KR20140139480A - 항체-약물 접합체 및 관련 화합물, 조성물, 및 방법 - Google Patents

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이제니카 바이오테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

항체-세포독소 항체-약물 접합체 및 관련 화합물, 예컨대 링커-세포독소 접합체 및 이들을 제조하는데 사용된 링커, 튜부리신 유사체 및 그의 합성에서의 중간체; 조성물; 및 암 치료 방법을 포함하는 방법.

Description

항체-약물 접합체 및 관련 화합물, 조성물, 및 방법 {ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND RELATED COMPOUNDS, COMPOSITIONS, AND METHODS}
본 발명은 항체-약물 접합체 (Antibody-Drug Conjugate; ADC), 및 관련 화합물, 예컨대 이를 제조하는데 사용된 링커, 튜부리신 유사체, 및 그의 합성에서의 중간체; 조성물; 및 암 치료 방법을 비롯한 방법에 관한 것이다.
암은 미국에서 두번째로 가장 만연된 사망 원인이나, 수술 절제를 넘어서는 효과적인 치료 옵션은 많지 않다. 의료적 암 치료법 중에서, 암 세포에 존재하는 항원을 표적하는 모노클로날 항체를 사용하는 일이 흔해졌다. 미국에서 치료 용도로 승인된 항암 항체에는, 만성 림프구성 백혈병 치료에 사용되는 인간화 항-CD52 항체인 알렘투주마브 (alemtuzumab) (CAMPATH®); 직장결장암에 사용되는 인간화 항-VEGF 항체인 베바시주마브 (bevacizumab) (AVASTIN®); 직장결장암, 두경부암 및 편평세포암종에 사용되는 키메라 항-표피 성장 인자 항체인 세툭시마브 (cetuximab) (ERBITUX®); 흑색종에 사용되는 인간 항-CTLA-4 항체인 이필리무마브 (ipilimumab) (YERVOY®); 만성 림프구성 백혈병에 사용되는 항-CD20 항체인 오파투무마브 (ofatumumab) (ARZERRA®); 직장결장암에 사용되는 인간 항-표피 성장 인자 수용체 항체인 파니투무마브 (panitumumab) (VECTIBIX®); 비(非)호지킨 림프종에 사용된 키메라 항-CD20 항체인 리툭시마브 (rituximab) (RITUXAN®); 비호지킨 림프종에 사용되는 쥣과동물 항-CD20 항체인 토시투모마브 (tositumomab) (BEXXAR®); 및 유방암에 사용되는 인간화 항-HER2 항체인 트라스투주마브 (trastuzumab) (HERCEPTIN®) 가 있다. 이들 항체는 이들이 권고되는 암 치료에서 유용한 것으로 입증된 바 있으나, 단일 제제로서는 치유력이 뒤떨어지고, 일반적으로 표준 암 화학요법과 조합되어 사용된다.
예로서, 트라스투주마브는, 인간 표피 성장 인자 수용체 2 단백질 HER2 (ErbB2) 의 세포외 도메인에 높은 친화력으로 선택적으로 결합해 HER2-양성 암 세포의 성장을 저해하는 재조합 DNA-유래의 인간화 모노클로날 항체이다 (Coussens et　al., Science 1985, 230, 1132-9; Salmon et　al., Science 1989, 244, 707-12).
HERCEPTIN 은, 광범위한 사전 항암치료를 받은 HER2-과발현 유방암 환자를 치료하는데 유용하나, 이 집단에서의 일부 환자들은 HERCEPTIN 치료에 차도를 보이지 않거나, 또는 단지 열악하게만 차도를 보인다. 따라서, HERCEPTIN 치료로도 차도를 보이지 않거나 또는 열악하게 차도를 보이는, HER2-과발현 종양이 있거나 또는 HER 발현과 관계된 기타 질병을 앓는 환자에게서는, 추가적인 HER2-유도 암 치료법 개발에 대한 상당한 임상적 요구가 있다.
빠르게 성장 중인 표적화 치료법 부류인 항체 약물 접합체 (ADC) 는 암 약물의 세포독성 활성과 선택성 양자 모두를 개선시키는 촉망되는 새로운 접근법에 해당한다. 예를 들어, 문헌 [Trail et　al., "Monoclonal antibody drug immunoconjugates for targeted treatment of cancer", Cancer Immunol. Immunother. 2003, 52, 328-337; and Chari, "Targeted Cancer Therapy: Conferring Specificity to Cytotoxic Drugs", Acc. Chem. Res., 2008, 41(1), 98-107] 참조. 이들 ADC 는 3 종의 성분을 갖는다: (1) 모노클로날 항체가 (2) 링커를 통해 (3) 세포독소에 접합된다. 세포독소는 항체 상의 리신 또는 시스테인 측쇄와, 리신 상 1차 아민과 선택적으로 반응하거나 또는 시스테인 상 술프히드릴기와 선택적으로 반응하는 링커를 통해 부착된다. 접합될 수 있는 링커/약물의 최대 수는 항체 상에 존재하는 반응성 아미노 또는 술프히드릴기의 개수에 의존한다. 전형적인 항체는 90 개 이하의 리신을 잠재적인 접합부로서 함유한다; 그러나, 대부분의 ADC 에 있어서 항체 당 세포독소의 최적 개수는, ADC 의 그보다 많은 수의 세포독소와의 응집으로 인해 2 내지 4 이다. 결과적으로, 현재 임상 개발에서 통상적인 리신 링크된 ADC 는 항체 상 상이한 아미노기에 접합된 세포독소를 항체 당 0 내지 10 개의 포함하는 이종 혼합물이다. ADC 의 성공의 핵심 요소는, 모노클로날 항체가 암 항원에 특이적이고, 비(非)면역원성이며 독성이 낮고 암 세포에 의해 내부화되며; 링커가 시스테인 (S) 또는 리신 (N) 결합에 특이적이면서, 순환에 있어서 안정적이고, 프로테아제에 절단가능하며, 및/또는 pH 민감성으로, 세포독소로의 부착에 적합하고; 세포독소는 매우 효력 (potency) 이 크고, 링커 부착에 적합한 것이다.
미국에서 치료 용도로 승인된 항암 ADC 에는, 역형성 큰세포 림프종 및 호지킨스 림프종에 사용된 모노메틸아우리스타틴 E 에 접합된 키메라 항-CD30 항체인 브렌툭시마브 베도틴 (brentuximab vedotin) (ADCETRIS®); 및 급성 골수성 백혈병에 사용된 칼리케아마이신γ에 접합된 인간화 항-CD33 항체인 겜투주마브 오조가마이신 (gemtuzumab ozogamicin) (MYLOTARG®) (이는 2010 년에 효능 부족으로 철회됨) 이 있다.
몇몇의 ADC 가 최근 임상적 성공을 입증한 바 있으나, 현재 개발중인 대부분의 ADC 는 번거로운 합성 프로세스에 의해 그 실용성이 제한적일 수 있고, 즉 고비용의 제품, 세포독성 약물의 제한된 효력과 연계되는 불충분한 항종양 활성 및 링커 불안정성 및 ADC 이종성으로 인한 미심쩍은 안전성이 야기될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ducry et　al., "Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies", Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13; Chari, "Targeted Cancer Therapy: Conferring Specificity to Cytotoxic Drugs", Acc. Chem. Res. 2008, 41, 98-107; and Senter, "Recent advancements in the use of antibody drug conjugates for cancer therapy", Biotechnol.: Pharma. Aspects, 2010, 11, 309-322.
예로서, 트라스투주마브는 메이탄시노이드 약물 머탄신 (mertansine) 에 접합되어 소위 트라스투주마브-DM1 또는 트라스투주마브-MD-DM1 (T-DM1 으로서 약칭) 로 불리우는 ADC 트라스투주마브 엠탄신 (emtansine) 을 형성한다 (LoRusso et　al., "Trastuzumab Emtansine: A Unique Antibody-Drug Conjugate in Development for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Cancer", Clin. Cancer Res. 2011, 17, 6437-6447; Burris et　al., "Trastuzumab emtansine: a novel antibody-drug conjugate for HER2-positive breast cancer", Expert Opin. Biol. Ther. 2011, 11, 807-819). 이것은 현재 상기 필요 조치로 미국에서 제 III 상 연구에 있다. 머탄신은 말레이미도카프로일 (MC) 링커를 통해 트라스투주마브에 접합되는데, 이때 상기 링커는 그의 말레이미드에서 머탑신 측쇄의 4-티오발레르산 말단에 결합되고, 링커의 카르복실기와 트라스투주마브의 리신 염기성 아민 사이에서는 아미드 결합을 형성한다. 트라스투주마브는 88 개의 리신 (및 32 개의 시스테인) 을 갖는다. 결과적으로, 트라스투주마브 엠타신은 평균 머탄신/트라스투주마브 비율이 3.4 인, 트라스투주마브 당 0 내지 8 개의 머탄신 단위를 포함하는 수십의 상이한 분자를 포함하는 고 이종성이다.
