JP2024524363A - ホスホ抗原を含む複合体及び治療における使用 - Google Patents

ホスホ抗原を含む複合体及び治療における使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ホスホ抗原と結合したターゲティング部分を含む新規の複合体、並びに疾患、例えば、がん、感染性疾患及び自己免疫疾患の治療における、必要に応じて他の治療剤と併用する、その使用に関する。ターゲティング部分は、抗体又はその結合断片であってもよい。ホスホ抗原は、プロドラッグであってもよい。さらに、本発明は、複合体の製造で使用するホスホ抗原を含むリンカー－薬物化合物及び前記免疫複合体を含む医薬組成物に関する。

Description

本発明は、ホスホ抗原（phosphoantigen）と結合したターゲティング部分、例えば抗体又はその結合断片、を含む新規の複合体、並びに、がん、感染性疾患及び自己免疫疾患といった疾患の治療における、必要に応じて他の治療剤と併用する、その使用に関する。さらに、本発明は、前記複合体の製造に使用するためのホスホ抗原を含むリンカー－薬物化合物及び前記免疫複合体を含む医薬組成物に関する。
がんを治療するための通常の方法は、手術、細胞毒性剤による化学療法及び放射線療法又はこれらの組合せを含む。細胞毒性剤又は放射線照射による治療は、その毒性及び非特異的性質のために、重篤な副作用をもたらす場合が多い。新生物細胞の根絶において、免疫系が重要な役割を果たすことが発見されたので、最近のがん治療は、がんを治療するためのツールとして免疫系の構成要素を用いることを目指している。
がんの免疫療法の一つのアプローチは、がん患者において抗腫瘍免疫応答を活性化することを目指して、「免疫チェックポイント」、例えば、Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）又はプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）をターゲットすることである。ＣＴＬＡ－４とＰＤ－１は、いずれも、免疫細胞の活性化を制限するように機能する負のフィードバック系に関与するタンパク質である。腫瘍細胞は、その表面に免疫チェックポイントリガンドを過剰発現することにより、この抑制機構を「悪用して」、免疫系の細胞による攻撃から自らを保護し、免疫系から逃避できる。免疫チェックポイントの、そのリガンドとの相互作用による活性化は、Ｔ細胞の不活性化と疲弊をもたらす。免疫チェックポイント阻害剤、例えば、免疫チェックポイント又はそのリガンドと結合する抗体は、がん細胞上に過剰発現した免疫チェックポイントをブロックする新しい抗がん薬である。認可された免疫チェックポイント阻害剤の例は、メラノーマの治療のために２０１１年に認可されたイピリムマブ（ＣＴＬＡ－４をブロック；商品名ヤーボイ（登録商標）、ＢＭＳが製造）、ＰＤ－１抗体ニボルマブ（商品名オプジーボ（登録商標）で販売され、ＢＭＳが開発）、及びペムブロリズマブ（商品名キイトルーダ（登録商標）、別のＰＤ－１阻害剤、Merckが製造）である。チェックポイント阻害剤は抗腫瘍応答を再活性化できるが、活性化された免疫細胞は、正常組織も攻撃でき、免疫学的に有害な副作用をもたらす。
がん治療への別のアプローチは、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の使用を含む。ＡＤＣは、腫瘍特異的抗原に対するモノクローナル抗体の特異性を、化学的な細胞毒性剤の細胞殺傷活性と組み合わせる。ＡＤＣの抗体は、ターゲティング剤及び細胞毒性ペイロードの運搬体として働く。抗体が標的と結合すると、細胞毒性ペイロードと結合したＡＤＣが、標的である腫瘍細胞に効率的に取り込まれる。細胞毒性ペイロードは、リンカーを介して抗体上へグラフトされた細胞毒性剤の不活性前駆体（プロドラッグ）であってもよく、リンカーは、血液中では安定で、腫瘍細胞の内部へ取り込まれた後、例えば細胞内プロテアーゼによって切断される。リンカーの切断は、腫瘍細胞においてペイロードの活性な細胞毒性型の放出を引き起こす可能性がある。ＡＤＣは、健康な組織への毒性と非特異的副作用を大幅に軽減できるという利点がある。臨床的に認可されているＡＤＣには、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）オゾガマイシン（マイロターグ（登録商標）；Wyeth Pharmaceuticals、Pfizerの子会社）、ブレンツキシマブ（抗ＣＤ３０）ベドチン（アドセトリス（登録商標）；Seattle Genetics/Millennium Pharmaceuticals）、（アド－）トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）エムタンシン（Kadcyla（登録商標）；Genentech/Roche）、イノツズマブ（抗ＣＤ２２）オゾガマイシン（ベスポンサ（登録商標）；Wyeth Pharmaceuticals、Pfizerの子会社）、エンホルツマブ（抗ネクチン－４）ベドチン（パドセブ（商標）；Astellas Pharma/Seattle Genetics）、ファム－トラスツズマブ デルクステカン（エンハーツ（登録商標）；Daiichi Sankyo/AstraZeneca）、ポラツズマブ（抗ＣＤ７９ｂ）ベドチン（ポライビー（商標）；Genentech/Roche）、及びサシツズマブ（抗ＴＲＯＰ－２）ゴビテカン（トロデルビー（Trodelvy）（商標）；Immunomedics）が含まれる。更に多くが臨床開発中である。
がん治療への更に別のアプローチは、免疫系、特にＴ細胞を活性化して、腫瘍細胞を攻撃して破壊する治療用化合物を用いる免疫療法である。そのような治療用化合物は、免疫細胞受容体のアゴニストであってもよく、大きな分子又は相対的に小さい化学構造であってもよい。そのような化合物の例は、トール様受容体（ＴＬＲ）を活性化するリガンドである。いくつかのＴＬＲリガンドが、がんの治療で認可されている。最初に認可されたＴＬＲリガンド（ＴＬＲアゴニスト）は、バチルスカルメット・ゲラン（ＢＣＧ）と呼ばれるマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）の弱毒株の一部である。最初、結核ワクチンとして開発されたＢＣＧは、活性ＴＬＲ２／４リガンドを含有し、膀胱がんの治療に用いられている。他の認可されたＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ４リガンドのモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）及び低分子ＴＬＲ７アゴニストのイミキモド、イミダゾキノリンである。
ＴＬＲリガンドは免疫複合体としても用いられている。そのような免疫複合体は、腫瘍微小環境における免疫系細胞の局所での活性化の誘導を目的として、ＴＬＲリガンドについてのターゲティング媒体として、腫瘍抗原に対して特異的な抗体を含む。ＴＬＲアゴニストが抗ＨＥＲ抗体と連結した、乳がんを治療するための免疫複合体は、国際公開第2017/072662号（Novartis A.G.）に記載されている。ＴＬＲ８アゴニストペイロードを有する抗ＨＥＲ複合体は、Silverback Therapeutics（ImmunoTAC（商標）SBT6050）により開発された。Bolt Therapeutics（国際公開第2020/047187号）及びAckerman et al., 2021, Nature Cancer, , Vol. 2(8), 18-33も、ＴＬＲ７／８アゴニスト（Ｔ７８５）と切断不可能なリンカーを介して複合化された腫瘍ターゲティングモノクローナル抗体を含むＴＬＲ免疫複合体を記載する；腫瘍抗原と結合した腫瘍ターゲティング抗体は、Ｆｃエフェクター機能によって、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に存在する抗原提示細胞を活性化し、一方、抗体と結合したＴＬＲアゴニストは、そのＴＬＲ受容体を介してＡＰＣを直接的に刺激し、これにより抗腫瘍免疫を促進する。
がん細胞に対して細胞毒性を示すことが知られたＴ細胞の特定のサブセットは、γδＴ細胞（γ鎖及びδ鎖で構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞）である。γδＴ細胞は、感染及び腫瘍細胞への迅速な自然免疫応答を生じる能力により、Ｔリンパ球の独特なサブセットと考えられている。腫瘍浸潤γδＴ細胞は、多くの異なる悪性腫瘍で見いだされた（Gentles et al., Nature Medicine, 2015, 21(8), 938-945）。γδＴ細胞、又はより具体的には、γδＴ細胞の主要なサブセットを形成するＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、「ホスホ抗原」として知られた特定の抗原セットによって活性化される。天然に存在するホスホ抗原は、低分子アルキルピロホスフェート、例えば、４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニル－ピロホスフェート（ＨＭＢＰＰ）及びイソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）である。これらの天然ホスホ抗原は病原性細胞が産生し、ＨＭＢＰＰはＩＰＰの直接前駆体である（ＨＭＢＰＰは、ヒトでは存在しない病原性ホスフェート抗原である）。細菌及び寄生生物は、非メバロン酸経路（ＭＥＰ）経路又は２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－ホスフェート／１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－ホスフェート（ＭＥＰ／ＤＯＸＰ）経路でイソプレノイド前駆体を産生し、結果として、イソプレノイド前駆体ＩＰＰの生合成が可能である。ヒトでは、ｐＡｇ産生はメバロン酸経路によって駆動される。
ＴＬＲアゴニストとは対照的に、ホスホ抗原は、骨髄細胞又はＴ細胞上に提示された受容体と直接的には作用しない。細胞内（例．がん細胞内）において、ホスホ抗原と、細胞表面分子であるブチロフィリン３Ａ１（ＢＴＮ３Ａ１）の細胞内ドメインが結合すると、ＢＴＮ３Ａ１複合体の細胞外部分の立体構造の変化を引き起こすと考えられ、ＢＴＮ２Ａ１も同様と考えられる（Sandstrom A, et al., 2014, Immunity, 40(4), 490-500, doi: 10.1016/j.immuni.2014.03.003）。
細胞外ＢＴＮ３Ａ１／ＢＴＮ２Ａ１複合体の立体構造の変化は、γδＴＣＲとの結合を生じ、活性化γδＴ細胞によるサイトカイン産生及び腫瘍／病原性細胞の殺傷をもたらす（Rigau et al., Science, 2020, 367, 642）。したがって、治療剤としてホスホ抗原を用いるγδＴ細胞の活性化は間接的である；ホスホ抗原は、細胞（例．腫瘍細胞又は感染細胞）内から作用して、前記細胞表面の細胞外ＢＴＮ３Ａ１／ＢＴＮ２Ａ１複合体の立体構造を変化させ、次に、γδＴ細胞上のγδＴＣＲに活性化シグナルを伝える。そして、γδＴ細胞は、腫瘍細胞又は感染細胞に対し細胞殺傷効果を発揮する。
ピロホスフェートＨＭＢＰＰは、薬物動態学的特性が悪い（血漿中で急速に加水分解される）ため、（窒素性）ビスホスホネート類似体、加えて（モノホスフェート）プロドラッグ型（対象へ投与された後、活性なホスホ抗原へ変換される）が開発されている。ホスホ抗原プロドラッグにおいて、ホスホネート基の負荷電の非結合酸素原子は、例えば細胞膜中への拡散を増加させるために、中性基で保護されている。当該保護基は細胞内に入ると除去され、活性ホスホ抗原を放出する。ホスホ抗原（特に、ビスホスホネートホスホ抗原）の半減期を向上させるための別のアプローチは、国際公開第2012/042024号に記載されている。ホスホ抗原は、送達媒体としての役割を果たす無機ナノ粒子及び脂質ナノベクターと複合体化された。生じたナノ粒子は、特定の細胞を標的とするためにその表面においてターゲティングリガンドでコーティングできるとされた。その例には、抗体のようながん細胞へのターゲティングを誘導する分子が含まれる。ヒトトランスフェリンの使用が例示された。
ホスホ抗原は、対象への投与のために、in vivoで、又は抗原提示細胞と共にin vitroでγδＴ細胞を増殖させることで、γδＴ細胞の腫瘍細胞への細胞毒性の向上を目的として、がん治療での使用について試験されている。ＢｒＨＰＰ（ホスホスチム（Phosphostim）、Innate Pharmaが製造）及びゾレドロネート（Zoledronate）（Novartis）といった合成ホスホ抗原が、がんの患者における臨床試験の対象物になっている。試験の対象であるホスホ抗原は、受け入れられる安全性プロファイルを示した。しかし、それらの効力は、全般的に十分ではなかった（Sebestyen et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2020,19(3), 169-184）。
そのような治療のための受け入れられる治療可能時間域／治療濃度域を見いだすことは、ブチロフィリン（ＢＴＮ３Ａ１／ＢＴＮ２Ａ１）複合体を（過剰）発現する細胞、例えば腫瘍細胞又は病原性細胞へホスホ抗原を送達するための、より強力で、選択的で、効果的な方法によって、大幅に向上する可能性がある。
本発明は、例えば、がんの治療においてホスホ抗原を用いるより効果的で選択的な方法を提供する。本発明は、免疫調節部分と共有結合したターゲティング部分を含む複合体であって、免疫調節部分がホスホ抗原（ｐＡｇ）である複合体に関する。好ましくは、ターゲティング部分は、腫瘍ターゲティング抗体又はその抗原結合断片である。そのような複合体は、がん、感染症、自己免疫疾患といった疾患の治療において、γδＴ細胞を活性化するために使用できる。本発明の複合体は、単独で、又は他の治療剤と併用して使用できる。
好ましくは、本発明の複合体は、ターゲティング部分として腫瘍ターゲティング抗体又はその抗原結合断片を含む免疫複合体である。ターゲティング部分として腫瘍ターゲティング抗体を含む本発明の複合体は、ホスホ抗原を局在した腫瘍細胞へ特異的に送達するために使用でき、それらは、抗体又はその抗原結合断片が腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合した後、腫瘍細胞内に取り込まれてもよい。本発明はまた、本発明の複合体の製造で使用するリンカー－薬物化合物であって、「薬物」がホスホ抗原であるリンカー－薬物化合物を提供する。さらに、本発明は、本発明の複合体及び１以上の薬学的添加剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の複合体は、例えば、がんの治療のための薬剤として用いてもよい。
さまざまな免疫細胞集団を識別するＦＣＣ／ゲーティングストラテジー。まず、時間ゲートを適用して一定の流れを確保した（Ａ）。引き続いて、ＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈプロット（Ｂ）及びＳＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ｈプロット（Ｃ）で、リンパ球ダブレットを除外した。その後、生存細胞を選択し（Ｄ）、続いて、リンパ球を選択した（Ｅ）。その後、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞をＮＫ細胞として同定した（Ｆ）。ＣＤ３陽性細胞を、Ｖｄ２陽性細胞とＶｄ１陽性細胞に分けた（Ｇ）。ＣＤ３陽性Ｖｄ２陰性Ｖｄ１陰性リンパ球も、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞に細分した（Ｈ）。 Ｖδ２γδＴ細胞によるＣＤ１０７ａ（図２Ａ）又はＩＦＮγ（図２Ｃ）の産生。活性化のレベルは、ＩＦＮγ＋又はＣＤ１０７ａ＋であるＶδ２γδＴ細胞の割合で示す。測定は、４人の健康なドナーで実施し、全てのドナーのＶδ２γδＴ細胞集団について示す。（図２及び４のいくつかのグラフでは、「ＩＦＮγ」を「ＩＦＮｙ」と記載）１人の代表するドナーについて、ＣＤ１０７ａ＋産生（図２Ｂ）及びＩＦＮγ産生（図２Ｄ）を、さまざまな濃度のプロドラッグ／ＨＭＢＰＰ（Ｍ）で前処理したＲａｊｉ細胞と共培養した全ＰＢＭＣからゲーティングされたＮＫ細胞、Ｖδ１ γδＴ細胞、又はＣＤ８＋ Ｔ細胞に関して示した。 ＰＨＡで活性化した、Ｖδ２γδＴ細胞（Ａ、Ｉ）、ＮＫ細胞（Ｂ、Ｊ）、Ｖδ１ γδＴ細胞（Ｃ、Ｋ）、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｄ、Ｌ）のＣＤ１０７ａ若しくはＩＦＮγ産生、又は、刺激していない、Ｖδ２γδＴ細胞（Ｅ、Ｍ）、ＮＫ細胞（Ｆ、Ｎ）、Ｖδ１ γδＴ細胞（Ｇ、Ｏ）、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｈ、Ｐ）のＣＤ１０７ａ若しくはＩＦＮγ産生。ＦＡＣＳプロットは、代表する健康なドナーのＣＤ１０７ａ（Ａ～Ｈ）又はＩＦＮγ（Ｉ～Ｐ）プロファイルを示す。 さまざまな濃度のＡＤＣ又はリツキシマブで前処理したＲａｊｉ細胞とＰＢＭＣの共培養後の、ゲーティング化Ｖδ２γδＴ細胞（Ａ、Ｅ）、ＮＫ細胞（Ｂ、Ｆ）、Ｖδ１ γδＴ細胞（Ｃ、Ｇ）、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｄ、Ｈ）によるＣＤ１０７ａ（Ａ～Ｄ）及びＩＦＮγ（Ｅ～Ｈ）産生。活性化のレベルは、ＩＦＮγ＋又はＣＤ１０７ａ＋の免疫細胞サブセットの割合で示す。測定は、３人（ＡＤＣ－ＸＤ１３－ｒ、ＡＤＣ－ＸＤ１３－ｉ）又は４人（ＡＤＣ－ＸＣ４－ｒ、ＡＤＣ－ＸＣ４－ｉ、ＡＤＣ－ＸＤ４－ｒ、ＡＤＣ－ＸＤ４－ｉ、リツキシマブ）の健康なドナーで実施した。結果は、１人の代表するドナーについて示す。 ＡＤＣ又はリツキシマブで処理したＲａｊｉ細胞との共培養後のＶδ２γδＴ細胞の、ＣＤ１０７ａ（Ａ、Ｃ、Ｅ）又はＩＦＮγ（Ｂ、Ｄ、Ｆ）産生の、ＥＣ５０（Ａ～Ｂ）、Ｖδ２γδＴ細胞陽性の最大の割合（Ｃ～Ｄ）、及び蛍光強度中央値（ＭＦＩ、Ｅ～Ｆ）。ＭＦＩは、ＣＤ１０７ａ＋又はＩＦＮγ＋ Ｖδ２γδＴ細胞で求めた。測定は、３人（ＡＤＣ－ＸＤ１３－ｒ）又は４人（ＡＤＣ－ＸＣ４－ｒ、ＡＤＣ－ＸＤ４－ｒ、リツキシマブ）の健康なドナーで実施し、各記号は、個々のドナーを表す。 