KR20140120374A - 에네디인 화합물, 그의 접합체, 및 그에 대한 용도 및 방법 - Google Patents

에네디인 화합물, 그의 접합체, 및 그에 대한 용도 및 방법 Download PDF

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Abstract

하기 화학식 I에 따른 구조를 갖는 에네디인 화합물은 질환, 예컨대 암의 치료를 위한 화학요법 약물에, 특히 접합체에 사용될 수 있다.
<화학식 I>
Figure pct00095

상기 식에서, R0, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 본원에 정의되어 있다.

Description

에네디인 화합물, 그의 접합체, 및 그에 대한 용도 및 방법{ENEDIYNE COMPOUNDS, CONJUGATES THEREOF, AND USES AND METHODS THEREFOR}
본 발명은 에네디인 화합물 및 그의 접합체, 이러한 화합물 및 접합체를 제조 및 사용하는 방법, 및 이러한 화합물 및 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
에네디인은 Z-탄소-탄소 이중 결합 및 2개의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하고, 통상적으로 후자의 2개가 전자의 측면에 배열된 독특한 긴장된 9-원 또는 10-원 고리계를 보유하는 항생제의 패밀리이다. 에네디인은 단일 및 이중 가닥 절단을 야기하는 DNA의 강력한 손상제이다. 그의 효력은 DNA에 결합하여 버그만(Bergmann) 재배열을 겪으면서, 긴장된 고리계가 고도로 반응성인 1,4-벤제노이드 디라디칼로 전환되고, 이것이 DNA로부터 수소를 제거함으로써 DNA를 손상시키는 그의 능력에 기인한다.
Figure pct00001
운시알라마이신은 지의류 클라도니아 운시알리스(Cladonia uncialis) 상에서 발견되는 스트렙토미세스(Streptomyces) 균주로부터 단리된 에네디인이다 (문헌 [Davies et al. 2005; 2007]) (제1 저자 또는 발명자에 의해 본 명세서에 언급된 참고문헌에 대한 전체 인용 및 연도는 하기 본원의 "참고문헌" 표제 하의 섹션에서 제공됨).
Figure pct00002
운시알라마이신의 구조는 전체 합성에 의해 확인되었다 (문헌 [Nicolaou et al. 2007a; 2007b]). 합성 과정에서, 비천연 26(S) 에피머는 거의 천연 26(R) 에피머와 같은 활성인 것으로 나타났는데, 즉 C27 메틸의 입체화학은 생물학적 활성에 대해 적은 효과를 가졌다. 에피머 둘 다는 몇몇 난소 종양 세포주에 대해 활성이었다. IC50 값은 에피머 및 세포주 또는 아세포주에 따라, 9 x 10-12 내지 1 x 10-10의 범위였다 (문헌 [Nicolaou et al., 2008]).
접합체는 종종 고도로 세포독성이고 전신 독성의 위험에 기인하여 투여에 달리 문제가 있을 수도 있는 항암 약물의 전달을 위한 중요한 방법이다. 접합체에서, 약물은 암 세포의 특징적 화학 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합함으로써, 높은 특이성으로 약물을 그곳에 전달하는 표적화 모이어티에 접합 (공유적으로 연결)된다. 또한, 약물은 통상적으로 공유 링커의 절단에 의해 접합체로부터 방출될 때까지 불활성 형태로 유지된다.
전형적으로, 표적화 모이어티는, 그의 항원이 암 세포에 의해 과다발현되거나 또는 특유하게 발현되는 것 ("종양 연관 항원")인 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다. 이러한 경우에, 생성된 접합체는 때때로 "면역접합체" 또는 "항체-약물 접합체" (ADC)로서 지칭된다. 바람직하게는, 종양 연관 항원은 암 세포의 표면 상에 위치하지만, 이웃자리 세포외 공간 내로 분비된 것일 수도 있다. 결합 시, 항원-접합체 복합체는 내재화되고, 결국 소포성 소체, 예컨대 리소솜 내부에 이르게 되며, 여기서 공유 링커가 절단되어 활성 약물을 유리시킴으로써 그의 화학요법 효과를 발휘하게 된다.
유리하게는, 공유 링커는 암 세포 내부에서는 우세하지만 혈장에서는 그렇지 않은 인자에 의해 절단이 야기되도록 설계된다. 이러한 한 가지 인자는 낮은 리소솜 pH이고, 이에 따라 공유 링커는 산-민감성 기, 예컨대 히드라존일 수 있다. 이러한 또 다른 인자는 일반적으로 보다 높은 세포내 글루타티온 농도이고, 이는 디술피드 교환 메카니즘에 의한 디술피드 공유 링커의 절단을 가능하게 한다. 이러한 또 다른 인자는 리소솜 효소, 예컨대 카텝신 B의 존재이고, 이는 바람직한 기질이 되도록 설계된 펩티드 링커를 절단할 수 있다 (문헌 [Dubowchik et al. 2002]).
접합체는 종양학에서 에네디인 약물을 전달하는데 사용되어 왔다. 겜투주맙 오조가미신 (밀로타르그(Mylotarg)®)은 항-CD33 모노클로날 항체 및 에네디인 칼리케아미신의 유도체의 접합체이다. 이것은 급성 골수 백혈병의 치료에 대해 승인되었지만, 이후에 시장으로부터 퇴출되었다. 몇몇 다른 에네디인 약물, 특히 접합된 형태의 약물이 개발 노력의 대상이 되어 왔다. 검토를 위해, 문헌 [Shao 2008]을 참조한다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 화학요법 약물로서 그대로 사용되든지 또는 접합체에 사용되든지 유용성을 갖는 강력한 세포독소인, 운시알라마이신 스캐폴드에 기반한 화합물을 제공한다. 한 측면에서, 하기 화학식 I에 나타낸 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다.
<화학식 I>
Figure pct00003
상기 식에서,
R0은 NHR1a, NHC(=O)OR1b, NHC(=O)NHR1b, OC(=O)NHR1b, (CH2)1-4NHR1a, F, Cl, Br, OR1a 또는 SR1b이고;
R1a는 H, C1-C6 알킬, (CH2)nNH2, C(=O)(CH2)nNH2, C(=O)CHR8NH2 또는 C(=O)R9NH2이고;
R1b는 H, C1-C6 알킬, (CH2)nNH2,
Figure pct00004
이고;
R2는 H, R10, C(=O)R10 또는 C(=O)OR10이고;
R3은 H이거나, 또는 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
R4는 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
R5는 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
R6은 H이거나, 또는 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 R5 및 R6은 결합되어 =O를 형성하고;
R7은 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
R8은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 측쇄 잔기이고;
R9는 비치환 또는 치환된 아릴렌, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴렌, 비치환 또는 치환된 알킬아릴렌, 비치환 또는 치환된 시클로알킬렌, 또는 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬렌이고;
각각의 R10은 독립적으로 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬, 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 아릴알킬, 비치환 또는 치환된 아릴; 또는 비치환 또는 치환된 헤테로아릴이고;
n은 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
바람직하게는, 화학식 I에서 R0은 NHR1a이다.
기 NHR1a는 위치 6, 7, 8 또는 9 (탄소 원자의 넘버링에 대해서는 상기 운시알라마이신에 대한 구조 화학식을 참조함)에서의 탄소 원자 중 임의의 것에 부착될 수 있다. 따라서, 화학식 I의 구조는 하기 화학식 I'에 의해 동등하게 도시될 수 있다.
<화학식 I'>
Figure pct00005
상기 식에서, R11 기 중 1개는 R0이고, 나머지 R11 기는 각각 H이고, R0, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 화학식 I에 대해 상기 정의된 바와 같다.
운시알라마이신은 접합체에서의 약물 성분에 대한 잠재적 후보이지만, 그것은 생물학적 활성의 손상 없이 표적화 모이어티에 대한 접합 부위로서 용이하게 사용가능한 관능기가 결여되어 있다. 본 발명자들은 생물학적 활성의 허용되지 않는 상실 없이, 화학식 I에 나타낸 바와 같은 안트라퀴논 모이어티에서 가장 왼쪽의 방향족 고리에 R0 기를 도입할 수 있고, 추가로 R0 기는 다기능 접합 부위임을 발견하였다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 바람직하게는 암 세포인 표적 세포 상의 화학 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티에 공유적으로 연결된 화학식 I에 따른 화합물을 포함하는 접합체를 제공한다. 바람직하게는, 표적화 모이어티는 항체이고 - 보다 바람직하게는 모노클로날 항체, 보다 더 바람직하게는 인간 모노클로날 항체임 - 화학 물질은 종양 연관 항원이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 표적화 모이어티에 대한 접합에 적합한 반응성 관능기를 갖는 링커 모이어티를 포함하는 물질의 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 화합물 또는 그의 표적화 모이어티 (특히 항체)와의 접합체를 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 암 세포는 백혈병, 신암, 난소암, 폐암, 결장암, 유방암 또는 전립선암 세포일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 본 발명의 화합물 또는 그의 표적화 모이어티 (특히 항체)와의 접합체를 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 암을 앓고 있는 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 화합물 또는 그의 표적화 모이어티 (특히 항체)와의 접합체의 용도가 제공된다. 암은 백혈병, 신암, 난소암, 폐암, 결장암, 유방암 또는 전립선암일 수 있다.
도 1 내지 6은 본 발명의 화합물의 합성에 대한 반응식을 나타낸다.
도 7 내지 10은 접합을 위한 제조에서의 본 발명의 화합물에 대한 링커 및 반응성 관능기의 부착에 대한 반응식을 나타낸다.
도11a 및 11b는 선택된 참조 화합물과 비교한, 본 발명의 화합물의 항증식 활성의 플롯을 나타낸다.
도12a 및 12b는 선택된 참조 화합물과 비교한, 본 발명의 추가의 화합물의 항증식 활성의 플롯을 나타낸다.
도 13a, 13b 및 13c는 본 발명의 화합물로부터 제조된 항체-약물 접합체의 항증식 활성의 플롯을 나타낸다.
정의
"항체"는 전체 항체, 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉 "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄 변이체를 의미한다. 전체 항체는 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL 또는 Vk) 및 하나의 단일 도메인 CL을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 보다 보존된 프레임워크 영역 (FR) 사이에 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함하며, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4로 배열된다. 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개할 수 있다. 항체는, 항체가 항원 X에 5 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 6 x 10-9 M 이하, 보다 바람직하게는 3 x 10-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 2 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하는 경우에, 항원 X에 "특이적으로 결합한다"라고 말해진다. 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 바람직하게는 인간 항체일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 글리코실화 유형 또는 정도에 영향을 미치기 위해, 항체 반감기를 연장시키기 위해, 이펙터 세포 또는 보체계와의 상호작용을 증진 또는 감소시키기 위해, 또는 일부 다른 특성을 조절하기 위해 조작될 수 있다. 조작은 하나 이상의 아미노산을 치환, 부가 또는 결실시키는 것에 의해, 또는 도메인을 또 다른 이뮤노글로불린 유형으로부터의 도메인으로 치환시키는 것에 의해, 또는 상기한 것의 조합에 의해 달성될 수 있다.
항체의 "항원 결합 단편" 및 "항원 결합 부분" (또는 단순히 "항체 부분" 또는 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편, 예컨대 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 단편 (예를 들어, 문헌 [Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007] 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타나 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하여 이들을 단일 단백질 쇄로 만들 수 있는 합성 링커에 의해 이들을 연결할 수 있으며, 이때 VL 및 VH 영역은 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성한다 (단일쇄 Fv, 또는 scFv로 공지되어 있음; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체도 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄된다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다 (예를 들어, 항원 X에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 항원 X가 아닌 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, 항원 X에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 항원 X 분자에 대한 교차 반응성을 가질 수는 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 항체는 인간 항원 X에 특이적으로 결합하고, 다른 (비-인간) 항원 X 항원들과는 교차 반응하지 않는다. 또한, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
"모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특정한 에피토프에 대한 단일의 결합 특이성 및 친화성을 나타내는, 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 의미한다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 (및 존재하는 경우, 불변 영역)이 둘 다 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래하는 것인 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체는 천연 또는 합성 변형을 비롯한 후기 변형을 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래하는 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식되어 있는 항체는 포함하지 않는다.
"인간 모노클로날 항체"는 단일의 결합 특이성을 나타내고, 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래하는 것인 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
"지방족"은 명시된 수의 탄소 원자를 갖거나 (예를 들어, "C3 지방족", "C1-C5 지방족" 또는 "C1 내지 C5 지방족"에서와 같고, 후자 2개의 어구는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모이어티에 대한 동의어임) 또는 탄소 원자의 수가 명확하게 명시되지 않은 경우에는 1 내지 4개의 탄소 원자 (불포화 지방족 모이어티의 경우에는 2 내지 4개의 탄소)를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다.
"알킬"은 탄소 원자의 수 지정에 대한 동일한 관례가 적용되는, 포화 지방족 모이어티를 의미한다. 예시로서, C1-C4 알킬 모이어티는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸, 1-부틸, 2-부틸 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. "알킬렌"은 알킬 기의 2가 대응물, 예컨대 CH2CH2, CH2CH2CH2 및 CH2CH2CH2CH2를 의미한다.