항체 시스테인이 또한 말레이미드 또는 기타 티올 특이적 작용기를 포함하는 링커를 통한 세포독소와의 접합에 사용될 수 있다. 전형적인 항체는 생체 내 항체 안정성에 기여하고 서로 중쇄 및 경쇄를 공유 결합하는 4 개 또는 때때로 5 개의 (중쇄 사이 2 개, 및 중쇄와 경쇄 사이 2 개) 쇄 간 디술파이드 결합을 포함한다. 이들 쇄간 디술파이드는 디티오트레이톨, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀, 또는 기타 약 환원제로 선택적으로 환원될 수 있어 접합을 위한 8 종의 반응성 술프히드릴기를 제공할 수 있다. 시스테인 링크된 ADC 는 리신 링크된 ADC 보다 잠재적인 접합부가 보다 소수이기 때문에 이종성이 덜하나; 이들은 또한 현 시스테인 링커가 오로지 하나의 황 원자에만 결합하므로, 접합 동안 쇄간 디술파이드 결합의 부분적인 손실이 야기되어 안정성이 덜한 경향도 있다. 시스테인 링크된 ADC 에 있어서, 항체 당 세포독소의 최적 개수는 또한 2 내지 4 이다. 예를 들어, ADCETRIS 는 시스테인을 통해 접합된 항체 당 0 내지 8 개의 모노메틸아우리스타틴 E 잔기를 포함하는 이종성 혼합물이다.
믹소박테리아 배양물로부터 Hoefle/Reichenbach 기에 의해 맨먼저 단리된 튜부리신 (tubulysin) (Sasse et　al., J. Antibiot. 2000, 53, 879-885) 은 튜불린 중합을 억제해 작용하고 이로써 아폽토시스를 유도하는 특출나게 효력이 있는 세포-성장 저해제이다. (Khalil et　al., Chem. Biochem. 2006, 7, 678-683; and Kaur et　al., Biochem. J. 2006, 396, 235-242). 튜부리신 (이 중 튜부리신 D 가 가장 효력이 강력함) 은, 에포틸론, 빈블라스틴 및 파클리탁셀 (TAXOL®) 을 포함하는 대부분의 기타 튜불린 개질제를 10 내지 1000 배 능가하는 활성을 갖는다 (Steinmetz et　al., Angew. Chem. 2004, 116, 4996-5000; Steinmetz et　al., Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4888-4892; and Hoefle et　al., Pure App. Chem. 2003, 75,167-178). 파클리탁셀 및 빈블라스틴이 각종 암에 대한 현 치료제이며, 에포틸론 유도체는 임상 시도에서 유효 평가 하에 있다. 튜부리신 D 의 합성 유도체는 저해 메카니즘 및 핵심적인 결합 상호작용에 관한 필수적인 정보를 제공할 것이며, 단리된 독립체로서 또는 표적 항체 또는 리간드에 대한 화학적 탄두로서 항암제로서의 우수한 특성을 가질 수 있을 것이다.
튜부리신 D 는 하기 식에 나타낸 바와 같이, 4 영역, 즉 Mep (d-N-메틸피페콜린산), Ile (이소류신), Tuv (투부발린), 및 Tup (투부페닐알라닌) 으로 나뉠 수 있는 복합 테트라펩티드이다:
Figure pct00001
튜부리신 D 를 포함해, 대부분의 튜부리신의 보다 효력이 강력한 유도체는 흥미로운 O-아실 N,O-아세탈 작용기가 혼입되어 있는데, 이는 자연 생성물에서는 드물게 관찰되는 것이다. 이러한 반응성 작용기는 산성 및 염기성 반응 조건 하 모두에서 불안정하고, 따라서 이는 튜부리신의 작용에서 핵심 역할을 할 수 있다 (Iley et　al., Pharm. Res. 1997, 14, 1634-1639). 최근, O-아실 N-O-아세탈 작용기를 혼입하는 임의의 멤버의 튜부리신 패밀리의 제 1 합성을 나타내는 튜부리신 D 의 전체 합성이 보고되었다 (Peltier et　al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 16018-16019). 튜부리신 U 및 V 를 포함한 기타 튜부리신이 Doemling et　al. ["Total Synthesis of Tubulysin U and V" Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7235-7239] 에 의해 합성된 바 있다.
미국 특허 출원 공보 US　2011/0021568　A1 (Ellman et　al.) 는, 본원에서 T1 및 T2 로 각각 지칭되는 화합물 (40) 및 (10) 을 포함하는 다수의 튜부리신 유사체의 합성 및 활성을 개시하고 있다:
Figure pct00002
문헌, [Schumacher et　al., "In Situ Maleimide Bridging of Disulfides and a New Approach to Protein PEGylation", Bioconjugate Chem. 2011, 22, 132-136] 는, 3,4-비스(2-히드록시에틸술파닐)피롤-2,5-디온 [Schumacher et　al 는 "디메라캅토에탄올말레이미드"로 지칭] 및 3,4-비스(페닐술파닐)피롤-2,5-디온 ["디티오페놀말레이미드"] 및 소마토스타틴에 대한 PEG화제로서의 상기의 N-PEG화 유도체 (이때, 치환된 말레이미드는 개방된 (opened) 시스테인-시스테인 디술파이드 결합의 2 개의 황 원자에 결합함) 과 같은 3,4-디치환된 말레이미드의 합성을 개시한다.
효력이 있는 동종성 ADC, 이를 포함하는 조성물 및 이의 암 치료에서의 사용 방법 및 이의 제조 방법 및 그 제조에서의 중간체를 개발하는 것이 요망될 것이다.
본 발명의 개요
제 1 측면에서, 본 발명은 하기 식의 항체-세포독소 항체-약물 접합체 (ADC) 이다:
Figure pct00003
[식 중,
A 는 항체이고,
PD 는 피롤-2,5-디온 또는 피롤리딘-2,5-디온이고,
이중 결합은 피롤-2,5-디온 또는 피롤리딘-2,5-디온의 3- 및 4-위치와, 항체 내 개방 시스테인-시스테인 디술파이드 결합의 2 종의 황 원자와의 결합을 나타내고,
L 은 -(CH2)m- 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 이고,
CTX 는 아미드 결합에 의해 L 에 결합된 세포독소이고,
n 은 1 내지 4 의 정수이고,
m 은 1 내지 12 의 정수임].
항체 내 개방 시스테인-시스테인 디술파이드 결합의 2 종 황 원자와의 PD 의 바이덴테이트 결합으로 인해, 이들 ADC 는 동종성이고, 모노덴테이트 링커를 갖는 ADC 보다 증강된 안정성을 가진다. 따라서, 이들은 생체 내 반감기가 증가될 것이고, 이로써 전신 방출된 세포독소 양이 감소되어, 모노덴테이트 링커를 갖는 ADC 보다 더 안전할 것이다.
제 2 측면에서, 본 발명은 제 1 측면의 본 발명의 ADC 를 포함하는 약학적 조성물이고; 제 3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 측면의 ADC 를 또는 본 발명의 제 2 측면의 약학적 조성물을 투여함으로써 관련 항체에 의해 표적되는 암 치료 방법이다.
제 4 측면에서, 본 발명은 하기 식 A, 식 B 및 식 C 의 링커-세포독소 접합체이다:
Figure pct00004
[식 중, R 은 할로 또는 히드록실로 임의 치환된 C1-6　알킬; 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 페닐; 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 나프틸; 또는 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 2-피리딜이고,
L 은 -(CH2)m- 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 이고,
CTX 는 아미드 결합에 의한 L 과 결합된 세포독소이고, 및
m 은 1 내지 12 의 정수임].
이들 바이덴테이트 링커-세포독소 접합체는 본 발명의 제 1 측면의 항체-약물 접합체 제조에 유용하다.
제 5 측면에서, 본 발명은 하기 식 AA, BB, 및 CC 의 링커이다:
Figure pct00005
[식 중, R 은 할로 또는 히드록실로 임의 치환된 C1-6　알킬; 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 페닐; 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 나프틸; 또는 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 2-피리딜이고,
L 은 -(CH2)m- 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 이고,
Z 는 카르복실, C1-6　알콕시카르보닐, 또는 아미노이고, 및
m 은 1 내지 12 의 정수임].
