CN117794581A - 包含磷酸抗原的缀合物及其在治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含与磷酸抗原部分连接的靶向部分的新的缀合物，及其在治疗疾病例如癌症、感染性疾病和自身免疫病中的用途，所述缀合物任选地与另外的治疗剂组合。靶向部分可以是抗体或其结合片段。磷酸抗原可以是前药。本发明还涉及用于制备缀合物的包含磷酸抗原部分的接头‑药物化合物，以及包含所述免疫缀合物的药物组合物。

Description

包含磷酸抗原的缀合物及其在治疗中的用途
技术领域
本发明涉及包含与磷酸抗原(phosphoantigen)部分连接的靶向部分(例如抗体或其结合片段)的新的缀合物，及其在治疗疾病例如癌症、感染性疾病和自身免疫病中的用途，所述缀合物任选地与另外的治疗剂组合。本发明还涉及用于制备缀合物的包含磷酸抗原部分的接头-药物化合物，以及包含所述免疫缀合物的药物组合物。
背景技术
治疗癌症的常规方法涉及手术、放射治疗和使用细胞毒性剂的化学治疗，或这些治疗的组合。由于它们的毒性和非特异性性质，用细胞毒性剂或辐射进行治疗通常导致严重的副作用。自从发现免疫系统在根除赘生性细胞方面发挥重要作用以来，更多的最新癌症治疗旨在使用免疫系统的组分作为治疗癌症的工具。
癌症免疫治疗中使用的一种方法是靶向“免疫检查点”，例如T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，目的是激活患有癌症的患者中的抗肿瘤免疫应答。CTLA-4和PD-1二者是参与负反馈系统的蛋白质，其功能是抑制免疫细胞活化。肿瘤细胞可通过在其表面上过表达免疫检查点配体进而通过“滥用”这种抑制机制而从免疫系统逃逸，以保护自己免受免疫系统细胞的攻击。免疫检查点通过与其配体相互作用使其活化，导致T细胞失活和耗竭。免疫检查点抑制剂，例如针对免疫检查点或其配体的抗体，是新的阻断癌细胞上过表达的免疫检查点的抗癌药物类别。经批准的免疫检查点抑制剂的一些实例是伊匹单抗(ipilimumab)(阻断CTLA-4，商标名由BMS生产)，其在2011年被批准用于治疗黑素瘤；PD-1抗体纳武单抗(nivolumab)(以商标名销售，并由BMS开发)；和派姆单抗(pembrolizumab)(商标名另一种PD-1抑制剂，由Merck生产)。虽然检查点抑制剂可重新激活(reinvigorate)抗肿瘤应答，但活化的免疫细胞也可攻击正常组织，导致免疫学上的不良副作用。
癌症治疗的另一种方法涉及使用抗体-药物缀合物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)。ADC结合了针对肿瘤特异性抗原的单克隆抗体的特异性和化学细胞毒性剂的细胞杀伤活性。ADC的抗体充当靶向剂和细胞毒性有效载荷的载体。抗体与其靶标的结合实现了ADC与其细胞毒性有效载荷向目标肿瘤细胞中的有效摄取。细胞毒性有效载荷可以是细胞毒性剂的非活性前体(前药)，其通过在循环中稳定的接头被接枝到抗体上，并在内化到肿瘤细胞中之后被切割，例如通过胞内蛋白酶。接头的切割可触发肿瘤细胞中有效载荷的活性、细胞毒性形式的释放。ADC具有可使对健康组织的毒性、非特异性副作用显著降低的优势。已被临床批准的ADC包括吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(抗CD33)(Wyeth Pharmaceuticals,Pfizer的子公司)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)(抗CD30)(Seattle Genetics/Millennium Pharmaceuticals)、(阿多-)曲妥珠单抗依酯((ado-)trastuzumab emtansine)(抗HER2)(Genentech/Roche)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)(抗CD22)(WyethPharmaceuticals,Pfizer的子公司)、恩诺单抗(enfortumab vedotin)(抗连接蛋白-4)(PadcevTM；Astellas Pharma/Seattle Genetics)、fam-德喜曲妥珠单抗(fam-trastuzumabderuxtecan)(Daiichi Sankyo/AstraZeneca)、维汀-波妥珠单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79b)(PolivyTM；Genentech/Roche)和戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)(抗TROP-2)(TrodelvyTM；Immunomedics)。更多的正在临床开发中。
癌症治疗的另一种方法是使用治疗性化合物的免疫治疗，所述治疗性化合物激活免疫系统，特别是T细胞以攻击并破坏肿瘤细胞。这样的治疗性化合物可以是免疫细胞受体的激动剂，并且可以是大分子或相对较小的化学结构。这样的化合物的一个实例是活化Toll样受体(Toll Like Receptor，TLR)的配体。已批准数种TLR配体用于癌症治疗。第一个经批准的TLR配体(TLR激动剂)形成被称作卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的减毒菌株的一部分。作为最初开发的结核病疫苗，BCG包含活性TLR2/4配体并且已经被用作膀胱癌的治疗剂。另一些经批准的TLR配体是TLR4配体单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A，MPLA)和小分子TLR7激动剂咪喹莫特(一种咪唑并喹啉)。
TLR配体也已被用于免疫缀合物。这样的免疫缀合物包含对作为TLR配体的靶向载剂具有特异性的肿瘤抗原的抗体，目的是在肿瘤微环境中诱导免疫系统的细胞的局部活化。WO2017/072662(Novartis A.G.)中描述了其中TLR激动剂与抗HER抗体偶联的用于治疗乳腺癌的免疫缀合物。Silverback Therapeutics开发了另一种具有TLR8激动剂有效载荷的抗HER缀合物(ImmunoTACTMSBT6050)。Bolt Therapeutics(WO2020/047187)与Ackermanet al.,2021,Nature Cancer,Vol.2(8),18-33也描述了TLR免疫缀合物，其包含通过不可切割接头与TLR 7/8激动剂(T785)缀合的肿瘤靶向单克隆抗体。与肿瘤抗原结合的肿瘤靶向抗体通过Fc效应物功能活化存在于肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中的抗原呈递细胞，而与之结合的TLR激动剂则通过其TLR受体直接刺激APC，进而促进抗肿瘤免疫。
已知对癌细胞表现出细胞毒性的特定T细胞亚群是γδ(gammadelta)T细胞(具有由γ链和δ链构成的T细胞受体(T-cells receptor，TCR)的T细胞)。γδT细胞由于其能够对感染和肿瘤细胞实现快速的固有性免疫应答而被认为是T淋巴细胞的独特亚群。在许多不同的恶性病中发现了肿瘤浸润γδT细胞(γδT细胞)(Gentles et al.,Nature Medicine,2015,21(8),938-945)。γδT细胞，或者更具体地，形成γδT细胞的主要亚群的Vγ9Vδ2T细胞(Vγ9Vδ2T细胞)可被称为“磷酸抗原”的特定抗原组活化。天然存在的磷酸抗原是低分子烷基焦磷酸盐/酯，例如4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基-焦磷酸酯(HMBPP)和异戊烯基焦磷酸酯(isopentenyl pyrophosphate，IPP)。这些天然磷酸抗原由致病性细胞产生，其中HMBPP是IPP的直接前体(HMBPP是不存在于人中的致病性磷酸抗原)。细菌和寄生虫可使用甲羟戊酸非依赖性途径(mevalonate pathway，MEP)途径或2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(MEP/DOXP)途径产生类异戊二烯前体，导致类异戊二烯前体IPP的生物合成。在人中，pAg产生是由甲羟戊酸途径驱动的。
与TLR激动剂相反，磷酸抗原不直接作用于在髓样细胞或T细胞上展示的受体。认为磷酸抗原与细胞表面分子嗜乳脂蛋白3A1(BTN3A1)的胞内结构域的胞内(例如癌细胞内)结合，导致了与BTN3A1复合物的胞外部分相关的构象变化，其也包括对BTN2A1的作用(Sandstrom A,et al.,2014,Immunity,40(4),490-500,doi:10.1016/j.immuni.2014.03.003)。
胞外BTN3A1/BTN2A1复合物的构象变化导致与γδTCR结合，这进而导致细胞因子产生并且由活化的γδT细胞杀伤肿瘤/致病性细胞(Rigau et al.,Science,2020,367,642)。因此，使用磷酸抗原作为治疗剂活化γδT细胞是间接的，磷酸抗原从细胞(例如肿瘤细胞或被感染的细胞)内起作用，以实现所述细胞的表面上的胞外BTN3A1/BTN2A1复合物的构象变化，进而向γδT细胞上的γδTCR提供活化信号。γδT细胞将进而对肿瘤细胞或被感染的细胞发挥其细胞杀伤作用。
因为焦磷酸盐/酯HMBPP的药代动力学性质差(其在血浆中快速水解)，所以已经开发了(含氮的)二膦酸盐/酯类似物，以及(单磷酸盐/酯)前药形式，其在施用于对象之后转化为活性磷酸抗原。在磷酸抗原-前药中，用中性基团保护膦酸盐/酯基团的带负电荷的非结合氧原子，以提高例如在细胞膜上的扩散。一旦进入细胞，保护基团就被去除以释放活性磷酸抗原。WO2012/042024中描述了另一种提高磷酸抗原(特别是二膦酸盐/酯磷酸抗原)的循环半衰期的方法。将磷酸抗原与无机和脂质纳米载体复合成纳米粒，充当磷酸抗原的递送载剂。认为所得纳米粒可在其表面上涂覆有靶向配体，以靶向特定细胞。提到的实例包括诱导靶向至癌细胞的分子，例如抗体。举例说明了人转铁蛋白的使用。
已经针对在癌症治疗中使用对磷酸抗原进行了测试，目的是在体内或通过体外扩增γδT细胞与抗原呈递细胞以促进γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用，以用于施用于对象。合成的磷酸抗原，例如BrHPP(Phosphostim，由Innate Pharma制造)和唑来膦酸盐/酯(Novartis)已经成为患有癌症的患者的临床测试对象。作为临床测试对象的磷酸抗原显示出可接受的安全性特性。然而，其效力通常不足(Sebestyen et al.,Nature Reviews DrugDiscovery,2020,19(3),169-184)。
发现通过更稳健的、更具选择性以及更有效的方式将磷酸抗原递送至(过)表达嗜乳脂蛋白(BTN3A1/BTN2A1)复合物的细胞(例如肿瘤或致病性细胞)，可极大地改善这样的治疗的可接受治疗窗。
发明内容
本发明提供了使用磷酸抗原治疗例如癌症的更有效且更具选择性的方法。本发明涉及缀合物，其包含与免疫调节部分共价连接的靶向部分，其中所述免疫调节部分是磷酸抗原部分(pAg)。优选地，所述靶向部分是肿瘤靶向抗体或其抗原结合片段。这样的缀合物可用于例如在疾病例如癌症、感染或自身免疫病的治疗中活化γδT细胞。根据本发明的缀合物可以单独使用，或者与另外的治疗剂组合使用。
优选地，根据本发明的缀合物是包含肿瘤靶向抗体或其抗原结合片段作为靶向部分的免疫缀合物。包含肿瘤靶向抗体作为靶向部分的根据本发明的这样的缀合物可用于将磷酸抗原特异性地递送至局部肿瘤细胞，在此所述缀合物可在抗体或其抗原结合片段与其肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)结合之后被内化至肿瘤细胞中。本发明也提供了用于制备根据本发明的缀合物的接头-药物化合物，其中“药物”是磷酸抗原部分。本发明还提供了包含根据本发明的缀合物以及一种或更多种药用赋形剂的药物组合物。根据本发明的缀合物可被用作药物，例如用于治疗癌症。
附图说明
图1：区分指定的多种免疫细胞群的FCC/设门策略。首先，应用时间门(time gate)以确保恒定的流量(A)。随后，在FSC-A vs.FSC-H(B)和SSC-A vs.SSC-H图(C)上排除淋巴细胞双联体(lymphocyte doublet)。然后选择有生存力的细胞(D)，随后选择淋巴细胞(E)。然后将CD3阴性、CD56阳性细胞鉴定为NK细胞(F)。CD3阳性细胞进一步分为Vd2和Vd1阳性细胞(G)。还将CD3阳性Vd2阴性Vd1阴性淋巴细胞细分为CD8阳性细胞毒性T细胞(H)。
图2：Vδ2γδT细胞的CD107a(图2A)或IFNγ(图2C)产生。活化水平由作为IFNγ+或CD107a+的Vδ2γδT细胞的比例表示。使用N＝4个健康供体(其全部针对Vδ2γδT细胞群进行描述)进行测量。(图2和图4中的一些图将“IFNγ”表示为“IFNy”)。对于一个代表性供体，在NK细胞、Vδ2γδT细胞或CD8+T细胞上显示出CD107a+产生(图2B)和IFNγ产生(图2D)，所述NK细胞、Vδ2γδT细胞或CD8+T细胞从与经一定浓度范围的前药/HMBPP(M)预处理的Raji细胞共培养的总PBMC设门。
图3：PHA活化的Vδ2γδT细胞(A、I)、NK细胞(B、J)、Vδ1γδT细胞(C、K)和CD8+T细胞(D、L)或未刺激的Vδ2γδT细胞(E、M)、NK细胞(F、N)、Vδ1γδT细胞(G、O)和CD8+T细胞(H、P)的CD107a或IFNγ产生。FACS图示出了代表性健康供体的CD107a(A至H)或IFNγ(I至P)图谱。
图4：在将PBMC与经一定浓度范围的ADC或利妥昔单抗预处理的Raji细胞共培养之后，设门的Vδ2γδT细胞(A、E)、NK细胞(B，F)、Vδ1γδT细胞(C、G)和CD8+T细胞(D、H)的CD107a(A至D)和IFNγ(E至H)产生。活化水平由作为IFNγ+或CD107a+的免疫细胞亚群的比例来表示。使用N＝3(ADC-XD13-r、ADC-XD13-i)或N＝4(ADC-XC4-r、ADC-XC4-i、ADC-XD4-r、ADC-XD4-i、利妥昔单抗)个不同的健康供体进行测量。示出了一个代表性供体的结果。
图5：在与经ADC或利妥昔单抗处理的Raji细胞共培养之后，Vδ2γδT细胞的CD107a(A、C、E)或IFNγ(B、D、F)产生的EC50值(A至B)、Vδ2γδT细胞阳性的最大比例(C至D)和中值荧光强度(median fluorescent intensity，MFI，E至F)。MFI是在CD107a+或IFNγ+Vδ2γδT细胞上确定的。使用N＝3(ADC-XD13-r)或N＝4(ADC-XC4-r、ADC-XD4-r、利妥昔单抗)个不同的健康供体进行测量并且每个符号表示一个单独的供体。
图6：与用ADC-XC4-r(A)、ADC-XD4-r(B)、ADC-XD13-r(C)、利妥昔单抗(D)预处理的Raji细胞共培养的电子设门的Vδ2γδT细胞的代表性IFNγ/CD107a图谱。
图7：在孵育6天之后，测量的利妥昔单抗、唑来膦酸、HMBPP、pAg缀合物或作为阳性对照的倍癌霉素对Raji细胞存活的直接作用。倍癌霉素被用作阳性对照。(A)将Raji细胞用一定浓度范围的指定化合物孵育，并确定细胞死亡。对照和游离药物在一幅图中示出，并且为了可读性，将不同的pAg缀合物分为三幅图。(B)在最高的pAg缀合物或利妥昔单抗浓度(10μg/mL)下的细胞存活(％)的概览。
图8：在将PBMC与经一定浓度范围的pAg缀合物或利妥昔单抗预处理的Raji细胞共培养之后，设门的Vδ2γδT细胞的CD107a产生。活化水平由作为CD107a+的免疫细胞亚群的比例表示。使用不同的健康供体进行测量。每幅图表示不同的实验并且每个字母表示所使用的供体。当在两个不同的实验中测试相同的供体时，其用“-1”或“-2”表示。
图9：在将PBMC与经一定浓度范围的pAg缀合物或利妥昔单抗预处理的Raji细胞共培养之后，设门的δ2γδT细胞的CD107a(A、D、G)、IFNγ(B、E、H)和TNFα(C、F、I)产生。箱线图示出了EC50值(A、B、C)、活化的细胞％(D、E、F)或中值荧光强度(MFI，G、H、I)。箱线图(D至I)中描绘的点表示平均值。该数据是表5至10的图示。值得注意的是，并未在每个实验中评估TNFα产生。
图10：与pAg缀合物预处理的Raji细胞共培养的γδT细胞的CD107a与IFNγ产生之间的相关性(EC50值、活性％和MFI)。在具有不同供体的不同实验中测试pAg缀合物的活性，并计算每种pAg缀合物的几何平均EC50值(A)，或平均活性％(B)和平均“中值荧光强度”(MFI，C)。绘制了CD107a与IFNγEC50、活性％以及MFI之间的相关性。虚线表示利妥昔单抗。
图11：在与用ADC-XD65-r、ADC8-XD65-r或利妥昔单抗预处理的Raji细胞共培养之后，阳性Vδ2γδT细胞的CD107a(A、D)、IFNγ(B、E)和TNFα(C、F)、EC50值(A至C)以及最大比例(D至F)。使用N＝2个不同的指定健康供体进行测量。
图12：Vδ2γδT细胞对经pAg缀合物预处理的Raji细胞的杀伤。将Raji细胞不用化合物(效应物+靶标；E+T；灰色方块)、用HMBPP(“+”符号)或一定浓度范围的ADC-XD18-r(黑色实心圆圈)、ADC-XD18-i(黑色空心圆圈，虚线)或利妥昔单抗(灰色菱形)预处理16小时，并随后与扩增的Vδ2γδT细胞共培养1小时。然后使用流式细胞术评估对Raji细胞的杀伤。(A)来自指定供体的扩增的Vδ2γδT细胞对Raji细胞的剂量依赖性杀伤。(B)利妥昔单抗效力与扩增的Vδ2γδT细胞上的CD16表达之间的相关性。(C、D)汇总图示出了所有受试供体的死亡Raji细胞％的EC50值(C)；和所有受试供体的效力％(D)。
图13：用ADC-XD18-i、ADC-XD18-r、利妥昔单抗和HMBPP预处理多种CD20阳性细胞系之后的Vδ2γδT细胞的活性。(A)在与经HMBPP预处理的细胞系共培养之后的CD107a阳性Vδ2γδT细胞的比例。(B至F)在与经一定浓度范围的ADC-XD18-i、ADC-XD18-r或利妥昔单抗预处理的细胞系共培养之后的CD107a阳性Vδ2γδT细胞的比例。所有实验都是用图中所示的N＝2个不同的健康供体进行的。
图14：在与用一定浓度范围的ADC-XD18-t、ADC-XD18-i或曲妥珠单抗预处理的BT-474(A、E、I)、SK-BR-3(B、F、J)、SK-OV-3(C、G、K)或HCT-116细胞(D、H、L)共培养之后，产生CD107a(A至D)、IFNγ(E至H)或TNFα(I至L)的Vδ2γδT细胞的比例。示出了来自N＝2(BT-474、SK-OV-3和HCT-116)和N＝4(SK-BR-3)的一个代表性供体的结果。
图15：在与经pAg缀合物或曲妥珠单抗处理的细胞系共培养6小时之后，Vδ2γδT细胞的CD107a(A、D)、IFNγ(B、E)或TNFα(C、F)产生的EC50值(A至C)和效力％(D至F)。每个符号表示一个健康供体，并示出了几何平均值(A至C)或平均值(D至F)。
图16：在与经HMBPP预处理的细胞系共培养6小时之后，CD107a-(A)、IFNγ-(B)或TNFα阳性(C)Vδ2γδT细胞的比例。每个符号表示一个单独的健康供体，并示出了平均值。
图17：在与用一定浓度范围的ADC-XD18-t、ADC-XD18-i或曲妥珠单抗预处理的BT-474、SK-BR-3、SK-OV-3或HCT-116细胞共培养之后，产生CD107a的NK细胞的比例。示出了来自N＝2(BT-474、SK-OV-3和HCT-116)和N＝4(SK-BR-3)的一个代表性供体的结果。
图18：在将PBMC与经一定浓度范围的pAg缀合物或对照化合物预处理的Raji或MOLM-13细胞共培养之后，设门的Vδ2γδT细胞的CD107a产生。(A)在与经HMBPP预处理的Raji或MOLM-13细胞共培养之后，Vδ2γδT细胞的活性(CD107a)％。(B至E)在与经预处理的Raji(顶部)或MOLM-13细胞(底部)共培养之后，来自不同健康供体的PBMC中的Vδ2γδT细胞的活化水平。每幅图代表不同的实验并且每个字母表示所使用的供体。(F至H)汇总图示出了所有受试供体的EC50值(F)、效力％(G)和中值荧光强度(MFI，H)。
具体实施方式
本发明提供了缀合物，其包含与免疫调节部分共价连接的靶向部分，其中所述免疫调节部分是磷酸抗原(pAg)部分。
缀合物
本发明提供了缀合物，其包含与免疫调节部分共价连接的靶向部分，其中免疫调节部分是磷酸抗原(pAg)部分。
根据本发明的缀合物包含与靶细胞特异性地结合的靶向部分。优选地，所述靶向部分是肿瘤靶向抗体或其抗原结合片段。所述靶向部分充当递送载剂，其将与所述靶向部分共价连接的pAg部分递送至靶细胞。所述pAg部分可与例如(多肽)靶向部分中的氨基酸侧链直接偶联。但是优选地，pAg通过连接部分与靶向部分缀合。
优选的根据本发明的缀合物可由通式I表示：
Tm-(L-(pAg)x)y (I),其中Tm表示靶向部分，优选抗体或其抗原结合片段，L表示连接部分，pAg表示磷酸抗原部分，x表示每个连接部分的磷酸抗原部分的数目，并且值为1至5，并且y表示每个Tm(每个靶向部分的接头部分)的L-(pAg)x的平均数，并且其为1至10的整数，优选1至8。式I中每个缀合物的pAg部分的数目(pAg与Tm比率)是x乘以y。pAg与Tm比率平均值可为1至16，或甚至20，或更高。每个靶向部分的pAg单元的比率可例如基于磷酸抗原部分或靶向部分的结构或功能特征而改变。在实践中，每个靶向部分的pAg数目为2至8或2至6，或者甚至低至2就可提供足够的治疗作用。优选地，连接部分携带1或2个pAg部分。在大多数情况下，每个连接部分可能携带1个pAg就足够了。优选地，目标pAg与Tm比率为2(x为1并且y为2)。
接头部分优选地是可切割接头部分。在根据本发明的缀合物中，可使用直的或支化的接头部分。当多个磷酸抗原部分与一个靶向部分连接时，每个磷酸抗原部分可通过单独的连接部分与靶向部分共价偶联。在实践中，当靶向部分是抗体并且与还原的链间二硫键发生偶联时，一个靶向部分可连接多达8个单独的连接部分，导致当每个磷酸抗原部分由其自身连接部分携带时，每个靶向部分8个磷酸抗原部分。在替代方案中，支化接头部分可携带1至5个磷酸抗原部分/连接部分(x是1、2、3、4或5)。特别是当期望更高的pAg与Tm比率时，或者当靶向部分上仅有有限数目的结合位置可用时，优选支化接头。例如，可使用携带2个pAg(x为2)的支化接头以将每个靶向部分的磷酸抗原部分的数目提高至更高的值。通过使用这样的连接部分，例如仅使用8个连接部分就可以使16个磷酸抗原部分与靶向部分结合。抗体可被修饰以引入除抗体氨基酸序列中的半胱氨酸数目之外的另外的半胱氨酸，所述另外的半胱氨酸形成二硫键并且可被还原并与接头-药物分子缀合。例如，如WO2015177360中所公开的，可在例如第41C位的位置处引入另外的半胱氨酸。对于包含多达10个可用于与可被结合的连接部分缀合的半胱氨酸的抗体，当使用携带每个接头两个pAg部分(x为2)的支化接头时，DAR甚至可以达到20(x为2，y为10)或更高。在最佳条件下，靶向部分中的所有结合位点将被连接部分占据。在实践中，可以产生缀合物混合物，其中每个靶标部分的磷酸抗原部分的确切数目可根据反应条件有一定程度的变化，并且y值是平均数。
根据本发明的包含磷酸抗原部分的缀合物可与可同时或顺序施用于有此需要的对象的另一些药物活性化合物组合使用。另外，靶向部分可携带磷酸抗原和不同有效载荷的组合。这样的“多有效载荷”方法的优点是两种活性物质将被同一靶向部分靶向。当然，有效载荷之间的比率必须根据(缀合)反应条件和结合位点来适当地设定。例如，每种有效载荷的单独的接头-药物化合物可与靶向部分上的不同结合位点(例如不同类型的氨基酸)缀合，和/或通过不同的缀合方法和/或不同的接头化学物质来缀合，以控制两种有效载荷的结合、分布和药物与抗体比率(drug to antibody ratio，DAR)。携带多种细胞毒性有效载荷的抗体药物缀合物(antibody drug conjugate，ADC)是本领域已知的。根据本发明的缀合物可将磷酸抗原部分例如与细胞毒性有效载荷或者与设计成增强整体期望治疗作用的另一种免疫调节有效载荷组合。因此，减少了磷酸抗原在非靶标部位与非靶标组织的任何非特异性结合和/或对非靶标组织的作用。
如本领域公知的，ADC中的药物负荷分布可例如通过使用疏水相互作用色谱(hydrophobic interaction chromatography，HIC)或反相高效液相色谱(reversed phasehigh-performance liquid chromatography，RP-HPLC)来确定。HIC特别适用于确定平均DAR(根据本发明的缀合物中的pAg与Tm比率)。
靶向部分
靶向部分特异性地或优选地与靶细胞结合，并且可以是靶向抗体或其抗原结合片段，或者可以是另一种靶向部分例如如核酸(适配体)或(多)肽，其可以是酶抑制剂、酶底物、受体配体和/或融合蛋白。也可使用小分子抑制剂作为靶向部分(产生小分子药物缀合物(small moleculedrug conjugate，SMDC))。靶向部分对其靶标的结合特异性(和亲和力)决定了根据本发明的缀合物将在体内何处发挥其治疗作用。
因此，通过选择合适的靶向部分，确保了将磷酸抗原部分递送至必须发挥其治疗作用的部位。
优选地，根据本发明的缀合物中的靶向部分是抗体或其抗原结合片段。在靶向部分是抗体或其抗原结合片段的情况下，缀合物通常被称为免疫缀合物或抗体药物缀合物(ADC)。靶向抗体是以高特异性识别由靶细胞表达的抗原(例如肿瘤相关抗原)的抗体。抗体或片段对其抗原的特异性允许效应分子(或“有效载荷”)特异性地递送至靶细胞，使健康组织在很大程度上不受影响。效应分子通过接头与抗体共价偶联，所述接头确保效应分子保持与抗体连接，至少直至抗体到达靶细胞，例如癌细胞。当抗体与其靶标结合时，效应分子在靶细胞上或靶细胞中(当缀合物被内化时)发挥其作用。效应分子可以是细胞毒性剂、放射性同位素或免疫调节部分。在根据本发明的缀合物中，效应分子是磷酸抗原部分。
抗体
本文使用的术语“抗体”优选指包含两条重链和两条轻链的抗体。一般而言，抗体或其任何抗原结合片段是具有治疗活性的抗体或其任何抗原结合片段，但如ADC领域中已知的，这样的独立的效力不是必需的。根据本发明使用的抗体可以是任何同种型，例如IgA、IgE、IgG或IgM抗体。优选地，所述抗体是IgG抗体，更优选IgG1或IgG2抗体。抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。优选地，抗体是人源化的或人的。甚至更优选地，抗体是人源化或人IgG抗体，更优选人源化或人IgG1单克隆抗体。抗体可具有κ(kappa)或λ(lambda)轻链，优选κ(kappa)轻链，即人源化或人IgG1-κ抗体。
本文使用的术语“抗原结合片段”包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或还原IgG(reduced IgG，rIgG)片段、单链(single chain，sc)抗体、单结构域(singledomain，sd)抗体、双抗体(diabody)或微抗体(minibody)。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人抗体的最少序列的抗体(例如非人-人嵌合抗体)。将非人抗体人源化的多种方法是本领域已知的。例如，重链(heavy chain，HC)和轻链(light chain，LC)的可变区(variable region，VR)中的抗原结合互补决定区(antigen-binding complementarity determining region，CDR)来源于来自非人物种(通常是小鼠、大鼠或兔)的抗体。这些非人CDR可以与HC和LC的可变区的人框架区(FR(framework region)，即FR1、FR2、FR3和FR4)组合，以这样的方式使得至少部分地保留了抗体的功能特性，例如结合亲和力和特异性。人FR中的选定氨基酸可以与相应的原始非人物种氨基酸交换，以进一步改进抗体性能，例如改善结合亲和力，同时保持低免疫原性。因此，人源化的可变区通常与人恒定区组合。非人抗体人源化的示例性方法是Winter及其同事的方法(Jones et al,1986,Nature,321,522-525；Riechmann et al,1988,Nature,332,323-327；Verhoeyen et al,1988,Science 239,1534-1536)。或者，非人抗体可以通过修饰其氨基酸序列来人源化，以提高与人中天然产生的抗体变体的相似性。例如，原始非人物种FR的选定氨基酸被交换为其相应的人氨基酸以降低免疫原性，同时保留抗体的结合亲和力。关于更多的细节，参见Jones et al(参见上文)；Riechmann et al(参见上文)和Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2,593-596。还参见以下综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani and Hamilton,1998,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.,1,105-115；Harris,1995,Biochem.Soc.Transactions,23,1035-1038；和Hurle and Gross,1994,Curr.Op.Biotech.,5,428-433。
可使用Kabat(在Kabat,E.A.et al,(1991),Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,NIH出版号：91-3242,第662,680,689页中)、Chothia(Chothia etal,1989,Nature,342,877-883)或IMGT(Lefranc,1999,The Immunologist,7,132-136)的方法来确定CDR。
通常来说，抗体是单特异性的(即，对一种抗原具有特异性；这样的抗原在物种之间可以是共有的，或者在物种之间具有相似的氨基酸序列)或双特异性的(即，对物种的两种不同抗原具有特异性)抗体，其包含至少一个与抗原靶标结合的HC和LC可变区，优选膜结合抗原靶标(其可以是内化的或不内化的)。优选地，抗体在与(抗原)靶标结合之后被靶细胞内化，此后在胞内释放活性效应分子，其在根据本发明的缀合物中是磷酸抗原。
可用于根据本发明的用于癌症治疗的缀合物中的靶向抗体可以是肿瘤靶向抗体，其选择性地与肿瘤特异性或肿瘤相关抗原结合。肿瘤特异性抗原仅存在于肿瘤细胞上，而肿瘤相关抗原是与正常(健康)细胞相比在癌细胞中以较高水平表达(例如过表达)的抗原。
与根据本发明的缀合物的抗体或抗原结合片段结合的抗原靶标可例如选自：膜联蛋白A1、B7H3、B7H4、BCMA、CA6、CA9、CA15-3、CA19-9、CA27-29、CA125、CA242(癌症抗原242)、CAIX、CCR2、CCR5、CD2、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30(肿瘤坏死因子8)、CD33、CD37、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD40、CD44、CD47(整联蛋白相关蛋白)、CD56(神经细胞黏附分子)、CD70、CD71、CD73、CD74、CD79、CD115(集落刺激因子1受体)、CD123(白介素-3受体)、CD138(黏结蛋白1)、CD203c(ENPP3)、CD303、CD333、CDCP1、CEA、CEACAM、密封蛋白4、密封蛋白7、CLCA-1(C型凝集素样分子-1)、CLL 1、c-MET(肝细胞生长因子受体)、Cripto、DLL3、EGFL、EGFR、EPCAM、EphA2、EPhB3、ETBR(内皮素B型受体)、FAP、FcRL5(Fc受体样蛋白5、CD307)、FGFR3、FOLR1(叶酸受体α)、FRβ、GCC(鸟苷酸环化酶C)、GD2、GITR、GLOBO H、GPA33、GPC3、GPNMB、HER2、p95HER2、HER3、HMW-MAA(高分子量黑素瘤相关抗原(high molecular weightmelanoma-associated antigen))、整联蛋白α(例如，αvβ3和αvβ5)、IGF1R、TM4SF1(L6)、路易斯A样碳水化合物、路易斯X、路易斯Y(CD174)、LGR5、LIV1、间皮素(mesothelin，MSLN)、MN(CA9)、MUC1、MUC16、NaPi2b、连接蛋白-4、Notch3、PD-L1、PSMA、PTK7、SLC44A4、STEAP-1、5T4(或TPBG、滋养层糖蛋白)、TF(组织因子、凝血活酶、CD142)、TF-Ag、Tag72、TNFα、TNFR、TROP2(肿瘤相关钙信号转导子2)、uPAR、VEGFR和VLA。