"알케닐"은 탄소 원자의 수 지정에 대한 동일한 관례가 적용되는, 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미한다. 예시로서, C2-C4 알케닐 모이어티는 에테닐 (비닐), 2-프로페닐 (알릴 또는 프로프-2-에닐), 시스-1-프로페닐, 트랜스-1-프로페닐, E- (또는 Z-) 2-부테닐, 3-부테닐, 1,3-부타디에닐 (부트-1,3-디에닐) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"알키닐"은 탄소 원자의 수 지정에 대한 동일한 관례가 적용되는, 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미한다. 예시로서, C2-C4 알키닐 기는 에티닐 (아세틸레닐), 프로파르길 (프로프-2-이닐), 1-프로피닐, 부트-2-이닐 등을 포함한다.
"시클로지방족"은 각각의 고리가 3 내지 8개 (바람직하게는 3 내지 6개)의 탄소 원자를 갖는 것인 1 내지 3개의 고리를 갖는 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다. "시클로알킬"은 각각의 고리가 포화된 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알케닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알키닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. 예시로서, 시클로지방족 모이어티는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸 및 아다만틸을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 시클로지방족 모이어티는 시클로알킬 모이어티, 특히 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이다. "시클로알킬렌"은 시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"헤테로시클로지방족"은 그의 적어도 1개의 고리에서 3개 이하 (바람직하게는 1 내지 2개)의 탄소가 N, O 또는 S로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자로 치환되고, 여기서 N 및 S가 임의로 산화될 수 있고, N이 임의로 4급화될 수 있는 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. 유사하게, "헤테로시클로알킬", "헤테로시클로알케닐" 및 "헤테로시클로알키닐"은 각각 그의 적어도 1개의 고리가 상기와 같이 변형된 것인 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 시클로알키닐 모이어티를 의미한다. 예시적인 헤테로시클로지방족 모이어티는 아지리디닐, 아제티디닐, 1,3-디옥사닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸릴, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로티오피라닐 술폰, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리닐 술폭시드, 티오모르폴리닐 술폰, 1,3-디옥솔라닐, 테트라히드로-1,1-디옥소티에닐, 1,4-디옥사닐, 티에타닐 등을 포함한다. "헤테로시클로알킬렌"은 헤테로시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"알콕시", "아릴옥시", "알킬티오" 및 "아릴티오"는 각각 -O(알킬), -O(아릴), -S(알킬) 및 -S(아릴)을 의미한다. 예는 각각 메톡시, 페녹시, 메틸티오 및 페닐티오이다.
"할로겐" 또는 "할로"는 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘을 의미한다.
"아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 방향족인 모노-, 비- 또는 트리시클릭 고리계를 갖는 탄화수소 모이어티를 의미한다. 고리계에서의 고리는 서로 융합될 수 있거나 (나프틸에서와 같음) 또는 서로 결합될 수 있고 (비페닐에서와 같음), 비-방향족 고리에 융합 또는 결합될 수 있다 (인다닐 또는 시클로헥실페닐에서와 같음). 추가의 예시로서, 아릴 모이어티는 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 비페닐, 페난트릴, 안트라세닐 및 아세나프틸을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. "아릴렌"은 아릴 기의 2가 대응물, 예를 들어 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌 또는 1,4-페닐렌을 의미한다.
"헤테로아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 N, O 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 방향족 고리이고, 여기서 N 및 S가 임의로 산화될 수 있고, N이 임의로 4급화될 수 있는 모노-, 비- 또는 트리시클릭 고리계를 갖는 모이어티를 의미한다. 이러한 적어도 1개의 헤테로원자를 함유하는 방향족 고리는 다른 유형의 고리에 융합될 수 있거나 (벤조푸라닐 또는 테트라히드로이소퀴놀릴에서와 같음) 또는 다른 유형의 고리에 직접 결합될 수 있다 (페닐피리딜 또는 2-시클로펜틸피리딜에서와 같음). 추가의 예시로서, 헤테로아릴 모이어티는 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐 (티에닐), 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, N-옥소피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 퀴노잘리닐, 나프티리디닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 벤조티오페닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 페노티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 디벤조푸라닐, 카르바졸릴, 디벤조티오페닐, 아크리디닐 등을 포함한다. "헤테로아릴렌"은 아릴 기의 2가 대응물을 의미한다.
예컨대 "비치환 또는 치환된 C1-C5 알킬" 또는 "임의로 치환된 헤테로아릴"에서와 같이 어구 "비치환 또는 치환된" 또는 "임의로 치환된"의 사용에 의해 모이어티가 치환될 수 있음을 나타낸 경우에, 이러한 모이어티는 1개 이상의 독립적으로 선택된 치환기, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 가질 수 있다. 치환기 및 치환 패턴은, 화학적으로 안정하고 당업계에 공지된 기술 뿐만 아니라 본원에 제시된 방법에 의해 합성될 수 있는 화합물을 제공하기 위해, 치환기가 부착되는 모이어티를 고려하여 당업자가 선택할 수 있다.
"아릴알킬", "(헤테로시클로지방족)알킬", "아릴알케닐", "아릴알키닐", "비아릴알킬" 등은, 경우에 따라 아릴, 헤테로시클로지방족, 비아릴 등의 모이어티에 의해 치환되고, 경우에 따라 알킬, 알케닐 또는 알키닐 모이어티에서 개방 (충족되지 않은) 원자가를 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 모이어티를 의미하며, 예를 들어 벤질, 페네틸, N-이미다조일에틸, N-모르폴리노에틸 등에서와 같은 것이다. 반대로, "알킬아릴", "알케닐시클로알킬" 등은, 경우에 따라 알킬, 알케닐 등의 모이어티에 의해 치환된 아릴, 시클로알킬 등의 모이어티를 의미하며, 경우에 따라 예를 들어 메틸페닐 (톨릴) 또는 알릴시클로헥실에서와 같은 것이다. "히드록시알킬", "할로알킬", "알킬아릴", "시아노아릴" 등은, 경우에 따라 확인된 치환기 (경우에 따라 히드록실, 할로 등) 중 1개 이상으로 치환된 알킬, 아릴 등을 의미한다.
예시로서, 허용가능한 치환기는 알킬 (특히 메틸 또는 에틸), 알케닐 (특히 알릴), 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로 (특히 플루오로), 할로알킬 (특히 트리플루오로메틸), 히드록실, 히드록시알킬 (특히 히드록시에틸), 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬) (특히 -OCF3), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), -SO2N(알킬)2 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
치환되는 모이어티가 지방족 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(=O)알킬, -S(시클로알킬), -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬) 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(아릴), =O, =NOH, =NO(알킬), -OC(=O)(알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2 및 -NHC(=NH)NH2이다. 페닐, 시아노, 할로, 히드록실, 니트로, C1-C4알콕시, O(C2-C4 알킬렌)OH 및 O(C2-C4 알킬렌)할로가 특히 바람직하다.
치환되는 모이어티가 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(아릴), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), 알킬티오, 아릴티오, -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬) 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2 및 -NHC(=NH)NH2이다. C1-C4 알킬, 시아노, 니트로, 할로 및 C1-C4알콕시가 특히 바람직하다.
"C1-C5 알킬" 또는 "5 내지 10%"에서와 같이 범위가 언급된 경우에, 이러한 범위는 첫번째 경우에는 C1 및 C5, 두번째 경우에는 5% 및 10%와 같은, 범위의 끝 지점을 포함한다.
특정한 입체이성질체를 구체적으로 (예를 들어, 구조 화학식의 관련 입체중심에서 굵은선 또는 파선 결합에 의해, 구조 화학식에서 E 또는 Z 배위를 갖는 것으로서의 이중 결합의 도시에 의해, 또는 입체화학-지정 명명법의 사용에 의해) 나타내지 않는 한, 모든 입체이성질체는 순수한 화합물 뿐만 아니라 그의 혼합물로서 본 발명의 범위에 포함된다. 달리 나타내지 않는 한, 개별 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 및 그의 조합물 및 혼합물은 모두 본 발명에 포괄된다.
당업자는 화합물이 본원에 사용된 구조 화학식에 도시된 것과 동등한 호변이성질체 형태 (예를 들어, 케토 및 엔올 형태), 공명 형태 및 쯔비터이온성 형태를 가질 수 있으며, 구조 화학식은 이러한 호변이성질체, 공명 또는 쯔비터이온성 형태를 포함함을 인지할 것이다.
"제약상 허용되는 에스테르"는 생체내에서 (예를 들어, 인간 신체에서) 가수분해되어 모 화합물 또는 그의 염을 생성하거나, 또는 모 화합물의 것과 유사한 활성 그 자체를 갖는 에스테르를 의미한다. 적합한 에스테르는 C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐 또는 C2-C5 알키닐 에스테르, 특히 메틸, 에틸 또는 n-프로필을 포함한다.
"제약상 허용되는 염"은 제약 제제에 적합한 화합물의 염을 의미한다. 화합물이 1개 이상의 염기성 기를 갖는 경우에, 염은 술페이트, 히드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 말레에이트, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 파모에이트 (엠보네이트), 히드로아이오다이드, 니트레이트, 히드로클로라이드, 락테이트, 메틸술페이트, 푸마레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 메실레이트, 락토비오네이트, 수베레이트, 토실레이트 등과 같은 산 부가염일 수 있다. 화합물이 1개 이상의 산성 기를 갖는 경우에, 염은 칼슘 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 메글루민 염, 암모늄 염, 아연 염, 피페라진 염, 트로메타민 염, 리튬 염, 콜린 염, 디에틸아민 염, 4-페닐시클로헥실아민 염, 벤자틴 염, 나트륨 염, 테트라메틸암모늄 염 등과 같은 염일 수 있다. 다형성 결정질 형태 및 용매화물도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
조성물
화학식 I에 따른 바람직한 실시양태는 하기 화학식 Ia에 의해 나타낸 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 이러한 실시양태에서, 기 NHR1a는 C6에 부착되고, 여기서 R1a는 화학식 I의 맥락에서 상기 정의된 바와 같다.
<화학식 Ia>
Figure pct00006
보다 바람직한 실시양태는 하기 화학식 Ib에 의해 나타낸 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이고, 여기서 R1a는 화학식 I의 맥락에서 상기 정의된 바와 같다. 화학식 Ib에서, C27-메틸의 입체화학은 자연 발생 운시알라마이신 (상기 운시알라마이신에 대한 구조 화학식 참조)의 것에 상응한다.
<화학식 Ib>
Figure pct00007
각각의 R0, R1a, R1b. R2, R3, R4, R5, R6 및 R7에서, 그들이 본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, 여기서 알킬, 알킬렌, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴, 헤테로아릴렌, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬렌 기는 비치환 또는 치환되는 것으로서 나타내고, 비치환된 실시양태가 바람직하다. 본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R2는 바람직하게는 H 또는 C1-C3 알킬, 보다 바람직하게는 H이다. 본원의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R3은 바람직하게는 C1-C3 알킬, 보다 바람직하게는 Me이다. 본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R4는 바람직하게는 OH, OR10 또는 OC(=O)R10 (여기서 R10은 바람직하게는 C1-C3 알킬임), 보다 바람직하게는 OH이다. 본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R5는 바람직하게는 OH, OR10 또는 OC(=O)R10 (여기서 R10은 바람직하게는 C1-C3 알킬임), 보다 바람직하게는 OH이다. 본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R6은 바람직하게는 H이다. 본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R7은 바람직하게는 OH, OR10 또는 OC(=O)R10 (여기서 R10은 바람직하게는 C1-C3 알킬임), 보다 바람직하게는 OH이다. 본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R9는 바람직하게는
Figure pct00008
이다.
보다 바람직하게는, R9는
Figure pct00009
,
특히 전자이다.
본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R10은 바람직하게는 C1-C6 알킬, 시클로헥실, 시클로펜틸, 페닐, 푸라닐 또는 피리딜이다. 보다 바람직하게는, R10은 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필이다.
본 명세서의 다른 곳에서 화학식 I, Ia, Ib 또는 다른 화학식에 나타나는 경우에, R8은 바람직하게는 아르기닌, 아스파르트산, 시트룰린, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 측쇄 잔기이다. 보다 바람직하게는, R8은 글리신, 리신, 시트룰린 또는 세린의 측쇄 잔기이다. 바람직하게는, 키랄 탄소에서의 입체화학은 자연 발생 단백질생성 α-아미노산의 것, 즉 L-이성질체에 상응한다.
화학식 I, Ia 및/또는 Ib에 따른 구조를 갖는 화합물의 바람직한 실시양태에서, 기 R1a는 H, Me,
Figure pct00010
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
화학식 I, Ia 및/또는 Ib에 따른 구조를 갖는 화합물의 보다 바람직한 실시양태에서, 기 R1a는 H,
Figure pct00011
이다.
본 발명의 구체적 화합물은 하기 화학식 IIa 내지 IIh에 따른 구조를 갖는 것 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
<화학식 IIa>
Figure pct00012
<화학식 IIb>
Figure pct00013
<화학식 IIc>
Figure pct00014
<화학식 IId>
Figure pct00015
<화학식 IIe>
Figure pct00016
<화학식 IIf>
Figure pct00017
<화학식 IIg>
Figure pct00018
<화학식 IIh>
Figure pct00019
접합체