ＡＤＣ－ＸＣ４－ｒ（Ａ）、ＡＤＣ－ＸＤ４－ｒ（Ｂ）、ＡＤＣ－ＸＤ１３－ｒ（Ｃ）、リツキシマブ（Ｄ）で前処理したＲａｊｉ細胞と共培養した、電子的ゲーティング化Ｖδ２γδＴ細胞の代表的なＩＦＮγ／ＣＤ１０７ａプロファイル。 ６日間のインキュベーション後に測定したＲａｊｉ細胞生存に対する、リツキシマブ、ゾレドロネート、ＨＭＢＰＰ、ｐＡｇ複合体、又は陽性対照としてのデュオカルマイシンの直接的効果。デュオカルマイシンを陽性対照として用いた。（Ａ）さまざまな濃度の化合物をＲａｊｉ細胞とインキュベートし、細胞死を確認した。対照及び遊離薬物は１つのグラフに示し、異なるｐＡｇ複合体は、読みやすさのために３つのグラフに分けた。（Ｂ）最も高いｐＡｇ複合体又はリツキシマブ（濃度１０μｇ／ｍＬ）の細胞生存率（％）の概要。 さまざまな濃度のｐＡｇ複合体又はリツキシマブで前処理したＲａｊｉ細胞とＰＢＭＣの共培養後の、ゲーティング化Ｖδ２γδＴ細胞によるＣＤ１０７ａ産生。活性化のレベルは、ＣＤ１０７ａ＋である免疫細胞サブセットの割合で示す。測定は、健康なドナーで実施した。各プロットは異なる実験を表し、各文字は用いられたドナーを示す。同じドナーを２つの異なる実験において試験した場合、「－１」又は「－２」で示した。 さまざまな濃度のｐＡｇ複合体又はリツキシマブで前処理したＲａｊｉ細胞とＰＢＭＣの共培養後の、ゲーティング化Ｖδ２γδＴ細胞によるＣＤ１０７ａ（Ａ、Ｄ、Ｇ）、ＩＦＮγ（Ｂ、Ｅ、Ｈ）及びＴＮＦα（Ｃ、Ｆ、Ｉ）産生。箱ひげ図は、ＥＣ５０（Ａ、Ｂ、Ｃ）、細胞活性化率（％）（Ｄ、Ｅ、Ｆ）又は蛍光強度中央値（ＭＦＩ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）を示す。箱ひげ図（Ｄ～Ｉ）中のドットは平均値を表す。表５～表１０をグラフで表示したものである。全ての実験で、ＴＮＦα産生を検討しなかった点に留意されたい。 ｐＡｇ複合体で前処理したＲａｊｉ細胞と共培養したγδＴ細胞による、ＣＤ１０７ａ産生とＩＦＮγ産生（ＥＣ５０、％活性、及びＭＦＩ）の間の相関。ｐＡｇ複合体の活性は、異なるドナーでの異なる実験で試験し、幾何平均ＥＣ５０（Ａ）又は平均活性化率（Ｂ）、及び「蛍光強度中央値」の平均（ＭＦＩ、Ｃ）を、各ｐＡｇ複合体について計算した。ＣＤ１０７ａとＩＦＮγの、ＥＣ５０、活性化率及びＭＦＩの間の相関をプロットした。リツキシマブは点線で示した。 ＡＤＣ－ＸＤ６５－ｒ、ＡＤＣ８－ＸＤ６５－ｒ又はリツキシマブで前処理したＲａｊｉ細胞との共培養後のＣＤ１０７ａ（Ａ、Ｄ）、ＩＦＮγ（Ｂ、Ｅ）及びＴＮＦα（Ｃ、Ｆ）の、ＥＣ５０（Ａ～Ｃ）及び陽性Ｖδ２γδＴ細胞の最大割合（Ｄ～Ｆ）。測定は２人の健康なドナーで実施した。 ｐＡｇ複合体で前処理したＲａｊｉ細胞のＶδ２γδＴ細胞による殺傷。Ｒａｊｉ細胞は、化合物なし（エフェクター＋標的；Ｅ＋Ｔ；灰色の四角形）、ＨＭＢＰＰ（＋記号）、又は、さまざまな濃度のＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒ（黒色の丸）、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｉ（白抜きの丸、点線）若しくはリツキシマブ（灰色の菱形）で、１６時間前処理し、続いて、増殖Ｖδ２γδＴ細胞と１時間共培養した。その後、Ｒａｊｉ細胞の殺傷を、フローサイトメトリーを用いて評価した。（Ａ）ドナー由来の増殖Ｖδ２γδＴ細胞によるＲａｊｉ細胞の用量依存的殺傷。（Ｂ）リツキシマブ効力と増殖Ｖδ２γδＴ細胞上のＣＤ１６発現の間の相関。（Ｃ、Ｄ）まとめたグラフは、試験を行った全てドナーの、死んだＲａｊｉ細胞の割合のＥＣ５０（Ｃ）及び効力（Ｄ）を示す。 複数のＣＤ２０陽性細胞株での前処理後のＡＤＣ－ＸＤ１８－ｉ、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒ、リツキシマブ及びＨＭＢＰＰのＶδ２γδＴ細胞に対する活性。（Ａ）ＨＭＢＰＰで前処理した細胞株との共培養後のＣＤ１０７ａ陽性Ｖδ２γδＴ細胞の割合。（Ｂ～Ｆ）さまざまな濃度のＡＤＣ－ＸＤ１８－ｉ、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒ又はリツキシマブで前処理した細胞株との共培養後のＣＤ１０７ａ陽性Ｖδ２γδＴ細胞の割合。全ての実験は、グラフに示す２人の健康なドナーで実施した。 さまざまな濃度のＡＤＣ－ＸＤ１８－ｔ、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｉ又はトラスツズマブで前処理した、ＢＴ－４７４（Ａ、Ｅ、Ｉ）、ＳＫ－ＢＲ－３（Ｂ、Ｆ、Ｊ）、ＳＫ－ＯＶ－３（Ｃ、Ｇ、Ｋ）又はＨＣＴ－１１６細胞（Ｄ、Ｈ、Ｌ）との共培養後の、ＣＤ１０７ａ（Ａ～Ｄ）、ＩＦＮγ（Ｅ～Ｈ）又はＴＮＦα（Ｉ～Ｌ）を産生するＶδ２γδＴ細胞の割合。結果は、２人（ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＯＶ－３、及びＨＣＴ－１１６）及び４人（ＳＫ－ＢＲ－３）から、１人の代表するドナーについて示している。 ｐＡｇ複合体又はトラスツズマブで処理した細胞株との６時間の共培養後のＶδ２γδＴ細胞のＣＤ１０７ａ（Ａ、Ｄ）、ＩＦＮγ（Ｂ、Ｅ）又はＴＮＦα（Ｃ、Ｆ）産生のＥＣ５０（Ａ～Ｃ）及び効力（Ｄ～Ｆ）。各記号は健康なドナーを表し、幾何平均（Ａ～Ｃ）又は平均（Ｄ～Ｆ）を示している。 ＨＭＢＰＰで前処理した細胞株との６時間の共培養後のＣＤ１０７ａ陽性（Ａ）、ＩＦＮγ陽性（Ｂ）又はＴＮＦα陽性（Ｃ）Ｖδ２γδＴ細胞の割合。各記号は個々の健康なドナーを表し、平均を示している。 さまざまな濃度のＡＤＣ－ＸＤ１８－ｔ、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｉ又はトラスツズマブで前処理した、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、ＳＫ－ＯＶ－３又はＨＣＴ－１１６細胞との共培養後のＣＤ１０７ａを産生するＮＫ細胞の割合。結果は、２人（ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＯＶ－３、及びＨＣＴ－１１６）及び４人（ＳＫ－ＢＲ－３）から、１人の代表するドナーについて示している。 さまざまな濃度のｐＡｇ複合体又は対照化合物で前処理したＲａｊｉ細胞又はＭＯＬＭ－１３細胞とＰＢＭＣの共培養後の、ゲーティング化Ｖδ２γδＴ細胞によるＣＤ１０７ａ産生。（Ａ）ＨＭＢＰＰで前処理したＲａｊｉ細胞又はＭＯＬＭ－１３細胞との共培養後のＶδ２γδＴ細胞の％活性（ＣＤ１０７ａ）。（Ｂ～Ｅ）前処理したＲａｊｉ細胞（上部）又はＭＯＬＭ－１３細胞（下部）との共培養後のさまざまな健康なドナーに由来するＰＢＭＣにおけるＶδ２γδＴ細胞の活性化のレベル。各プロットは、異なる実験を表し、各文字はドナーを示す。（Ｆ～Ｈ）まとめたグラフは、試験を行った全てのドナーのＥＣ５０（Ｆ）、効力（Ｇ）、及び蛍光強度中央値（ＭＦＩ、Ｈ）を示す。
発明の詳細な説明
本発明では、免疫調節部分と共有結合したターゲティング部分を含む複合体であって、免疫調節部分がホスホ抗原（ｐＡｇ）部分である、複合体を提供する。
複合体
本発明は、免疫調節部分と共有結合したターゲティング部分を含む複合体であって、免疫調節部分がホスホ抗原（ｐＡｇ）部分である、複合体を提供する。
本発明の複合体は、標的細胞を特異的に結合するターゲティング部分を含む。好ましくは、ターゲティング部分は、腫瘍ターゲティング抗体又はその抗原結合断片である。ターゲティング部分は、送達媒体としての役割を果たす；それは、ターゲティング部分と共有結合したｐＡｇを標的細胞へ送達する。ｐＡｇは、例えば（ポリペプチド）ターゲティング部分におけるアミノ酸側鎖と直接結合してもよい。好ましくは、ｐＡｇは連結部分を介してターゲティング部分と複合化される。
本発明の好ましい複合体は、一般式Ｉ：
Ｔｍ－（Ｌ－（ｐＡｇ）ｘ）ｙ （Ｉ）
（式中、Ｔｍはターゲティング部分、好ましくは抗体又はその抗原結合断片を表し、Ｌは連結部分を表し、ｐＡｇはホスホ抗原を表し、ｘは連結部分あたりのホスホ抗原の数を表し、かつ１～５であり、ｙはＴｍあたりのＬ－（ｐＡｇ）ｘ（ターゲティング部分あたりのリンカー部分）の平均数を表し、かつ１～１０の整数、好ましくは１～８の整数である）
で表すことができる。式Ｉにおける複合体あたりのｐＡｇの数（Ｔｍに対するｐＡｇの比）は、ｘにｙを掛けた数である。Ｔｍに対するｐＡｇの比の平均は、１から、１６又は２０若しくはそれ以上までであってもよい。ターゲティング部分あたりのｐＡｇユニットの比は、例えば、ホスホ抗原又はターゲティング部分のいずれかの構造的又は機能的特徴によって、変えることができる。実際、ターゲティング部分あたりのｐＡｇの数が、２～８若しくは２～６、又は２のような少ない場合であっても、十分な治療効果を提供する可能性がある。好ましくは、連結部分は１個又は２個のｐＡｇを有する。大半の場合、各連結部分のｐＡｇは１で十分の可能性がある。好ましくは、Ｔｍに対する標的ｐＡｇの比は、２（ｘが１でｙが２）である。
リンカー部分は、好ましくは、切断可能なリンカー部分である。本発明の複合体において、直鎖状又は分枝鎖状のリンカー部分を用いてもよい。複数のホスホ抗原が１個のターゲティング部分と結合している場合、各ホスホ抗原は、別々の連結部分によってターゲティング部分と共有結合してもよい。実際、ターゲティング部分が抗体であり、かつ連結が還元型鎖間ジスルフィドで生じる場合、１個のターゲティング部分と結合した多くても８個の別々の連結部分があってもよく、その結果、各ホスホ抗原がそれ自体の連結部分により保有される場合、ターゲット部分あたり８個のホスホ抗原を生じる。別の分枝鎖状リンカー部分では、連結部分あたり１～５個のホスホ抗原（ｘが、１、２、３、４又は５）を含んでいてもよい。特に、Ｔｍに対するｐＡｇの比が高いことが望まれる場合、又はターゲティング部分で利用できる結合場所が限られる場合、分枝鎖状リンカーが好ましい。例えば、ターゲティング部分あたりのホスホ抗原の数を増加させるために、２個のｐＡｇ（ｘが２）を有する分枝鎖状リンカーを使用できる。そのような連結部分を使用することで、例えば、８個の連結部分のみで、１６個のホスホ抗原をターゲティング部分と結合できる。抗体は、そのアミノ酸配列中に、ジスルフィド結合を形成し、還元されてリンカー－薬物分子と複合化できるシステインを追加するように改変できる。例えば、追加のシステインは、国際公開第2015/177360号に開示されているように、例えば４１Ｃ位に導入できる。連結部分が結合できる複合化に利用できるシステインを最大で１０個有する抗体では、リンカーあたり２個のｐＡｇ（ｘが２）を有する分枝鎖状リンカーを使用した場合、２０（ｘが２でｙが１０）以上のＤＡＲとすることができる。最適な条件下では、ターゲティング部分における全ての結合部位が連結部分によって占有される。実際には複合体の混合物が生成する可能性があり、その場合、ターゲット部分あたりのホスホ抗原の正確な数は反応条件に依存して若干変化する可能性があり、ｙ値は平均数である。
ホスホ抗原を含む本発明の複合体は、それを必要としている対象へ同時に又は逐次的に投与できる他の薬学的活性化合物と併用して用いてもよい。さらに、ターゲティング部分は、ホスホ抗原及び異なるペイロードの組合せを保有してもよい。そのような「複数のペイロード」アプローチの利点は、異なる活性物質が同じターゲティング部分によってターゲットされることである。ペイロード間の比はもちろん、（複合化の）反応条件及び結合部位が適切に設定されなければならない。各ペイロードについての別々のリンカー－薬物化合物は、例えば、ターゲティング部分上の異なる結合部位（例．異なる型のアミノ酸）で複合化されてもよく、並びに／又は、異なるペイロードの結合、分布及び薬物抗体比（ＤＡＲ）を調節するために異なる複合化方法及び／若しくは異なる化学的性質のリンカーによって複合化されてもよい。複数の細胞毒性ペイロードを有する抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は当技術分野において知られている。本発明の複合体は、ホスホ抗原を、例えば全体的な所望の治療効果を増強するようにデザインされた細胞毒性ペイロード又は別の免疫調節ペイロードと組み合わせてもよい。したがって、非標的部位でのホスホ抗原の標的ではない組織への非特異的な結合及び／又は効果が減少する。
当技術分野においてよく知られているように、ＡＤＣにおける薬物の結合は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって決定できる。ＨＩＣは、平均ＤＡＲ（本発明の複合体におけるＴｍに対するｐＡｇの比）を決定するために特に適している。
ターゲティング部分
ターゲティング部分は、標的細胞と特異的に又は好んで結合し、ターゲティング抗体若しくはその抗原結合断片、又は例えば核酸（アプタマー）若しくは、酵素阻害剤、酵素基質、受容体リガンド及び／若しくは融合タンパク質であってもよい（ポリ）ペプチドといった別のターゲティング部分であってもよい。また、低分子阻害剤を、ターゲティング部分として使用できる（結果として、低分子薬物複合体（ＳＭＤＣ）を生じる）。ターゲティング部分の標的に対する結合特異性（及び親和性）は、本発明の複合体が治療効果を発揮する体内の部位を決定する。
したがって、適切なターゲティング部分を選択することで、ホスホ抗原が治療効果を発揮しなければならない部位に送達されることが保証される。
好ましくは、本発明の複合体におけるターゲティング部分は、抗体又はその抗原結合断片である。ターゲティング部分が抗体又はその抗原結合断片である場合、複合体は、一般的に免疫複合体又は抗体薬物複合体（ＡＤＣ）と呼ばれる。ターゲティング部分は、標的細胞で発現した抗原、例えば、腫瘍関連抗原を高特異性で認識する抗体である。抗体又はその断片の抗原に対する特異性は、エフェクター分子（又は「ペイロード」）の標的細胞への特異的な送達を可能にし、健康な組織にはほとんど影響を及ぼさない。エフェクター分子は、リンカーを介して抗体と共有結合し、そのリンカーは、エフェクター分子が、少なくとも抗体が標的細胞、例えばがん細胞に達するまで、抗体と接続されたままであることを保証する。エフェクター分子は、抗体が標的と結合した場合に、標的細胞上又は中（複合体が内部へ取り込まれた時）でその効果を発揮する。エフェクター分子は、細胞毒性剤、放射性同位元素又は免疫調節部分であってもよい。本発明の複合体において、エフェクター分子はホスホ抗原である。
抗体
この明細書では、用語「抗体」は、好ましくは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体を指す。一般的に、抗体又はその抗原結合断片は治療活性を有するが、そのような独立した効果は、ＡＤＣの分野において知られているように、必ずしも必要ではない。本発明で用いることができる抗体は、アイソタイプ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体であってもよい。好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体である。抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体であってもよい。好ましくは、抗体はヒト化又はヒト抗体である。更により好ましくは、抗体は、ヒト化又はヒトＩｇＧ抗体、より好ましくはヒト化又はヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。抗体は、κ又はλ軽鎖、好ましくはκ軽鎖を有してもよく、すなわち、ヒト化又はヒトＩｇＧ１－κ抗体であってもよい。
この明細書では、用語「抗原結合断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、若しくは還元型ＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖（ｓｃ）抗体、単一ドメイン（ｓｄ）抗体、ダイアボディ又はミニボディを含む。
「ヒト化」の非ヒト（例．げっ歯類）抗体は、非ヒト抗体に由来した最小配列を含有する抗体（例．非ヒト－ヒトキメラ抗体）である。非ヒト抗体をヒト化するためのさまざまな方法が当技術分野において知られている。例えば、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域（ＶＲ）における抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）は、非ヒト種、一般的にはマウス、ラット又はウサギ由来の抗体から導き出される。これらの非ヒトＣＤＲは、抗体の機能的特性、例えば、結合親和性及び特異性が少なくとも部分的に保持されるように、ＨＣ及びＬＣの可変領域のヒトフレームワーク領域（ＦＲ、すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と、組み合わせられる。抗体パフォーマンスを更に洗練させるために、例えば、低免疫原性を保持しながら結合親和性を向上させるために、ヒトＦＲの選択したアミノ酸を対応する元の非ヒト種アミノ酸と交換してもよい。このようにしてヒト化された可変領域は、通常、ヒト定常領域と組み合わせられる。非ヒト抗体のヒト化のための代表的な方法は、Winter及び共同研究者の方法である（Jones et al, 1986, Nature, 321, 522-525; Riechmann et al, 1988, Nature, 332, 323-327; Verhoeyen et al, 1988, Science 239, 1534-1536）。あるいは、非ヒト抗体は、ヒトにおいて天然で産生される抗体バリアントとの類似性を増加させるように、そのアミノ酸配列を改変してヒト化できる。例えば、元の非ヒト種ＦＲの選択されたアミノ酸は、抗体の結合親和性を保持しながら免疫原性を低下させるために、その対応するヒトアミノ酸と交換できる。詳細については、Jones et al, 前掲；Riechmann et al., 前掲及びPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596を参照。以下の総説とそこで引用されている参考文献も参照。Vaswani and Hamilton, 1998, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1, 105-115；Harris, 1995, Biochem. Soc. Transactions, 23, 1035-1038及びHurle and Gross, 1994, Curr. Op. Biotech., 5, 428-433.
