EA027925B1

EA027925B1 - Ендиины, их конъюгаты и способы их получения и применения

Info

Publication number: EA027925B1
Application number: EA201491447A
Authority: EA
Inventors: Найду С. Чоудари; Санжив Гангвар; Билал Суфи
Original assignee: Бристол-Майерс Сквибб Компани
Priority date: 2012-02-13
Filing date: 2013-02-08
Publication date: 2017-09-29
Also published as: BR112014019990A2; CA2864420A1; US8709431B2; TW201336851A; AU2013221873B2; JP2015508074A; CO7061078A2; US20130209494A1; HUE033704T2; EA201491447A1; PT2814829T; HRP20170334T1; DK2814829T3; IL233965B; EP2814829A1; KR101660146B1; EP2814829B1; AU2013221873A1; CY1118899T1; MX350539B

Abstract

Группа изобретений относится к ендиинам, имеющим структуру, представленную формулой (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf), (IIg) или (IIh)или их фармацевтически приемлемая соль. Данные соединения можно применять в химиотерапевтических лекарственных средствах в особенности в виде конъюгатов для лечения заболеваний, таких как рак.

Description

Настоящее изобретение относится к ендиинам и их конъюгатам, способам получения и применения таких ендиинов и конъюгатов и к композициям, содержащим такие ендиины и конъюгаты.

Уровень техники

Ендиины представляют собой семейство антибиотиков, которые содержат характерную напряжённую девяти- или десятичленную циклическую систему, содержащую Ζ-углерод-углеродную двойную связь и две углерод-углеродные тройные связи, причём обычно последние две фланкируют первую. Ендиины активно повреждают ДНК, вызывая одно- и двунитевые разрывы. Их активность относят за счёт их способности связываться с ДНК и претерпевать перегруппировку Бергмана, при этом напряжённая циклическая система превращается в обладающий высокой реакционной способностью 1,4бензеноидный бирадикал, который повреждает ДНК, отрывая от неё водород.

Унциаламицин представляет собой ендиин, выделенный из штамма 81гер1ошусе§ из лишайника С1айоша ипшайз (Иаухез е! а1. 2005; 2007) (полный список цитируемых материалов, указанных в данном описании фамилией первого автора или изобретателя и годом, даётся ниже, в разделе, озаглавленном Ссылочные материалы).

Структура унциаламицина подтверждена полным синтезом (\|со1аон е! а1. 2007а; 2007Ь). В процессе синтеза было обнаружено, что неприродный 26(8) эпимер является почти таким же активным, как природный 26(К) эпимер, т.е. стереохимия С27 метильной группы слабо влияет на биологическую активность. Оба эпимера были активны в отношении некоторых клеточных линий опухолей яичников. Значения 1С₅₀ находятся в диапазоне от 9х10^-12 до 1х10^-10 в зависимости от эпимера и линии или сублинии клеток (№со1аои е! а1., 2008).

Конъюгаты представляют собой предпочтительный способ доставки противораковых лекарственных средств, которые часто обладают высокой цитотоксичностью и ввести которые иным способом было бы проблематично из-за риска системной токсичности. В конъюгате лекарственное вещество конъюгировано (связано ковалентной связью) с нацеливающей молекулой, которая специфически или преимущественно связывается с химическим структурным элементом, характерным для раковой клетки, тем самым обеспечивается доставка лекарственного вещества с высокой специфичностью. Кроме того, доставка лекарственного вещества осуществляется в неактивной форме до момента высвобождения его из конъюгата, обычно после отщепления ковалентного линкера. Как правило, нацеливающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий участок, антиген для которого избыточно (сверхэкспрессия) или исключительно экспрессируется в раковых клетках (опухолеассоциированный антиген). В таких случаях полученный в результате конъюгат иногда называют иммуноконъюгатом или конъюгатом антитело-лекарственное средство (лекарство) (ДОС). Предпочтительно опухолеассоциированный антиген локализуется на поверхности раковой клетки, но он также может секретироваться в окружающее внеклеточное пространство. После связывания комплекс антиген-конъюгат интернализуется и, в конечном счёте, находит дорогу внутрь пузырька-везикулы, такого как лизосома, где ковалентный линкер отщепляется, что позволяет активному лекарственному веществу проявить своё химиотерапевтическое действие.

Предпочтительно ковалентный линкер конструируется таким образом, чтобы его отщепление вызывал фактор, преобладающий внутри раковой клетки, а не в плазме. Одним таким фактором является низкое значение рН во внутрилизосомном пространстве, поэтому ковалентный линкер может являться чувствительной к кислоте группой, такой как гидразонная. Другим таким фактором является, как правило, повышенная внутриклеточная концентрация глутатиона, способствующая отщеплению дисульфидного ковалентного линкера по механизму (тиол)-дисульфидного обмена. Ещё одним таким фактором является присутствие лизосомальных ферментов, таких как катепсин В, которые могут отщеплять пептидные линкеры, создаваемые для применения в качестве предпочтительных субстратов (1)иЬо\ус1нЕ е! а1. 2002).

Конъюгаты применяются в онкологии для доставки лекарств на основе ендиинов. Гемтузумаб озогамицин (Му1о1аг§®) представляет собой конъюгат моноклонального антитела против С1)33 и производ- 1 027925 ного ендиина калихеамицина. Он был одобрен для лечения острого миелоидного лейкоза, но позднее был изъят с рынка. Делались попытки разработать некоторые другие лекарственные средства на основе ендиинов, особенно в форме конъюгатов. См. обзор 8Нао 2008.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предусматривает соединения на основе унциаламицина, которые являются мощными цитотоксинами, находящими применение в качестве химиотерапевтических лекарственных средств, самостоятельно или в виде конъюгатов. В одном аспекте предусматривается соединение, имеющее структуру, представленную формулой (11а), (НЪ), (11с), (ΙΙ6), (Не), (ΙΙί), (ΙΙ§) или (ПН)

или его фармацевтически приемлемая соль.

В другом аспекте представлен конъюгат, содержащий (11а), (11Ъ), (11с), (ΙΙ6), (Не), (ΙΙί), (ΙΙ§) или (ΙΙΗ), связанный ковалентной связью с антителом или его антигенсвязывающим участком, которое специфически или предпочтительно связывается с опухолеассоциированным антигеном на опухолевой клетке, где соединение в сконъюгированном состоянии имеет формулу выбранную из

- 2 027925

В другом аспекте представлен конъюгат формулы (III) [О(х°)_ас(х²)ь]„г (ш), где Ζ означает антитело;

Х° и Χ^Ζ означают первую и вторую спейсерные частицы, соответственно, независимо выбранные из

Н _г О _г ξ-Ν-(ΟΗ₂)_Μ-(ΝΗ)₄-1 Ц(СН₂)₂.₆-сЦ 1-(СН₂)_м-(МН)_ч—1 о ’ ’ О ’

Η ε-(ΟΗ₂)₂„-(ΝΗ)₄4 Ρ(ΝΗ)„—(СН₂СН₂О)_г-СН₂СН₂-Й-| |-(ΟΗ₂)₃-0-Ν-(ΟΗ₂ΟΗ₂0)₄-ΟΗ₂ΟΗ₂-0-Ν-(ΟΗ₂)₂-(ΝΗ)₍,-|

Ι-ΙΟΗ^-Ο-Ν-ΙΟΗ^-ΙΝΗ).-?

Ι-ΙΟΗ^-Ν-Ο-ΙΟΗ,^-ΙΝΗ),-!

где ς представляет собой 0 или 1 и г представляет собой от 1 до 24;

С означает последовательность, содержащую от одной до пяти аминокислот, выбранную из Уа1 Сй,

А1а Уа1, Уа1 А1а Уа1, Бу§ Бу§, А1а А§п Уа1, Уа1 Беи Бу§, СИ СИ, Уа1 Бу§, А1а А1а А§п, Бу§, СИ, 5ег и О1и; нижние индексы а и Ь независимо означают 0 или 1; нижний индекс т означает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

Б выбран из

- 3 027925

В другом аспекте представлено соединение формулы (IV)

О-(Х°)аС(Х²)ь-К³¹ (IV), где К³¹ означает реакционноспособную функциональную группу, выбранную из азида, циклооктина,

- 4 027925

С означает последовательность, содержащую от одной до пяти аминокислот, выбранную из Уа1 СИ, А1а Уа1, Уа1 А1а Уа1, Ьуз Ьуз, А1а Азп Уа1, Уа1 Ьеи Ьуз, СЧ СЦ, Уа1 Ьуз, А1а А1а Азп, Ьуз, СЦ, 8ег и О1и;

нижние индексы а и Ь независимо означают 0 или 1; нижний индекс т означает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

Ό выбран из

В другом аспекте представлен способ лечения ракового заболевания у субъекта, страдающего таким раковым заболеванием, включающий введение данному субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата.

В другом аспекте представлен способ, в котором антитело связывается с антигеном, который избыточно экспрессируется или исключительно экспрессируется в раковых клетках.

В другом аспекте представлен способ, в котором раковое заболевание выбрано из лейкоза, рака почки, рака яичника, рака лёгкого, колоректального рака, рака молочной железы и рака простаты.

В другом аспекте представлена фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая конъюгат по любому и фармацевтически приемлемый носитель.

Унциаламицин представляет собой потенциальный кандидат на роль лекарственного компонента в конъюгате, но в нём отсутствуют функциональные группы, которые пригодны для применения в качестве сайтов для конъюгации с нацеливающей молекулой без нарушения биологической активности. Мы нашли, что можно ввести группу К⁰ в крайний левый ароматический цикл в антрахиноновом фрагменте, показанном в формуле (I), и при этом не наблюдается нежелательная потеря биологической активности, и, кроме того, группа К⁰ представляет собой универсальный сайт для конъюгации. Так, согласно другому варианту настоящее изобретение предусматривает конъюгат, содержащий соединение формулы (I), связанное ковалентной связью с нацеливающей молекулой, которая специфически или предпочтительно связывается с химическим структурным элементом на клетке-мишени, предпочтительно являющейся раковой клеткой. Предпочтительно нацеливающая молекула представляет собой антитело, более предпочтительно моноклональное антитело и ещё более предпочтительно человеческое моноклональное антитело, а химический структурный элемент представляет собой опухолеассоциированный антиген.

Согласно другому варианту изобретение предусматривает конъюгат, содержащий соединение по данному изобретению и линкерную частицу, содержащую реакционноспособную функциональную

- 5 027925 группу, пригодную для конъюгации с нацеливающей молекулой.

Согласно другому варианту настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования пролиферации раковых клеток у субъекта, больного раком, заключающийся во введении этому субъекту терапевтически эффективного количества соединения по данному изобретению или его конъюгата с нацеливающей молекулой (в частности, с антителом). Раковые клетки могут представлять собой лейкозные клетки, клетки рака почек, рака яичников, рака лёгкого, колоректального рака, рака молочной железы или рака простаты.

Согласно другому варианту изобретение предусматривает способ лечения рака у субъекта, страдающего таким раковым заболеванием, заключающийся в введении этому субъекту терапевтически эффективного количества соединения по данному изобретению или его конъюгата с нацеливающей молекулой (в частности, с антителом). Согласно другому варианту изобретение предусматривает применение соединения по данному изобретению или его конъюгата с нацеливающей молекулой (в частности, с антителом) для получения лекарственного средства для лечения рака у больного, страдающего этим заболеванием. Раковое заболевание может представлять собой лейкоз, рак почек, рак яичников, рак лёгкого, колоректальный рак, рак молочной железы или рак простаты.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1-6 представлены схемы синтеза соединений по настоящему изобретению.

На фиг. 7-10 показаны схемы проводимых для подготовки к конъюгации реакций связывания линкера за счёт реакционноспособных функциональных групп с соединениями по данному изобретению.

На фиг. 11а и 11Ь показаны графики, иллюстрирующие антипролиферативную активность соединения по изобретению по сравнению с выбранными референсными (эталонными) соединениями.

На фиг. 12а и 12Ь показаны графики, иллюстрирующие антипролиферативную активность дополнительных соединений по сравнению с выбранными эталонными соединениями.

На фиг. 13а, 13Ь и 13с показаны графики, иллюстрирующие антипролиферативную активность конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученных при использовании соединений по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Определения.

Термин антитело означает полные антитела и их любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающий участок) или их одноцепочечные варианты. Полное антитело представляет собой белок, содержащий по меньшей мере две тяжёлых (Н) цепи и две лёгких (Ь) цепи, связанных между собой дисульфидными связями. Каждая тяжёлая цепь содержит вариабельную область тяжёлой цепи (ν_Η) и константную область тяжёлой цепи, включающую три домена, С_Н1 С_Н2 и С_Н3. Каждая лёгкая цепь содержит вариабельную область лёгкой цепи (V или ν_κ) и константную область лёгкой цепи, включающую один домен С_ь. Области ν_Η и ν₇ могут далее подразделяться на области (участки) гипервариабельности (гипервариабельные области), называемые областями (участками), определяющими комплементарность (СЭКв), с вкраплениями более консервативных каркасных участков (РРв). Каждая ν_Η и ν₇ область содержит три СЭК.5 и четыре РРв, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: РР1, СОРТ, РР2, СЭК2. РР3, СЭР3 и РР4. Вариабельные области содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области могут опосредовать связывание антитела с клетками-хозяевами или с факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1ц) классического пути активации системы комплемента. Говорят, что антитело специфически связывается с антигеном X, если антитело связывается с антигеном X с К_с5х10^-8 М или менее, более предпочтительно 1х10^-8 М или менее, более предпочтительно 6х10^-9 М или менее, более предпочтительно 3х10^-9 М или менее, ещё более предпочтительно, 2х10^-9 М или менее. Антитело может быть химерным, гуманизированным или предпочтительно человеческим антителом. Константную область тяжёлой цепи можно сконструировать (методом рекомбинантных ДНК) таким образом, чтобы повлиять на тип или степень гликозилирования, продлить период полужизни антитела, усилить или ослабить взаимодействие с эффекторными клетками или системой комплемента или модулировать некоторые другие свойства. Метод рекомбинантных ДНК можно осуществлять путём замены, добавления или делеции одной или более аминокислот или заменой домена доменом иммуноглобулина другого типа или комбинацией вышеуказанных процедур.

Термины (выражения) антигенсвязывающий фрагмент и антигенсвязывающий участок антитела (или просто участок антитела или фрагмент антитела) означают один или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антителом. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела, такими как (ί) фрагмент РаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов ν_Σ, ν_Η, С_ь И С_т; (ίί) фрагмент Р(аЬ')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента РаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) фрагмент РаЬ', который, по существу, представляет собой РаЬ с частью шарнирной области (см., например, АЬЬав с1 а1., Се11и1аг апб Мо1еси1аг 1ттипо1оду, 6ΐ1ι Еб., Баипбетв ЕЕсуюг 2007); (ίν) фрагмент Рб, состоящий из доменов ν_Η и С_т; (ν) фрагмент Ρν, состоящий из доменов ν₇ и ν_Η

- 6 027925 одного плеча антитела, (νί) фрагмент бАЬ (Аагб с1 а1., (1989) Ыа!иге 341: 544-546), который состоит из ν_Ηдомена; (νίί) выделенная гипервариабельная область (СБК); и (νίίί) нанотело, вариабельная область тяжёлой цепи, содержащая один вариабельный домен и два константных домена.

Помимо этого, хотя два домена Ρν фрагмента, ν₂ и ν_Η, кодируются отдельными генами, их можно связывать, применяя методы рекомбинантных ДНК, посредством синтетического линкера, который позволяет их получать в виде одной белковой цепи, в которой области V и ν_Η соединены попарно с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Ρν, или 8ϋΡν); см., например, Вйб е1 а1. (1988) 8с1еисе 242:423-426; и НиЧоп е! а1. (1988) Ргос. №д1. Асаб. 8сг И8А 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающий участок антитела.

Выделенное антитело означает антитело, которое, по существу (практически), не содержит других антител с другой антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывает антиген X, по существу (практически), не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от антигена X). Однако выделенное антитело, которое специфически связывает антиген X, может проявлять перекрёстную реактивность по отношению к другим антигенам, таким как молекулы антигена X (особей) другого вида. Согласно некоторым вариантам выделенное антитело специфически связывается с человеческим антигеном X и не участвует в перекрёстной реакции с другими (не человеческого происхождения) антигенами X. Кроме того, выделенное антитело практически не содержит другой клеточный материал и/или химические реагенты.

Моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела означает препарат, содержащий молекулы антитела одного молекулярного состава, который проявляет одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Человеческое антитело означает антитело, имеющее вариабельные области, в которых как каркасные, так и СБК области (и константная область, если таковая имеется) получены из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии человека. Человеческие антитела могут включать поздние модификации, в том числе природные или синтетические модификации. Человеческие антитела могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями (генов) иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введённые с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза ίη νίίτο или с помощью соматической мутации ίη νίνο). Однако термин человеческое антитело не включает антитела, в которых последовательности СБК из зародышевой линии млекопитающего другого вида, такого как мышь, были привиты на каркасные последовательности антитела человека.

Человеческое моноклональное антитело означает антитело, проявляющее одну (единственную) специфичность связывания, имеющее вариабельные области, в которых как каркасные, так и СБК участки получены из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии человека. Согласно одному варианту человеческие моноклональные антитела получают при использовании гибридомы, которая включает В клетку трансгенного, отличного от человека, животного, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжёлой цепи и трансген человеческой лёгкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой. Термин алифатический означает линейную или разветвлённую, насыщенную или ненасыщенную, неароматическую углеводородную частицу (молекулу, группу, радикал), содержащую указанное число углеродных атомов (например, как в С₃ алифатический, С₁-С₅алифатический или С₁-С₅ алифатический, причём последние два выражения являются синонимами для определения алифатической частицы, содержащей от 1 до 5 углеродных атомов), или в случае, когда число углеродных атомов однозначно не определено, от 1 до 4 углеродных атомов (от 2 до 4 углеродных атомов в случае ненасыщенных алифатических частиц).