본 발명의 또 다른 실시양태는 암 세포 상의 화학 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티에 접합되는 화학식 I, Ia, Ib, IIa, IIb, IIc, IId, IIe, IIg 또는 IIh에 의해 나타낸 구조를 갖는 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 표적화 모이어티는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이고, 화학 물질은 종양 연관 항원이다. 바람직하게는, 접합은 기 R0에 대한 화학 결합을 통해 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 하기 화학식 III에 의해 나타낸 본 발명에 따른 세포독성 화합물 및 리간드를 포함하는 접합체가 제공된다.
<화학식 III>
Figure pct00020
상기 식에서, Z는 리간드이고; D는 본 발명에 따른 세포독성 화합물 (예를 들어, 화학식 I, Ia 또는 Ib에 따른 화합물)이고; -(XD)aC(XZ)b-는 Z와 D를 연결하기 때문에 집합적으로 "링커 모이어티" 또는 "링커"로서 지칭된다. 링커 내에서, C는 화합물 D의 의도된 생물학적 작용 부위 또는 그 근처에서 절단되도록 설계된 절단가능한 기이고; XD 및 XZ는 각각 D와 C 및 C와 Z를 공간적으로 떨어뜨려 놓기 때문에 스페이서 모이어티 (또는 "스페이서")로서 지칭되고; 아래첨자 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고 (즉, XD 및/또는 XZ의 존재는 임의적임); 아래첨자 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 (바람직하게는 1, 2, 3 또는 4)이다. D, XD, C, XZ 및 Z는 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다.
리간드 Z - 예를 들어 항체 - 는 표적화 기능을 제공한다. 그의 항원 또는 수용체가 위치하는 표적 조직 또는 세포에 결합함으로써, 리간드 Z는 접합체를 그곳으로 향하게 한다. 바람직하게는, 표적 조직 또는 세포는 암 조직 또는 세포이며, 항원 또는 수용체는 종양-연관 항원, 즉 비-암성 세포와 비교하여 암성 세포에 의해 특유하게 발현되거나 또는 암 세포에 의해 과다발현되는 항원이다. 표적 조직 또는 세포에서 기 C의 절단으로 화합물 D가 방출되어 국부적으로 그의 세포독성 효과가 발휘된다. 일부 경우에, 접합체는 세포내이입에 의해 표적 세포 내로 내재화되고, 표적 세포 내에서 절단이 일어난다. 상기 방식으로, 의도된 작용 부위에서의 화합물 D의 정확한 전달이 달성되어 필요한 투여량이 감소된다. 또한, 화합물 D는 그의 접합된 상태에서는 일반적으로 생물학적으로 불활성 (또는 유의하게 덜 활성)이고, 이로써 비-표적 조직 또는 세포에 대한 바람직하지 않은 독성이 감소된다. 항암 약물은 일반적으로 세포에 대해 종종 고도로 독성이기 때문에, 이는 중요한 고려사항이다.
아래첨자 m에 의해 반영된 바와 같이, 리간드 Z의 각각의 분자는 접합에 이용가능한 리간드 Z 부위의 수 및 사용된 실험 조건에 따라, 하나 초과의 화합물 D와 접합될 수 있다. 당업자는 리간드 Z의 각각의 개별 분자가 정수의 수의 화합물 D와 접합되지만, 접합체의 제조는 통계적 평균을 반영하여 리간드 Z에 대한 화합물 D의 비-정수 비에 대해 분석할 수 있음을 인지할 것이다.
리간드 Z 및 그의 접합
바람직하게는, 리간드 Z는 항체이다. 편의성 및 간결성을 위해, 제한 없이, 리간드 Z의 접합과 관련하여 본원에 후속되는 상세한 논의는 그것이 항체라는 맥락에서 기술될 것이지만, 당업자는 필요한 변경을 가하여 다른 유형의 리간드 Z도 접합될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 리간드로서 폴산을 갖는 접합체는 그의 표면 상의 폴레이트 수용체를 갖는 세포를 표적화할 수 있다 (문헌 [Vlahov et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18(16), 4558-4561; Leamon et al., Cancer Res. 2008, 68 (23), 9839-9844]). 동일한 이유로, 하기 상세한 논의는 주로 항체 Z 대 화합물 D의 1:1 비의 관점에서 기술된다.
바람직하게는, 리간드 Z는 이러한 리간드 Z를 포함하는 접합체가 암 세포를 선택적으로 표적화 하는 것을 가능하게 하는 종양 연관 항원에 대한 항체이다. 이러한 항원의 예는 메소텔린, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), CD19, CD22, CD30, CD70, CD200 (OX-2로도 공지됨), B7H4 (O8E로도 공지됨), 단백질 티로신 키나제 7 (PTK7), RG1, CTLA-4 및 CD44를 포함한다. 항체는 동물 (예를 들어, 뮤린), 키메라, 인간화, 또는 바람직하게는 인간 항체일 수 있다. 항체는 바람직하게는 모노클로날, 특히 모노클로날 인간 항체이다. 상기 언급된 항원 중 일부에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조는 US 2009/0074660 A1 (Korman et al.) (B7H4); US 2009/0142349 A1 A2 (Rao-Naik et al.) (CD19); US 2010/0143368 A1 (King et al.) (CD22); US 7,387,776 B2 (2008) (Keler et al.) (CD30); US 2009/0028872 A1 (Terrett et al.) (CD70); US 7,238,352 B2 (2007) (Gorczynski et al.) (CD200); US 6,984,720 B1 (2006) (Korman et al.) (CTLA-4); US 8,008,449 B2 (2011) (Korman et al.) (PD-1); US 2008/0279868 A1 (Huang et al.) (PSMA); US 2010/0034826 A1 (Terrett et al.) (PTK7); US 7,335,748 B2 (2008) (Harkins et al.) (RG1); WO 2009/045957 A1 (Terrett et al.) (메소텔린); 및 US 2010/0092484 A1 (Xu et al.) (CD44)에 개시되어 있으며; 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
리간드 Z는 또한 항체 단편 또는 항체 모방체, 예컨대 아피바디, 도메인 항체 (dAb), 나노바디, 유니바디, DARPin, 안티칼린, 베르사바디, 듀오칼린, 리포칼린 또는 아비머일 수 있다.
리간드 Z 상의 몇몇 다양한 반응성 기 중 임의의 하나는 리신 잔기 내의 ε-아미노 기, 펜던트 탄수화물 모이어티, 카르복실산 기, 디술피드 기 및 티올 기를 비롯한 접합 부위일 수 있다. 각 유형의 반응성 기는 몇몇 이점 및 몇몇 단점을 갖는 균형을 나타낸다. 접합에 적합한 항체 반응성 기의 검토를 위해, 예를 들어 그의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216 및 Dubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123]을 참조한다.
한 실시양태에서, 리간드 Z는 리신 ε-아미노 기를 통해 접합된다. 대부분의 항체는 여러 개의 노출된 리신 ε-아미노 기를 갖고, 이는 이종이관능성 작용제 (하기에 추가로 기재된 바와 같은 것)를 사용한 변형을 비롯한 당업계에 공지된 기술을 사용하여 아미드, 우레아, 티오우레아 또는 카르바메이트 결합을 통해 접합될 수 있다. 그러나, 접합체 제조에서 잠재적인 배치-대-배치 변동성이 유발되도록 어떤 ε-아미노 기를 얼마나 많이 반응시킬지 제어하는 것은 어렵다. 또한, 접합은 항체의 천연 입체형태를 유지하는데 중요한 양성자화 ε-아미노 기의 중화를 야기할 수 있거나, 또는 항원 결합 부위 또는 그 근처에서의 리신에서 발생할 수 있으며, 이들 중 어느 것도 바람직한 경우는 아니다.
또 다른 실시양태에서, 다수의 항체가 글리코실화되는 것과 같이, 리간드 Z는 탄수화물 측쇄를 통해 접합될 수 있다. 탄수화물 측쇄는 퍼아이오데이트에 의해 산화되어 알데히드 기를 생성할 수 있고, 이는 다시 아민과 반응하여 세미카르바존, 옥심 또는 히드라존에서와 같이 이민 기를 형성할 수 있다. 원하는 경우에, 소듐 시아노보로히드라이드를 사용한 환원에 의해 이민 기를 보다 안정한 아민 기로 전환할 수 있다. 탄수화물 측쇄를 통한 접합에 대한 추가의 개시내용에 대해서는, 예를 들어 그의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Rodwell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986)]을 참조한다. 리신 ε-아미노 기에서와 같이, 접합 부위(들)의 위치의 재현성 및 화학량론에 관한 우려가 존재한다.
또 다른 실시양태에서, 리간드 Z는 카르복실산 기를 통해 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 말단 카르복실산 기는 관능화되어 카르보히드라지드를 생성하고, 이는 이어서 알데히드-보유 접합 모이어티와 반응한다. 문헌 [Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153]을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 Z는 항체 Z 상의 시스테인 잔기 및 접합체의 다른 부분 상의 황을 가교하는 디술피드 기를 통해 접합될 수 있다. 일부 항체는 유리 티올 (술프히드릴) 기가 결여되어 있지만, 예를 들어 힌지 영역에 디술피드 기를 갖는다. 이러한 경우에, 유리 티올 기는 천연 디술피드 기의 환원에 의해 생성될 수 있다. 이렇게 생성된 티올 기는 이어서 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 그의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994); 및 Doronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003)]을 참조한다. 다시, 접합 부위 위치 및 화학량론 및 항체 천연 입체형태의 가능한 파괴에 관한 우려가 존재한다.
천연 디술피드 결합을 파괴하지 않으면서 항체에 유리 티올 기를 도입하기 위한 다수의 방법이 공지되어 있고, 그러한 방법은 본 발명의 리간드 Z로 수행할 수 있다. 사용하는 방법에 따라, 예정된 위치에 예측가능한 수의 유리 술프히드릴을 도입하는 것이 가능할 수 있다. 한 가지 접근법에서는, 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이된 항체가 제조된다. 예를 들어, US 7,521,541 B2 (2009) (Eigenbrot et al.); 문헌 [Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507]; US 4,698,420 (1987) (Urnovitz et al.); [Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000)]; US 7,311,902 B2 (2007) (Bam et al.); [Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995)]을 참조한다. 또 다른 접근법에서는, 여분의 시스테인을 C-말단에 부가한다. 예를 들어, 문헌 [Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al, Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); 및 Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004)]을 참조한다. 유리 시스테인을 도입하기 위한 바람직한 방법은 WO 2009/026274 A1 (Liu et al.)에 교시되어 있으며, 여기서는 시스테인 보유 아미노산 서열을 항체 중쇄의 C-말단에 부가한다. 상기 방법은 공지된 수의 시스테인 잔기 (중쇄당 하나)를 항원 결합 부위와 떨어진 공지된 위치에 도입한다. 본 단락에서 언급한 문헌의 개시내용은 모두 본원에 참고로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 리신 ε-아미노 기를 2-이미노티올란 또는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트 (SPDP)와 같은 이종이관능성 시약을 사용하여 변형시켜 ε-아미노 기를 티올 또는 디술피드 기로 전환시킴으로써 - 이를테면 시스테인 대용물을 생성할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 적절한 ε-아미노 기와 연관된 동일한 접합 위치 및 화학량론 제한으로 인해 곤란을 겪게 된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 리간드 Z는 티올 기의 친핵성 부가 생성물을 통해 수용자 모이어티에 접합된다. 바람직한 수용자 모이어티는 말레이미드 기이고, 그의 항체 티올 기와의 반응은 하기에 일반적으로 예시된다. 티올 기는 천연 티올 기 또는 상기에 기재된 바와 같이 도입된 티올 기일 수 있다.
Figure pct00021
리간드 Z는 또한 하기에 논의된 바와 같은 "클릭(click)" 화학과의 사용에 적합화된 관능기를 통해 접합될 수 있다.
Figure pct00022
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 접합체의 링커 부분은 3개 이하의 요소: 절단가능한 기 C 및 임의적 스페이서 XZ 및 XD를 포함한다.
절단가능한 기 C는 생리학적 조건 하에 절단가능한 기이고, 바람직하게는 접합체가 혈장 내에서 일반적으로 순환되는 동안에는 상대적으로 안정하지만, 접합체가 의도된 그의 작용 부위, 즉 표적 세포 근처, 표적 세포 또는 표적 세포 내에 일단 도달하면 용이하게 절단되도록 선택된다. 바람직하게는, 접합체는 항체 Z가 표적 세포의 표면 상에 나타난 항원에 결합되었을 때 표적 세포에 의한 세포내이입에 의해 내재화된다. 후속적으로, 표적 세포의 소포성 소체 (초기 엔도솜, 후기 엔도솜 또는 특히 리소솜)에서 기 C의 절단이 발생한다.
한 실시양태에서, 기 C는 pH 민감성 기이다. 혈장 내 pH는 중성을 약간 초과하는 반면, 리소솜 내의 pH는 약 5로, 산성이다. 따라서, 절단이 산 촉매되는 기 C는 혈장 내에서의 속도에 비해 리소솜 내에서 몇몇 자릿수 더 빠른 속도로 절단될 것이다. 적합한 산-민감성 기의 예는 그의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 US 4,631,190 (1986) (Shen et al.); US 5,144,011 (1992) (Shen et al.); 문헌 [Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981) 및 Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988)]에 기재된 바와 같은 시스-아코니틸 아미드 및 히드라존을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 기 C는 디술피드이다. 디술피드는 티올-디술피드 교환 메카니즘에 의해 주위 티올 농도에 의존적인 속도로 절단될 수 있다. 글루타티온 및 다른 티올의 세포내 농도는 그들의 혈청 농도보다 높기 때문에, 디술피드의 절단 속도는 세포내에서 더 높을 것이다. 또한, 티올-디술피드 교환 속도는 증진된 혈청 안정성 또는 특정한 절단 속도를 갖는 디술피드 연결의 설계를 가능하게 하는 디술피드의 입체 및 전자 특징의 조정 (예를 들어, 알킬-아릴 디술피드 대 알킬-알킬 디술피드; 아릴 고리 상에서의 치환 등)에 의해 조절될 수 있다. 접합체에서의 디술피드 절단가능한 기와 관련된 추가의 개시내용에 대해서는, 예를 들어 그의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988)]; US 7,541,530 B2 (2009) (Santi et al.); US 6,989,452 B2 (2006) (Ng et al.); WO 2002/096910 A1 (Ng et al.); US 7,691,962 B2 (Boyd et al.); 및 US 2010/0145036 A1 (Sufi et al.)을 참조한다.
바람직한 기 C는, 혈청 내의 프로테아제에 의한 것과는 대조적으로, 의도된 작용 부위에서 프로테아제에 의해 우세하게 절단되는 펩티드 결합을 포함한다. 전형적으로, 기 C는 1 내지 20개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 6개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산을 포함한다. 아미노산(들)은 천연 및/또는 비천연 α-아미노산일 수 있다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것, 뿐만 아니라 그로부터 유래된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 시트룰린 및 O-포스포세린이다. 용어 아미노산은 또한 아미노산 유사체 및 모방체를 포함한다. 유사체는 R 기가 천연 아미노산 중에서 발견되는 것이 아님을 제외하고는, 천연 아미노산과 동일한 일반적 H2N(R)CHCO2H 구조를 갖는 화합물이다. 유사체의 예는 호모세린, 노르류신, 메티오닌-술폭시드 및 메티오닌 메틸 술포늄을 포함한다. 아미노산 모방체는 α-아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 그와 유사한 방식으로 기능하는 화합물이다. 용어 "비천연 아미노산"은 "D" 입체화학적 형태를 나타내는 것으로 의도되며, 천연 아미노산은 "L" 형태의 것이다.
바람직하게는, 기 C는 프로테아제에 대한 절단 인식 서열인 아미노산 서열을 함유한다. 다수의 절단 인식 서열이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 그의 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); 및 Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995)]을 참조한다.