本领域已知的合适抗体的一些实例包括博纳吐单抗(blinatumomab)(CD19)、利妥昔单抗(rituximab)(CD20)，或另一些抗CD20抗体，例如奥法木单抗(ofatumumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)或奥美珠单抗(ocrelizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)(CD22)、伊妥木单抗(iratumumab)和本妥昔单抗(brentuximab)(CD30)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、伐达妥昔单抗(vadastuximab)(CD33)、tetulumab(CD37)、达雷妥尤单抗(darartumumab)、伊沙妥昔单抗(isatuximab)(CD38)、比伐珠单抗(bivatuzumab)(CD44)、阿仑单抗(alemtuzumab)(CD52)、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)(CD56)、沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)(CD70)、米拉珠单抗(milatuzumab)(CD74)、波妥珠单抗(polatuzumab)(CD79)、洛伐妥珠单抗(rovalpituzumab)(DLL3)、伏妥昔单抗(futuximab)(EGFR)、奥珀妥珠单抗(oportuzumab)(EPCAM)、法乐妥珠单抗(farletuzumab)(FOLR1)、格巴妥木单抗(glembatumumab)(GPNMB)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)和马格妥昔单抗(margetuximab)(HER2)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)(整联蛋白)、阿奈妥单抗(anetumab)(间皮素)、潘科曼单抗(pankomab)(MUC1)、恩弗妥单抗(enfortumab)(连接蛋白-4)、H8、A1、和A3(5T4)以及针对TROP2的抗体，例如赛妥珠单抗(sacituzumab)、datopotamab和PF-06664178。在实施例中举例说明了其中靶向部分是针对CD20(例如利妥昔单抗)、HER2(例如曲妥珠单抗)的肿瘤靶向抗体或抗CD123抗体的根据本发明的缀合物。
因为应在细胞中展示pAg部分的pAg活性，所以优选内化抗体。
如果适用的话，抗体或其抗原结合片段可包含(1)经工程化的恒定区，即可引入一个或更多个突变，以例如提高半衰期、提供接头-药物的连接位点和/或提高或降低效应物功能；或(2)经工程化的可变区，即可引入一个或更多个突变，以例如提供接头-药物的连接位点。可重组地、合成地或通过其他已知的合适方法产生抗体或其抗原结合片段。例如，可降低抗体的Fc介导的效应物功能的突变是例如Leabman et al.,2013,MAbs,5(6):896-903和Bruhns P,et al.,2015,Immunol Rev.,268(1):25-51.doi:10.1111/imr.12350.PMID:2649751中描述的那些突变。
根据本发明的缀合物可以是野生型或位点特异性的(意指特定的缀合位点，例如半胱氨酸或非天然氨基酸已经被工程化到抗体蛋白质序列中)或者其组合，并且可以通过本领域已知的任何方法产生。
根据本发明的免疫缀合物包含作为免疫调节部分的磷酸抗原部分(pAg)。发现根据本发明的免疫缀合物非常有效地将其pAg有效载荷递送至抗原呈递细胞例如癌细胞，从而在抗原呈递细胞内产生活性磷酸抗原。抗原呈递细胞可以是在其表面上表达或过表达某些肿瘤抗原的肿瘤细胞。这样的细胞也可以表达或过表达参与pAg对γδT细胞的间接活化的TCR活化分子，例如BTN3A1/BTN2A1受体复合物分子。
磷酸抗原部分(pAg)
磷酸抗原部分包含具有相对较小质量的非肽抗原，其可在存在抗原呈递细胞的情况下刺激γδT细胞(更具体地Vγ9Vδ2细胞)。本说明书通篇使用的术语“磷酸抗原部分”或“pAg”是指任何天然存在的磷酸抗原，以及非天然存在的(合成的)pAg，包括经修饰的pAg，例如天然存在的pAg的类似物或其前药。适用于本发明的pAg可以是焦磷酸盐/酯(二磷酸盐/酯)、焦膦酸盐/酯、双膦酸盐/酯(或二膦酸/酯)、单磷酸盐/酯或单膦酸盐/酯，或其前药。用于本发明缀合物和接头药物的优选的pAg是(单)膦酸盐/酯。用于本发明的缀合物和接头-药物化合物的优选的磷酸抗原包含烯丙醇基，例如存在于天然磷酸抗原如HMBPP中的烯丙醇基。优选地，磷酸抗原是包含烯丙醇基的单膦酸盐/酯。
作为根据本发明的缀合物或接头-药物化合物的一部分的“磷酸抗原部分”不一定包含其活性形式的磷酸抗原。缀合物或接头-药物化合物中的磷酸抗原部分可包含活性磷酸抗原的非活性前体形式，和/或可仅在缀合物与其靶标结合并被加工之后释放活性磷酸抗原。因此，作为缀合物或接头-药物化合物的一部分的处于结合状态的磷酸抗原部分可在结构上不同于从中释放的活性磷酸抗原。例如，从连接部分断开或连接部分的切割可引发结构重排和/或者化学或酶促反应，导致功能活性磷酸抗原的形成。此外，前药部分的去除或重排(例如响应于环境的变化或作为靶部位的酶活性的结果)可释放功能活性磷酸抗原。
认为具有细胞pAg活性的化合物能够通过与靶细胞中的pAg受体结合来直接展示其活性(“直接pAg”)。该受体被认为是细胞表面分子嗜乳脂蛋白3A1(BTN3A1)的胞内结构域。天然的直接pAg的一个实例是HMBPP。HMBPP由致病性细菌产生。发现天然pAg例如HMBPP中的烯丙醇对于BTN3A1结合和使pAg活性最大化是重要的。直接pAg，例如HMBPP，在其胞内B30.2结构域中与BTN3A1直接结合。HMBPP的类似物，例如卤代醇例如BrHPP、IHPP和ClHPP也是本领域中已知的(Wiemer et al.,2020,Chem.Med.Chem.,15,1030-1039)。
另一些化合物通过IPP的积累显示出间接pAg活性。这样的化合物可被称为“间接pAg”。间接pAg作用于提高(内源性的)直接pAg(例如IPP)的细胞水平并同时活化Vγ9Vδ2T细胞的途径。与直接pAg相反，间接pAg不与靶细胞中的嗜乳脂蛋白受体直接相互作用，其也不是pAg前体(被酶促或化学转化为直接pAg的化合物)。间接pAg可以是例如抑制下游酶例如法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS)的化合物。对FPPS的抑制阻断了IPP的使用，并导致细胞中IPP的积累。已知的FPPS抑制剂是氨基双膦酸盐/酯(aminobisphosphonate，N-BP)，例如唑来膦酸盐/酯(Wiemer et al.,2020,Chem.Med.Chem.,15,1030-1039；Park et al.,2021,Frontiers in Chemistry,Vol.8,Article 612728)。
氨基双膦酸盐/酯(N-BP)，例如唑来膦酸盐/酯、帕米膦酸盐/酯和阿仑膦酸盐/酯由于其特异性结合羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的能力，也被称为“骨靶向剂”(Farrell et al.,2018,Bone Reports,9,47-60)。还使阿仑膦酸盐/酯与曲妥珠单抗缀合，目的是使用阿仑膦酸盐/酯作为骨靶向剂将曲妥珠单抗靶向至骨转移(Tian et al.,2021,Sci.Adv.,7,2-11)。由于其带负电荷，阿仑膦酸盐/酯对HA具有高亲和力，导致与骨优先结合。因此，Tian et al.提出使用带负电荷的氨基双膦酸盐/酯如阿仑膦酸盐/酯作为用于治疗骨相关疾病的抗体的靶向剂。
在根据本发明的缀合物中，例如抗体(靶向部分)与其特异性结合配偶体(例如肿瘤特异性抗原)的特异性结合将引导pAg部分到达其靶部位，而不是相反的情况(pAg部分不是靶向部分)。在根据本发明的缀合物中，正是靶向部分(例如抗体)的结合特异性和亲和力确保了磷酸抗原部分被递送至必须发挥其治疗作用的部位。
优选的用于本发明的pAg部分包含烯丙醇或其前药(例如其中在前药基团被去除之后或者在通过异戊二烯单元缀合或与异戊二烯单元缀合的接头部分被切割之后产生烯丙醇的pAg部分)。这样的化合物被认为是包含直接pAg活性的pAg部分(充当BTN3A1配体的pAg)的实例。在替代方案中，前体(例如被代谢成具有(直接)pAg活性的化合物的化合物)，或者前体或直接pAg的前药，可被用作根据本发明的缀合物中的pAg部分。
如在实施例中所举例说明的，可在细胞测定中测量Vγ9Vδ2T细胞上磷酸抗原的活性。在所使用的基于细胞的测定中，在第一步骤中，将靶细胞(例如肿瘤细胞，例如来自CD20阳性伯基特淋巴瘤(Burkitt’s Lymphoma)人肿瘤细胞系Raji的细胞)与根据本发明的磷酸抗原或带有磷酸抗原的缀合物一起孵育(过夜)。
在该第一步骤中，根据本发明的磷酸抗原或缀合物将被内化到靶(肿瘤)细胞中。假定在内化(以及在缀合物的情况下切割接头)之后，磷酸抗原将与BTN3A1受体的胞内结构域结合，这将导致BTN3A1/BTN2A1二聚体的活化。
在第二步骤中，来自第一步骤的经预处理、洗涤的肿瘤细胞可与γδT细胞共培养。当Vγ9Vδ2T细胞被活化时，它们产生细胞因子并释放细胞毒性颗粒(脱颗粒)，分别导致免疫活化和靶细胞杀伤。
为了评估γδT细胞上磷酸抗原的活性，在γδT细胞和靶标的共培养期间添加莫能菌素(monensin)和/或布雷菲德菌素A(brefeldin A)。这将捕获在活化的细胞中产生的细胞因子(例如干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子α(TNFα))。在存在皂苷的情况下用经荧光标记的抗体进行染色，使得抗细胞因子抗体进入细胞，将确定产生细胞因子的细胞。也可在共培养期间添加针对CD107a的经荧光标记的抗体，并将对经历脱颗粒的细胞进行染色。脱颗粒与肿瘤细胞杀伤相关(Aktas et al.,2009,Cell Immunol.,254(2),149-154)。
因此，通过将经荧光标记的免疫细胞特异性标志物与CD107a标志物和细胞因子标志物组合，可确定γδT细胞和/或其他免疫细胞亚群在与预处理的靶细胞共培养之后的活化状态。
γδT细胞杀伤预处理的肿瘤细胞的能力可通过确定共培养之后的死亡肿瘤细胞的比例来检测。用荧光标签可容易地鉴定肿瘤细胞，并且早在与γδT细胞共培养之后1小时就已经可以确定它们的细胞死亡。
磷酸抗原类似物
(化学)类似物是在其结构特征上不同于天然磷酸抗原，但在其功能性生物活性上类似于天然磷酸抗原的化合物。(即它们显示出(间接的)免疫刺激活性，特别是在γδT细胞上)。类似物可被设计成改善天然存在的pAg的一种或更多种特征，例如在将其用于根据本发明的免疫缀合物和接头-药物化合物中的情况下，有关稳定性、功效、生物利用度、或与连接部分的连接的改善的特征。天然磷酸抗原包括焦磷酸盐/酯(二磷酸盐/酯)，例如HMBPP和IPP。天然磷酸抗原的已知类似物包括焦磷酸溴代醇(BrHPP)和焦膦酸盐/酯，例如C-HMBPP，其是天然存在的HMBPP的焦膦酸盐/酯等同物。本领域已知的具有磷酸抗原活性的膦酸盐/酯还包括在两个磷酸基团之间的中心碳上的取代基不同的双膦酸盐/酯。一些实例包括依替膦酸盐/酯、氯膦酸盐/酯、替鲁膦酸盐/酯和一类在中心碳原子上的一个取代基中具有氮或氨基的双膦酸盐/酯，认为其提高了双膦酸盐/酯的功效(Drake et al.,MayoClin.Proc.,2008,83(9),1032-1045)。这些含氮双膦酸盐/酯磷酸抗原包括唑来膦酸盐/酯(唑来膦酸)、阿仑膦酸盐/酯、利塞膦酸盐/酯、伊班膦酸盐/酯、帕米膦酸盐/酯、奈立膦酸盐/酯和奥帕膦酸盐/酯。
在WO2005/05258(Innate Pharma)中描述了具有声称的提高的功效的另一类磷酸抗原类似物亚磷酸酰胺酯，例如N-HDMAPP，其中存在于天然HMBPP中的异戊二烯单元通过NH基团与焦磷酸盐/酯连接。
磷酸抗原前药
前药意指磷酸抗原部分的非活性前体，其在去除或转化保护基团(例如膦酸盐/酯基团的带负电荷的非结合氧原子上的中性保护基团)之后转化为活性磷酸抗原。在将根据本发明的包含前药形式的磷酸抗原部分的缀合物施用于身体之后，保护基团可在靶部位处被代谢性地去除。前药也可因连接部分与磷酸抗原部分结合而形成。在这种情况下，可形成活性磷酸抗原，因为缀合物中用于使磷酸抗原前药部分与靶向部分结合的接头被切割，导致活性磷酸抗原的释放，和/或因为保护基团从磷酸抗原部分去除。优选地，释放活性磷酸抗原的这样的转化仅在根据本发明的缀合物到达其必须发挥其治疗作用的部位之后(例如，在其被肿瘤细胞内化之后)或者至少在肿瘤微环境中发生，以防止磷酸抗原部分在健康和/或非靶标组织中的不想要和非特异性副作用。
例如，某些双膦酸盐/酯对骨矿物质具有高亲和力并被用作“骨靶向剂”。这样的双膦酸盐/酯用作与双膦酸盐/酯缀合的不同药物的靶向分子，并将药物靶向至药物在其中发挥治疗作用的骨，例如在骨局部细胞上(Farrell et al.,2018,Bone Reports,9,47-60)。
相比之下，在根据本发明的缀合物中，磷酸抗原与靶向部分(例如肿瘤特异性抗体)缀合。在根据本发明的缀合物中，靶向部分的结合特异性确保了磷酸抗原部分被递送至必须发挥其治疗作用的部位。
在本发明的上下文中，通过在缀合物中包含前药而不是活性磷酸抗原可进一步防止磷酸抗原部分的任何不想要的反应性(例如，通过磷酸抗原本身与非靶标组织结合)。
例如，双膦酸盐/酯的带负电荷的膦酸盐/酯基团可被前药部分掩蔽。前药通过缀合物的靶向部分被递送到靶部位，在那里其被转化为活性磷酸抗原。
前药形式包括本领域已知的保护基团，例如芳基酯、芳基酰胺或新戊酰氧基甲基(pivaloyloxymethyl，POM)前药形式。在WO2019/182904中描述了C-HMBP(单膦酸盐/酯)磷酸抗原类似物/前药。为了合成与天然磷酸抗原例如HMBPP一样有效的磷酸抗原前药，合成了(单膦酸盐/酯)磷酸抗原的芳氧基亚磷酰胺三酯(aryloxy triester phosphoamidite)前药，如Davey et al.,2018,J.Med.Chem.,61,2111-2117中所述。在这些前药中，单膦酸酯基团被芳基基序和氨基酸酯部分掩蔽。由于分子中磷酸部分和类异戊二烯部分之间的-P-O-键的切割，这些化合物(“HMBP ProPagen”)仍然具有相当低的血清稳定性。在WO2020/008189中描述了其中碳替换了-P-O-键中的氧的类似的“ProPagen”化合物。Wiemer etal.,2020,Chem.Med.Chem.,15,1030-1039描述了针对磷酸抗原(前药)的提出的结构活性关系(structure activity relationship，SAR)。
可切割连接部分通过烯丙醇部分的醇基可方便地与磷酸抗原偶联。在这种情况下，当可切割连接部分被切割时，烯丙醇可在细胞内(再)形成。
作为根据本发明的缀合物的一部分的磷酸抗原前药中的前药部分可以是相同的或不同的。例如，所有前药部分可以是POM基团，或者磷酸抗原部分可包含例如“proTide”基团的组合，所述“proTide”基团例如芳氧基和氨基酸酯基团，例如如在WO2020/008189或WO2019/182904中针对磷酸抗原前药所描述的那些。
合适的膦酸盐/酯前药物技术和膦酸盐/酯前药的合成是本领域已知的。这样的前药技术在例如Pradere et al.,2014,Chem.Rev.,114,9154-9218中被进一步综述，并且包括使用羰基氧基甲基前药部分，例如新戊酰氧基甲基(POM)和异丙基氧基羰基氧基甲基(POC)衍生物，基于S-酰基-2-硫代乙基(SATE)和S-[(2-羟基乙基)硫醚基]-2-硫代乙基(DTE)的前药，基于环水杨基(cycloSal)磷酸盐/酯和膦酸盐/酯的前药和基于烷氧基烷基单酯(十六烷氧基丙基-(hexadecyloxypropyl，HDP)、十八烷氧基乙基-(octadecyloxyethyl，ODE))的前药，基于亚磷酰胺和亚膦酰胺的前药(包括芳氧基氨基酸酰胺化物(ProTide)前药)，以及磷酸二酰胺盐/酯和膦酸二酰胺盐/酯。
接头-药物化合物
本发明还提供了接头-药物化合物，其包含至少一个与连接部分共价结合的磷酸抗原部分。这样的接头-药物化合物可在合成根据本发明的缀合物中用作中间体。例如，当靶向部分是抗体或其抗原结合片段时，根据本发明的一种或更多种接头-药物化合物可与靶向抗体缀合，从而产生根据本发明的缀合物。
根据本发明的接头-药物化合物包含至少一种磷酸抗原部分(pAg或“药物”)和连接部分(L或“接头”)。这样的接头-药物分子可用于制备根据本发明的缀合物。优选的根据本发明的接头-药物化合物可由通式II表示：
其中：
Q表示式IIa或IIb中示出的结构：
Y是卤素，
W1是N、CH或CF，优选CH；
W2是CH2、CHF、CF2或O；
X1是O、S、NH、CH2、CHF或CF2；
X2是O、CH2、CHF或CF2；
X3是不存在的，或者是O或NH；
X4a至4d中的每一个独立地选自O和S；
X5是CH3、CH2F、CHF2或CF3或CCl3；
x是1至5的整数；
m是1、2或3；
n是0、1或2；
R1是H或与连接部分(L)的连接部(connection)，或者是前药部分；
R2是H或与连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
R3是H或与连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
R4是H或与连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
或者，当n是0时，R3和R2通过C1-6(杂)烷基连接，或者
当n是1或2时，R3和R4通过C1-6(杂)烷基连接。
其中Q具有式IIb的接头药物化合物可具有类似于(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMBPP)类似物的磷酸抗原部分，例如BrHPP(Phosphostim)、IHPP或ClHPP。
在本发明的一个优选实施方案中，接头-药物化合物涵盖根据式II的化合物，其中Q表示式IIa中示出的结构。这样的化合物由通式III表示：
其中：
W1是N、CH或CF，优选CH；
W2是CH2、CHF、CF2或O；
X1是O、S、NH、CH2、CHF或CF2；
X2是O、CH2、CHF或CF2；
X3是不存在的，或者是O或NH；
X4a至4d中的每一个独立地选自O和S；
X5是CH3、CH2F、CHF2或CF3或CCl3；
x是1至5的整数；
m是1、2或3；
n是0、1或2；
R1是H或与连接部分(L)的连接部，或者是前药部分；
R2是H或与连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
R3是H或与连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
R4是H或与连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
或者，当n是0时，R3和R2通过C1-6(杂)烷基连接，或者
当n是1或2时，R3和R4通过C1-6(杂)烷基连接。
外括号之间的式表示pAg部分，而L表示接头部分。每个接头药物分子仅一个与连接部分的连接部。(但是当x大于1时，多个pAg部分与一个(支化的)接头部分连接)。
优选n是0或1，最优选0。当n是1或2时，X2优选是O。具有其中n是1并且X2是CH2，或者其中n是1并且X2是O的磷酸抗原部分的接头-药物化合物同样是本发明的一部分。在这种情况下，X4a至4d中的每一个优选是O。在这样的接头药物化合物中，R3或R1可表示与连接部分的连接部，优选R3表示与连接部分的连接部。
当n是2时，X2将在式II中出现两次，并且可被称为X2a和X2b，其可独立地选自O、CH2、CHF和CF2。当n是2时，R4也将出现两次，并且可被称为R4a和R4b，其可独立地选自H、与连接部分(L)的连接部、Cat+和前药部分。当n是2时，X4c和X4d也是如此。二者都出现两次(X4c、X4ci、X4d和X4di)，并且可独立地选自O和S。
当m是2或3时，W2将在式II中出现多次，并且每个W2可独立地选自CH2、CHF、CF2或O。优选地，W2是CH2。在一个优选实施方案中，m是1，并且最优选地，当m是1时，W2是CH2。
Cat+表示(有机或无机(mineral))阳离子，包括质子。
X1优选是CH2、O或S，最优选CH2。
X4a至4d中的每一个(当存在时)优选为O。本发明的一部分是这样的化合物：其中n是1或0，并且其中X4a至4b和X4c至4d(当存在时)是O，并且其中R2和R4(当存在时)优选是H。优选n是0，并且X4a和X4b是O，并且R2优选是H。
在其中Q表示式IIa中示出的结构的接头药物化合物中，优选W1是CH或CF，最优选CH。
当Q表示式IIa中示出的结构时，X5优选是CH3。
在其中Q表示式IIa中示出的结构的接头药物化合物中，优选R1是H或与连接部分(L)的连接部，最优选是H。
在其中Q表示式IIa中示出的结构的接头药物化合物中，优选W1是CH，X5是CH3，X1是CH2，并且R1是H，从而形成携带具有烯丙醇基的pAg部分的接头药物分子。优选地，当W1是CH，X5是CH3，X1是CH2并且R1是H时，W2是CH2且m是1。当W1是CH，W2是CH2，m是1，X5是CH3，X1是O并且R1是H时，磷酸抗原部分包含存在于天然磷酸抗原例如HMBPP中的烯丙醇链。
优选的接头药物化合物是这样的接头药物化合物：其中Q表示式IIa中示出的结构，X3是O，R3是与可切割连接部分的连接部，W1是CH，X5是CH3并且R1是H，W2是CH2，且m是1，以及X1是CH2。
在这样的化合物中，R2、R3和/或R4可以是单独的或者分别与X4b、X4d和/或X3(当X3存在时)组合的前药部分(前药部分是-X4b-R2、-X4d-R4和/或-X3-R3)。
优选地，在其中Q表示式IIa中示出的结构的接头-药物化合物中，W1是CH，W2是CH2，X4a至4d是O，R2和R4是H，X5是CH3并且m是1。
在一个优选实施方案中，Q表示式IIa中示出的结构，W1是CH，W2是CH2，n是0，X4a至4b是O，X5是CH3并且m是1。
在式II中，x表示每个连接部分(L)的磷酸抗原部分(pAg)的数目，因此，其中括号之间的结构是优选地用于根据本发明的接头-药物化合物中的磷酸抗原部分的结构表示。x可以是1至5的整数(每个连接部分携带1至5个pAg)。优选地，连接部分携带1或2个pAg部分。在大多数情况下，每个连接部分可能携带1个pAg就足够了。
与连接部分的连接部可以是R1(的一部分)，或者，在替代方案中，连接部分可(连接至)R2、R3或R4。优选R1或R3是与连接部分的连接部，更优选R3。当连接部分连接在R3时，X3优选为O。当R3是与连接部分的连接部时，优选X3为O并且R1优选为H。
当连接部分连接在R2或R4位置时，X4b或X4d分别优选为O。
优选的接头药物化合物是这样的接头药物化合物：其中Q表示式IIa中示出的结构，X3是O并且R3是与可切割连接部分的连接部，其中优选W1是CH，X5是CH3并且R1是H，W2是CH2并且m是1，以及X1是CH2。在这样的化合物中，n优选为0。
用“与连接部分的连接部”意指分子中接头与磷酸抗原部分连接的位置。“连接部”不一定意指R1、R2、R3或R4(取决于接头连接的位置)表示接头与磷酸抗原部分的剩余部分之间的接头-药物化合物的实际(剩余)结构元件。例如，根据所使用的接头化学物质，当R1表示与连接部分的连接部时，这还包括其中接头与接头-药物分子中磷酸抗原部分的氧原子直接连接的情况。在替代方案中，R1是与连接部分(L)的连接部。在其中R1是与连接部分(L)的连接部的这样的情况下，优选W1是CH，W2是CH2，m是1，X5是CH3并且X1是CH2。当将这样的接头-药物分子并入到根据本发明的缀合物中时，在施用之后切割接头可导致烯丙醇基的(再)形成(在从缀合物释放的实际功能活性磷酸抗原部分中，R1是H)。R1也可以是前药部分。合适的醇前药部分是本领域已知的。例如，醇可被基于酯的前药基团掩蔽。活性醇的产生依赖于(细胞)酯酶对酯键的水解，导致醇(药物)和羧酸(离去基团)的代谢再生。
R2、R3和R4可以各自独立地是H或与连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分。在一个优选实施方案中，根据本发明的化合物是单膦酸盐/酯(n是0)并且因此R4是不存在的。
Cat+表示(有机或无机)阳离子，包括质子(并且可以在制剂缓冲液或血浆中交换)。当R2、R3和/或R4是Cat+时，Cat+可以是相同的或不同的。优选地，当R2、R3和/或R4是Cat+，X4b和X4d(当存在时，即n不为0)，和/或X3是O时，产生O-Cat+。
在本发明的另一个实施方案中，其中n是0，R3和R2通过C1-6(杂)烷基连接。在这种情况下，R3和R2一起形成经取代或未经取代的5至8元环。在这样的一个实施方案中，连接部分优选连接在R1位置处。在其中n不为0的一个替代实施方案中，R3和R4可以以类似的方式通过C1-6(杂)烷基连接。
R2、R3和/或R4也可以是单独的或者分别与X4b、X4d和/或X3(当X3存在时)组合的前药部分(前药部分是-X4b-R2、-X4d-R4和/或-X3-R3)。
“前药部分”可以是可被非酶促或酶促切割(释放活性化合物)的基团。在将根据本发明的缀合物施用于对象之后,“前药部分”可诱导分子中另一位置上的第二前药部分的释放。优选地，前药形式的磷酸抗原部分在靶细胞(例如肿瘤细胞)内部被转化为功能活性磷酸抗原，例如通过酶促去除前药部分。
本领域已知的前药技术的一些实例包括使用新戊酰氧基甲基(POM)或异丙氧基羰基氧基甲基(POC)基团。在一个优选实施方案中，至少R2和R3独立地选自POM或POC基团(例如，当n是0时)。当n是1或2时，R4也可以是POM或POC基团。
例如，在WO2019/182904中描述了这种类型的磷酸抗原前药。这样的磷酸抗原前药可用作根据本发明的接头-药物化合物和缀合物中的pAg部分的基础。
在替代方案中，可使用离去基团的组合。这样的前药技术的一个实例是为单磷酸盐/酯和单膦酸盐/酯的胞内递送而开发的“ProTide”技术。ProTide前药中的单磷酸盐/酯或单膦酸盐/酯基团的羟基被芳族基团和氨基酸酯部分掩蔽(或替换)，所述芳族基团和氨基酸酯部分在细胞内部被酶促切割以释放游离的单磷酸盐/酯和单膦酸盐/酯(Mehellouet al.2018,Journal of Medicinal Chemistry,61(6),2211-2226)。
因此，其中磷酸抗原部分是单磷酸盐/酯或单膦酸盐/酯并且其中R2和R3是“ProTide”离去基团的组合的根据本发明的接头-药物化合物和缀合物也是本发明的一部分。在其中磷酸抗原部分是磷酸抗原的ProTide前药的这样的情况下，R2是芳族部分并且R3是氨基酸酯部分，或反之亦然。在本发明的优选实施方案中，当n是0时，R2或R3中的一者可以是经取代或未经取代的(杂)芳基，而另一者(R3或R2)可选自根据式IV和V的结构：
其中：
Ra和Ra’独立地选自H、任选经取代的氨基酸侧链和包含任选经取代的C1-14烷基链的非极性侧链，
Rb是H、苄基或者经取代或未经取代的(C1-8)烷基，
Rc和Rc’独立地选自H、任选经取代的(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基或杂芳基。Rc和Rc’也可以与其所结合的氮一起形成任选经取代的环，例如氮丙啶环、氮杂环丁烷环、吗啉基环、哌嗪基环、吡咯烷基环或哌啶基环。
Rc和/或Rc’上的任选取代基是羧酸生物电子等排体(bioisostere)、氨基、四唑、磺酸根、羟基、卤素或烷基。
当Rb是经取代的烷基时，取代基可以是独立地选自以下的一种或更多种基团：羟基、氨基、卤素、硝基、氰基、羧基、NRxRy、(C1-6)烷氧基、(C1-6)烷酰基、(C1-6)烷氧基羰基、(C1-6)烷硫基和(C2-6)烷酰氧基，其中Rx和Ry各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C3-6)环烷基和(C3-6)环烷基(C1-6)烷基。在替代方案中，Rx和Ry与其所连接的氮一起形成氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基或哌啶基。
连接部分
用于根据本发明的缀合物或接头-药物化合物中的连接部分(或“接头”)优选为合成接头。接头的结构使得该接头可以容易地与小的效应分子(磷酸抗原部分)化学连接，并且使得所得接头-药物化合物可以容易地与另外的物质例如如多肽(例如抗体)缀合。接头的选择可以影响这样的最终缀合物在循环中的稳定性，并且如果被释放的话，其可影响小分子效应物化合物(磷酸抗原)的释放方式。合适的接头例如描述于Ducry et a.l,2010,Bioconjugate Chem.,21,5-13；King and Wagner,2014,Bioconjugate Chem.,25,825-839；Gordon et al.,2015,Bioconjugate Chem.,26,2198-2215；Tsuchikama and An,2018,Protein&Cell,9,33-46DOI:10.1007/s13238-016-0323-0；Polakis,2016,Pharmacological Reviews,68(1),3-19,DOI:10.1124/pr.114.009373；Bargh et al.,2019,Chem.Soc.Rev.,48,4361-4374,DOI:10.1039/c8cs00676h；WO 02/083180，WO2004/043493，WO2010/062171,WO2011/133039，WO2015/177360中和WO2018/069375中。接头可以是可切割的或不可切割的，如在例如van Delft,F and Lambert,J.M.,2021,ChemicalLinkers in Antibody-Drug Conjugates(ADCs),1st Ed.Royal Society of Chemistry,ISBN-10:1839162635中所述。将接头-药物与抗体偶联的另一种方法是通过使用转肽酶，例如细菌定位酶(sortase)或植物天冬酰胺内肽酶，实现了与合适的合成肽连接的化学部分的位点特异性固定。定位酶A(Sort-A)识别C端肽序列(LPXTG)，并在该序列内的苏氨酸与ADC的缀合配偶体，例如经甘氨酸标记的有效载荷的N端上提供的甘氨酸之间产生键(Combset al.,2015,the AAPS Journal,Vol.17,No.2,339-351,DOI:10.1208/s12248-014-9710-8)。抗体药物缀合也可通过位点特异性糖改造，例如通过使用内-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(ENGase)和单糖基转移酶突变体来实现(Manabe et al.,2021,Chem Rec,(11),3005-3014,doi:10.1002/tcr.202100054；Wang et al.,2019,Annu Rev Biochem,20；88,433-459,doi:10.1146/annurev-biochem-062917-012911)。
优选在根据本发明的缀合物中使用可切割接头。可切割接头包含可被切割的部分，例如当暴露于溶酶体蛋白酶或具有酸性pH或较高还原电位的环境时。合适的可切割接头是本领域已知的，并且包括例如单肽、二肽、三肽或四肽，即单个、两个、三个或四个氨基酸残基。另外，可切割接头可包含自我牺牲(selfimmolative)部分，例如ω-氨基氨基羰基环化间隔基，参见Saari et al,1990,J.Med.Chem.,33,97-101，或-NH-CH2-O-部分。接头的切割使得根据本发明的缀合物中的免疫调节效应物部分(磷酸抗原或“pAg”部分)对周围环境是可用的。不可切割接头仍然可有效地从根据本发明的免疫缀合物中释放磷酸抗原部分(的活性衍生物)，例如当缀合的多肽(抗体)在溶酶体中被降解时。不可切割接头包括例如琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基(环己烷)-1-羧酸酯和马来酰亚胺基己酸(maleimidocaproic acid)及其类似物。
为了能够将连接部分或接头-药物化合物与多肽(例如抗体)缀合，连接部分的将与抗体(共价)结合的侧通常包含可在相对温和的条件下与抗体的氨基酸残基反应的官能团。该官能团在本文中被称为反应性部分(reactive moiety，RM)。反应性部分的一些实例包括但不限于氨甲酰基卤化物、酰基卤化物、活性酯、酸酐、α-卤代乙酰基、α-卤代乙酰胺、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、二硫化物、硫醇、肼、酰肼、磺酰氯、醛、甲基酮、乙烯砜、卤代甲基、甲基磺酸酯、环辛炔和反式环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)。官能团与之反应的这样的氨基酸残基可以是天然或非天然的氨基酸残基，或者(非)天然聚糖(Manabe etal.,Wang etal.(参见上文))。本文使用的术语“非天然氨基酸”旨在表示经(合成)修饰的氨基酸或天然存在的氨基酸的D立体异构体。优选地，官能团与之反应的氨基酸残基是天然氨基酸。
用于根据本发明的缀合物或接头-药物化合物的连接部分(L)可包含根据式VI或式VII的结构：
其中m是1至10的整数，优选5；A是氨基酸，优选天然氨基酸，并且p是0、1、2、3或4。当p大于1时，氨基酸可以是相同的或不同的。
合适的氨基酸组合是本领域已知的并且包含选自丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和瓜氨酸的氨基酸。优选p为2。当p为2时，AA2可以是例如苯丙氨酰赖氨酸、缬氨酰丙氨酸、缬氨酰瓜氨酸或缬氨酰赖氨酸。当p为2时，AA2优选为缬氨酰丙氨酸或缬氨酰瓜氨酸。当p为3时，AA3可以是例如丙氨酰苯丙氨酰赖氨酸，当p为4时，AA4可以是例如甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甘氨酸。
“q”是1至12的整数，优选2；ES是不存在的，或者是选自以下的延伸间隔基：
其中R5是H、卤素、CF3、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基，优选H、F、CH3或CF3，更优选H或F；并且V是H、乙基、CH2CH2O)p-OMe、CH2CH2SO2Me或CH2CH2N(Me)2，其中p是1至12的整数。
连接部分也可以是支化的，这导致一个连接部分能够携带多个磷酸抗原部分。支化的连接部分的一些实例是：
这些支化接头部分可用于产生具有相对较高的pAg与靶向部分比率(“DAR”)的缀合物。使用这样的支化接头，可合成DAR为16以及甚至20或者更高的缀合物。根据本发明的基于抗体的缀合物可能仅需要约为2的DAR。然而，对于已知在目标肿瘤细胞上以相对较低水平表达的针对肿瘤特异性靶标的抗体，具有高的pAg与靶向部分比率的缀合物可以是优选的。用于根据本发明的接头-药物化合物中的接头-药物化合物可例如包含选自以下的任何连接部分：