이들 바이덴테이트 링커는 본 발명의 제 4 측면의 링커-세포독소 접합체 제조에 유용하다.
제 6 측면에서, 본 발명은 하기 식 AAA, BBB, 및 CCC 의 링커이다:
Figure pct00006
[식 중, R' 은 클로로, 브로모, 요오도, C1-6　알킬술포닐옥시, 트리플루오로메탄술포닐옥시, 벤젠술포닐옥시, 또는 4-톨루엔술포닐옥시이고,
L 은 -(CH2)m- 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 이고,
Z 는 카르복실, C1-6　알콕시카르보닐, 또는 아미노이고, 및
m 은 1 내지 12 의 정수임].
이들 바이덴테이트 링커는 또한 본 발명의 제 4 측면의 링커-세포독소 접합체 제조에 유용하고, 본 발명의 제 5 측면의 링커 제조에 유용하다.
제 7 측면에서, 본 발명은 하기 식 T3 및 T4 의 식의 튜부리신이다:
Figure pct00007
이들 새로운 튜부리신은 앞서 지칭된 공지의 튜부리신 T1 및 T2 의 유사체이나, 말단 N-메틸피레리딘이 비치환된 피페리딘에 의해 대체되어 있기 때문에, 이들 새로운 화합물은 링커 카르복시기의 카르보닐과 피페리딘 질소 원자와의 아미드 결합을 형성함으로써 카르복실기를 포함하는 링커를 갖는 튜부리신-링커 접합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 제출된 바와 같은 본 출원의 제 1 항 내지 제 47 항의 특성 및 상응 약학적 조성물, 방법 및 이들 화합물의 용도의 특성에 의해, 및 상세한 설명에 의해 특성화된다.
정의
면역글로불린으로서 공지되기도 한 "항체"는 박테리아 및 바이러스 등의 외래 대상체를 동정하고 중화하기 위해 면역계에 의해 사용되는 대형의 Y-형 단백질이다. 항체의 "Y" 의 각 첨단은 항원부에 특이적인 부위를 포함해 이들 두 구조가 그에 정확히 결합하게 되므로, 항체는 항원으로 불리우는 외래 표적의 독특한 부분을 인지한다. 항체는 2 종의 동일한 중쇄 및 2 종의 동일한 경쇄가 시스테인 디술파이드 결합에 의해 연결되어 있는 4 종의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. "모노클로날 항체"는, 모든 항체 분자가 독특한 부모 세포의 모든 클론인 동일 면역 세포들에 의해 만들어지 때문에 동일한 1특이적 항체이다. 당초, 모노클로날 항체는 원하는 항원으로 면역화된 바 있는 마우스의 비장 세포와 (또는 래빗의 B 세포) 골수종 세포를 융합한 다음, 친화도 정제와 같은 기술로써 생성 하이브리도마를 정제함으로써 제조되는 것이 전형적이다. 재조합 모노클로날 항체는 마우스에서보다는 레퍼토리 클로닝 또는 파아지 디스플레이/효모 디스플레이로서 지칭되는 기술을 통해 바이러스 또는 효모 세포에서 제조되는데, 이때 상기 면역글로불린 유전자 분절의 클로닝으로 약간 상이한 아미노산 서열을 가진 항체의 라이브러리 (이로부터, 원하는 특이성을 가진 항체가 수득될 수 있음 ) 가 제조된다. 이로써 생성된 항체는 발효에 의해 대규모로 제조될 수 있다. "키메라" 또는 "인간화" 항체는 모노클로날 항체의 결합부를 인코딩하는 마우스 DNA 가 인간 항체-생성 DNA 와 합쳐져 부분-마우스, 부분-인간 모노클로날 항체를 생성시키는 것과 같이, 재조합 프로세스에서 사용된 본래 (통상 마우스) 및 인간 DNA 서열의 조합을 포함하는 항체이다. 완전-인간화 항체는 트랜스제닉 마우스 (인간 항체 제조를 위해 조작됨) 또는 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용해 제조된다. 본 발명에서 특히 관심 있는 항체는 암 항원에 특이적이고, 비면역원성이며, 낮은 독성을 지니고, 암 세포에 의해 손쉽게 내부화되는 것으로서; 적합한 항체에는 알렘투주마브, 베바시주마브, 브렌툭시마브 (brentuximab), 세툭시마브, 겜투주마브 (gemtuzumab), 이필리무마브, 오파투무마브, 파니투무마브, 리툭시마브, 토시투모마브, 및 트라스투주마브가 포함된다.
"세포독소"는 암 세포 내 방출시, 그 세포에 독성인 분자이다. 본 발명에서 특히 관심 있는 세포독소는 튜부리신 (예, 식 T3 및 T4 의 튜부리신), 아우리스타틴 (예, 모노메틸아우리스타틴 E 및 모노메틸아우리스타틴 F), 메이탄시노이드 (예, 머탄신), 칼리케아마이신 (예, 칼리케아마이신 γ) 으로; 특히, 염기성 아민 또는 카르복실기 보유에 의한 바와 같이, 링커와의 아미드 결합을 통해 배위 가능한, 식 T3 및 T4 의 튜부리신과 같은 세포독소이다.
"링커"는 하나는 항체와의 접합을 위한 것이고, 나머지 하나는 세포독소와의 접합을 위한 2 종의 반응성 말단을 갖는 분자이다. 링커의 항체 접합 반응성 말단은, 전형적으로 항체 상 시스테인 티올 또는 리신 아민기를 통해 항체에 접합할 수 있는 부위로, 전형적으로 티올-반응성기, 예컨대 이중 결합 (말레이미드 내에서와 같음), 또는 이탈기, 예컨대 클로로, 브로모 또는 요오도, 또는 R-술파닐기, 또는 아민-반응성기, 예컨대 카르복실기가 그러하고; 한편, 링커의 항체 접합 반응성 말단은 전형적으로 세포독소 상 염기성 아민 또는 카르복실 기와의 아미드 결합 형성을 통해 세포독소에 접합 가능한 부위로, 전형적으로는 카르복실 또는 염기성 아민기가 그러하다. 용어 "링커"를 접합 형태의 링커를 기술하는데 사용하는 경우, 링커 및/또는 세포독소 사이의 결합 형성으로 인해, 반응성 말단의 한쪽 또는 양쪽은 존재하지 않을 수 있거나 (예, 티올-반응기의 이탈기) 또는 불완전할 것이다 (예, 오직 카르복실산의 카르보닐).
"항체-약물 접합체" 또는 "ADC" 는 하나 이상 (전형적으로 1 내지 4) 의 세포독소에 각각 링커를 통해 접합된 항체이다. 항체는 전형적으로 암 항원에 특이적인 모노클로날 항체이다.
"튜부리신" 은 관련 기술의 설명에서 언급된 Sasse et　al 및 기타 작가에 의해서와 같은, 튜부리신으로서 기재된 천연 생성물, 나아가 US 특허 출원 공보 제 US 2011/0021568　A1 호에서 기술된 튜부리신 유사체 모두를 포함한다. 본 발명에서 특히 관심 있는 튜부리신은 식 T3 및 T4 의 튜부리신과, 말단 N-메틸피페리딘이 비치환된 피페리딘에 의해 대체되어 링커와의 아미드 결합을 허용하는 기타 튜부리신이다.
식 T3 및 T4 의 튜부리신의 말단 피페리딘기의 일부를 형성하는 아민과 같은 "염기성 아민"은 아미드의 일부가 아닌 1차 또는 2차 아민이다.
"치료적 유효량"은 암을 앓고 있는 인간에게 투여시 암 치료를 도모하기에 충분한, 본 발명의 제 1 측면의 ADC, 또는 본 발명의 제 2 측면의 조성물의 양을 의미한다. 암을 "치료하는 것" 또는 암의 "치료"는 하기 중 하나 이상을 포함한다:
(1) 암 성장을 제한/저해하는 것, 즉 그의 발달을 제한하는 것;
(2) 암이 퍼지는 것을 감소/막는 것, 즉 전이 감소/방지;
(3) 암을 완화시키는 것, 즉 암의 퇴화를 도모하는 것,
(4) 암의 재발을 감소/막는 것; 및
(5) 암의 증상을 완화하는 것.