세포에 의해 내재화되는 것이 의도되지 않는 접합체에 대해서는, 기 C가 표적 조직 부근의 세포외 매트릭스에 존재하는 프로테아제, 예를 들어 근처의 사멸되는 세포에 의해 방출된 프로테아제 또는 종양-연관 프로테아제에 의해 절단되도록 선택될 수 있다. 예시적인 세포외 종양-연관 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), 티메트 올리고펩티다제 (TOP) 및 CD10이다.
세포에 의해 내재화되도록 설계된 접합체에 대해서는, 기 C가 바람직하게는 엔도솜 또는 리소솜 프로테아제, 특히 후자에 의해 절단되도록 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 프로테아제의 비제한적인 예는 카텝신 B, C, D, H, L 및 S, 특히 카텝신 B를 포함한다. 카텝신 B는 서열 -AA2-AA1- (여기서 AA1은 염기성 또는 강력한 수소 결합 아미노산 (예컨대, 리신, 아르기닌 또는 시트룰린)이고, AA2는 소수성 아미노산 (예컨대, 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신 또는 이소류신)임), 예를 들어 Val-Cit (여기서 Cit는 시트룰린을 나타냄) 또는 Val-Lys에서 펩티드를 우세하게 절단한다 (본원에서, 문맥상 달리 분명하게 나타내지 않는 한, 아미노산 서열은 H2N-AA2-AA1-CO2H에서와 같이 N에서 C 방향으로 기술됨). 카텝신-절단가능한 기에 관한 추가의 정보에 대해서는, 그의 개시내용이 참고로 포함되는 문헌 [Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998); 및 Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002)]을 참조한다. 펩티딜 링커를 절단하는데 이용될 수 있는 또 다른 효소는 Ala-Ala-Asn에서 우세하게 절단하는 리소솜 시스테인 프로테아제인 레구마인이다.
한 실시양태에서, 기 C는 2개의 아미노산 서열 -AA2-AA1-을 포함하는 펩티드이고, 여기서 AA1은 리신, 아르기닌 또는 시트룰린이고, AA2는 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신 또는 이소류신이다. 또 다른 실시양태에서, C는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Ala-Asn, Lys, Cit, Ser 및 Glu로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 아미노산 서열로 이루어진다.
단일 아미노산으로 이루어진 절단가능한 기 C의 제조 및 설계는 US 2010/0113476 A1 (Chen et al.)에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
기 C는 또한 광절단가능한 것, 예를 들어 광에 노출 시 절단되는 니트로벤질 에테르일 수 있다.
기 C는 항체 Z 또는 화합물 D에 직접 결합될 수 있는데; 즉, 스페이서 XZ 및 경우에 따라 XD가 부재할 수 있다. 예를 들어, 기 C가 디술피드인 경우에, 2개의 황 중 1개는 시스테인 잔기일 수 있거나 또는 항체 Z에 대한 그의 대용물일 수 있다. 또는, 기 C는 항체의 탄수화물 측쇄 상의 알데히드에 결합된 히드라존일 수 있다. 또는, 기 C는 항체 Z의 리신 ε-아미노 기와 함께 형성된 펩티드 결합일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화합물 D는 화합물 D 내의 카르복실 또는 아민 기에 대한 펩티딜 결합을 통해 기 C에 직접 결합된다.
존재하는 경우에, 스페이서 XZ는 기 C와 항체 Z 사이에, 전자가 후자에 의한 항원 결합을 입체적으로 간섭하거나 또는 후자가 전자의 절단을 입체적으로 간섭하지 않도록 공간적 분리를 제공한다. 또한, 스페이서 XZ는 접합체에 증가된 용해도 또는 감소된 응집 특성을 부여하는데 사용될 수 있다. 스페이서 XZ는 하나 이상의 모듈화된 절편을 포함할 수 있고, 이는 임의의 수의 조합으로 조립될 수 있다. 스페이서 XZ에 적합한 절편의 예는
Figure pct00023
이고, 여기서 아래첨자 q는 0 또는 1이고, 아래첨자 r은 1 내지 24, 바람직하게는 2 내지 4이다. 이들 절편은 하기에 나타낸 바와 같이 조합될 수 있다.
Figure pct00024
스페이서 XD는, 존재하는 경우에, 기 C와 화합물 D 사이에, 후자가 전자의 절단을 입체적으로 또는 전자적으로 간섭하지 않도록 공간적 분리를 제공한다. 스페이서 XD는 또한 접합체에 부가적인 분자 질량 및 화학적 관능기를 도입하도록 작용할 수 있다. 일반적으로, 부가적인 질량 및 관능기는 접합체의 혈청 반감기 및 다른 특성에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 스페이서 기의 신중한 선택을 통해 접합체의 혈청 반감기를 조절할 수 있다. 스페이서 XD는 또한 스페이서 XZ의 맥락에서 상기에 기재된 바와 같이 모듈화된 절편으로부터 조립될 수 있다.
스페이서 XZ 및/또는 XD는, 존재하는 경우에, 바람직하게는 각각 Z와 C 또는 D와 C 사이에, 5 내지 15개 원자, 보다 바람직하게는 5 내지 20개 원자의 선형 분리를 제공한다.
스페이서 XZ 또는 XD 중 어느 하나, 또는 둘 다는 자기 희생 모이어티를 포함할 수 있다. 자기 희생 모이어티는 (1) 기 C 및 항체 Z 또는 세포독소 D 중 어느 하나에 결합되고 (2) 기 C로부터의 절단이, 자기 희생 모이어티가 그 자신을 항체 Z 또는 경우에 따라 세포독소 D로부터 결합분리시키게 하는 반응 순서를 개시하도록 하는 구조를 갖는 모이어티이다. 즉, 항체 Z 또는 세포독소 D로부터 떨어져 있는 부위에서의 반응 (기 C로부터의 절단)은 XZ-Z 또는 XD-D 결합의 파열도 야기한다. 자기 희생 모이어티의 존재는 스페이서 XD의 경우에 바람직한데, 이는 접합체의 절단 후 스페이서 XD 또는 그의 일부가 세포독소 D에 부착된 채로 유지되는 경우에, 후자의 생물학적 활성이 손상될 수 있기 때문이다. 자기 희생 모이어티의 사용은 절단가능한 기 C가 폴리펩티드인 경우에 특히 바람직하다.
파트너 분자 D 상의 히드록실 또는 아미노 기에 결합된 예시적인 자기 희생 모이어티 (i) 내지 (v)를 하기에 나타낸다:
Figure pct00025
자기 희생 모이어티는 점선 a와 b 사이의 구조이고, 인접한 구조적 특징은 전후관계를 제공하기 위해 나타냈다. 자기 희생 모이어티 (i) 및 (v)는 화합물 D-NH2 (즉, 화합물 D는 아미노 기를 통해 접합됨)에 결합하는 반면, 자기 희생 모이어티 (ii), (iii) 및 (iv)는 화합물 D-OH (즉, 화합물 D는 히드록실 또는 카르복실 기를 통해 접합됨)에 결합한다. 점선 b에서의 아미드 결합의 절단은 아미드 질소를 아민 질소로서 방출시켜, 점선 a에서의 결합의 절단 및 D-OH 또는 경우에 따라 D-NH2의 결과적 방출을 유발하는 반응 순서가 개시된다. 자기 희생 모이어티에 관한 추가의 개시내용에 대해서는, 그의 개시내용이 참고로 포함되는 문헌 [Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981)]; WO 81/01145 (1981) (Carl et al.); [Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999)]; US 6,214,345 B1 (2001) (Firestone et al.); [Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002)]; [Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941)]; US 7,691,962 B2 (Boyd et al.); US 2008/0279868 A1 (Boyd et al.); WO 2008/083312 A2 (Sufi et al.); US 7,375,078 B2 (Feng); 및 US 2003/0096743 A1 (Senter et al.)을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 표적화 모이어티 및 세포독성 화합물 D는 절단가능하지 않은 링커에 의해 연결된다. 항체의 분해는 결국 세포독성 화합물 D의 생물학적 활성을 간섭하지 않는 부가된 작은 모이어티로 링커를 감소시킨다.
화합물 D - 링커 조성물
본 발명의 화합물에서, 접합은 바람직하게는 화학식 I에서 정의된 바와 같은 기 R0에 대한 결합을 통해 이루어진다. 바람직하게는, R0은 NHR1a이다. R1a가 H 또는 알킬인 경우에, 결합은 R1aNH의 질소에 대한 것일 수 있다. R1a가 (CH2)nNH2, C(=O)(CH2)nNH2, C(=O)CHR8NH2 또는 C(=O)R9NH2인 경우에, 접합은 R1a의 아미노 (NH2) 기를 통해 이루어질 수 있다. 따라서, R1aNH 의 구조에 따라, D는
Figure pct00026
로서 나타낼 수 있고,
여기서 R12는 C1-C6 알킬이고, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 n은 화학식 I과 관련하여 정의된 바와 같다.
필요한 변경을 가하여 화학식 Ia, Ib, 또는 IIa 내지 IIh로부터 상응하는 구조를 유도할 수 있다.
바람직하게는, D는
Figure pct00027
이다.
본 발명의 접합체는 바람직하게는 먼저 화합물 D 및 링커 (XD)aC(XZ)b를 결합시켜 하기 화학식 IV에 의해 나타낸 약물-링커 조성물을 형성함으로써 제조된다.
<화학식 IV>
Figure pct00028
상기 식에서, R31은 항체 Z 상의 관능기와 반응하여 접합체를 형성하기에 적합한 관능기이다. 적합한 기 R31의 예는 아지드, 시클로옥틴,
Figure pct00029
을 포함하고, 여기서 R32는 Cl, Br, F, 메실레이트 또는 토실레이트이고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-숙신이미딜, -O-(4-니트로페닐), -O-펜타플루오로페닐 또는 -O-테트라플루오로페닐이다. 적합한 모이어티 D-(XD)aC(XZ)b-R31을 제조하는데 일반적으로 사용가능한 화학은 US 7,087,600 B2 (2006) (Ng et al.); US 6,989,452 B2 (2006) (Ng et al.); US 7,129,261 B2 (2006) (Ng et al.); WO 02/096910 A1 (Ng et al.); US 7,691,962 B2 (Boyd et al.); US 7,517,903 B2 (2009) (Chen et al.); US 7,714,016 B2 (2010) (Gangwar et al.); US 2008/0279868 A1 (Boyd et al.); US 7,847,105 B2 (2010) (Gangwar et al.); US 7,968,586 B2 (2011) (Gangwar et al.); US 2010/0145036 A1 (Sufi et al.); 및 US 2010/0113476 A1 (Chen et al.)에 개시되어 있고; 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
바람직하게는 반응성 관능기 -R31은 -NH2, -OH, -CO2H, -SH, 말레이미도, 시클로옥틴, 아지도 (-N3), 히드록실아미노 (-ONH2) 또는 N-히드록시숙신이미도이다.
-OH 기는 항체 상에서, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산 측쇄 상에서 카르복시 기로 에스테르화될 수 있다.
-CO2H 기는 항체 상에서 -OH 기로 에스테르화되거나 또는 아미노 기 (예를 들어, 리신 측쇄 상에서의 것)로 아미드화될 수 있다.
N-히드록시숙신이미드 기는 기능적으로 활성화된 카르복실 기이고, 아미노 기 (예를 들어, 리신으로부터의 것)와의 반응에 의해 편리하게 아미드화될 수 있다.
말레이미드 기는 마이클 첨가 반응에서 항체 상에서의 -SH 기 (예를 들어, 시스테인, 또는 술프히드릴 관능기를 도입하기 위한 항체의 화학적 변형으로부터의 것)와 접합될 수 있다.
-SH 기는 상기 기재된 것의 "거울상"인 마이클 첨가 반응에서 항체가 그에 대해 말레이미드 기를 도입하도록 변형된 경우의 접합에 특히 유용하다. 항체는 N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)-시클로헥산카르복실레이트 (SMCC) 또는 그의 술폰화 변이체인 술포-SMCC (시약은 둘 다 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 입수가능함)를 사용하여 말레이미드 기를 갖도록 변형될 수 있다.
아지드 및 시클로옥틴은, 아지드가 시클로옥틴의 긴장된 알킨 결합을 가로질러 부가됨으로써 1,2,3-트리아졸 고리를 형성하는 소위 구리-무함유 "클릭 화학"을 통해 접합을 이룰 수 있는 상보적 관능기이다. 예를 들어, 문헌 [Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571-6584]을 참조한다. 아지드는 화학식 IV에서의 반응성 관능기 R31일 수 있고, 시클로옥틴은 항체 또는 그의 항원 결합 부분 상에 위치할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 시클로옥틴 기는 DIBO 시약 (오레곤주 유진 소재 인비트로젠/몰레큘라 프로브스(Invitrogen/Molecular Probes)로부터 입수가능함)에 의해 제공될 수 있다.
반응성 관능기와의 접합을 위한 관능기를 제공하는 비천연 아미노산을 항체에 도입하는 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산인 p-아세틸페닐알라닌을, WO 2008/030612 A2 (2008) (Tian et al.)에 교시되어 있는 바와 같이 항체에 혼입시킬 수 있다. p-아세틸페닐알라닌의 케톤 기는 히드록실아미노 반응성 관능기와의 옥심 형성에 의해 접합 부위가 될 수 있다.
아민 (NH2) 기는, 문헌 [Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995 -9997]에 교시되어 있는 바와 같이 효소 트랜스글루타미나제를 사용하여 접합에 사용될 수 있다.
접합은, 문헌 [Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10]; WO 2010/087994 A2 (2010) (Ploegh et al.); 및 WO 2005/051976 A2 (2005) (Mao et al.)에 교시되어 있는 바와 같이 효소 소르타제 A를 사용하여 이루어질 수도 있다. 소르타제 A 인식 모티프 (전형적으로 LPXTG, 여기서 X는 임의의 천연 아미노산임)는 리간드 Z 상에 위치할 수 있고, 친핵성 수용자 모티프 (전형적으로 GGG)는 화학식 IV에서의 기 R31일 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.
화학식 IV에 따른 조성물의 예는 하기 화학식 IVa 내지 IVg에 의해 나타낸 구조를 갖는 것을 포함한다.
<화학식 IVa>
Figure pct00030
<화학식 IVb>
Figure pct00031
<화학식 IVc>
Figure pct00032
<화학식 IVd>
Figure pct00033
<화학식 IVe>
Figure pct00034
<화학식 IVf>
Figure pct00035
<화학식 IVg>
Figure pct00036
접합체의 제조
하기는 상기에 기재된 바와 같이 리신 ε-아미노 기를 2-이미노티올란과 반응시킨 후 말레이미드-함유 약물-링커 모이어티와 반응시킴으로써 항체에 유리 티올 기를 도입하는 것에 기반한 예시적인 절차이다. 먼저 항체를 50 mM NaCl 및 2 mM 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA)을 함유하는 0.1 M 포스페이트 완충제 (pH 8.0)로 완충제 교환하고, 5 내지 10 mg/mL로 농축시킨다. 2-이미노티올란을 항체에 첨가하는 것을 통해 티올화를 달성한다. 첨가하는 2-이미노티올란의 양은 예비 실험에 의해 결정될 수 있고, 항체마다 상이하다. 예비 실험에서는, 적정 증가량의 2-이미노티올란을 항체에 첨가하고, 항체와 RT (실온, 약 25℃)에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세파덱스(SEPHADEX)™ G-25 칼럼을 사용하여 50 mM pH 6.0 HEPES 완충제로 항체를 탈염시키고, 도입된 티올 기의 수를 디티오디피리딘 (DTDP)과의 반응에 의해 신속하게 결정한다. 티올 기의 DTDP와의 반응은 티오피리딘을 유리시키고, 이는 324 nm에서 분광학적으로 모니터링할 수 있다. 전형적으로 0.5 내지 1.0 mg/mL 단백질 농도의 샘플을 사용한다. 280 nm에서의 흡광도를 사용하여 샘플 내 단백질 농도를 정확하게 결정할 수 있고, 이어서 각 샘플의 분취액 (0.9 mL)을 0.1 mL DTDP (에탄올 중 5 mM 원액)와 함께 10분 동안 RT에서 인큐베이션한다. 블랭크 완충제 샘플 단독 + DTDP를 또한 나란히 인큐베이션한다. 10분 후에, 324 nm에서의 흡광도를 측정하고, 티오피리딘에 대한 흡광 계수 19,800 M-1을 사용하여 티올 기의 수를 정량화한다.
전형적으로, 항체당 약 3개의 티올 기의 티올화 수준이 바람직하다. 예를 들어, 일부 항체의 경우에, 이는 2-이미노티올란을 15배 몰 과량으로 첨가한 후 RT에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 달성될 수 있다. 이어서, 항체를 2-이미노티올란과 함께 목적하는 몰비로 인큐베이션한 다음, 접합 완충제 (5 mM 글리신 및 2 mM DTPA를 함유하는 50 mM pH 6.0 HEPES 완충제)로 탈염시킨다. 티올화 물질을 빙상에 유지시키면서 도입된 티올의 수를 상기에 기재된 바와 같이 정량화한다.