ＣＤＲは、Kabat（in Kabat, E.A. et al, (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689）、Chothia（ et al, 1989, Nature, 342, 877-883）又はＩＭＧＴ（Lefranc, 1999, The Immunologist, 7, 132-136）の方法で決定できる。
通常、抗体は、抗原標的、好ましくは内在化しても内在化しなくてもよい膜に結合する抗原標的と結合する少なくとも１つのＨＣ及びＬＣ可変領域を含む、単一特異性（１つの抗原に対して特異的；そのような抗原は、種間で共通であってもよく、又は種間で類似のアミノ酸配列を有してもよい）又は二重特異性（種の２つの異なる抗原に対して特異的）抗体である。好ましくは、抗体は、（抗原）標的と結合した後、標的細胞内に取り込まれ、その後、本発明の複合体ではホスホ抗原である活性エフェクター分子が、細胞内に放出される。
がん治療で使用する本発明の複合体で用いてもよいターゲティング抗体は、腫瘍特異的又は腫瘍関連抗原と選択的に結合する腫瘍ターゲティング抗体であってもよい。腫瘍特異的抗原は腫瘍細胞上にのみ存在し、一方、腫瘍関連抗原は、正常（健康な）細胞と比較して場合、がん細胞において高いレベルで発現（例．過剰発現）する抗原である。
本発明の複合体の抗体又は抗原結合断片が結合する抗原標的は、例えば、アネキシンＡｌ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ２７－２９、ＣＡ１２５、ＣＡ２４２（がん抗原２４２）、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０（腫瘍壊死因子８）、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８（サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）、ＣＤ５６（神経細胞接着分子）、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１１５（コロニー刺激因子１受容体）、ＣＤ１２３（インターロイキン－３受容体）、ＣＤ１３８（シンデカン１）、ＣＤ２０３ｃ（ＥＮＰＰ３）、ＣＤ３０３、ＣＤ３３３、ＣＤＣＰ１、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ、クローディン４、クローディン７、ＣＬＣＡ－１（Ｃ型レクチン様分子－１）、ＣＬＬ １、ｃ－ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＬ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥＰｈＢ３、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、ＦＡＰ、ＦｃＲＬ５（Ｆｃ受容体様タンパク質５、ＣＤ３０７）、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１（葉酸受容体α）、ＦＲｂｅｔａ、ＧＣＣ（グアニリルシクラーゼＣ）、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＯＢＯ Ｈ、ＧＰＡ３３、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ（高分子量メラノーマ関連抗原）、インテグリンα（例．αｖβ３及びαｖβ５）、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＭ４ＳＦ１（Ｌ６）、ルイスＡ様糖鎖、ルイスＸ、ルイスＹ（ＣＤ１７４）、ＬＧＲ５、ＬＩＶ１、メゾテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＮ（ＣＡ９）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＴＥＡＰ－１、５Ｔ４（又はＴＰＢＧ、トロホブラスト糖タンパク質）、ＴＦ（組織因子、トロンボプラスチン、ＣＤ１４２）、ＴＦ－Ａｇ、Ｔａｇ７２、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＯＰ２（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２）、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦＲ及びＶＬＡからなる群から選択してもよい。
当技術分野において知られた適切な抗体の例には、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、リツキシマブ（ＣＤ２０）又は他の抗ＣＤ２０抗体、例えば、オファツムマブ、ウブリツキシマブ若しくはオクレリズマブ、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、イラツムマブ及びブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、ゲムツズマブ、バダスツキシマブ（ＣＤ３３）、テツルマブ（ＣＤ３７）、ダラツムマブ、イサツキシマブ（ＣＤ３８）、ビバツズマブ（ＣＤ４４）、アレムツズマブ（ＣＤ５２）、ロルボツズマブ（ＣＤ５６）、ボルセツズマブ（ＣＤ７０）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ポラツズマブ（ＣＤ７９）、ロバルピツズマブ（ＤＬＬ３）、フツキシマブ（ＥＧＦＲ）、オポルツズマブ（ＥＰＣＡＭ）、ファルレツズマブ（ＦＯＬＲ１）、グレムバツムマブ（ＧＰＮＭＢ）、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びマルゲツキシマブ（ＨＥＲ２）、エタラシズマブ（インテグリン）、アネツマブ（メゾテリン）、パンコマブ（ＭＵＣ１）、エンホルツマブ（ネクチン－４）、Ｈ８、Ａ１及びＡ３（５Ｔ４）、並びにＴＲＯＰ２に対する抗体、例えば、サシツズマブ、ダトポタマブ及びＰＦ－０６６６４１７８が含まれる。ターゲティング部分がＣＤ２０（例．リツキシマブ）、ＨＥＲ２（例．トラスツズマブ）に対する腫瘍ターゲティング抗体、又は抗ＣＤ１２３抗体である本発明の複合体を、実施例で示している。
ｐＡｇ部分のｐＡｇ活性は細胞内で発揮される必要があるため、細胞内に移行する抗体が好ましい。
抗体又はその抗原結合断片は、該当する場合、（１）操作された、すなわち、例えば、半減期を増加させるために、リンカー－薬物が結合する部位を提供するために、及び／又は、エフェクター機能を増加若しくは減少させるために、１つ以上の変異が導入されてもよい、定常領域；あるいは（２）操作された、すなわち、例えばリンカー－薬物が結合する部位を提供するために、１つ以上の変異が導入されてもよい、可変領域を含んでいてもよい。抗体又はその抗原結合断片は、組換えで、合成的に、又は他の知られた適切な方法により、製造してもよい。抗体のＦｃ媒介性エフェクター機能を減少させ得る変異は、例えば、Leabman et al., 2013, MAbs, 5(6):896-903及びBruhns P, et al., 2015, Immunol Rev., 268(1):25-51. doi: 10.1111/imr.12350. PMID: 26497511に記載されたものなどの変異である。
本発明の複合体は、野生型若しくは部位特異的（特定の複合化部位、例えば、システイン又は非天然アミノ酸が、抗体タンパク質配列の中へ操作されていることを意味する）、又はその組合せであってもよく、当技術分野において知られた方法により製造できる。
本発明の免疫複合体は、免疫調節部分としてホスホ抗原（ｐＡｇ）を含有する。本発明の免疫複合体は、ｐＡｇペイロードを、がん細胞のような抗原提示細胞へ非常に効率的に送達し、抗原提示細胞内に活性なホスホ抗原を生じることが見いだされた。抗原提示細胞は、その表面にある特定の腫瘍抗原を発現又は過剰発現する腫瘍細胞であってもよい。そのような細胞は、ＢＴＮ３Ａ１／ＢＴＮ２Ａ１受容体複合体分子のようなｐＡｇによるγδＴ細胞の間接的活性化に関与するＴＣＲ活性化分子も発現又は過剰発現する可能性がある。
ホスホ抗原（ｐＡｇ）
ホスホ抗原は、抗原提示細胞の存在下で、γδＴ細胞（より具体的にはＶγ９Ｖδ２細胞）を刺激できる相対的に質量が小さい非ペプチド抗原を含む。この明細書全体で、用語「ホスホ抗原」又は「ｐＡｇ」は、天然に存在するホスホ抗原、加えて、修飾ｐＡｇ、例えば、天然に存在するｐＡｇの類似体を含む、天然に存在しない（合成）ｐＡｇ又はそのプロドラッグを指す。本発明における使用に適したｐＡｇは、ピロホスフェート（ジホスフェート）、ピロホスホネート、ビスホスホネート（又はジホスホネート）、モノホスフェート若しくはモノホスホネート又はそのプロドラッグであってもよい。本発明の複合体及びリンカー－薬物で使用する好ましいｐＡｇは、（モノ）ホスホネートである。本発明の複合体及びリンカー－薬物化合物で使用する好ましいホスホ抗原は、アリルアルコール基、例えば、天然ホスホ抗原、例えばＨＭＢＰＰに存在するアリルアルコール基を含む。好ましくは、ホスホ抗原はアリルアルコール基を含むモノホスホネートである。
本発明の複合体又はリンカー－薬物化合物の一部としての「ホスホ抗原」は、必ずしもホスホ抗原をその活性型で含有するとは限らない。複合体又はリンカー－薬物化合物におけるホスホ抗原は、活性なホスホ抗原の不活性前駆体型を含んでいてもよく、及び／又は複合体が標的と結合し、かつプロセシングされた後のみ、活性なホスホ抗原を放出してもよい。したがって、複合体又はリンカー－薬物化合物の一部として結合した状態のホスホ抗原は、それから放出される活性なホスホ抗原とは構造的に異なっていてもよい。例えば、連結部分からの分離又は連結部分の切断が、機能的に活性なホスホ抗原の形成を導く構造的再編成及び／又は化学若しくは酵素反応を惹起する可能性がある。また、例えば環境の変化に対して応答し、又は標的部位での酵素活性の結果として、プロドラッグ部分が除去され又は再配置されることで、機能的に活性なホスホ抗原が放出される可能性がある。
細胞ｐＡｇ活性を有する化合物は、標的細胞でのｐＡｇ受容体との結合によって、直接的に活性を示すことができると考えられている（「直接的ｐＡｇ」）。この受容体は、細胞表面分子の細胞内ドメインであるブチロフィリン３Ａ１（ＢＴＮ３Ａ１）と考えられている。天然の直接的ｐＡｇの例はＨＭＢＰＰである。ＨＭＢＰＰは、病原性細菌が産生する。ＨＭＢＰＰなどの天然ｐＡｇにおけるアリル型アルコールが、ＢＴＮ３Ａ１結合とｐＡｇ活性の最大化に重要であることが見いだされた。ＨＭＢＰＰなどの直接的ｐＡｇは、その細胞内Ｂ３０．２ドメインにおいて直接ＢＴＮ３Ａ１と結合する。ＨＭＢＰＰの類似体、例えば、ＢｒＨＰＰ、ＩＨＰＰ及びＣｌＨＰＰといったハロヒドリンも当技術分野において知られている（Wiemer et al., 2020, Chem. Med. Chem., 15, 1030-1039）。
他の化合物は、ＩＰＰの蓄積により間接的ｐＡｇ活性を示す。そのような化合物は、「間接的ｐＡｇ」ということができる。間接的ｐＡｇは、（内因性）直接的ｐＡｇ、例えばＩＰＰの細胞レベル及びＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の同時活性化を増加させる経路に作用する。直接的ｐＡｇとは対照的に、間接的ｐＡｇは、標的細胞におけるブチロフィリン受容体と直接的には相互作用せず、それらはｐＡｇ前駆体（直接的ｐＡｇへ酵素的に又は化学的に変換される化合物）でもない。間接的ｐＡｇは、例えば、下流の酵素、例えば、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）を阻害する化合物であってもよい。ＦＰＰＳの阻害は、ＩＰＰの使用を阻止し、細胞においてＩＰＰの蓄積をもたらす。ＦＰＰＳ阻害剤としては、アミノビスホスホネート（Ｎ－ＢＰ）、例えばゾレドロネートが知られている（Wiemer et al., 2020, Chem. Med. Chem., 15, 1030-1039；Park et al., 2021, Frontiers in Chemistry, Vol. 8, Article 612728）。
ゾレドロネート、パミドロネート及びアレンドロネートといったアミノビスホスホネート（Ｎ－ＢＰ）は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）と特異的に結合する能力のために「骨ターゲティング剤」としても知られている（Farrell et al., 2018, Bone Reports, 9, 47-60）。アレンドロネートはまた、骨ターゲティング剤としての機能を用いて、トラスツズマブを骨転移へ標的とすることを目的として、トラスツズマブと複合化された（Tian et al., 2021, Sci.Adv., 7, 2-11）。アレンドロネートは、その負電荷のため、ＨＡに対する親和性が高く、骨と優先的に結合する。したがって、Tianらは、アレンドロネートのような負に帯電したアミノビスホスホネートを、骨関連疾患を治療する抗体のターゲティング剤として使用することを提案した。
本発明の複合体では、例えば抗体（ターゲティング部分）とその特異的な結合パートナー（例．腫瘍特異的抗原）との特異的結合が、ｐＡｇをその標的部位に導くが、その逆はない（ｐＡｇはターゲティング部分ではない）。本発明の複合体では、ホスホ抗原が、それの治療効果を発揮しなければならない部位に送達されることを保証するのは、ターゲティング部分（例．抗体）の結合特異性と親和性である。
本発明で使用する好ましいｐＡｇは、アリル型アルコール又はそのプロドラッグ（例．プロドラッグ基が除去された後に、又はイソプレン単位を介して若しくはイソプレン単位と複合化したリンカー部分が切断された後に、アリル型アルコールが生成されるｐＡｇ）を含む。そのような化合物は、直接的ｐＡｇ活性（ＢＴＮ３Ａ１リガンドとして働くｐＡｇ）を有するｐＡｇの例であると考えられる。別の前駆体では、例えば、（直接的）ｐＡｇ活性を有する化合物へ代謝される化合物、又は直接的ｐＡｇのプロドラッグ若しくは前駆体が、本発明の複合体でｐＡｇとして使用できる。
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞におけるホスホ抗原の活性は、実施例に例示されているように、細胞アッセイにおいて測定できる。用いられる細胞に基づくアッセイにおいて、第１の工程では、標的細胞、例えば、腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２０陽性バーキットリンパ腫ヒト腫瘍細胞株Ｒａｊｉ由来の細胞が、ホスホ抗原又は本発明のホスホ抗原含有複合体と（一晩）インキュベートされる。
この第１の工程において、ホスホ抗原又は本発明の複合体は、標的（腫瘍）細胞内に取り込まれる。内部移行（及び複合体の場合、リンカーの切断）の後、ホスホ抗原は、ＢＴＮ３Ａ１受容体の細胞内ドメインと結合し、そのことがＢＴＮ３Ａ１／ＢＴＮ２Ａ１ダイマーの活性化をもたらす。
第１の工程からの前処理され洗浄された腫瘍細胞は、第２の工程でγδＴ細胞と共培養できる。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞が活性化された場合、細胞は、サイトカインを産生して免疫を活性化し、かつ細胞毒性顆粒を放出（脱顆粒）して標的細胞を殺傷する。
γδＴ細胞におけるホスホ抗原の活性を評価するために、モネンシン及び／又はブレフェルジンＡを、γδＴ細胞と標的の共培養物中に加える。これは、活性化細胞が産生したサイトカイン（例．インターフェロンγ（ＩＦＮγ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα））を捕捉する。抗サイトカイン抗体が細胞内に移行することを可能にするサポニンの存在下での蛍光標識抗体での染色は、サイトカイン産生細胞を同定する。ＣＤ１０７ａに対する蛍光標識抗体も、共培養物中に加えることができ、脱顆粒を起こしている細胞を染色する。脱顆粒は、腫瘍細胞の殺傷と相関する（Aktas et al., 2009, Cell Immunol., 254(2),149-154）。
したがって、蛍光標識した免疫細胞特異的マーカーと、ＣＤ１０７ａ及びサイトカインマーカーを組み合わせることにより、前処理した標的細胞と共培養した後に、γδＴ細胞及び／又は他の免疫細胞サブセットの活性化状態の決定が可能である。
γδＴ細胞の、前処理した腫瘍細胞を殺傷する能力は、共培養後の死んだ腫瘍細胞の割合を決定することにより調べることができる。腫瘍細胞は、蛍光タグで容易に同定でき、その死細胞は、γδＴ細胞との共培養から早くも１時間後には決定できる。
ホスホ抗原類似体
（化学的）類似体は、天然ホスホ抗原とは構造的特徴で異なるが、天然ホスホ抗原と機能的生物活性（特にγδＴ細胞に対して（間接的な）免疫刺激活性を示す）で類似する化合物である。類似体は、本発明の免疫複合体及びリンカー－薬物化合物での使用に関連して、安定性、作用強度、生物学的利用能又は連結部分との結合など、天然に存在するｐＡｇの１つ以上の特徴を向上させるようにデザインできる。天然ホスホ抗原には、ＨＭＢＰＰ及びＩＰＰなどのピロホスフェート（ジホスフェート）が含まれる。天然ホスホ抗原の既知の類似体には、ブロモヒドリンピロホスフェート（ＢｒＨＰＰ）、及び、Ｃ－ＨＭＢＰＰなどのピロホスホネートが含まれる。当技術分野において知られたホスホ抗原活性を有するホスホネートには、２個のホスフェート基の間の中心炭素の置換基で異なるビスホスホネートが更に含まれる。その例には、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート及びビスホスホネートの作用強度を増加させると考えられる、中心炭素の置換基の１つに窒素又はアミノ基を有するビスホスホネートの一群が含まれる（Drake et al., Mayo Clin. Proc., 2008, 83(9), 1032-1045）。これらの窒素含有ビスホスホネートのホスホ抗原には、ゾレドロネート（ゾレドロン酸）、アレンドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、ネリドロネート及びオルパドロネートが含まれる。
作用強度が増加したとされる別のホスホ抗原類似体であるホスホラミダイトエステルは、国際公開第2005/05258号（Innate Pharma）に記載され、例えば、Ｎ－ＨＤＭＡＰＰであり、天然ＨＭＢＰＰに存在するイソプレン単位が、ピロホスフェートとＮＨ基を介して結合している。
ホスホ抗原プロドラッグ
プロドラッグについて、ホスホ抗原の不活性前駆体は、保護基（例．ホスホネート基の負荷電の非結合酸素原子上の中性保護基）の除去又は変換後に、活性なホスホ抗原へ変換されるものを意味する。本発明のホスホ抗原をプロドラッグの形で含む複合体が身体へ投与された後、保護基は、標的部位において代謝的に除去されてもよい。プロドラッグは、ホスホ抗原と連結部分の結合によって形成されてもよい。この場合、ホスホ抗原プロドラッグ部分とターゲティング部分を結合させるために用いた複合体のリンカーが切断されて、活性ホスホ抗原が放出されるため、及び／又は、保護基がホスホ抗原から除去されるため、活性ホスホ抗原が形成されてもよい。好ましくは、活性なホスホ抗原を放出するそのような変換は、健康な及び／又は標的ではない組織におけるホスホ抗原の望まれず、かつ非特異的な副作用を防止するために、本発明の複合体が治療効果を発揮しなければならない部位に到達した後に、例えば、それが腫瘍細胞の内部へ取り込まれた後に、又は少なくとも腫瘍微小環境内でのみ生じる。
例えば、ある特定のビスホスホネートは、骨塩に対する高い親和性を有し、「骨ターゲティング剤」として用いられる。そのようなビスホスホネートは、そのビスホスホネートと複合化された異なる薬物についてのターゲティング分子として働き、薬物を骨に標的化し、薬物は、例えば骨に局在する細胞に対して治療効果を発揮する（Farrell et al., 2018, Bone Reports, 9, 47-60）。
対照的に、本発明の複合体において、ホスホ抗原は、ターゲティング部分（例．腫瘍特異的抗体）と複合化される。本発明の複合体において、ホスホ抗原がその治療効果を発揮しなければならない部位に送達されることを保証するのは、ターゲティング部分の結合特異性である。
本発明では、ホスホ抗原の望まれない反応性（例．ホスホ抗原それ自体による標的ではない組織との結合）は、活性なホスホ抗原ではなく、そのプロドラッグを複合体に含めることで更に防止できる。
例えばビスホスホネートの負荷電ホスホネート基を、プロドラッグ部分でマスクしてもよい。プロドラッグは、複合体のターゲティング部分によって標的部位へ送達され、そこで活性なホスホ抗原へ変換される。
