaaaccc 120
gacggcaccg tgaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc tggcacccac tacagcctga ccatcaccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ctacctactt ctgtcagcaa ggctaccccc tgccctggac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcaa g 321
<210> 32
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> chB1重链的氨基酸序列
<400> 32
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Gln Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 33
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码chB1重链的核苷酸序列
<400> 33
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60
gtgcagctgc agcagtctgg ccccgagctc gtgaaacctg gcgcctccgt gaagatcagc 120
tgcaagacca gcggctacac cttcaccgag tacaccatgc actgggtgca gcagagccac 180
ggcaagagcc tggaatggat cggcggcgtg aaccccaaca gcggcgacac cagctacaac 240
cagaagttca agggcaaggc caccctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300
gaactgcgga gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgtgccag acctggcggc 360
tacgacgtgg gctactacgc catggattac tggggccagg gcaccagcgt gaccgtcagc 420
tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540
agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780
ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960
aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320
tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380
acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413
<210> 34
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> chB1重链的可变区的氨基酸序列
<400> 34
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Gln Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码chB1重链的可变区的核苷酸序列
<400> 35
gaagtgcagc tgcagcagtc tggccccgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60
agctgcaaga ccagcggcta caccttcacc gagtacacca tgcactgggt gcagcagagc 120
cacggcaaga gcctggaatg gatcggcggc gtgaacccca acagcggcga caccagctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgtgc cagacctggc 300
ggctacgacg tgggctacta cgccatggat tactggggcc agggcaccag cgtgaccgtc 360
agctca 366
<210> 36
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体轻链hL1的氨基酸序列
<400> 36
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr
100 105 110
Pro Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 37
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体轻链hL1的核苷酸序列
<400> 37
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120
atcacctgta gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaagccc 180
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 240
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga caatcagcag cctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctaccccc tgccttggac atttggccag 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体轻链hL1的可变区的氨基酸序列
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体轻链hL1的可变区的核苷酸序列
<400> 39
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga caatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctaccccc tgccttggac atttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 40
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体轻链hL2的氨基酸序列
<400> 40
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr
100 105 110
Pro Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 41
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体轻链hL2的核苷酸序列
<400> 41
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120
atcacctgta gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaaaccc 180
ggcaaggccg tgaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 240
agattttctg gcagcggctc tggcacccac tacaccctga caatcagcag cctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctaccccc tgccttggac atttggccag 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体轻链hL2的可变区的氨基酸序列
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体轻链hL2的可变区的核苷酸序列
<400> 43
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaaaccc 120
ggcaaggccg tgaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc tggcacccac tacaccctga caatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctaccccc tgccttggac atttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 44
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体轻链hL3的氨基酸序列
<400> 44
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr
100 105 110
Pro Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 45
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体轻链hL3的核苷酸序列
<400> 45
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120
atcacctgta gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaaaccc 180
ggcggagccg tgaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 240
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga caatcagcag cctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctaccccc tgccctggac atttggcggc 360
ggaacaaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体轻链hL3的可变区的氨基酸序列
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体轻链hL3的可变区的核苷酸序列
<400> 47
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaaaccc 120
ggcggagccg tgaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga caatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctaccccc tgccctggac atttggcggc 300