Термин алкил означает насыщенный алифатический радикал (группу), к которому применимы те же самые правила для обозначения числа атомов. Например (для наглядности), С₁-С₄ алкильные радикалы включают, но без ограничения, метил, этил, пропил, изопропил, изобутил, трет-бутил, 1-бутил, 2бутил и т.п. Термин алкилен означает двухвалентный аналог алкильной группы, например, СН₂СН₂, СН₂СН₂СН₂ и СН₂СН₂СН₂СН₂.

Термин алкенил означает алифатический радикал (группу), содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, к которому применимы те же самые правила для обозначения числа атомов. Например (для наглядности), С₂-С₄ алкенильные радикалы включают, но без ограничения, этенил (винил), 2-пропенил (аллил или проп-2-енил), цис-1-пропенил, транс-1-пропенил, Е- (или Ζ-) 2бутенил, 3-бутенил, 1,3-бутадиенил (бут-1,3-диенил) и т.п.

Термин алкинил означает алифатический радикал (группу), содержащий по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, к которому применимы те же самые правила для обозначения числа атомов. Например (для наглядности), С2-С4 алкинильные группы включают этинил (ацетиленил), пропаргил (проп-2-инил), 1-пропинил, бут-2-инил и т.п.

Термин циклоалифатический означает алифатический или неалифатический, неароматический углеводородный радикал (группу), имеющий по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, который содержит от 1 до 3 циклов, причём каждый цикл включает от 3 до 8 (предпочтительно от 3 до 6) углеродных атомов. Термин циклоалкил означает циклоалифатический радикал, в котором каждый цикл является насыщенным. Термин циклоалкенил означает циклоалифатический радикал, в котором

- 7 027925 по меньшей мере один цикл содержит по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Термин циклоалкинил означает циклоалифатический радикал, в котором, по меньшей мере, один цикл содержит по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь. Например (для наглядности), циклоалифатические радикалы включают, но без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил и адамантил. Предпочтительными алифатическими радикалами являются циклоалкильные радикалы, в особенности циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил. Термин циклоалкилен означает двухвалентный аналог циклоалкильной группы.

Термин гетероциклоалифатический означает циклоалифатический радикал, в котором, по меньшей мере в одном цикле, до трёх (предпочтительно от 1 до 2) углеродных атомов замещены на гетероатом, независимо выбранный из атомов Ν, О или 8, где атомы N и 8, необязательно, могут быть окисленными, а атом Ν, необязательно, может быть кватернизованным (четвертичным). Аналогично, термины гетероциклоалкил, гетероциклоалкенил и гетероциклоалкинил означают циклоалкильный, циклоалкенильный или циклоалкинильный радикал (группу), соответственно, в котором по меньшей мере один цикл модифицирован подобным образом. Примеры циклоалифатических радикалов (групп) включают азиридинил, азетидинил, 1,3-диоксанил, оксетанил, тетрагидрофурил, пирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, тетрагидропиранил, тетрагидротиопиранил сульфон, морфолинил, тиоморфолинил, тиоморфолинил сульфоксид, тиоморфолинил сульфон, 1,3-диоксоланил, тетрагидро-1,1-диоксотиенил, 1,4диоксанил, тиетанил и т.п.

Термин гетероциклоалкилен означает двухвалентный аналог гетероциклоалкильной группы (радикала).

Термины алкокси, арилокси, алкилтио и арилтио означают -О(алкил), -О(арил), -8(алкил) и -8(арил) соответственно. Примерами являются метокси, фенокси, метилтио и фенилтио соответственно.

Термин галоген или галоид означает фтор, хлор, бром или иод.

Термин арил означает углеводородный радикал (группу), представляющий собой моно-, би- или трициклическую систему, в которой каждый цикл содержит от 3 до 7 углеродных атомов и по меньшей мере один цикл является ароматическим. Циклы в циклической системе могут быть конденсированы друг с другом (как в нафтиле) или связаны друг с другом (как в бифениле (дифениле)) и могут быть конденсированы или связаны с неароматическими циклами (как в инданиле или циклогексилфениле). Например, в качестве иллюстрации арильные радикалы (группы) включают, но без ограничения, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, бифенил, фенантрил, антраценил и аценафтил. Термин арилен означает двухвалентный аналог арильной группы, например 1,2-фенилен, 1,3-фенилен или 1,4-фенилен.

Термин гетероарил означает радикал (группу), имеющую моно-, би- или трициклическую систему, в которой каждый цикл содержит от 3 до 7 углеродных атомов и по меньшей мере один цикл является ароматическим циклом, содержащим от 1 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из атомов Ν, О или 8, где атомы N и 8, необязательно, могут быть окисленными, а атом Ν, необязательно, может быть кватернизованным (четвертичным). Так, по меньшей мере один цикл, содержащий гетероатом, может быть конденсирован с циклами другого типа (как в бензофураниле или тетрагидроизохинолиле) или непосредственно связан с циклами другого типа (как в фенилпиридиле или в 2-циклопентилпиридиле). Например (для наглядности), гетероарильные радикалы (группы) включают пирролил, фуранил, тиофенил (тиенил), имидазолил, пиразолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, триазолил, тетразолил, пиридил, Ν-оксопиридил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, хинолинил, изохинолинил, хиназолинил, циннолинил, хиназолинил, нафтиридинил, бензофуранил, индолил, бензотиофенил, оксадиазолил, тиадиазолил, фенотиазолил, бензимидазолил, бензотриазолил, дибензофуранил, карбазолил, дибензотиофенил, акридинил и т.п. Термин гетероарилен означает двухвалентный аналог арильной группы. Если указывается, что радикал (группа, частица) может быть замещённым, например, используется выражение незамещённый или замещённый или необязательно замещённый, например незамещённый или замещённый С1-С5 алкил или необязательно замещённый гетероарил, такой радикал может иметь один или более независимо выбранных заместителей, предпочтительно от одного до пяти, более предпочтительно один или два. Специалист в данной области техники (в области органического синтеза) может выбрать заместители и тип заместителей с учётом радикала (группы), с которым связан заместитель, чтобы получить соединения, которые являются химически устойчивыми и которые можно синтезировать методами, известными из уровня техники, а также методами, представленными в настоящей заявке. Термины арилалкил, (гетероциклоалифатический радикал)алкил, арилалкенил, арилалкинил, биарилалкил и т.п. означают алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, соответственно, замещённый арилом, гетероциклоалифатическим радикалом, биарилом и т.д., соответственно, со свободной (ненасыщенной) валентностью в алкильном, алкенильном или алкинильном радикале, например бензил, фенетил, Ν-имидазоилэтил, Ν-морфолиноэтил и т.п. И напротив, термины алкиларил, алкенилциклоалкил и т.п. означают арильный, циклоалкильный и т.д. радикал, соответственно, замещённый алкильным, алкенильным и т.д. радикалом (группой), соответственно, например метилфенил (толил) или аллилциклогексил. Термины гидроксиалкил, галогеналкил, алкиларил, цианоарил и т.п. означают алкильный, арильный и т.д. радикал, соответственно, замещённый одним или более определённых замес- 8 027925 тителей (гидроксилом, галогеном и т.д. соответственно).

Наглядные примеры возможных заместителей включают, но без ограничения, алкил (в частности, метил или этил), алкенил (в частности, аллил), алкинил, арил, гетероарил, циклоалифатический радикал, гетероалифатический радикал, галоген (в частности, фтор), галогеналкил (в частности, трифторметил), гидроксил, гидроксиалкил (в частности, гидроксиэтил), циано, нитро, алкокси, -О(гидроксиалкил), -О(галогеналкил) (в частности -ОСР₃), -О(циклоалкил), -О(гетероалкил), -О(арил), алкилтио, арилтио, =О, =ΝΗ ,=Ы(алкил), =ΝΟΗ, =ЫО(алкил), -С(=О)(алкил), -С(=О)Н, -СО₂Н, -С( О)\НОН. -С(=О)О(алкил), -С(=О)О(гидроксиалкил), -С(=Ο)NΗ₂, -С(=Ο)NΗ(алкил), -С(=О)Ы(алкил)₂, -ОС(=О)(алкил), -ОС(=О)(гидроксиалкил), -ОС(=О)О(алкил), -ОС(=О)О(гидроксиалкил), -ОС(=Ο)NΗ₂, -ΟС(=Ο)NΗ(алкил), -ОС(=О)Ы(алкил)₂, азидо, -ΝΗ₂, -NΗ(алкил), -Л(алкил)₂, -ЛЩарил), -NΗ(гидроксиалкил), -МИС(=О)(алкил), -ΝΗϋ^Η, -ΝΗ^^ΝΗ^ ^С(=О^(алкил), -МИС(=О)^алкил)₂, -ΝΗ^=ΝΗ)ΝΗ₂, -О8О₂(алкил), -8Η, -8(алкил), -8(арил), -8(циклоалкил), -8(=О)алкил, -8О₂(алкил), -8О₂ПП₂, -8О₂ПП(алкил), -8О₂Ы(алкил)₂ и т.п.

Если замещаемый (имеющий заместитель) радикал (группа) является алифатическим радикалом (группой), предпочтительными заместителями являются арил, гетероарил, циклоалифатический радикал, гетероалифатический радикал, галоген, гидроксил, циано, нитро, алкокси, -О(гидроксиалкил), -О(галогеналкил), -О(циклоалкил), -О(гетероциклоалкил), -О(арил), алкилтио, арилтио, =О, =ΝΗ, =Ы(алкил), =МОИ, =ЫО)(алкил), =ЫО(алкил), -СО₂Н, -С^О)^^^ -С(=О)О(алкил), -С(=О)О(гидроксиалкил), -С(=О)МИ₂, -С(=О)МИ(алкил), -С(=О)Ы(алкил)₂, -ОС(=О)(алкил), -ОС(=О)(гидроксиалкил), -ОС(=О)О(алкил), -ОС(=О)О(гидроксиалкил), -ОС(=О)МИ₂, -ОС(=О)МИ(алкил), -ОС(=О)Ы(алкил)₂, азидо, -ΝΗ₂, -МИ(алкил), -Ы(алкил)₂, -МИ(арил), -МИ(гидроксиалкил), -МИС(=О)(алкил), -МИС^ОЩ, -ΝΗ^^ΝΗ^ -НПС^О^Щалкил), -NΗС(=Ο)N(алкил)₂, -ΝΗ^=ΝΗ)ΝΗ₂, -О8О₂(алкил), -8Η, -8(алкил), -8(арил), -8(=О)алкил, -8(циклоалкил), -8О₂(алкил), -δΟ₂NΗ₂, -δΟ₂NΗ(алкил) и -§О₂Ы(алкил)₂. Более предпочтительными заместителями являются галоген, гидроксил, циано, нитро, алкокси, -О(арил), =О, =NΟΗ, =ЫО(алкил), -ОС(=О)(алкил), -ОС(=О)О(алкил), -ОС^О)^^, -ОС(=О)NΗ(алкил), -ОС(=О)Ы(алкил)₂,азидо, -ΝΗ₂, -ЛЩалкил), -Ы(алкил)₂, -ЛЩарил), -NΗС(=О)(алкил), -ЛпС^ОЩ, -NΗС(=Ο)NΗ₂, -NΗС(=Ο)NΗ(алкил), -ПЫС^О^^лкилХ и -ΝΗί'.’(=ΝΗ)ΝΗ₂. Особенно предпочтительными заместителями являются фенил, циано, галоген, гидроксил, нитро, С^Сд-алкокси, О(С₂-С₄алкилен)ОН и О(С₂-С₄-алкилен)галоген.

Если замещаемый радикал (группа) является циклоалифатическим, гетероциклоалифатическим, арильным или гетероарильным радикалом, то предпочтительными заместителями являются алкил, алкенил, алкинил, галоген, галогеналкил, гидроксил, гидроксиалкил, циано, нитро, алкокси, -О(гидроксиалкил), -О(галогеналкил), -О(арил), -О(циклоалкил), алкилтио, арилтио, -С(=О)(алкил), -С(=О)Н, -СО₂Н, -С^О)^^^ -С(=О)О(алкил), -С(=О)О(гидроксиалкил), -С^О)^^, -С(=О)NΗ(алкил), -С(=О)Ы(алкил)₂, -ОС(=О)(алкил), -ОС(=О)(гидроксиалкил), -ОС(=О)О(алкил), -ОС(=О)О(гидрокси алкил), -ОС^О)^^, -ОС(=О)NΗ(алкил), -ОС(=О)Ы(алкил)₂, азидо, -ΝΗ₂, -ЫЩалкил), -Ы(алкил)₂, -ПЩарил), -ЛЩгидрокси алкил), -NΗС(=Ο)(алкил), -ППС^ОЩ, -NΗС(=Ο)NΗ₂, -NΗС(=Ο)NΗ(алкил), -NнС(=О)N(алкил)₂, -ΝΗ0(=ΝΗ)ΝΗ₂, -О§О₂(алкил), -8Η, -8(алкил), -8(арил), -8(циклоалкил), -8(=О) алкил, -ЗО₂(алкил), -δΟ₂NΗ₂, -δΟ₂NΗ(алкил) и -8О₂Ы(алкил)₂. Более предпочтительными заместителями являются алкил, алкенил, галоген, галогеналкил, гидроксил, гидроксиалкил ,циано, нитро, алкокси, -О(гидроксиалкил), -С(=О)алкил, -С(=О)Н, -С(=Ο)NΗΟΗ, -(=О)О(алкил), -С(=О)О(гидроксиалкил), -0(=Θ)ΝΗ₂, -С(=О)NΗ(алкил), -С(=О)Ы(алкил)₂, -ОС(=О)(алкил), -ОС(=О)(гидроксиалкил), -ОС(=О)О(алкил), -ОС(=О)О(гидроксиалкил), -ОС (^)^¾ -ОС(=О)NΗ(алкил), -ОС(=О)Ы(алкил)₂, -ΝΗ2, -ЛЩалкил), -\(а.п<и.1), -НЩарил), -ЫЫС^ОХалкил), -ΝΗϋ^Η, -ΝΗϋ^ΝΗ, -NΗС(=Ο)NΗ(алкил), -NΗС(=Ο)N(алкил)₂ и -ΝΗί'.’(=ΝΗ)ΝΗ₂. Особенно предпочтительны С1-С₄-алкил, циано, нитро, галоген и С₁-С₄-алкокси.

Если указывается интервал (диапазон), как, например, С₁-С5-алкил или от 5 до 10%, такой интервал включает крайние точки интервала, например, С₁ и С₅ в первом случае и 5% и 10% во втором случае.

Если точно не указываются конкретные стереоизомеры (например, выделенной в структурной формуле жирным шрифтом или пунктиром связью при соответствующем стереоцентре, изображением двойной связи в структурной формуле с заместителями в Е- или Ζ-конфигурации или с применением стереохимической номенклатуры), то все стереоизомеры включены в объём изобретения в виде чистых соединений, а также в виде их смесей. Если особо не указано иное, индивидуальные энантиомеры, диастереомеры, геометрические изомеры и их комбинации и смеси охватываются настоящим изобретением.

Специалисты в данной области техники понимают, что соединения могут быть в виде таутомеров (например, в виде кето- и енольных форм), в виде резонансных форм, и в виде цвиттер-ионов, которые эквивалентны формам, изображённым в структурных формулах в данной заявке, и что эти структурные формулы охватывают такие таутомерные, резонансные и цвиттер-ионные формы.

Выражение фармацевтически приемлемый сложный эфир означает сложный эфир, который гидролизуется ίη νίνο (например, в организме человека), давая исходное соединение или его соль, или сам по себе проявляет активность, аналогичную активности исходного соединения. Подходящие сложные

- 9 027925 эфиры включают С1-С₅ алкиловые, С₂-С₅ алкениловые или С₂-С₅ алкениловые сложные эфиры, в особенности метиловые, этиловые или н-пропиловые эфиры.

Фармацевтически приемлемая соль означает соль соединения, применимая для приготовления фармацевтической композиции. Если соединение имеет одну или более основных групп, соль может представлять собой кислотно-аддитивную соль (соль присоединения кислоты), такую как сульфат, гидробромид, тартрат, мезилат, малеат, цитрат, фосфат, ацетат, памоат (эмбонат), гидроиодид, нитрат, гидрохлорид, лактат, метилсульфат, фумарат, бензоат, сукцинат, мезилат, лактобионат, суберат, тозилат и т.п. Если соединение имеет одну или более кислотных групп, соль может представлять собой такую соль, как соль кальция, соль калия, соль магния, соль меглумина (меглюмина), соль аммония, соль цинка, соль пиперазина, соль трометамина, соль лития, соль холина, соль диметиламина, соль 4- фенилциклогексиламина, бензатиновая соль, соль натрия, соль тетраметиламмония и т.п. Полиморфные кристаллические формы и сольваты также входят в объём настоящего изобретения.

Соединения.

Предпочтительным вариантом изобретения в соответствии с формулой (I) является соединение, имеющее структуру, представленную формулой (1а), или его фармацевтически приемлемая соль. Согласно данному варианту группа ΝΗΚ^1α связана с С6, где К^1а имеет значение по определению выше применительно к формуле (I)

Более предпочтительным вариантом является соединение, имеющее структуру, представленную формулой (ГЬ), или её фармацевтически приемлемая соль, где К^1а имеет значение по определению выше применительно к формуле (I). В соединении формулы (ГЬ) стереохимия С27- метильной группы соответствует стереохимии природного унциаламицина (структурную формулу унциаламицина см. выше).