接头部分(L)可与pAg部分缀合，产生根据本发明的具有式II中所示通式的接头药物化合物。
根据本发明的接头-药物化合物可与靶向部分缀合以产生根据本发明的缀合物。优选的根据本发明的缀合物包含与根据本发明的接头药物化合物缀合的肿瘤靶向抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个具体实施方案中，作为根据本发明的缀合物的一部分的磷酸抗原部分是单膦酸盐/酯前药，其中膦酸盐/酯基团的带负电荷的非结合氧原子被前药部分(例如ProTide部分((杂)芳基和氨基酯基)或者一个或更多个POM或POC)保护，而可切割连接部分可与磷酸抗原分子的异戊二烯单元连接，一旦接头被切割，该异戊二烯单元将转化为烯丙醇，见于磷酸抗原例如HMBPP中。
应当理解，当包含在根据本发明的缀合物中时，包含至少一个与根据本发明的连接部分共价结合的磷酸抗原的接头-药物化合物，与当不包含在缀合物中时的根据本发明的相同接头-药物化合物相比，可缺少或获得某些原子或原子团，例如，其可缺少氢原子。这可以是例如因为根据本发明的接头-药物化合物通过例如与羟基部分的酯化而与多肽缀合。
在实施例中进一步举例说明了根据本发明的接头-药物分子的一些实例的合成。优选的根据本发明的接头药物化合物的一个实例是XD18，其具有以下结构式：
根据本发明的基于接头-药物XD18的缀合物可包含1至20个、优选1至8个、更优选2个接头药物分子/抗体(例如利妥昔单抗，如实施例中所举例说明的)。
根据本发明的缀合物的合成
为了合成根据本发明的缀合物，可将根据本发明的一种或更多种接头-药物化合物与合适的靶标部分缀合。当靶标部分是多肽(抗体或其结合片段)时，接头-药物化合物可通过合适多肽中存在的反应性天然氨基酸残基例如赖氨酸或半胱氨酸，或者通过N端或C端缀合。或者，可将天然或非天然的反应性氨基酸残基遗传改造到合适的多肽中，或者可通过翻译后修饰引入反应性基团。
根据本发明的缀合物可通过将根据本发明的接头-药物化合物与抗体或其抗原结合片段缀合来产生，例如通过抗体的赖氨酸ε-氨基，优选使用包含胺反应性基团例如活化的酯的中间体。已知这样的方法用于产生常规的抗体-药物缀合物(ADC)。
或者，免疫缀合物可如下产生：使用本领域已知的方法和条件，例如参见Doroninaet al,2006,Bioconjugate Chem.,17,114-124，通过由链间二硫键的还原产生的半胱氨酸侧链的游离硫醇来缀合接头。制备方法涉及部分还原暴露于溶剂的链间二硫化物，随后用包含Michael受体的接头例如包含马来酰亚胺的接头、α-卤代乙酰胺或酯来修饰所得硫醇。半胱氨酸连接策略导致对于每个还原的二硫化物，最大两个包含接头的接头-药物。
在根据本发明的缀合物中用作靶向部分的优选抗体具有人IgG型。大多数人IgG分子具有四个暴露于溶剂的二硫键，这相当于每个抗体0至8的整数范围个连接的连接部分。每个靶标部分的连接的磷酸抗原部分的确切数目由每个连接部分的磷酸抗原部分的数目、二硫化物还原的程度和在随后的缀合反应中包含接头的接头-药物的摩尔当量数决定。全部四个二硫键的完全还原产生每个抗体八个接头部分的均一构建体，而部分还原通常会导致每个抗体零、二、四、六或八个连接部分的异质混合物。
在一个优选实施方案中，本发明涉及这样的缀合物，其中根据本发明的接头-药物化合物通过抗体或抗原结合片段的半胱氨酸残基与该抗体或其抗原结合片段缀合。
与抗体或其抗原结合片段的位点特异性缀合
因为抗体包含许多赖氨酸残基和半胱氨酸二硫键，所以常规缀合通常产生异质混合物，这对于分析表征和制备提出了挑战。此外，这些混合物的单个组分对于其药代动力学、效力和安全性特性(safety profile)表现出不同的物理化学特性和药理学，阻碍了优化这种模式的合理方法。
为了改善缀合物均一性，可对用于根据本发明的(免疫)缀合物中的抗体进行修饰，以允许接头的位点特异性缀合。C.R.Behrens and B.Liu,2014,mAbs,6(1)1-8全面综述了位点特异性药物与抗体缀合的方法，并且其可见于WO2015/177360、WO2005/084390和WO2006/034488中。
优选通过在突变的抗体或其抗原结合片段的合适位置上通过经改造半胱氨酸残基的侧链将接头-药物化合物与抗体或其抗原结合片段缀合来产生位点特异性免疫缀合物。经改造半胱氨酸通常被其他硫醇例如半胱氨酸或谷胱甘肽封端，以形成二硫化物。这些经封端的残基需要先解封，然后才能发生接头-药物连接。通过以下任一种可实现接头-药物与经改造残基的连接：(1)通过对天然链间二硫化物和突变二硫化物二者进行还原，然后使用温和的氧化剂(例如CuSO4或脱氢抗坏血酸)对天然链间半胱氨酸进行再氧化，随后将未封端的经改造半胱氨酸与接头-药物进行标准缀合；或者(2)通过使用温和的还原剂，其以比链间二硫键更高的速率还原突变二硫化物，随后将未封端的经改造半胱氨酸与接头-药物进行标准缀合。用于位点特异性地缀合接头-药物的合适方法可见于：例如WO 2015/177360，其描述了还原和再氧化的过程；WO 2017/137628，其描述了使用温和还原剂的方法；以及WO 2018/215427，其描述了用于缀合还原的链间半胱氨酸和未封端的经改造半胱氨酸二者的方法。
药物组合物
在另一个方面中，本发明提供了包含根据本发明的缀合物的组合物，优选地其中所述组合物是药物组合物，更优选地该药物组合物还包含一种或更多种可药用赋形剂。这样的组合物在下文中被称为根据本发明的组合物。所述组合物可以是例如液体制剂、冻干制剂或者为例如胶囊剂或片剂的形式。
通常来说，包含根据本发明的免疫缀合物的药物组合物采取冻干饼(冻干粉)的形式，其在静脉内输注之前需要(水性)溶解(即，重构)；或者采取冷冻(水性)溶液的形式，其在使用之前需要解冻。因此，在一些优选实施方案中，本发明提供了包含根据本发明的免疫缀合物的冻干组合物，优选地其中所述组合物是药物组合物，更优选地该药物组合物还包含一种或更多种可药用赋形剂。在另一些优选实施方案中，本发明提供了包含水和根据本发明的免疫缀合物的冷冻组合物，优选地其中所述组合物是药物组合物，更优选地该药物组合物还包含一种或更多种可药用赋形剂。在这种情况下，冷冻溶液优选在大气压下，并且冷冻溶液优选通过在低于0℃的温度下对根据本发明的液体组合物进行冷冻获得。用于包含在根据本发明的药物组合物(冷冻干燥之前)中的合适的可药用赋形剂包括缓冲溶液(例如，在水中的柠檬酸盐、氨基酸例如组氨酸、或包含琥珀酸盐的盐)、冻干保护剂(例如，蔗糖、海藻糖)、张力调节剂(例如，氯化物盐，例如氯化钠)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)和填充剂(例如，甘露醇、甘氨酸)。选择用于冷冻干燥的蛋白质制剂的赋形剂是因为它们能够在冷冻干燥过程期间以及在储存期间防止蛋白质变性。
医学用途
在另一个方面中，本发明提供了根据本发明的缀合物或根据本发明的组合物，其用作药物，优选用于治疗癌症、自身免疫病或感染性疾病。根据本发明的缀合物可用于诱导γδT细胞对例如肿瘤细胞和/或受感染细胞的细胞毒性作用。
缀合物和组合物在下文中统称为根据本发明使用的产品。
在一个实施方案中，根据本发明使用的产品用于治疗实体瘤或恶性血液病。在第二个实施方案中，根据本发明使用的产品用于治疗自身免疫病。在第三个实施方案中，根据本发明使用的产品用于治疗感染性疾病，例如细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染或其他感染。
在本发明的上下文中，癌症优选是表达根据本发明使用的产品所针对的抗原的肿瘤。这样的肿瘤可以是实体瘤或恶性血液病。可用如上定义的根据本发明使用的产品治疗的肿瘤或恶性血液病的一些实例可包括但不限于：乳腺癌；脑癌(例如胶质母细胞瘤)；头颈癌；甲状腺癌；腮腺癌；肾上腺癌(例如神经母细胞瘤、副神经节瘤或嗜铬细胞瘤)；骨癌(例如骨肉瘤)；软组织肉瘤(soft tissue sarcoma，STS)；眼癌(例如葡萄膜黑素瘤)；食管癌；胃癌；小肠癌；结直肠癌；尿路上皮细胞癌(例如膀胱癌、阴茎癌、输尿管癌或肾癌)；卵巢癌；子宫癌；阴道癌、外阴癌和宫颈癌；肺癌(尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC))；黑素瘤；间皮瘤(尤其是恶性胸膜和腹部间皮瘤)；肝癌(例如肝细胞癌)；胰腺癌；皮肤癌(例如基底细胞瘤、鳞状细胞癌或隆凸性皮肤纤维肉瘤)；睾丸癌；前列腺癌；急性髓系白血病(acute myeloidleukemia，AML)；慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)；慢性淋巴性白血病(chronic lymphatic leukemia，CLL)；急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblasticleukemia，ALL)；骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)；母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasia，BPDCN)；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)(包括滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma，FL)、CNS淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL))；轻链淀粉样变性；浆细胞白血病；以及多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)。
在本发明的上下文中，自身免疫病优选是与根据本发明使用的产品所针对的抗原相关的自身免疫病。自身免疫病表示由对正常身体细胞和组织的异常免疫应答引起的病症。存在至少80种类型的广泛多种自身免疫病。一些疾病是器官特异性的，并限于影响某些组织，而另一些疾病类似于影响全身许多组织的全身炎性疾病。这些体征和症状的出现和严重程度取决于发生炎性应答的部位和类型，并可随时间波动。可用如上定义的根据本发明使用的产品治疗的自身免疫病的一些实例可包括但不限于：类风湿性关节炎；幼年皮肌炎(juveniledermatomyositis)；银屑病；银屑病关节炎；狼疮；结节病；克罗恩病(Crohn'sdisease)；湿疹；肾炎；葡萄膜炎；多发性肌炎；神经炎，包括格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)；脑炎；蛛网膜炎；系统性硬化；自身免疫介导的肌肉骨骼和结缔组织疾病；神经肌肉变性疾病，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、多发性硬化(multiplesclerosis，MS)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、视神经脊髓炎和大、中、小型血管川崎病(large,middle size,small vessel Kawasaki)和过敏性血管炎(Henoch Schonlein vasculitis)；冷温凝集素病；自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehemolytic anemia，AIHA)；免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenicpurpura，ITP)；I型糖尿病；桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)；格雷夫斯病(Graves’disease)；格雷夫斯眼病；肾上腺炎；垂体炎；寻常性天疱疮；艾迪生病(Addison’sdisease)；强直性脊柱炎；白塞综合征(Behcet’s syndrome)；乳糜泻；古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)；重症肌无力；结节病；硬皮病；原发性硬化性胆管炎、获得性大疱性表皮松解和大疱性类天疱疮。
本发明上下文中的感染性疾病优选是与根据本发明使用的产品所针对的抗原相关的感染性疾病。这样的感染性疾病可以是细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染或其他感染。可用如上定义的根据本发明使用的产品治疗的感染性疾病的一些实例可包括但不限于：疟疾；弓形虫病；杰氏肺囊虫类鼻疽(pneumocystis jirovecii melioidosis)；志贺菌病(shigellosis)；李斯特菌(listeria)；由环孢子虫(Cyclospora)或麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)引起的疾病；结核病；以及免疫受损个体(例如HIV阳性个体、接受免疫抑制治疗的个体或患有先天性缺陷例如囊性纤维化或良性增殖性疾病(例如molahydatidosa或子宫内膜异位症)的个体)中的感染预防。
如本文所述的根据本发明使用的产品可用于制备如本文所述的药物。如本文所述的根据本发明使用的产品优选用于治疗方法，其中使用的产品以治疗有效量施用于对象，优选施用于有此需要的对象。因此，替代地，或与任何另外的实施方案组合，在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明使用的产品在制备用于治疗癌症、自身免疫病或感染性疾病，特别是用于治疗癌症的药物中的用途。对于待根据本发明治疗的说明性、非限制性癌症或其他疾病：参见上文。
替代地，或与任何另外的实施方案组合，在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症、自身免疫病或感染性疾病，特别是癌症的方法，该方法包括向需要所述治疗的对象施用治疗有效量的根据本发明使用的产品。对于待根据本发明治疗的说明性、非限制性癌症或其他疾病：参见上文。
根据本发明使用的产品用于施用于对象。根据本发明使用的产品可用于上述的通过将有效量的组合物施用于有此需要的对象的治疗方法中。本文使用的术语“对象”是指所有归类为哺乳动物的动物，并且包括但不限于灵长类和人。对象优选人。表述“治疗有效量”意指足以引起期望的响应或改善症状或体征的量。用于特定对象的治疗有效量可根据多种因素而变化，所述多种因素例如所治疗的病症、对象的整体健康状况、施用的方法、途径和剂量以及副作用的严重程度。
组合使用
在另一些实施方案中，本发明提供了根据本发明使用的产品，其中该使用与一种或更多种另外的治疗剂组合。根据本发明使用的产品可与一种或更多种另外的治疗剂同时或顺序使用。
合适的化学治疗剂包括烷化剂，例如氮芥、羟基脲、亚硝基脲、四嗪(例如替莫唑胺)和氮丙啶(例如丝裂霉素)；干扰DNA损伤应答的药物，例如PARP抑制剂、ATR和ATM抑制剂、CHK1和CHK2抑制剂、DNA-PK抑制剂和WEE1抑制剂；抗代谢物，例如抗叶酸剂(例如培美曲塞)、氟嘧啶(例如吉西他滨)、脱氧核苷类似物和硫嘌呤；抗微管剂，例如长春花生物碱和紫杉烷；拓扑异构酶I和II抑制剂；细胞毒性抗生素，例如蒽环素和博来霉素；低甲基化剂，例如地西他滨和阿扎胞苷；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；全反式视黄酸；和三氧化二砷。合适的放射性治疗剂包括放射性同位素，例如131I-间碘苄胍(MIBG)、作为磷酸钠的32P、223Ra氯化物、89Sr氯化物和153Sm二胺四亚甲基膦酸盐/酯(EDTMP)。待用作激素治疗剂的合适药剂包括激素合成抑制剂，例如芳香酶抑制剂和GnRH类似物；激素受体拮抗剂，例如选择性雌激素受体调节剂(例如他莫昔芬(tamoxifen)和氟维司群(fulvestrant))和抗雄激素药，例如比卡鲁胺(bicalutamide)、恩杂鲁胺(enzalutamide)和氟他胺(flutamide)；CYP17A1抑制剂，例如阿比特龙(abiraterone)；和生长抑素类似物。
靶向治疗剂是干扰参与肿瘤发生和增殖的特定蛋白质的治疗剂，并且其可以是小分子药物；蛋白质，例如治疗性抗体；肽和肽衍生物；或蛋白质-小分子混合物(hybrid)，例如ADC。靶向小分子药物的一些实例包括TLR配体，mTor抑制剂，例如依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)和雷帕霉素(rapamycin)；激酶抑制剂，例如伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)和尼罗替尼(nilotinib)；VEGF抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)和瑞戈非尼(regorafenib)；EGFR/HER2抑制剂，例如吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)和埃罗替尼(erlotinib)；和CDK4/6抑制剂，例如帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)和玻玛西尼(abemaciclib)。肽或肽衍生物靶向治疗剂的一些实例包括蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米(bortezomib)和卡非佐米(carfilzomib)。
合适的抗炎药物包括D-青霉胺、硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤、环孢素、抗TNF生物制剂(例如英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)或(赛妥珠单抗(certolizumabpegol))、来氟米特(lenflunomide)、阿巴西普(abatacept)、托珠单抗(tocilizumab)、阿那白滞素(anakinra)、优特克单抗(ustekinumab)、利妥昔单抗、达雷木单抗(daratumumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、苏金单抗(secukinumab)、阿普斯特(apremilast)、acetretin和JAK抑制剂(例如托法替尼(tofacitinib)、巴瑞克替尼(baricitinib)或乌帕替尼(upadacitinib))。
免疫治疗剂包括诱导、增强或抑制免疫应答的物质，例如细胞因子(IL-2和IFN-α)；免疫调节酰亚胺药物，例如沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)或咪喹莫特(imiquimod)；治疗性癌症疫苗，例如talimogenelaherparepvec；基于细胞的免疫治疗剂，例如树突细胞疫苗、过继性T细胞或嵌合抗原受体修饰的T细胞；以及当与细胞上的膜结合配体结合时可通过其Fc区触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)或补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)的治疗性(双特异性)抗体或其他ADC。
在本发明的上下文中，治疗优选地是预防、逆转、治愈、改善和/或延迟癌症、自身免疫病或感染性疾病。这可意味着癌症、自身免疫病或感染性疾病的至少一种症状的严重程度已经降低，和/或至少与癌症、自身免疫病或感染性疾病相关的参数已经改善。
在本发明的上下文中，对象可存活和/或可被认为没有疾病。或者，疾病或病症可能已经停止或延迟。在本发明的上下文中，生活质量的改善和所观察到的疼痛缓解可意指对象可能需要比治疗开始时更少的疼痛缓解药物。在这种情况下，“更少”可意指少5％、少10％、少20％、少30％、少40％、少50％、少60％、少70％、少80％、少90％。对象可能不再需要任何疼痛缓解药物。与所述对象治疗开始时的生活质量和所观察到的疼痛缓解相比，治疗至少一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后，在对象中可观察、检测或评估到生活质量和所观察到的疼痛缓解的这种改善。
一般定义
根据本发明的缀合物和接头-药物化合物可包含一个或更多个手性中心和/或双键，并因此可作为立体异构体存在，例如双键异构体(即，几何异构体)、区域异构体、对映体或非对映体。因此，本文中描述的化学结构涵盖了所示或所鉴定化合物的所有可能的对映体和立体异构体，包括立体异构纯形式(例如，几何纯的、对映体纯的或非对映体纯的)以及对映体和立体异构混合物。可使用本领域技术人员公知的分离技术或手性合成技术将对映体和立体异构体混合物拆分成它们的组分对映体或立体异构体。化合物也可以以数种互变异构形式存在，包括烯醇形式、酮形式及其混合物。因此，本文中描述的化学结构涵盖了所示或所鉴定化合物的所有可能的互变异构形式。还应理解，本领域技术人员可通过物理和/或化学方法分离一些异构体形式，例如非对映体、对映体和几何异构体。当技术人员理解结构式或化学名称具有手性中心，但没有指出手性时，对于每个手性中心，单独提及外消旋混合物、纯R对映体和纯S对映体中的全部三种。当化合物的结构被描述为特定的对映体时，应当理解本申请的发明不限于该特定的对映体。当说两个部分一起形成键时，这意味着这些部分不作为原子存在，并且通过替换电子键来满足化合价。所有这些在本领域中都是已知的。
本说明书和权利要求书中公开的化合物还可作为外位和内位区域异构体存在。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中对任何化合物的描述都意指包括化合物的单独外位和单独内位区域异构体二者，以及它们的混合物。此外，本说明书和权利要求书中公开的化合物可以以顺式和反式异构体存在。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中对任何化合物的描述都意指包括化合物的单独顺式和单独反式异构体二者，以及它们的混合物。例如，当化合物的结构被描述为顺式异构体时，应当理解，相应的反式异构体或顺式和反式异构体的混合物不排除在本申请发明之外。
在本文件及其权利要求书中，动词“包含/包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，意指包括在该词之后的项目，但是不排除未具体提及的项目。另外，除非上下文明确要求存在一个且仅一个要素，否则通过不定冠词对要素的提及不排除存在多于一个要素的可能性。因此，未用数量词限定的名词通常意指“至少一个/种”。
当与数值(例如，约10)一起使用时，词语“约”或“大约”优选意指该值可以是该值的大或少1％的给定值。
每当在本发明的上下文中讨论物质的参数时，假设除非另有说明，否则该参数是在生理条件下确定、测量或显示的。生理条件是本领域技术人员已知的，并且包括水性溶剂体系、大气压、6至8的pH值、室温(room temperature，RT)至约37℃(约20℃至约40℃)的温度以及缓冲盐或其他组分的合适浓度。应当理解，电荷通常与平衡有关。被称为携带或带有电荷的部分是以如下状态存在的部分：在所述状态下，它携带或带有这样的电荷的次数比它不携带或带有这样的电荷的次数多。因此，如本领域技术人员所理解的，在本公开内容中所示的带电荷的原子在特定条件下可以不带电，并且中性部分在特定条件下可以带电。
本说明书中引用的所有专利和文献参考均通过引用在此整体并入。
提供以下实施例仅用于举例说明的目的，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
一般性操作
溶剂：
使用的所有溶剂均是来自不同供应商的试剂级或HPLC级。
NMR谱：
NMR谱在Bruker AVANCE400(对于1H为400MHz；对于13C为101MHz)上记录。
化学位移：
化学位移相对于作为内标的四甲基硅烷或残留未氘化溶剂以ppm报告。
产物的UPLC表征：
在具有Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(颗粒尺寸1.7μm，2.1×50mm)的WatersUPLC-MS(配备有SQD 2检测器)上，以0.4mL/分钟的流量对产物进行表征。(MeCN/水×0.1％甲酸)。
HPLC纯化：
使用配备有Waters SunFire Prep C18 OBD 5μm柱(19×150mm)的ShimadzuProminence 20AP系统，以17ml/分钟的流量通过制备型HPLC进行纯化。
一般性操作XXA：用氨基甲酸氯甲酯进行醇的烷基化。
在N2下，将多聚甲醛(3当量)和三甲基氯硅烷(trimethylsilylchloride，TMSCl)(2.75当量)顺序添加至氨基甲酸酯(2.75当量)在二氯甲烷(dichloromethane，DCM)(0.45M氨基甲酸酯)中的RT混悬液。将混合物搅拌1小时，并随后浓缩，与DCM共蒸发，并在高真空下干燥2分钟。将淡黄色油状物溶解在DCM(0.6M氨基甲酸酯)中。
然后将该溶液的等分试样(通常为1.5当量氨基甲酸氯甲酯)添加醇(1当量)在DCM(0.24M)中的冷却(0℃)混合物。添加N,N-二异丙基乙胺(N,N-Diisopropylethylamine，DIPEA，3当量)并在搅拌5分钟之后，将反应物温热至RT。在30至60分钟之后，使用UPLC-MS评估转化率，并且如果不完全，添加更多的储备溶液。随后每次添加氨基甲酸氯甲酯时，添加化学计量量的DIPEA以保持碱性pH。一旦观察到完全转化，用MeOH淬灭反应，按照指示进行浓缩和纯化。
一般性操作XXB：从膦酸二酯制备膦酸二氯化物
在N2气氛下，将三甲基溴硅烷(trimethylsilylbromide，TMSBr，10当量)在5分钟内添加至膦酸二酯(1当量)在DCM(0.2M)中的冷却(0℃)溶液。在30分钟之后，移除冰浴，并将反应物在RT下搅拌3.5小时。使用N2吹扫的旋转蒸发器浓缩溶液，并在N2气氛下使粗制品溶于(take up)DCM(0.2M)中，并冷却至0℃。添加二甲基甲酰胺(DMF，2滴)随后逐滴添加草酰氯(3当量)。将冷却浴在1小时内温热至RT，并持续搅拌16小时。将反应物在N2气氛下浓缩并与DCM(3×10mL)共蒸发以得到粗的膦酰二氯，其不经进一步纯化即可使用。
一般性操作XXC：在SeO2下进行烯丙基氧化
步骤1：在RT下，将SeO2(0.7当量)和水杨酸(0.1当量)溶解在DCM(0.9M SeO2)中，并添加t-BuOOH(4.5当量)。在剧烈搅拌15分钟之后，添加在DCM(0.82M)中的烯烃(1当量)。将所得反应混合物剧烈搅拌，直至UPLC-MS分析表明烯烃完全消耗(通常为16至48小时)。使反应混合物冷却至0℃，并随后小心地用饱和NaHCO3水溶液(使用10mL/1mL tBuOOH)淬灭。用水稀释混合物以帮助溶解任何沉淀的盐，并将产物用DCM(或EtOAc，其用于更具极性的化合物)萃取3至6次，直至UPLC-MS分析显示水相中没有更多的产物。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到烯丙醇和相应醛产物的混合物。
步骤2：将粗制物溶解在EtOAc(0.2M)中并添加AcOH(5当量)，随后添加NaBH(OAc)3(5当量)。将反应混合物在50℃下搅拌，直至UPLC-MS分析表明醛完全消耗(通常为1至3小时)。之后，使反应混合物冷却至RT，并添加水(1至5体积)。将水层用EtOAc萃取(2至6次)，直至UPLC-MS分析表明水相中没有更多的产物。将合并的有机层用小体积的饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。按照指示进行纯化。
实施例1：氨基甲酸酯(XD5)的合成。
(S)-2-叠氮基-N-(4-(羟甲基)苯基)丙酰胺基(XD7)
将(S)-2-叠氮基丙酸(6.73g，58.5mmol)和(4-氨基苯基)甲醇(10.0g,82mmol)溶解在DCM(228mL)和MeOH(75mL)中。在冷却至0℃之后，添加N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ，28.9g，117mmol)，并将混合物在RT下搅拌过夜并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至40％ EtOAc)进行纯化，得到作为黄色液体的叠氮化物XD7(9.3g，72％)。对于C10H13N4O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：221.10，实测值：221.11。
(S)-4-(2-叠氮基丙酰胺基)苄基氨基甲酸乙酯(XD5)
在0℃下，向XD7(3.8g，17.2mmol)在四氢呋喃(tetrahydrofuran，THF，100mL)中的溶液添加二月桂酸二丁基锡(2.57ml，4.31mmol)和异氰酸乙酯(2.05mL，25.9mmol)，并且将混合物在RT下搅拌5小时。将反应混合物在硅胶上浓缩并通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至50％乙醚，随后在庚烷中的0至100％ EtOAc)纯化，以得到作为白色固体的叠氮化物XD5(4.25g，85％)。
对于C13H17N5NaO3 +[M+Na]+，MS(ESI+)计算值：314.1，实测值：314.1。
实施例2：从pAg(前药)部分XD1合成接头-药物化合物XD4。
苄基(((E)-5-(((((4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基)氧)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XD2)
使XD1(100mg，0.240mmol，如Kadri et al.,J.Med.Chem.2020,63,11258-11270中所述制备)与氨基甲酸酯XD5根据一般性操作XXA进行反应。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至5％ MeOH)纯化，得到作为为无色油状物的XD2(134mg，78％)。对于C36H46N6O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：721.3，实测值：721.6。
苄基(((E)-5-(((((4-((S)-2-氨基丙酰胺基)苄基)氧)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XD3)
将叠氮化物XD2(134mg，0.186mmol)在THF/水(2mL，9:1)中的溶液用N2吹扫15分钟。在RT下添加三丁基膦(0.116ml，0.465mmol)，并将混合物搅拌4小时。将反应物浓缩，并通过与MeCN(2×7mL)和甲苯(1×7mL)共蒸发除去残留的水。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至20％ MeOH)纯化粗制物，得到胺XD3(97mg，75％)。对于C36H48N4O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：695.3，实测值：695.5。
苄基(((E)-5-(((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XD4)。
将N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC；0.013mL，0.085mmol)添加至(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-L-缬氨酸(26.5mg，0.085mmol，如WO2013122823中所述制备)、DMAP(1.0mg,8.5μmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(13.9mg，0.085mmol)在THF(0.8ml)中的RT混悬液。在RT下在3小时之后，将反应混合物浓缩并混悬在DCM(约1mL)中。然后将橙/红色上清液添加至XD3(41mg，0.059mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液，并在RT下搅拌75分钟。在浓缩之后，通过RP-HPLC(水/MeCN，梯度：40％至90％，未添加改性剂)纯化粗制物。将产物级分进行冻干，得到XD4(10.9mg，13％)。对于C51H68N6O12P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：987.5，实测值：987.7。
如实施例22中所述，将接头-药物化合物XD4与抗体缀合以产生缀合物ADC-XD4-r和ADC-XD4-i。如实施例23所述，测试二者对γδT细胞的作用。
实施例3：接头-药物化合物XD13的合成
4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基P-(丁-3-烯-1-基)-N-(环丁基甲基)膦酰胺酸酯(XD9)
在第一步中，在-78℃下，将丁-3-烯-1-基膦酰二氯(XD8，338mg，1.95mmol，如Kadri et al.J.Med.Chem.2020,63,11258-11270中所述制备)逐滴添加至环丁基甲胺(166mg，1.95mmol)和Et3N(0.544ml，3.90mmol)在DCM(3.8ml)中的溶液。在5分钟之后，移除冷却浴，并持续搅拌45分钟。
在单独的烧瓶中，将醇XD7(429mg，1.95mmol)和Et3N(0.544ml，3.90mmol)在N2下溶解在DCM(3.8ml)中，并将混合物冷却至-78℃。然后将在第一步中制备的溶液直接过滤到包含醇XD7的溶液中。使用DCM(2mL)完成转移。在5分钟之后，将反应物温热至RT并搅拌5小时。将反应用1-甲基哌嗪(0.1mL)淬灭。在浓缩之后将粗制物溶于EtOAc(50mL)中并用HCl水溶液(0.1M，30mL)洗涤。将水层用EtOAc(15mL)萃取并将合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至80％ EtOAc)纯化，得到作为无色油状物的叠氮化物XD9(363mg，46％)。