치료 대상의 관심 암에는 이에 제한되는 것은 아니나 하기가 포함된다: 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프구암. 이러한 암의 보다 특별한 예에는 하기가 포함된다: 상피 세포 암 (예, 편평 상피 세포 암), 폐암, 예컨대 소세포 폐암, 비(非)소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막 암, 간세포 암, 위장 또는 위 암, 예컨대 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 경구암, 간 암, 방광암, 요로암, 간암, 유방암, 예컨대 HER2-양성 유방암, 결장암, 직장암, 직장결장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 다발 골수종 및 B-세포 림프종, 뇌암, 두경부 암, 및 이의 관련 전이.
축약어/약어
ADC: 항체-약물 접합체; DEA: 디에틸아민; DCC: 1,3-디시클로헥실카르보디이미드; DIAD: 디이소프로필 아조디카르복실레이트; DIPC: 1,3-디이소프로필카르보디이미드; DIPEA: 디이소프로필에틸아민; DMF: N,N-디메틸포름아미드; DPBS: Dulbecco 인산완충액; DTPA: 디에틸렌트리아민펜타아세트산; DTT: 디티오트레이톨; EDC: 에틸 3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드; HATU: O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트; HOBT: N-히드록시벤조트리아졸; NHS: N-히드록시숙신이미드; NMM: N-메틸모르폴린; MMAE: 모노메틸아우리스타틴 E; MMAF: 모노메틸아우리스타틴 F, 모노메틸아우리스타틴 페닐알라닌; MC: 말레이미도카프로일, 6-(2,5-디옥소프롤릴)헥사노일; PBS: 인산완충액; PEG: 폴리(에틸렌글리콜); TBTU: 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트; TCEP: 트리스(2-카르복시에틸)포스핀; TGI: 종양 성장 저해.
본 발명의 ADC
관련 기술 설명서에 언급된 바, 항체의 시스테인 티올과 배위 결합하는 종래 기술의 ADC 는 1작용성 링커를 이용하며, 이들 중 MC 링커가 그 예이다. 접합을 위한 자유 티올을 제공하는 시스테인-시스테인 디술파이드 결합의 환원 및 개방은 항체의 안정성을 감소시키고, 환원된 티올의 반응에 의한 ADC 의 형성은 하기 도식에서 예시되는 바와 같이 결합을 다시 형성하지 않는다.
Figure pct00008
그러나, 본 발명의 2작용성 피롤-2,5-디온- 및 피롤리딘-2,5-디온-기재 링커는 개방된 시스테인-시스테인 디술파이드 결합의 2 개의 황 원자와 반응하는 2 개의 반응성 작용기 (하기 반응식에서 X) 를 포함한다. 2 개의 시스테인과의 2작용성 링커의 반응은 하기 반응식에 나타낸 바와 같이, 2 개의 티오에테르 결합을 통해 연결된 디술파이드 당 1 개의 링커와의 "스테이플식 (stapled)" 디티오숙신이미드 또는 디티오말레이미드 항체 접합체를 제공한다 (고리 내 이중 결합 부재: 식 AA 및 AAA 의 숙신이미드 링커; 고리 내 존재하는 이중 결합: 식 BB 및 BBB 의 말레이미드 결합):
Figure pct00009
시스테인 접합에 대한 통상적인 방법과는 달리, 상기 반응은 2 개의 시스테인 황 원자 사이에 공유 결합된 구조를 재형성시키고, 따라서 항체의 전반적인 안정성을 양보하지 않는다. 상기 방법은 또한 반응성 시스테인 전부가 사용되기 때문에 항체 당 최적 4 종의 약물의 접합을 가능하게 하여 동종성 ADC 를 제공한다. 종합적인 성과는, 시스테인 사이에서 안정적인 "스테이플"로, 비교적 불안정한 디술파이드가 대체된 것이다. 말레이미드의 이중 결합은 X 기 및 시스테인 황 원자 중 하나와 나머지 하나와의 접합을 가능하게 하기 때문에, 항체와 접합된 모노치환된 말레이미드 링커 (식 CC 및 CCC) 도 또한 효과적인 2작용성이다.
본 발명의 화합물의 제조
ADC, 링커-세포독소 접합체, 링커 및 튜부리신 등의 본 발명의 화합물은 유기 및 생유기 화학의 통상 방법에 의해 제조된다. 예를 들어, 문헌 [Larock, "Comprehensive Organic Transformations", Wiley-VCH, New York, N.Y., U.S.A.] 참조. 적합한 보호기 및 그의 첨가 및 제거법은 적절히 문헌 [Greene et　al., "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., 1991, John Wiley and Sons, New York, NY, US] 에 기재되어 있다. 링커 합성에 대해 앞서 언급된 Schumacher et al 문헌, 튜부리신의 제조에 대해서는 US 특허 출원 공보 US 2011/0021568　A1 등과 같이 출원서에 언급된 문헌이 또한 인용될 수 있다.
튜부리신의 제조
튜부리신 T3 및 T4 는 Peltier et　al. 및 US 특허 출원 공보 US 2011/0021568　A1 의 것과 유사한 방법에 의해, D-피페콜린산을 D-N-메틸피페콜린산에 대해 치환하고 적절한 경우 탈보호화하여 제조한다.
링커의 제조
비교 MC 링커는 이의 제조를 위해 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 링커는 하기와 같이 Schumacher et　al. 의 것과 유사한 방법에 의해 제조된다 (이 반응식에서, R, L 및 Z 는 상기 본 발명의 제 5 및 제 6 측면의 논의에서 주어진 의미를 지님):
Figure pct00010
2,3-디브로모말레이미드, 1 당량 및 염기, 예컨대 중탄산나트륨, 약 5 당량을 메탄올 중에 용해하고, 1 당량보다 약간 많은 2-피리딘티올의 메탄올 중 용액을 첨가한다. 반응물을 15 분 동안 주위 온도에서 교반한다. 용매를 진공 하 제거하고, 잔류물을 실리카 겔 상 (페트롤륨 에테르: 에틸 아세테이트, 구배 용리 9:1 → 7:3) 플래시 크로마토그래피에 의해서와 같이 정제해 3,4-비스(2-피리딜술파닐)피롤-2,5-디온을 수득한다.
3,4-비스(2-피리딜술파닐)피롤-2,5-디온의 측쇄와의 커플링은 엄격하게 건조 조건 하 수행한다. 테트라히드로푸란 및 디클로로메탄의 혼합물 중 3,4-비스(2-피리딜술파닐)피롤-2,5-디온 (1　당량) 및 트리페닐포스핀 (1 당량) 에, DIAD (1 당량) 을 -78 ℃ 에서 적가한다. 반응물을 5 분 동안 교반하고, 디클로로메탄 중 측쇄 (0.5 당량) 를 적가한다. 5 분간의 교반 후, 테트라히드로푸란 및 디클로로메탄 중 네오펜틸 알코올 (1 당량) 을 첨가하고, 추가 5 분 동안 교반한 다음 3,4-비스(2-피리딜술파닐)피롤-2,5-디온 (1 당량) 을 첨가하고, 또 다른 5 분 동안 교반한다. 반응물을 주위 온도로 20 시간 동안 교반과 함께 가온되게 한 다음, 용매를 진공 하 제거한다. 잔류물을, 실리카 겔 상 플래시 크로마토그래피에 의해서와 같이 (메탄올:디클로로메탄, 구배 용리 0 - 10% 메탄올) 정제해, 링커를 수득한다. 측쇄를 보호된 형태로 이용할 수 있고, 적절한 경우 Mitsunobu 반응에 따라 탈보호화할 수 있다.
대안적으로, 측쇄 (적절한 경우, 임의로는 보호화됨) 는 Mitsunobu 커플링에 의해 3,4-디브로모말레이미드에 커플링될 수 있고; 생성 화합물은 앞 2 문단에서 기술된 합성과 반대로; 염기의 존재 하 R-티올과의 반응에 의한 디술파이드 교환을 위해 활성화된다.
유사 방법이, 2,3-디브로모숙신이미드로 출발함으로써 상기 나타낸 피롤-2,5-디온 모이어티 보다는 피롤리딘-2,5-디온 모이어티를 포함하는 링커에 대해 사용될 수 있으나; 더 통상적으로는 이들 링커는 비치환된 말레이미드로 링커를 제조하고, 그 링커를 브롬화하여 측쇄와 커플링 후 디브로모숙신이미드 모이어티를 수득한 다음, 마지막 단계로서 R-티올로 링커를 "활성화"시킴으로써 제조된다.