соединениях, соответствующих формуле (I) или другим формулам где-либо в данном описании, алкильная, алкиленовая, арильная, ариленовая, гетероарильная, гетероариленовая, циклоалкильная, циклоалкиленовая, гетероциклоалкильная или гетероциклоалкиленовая группа является либо незамещенной, либо замещенной, предпочтительной является незамещённый вариант. В соединениях формулы (I) или в соединениях, соответствующих другим формулам в данном описании, К² предпочтительно означает Н или С1-С3 алкил, более предпочтительно Н. В соединении формулы (I) или в соединениях, соответствующих другим формулам в данном описании, К³ предпочтительно означает С1-С₃ алкил, более предпочтительно Ме. В соединениях формулы (I) или в соединениях, соответствующих другим формулам в данном описании, К⁴ предпочтительно означает ОН, ОК¹⁰ или ОС(=О)К¹⁰ (причём К¹⁰ предпочтительно означает С1-С3 алкил), более предпочтительно ОН. В соединениях формулы (I) или в соединениях, соответствующих другим формулам в данном описании, К⁵ предпочтительно означает ОН, ОК¹⁰ или ОС(=О)К¹⁰ (причём К¹⁰ предпочтительно означает С1-С₃ алкил), более предпочтительно ОН. В соединениях формулы (I) или в соединениях, соответствующих другим формулам в данном описании, К⁶ предпочтительно означает Н. В соединениях формулы (I) или в соединениях, соответствующих другим формулам в данном описании, К⁷ предпочтительно означает ОН, ОК¹⁰ или ОС(=О)К¹⁰ (где К¹⁰ предпочтительно означает С₁-С₃ алкил), более предпочтительно ОН. В соединениях формулы (I) или в соединениях, соответствующих другим формулам в данном описании, К⁹ предпочтительно означает

Более предпочтительно К⁹ означает

- 10 027925

в особенности первый.

В соединениях формулы (I) или в соединениях, соответствующих другим формулам в данном описании, К¹⁰ предпочтительно означает С^С₆ алкил, циклогексил, циклопентил, фенил, фуранил или пиридил. Более предпочтительно К¹⁰ означает метил, этил, пропил или изопропил.

В соединениях формул (I), (1а), (1Ь) или в соединениях, соответствующих другим формулам в других местах данного описания, К⁸ предпочтительно означает остаток боковой цепи α-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аргинина, аспарагиновой кислоты, цитруллина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, фенилаланина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Более предпочтительно К⁸ означает остаток боковой цепи глицина, лизина, цитруллина или серина. Предпочтительно стереохимия при хиральном атоме углерода соответствует стереохимии природной протеиногенной α-аминокислоты, т.е. Б-изомеру. Согласно предпочтительному варианту в соединениях, имеющих структуру, соответствующую формулам (I), (1а) и/или (1Ь), заместитель К^1а выбран из группы, состоящей из Н, Ме,

Согласно более предпочтительному варианту в соединениях, имеющих структуру согласно формулам (I), (1а) и/или (1Ь), группа К^1а означает Н,

η₂ν

Конкретные соединения по данному изобретению включают соединения, имеющие структуру, от-

Конъюгаты.

Согласно другим вариантам изобретение включает соединение, имеющее структуру, представленную формулой (I), (Та), (1Ь), (11а), (ПЬ), (11с), (Пб), (Пе), (Пд) или (НИ), конъюгированное с нацеливающей молекулой, которая специфически или предпочтительно связывается с химическим структурным элементом на раковой клетке. Предпочтительно нацеливающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий участок, а химический структурный элемент представляет собой опухолеассоциированный антиген. Предпочтительно конъюгация осуществляется за счёт химической связи с группой К⁰.

Согласно другому варианту предусматривается конъюгат, представленный формулой (III), содержащий цитотоксическое соединение согласно данному изобретению и лиганд [О(Х°)аС(Х²)ъ]т2 (III) где Ζ означает лиганд; О означает цитотоксическое соединение по данному изобретению (например, соединение, представленное формулой (I), ^а) или (ГЬ)); а элемент -(Х°)_аС(Х²)_Ь- совместно называется линкерной частицей или линкером, поскольку он связывает Ζ и О. В линкере С означает отщепляемую группу, предназначенную для отщепления в месте или близ места предполагаемого биологичеО Ζ ского действия соединения □; X и X называются спейсерными частицами (или спейсерами), так как они находятся между (разносят, разделяют) □ и С и С и Ζ, соответственно; нижние индексы а и Ь, независимо, означают 0 или 1 (т.е. присутствие Х° и/или Χ^Ζ является необязательным); а нижний индекс т означает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (предпочтительно 1, 2, 3 или 4). Более подробно компоненты О, Х°, С, Χ^Ζ и Ζ описаны ниже.

Лиганд Ζ, например, антитело - выполняет нацеливающую функцию. Связываясь с целевой тканью (тканью-мишенью) или клеткой (клеткой-мишенью), в которой локализован антиген или рецептор, лиганд Ζ направляет к ней конъюгат.

Предпочтительно целевая ткань или клетка представляет собой раковую ткань или клетку, а антиген или рецептор представляет собой опухолеассоциированный антиген, т.е. антиген, который экспрессируется исключительно раковыми клетками или избыточно экспрессируется (сверхэкспрессируется) раковыми клетками по сравнению с нераковыми клетками. Отщепление группы С в целевой ткани или в клетке высвобождает соединение О, что позволяет ему локально проявлять цитотоксический эффект. В некоторых случаях конъюгат интернализуется в клетку-мишень посредством эндоцитоза, и расщепление происходит внутри клетки-мишени. Таким образом, достигается точная доставка соединения □ в область предполагаемого действия, что позволяет снизить необходимую дозу. Также обычно соединение О в виде конъюгата является биологически неактивным (или значительно менее активным), тем самым снижается нежелательная токсичность по отношению к нецелевой ткани или к нецелевым клеткам. Это важное обстоятельство, так как противораковые лекарственные средства часто бывают высокотоксичными по отношению к клеткам в целом.

Как показывает нижний индекс т, каждая молекула лиганда Ζ может давать конъюгат более чем с одной молекулой соединения □ в зависимости от числа сайтов лиганда Ζ, доступных для конъюгации, и условий эксперимента. Специалисты в данной области техники понимают, что хотя каждая отдельная молекула лиганда Ζ связывается с целым числом молекул соединения О, анализ препарата конъюгата может показывать нецелочисленное значение отношения молекул соединения О к лиганду Ζ, которое является статистическим средним.

Лиганд Ζ и его конъюгация.

Предпочтительно лиганд Ζ представляет собой антитело. Для удобства и краткости, но не с целью ограничения, приводимое ниже в данном описании подробное обсуждение конъюгации лиганда Ζ описывается при условии, что этот лиганд является антителом, но специалисты в данной области техники понимают, что конъюгироваться могут лиганды Ζ другого типа, с соответствующими поправками. Например, конъюгаты с фолиевой кислотой в качестве лиганда могут нацеливаться на клетки, на поверхности которых находится рецептор фолиевой кислоты (фолат-рецептор) (Λ'Μιον е! а1., Вюогд. Меб. СИет. Бе!!. 2008, 18(16), 4558-4561; Беатой е! а1., Сапсег Кез. 2008, 68 (23), 9839- 9844). По той же причине ниже подробно обсуждается главным образом вариант, когда соотношение молекул антитела Ζ и соединения О составляет 1:1.

Предпочтительно лиганд Ζ представляет собой антитело против опухолеассоциированного антигена, которое даёт возможность конъюгату, содержащему такой лиганд Ζ, селективно нацеливаться на раковые клетки. Примеры таких антигенов включают мезотелин, простатический специфический мембранный антиген (Р8МА), СШ9. СЭ22, СЭ30, СЭ70, СЭ200 (также известный как ОХ-2), В7Н4 (также известный как О8Е), протеинтирозинкиназу 7 (РТК7), КО1, СТБА-4 и СО44. Антитело может представлять собой антитело животного (например, мышиное), химерное, гуманизированное или предпочтительно человеческое антитело. Предпочтительно антитело является моноклональным, главным образом, моноклональным человеческим антителом. Получение человеческих моноклональных антител против вышеприведённых антигенов раскрывается в следующих документах: Когтап е! а1., заявка на патент США 2009/0074660 А1 (В7Н4); Као-Хнк е! а1., заявка на патент США 2009/0142349 А1 А2 (СО19); Кпд е! а1., заявка на патент США 2010/0143368 А1 (СО22); Ке1ег е! а1., патент США 7387776 В2 (2008) (СО30); Тегге!! е! а1., заявка на патент США 2009/0028872 А1 (СО70); Оогс/унзк! е! а1., патент США 7238352 В2

- 12 027925 (2007) (СЭ200); Когтап е! а1., патент США 6984720 В1 (2006) (СТЬА-4); Когтап е! а1., патент США 8008449 В2 (2011) (РЭ-1); Ниапд е! а1., заявка на патент США 2008/0279868 А1 (Р8МА); Тегге!! е! а1., заявка на патент США 2010/0034826 А1 (РТК7); Наткшк е! а1., патент США 7335748 В2 (2008) (КС1); Тегге!! е! а1., Международная заявка 40 2009/045957 А1 (мезотелин); и Хи е! а1., заявка на патент США 2010/0092484 А1 (СО44); описания которых включены в настоящее изобретение посредством отсылки.

Лиганд Ζ может также представлять собой фрагмент антитела или миметик антитела, такой как аффитело (аТйЬойу), У-домен (йАЬ, вариабельный домен тяжёлой цепи), нанотело, одновалентное антитело (ишЬойу), ΟΛΒΡίη (искусственный белок с анкириновыми повторами), антикалин, уеткаЬойу, дуокалин, липокалин или авимер. Любая из нескольких различных реакционноспособных групп в лиганде Ζ может служить в качестве сайта конъюгации, включая ε-аминогруппы в лизиновых остатках, боковые углеводные фрагменты, карбоксильные группы, дисульфидные группы и тиольные группы. Реакционноспособная группа каждого типа является компромиссной, имеющей некоторые преимущества и некоторые недостатки. Обзор по реакционноспособным группам, применимым для конъюгации, см., например, в Сагпей, Айу. Эгид Эейуету Кеу. 53 (2001), 171-216 и ЭиЬо\ус1йк апй 4а1кег, Рйагтасо1оду & Тйетареийск 83 (1999), 67-123, их описания включены в настоящее изобретение посредством отсылки. Согласно одному варианту лиганд Ζ связывается по ε-аминогруппе лизина. Большинство антител содержит множество доступных ε-аминогрупп лизина, которые могут связываться с образованием амидных, мочевинных, тиомочевинных и карбаматных групп (связей) методами, известными в уровне техники, включая модификации с применением гетеробифункционального агента (описанного ниже). Однако трудно контролировать, какие из и сколько ε-аминогрупп прореагируют, это приводит к возможным различиям между препаратами конъюгатов из разных партий. Конъюгация может приводить к нейтрализации протонированной ε-аминогруппы, важной для сохранения естественной конформации антитела, может происходить по остатку лизина рядом с сайтом или по сайту связывания антигена, причём любой из этих вариантов является нежелательным. Согласно другому варианту лиганд Ζ может связываться (конъюгировать) по боковой углеводной цепи, поскольку многие тела являются гликозилированными. Боковые углеводные цепи можно окислять периодатом, получая альдегидные группы, которые в свою очередь могут реагировать с аминами с образованием иминогруппы, например семикарбазона, оксима или гидразона. При необходимости иминогруппу можно превратить в более устойчивую аминогруппу восстановлением с использованием цианоборогидрида натрия. Дополнительную информацию о конъюгации по боковым углеводным цепям см., например, статью Кой\\е11 е! а1., Ргос. №й'1 Асай. 8ск И8А 83, 2632-2636 (1986); описание которой вводится в настоящее изобретение посредством отсылки. Как и в случае лизиновых εаминогрупп, в этом случае имеются проблемы, касающиеся воспроизводимости положения сайта(ов) связывания (конъюгации) и стехиометрии. Согласно другому варианту лиганд Ζ может связываться по карбоксильной группе. Согласно одному варианту функционализируют концевую карбоксильную группу, получая карбогидразид (карбазид), который затем реагирует с молекулой, несущей альдегидную группу. См. Иксй е! а1., Вюсопщда!е СйетМгу 1992, 3, 147-153. Согласно другому варианту антитело Ζ может конъюгировать с образованием дисульфидного мостика, связывающего цистеиновый остаток в молекуле антитела Ζ и атом серы на другом участке конъюгата. Некоторые антитела не содержат свободных тиольных (сульфгидрильных) групп, но имеют дисульфидные группы, например, в шарнирной области. В этом случае свободные тиольные группы можно получать восстановлением нативных (природных) дисульфидных групп. Полученные таким образом тиольные группы можно затем использовать для конъюгации. См., например, статьи Раскагй е! а1., ВюсйетМгу 1986, 25, 3548-3552; Ктд е! а1., Сапсег Кек. 54, 6176-6185 (1994); и Эогошпа е! а1., Ха!иге Вю!есйпо1. 21(7), 778-784 (2003); описания которых включены в настоящее изобретение посредством отсылки. И в этом случае имеются трудности, связанные с местоположением сайта конъюгации и стехиометрией и возможным нарушением естественной конформации антитела.

Известно много методов введения тиольных групп в антитела без разрыва нативных дисульфидных связей, эти методы можно применять в случае лиганда Ζ по данному изобретению. В зависимости от применяемого метода можно вводить заданное число свободных сульфгидрильных групп в заранее определённые положения. Согласно одному методу получают мутантные антитела, в которых цистеин заменён на другую аминокислоту. См., например, Е1депЬто! е! а1., патент США 7521541 В2 (2009); Сййкой е! а1., Вюсоищда!е Сйет. 1994, 5, 504-507; игпоуй/ е! а1., патент США 4698420 (1987); 8йтте1 е! а1., I. Вю1. Сйет., 275 (39), 30445-30450 (2000); Ват е! а1., патент США 7311902 В2 (2007); Киап е! а1., I. Вю1. Сйет., 269 (10), 7610-7618 (1994); Рооп е! а1., I. Вю1. Сйет., 270 (15), 8571-8577 (1995). Согласно другому методу на С-конце добавляют дополнительный цистеиновый остаток. См., например, СитЬег е! а1., I. 1ттипо1, 149, 120-126 (1992); Ктд е! а1, Сапсег Кек., 54, 6176-6185 (1994); Ы е! а1., Вюсопщда!е Сйет., 13, 985-995 (2002); Уапд е! а1., Рго!еш Епдшеейпд, 16, 761-770 (2003) и 01а£коп е! а1., Рто!еш Епдшеейпд Эелдп & 8е1ес!юп, 17, 21-27 (2004). Предпочтительным методом введения свободных цистеиновых остатков является метод, предлагаемый Ьш е! а1., (международная заявка 40 2009/026274 А1), в котором аминокислотную последовательность, содержащую цистеиновый остаток, добавляют к С-концу тяжёлой цепи антитела. Этот метод позволяет вводить известное число цистеиновых остатков (один на тяжёлую

- 13 027925 цепь) в известное положение, удалённое от сайта связывания антигена. Описания всех документов, цитированных в данном абзаце, включены в настоящее изобретение посредством отсылки.

Согласно ещё одному варианту ε-аминогруппы лизина можно модифицировать с использованием гетеробифункциональных реагентов, таких как 2-иминотиолан или Х-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (8ΡΌΡ), превращая ε-аминогруппу в тиольную или дисульфидную группу - с образованием фактического имитатора цистеина. Однако этот метод имеет те же самые ограничения, относящиеся к местоположению конъюгации и к стехиометрии, обусловленные соответствующими ε-аминогруппами. Согласно ещё одному предпочтительному варианту лиганд Ζ связывается с использованием продукта нуклеофильного присоединения тиольной группы с акцепторной группой. Предпочтительной акцепторной группой является малеимидная группа, реакция которой с тиольной группой антитела показана ниже. Тиольная группа может представлять собой нативную, природную группу, или она может быть введена как описано выше.

Лиганд Ζ может также связываться с использованием функциональной группы, адаптированной для применения в клик химии, обсуждаемой ниже в данном описании.

Линкер -(Х^г)аС( Χ^Ζ)Η-.

Как отмечается выше, линкерный участок конъюгата по настоящему изобретению содержит до трёх компонентов: отщепляемую группу С и необязательные спейсеры Χ^Ζ и Х°.

Отщепляемая группа С представляет собой группу, отщепляемую в физиологических условиях, предпочтительно выбранную таким образом, чтобы она была устойчивой, пока конъюгат находится в кровотоке в плазме крови, но легко отщеплялась, когда конъюгат достигал участка (места) предполагаемого действия, расположенного рядом с клеткой-мишенью, на клетке-мишени или внутри клеткимишени. Предпочтительно конъюгат посредством эндоцитоза интернализуется (поглощается) клеткоймишенью после связывания антитела Ζ с антигеном, выявляемым на поверхности клетки-мишени. Затем в пузырьке-везикуле клетки-мишени (ранней эндосоме, поздней эндосоме или, главным образом, в лизосоме) происходит отщепление группы С.

Согласно одному варианту группа С представляет собой группу, чувствительную к рН. Значение рН в плазме крови немного выше нейтрального, тогда как среда (рН) внутри лизосомы является кислой, около 5. Поэтому скорость отщепления группы С, отщепление которой катализируется кислотой, на несколько порядков выше внутри лизосомы, чем в плазме крови. Примеры соответствующих групп, чувствительных к кислоте, включают амиды и гидразоны цис-аконитовой кислоты, описанные в документах: 8йеп е! а1., патент США 4631190 (1986); 8йеп е! а1., патент США 5144011 (1992); 8йеп е! а1., Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Соттип. 102, 1048-1054 (1981) и Уапд е! а1., Ргос. Х'аО Аса4. 8с1 (И8А), 85, 1189-1193 (1988); описания которых включены в настоящее изобретение посредством отсылки.