对于C19H29N5O3P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：406.2，实测值：406.4。4-((S)-2-氨基丙酰胺基)苄基P-(丁-3-烯-1-基)-N-(环丁基甲基)膦酰胺酸酯(XD10)
用N2吹扫叠氮化物XD9(244mg，0.602mmol)在THF(1.8ml)/水(0.2ml)中的溶液，持续15分钟。在RT下添加三丁基膦(0.376ml，1.51mmol)，并将混合物搅拌22小时。将反应物浓缩、与MeCN(2×7mL)和甲苯(1×7mL)共蒸发，并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至20％MeOH)纯化粗制物，以得到胺XD10(182mg，80％)。
对于C19H31N3O3P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：380.2，实测值：380.3。(9H-芴-9-基)甲基((2S)-1-(((2S)-1-((4-(((丁-3-烯-1-基((环丁基甲基)氨基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(XD11)
在RT下，将Fmoc-Val-OSu(220mg，0.50mmol)添加至胺XD10(182mg，0.48mmol)和DIPEA(0.079ml，0.46mmol)在THF(4.8ml)中的溶液。在70分钟之后，形成凝胶样混合物。添加破坏凝胶的乙酸乙酯(4.0ml)并持续搅拌4小时。将反应混合物用EtOAc/异丙醇(9:1)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液和盐水进行洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至10％ MeOH)纯化，得到酰胺XD11(279mg，83％)。
对于C39H50N4O6P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：701.4，实测值：701.5。(9H-芴-9-基)甲基((2S)-1-(((2S)-1-((4-(((((环丁基甲基)氨基)((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(XD12)
在RT下，在N2下，将酰胺XD11(100mg，0.143mmol)、2-甲基丙-2-烯-1-醇(0.126ml，1.50mmol)和1,4-苯醌(1.5mg，0.014mmol)混悬于1,2-二氯乙烷(1.2ml)中。在RT下，添加Hoveyda-Grubbs第二代(Hoveyda-Grubbs 2nd gen.)催化剂(4.5mg，7.1μmol，CAS：301224-40-8)并将混悬液加热至45℃。在4小时之后，添加另外的Hoveyda-Grubbs第二代催化剂(4.5mg，7.1μmol)，并在45℃下持续搅拌过夜。添加更多的1,4-苯醌(2.3mg，0.021mmol)和Hoveyda-Grubbs第二代催化剂(8.9mg，0.014mmol)，并继续反应5小时。将反应物冷却至RT，添加1,4-双(3-异氰基丙基)哌嗪(SnatchCat，12.6mg，0.057mmol)，并将混合物搅拌30分钟。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至10％ MeOH)纯化，得到XD12(39mg，掺杂有不期望的Z-异构体以及来源于在交叉复分解之前在sm至内部位置中的双键异构化的杂质(m/z731.6))。该物质在这一阶段不经任何进一步纯化即可用于下一步。对于C41H54N4O7P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：745.4，实测值：745.6。
4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基N-(环丁基甲基)-P-((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰胺酸酯(XD13)
在RT下，将二肽XD12(39mg，0.052mmol)溶解在DMF(1ml)中。添加哌啶(0.39ml，3.9mmol)，并将混合物搅拌30分钟。在浓缩之后，添加乙醚(8mL)并将混合物在RT下搅拌15分钟。产物没有很好地溶解并且粘在烧瓶上。通过移液管除去乙醚，并将烧瓶用乙醚(1×)冲洗。将剩余的油状物在真空下干燥，以得到无色的油状物(24.5mg)。
在RT下，将该物质溶解在DMF(0.5ml)中，并顺序添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(14.5mg，0.047mmol)和DIPEA(0.025ml，0.141mmol)。将反应混合物在RT下搅拌3小时。在浓缩之后，通过RP-HPLC(水/MeCN，梯度：70:30至50:50，未添加改性剂)纯化粗制物，以得到纯的XD13(16.2mg，43％，2个步骤)。
对于C36H55N5O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：716.4，实测值：716.6。
如实施例22中所述，将接头-药物化合物XD13与抗体缀合，以产生缀合物ADC-XD13-r和ADC-XD13-i。如实施例23中所述，测试二者对γδT细胞的作用。
实施例4：羧酸XT2的合成
((2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)羰基)-L-缬氨酸(XT2)
在0℃下，向L-缬氨酸(167mg，1.4mmol)和碳酸酯XT1(500mg，1.4mmol，如Elgersmaet al.,Mol.Pharm.,2015,12,1813-1835所述制备)在DMF(5ml)中的溶液添加DIPEA(0.249ml,1.40mmol)，并将所得混合物在RT下搅拌10天。将混合物浓缩，溶于EtOAc(25ml)并用HCl水溶液(1M，50ml)洗涤。将水层用EtOAc(25ml)萃取，并将合并的有机层干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至40％ MeOH)纯化，得到作为澄清油状物的酸XT2(250mg，53％)。对于C14H21N2O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：329.1，实测值：329.2。
实施例5：接头-(前)药物化合物XC4的合成
(S,E)-(((5-(((((4-(2-叠氮基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2,2-二甲基丙酸酯(XC2)
使醇XC1(70mg，0.171mmol，如Wiemer,Chem.Biol.2014,21,945-954所述制备)与氨基甲酸酯XD5根据实施例1中所述的一般性操作XXA进行反应。一旦反应完成，将一半溶剂体积通过旋转蒸发除去。然后将粗制混合物直接装载在硅胶柱上，并通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至100％ EtOAc)纯化。获得作为不纯的无色油状物的叠氮化物XC2(140mg，定量)，其不经任何进一步纯化即可用于下一步。对于C32H51N5O11P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：712.3，实测值：712.5。
(S,E)-(((5-(((((4-(2-氨基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2,2-二甲基丙酸酯)(XC3)
在RT下，向叠氮化物XC2(70mg，0.098mmol)在THF(1.85mL)/水(0.093mL)中的溶液添加三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl，85mg，0.295mmol)，并将所得混合物搅拌18小时。将混悬液经脱脂棉过滤，用THF冲洗并将滤液在硅胶上浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至10％ MeOH)纯化，得到作为无色油状物的胺XC3(15mg，22％)。
对于C32H53N3O11P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：686.3，实测值：686.7。((((E)-5-(((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7-二氧代-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄基)氧基)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)双(氧基))双(亚甲基)双(2,2-二甲基丙酸酯)(XC4)
向胺XC3(15mg，0.022mmol)添加酸XT2(7.2mg，0.022mmol)在DMF(0.500mL)中的溶液。将混合物在冰浴中冷却，顺序添加1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HATU，10.0mg，0.026mmol)和DIPEA(7.6μl，0.044mmol)，并搅拌所得混合物，同时将其逐渐温热至RT。在RT下搅拌1.5小时之后，将反应物在真空中浓缩，并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至8％ MeOH)纯化粗制物，以得到掺杂有残余物XT2的XC4(18mg)。将该产物溶于EtOAc，并随后用饱和NaHCO3水溶液/水(1:1)、水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至8％ MeOH)进一步纯化，以得到作为无色油状物的XC4(10mg，45％)。
对于C46H71N5O17P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：996.5，实测值：996.7。
如实施例22中所述，将接头-药物化合物XC4与抗体缀合以产生缀合物ADC-XC4-r和ADC-XC4-i。如实施例23中所述，测试二者对γδT细胞的作用。
实施例6：接头-药物化合物XD18的制备
二甲基(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD15)
在-78℃下，向二异丙胺(13.0ml，92.7mmol)在THF(280ml)中的搅拌溶液添加正丁基锂(在己烷中1.6M，55.4ml,88.6mmol)。在-78℃下，将所得溶液搅拌20分钟。接下来，通过注射器缓慢添加甲基膦酸二甲酯(8.73ml，80.6mmol)，并将混合物搅拌1小时。通过注射器缓慢添加异戊二烯基溴(11.6ml，101mmol)，并随后将溶液温热至RT过夜。将反应物在冰上冷却，用饱和NH4Cl(水性)水溶液淬灭并用Et2O(3x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在乙醚中的0至3％ MeOH)纯化。将产物级分进行浓缩并与DCM(3×)共蒸发以除去痕量的甲醇，得到作为黄色液体的膦酸二酯XD15(12.88g，83％)。
对于C8H18O3P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：193.1，实测值：193.1。
(9H-芴-9-基)甲基((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-氰基乙氧基)(4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)-氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(XD16)
步骤1：向在DCM(1.8mL)中的(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰二氯(97.0mg，0.485mmol，根据一般性操作XXB从膦酸二酯XD15制备)添加5-(乙硫基)-1H-四唑(6.31mg，0.048mmol)。将溶液冷却至-78℃，并添加3-羟基丙腈(0.033ml，0.485mmol)和吡啶(0.047ml，0.582mmol)。在-78℃下搅拌30分钟之后，将反应物温热至RT并搅拌2.5小时。
步骤2：在单独的烧瓶中，将Fmoc-Val-Ala-PAB(250mg，0.485mmol)溶于吡啶(1.0ml)。在冷却至0℃之后，将步骤1中制备的在DCM中的膦酰氯溶液经插管逐滴添加至吡啶溶液中。将反应物在0℃下搅拌30分钟，并随后在RT下搅拌1小时。UPLC-MS分析表明反应在50％转化率时停止。将反应物在-30℃下储存过夜，并随后以相同的量重复步骤1，不同之处在于在RT下搅拌过夜，而不是在RT下搅拌2.5小时。第二天，在0℃下，将所得溶液添加至储存过夜的反应混合物。在0℃下搅拌30分钟和在RT下搅拌1小时之后，观察到完全转化。将该溶液浓缩并将粗制物干燥装载在硅胶上，并且通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至25％丙酮)纯化，以得到作为不纯的白色固体的混合的膦酸二酯XD16(127mg，37％)。对于C39H48N4O7P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：715.3，实测值：715.5。
(9H-芴-9-基)甲基((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-氰基乙氧基)((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(XD17)
在RT下，将SeO2(71mg，0.64mmol)和2-羟基苯甲酸(17mg，0.12mmol)溶解在DCM(0.7ml)中并添加t-BuOOH(水中70％，0.66ml，4.81mmol)。在剧烈搅拌15分钟之后，将溶液通过移液管添加至XD16(127mg，0.178mmol)在DCM(1.1ml)中的混悬液。将所得混合物剧烈搅拌ON。将混合物冷却至0℃，并用饱和NaHCO3水溶液缓慢淬灭直至泡腾停止。添加水以溶解沉淀的盐。将产物用DCM萃取(3×)，并将合并的有机层经Na2SO4干燥，并在硅胶上浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至5％ MeOH)纯化，得到作为白色固体的醇XD17(45mg，35％)，所述醇XD17对于接下来的步骤足够纯。对于C39H48N4O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：731.3，实测值：731.6。
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙-氨基)苄基氢((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD18)
步骤1：将在THF(1.0mL)中的膦酸酯XD17(45mg，0.062mmol)用MeOH(9.0mL)稀释。然后在RT下添加在甲醇中的氨(Ammonia)(7M，2.35mL)，并将混合物在RT下搅拌3小时。接下来，在RT下添加NaOH水溶液(2M，1.15mL)并将混合物搅拌15分钟。将反应物在冰上冷却，并添加AcOH水溶液(1M，23.5mL)。形成了混浊的溶液，然后经注射器过滤器进行过滤。将滤液在真空下浓缩，并溶于二烷/水(1:1，1mL)中。将溶液冻干以得到200mg的白色固体(产物和盐的混合物)。
步骤2：在RT下，将产物溶于DMF(1mL)中，添加DIPEA(0.049mL，0.281mmol)和6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(70.4mg，0.228mmol)，并将混合物搅拌30分钟。将过量的碱在0℃用AcOH水溶液(1M，0.52mL)淬灭，并将混合物浓缩。将粗制物通过制备型RP-HPLC(水×0.1％ TFA/MeCN×0.1％2,2,2-三氟乙酸(TFA)/MeCN，梯度：90:10至45:55)纯化。将MeCN通过旋转蒸发除去，并将混合物水溶液冻干，以得到XD18(26.5mg，89％，两个步骤)。
对于C31H46N4O9P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：649.3，实测值：649.6。
实施例7：接头-药物化合物XC9的合成
(S)-4-(2-叠氮基丙酰胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(XC5)
在0℃下，向醇XD7(1.60g，7.27mmol)在THF(20mL)中的溶液添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(4.42g，14.5mmol)和DIPEA(1.90mL，10.9mmol)。将所得混合物在RT下搅拌18小时，并随后在真空中浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至5％ EtOAc)纯化，得到作为淡黄色油状物的碳酸酯XC5(1.97g，70％)。对于C17H16N5O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：386.1，实测值：386.2。
(S)-4-(2-叠氮基丙酰胺基)苄基(2,5,8,11,14,17,20-七氧杂二十二烷-22-基)氨基甲酸酯(XC6)
向碳酸酯XC5(624mg，1.62mmol)在THF(10.8mL)中的冷却(0℃)溶液添加2,5,8,11,14,17,20-七氧杂二十二烷-22-胺(550mg，1.62mmol)和DIPEA(0.340mL，1.94mmol)，并将所得亮黄色溶液搅拌18小时，同时逐渐温热至RT。在浓缩之后，通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至6％ MeOH)纯化粗制物，得到作为淡黄色油状物的氨基甲酸酯XC6(875mg，92％)。对于C26H44N5O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：586.3，实测值：586.4。
苄基(((E)-23-(((4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)-27-甲基-2,5,8,11,14,17,20,25-八氧杂-23-氮杂三十烷-27-烯-30-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XC7)
使醇XD1(100mg，0.240mmol，如Kadri,H.et al.J.Med.Chem.2020,63,11258-11270中所述制备)与氨基甲酸酯XC6根据一般性操作XXA反应。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至11％ MeOH)纯化，得到作为无色油状物的不纯的叠氮化物XC7(313mg)，其不经任何进一步纯化即可用于下一步。对于C49H71N6NaO15P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：1037.5，实测值：1037.7。
苄基(((E)-23-(((4-((S)-2-氨基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)-27-甲基-2,5,8,11,14,17,20,25-八氧杂-23-氮杂三十烷-27-烯-30-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XC8)
将叠氮化物XC7(121mg，0.119mmol)在THF(1.14mL)/水(0.13mL)中的溶液用N2吹扫15分钟。在RT下添加三丁基膦(0.074ml，0.298mmol)并将混合物在RT下搅拌5.5小时，然后在真空下浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至15％ MeOH)纯化粗制物，得到作为黄色油状物的胺XC8(62mg，52％)。对于C49H74N4O15P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：989.5，实测值：989.8。
苄基(((E)-23-(((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)-27-甲基-2,5,8,11,14,17,20,25-八氧杂-23-氮杂三十烷-27-烯-30-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XC9)
向胺XC8(62mg，0.063mmol)和(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-L-缬氨酸(19.5mg，0.063mmol，如WO2013122823中所述制备)在DMF(1mL)中的冷却(0℃)溶液添加HATU(28.6mg，0.075mmol)和DIPEA(0.022mL，0.125mmol)。将所得黄色混合物在RT下搅拌1.5小时，然后在真空中浓缩。将剩余物溶解在EtOAc中并用饱和的NaHCO3/水(1:1)水溶液、水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至10％MeOH)纯化粗制物，得到无色油状物。将该油状物溶于MeCN/MilliQ(1:1)，并通过制备型RP-HPLC(水/MeCN，梯度：60:40至10:90，未使用改性剂)纯化。将产物级分合并，并通过旋转蒸发除去MeCN。然后将水性混合物冻干，以产生作为无色油状物的马来酰亚胺XC9(25mg，31％)。对于C64H94N6O19P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：1281.6，实测值：1282.0。
实施例8：接头-药物化合物XC13的合成
(E)-((5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)(4-碘苯氧基)磷酰基)丙氨酸酯(XS4)的制备
苄基((4-碘苯氧基)(4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)丙氨酸酯(XS3)
在-78℃下，向在甲苯(27mL)中的(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰二氯(837mg，4.16mmol，根据一般性操作XXB从膦酸二酯XD15(1.00g，5.20mmol)制备)逐滴添加4-碘苯酚(1.83g，8.33mmol)和DIPEA(1.45mL，8.33mmol)在甲苯(27mL)中的溶液。将反应混合物在-78℃下搅拌30分钟。添加苄基L-丙氨酸盐酸盐(1.89g，8.74mmol)和DIPEA(3.05mL，17.5mmol)，并使反应混合物达到RT并将其搅拌2小时。将反应混合物浓缩并通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至50％ EtOAc)纯化粗制物，以产生作为黄色固体的XS3(0.490g，22％，约3:2非对映体混合物)。
对于C22H28INO4P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：528.08，实测值：528.26。苄基(E)-((5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)(4-碘苯氧基)磷酰基)丙氨酸酯(XS4)
根据一般性操作XXC进行烯烃XS3(0.434g，0.823mmol)的烯丙基氧化。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的40至100％ EtOAc)纯化粗制物，以产生作为无色油状物的醇XS4(0.254g，57％，约3:2非对映体混合物)。
对于C22H28INO5P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：544.07，实测值：544.32。
根据以下反应方案从XS4合成接头-药物化合物XC13。
苄基((4-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-25-炔-26-基)苯氧基)((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XC10)
向XS4(50mg，0.092mmol)、2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-25-炔(34.8mg，0.092mmol)、双(三苯基膦基)氯化钯(3.23mg，4.60μmol)和Cu(I)I(1.753mg，9.20μmol)添加脱气的Et3N(0.2mL，1.44mmol)。将混合物在RT下搅拌4小时。在浓缩之后，将粗制物重新溶解在DCM中并再次浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至11％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为褐色油状物的醇XC10(67mg，83％)。对于C40H61NO13P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：794.4，实测值：794.6。苄基((4-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-25-炔-26-基)苯氧基)((E)-5-(((((4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XC11)
使醇XC10(67mg，0.076mmol)与氨基甲酸酯XD5根据一般性操作XXA反应。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至8％ MeOH)纯化，以得到作为浅褐色油状物的叠氮化物XC11(54mg，65％)。对于C54H78N6O16P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：1097.5，实测值：1097.8。
苄基((4-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-25-炔-26-基)苯氧基)((E)-5-(((((4-((S)-2-氨基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XC12)
将叠氮化物XC11(54mg，0.049mmol)在THF(0.473mL)/水(0.053mL)中的溶液用N2吹扫15分钟。在RT下，添加三丁基膦(0.031ml，0.123mmol)并将混合物在RT下搅拌5.5小时，然后在真空下浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至15％ MeOH)纯化，得到作为淡黄色油状物的胺XC12(42mg，80％)。对于C54H80N4O16P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：1071.5，实测值：1071.9。
苄基((4-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧杂二十六烷-25-炔-26-基)苯氧基)((E)-5-(((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XC13)
向胺XC12(42mg，0.039mmol)和(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-L-缬氨酸(12.2mg，0.039mmol，如WO2013122823中所述制备)在DMF(1mL)中的冷却(0℃)溶液添加HATU(17.9mg，0.047mmol)和DIPEA(0.014mL，0.078mmol)。将所得黄色混合物在RT下搅拌1.5小时，然后在真空中浓缩。将剩余物溶解在EtOAc中并用饱和的NaHCO3/水(1:1)水溶液、水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至10％MeOH)纯化粗制物，得到无色油状物。将该油状物通过制备型RP-HPLC(水/MeCN，梯度：60:40至10:90，未使用改性剂)纯化。将产物级分合并，并通过旋转蒸发除去MeCN。然后将水性混合物冻干，以产生作为白色固体的马来酰亚胺XC13(21mg，40％)。对于C69H100N6O20P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：1363.7，实测值：1364.1。
实施例9：接头-药物化合物XS2的合成
2,5-二氧代吡咯烷-1-基(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)甘氨酰基甘氨酰基-L-苯基丙氨酸酯(XD20)的制备
2,5-二氧代吡咯烷-1-基(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)甘氨酰基甘氨酰基-L-苯基丙氨酸酯(XD20)
在RT下，将N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC，459mg，2.222mmol)添加至XD19(1.05g，2.22mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(256mg，2.22mmol，如EP2907824中所述合成)在THF(40ml)中的混悬液。在搅拌3.5小时之后，将混合物过滤，并用DCM彻底洗涤剩余物。将滤液用EtOAc稀释并随后浓缩。将白色固体混悬在小体积的EtOAc中，并随后过滤，以得到作为白色固体的OSu-酯XD20(612mg，48％)。对于C27H32N5O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：570.2，实测值：570.4。
苄基(((E)-5-((2-((S)-2-(2-(2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)乙酰胺基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XS2)的制备
苄基(((E)-5-((2-氨基乙酰胺基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XS1)
步骤1：在N2下，将(2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)乙酸甲酯(0.152g，0.659mmol，如Brailsford et al.Tetrahedron,2018,74,1951-1956所述制备)和对甲苯磺酸吡啶(PPTS；10.6mg，0.042mmol)装入烧瓶。添加在甲苯(1.3mL)中的醇XD1(0.110g，0.264mmol，如Kadri et al.J.Med.Chem.2020,63,11258-11270中所述制备)，并将反应混合物在80℃下搅拌1小时。在冷却至RT之后，添加Et3N(4滴)并将反应混合物浓缩，并与DCM(1mL)共蒸发。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的20至100％ EtOAc)纯化粗制物，以产生作为非对映异构体的混合物的苄基(E)-((5-((2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基-)丙氨酸酯(0.120g，68％产率)。对于C29H39N3O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：588.25，实测值：588.42。
步骤2：用N2(3次真空/N2循环)吹扫10mL小瓶，并装入Pd(PPh3)4(4.2mg，0.0036mmol)。接下来，添加在DCM(1.80mL)中的Alloc保护的胺(0.120g，0.180mmol，在步骤1中制备)，随后添加PhSiH3(0.155mL，1.26mmol)。将反应混合物搅拌1小时。将反应混合物用DCM稀释并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的5至15％ MeOH)纯化，以产生作为黄色油状物的XS1(63.7mg，70％，约3:2非对映体混合物)。
对于C25H35N3O6P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：504.2，实测值：504.4。苄基(((E)-5-((2-((S)-2-(2-(2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)乙酰胺基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XS2)