ggaacaaagg tggaaatcaa g 321
<210> 48
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体轻链hL4的氨基酸序列
<400> 48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 49
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体轻链hL4的核苷酸序列
<400> 49
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120
atcacctgta gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaaaccc 180
ggcggagccg tgaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 240
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga caatcagcag cctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacaccc tgccctggac atttggcgga 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体轻链hL4的可变区的氨基酸序列
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体轻链hL4的可变区的核苷酸序列
<400> 51
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca ggacatcaac aactacctga actggtatca gcagaaaccc 120
ggcggagccg tgaagctgct gatctacttc accagcagac tgcacagcgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga caatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggcaacaccc tgccctggac atttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 52
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体重链hH1的氨基酸序列
<400> 52
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 53
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体重链hH1的核苷酸序列
<400> 53
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccgag tacaccatgc actgggtgcg ccaggctcca 180
ggccagggac tggaatggat gggcggcgtg aaccccaaca gcggcgatac aagctacgcc 240
cagaaattcc agggcagagt gaccatcacc gccgacacca gcacctccac cgcctacatg 300
gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgtgctag acctggcggc 360
tacgacgtgg gctactacgc catggattac tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420
tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540
agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780
ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
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aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
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acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413
<210> 54
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体重链hH1的可变区的氨基酸序列
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体重链hH1的可变区的核苷酸序列
<400> 55
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
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<210> 56
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体重链hH2的氨基酸序列
<400> 56
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
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20 25 30
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
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Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
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Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
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Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
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370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
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465 470
<210> 57
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体重链hH2的核苷酸序列
<400> 57
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60
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acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780
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cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
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aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320
tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380
acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413
<210> 58
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体重链hH2的可变区的氨基酸序列
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
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Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体重链hH2的可变区的核苷酸序列
<400> 59
gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
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cctggcaaga gcctggaatg gatgggcggc gtgaacccca acagcggcga tacaagctac 180
gcccagaaat tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240
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ggctacgacg tgggctacta cgccatggat tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360
agctca 366
<210> 60
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体重链hH3的氨基酸序列
<400> 60
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
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Glu Trp Met Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Ala
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Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 61
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体重链hH3的核苷酸序列
<400> 61
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaagacca gcggctacac ctttaccgag tacaccatgc actgggtgcg ccaggctcca 180
ggccagggac tggaatggat gggcggcgtg aaccccaaca gcggcgatac aagctacgcc 240
cagaaattcc agggcagagt gaccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300
gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgtgctag acctggcggc 360
tacgacgtgg gctactacgc catggattac tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420
tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540
agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780
ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960
aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320
tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380
acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413
<210> 62
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 人源化抗体重链hH3的可变区的氨基酸序列
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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115 120
<210> 63
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码人源化抗体重链hH3的可变区的核苷酸序列
<400> 63
gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaaga ccagcggcta cacctttacc gagtacacca tgcactgggt gcgccaggct 120
ccaggccagg gactggaatg gatgggcggc gtgaacccca acagcggcga tacaagctac 180
gcccagaaat tccagggcag agtgaccctg accgtggaca agagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc tagacctggc 300
ggctacgacg tgggctacta cgccatggat tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360
agctca 366
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 曲妥珠单抗轻链的氨基酸序列
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 65
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 曲妥珠单抗重链的氨基酸序列
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 66
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 抗LPS抗体（h#1G5－H1L1）轻链的氨基酸序列
<400> 66
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Val Gly Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr
100 105 110
Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 67
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 抗LPS抗体（h#1G5－H1L1）重链的氨基酸序列
<400> 67
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ile Tyr Asn Tyr Gly Ser Ser Gly Tyr Asn
115 120 125
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 68
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 抗TROP2抗体（hRS7）轻链的氨基酸序列
<400> 68
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 69
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 抗TROP2抗体（hRS7）重链的氨基酸序列
<400> 69
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 70
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 抗CD98抗体（hM23－H1L1）轻链的氨基酸序列
<400> 70
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Arg Tyr Tyr Gly Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 71
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 抗CD98抗体（hM23－H1L1）重链的氨基酸序列
<400> 71
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
225 230 235 240
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 72
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码曲妥珠单抗突变体轻链的核苷酸序列
<400> 72
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 120
atcacctgta gagccagcca ggacgtgaac acagccgtgg cttggtatca gcagaagcct 180
ggcaaggccc ctaagctgct gatctacagc gccagctttc tgtacagcgg cgtgcccagc 240
agattcagcg gctctagaag cggcaccgac ttcaccctga ccataagcag tctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag cactacacca cacctccaac ctttggccag 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 73
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 曲妥珠单抗突变体轻链的氨基酸序列
<400> 73
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 74
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> misc_特征
<223> 编码曲妥珠单抗突变体重链的核苷酸序列
<400> 74
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag 60
gtgcagctgg ttgaatctgg cggaggactg gttcagcctg gcggatctct gagactgtct 120
tgtgccgcca gcggcttcaa catcaaggac acctacatcc actgggtccg acaggcccct 180
ggcaaaggac ttgaatgggt cgccagaatc taccccacca acggctacac cagatacgcc 240
gactctgtga agggcagatt caccatcagc gccgacacca gcaagaacac cgcctacctg 300
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgttctag atggggaggc 360
gacggcttct acgccatgga ttattggggc cagggcaccc tggttaccgt tagctcagcc 420
tccaccaagg gcccaagcgt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctggcggc 480
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aacccgtgac cgtgagctgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ctgtcctgca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccc tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccc 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagcccc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaaggcc agccccggga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
cagggcaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacccag 1380
aagagcctct ccctgtctcc cggcaaa 1407
<210> 75
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 曲妥珠单抗突变体重链的氨基酸序列
<400> 75
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
245 250 255
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 76
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 曲妥珠单抗突变体2轻链的氨基酸序列
<400> 76
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 77
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<220>
<221> MISC_特征
<223> 曲妥珠单抗突变体2重链的氨基酸序列
<400> 77