모노치환된 말레이미드 링커는 통상적으로 염기성 조건 하 디브로모숙신이미드 링커의 탈히드로브롬화 및 관련 방법에 의해 제조된다.
링커-세포독소 접합체의 제조
링커-세포독소 접합체는 문헌 [Doronina et　al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124] 의 것 및 유사 문헌과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 링커 (1 당량) 및 HATU (1 당량) 을 무수 DMF 중에 용해한 후, DIPEA 2　당량을 첨가한다. 생성 용액을 DMF 중 용해된 세포독소 (0.5 당량) 에 첨가하고, 반응물을 주위 온도에서 3 시간 교반한다. 링커-세포독소 접합체를 C-18 컬럼 상 역상 HPLC 로써 정제한다.
ADC 의 제조
항체, 전형적으로 모노클로날 항체는 특이적 암 표적 (항원) 에 대항하여 야기되고, 정제 및 특성화된다. 상기 항체를 포함하는 치료적 ADC 가 하기의 것과 유사한 방법에 의해서 등 시스테인 접합을 위한 표준 방법에 의해 제조된다: Hamblett et　al., "Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate", Clin. Cancer Res. 2004, 10, 7063-7070; Doronina et　al., "Development of potent and highly efficacious monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy", Nat. Biotechnol., 2003, 21(7), 778-784; and Francisco et　al., "cAC10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethylauristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity", Blood, 2003, 102, 1458-1465. 항체 당 4 종의 약물을 가진 항체-약물 접합체를 37 ℃ 에서 30 분간 DTT 또는 TCEP 와 같은 과량의 환원제로 항체를 부분적 환원시킨 다음 DPBS 중 1 mM DTPA 로 SEPHADEX®G-25 를 통한 용리로써 버퍼 교환해 제조한다. 용리제를 추가 DPBS 로 희석하고, 항체의 티올 농도는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) [Ellman 시약] 을 이용해 측정할 수 있다. 과량, 예를 들어 5 배의 링커-세포독소 접합체를 4 ℃ 에서 1　시간 동안 첨가하고, 접합 반응을 실질적 과량, 예를 들어 20 배의 시스테인 첨가로써 켄칭할 수 있다. 생성 ADC 혼합물을 PBS 중 평형화된 SEPHADEX G-25 상 정제해 미반응된 링커-세포독소 접합체를 제거하고, 원하는 경우 탈염하고, 크기 배제 크로마토그래피로써 정제한다. 이어서, 생성 ADC 를 예를 들어 0.2 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과할 수 있고, 원하는 경우 저장을 위해 동결건조할 수 있다.
본 발명의 ADC 의 형성은 하기 반응식으로써 예시되고, 이때 "Y"-형상 구조는 항체를 나타내고, 오직 하나의 디술파이드 결합을 나타내고, 링커-세포독소 접합체의 상세 사항은 ADC 의 컨셉을 보여주는 데 간결하도록 생략한다.
Figure pct00011
전형적으로, n 은 4 일 것이며, 이때 쇄간 시스테인 디술파이드 결합 전부는 링커-약물 접합체에 의해 대체된다. Schumacher et　al 에 따르면, 그의 소마토스타틴과의 접합에 있어서, 환원제를 소마토스타틴과 PEG화 링커의 혼합물에 더하고, 그리하여 항체 및 링커-세포독소 접합체가 가능해질 수 있고, 이 방법은 합성 방법으로서 배제되지 않는다.
검정
본 발명의 ADC 는 항체 검정에 통상적으로 사용된 임의의 방법에 의해, 원하는 항원에 대한 특이성 및 결합 친화도에 대해 검정할 수 있고; 이는 세포 배양에 대항하는 효력 검정, 이종이식 검정 등과 같은, 세포정지/세포독성제의 검정에 통상적으로 사용되는 임의의 방법에 의해 항암제로서의 효능을 검정할 수 있다. 당업자는 이용가능한 기술 및 문헌을 고려하여 적절한 검정 기술을 결정하는데 어려움이 없을 것이며; 그러한 검정 결과로부터, 항암제로서 인간에서 시험하는데 적절한 용량을 결정하는데 어려움도 없을 것이며, 그 시험 결과로부터, 인간의 암 치료에 사용되는 적절 용량을 결정하는데 있어서도 어려움이 없을 것이다.
제형 및 투여
본 발명의 제 1 측면의 ADC 는 정맥내 투여를 위한 용액으로서 제형화되거나, 또는 (예를 들어, 통상의 염수, 5% 덱스트로오스 또는 유사 등장 용액으로 재구성되도록) 정맥내 용액을 제조하도록 재구성하기 위한 동결건조된 농축물로서 제형화되는 것이 전형적일 것이다. 이는 전형적으로 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여될 것이다. 약학 제형의, 특히 항암 항체 제형의 당업자는 이용가능한 기술 및 문헌을 고려해 적합한 제형을 개발하는데 어려움이 없을 것이다.
실시예
링커 합성
실시예 1 - 3,4-비스(2-피리딜술파닐)피롤-2,5-디온의 합성
Figure pct00012
3,4-디브로모피롤-2,5-디온 [2,3-디브로모말레이미드], 1　g 를, 러버 스토퍼 및 버블러가 장착된 클린 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 더하고, 50 mL HPLC 등급 메탄올 중 용해하였다. 2-피리딘티올 (2 당량) 을 20 mL 신틸레이션 바이얼에 첨가하고, 10 mL 메탄올 중에 용해하였다. 질소 및 교반 하, 2-피리딘티올/메탄올 용액을 3,4-디브로모피롤-2,5-디온에 16 게이지 니들을 가진 20 mL 시린지를 통해 적가하고, 반응 혼합물을 추가 3-4 시간 동안 교반했다. 메탄올을 증발시키고, 미정제 생성물을 에틸 아세테이트 중 용해하고, 약 2 g 실리카 겔 상에 로딩했다. 실리카 겔-로딩된 미정제 생성물을 12 g 실리카 겔 카트리지를 통해 헥산: 에틸 아세테이트 구배 9:1 → 0:1 로 25 컬럼 부피 상 용리했다. 풍부한 분획을 동정, 풀링 및 건조될 때까지 동결건조하였다. 최종 생성물을 에틸 아세테이트 및 디에틸 에테르로부터 재결정화해, 황색의 니들 결정을 수득하고 이를 여과로써 수집했다.
기타 3,4-디(R-술파닐)피롤-2,5-디온에 대해 Schumacher et　al 의 방법을 이용해 유사 합성을 수행할 수 있다 (참조: Supplementary Materials at pages S17-S18). 유사 합성을 또한 (3,4-디브로모-2,5-디옥소피롤릴)-말단화 링커 [즉, 측쇄가 피롤 질소에 이미 첨가되어진 화합물] 로 시작해 수행해, 상응하는 (2,5-디옥소-3,4-디(R-술파닐)피롤릴)-말단화 링커; 및/또는 기타 티올 (예, 벤젠티올 및 2-히드록시에탄티올, Schumacher et　al.) 로 시작해, 상응하는 링커; 및/또는 기타 피롤디온 또는 피롤리딘디온, 예컨대 3,4-디클로로피롤-2,5-디온 또는 3,4-디브로모피롤리딘-2,5-디온으로 시작해 또는 이를 기재로 해, 상응하는 3,4-디(R-술파닐)피롤-2,5-디온 또는 3,4-디(R-술파닐)피롤리딘-2,5-디온 또는 이를 기재로 하는 링커를 수득했다.