プロドラッグの型には、当技術分野において知られた保護基、例えば、アリールエステル、アリールアミド又はピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）プロドラッグが含まれる。Ｃ－ＨＭＢＰ（モノホスホネート）ホスホ抗原類似体／プロドラッグは国際公開第2019/182904号に記載されている。天然ホスホ抗原、例えばＨＭＢＰＰと同程度に強力であるホスホ抗原プロドラッグを合成することを目的として、（モノホスホネート）ホスホ抗原のアリールオキシトリエステルホスホラミダイトプロドラッグが、Davey et al., 2018, J. Med. Chem., 61, 2111-2117に記載のとおりに合成された。これらのプロドラッグでは、モノホスホネート基が、アリールモチーフ及びアミノ酸エステル部分によってマスクされている。これらの化合物（「HMBP ProPagens」）は、その分子におけるホスフェート部分とイソプレノイド部分との間の－Ｐ－Ｏ－結合の切断のために、血清中での安定性がかなり低かった。－Ｐ－Ｏ－結合における酸素が炭素によって置き換えられている、類似した「ProPagens」化合物は、国際公開第2020/008189号に記載されている。ホスホ抗原（プロドラッグ）の提案された構造活性相関（ＳＡＲ）は、Wiemer et al., 2020, Chem.Med.Chem., 15, 1030-1039により記載されている。
切断可能な連結部分は、アリルアルコールのアルコール基を介てホスホ抗原と共有結合してもよい。この場合、アリルアルコールは、切断可能な連結部分が切断された場合に細胞内で（再）形成される。
本発明の複合体の一部としてのホスホ抗原プロドラッグにおけるプロドラッグ部分は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、全てのプロドラッグ部分がＰＯＭ基であってもよく、又はホスホ抗原は、例えば「proTide」基、例えばアリールオキシ及びアミノ酸エステルラジカルの組合せ、例えば、国際公開第2020/008189号又は国際公開第2019/182904号においてホスホ抗原プロドラッグについて記載されたものを含んでいてもよい。
適切なホスホネートプロドラッグ技術及びホスホネートプロドラッグの合成は、当技術分野において知られている。そのようなプロドラッグ技術は、例えば、Pradere et al., 2014, Chem. Rev., 114, 9154-9218に更に概説され、カルボニルオキシメチルプロドラッグ部分、例えば、ピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）及びイソプロピルオキシカルボニルオキシメチル（ＰＯＣ）誘導体、Ｓ－アシル－２－チオエチル（ＳＡＴＥ）及びＳ－［（２－ヒドロキシエチル）スルフィジル］－２－チオエチル（ＤＴＥ）に基づくプロドラッグ、シクロサリゲニル（ｃｙｃｌｏＳａｌ）ホスフェート及びホスホネートに基づくプロドラッグ及びアルコキシアルキルモノエステル（ヘキサデシルオキシプロピル－（ＨＤＰ）、オクタデシルオキシエチル－（ＯＤＥ））に基づくプロドラッグ、ホスホラミダイト及びホスホンアミダイトに基づくプロドラッグ（アリールオキシアミノ酸アミデート（ProTide）プロドラッグを含む）、並びにホスホルジアミデート及びホスホノジアミデートの使用を含む。
リンカー－薬物化合物
本発明はまた、連結部分と共有結合した少なくとも１個のホスホ抗原を含むリンカー－薬物化合物を提供する。そのようなリンカー－薬物化合物は、本発明の複合体の合成における中間体として用いてもよい。例えば、ターゲティング部分が抗体又はその抗原結合断片である場合、本発明の１つ以上のリンカー－薬物化合物は、ターゲティング抗体と結合して本発明の複合体が生成できる。
本発明のリンカー－薬物化合物は、少なくとも１個のホスホ抗原（ｐＡｇ又は「薬物」）及び連結部分（Ｌ又は「リンカー」）を含む。そのようなリンカー－薬物分子は、本発明の複合体の製造に使用できる。本発明の好ましいリンカー－薬物化合物は、一般式ＩＩ：
Figure 2024524363000001
 （式中、
Ｑは、式ＩＩａ又は式ＩＩｂ：
Figure 2024524363000002
 で示す構造であり；
Ｙはハロゲンであり；
Ｗ１は、Ｎ、ＣＨ又はＣＦ、好ましくはＣＨであり；
Ｗ２は、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦ２又はＯであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＣＨＦ又はＣＦ２であり；
Ｘ２は、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＦ又はＣＦ２であり；
Ｘ３は、存在しないか又はＯ若しくはＮＨであり；
Ｘ４ａ～ｄは、それぞれ独立してＯ及びＳから選択され；
Ｘ５は、ＣＨ３、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３又はＣＣｌ３であり；
ｘは、１～５の整数であり；
ｍは、１、２又は３であり；
ｎは、０、１又は２であり；
Ｒ１は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
Ｒ２は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
Ｒ３は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
Ｒ４は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
あるいは、ｎが０である場合、Ｒ３とＲ２はＣ１～６（ヘテロ）アルキル基によって接続している；又は
ｎが１若しくは２である場合、Ｒ３とＲ４はＣ１～６（ヘテロ）アルキル基によって接続している）
で表されていてもよい。
Ｑが式ＩＩｂで示す構造のリンカー－薬物化合物は、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロホスフェート（ＨＭＢＰＰ）類似体、例えば、ＢｒＨＰＰ（ホスホスチム）、ＩＨＰＰ又はＣｌＨＰＰと類似するホスホ抗原を有してもよい。
本発明の好ましい態様において、リンカー－薬物化合物は、式ＩＩで示される化合物を包含し、式中、Ｑは式ＩＩａで示す構造である。そのような化合物は一般式ＩＩＩ：
Figure 2024524363000003
 （式中、
Ｗ１は、Ｎ、ＣＨ又はＣＦ、好ましくはＣＨであり；
Ｗ２は、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦ２又はＯであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＣＨＦ又はＣＦ２であり；
Ｘ２は、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＦ又はＣＦ２であり；
Ｘ３は、存在しないか又はＯ若しくはＮＨであり；
Ｘ４ａ～ｄは、それぞれ独立してＯ及びＳから選択され；
Ｘ５は、ＣＨ３、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３又はＣＣｌ３であり；
ｘは、１～５の整数であり；
ｍは、１、２又は３であり；
ｎは、０、１又は２であり；
Ｒ１は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
Ｒ２は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
Ｒ３は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
Ｒ４は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
あるいは、ｎが０である場合、Ｒ３とＲ２はＣ１～６（ヘテロ）アルキル基によって接続している；又は
ｎが１若しくは２である場合、Ｒ３とＲ４はＣ１～６（ヘテロ）アルキル基によって接続している）
で表される。
外側の角括弧の間の構造式はｐＡｇを表し、Ｌはリンカー部分を表す。１つのリンカー－薬物分子あたり、連結部分との接続部は１のみである（しかし、ｘが１より大きい場合、１つの（分枝鎖状）リンカー部分に複数のｐＡｇが接続する）。
好ましくは、ｎは０又は１であり、最も好ましくは０である。ｎが１又は２である場合、Ｘ２は好ましくはＯである。ｎが１でありＸ２がＣＨ２であるか、ｎが１でありＸ２がＯのホスホ抗原を有するリンカー－薬物化合物は、同様に、本発明の一部である。この場合、各Ｘ４ａ～ｄは、好ましくはＯである。そのようなリンカー－薬物化合物において、Ｒ３又はＲ１は、連結部分との接続部であってもよく、好ましくは、Ｒ３が連結部分との接続部を表す。
ｎが２である場合、Ｘ２は式ＩＩにおいて２回出現し、Ｘ２ａ及びＸ２ｂとされ、それらは、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＦ及びＣＦ２から独立して選択できる。ｎが２である場合、Ｒ４も２回出現し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂとされ、それらは、Ｈ、連結部分（Ｌ）との接続部、Ｃａｔ＋との接続部及びプロドラッグ部分との接続部から独立して選択できる。ｎが２である場合、Ｘ４ｃ及びＸ４ｄについても同様である。これらは２回（Ｘ４ｃ、Ｘ４ｃｉ、Ｘ４ｄ及びＸ４ｄｉ）出現し、Ｏ及びＳから独立して選択してもよい。
ｍが２又は３である場合、Ｗ２は、式ＩＩにおいて複数回出現し、各Ｗ２は、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦ２又はＯから独立して選択できる。好ましくは、Ｗ２はＣＨ２である。好ましい態様において、ｍは１であり、最も好ましくは、ｍが１である場合、Ｗ２がＣＨ２である。
Ｃａｔ＋は、水素イオンを含む、（有機又は無機）陽イオンを表す。
Ｘ１は、好ましくはＣＨ２、Ｏ又はＳ、最も好ましくはＣＨ２である。
各Ｘ４ａ～ｄ（存在する場合）は、好ましくはＯである。ｎが１又は０で、Ｘ４ａ～ｂ及びＸ４ｃ～ｄ（存在する場合）がＯで、Ｒ２及びＲ４（存在する場合）が好ましくはＨの化合物は、本発明の一部である。好ましくは、ｎが０で、Ｘ４ａ及びＸ４ｂがＯであり、Ｒ２が好ましくはＨである。
Ｑが式ＩＩａで示す構造であるリンカー－薬物化合物では、Ｗ１は、好ましくはＣＨ又はＣＦ、最も好ましくはＣＨである。
Ｑが式ＩＩａで示す構造である場合、Ｘ５は好ましくはＣＨ３である。
Ｑが式ＩＩａで示す構造であるリンカー－薬物化合物では、Ｒ１は、好ましくはＨ又は連結部分（Ｌ）との接続部、最も好ましくはＨである。
Ｑが式ＩＩａで示す構造であるリンカー－薬物化合物では、好ましくは、Ｗ１はＣＨで、Ｘ５はＣＨ３で、Ｘ１はＣＨ２で、Ｒ１はＨであり、その結果、アリル型アルコール基を有するｐＡｇを有するリンカー－薬物分子を生じる。好ましくは、Ｗ１がＣＨで、Ｘ５がＣＨ３で、Ｘ１がＣＨ２で、Ｒ１がＨである場合、Ｗ２はＣＨ２でｍは１である。Ｗ１がＣＨで、Ｗ２がＣＨ２で、ｍが１で、Ｘ５がＣＨ３で、Ｘ１がＯで、Ｒ１がＨである場合、ホスホ抗原は、天然ホスホ抗原、例えばＨＭＢＰＰに存在するアリルアルコール鎖を含む。
好ましいリンカー－薬物化合物は、Ｑが式ＩＩａで示す構造で、Ｘ３がＯで、Ｒ３が切断可能な連結部分との接続部で、Ｗ１がＣＨで、Ｘ５がＣＨ３で、Ｒ１がＨで、Ｗ２がＣＨ２で、ｍが１で、Ｘ１がＣＨ２のものである。
そのような化合物において、Ｒ２、Ｒ３及び／又はＲ４は、単独でプロドラッグ部分であってもよく、又は、Ｘ４ｂ、Ｘ４ｄ及び／若しくはＸ３（存在する場合）と組み合わせたプロドラッグ部分であってもよい（プロドラッグ部分は－Ｘ４ｂ－Ｒ２、－Ｘ４ｄ－Ｒ４及び／又は－Ｘ３－Ｒ３である）。
好ましくは、Ｑが式ＩＩａで示す構造であるリンカー－薬物化合物では、Ｗ１はＣＨで、Ｗ２はＣＨ２で、Ｘ４ａ～ｄはＯで、Ｒ２及びＲ４はＨで、Ｘ５はＣＨ３で、ｍは１である。
好ましい態様では、Ｑは式ＩＩａで示す構造で、Ｗ１はＣＨで、Ｗ２はＣＨ２で、ｎは０で、Ｘ４ａ～ｂはＯで、Ｘ５はＣＨ３で、ｍは１である。
式ＩＩにおいて、ｘは、連結部分（Ｌ）あたりのホスホ抗原（ｐＡｇ）の数を表し、角括弧の間の構造は、好ましくは本発明のリンカー－薬物化合物に用いるホスホ抗原の構造である。Ｘは１～５の整数であってもよい（各連結部分が１～５個のｐＡｇを有する）。好ましくは、連結部分は１個又は２個のｐＡｇを有する。大半の場合、各連結部分が１個のｐＡｇを有するので十分である。
連結部分との接続部はＲ１（の一部）であってもよく、あるいは、連結部分は、Ｒ２、Ｒ３若しくはＲ４であってもよい（と接続してもよい）。好ましくはＲ１又はＲ３、より好ましくはＲ３が、連結部分との接続部である。連結部分がＲ３で接続される場合、Ｘ３は好ましくはＯである。Ｒ３がリンカー部分との接続部である場合、好ましくはＸ３はＯであり、Ｒ１は好ましくはＨである。
連結部分がＲ２又はＲ４で結合している場合、Ｘ４ｂ又はＸ４ｄは、好ましくはＯである。
好ましいリンカー－薬物化合物は、Ｑが式ＩＩａで示す構造で、Ｘ３がＯで、Ｒ３が切断可能な連結部分との接続部で、好ましくは、Ｗ１がＣＨで、Ｘ５がＣＨ３で、Ｒ１がＨで、Ｗ２がＣＨ２で、ｍが１で、Ｘ１がＣＨ２のものである。そのような化合物では、ｎは好ましくは０である。
「連結部分との接続部」は、リンカーがホスホ抗原と接続する分子における位置を意味する。「接続部」は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４（リンカーが接続している箇所に依存）が、リンカーとホスホ抗原の残りとの間の、リンカー－薬物化合物の実際の（残りの）構造的要素を表すことを意味するとは限らない。例えば、用いるリンカーに依存して、Ｒ１が連結部分との接続部を表す場合、これはまた、リンカーが、リンカー－薬物分子におけるホスホ抗原の酸素原子と直接的に結合している状況も含む。別の例では、Ｒ１は連結部分（Ｌ）との接続部である。Ｒ１が連結部分（Ｌ）との接続部である場合、好ましくは、Ｗ１はＣＨで、Ｗ２はＣＨ２で、ｍは１で、Ｘ５はＣＨ３で、Ｘ１はＣＨ２である。そのようなリンカー－薬物分子が本発明の複合体に組み込まれた場合、投与後のリンカーの切断は、アリルアルコール基（複合体から放出される実際の機能的に活性なホスホ抗原では、Ｒ１がＨ）が（再）形成される可能性がある。Ｒ１はまたプロドラッグ部分であってもよい。適切なアルコールプロドラッグ部分は当技術分野において知られている。例えば、アルコールは、エステルに基づくプロドラッグ基によってマスクできる。活性アルコールの生成は、エステル結合の（細胞）エステラーゼによる加水分解に依存し、アルコール（薬物）及びカルボン酸（遊離基）を代謝的に再生される。
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ、独立して、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であってもよい。好ましい態様において、本発明の化合物はモノホスホネート（ｎが０）であり、したがって、Ｒ４は存在しない。
Ｃａｔ＋は、水素イオンを含む（有機又は無機）陽イオンを表す（及び製剤緩衝液又は血漿中で交換されてもよい）。Ｒ２、Ｒ３及び／又はＲ４がＣａｔ＋である場合、Ｃａｔ＋は、同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、Ｒ２、Ｒ３及び／又はＲ４がＣａｔ＋である場合、Ｘ４ｂ及びＸ４ｄ（存在する、すなわち、ｎが０ではない場合）並びに／又はＸ３はＯであり、Ｏ－Ｃａｔ＋を生じる。
本発明の別の態様において、ｎが０である場合、Ｒ３及びＲ２はＣ１～６（ヘテロ）アルキル基によって接続している。この場合、Ｒ３及びＲ２は一緒になって置換又は非置換の５～８員環を形成する。そのような態様では、好ましくは連結部分はＲ１で接続する。別の態様では、ｎが０ではない場合、Ｒ３及びＲ４はＣ１～６（ヘテロ）アルキル基によって同様の様式で接続してもよい。
Ｒ２、Ｒ３及び／又はＲ４はまた、単独でプロドラッグ部分であってもよく、又は、Ｘ４ｂ、Ｘ４ｄ及び／若しくはＸ３（存在する場合）と組み合わせたプロドラッグ部分であってもよい（プロドラッグ部分は－Ｘ４ｂ－Ｒ２、－Ｘ４ｄ－Ｒ４及び／又は－Ｘ３－Ｒ３）。
「プロドラッグ部分」は、非酵素的又は酵素的に切断される（活性化合物を放出する）基であってもよい。「プロドラッグ部分」は、本発明の複合体が対象に投与された後、その分子における別の位置の第２のプロドラッグ部分の放出を誘導する可能性がある。好ましくは、プロドラッグの形でのホスホ抗原は、標的細胞（例．腫瘍細胞）の内部で、例えばプロドラッグ部分の酵素的除去により、機能的に活性なホスホ抗原へ変換される。
当技術分野において知られたプロドラッグ技術の例には、ピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）又はイソプロピルオキシカルボニルオキシメチル（ＰＯＣ）基の使用が含まれる。好ましい態様において、少なくともＲ２及びＲ３は、ＰＯＭ基又はＰＯＣ基から独立して選択される（例えば、ｎが０である場合）。ｎが１又は２である場合、Ｒ４も同様にＰＯＭ又はＰＯＣ基であってもよい。
この種のホスホ抗原プロドラッグは、例えば、国際公開第2019/182904号に記載されている。そのようなホスホ抗原プロドラッグは、本発明のリンカー－薬物化合物及び複合体におけるｐＡｇ源として使用できる。
別の例では、遊離基の組合せが使用できる。そのようなプロドラッグ技術の例は、モノホスフェート及びモノホスホネートの細胞内送達のために開発された「ProTide」技術である。ProTideプロドラッグにおけるモノホスフェート又はモノホスホネート基のヒドロキシルは、芳香族基及びアミノ酸エステル部分によってマスクされ（又は置換され）、それらが細胞内で酵素的に切断されて、遊離モノホスフェート及びモノホスホネートを放出する（Mehellou et al. 2018, Journal of Medicinal Chemistry, 61(6), 2211-2226）。
したがって、ホスホ抗原がモノホスフェート又はモノホスホネートであり、かつＲ２及びＲ３が「ProTide」遊離基の組合せである本発明のリンカー－薬物化合物及び複合体も、本発明の一部である。ホスホ抗原がProTideプロドラッグである場合、Ｒ２が芳香族部分で、かつＲ３がアミノ酸エステル部分であるか、又はその逆である。本発明の好ましい態様において、ｎが０である場合、Ｒ２又はＲ３の一方が、置換又は非置換（ヘテロ）アリール基であってもよく、Ｒ２又はＲ３のもう一方は、式ＩＶ及び式Ｖ：
Figure 2024524363000004
 （式中；
Ｒａ及びＲａ’は、Ｈ、置換されていてもよいアミノ酸側鎖、及び置換されていてもよいＣ１～１４アルキル鎖を含む無極性側鎖から独立して選択され、
Ｒｂは、Ｈ、ベンジル又は置換若しくは非置換（Ｃ１～８）－アルキルであり、
Ｒｃ及びＲｃ’は、Ｈ、又は置換されていてもよい（Ｃ１～６）－アルキル、（Ｃ３～６）シクロアルキル、アリール若しくはヘテロアリールから独立して選択されるか、Ｒｃ及びＲｃ’は、それらが結合している窒素と一緒に、置換されていてもよい環、例えば、アジリジノ、アゼチジノ、モルホリノ、ピペラジノ、ピロリジノ又はピペリジノ環を形成してもよい）
で示す構造から選択されてもよい。
Ｒｃ及び／又はＲｃ’における置換基は、カルボン酸の生物学的等価体、アミノ、テトラゾール、スルホネート、ヒドロキシル、ハロ又はアルキルである。
Ｒｂが置換アルキルである場合、置換基は、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ＮＲｘＲｙ、（Ｃ１～６）アルコキシ、（Ｃ１～６）アルカノイル、（Ｃ１～６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１～６）アルキルチオ及び（Ｃ２～６）アルカノイルオキシからなる群から独立して選択される１つ以上の基であってもよく、Ｒｘ及びＲｙは、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、（Ｃ３～６）シクロアルキル及び（Ｃ３～６）シクロアルキル（Ｃ１～６）アルキルからなる群から独立して選択される。または、Ｒｘ及びＲｙは、それらが結合する窒素と一緒に、アジリジノ、アゼチジノ、モルホリノ、ピペラジノ、ピロリジノ又はピペリジノ基を形成する。
連結部分