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
245 250 255
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465

Claims (73)

1.一种医药组合物，其特征在于，所述医药组合物为包含抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物和/或PARP抑制剂的用于癌症治疗的医药组合物，所述抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与所述PARP抑制剂被组合给药，
所述偶联物由下式表示：
Figure FDA0003279539640000011
或者
Figure FDA0003279539640000012
或者
Figure FDA0003279539640000013
Figure FDA0003279539640000021
或者
Figure FDA0003279539640000022
或、
Figure FDA0003279539640000023
或者
Figure FDA0003279539640000024
在上述所示的各结构式中，m1为整数1或2，
Ab为抗体或该抗体的功能性片段，
N297糖链为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或它们的混合物、或N297－(Fuc)SG，
Figure FDA0003279539640000025
Figure FDA0003279539640000031
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
N297糖链中的L(PEG)表示*－(CH2CH2－O)3－CH2CH2－NH－，
在此，右端的氨基经由酰胺键与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧或/和1－6链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧酸键合，左端的星号*表示与所述式中的三唑环上的1位或3位氮原子结合。
2.根据权利要求1所述的医药组合物，其特征在于，
抗体与在肿瘤细胞表达的抗原结合，被吞入肿瘤细胞内而内化。
3.根据权利要求1或2所述的医药组合物，其特征在于，
抗体具有抗肿瘤效果。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体为抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3抗体、抗FAP抗体、抗CDH11抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7－H3抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4抗体、抗LRRC15抗体、抗DR5抗体、抗CDH3抗体、抗PDPN抗体或抗CD123抗体。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的医药组合物，其特征在于，
抗体与CLDN6和/或CLDN9特异性结合。
6.根据权利要求5所述的医药组合物，其中，
抗体包含：含以下的(a)或(b)所述的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重链，和含以下的(a)或(b)所述的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的轻链，
(a)由序列号9所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号10所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号6所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号7所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中一个或两个氨基酸被取代的氨基酸序列形成的CDRL3，或，
(b)由序列号15所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号16所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号17所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号13所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号14所述的氨基酸序列形成的CDRL3。
7.根据权利要求6所述的医药组合物，其中，
抗体包含：含以下的(a)或(b)所述的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重链，和含以下的(a)或(b)所述的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的轻链，
(a)由序列号9所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号10所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号6所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号7所述的氨基酸序列或序列号8所述的氨基酸序列形成的CDRL3，或，
(b)由序列号15所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号16所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号17所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号13所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号14所述的氨基酸序列形成的CDRL3。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体包含以下的(a)或(b)所述的重链可变区和轻链可变区，
(a)由序列号21所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号19所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，或，
(b)由序列号25所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号23所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的医药组合物，其中，
包含：由选自由以下的(a)～(e)构成的组中的氨基酸序列形成的重链可变区，和由选自由以下的(f)～(k)构成的组中的氨基酸序列形成的轻链可变区，
(a)序列号54所述的氨基酸序列，
(b)序列号58所述的氨基酸序列，
(c)序列号62所述的氨基酸序列，
(d)对于(a)～(c)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，
(e)在(a)～(c)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列中、缺失一个或几个氨基酸、取代一个或几个氨基酸或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列，
(f)序列号38所述的氨基酸序列，
(g)序列号42所述的氨基酸序列，
(h)序列号46所述的氨基酸序列，
(i)序列号50所述的氨基酸序列，
(j)对于(f)～(i)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，以及，
(k)在(f)～(i)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列中、缺失一个或几个氨基酸、取代一个或几个氨基酸或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的医药组合物，其中，
抗体包含选自由以下的(a)～(e)构成的组中的重链可变区和轻链可变区，
(a)由序列号54所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号38所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，
(b)由序列号58所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号42所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，
(c)由序列号54所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号46所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，
(d)由序列号58所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号50所述的氨基酸序列形成的轻链可变区所构成的轻链可变区，以及，
(e)由序列号62所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号46所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
11.根据权利要求5～10中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体为嵌合抗体。
12.根据权利要求5～10中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体为人源化抗体。
13.根据权利要求5～12中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体包含人IgG1、人IgG2或人IgG4的重链恒定区。
14.根据权利要求12或13所述的医药组合物，其中，
包含：选自由以下的(a)～(e)构成的组中的重链和轻链，
(a)由序列号52的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号36的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，
(b)由序列号56的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号40的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，
(c)由序列号52的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号44的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，