向胺XS1(25.7mg，0.051mmol)在DMF(0.51mL)中的溶液添加OSu-酯XD20(31.7mg，0.056mmol)，随后添加DIPEA(0.027mL，0.153mmol)。将反应混合物在RT下搅拌60分钟。添加更多的OSu-酯XD20(5.81mg，10.2μmol)，并在搅拌40分钟之后，添加最后一部分的OSu-酯XD20(5.81mg，10.2μmol)，随后搅拌30分钟。将反应混合物浓缩，与甲苯(2mL)共蒸发并在真空中干燥。将粗制物溶解在DCM(5mL)中，经注射器过滤器过滤，并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至8％MeOH)纯化。将该产物通过制备型RP-HPLC(水/MeCN，梯度：70:30至45:55，未添加改性剂)进一步纯化。蒸发MeCN并随后冻干，得到XS2(14.8mg，30％，约3:2非对映体混合物)。
对于C48H61N7O12P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：958.4，实测值：958.8。
实施例10：接头-药物XS7的合成
(S)-4-(2-叠氮基丙酰胺基)苄基(2-(甲磺酰基)乙基)氨基甲酸酯(XS5)
步骤1：向XD7(1.14g，5.18mmol，如实施例1中所述制备)在THF(17mL)中的溶液添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(3.15g，10.4mmol)，随后添加DIPEA(1.36mL，7.76mmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物浓缩并且将粗制物在Et2O(20mL)中搅拌15分钟并过滤。将该过程重复两次并将滤液合并，并进行浓缩。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至50％ EtOAc)纯化，得到相应的碳酸酯(1.57g，79％)。对C17H16N5O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：386.1，实测值：386.2。
步骤2：在0℃下，将碳酸酯中间体(0.340g，0.882mmol)溶解在THF(4.4mL)中，并添加2-(甲磺酰基)乙-1-胺盐酸盐(0.148g，0.926mmol)和TEA(0.258mL，1.85mmol)。使混合物达到RT，并在搅拌3小时之后，将反应混合物浓缩，溶于EtOAc(30mL)中并用饱和NaHCO3水溶液(3×20mL)和盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至100％ EtOAc)纯化粗制物，以产生作为白色固体的氨基甲酸酯XS5(0.260g，80％)。
对于C14H19N5NaO5S+[M+Na]+，MS(ESI+)计算值：392.1，实测值：392.1。苄基(((E)-5-(((((4-((S)-2-氨基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XS6)
步骤1：向氨基甲酸酯XS5(0.186g，0.503mmol)在DCM(2.5mL)中的溶液添加多聚甲醛(18mg，0.60mmol)。将反应混合物搅拌5分钟，之后添加TMSC1(0.070mL，0.55mmol)。将反应混合物搅拌1小时，浓缩，与DCM(1mL)共蒸发，在真空中干燥15分钟，并溶解在DCM(2.5mL)中以得到溶液A。将烯丙醇XD1(84mg，0.20mmol)溶解在DCM(1.3mL)中，冷却至0℃，并添加一部分溶液A(1.5mL)，随后添加2,6-卢剔啶(0.070mL，0.60mmol)。使反应混合物达到RT并将其搅拌2小时。添加更多的溶液A(0.50mL)和2,6-卢剔啶(0.023mL，0.20mmol)并将混合物搅拌1小时。添加更多的溶液A(0.50mL)和2,6-卢剔啶(0.023mL，0.20mmol)并将混合物搅拌过夜。添加数滴n-BuOH以淬灭反应并将混合物浓缩，与庚烷(1mL)、甲苯(1mL)以及DCM(1mL)共蒸发。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至100％ EtOAc)纯化粗制物，以产生作为无色油状物的苄基(((E)-5-(((((4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(2-(甲磺酰基)乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(0.104g，65％)的两种非对映体。对C37H48N6O10PS+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：799.3，实测值：799.6。
步骤2：将该中间体(60mg，0.075mmol)溶解在THF(0.68mL)/水(0.075mL)中，并将所得溶液用N2吹扫15分钟。添加三丁基膦(0.047mL，0.188mmol)并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，与MeCN(2×2mL)共蒸发，并在真空中干燥。通过快速色谱(硅胶，在DCM中0至20％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为非对映体混合物的胺XS6(27.5mg，47％)。对于C37H50N4O10PS+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：773.3，实测值：773.6。
接头-药物XS7
将胺XS6(28mg，0.036mmol)和(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-L-缬氨酸(12mg，0.039mmol，如WO2013122823中所述制备)溶解在DMF(0.36mL)中，并添加HATU(15mg，0.039mmol)和DIPEA(0.025mL，0.14mmol)。将反应混合物在RT下搅拌40分钟，浓缩并与甲苯(2×1mL)共蒸发。将剩余物溶解在EtOAc(10mL)中并用饱和NaHCO3水溶液(10mL)洗涤。将水层用EtOAc(2×10mL)反萃取，并将合并的有机层用水(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过制备型RP-HPLC(MilliQ/MeCN，梯度：70:30至20:80，不添加改性剂)纯化粗制物，以在冻干之后得到作为非对映异构体混合物的XS7(17.1mg，45％)。
对于C52H70N6O14PS+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：1065.4，实测值：1065.9。
实施例11：接头-药物XS25的合成
(S)-4-(2-叠氮基丙酰胺基)苄基(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯(XS23)
如XS5的合成中所述制备XD7的PNP-碳酸酯。将碳酸酯(0.393g，1.02mmol)溶解在THF(5.1mL)中并在0℃下添加N,N-二甲基乙烷-1,2-二胺(0.137mL，1.25mmol)和TEA(0.258mL，1.85mmol)。使混合物达到RT并将其搅拌4小时。将反应混合物浓缩，溶于EtOAc(30mL)中并用饱和NaHCO3水溶液(3×15mL)洗涤。将合并的水层用EtOAc(25mL)反萃取并且将合并的有机层用NaOH水溶液(2×15mL，1N)、盐水(25mL)洗涤，并经Na2SO4干燥并蒸发，以产生作为浅黄色固体的氨基甲酸酯XS23(0.299g，88％)。
对于C15H23N6O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：335.2，实测值：335.3。苄基(((E)-5-(((((4-((S)-2-氨基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(2-(二甲基氨基)-乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XS24)
步骤1：向氨基甲酸酯XS23(0.160g，0.478mmol)在DCM(4.8mL)中的溶液中添加多聚甲醛(20mg，0.67mmol)。将反应混合物搅拌15分钟，之后添加TMSC1(0.094mL，0.74mmol)。将反应混合物搅拌1小时，添加TMSCl(0.094mL，0.74mmol)并继续搅拌2.5小时。然后将反应混合物浓缩，与DCM(1mL)共蒸发并在真空中干燥15分钟。将粗制中间体混悬于DCM(4.8mL)中，并添加XD1(0.493g，1.18mmol)在DCM(4.8mL)中的溶液。将反应混合物搅拌15分钟，随后添加2,6-卢剔啶(0.167mL，1.44mmol)。在20分钟之后，添加MeOH(2mL)并将反应混合物浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至20％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为浅黄色油状物的苄基(((E)-5-(((((4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(2-(二甲基氨基)-乙基)氨基)甲氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(0.272g，74％)的非对映体混合物。
对于C38H51N7O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：764.4，实测值：764.7。
步骤2：将该中间体(75mg，0.098mmol)溶解在THF(0.884mL)/水(0.098mL)中，并将所得溶液用N2吹扫15分钟。添加三丁基膦(61μL，0.245mmol)并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，与MeCN(2×2mL)共蒸发并在真空中干燥。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至25％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为黄色油状物的胺XS24(33mg，45％)的两种非对映体。对于C38H53N5O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：738.4，实测值：736.7。
接头-药物XS25
将胺XS24(33mg，0.044mmol)和(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-L-缬氨酸(14mg，0.046mmol，如WO2013122823中所述制备)溶解在DMF(0.44mL)中。添加HATU(18mg，0.049mmol)和DIPEA(31μL，0.18mmol)，并将反应混合物在RT下搅拌1小时，浓缩并与甲苯(1mL)共蒸发。添加水(1mL)，除去所得上清液并用水洗涤沉淀物。通过制备型RP-HPLC(MilliQ×0.1％ TFA/MeCN，梯度：80:20至30:70)纯化粗制物，以在冻干之后得到作为非对映体混合物的XS25(18mg，39％)。
对于C53H73N7O12P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：1030.5，实测值：1030.9。
实施例12：接头-药物XS12的合成
A：叠氮化物XS9的制备
(4-氨基-3-氟苯基)甲醇(XS8)
向(3-氟-4-硝基苯基)甲醇(0.610g，3.56mmol)在MeOH(8.9mL)和THF(8.9mL)中的溶液中添加锌粉(2.33g，35.6mmol)和氯化铵(1.91g，35.6mmol)。将反应混合物在RT下搅拌24小时，经硅藻土过滤并用MeOH(20mL)洗涤。将滤液浓缩并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至10％ MeOH)纯化，以产生作为橙色油状物的苯胺XS8(0.312g，62％)。
对于C7H9FNO+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：142.1，实测值：142.1。
(S)-2-叠氮基-N-(2-氟-4-(羟甲基)苯基)丙烯酰胺(XS9)
将(S)-2-叠氮基丙酸(0.180g，1.56mmol)在MeOH(1.8mL)中的溶液添加至苯胺XS8(0.309g,2.19mmol)在DCM(5.9mL)中的溶液。将该溶液冷却至0℃并添加EEDQ(0.774g,3.13mmol)。在15分钟之后，使反应混合物达到RT并将其搅拌过夜。将反应混合物浓缩并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至100％ EtOAc)纯化，以产生酰胺XS9(0.416g，100％)。
对于C10H12FN4O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：239.1，实测值：239.2。B：接头-药物XS12的制备
4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)-3-氟苄基N-(环丙基甲基)-P-(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰胺酸酯(XS10)
将环丙基甲胺盐酸盐(0.128g，1.19mmol)混悬于DCM(1.0mL)中，并冷却至-78℃。添加(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰二氯(0.300g，1.19mmol，根据一般性操作XXB从膦酸二酯XD15(0.323g，1.50mmol)制备)在DCM(2.0mL)中的溶液，随后添加TEA(0.333mL，2.39mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌1小时，使其达到RT并搅拌2小时。使反应混合物冷却至-78℃并添加苄醇XS9(0.379g，1.43mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液，随后添加TEA(0.200mL，1.43mmol)。使反应混合物达到RT并将其搅拌2小时。添加TEA(0.100mL，0.717mmol)，并将反应混合物搅拌1小时并浓缩。将粗制物在EtOAc(50mL)和HCl水溶液(15mL，1M)之间分配，并将水层用EtOAc(3×15mL)反萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至100％ EtOAc)纯化粗制物，以产生作为无色油状物的膦酰胺酸酯XS10(0.194g，37％)的两种非对映体。
对于C20H30FN5O3P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：438.2，实测值：438.4。4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)-3-氟苄基N-(环丙基甲基)-P-((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰胺酸酯(XS11)
根据一般性操作XXC进行烯烃XS10(0.183g，0.418mmol)的烯丙基氧化。通过快速色谱(硅胶，在EtOAc中的0至5％ MeOH)纯化粗制物，以产生醇XS11(80mg，44％)的两种非对映体。
对于C20H30FN5O4P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：454.2，实测值：454.5。
接头-药物XS12
步骤1：将叠氮化物XS11(74mg，0.16mmol)溶解在THF(1.5mL)/水(0.16mL)中并将所得溶液用N2吹扫15分钟。添加三丁基膦(0.102mL，0.408mmol)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，与MeCN(3×1mL)共蒸发，并在真空中干燥。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至20％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为油状物的4-((S)-2-氨基丙酰胺基)-3-氟苄基N-(环丙基甲基)-P-((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰胺酸酯(51mg，73％)的两种非对映体。对于C20H32FN3O4P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：428.2，实测值：428.4。
步骤2：将中间体胺(47mg，0.11mmol)和(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-L-缬氨酸(36mg，0.12mmol，如WO2013122823中所述制备)溶解在DMF(1.1mL)中。添加HATU(46mg，0.12mmol)和DIPEA(0.077mL，0.44mmol)，并将反应混合物在RT下搅拌30分钟。添加HATU(4.2mg，0.011mmol)并将反应混合物搅拌15分钟，浓缩，并与甲苯(1mL)共蒸发。将剩余物在EtOAc(10mL)与饱和NaHCO3水溶液(10mL)之间分配。将水层用EtOAc(2×10mL)反萃取并将合并的有机层用水(10mL)/盐水(5mL)和盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过制备型RP-HPLC(MilliQ/MeCN，梯度：90:10至40:60，不添加改性剂)纯化粗制物，以在冻干之后得到作为白色固体的XS12(30mg，38％)的非对映体混合物。
对于C35H52FN5O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：720.4，实测值：720.7。
实施例13：接头-药物XS17的合成
A：叠氮化物XS14的制备
(4-氨基-2-氟苯基)甲醇(XS13)
步骤1：将4-氨基-2-氟苯甲酸(1.00g，6.45mmol)混悬于MeOH(3.2mL)中并冷却至0℃。逐滴添加亚硫酰氯(0.706mL，9.67mmol)，之后将反应混合物回流1小时。添加MeOH(5.0mL)，并将反应混合物在RT下搅拌2小时。将混合物添加至饱和NaHCO3水溶液(100mL)并将产物用EtOAc(3×75mL)萃取。将合并的有机层用盐水(2×50mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，与MeOH(10mL)共蒸发并在真空中干燥，以产生作为褐色固体的4-氨基-2-氟苯甲酸甲酯(1.01g，93％)。
对于C8H9FNO2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：170.1，实测值：170.2。
步骤2：向中间体酯(0.486g，2.87mmol)在THF(19mL)中的0℃溶液逐滴添加在THF中的LiAlH4(3.59mL，8.62mmol)。使反应混合物达到RT并将其搅拌3小时。使反应混合物冷却至0℃并通过分批添加Na2SO4·10H2O(3.5g)和硅藻土(3.5g)的混合物来将其淬灭。将混合物过滤并将剩余物用THF(10mL)洗涤。将滤液在真空中浓缩，以产生作为灰白色固体的苄醇XS13(0.367g，91％)。
对于C7H9FNO+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：142.1，实测值：142.1。
(S)-2-叠氮基-N-(3-氟-4-(羟甲基)苯基)丙烯酰胺(XS14)
将(S)-2-叠氮基丙酸(0.210g，1.83mmol)在MeOH(2.1mL)中的溶液添加至苯胺XS13(0.361g，2.55mmol)在DCM(6.8mL)中的溶液。使溶液冷却至0℃并添加EEDQ(0.902g，3.65mmol)。在15分钟之后，使反应混合物达到RT并将其搅拌过夜。将反应混合物浓缩并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至100％ EtOAc)纯化，以产生酰胺XS14(0.902g，定量)。
对于C10H12FN4O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：239.1，实测值：239.2。B：接头-药物XS17的制备
4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)-2-氟苄基N-(环丙基甲基)-P-(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰胺酸酯(XS15)
将环丙基甲胺盐酸盐(0.128g，1.19mmol)混悬于DCM(1.0mL)中并冷却至-78℃。添加(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰二氯(0.300g，1.19mmol，根据一般性操作XXB从膦酸二酯XD15(0.323g，1.50mmol)制备)在DCM(2.0mL)中的溶液，随后添加TEA(0.333mL，2.39mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌1小时，使其达到RT并搅拌2小时。使反应混合物冷却至-78℃并添加苄醇XS14(0.379g，1.43mmol)在DCM(4.0mL)中的溶液，随后添加TEA(0.200mL，1.43mmol)。使反应混合物达到RT并将其搅拌2小时。添加TEA(0.030mL，0.215mmol)，并将反应混合物搅拌1小时并浓缩。将剩余物在EtOAc(50mL)和HCl水溶液(15mL，1M)之间分配，并将水层用EtOAc(3×15mL)反萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至100％ EtOAc)纯化粗制物，以产生作为无色油状物的膦酰胺酸酯XS15(0.294g，56％)的非对映体混合物。
对于C20H30FN5O3P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：438.2，实测值：438.4。4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)-2-氟苄基N-(环丙基甲基)-P-((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰胺酸酯(XS16)
根据一般性操作XXC进行烯XS15(0.288g，0.658mmol)的烯丙基氧化。通过快速色谱(硅胶，在EtOAc中的0至5％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为非对映体混合物的XS16(64mg，32％)。
对于C20H30FN5O4P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：454.2，实测值：454.5。
接头-药物XS17
步骤1：将叠氮化物XS16(61mg，0.14mmol)溶解在THF(1.2mL)/水(0.14mL)中，并将所得溶液用N2吹扫15分钟。添加三丁基膦(84μL，0.336mmol)并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，与MeCN(3×1mL)共蒸发并在真空中干燥。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至20％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为油状物的4-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2-氟苄基N-(环丙基甲基)-P-((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰胺酸酯(44mg，77％)的两种非对映体。对于C20H32FN3O4P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：428.2，实测值：428.6。
步骤2：将中间体胺(44mg，0.10mmol)和(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-L-缬氨酸(34mg，0.11mmol，如WO2013122823中所述制备)溶解在DMF(1.0mL)中。添加HATU(43mg，0.11mmol)和DIPEA(72μL，0.41mmol)，并将反应混合物在RT下搅拌90分钟，浓缩并与甲苯(1mL)共蒸发。将剩余物在EtOAc(10mL)与饱和NaHCO3(10mL)之间分配。将水层用EtOAc(2×10mL)反萃取，并将合并的有机层用水(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过制备型RP-HPLC(MilliQ/MeCN，梯度：90:10至40:60，不添加改性剂)纯化粗制物。蒸发MeCN并随后冻干，得到作为非对映体混合物的XS17(32mg，43％)。
对于C35H52FN5O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：720.4，实测值：720.7。
实施例14：接头-药物XS22的合成
A：叠氮化物XS19的制备
4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)L-丙氨酸苄酯(XS19)
步骤1：将Fmoc-Ala-OH(0.386g，1.240mmol)溶解在DCM(12mL)中并冷却至0℃。添加DMAP(12mg，0.099mmol)，随后添加EDC(0.291g，1.52mmol)和HOBt(0.155g，1.01mmol)。在搅拌15分钟之后，添加醇XD7(0.300g，1.36mmol)，并使反应混合物达到RT并将其搅拌过夜。将反应混合物添加至水(15mL)中并将水层用DCM(2×15mL)萃取。将合并的有机层用盐水(15mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至80％ EtOAc)纯化粗制物，以产生作为白色固体的4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-丙氨酸酯(0.406g，64％)。对于C28H28N5O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：514.2，实测值：514.5。
步骤2：将中间体酯(0.404g，0.786mmol)溶解在DMF(5.3mL)中并添加哌啶(0.389mL，3.93mmol)。将反应混合物搅拌20分钟，然后浓缩并与甲苯(2×5mL)共蒸发。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至15％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为无色油状物的胺XS19(0.219g，96％)。
对于C13H18N5O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：292.1，实测值：292.3。B：接头-药物XS22的制备
4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基((4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XS20)
在-78℃下向在甲苯(4.5mL)中的(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰二氯(0.176g，0.700mmol，根据一般性操作XXB从膦酸二酯XD15(0.189g，0.875mmol)制备)逐滴添加苯酚(66mg，0.70mmol)和DIPEA(0.122mL，0.700mmol)在甲苯(4.5mL)中的溶液。使反应混合物达到RT并将其搅拌2小时30分钟。在-78℃下添加胺XS19(0.214g，0.735mmol)和DIPEA(0.128mL，0.735mmol)，并使反应混合物达到RT并将其搅拌2小时。添加DIPEA(0.128mL，0.735mmol)并将反应混合物搅拌90分钟并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至100％EtOAc)纯化粗制物，以产生作为浅黄色油状物的膦酰胺酸酯XS20(0.100g，28％)的非对映体混合物。
对于C25H33N5O5P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：514.2，实测值：514.5。4-((S)-2-叠氮基丙酰胺基)苄基(((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸酯(XS21)
根据一般性操作XXC进行烯XS20(0.100g，0.195mmol)的烯丙基氧化。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至100％ EtOAc)纯化粗制物，以产生醇XS21(27mg，26％)的两种非对映体。
对于C25H33N5O6P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：530.2，实测值：530.5。
接头-药物XS22
步骤1：将叠氮化物XS21(27mg，0.050mmol)溶解在THF(0.45mL)/水(0.050mL)中，并将所得溶液用N2吹扫15分钟。添加三丁基膦(0.032mL，0.126mmol)并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，与MeCN(3×1mL)共蒸发并在真空中干燥。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至20％ MeOH)纯化粗制物，以产生作为无色油状物的4-((S)-2-氨基丙酰胺基)苄基(((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)(苯氧基)磷酰基)-L丙氨酸酯(15mg，58％)的两种非对映体。对于C25H35N3O6P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：504.2，实测值：504.6。
步骤2：将中间体胺(15mg，0.029mmol)和(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-L-缬氨酸(9.9mg，0.032mmol，如WO2013122823中所述制备)溶解在DMF(0.29mL)中。添加HATU(13mg，0.035mmol)和DIPEA(0.020mL，0.12mmol)，并将反应混合物在RT下搅拌75分钟，浓缩并与甲苯(1mL)共蒸发。将剩余物在EtOAc(10mL)与饱和NaHCO3(10mL)之间分配。将水层用EtOAc(2×10mL)反萃取，并将合并的有机层用水(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过制备型RP-HPLC(MilliQ/MeCN，梯度：80:20至30:70，不添加改性剂)纯化粗制物，以在冻干之后得到作为白色固体的接头-药物XS22(10mg，44％)的非对映体混合物。
对于C40H55N5O10P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：796.4，实测值：796.6。
实施例15：接头-药物XD24的合成
A：氨基甲酸酯XD26的制备
(S)-4-(2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙酰胺基)乙基氨基甲酸苄酯(XD26)
步骤1：将酰胺XD25(11.4g，61.6mmol，如由Z.P.Tachrim et al.Molecules，2007,22,1748所述制备)在DCM(275ml)和MeOH(175ml)中的溶液冷却至0℃并添加EEDQ(30.5g，123mmol)和(4-氨基苯基)甲醇(10.6g，86.0mmol)。在1小时之后，使橙色溶液温热至RT并将其搅拌过夜。将反应物浓缩并将粗制物在RT下在乙醚(500mL)中搅拌1小时。将混合物过滤并将固体用乙醚洗涤以得到作为白色固体的第一批(first crop)(S)-N-(4-(羟甲基)苯基)-2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙酰胺(10.8g，61％)。将滤液浓缩并将粗制物溶于EtOAc(150mL)中。用HCl水溶液(2M，90mL)洗涤溶液并将水层用EtOAc(3×125mL)反萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗制物混悬于最小体积的DCM中，搅拌30分钟，并随后过滤厚的块状物(cake)。收集固体并在真空下干燥，以得到作为膏状固体的第二批(S)-N-(4-(羟甲基)苯基)-2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙酰胺(4.66g，26％产率)。对于C12H14F3N2O3[M+H]+，MS(ESI+)计算值：291.10，实测值：291.24。