Согласно другому варианту группа С означает дисульфид. Дисульфиды могут расщепляться по тиол-дисульфидному механизму со скоростью, зависящей от концентрации тиола в окружающей среде. Так как внутриклеточная концентрация глутатиона и других тиолов выше их сывороточных концентраций, скорость расщепления дисульфида будет выше внутри клетки. Кроме того, скорость обмена тиолдисульфид можно модулировать, корректируя пространственную и электронную структуру дисульфида (например, алкил-арилдисульфид по сравнению с алкил-алкилдисульфидом; замена в арильном кольце и т.д.), что позволяет моделировать дисульфидные связи с повышенной устойчивостью в сыворотке крови или с конкретной скоростью расщепления. Дополнительную информацию, относящуюся к расщепляемым дисульфидным группам в конъюгатах, см., например, в Тйогре е! а1., Сапсег Кез. 48, 6396-6403 (1988); 5апй е! а1., патент США 7541530 В2 (2009); Ν§ е! а1., патент США 6989452 В2 (2006); Ν§ е! а1., международная заявка \\Ό 2002/096910 А1; Воу4 е! а1., патент США 7691962 В2; и 8ий е! а1., заявка на патент США 2010/0145036 А1; описания которых включены в настоящее изобретение посредством отсылки.

Предпочтительная группа С содержит пептидную связь, которая предпочтительно расщепляется протеазой в предполагаемом месте (области) действия по сравнению с протеазой в сыворотке крови. Как правило, группа С содержит от 1 до 20 аминокислот, предпочтительно от 1 до 6 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 3 аминокислот Аминокислота(ы) может(могут) быть природной(ыми) и/или неприродной(ыми) аминокислотой(ами). Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, образованные из них, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, цитруллин и О-фосфосерин. Термин аминокислоты также включает аналоги и миметики аминокислот. Аналоги представляют собой соединения, имеющие структуру природной аминокислоты общей формулы Н^(К)СНСО₂Н за исключением того, что группа К не присутствует в природных аминокислотах. Примеры аналогов включают гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид и метионинметилсульфоний. Миметик аминокислоты представляет собой соединение, имеющее структу- 14 027925 ру, отличную от общей химической структуры α-аминокислоты, но функции которого до некоторой степени аналогичны функции α-аминокислот. Предполагается, что термин неприродная аминокислота относится к Ό''-стереоизомерам, тогда как природные аминокислоты являются Б'-аминокислотами. Предпочтительно группа С содержит аминокислотную последовательность, сайт расщепления на которой распознаётся протеазой. Из уровня техники известно множество последовательностей, сайты расщепления которых известны. См., например, Ма!ауозН1 е! а1. 8с1епсе 247: 954 (1990); 1)ипп е! а1. Ме!Н. Ηπ/νто1. 241: 254 (1994); 8е1йаН е! а1. Ме!Н. Еп/уто1. 244: 175 (1994); ТНотЬеггу, Ме!Н. Еп/уто1. 244: 615 (1994); \¥еЬег е! а1. Ме!Н. Еп/уто1. 244: 595 (1994); 8тйН е! а1. Ме!Н. Еп/уто1. 244: 412 (1994); и Боиу1ег е! а1. Ме!Н. Еп/уто1. 248: 614 (1995); описания которых включены в настоящее изобретение посредством отсылки.

Для конъюгатов, не предназначенных для интернализации клеткой, группу С можно выбрать таким образом, чтобы они расщеплялись протеазой, присутствующей во внеклеточном матриксе вблизи тканимишени, например протеазой, высвобождающейся соседними гибнущими клетками, или опухолеассоциированной протеазой. Примерами внеклеточных опухолеассоциированных протеаз являются матриксные металлопротеазы (ММР), тимет-олигопептидаза (ТОР) и СЭ10.

В конъюгатах, предназначенных для интернализации клеткой, группа С предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную с целью расщепления эндосомальной или липосомальной протеазой, в особенности последней. Неограничивающие примеры таких протеаз включают катепсины В, С, Ό, Н, Б и 8, в особенности В. Катепсин В предпочтительно расщепляет пептиды по сайту -АА²-АА¹-, где АА¹ означает основную аминокислоту или аминокислоту с сильной водородной связью (такую как лизин, аргинин или цитруллин), а АА² означает гидрофобную аминокислоту (такую как фенилаланин, валин, аланин, лейцин или изолейцин), например Уа1-Сй (где Сй означает цитруллин) или Уа1-Буз. (В данном описании аминокислотные последовательности представлены в направлении от Ν-кС, как в Н^-АА²-ААЙСО₂Н, если в контексте однозначно не указывается иное.) Дополнительные сведения, относящиеся к группам, расщепляемым с помощью катепсинов, представлены в статьях ОиЬо^сЫк е! а1., Вюгд. Мей. СНет. Бе!!. 8, 3341-3346 (1998); ОиЬо^сЫк е! а1., Вюогд. Мей. СНет. Бе!!, 8 3347-3352 (1998) и ОиЬо^сЫк е! а1., Вюсоп)ида!е СНет. 13, 855-869 (2002); описания которых включены в настоящее изобретение посредством отсылки. Другим ферментом, который можно применять для отщепления пептидильных линкеров, является легуамаин, лизосомальная цистеинпротеаза, которая расщепляет преимущественно по сайту А1а-А1а-Азп.

Согласно одному варианту группа С означает пептид, содержащий последовательность из двух аминокислот -АА²-АА¹-, в которой АА¹ означает лизин, аргинин или цитруллин, а АА² означает фенилаланин, валин, аланин, лейцин или изолейцин. Согласно другому варианту группа С представляет собой последовательность, содержащую от одной до пяти аминокислот, выбранную из группы, состоящей из Уа1-Сй, А1а-Уа1, Уа1-А1а-Уа1, Буз-Буз, А1а-Азп-Уа1, Уа1-Беи-Буз, СН-СН, Уа1-Буз, А1а-А1а-Азп, Буз, Сй, 8ег и О1и. Получение и дизайн отщепляемых групп С, состоящих из одной аминокислоты, описано в патенте США 2010/0113476 А1 на имя СНеп е! а1., описание которого включено в настоящее изобретение посредством отсылки.

Также группа С может представлять собой фотоотщепляемую группу, например нитробензиловый эфир, отщепляемый под действием света.

Группа С может быть связана непосредственно с антителом Ζ или с соединением Ό; т.е. в определённых случаях спейсеры Χ^Ζ и Х° могут отсутствовать. Например, если группа С представляет собой дисульфид, в котором один из двух атомов серы принадлежит цистеиновому остатку или его заменителю в молекуле антитела Ζ. Или группа С может представлять собой гидразонную группу, связанную с альдегидной группой в боковой углеводной цепи антитела. Или группа С может представлять собой пептидную связь, образованную ε-аминогруппой лизинового остатка в молекуле антитела Ζ. Согласно предпочтительному варианту соединение Ό непосредственно связывается с группой С за счёт пептидильной связи с карбоксильной или аминогруппой в соединении Ό. Спейсер Χ^Ζ, в случае его присутствия, обеспечивает пространственное разнесение (разделение) группы С и антитела Ζ, чтобы исключить вызываемые первой (группой С) стерические препятствия, мешающие связыванию последнего с антигеном, или вызываемые последним (Ζ) стерические препятствия, мешающие отщеплению первой (группы С). Помимо этого, спейсер Χ^Ζ можно применять для повышения растворимости конъюгатов или уменьшения их агрегационных свойств. Спейсер Χ^Ζ может содержать один или более модульных сегментов (звеньев), которые могут быть собраны в любой комбинации. Примерами звеньев (сегментов), подходящих для спейсера Χ^Ζ, являются § Н 3 г ° г 3 3

Ν—(СН₂)₂.₆—(ΝΗ)η—I |-(СН₂)₂.₆-С-1 3 (θΗ₂)₂.₆—(ΝΗ)ς—ξ ° _ь ° > 11 > 11 >

1—θ-(ΟΗ₂)₂_₆-(ΝΗ)₄-1 _и 1-(МН)_ч-(СН₂СН₂О)_г-СН₂СН₂-С-| где нижний индекс ς означает 0 или 1, а нижний индекс г означает число от 1 до 24, предпочтитель- 15 027925 но от 2 до 4. Эти звенья можно объединять, например, как показано ниже

О _н

ЧСН₂)₃-С-М-(СН₂)₂-(МН)_ч или '(СН₂)₂.₆ Ν θ (θΗ₂)2-6 (ΝΗ)α н ° П II

Спейсер Х°, если таковой присутствует, обеспечивает пространственное разнесение (разделение) группы С и соединения I), с целью исключить вызываемые последним (соединением □ ) стерические или электронные препятствия, мешающие отщеплению первой (группы С). Также спейсер Х° может способствовать введению в конъюгат дополнительных фрагментов (т.е. увеличению молекулярной массы конъюгата) и дополнительной функции. Как правило, дополнительная масса и дополнительная химическая функция влияют на период полужизни в сыворотке крови и другие свойства конъюгата. Таким образом, путём продуманного отбора спейсерных групп можно модулировать период полужизни конъюгата в сыворотке крови. Сборку спейсера Х° из модульных сегментов (звеньев) можно проводить таким же методом, который описан выше для спейсера Χ^Ζ.

Спейсеры Χ^Ζ и/или Х°, если они имеются, предпочтительно обеспечивают линейные расстояния из 5-15 атомов, более предпочтительно из 5-20 атомов между Ζ и С или I) и С соответственно.

Либо спейсер Χ^Ζ, либо спейсер Х°, либо оба, могут содержать саморазрушающийся фрагмент (группу). Саморазрушающийся фрагмент представляет собой фрагмент, (1) который связывается с группой С и либо с антителом Ζ, либо с цитотоксином I), и (2) структура его такова, что отщепление его от группы С инициирует последовательные реакции, в результате которых разрывается связь самого саморазрушающегося фрагмента с антителом Ζ или с цитотоксином I) соответственно. Другими словами, реакция в положении, удалённом от антитела Ζ или цитотоксина Ώ (отщепление от группы С), вызывает также разрыв связи X^Ζ-Ζ или Х°-О. Присутствие саморазрушающегося фрагмента в случае спейсера Х° является необходимым, так как, если после расщепления конъюгата спейсер Х° или его участок остаётся связанным с цитотоксином I), биологическая активность последнего может понизиться. Использование саморазрушающегося фрагмента (группы) особенно желательно, когда отщепляемая группа С представляет собой полипептид.

Примеры саморазрушающихся фрагментов (групп) (ΐ)-(ν), связанных с гидроксильной или аминогруппой при молекуле-партнёре Ώ, приводятся ниже

На вышеприведённых рисунках саморазрушающиеся фрагменты изображены между пунктирными линиями а и Ь вместе со связанными с ними структурными элементами. Саморазрушающиеся фрагменты (ΐ) и (ν) связываются с соединением Ώ-ΝΗ₂ (т.е. соединение Ώ связывается с помощью аминогруппы), тогда как саморазрушающиеся фрагменты (ΐϊ), (ίίί) и (ίν) связываются с соединением Ώ-ΟΗ (т.е. соединение Ώ образует конъюгат за счёт гидроксильной или карбоксильной группы). Расщепление амидной связи по пунктирной линии Ь высвобождает амидный азот в виде азота аминогруппы, инициируя последовательные реакций, в результате которых происходит разрыв связи по пунктирной линии а и последующее высвобождение Ώ-ΟΗ или Ώ-ΝΗ₂ соответственно. Дополнительную информацию, относящуюся к саморазрушающимся фрагментам (группам), см. в документах Саг1 е! а1., 1. Мей. СЕет., 24 (3), 479-480 (1981); Саг1 е! а1., международная заявка АО 81/01145 (1981); ЭиЬохусЕА е! а1., РЕагтасо1оду & ТЕегареийсз, 83, 67-123 (1999); РпезЮие е! а1., патент США 6214345 В1 (2001); Ток1 е! а1., 1. Огд. СЕет. 67, 1866-1872 (2002); Эогопта е! а1., ΝπΚιιό Вю!есЕпо1оду 21 (7), 778-784 (2003) (егга!ит, р. 941); Воуй е! а1., патент США 7691,962 В2; Воуй е! а1., патент США 2008/0279868 А1; 8иП е! а1., международная заявка АО 2008/083312 А2; Репд, патент США 7375078 В2; и 8еп!ег е! а1., патент США 2003/0096743 А1; описания которых включены в настоящее изобретение посредством отсылки.

Согласно другому варианту нацеливающая молекула антитела и цитотоксическое соединение Ώ

- 16 027925 связываются нерасщепляющимся линкером. Распад (конъюгата) антитела в конечном счёте уменьшает линкер до небольшой связанной группы, которая не снижает биологическую активность цитотоксического соединения Б.

Структуры соединение Б - линкер.

В соединениях по изобретению конъюгация осуществляется предпочтительно за счёт связи с группой К⁰, имеющей значение по определению в формуле (I). Предпочтительно К⁰ означает КНК^1а. Если К^1аозначает Н или алкил, связь может представлять собой связь с атомом азота в К^1аКН. Если К^1а означает (СН2)пКН2, С(=О)(СН2)пКН2, С(=О)СНК⁸КН2 или С(=О)К⁹КН₂, конъюгацию можно осуществлять за счёт аминогруппы (N11₂) при радикале К^1а. Таким образом, в зависимости от строения К^1аКН, Б может иметь формулу

где К¹² означает С₁-С₆ алкил и К², К³, К⁴, К⁵, К⁶, К⁷, К⁸, К⁹ и п имеют значение применительно к формуле (I).

Соответствующие структуры можно получать из соединений формул ^а), (№) или (Па)-(ИН), внося необходимые изменения.

- 17 027925

Предпочтительно Ό означает

Предпочтительно конъюгаты по данному изобретению получают, сначала связывая соединение Ό с линкером (Х°)_аС(Х²)_ь с образованием структуры лекарственное вещество-линкер, представленное формулой (IV)

О-(Х°)_аС(Х²)ъ-К³¹ (IV) где К³¹ означает функциональную группу, подходящую для реакции с функциональной группой в молекуле антитела Ζ с образованием конъюгата. Примеры соответствующих групп К³¹ включают азид, циклооктин,

где К³² означает С1, Вг, Р, мезилат или тозилат, а К³³ означает С1, Вг, I, Р, ОН, -Ο-Ν-сукцинимидил, -О-(4-нитрофенил), -О-пентафторфенил или -О-тетрафторфенил.

Химические реагенты и реакции, применяемые обычно для получения соответствующих компонентов О-(Х°)_аС(Х^_ь-К³¹, раскрываются в документах Ν§ е! а1., патент США 7087600 В2 (2006); Ν§ е! а1., патент США 6989452 В2 (2006); Ν§ е! а1., патент США 7129261 В2 (2006); Ν§ е! а1., международная заявка \ΥΟ 02/096910 А1; Воуй е! а1., патент США 7691962 В2; Сйеп е! а1., патент США 7517903 В2 (2009); Оапдлуаг е! а1., патент США 7714016 В2 (2010); Воуй е! а1., заявка на патент США 2008/0279868 А1; Оапд^аг е! а1., патент США 7847105 В2 (2010); Оапд^аг е! а1., патент США 7968586 В2 (2011); Зий е! а1., заявка на патент США 2010/0145036 А1; и СИеп е! а1., заявка на патент США 2010/0113476 А1; описания которых включены в настоящее изобретение посредством отсылки.

Предпочтительная реакционноспособная функциональная группа -К³¹ означает -ΝΗ₂, -ОН, -СО₂Н, -ЗН, малеимидо, циклооктин, азидо (-Ν₃), гидроксиламино (-ΟΝΗ₂) или Ν-гидроксисукцинимидо.

Группа -ОН может быть этерифицирована реакцией с карбоксильной группой в молекуле антитела, например в боковой цепи глутаминовой или аспарагиновой кислоты.

Группа -СО2Н может быть этерифицирована реакцией с -ОН группой или амидирована реакцией с

- 18 027925 аминогруппой (например, в боковой цепи лизинового остатка) в молекуле антитела.

Ν-гидроксисукцинимидная группа функционально представляет собой активированную карбоксильную группу и может для удобства амидироваться с применением аминогруппы в молекуле антитела (например, в боковой цепи лизинового остатка).

Малеимидная группа может конъюгироваться (связываться) по реакции Михаэля с -§Н группой в молекуле антитела (например, цистеина) или -§Н группой, образующейся в результате модификации антитела с введением сульфгидрильной функциональной группы.

В особенности группа -8Н применима для конъюгации в тех случаях, когда молекула антитела модифицирована введением в неё малеимидной группы, а именно в реакции Михаэля, которая является зеркальным изображением реакции, описанной выше.

Молекулы антител можно модифицировать путём введения малеимидных групп реакцией с Νсукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилатом (§МСС) или его сульфированным вариантом сульфо-8МСС, оба реагента предлагаются фирмой 54дта-А1бпсЬ.

Азидная и циклооктиновая группы представляют собой комплементарные (взаимодополняющие) функциональные группы, которые могут осуществлять конъюгацию посредством реакций так называемой клик-химии без меди, в которых азид присоединяется по напряжённой алкиновой связи циклооктина с образованием 1,2,3-триазольного кольца. См., например, Адагб е! а1, Г Атег. СЬет. §ос. 2004, 126, 15046-15047; Век!, ВюсЬет15йу 2009, 48, 6571-6584. Азид может представлять собой реакционноспособную функциональную группу К³¹ в формуле (IV), а циклооктин может находиться в молекуле антитела или в его антигенсвязывающем фрагменте, или наоборот.