도입된 티올의 수를 검증한 후, 약물-링커 모이어티를 티올당 3배 몰 과량으로 첨가한다. 최종 농도 5%의 디메틸술폭시드 (DMSO) 또는 유사한 대안 용매를 또한 함유하는 접합 완충제 중에서 접합 반응이 진행되도록 한다. 통상적으로, 약물-링커 원액을 100% DMSO 중에 용해시킨다. DMSO가 최종 농도를 10%에 이르게 하는데 충분한 DMSO가 첨가된 티올화 항체에 원액을 직접 첨가하거나, 또는 최종 농도 10%의 DMSO를 함유하는 접합 완충제 중에 미리 희석시킨 후, 동등 부피의 티올화 항체를 첨가한다.
접합 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하면서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 접합 반응 혼합물을 원심분리하고, 0.2 μm 필터를 통해 여과한다. 접합체의 정제는 다수의 방법을 사용하여 크로마토그래피를 통해 달성할 수 있다. 한 가지 방법에서는, 5 mM 글리신 및 50 mM NaCl을 함유하는 50 mM pH 7.2 HEPES 완충제로 미리 평형화된 세파크릴(SEPHACRYL)™ S200 칼럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 접합체를 정제한다. 크로마토그래피는 28 cm/h의 선형 유량으로 수행한다. 접합체를 함유하는 분획을 수집하고, 풀링하고, 농축시킨다. 대안적 방법에서는, 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제를 달성할 수 있다. 조건은 항체마다 상이하며, 각 경우에서 최적화되어야 한다. 예를 들어, 항체-약물 접합체 반응 믹스를 5mM 글리신을 함유하는 50 mM pH 5.5 HEPES 중에서 미리 평형화된 SP-세파로스(SP-SEPHAROSE)™ 칼럼에 적용한다. 항체 접합체를 pH 5.5의 평형 완충제 중 0-1 M NaCl 구배를 사용하여 용리시킨다. 접합체를 함유하는 적절한 분획을 풀링하고, 제제 완충제 (5 mM 글리신 및 100 mM NaCl을 함유하는 50 mM pH 7.2 HEPES 완충제)에 대해 투석한다.
당업자는 상기 기재된 조건 및 방법론이 예시적이고 비제한적이며, 접합을 위한 다른 접근법이 당업계에 공지되어 있고 본 발명에서 이용가능하다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 일부 바람직한 접합체의 구조는, Ab가 항체를 나타내고, m이 1, 2, 3 또는 4인 하기 화학식 Va 내지 Vg에 의해 나타낸다.
<화학식 Va>
Figure pct00037
<화학식 Vb>
Figure pct00038
<화학식 Vc>
Figure pct00039
<화학식 Vd>
Figure pct00040
<화학식 Ve>
Figure pct00041
<화학식 Vf>
Figure pct00042
<화학식 Vg>
Figure pct00043
생물학적 활성
본 발명의 화합물 및 접합체의 생물학적 활성 대한 데이터는 본 명세서의 실시예 13 및 14에 제공된다.
당업자는 기 R1a가 H2NCHR8C(=O)인 화학식 I, Ia 또는 Ib의 화합물 - 화합물 (IIb), (IIf), (IIg) 또는 (IIh)에 예시된 바와 같은 것 - 이 접합체에 사용되는 경우에, 모이어티 R1a는, 그의 절단이 원래의 화합물 - 예를 들어, (IIb), (IIf), (IIg) 또는 (IIh) - 은 재생시키지 못하지만 화합물 (IIa)는 재생시키는, 효소적으로 절단가능한 펩티딜 링커의 일부일 수 있음을 인지할 것이다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제제화된 본 발명의 화합물 또는 그의 접합체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이는 임의로 하나 이상의 추가의 제약 활성 성분, 예컨대 항체 또는 또 다른 약물을 함유할 수 있다. 제약 조성물은 또 다른 치료제, 특히 또 다른 항암제와 조합 요법으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장화제 및 그의 조합물을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 문헌 [Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에 교시되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
바람직하게는, 제약 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함). 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 산의 작용 및 그를 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 그를 보호하는 물질 내에 코팅될 수 있다. 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 장내 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 제약 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액의 형태일 수 있다. 이는 또한 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도를 달성하는데 적합한 다른 규칙적인 구조로 제제화될 수 있다. 조성물은 또한 투여 전에 물 중에서 재구성하기 위한 동결건조물 형태로 제공될 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 대상체 및 특정한 투여 방식에 따라 상이할 것이고, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로 100%를 기준으로, 이 양은 제약상 허용되는 담체와 조합된 활성 성분 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 활성 성분 약 1% 내지 약 30%의 범위일 것이다.
투여 요법은 치료 반응을 제공하기 위해 조절된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수도 있고, 용량이 상황의 긴급성에 따라 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수도 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. "투여 단위 형태"는 치료할 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합화된 물리적인 이산 단위를 지칭하는데; 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 반응을 생성하도록 계산된 예정량의 활성 화합물을 함유한다.
투여량은 숙주 체중의 kg당 약 0.0001 내지 100 mg, 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 mg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수 있거나, 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위 이내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 매주 1회, 매 2주 1회, 매 3주 1회, 매 4주 1회, 매월 1회, 매 3개월 1회, 또는 매 3개월 내지 매 6개월 1회 투여이다. 바람직한 투여 요법은 하기 투여 스케줄: (i) 6회의 투여에 대해 매 4주 후, 매 3개월; (ii) 매 3주; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 매 3주 1 mg/kg 체중 중 하나를 사용하는, 정맥내 투여를 통한 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함한다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1 내지 1000 μg/ml, 일부 방법에서는 약 25 내지 300 μg/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
"치료 유효량"의 본 발명의 화합물은 바람직하게는 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간을 증가시키거나, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 불능을 예방한다. 예를 들어, 종양-보유 대상체의 치료에 대해, "치료 유효량"은 바람직하게는 치료하지 않은 대상체에 비해 종양 성장을 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 치료 유효량의 치료 화합물은 전형적으로는 인간이지만 또 다른 포유동물일 수도 있는 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나, 또는 달리 증상을 개선시킬 수 있다.
제약 조성물은 제어 또는 지속 방출 제제, 예컨대 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템일 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 의료 장치, 예컨대 (1) 무바늘 피하 주사 장치 (예를 들어, US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 및 4,596,556); (2) 미세-주입 펌프 (US 4,487,603); (3) 경피 장치 (US 4,486,194); (4) 주입 장치 (US 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 삼투 장치 (US 4,439,196 및 4,475,196) (이의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)를 통해 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 생체내에서 적절한 분포가 보장되도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 화합물이 혈액-뇌 장벽을 가로지르도록 보장하기 위해, 그것은 리포솜 내에 제제화될 수 있고, 이는 특정한 세포 또는 기관으로의 선택적 수송을 증진시키는 표적화 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, US 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
용도
본 발명의 화합물 또는 그의 접합체는 질환, 예컨대 비제한적으로 과다증식성 질환, 예컨대 두부, 경부, 비강, 부비동, 비인두, 구강, 구인두, 후두, 하인두, 타액선 및 부신경절종의 종양을 포함하는 두경부암; 간 및 담도계의 암, 특히 간세포성 암종; 장암, 특히 결장직장암; 난소암; 소세포 및 비-소세포 폐암 (SCLC 및 NSCLC); 유방암 육종, 예컨대 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 배아성 횡문근육종, 평활근육종, 신경섬유육종, 골육종, 활막 육종, 지방육종 및 폐포 연부 육종; 백혈병, 예컨대 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 골수 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 및 만성 골수 백혈병 (CML); 중추 신경계의 신생물, 특히 뇌암; 다발성 골수종 (MM), 림프종, 예컨대 호지킨 림프종, 림프형질세포양 림프종, 여포성 림프종, 점막-연관 림프성 조직 림프종, 외투 세포 림프종, B-계통 대세포 림프종, 버킷 림프종 및 T-세포 역형성 대세포 림프종을 치료하는데 사용될 수 있다. 임상적으로, 본원에 기재된 방법의 실시 및 조성물의 사용은 암성 성장의 크기 또는 수를 감소시키고/거나 연관된 증상 (적용가능한 경우)을 감소시킬 것이다. 병리학적으로, 본원에 기재된 방법의 실시 및 조성물의 사용은 병리학적 관련 반응, 예컨대 암 세포 증식의 억제, 암 또는 종양 크기의 감소, 추가 전이의 예방, 종양 혈관신생의 억제를 생성시킬 것이다. 이러한 질환의 치료 방법은 치료 유효량의 본 발명의 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 필요에 따라 반복될 수 있다. 특히, 암은 결장직장암, 간암, 전립선암, 유방암, 흑색종, 교모세포종, 폐암, 췌장암, 난소암, 다발성 골수종, 신암, 백혈병 (특히 ALL, APL 또는 AML) 또는 림프종일 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 접합체는 항체, 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항대사물, DNA 절단제, DNA 가교제, DNA 삽입제, DNA 작은 홈 결합제, 에네디인, 열 쇼크 단백질 90 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 면역조절제, 미세관 안정화제, 뉴클레오시드 (퓨린 또는 피리미딘) 유사체, 핵 유출 억제제, 프로테아솜 억제제, 토포이소머라제 (I 또는 II) 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 세린/트레오닌 키나제 억제제를 비롯한 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 특정한 치료제는 아달리무맙, 안사미토신 P3, 아우리스타틴, 벤다무스틴, 베바시주맙, 비칼루타미드, 블레오마이신, 보르테조밉, 부술판, 칼리스타틴 A, 캄프토테신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 세툭시맙, 시스플라틴, 클라드리빈, 시타라빈, 크립토피신, 다카르바진, 다사티닙, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 두오카르마이신, 디네마이신 A, 에포틸론, 에토포시드, 플록수리딘, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 게피티닙, 겜시타빈, 이필리무맙, 히드록시우레아, 이마티닙, 인플릭시맙, 인터페론, 인터류킨, β-라파콘, 레날리도미드, 이리노테칸, 메이탄신, 메클로레타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 프로카르바진, 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), 6-티오구아니딘, 티오테파, 테니포시드, 토포테칸, 트라스투주맙, 트리코스타틴 A, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 빈데신을 포함한다.
실시예
본 발명의 실시는 하기의 실시예를 참고하여 추가로 이해될 수 있으며, 이는 예시로서 제공되는 것이지, 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1 - 화합물 (IIa)
본 실시예는 화합물 (IIa) 또는 8-아미노운시알라마이신의 제조를 설명한다. 그의 제조를 위한 합성 반응식은 그것을 화합물 9로 표지하여 도 1에 나타낸다.
2,2,2-트리클로로에틸 (3-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)카르바메이트 2. 0℃에서 디클로로메탄 (DCM, 200 mL) 중 6-아미노이소벤조푸란-1(3H)-온 1 (메이브리지(Maybridge), 13.43 g, 90 mmol)의 현탁액에 2,2,2-트리클로로에틸 카르보노클로리데이트 1a (18.23 mL, 135 mmol) 및 피리딘 (17.79 mL, 180 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온 (RT, 약 25℃)에서 1시간 동안 교반하였다. 박층 크로마토그래피 (TLC) 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 여과하고, DCM (2x30 mL)으로 세척하여 카르바메이트 2를 백색 고체 (17.03g, 58%)로서 수득하였다.
Figure pct00044
히드록시프탈리드 3. CCl4 (150 mL) 중 카르바메이트 2 (17.0 g, 52.4 mmol), N-브로모숙신이미드 (NBS, 10.26 g, 57.6 mmol)의 현탁액을 교반하고, 환류 (85℃ 오일조) 하에 가열하였다. 반응 혼합물을 플라스크로부터 대략 10 cm에 위치한 선 램프로부터의 광에 노출시켰다. 2시간 후, TLC는 반응이 완결되었음을 나타내었다. HPLC는 중간체 브로마이드의 불안정한 특성에 기인하여 다중 피크를 나타내었다. 회전 증발기 상에서 농축시켜 갈색 고체를 수득하였다. 물 (200 mL)을 계내에서 갈색 고체에 첨가하고, 환류 하에 5시간 동안 가열하여 약간의 불용성 물질을 함유하는 거의 투명한 용액을 생성하였다. TLC 및 HPLC는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 회전 증발기 상에서 농축시킨 후, 120 g 실리카 칼럼 상에서 헥산 중 0-50% EtOAc 구배를 사용하는 콤비플래쉬(COMBIFLASH)™ 유닛으로 정제하여 히드록시프탈리드 3 (13.55g, 76%)을 수득하였다.
Figure pct00045