실시예 2 - 39-(3,4-디브로모-2,5-디옥소피롤릴)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄산의 합성:
Figure pct00013
100　mL 2-목 둥근 바닥 플라스크를 불꽃 건조하고 질소 하 냉각했다. 냉각된 플라스크에 200　mg (0.296　mmol) 의 tert-부틸 39-히드록시-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘타노에이트를 충전했다. 트리페닐포스핀 (106　mg) 을 바이알 중 약 5 mL 무수 테트라히드로푸란 중 용해하고, 용액을 100 mL 플라스크에 질소 하 캐뉼라를 통해 첨가했다. 100 mL 플라스크를 빙수조에 15 분 동안 냉각시켰다. 냉각된 용액에, 맑응 용액이 관찰될 때까지 교반 하 55　mg (0.217mmol) 3,4-디브로모피롤-2,5-디온을 첨가했다. DIAD, 58.3　㎕ 을 냉각된 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 빙조에서 추가 10 분 동안 교반했다. 반응 혼합물을 교반하고, 약 20 시간에 걸쳐 실온에 도달되게 한 다음 회전 증발기 상에서 건조시까지 농축해, 황색 점성 오일을 수득하고, 이를 약 1 g 실리카 겔 상으로 흡착시키고, Reverleris 정상 상 크로마토그래피 유닛 상으로 건조-로딩했다. 오일을 12 g 실리카 겔 카트리지 상에서 28 컬럼 부피로 1:0 → 9:1 의 메탄올:디클로로메탄 구배로 용리했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 풀링하고 건조시까지 농축했다. 정제된 생성물을 50:50 아세토니트릴:물 중 현탁하고, 하룻밤 동결건조해 맑은 옅은 황색의 점성 오일을 수득했다. LC-MS 분석에 의해, tert-부틸-보호화 카르복실산 생성물을 워크업 동안 부분적으로 탈보호화했다. 상기 물질을 유리 산으로 완전히 탈보호화하기 위해, 동결건조된 물질을 디클로로메탄 중 5% 트리플루오로아세트산으로 처리하고, 건조시까지 농축하고, 아세토니트릴:물 (50:50) 중 하룻밤 동결건조했다.
유사 합성을, 3,4-비스(2-피리딜술파닐)피롤-2,5-디온으로 시작해 수행하여 39-(2,5-디옥소-3,4-비스(2-피리딜술파닐)피롤릴)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄산을 수득할 수 있거나, 또는 기타 3,4-디(R-술파닐)피롤-2,5-디온으로 시작해, 상응 링커를 수득할 수 있고; 및/또는 기타 히드록실-말단화 측쇄, 예를 들어, tert-부틸 6-히드록시헥사노에이트를 이용해 시작해 6-(3,4-디브로모-2,5-디옥소피롤릴)헥산산, 등을 수득할 수 있다. 2,3-디브로모말레이미드 외 말레이미드로 시작하는 유사 합성으로, 종래 기술의 비교 링커, 예컨대 6-(2,5-디옥소피롤릴)헥산산, MC 링커를 수득했다.
실시예 3: 39-(3,4-디브로모-2,5-디옥소피롤리디닐)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄산 [dBrPEG 링커] 의 합성:
Figure pct00014
39-(2,5-디옥소피롤릴)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄산을, 실시예 2 의 39-(3,4-디브로모-2,5-디옥소피롤릴)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄산과 동일 방식으로 하나, 2,3-디브로모말레이미드 외 말레이미드로 시작하여 제조했다. 산을 클로로포름 중 0.5 당량의 브롬으로 처리한 후, 하룻밤 환류해, 39-(3,4-디브로모-2,5-디옥소피롤리디닐)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄산을 실리카 겔 상 플래시 정제 후 수득했다.
유사 합성을 기타 히드록실-말단화 측쇄, 예를 들어 tert-부틸 6-히드록시헥사노에이트를 이용해 수행하여 6-(3,4-디브로모-2,5-디옥소피롤리디닐)헥산산, 등을 수득할 수 있다. 상기 합성의 생성물인 디브롬화 링커를 추가 단계에서 염기로 탈히드로브롬화하여, (3-브로모-2,5-디옥소피롤릴)-말단화 링커, 예컨대 6-(3-브로모-2,5-디옥소피롤릴)헥산산을 수득할 수 있다.
링커-세포독소 접합체의 합성
실시예 4: T4 의 합성
Figure pct00015
Fmoc-T4 을, Fmoc-D-2-피페리딘카르복실산을 이소류신에 EDC 및 중탄산나트륨의 존재 하에서 커플링한 다음, 생성된 Fmoc-D-Pip-Ile-OH 를 N-메틸발린 중간체 1 (Concortis 사에서 구입) 에, 1 당량의 HOBT 및 DIPC (DMF 중) 과 혼합한 후 2.5 당량의 NMM 을 첨가함으로써 커플링함으로써 제조했다. 반응 혼합물을 하룻밤 교반하고, 헥산 및 에틸 아세테이트의 구배를 이용해 실리카 겔 상 플래시 크로마토그래피로써 정제했다. 용매를 증발시켜, Fmoc-T4 를 황색 오일로서 수득했다. 이후, Fmoc-T4 를 메틸렌 클로라이드 중 20% DEA 로 30 분간 처리해 탈보호화해 T4 를 수득하고, 이를 아세토니트릴/물로 용리된 C18 역상 컬럼 상에서 제조용 HPLC 로써 정제했다.
실시예 5: 6-(2,5-디옥소피롤릴)헥사노일-T4 [MC-T4] 및 39-(3,4-디브로모-2,5-디옥소피롤리디닐)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘타노일-T4 [dBrPEG-T4] 의 합성
Figure pct00016

T4 의 MC 또는 dBrPEG 링커 (실시예 2 및 3 각각에서 기술) 와의 커플링을, 상기 링커를 1 당량의 TBTU 로 DMF 중 2 당량의 DIPEA 의 존재 하에서 활성화한 다음, T4 를 72 시간 동안 실온에서 커플링함으로써 수행했다. 제조용 C18 HPLC (아세토니트릴-물 구배) 의 정제로, 항체 접합에 적합한 MC-T4 또는 dBrPEG-T4 를 수득했다.
기타 링커를 이용하는 유사 합성으로, 상응하는 링커-T4 접합체를 수득한다. T3, MMAF 또는 염기성 아민을 가진 기타 세포독소를 이용한 유사 합성으로, 상응하는 링커-세포독소 접합체를 수득한다. 아민-말단화 링커 및 카르복실기를 가진 세포독소를 이용하고 상기 링커를 상기 실시예에서 활성화하는 동일한 방식으로 세포독소를 활성화시키는 유사 합성으로, 기타 링커-세포독소 접합체를 수득한다.
실시예 6. 39-(2,5-디옥소-3,4-비스(2-피리딜술파닐)피롤릴)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘타노일-MMAF [dPSPEG-MMAF] 의 합성:
Figure pct00017
39-(2,5-디옥소-3,4-비스(피리딘-2-일티오)-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄산을, 클린 불꽃-건조된 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고, 카르복실산을 NHS 로 3 mL 의 DMF 중 DCC 의 존재 하에서 활성화시켰다. MMAF 를 약 1 mL DMF 중에 사전용해하고, NHS-활성화 산에 22 게이지 니들을 통해 옮겼다. DIPEA 를 반응 혼합물에 첨가하고, 하룻밤 교반했다. 미정제 반응 혼합물을 21.2 mm x 50 mm Agilent PREP-C18 컬럼 상에서 역상 HPLC 로써, 35 mL/분의 유속으로 20 컬럼 부피로 (약 30 분의 구배 시간) 정제했다. 풍부한 분획을 동정하고, 풀링 및 동결건조시켜 백색 반-고체로서 dPSPEG-MMAF 접합체를 수득했다.
기타 링커를 이용한 유사 합성으로, 상응하는 링커-MMAF 접합체를 수득한다. T3, T4 또는 염기성 아민을 가진 기타 세포독소를 이용한 유사 합성으로, 상응하는 링커-세포독소 접합체, 예컨대 dPSPEG-T4 를 수득한다. 아민-말단화 링커 및 카르복실기를 가진 세포독소를 이용하고, 링커를 상기 실시예에서 활성화한 동일한 방식으로 세포독소를 활성화하는 유사 합성으로, 기타 링커-세포독소 접합체를 수득한다.
항체-약물 접합체의 합성
실시예 7: 트라스투주마브-dTSPEG-MMAF ADC 의 합성
Figure pct00018
1mM DTPA 와 함께 pH 7.4 PBS (Gibco Mg 및 Ca 부재) 중 트라스투주마브 20　mg/mL 용액 1 mL 를 멸균 1.7 mL Eppendorf 튜브에 로딩한 다음, 2.75 당량의 TCEP 히드로클로라이드 (Sigma 앰플 0.5M 농도) 를 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 37　℃ 에서 인큐베이션해 트라스투주마브 당 평균 4 종의 자유 티올 쌍을 수득했다 (이는 Ellman 의 비색 검정으로써 증명될 수 있다: 참조 - Ellman, "Tissue sulfhydryl groups", Arch. Biochem. Biophys, 1959, 82, 70-77, 또는 상기 검정을 지시하는 그 후의 논문). 환원된 항체 용액을 빙조에서 약 0　℃ 에서 15 분 냉각시킨 다음; 약 4 당량의 dPSPEG-MMAF 의 디메틸술폭시드 중 용액을 첨가하고, 혼합물을 37　℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다 (또는 4　℃ 에서 20 시간 동안). 생성 트라스투주마브-dTSPEG-MMAF ADC 를 크기 배제 크로마토그래피 (GE AKTA 순수 크로마토그래피 시스템) 또는 PD10 탈염 컬럼에 의해 정제하였다.