本発明の複合体又はリンカー－薬物化合物で使用する連結部分（又は「リンカー」）は、好ましくは合成リンカーである。リンカーの構造は、リンカーが低分子量のエフェクター分子（ホスホ抗原）とたやすく化学的に結合できるように、そして、得られたリンカー－薬物化合物が、別の物質、例えばポリペプチド（例．抗体）とたやすく複合化できるような構造である。リンカーの選択は、血中における複合体の安定性に影響し、低分子エフェクター化合物（ホスホ抗原）が放出される場合には、放出される様式に影響することができる。適切なリンカーは、例えば、Ducry et al, 2010, Bioconjugate Chem., 21, 5-13；King and Wagner, 2014, Bioconjugate Chem., 25, 825-839；Gordon et al., 2015, Bioconjugate Chem., 26, 2198-2215；Tsuchikama and An, 2018, Protein & Cell, 9, 33-46 DOI: 10.1007/s13238-016-0323-0；Polakis, 2016, Pharmacological Reviews, 68 (1), 3-19, DOI: 10.1124/pr.114.009373；Bargh et al., 2019, Chem. Soc. Rev., 48, 4361-4374, DOI: 10.1039/c8cs00676h、国際公開第02/83180号、同第2004/043493号、同第2010/062171号、同第2011/133039号、同第2015/177360号及び同第2018/069375号に記載されている。リンカーは、例えば、van Delft, F and Lambert, J.M., 2021, Chemical Linkers in Antibody-Drug Conjugates (ADCs), 1st Ed. Royal Society of Chemistry, ISBN-10: 1839162635に記載のとおりに、切断可能であっても切断不可能であってもよい。リンカー－薬物を抗体と結合させる別の方法は、トランスペプチダーゼ、例えば細菌ソルターゼ又は植物アスパラギニルエンドペプチダーゼを用いて、適切な合成ペプチドと結合した化学的部分を部位特異的に結合させることを可能にすることである。ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔ－Ａ）は、Ｃ末端ペプチド配列（ＬＰＸＴＧ）を認識し、この配列内のスレオニンと、結合相手（例．グリシンタグづけペイロードであるＡＤＣ）のＮ末端のグリシンとの間に結合を作成する（Combs et al., 2015, the AAPS Journal, Vol. 17, No. 2, 339-351, DOI: 10.1208/s12248-014-9710-8）。抗体薬物複合化は、部位特異的糖鎖工学によっても、例えば、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）及びモノサッカリルトランスフェラーゼ変異体を用いることで、達成できる（Manabe et al., 2021, Chem Rec, (11),3005-3014, doi: 10.1002/tcr.202100054；Wang et al., 2019, Annu Rev Biochem, 20;88,433-459, doi: 10.1146/annurev-biochem-062917-012911）。
本発明の複合体では切断可能なリンカーの使用が好ましい。切断可能なリンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼに、又は酸性ｐＨ若しくは高い還元電位の環境に曝された場合に、切断される部分を含む。適切な切断可能なリンカーは、当技術分野において知られており、例えば、モノ、ジ、トリ又はテトラペプチド、すなわち、１、２、３又は４アミノ酸残基を含む。さらに、切断可能なリンカーは、自壊性部分、例えば、ω－アミノアミノカルボニル環化スペーサー（Saari et al, 1990, J. Med. Chem., 33, 97-101参照）又は－ＮＨ－ＣＨ２－Ｏ－を含んでいてもよい。リンカーの切断は、本発明の複合体における免疫調節エフェクター部分（ホスホ抗原又は「ｐＡｇ」部分）がその周囲の環境で利用できるようにする。切断不可能なリンカーも、例えば複合体化ポリペプチド（抗体）がリソソームで分解された場合、本発明の免疫複合体からホスホ抗原（の活性誘導体）を効果的に放出できる。切断不可能なリンカーには、例えば、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル（シクロヘキサン）－１－カルボキシレート及びマレイミドカプロン酸並びにその類似体が含まれる。
連結部分又はリンカー－薬物化合物を、抗体のようなポリペプチドと複合化することを可能にするために、抗体と（共有）結合する連結部分は、通常、相対的に穏やかな条件下で、抗体のアミノ酸残基と反応できる官能基を有する。この官能基は、この明細書では、反応部分（ＲＭ）という。反応部分の例には、カルバモイルハライド、アシルハライド、活性エステル、無水物、α－ハロアセチル、α－ハロアセトアミド、マレイミド、イソシアネート、イソチオシアネート、ジスルフィド、チオール、ヒドラジン、ヒドラジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、メチルケトン、ビニルスルホン、ハロメチル、メチルスルホネート、シクロオクチン及びトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）が含まれるが、これらには限定されない。官能基と反応するアミノ酸残基は、天然若しくは非天然のアミノ酸残基、又は（非）天然グリカンであってもよい（Manabe et al.、Wang et al., 前掲）。この明細書では、用語「非天然アミノ酸」は、（合成的に）改変されたアミノ酸、又は天然に存在するアミノ酸のＤ－立体異性体を表すことを意図する。好ましくは、官能基が反応するアミノ酸残基は天然アミノ酸である。
本発明の複合体又はリンカー－薬物化合物で使用する連結部分（Ｌ）は、式ＶＩ又は式ＶＩＩ：
Figure 2024524363000005
 （式中、ｍは１～１０の整数、好ましくは５であり、Ａはアミノ酸、好ましくは天然アミノ酸であり、ｐは０、１、２、３又は４である。ｐが１より大きい場合、そのアミノ酸は同じであっても異なっていてもよい）
で示す構造を含んでいてもよい。
適切なアミノ酸の組合せは当技術分野において知られており、アラニン、グリシン、リジン、フェニルアラニン、バリン及びシトルリンからなる群から選択されるアミノ酸を含む。好ましくはｐは２である。ｐが２である場合、ＡＡ２は、例えば、フェニルアラニルリジン、バリルアラニン、バリルシトルリン又はバリルリジンであってもよい。ｐが２である場合、ＡＡ２は、好ましくはバリルアラニン又はバリルシトルリンである。ｐが３である場合、ＡＡ３は、例えばアラニルフェニルアラニルリジンであってもよく、ｐが４である場合、ＡＡ４は、例えばグリシルグリシルフェニルアラニルグリシンであってもよい。
「ｑ」は、１～１２の整数、好ましくは２である；ＥＳは、存在しないか、又は以下から選択される延長スペーサーである：
Figure 2024524363000006
 （式中、Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル、Ｃ２～４アルキニル、Ｃ１～４アルコキシル又はＣ１～４アルキルチオ、好ましくはＨ、Ｆ、ＣＨ３又はＣＦ３、より好ましくはＨ又はＦであり；Ｖは、Ｈ、エチル、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ－ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ又はＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）２であり、ｐは１～１２の整数である）。
連結部分は分枝鎖状であってもよく、その場合、複数のホスホ抗原を保有できる１個の連結部分を生じる。分枝鎖状の連結部分の例は以下のとおり：
Figure 2024524363000007
これらの分枝鎖状リンカー部分は、ターゲティング部分に対するｐＡｇの比（「ＤＡＲ」）が相対的に高い複合体を得るために使用できる。そのような分枝鎖状リンカーを用いて、ＤＡＲが１６、更に２０以上の複合体を合成できる。本発明の抗体に基づく複合体のＤＡＲは、わずか約２であってもよい。しかし、標的腫瘍細胞での発現が相対的に低いことが知られている腫瘍特異的標的に対する抗体では、ターゲティング部分に対するｐＡｇの比が高い複合体が好ましい可能性がある。本発明のリンカー－薬物化合物で使用するリンカー－薬物化合物は、例えば、以下から選択される連結部分を含有してもよい：
Figure 2024524363000008
Figure 2024524363000009
リンカー部分（Ｌ）は、ｐＡｇと結合して、式ＩＩに示す一般式のリンカー－薬物化合物を生じてもよい。
本発明のリンカー－薬物化合物は、ターゲティング部分と結合して、本発明の複合体を生成できる。本発明の好ましい複合体は、本発明のリンカー－薬物化合物と結合した腫瘍ターゲティング抗体又はその抗原結合断片を含む。
本発明の具体的な態様において、本発明の複合体の一部としてのホスホ抗原はモノホスホネートプロドラッグであり、ここで、ホスホネート基の負荷電の非結合酸素原子は、ProTide部分（（ヘテロ）アリール基及びアミノエステルラジカル）の組合せ又は１以上のＰＯＭ若しくはＰＯＣのようなプロドラッグ部分により保護され、一方、切断可能な連結部分は、ホスホ抗原分子中の、リンカーが切断されるとＨＭＢＰＰなどのホスホ抗原に存在するアリル型アルコールに変換されるイソプレン単位と結合していてもい。
本発明の連結部分と共有結合した少なくとも１個のホスホ抗原を含むリンカー－薬物化合物は、本発明の複合体に含まれている場合、ある特定の原子又は原子群を欠損又は獲得してもよく、例えば、それは、複合体に含まれていない場合の本発明の同じリンカー－薬物化合物と比較して、水素原子を欠損してもよいことを理解する必要がある。これは、例えば、本発明のリンカー－薬物化合物が、例えば、ヒドロキシル部分へのエステル化を介してポリペプチドと複合化するための可能性がある。
本発明のリンカー－薬物分子の合成例は、実施例において更に示している。本発明の好ましいリンカー－薬物化合物の例は、以下の構造式のＸＤ１８である：
Figure 2024524363000010
リンカー－薬物ＸＤ１８に基づく本発明の複合体は、抗体（例．実施例で例示されているように、リツキシマブ）あたり１～２０個、好ましくは１～８個、より好ましくは２個のリンカー－薬物分子を含んでいてもよい。
本発明の複合体の合成
本発明の複合体を合成するために、本発明の１つ以上のリンカー－薬物化合物を適切なターゲット部分と結合させてもよい。ターゲット部分がポリペプチド（抗体又はその結合断片）である場合、リンカー－薬物化合物は、適切なポリペプチドに存在する反応性天然アミノ酸残基、例えばリジン若しくはシステインを介して、又はＮ末端若しくはＣ末端を介して、複合化してもよい。あるいは、天然若しくは非天然の反応性アミノ酸残基が適切なポリペプチド中へ遺伝子操作されてもよく、又は反応基が翻訳後修飾によって導入されてもよい。
本発明の複合体は、本発明のリンカー－薬物化合物を抗体又はその抗原結合断片と、例えば抗体のリジンε－アミノ基を介して、好ましくはアミン反応基を含む中間体、例えば、活性化エステルを用いて、複合化することで製造してもよい。そのような方法は通常の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を製造するために知られている。
あるいは、免疫複合体は、当技術分野において知られた方法及び条件を用いて、鎖間のジスルフィド結合の還元によって生成されるシステインの側鎖の遊離チオールを介してリンカーを複合化することで製造でき、例えば、Doronina et al, 2006, Bioconjugate Chem., 17, 114-124を参照されたい。製造過程は、溶媒露出した鎖間ジスルフィドの部分的還元、続いて、生じたチオールの、マイケル受容体含有リンカー、例えばマレイミド含有リンカー、αハロ酢酸アミド又はエステルでの修飾を含む。システイン結合ストラテジーは、還元型ジスルフィドあたり最大２個のリンカー含有リンカー－薬物を生じる。
本発明の複合体におけるターゲティング部分として用いられる好ましい抗体は、ヒトＩｇＧである。大半のヒトＩｇＧ分子は、４つの溶媒露出ジスルフィド結合を有し、そのことは、抗体あたり０から８までの整数の結合する連結部分と等しい。ターゲット部分あたりの結合したホスホ抗原の正確な数は、連結部分あたりのホスホ抗原の数、ジスルフィド還元の程度、及びその後の複合化反応におけるリンカー含有リンカー－薬物のモル当量によって決まる。全ての４つのジスルフィド結合の完全な還元は、抗体あたり８個のリンカー部分を有する均一な構築物を与え、一方、部分的還元は、通常、抗体あたり０個、２個、４個、６個又は８個の連結部分を有する不均一な混合物を生じる。
好ましい態様において、本発明は、本発明のリンカー－薬物化合物が、抗体又はその抗原結合断片と、抗体又はその抗原結合断片のシステイン残基を介して結合している複合体に関する。
抗体又はその抗原結合断片との部位特異的複合化
抗体は多くのリジン残基及びシステインジスルフィド結合を含有するため、通常の複合化は、分析的特徴づけ及び製造に関して課題を提示する不均一な混合物を生じる。さらに、これらの混合物の個々の構成物は、その薬物動態、効力及び安全性プロファイルに関して異なる物理化学的特性及び薬理を示し、この様式を最適化することへの合理的なアプローチの妨げになる。
複合体の均一性を向上させるために、本発明の（イムノ）複合体に用いられる抗体は、リンカーの部位特異的複合化を可能にするように改変してもよい。部位特異的な、薬物の抗体への複合化の方法は、C.R. Behrens and B. Liu, 2014, mAbs, 6 (1), 1-8に包括的に概説されており、国際公開第2015/177360号、同第2005/084390号及び同第2006/034488号に記載されている。
部位特異的免疫複合体は、変異型抗体又はその抗原結合断片の適切な位置における操作されたシステイン残基の側鎖を介して、リンカー－薬物化合物を抗体又はその抗原結合断片と複合化させることによって製造するのが好ましい。操作されたシステインは、通常、他のチオール、例えばシステイン又はグルタチオンでキャップされて、ジスルフィドを形成する。これらのキャップされた残基は、リンカー－薬物結合を行う前に、キャップをはずす必要がある。リンカー－薬物と操作された残基との結合は、（１）天然の鎖間ジスルフィドと変異型ジスルフィドの両者を還元し、その後、ＣｕＳＯ４若しくはデヒドロアスコルビン酸といった穏やかな酸化剤を用いて天然の鎖間システインを再酸化し、続いて、キャップがない操作されたシステインとリンカー－薬物とを標準的な複合化を行う方法、又は（２）鎖間ジスルフィド結合より速く変異型ジスルフィドを還元する穏やかな還元剤を用い、続いて、キャップがない操作されたシステインとリンカー－薬物とを標準的な複合化を行う方法、で達成される。リンカー－薬物を部位特異的に複合化する適切な方法は、例えば、還元と再酸化について記載する国際公開第2015/177360号、穏やかな還元剤を使用する方法を記載する国際公開第2017/137628号、及び還元された鎖間システインとキャップされていない操作されたシステインを結合する方法について記載する国際公開第2018/215427号に見いだすことができる。
医薬組成物
別の側面では、本発明は、本発明の複合体を含む組成物に関し、好ましくは組成物は医薬組成物であり、より好ましくは１つ以上の薬学的に許容される添加剤を更に含む。そのような組成物を、以後、本発明の組成物という。組成物は、液体製剤、凍結乾燥製剤であってもよく、又は、カプセル剤若しくは錠剤の形態であってもよい。
本発明の免疫複合体を含む医薬組成物は、通常、静脈内注入前に（水への）溶解（すなわち、再構成）を必要とする凍結乾燥ケーキ（凍結乾燥粉末）、又は使用前に解凍を必要とする凍結（水性）溶液の形態をとる。したがって、好ましい態様において、本発明は、本発明の免疫複合体を含む凍結乾燥組成物に関し、好ましくは組成物は医薬組成物であり、より好ましくは１つ以上の薬学的に許容される添加剤を更に含む。別の好ましい態様において、本発明は、水及び本発明の免疫複合体を含む凍結組成物に関し、好ましくは組成物は医薬組成物であり、より好ましくは１つ以上の薬学的に許容される添加剤を更に含む。これに関連して、凍結溶液は大気圧であることが好ましく、凍結溶液は、０℃未満で本発明の液体組成物を凍結させて得られたものであることが好ましい。（凍結乾燥前の）本発明の医薬組成物に配合する適切な薬学的に許容される添加剤には、緩衝液（例．クエン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸又はコハク酸を有する塩の水溶液）、凍結乾燥保護剤（例．スクロース、トレハロース）、浸透圧調節剤（例．塩化ナトリウムなどの塩化物の塩）、界面活性剤（例．ポリソルベート）及び増量剤（例．マンニトール、グリシン）が含まれる。凍結乾燥タンパク質製剤に用いる添加剤は、凍結乾燥工程及び保存中にタンパク質変性を防止する能力に基づいて選択される。
医学用途
別の側面では、本発明は、医薬品として使用するための、好ましくは、がん、自己免疫疾患又は感染性疾患を治療するための、本発明の複合体又は本発明の組成物を提供する。本発明の複合体は、例えば、腫瘍細胞及び／又は感染細胞にγδＴ細胞の細胞毒性を誘導するために使用できる。
複合体及び組成物を、以後、本発明で使用する製造物と集合的にいう。
第１の態様において、本発明の製造物の用途は、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍の治療である。第２の態様において、本発明の製造物の用途は、自己免疫疾患の治療である。第３の態様において、本発明の製造物の用途は、感染性疾患、例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫又は他の感染症の治療である。
本発明におけるがんは、好ましくは、本発明で使用する製造物が結合する抗原を発現する腫瘍である。そのような腫瘍は、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍であってもよい。これまでに説明した本発明で使用する製造物で治療できる腫瘍又は血液悪性腫瘍の例には、乳がん；脳がん（例．神経膠芽腫）；頭頚部がん；甲状腺がん；耳下腺がん、副腎がん（例．神経芽細胞腫、傍神経節腫又は褐色細胞腫）；骨がん（例．骨肉腫）；軟部肉腫（ＳＴＳ）；眼がん（例．ぶどう膜黒色腫）；食道がん；胃がん；小腸がん；結腸直腸がん；尿路上皮細胞がん（例．膀胱、陰茎、尿管又は腎がん）；卵巣がん；子宮がん；膣がん、外陰部のがん及び子宮頚がん；肺がん（特に、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺がん（ＳＣＬＣ））；黒色腫；中皮腫（特に、悪性胸膜及び腹膜中皮腫）；肝臓がん（例．肝細胞がん）；膵臓がん；皮膚がん（例．基底細胞腫、扁平上皮がん又は隆起性皮膚線維肉腫）；精巣がん；前立腺がん；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（ろ胞性リンパ腫（ＦＬ）、ＣＮＳリンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含む）；軽鎖アミロイドーシス；形質細胞性白血病；及び多発性骨髄腫（ＭＭ）が含まれるが、これには限定されない。
本発明における自己免疫疾患は、好ましくは、本発明で使用する製造物が結合する抗原に関連した自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、正常な体細胞及び体内組織に対する異常な免疫応答から生じた状態を表す。少なくとも８０種類の幅広い自己免疫疾患がある。器官特異的で、かつある特定の組織を冒すことに限定される疾患もあれば、身体中の多くの組織に影響する全身性炎症性疾患と類似する疾患もある。これらの徴候及び症状の出現及び重症度は、生じる炎症応答の場所及びタイプに依存し、時間と共に変動する可能性がある。これまでに説明した本発明で使用する製造物で治療できる自己免疫疾患の例には、関節リウマチ；若年性皮膚筋炎；乾癬；乾癬性関節炎；ループス；サルコイドーシス；クローン病；湿疹；腎炎；ぶどう膜炎；多発性筋炎；神経炎、例えば、ギラン・バレー症候群；脳炎；くも膜炎；全身性硬化症；自己免疫媒介性筋骨格系及び結合組織疾患；神経筋変性疾患、例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、視神経脊髄炎、並びに大、中、小血管の川崎及びヘノッホ・シェーンライン血管炎；寒冷及び温式凝集素症；自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）；免疫性血小板減少性紫斑病、ＩＴＰ）、１型糖尿病；橋本甲状腺炎；グレーブス病；グレーブス眼症；副腎炎；下垂体炎；尋常性天疱瘡；アジソン病；強直性脊椎炎；ベーチェット症候群；セリアック病；グッドパスチャー症候群；重症筋無力症；サルコイドーシス；強皮症；原発性硬化性胆管炎、後天性表皮水疱症及び類天疱瘡が含まれるが、これには限定されない。