(d)由序列号56的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号48的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，以及，
(e)由序列号60的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号44的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
15.根据权利要求5所述的医药组合物，其中，
抗体与权利要求6～10以及14中任一项所述的抗体、在与CLDN6和/或CLDN9的结合上进行竞争，或抗体与权利要求6～10以及14中任一项所述的抗体所识别的CLDN6和/或CLDN9上的部位结合。
16.根据权利要求1～4中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体与HER2特异性结合。
17.根据权利要求16所述的医药组合物，其中，
具有抗体依赖性细胞毒ADCC活性和/或补体依赖性细胞毒CDC活性。
18.根据权利要求16所述的医药组合物，其中，
抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含引起ADCC和/或CDC活性的降低的变异。
19.根据权利要求18所述的医药组合物，其中，
抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，所述重链恒定区中由EU Index所示的234位和235位亮氨酸被丙氨酸取代。
20.根据权利要求16或17所述的医药组合物，其中，
为包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的重链、和由序列号64所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
21.根据权利要求16、18以及19中任一项所述的医药组合物，其中，
为包含由序列号75的氨基酸编号20～139所述的氨基酸序列形成的重链可变区、和由序列号73的氨基酸编号21～127所述的氨基酸序列形成的轻链可变区的抗体。
22.根据权利要求16、18、19以及21中任一项所述的医药组合物，其中，
为包含由序列号75的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链、和由序列号73的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
23.根据权利要求16、18、19以及21中任一项所述的医药组合物，其中，
为包含由序列号77的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链、和由序列号76的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链的抗体。
24.根据权利要求5～23中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体包括选自由N－连接糖基化、O－连接糖基化、N末端加工、C末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、蛋氨酸的氧化、N末端的蛋氨酸残基的添加、脯氨酸残基的酰胺化以及重链的羧基末端的一个或两个氨基酸残基的缺失构成的组中的一种或两种以上的修饰。
25.根据权利要求24所述的医药组合物，其中，
在抗体的重链的羧基末端缺失一个或几个氨基酸残基。
26.根据权利要求24或25所述的医药组合物，其中，
在抗体的两条重链双方的羧基末端缺失一个氨基酸残基。
27.根据权利要求24～26中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体的重链的羧基末端的脯氨酸残基进一步被酰胺化。
28.根据权利要求1～27中任一项所述的医药组合物，其中，
N297糖链为N297－(Fuc)MSG1。
29.根据权利要求1～28中任一项所述的医药组合物，其中，
m1为整数1。
30.根据权利要求1～29中任一项所述的医药组合物，其中，
抗体―吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数为1～3或3～5。
31.根据权利要求1～30中任一项所述的医药组合物，其中，
PARP抑制剂为奥拉帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕利或者他拉唑帕尼、或它们的药理上可接受的盐。
32.根据权利要求1～31中任一项所述的医药组合物，其特征在于，
在各自不同的制剂中作为有效成分而含有抗体－药物偶联物与PARP抑制剂，抗体－药物偶联物与PARP抑制剂同时或在不同的时间进行给药。
33.根据权利要求1～32中任一项所述的医药组合物，其中，
所述医药组合物用于治疗选自由肺癌、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌癌、子宫体癌、睾丸癌、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌以及它们的转移性形态构成的组中的至少一种癌症，
其中，所述肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌等，所述卵巢癌包括表层上皮性肿瘤、间质性肿瘤、生殖细胞肿瘤等，所述睾丸癌包括精原细胞瘤、非精原细胞瘤。
34.一种癌症的治疗方法，其特征在于，
抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物与PARP抑制剂被组合给药，
所述偶联物由下式表示：
Figure FDA0003279539640000091
或者
Figure FDA0003279539640000092
Figure FDA0003279539640000101
或者
Figure FDA0003279539640000102
或者
Figure FDA0003279539640000103
或、
Figure FDA0003279539640000111
或者
Figure FDA0003279539640000112
在上述所示的各结构式中，m1为整数1或2，
Ab为抗体或该抗体的功能性片段，
N297糖链为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或它们的混合物、或N297－(Fuc)SG，
Figure FDA0003279539640000113
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
N297糖链中的L(PEG)表示*－(CH2CH2－O)3－CH2CH2－NH－，
在此，右端的氨基经由酰胺键与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧或/和1－6链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧酸键合，左端的星号*表示与所述式中的三唑环上的1位或3位氮原子结合。
35.根据权利要求34所述的治疗方法，其特征在于，
抗体与在肿瘤细胞表达的抗原结合，被吞入肿瘤细胞内而内化。
36.根据权利要求34或35所述的治疗方法，其特征在于，
抗体具有抗肿瘤效果。
37.根据权利要求34～36中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体为抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3抗体、抗FAP抗体、抗CDH11抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7－H3抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗体PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4抗体、抗LRRC15抗体、抗DR5抗体、抗CDH3抗体、抗PDPN抗体或抗CD123抗体。
38.根据权利要求34～37中任一项所述的治疗方法，其特征在于，
抗体与CLDN6和/或CLDN9特异性结合。
39.根据权利要求38所述的治疗方法，其中，
抗体包含：含以下的(a)或(b)所述的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重链，和含以下的(a)或(b)所述的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的轻链，
(a)由序列号9所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号10所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号6所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号7所述的氨基酸序列或该氨基酸序列中一个或两个氨基酸被取代的氨基酸序列形成的CDRL3，或，
(b)由序列号15所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号16所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号17所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号13所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号14所述的氨基酸序列形成的CDRL3。
40.根据权利要求39所述的治疗方法，其中，
抗体包含：含以下的(a)或(b)所述的CDRH1、CDRH2以及CDRH3的重链，和含以下的(a)或(b)所述的CDRL1、CDRL2以及CDRL3的轻链，
(a)由序列号9所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号10所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号6所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号7所述的氨基酸序列或由序列号8所述的氨基酸序列形成的CDRL3，或，
(b)由序列号15所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号16所述的氨基酸序列形成的CDRH2以及由序列号17所述的氨基酸序列形成的CDRH3、以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号13所述的氨基酸序列形成的CDRL2以及由序列号14所述的氨基酸序列形成的CDRL3。
41.根据权利要求38～40中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体包含以下的(a)或(b)所述的重链可变区和轻链可变区，
(a)抗体包含由序列号21所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号19所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，或，