步骤2：在0℃下向(S)-N-(4-(羟甲基)苯基)-2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙酰胺(3.24g，11.2mmol)在THF(80ml)中的溶液添加二月桂酸二丁基锡(1.66ml，2.79mmol)和异氰酸乙酯(1.33ml，16.7mmol)。移除冷却浴并将混合物在RT下搅拌3小时。将反应混合物在硅胶上浓缩并通过快速色谱(首先用庚烷中的0至80％梯度的乙醚除去锡烷杂质，随后用庚烷中的0至100％梯度的EtOAc洗脱产物)纯化，以得到作为白色固体的氨基甲酸酯XD26(3.62g，78％，2个步骤)。
对于C15H18F3N3NaO4 +[M+Na]+，MS(ESI+)计算值：384.1，实测值：384.3。B：接头-药物XD24的制备
双(2-氰乙基)(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD21)
将(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰二氯(1.04g，5.20mmol，根据一般性操作XXB从膦酸二酯XD15制备)在DCM(3.3ml)中的溶液逐滴添加至3-羟基丙腈(0.746ml，10.9mmol)和吡啶(0.883ml，10.9mmol)在DCM(17ml)中的冷却(-78℃)溶液。在30分钟之后，使反应物温热至RT。在45分钟之后，在RT下添加更多的3-羟基丙腈(0.267ml，3.90mmol)和吡啶(0.315ml，3.90mmol)并持续搅拌3小时。将反应物倒入EtOAc(100mL)和HCl水溶液(1M，20mL)的混合物中。使层分离并将水层用EtOAc(3×30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。进行快速色谱(在DCM中的0至100％ EtOAc)纯化，得到作为浅黄色油状物的二烷基膦酸酯XD21(986mg，70％)。
对于C12H20N2O3P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：271.1，实测值：271.2。双(2-氰乙基)(E)-(5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD22)
根据一般性操作XXC进行烯烃XD21(0.986g，3.65mmol)的烯丙基氧化。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至6％ MeOH)纯化粗制物，以产生醇XD22(0.586g，56％)。
对于C12H19N2NaO4P+[M+Na]+，MS(ESI+)计算值：309.1，实测值：309.2。(S)-4-(2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙酰胺基)苄基(E)-(((5-(双(2-氰乙氧基)磷酰基)-2-甲基戊-2-烯-1-基)氧基)甲基)(乙基)氨基甲酸酯(XD23)
使醇XD22(100mg，0.349mmol)与氨基甲酸酯XD26根据具有以下修改的一般性操作XXA反应：使用2,6-卢剔啶代替DIPEA。通过快速色谱(硅胶，在DCM中0至4％ MeOH)纯化粗制物，得到作为无色油状物的氨基甲酸酯XD23(217mg，94％)。
对于C28H38F3N5O8P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：660.2，实测值：660.6。
接头-药物XD24
步骤1：将酰胺XD23(44.5mg，0.067mmol)溶解在MeOH(1.1ml)中。添加水(0.135ml)并将混合物冷却至0℃。添加NaOH(水中2M，0.135ml，0.270mmol)并在2分钟之后移除冰浴并在RT下持续搅拌。在2小时之后添加更多的NaOH(水中2M，0.135ml，0.270mmol)，并且在RT下继续反应，持续9小时的总反应时间。将反应物冷却至0℃并添加HCl水溶液(1M，0.304mL)。溶液随后不经任何进一步纯化即可用于下一步。
步骤2：将步骤1的溶液用AcOH水溶液(1M，0.170mL)处理并将混合物浓缩。在RT下，将粗制物溶于水(0.4mL)中并添加固体NaHCO3(16.9mg，0.201mmol)，随后添加在THF(0.4mL)中的Fmoc-Val-OSu(29.4mg，0.067mmol)。将混合物在RT下搅拌24小时，并随后浓缩。
步骤3：将步骤3中制备的粗制物混悬于DMF(2.0mL)中并在RT下添加哌啶(0.8mL)。在搅拌1小时之后，将反应物浓缩并重新溶解在DMF(2.0mL)中。添加Et3N(0.8mL)并将混合物搅拌5分钟，以得到细密的(fine)混悬液。将混合物浓缩，并再次重复该过程以确保完全除去哌啶残留物。将白色固体混悬于乙醚(5mL)中并将该混合物搅拌30分钟。小心地除去上清液，并重复该过程，直至UPLC-MS分析表明上清液中不再有Fmoc残留物。将固体在真空下干燥。
步骤4：在RT下，将固体溶解在水(0.4mL)中，并添加固体NaHCO3(17.0mg，0.200mmol)，随后添加在THF(0.4mL)中的2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(20.8mg，0.068mmol)。在搅拌3小时之后，在RT下通过短暂的旋转蒸发除去大多数THF。然后将水溶液用在MilliQ(8mL)中的10％ MeCN稀释，并通过制备型RP-HPLC(水×0.025％ NH4OH/MeCN，梯度：10至40％)纯化澄清溶液。注意，将产物收集在预填充有AcOH水溶液(1M，0.5mL)以确保碱性洗脱剂的直接酸化的测试管中。将产物级分立即冷冻并随后冻干，以得到作为白色固体的标题化合物XD24(11.5mg)。
对于C35H51N5O11P-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：748.3，实测值：748.8。
实施例17：接头-药物XD44、XD45和XD46的合成
A：双((9H-芴-9-基)甲基)氯磷酸酯(XD34)的制备
双((9H-芴-9-基)甲基)膦酸酯(XD50)
在RT下，在N2下，将(9H-芴-9-基)甲醇(4.55g，23.2mmol)添加至二苯基亚磷酸酯(2.13ml，10.6mmol)在无水吡啶(20ml)中的溶液，并将混合物搅拌2小时。将反应物浓缩并溶于EtOAc(250mL)中。将有机相用HCl水溶液(2×，1M)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在硅胶上浓缩。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至85％ EtOAc/DCM(1:4))纯化，得到作为无色蜡状物的H-膦酸酯XD50(3.46g，75％)。
对于C28H24O3P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：439.2，实测值：439.3。双((9H-芴-9-基)甲基)氯磷酸酯(XD34)
将H-膦酸酯XD50(8.57g，19.6mmol)溶解在甲苯(98ml)中，并用N2吹扫顶部空间。在RT下添加NCS(3.13g，23.5mmol)，并随后将反应混合物在40℃下搅拌2小时。在冷却至RT之后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物与MeCN(10mL)共蒸发以得到白色固体。用热风枪使用温和加热以溶解所有固体来将固体溶解在MeCN(25mL)中。将溶液逐渐冷却降至-30℃，此时白色固体开始沉淀。将烧瓶在-30℃下储存过夜，并随后使其温热至RT，然后过滤。使用冰冷的MeCN(10mL)洗涤固体，以得到作为白色固体的氯化物XD34(8.03g，87％产率)。
对于C28H24ClO4P+[M+NH4]+，MS(ESI+)计算值：490.1，实测值：490.3。
B：膦酸酯XD37的制备
三乙基铵(E)-氢(5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD37)
在0℃下，将DBU(0.401ml，2.66mmol)添加至XD22(305mg，1.07mmol)在THF(10ml)中的溶液。在2分钟之后移除冷却浴，并将反应物在RT下搅拌4小时，以仅得到单-脱保护产物。将混合物用乙醚(30mL)稀释，并在搅拌15分钟之后使乳液沉降(15分钟)。将上清液倾析并将剩余物溶于MeOH(10mL)和水(1.25mL)中。在0℃下添加NaOH(水中2M，3.20mL，6.40mmol)并将混合物在该温度下搅拌30分钟。移除冰浴并且使反应在RT下继续进行3小时30分钟。然后将反应混合物装载到DOWEX 50WX8-200氢型柱(5g，用甲醇预洗涤，直至洗脱液为中性且呈无色)上。将产物用甲醇洗脱。合并产物级分并添加Et3N(0.148mL，1.07mmol)。通过旋转蒸发除去甲醇并用MeCN稀释水相，并随后冻干，以得到作为无色油状物的XD37(259mg，98％)。
对于C6H12O4P-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：179.1，实测值：179.1。
C：磷酸酯XD38的制备
(E)-双((9H-芴-9-基)甲基)(4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-甲基丁-2-烯-1-基)磷酸酯(XD48)
在0℃下向醇XD47(1.35g，3.97mmol，如Serra,S.Tetrahedron:Asymmetry,2014,25,1561-1572所述合成)、5-(乙硫基)-1H-四唑(0.043g，0.331mmol)和2,6-卢剔啶(1.54ml，13.2mmol)在MeCN(5mL)中的溶液添加在MeCN/DCM(1:1，5mL)中的XD34(1.45g，3.31mmol)。移除冷却浴并将反应物在RT下搅拌75分钟。将混合物浓缩并将粗制物溶于EtOAc(100mL)中。用HCl水溶液(1M，约50ml)洗涤混悬液并将水层用EtOAc(1×)反萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至60％ Et2O/DCM(1:1))纯化粗制物，以得到XD48(1.95g，76％)。
对于C49H49NaO5PSi+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：799.3，实测值：799.6。三乙基铵(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基磷酸酯(XD38)
步骤1：在N2下在聚四氟乙烯管中，将TBDPS-乙醚XD48(911mg，1.17mmol)溶解在THF/吡啶(1:1，6mL)中。将混合物冷却至0℃并添加HF·py(2ml，70％ HF)。在0℃下搅拌80分钟之后，将反应混合物在搅拌下小心地添加至饱和NaHCO3水溶液和EtOAc的冷却(0℃)混合物中。在泡腾停止之后，将层分离并将水相用EtOAc萃取(3×)。将合并的有机层用HCl水溶液(1M)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至55％EtOAc)纯化，得到相应的醇(418mg，66％)。
步骤2：将醇(313mg，0.581mmol)溶于THF(13ml)中。将混合物冷却至-78℃并添加DBU(0.219ml，1.45mmol)。在5分钟之后，移除冷却浴并将混合物在RT下搅拌45分钟。在此期间，形成了黏性沉淀物。将反应物用乙醚(约10mL)稀释并在搅拌2分钟之后将反应物倾析。将剩余物溶于最小量的MeCN(约2mL)中，并添加少量的MeOH以获得澄清的溶液。然后将反应物用乙醚(约70mL)稀释。将浑浊的混合物搅拌5分钟，并随后使其过夜沉降。通过倾析除去上清液，并将溶解在MeCN/MeOH中并用乙醚进行沉淀的过程重复三次。将剩余物在真空下干燥，以得到209mg油状物。将该物质溶于乙醇(2ml)中，并装载在DOWEX 50WX8-200氢型柱(5g，用乙醇预洗涤直至洗脱液为中性且呈无色)上。将产物用乙醇洗脱。合并产物级分，添加Et3N(0.083mL)，并将无色澄清溶液浓缩，以得到作为无色油状物的XD38(125mg，76％)。
对于C5H10O5P-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：181.0，实测值：181.1。D：硫代磷酸酯XD39的制备
(E)-叔丁基((4-氯-2-甲基丁-2-烯-1-基)氧基)二苯基硅烷(XD51)
将NCS(1.02g，7.63mmol)溶解在无水DCM(25ml)中并将混合物冷却至-40℃。在搅拌下逐滴添加DMS(0.695ml，9.40mmol)，并随后将反应物温热至0℃并搅拌10分钟。将反应物冷却至-40℃，并添加溶解在无水DCM(5ml)中的醇XD47(2.00g，5.87mmol，如Serra,S.Tetrahedron:Asymmetry,2014,25,1561-1572所述合成)。使反应物在2.5小时内温热至0℃，并随后在0℃下搅拌另外的90分钟。在0℃下添加盐水(30mL)并将层分离。将水层用DCM(40mL)萃取并使合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将接近无色的粗油状物通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至20％ DCM)纯化，以得到为无色油状物的氯化物XD51(1.93g，92％)。
(E)-O,O-双((9H-芴-9-基)甲基)S-(4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-甲基丁-2-烯-1-基)硫代磷酸酯(XD52)
步骤1：将硫代甲磺酸钠(262mg，1.95mmol)添加至氯化物XD51(700mg，1.95mmol)在DMF(4ml)中的RT溶液中。在搅拌5小时之后，将混合物倒入水(50mL)中并将混合物用EtOAc/庚烷(1:1，2×30mL)萃取，并将合并的有机层用水(2×30mL)和盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至15％EtOAc)纯化，得到作为无色油状物的(E)-S-(4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-甲基丁-2-烯-1-基)硫代甲磺酸酯(725mg，86％)。
步骤2：在N2下，将XD50(570mg，1.30mmol)溶于MeCN(2.75ml)和吡啶(5.6ml)中。将溶液在冰浴中冷却并逐滴添加TMSCl(0.825ml，6.51mmol)。在5分钟之后，移除冷却浴并将反应物在RT下搅拌45分钟。随后添加(E)-S-(4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-甲基丁-2-烯-1-基)硫代甲磺酸酯(706mg，1.62mmol)，并将混合物在RT下搅拌15分钟。添加甲苯(10mL)，并将混合物浓缩。将剩余物再次与甲苯(10mL)共蒸发，然后通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至50％“1:1乙醚/DCM”)纯化，得到作为无色蜡状物的XD52(818mg，79％)。
三乙基铵(E)-S-(4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基)O-氢硫代磷酸酯(XD39)
步骤1：使TBDPS-乙醚XD52(800mg,1.01mmol)以类似于针对XD38的操作与HF·py反应，反应时间为1小时45分钟。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至40％ EtOAc)纯化粗制物，得到作为无色油状物的相应的醇(452mg，81％)。
对于C33H32O4PS+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：555.2，实测值：555.5。
步骤2：在RT下将醇(272mg，0.490mmol)溶解在THF(3ml)中并添加Et3N(0.75ml，5.38mmol)。在7小时之后，形成油状沉淀物，并添加MeCN(2ml)，随后添加三乙胺(0.5ml，3.59mmol)，以得到澄清溶液。持续搅拌过夜，并随后将澄清溶液浓缩至约1mL，并与甲苯(6mL)共蒸发。将油状剩余物溶于MeCN(约0.7mL)中，并随后在搅拌下通过缓慢添加乙醚(7mL)使其沉淀。在搅拌5分钟之后，使乳液沉降，并随后通过倾析除去溶液，留下油状剩余物。重复4次MeCN/乙醚处理，并随后将剩余物在真空下干燥，以得到作为无色油状物的三乙胺盐XD39(123mg，83％)。
对于C5H10O4PS-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：197.0，实测值：197.0。
E：炔烃接头XD43的制备
2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基丙-2-炔-1-基氨基甲酸酯(XD43)
在0℃下，向在THF(10ml)中的PNP-碳酸酯XD53(511mg，1.46mmol，根据Elgersma,R.C.et al.Mol.Pharm.2015,12,1813-1835合成)添加炔丙基胺(0.093ml，1.46mmol)。移除冷却浴并将混合物在RT下搅拌2小时。将混合物浓缩，并通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至70％EtOAc)纯化粗产物，以得到作为白色固体的XD43(265mg，68％)。
F：一般性操作XXD：磷酸酯的CDI活化以及与膦酸酯、磷酸酯或硫代磷酸酯的偶联
在RT下，在N2下将磷酸酯的单-三乙胺盐(1.0当量)溶解在DMF(0.15M)中，并添加CDI(2.1当量)。在搅拌30分钟之后，添加无水MeOH(1.0当量)并将混合物在RT下搅拌15分钟，然后浓缩。将剩余物与DMF共蒸发，以得到粗制物A。
在单独的烧瓶中，在N2下，将膦酸酯、磷酸酯或硫代磷酸酯反应物的单-三乙胺盐(1.2当量)与DMF共蒸发，并随后重新溶解在DMF(0.36M)中。然后在RT下使混合物经插管到含有粗制物A的烧瓶中。使用相同体积的DMF冲洗烧瓶并完成转移。将混合物在RT下在N2下搅拌，并且一旦UPLC-MS分析显示基本上完全转化(通常为20至24小时)，将反应物浓缩，并通过制备型HPLC按照指示纯化。将产物级分冻干得到产物。
G：一般性操作XXE：点击-反应
在RT下，将在经氮气吹扫的水(0.034M)中的五水硫酸铜(II)(0.77当量)添加至含有固体叠氮化物(1.0当量)和炔烃(1.4当量)的烧瓶中。添加相等体积的THF，以得到均质的水/THF(1:1)溶液。用N2短暂吹扫烧瓶的顶部空间，并添加抗坏血酸钠(1.5当量)在经氮气吹扫的水(0.13M)中的溶液。将反应物在RT下搅拌，直至UPLC-MS分析表明完全转化(通常为1至2小时)。通过短暂的旋转蒸发除去大多数THF，并将水相溶于在MilliQ中的MeCN/25mMNH4HCO3(1:9)中。使用注射器过滤器过滤掉不溶物质并通过制备型HPLC按照指示纯化滤液。将产物级分冻干得到产物。
H：接头-药物XD44、XD45和XD46的制备
双((9H-芴-9-基)甲基)(4-((14S,17S)-1-叠氮基-14-异丙基-17-甲基-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,16-二氮杂十八烷-18-酰胺基)苄基)磷酸酯(XD35)
步骤1：将3-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(142mg，0.574mmol)溶解在DMF(1ml)中。在RT下，添加在DMF(3.0ml)中的Val-Ala-PAB(160mg，0.545mmol)，随后添加HATU(228mg，0.600mmol)和DIPEA(0.143ml，0.818mmol)。将反应物搅拌30分钟，然后浓缩。将粗制物溶于MeOH(1mL)中，并通过使溶液通过已经用甲醇预洗涤的短的DOWEX 50WX8塞状物来除去碱性杂质。将产物用甲醇洗脱并将粗产物在硅胶上浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至8％MeOH)纯化，得到作为乳膏状固体的所得酰胺(262mg，92％)。对于C24H39N6O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：523.3，实测值：523.6。
步骤2：在RT下，在N2下向在MeCN(3.7ml)中的酰胺产物(977mg，1.87mmol)和5-(乙硫基)-1H-四唑(19mg，0.15mmol)添加2,6-卢剔啶(719μl，6.17mmol)，随后添加氯化物XD34(884mg，1.87mmol)在DCM(3.7mL)中的溶液，并将混合物在RT下搅拌。在80分钟(88mg，0.187mmol)和140分钟(177mg，0.374mmol)之后，添加更多的氯化物XD34。在185分钟的总反应时间之后，添加更多的2,6-卢剔啶(218μl，1.87mmol)，并使反应继续进行2小时，然后用甲醇(1mL)将其淬灭。将混合物浓缩，并将粗制物溶于EtOAc(80mL)和HCl水溶液(40mL，1M)中。添加少量的MeCN(4mL)以溶解剩余的固体，并将层分离。将水层用EtOAc(80mL)萃取，并且将合并的有机层用盐水洗涤，并经Na2SO4干燥。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至5％MeOH)纯化粗制物，以产生磷酸酯XD35(1.40g，66％产率)。
对于C52H59N6O10PNa+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：981.4，实测值：981.8。4-((14S,17S)-1-叠氮基-14-异丙基-17-甲基-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,16-二氮杂十八烷-18-酰胺基)磷酸二氢苄酯(XD36)
将三乙胺(0.25ml)添加至磷酸酯XD35(160mg，0.167mmol)在MeCN(1ml)中的RT溶液，并将反应物搅拌24小时。将反应物用甲苯(8mL)稀释，并随后浓缩。将粗制物混悬于乙醚(10mL)中，过滤，并用乙醚重复洗涤固体，以得到作为单三乙基铵盐的烷基磷酸酯XD36(108mg，92％)。(注意：产物含有杂质(m/z 606)，其可能是通过消除磷酸酯并用三乙基胺捕获中间体氮杂醌甲基化物(azaquinone methide)形成的。该杂质在下一步中是无反应性的，并且不需要进一步纯化)。对于C24H38N6O10P-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：601.2，实测值：601.7。
叠氮化物XD40
使烷基磷酸酯XD36(107mg，0.152mmol)与膦酸酯XD37根据一般性操作XXD反应。通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mM NH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化粗制物，以在冻干之后得到作为蓬松白色固体的膦酰基磷酸酯XD40(60.5mg，50％)。
对于C30H49N6O13P2 -[M-H]-，MS(ESI-)计算值：763.3，实测值：763.7。
叠氮化物XD41
使烷基磷酸酯XD36(142mg，0.202mmol)与烷基磷酸酯XD38根据一般性操作XXD反应。通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mM NH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化粗制物，以在冻干之后得到作为蓬松白色固体的焦磷酸酯XD41(65.9mg，41％)。对于C29H47N6O14P2 -[M-H]-，MS(ESI-)计算值：765.3，实测值：765.6。
叠氮化物XD42
使烷基磷酸酯XD36(142mg，0.202mmol)与烷基磷酸酯XD39根据一般性操作XXD反应。通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mM NH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化粗制物，以在冻干之后得到作为蓬松白色固体的叠氮化物XD42(88.6mg，54％)。
对于C29H47N6O13P2S-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：781.3，实测值：781.5。
接头-药物XD44
使叠氮化物XD40(18.5mg，0.023mmol)与炔烃XD43根据一般性操作XXE反应。通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mM NH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化，在冻干之后得到作为蓬松白色固体的膦酰基磷酸酯XD44(11.6mg，47％)。
对于C42H63N8O18P2 -[M-H]-，MS(ESI-)计算值：1029.4，实测值：1029.8。
接头-药物XD45
使叠氮化物XD41(30.2mg，0.038mmol)与炔烃XD43根据一般性操作XXE反应。通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mM NH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化，在冻干之后得到作为蓬松白色固体的焦磷酸酯XD45(36.2mg，90％)。对于C41H61N8O19P2 -[M-H]-，MS(ESI-)计算值：1031.4，实测值：1031.7。
接头-药物XD46
使叠氮化物XD42(27.1mg，0.033mmol)与炔烃XD43根据一般性操作XXE反应。通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mM NH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化，在冻干之后得到作为蓬松白色固体的接头-药物XD46(22.6mg，63％)。对于C41H61N8O18P2S-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：1047.3，实测值：1047.7。
实施例18：接头-药物XD58的合成
A：叠氮化物XD57的制备
2-氰乙基(4-((S)-2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙酰胺基)苄基)(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD54)
将(4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酰二氯(540mg，2.69mmol，根据一般性操作XXB从膦酸二酯XD15制备)在DCM(4.3mL)中的溶液添加至装有5-(乙硫基)-1H-四唑(35.0mg，0.269mmol)的经氮气吹扫的小瓶。将溶液冷却至-78℃并顺序添加3-羟基丙腈(0.184ml，2.69mmol)和2,6-卢剔啶(0.313ml，2.69mmol)。在-78℃下搅拌30分钟之后，将反应物温热至RT并搅拌2.5小时。然后在RT下将XD49(780mg，2.69mmol，如针对XD26的合成所述制备)在THF/DCM(11mL，3:1，需用热风枪来温和加热以获得澄清溶液，然后冷却回RT)中的溶液快速添加至反应混合物。在3小时之后，添加更多的2,6-卢剔啶(0.313ml，2.69mmol)，并继续反应90分钟。将混合物用EtOAc(50mL)稀释并用HCl水溶液(50mL，1M)洗涤。将水层用EtOAc(2×25mL)反萃取，并将合并的有机层用盐水(25mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至40％丙酮)纯化，提供了不完全的分离，并将不纯的产物通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至40％MeOH)再纯化，以得到纯的XD54(630mg，48％)。对于C21H27F3N3NaO5P+[M+Na]+，MS(ESI+)计算值：512.2，实测值：512.5。
2-氰乙基(4-((S)-2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙酰胺基)苄基)((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD55)
根据一般性操作XXC进行烯烃XD54(0.625g，1.28mmol)的烯丙基氧化。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至8％ MeOH)纯化粗制物，以产生醇XD55(0.411g，64％)。
对于C21H27F3N3NaO6P+[M+Na]+，MS(ESI+)计算值：528.2，实测值：528.4。
叠氮化物XD57
步骤1：将NaOH水溶液(2M，1.31ml，2.62mmol)添加至XD55(396mg，0.655mmol)在MeOH(4.6ml)/水(0.6ml)中的冷(0℃)溶液中。在10分钟之后，添加更多的NaOH水溶液(2M，1.31ml，2.62mmol)，并随后移除冷却浴。在2小时之后，使反应物冷却至0℃，并添加HCl水溶液(1M，2.95mL，4.5当量)，随后添加AcOH水溶液(1M，1.97mL，3.0当量)。然后将混合物浓缩。对于C16H26N2O5P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：357.2，实测值：357.4。
步骤2：将粗产物溶于水(5mL)中，并添加NaHCO3(165mg，1.97mmol)和iPrOH(5mL)。在RT下，在搅拌下添加Fmoc-Val-OSu(286mg，0.655mmol)，随后添加THF(2.5mL)。在2.5小时之后，将反应物用AcOH水溶液(1M，2mL)淬灭并浓缩。将粗制物与MeCN共蒸发(3×)来除去痕量的水。在40℃，在搅拌下将所得固体用EtOAc(20mL)重复洗涤，直至在上清液中不再检测到OSu酯，产生白色固体。
步骤3：向粗固体在MeOH/水(10mL，9:1)中的冷(0℃)溶液添加NaOH水溶液(2M，1.31mL，2.62mmol)，并随后将混合物在RT下搅拌45分钟。用AcOH水溶液(1M，3.9mL)来淬灭反应。然后通过旋转蒸发除去甲醇，并将水性混悬液用水稀释并过滤。将固体用水洗涤并将水相冻干，以得到作为白色固体的中间体XD56(840mg)。对于后续反应，假定对步骤1至3进行了定量转化，对应于对粗XD56的35wt％纯度。对于C21H35N3O6P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：456.2，实测值：456.5。
步骤4：在RT下将一部分中间体XD56(490mg粗制物，理论最大值0.365mmol)混悬于DMF(4ml)中。添加在DMF(1ml)中的DIPEA(0.254ml，1.46mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(146mg，0.424mmol)，并将混合物搅拌70分钟。将混合物浓缩，并立即将粗制物通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mM NH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化，以在冻干之后得到作为白色固体的叠氮化物XD57(163.6mg，64％)。
对于C30H48N6O10P-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：683.3，实测值：683.6。B：接头-药物XD58的制备
接头药物XD58
使叠氮化物XD57(21.4mg，0.030mmol)与炔烃XD43根据一般性操作XXE反应。通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mM NH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化，在冻干之后得到作为蓬松白色固体的接头-药物XD58(19.7mg，67％)。
对于C42H62N8O15P-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：949.4，实测值：949.8。
实施例19：接头-药物XD59的合成
A：二炔烃接头XS30的制备
1-(丙-2-炔-1-基)哌嗪(XS28)