시아노프탈리드 5. 물 (4 mL) 중 히드록시프탈리드 3 (1.391 g, 4.09 mmol) 및 시안화칼륨 (399 mg, 6.14 mmol, 1.5 당량)의 현탁액에 0℃ (빙조)에서 33% 수성 HCl (1.2 mL)을 천천히 첨가하였다. 빙조를 제거하고, 교반을 2시간 동안 계속하였다. LCMS (m+1 = 368)는 화합물 4의 형성을 나타내었다. 반응 혼합물을 EtOAc로 추출하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 20 mL로 농축시켰다. 0℃로 냉각시킨 후, 용액을 디시클로헥실 카르보디이미드 (DCC, 1.2 당량)로 처리하고, 실온에서 8시간 동안 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 여과하여 우레아 부산물을 제거하고, 여과물을 30% EtOAc/헥산 구배를 사용하는 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 농축시켜 시아노프탈리드 5 (1.116 g, 78% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00046
아미노시아노프탈리드 6. 아연 (8.58 g, 131 mmol)을 실온에서 아세트산 (82 mL) 및 물 (4.3 mL) 중 시아노프탈리드 5 (3 g, 8.58 mmol)의 용액에 첨가하였다. 30분 후, TLC 및 HPLC는 생성물 및 일탈염소화 부산물의 3:1 비로 반응이 완결되었음을 나타내었다. 셀라이트(CELITE)™ 상에서 여과하고, EtOAc (50 mL) 및 물 (50 mL)로 세척한 후, 0-50% EtOAc/헥산 구배를 사용하는 콤비플래쉬™ 40g 실리카 칼럼 상에서 농축시키고 정제하여 아미노시아노프탈리드 6을 백색 고체 (980 mg, 66% 수율)로서 수득하였다.
Figure pct00047
8-아미노운시알라마이신-OTES 8. 하우저(Hauser) 고리형성 절차를 사용하였다. -70℃에서 테트라히드로푸란 (THF, 5.3 mL) 중 아미노시아노프탈리드 6 (155 mg, 0.891 mmol)의 용액에 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드 (LiHMDS, 1.782 mL, 1.782 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였다. THF (12.5 mL) 중 이미노퀴논 7 (문헌 [Nicolaou et al. 2007a]에 따라 제조한 것, 125 mg, 0.297 mmol)의 사전냉각된 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 5분 동안 교반한 다음, 30분에 걸쳐 천천히 실온으로 가온시켰다. 반응물을 포스페이트 완충제 (pH 6.8, 100 mL)로 켄칭하고, EtOAc (3x75 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 MgSO4 상에서 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 0-50% EtOAc/헥산 구배를 사용하는 콤비플래쉬™ 12 g 실리카 겔 칼럼 상에서 정제하여 생성물 8을 자주색 고체 (60 mg, 36% 수율)로서 수득하였다.
Figure pct00048
8-아미노운시알라마이신 9. 아미노운시알라마이신-OTES 8 (30 mg)을 THF (3 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 THF 중 Et3N·3HF의 용액 (1:1, 1.5 mL)으로 처리하였다. 1시간 후, TLC 및 HPLC에 의해 모니터링된 바와 같이 탈실릴화가 완결되었다. 반응 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 0-55% EtOAc/헥산 구배를 사용하는 콤비플래쉬™ 실리카 겔 칼럼 상에서 정제하여 8-아미노운시알라마이신 9를 자주색 고체 (80% 수율)로서 수득하였다.
Figure pct00049
당업자는 하기에서와 같은, 고리의 다른 곳에 그의 아미노 기를 갖거나 또는 상이한 기에 의해 치환된 화합물 1의 변이체를 출발 물질로서 사용함으로써, 다른 고리 위치에 위치한 아미노 기를 갖는 화합물 (IIa)의 변이체를 제조할 수 있음을 인지할 것이다.
Figure pct00050
실시예 2 - 화합물 (IIb), (IIg) 및 (IIh)
8-아미노운시알라마이신에서의 8-아미노 기가 특히 반응성은 아니지만, 그것은 시안화은의 존재 하에 α-아미노산 클로라이드로 아미드화될 수 있다. 도 2는 상기 절차를 통해 화합물 (IIb), (IIh) 및 (IIg)를 제조하는 예시적 절차를 나타낸다. 도 2에서, 화합물 (IIb), (IIh) 및 (IIg)는 각각 13a, 13b 및 13c'로 표지한다.
Fmoc-Gly-NH-운시알라마이신-OTES 11a. 아미노운시알라마이신-OTES 8 (5 mg) 및 Fmoc-보호된 글리시닐 클로라이드 10a (켐-임펙스(Chem-Impex), 8.4 mg, 3 당량)를 아세토니트릴 (2 mL) 중에 용해시키고, AgCN (7 mg, 6 당량)의 존재 하에 밤새 교반하였다. TLC 및 HPLC에 의해 모니터링된 바와 같이 반응이 완결되었다. 0-40% EtOAc/헥산 구배를 사용하는 콤비플래쉬™ 실리카 칼럼 상에서 농축시키고 정제하여 생성물 11a를 자주색 고체 (90% 수율)로서 수득하였다
Figure pct00051
Fmoc-Gly-NH-운시알라마이신 12a. 생성물 11a (4 mg)를 THF (0.5 mL) 중에 용해시키고, 실온에서 Et3N·3HF·THF의 용액 (1:1, 0.25 mL)으로 처리하였다. 1시간 후, TLC 및 HPLC에 의해 모니터링된 바와 같이 탈실릴화가 완결되었다. 반응 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 0-55% EtOAc/헥산 구배를 사용하는 콤비플래쉬™ 실리카 겔 칼럼 상에서 정제하여 화합물 12a를 자주색 고체 (80% 수율)로서 수득하였다.
Figure pct00052
Gly-NH-운시알라마이신 13a. 화합물 12a (2 mg)를 실온에서 15분 동안 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 1 mL) 중 20% 피페리딘으로 처리하였다. 아세토니트릴/물 중 0.1% TFA 용리액을 사용하는 역상 HPLC (R-HPLC)를 사용하여 농축시키고 정제하여 화합물 13a (50% 수율)를 수득하였다.
Figure pct00053
유사한 리신 및 세린 화합물 13b 및 13c'는 동일한 일반적 절차를 사용하여 제조하였다. 산 클로라이드 10b 및 10c를 상응하는 카르복실산 (둘 다 켐-임펙스로부터의 것)으로부터 티오닐 클로라이드 또는 고세즈(Ghosez) 시약과의 반응에 의해 제조하였다. 화합물 13c로부터의 TES 기의 제거를 아세트산으로 달성하였다.
Figure pct00054
실시예 3 - 화합물 (IIf)
시트룰린 산 클로라이드의 불안정성 때문에, 이전 실시예의 절차를 시트룰린에 사용할 수 없었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 시트룰린을 화합물 7과의 축합 전에 프탈리드에 부착시켜 도면에 17로 표지한 화합물 (IIf)를 제조하는, 대안적 합성 접근법이 고안되었다.
Fmoc-시트룰린 커플링된 시아노프탈리드 14. DCM:DMF (17:3, 20 mL) 중 Boc-보호된 시트룰린 6a (켐-임펙스, 0.726 g, 2.64 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 0.578g, 2.9 mmol)를 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 아미노시아노프탈리드 6 (0.23 g, 1.32 mmol)을 첨가하고, 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 후처리하고, 포화 NaHCO3 용액으로 세척하고, 물 및 염수로 추가로 세척하였다. DCM 중 17% MeOH로 용리시키면서 콤비플래쉬 칼럼으로 농축시키고 정제하여 시아노프탈리드 14 (40% 수율)를 수득하였다.
Figure pct00055
화합물 15. 프탈리드 14를 DCM-트리플루오로아세트산 (TFA) (1:1)으로 처리하여 화합물 15를 수득하였다.
Figure pct00056
화합물 17. 추가 정제 없이, 화합물 15의 TFA 염을 상기에 기재된 일반적 조건을 사용하여 이미노퀴논 7과의 하우저 고리형성에 적용시켜 TES 보호된 화합물 16 (10% 수율)을 수득하였다. 화합물 16을 Et3N·3HF로 탈실릴화한 후, CH3CN/물 중 0.1% TFA를 사용하는 R-HPLC로 화합물 17을 수득하였다.
Figure pct00057
실시예 4 - 화합물 (IIc)
도 4는 도면에서 22로 표지된 화합물 (IIc)의 합성에 대한 반응식을 나타낸다.
화합물 19. ClCH2CH2Cl (30 mL) 중 아미노시아노프탈리드 6 (300 mg, 1.723 mmol), 화합물 18 (알드리치-시그마(Aldrich-Sigma), 823 mg, 5.17 mmol) 및 아세트산 (5 당량)의 용액에 소듐 트리아세톡시 보로히드라이드 (3 당량)를 첨가하고, 실온에서 5시간 동안 교반하였다. HPLC는 90% 전환율을 나타내었다. 반응 혼합물을 DCM (100 mL)에 녹이고, 포화 NaHCO3 용액 (50 mL)으로 세척하였다. 용리액으로서 40% EtOAc/헥산을 사용하는 콤비플래쉬™ 칼럼을 사용하여 농축시키고 정제하여 화합물 19를 수득하였다.
Figure pct00058
화합물 20a. 화합물 19를 DCM (6 mL) 중에 용해시키고, 0℃에서 TFA (3 mL)로 처리하였다. 온도가 실온으로 상승되도록 하고, 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. HPLC는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 농축시켜 점착성 물질을 수득하였고, 이를 에테르 (2x20 mL)로 세척하고, 아세토니트릴/물 중에 용해시키고, 동결건조시켜 화합물 20a (601 mg, 78% 수율)를 수득하였다.
Figure pct00059
화합물 20b. 0℃에서 DMF (2 mL) 중 화합물 20a (비스-TFA 염으로서 200 mg, 0.451 mmol)의 용액에 트리에틸아민 (0.314 mL, 2.256 mmol)에 이어서 DCM (2 mL) 중 (클로로(4-메톡시페닐)메틸렌)디벤젠 (167 mg, 0.541 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, EtOAc 및 물로 후처리하였다. 헥산 중 30% EtOAc를 사용하는 중성 알루미나 칼럼 상에서 정제하여 p-메톡시페닐디페닐메틸 (MMT) 보호된 생성물 20b를 연황색 고체 (105 mg, 48% 수율)로서 수득하였다. 순도는 TLC에 의해 트리에틸아민:EtOAc:헥산 (1:30:70) 이동상으로 확인되었다.
Figure pct00060
화합물 22. -70℃에서 THF (2 mL) 중 생성물 20b (92 mg, 0.188 mmol)의 용액에 LiHMDS (0.376 mL, 0.376 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였다. THF (2.6 mL) 중 이미노퀴논 7 (52.8 mg, 0.125 mmol)의 사전냉각된 용액을 첨가하고, 동일한 온도에서 5분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 20분에 걸쳐 천천히 가온시키고, 포스페이트 완충제 (pH 6.8, 20 mL)로 켄칭하고, EtOAc (3x15 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (30 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켜 조 생성물 21을 수득하였다. 비정제된 생성물 21을 DMSO (2 mL) 중에 용해시키고, 4℃에서 Et3N·3HF (0.5 mL)로 처리하고, 실온에서 교반하였다. 1시간 후, LCMS는 생성물의 형성을 나타내었다. 조 생성물을 이동상으로서 아세토니트릴/물 중 0.1% TFA를 사용하는 엑스-브리지(X-Bridge) 정제용 C18 칼럼 5μm OBD (30x150 mm) 상에서 정제하였다. 동결건조로 생성물 22 (두 단계에 걸쳐 14.4 mg, 23% 수율)를 수득하였다.
Figure pct00061
실시예 5 - 화합물 (IIe)
도 5는 도면에서 25로 표지된 화합물 (IIe)의 합성에 대한 반응식을 나타낸다.
8-메틸아미노운시알라마이신 25. ClCH2CH2Cl (2 mL) 중 아미노시아노프탈리드 6 (34 mg, 0.195 mmol), 파라포름알데히드 (11.72 mg, 0.390 mmol) 및 아세트산의 용액에 소듐 트리아세톡시 보로히드라이드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 유지하였다. HPLC는 90% 전환율을 나타내었다. 반응 혼합물을 EtOAc (20 mL)에 녹이고, 포화 NaHCO3 용액 (10 mL)으로 세척하였다. R-HPLC에 의해 농축시키고 정제하여 생성물 23 (15 mg, 41% 수율)을 수득하였다. MS (m+1) = 189. 생성물 23을 상기에 기재된 바와 같이 하우저 고리형성에 적용시킨 후 TES 탈보호시켜 8-메틸아미노운시알라마이신 25를 수득하였다.
Figure pct00062
실시예 6 - 화합물 (IId)
도 6은 도면에서 30으로 표지된 화합물 (IId)의 합성에 대한 반응식을 나타낸다.
화합물 30. DCM (24 mL) 중 4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)벤조산 26 (플루카(Fluka), 1.885 g, 7.95 mmol) 및 EDC (1.676 g, 8.74 mmol)의 조합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, DMF (6.00 mL) 중 아미노시아노프탈리드 6 (0.346 g, 1.987 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 온도를 50℃로 상승시키고; 40시간 후에 DCM을 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 EtOAc에 녹였다. EtOAc를 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. DCM 중 15% MeOH 용리액을 사용하는 콤비플래쉬™ 유닛 상에서 농축시키고 정제하여 화합물 27을 황색 고체 (587 mg, 75% 수율)로서 수득하였다.
Figure pct00063
상기 물질 27 (567 mg, 1.441 mmol)을 DCM (2 mL) 중에 현탁시키고, TFA (2 mL, 26.0 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 50분 동안 교반한 후, LCMS 및 HPLC는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 고진공 하에 2시간 동안 농축 및 건조시켜 화합물 28을 수득하였고, 이를 상기에 기재된 바와 같이 하우저 고리형성에 적용시킨 후 Et3N·3HF로 TES 탈보호시켜 화합물 30 (18% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00064
실시예 7 - 접합을 위한 화합물 (IIb)의 적합화
도 7은 접합을 위해 화합물 (IIb)를 적합화시키는 반응식을 나타낸다.
화합물 32. DMSO 중 화합물 13a (1 당량) 및 31 (문헌 [Dubowchik et al. 2002]; 1.2 당량)을 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 3 당량)으로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 용리액으로서 CH3CN/물 중 0.1% TFA를 사용하는 R-HPLC에 의해 정제하여 화합물 32 (50% 수율)를 수득하였다.
Figure pct00065
화합물 34. 말레이미도부탄산 33 (TCI)의 N-히드록시숙신이미드 에스테르의 유사한 반응으로 화합물 34를 수득하였다.
Figure pct00066
실시예 8 - 접합을 위한 화합물 (IIf)의 적합화
도 8은 접합을 위해 화합물 (IIf)를 적합화시키는 반응식을 나타낸다.
화합물 38. DMF (2 mL) 중 화합물 17 (5 mg) 및 35 (바켐(Bachem), 10 mg, 22 μmol)의 용액에 DIPEA (16 μl)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반하였다. DCM 중 30% MeOH 용리액을 사용하는 콤비플래쉬™ 유닛으로 농축시키고 정제하여 화합물 36 (29% 수율)을 수득하였다. 화합물 36을 DMF (2 mL) 중 20% 피페리딘으로 처리하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후, LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 피페리딘을 회전 증발기 상에서 제거하였다. 반응 혼합물을 실리카 겔 상에 흡수시키고, DCM 중 30% 메탄올 용리액을 사용하는 콤비플래쉬™ 유닛으로 정제하여 생성물 37 (60% 수율)을 수득하였다. 생성물 37을 DMSO (1 mL) 중 DIPEA (16 μl) 중에서 N-히드록시숙신이미드 에스테르 33 (6 mg)과 실온에서 3시간 동안 커플링시켰다. R-HPLC에 의한 정제로 생성물 38 (1.56 mg)을 수득하였다.
Figure pct00067
화합물 39. DMF (0.5 mL) 중 화합물 17 (1.68 mg) 및 33 (2 mg, 22 μmol)의 용액에 DIPEA (5 μl)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. R-HPLC에 의해 정제하여 생성물 39 (0.776 mg)를 수득하였다.
Figure pct00068
실시예 9 - 접합을 위해 화합물 (IIc)의 적합화
도 9는 접합을 위해 화합물 (IIc)를 적합화시키는 반응식을 나타낸다.
화합물 40. DMSO (3 mL) 중 화합물 22 (4.89 mg, 8 μmol), 화합물 31 (5.68 mg, 8.00 μmol) 및 DIPEA (6.95 μl, 40.0 μmol)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. R-HPLC에 의해 정제하고 동결건조시켜 목적 화합물 40 4.6 mg (54% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00069