本発明における感染性疾患は、好ましくは、本発明で使用する製造物が結合する抗原に関連した感染性疾患である。そのような感染性疾患は、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫又は他の感染症であってもよい。これまでに説明した本発明で使用する製造物で治療できる感染性疾患の例には、マラリア；トキソプラズマ症；ニューモシスチス・イロベチ（pneumocystis jirovecii）類鼻疽；細菌性赤痢；リステリア；シクロスポラ属（Cyclospora）又はらい菌（mycobacterium leprae）が引き起こす疾患；結核；及びＨＩＶ陽性個体、免疫抑制治療中の個体、又は、嚢胞性線維症若しくは良性増殖性疾患（例．胞状奇胎又は子宮内膜症）といった先天異常の個体のような免疫不全個体における感染が含まれるが、これには限定されない。
この明細書に記載の製造物の用途は、この明細書に記載の医薬品の製造のためであってもよい。この明細書に記載の本発明で使用する製造物は、好ましくは、治療方法のためであり、使用のための製造物が、対象、好ましくはそれを必要としている対象へ、治療有効量で投与される。したがって、あるいは、他の態様と組み合わせて、ある態様では、本発明は、がん、自己免疫疾患又は感染性疾患、特にがんを治療する医薬品の製造のための本発明の製造物の使用に関する。本発明で治療できる限定するものではないがん又は他の疾患については、これまでの説明を参照されたい。
あるいは、他の態様と組み合わせて、ある態様では、本発明は、がん、自己免疫疾患又は感染性疾患、特にがんを治療する方法であって、前記治療を必要としている対象へ本発明で使用する製造物の治療有効量を投与することを含む、方法に関する。本発明で治療できる、限定するものではないがん又は他の疾患については、これまでの説明を参照されたい。
本発明で使用する製造物は、対象に投与するためのものである。本発明で使用する製造物は、有効量の組成物を必要としている対象に投与することで、これまでに説明した治療方法で使用できる。この明細書では、用語「対象」は、哺乳動物として分類される全ての動物を指し、霊長類及びヒトが含まれるが、これには限定されない。対象は、好ましくはヒトである。「治療有効量」は、所望の応答をもたらすのに、又は症状若しくは徴候を寛解させるのに十分な量を意味する。特定の対象についての治療有効量は、治療されている状態、対象の健康状態、投与方法、経路及び用量並びに副作用の重症度といった因子に応じて変化してもよい。
組合せ使用
別の態様では、本発明は、本発明で使用する製造物を提供し、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて使用する。本発明で使用する製造物は、１つ以上の他の治療剤と同時に又は逐次的に用いてもよい。
適切な化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、ヒドロキシウレア、ニトロソウレア、テトラジン（例．テモゾロミド）及びアジリジン（例．マイトマイシン）；ＤＮＡ損傷応答に干渉する薬物、例えば、ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＴＲ及びＡＴＭ阻害剤、ＣＨＫ１及びＣＨＫ２阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、並びにＷＥＥ１阻害剤；代謝拮抗剤、例えば葉酸代謝拮抗剤（例．ペメトレキセド）、フルオロピリミジン（例．ゲムシタビン）、デオキシヌクレオシド類似体及びチオプリン；微小管阻害剤、例えば、ビンカアルカロイド及びタキサン；トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤；細胞毒性抗生物質、例えば、アントラサイクリン及びブレオマイシン；低メチル化剤、例えば、デシタビン及びアザシチジン；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；オールトランスレチノイン酸；並びに三酸化ヒ素が含まれる。適切な放射線療法剤には、放射性同位元素、例えば、１３１Ｉ－メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）、リン酸ナトリウムとしての３２Ｐ、塩化２２３Ｒａ、塩化８９Ｓｒ及び１５３Ｓｍジアミンテトラメチレンホスホネート（ＥＤＴＭＰ）が含まれる。ホルモン治療剤として使用される適切な物質には、ホルモン合成の阻害剤、例えば、アロマターゼ阻害剤及びＧｎＲＨ類似体；ホルモン受容体アンタゴニスト、例えば、選択的エストロゲン受容体調節物質（例．タモキシフェン及びフルベストラント）並びに抗アンドロゲン剤、例えば、ビカルタミド、エンザルタミド及びフルタミド；ＣＹＰ１７Ａ１阻害剤、例えば、アビラテロン；並びにソマトスタチン類似体が含まれる。
ターゲット化治療剤は、腫瘍形成及び増殖に関与する特定のタンパク質に干渉する治療剤であり、低分子薬；タンパク質、例えば、治療用抗体；ペプチド及びペプチド誘導体；又はタンパク質－低分子ハイブリッド、例えば、ＡＤＣであってもよい。ターゲット化低分子薬の例には、ＴＬＲリガンド、ｍＴｏｒ阻害剤、例えば、エベロリムス、テムシロリムス及びラパマイシン；キナーゼ阻害剤、例えば、イマチニブ、ダサチニブ及びニロチニブ；ＶＥＧＦ阻害剤、例えば、ソラフェニブ及びレゴラフェニブ；ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２阻害剤、例えば、ゲフィチニブ、ラパチニブ及びエルロチニブ；並びにＣＤＫ４／６阻害剤、例えば、パルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブが含まれる。ペプチド又はペプチド誘導体ターゲット化治療剤の例には、プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブが含まれる。
適切な抗炎症薬には、Ｄ－ペニシラミン、アザチオプリン及び６－メルカプトプリン、シクロスポリン、抗ＴＮＦ生物製剤（例．インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ又はセルトリズマブペゴル）、レンフルノミド（lenflunomide）、アバタセプト、トシリズマブ、アナキンラ、ウステキヌマブ、リツキシマブ、ダラツムマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、セクキヌマブ、アプレミラスト、アセトレチン（acetretin）、並びにＪＡＫ阻害剤（例．トファシチニブ、バリシチニブ又はウパダシチニブ）が含まれる。
免疫治療剤には、免疫応答を誘導、増強又は抑制する物質、例えば、サイトカイン（ＩＬ－２及びＩＦＮ－α）；免疫調節イミド薬、例えば、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド又はイミキモド；治療用がんワクチン、例えば、タリモジンラヘルパレプベク；細胞に基づく免疫治療剤、例えば、樹状細胞ワクチン、養子Ｔ細胞又はキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞；及び治療用（二重特異性）抗体又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）、若しくは細胞上の膜結合型リガンドと結合した時にＦｃ領域を介する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こすことができる他のＡＤＣが含まれる。
本発明において、治療は、好ましくは、がん、自己免疫疾患又は感染性疾患を防止し、元の状態に戻し、治癒させ、寛解させ、及び／又は遅らせることである。これは、がん、自己免疫疾患若しくは感染性疾患の少なくとも１つの症状の重症度が低下しており、及び／又は、がん、自己免疫疾患若しくは感染性疾患に関連した少なくとも１つのパラメーターが改善されていることを意味してもよい。
本発明において、対象は、生き延びた者であってもよく、及び／又は病気にかかっていないと考えられてもよい。あるいは、疾患又は状態が、停止又は遅延していてもよい。本発明において、生活の質の向上及び観察される鎮痛とは、対象が必要とする鎮痛薬の量が、治療の開始時点より少ない可能性があることを意味してもよい。これに関連して、「より少ない」とは、５％少ない、１０％少ない、２０％少ない、３０％少ない、４０％少ない、５０％少ない、６０％少ない、７０％少ない、８０％少ない、９０％少ないことを意味してもよい。対象は、もはや鎮痛薬を必要としなくてもよい。これらの生活の質の向上及び観察される鎮痛は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１月、２月、３月、４月、５月、６月又はそれ以上の治療後に対象で、見られ、検出され、又は評価されてもよく、前記対象の治療の開始時点での生活の質及び観察された鎮痛と比較してもよい。
一般的な定義
本発明の複合体及びリンカー－薬物は、１つ以上のキラル中心及び／又は二重結合を有してもよく、したがって、立体異性体、例えば、二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、位置異性体、鏡像異性体又はジアステレオマーとして存在してもよい。したがって、明細書に示す化学構造は、立体異性的に純粋な形（例．幾何的に純粋、鏡像異性的に純粋又はジアステレオ異性的に純粋）並びに鏡像異性体混合物及び立体異性体混合物を含む、例示し、特定した化合物の全ての可能な鏡像異性体及び立体異性体を包含する。鏡像異性体混合物及び立体異性体混合物は、当業者によく知られた分離技術又はキラル合成技術を用いて、その構成要素、鏡像異性体又は立体異性体へ分解できる。化合物は、エノール形、ケト形及びその混合物を含むいくつかの互変異性形で存在する可能性がある。したがって、明細書に示した化学構造は、例示し、特定した化合物の全ての可能な互変異性形を含む。いくつかの異性体の形、例えば、ジアステレオマー、鏡像異性体及び幾何異性体は、当業者により物理的及び／又は化学的方法により分離できることも理解されている。構造式又は物質名からキラル中心があると当業者は理解するが、キラリティーが示されていない場合、各キラル中心について、ラセミ混合物、純粋なＲ鏡像異性体及び純粋なＳ鏡像異性体の３つ全てが個々に参照される。化合物の構造が特定の鏡像異性体として示されている場合、この発明は、その特定の鏡像異性体に限定されないことを理解する必要がある。２つの部分が一緒に結合する場合、これは、これらの部分が原子として存在しないことを意味し、原子価のコンプライアンスは電子結合の置換で満たされる。これらは全て当技術分野において知られている。
この明細書及び特許請求の範囲に開示した化合物は、エキソ及びエンド位置異性体として存在してもよい。他に説明がない限り、明細書及び特許請求の範囲における化合物の記載は、化合物の個々のエキソ位置異性体と個々のエンド位置異性体の両者、加えてその混合物を含むことが意図される。さらに、この明細書及び特許請求の範囲に開示された化合物は、シス及びトランス異性体として存在してもよい。他に説明がない限り、明細書及び特許請求の範囲における化合物の記載は、化合物の個々のシス異性体と個々のトランス異性体の両者、加えてその混合物を含むことが意図される。例えば、化合物の構造がシス異性体として示されている場合、対応するトランス異性体、又はシス及びトランス異性体の混合物が、この発明から排除されないことを理解する必要がある。
この文書及びそれの特許請求の範囲において、動詞「含むこと」及びそれの活用形は、その語の後の項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は排除されないことを意味するように、それの限定されない意味で用いられる。加えて、不定冠詞「１つの（a, an）」による要素への言及は、文脈が、その要素の１つ及び１つだけあることを明らかに要求しない限り、その要素の１つより多くが存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（a, an）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
数値に付随して用いる場合の「約」又は「およそ」（例．約１０）は、好ましくは、その値が、その値の１％多い又は少ない所定の値であってもよいことを意味する。
物質のパラメーターをこの発明で検討する場合、他に特定しない限り、パラメーターは、生理学的条件で決定され、測定され、又は明らかにされることが仮定される。生理学的条件は当業者に知られており、水性溶媒系、大気圧、６～８のｐＨ、室温（ＲＴ）から約３７℃まで（約２０℃～約４０℃）、及び緩衝液塩又は他の構成要素の適切な濃度を含む。電荷は平衡を伴う場合が多いことは理解されている。電荷を保有又は所有すると言われる部分は、それがそのような電荷を所有又は保有しない状態より頻繁に、それがそのような電荷を所有又は保有する状態で見いだされる部分である。そのようなものとして、当業者によって理解されているように、荷電されるこの明細書で示した原子は、特定の条件下で非荷電であってもよく、中性部分は、特定の条件下で荷電されてもよい。
この明細書で引用した全ての特許及び論文は、全体として参照によりこの明細書に組み入れられる。
以下の実施例は、例示を目的としてのみ提供し、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。
一般的手順
溶媒：
さまざまなベンダー製の試薬グレード又はＨＰＬＣグレードの溶媒を使用した。
ＮＭＲスペクトル：
ＮＭＲスペクトルは、Bruker AVANCE400（１Ｈでは４００ＭＨｚ；１３Ｃでは１０１ＭＨｚ）で記録した。
化学シフト：
化学シフトは、内部標準であるテトラメチルシラン又は残留非重水素化溶媒に対してｐｐｍで示す。
生成物のＵＰＬＣ測定：
生成物は、流量０．４ｍＬ／分でWaters ACQUITY UPLC BEH C18カラム（１．７μｍ粒子サイズ、２．１×５０ｍｍ）を装着したWaters UPLC-MS（ＳＱＤ ２検出器付き）で測定した。（ＭｅＣＮ／水×０．１％ギ酸）。
ＨＰＬＣ精製：
分取ＨＰＬＣによる精製は、Waters SunFire Prep C18 OBD ５μｍカラム（１９×１５０ｍｍ）を装着したShimadzu Prominence 20APシステムにより流量１７ｍｌ／分で行った。
一般的手順ＸＸＡ：クロロメチルカルバメートによるアルコールのアルキル化
パラホルムアルデヒド（３当量）及びトリメチルシリルクロリド（ＴＭＳＣｌ）（２．７５当量）を、順次、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のカルバメート（２．５当量）（０．４５Ｍカルバメート）の懸濁液（室温）へ、窒素雰囲気下で加えた。混合物を１時間撹拌し、次いで濃縮し、ＤＣＭと共に蒸発させ、高真空で２分間乾燥させた。淡黄色のオイル状物をＤＣＭ（０．６Ｍカルバメート）中に溶解した。
次いで、この溶液のアリコート（通常１．５当量のクロロメチルカルバメート）を、ＤＣＭ（０．２４Ｍ）中のアルコール（１当量）の冷却（０℃）した混合物に加えた。N,N-ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、３当量）を加え、５分間撹拌した後、反応物を室温に温めた。３０～６０分後、ＵＰＬＣ－ＭＳを用いて変換を評価し、不完全な場合には、ストック溶液を更に加えた。クロロメチルカルバメートの添加ごとに、化学量論的量のＤＩＰＥＡを加え、塩基性のｐＨを維持した。完全な変換が観察された時点で、ＭｅＯＨで反応を停止し、濃縮し、精製した。
一般的手順ＸＸＢ：ホスホン酸ジクロリドのホスホネートジエステルからの製造
トリメチルシリルブロミド（ＴＭＳＢｒ、１０当量）を、ＤＣＭ（０．２Ｍ）中のホスホネートジエステル（１当量）の冷却（０℃）溶液へ、窒素雰囲気下、５分間かけて加えた。３０分後に氷浴を取り除き、反応物を室温で３．５時間撹拌した。窒素ガスでパージしたロータリーエバポレーターを用いて、溶液を濃縮し、粗生成物を窒素雰囲気下でＤＣＭ（０．２Ｍ）に溶解し、０℃に冷却した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２滴）を加え、続いて、塩化オキサリル（３当量）を滴下した。冷却浴を１時間かけて室温まで温め、１６時間撹拌した。反応物を窒素雰囲気下で濃縮し、ＤＣＭ（３× １０ｍＬ）と共に蒸発させて、更に精製することなく使用できる粗ホスホン酸ジクロリドを得た。
一般的手順ＸＸＣ：ＳｅＯ２によるアリル酸化
工程１ ＳｅＯ２（０．７当量）及びサリチル酸（０．１当量）をＤＣＭに溶解し（０．９Ｍ ＳｅＯ２）、t-ＢｕＯＯＨ（４．５当量）を室温で加えた。１５分間激しく撹拌した後、ＤＣＭ（０．８２Ｍ）中のアルケン（１当量）を加えた。生じた反応混合物を、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析がアルケンの完全な消費を示すまで（通常１６～４８時間）、激しく撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、次いで、飽和水溶液ＮａＨＣＯ３（用いた１ｍＬのｔＢｕＯＯＨにつき１０ｍＬ）で慎重にクエンチした。混合物を、沈澱した塩が溶解するのを助けるために水で希釈し、生成物を、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析で水相に生成物が存在しなくなるまで、ＤＣＭ（又はより極性の化合物ではＥｔＯＡｃ）で３～６回、抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮して、アリル型アルコール及び対応するアルデヒド生成物の混合物を得た。
工程２ 粗生成物をＥｔＯＡｃ（０．２Ｍ）に溶解し、ＡｃＯＨ（５当量）、引き続いて、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（５当量）を加えた。反応混合物を、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析がアルデヒドの完全な消費を示すまで（通常１～３時間）、５０℃で撹拌した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、水（１～５体積）を加えた。水層を、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析で水相中に生成物が存在しなくなるまで、ＥｔＯＡｃ（２～６×）で抽出した。合わせた有機層を、少量の飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、精製した。
実施例１ カルバミン酸エステル（ＸＤ５）の合成
Figure 2024524363000011
(S)-2-アジド-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)プロパンアミド（ＸＤ７）
(S)-2-アジドプロピオン酸（６．７３ｇ、５８．５ｍｍｏｌ）と(4-アミノフェニル)メタノール（１０．０ｇ、８２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２２８ｍＬ）及びＭｅＯＨ（７５ｍＬ）中に溶解した。０℃に冷却後、N-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、２８．９ｇ、１１７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で終夜撹拌し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～４０％ＥｔＯＡｃ）により、アジ化物ＸＤ７（９．３ｇ、７２％）を黄色の液体として得た。MS (ESI+) C10H13N4O2 + [M+H]+ 計算値221.10、実測値221.11。
エチルカルバミン酸(S)-4-(2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＤ５）