기타 링커-세포독소 접합체, 예컨대 dPSPEG-T4, 및/또는 기타 항체, 예컨대 18-2A (쥣과 동물 IgG2a 항체) 를 이용한 유사 합성으로, 상응 ADC 를 수득한다.
검정
본 발명의 ADC 를, 관심 암 세포주에서, 예컨대 ADC 의 항체 부분에 상응하는 항원을 발현하는 암 세포주 및 항원이 결핍된 유사 암 세포주에서 그의 세포독성을 측정함으로써 시험관 내 효력 및 선택성에 대해 시험한다. 이들을 암 연구 당업자에게 익히 공지되어 있는 마우스 피하 암 이종이식 및 마우스 정위 암 이종이식 모델과 같은 동물 모델에서, 생체 내 효력 및 안전성에 대해 시험한다.
실시예 8: 트라스투주마브와 비교시, 트라스투주마브 ADC 의 세포독성
트라스투주마브를 MC 링커를 통해 현재 이용 중인 세포독소 MMAF 와 접합시킨 [트라스투주마브-MC-MMAF] 2 종의 ADC 의 세포독성을, HER2-양성 및 HER2-음성 종양 세포에서 트라스투주마브 단독의 세포독성과 비교했다. HER2-음성 종양 세포에서, ADC 및 트라스투주마브 그 자체 양자 모두의 IC50 는 >500　nM 였으나; HER2-양성 종양 세포에서, 트라스투주마브 그 자체의 IC50 은 여전히 >500 nM 이었지만, 2 종의 트라스투주마브-MC-MMAF ADC 는 0.009　nM 및 0.018　nM 의 IC50 을 가졌다. 이들 결과는 ADC 가 그의 부모 항체보다 효력이 상당히 더 강력하다는 점을 시사한다.
실시예 9: MMAF 와 비교시 T1 및 T2 의 세포독성
튜부리신 T1 및 T2 의 세포독성을, 표준 세포 세포독성 검정에서 BT474 (HER2+) 세포주를 이용해 MMAF 의 세포독성과 비교했다. 이들 세포에서, MMAF 는 IC50 이 93　nM 였고, T1 은 IC50 이 11　nM 이었고, T2 는 IC50 이 <0.1　nM 이었으며, 이는 이들 튜부리신이 MMAF 보다 효력이 현저하게 더 강력하다는 점을 보여준다. 이들 결과는, N-접합성 튜부리신 T3 및 T4 이 비(非)-N-접합성 튜부리신 T1 및 T2 와 유사한 효력을 지니고, MMAF 보다는 효력이 현저하게 더 강력하다는 점을 시사한다. 이들 결과 및 실시예 8 의 결과는, 튜부리신 ADC 가 MMAF ADC 보다 더 효력이 현저하게 강력하므로, 이것이 유효한 항암제일 것이라는 점을 제시한다.
실시예 10: 항원-발현 세포에 대한 ADC 의 결합 친화도
항체 및 ADC 의 항원-발현 세포와의 결합을, 세포 ELISA 를 이용해 측정한다. 표적을 발현하도록 형질도입된 육중 세포를 (HER2 에 대해서는 F279 세포, CD98 에 대해서는 F244 세포) 384-웰 플레이트 내 웰 당 5000 개의 세포로 당일 플레이트한다. 익일, 항체를 별개의 플레이트에서 계단 희석한 다음, 흡인으로써 배지를 이전에 제거한 세포 플레이트로 옮겼다. 2 시간 실온에서의 인큐베이션 후, 플레이트를 세정 버퍼 (0.1% 소 혈청 알부민 함유 DPBS, pH7.4) 로 세정한 다음, 배지에 희석된 25　㎕ 홍당무과산화효소-표지된 2차 항체를 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이어서, 플레이트를 세정하고, 15　㎕ 의 화학발광 기질 (Pierce catalog #37069) 를 첨가하고; 플레이트를 플레이트-기재 형광 리더에서 판독한다. 트라스투주마브 및 트라스투주마브 ADC (트라스투주마브-MC-MMAF, 트라스투주마브-MC-T4, 트라스투주마브-dTSPEG-MMAF, 및 트라스투주마브-dTSPEG-T4) 는 F277 세포에 대해 필적할만한 친화도를 나타냈고; 18-2A 및 18-2A ADC (18-2A-MC-MMAF, 18-2A-MC-T4, 18-2A-dTSPEG-MMAF, 및 18-2A-dTSPEG-T4) 는 F244 세포에 대해 필적할만한 친화도를 보였는데, 이는 약물이 탑재되는 접합이 항원 결합에 영향을 미치지 않는다는 점을 지시한다.
실시예 11: 항원-발현 세포에 대항하는 ADC 의 효력
종양 세포 성장 저해에 대한 ADC 의 효력을, 세포 증식 검정에서 시험했다. Ramos (B-세포 림프종) 및 BT474 (HER2+ 인간 유방 암종) 세포주를, 각각 웰 당 3000 및 5000 개의 세포로 약물 처리 전일에 96 웰 반면적 플레이트에 시딩했다. ADC 및 대조군을 마스터 플레이트에서 계단 희석한 다음, 세포 플레이트로 옮기고, 이를 37 도씨 및 5% CO2 에서 3 일 동안 인큐베이션했다. 세포를 제작자가 기재한 대로 ATPLite 1Step kit (Perkin Elmer catalog #50-904-9883) 를 이용해 웰 내 ATP 의 수준을 측정함으로써 정량하였다. 18-2A ADC (18-2A-MC-MMAF, 18-2A-MC-T4, 18-2A-dTSPEG-MMAF, 및 18-2A-dTSPEG-T4) 는 Ramos 세포에서 효력이 거의 동등했고, 부모 18-2A 항체보다는 효력이 현저하게 더 강한 반면에, 트라스투주마브 ADC (트라스투주마브-MC-MMAF, 트라스투주마브-MC-T4, 트라스투주마브-dTSPEG-MMAF, 및 트라스투주마브-dTSPEG-T4) 는 BT474 세포에서 효력이 거의 동등했고, 부모 트라스투주마브 항체보다는 효력이 현저히 강했다.
실시예 12: 쥣과동물 이종이식 모델에서 ADC 의 효능
Ramos 세포 이종이식 모델.
Ramos 세포주를 ATCC 로부터 획득하고, 공급자 프로토콜에 따라 배양했다. 4-6 주령 면역결핍 암컷 마우스 (Taconic C.B-17 산) 의 우측 옆구리에 PBS (마그네슘 또는 칼슘 부재) 및 BD Matrigel (BD Biosciences) 의 1:1 비율의 혼합물 중 1x107 생세포로 피하 주사했다. 마우스 당 주입된 총 부피는 200　㎕ 였고, 그 중 50% 는 Matrigel 이었다. 일단 종양의 크기가 65-200　mm3 에 도달하면, 마우스를 무작위 추출하였다. ADC 를 PBS 중에서 제형화하고, 꼬리 측정맥에 1 mg/kg 의 투여량으로 정맥내 1 회 투여하고, 체중 및 종양을 1 주일에 2 회 측정했다. 종양 부피를 문헌 [van der Horst et　al., "Discovery of Fully Human Anti-MET Monoclonal Antibodies with Antitumor Activity against Colon Cancer Tumor Models　In Vivo", Neoplasia, 2009, 11, 355-364] 에 기재된 바와 같이 산출했다. 실험을 실험 포인트 당 8 마리의 동물 군에서 수행했다. 음성 대조군에는 HB121 (IgG2a-음성 항체) 및 적절한 경우, 자유 MMAF 또는 T4 를, ADC 에 의해 방출되는 농도와 등몰 농도로 수여하고, 양성 대조군에는 18-2A 를 수여했다. 본 발명의 링커를 갖는 18-2A ADC (18-2A-dTSPEG-MMAF 및 18-2A-dTSPEG-T4) 는, 비교 ADC 보다 (각각 18-2A-MC-MMAF 및 18-2A-MC-T4) 약간 더, 그러나 필적할만한 TGI 를 보였고, 부모 18-2A 항체 보다는 더 큰 TGI 를 보이는 한편, 상기 모두는 대조군과 비교하면, 유의한 TGI 를 보였다. 동물 체중 측정을 기반으로 할 때 독성은 관찰되지 않았다.