화합물 41. DMSO (3 mL) 중 화합물 22 (4.89 mg, 8 μmol)의 용액에 DIPEA (4.35 μl, 25.00 μmol) 및 화합물 33a (TCI, 2.466 mg, 8.00 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 30분 후, 추가 0.5 당량의 화합물 33a 및 DIPEA (5 당량)를 첨가하고, 교반을 30분 동안 계속하였다. HPLC 및 LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. R-HPLC에 의해 정제하고 동결건조시켜 화합물 41 2.35 mg (43% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00070
실시예 10 - 접합을 위한 화합물 (IId)의 적합화
도 10은 접합을 위해 화합물 (IId) (30으로 표지함)를 적합화시키는 반응식을 나타낸다.
화합물 43. DIPEA (0.012 mL, 68.3 μmol)를 DMF (1 mL) 중 화합물 30 (6.53 mg, 11.39 μmol), Fmoc-보호된 시트룰린 42 (켐-임펙스, 9.05 mg, 22.77 μmol), 및 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 8.66 mg, 22.77 μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 포화 NaHCO3 용액 및 염수로 후처리하였다. DCM 중 12% MeOH 용리액을 사용하는 12 g 실리카 칼럼 상에서 콤비플래쉬™ 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물 43 (29% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00071
화합물 44. DMF (0.8 mL) 중 화합물 43 (4 mg, 4.20 μmol)의 용액에 피페리딘 (200 μL, 2.020 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후, LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 피페리딘을 회전 증발에 의해 제거하였다. 반응 혼합물을 실리카 겔 상에 흡착시키고, 용리액으로서 25-65% MeOH/DCM 구배를 사용하는 콤비플래쉬™ 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 44 (80% 수율)를 수득하였다.
Figure pct00072
말레이미도 화합물 45. EDC (2 당량)를 실온에서 DCM (50 mL) 중 t-부탄올 (1 당량), t-부틸 발린 (1.05 당량) 및 말레이미드 (2.11 g, 1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 1시간 후, 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 이를 수성 시트르산, 수성 중탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 증발에 의해 건조시키고 농축시켜 용매를 제거하였다. 잔류물을 칼럼 (EtOAc/헥산 0-80% 구배)에 통과시켜 오일 3.02 g을 수득하였다. 상기 오일을 실온에서 DCM-TFA (3:2; 20 mL) 중에 용해시켰다. 4시간 후, 용액을 증발시키고, 고진공 하에 밤새 건조시켜 화합물 45를 백색 고체 (2.1 g, 68% 수율)로서 수득하였다.
Figure pct00073
화합물 46. DMF (1 mL) 중 말레이미도 화합물 45 (3.12 mg, 10.06 μmol) 및 화합물 44 (2.45 mg, 3.35 μmol)의 용액에 HATU (4.59 mg, 0.012 mmol)에 이어서 DIPEA (5.26 μl, 0.030 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. R-HPLC에 의해 정제하여 생성물 46 (0.455 mg, 13% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00074
실시예 11 - 항-메소텔린 항체와의 접합
본 실시예는 도 9에서의 화합물 (IVe) (41로 표지함) 및 (IVf) (도 9에서 40으로 표지함)의 항-메소텔린 항체와의 접합을 설명한다.
100 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 8.0 중 5.3 mg/mL 농도의 모노클로날 항-메소텔린 항체 6A4 (WO 2009/045957 A1 (Terrett et al.))를 2-이미노티올란의 10배 몰 과량으로 티올화시켰다. 교반을 계속하면서 티올화 반응을 실온에서 1시간 동안 진행되도록 하였다.
티올화 후, 항체 6A4를 PD10 칼럼 (세파덱스 G-25)을 통해 접합 완충제 (50 mM HEPES, 5 mM 글리신, pH 7.0)로 완충제-교환하였다. 티올화 항체의 농도를 280 nm에서 UV 분광법에 의해 결정하였다. 티올 농도를 디티오디피리딘 검정을 사용하여 측정하였다.
DMSO 중 화합물 (IVe) 또는 경우에 따라 (IVf)의 2 mM 원액을 항체 6A4 중 티올 기당 1.5배 몰 과량으로 첨가하였다. DMSO를 20%의 최종 농도가 되도록 첨가한 다음, 트윈-80™을 0.1%의 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 접합 단계 후, DMSO 중 100 mM N-에틸말레이미드 (NEM)를 항체 6A4 중 티올 기에 대해 10배 몰 과량으로 첨가하여 임의의 미반응 티올 기를 켄칭하였다. 교반을 계속하면서 켄칭 반응을 실온에서 1시간 동안 진행되도록 하였다.
접합된 항체 6A4를 0.2 μm 필터를 통해 여과한 다음, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피 정제에 적용시켰다. SP 세파로스 고성능 CEX 칼럼을 50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 1M NaCl, pH 7.0 완충제 5 칼럼 부피 (CV)로 재생시켰다. 재생 후, 칼럼을 평형 완충제 (50 mM HEPES, 5 mM 글리신, pH 7.0) 3 CV로 평형화시켰다. 화합물 (IVe) 또는 경우에 따라 (IVf)와의 항체 6A4 접합체를 칼럼 상에 로딩하고, 칼럼을 평형 완충제로 1회 세척하였다. 접합체를 50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 110 mM NaCl, pH 7.0으로 용리시켰다. 용출액을 분획으로 수집하였다. 이어서, 칼럼을 50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 1M NaCl, pH 7.0으로 재생시켜, 단백질 응집체 및 임의의 미반응 화합물 (IVe) 또는 (IVf)를 제거하였다.
단량체 항체 접합체를 함유하는 용출액 분획을 풀링하였다. 항체 접합체 농도 및 치환 비를 280 및 560 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
접합체의 정제된 CEX 용출액 풀을 10 MWCO 막을 사용한 투석에 의해 50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 100 mM NaCl, 0.01% 트윈 80™, pH 7.0으로 완충제 교환하였다. 투석 후, 항체 접합체 농도 및 치환 비를 280 및 560 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 수득한 접합체의 특성을 하기 표 1에 요약하였다:
Figure pct00075
실시예 12 - 항-CD70 항체와의 접합
본 실시예는 화합물 (IVe) 및 (Ivf)의 항-CD70 항체와의 접합을 설명한다.
20 mM 인산나트륨, 50 mM NaCl, 0.02% 트윈-80™, pH 7.5 중 5.5 mg/mL 농도의 모노클로날 항-CD70 항체 2H5 (US 2009/0028872 A1 (Terrett et al.))를 2-이미노티올란의 15배 몰 과량으로 티올화시켰다. 교반을 계속하면서 티올화 반응을 1시간 동안 실온에서 진행되도록 하였다.
티올화 후, 항체 2H5를 PD10 칼럼 (세파덱스 G-25)을 통해 접합 완충제 (50 mM HEPES, 5 mM 글리신, pH 7.0)로 완충제-교환하였다. 티올화 항체의 농도를 280 nm에서 UV 분광법에 의해 결정하였다. 티올 농도를 디티오디피리딘 검정을 사용하여 측정하였다.
DMSO 중 화합물 (IVe) 또는 경우에 따라 (IVf)의 2 mM 원액을 항체 2H5 중 티올 기당 1.5배 몰 과량으로 첨가하였다. DMSO를 20%의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 트윈-80™을 0.1%의 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 반응 매질을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 접합 단계 후, DMSO 중 100 mM NEM을 항체 6A4 중 티올 기에 대해 10배 몰 과량으로 첨가하여 임의의 미반응 티올 기를 켄칭하였다. 교반을 계속하면서 켄칭 반응을 실온에서 1시간 동안 진행되도록 하였다.
접합된 항체 2H5를 0.2 μm 필터를 통해 여과한 다음, CEX 크로마토그래피 정제에 적용하였다. SP 세파로스 고성능 CEX 칼럼을 50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 1M NaCl, pH 7.0 완충제 5 CV로 재생시켰다. 재생 후, 칼럼을 평형 완충제 (50 mM HEPES, 5 mM 글리신, pH 7.0) 3 CV로 평형화시켰다. 화합물 (IVe) 또는 경우에 따라 (IVf)와의 항체 2H5 접합체를 칼럼 상에 로딩하고, 칼럼을 평형 완충제로 1회 세척하였다. 접합체를 50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 110 mM NaCl, pH 7.0으로 용리시켰다. 용출액을 분획으로 수집하였다. 이어서, 칼럼을 50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 1M NaCl, pH 7.0으로 재생시켜 단백질 응집체 및 임의의 미반응 화합물 (IVe) 또는 (IVf)를 제거하였다.
분획을 함유하는 접합체를 이전 실시예에 기재된 바와 같이 풀링하고, 완충제 교환하고, 투석하였다. 수득한 접합체의 특성을 표 2에 요약하였다.
Figure pct00076
실시예 13 - 화합물의 생물학적 활성
본 발명의 화합물 또는 그의 접합체의 항증식 활성을 하기와 같이 검정하였다. 인간 종양 세포주를 미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오. 박스 1549 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 입수하여 ATCC로부터의 지침서에 따라 배양하였다. ATP 검정 또는 3H 티미딘 검정을 위해, 세포를 96-웰 플레이트에 3시간 동안 1.0x103 또는 1.0x104개 세포/웰로 각각 시딩하였다. 유리 (미접합) 화합물 또는 그의 접합체의 1:3 연속 희석물을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 24 내지 72시간 동안 인큐베이션되도록 하였다. 3H 티미딘 플레이트를 웰당 1.0 μCi의 3H-티미딘으로 총 인큐베이션 기간의 마지막 24시간 동안 펄싱하고, 수거하고, 탑 카운트 섬광 계수기(Top Count Scintillation Counter) (팩커드 인스트루먼츠(Packard Instruments), 코네티컷주 메리덴) 상에서 판독하였다. ATP 플레이트에서의 ATP 수준을 셀타이터-글로(CELLTITER-GLO)® 발광 세포 생존율 키트를 제조업체의 매뉴얼에 따라 사용하여 측정하고, 글로맥스(GLOMAX)® 20/20 발광측정기 상에서 판독하였다 (둘 다 프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨). 프리즘(PRISM)™ 소프트웨어, 버전 4.0 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 라호야)을 사용하여 EC50 값 - 작용제가 세포 증식을 50%만큼 억제하거나 또는 감소시키는 농도 - 을 결정하였다.
도 11a는 3개의 참조 화합물: 독소루비신 (아드리아마이신), 운시알라마이신 및 하기 구조를 갖는 DNA 알킬화제인 화합물 A에 대해 비교한, 72시간 인큐베이션 기간을 사용한 ATP 검정에 의해 측정된 바와 같은, HL-60 백혈병 세포에 대한 화합물 (IIa)의 항증식 활성의 플롯이다.
Figure pct00077
도 11a로부터 유도된 EC50 값을 표 3에 나타내었다. 화합물 (IIa)의 효력은 운시알라마이신 그 자체의 것보다 컸다.
Figure pct00078
도 11b는 또한 ATP 검정 및 72시간 인큐베이션 기간을 사용한 독소루비신-내성 난소암 세포주 (Adr)에 대한 항증식 활성의 유사한 플롯이다. 상응하는 EC50 값을 표 4에 나타내었다. 화합물 (IIa)의 효력 - 다시 운시알라마이신 그 자체의 것보다 훨씬 큼 - 은 내성 세포주에 직면하는 경우의 독소루비신 및 화합물 A의 효력 상실을 고려할 때 주목할 만하다.
Figure pct00079
표 5는 접합체에 사용된 다른 2개의 독소: 화합물 A 및 독소루비신과 비교한, 화합물 (IIa)에 대한 추가의 항증식 데이터를 나타낸다. 검정 방법은 ATP 방법이었다. 이에 대해 시험한 암 세포주는 A2780 (난소), A549 (폐), CCRF-CEM (급성 림프모구성 백혈병), COLO205 (결장), DU4475 (유방), H2087 (폐, 비-소세포), H661 (폐, 대세포), HCT116 (결장), LNCaP (전립선), LS174T (결장), MDA MB468 (유방), MDA MB231 (유방) 및 SET2 (백혈병)였다. 항증식 효과는 IC50, 즉 50% 억제 효과를 생성하는 독소의 농도로서 보고하였다.
Figure pct00080
도 12a는 786-O 신암 세포에 대한, 비교 화합물로서 독소루비신을 사용한 화합물 (IIa), (IIc), (IId) 및 (IIe)의 추가의 항증식 데이터를 나타낸다. 도 12a로부터 유도된 EC50 값을 표 6에 제공하였다. ATP 검정을 72시간 인큐베이션 기간으로 사용하였다.
Figure pct00081
도 12b는 유사한 항증식 플롯이지만, H226 폐암 세포에 대한 것이다. 유도된 EC50 값을 표 7에 제공하였다. ATP 검정을 72시간 인큐베이션 기간으로 사용하였다.
Figure pct00082
실시예 14 - 접합체의 생물학적 활성
상기에 기재된 동일한 검정 방법을 사용하여, 본 발명의 화합물로부터 제조된 접합체의 항증식 활성을 측정하였다.
도 13a는 본 발명의 화합물로부터 제조된 4개의 접합체: (a) 화합물 (IVf)와 항체 2H5 (항-CD70, US 2009/0028872 A1 (Terrett et al.))의 접합체, (b) 화합물 (IVf)와 항체 6A4 (항-메소텔린, WO 2009/045957 A1 (Terrett et al.))의 접합체, (c) 화합물 (IVe)와 항체 2H5의 접합체, 및 (d) 화합물 (IVe)와 항체 6A4의 접합체의 3H 티미딘 혼입 검정 (72시간 인큐베이션)을 사용한 786-O 세포에 대한 항증식 활성을 나타낸다. 도 13a에서 (및 후속 도 13b 및 13c에서도), "독소 농도"에 대한 X-축 값은 치환 비 (SR)에 대해 조정되는데 - 즉, 값은 접합체의 몰 농도 × SR이다. 도 13a에서의 플롯으로부터 유도된 EC50 값을 표 8에 제공하였다.
Figure pct00083
도 13b는 다시 3H 티미딘 혼입 검정 및 72시간 인큐베이션 기간을 사용한 H226 세포에 대한 동일한 4개의 접합체의 항증식 활성을 나타낸다. 유도된 EC50 값을 표 9에 나타내었다.
Figure pct00084
도 13c는 H226 세포에 대한 접합체 2H5-(IVf) 및 6A4-(IVf)의 항증식 활성의 또 다른 플롯이지만, 72시간 인큐베이션 기간으로 ATP 검정을 사용하여 측정한 것이다. 유도된 EC50 값은 각각 6.630 및 0.1548 nM이었다.
본 발명의 상기 상세한 설명은 본 발명의 특정한 부분 또는 측면과 주로 또는 배타적으로 관련된 구절을 포함한다. 이는 명료성 및 편의성을 위한 것이고, 특정한 특징은 개시된 구절 이상으로 관련될 수 있으며, 본원의 개시내용은 상이한 구절에서 발견된 적절한 모든 정보의 조합을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 유사하게, 본원의 각종 도면 및 설명은 본 발명의 구체적 실시양태와 관련되어 있지만, 구체적인 특징이 특정한 도면 또는 실시양태의 맥락에서 개시되는 경우에, 이러한 특징은 또한 적절한 정도로, 또 다른 도면 또는 실시양태의 맥락에서, 또 다른 특징과 조합하여, 또는 일반적으로 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
또한, 본 발명은 특히 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되어 있지만, 본 발명은 이러한 바람직한 실시양태로 제한되지는 않는다. 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된다.
참고문헌
본 명세서에서 이전에 제1 저자 (또는 발명자)에 의해 요약된 방식으로 언급된 하기 참고문헌에 대한 전체 인용 및 연도를 하기에 제공한다. 이들 참고문헌 각각은 모든 목적에 대해 본원에 참고로 포함된다.
Figure pct00085