Группа циклооктина может предоставляться реагентом ΌΙΒΘ (от фирмы 1пуйгодеп/Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе, Огедоп).

Можно применять методы введения неприродных аминокислот в молекулы антител, причём неприродная аминокислота предоставляет функциональную группу для конъюгации с реакционноспособной функциональной группой. Например, неприродную аминокислоту п-ацетилфенилаланин можно вводить в антитело как указано в международной заявке \УО 2008/030612 А2 (2008) на имя Т1ап е! а1. Кетогруппа в молекуле п-ацетилфенилаланина может являться местом конъюгации с образованием оксима при взаимодействии с реакционноспособной функциональной гидроксиламиногруппой.

Аминогруппу (ΝΗ₂) можно использовать для конъюгации с использованием фермента трансглутаминазы, как показано в статье 1едег е! а1., Апдете. СЬет. Ιη!. Еб. 2010, 49, 9995-9997.

Можно также проводить конъюгацию с применением фермента сортазы А, как показано в документах Ьеуагу е! а1., РЬо8 Опе 2011, 6(4), е18342; Ргой, Вю!есЬпо1. Ьей. 2010, 32, 1-10; Р1оедЬ е! а1., международная заявка \УО 2010/087994 А2 (2010) и Мао е! а1., международная заявка \УО 2005/051976 А2 (2005). Мотив для распознавания сортазой А (как правило, ЬРХТС, где X означает любую природную аминокислоту) может находиться в молекуле лиганда Ζ, а мотив нуклеофильного акцептора (как правило, ССС) может представлять собой группу К³¹ в формуле (IV), или наоборот.

Примеры структур (соединений) формулы (IV) включают структуры, соответствующие формулам (Ша)-(Шд)

- 19 027925

Получение конъюгатов.

Ниже описана иллюстративная методика, основанная на введении свободных тиольных групп в антитело путём взаимодействия ε-аминогрупп лизина с 2-иминотиоланом, и последующего взаимодействия с фрагментом лекарство-линкер, содержащим малеимидную группу, как описано выше. Вначале проводят буферный обмен антитела, помещая его в буфер обмена, представляющий собой 0.1М фосфатный буфер (рН 8.0), содержащий 50 мМ №С1 и 2 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ΌΤΡΑ), и концентрируют до 5-10 мг/мл. Тиолирование происходит при добавлении 2-иминотиолана к антителу. Количество 2-иминотиолана, которое должно быть добавлено, можно определить путём проведения предварительного опыта, и это количество будет меняться от антитела к антителу. При осуществлении

- 20 027925 предварительного опыта к антителу добавляются возрастающие титры 2-иминотиолана, затем проводится инкубация с антителом в течение 1 ч при КТ (при комнатной температуре, около 25°С), антитело обессоливают в 50 мМ буфера НЕРЕЗ, рН 6.0, с применением колонки ЗЕРНАИЕХ™ 0-25 и сразу же определяют количество введённых тиольных групп по реакции с дитиодипиридином (ИТИР). Взаимодействие тиольных групп с дитиодипиридином (ИТИР) приводит к высвобождению тиопиридина, что может быть обнаружено спектроскопическим методом при длине волны 324 нм. Обычно используют образцы с концентрацией белка равной 0.5-1.0 мг/мл. Для точного определения концентрации белка в образцах можно применять поглощение при длине волны 280 нм, затем аликвоту каждого образца (0.9 мл) инкубируют в присутствии 0.1 мл ИТИР (5 мМ исходного раствора в этаноле) в течение 10 мин при КТ. Параллельно инкубируют контрольные пробы (только буфер плюс ИТИР). Через 10 мин измеряют величину поглощения при длине волны 324 нм и количественно определяют тиольные группы, используя коэффициент экстинкции для тиопиридина равный 19,800 М^-1.

Обычно желательно вводить в антитело примерно три тиольные группы. Например, в случае некоторых антител это может быть достигнуто путём добавления 15-кратного мольного избытка 2иминотиолана с последующей инкубацией при КТ в течение 1 ч. Затем антитело инкубируют в присутствии 2-иминотиолана при желаемом мольном отношении и затем для обессоливания помещают в буфер для конъюгации (50 мМ, буфер НЕРЕЗ, рН 6.0, содержащий 5 мМ глицина и 2 мМ ИТРА). Полученный продукт с тиольными группами выдерживают на льду, в это время определяют количество введённых тиольных групп, как описано выше.

После определения количества введённых тиольных групп конъюгат лекарство- линкер добавляют при 3-кратном мольном избытке тиольных групп. Реакция конъюгации протекает в буфере для конъюгации, также содержащем диметилсульфоксид (ИМЗО) с конечной концентрацией равной 5%, или же похожий альтернативный растворитель. Обычно исходный раствор конъюгата лекарство-линкер растворяют в 100% ИМЗО. Исходный раствор сразу же добавляют к тиолированному антителу, которое содержит ИМЗО в количестве, достаточном для получения его конечной концентрации равной 10%, или же предварительно разбавляют буфером для конъюгации, содержащим конечную концентрацию ИМЗО равную 10% с последующим добавлением равного объёма тиолированного антитела.

Реакционную смесь для конъюгации инкубируют при КТ в течение 2 ч при перемешивании. После инкубации реакционную смесь для конъюгации центрифугируют и фильтруют через фильтр 0.2 мкм. Очистку конъюгата можно провести путём различных хроматографических методов. В соответствии с одним методом конъюгат очищают, используя эксклюзионную хроматографию на колонке ЗЕРНАСКУБ™ З200, предварительно кондиционированной при помощи 50 мМ буфера НЕРЕЗ с рН 7.2, содержащего 5 мМ глицина и 50 мМ ИаС1. Хроматографию осуществляют с линейной скоростью потока равной 28 см/ч. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и концентрируют. В соответствии с альтернативным методом очистку можно осуществить при помощи метода ионообменной хроматографии. Условия хроматографии меняются от антитела к антителу и должны быть оптимизированы в каждом случае. Например, реакционную смесь конъюгата антитело-лекарство помещают в колонку ЗР-ЗЕРНАКОЗЕ™, предварительно кондиционированную 50 мМ буфером НЕРЕЗ с рН 5.5, содержащим 5 мМ глицина. Конъюгат антитела элюируют в градиенте 0-1М ИаС1 в уравновешивающем буфере при величине рН 5.5. Релевантные фракции, содержащие конъюгат, собирают и подвергают диализу против буферной смеси (50 мМ буфера НЕРЕЗ с рН 7.2, содержащего 5 мМ глицина и 100 мМ ИаС1).

Специалистам в данной области понятно, что описанные выше условия и методики приведены только в качестве примеров, являющихся неограничительными, и что в уровне техники известны и другие подходы к конъюгации, которые можно использовать согласно данному изобретению.

Структуры некоторых конъюгатов, являющихся предпочтительными согласно данному изобретению, представлены формулами (Уа)-(Уд), где АЬ обозначает антитело и т равен 1, 2, 3 или 4

АЬ

он о он

- 21 027925

Биологическая активность

Данные, характеризующие биологическую активность соединений и конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением, приведены в примерах 13 и 14 данного описания.

Специалистам в данной области очевидно, что когда в конъюгате использованы соединения формул (I), (1а) или (1Ь), где группа К^1а обозначает Н₂КСНК⁸С(=О)-, как, например, в соединениях (ПЬ), (III), (Пд) или (ПН), группа К^1а может быть частью ферментативно отщепляемого пептидильного линкера, отщепление которого не приводит к получению исходного соединения, например, (ПЬ), (III), (Пд) или (ПН), но скорее к получению соединения (Па).

Фармацевтические композиции

Согласно другому аспекту настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую соединение по данному изобретению или его конъюгат вместе с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. Она тоже может содержать один или более дополнительных фармацевтически активных ингредиентов, таких как антитело или другое лекарство. Фармацевтические композиции могут применяться при осуществлении комбинированной терапии с другим терапевтическим агентом, особенно с другим противораковым агентом.

- 22 027925

Фармацевтическая композиция может содержать один или более эксципиентов. Эксципиенты, которые могут быть использованы согласно данному изобретению, включают носители, поверхностноактивные вещества, загущающие или эмульгирующие агенты, твёрдые связующие, диспергирующие или суспендирующие вспомогательные средства, солюбилизаторы, красящие вещества, ароматизирующие агенты, ингредиенты для получения покрытий, дезинтегрирующие агенты, смазывающие вещества, подсластители, консерванты, изотонические агенты и их комбинации. Выбор и применение подходящих эксципиентов описаны в публикации Оеииато, ей., Кетш§1ои: ТНе 8аеисе апй Ртасйсе о£ РНагтасу. 201Н Ей. (ЫрртсоБ ХУППапъ & ХУПкиъ 2003, содержание которой включено в данную заявку посредством отсылки. Предпочтительно фармацевтическая композиция согласно данному изобретению является пригодной для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинномозгового или эпидермального введения (например, путём инъекции или инфузии). В зависимости от метода введения на активное соединение может быть нанесено покрытие на основе какого-либо материала для защиты этого соединения от действия кислотных агентов и других природных условий, которые могут привести к его инактивации. Термин парентеральное введение означает методы введения, которые отличаются от энтерального и топического методов, обычно осуществляемые путём инъекции, они включают, без ограничения, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, внутрикапсульное, внутриглазничное, внутрисердечное, внутрикожное, интраперитонеальное, внутритрахеальное, подкожное, внутрисуставное, подкапсулярное, субарахноидальное, интраспинальное, эпидуральное и внутригрудинное введение путём инъекции и инфузии. Или же фармацевтическая композиция может быть введена не парентеральным методом, таким как топический и эпидермальный методы или введение через слизистую оболочку, например, интраназальным, оральным, вагинальным, ректальным, подъязычным или локальным путём.

Фармацевтические композиции могут также быть в виде стерильных водных растворов или дисперсий. Они могут быть также получены в виде микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для удерживания высокой концентрации лекарства. Композиции могут быть также получены в виде лиофилизатов для последующего растворения в воде до применения.

Количество активного ингредиента, которое может быть соединено с материалом носителя для получения однократной лекарственной формы, зависит от вида субъекта, который подвергается лечению, и конкретного метода введения и обычно представляет собой то количество композиции, которое приводит к получению терапевтического эффекта. Обычно это количество вполне может содержать от примерно 0.01 до примерно 99% активного ингредиента, предпочтительно от примерно 0.1 до примерно 70%, наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Схема приёма регулируется таким образом, чтобы достигался терапевтический ответ. Например, может быть введён единственный болюс, могут вводиться дробные дозы в течение определённого промежутка времени, или доза может пропорционально уменьшаться или увеличиваться в зависимости от конкретной ситуации. Особенно предпочтительно готовить парентеральные композиции в виде лекарственных форм для облегчения введения и однородного дозирования лекарства. Термин стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам дозирования, которые пригодны в качестве однократных доз для субъектов, подвергающихся лечению; при этом каждая единица дозирования содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное таким образом, чтобы оно приводило к получению желаемого терапевтического ответа, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Величины доз колеблются от примерно 0.0001 до 100 мг/кг, обычно от 0.01 до 5 мг/кг веса пациента. Например, величина дозы может составлять 0.3 мг/кг веса, 1 мг/кг веса, 3 мг/кг веса, 5 мг/кг веса или 10 мг/кг веса пациента или может находиться в пределах 110 мг/кг веса пациента.

Примерные схемы лечения включают введение лекарства один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз в месяц, один раз каждые 3 мес или один раз в каждые 3-6 мес.

Предпочтительные схемы лечения включают введение 1 мг/кг веса пациента или 3 мг/кг веса пациента путём внутривенной инъекции с использованием следующей схемы дозирования: (ί) шесть доз каждые четыре недели, затем каждые три месяца; (ίί) каждые три недели; (ίίί) 3 мг/кг веса пациента один раз с последующим введением 1 мг/кг веса пациента каждые три недели. При осуществлении некоторых методов дозировку регулируют для достижения концентрации антитела в плазме примерно 1-1000 мкг/мл и в некоторых случаях примерно 25-300 мкг/мл.

Терапевтически эффективное количество соединения согласно данному изобретению предпочтительно приводит к уменьшению степени серьёзности симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов без ощущения симптомов заболевания или к предотвращению ухудшения или ограничения жизнеспособности из-за наличия заболевания.

Например, для лечения субъектов, имеющих опухоли, терапевтически эффективное количество предпочтительно ингибирует рост опухоли по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, ещё более предпочтительно по меньшей мере на 60% и ещё более предпочтительно по меньшей мере на 80% по сравнению с субъектами, не подвергающимися этому лечению. Терапевтически

- 23 027925 эффективное количество терапевтического соединения может приводить к уменьшению размера опухоли или иначе ослаблять симптомы заболевания у субъекта, который обычно представляет собой человека, но может быть и другим млекопитающим. Фармацевтическая композиция может быть составом с контролируемым или пролонгированным высвобождением, это могут быть имплантаты, трансдермальные пластыри, а также микроинкапсулированные системы для доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена с винилацетатом, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. См., например, 8ик1ашей апй Соп!го11ей Ре1еаке Эгид Эеймегу 8ук!етк, 1.Р. РоЫпкоп, ей., Магсе1 Эеккег, 1пс., Νον Уогк, 1978.

Терапевтические композиции могут быть введены при помощи медицинских устройств, таких как (1) безыгольное устройство для подкожной инъекции (см., например, патенты США №№ 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 и 4596556); (2) насосы для микроинфузии (патент США № 4487603); (3) трансдермальные устройства (патент США № 4486194); (4) устройства для инфузии (патенты США №№ 4447233 и 4447224) и (5) осмотические устройства (патенты США №№ 4439196 и 4475196); содержание всех этих документов полностью включено в данную заявку посредством отсылки.

Согласно некоторым вариантам фармацевтическая композиция может быть получена с целью обеспечения нужного ίη νί\Ό распределения. Например, для того чтобы обеспечить пересечение гематоэнцефалического барьера терапевтическими соединениями по изобретению, эти композиции могут быть в виде липосом, которые могут дополнительно включать нацеливающие фрагменты для обеспечения селективного переноса в специфические клетки или органы. См., например, патенты США №№ 4522811; 5374548; 5416016 и 5399331; У.У. Рапайе (1989) 1. С1ш. РЬагтасо1. 29:685; ктелпха е! а1., (1988) БюсЬет. ВюрЬук. Рек. Соттип. 153:1038; В1оетап е! а1. (1995) РЕВ8 Ьей. 357:140; М. ϋνηίκ е! а1. (1995) АпйтюгоЪ. АдеШк СЬето!Ьег. 39:180; Вйксое е! а1. (1995) Ат. 1. РЬукю1. 1233:134; 8сЬге1ег е! а1. (1994) 7. Вю1. СЬет. 269:9090; Кешапеп апй Ьаиккапеп (1994) РЕВ8 Ьей. 346:123; и КЫюп апй Р1й1ег (1994) 1ттипоте!койк 4:273.

Применение

Соединения согласно настоящему изобретению или их конъюгаты могут быть использованы для лечения заболеваний, таких как, но без всякого ограничения, гиперпролиферативные заболевания, включая рак головы и шеи, эти заболевания охватывают также опухоли головы, шеи, носовой полости, придаточных пазух носа, носовой части глотки, ротовой полости, ротовой части глотки, дыхательного горла, гортанной части глотки, слюнных желёз и гломерулоцитому; раковые заболевания печени и жёлчных протоков, в особенности, гепатоцеллюлярный рак; рак кишечника, особенно рак толстой и прямой кишки; рак яичника; мелкоклеточный и немелкоклеточный рак лёгкого (8СЬС и №СЬС); саркомы молочной железы, такие как фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, эмбриональная рабдомиосаркома, лейомиосаркома, нейрофибросаркома, остеосаркома, синовиальная саркома, липосаркома и альвеолярная саркома мягких тканей; лейкозы, такие как острый промиелоцитарный лейкоз (АРЬ), острый миелогенный лейкоз (АМЬ), острый лимфобластный лейкоз (АРЬ) и хронический миелогенный лейкоз (СМЬ); опухоли центральной нервной системы, в особенности опухоли мозга; множественную миелому (ММ), лимфомы, такие как лимфому Ходжкина, лимфоплазмацитоидную лимфому, фолликулярную лимфому, лимфому лимфоидной ткани слизистых оболочек, лимфому из клеток мантийной ткани, В-крупноклеточную лимфому, лимфому Беркитта и Т-крупноклеточную анапластическую лимфому. В клинике осуществление способов и применение композиций, описанных в данной заявке, приведёт к уменьшению размера или количества злокачественных опухолей и/или к уменьшению связанных с ними симптомов (где это возможно). Патологически осуществление способов и применение композиций, описанных в данной заявке, приведёт к получению патологически релевантного ответа, такого как ингибирование пролиферации раковых клеток, уменьшение раковой опухоли или опухоли, предотвращение появления новых метастазов и ингибирование ангиогенеза опухолей. Способ лечения таких болезней включает введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинации согласно данному изобретению. Если необходимо, этот способ может повторяться. Он особенно применим, когда заболевание представляет собой рак толстой и прямой кишки, рак печени, рак простаты, рак молочной железы, меланому, глиобластому, рак лёгкого, рак поджелудочной железы, рак яичника, множественную миелому, рак почки, лейкоз (в особенности, АРЬ, АРЬ или АМЬ) или лимфому.