步骤1：在0℃下，向哌嗪-1-羧酸叔丁酯(3.44g，18.5mmol)在MeCN(17mL)中的溶液中添加DIPEA(5.87mL，33.6mmol)，随后添加炔丙基溴(在甲苯中的80％，1.80mL，16.8mL)。使反应混合物达到RT并将其搅拌2小时。然后，将其在EtOAc(25mL)和水(25mL)之间分配。将水层用EtOAc(12mL)萃取并将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至50％ EtOAc)纯化，产生作为浅黄色油状物的4-(丙-2-炔-1-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(3.56g，15.9mmol，94％)。
对于C12H21N2O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：225.2，实测值：225.2。
步骤2：将一部分产物(2.82g，12.6mmol)溶解在DCM(6.3mL)中，并在搅拌下逐滴添加4M HCl在二烷(28.3mL，113mmol)中的溶液。将反应混合物在RT下搅拌4小时。将所得混悬液过滤，并将剩余物用DCM(2×5mL)洗涤。将白色固体在真空下干燥，以产生作为盐酸盐的胺XS28(2.48g，定量)。
对于C7H13N2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：125.1，实测值：125.1。烯丙基((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(XS29)
向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(1.90g，9.00mmol)在DCM(45mL)中的溶液中添加DIPEA(6.28mL，36.0mmol)，随后添加HATU(3.59g，9.45mmol)。将反应混合物搅拌1小时，之后添加胺XS28(1.87g，9.45mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，之后将其在EtOAc(50mL)与饱和NaHCO3水溶液(50mL)之间分配。将水层用EtOAc(2×50mL)萃取，并将合并的有机层用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，在EtOAc中的0至0.1％ Et3N)纯化粗制物，以产生作为浅黄色油状物的酰胺XS29(2.20g，77％)。
对于C17H24N3O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值：318.2，实测值：318.3。4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-1,1-二(丙-2-炔-1-基)哌嗪-1-溴化物(XS30)
在0℃下，向胺XS29(0.528g，1.66mmol)在MeCN(3.3mL)中的溶液添加炔丙基溴(在甲苯中的80％，0.926mL，8.32mmol)。使反应混合物达到RT并将其搅拌过夜，之后在搅拌下将其逐滴添加至乙醚(45mL)。形成了油状沉淀物，并通过倾析除去上清液。将剩余物用乙醚(5mL)洗涤，并且随后溶于MeCN/甲苯(4:1)的混合物中，并浓缩，以得到作为浅黄色油状物的季铵XS30(0.710g，79％)。
对于C20H26N3O3 +[M]+，MS(ESI+)计算值：356.2，实测值：356.4。B：接头-药物XD59的制备
接头-药物XD59
在使用之前，将水在搅拌下用N2吹扫20分钟。在RT下，在N2下，将在THF/水(1:10，0.55mL)中的炔烃XS30(9.2mg，0.017mmol)添加至固体XD57(30.1mg，0.043mmol)。接下来，添加在水(1.0mL)中的五水硫酸铜(II)(8.3mg，0.033mmol)，以得到澄清溶液。在RT下，用N2吹扫小瓶的顶部空间，并随后添加在水(0.48mL)中的抗坏血酸钠(0.013g，0.064mmol)，以得到混浊的混悬液。在3小时内将更多的炔烃XS30(在THF/水(1:10，0.540mL)中的10mg)分4份添加，此时UPLC-MS分析显示完全转化。通过短暂的旋转蒸发来除去THF，并将水溶液用在25mM NH4HCO3中的10％ MeCN(10mL)稀释并通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中25mMNH4HCO3，梯度：90:10至50:50)纯化，以在冻干之后得到作为白色固体的接头-药物XD59(23.0mg)。
对于C80H122N15O23P2 -[M-H]-，MS(ESI-)计算值：1722.8，实测值：1723.2。
实施例20：接头-药物XD63的合成
A：膦酸酯XD61的制备
(E)-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸二甲酯(XL1)
将甲基膦酸二甲酯(13.1ml，121mmol)溶解在THF(440ml)中并冷却至-78℃，随后添加正丁基锂(75ml，121mmol)。将混合物在-78℃下搅拌1小时，并随后温热至-50℃，随后添加CuI(11.5g，60.4mmol)，并在该温度下搅拌1小时。将混合物再次冷却至-78℃，并添加溶解在THF(110ml)中的XD51(19.7g，54.9mmol)。使反应物温热至RT，过夜，并随后用饱和NH4Cl水溶液(500mL)进行淬灭。将混合物用EtOAc(2×500mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的0至100％EtOAc)纯化粗物质，以得到作为黄色油状物的XL1(23.2g，95％产率)。
对于C24H36O4PSi+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：447.2，实测值：447.4。
B：接头-药物XD63的制备
双(2-氰乙基)(E)-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD60)
如一般性操作XXB中所述的，将膦酸酯XL1(580mg，1.30mmol)转化成膦酰二氯。然后使粗产物与3-羟基丙腈如针对XD21的合成所述进行反应，不同之处在于使用2,6-卢剔啶代替吡啶。通过快速色谱(硅胶，在庚烷中的20至100％ EtOAc)纯化粗制物，得到作为无色油状物的膦酸酯XD60(360mg，53％)。
对于C28H37N2NaO4PSi+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：547.2，实测值：547.5。三乙胺2-氰乙基(E)-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-4-甲基戊-3-烯-1-基)膦酸酯(XD61)
在RT下，将DBU(0.053ml，0.349mmol)添加至膦酸酯XD60(122mg，0.233mmol)在THF(2ml)中的溶液。在搅拌30分钟之后，将混合物浓缩至约0.5mL，并将溶液用MeOH(1mL)稀释。然后通过使溶液通过短的DOWEX 50WX8(H+形)塞状物来除去DBU，使用甲醇来洗脱产物。
将三乙胺(0.032ml，0.233mmol)添加至洗脱液中，并将混合物浓缩并与MeCN共蒸发(2×)。膦酸酯XD61(120mg，97％)以比例为1:0.6的膦酸酯:Et3N作为三乙胺盐分离出来。
对于C25H33NO4PSi-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：470.2，实测值：470.4。
(9H-芴-9-基)甲基((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-氰基乙氧基)((E)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯-1-基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(XD62)
步骤1：将膦酸酯XD61(187mg，0.326mmol)和Fmoc-Val-Cit-PAB(295mg，0.490mmol)合并在圆底烧瓶中，并与DMF(3×8mL)共蒸发。然后在RT下，在N2下引入DMF(3.2ml)，随后添加PyBOP(255mg，0.490mmol)和DIPEA(0.057ml，0.326mmol)。在5分钟之后添加更多的DIPEA(0.114ml，0.653mmol)，并将混合物搅拌2小时。然后将反应混合物缓慢且逐滴添加至水(70mL，0℃)中。应温和地搅拌，以避免凝胶形成。将白色混悬液温和搅拌5分钟，并随后过滤。收集固体并与MeCN共蒸发(2×)以除去痕量的水。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至12％ MeOH)纯化固体，得到作为白色固体的产物(263mg，76％)。对于C58H72N6O9PSi+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：1055.5，实测值：1056.0。
步骤2：在N2下将一部分产物(257mg，0.244mmol)混悬于PFA小瓶中的THF(3.8ml)和吡啶(0.370ml)中。将小瓶冷却至0℃，并引入HF·吡啶(0.25ml，70％)。将混合物在该温度下搅拌6小时，并随后小心地将冷却的混悬液添加至EtOAc混合物中的冷(0℃)饱和NaHCO3水溶液/10％iPrOH中。在搅拌5分钟之后，将层分离并将有机相用HCl水溶液(1M)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在硅胶上浓缩。通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至15％MeOH)纯化，得到作为白色固体的醇XD62(148mg，74％)。
对于C42H54N6O9P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：817.4，实测值：817.8。
接头-药物XD63
在具有以下修改的情况下类似于XD57合成中的步骤3和4，在NaOH下进行膦酸酯XD62的去保护，随后将酰胺与2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯进行偶联，并通过RP-HPLC进行纯化。步骤3：使用5当量NaOH(2M)并且反应时间为2小时。步骤4：使用2当量OSu酯。获得了作为白色固体的接头-药物XD63(47.9mg，36％)。
对于C34H52N6O10P+[M+H]+，MS(ESI+)计算值：735.4，实测值：735.7。
实施例21：接头-药物XD65的制备
(9H-芴-9-基)甲基((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((((E)-4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(XD64)
在RT下，在N2下，将Fmoc-Val-Cit-PAB(300mg，0.499mmol)溶解在DMF(7.0ml)中，并添加(3-((双(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(0.174ml，0.548mmol)，随后逐滴添加在MeCN(0.45M，1.22ml，0.548mmol)中的四唑。将混合物在RT下搅拌2小时。同时，将醇XD47(282mg，0.828mmol，如Serra,S.Tetrahedron:Asymmetry,2014,25,1561-1572所述合成)和5-(乙硫基)-1H-四唑(143mg，1.097mmol)装载在10mL圆底烧瓶中，并与无水MeCN共蒸发。在N2下将剩余物溶于DMF(0.5ml)中，并随后在RT下通过插管将该混合物添加至反应混合物。在过夜搅拌之后，在0℃下添加tBuOOH(在癸烷中的5.5M，0.199ml，1.097mmol)，并在2分钟之后，使反应物温热至RT并将其搅拌90分钟。然后在搅拌下将反应物倒入冰冷的水(70mL)中，并且在5分钟之后将混悬液过滤，并用少量的水(2×6mL)洗涤。然后通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至10％ MeOH)纯化固体，以得到产物和Fmoc-Val-Cit-PAB的混合物(354mg)。该物质不经进一步纯化即可用于下一步。对于C57H69N6NaO10PSi+[M+Na]+，MS(ESI+)计算值：1079.5，实测值：1079.9。
接头-药物XD65
将(9H-芴-9-基)甲基((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((((E)-4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-甲基丁-2-烯-1-基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(162mg，0.153mmol)溶解在DMF(3.0ml)中。在RT下添加TBAF(在THF中的1.0M，458μl，0.458mmol)。在35分钟之后，添加更多的TBAF(在THF中的1.0M，1.30mL，1.30mmol)，并使反应继续进行45分钟。添加乙醚(约50mL)以得到具有混浊上清液的油状物。除去上清液并将剩余油状物用乙醚处理两次(添加乙醚、旋动、然后倾析)。在RT下，将油状剩余物溶于DMF(0.3mL)中，并添加乙酸(0.044mL，0.764mmol)，随后添加DIPEA(0.080mL，0.458mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(70.6mg，0.229mmol)。在25分钟之后，观察到完全转化。添加乙酸(0.044mL，0.764mmol)并将混合物浓缩。通过制备型RP-HPLC(MilliQ×0.1％ TFA/MeCN，梯度：90:10至40:60)纯化粗制物，并将产物级分冻干。在这些酸性条件下冻干后观察到了部分分解。将一部分不纯的产物通过制备型RP-HPLC(在MilliQ/MeCN中10mM NH4HCO3，梯度：90:10至65:35)再纯化，以在冻干之后得到接头-药物XD65(15.3mg)。
对于C33H48N6O11P-[M-H]-，MS(ESI-)计算值：735.3，实测值：735.9。
实施例22：从接头-药物化合物(LD)合成缀合物
表1中使用的ADC编号示出了如实施例中所公开合成的对应的接头-前药，以及所使用的抗体。
表1中所示缀合物中使用的抗体为：
●抗CD20单克隆抗体(MoAb)利妥昔单抗(r)
●抗Her2 MoAb曲妥珠单抗(t)或曲妥珠单抗-41C(t41C)，其中在抗体重链(HC)中第41位的氨基酸已被半胱氨酸替代。
●抗CD123 MoAb(CD123，其为专有MoAb，Byondis B.V)。
●抗5T4-Moab(5T4)，其为在WO2015/177360中作为H8-HC41C(重链包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列)公开的抗5T4抗体。
●抗PSMA MoAb SYD1030 41C(p41C)，其为在WO2015/177360中作为SYD1030(重链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列)公开的在重链的第41位具有经改造半胱氨酸的抗PSMA抗体(即HC41C)。
●同种型对照抗体(i)。所使用的同种型对照抗体包含登录号为2NY7的人抗HIV-1pg120抗体B12的可变结构域序列(Zhou et al,2007,Nature,445,732-737)，并且已被用作IgG1κ同种型对照抗体(登录号分别为P01857和P01834)。
根据实施例22a至c中所述的方法来合成相应的缀合物。根据实施例22a中所述的操作合成表1中示出的具有低于8的DAR的所有缀合物，具有DAR2的缀合物除外，其如实施例22b中所述通过位点特异性缀合来制备。通过实施例22c中所述的操作来制备具有较高DAR(8及高于8)的缀合物。表1中也示出了DAR(缀合物中的pAg与抗体比率)。
实施例22a：具有DAR2的缀合物的合成
向抗体溶液(10至12mg/mL)添加TRIS(1体积％，1M，pH 8)、EDTA(4体积％，25mM)和TCEP(在水中5mM)。将所得溶液在RT下孵育2小时。在孵育之后，将还原的抗体重新缓冲至4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)并用二甲基乙酰胺(dimethylacetamide，DMA)和接头-药物化合物(LD)(在DMA中为10mM，>1.5当量/SH)处理。最终DMA含量为约10体积％。将所得混合物在RT下在黑暗中进行辊式混合，过夜。添加活性炭，并将混悬液在黑暗中进行辊式混合1小时，过滤，用4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)洗涤。将溶液重新缓冲至4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)中，并进行无菌过滤。
实施例22b：通过位点特异性缀合合成具有DAR2的缀合物
通过位点特异性缀合合成一些具有DAR2的缀合物(ADC-XD18-CD12341C、ADC-XD18-5T441，如表1中所示)，其中根据Kabat编号系统，接头药物分子仅与抗体重链中第41位上的两个经改造半胱氨酸(“41C”)连接。这些缀合物根据WO2015177360和WO2017137628中公开的方法制备。
实施例22c：具有较高DAR(DAR8、DAR16和DAR10、DAR20)的缀合物的合成
向抗体溶液(在4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)中为12mg/mL)添加EDTA(在水中25mM，4％v/v)和TRIS(在水中1M，pH 8，2％v/v)。
对于具有DAR为8或16的缀合物，使用野生型抗体。对于具有DAR为10或20的缀合物，使用41C经修饰抗体，其中根据Kabat编号系统，重链中第41位的氨基酸被半胱氨酸替代。该修饰导致在抗体的氨基酸序列中引入2个另外的半胱氨酸(可在下一步中用TCEP还原)，导致接头药物(LD)的总共10个潜在连接位置。
添加TCEP(在水中10mM，30当量)，并将所得混合物在RT下孵育过夜。使用4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)通过离心浓缩器(Vivaspin过滤器，30kDa截留，PES)除去反应物。
添加DMA，随后添加适当的接头-药物的溶液。对于具有DAR＝8和DAR＝16的缀合物，添加16当量的10mM DMA。对于具有DAR＝10或20的缀合物，添加20当量的10mM DMA。
用基于支化接头的接头药物来制备具有DAR16和DAR20的缀合物，其中每个支化接头携带两个pAg部分(接头药物XD59，如表1中所示)。DMA的最终浓度为10％。
将所得混合物在RT下在不存在光的情况下孵育3小时或过夜。为了除去过量的接头-药物，添加活性炭并将混合物在RT下孵育1小时。使用0.2μm PES或PVDF过滤器来除去炭，并使用Vivaspin离心浓缩器(30kDa截留，PES)将所得ADC配制在4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)中。最后，使用0.2μm PVDF过滤器对ADC溶液进行无菌过滤。
为了使缀合物的DAR(pAg与抗体比率)与目标DAR为2接近，如实施例22a或22b中所述进行合成，用疏水性seco-DUBA有效载荷(SYD980，描述于a.o.WO2015/177360中)进行替代缀合，这使通过HIC容易地进行DAR测定。
表1中示出了其中目标DAR为2的缀合物的所得近似DAR。对于如实施例22c中所述合成的具有较高DAR的缀合物，表1示出了目标DAR(用“目标”表示)。实际DAR可在某些程度上偏离该值(这意味着由于峰重叠(对于目标DAR 2的ADC)或由于所制备的ADC被完全还原/缀合(对于目标DAR 8/10/16/20的ADC)的事实，DAR不能由标准(HIC)技术测量)。
当对于DAR或％HMW得到多个值时，将其通过逗号隔开，这些是指同一ADC的不同批次(bach)。
在表1中，“<LOD”表示“低于检测限”。
表1：具有合成中使用的抗体和接头-药物(LD)化合物的合成缀合物
实施例23：γδT细胞上前药和缀合物的活性
为了确定(未缀合的)磷酸抗原前药活性，将Raji靶细胞与XC1和XD1预孵育，然后与含有效应细胞的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)共培养。在将PBMC与用磷酸抗原HMBPP、磷酸抗原前药XC1、XD1或表1中所列的缀合物预处理的肿瘤细胞(来自CD20阳性伯基特淋巴瘤(Burkitt’s Lymphoma)人肿瘤细胞系Raji)共培养之后，在体外研究了选择性γδT细胞活化。在下表2中列出了受试前药的结构式。
表2：磷酸抗原前药；结构式和代码
使用健康人供体的PBMC作为免疫细胞的来源。
一旦活化，Vγ9Vδ2γδT细胞产生细胞因子并释放细胞毒性颗粒(脱颗粒)，分别导致免疫活化和靶细胞杀伤。虽然已知仅Vγ9Vδ2γδT细胞感知磷酸抗原水平的波动，但诱导的一些效应机制是与其他免疫细胞，包括CD8+T细胞、NK细胞以及γδT细胞的其他亚群共有的。这些免疫细胞群全都存在于从健康供体的血液中分离的PBMC中。因此，PBMC代表了用于进行体外实验以确定γδT细胞的选择性活化的良好的细胞来源。
通过用经荧光标记的单克隆抗体进行特异性染色可实现对不同免疫细胞群的鉴定。当在PBMC和靶标的共培养期间添加莫能菌素和/或布雷菲德菌素A时，产生的IFNγ将被捕获在活化的细胞中。在存在皂苷的情况下，用经荧光标记的抗体染色，允许抗IFNγ抗体进入细胞，将鉴定出产生IFNγ的细胞。也可在共培养期间添加针对CD107a的经荧光标记的抗体，并且将会对已经历脱颗粒的细胞进行染色。因此，通过将经荧光标记的免疫细胞特异性标志物与CD107a-标志物和IFNγ-标志物组合，可确定与预处理的靶细胞共培养之后的γδT细胞和/或其他免疫细胞亚群的活化状态。
材料和方法
使用CD20阳性伯基特淋巴瘤人肿瘤细胞系Raji(DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心(German collection of Microorganisms and cell cultures)GmbH(莱布尼茨研究所(Leibniz Institute)，德国))进行体外实验。在补充有10％热灭活(Heat-inactivated，HI)胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)(Gibco-Life Technologies；Carlsbad，CA)和80U/mL青霉素-链霉素溶液(Lonza Group Ltd，Basel Switzerland)的完全生长培养基(complete growth medium，CGM):RPMI-1640(Lonza，Walkersville，MD，USA)中培养Raji细胞。将Raji细胞保持在37℃下在含有5％ CO2的湿润培养箱中，并且每周传代培养两次。
为了用根据本发明的缀合物(ADC)、未缀合的磷酸抗原前药和HMBPP进行刺激，收获Raji细胞，并将其稀释至5×106个细胞/mL的浓度，并将50μL(相当于250,000个细胞/孔)的该细胞混悬液接种到96孔板中。在CGM中制备2倍浓缩、10倍连续稀释的前药和ADC。将接种的Raji细胞在37℃下在具有5％ CO2的湿润培养箱中与50μL/孔的连续稀释的化合物孵育过夜(O/N)。
第二天，通过添加100μL/孔CGM来洗涤具有Raji细胞和化合物(ADC、未缀合的磷酸抗原前药或HMBPP)的96孔板，在室温(RT)下以300×g离心3分钟，并除去上清液来除去过量的未结合化合物。
作为免疫细胞的来源，将健康人供体的冷冻外周血单个核细胞(PBMC)解冻，重悬于CGM中，并将其在37℃下在具有5％ CO2的湿润培养箱中放置O/N以使细胞恢复。
收获恢复的PBMC，对其进行计数并在CGM中稀释至10×106个细胞/mL的浓度，并向Raji细胞添加50μL/孔(相当于0.5×106个细胞/孔)。在包含GolgiStop(莫能菌素)和GolgiPlug(布雷菲德菌素A)(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)的CGM中制备2倍浓缩的抗CD107a-AlexaFluor 647溶液，并向Raji-PBMC共培养物中添加50μL/孔。在所有实验中，孔中还包含已知作为免疫细胞的非特异性活化剂的1％植物血凝素(PHA-M，Gibco-ThermoFisher)作为阳性对照。将样品在37℃下在具有5％ CO2的湿润培养箱中孵育6小时。
对于免疫细胞亚群的特异性染色，在Brilliant染色缓冲液中制备多色抗体染色混合物，其包含抗CD3 BUV396(并非在所有情况下都包含)、抗CD8 BV421、抗CD56 PE-Cy7、可固定生存力染色剂780(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)、抗TCR Vδ1PerCP-Vio700、FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)和抗TCR Vδ2BV711(Biolegend，San Diego，USA)。在6小时孵育期之后，将板在RT下以300×g离心3分钟，并弃去上清液。将沉淀物重悬于50μL抗体混合物中，并在冰上避光孵育30分钟。通过添加100μL冰冷的FACS缓冲液(PBS1×，0.1％v/wBSA，0.02％v/v叠氮化钠(NaN3))将板洗涤两次，随后以300×g离心3分钟，并弃去上清液。使用100μL/孔Cytofix/Cytoperm溶液(BDbioscience，San Jose，CA，USA)固定和透化细胞，并在冰上避光孵育20分钟。通过添加含有皂苷的150μL BD Perm/wash溶液(在蒸馏水中稀释10×BD Perm/Wash缓冲液，以在使用之前制成1×溶液)将细胞洗涤三次，随后以300×g离心3分钟，并弃去上清液。最终，将细胞重悬于FACS缓冲液中，并在冰箱中在4℃下避光储存O/N。
在第三天，将经染色的PBMC/Raji细胞在150μL BD Perm/wash溶液中洗涤一次，随后以300×g离心3分钟，并弃去上清液。将沉淀物重悬于在Perm/Wash溶液中稀释的50μL抗IFNγBV650(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)的混合物中，并在冰上避光孵育30分钟。在孵育之后，将板用150μL冰冷的FACS缓冲液洗涤一次，随后以300×g离心3分钟，并弃去上清液。之后，将细胞沉淀物重悬于150μL FACS缓冲液中，并使用具有相应的高通量采样器(High Throughput Sampler)的BD FACSymphony A3细胞分析仪(BD Biosciences，SanJose，CA，USA)分析样品，以分析96孔板中的样品。
设门策略
使用FlowJo V10.7进行分析，并对获取的样品进行电子设门，以限定多种免疫细胞群(图1)。首先，应用时间门以确保恒定的流量(图1A)并排除潜在不规则性，然后在FSC-Avs.FSC-H和SSC-A vs.SSC-H图上排除双联体和死细胞(图1B和图1C)。
然后选择有生存力的细胞(图1D)，随后基于FSC/SSC(图1E)选择淋巴细胞。然后将CD3阴性、CD56阳性细胞鉴定为NK细胞(图1F)。进一步将CD3阳性细胞分为Vδ2和Vδ1阳性细胞(图1G)。还将淋巴细胞细分为CD8阳性细胞毒性T细胞(图1H)，产生4种细胞家族：
-NK细胞被限定为CD3-CD56+细胞，
-CD8+T细胞被限定为CD3+Vδ1-Vδ2-CD8+，
-vδ1γδT细胞被限定为CD3+Vδ1+Vδ2-，且
-vδ2γδT细胞被限定为CD3+Vδ1-Vδ2+。
值得注意的是，在此用于对Vδ2γδT细胞染色的B6克隆仅使Vγ9Vδ2γδT细胞染上色，而不是Vδ2γδT细胞的Vγ9-群。对于这四种免疫细胞群，确定了CD107a+或IFNγ+细胞的比例。另外，将CD107+或IFNγ+细胞群的中值荧光强度确定为每个细胞的活性的量度。CD107a已被描述为是脱颗粒的标志物，并与靶细胞杀伤密切相关。由布雷菲德菌素A/莫能菌素处理而阻止排泄造成的IFNγ累积是IFNγ细胞因子产生的量度。
结果/结论
可透过细胞膜的前药诱导Vδ2γδT细胞的活化
前药XC1和XD1二者均剂量依赖性地诱导原代人PBMC中Vδ2γδT细胞群的IFNγ产生和脱颗粒(即CD107a)(图2A，图2C)，而没有诱导其他免疫细胞(NK细胞、CD8+T细胞、Vδ1γδT细胞)的直接活化(图2B，图2D)。阳性对照植物血凝素(PHA-M)能够活化所有免疫细胞(图3A至D，图3I至L)，表明这些免疫细胞保留了其免疫原性潜力。与用HMBPP预处理相比，用XC1和XD1预处理的Raji细胞更有效地诱导Vδ2γδT细胞的IFNγ产生和脱颗粒(图2A，图2C)。
如实施例4中所述，通过可切割接头使三种前药与利妥昔单抗或非结合同种型对照缀合。用CD20靶向ADC-XC4-r、ADC-XD4-r和ADC-XD13-r预孵育的Raji细胞剂量依赖性地诱导Vδ2γδT细胞的IFNγ产生，其中平均EC50为169、220、2622ng/ml；以及脱颗粒(CD107a)，其中平均EC50分别为51.3、45.5、470ng/ml(图4，图5A、B，图6，表3)。由于各自的非结合对照ADC-XC4-i和ADC-XD4-i诱导Vδ2γδT细胞活化的效力低，并且非结合对照ADC-XD13-i不诱导Vδ2γδT细胞的IFNγ产生或脱颗粒，因此强效的Vδ2γδT细胞活化依赖于靶细胞介导的ADC活化(图4)。
正如所预期的，用CD20结合抗体利妥昔单抗预处理的Raji细胞也活化了Vδ2γδT细胞。然而，利妥昔单抗-ADC比利妥昔单抗本身在更多的Vδ2γδT细胞中诱导脱颗粒和IFNγ产生(图5C、图5D)，并且还诱导每个细胞更高的CD107a和IFNγ表达(图5E、图5F，图6)。
经利妥昔单抗预处理的Raji细胞还活化了NK细胞，很可能是通过公知的由NK细胞表达的FcγR进行的。经ADC预处理的Raji细胞没有进一步提高活化的NK细胞的比例(图4B、图4F)。这些结果表明，用所述CD20结合ADC预处理肿瘤细胞与用利妥昔单抗预处理肿瘤细胞相比导致了剂量依赖性的更有效的Vδ2γδT细胞的IFNγ诱导和脱颗粒，并且依赖于靶标结合和内化，表明本发明的ADC可改善抗肿瘤免疫应答。所述ADC具有活性Fc尾，其很可能通过明确限定的FcγR相互作用活化其他免疫细胞。
表3.通过经前药预处理的Raji细胞诱导的指定免疫细胞群的IFNγ或CD107a表达
EC50(ng/ml)值表示达到50％活化的浓度。
n.d.＝未确定。
#＝不能通过GraphPad prism确定。
实施例24：由不同pAg缀合物诱导的Vδ2γδT细胞活性
将多种合成的磷酸抗原(pAg)缀合物与利妥昔单抗(抗CD20)连接，并测试其在与CD20阳性Raji细胞孵育过夜之后选择性活化Vδ2γδT细胞的能力。受试缀合物在表1中所示的列表中。将预处理的Raji细胞与PBMC共培养，并如实施例23中所述使用多色流式细胞术确定Vδ2γδT细胞、Vδ1γδT细胞、CD8阳性T细胞和NK细胞的活化(IFNγ和TNFα产生)和脱颗粒(CD107a)。
材料和方法
细胞结合
如实施例23中所述培养Raji细胞。对于96孔板中的细胞结合，将100,000个Raji细胞/孔用冰冷的FACS缓冲液(PBS1×，0.1％v/w BSA，0.02％v/v叠氮化钠(NaN3))洗涤两次，随后添加在冰冷的FACS缓冲液中稀释的一定浓度范围的50μL/孔的pAg缀合物、裸抗体(例如利妥昔单抗)或非结合同种型对照pAg缀合物。在4℃下，在30分钟孵育时间之后，将细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤两次。然后，添加50μL/孔APC缀合的第二F(ab’)2山羊抗人IgG(Fc片段特异性，Jackson Immuno research,109-136-098,1:6000或1:500)。在4℃下，在30分钟之后，将细胞洗涤两次并重悬于150μL冰冷的FACS缓冲液中。使用FACSVerse或FACSymphony(BD Biosciences)，通过流式细胞术测定荧光强度，并将其表示为中值荧光强度(MFI)。在GraphPad Prism第9版中，通过具有可变斜率(四个参数)的非线性回归拟合曲线。在GraphPad Prism中将EC50值计算为以μg/mL计的浓度，其给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应。结合实验进行N＝2或N＝3次。
直接化合物相关的细胞死亡的确定
将Raji细胞平板接种在96孔板(90μL/孔，1000个细胞/孔)或384孔板(45μL/孔，500个细胞/孔)中的补充有10％热灭活(HI)胎牛血清(FBS)(Gibco-Life Technologies；Carlsbad，CA)和80U/mL青霉素-链霉素溶液(Gibco-Life Technologies；Carlsbad，CA)的CGM(完全生长培养基，RPMI-1640(Gibco-Life Technologies；Carlsbad，CA)中，并在37℃下在含有5％ CO2的湿润培养箱中孵育。在过夜孵育之后，添加10μL或5μL一定浓度范围的抗体(例如利妥昔单抗)、pAg缀合物或对照化合物(毒素(倍癌霉素型):环丙基DC1)。在6天之后，使用来自Promega公司(Madison，WI)的CellTiter-GloTM(CTG)发光测定试剂盒，根据制造商的说明评估代谢活性。细胞生存力表示为相对于未经处理的细胞或经载剂处理的细胞(仅生长培养基或1％ DMSO)的平均值的存活百分比乘以100。通过从100％减去剂量响应曲线(dose response curve，DRC)的底部来计算效力。