ＸＤ７（３．８ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１００ｍＬ）溶液に、０℃で、ジラウリン酸ジブチルスズ（２．５７ｍｌ、４．３１ｍｍｏｌ）とイソシアン酸エチル（２．０５ｍＬ、２５．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物をシリカゲル上で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～５０％ジエチルエーテル、続いてヘプタン中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、アジ化物ＸＤ５（４．２５ｇ、８５％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.29 (br s, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.04 (s, 2H), 4.92 (br s, 1H), 4.18 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.22 (quint, J = 6.7 Hz, 2H), 1.61 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.12 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。MS (ESI+) C13H17N5NaO3 + [M+Na]+ 計算値314.1、実測値314.1。
実施例２ ｐＡｇ（プロドラッグ）部分ＸＤ１からのリンカー－薬物化合物ＸＤ４の合成
Figure 2024524363000012
(((E)-5-(((((4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＤ２）
ＸＤ１（１００ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ、Kadri et al., J. Med. Chem. 2020, 63, 11258-11270に記載のとおりに製造）を、一般手順ＸＸＡに従い、カルバミン酸エステルＸＤ５と反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨ）により、ＸＤ２（１３４ｍｇ、７８％）を無色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C36H46N6O8P+ [M+H]+ 計算値721.3、実測値721.6。
(((E)-5-(((((4-((S)-2-アミノプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＤ３）
アジ化物ＸＤ２（１３４ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／水（２ｍＬ、９：１）溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。室温でトリブチルホスフィン（０．１１６ｍｌ、０．４６５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で４時間撹拌した。反応物を濃縮し、含まれる水分をＭｅＣＮ（２× ７ｍＬ）及びトルエン（１× ７ｍＬ）と共に蒸発させて除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２０％ＭｅＯＨ）で精製して、アミンＸＤ３（９７ｍｇ、７５％）を得た。MS (ESI+) C36H48N4O8P+ [M+H]+ 計算値695.3、実測値695.5。
(((E)-5-(((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＤ４）
(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-L-バリン（２６．５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、国際公開第2013/122823号に記載のとおりに製造）、ＤＭＡＰ（１．０ｍｇ、８．５μｍｏｌ）及びN-ヒドロキシフタルイミド（１３．９ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．８ｍＬ）懸濁液（室温）に、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ；０．０１３ｍＬ、０．０８５ｍｍｏｌ）を加えた。３時間後、室温で反応混合物を濃縮し、ＤＣＭ（約１ｍＬ）中に懸濁した。次いで、ＸＤ３（４１ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液にオレンジ／赤の上清を加え、室温で７５分間撹拌した。濃縮後、粗生成物をＲＰ－ＨＰＬＣ（水／ＭｅＣＮ、４０％から９０％勾配、修飾剤は使用せず）で精製した。生成物画分の凍結乾燥により、ＸＤ４（１０．９ｍｇ、１３％）を得た。MS (ESI+) C51H68N6O12P+ [M+H]+ 計算値987.5、実測値987.7。
リンカー－薬物化合物ＸＤ４を抗体と結合させて、複合体ＡＤＣ－ＸＤ４－ｒ及びＡＤＣ－ＸＤ４－ｉを、実施例２２に記載のとおりに製造した。これらのγδＴ細胞に対する効果を、実施例２３に記載のとおりに試験した。
実施例３ リンカー－薬物化合物ＸＤ１３の合成
Figure 2024524363000013
P-(ブタ-3-エン-1-イル)-N-(シクロブチルメチル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＤ９）
最初に、シクロブタンメタンアミン（１６６ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（０．５４４ｍｌ、３．９０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３．８ｍＬ）溶液に、－７８℃で、ブタ-3-エン-1-イルホスホン酸ジクロリド（ＸＤ８、３３８ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、Kadri et al. J. Med. Chem. 2020, 63, 11258-11270に記載のとおりに製造）を滴下した。５分後に冷却浴を取り除き、４５分間撹拌を続けた。
別のフラスコで、アルコールＸＤ７（４２９ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（０．５４４ｍｌ、３．９０ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下でＤＣＭ（３．８ｍＬ）に溶解し、混合物を－７８℃に冷却した。次に、最初の工程で調製した溶液をろ過し、アルコールＸＤ７を含む溶液に直接加えた。ＤＣＭ（２ｍＬ）を使用して移し替えを完了した。５分後に反応物を室温に温め、５時間撹拌した。反応を1-メチルピペラジン（０．１ｍＬ）でクエンチした。濃縮後、粗生成物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解し、塩酸（０．１Ｍ、３０ｍＬ）で洗浄した。水相をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、水及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～８０％ＥｔＯＡｃ）により、アジ化物ＸＤ９（３６３ｍｇ、４６％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.21 (br s, 1H), 7.56 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.85 (ddt, J = 16.9, 10.3, 6.4 Hz, 1H), 5.09-4.96 (m, 3H), 4.89 (dd, J = 11.9, 7.6 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 2.88 (br s, 2H), 2.43-2.27 (m, 4H), 2.13-1.97 (m, 2H), 1.97-1.75 (m, 4H), 1.70-1.55 (m, 5H)。MS (ESI+) C19H29N5O3P+ [M+H]+ 計算値406.2、実測値406.4。
P-(ブタ-3-エン-1-イル)-N-(シクロブチルメチル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-アミノプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＤ１０）
アジ化物ＸＤ９（２４４ｍｇ、０．６０２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１．８ｍＬ）／水（０．２ｍＬ）溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。室温でトリブチルホスフィン（０．３７６ｍｌ、１．５１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２２時間撹拌した。反応物を濃縮し、ＭｅＣＮ（２× ７ｍＬ）及びトルエン（１× ７ｍＬ）と共に蒸発させ、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２０％ＭｅＯＨ）で精製してアミンＸＤ１０（１８２ｍｇ、８０％）を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) ppm = 7.63 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.89 (ddt, J = 16.9, 10.3, 6.4 Hz, 1H), 5.07 (dq, J = 17.0, 1.6 Hz, 1H), 5.02-4.89 (m, 3H), 3.58 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 2.99-2.85 (m, 2H), 2.50-2.39 (m, 1H), 2.38-2.27 (m, 2H), 2.12-2.01 (m, 2H), 1.98-1.77 (m, 4H), 1.77-1.66 (m, 2H), 1.37 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。MS (ESI+) C19H31N3O3P+ [M+H]+ 計算値380.2、実測値380.3。
((2S)-1-(((2S)-1-((4-(((ブタ-3-エン-1-イル((シクロブチルメチル)アミノ)ホスホリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチルエステル（ＸＤ１１）
アミンＸＤ１０（１８２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０７９ｍｌ、０．４６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．８ｍＬ）溶液に、室温で、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（２２０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。７０分後、ゲル状の混合物が形成された。ゲルをばらばらにする酢酸エチル（４．０ｍＬ）を加え、撹拌を４時間続けた。反応混合物をＥｔＯＡｃ／イソプロピルアルコール（９：１）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液とブラインで洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨ）により、アミドＸＤ１１（２７９ｍｇ、８３％）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.00 (s, 1H), 8.17 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.46-7.38 (m, 3H), 7.37-7.27 (m, 4H), 5.87 (ddt, J = 16.9, 10.4, 6.3 Hz, 1H), 5.08-4.91 (m, 2H), 4.84 (dd, J = 12.1, 7.6 Hz, 1H), 4.77 (dd, J = 12.1, 7.6 Hz, 1H), 4.57 (dt, J = 11.1, 6.8 Hz, 1H), 4.43 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 4.34-4.18 (m, 3H), 3.92 (dd, J = 8.9, 7.1 Hz, 1H), 2.87-2.73 (m, 2H), 2.39-2.26 (m, 1H), 2.26-2.15 (m, 2H), 2.05-1.90 (m, 3H), 1.85-1.59 (m, 6H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI+) C39H50N4O6P+ [M+H]+ 計算値701.4、実測値701.5。
((2S)-1-(((2S)-1-((4-(((((シクロブチルメチル)アミノ)((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチルエステル（ＸＤ１２）
アミドＸＤ１１（１００ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）、2-メチルプロペ-2-エン-1-オール（０．１２６ｍｌ、１．５０ｍｍｏｌ）及び1,4-ベンゾキノン（１．５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、室温で1,2-ジクロロエタン（１．２ｍＬ）中に懸濁した。室温で第二世代ホベイダ－グラブス触媒（４．５ｍｇ、７．１μｍｏｌ、CAS：301224-40-8）を加え、懸濁液を４５℃に加熱した。４時間後、第二世代ホベイダ－グラブス触媒（４．５ｍｇ、７．１μｍｏｌ）を更に加え、４５℃で撹拌を終夜続けた。1,4-ベンゾキノン（２．３ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）と第二世代ホベイダ－グラブス触媒（８．９ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を更に加え、反応を５時間続けた。反応物を室温に冷却し、1,4-ビス(3-イソシアノプロピル)ピペラジン（SnatchCat、１２．６ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨ）により、ＸＤ１２（３９ｍｇ、交差メタセシスの前に、内部位置に、望ましくないＺ異性体とｓｍ中の二重結合異性化に由来する不純物が混入（m/z 731.6））を得た。この物質を更に精製することなく次の工程で使用した。MS (ESI+) C41H54N4O7P+ [M+H]+ 計算値745.4、実測値745.6。
N-(シクロブチルメチル)-P-((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＤ１３）
ジペプチドＸＤ１２（３９ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を室温でＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。ピペリジン（０．３９ｍｌ、３．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。濃縮後、エーテル（８ｍＬ）を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。生成物は十分に溶解せず、フラスコに付着した。ピペッティングによりエーテルを除去し、フラスコをエーテル（１×）ですすいだ。残ったオイル状物を真空中で乾燥させて、無色のオイル状物（２４．５ｍｇ）を得た。
この物質を、室温でＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル（１４．５ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０２５ｍｌ、０．１４１ｍｍｏｌ）を、順次加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。濃縮後、粗生成物をＲＰ－ＨＰＬＣ（水／ＭｅＣＮ、７０：３０から５０：５０勾配、修飾剤は使用せず）で精製し、純粋なＸＤ１３（１６．２ｍｇ、４３％、２工程）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.91 (s, 1H), 8.13 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.62-7.56 (m, 2H), 7.31 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.00 (s, 2H), 5.35 (td, J = 7.2, 1.3 Hz, 1H), 4.83 (dd, J = 12.3, 7.6 Hz, 1H), 4.76 (dd, J = 12.1, 7.8 Hz, 1H), 4.63 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.54 (dt, J = 11.0, 6.8 Hz, 1H), 4.39 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.6, 6.9 Hz, 1H), 3.76 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.88-2.72 (m, 2H), 2.39-2.26 (m, 1H), 2.23-2.10 (m, 4H), 2.02-1.88 (m, 3H), 1.87-1.70 (m, 2H), 1.69-1.57 (m, 4H), 1.56-1.52 (m, 3H), 1.52-1.40 (m, 4H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.18 (quint, J = 7.5 Hz, 2H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.9 Hz, 3H)。MS (ESI+) C36H55N5O8P+ [M+H]+ 計算値716.4、実測値716.6。
リンカー－薬物化合物ＸＤ１３を抗体と結合させて、複合体ＡＤＣ－ＸＤ１３－ｒ及びＡＤＣ－ＸＤ１３－ｉを、実施例２２に記載のとおりに製造した。これらのγδＴ細胞に対する効果を、実施例２３に記載のとおりに試験した。
実施例４ カルボン酸ＸＴ２の合成
Figure 2024524363000014
((2-(2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エトキシ)エトキシ)カルボニル)-L-バリン（ＸＴ２）
L-バリン（１６７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）と炭酸エステルＸＴ１（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、Elgersma et al., Mol. Pharm., 2015, 12, 1813-1835に記載のとおりに製造）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、０℃で、ＤＩＰＥＡ（０．２４９ｍｌ、１．４０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１０日間撹拌した。混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）に溶解し、塩酸（１Ｍ、５０ｍＬ）で洗浄した。水相をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～４０％ＭｅＯＨ）により、酸ＸＴ２（２５０ｍｇ、５３％）を透明なオイル状物として得た。MS (ESI+) C14H21N2O7 + [M+H]+ 計算値329.1、実測値329.2。
実施例５ リンカー－（プロ）ドラッグ化合物ＸＣ４の合成
Figure 2024524363000015