Соединения согласно данному изобретению могут вводиться в комбинации с другими терапевтическими агентами, включая антитела, алкилирующие агенты, ингибиторы ангиогенеза, антиметаболиты, агенты для расщепления ДНК, агенты для сшивки ДНК, ДНК-интеркаляторы, связующие малых бороздок ДНК, ендиины, ингибиторы белка 90 теплового шока, ингибиторы гистон-деацетилазы, иммуномодуляторы, стабилизаторы микротрубочек, аналоги нуклеозидов (пурина или пиримидина), ингибиторы ядерного экспорта, ингибиторы протеасом, ингибиторы топоизомераз (I или II), ингибиторы тирозинкиназ и ингибиторы серин/треонинкиназ. Конкретные терапевтические агенты включают адалимумаб, ансамитоцин РЗ, ауристатин, бендамустин, бевасизумаб, бикалутамид, блеомицн, бортезомиб, бусульфан, каллистатин А, камптотецин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, цетуксимаб, цисплатин, кладрибин, цитарабин, криптофицины, дакарбазин, дасатиниб, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, дуокармицин, динемицин А, эпотилоны, этопозид, флоксуридин, флударабин, 5-флуорацил, гефитиниб, гемцита- 24 027925 бин, ипилимумаб, гидроксимочевину, иматиниб, инфликсимаб, интерфероны, интерлейкины, беталапахон, леналидомид, иринотекан, мейтансин, мехлорэтамин, мелфалан, 6-меркаптопурин, метотрексат, митомицин С, нилотиниб, оксалиплатин, паклитаксел, прокарбазин, субероиланилид гидроксамовой кислоты (§АНА), 6-тиогуанидин, тиотепу, тенипозид, топотекан, трастузумаб, трихостатин А, винбластин, винкристин и виндесин.

Примеры

Данное изобретение будет далее более понятно при рассмотрении следующих примеров, которые приведены только для иллюстрации изобретения и не являются ограничительными.

Пример 1. Соединение (11а).

В этом примере описано получение соединения (11а) или 8-аминоунциаламицина. Схема синтеза этого соединения приведена на фиг. 1, где оно обозначено как соединение 9.

2,2,2-Трихлорэтил(3-оксо-1,3-дигидроизобензофуран-5-ил)карбамат 2.

К суспензии 6-аминобензофуран-1(3Н)она 1 (МауЬпбде, 13.43 г, 90 ммоль) в дихлорметане (ОСМ, 200 мл) при температуре 0°С добавляли 2,2,2-трихлорэтилкарбонохлоридат 1а (18.23 мл, 135 ммоль) и пиридин (17.79 мл, 180 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре (РТ, около 25°С) в течение 1 ч. Тонкослойная хроматография (ТЬС) и высокоэффективная жидкостная хроматография (НРЬС) показали, что реакция завершилась. Реакционную смесь отфильтровывали и промывали дихлорметаном (2x30 мл) с получением карбамата 2 в виде твёрдого продукта белого цвета (17.03 г, 58%). БСМ8: [М+1] = 324.

Гидроксифталид 3.

Суспензию карбамата 2 (17.0 г, 52.4 ммоль), Ν-бромсукцинимида (ΝΒδ, 10.26 г, 57.6 ммоль) в СС1₄(150 мл) перемешивали и нагревали с обратным холодильником (85°С, на масляной бане). Реакционную смесь подвергали действию солнечного света от лампы, расположенной на расстоянии около 10 см от колбы. Через 2 ч реакция была завершена (по данным ТЬС). НРЬС показала наличие множества пиков, обусловленных лабильной природой промежуточного бромида. После концентрирования в роторном испарителе получали твёрдое вещество коричневого цвета. К этому продукту коричневого цвета ίη вйи добавляли воду (200 мл) и нагревали с обратным холодильником в течение 5 ч с получением почти прозрачного раствора, содержащего некоторое количество нерастворимого вещества. ТЬС и высокоэффективная жидкостная хроматография (НРЬС) показали, что реакция завершилась. После концентрирования на роторном испарителе с последующей очисткой на установке СОМВ1РЬА§Н™ с градиентом 0-50% ЕЮАс в смеси гексанов в колонке с 120 г силикагеля получали гидроксифталид 3 (13.55 г, 76%). ЬСМ§: [М+1] = 340.

Цианофталид 5.

К суспензии гидроксифталида 3 (1.391 г, 4.09 ммоль) и цианида калия (399 мг, 6.14 ммоль, 1.5 экв.) в воде (4 мл) медленно добавляли 33%-ный водный раствор НС1 (1.2 мл) при температуре 0°С (на ледяной бане). Ледяную баню удаляли и продолжали перемешивание в течение 2 ч. Образовалось соединение 4 (ЬСМ§ (т+1 = 368)). Реакционную смесь экстрагировали ЕЮАс, сушили над Мд§О₄ и концентрировали до получения объёма, равного 20 мл. После охлаждения до температуры, равной 0°С, к раствору прибавляли дициклогексилкарбодиимид (ОСС, 1.2 экв.) и перемешивание продолжали при РТ в течение 8 ч. Реакционную смесь отфильтровывали для удаления побочного продукта, мочевины, и фильтрат концентрировали с использованием колоночной флэш-хроматографии с градиентом 30% ЕЮАс/гексан, получая цианофталид 5 (1.116 г, выход 78%) в виде твёрдого вещества белого цвета.

¹Н ЯМР(400 МГц, СОС1₃): δ 8.10 (б, 1= 2.0 Гц, 1Н), 7.93 (бб, 1= 8.8, 2.0 Гц, 1Н), 7.67 (б, 1= 8.8 Гц, 1Н), 6.06 (5, 1Н), 4.87 (5, 1Н).

Аминоцианофталид 6.

К раствору цианофталида 5 (3 г, 8.58 ммоль) в уксусной кислоте (82 мл) и воде (4.3 мл) при РТ добавляли цинк (8.58 г, 131 ммоль). Через 30 мин по данным ТЬС и НРЬС реакция была завершена, получались целевой продукт и побочный монодехлорированный продукт в отношении 3:1. Фильтрование через СБЫТЕ™ и промывка при помощи ЕЮАс (50 мл) и воды (50 мл) с последующими концентрированием и очисткой на колонке СОМВ1РЬА§Н™ с 40 г силикагеля в градиенте 0-50% ЕЮАс/гексан позволили получить аминоцианофталид 6 в виде твёрдого вещества белого цвета (980 мг, выход 66%).

¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ 7.46 (б, 1= 8.4 Гц, 1Н), 7.05 (бб, 1= 8.4, 2.4 Гц, 1Н), 6.95 (б, I = 2.4 Гц, 1Н), 6.47 (5, 1Н).

8-Аминоунциаламицин-ОТЕ§ 8.

В этом примере использовали метод аннелирования по Хаузеру. К раствору аминоцианофталида 6 (155 мг, 0.891 ммоль) в тетрагидрофуране (ТНР, 5.3 мл) при температуре -70°С добавляли бис(триметилсилил)амид лития (ЫНМ0§, 1.782 мл, 1.782 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин. Добавляли предварительно охлаждённый раствор иминохинона 7 (был получен №со1аои е1 а1. 2007а, 125 мг, 0.297 ммоль) в ТНР (12.5 мл). Реакционную смесь перемешивали при той же температуре в течение 5 мин и затем медленно нагревали до РТ в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением фосфатного буфера (рН 6.8, 100 мл) и проводили экстракцию при помощи ЕЮАс (3x75 мл).

- 25 027925

Объединённые экстракты высушивали над М§8О₄ с получением сырого продукта. Очистка на колонке СОМВ1РЬА8Н™ с 12 г силикагеля с градиентом 0-50% ЕЮАс/гексан позволила получить продукт 8 в виде твёрдого вещества пурпурного цвета (60 мг, выход 36%). БСМ8: [М+1] = 569.

¹Н ЯМР (400 МГц, СПэСХ): δ 13.14 (δ, 1Η), 9.96 (б, 1= 4.0 Гц, 1Η), 8.40 (т, 1Η), 8.03 (б, I = 9.6 Гц, 1Η), 7.38 (т, 1Η), 7.02 (ί6, 1= 8.0 Гц, 1= 1.6 Гц 1Η), 5.92 (бб, 1= 24, 9.6 Гц, 2Η), 5.20 (δ, 2Η), 5.12 (б, 1= 4.4 Гц, 1Η), 4.94 (б, 1= 4.0 Гц, 1Η), 4.65 (т, 1Η), 4.55 (ς, 1= 6.4 Гц, 1Η), 4.46 (б, 1= 4.8 Гц, 1Η), 3.41 (т, 1Η), 1.40 (б, 1= 6.0 Гц, 3Η), 1.00 (ί, 1= 8.0 Гц, 9Η), 0.68 (ς, 1= 7.2 Гц, 3Η).

8-Аминоунциаламицин 9.

Аминоунциаламицин-ОТЕ8 8 (30 мг) растворяли в ΤΗΡ (3 мл) и обрабатывали раствором Εί₃Ν·3ΗΡ в ΤΗΡ (1:1, 1.5 мл) при КТ. Через 1 ч десилирование было завершено (по данным ТЬС и НРЬС). Реакционную смесь отбирали в ЕЮАс, промывали насыщенным раствором №НСО₃, сушили над Μ§δΟ₄ и концентрировали. Очистка на колонке СОМВ1РЬА8Н™ в градиенте 0-50% ЕЮАс/гексаны позволила получить 8-аминоунциаламицин 9 в виде твёрдого вещества пурпурного цвета (выход 80%). БСМ8: [М+1] = 455.

Специалистам в данной области очевидно, что варианты соединения (11а) с аминогруппой, расположенной в различных положениях другого кольца, могут быть получены с использованием в качестве исходного материала вариантов соединения 1, аминогруппы которого находятся ещё где-либо в кольце или замещены другой группой как в соединениях

Пример 2. Соединения (ПЬ), (11д) и (ПН).

Хотя 8-аминогруппа в 8-аминоунциаламицине не является слишком реакционноспособной, она может быть амидирована с помощью хлорангидрида α-аминокислоты в присутствии цианида серебра. На фиг. 2 показана схема получения соединений (ПЬ), (ΙΙΗ) и (ΙΙ§) по этой методике. На фиг. 2 соединения (ПЬ), (ΙΙΗ) и (Пу) обозначены как 13а, 13Ь и 13с' соответственно. Ртос-О1у^Н-унциаламицин-ОТЕ8 11а.

Аминоунциаламицин-ОТЕ8 8 (5 мг) и Ртос-защищённый хлорангидрид глицина 10а (СНетЯтрех, 8.4 мг, 3 экв.) растворяли в ацетонитриле (2 мл) и перемешивали в присутствии АцС\ (7 мг, 6 экв.) в течение ночи. Реакция была завершена (по данным ТЬС и НРЬС). Концентрирование и очистка на колонке СОМВ1РЬА8Н™ с силикагелем с градиентом 0-40% ЕЮАс/гексаны позволили получить продукт 11а в виде твёрдого вещества пурпурного цвета (выход 90%). БСМ8: [М+1] = 848.

Ртос-О1у^Н-унциаламицин 12а.

Продукт 11а (4 мг) растворяли в ТНР (0.5 мл) и обрабатывали раствором Е!₃№3НРПНР (1:1, 0.25 мл) при КТ. Через 1 ч десилирование было завершено (по данным ТЬС и НРЬС). Реакционную смесь отбирали в ЕЮАс, промывали насыщенным раствором №НСО₃, сушили над М§8О₄ и концентрировали. Очистка на колонке СОМВ1РЬА8Н™ с градиентом 0-55% ЕЮАс/гексаны позволила получить соединение 12а в виде твёрдого вещества пурпурного цвета (выход 80%). БСМ8: [М+1] = 734.

О1у^Н-унциаламицин 13а.

Соединение 12а (2 мг) обрабатывали 20% раствором пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде (1)МР, 1 мл) при КТ в течение 15 мин. Концентрирование и очистка с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ (К-НРЬС) с элюентом (эффлюентом) 0.1% ТРА в смеси ацетонитрил/вода позволила получить соединение 13а (выход 50%). БСМ8: [М+1] = 512.

Аналогичные лизиновое и сериновое соединения 13Ь апб 13с' получали с применением тех же общих методик. Хлорангидриды 10Ь и 10с получали из соответствующих карбоновых кислот (оба из СНет1трех) по реакции с тионилхлоридом или реагентом Госеза. Удаление группы ТЕ8 из соединения 13с можно было осуществить при помощи уксусной кислоты. Соединение 13Ь: БСМ8 [М+1] = 583.2; соединение 11с: БСМ8 [М+1] = 770.3.

Пример 3. Соединение (ΙΙί).

Методику, описанную в предыдущем примере, нельзя применять в случае цитруллина из-за нестабильности хлорангидрида цитруллина. Был использован альтернативный способ, в котором цитруллин присоединяли к фталиду перед конденсацией с соединением 7, как показано на фиг. 3, для получения соединения (ΙΙί), обозначенного цифрой 17 на этой фигуре.

Цианофталид, присоединённый к Ртос-цитруллину 14.

Вос-защищённый цитруллин 6а (СНетЯтрех, 0.726 г, 2.64 ммоль) и ^(3-диметиламинопропил)-Уэтилкарбодиимида гидрохлорид (ЕОС, 0.578 г, 2.9 ммоль) в 1)СМ:1)МР (17:3,20 мл) перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем добавляли аминоцианофталид 6 (0.23 г, 1.32 ммоль) и перемешивали при КТ

- 26 027925 в течение 18 ч. Реакционную смесь обрабатывали этилацетатом, промывали насыщенным раствором NаΗСΟз и затем промывали водой и рассолом. Концентрирование и очистка на колонке СОМВ1РЬА8Н с элюентом 17% МеОН в ЭСМ позволили получить цианофталид 14 (выход 40%). ЬСМЗ: [М+1] = 432.

¹Н ЯМР (400 МГц, ΌΜ3Ο-ά₆): δ 10.50 (5, 1Н), 8.37 (й, 1 = 8.4 Гц, 1Н), 7.96 (т, 1Н), 7.91 (й, 1= 8.0 Гц, 1Н), 7.16 (й, 1= 8.0 Гц, 1Н), 6.72 (5, 1Н), 5.40 (5, 2Н), 4.02 (т, 2Н), 2.92 (т, 2Н), 1.60 (т, 2Н), 1.36 (т, 9Н).

¹³С ЯМР (100 МГц, ΌΜ3Ο-φ): δ 172.7, 168.3, 159.3, 156.0, 141.9, 137.0, 126.7, 125.0, 124.5, 115.7, 114.8, 78.5, 66.7, 55.3,29.4,28.6,27.3.

Соединение 15.

Фталид 14 обрабатывали смесью ЭСМ-трифторуксусная кислота (ТРА) (1:1) с получением соединения 15. ЬСМЗ: [М+1] = 332.

Соединение 17.

Без дальнейшей очистки соединение 15 в виде соли с ТРА подвергали аннелированию по Хаузеру с использованием иминохинона 7 и общих условий, описанных выше, с получением ТЕЗ-защищённого соединения 16 (выход 10%). Десилирование соединения 16 с помощью Е1₃№3НР с последующим проведением К-НРЬС с 0.1 % ТРА в смеси СН₃СХ/вода привели к получению соединения 17. ЬСМЗ: [М+1] = 612.

Пример 4. Соединение (11с).

На фиг. 4 приведена схема синтеза соединения (11с), обозначенного цифрой 22.

Соединение 19.

К раствору аминоцианофталида 6 (300 мг, 1.723 ммоль), соединения 18 (ЛИпсН-ЗЦта. 823 мг, 5.17 ммоль) и уксусной кислоты (5 экв.) в С1СН₂СН₂С1 (30 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (3 экв.) и перемешивали при КТ в течение 5 ч. НРЬС показала, что конверсия была равна 90%. Реакционную смесь отбирали в ЕЮАс, промывали насыщенным раствором NаΗСΟ₃, сушили над М§ЗΟ₄ и концентрировали.

Концентрирование и очистка на колонке СΟМВIР^АЗΗ™ в градиенте 40% ЕЮАс/гексаны позволила получить соединение 19.

'П ЯМР (400 МГц, 1)\1ЗС)-й.): δ 7.53 (й, 1= 8.4 Гц, 1Н), 7.07 (йй, 1= 8.8, 2.4 Гц, 1Н), 6.89 (й, 1= 2.0 Гц, 1Н), 6.85 (Ьг5, 1Н), 6.56 (5, 1Н), 4.0 (Ьг5, 1Н), 3.06-3.13 (т, 4Н), 1.34 (т, 9Н).

Соединение 20а.

Соединение 19 растворяли в ЭСМ (6 мл) и обрабатывали ТРА (3 мл) при температуре, равной 0°С. Давали температуре повыситься до КТ и перемешивали реакционную смесь в течение 30 мин. НРЬС показала, что реакция завершилась. Реакционную смесь концентрировали с получением резиноподобного материала, который промывали простым эфиром (2x20 мл), растворяли в смеси ацетонитрил/вода и подвергали лиофилизации с получением соединения 20а (601 мг, выход 78%). ЬСМЗ: [М+1] = 218.

Соединение 20Ь.

К раствору соединения 20а (200 мг, 0.451 ммоль, в виде бис-ТРА соли) в ОМР (2 мл) при температуре, равной 0°С, добавляли триэтиламин (0.314 мл, 2.256 ммоль) и затем (хлор-(4-метоксифенил)метилен)дибензол (167 мг, 0.541 ммоль) в ЭСМ (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и обрабатывали ЕЮАс и водой. Очистка на колонке с нейтральным оксидом алюминия с использованием 30% ЕЮАс в смеси гексанов привела к получению п-метоксифенилдифенилметил(ММТ)защищённого продукта 20Ь в виде твёрдого вещества бледно-жёлтого цвета (105 мг, выход 48%). Чистоту определяли методом ТСЖ с мобильной фазой, представляющей собой смесь триэтиламин: ЕЮАс:гексан (1:30:70).

'II ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ 7.2-7.7 (т, 16Н), 7.0 (т, 2Н), 6.8 (т, 3Н), 6.19 (5, 1Н), 4.57 (Ьг5, 1Н), 3.77 (т, 3Н), 3.28 (т, 2Н), 2.50 (т, 2Н).