功能测定(确定由不同pAg缀合物诱导的γδT细胞活性)
如实施例23中所公开的进行功能测定。除了抗IFNγBV650之外，在胞内细胞因子染色步骤期间，大多数实验中还包含抗TNFαPE(BD Biosciences，San Jose，CA，USA，克隆Mab11)。将抗体/缀合物用于预处理Raji细胞的最高化合物浓度为150μg/mL。在GraphPadPrism中将EC50值计算为以μg/mL计的浓度，其给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应。在汇总图中，从来自与用最高化合物浓度(例如，对于抗体和pAg缀合物为150μg/mL，或者当来自最高化合物的数据遇到技术问题时为30或6μg/mL)预处理的Raji细胞共培养的样品确定了“活化(细胞)％”以及CD107a、IFNγ和TNFαMFI。
结果/结论
利妥昔单抗-缀合物以比利妥昔单抗更高的效力和功效活化Vδ2γδT细胞
产生了多种与利妥昔单抗和非结合性对照连接的pAg缀合物，其中药物与抗体比率为约2。其与Raji细胞的结合与裸利妥昔单抗相当(表4)，而非结合同种型对照没有显示出结合。还确定了pAg缀合物是否对CD20阳性Raji肿瘤细胞具有直接的细胞毒性作用。将一定浓度范围的pAg缀合物ADC-XC4-r、ADC-XD4-r、ADC-XD-13-r、ADC-XS2-r、ADC-XD18-r、ADC-XC9-r、ADC-XC13-r、ADC-XS7-r、ADC-XS12-r、ADC-XS17和ADC-XS22-r以及各自的非结合对照pAg缀合物与Raji细胞一起孵育6天，并使用确定细胞存活。受试pAg缀合物、HMBPP和唑来膦酸均未诱导显著的(>15％)直接化合物相关的细胞死亡，而阳性对照(倍癌霉素型毒素)非常有效(图7)。因此，不再测试其他pAg缀合物。表4：与裸利妥昔单抗相比的利妥昔单抗pAg缀合物与Raji细胞的结合。EC50(μg/ml)值表示达到50％活化的浓度。
置信区间不可靠；>150＝高至150μg/mL无剂量依赖性响应；N/A＝不适用
在与Raji细胞过夜孵育，随后与含有Vδ2γδT细胞的PBMC共培养6小时之后，测试产生的pAg缀合物诱导选择性Vδ2γδT细胞活化的能力。生成Vδ2γδT细胞脱颗粒、IFNγ和TNFα产生的剂量-响应曲线(通过图8中的CD107a产生举例说明)，并且这些结果表明，用非结合同种型对照pAg缀合物预处理的Raji细胞活化Vδ2γδT细胞的效力低，并且不能可靠地计算EC50值。对于利妥昔单抗pAg缀合物，计算EC50值和效力(表5至10)。箱线图示出了CD107a、IFNγ和TNFαEC50值、效力和MFI的概览(图9)。由pAg缀合物诱导的脱颗粒与IFNγ产生相关(图10)。由于未在每个实验中评估TNFα产生，所以没有生成这种细胞因子的相关性图。
图8至10和表5至10中示出的结果表明，经pAg缀合物预处理的Raji细胞诱导剂量依赖性CD107a、IFNγ和TNFα产生，当与利妥昔单抗预处理相比时，这对于大多数pAg缀合物更强效(更低的EC50)(ADC-XD65-r(更高的CD107a、IFNγ和TNFαEC50值)、ADC-XD44-r(更高的CD107a和IFNγEC50值)以及ADC-XD13-r和ADC-XS12-r(更高的IFNγEC50值)除外)。除ADC-XD65-r之外，所有pAg缀合物均比利妥昔单抗活化更多的Vδ2γδT细胞(％活性)，并且产生的细胞因子的量和脱颗粒(MFI)更高。总的来说，这些结果表明，与pAg缀合物预孵育的Raji细胞强有力且高效地活化了Vδ2γδT细胞。
虽然大多数pAg缀合物在诱导Vδ2γδT细胞活性方面是强效且高效的，但ADC-XD65-r与利妥昔单抗相比不那么强效和高效。因此，产生了该化合物的DAR8。当用Raij细胞预处理时，与ADC-XD65-r相比，ADC8-XD65-r在诱导Vδ2γδT细胞活化方面更强效和高效，如通过CD107a、IFNγ和TNFα产生测量的(图11)。因此，提高DAR使得低效pAg缀合物的活性得到改善。
表5：由利妥昔单抗pAg缀合物或利妥昔单抗预处理的Raji细胞诱导的Vδ2γδT细胞的CD107a EC50(μg/mL)。当区域为空时，未确定EC50值(未测试)。字母表示所使用的供体。当在两个不同的实验中测试相同供体时，其用“1”或“2”表示。Rmab＝利妥昔单抗。
值不能可靠地确定
表6：由利妥昔单抗pAg缀合物或利妥昔单抗预处理的Raji细胞诱导的Vδ2γδT细胞的IFNγEC50(μg/mL)。当区域为空时，未确定EC50值(未测试)。字母表示所使用的供体。当在两个不同的实验中测试相同供体时，其用“1”或“2”表示。Rmab＝利妥昔单抗。
＝EC50值不能可靠地确定
表7：由利妥昔单抗pAg缀合物或利妥昔单抗预处理的Raji细胞诱导的Vδ2γδT细胞的TNFαEC50(μg/mL)。当区域为空时，未确定EC50值(未测试)。字母表示所使用的供体。当在两个不同的实验中测试相同供体时，其用“1”或“2”表示。Rmab＝利妥昔单抗。
值不能可靠地确定
表8：由利妥昔单抗pAg缀合物或利妥昔单抗预处理的Raji细胞诱导的CD107a阳性Vδ2γδT细胞％。空区域是未测试的。字母表示所使用的供体。当在两个不同的实验中测试相同供体时，其用“1”或“2”表示。Rmab＝利妥昔单抗。
＝由于技术问题而排除
表9：由利妥昔单抗pAg缀合物或利妥昔单抗预处理的Raji细胞诱导的IFNγ阳性Vδ2γδT细胞％。空区域是未测试的。字母表示所使用的供体。当在两个不同的实验中测试相同供体时，其用“1”或“2”表示。Rmab＝利妥昔单抗。
＝由于技术问题而排除
表10：由利妥昔单抗pAg缀合物或利妥昔单抗预处理的Raji细胞诱导的TNFα阳性Vδ2γδT细胞％。空区域是未测试的。字母表示所使用的供体。当在两个不同的实验中测试相同供体时，其用“1”或“2”表示。Rmab＝利妥昔单抗。
＝由于技术问题而排除
实施例25：在用pAg ADC-XD18-r预处理之后Vδ2γδT细胞对Raji细胞的有效杀伤。
Vδ2γδT细胞可裂解用治疗性抗体如利妥昔单抗调理的肿瘤细胞(Sabrina Brazaet al.,2011,Haematologica,96(3),400-407)，最可能是通过γδT细胞上表达的CD16(经典的抗体依赖性细胞毒性，ADCC)。然而，并不是所有的γδT细胞都表达CD16(SabrinaBraza et al，同上)。Vδ2γδT细胞也可强效地杀伤具有高水平pAg的肿瘤细胞。这些pAg胞内诱导BTN3A1/BTN2A1受体复合物的构象变化，导致γδ-T细胞活化并杀伤靶细胞(Rigauet al，同上)。在此确定了肿瘤靶向抗体是否可用作将pAg递送至肿瘤细胞中的载剂，导致Vδ2γδ-T细胞的特异性肿瘤细胞杀伤。为此，将Raji细胞用利妥昔单抗pAg缀合物预处理，并在与Vδ2γδ-T细胞共培养1小时之后研究细胞毒性。
材料和方法
γδT细胞扩增
为了获得大量的Vδ2γδT细胞，使用标准方案用IL-2和唑来膦酸扩增Vδ2γδT细胞(Kondo et al.,2008,Cytotherapy,10(8):842-56.doi:10.1080/14653240802419328.)。为此，将从健康供体的血沉棕黄层分离的冷冻PBMC(Sanquin,Nijmegen,The Netherlands)解冻，并以1250万个细胞接种于T25中的10mL CTSTM OpTmizerTM T细胞扩增无血清培养基(CTS培养基，Gibco，A3705001；根据制造商的说明，在使用之前将基础培养基和浓缩培养基预混合，并添加10％热灭活(HI)胎牛血清(FBS)(Gibco)和80U/mL青霉素-链霉素溶液(Gibco)以及glutamax(Gibco))加上1000个国际单位(international unit，IU)的重组人(rh)IL-2(Miltenyi，130-097-746)和5μM唑来膦酸(Merck)中，并将其在37℃下在含有5％CO2的湿润培养箱中培养3天。在3天之后，将细胞转移至T75烧瓶中，并添加加有1000IUrhIL-2的CTS培养基。在第8天，将细胞转移至T175烧瓶中，并添加加有1000IU rhIL-2的CTS培养基。在13或14天之后，通过流式细胞术评估细胞的纯度及其表型。所使用的9个不同健康供体的活细胞的Vδ2γδT细胞纯度为67.3、81.7、82.8、84.5、87、90.6、91.2、92和95.4％。在14天之后将扩增的Vδ2γδT细胞用于杀伤测定。为此，将细胞沉淀并在完全生长培养基(CGM；补充有10％热灭活(HI)胎牛血清(FBS)(Gibco)和80U/mL青霉素-链霉素溶液(Gibco)的RPMI-1640(Gibco))中重悬至200万个细胞/mL。
为了对扩增的Vδ2γδT细胞进行表型分析和纯度确定，将500,000个细胞/孔添加至U型底96孔板，用冰冷的FACS缓冲液(PBS1×，0.1％v/wBSA，0.02％v/v叠氮化钠(NaN3))洗涤两次，并将细胞沉淀物重悬于在冰冷的FACS缓冲液中稀释的100μL抗体混合物：抗Vδ2BV711(克隆B6，Biolegend，1:300)、抗CD56 AlexaFluor647(克隆B159，BD Bioscience，1:200)、抗CD16 FITC(克隆3G8，BD Biosciences，1:50)、可固定生存力染色剂780(ThermoFisher Scientific，1:1000)中。在黑暗中在冰上孵育30分钟之后，然后通过添加冰冷的FACS缓冲液将细胞洗涤两次，随后以300×g离心3分钟，并弃去上清液。将沉淀物重悬于150μL冰冷的FACS缓冲液中，并使用BD FACSymphony A3细胞分析仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)进行分析。使用FlowJo V10.7进行进一步分析。将Vδ2γδT细胞限定为活Vδ2+细胞。
杀伤测定
如实施例23中所述培养Raji细胞。
对于杀伤测定，首先将Raji细胞用PBS(Gibco，2326202)洗涤两次，并随后在黑暗中在37℃下用10μM细胞增殖染料eFluor 450(Thermofisher Scientific，65-0842-85)标记10分钟。在冰上添加4至5体积的CGM持续5分钟之后，将细胞用RPMI-1640加10％ HI-FBS洗涤3次，在CGM中稀释至200,000个细胞/mL，并以50μL/孔平板接种到96孔板(GreinerBio-one，650185，U型底)中。然后，添加50μL/孔的一定浓度范围的在CGM中稀释的利妥昔单抗pAg缀合物、利妥昔单抗，或者0.1mM或0.013mM HMBPP，并在37℃下在含有5％ CO2的湿润培养箱中孵育16小时。值得注意的是，所使用的HMBPP的浓度显示出诱导了最大效力(数据未显示)。在16小时之后，添加100μl CGM/孔，并通过以300×g离心沉淀细胞，除去上清液，并将100,000个扩增的Vδ2γδT细胞(培养的第14天)以50μL/孔的体积添加至每个孔。将板放置在37℃下的含有5％ CO2的湿润培养箱中并孵育1小时。然后通过以300×g离心3分钟来沉淀细胞，并除去上清液。将细胞重悬于50μL加有抗CD19 FITC(Miltenyi130-113-645)的可固定生存力染色剂780(BD Biosciences，在冰冷的FACS缓冲液中1000×稀释的)中，在黑暗中在冰上孵育30分钟，并通过添加150μL冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心3分钟。然后将细胞沉淀物重悬于50μL BD cytofix溶液(554655)中，并在黑暗中在冰上孵育15分钟之后，通过添加150μL冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，离心(300×g，3分钟)并除去上清液。最后，将细胞重悬于150μL冰冷的FACS缓冲液中，并使用BD FACSymphony A3细胞分析仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)进行分析。使用eFluor450染料对Raji细胞进行设门，并使用生存力染色来确定死亡Raji细胞％。使用FlowJo V10.7进行进一步分析。效力＝用最高浓度的化合物预处理的死亡Raji细胞％-未用化合物预处理的死亡Raji细胞％。
结果/结论
当将Raji细胞用利妥昔单抗预处理时，检测到来自大多数供体的扩增的Vδ2γδT细胞的剂量依赖性杀伤(图12)。利妥昔单抗的效力是可变的，并正如所预期的，与扩增的Vδ2γδT细胞上CD16的表达相关，这也显示出了高的供体间变化(图12B)。与HMBPP预处理相比，由利妥昔单抗预处理诱导的效力总是较低。当将扩增的Vδ2γδT细胞暴露于用ADC-XD18-r预处理的Raji细胞时，观察到Raji细胞的剂量依赖性杀伤，并且与HMBPP预处理的Raji细胞相比，其效力在相似的范围内并高于利妥昔单抗的效力(图12A和图12D)。非结合同种型pAg缀合物的效力低，并且对Vδ2γδT细胞活化的可靠的EC50计算是不可能的(图12A和图12C)。总的来说，这些结果表明利妥昔单抗pAg缀合物可以以TAA特异性方式强效且高效地促使(confer)肿瘤细胞成为靶标，从而被Vδ2γδT细胞破坏。
实施例26：来源于多种B细胞恶性病的CD20阳性细胞系在与ADC-XD18-r预孵育之后强效且高效地活化Vδ2γδT细胞。
用代表具有不同CD20表达水平的不同B细胞恶性病(CLL，NHL)的多种CD20阳性细胞系来测试ADC-XD18-r的活性(表11)。为此，将B细胞系首先用化合物预处理16小时，并随后与PBMC共培养。通过确定脱颗粒(CD107a产生)水平来评估Vδ2γδT细胞活化。
材料和方法
功能测定
如实施例23中所述培养Raji细胞。人肿瘤细胞系MEC-1、HG-3、SU-DHL-4和SU-DHL-8细胞来自德国微生物和细胞培养物保藏中心GmbH(DSMZ，莱布尼茨研究所，德国)。在CGM中培养HG-3和SU-DHL-4细胞。在补充有20％热灭活(HI)胎牛血清(FBS)(Gibco)和80U/mL青霉素-链霉素溶液(Lonza)的RPMI-1640(Lonza)中培养SU-DHL-8。在补充10％热灭活(HI)胎牛血清(FBS)(Gibco-Life Technologies；Carlsbad，CA)和80U/mL青霉素-链霉素溶液(LonzaGroup Ltd，Basel Switzerland)的IMDM(12-722F，IMDM，Lonza)中培养MEC-1细胞。将所有细胞保持在37℃下在含有5％ CO2的湿润培养箱中，并且每周传代培养两次。
关于功能测定的材料和方法，参见实施例23，不同之处在于仅确定脱颗粒水平而不是IFNγ表达水平。因此，在第三个实验日，在BD FACSymphony A3细胞分析仪(BDBiosciences，San Jose，CA，USA)上直接分析细胞，然后与BD Perm/wash孵育。用于预处理Raji细胞的最高化合物浓度对于抗体/ADC为150μg/mL，并且对于HMBPP为0.1mM。在GraphPad Prism中将EC50值计算为以μg/mL计的浓度，其给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应。在汇总图中，从与用最高化合物浓度(例如，对于抗体和ADC为150μg/mL)预处理的Raji细胞共培养的样品中确定了“活化的Vδ2γδT细胞％”。
CD20表达水平确定
使用人校准物试剂盒(Biocytex，CP010)确定CD20受体表达水平。将靶细胞(96孔板中100,000个细胞/孔)用冰冷的FACS缓冲液(PBS+0.1％v/w BSA+0.02％v/v叠氮化钠(NaN3))洗涤两次，随后添加在冰冷的FACS缓冲液中稀释的一定浓度范围的50μL/孔利妥昔单抗(抗CD20)。在4℃下在30分钟的孵育时间之后，将细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤两次，并重悬于50μL FACS缓冲液中。然后，将来自人校准物试剂盒的50μL珠添加至96孔板的单独孔中。产生APC缀合的第二F(ab’)2山羊抗人IgG(Fc片段特异性，Jackson ImmunoResearch，最终1:3000，1:6000)的两倍浓缩储备溶液，并将50μL/孔添加至细胞和珠。在黑暗中在4℃下孵育30分钟之后，将细胞和珠在冰冷的FACS缓冲液中洗涤两次，并将其重悬于150μL冰冷的FACS缓冲液中。使用FACSymphony(BD Biosciences)通过流式细胞术确定荧光强度，并根据制造商的说明确定受体的绝对数目。实验进行了N＝2次。
结果/结论
本实施例中所使用的B细胞系表达不同水平的CD20(表11)。
表11：在与指定的经ADC-XD18-r或利妥昔单抗预处理的细胞系共培养之后，代表不同B细胞恶性病(CLL，NHL)的多种CD20阳性细胞系的CD20表达水平，以及Vδ2γδT细胞的CD107a EC50值(μg/mL)，使用CD107a作为读出。
＝不完整的饱和曲线(EC50不可计算)
所有受试B细胞系都具有活化Vδ2γδT细胞的能力，因为HMBPP预处理诱导了Vδ2γδT细胞的脱颗粒(图13A)。当将B细胞系用一定浓度范围的ADC-XD18-r预处理时，它们全都以比利妥昔单抗本身更高的效力(％活性)和功效诱导Vδ2γδT细胞的有效活化(图13B至F，表11)。非结合对照ADC以低的/可忽略不计的效力和功效诱导Vδ2γδT细胞活化。这些结果表明，当与具有低和高CD20表达水平的多种B细胞恶性肿瘤预孵育时，ADC-XD18-r实现了Vδ2γδT细胞的活化，而用非结合pAg缀合物预处理未能诱导Vδ2γδT细胞活化。
实施例27：经曲妥珠单抗-ADC预处理的HER2高细胞诱导Vδ2γδT细胞活化
为了示出pAg缀合物的活性概念性超过利妥昔单抗，将接头药物XD18与曲妥珠单抗缀合，以产生ADC-XD18-t。在将HER2阳性细胞系(在表12中示出)用这些新的ADC预处理并与PBMC共孵育之后，确定Vδ2γδT细胞活性。
材料和方法
功能测定
如实施例23中所公开的进行功能测定。在胞内细胞因子染色步骤期间，大多数实验中除抗IFNγBV650之外还包含抗TNFαPE(BD Biosciences，San Jose，CA，USA，克隆Mab11)。用于预处理Raji细胞的最高化合物浓度对于抗体/ADC为150μg/mL，并且对于HMBPP为0.1mM。在GraphPad Prism中将EC50值计算为以μg/mL计的浓度，其给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应。在汇总图中，从与用最高化合物浓度(例如，对于抗体和pAg缀合物为150μg/mL)预处理的Raji细胞共培养的样品确定了“活化的Vδ2γδT细胞％”。
人肿瘤细胞系SK-BR-3、BT-474、SK-OV-3从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，ATCC，Rockville，MD)获得，HCT-116来自德国微生物和细胞培养物保藏中心GmbH(DSMZ，莱布尼茨研究所，德国)。在CGM中培养BT-474(ATCC；ATCC-HTB-20)，并将其保持在37℃下在含有5％ CO2的湿润培养箱中，并且每周传代培养两次。将SK-BR-3、SK-OV-3以及HCT-116保持在含有10％v/w FBS HI和80U/mL青霉素-链霉素溶液(Lonza)的McCoys 5A培养基(Lonza)中。
HER2表达水平确定
参见实施例25，调整之处为使用曲妥珠单抗来确定细胞上的HER2水平。实验进行了N＝2次，并报告平均sABC。
结果/结论
在此使用的细胞系表达高水平的HER2(BT-474、SK-BR-3和SK-OV-3)或表达低水平的HER2(HCT-116)(表12)。
表12：所选细胞系上的HER2表达水平
细胞系 恶性病 HER2表达水平(sABC/细胞)
BT-474 乳腺癌 3,300,000
SK-BR-3 乳腺癌 3,000,000
SK-OV-3 卵巢癌 2,400,000
HCT-116 结直肠癌 21,000
将四种不同的细胞系首先与ADC-XD18-t、ADC-XD18-i或曲妥珠单抗预孵育，并随后与含有Vδ2γδT细胞的PBMC共培养，并确定免疫细胞活化。图14中示出了来自代表性供体的结果，并且图15中总结了所有受试供体的功效(EC50)和效力。与曲妥珠单抗预孵育的BT-474、SK-BR-3和SK-OV-3细胞以剂量依赖性方式诱导Vδ2γδT细胞的活化，其很可能是通过曲妥珠单抗-FcγR相互作用进行的。用曲妥珠单抗预处理的HCT-116细胞未能诱导Vδ2γδT细胞的显著活化，可能是由于HCT-116细胞表面上的HER2受体的数目少(表12)。当与BT-474、SK-BR-3和SK-OV-3细胞预孵育时，ADC-XD18-t在Vδ2γδT细胞中诱导的脱颗粒(CD107a)、IFNγ和TNFα产生比曲妥珠单抗本身的多。当与ADC-XD18-t预孵育时，HCT-116细胞未能活化Vδ2γδT细胞。这不是由于HCT-116细胞不能活化Vδ2γδT细胞，因为HMBPP预处理的HCT-116能够活化Vδ2γδT细胞(图16)。用非结合同种型对照-ADC预处理BT-474、SK-BR-3、SK-OV-3和HCT-116细胞，导致Vδ2γδT细胞的可忽略不计或低效的活化(图14中举例说明)。曲妥珠单抗预处理的BT-474、SK-BR-3和SK-OV-3也活化了NK细胞，很可能是通过公知的由NK细胞表达的FcγR进行的。经曲妥珠单抗pAg缀合物预处理的BT-474、SK-BR-3和SK-OV-3细胞也能够将NK细胞活化至相似的程度(图17)，表明在添加pAg缀合物之后，曲妥珠单抗诱导的效应物功能仍是完整的。在与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-ADC预孵育之后，HCT-116细胞没有表现出显著的NK细胞活化，再次表明该细胞系上的HER2表达水平太低而不能触发免疫细胞活化。总之，这些结果表明pAg缀合物可与多种肿瘤靶向抗体连接来靶向多种恶性病进而诱导Vδ2γδT细胞活化。
实施例28：较高的pAg药物与抗体比率(DAR)改善了Vδ2γδT细胞对具有低肿瘤相关抗原(TAA)表达的细胞的活性。
研究了提高DAR是否会导致更具功效和效力的Vδ2γδT细胞活化，特别是对于TAA数目少的细胞系。
材料和方法
Vδ2γδT细胞活化测定
功能测定
如实施例23中所公开的进行功能测定，不同之处在于将Raji和MOLM-13细胞用抗体/ADC/对照预处理16或40小时(表13)。此外，仅确定了CD107a脱颗粒水平，而不是IFNγ表达水平。因此，在第三个实验日，在BD FACSymphony A3细胞分析仪(BD Biosciences，SanJose，CA，USA)上直接分析细胞，然后与BD Perm/wash孵育。用于预处理Raji和MOLM-13细胞的最高化合物浓度对于抗体/ADC为150μg/mL，并且对于HMBPP为0.1mM。在GraphPad Prism中将EC50值计算为以μg/mL计的浓度，其给出在曲线的底部和顶部之间一半的响应。在汇总图中，从与用最高化合物浓度(例如，对于抗体和ADC为150μg/mL)预处理的Raji或MOLM-13细胞共培养的样品确定了“活化的Vδ2γδT细胞％”。
表13：用于在与PBMC共培养之前预处理Raji或MOLM-13细胞的化合物概览
受试细胞系 pAg缀合物(详情参见表1)
MOLM-13 ADC-XD18-CD12341C
MOLM-13 ADC10-XD18-CD12341C
MOLM-13 ADC20-XD59-CD12341C
MOLM-13 ADC-XD18-141C
MOLM-13 ADC8-XD18-1
MOLM-13 ADC16-XD59-1
MOLM-13 抗CD123 41C MoAb
Raji ADC-XD18-r
Raji ADC8-XD18-r
Raji ADC16-XD59-r
Raji ADC-XD18-i
Raji ADC8-XD18-i
Raji ADC16-XD59-i
Raji 利妥昔单抗
CD123表达水平确定
使用Qifi试剂盒(DAKO，agilent，USA)确定CD123受体表达水平。将细胞(96孔板中100,000个细胞/孔)用冰冷的FACS缓冲液(PBS+0.1％v/w BSA+0.02％v/v叠氮化钠(NaN3))洗涤两次，随后添加在冰冷的FACS缓冲液中稀释的一定浓度范围的50μL/孔的抗CD123(克隆6H6，ThermoFisher Scientific)。在4℃下在30分钟的孵育时间之后，将细胞用冰冷的FACS缓冲液洗涤两次，并将其重悬于50μL在冰冷的FACS缓冲液中的APC缀合的第二F(ab’)2山羊抗人IgG(Fc片段特异性，Jackson ImmunoResearch，最终1:6000)中。还将二抗的稀释液添加至来自Qifi试剂盒的沉淀的珠。在黑暗中，在4℃下与二抗在冰上进行30分钟的孵育，并随后将细胞和珠在冰冷的FACS缓冲液中洗涤两次，并重悬于150μL冰冷的FACS缓冲液中。使用FACSVerse或FACSymphony(BD Biosciences)通过流式细胞术确定荧光强度，并根据制造商的说明确定受体的绝对数目。
MOLM-13和Raji细胞培养
如实施例23中所述培养Raji细胞。在CGM中培养CD123阳性急性单核细胞白血病细胞系MOLM-13(DSMZ，ACC 554，德国微生物和细胞培养物保藏中心GmbH(莱布尼茨研究所，德国))，并将其保持在37℃下在含有5％ CO2的湿润培养箱中，并且每周传代培养两次。
结果/结论
MOLM-13细胞系表达低水平的CD123(表14)。Raji细胞上的CD20表达水平在表12中示出。
表14：MOLM-13细胞上的CD123表达水平
细胞系 恶性病 CD123表达水平(sABC/细胞)
MOLM-13 急性单核细胞白血病 9664
在用HMBPP预处理之后，MOLM-13和Raji细胞二者均能够活化Vδ2γδT细胞(图18A)。在与MOLM-13或Raji细胞过夜孵育，随后与含有Vδ2γδT细胞的PBMC共培养6小时之后，测试产生的pAg缀合物和对照化合物诱导选择性Vδ2γδT细胞活化的能力。生成了Vδ2γδT细胞脱颗粒的剂量-响应曲线(图18B至18E)，并且这些结果表明，用非结合同种型对照pAg缀合物预处理的细胞活化Vδ2γδT细胞的功效低。因此，不能可靠地计算EC50值。计算利妥昔单抗/抗CD12341C MoAb pAg缀合物的EC50值、效力和MFI(图18F至18H)。
当将抗CD12341C MoAb预处理的MOLM-13细胞与PBMC共培养时，4个供体中的3个供体未测量出Vδ2γδT细胞活化。当将ADC-XD18-CD12341C预处理的MOLM-13细胞与PBMC共培养时，活化的Vδ2γδT细胞的百分比提高。另外，具有pAg缀合物的每种细胞产生的CD107a的量相对于裸mAb更高(图18H)。提高DAR使得CD107a阳性Vδ2γδT细胞百分比进一步提高(图18G，CD12341C ADC)。较高的DAR并不改善基于抗CD20的ADC的效力(图4G)，这可能是因为在DAR2下已经达到了最大活性。在较高的DAR下，不仅改善抗CD20 ADC的功效，而且还改善非结合同种型对照的功效。总之，这些结果表明抗CD123 pAg缀合物可比仅mAb更好地活化Vδ2γδT细胞，并且较高的DAR改善了抗CD123 pAg缀合物的效力。

Claims (25)

1.缀合物，其包含与免疫调节部分共价连接的靶向部分，其中所述免疫调节部分是磷酸抗原部分。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述靶向部分是肿瘤靶向抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述磷酸抗原部分是焦磷酸盐/酯、焦膦酸盐/酯、双膦酸盐/酯、单磷酸盐/酯或单膦酸盐/酯，或者其前药，并且包含烯丙醇基。
4.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述靶向部分通过连接部分与所述磷酸抗原部分连接。
5.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其由式I表示：
Tm-(L-(pAg)x)y (I)，
其中：
Tm表示靶向部分，
L表示连接部分，
pAg表示磷酸抗原部分，
x表示每个连接部分的磷酸抗原部分的数目，并且为1至5的整数，
y表示每个Tm(靶向部分)的L-(pAg)x的数目，并且值为1至10。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中y的值为1至8。
7.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中所述连接部分包含可切割接头。
8.接头-药物化合物，其包含一种或更多种与连接部分(L)共价结合的磷酸抗原部分，所述接头-药物化合物具有式(II)中示出的一般结构：
其中：
Q表示式IIa或IIb中示出的结构：
Y是卤素，
W1是N、CH或CF，优选CH；
W2是CH2、CHF、CF2或O；
X1是O、S、NH、CH2、CHF或CF2；
X2是O、CH2、CHF或CF2；
X3是不存在的，或者是O或NH；
X4a至4d中的每一个独立地选自O和S；
X5是CH3、CH2F、CHF2、或CF3、或CCl3；
x是1至5的整数；
m是1、2或3；
n是0、1或2；
R1是H或与所述连接部分(L)的连接部，或者是前药部分；
R2是H或与所述连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
R3是H或与所述连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
R4是H或与所述连接部分(L)的连接部，或者是Cat+或前药部分；
或者，当n是0时，R3和R2通过C1-6(杂)烷基连接，或者
当n是1或2时，R3和R4通过C1-6(杂)烷基连接。
9.根据权利要求8中任一项所述的接头-药物化合物，其中Q表示式IIa中示出的结构。
10.根据权利要求9所述的接头-药物化合物，其中W1是CH，X5是CH3，并且R1是H或与所述连接部分(L)的连接部。
11.根据权利要求9或10所述的接头-药物化合物，其中X3是O，R3是与可切割连接部分的连接部，并且R1是H。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的接头-药物化合物，其中W2是CH2并且m是1。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的接头-药物化合物，其中X1是CH2。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的接头-药物化合物，其中X3是O，R3是与可切割连接部分的连接部，W1是CH，X5是CH3，R1是H，W2是CH2且m是1，并且X1是CH2。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的接头-药物化合物，其中n为0或1，X4a至4b和X4c至4d(当存在时)为O，并且其中R2和R4(当存在时)为H。
16.根据权利要求8所述的接头-药物化合物，其中R2和R3是选自以下的前药部分：
-新戊酰氧基甲基(POM)和异丙基氧基羰基氧基甲基(POC)基团，
-经取代或未经取代的(杂)芳基，和
-根据式IV或V的结构
其中：
Ra和Ra’独立地选自H、任选经取代的氨基酸侧链和包含任选经取代的C1-14烷基链的非极性侧链，
Rb是H、苄基、或者经取代或未经取代的(C1-8)烷基，
Rc和Rc’独立地选自H和任选地经取代的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基或杂芳基。
17.根据权利要求16所述的接头-药物化合物，其中R2和R3独立地选自POM基团和POC基团。
18.根据权利要求16所述的接头-药物化合物，其中n为0，R2或R3为经取代或未经取代的5元或6元(杂)芳基，并且R3为根据式IV或V的结构，或者反之亦然。
19.根据权利要求8至18中任一项所述的接头-药物化合物，其中所述连接部分(L)包含根据式VI或VII的结构：
其中：
m是1至10的整数，优选5；
AA是氨基酸，优选天然氨基酸；并且
p是0、1、2、3或4；
q是1至12的整数，优选2；
ES是不存在的，或者是选自以下的延伸间隔基：
其中R4是H、卤素、CF3、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基，优选H、F、CH3、CF3，更优选H或F；
其中V是H、乙基、-(CH2CH2O)p-OMe、CH2CH2SO2Me或CH2CH2N(Me)2；
其中p是1至12的整数。
20.根据权利要求8所述的接头药物化合物，其具有以下结构：
21.根据权利要求8至20中任一项所述的接头-药物化合物在制备根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物中的用途。
22.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其用作药物。
23.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其用于治疗癌症、自身免疫病或感染。
24.缀合物，其包含与根据权利要求8至20中任一项所述的接头药物化合物缀合的肿瘤靶向抗体或其抗原结合片段。
25.药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，以及一种或更多种药物赋形剂。
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