BT474 세포 이종이식 모델
BT474 세포주를 ATCC 로부터 획득하고, 공급자 프로토콜에 따라 배양했다. 4-6 주령 면역결핍 암컷 마우스 (Taconic C.B-17 산) 의 우측 옆구리에 PBS (마그네슘 또는 칼슘 부재) 및 BD Matrigel (BD Biosciences) 의 1:1 비의 혼합물 중 1x107 개의 생세포를 피하 주사하기 3 일 전에 β-에스트라디올 펠릿을 이식했다. 마우스 당 주사된 총 부피는 200　㎕ 였고, 50% 는 Matrigel 였다. 일단 종양 크기가 100-150　mm3 에 도달하면, 마우스를 무작위로 추출했다. ADC 를 PBS 중 제형화하고, 꼬리 측정맥에 1 mg/Kg 의 투여량으로 정맥내 1 회 투여하고, 체중 및 종양을 1 주일에 2 회 측정했다. 종양 부피를 상기 인용된 van der Horst et　al 에 기재된 바와 같이 산출했다. 실험을 실험 포인트 당 8 마리의 동물 군에서 수행했다. 음성 대조군에는 HB121 및 적절한 경우 자유 MMAF 또는 T4 를 ADC 에 의해 방출되는 농도와 등몰 농도로 수여하는 반면에, 양성 대조군에는 트라스투주마브를 1 mg/Kg 수여했다. 본 발명의 링커를 갖는 트라스투주마브 ADC (트라스투주마브-dTSPEG-MMAF 및 트라스투주마브-dTSPEG-T4) 는, 비교 ADC (각각, 트라스투주마브-MC-MMAF 및 트라스투주마브-MC-T4) 보다 필적할만한 TGI 를 보이고, 부모 트라스투주마브 보다는 약간 더 TGI 를 보이는 한편, 상기 모두는 대조군과 비교하면, 유의한 TGI 를 보였다. 동물 중량 측정을 기준으로 할 때 독성은 관찰되지 않았다.
유사 시험을 기타 암 (상이한 항원을 발현하는 것) 및 ADC 로 수행하였고, 이때 항체는 암에 의해 발현된 항원에 대응한다.

Claims (47)

  1. 하기 식의 항체-약물 접합체:
    Figure pct00019

    [식 중,
    A 는 항체이고,
    PD 는 피롤-2,5-디온 또는 피롤리딘-2,5-디온이고,
    이중 결합은 피롤-2,5-디온 또는 피롤리딘-2,5-디온의 3- 및 4-위치와, 항체 내 개방된 시스테인-시스테인 디술파이드 결합의 2 종의 황 원자와의 결합을 나타내고,
    L 은 -(CH2)m- 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 이고,
    CTX 는 아미드 결합에 의해 L 에 결합된 세포독소이고,
    n 은 1 내지 4 의 정수이고, 및
    m 은 1 내지 12 의 정수임].
  2. 제 1 항에 있어서, A 는 모노클로날 항체인 항체-약물 접합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, A 는 인간 또는 인간화 항체인 항체-약물 접합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, A 는 암 항원에 특이적인 항체인 항체-약물 접합체.
  5. 제 1 항에 있어서, A 는 알렘투주마브, 베바시주마브, 브렌툭시마브, 세툭시마브, 겜투주마브, 이필리무마브, 오파투무마브, 파니투무마브, 리툭시마브, 토시투모마브 또는 트라스투주마브인 항체-약물 접합체.
  6. 제 1 항에 있어서, A 는 트라스투주마브인 항체-약물 접합체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, CTX 는 아우리스타틴, 칼리케아마이신, 메이탄시노이드 또는 튜부리신인 항체-약물 접합체.
  8. 제 7 항에 있어서, CTX 는 모노메틸아우리스타틴 E, 모노메틸아우리스타틴 F, 칼리케아마이신　γ, 머탄신, 튜부리신 T3 또는 튜부리신 T4 인 항체-약물 접합체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, PD 는 피롤리딘-2,5-디온인 항체-약물 접합체.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, PD 는 피롤-2,5-디온인 항체-약물 접합체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -(CH2)m- 인 항체-약물 접합체.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 인 항체-약물 접합체.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 암을 앓고 있는 인간에게 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 항체 약물 접합체 또는 제 13 항의 약학적 조성물을 유효량 투여함으로써 암을 치료하는 방법.
  15. 하기 식 A, B, 또는 C 의 링커-세포독소 접합체:
    Figure pct00020

    [식 중, R 은 할로 또는 히드록실로 임의 치환된 C1-6　알킬; 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 페닐; 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 나프틸; 또는 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 2-피리딜이고,
    L 은 -(CH2)m- 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 이고,
    CTX 는 아미드 결합에 의해 L 에 결합된 세포독소이고, 및
    m 은 1 내지 12 의 정수임].
  16. 제 15 항에 있어서, 접합체가 식 A 의 것인 링커-세포독소 접합체.
  17. 제 15 항에 있어서, 접합체가 식 B 의 것인 링커-세포독소 접합체.
  18. 제 15 항에 있어서, 접합체가 식 C 의 것인 링커-세포독소 접합체.
  19. 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, R 은 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 2-피리딜인 링커-세포독소 접합체.
  20. 제 19 항에 있어서, R 은 2-피리딜인 링커-세포독소 접합체.
  21. 제 15 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, CTX 는 아우리스타틴, 칼리케아마이신, 메이탄시노이드 또는 튜부리신인 링커-세포독소 접합체.
  22. 제 21 항에 있어서, CTX 는 모노메틸아우리스타틴 E, 모노메틸아우리스타틴 F, 칼리케아마이신　γ, 머탄신, 튜부리신 T3, 또는 튜부리신 T4 인 링커-세포독소 접합체.
  23. 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -(CH2)m- 인 링커-세포독소 접합체.
  24. 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 인 링커-세포독소 접합체.
  25. 하기 식 AA, BB, 또는 CC 의 링커:
    Figure pct00021

    [식 중, R 은 할로 또는 히드록실로 임의 치환된 C1-6　알킬; 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 페닐; 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 나프틸; 또는 할로, 히드록실, 카르복실, C1-3　알콕시카르보닐, 또는 C1-3　알킬로 임의 치환된 2-피리딜이고,
    L 은 -(CH2)m- 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 이고,
    Z 는 카르복실, C1-6　알콕시카르보닐, 또는 아미노이고,
    m 은 1 내지 12 의 정수임].
  26. 제 25 항에 있어서, 링커는 식 AA 의 것인 링커.
  27. 제 25 항에 있어서, 링커는 식 BB 의 것인 링커.
  28. 제 25 항에 있어서, 링커는 식 CC 의 것인 링커.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, R 은 2-피리딜인 링커.
  30. 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -(CH2)m- 인 링커.
  31. 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 인 링커.
  32. 제 25 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, Z 는 카르복실인 링커.
  33. 제 25 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, Z 는 C1-6　알콕시카르보닐인 링커.
  34. 제 25 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, Z 는 아미노인 링커.
  35. 하기 식 AAA, BBB, 또는 CCC 의 링커:
    Figure pct00022

    [식 중,
    R' 은 클로로, 브로모, 요오도, C1-6　알킬술포닐옥시, 트리플루오로메탄술포닐옥시, 벤젠술포닐옥시, 또는 4-톨루엔술포닐옥시이고,
    L 은 -(CH2)m- 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 이고,
    Z 는 카르복실, C1-6　알콕시카르보닐, 또는 아미노이고, 및
    m 은 1 내지 12 의 정수임].
  36. 제 35 항에 있어서, 링커는 식 AAA 의 것인 링커.
  37. 제 35 항에 있어서, 링커는 식 BBB 의 것인 링커.
  38. 제 35 항에 있어서, 링커는 식 CCC 의 것인 링커.
  39. 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -(CH2)m- 인 링커.
  40. 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, L 은 -(CH2CH2O)mCH2CH2- 인 링커.
  41. 제 35 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, Z 는 카르복실인 링커.
  42. 제 35 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, Z 는 C1-6　알콕시카르보닐인 링커.
  43. 제 35 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, Z 는 아미노인 링커.
  44. 제 35 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, R' 은 클로로, 브로모 또는 요오도인 링커.
  45. 제 44 항에 있어서, R' 은 브로모인 링커.
  46. 하기 식 T3 의 튜부리신 화합물:
    Figure pct00023
    .
  47. 하기 식 T4 의 튜부리신 화합물:
    Figure pct00024
    .
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