(b)抗体包含由序列号25所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号23所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
42.根据权利要求38～41中任一项所述的治疗方法，其中，
包含：由选自由以下的(a)～(e)构成的组中的氨基酸序列形成的重链可变区，和由选自由以下的(f)～(k)构成的组中的氨基酸序列形成的轻链可变区，
(a)序列号54所述的氨基酸序列，
(b)序列号58所述的氨基酸序列，
(c)序列号62所述的氨基酸序列，
(d)对于(a)～(c)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，
(e)在(a)～(c)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列中、缺失一个或几个氨基酸、取代一个或几个氨基酸或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列，
(f)序列号38所述的氨基酸序列，
(g)序列号42所述的氨基酸序列，
(h)序列号46所述的氨基酸序列，
(i)序列号50所述的氨基酸序列，
(j)对于(f)～(i)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列，以及，
(k)在(f)～(i)的序列中各CDR序列以外的框架区的序列中、缺失一个或几个氨基酸、取代一个或几个氨基酸或添加一个或几个氨基酸而成的氨基酸序列。
43.根据权利要求42所述的治疗方法，其中，
抗体包含选自由以下的(a)～(e)构成的组中的重链可变区和轻链可变区，
(a)由序列号54所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号38所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，
(b)由序列号58所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号42所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，
(c)由序列号54所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号46所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，
(d)由序列号58所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号50所述的氨基酸序列形成的轻链可变区所构成的轻链可变区，以及，
(e)由序列号62所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号46所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
44.根据权利要求38～43中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体为嵌合抗体。
45.根据权利要求38～43中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体为人源化抗体。
46.根据权利要求38～45中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体包含人IgG1、人IgG2或人IgG4的重链恒定区。
47.根据权利要求45或46所述的治疗方法，其中，
包含选自由以下的(a)～(e)构成的组中的重链和轻链，
(a)由序列号52的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号36的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，
(b)由序列号56的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号40的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，
(c)由序列号52的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号44的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，
(d)由序列号56的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号48的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链，以及，
(e)由序列号60的氨基酸编号20～471所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号44的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
48.根据权利要求38所述的治疗方法，其中，
抗体与权利要求39～43以及47中任一项所述的抗体、在与CLDN6和/或CLDN9的结合上进行竞争，或抗体与权利要求39～43以及47中任一项所述的抗体所识别的CLDN6和/或CLDN9上的部位结合。
49.根据权利要求34～37中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体与HER2特异性结合。
50.根据权利要求49所述的治疗方法，其中，
具有抗体依赖性细胞毒ADCC活性和/或补体依赖性细胞毒CDC活性。
51.根据权利要求49所述的治疗方法，其中，
抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含引起ADCC和/或CDC活性的降低的变异。
52.根据权利要求51所述的治疗方法，其中，
抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，所述重链恒定区中由EU Index所示的234位和235位亮氨酸被丙氨酸取代。
53.根据权利要求49或50所述的治疗方法，其中，
抗体包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号64所述的氨基酸序列形成的轻链。
54.根据权利要求49、51以及52中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体包含由序列号75的氨基酸编号20～139所述的氨基酸序列形成的重链可变区和由序列号73的氨基酸编号21～127所述的氨基酸序列形成的轻链可变区。
55.根据权利要求49、51、52以及54中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体包含由序列号75的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号73的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
56.根据权利要求49、51、52以及54中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体包含由序列号77的氨基酸编号20～469所述的氨基酸序列形成的重链和由序列号76的氨基酸编号21～234所述的氨基酸序列形成的轻链。
57.根据权利要求38～56中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体包括选自由N－连接糖基化、O－连接糖基化、N末端加工、C末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、蛋氨酸的氧化、N末端的蛋氨酸残基的添加、脯氨酸残基的酰胺化以及重链的羧基末端的一个或两个氨基酸残基的缺失构成的组中的一种或两种以上的修饰。
58.根据权利要求57所述的治疗方法，其中，
在抗体的重链的羧基末端缺失一个或几个氨基酸残基。
59.根据权利要求57或58所述的治疗方法，其中，
在抗体的两条重链双方的羧基末端缺失一个氨基酸残基。
60.根据权利要求57～59中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体的重链的羧基末端的脯氨酸残基进一步被酰胺化。
61.根据权利要求34～60中任一项所述的治疗方法，其中，
N297糖链为N297－(Fuc)MSG1。
62.根据权利要求34～61中任一项所述的治疗方法，其中，
m1为整数1。
63.根据权利要求34～62中任一项所述的治疗方法，其中，
抗体―吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数为1～3或3～5。
64.根据权利要求34～63中任一项所述的治疗方法，其中，
PARP抑制剂为奥拉帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕利或者他拉唑帕尼、或它们的药理上可接受的盐。
65.根据权利要求34～64中任一项所述的治疗方法，其中，
所述治疗方法用于治疗选自由肺癌、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌癌、子宫体癌、睾丸癌、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌以及它们的转移性形态构成的组中的至少一种癌症，其中，所述肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌等，所述卵巢癌包括表层上皮性肿瘤、间质性肿瘤、生殖细胞肿瘤等，所述睾丸癌包括精原细胞瘤、非精原细胞瘤。
66.一种医药组合物，其包含用于与PARP抑制剂联用的权利要求1所述的抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物。
67.一种医药组合物，其包含PARP抑制剂，通过与权利要求1所述的抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物联用，使该偶联物的作用上升。
68.一种医药组合物，其包含用于与权利要求1所述的抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物联用的PARP抑制剂。
69.一种医药组合物，其包含权利要求1所述的抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物，通过与PARP抑制剂联用，使PARP抑制剂的作用上升。
70.根据权利要求1所述的医药组合物，其中，
所述吡咯并苯并二氮杂卓衍生物在DNA的小沟中未形成交联。
71.根据权利要求1所述的医药组合物，其中，
癌症对PARP抑制剂为非敏感性。
72.根据权利要求1所述的医药组合物，其中，
癌症不依赖于同源重组HR依赖性DNA双链断裂DSB修复途径。
73.根据权利要求34～64中任一项所述的治疗方法，其特征在于，
在各自不同的制剂中作为有效成分而含有权利要求1所述的抗体－药物偶联物与PARP抑制剂，抗体－药物偶联物与PARP抑制剂同时或在不同的时间进行给药。
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