Claims (15)

  1. 하기 화학식 I에 의해 나타낸 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 I>
    Figure pct00086

    상기 식에서,
    R0은 NHR1a, NHC(=O)OR1b, NHC(=O)NHR1b, OC(=O)NHR1b, (CH2)1-4NHR1a, F, Cl, Br, OR1a 또는 SR1b이고;
    R1a는 H, C1-C6 알킬, (CH2)nNH2, C(=O)(CH2)nNH2, C(=O)CHR8NH2 또는 C(=O)R9NH2이고;
    R1b는 H, C1-C6 알킬, (CH2)nNH2,
    Figure pct00087

    이고;
    R2는 H, R10, C(=O)R10 또는 C(=O)OR10이고;
    R3은 H이거나, 또는 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
    R4는 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R5는 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R6은 H이거나, 또는 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 R5 및 R6은 결합되어 =O를 형성하고;
    R7은 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R8은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 측쇄 잔기이고;
    R9는 비치환 또는 치환된 아릴렌, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴렌, 비치환 또는 치환된 알킬아릴렌, 비치환 또는 치환된 시클로알킬렌, 또는 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬렌이고;
    각각의 R10은 독립적으로 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬, 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 아릴알킬, 비치환 또는 치환된 아릴; 또는 비치환 또는 치환된 헤테로아릴이고;
    n은 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ia에 의해 나타낸 구조를 갖는 화합물.
    <화학식 Ia>
    Figure pct00088
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ib에 의해 나타낸 구조를 갖는 화합물.
    <화학식 Ib>
    Figure pct00089
  4. 제3항에 있어서, R1a가 H, Me,
    Figure pct00090

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  5. 표적 세포 상의 화학 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티에 공유적으로 연결된 제1항에 따른 화합물을 포함하는 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 표적화 모이어티가 항체 또는 그의 항원 결합 부분이고, 표적 세포가 종양 세포이고, 화학 물질이 종양 연관 항원인 접합체.
  7. 제5항에 있어서, 하기 화학식 III에 의해 나타낸 구조를 갖는 접합체.
    <화학식 III>
    Figure pct00091

    상기 식에서,
    Z는 표적화 모이어티이고;
    XD는 제1 스페이서 모이어티이고;
    XZ는 제2 스페이서 모이어티이고;
    C는 절단가능한 기이고;
    아래첨자 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고;
    아래첨자 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
    D는
    Figure pct00092

    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기서,
    R2는 H, R10, C(=O)R10 또는 C(=O)OR10이고;
    R3은 H이거나, 또는 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
    R4는 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R5는 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R6은 H이거나, 또는 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 R5 및 R6은 결합되어 =O를 형성하고;
    R7은 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R8은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 측쇄 잔기이고;
    R9는 비치환 또는 치환된 아릴렌, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴렌, 비치환 또는 치환된 알킬아릴렌, 비치환 또는 치환된 시클로알킬렌, 또는 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬렌이고;
    각각의 R10은 독립적으로 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬, 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 아릴알킬, 비치환 또는 치환된 아릴; 또는 비치환 또는 치환된 헤테로아릴이고;
    R12는 C1-C6 알킬이고;
    n은 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
  8. 하기 화학식 IV에 따른 구조를 갖는 조성물.
    <화학식 IV>
    Figure pct00093

    상기 식에서,
    R31은 반응성 관능기이고;
    XD는 제1 스페이서 모이어티이고;
    XZ는 제2 스페이서 모이어티이고;
    C는 절단가능한 기이고;
    아래첨자 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고;
    아래첨자 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
    D는
    Figure pct00094

    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기서,
    R2는 H, R10, C(=O)R10 또는 C(=O)OR10이고;
    R3은 H이거나, 또는 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
    R4는 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R5는 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R6은 H이거나, 또는 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬이거나; 또는 R5 및 R6은 결합되어 =O를 형성하고;
    R7은 OH, SH, NH2, OR10, SR10, NHR10, N(R10)2, NHC(=O)OR10, OC(=O)NHR1b, OC(=O)R10, SC(=O)R10 또는 NHC(=O)R10이고;
    R8은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 α-아미노산의 측쇄 잔기이고;
    R9는 비치환 또는 치환된 아릴렌, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴렌, 비치환 또는 치환된 알킬아릴렌, 비치환 또는 치환된 시클로알킬렌, 또는 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬렌이고;
    각각의 R10은 독립적으로 비치환 또는 치환된 C1-C6 알킬, 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 아릴알킬, 비치환 또는 치환된 아릴; 또는 비치환 또는 치환된 헤테로아릴이고;
    R12는 C1-C6 알킬이고;
    n은 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
  9. 제8항에 있어서, R31이 -NH2, -OH, -CO2H, -SH, 말레이미도, 시클로옥틴, 아지도, 히드록실아미노 또는 N-히드록시숙신이미도인 조성물.
  10. 치료 유효량의 제1항에 따른 화합물 또는 그의 표적화 모이어티와의 접합체를 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 화합물이 항체인 표적화 모이어티에 접합되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 항체가 암에 의해 과다발현되거나 또는 특유하게 발현되는 항원에 결합하는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 암이 백혈병, 신암, 난소암, 폐암, 결장암, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항에 따른 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 화합물이 표적화 모이어티에 접합되는 것인 제약 조성물.
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