Соединение 22.

К раствору соединения 20Ь (92 мг, 0.188 ммоль) в ТНР (2 мл) при температуре -70°С добавляли ЫНМЭЗ (0.376 мл, 0.376 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин. Добавляли предварительно охлаждённый раствор иминохинона 7 (52.8 мг, 0.125 ммоль) в ТНР (2.6 мл) и перемешивали при той же температуре в течение 5 мин. Реакционную смесь нагревали медленно до КТ в течение 20 мин, останавливали реакцию путём добавления фосфатного буфера (рН 6.8, 20 мл) и проводили экстракцию при помощи ЕЮАс (3x15 мл). Объединённые органические фазы промывали рассолом (30 мл) и высушивали над М§ЗΟ₄ с получением сырого продукта 21. Неочищенный продукт 21 растворяли в ^МЗΟ (2 мл) и обрабатывали Е1₃№3НР (0.5 мл) при температуре 4°С и перемешивали при комнатной температуре (КТ). Через 1 ч ЬСМЗ (жидкостная хромато-масс-спектроскопия) показала образование продукта. Полученный сырой продукт очищали на колонке Х-Впйде ргер С18 мкм ΟΕΌ (30x150 мм), используя в качестве мобильной фазы 0.1% ТРА в смеси ацетонитрил/вода. После проведения лиофилизации получали продукт 22 (14.4 мг, выход 23% после двух стадий). ЬСМЗ [М+1] = 498.3.

Пример 5. Соединение (11е).

На фиг. 5 приведена схема синтеза соединения (11е), обозначенного цифрой 25.

8-Метилунциаламицин 25.

- 27 027925

К раствору аминоцианофталида 6 (34 мг, 0.195 ммоль), параформальдегида (11.72 мг, 0.390 ммоль) и уксусной кислоты в С1СН₂СН₂С1 (2 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия. Реакционную смесь выдерживали при КТ в течение 24 ч. НРЬС показала, что степень конверсии была равна 90%. Реакционную смесь отбирали в Е!ОАс (20 мл) и промывали насыщенным раствором №НСО₃ (10 мл). Концентрирование и очистка методом К-НРЬС привела к получению продукта 23 (15 мг, выход 41%). М8 (т+1) = 189. Соединение 23 подвергали аннелированию по Хаузеру с последующим снятием защиты ТЕ8, как описано выше, с получением 8-метилунциаламицина 25. ЬСМ8: (М+1) = 467.

Пример 6. Соединение (ΙΙά).

На фиг. 6 приведена схема синтеза соединения (ΙΙά), обозначенного цифрой 30.

Соединение 30.

Комбинацию 4-((трет-бутоксикарбонил)амино)бензойной кислоты 26 (Р1ика, 1.885 г, 7.95 ммоль) и ЕЭС (1.676 г, 8.74 ммоль) в ЭСМ (24 мл) перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем добавляли аминоцианофталид 6 (0.346 г, 1.987 ммоль) в ИМР (6.00 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 ч. Температуру повышали до 50°С; через 40 ч путём выпаривания удаляли ЭСМ. Остаток отбирали в Е!ОАс. Е!ОАс промывали насыщенным раствором NаНСОз, водой и рассолом. Концентрирование и очистка на установке СОМВ1РЬА8Н™ с использованием в качестве элюента 15% МеОН в ИСМ привела к получению соединения 27 в виде твёрдого вещества жёлтого цвета (587 мг, выход 75%). ЬСМ8: [М+1] = 394.

¹Н ЯМР (400 МГц, ИМЗО-бб): δ 10.53 (з, 1Н), 9.71 (з, 1Н), 8.42 (ά, 1= 2.0 Гц, 1Н), 8.19 (άά, 1= 8.4, 2.0 Гц, 1Н), 7.9 (т, 3Н), 7.59 (άά, 1= 7.2, 1= 2.0 Гц, 2Н), 6.74 (з, 1Н), 1.47 (т, 9Н).

Это соединение 27 (567 мг, 1.441 ммоль) суспендировали в дихлорметане (ЭСМ) (2 мл) и добавляли ТРА (2 мл, 26.0 ммоль). После перемешивания в течение 50 мин при КТ ЬСМ8 и НРЬС показали, что реакция была завершена. Концентрирование и сушка в условиях высокого вакуума в течение 2 ч привели к получению соединения 28, которое подвергали аннелированию по Хаузеру с последующим снятием защиты ТЕ8 с помощью Е!₃№3НР, как описано выше, получали соединение 30 (выход 18%). ЬСМ8: М+1=574.2.

Пример 7. Модификация соединения (11Ь) для конъюгации.

На фиг. 7 приведена схема реакции модификации соединения (11Ь) для конъюгации.

Соединение 32.

Соединения 13а (1 экв.) и 31 (ЭиЬотоЫк е! а1. 2002; 1.2 экв.) в ЭМ8О обрабатывали Ν,Νдиизопропилэтиламином (Э1РЕА. 3 экв.) при КТ в течение 1 ч. Очистка методом К-НРЬС с использованием в качестве элюента 0.1% ТРА в смеси СН₃СИ/вода привела к получению соединения 32 (выход 50%). ЬСМ8: [М+1] = 1082.

'II ЯМР (400 МГц, ЭМ8О-Ф₆): δ 13.12 (з, 1Н), 10.62 (з, 1Н), 9.67 (т, 1Н), 8.49 (з, 1Н), 8.29 (ά, 1= 9.2 Гц, 1Н), 8.19 (ά, 1= 9.2 Гц, 1Н), 8.07 (т, 1Н), 7.83 (ά, 1= 8.4 Гц, 1Н), 7.57 (т, 2Н), 7.29 (т, 2Н), 6.98 (т, 1Н), 6.65 (ά, 1= 4.8 Гц, 1Н), 5.99 (άά, 1= 30, 9.2 Гц, 2Н), 5.38 (ά, 1= 4.8 Гц, 1Н), 5.14 (ά, 1= 4.8 Гц, 1Н), 5.03 (т, 1Н), 4.97 (з, 1Н), 4.16 (!, 1= 7.6 Гц, 1Н), 4.08 (ц, 1= 5.2 Гц, 4Н), 3.86 (ά, 1= 6.0 Гц, 1Н), 3.38 (!, 1= 6.8 Гц, 1Н), 2.90 (т, 2Н), 1.94 (т, 2Н), 1.69 (т, 2Н), 1.29 (ά, 1= 6.4 Гц, 3Н), 0.83 (т, 6Н).

Соединение 34.

Похожая реакция Ν-гидроксисукцинимидного эфира мальимидобутановой кислоты 33 (ТС1) привела к получению соединения 34. ЬСМ8: [М+1] = 677.

Пример 8. Модификация соединения (ΙΙΓ) для конъюгации.

На фиг. 8 приведена схема реакции для модификации соединения (ΙΙΓ) для последующей конъюгации.

Соединение 38.

К раствору соединений 17 (5 мг) и 35 (Васйет, 10 мг, 22 мкмоль) в ЭМР (2 мл) добавляли Э1РЕА (16 мкл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 7 ч.

Концентрирование и очистка на установке СОМВ1РЬА§Н™ с применением в качестве элюента 30% МеОН в ЭСМ привели к получению соединения 36 (выход 29%).

Соединение 36 обрабатывали 20% раствором пиперидина в ЭМЕ (2 мл). После перемешивания при КТ в течение 15 мин ЬСМ8 показала, что реакция была завершена.

При помощи ротационного испарителя удаляли пиперидин. Реакционную смесь абсорбировали силикагелем и очищали на установке СОМВ1РЬА§Н™, используя в качестве элюента 30% метанола в ЭСМ, получали продукт 37 (выход 60%). Продукт 37 соединяли с Ν-гидроксисукцинимидным эфиром 33 (6 мг) в Э1РЕА (16 мкл) и в ЭМ8О (1 мл) при КТ в течение 3 ч. Очистка методом К-НРЬС привела к получению продукта 38 (1.56 мг). ЬС М8 (т+1 = 876).

Соединение 39.

К соединениям 17 (1.68 мг) и 33 (2 мг, 22 мкмоль) в ЭМЕ (0.5 мл) добавляли Э1РЕА (5 мкл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Очистка методом К-НРЬС привела к получению продукта 39 (0.776 мг). ЬС М8 (т+1 = 777).

Пример 9. Модификация соединения (11с) для последующей конъюгации.

- 28 027925

На фиг. 9 приведена схема реакции для модификации соединения (Нс) для конъюгации.

Соединение 40.

Раствор соединения 22 (4.89 мг, 8 мкмоль), соединения 31 (5.68 мг, 8.00 мкмоль) и ЭРЕА (6.95 мкл, 40.0 мкмоль) в ΌΜδΟ (3 мл) перемешивали при КТ в течение 1 ч. Очистка методом К-НРЬС и лиофилизация привели к получению 4.6 мг желаемого соединения 40 (выход 54%). ЬС Μδ (т/2+1 = 535).

¹Н ЯМР (400 МГц, ΌΜδΟ-бЦ: δ 13.07 (5, 1Н), 9.87 (т, 1Н), 8.37 (5, 1Н), 8.01 (б, 1= 7.2 Гц, 1Н), 7.91 (б, 1= 8.4 Гц, 1Н), 7.77 (б, 1= 8.4 Гц, 1Н), 7.51 (б, 1= 8.8 Гц, 1Н), 7.2 (т, 5Н), 6.95 (т, 3Н), 5.92 (бб, 1= 30, 9.2 Гц, 2Н), 5.35 (т, 2Н), 5.08 (5, 1Н), 4.08 (ί, 1= 7.6 Гц, 1Н), 3.31 (ί, 1= 6.8 Гц, 1Н), 2.93 (т, 2Н), 2.09 (т, 2Н), 1.90 (т, 1Н), 1.63 (т, 2Н), 1.29 (б, 1= 6.4 Гц, 3Н), 0.78 (т, 6Н).

Соединение 41.

К раствору соединения 22 (4.89 мг, 8 мкмоль) в ΌΜδΟ (3 мл) добавляли ΌΡΕΑ (4.35 мкл, 25.00 мкмоль) и соединение 33а (ТО, 2.466 мг, 8.00 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ. Через 30 мин добавляли ещё 0.5 экв. соединения 33а и ΌΓΡΕΑ (5 экв.) и перемешивание продолжали в течение 30 мин. НРЬС и ΕίΜδ показали, что реакция была завершена. К-НРЬС и лиофилизация привели к получению 2.35 мг соединения 41 (выход 43%). ЬС Μδ (т+1 = 691.3 ).

'II ЯМР (400 МГц, ΌΜδΟ-бЦ: δ 13.07 (5, 1Н), 9.87 (т, 1Н), 8.38 (5, 1Н), 7.89 (т, 2Н), 7.1 - 7.5 (т, 2Н), 6.7-7.0 (т, 4Н), 6.4- 6.6 (т, 2Н), 5.92 (бб, 1= 30.4, 10.0 Гц, 2Н), 5.28 (т, 1Н), 5.08 (5, 1Н), 4.91 (т, 1Н), 4.24 (т, 1Н), 1.98 (т, 4Н), 1.40 (т, 2Н), 1.24 (б, 1= 6.0 Гц, 3Н), 1.0-1.2 (т, 4Н).

Пример 10. Модификация соединения (Нб) для последующей конъюгации.

На фиг. 10 приведена схема реакции для модификации соединения (Нб) для последующей конъюгации.

Соединение 43.

ΌΡΕΑ (0.012 мл, 68.3 мкмоль) добавляли к раствору соединения 30 (6.53 мг, 11.39 мкмоль), Ртосзащищённого цитруллина 42 (СЬетЧтрех, 9.05 мг, 22.77 мкмоль) и Ы,М,№,№-тетраметил-О-(7азабензотриазол-1-ил)урония гексафторфосфата (НАТИ, 8.66 мг, 22.77 мкмоль) в ΌΜΡ (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч и обрабатывали насыщенным раствором ЫаНСО₃ и рассолом. Очистка методом хроматографии на колонке СΟΜΒIΡ^ЛδН™ с 12 г силикагеля с использованием в качестве элюента 12% МеОН в Όί,’Μ привела к получению продукта 43 (выход 29%). ΕίΜδ [[Μ+1]=953.

Соединение 44.

К раствору соединения 43 (4 мг, 4.20 мкмоль) в ΌΜΡ (0.8 мл) добавляли пиперидин (200 мкл, 2.020 ммоль). После перемешивания реакционной смеси при КТ в течение 15 мин ΕΕ'Μδ показала, что реакция завершилась. Пиперидин удаляли в ротационном испарителе. Реакционную смесь абсорбировали силикагелем и очищали методом хроматографии СΟΜΒIΡ^ЛδН™ с градиентом 25-65% ΜеΟН/^СΜ в качестве элюента и получали соединение 44 (выход 80%). ΕΕ’Μδ [Μ+1] = 731.

Малеимидное соединение 45.

ЕОС (2 экв.) добавляли к раствору трет.бутилового спирта (1 экв.), трет.бутилвалина (1.05 экв.) и малемида (2.11 г, 1.0 экв.) в ΌΕ’Μ (50 мл) при КТ. Через 1 ч смесь отбирали ЕЮАс, который затем промывали водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбоната натрия и рассолом. Органическую фазу высушивали и концентрировали путём выпаривания для удаления растворителя. Остаток пропускали через колонку (градиент 0-80% ЕЮЛс/гексан) и получали 3.02 г продукта в виде масла. Это масло растворяли в ЭСМ-ТРА (3:2; 20 мл) при КТ. Через 4 ч раствор упаривали и высушивали в условиях высокого вакуума в течение ночи, что привело к получению соединения 45 в виде твёрдого вещества белого цвета (2.1 г, выход 68%). ΕΟ’Μδ: (Μ+1) = 311.

Соединение 46.

К раствору малеимидного соединения 45 (3.12 мг, 10.06 мкмоль) и соединения 44 (2.45 мг, 3.35 мкмоль) в ΌΜΡ (1 мл) добавляли НАТИ (4.59 мг, 0.012 ммоль) с последующим добавлением ЭРЕА (5.26 мкл, 0.030 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 17 ч. После очистки методом КНРЬС получали продукт 46 (0.455 мг, выход 13%). ΕΟ’Μδ (т+1 = 1023).

Пример 11. Конъюгация с антителом против мезотелина.

В этом примере описана конъюгация соединения ^Уе) (обозначенного цифрой 41) на фиг. 9 и соединения ^УГ) (обозначенного цифрой 40 на фиг. 9) с антителом против мезотелина. Моноклональное антитело против мезотелина 6А4 (Тетгей е! а1., \£О 2009/045957 А1) с концентрацией 5.3 мг/мл в 100 мМ фосфата натрия, 150 мМ №С1. рН 8.0, подвергали тиолированию с использованием 10-кратного мольного избытка 2-иминотиолана. Реакцию тиолирования проводили в течение 1 ч при КТ и при постоянном перемешивании. После завершения тиолирования антитело 6А4 подвергали буферному обмену в буфере для конъюгации (50 мМ НЕРЕδ, 5 мМ глицина, рН 7.0) в колонке РО10 (ЪерНабе.х 0-25). Концентрация тиолированного антитела была определена методом УФ-спектроскопии при длине волны 280 нм. Концентрацию тиола измеряли, используя взаимодействие с дитиодипиридином.

Исходный раствор соединения ^Уе) или (ГУ!), соответственно, с концентрацией 2 мМ в ΌΜδΟ добавляли к антителу 6А4 с 1.5-кратным мольным избытком в расчёте на тиольные группы. Для получения

- 29 027925 конечной концентрации, равной 20%, добавляли ΌΜ8Ο и затем добавляли ΤΑΕΕΝ-80™ до получения конечной концентрации, составляющей 0.1%. Реакционную смесь перемешивали 2 ч при КТ. После этой стадии конъюгации добавляли 100 мМ Ν-этилмальимида (ΝΕΜ) в ΌΜ8Ο при 10-кратном мольном избытке в расчёте на тиольные группы антитела 6А4 для кэпирования любых непрореагировавших тиольных групп. Процесс гашения этой реакции проводили в течение 1 ч при КТ и при постоянном перемешивании.

Конъюгат антитела 6А4 фильтровали через фильтр 0.2 мкм и затем подвергали хроматографической очистке путём ионного обмена (СЕХ). Колонку 8Р 8ерЕагозе I ЕдЕ РегЕогтапсе СЕХ регенерировали пятью объёмами (объёмами колонки) (СУз) с помощью буфера, содержащего 50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, 1М №С1, рΗ 7.0. После регенерации колонку уравновешивали 3 СУз буфера для уравновешивания (50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, рН 7.0). Конъюгат антитела 6А4 вместе с соединением (1Уе) или (IV!), соответственно, помещали в колонку и эту колонку промывали один раз буфером для уравновешивания. Конъюгат элюировали из колонки при помощи буфера (50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, 110 мМ ЖС1, рΗ 7.0). Затем собирали фракции элюата. После этого колонку регенерировали буфером (50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, 1М ЖС1, рΗ 7.0) для удаления агрегатов белка и непрореагировавшего соединения (1Уе) или (IV!). Собирали фракции элюата, содержащие мономерный конъюгат антитела, и степени замещения определяли путём измерения абсорбции при длинах волн 280 и 560 нм. Очищенный СЕХ элюат пула конъюгата подвергали буферному обмену в буфере (50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, 100 мМ №С1, 0.01% ΤАΕΕN 80™, рН 7.0), путём диализа с применением мембраны МА». После диализа определяли концентрацию конъюгата антитела и степени замещения путём измерения абсорбции при длинах волн 280 и 560 нм. Полученные характеристики конъюгатов приведены в табл. 1 ниже.

Таблица 1 - Конъюгация с антителом 6А4 против мезотелина
Конъюгат	Концентрац ИЯ (мг/мл)	Степень замещения	Агрегация (%)	Общее количество (мг)	Выход (%)
6А4-С_Ра(1Уе)	1.51	1.0	11.0	7.55	73
6А4-С_Ра (IV!)	1.23	1.2	12.0	6.15	58

Пример 12. Конъюгация с антителом против СГ)70.

В этом примере описана конъюгация соединений (1Уе) и (IV!) с антителом против СГ)70. Моноклональное антитело 2Η5 против СБ70 (Тегге!! е! а1., заявка США на патент № 2009/0028872 А1) с концентрацией 5.5 мг/мл в 20 мМ фосфата натрия, 50 мМ ЖС1, 0.02% ΤАΕΕN-80™, рН 7.5, подвергали тиолированию, используя 15-кратный мольный избыток 2-иминотиолана. Реакцию тиолирования проводили в течение 1 ч при КТ и при постоянном перемешивании. После завершения тиолирования антитело 6А4 подвергали буферному обмену в буфере для конъюгации (50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, рН 7.0) в колонке ΡΌ10 (8ерЕайех Θ-25). Концентрацию тиолированного антитела определяли методом УФспектроскопии при длине волны 280 нм. Концентрацию тиола измеряли, используя взаимодействие с дитиодипиридином.

Исходный раствор соединения (1Уе) или (IV!), соответственно, с концентрацией 2 мМ в ΌΜ8Ο добавляли к антителу 2Η5 с 1.5-кратным мольным избытком в расчёте на тиольную группу. Для получения конечной концентрации равной 20% добавляли ΌΜ8Ο и затем добавляли ΤАΕΕN-80™ до получения конечной концентрации, составляющей 0.1%. Реакционную смесь перемешивали 2 ч при КТ. После этой стадии конъюгации добавляли 100 мМ Ν-этилмальимида (ΝΕΜ) в ΌΜ8Ο при 10-кратном мольном избытке на тиольные группы антитела 6А4 для кэпирования (блокирования) любых непрореагировавших тиольных групп. Реакцию гашения этой реакции проводили в течение 1 ч при КТ и при постоянном перемешивании.

Конъюгат антитела 2Н5 фильтровали через фильтр 0.2 мкм и затем подвергали хроматографической очистке путём ионного обмена (СЕХ). Колонку 8Ρ 8ерЕагозе ИдЕ Ρе^ίо^таηсе СЕХ регенерировали пятью СУз с использованием буфера, содержащего 50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, 1М ЖС1, рН 7.0.

После регенерации колонку уравновешивали 3 СУз буфера для уравновешивания (50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, рН 7.0). Конъюгат антитела 2Р5 вместе с соединением (1Уе) или (IV!), соответственно, помещали в колонку и эту колонку промывали один раз буфером для уравновешивания. Конъюгат элюировали из колонки при помощи буфера (50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, 110 мМ №С1, рΗ 7.0). Затем собирали фракции элюата. После этого колонку регенерировали буфером (50 мМ ΗΕΡΕ8, 5 мМ глицина, 1М ЖС1, рΗ 7.0) для удаления агрегатов белка и непрореагировавшего соединения (Ае) или (IV!). Собирали фракции элюата, подвергали буферному обмену и диализу, как описано в предыдущем примере. Характеристики полученных конъюгатов приведены ниже в табл. 2.

- 30 027925

Таблица 2 - Конъюгация с антителом 2Н5 против СО70

Конъюгат	Концентрац ия(мг/мл)	Степень замещения	Агрегация (%)	Общее количество (мг)	Выход (%)
2Н5-Срб (1Уе)	0.87	1.38	8.1	6.52	59
2Н5-Срб (ΙΥΓ)	1.14	4.8	9.5	8.55	77

Пример 13. Биологическая активность соединений.

Антипролиферативную активность соединений согласно данному изобретению или их конъюгатов определяли следующим образом. Клеточные линии опухолей человека получали из Американской коллекции типовых культур Атепсап Туре СиНиге Со11есйоп (АТСС), Р.О. Вох 1549, Мапаззаз, VА 20108, иЗА и культивировали в соответствии с инструкцией производителя из АТСС. Эти клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1.0х10³ или 1.0х10⁴ клеток/лунку на 3 ч с помощью индикации АТФ (аденозинтрифосфата) или метили планшеты ³Н-тимидином соответственно. Затем в лунки добавляли серийные разведения 1:3 свободных (неконъюгированных) соединений или их конъюгатов. Планшеты инкубировали в течение 24-72 ч. В планшетах с добавленным ³Н-тимидином наблюдалась пульсация с активностью 1.0 мкКюри ³Н-тимидина на лунку в течение последних 24 ч всего периода инкубации, клетки собирали и производили считывание на счётчике Тор Соип! Зстй11а!юп Соип1ег (Раскагб 1пз!гитеп1з, Мепбеп, СТ).

Концентрацию АТФ в клетках в лунках с АТФ определяли с применением набора для анализа СЕЬЬТ1ТЕК-СЬО® Ьиттезсеп! Се11 У1аЬП0у кй в соответствии с инструкцией производителя, и полученные данные считывали на люминометре СЬОМАХ® 20/20. Оба прибора были приобретены в Рготеда, МаШзоп,^1, ИЗА). Величины ЕС₅₀ - концентрации, при которой агент ингибирует или уменьшает пролиферацию клеток на 50%, определяли, применяя компьютерную программу РК1ЗМ™, версия 4.0 (СгарЬРаб Зой^аге, Ьа 1о11а, СА, ИЗА).

На фиг. 11а приведён график, показывающий антипролиферативную активность соединения (11а) в отношении клеток лейкоза НЬ-60, которая была определена с использованием АТФ при инкубации в течение 72 ч и сравнивалась с активностью трёх референсных соединений: доксорубицина (адриамицина), унциаламицина и соединения А, которое представляет собой алкилирующий ДНК агент, имеющий следующую структурную формулу:

Величины ЕС₅₀, показанные на фиг. 11а, приведены в табл. 3. Активность соединения (11а) была больше, чем активность самого унциаламицина.

Таблица 3 - Активность соединения (Па) по отношению к клеткам лейкоза НЬ-60
	Доксорубицин	Унциаламицин	Соединение (Па)	Соединение А
ЕС₅₀ (пМ)	5.979	0.01199	0.00404	0.001872

На фиг. 11Ь приведён аналогичный график, иллюстрирующий антипролиферативную активность соединения (11а) в отношении резистентных к доксорубицину клеток опухоли яичника (линия Абг), которая также была определена с использованием АТФ при инкубации в течение 72 ч. Соответствующие величины ЕС₅₀ показаны в табл. 4 ниже. Активность соединения (11а), которая опять была даже больше, чем активность самого унциаламицина, заслуживает особенного упоминания ввиду потери активности доксорубицина и соединения А при сравнении с резистентной клеточной линией.

Таблица 4 -Активность соединения (Па) по отношению к клетка Ас1г
	Доксорубицин	Унциаламицин	Соединение (Па)	Соединение А
ЕС 5о (пМ)	3846	0.08502	0.06118	0.1432

В табл. 5 приведены дополнительные данные по антипролиферативной активности для соединения (11а) по сравнению с двумя другими токсинами, которые были использованы при получении конъюгатов: соединением А и доксорубицином. Способ определения включал индикацию АТФ. Испытывали следующие клеточные линии раковых опухолей: А2780 (яичника), А549 (лёгкого), ССКЕ-СЕМ (острого лимфобластного лейкоза), СОБО205 (толстой кишки), Όυ4475 (молочной железы), Н2087 (немелкокле- 31 027925 точного рака лёгкого), Н661 (крупноклеточного рака лёгкого), НСТ116 (толстой кишки), БЫСаР (простаты), БЗ174Т (толстой кишки), МОЛ МВ468 (молочной железы), МОЛ МВ231 (молочной железы) и ЗЕТ2 (лейкоза). Антипролиферативная активность выражалась как ^₅₀, то есть концентрация токсина, которая продуцирует 50%-ный ингибирующий эффект.

Таблица 5 - Антипролиферативная активность соединения (Па) против линий раковых клеток
Клеточная линия	1С₅₀ (пМ)
Соединение А	Доксорубицин	Соединение (Па)
А2790	0.004	1Е2	0.003
А549	0.04	138.5	0.076
ССКР-СЕМ	0.019	19.4	0.014
СОБО205	0.019	19.7	0.01
ОЦ4475	0.001	2.9	0.002
Н2087	0.019	54.4	0.037
Н661	0.02	26.6	0.053
НСТ116	0.002	23.4	0.007
ЬЖАР	0.01	5.5	0.001
Б8174Т	0.015	1Е1	0.002
МО А МВ468	0.009	29	0.012
МСОМВ231	0.068	90.5	0.085
8ЕТ2	0.002	67.6	0.008

На фиг. 12а показаны дополнительные данные по антипролиферативной активности для соединений (Па), (Пс), (Пб) и (Пе) по сравнению с доксорубицином на примере клеток рака почки 786-0. Величины ЕС₅₀, показанные на фиг. 12а, приведены в табл. 6 ниже. Опять проводили определение АТФ при инкубационном периоде, равном 72 ч.

Таблица 6 - Антипролиферативная активность соединений против клеток 786-0
	Доксорубицин	Соед. (Па)	Соед. (Пс)	Соед. (Пб)	Соед. (Пе)
ЕСзо (пМ)	92.31	0.1160	1.275	0.05803	1.716

На фиг. 12Ь приведён аналогичный график, иллюстрирующий антипролиферативную активность, но по отношению к клеткам рака лёгкого Н226. Полученные величины ЕС₅₀ показаны в табл. 7 ниже. Опять проводили определение АТФ при инкубационном периоде, равном 72 ч.

Таблица 7 - Антипролиферативная активность соединений против клеток Н226
	Доксорубицин	Соед. (Па)	Соед. (Пс)	Соед. (Пб)	Соед. (Пе)
ЕС₅о (пМ)	141.2	1.001	0.9859	0.8729	17.45

Пример 14. Биологическая активность конъюгатов.

Используя те же методы анализа, которые описаны выше, определяли антипролиферативную активность конъюгатов, полученных из соединений по данному изобретению.

Фиг. 13а на примере клеток 786-0 с применением введения ³Н-тимидина (инкубационный период 72 ч) иллюстрирует антипролиферативную активность четырёх конъюгатов, полученных из соединений согласно данному изобретению: (а) конъюгата антитела 2Н5 (антитело против СГ)70. ТеггеД е! а1., заявка США на патент № 2009/0028872 А1) с соединением ^У!), (б) конъюгата антитела 6А4 (антитело против мезотелина, ТегтеД е! а1., ^0 2009/045957 А1) с соединением (£У£), (в) конъюгата антитела 2Н5 с соединением СУе) и (г) конъюгата антитела 6А4 с соединением ^Уе). На фиг. 13а (и также на следующих фиг. 13Ь и 13 с) величины на оси X Концентрация токсина даны для степени замещения (ЗК) - то есть величины равны мольной концентрации, умноженной на ЗК при конъюгации. Величины ЕС₅₀, показанные на графике на фиг. 13а, приведены в табл. 8 ниже.

Таблица 8 -Активность конъюгатов по отношению к клеткам 786-0
	2Н5-(1УГ)	6Α4-(ΐνί)	2Н5-(ГУе)	6А4-(ГУе)
ЕС₅о (пМ)	0.7629	33.37	19.68	27.43

Фиг. 13Ь на примере клеток Н226 с применением введения ³Н-тимидина (инкубационный период 72 ч) иллюстрирует антипролиферативную активность тех же самых четырёх конъюгатов. Величины ЕС50, показанные на графике на фиг. 13Ь, приведены в табл. 9 ниже.

- 32 027925

Таблица 9 - Активность конъюгатов по отношению к клеткам Н226
	2Н5-(ГУГ)	6А4-(ГУ£)	2Н5-(ГУе)	6А4-(ГУе)
ЕС₅₀ (пМ)	12.37	0.8822	28.24	39.60

На фиг. 13с показан ещё один график, иллюстрирующий антипролиферативную активность конъюгатов 245-(^1) и 6А4-(IVί) по отношению к клеткам Н226, которая измерена с применением АТФ и после проведения периода инкубации равного 72 ч.

Полученные величины ЕС₅₀ были равны 6.630 и 0.1548 нМ соответственно.

Приведённое выше подробное описание настоящего изобретения включает разделы, которые касаются исключительно конкретных частей аспектов данного изобретения.

Следует иметь в виду, что это сделано для ясности и удобства изложения и что конкретный признак может быть релевантным и другим разделам, а не только тому разделу, где он описан, описание включает все возможные комбинации сведений, описанных в разных разделах. Точно так же, хотя различные фигуры и разделы описания относятся к конкретным вариантам данного изобретения, следует понимать, что когда конкретный признак описан в контексте конкретной фигуры или варианта изобретения, это признак может быть также использован в соответствующей степени в контексте другой фигуры или варианта в комбинации с другим признаком или вообще в контексте всего изобретения.

Кроме того, хотя настоящее изобретение было конкретно описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов, изобретение не ограничивается такими предпочтительными вариантами. Объём настоящего изобретения определяется только прилагаемой формулой изобретения.

Ссылочные материалы.

Ниже приведено полное указание ссылок, которые в описании указывались в сокращённом виде с приведением фамилии первого автора (или изобретателя). Каждая из этих публикаций включена в данную заявку посредством отсылок.

ПаУ1е5 е! а1., Огд Бей. 2005, 7 (23), 5233-5236.

БаУ1е5 е! а1., АО 2007/038868 А2 (2007).

БиЬо^сЫк е! а1., Бюсоп)ида!е СНет. 2002, 13, 855-869.

№со1аои е! а1.,Апд. СНет. 2007, 119, 4788-4791 [2007а].

№со1аои е! а1., Апд. СНет. Ы. Еб. 2007, 46, 4704-4707 [2007Ь].

№со1аои е! а1., Апд. СНет. Ш. Еб. 2008, 47, 185-189.

ЗНао, Сигг. Мо1. РНагтасо1оду 2008, 1, 50-60.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (На), (НЬ), (Нс), (Нб), (Не), (III), (Нд) или (НН)

- 33 027925 или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Конъюгат, содержащий соединение по п.1, связанное ковалентной связью с антителом или его антигенсвязывающим участком, которое специфически или предпочтительно связывается с опухолеассоциированным антигеном на опухолевой клетке, где соединение в сконъюгированном состоянии имеет формулу, выбранную из
3. Конъюгат формулы (III) [О(Х^п)аС(Х²)ь]_т/ (III), где Ζ означает антитело;

Х° и Χ^Ζ означают первую и вторую спейсерные частицы, соответственно, независимо выбранные из _? И , . 9 . , _ξ

1—Ν—(СН₂)₂.₆—(ΝΗ)„—I (СН₂)₂.₆-С—1 1-<θΗ₂)₂-6-(ΝΗ)₄—ξ , 9 , о ξ—θ-(ΟΗ₂)₂-6-(ΝΗ)₄-1 ζ-(ΝΗ)_η—(СН2СН₂О)_Г-СН₂СН2-С—I

9 н 9 η |-(ΟΗ₂)₃-Ο-Ν-(ΟΗ₂ΟΗ₂Ο)₄-ΟΗ₂ΟΗ₂-Ο-Ν-(ΟΗ₂)₂-(ΝΗ)₄-|

II Η ι Η II ι | (СН₂)з^—С-Ν—(СН₂)₂-(ΝΗ)η—ξ I (ΟΗ₂)₂._θ-—Ν-С—(СН₂)₂_₆ (ΝΗ)_η—| где ς представляет собой 0 или 1 и г представляет собой от 1 до 24;

С означает последовательность, содержащую от одной до пяти аминокислот, выбранную из Уа1 СЁГ, А1а Уа1, Уа1 А1а Уа1, Ьу§ Ьу§, А1а А§п Уа1, Уа1 Ьей Ьу§, Сй Сй, Уа1 Ьу§, А1а А1а А§п, Ьу§, Сй, 8ег и С1и;

нижние индексы а и Ь независимо означают 0 или 1; нижний индекс т означает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 и Ό выбран из

- 34 027925

П-(Х°)аС(Х^_ь-К³¹ (IV),
4. Соединение формулы (IV) где К³¹ означает реакционноспособную функциональную группу, выбранную из азида, циклооктина,

Х° и Χ^Ζ означают первую и вторую спейсерные частицы, соответственно, независимо выбранные из

О

-(сн₂)₂-б-сН 1^_(сн₂)₂^-(мн)₍,—1 где ς представляет собой 0 или 1 и г представляет собой от 1 до 24;

С означает последовательность, содержащую от одной до пяти аминокислот, выбранную из Уа1 Сг!, А1а Уа1, Уа1 А1а Уа1, Ьуз Ьуз, А1а Азп Уа1, Уа1 Ьеи Ьуз, Сй Сг!, Уа1 Ьуз, А1а А1а Азп, Ьуз, Сй, 8ег и С1и;

нижние индексы а и Ь независимо означают 0 или 1; нижний индекс т означает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 и Ό выбран из

- 35 027925
5. Способ лечения ракового заболевания у субъекта, страдающего таким раковым заболеванием, включающий введение данному субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата по любому из пп.2, 3.
6. Способ по п.5, в котором антитело связывается с антигеном, который избыточно экспрессируется или исключительно экспрессируется в раковых клетках.
7. Способ по п.5, в котором раковое заболевание выбрано из лейкоза, рака почки, рака яичника, рака лёгкого, колоректального рака, рака молочной железы и рака простаты.
8. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая конъюгат по любому из пп.2, 3 и фармацевтически приемлемый носитель.