(S,E)-(((5-(((((4-(2-アジドプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)ビス(オキシ))ビス(メチレン) ビス(2,2-ジメチルプロパン酸)エステル（ＸＣ２）
アルコールＸＣ１（７０ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ、Wiemer, Chem. Biol. 2014, 21, 945-954に記載のとおりに製造）を、実施例１に記載の一般手順ＸＸＡに従い、カルバミン酸エステルＸＤ５と反応させた。反応完了後、溶媒の半量をロータリーエバポレーターで除去した。次いで、粗混合物をシリカゲルカラムに直接ロードし、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製した。アジ化物ＸＣ２（１４０ｍｇ、定量）を不純な無色のオイル状物として得、更に精製することなく次の工程で使用した。MS (ESI+) C32H51N5O11P+ [M+H]+ 計算値712.3、実測値712.5。
(S,E)-(((5-(((((4-(2-アミノプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)ビス(オキシ))ビス(メチレン) ビス(2,2-ジメチルプロパン酸)エステル（ＸＣ３）
アジ化物ＸＣ２（７０ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１．８５ｍＬ）／水（０．０９３ｍＬ）溶液に、室温でトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ、８５ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１８時間撹拌した。懸濁液を脱脂綿でろ過し、ＴＨＦですすぎ、ろ液をシリカゲル上で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨ）により、アミンＸＣ３（１５ｍｇ、２２％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) ppm = 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.61-5.52 (m, 4H), 5.35-5.13 (m, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.65 (br s, 2H), 3.80 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.70 (br d, J = 1.0 Hz, 2H), 3.27 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.27-2.09 (m, 2H), 1.91-1.71 (m, 2H), 1.58-1.45 (m, 3H), 1.42 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.13 (s, 18H), 1.09-1.00 (m, 3H)。MS (ESI+) C32H53N3O11P+ [M+H]+ 計算値686.3、実測値686.7。
((((E)-5-(((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-イソプロピル-2-メチル-4,7-ジオキソ-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)ビス(オキシ))ビス(メチレン) ビス(2,2-ジメチルプロパン酸)エステル（ＸＣ４）
アミンＸＣ３（１５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）に、酸ＸＴ２（７．２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５００ｍＬ）溶液を加えた。混合物を氷浴中で冷却し、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム-3-オキシド ヘキサフルオロリン酸（ＨＡＴＵ、１０．０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（７．６μｌ、０．０４４ｍｍｏｌ）を順次加え、得られた混合物を室温まで徐々に温めながら撹拌した。室温で１．５時間撹拌した後、反応物を真空中で濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～８％ＭｅＯＨ）で精製して、ＸＴ２が混入したＸＣ４（１８ｍｇ）を得た。生成物をＥｔＯＡｃに溶解し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液／水（１：１）、水及びブラインで洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～８％ＭｅＯＨ）で更に精製して、ＸＣ４（１０ｍｇ、４５％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.80-8.51 (m, 1H), 7.65-7.52 (m, 2H), 7.33-7.28 (m, 2H), 7.14-6.94 (m, 1H), 6.70 (s, 2H), 5.67 (d, J = 12.9 Hz, 4H), 5.39-5.27 (m, 1H), 5.16 (br s, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.77 (br s, 1H), 4.74-4.63 (m, 2H), 4.30 (br s, 1H), 4.09 (br s, 1H), 4.03 (br t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.84 (br s, 1H), 3.76-3.60 (m, 5H), 3.55 (br s, 2H), 3.44-3.29 (m, 2H), 2.38-2.18 (m, 3H), 1.98-1.70 (m, 2H), 1.65-1.53 (m, 3H), 1.46 (br d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.23 (s, 18H), 1.18-1.10 (m, 3H), 1.01 (br d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.96 (br d, J = 6.9 Hz, 3H)。MS (ESI+) C46H71N5O17P+ [M+H]+ 計算値996.5、実測値996.7。
リンカー－薬物化合物ＸＣ４を抗体と結合させて、複合体ＡＤＣ－ＸＣ４－ｒ及びＡＤＣ－ＸＣ４－ｉを、実施例２２に記載のとおりに製造した。これらのγδＴ細胞に対する効果を、実施例２３に記載のとおりに試験した。
実施例６ リンカー－薬物化合物ＸＤ１８の製造
Figure 2024524363000016
(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジメチルエステル（ＸＤ１５）
撹拌中のジイソプロピルアミン（１３．０ｍｌ、９２．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２８０ｍＬ）溶液（－７８℃）に、n-ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、５５．４ｍｌ、８８．６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を－７８℃で２０分間撹拌した。次に、シリンジを使用してメチルホスホン酸ジメチルエステル（８．７３ｍｌ、８０．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、混合物を１時間撹拌した。臭化プレニル（１１．６ｍｌ、１０１ｍｍｏｌ）をシリンジを使用してゆっくりと加え、次いで溶液を一晩、室温に温めた。反応物を氷浴上で冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチし、Ｅｔ２Ｏ（３×）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、エーテル中の０～３％ＭｅＯＨ）で精製した。生成物の画分を濃縮し、ＤＣＭ（３×）と共に蒸発させてわずかなメタノールを除去し、ホスホン酸ジエステルＸＤ１５（１２．８８ｇ、８３％）を黄色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 5.14-5.07 (m, 1H), 3.74 (d, J = 10.8 Hz, 6H), 2.33-2.22 (m, 2H), 1.83-1.71 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.62 (s, 3H)。MS (ESI+) C8H18O3P+ [M+H]+ 計算値193.1、実測値193.1。
((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-シアノエトキシ)(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)-オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチルエステル（ＸＤ１６）
工程１ ＤＣＭ（１．８ｍＬ）中の(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジクロリド（９７．０ｍｇ、０．４８５ｍｍｏｌ、一般手順ＸＸＢに従いホスホン酸ジエステルＸＤ１５から製造）に、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール（６．３１ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を－７８℃に冷却し、3-ヒドロキシプロパンニトリル（０．０３３ｍｌ、０．４８５ｍｍｏｌ）とピリジン（０．０４７ｍｌ、０．５８２ｍｍｏｌ）を加えた。－７８℃で３０分間撹拌した後、反応物を室温に温め、２．５時間撹拌した。
工程２ 別のフラスコで、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ（２５０ｍｇ、０．４８５ｍｍｏｌ）をピリジン（１．０ｍＬ）に溶解した。０℃に冷却後、工程１で製造したホスホン酸クロリドのＤＣＭ溶液を、カニューレを使用して、ピリジン溶液に滴下した。反応物を０℃で３０分間撹拌し、次いで、室温で１時間撹拌した。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析は、反応が５０％の変換で停止したことを示した。反応物を－３０℃で一晩保管し、次いで、工程１で２．５時間の撹拌を室温で一晩の撹拌に変えて、同じ量で繰り返した。翌日、得られた溶液を一晩保管した反応混合物に０℃で加えた。０℃で３０分間、そして室温で１時間撹拌した後に、反応が完全に終了したことが観察された。溶液を濃縮し、粗生成物をシリカゲルにドライロードし、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２５％アセトン）で精製して、ホスホン酸ジエステル混合物ＸＤ１６（１２７ｍｇ、３７％）を不純な白色の固体として得た。MS (ESI+) C39H48N4O7P+ [M+H]+ 計算値715.3、実測値715.5。
((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-シアノエトキシ)((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-1-オキソプロパン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチルエステル（ＸＤ１７）
ＳｅＯ２（７１ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）と2-ヒドロキシ安息香酸（１７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（０．７ｍＬ）に溶解し、室温でt-ＢｕＯＯＨ（水中に７０％、０．６６ｍｌ、４．８１ｍｍｏｌ）を加えた。１５分間激しく撹拌した後、溶液をＸＤ１６（１２７ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．１ｍＬ）懸濁液にピペッティングした。得られた混合物を終夜激しく撹拌した。混合物を０℃に冷却し、発泡が停止するまで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でゆっくりとクエンチした。水を加えて沈殿した塩を溶解した。生成物をＤＣＭ（３×）で抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、シリカゲル上で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨ）により、アルコールＸＤ１７（４５ｍｇ、３５％）を次の工程で使用できる純粋な白色の固体として得た。MS (ESI+) C39H48N4O8P+ [M+H]+ 計算値731.3、実測値731.6。
((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパン-アミド)ベンジルエステル（ＸＤ１８）
工程１ ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中のホスホン酸エステルＸＤ１７（４５ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（９．０ｍＬ）で希釈した。次いで、室温でアンモニアのメタノール溶液（７Ｍ、２．３５ｍＬ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌した。次に、室温でＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、１．１５ｍＬ）を加え、混合物を１５分間撹拌した。反応物を氷浴上で冷却し、ＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ、２３．５ｍＬ）を加えた。濁った溶液が得られたので、シリンジフィルターでろ過した。ろ液を真空中で濃縮し、ジオキサン／水（１：１、１ｍＬ）に溶解した。溶液を凍結乾燥して２００ｍｇの白色の固体を得た（生成物と塩の混合物）。
工程２ 生成物をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、室温でＤＩＰＥＡ（０．０４９ｍＬ、０．２８１ｍｍｏｌ）と6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（７０．４ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。過剰の塩基を０℃でＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ、０．５２ｍＬ）によりクエンチし、混合物を濃縮した。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（水×０．１％ ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ 2,2,2-トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ＭｅＣＮ、９０：１０から４５：５５勾配）で精製した。ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水性の混合物を凍結乾燥してＸＤ１８（２６．５ｍｇ、２工程で８９％）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.92 (s, 1H), 8.14 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.99 (s, 2H), 5.33 (td, J = 7.1, 1.0 Hz, 1H), 4.84 (br d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.61 (br s, 1H), 4.39 (quint, J = 6.9 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.5, 6.9 Hz, 1H), 3.74 (s, 2H), 3.36 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.26-2.06 (m, 4H), 2.02-1.91 (m, 1H), 1.66-1.54 (m, 2H), 1.50 (s, 3H), 1.51-1.39 (m, 4H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.26-1.12 (m, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI+) C31H46N4O9P+ [M+H]+ 計算値649.3、実測値649.6。
実施例７ リンカー－薬物化合物ＸＣ９の合成
Figure 2024524363000017
(4-ニトロフェニル) (S)-4-(2-アジドプロパンアミド)ベンジル 炭酸エステル（ＸＣ５）
アルコールＸＤ７（１．６０ｇ、７．２７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、０℃で、炭酸ビス(4-ニトロフェニル)（４．４２ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１．９０ｍＬ、１０．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～５％ＥｔＯＡｃ）により、炭酸エステルＸＣ５（１．９７ｇ、７０％）を淡黄色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C17H16N5O6 + [M+H]+ 計算値386.1、実測値386.2。
(2,5,8,11,14,17,20-ヘプタオキサドコサン-22-イル)カルバミン酸(S)-4-(2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＣ６）
炭酸エステルＸＣ５（６２４ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０．８ｍＬ）溶液（０℃）に、2,5,8,11,14,17,20-ヘプタオキサドコサン-22-アミン（５５０ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．３４０ｍＬ、１．９４ｍｍｏｌ）を加え、得られた明るい黄色の溶液を、室温まで徐々に温めながら１８時間撹拌した。濃縮後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～６％ＭｅＯＨ）で精製して、カルバミン酸エステルＸＣ６（８７５ｍｇ、９２％）を淡黄色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C26H44N5O10 + [M+H]+ 計算値586.3、実測値586.4。
(((E)-23-(((4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-27-メチル-2,5,8,11,14,17,20,25-オクタオキサ-23-アザトリアコンタ-27-エン-30-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＣ７）
アルコールＸＤ１（１００ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ、Kadri, H. et al. J. Med. Chem. 2020, 63, 11258-11270に記載のとおりに製造）を、一般手順ＸＸＡに従い、カルバミン酸エステルＸＣ６と反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１１％ＭｅＯＨ）により、不純なアジ化物ＸＣ７（３１３ｍｇ）を無色のオイル状物として得、更に精製することなく次の工程で使用した。MS (ESI+) C49H71N6NaO15P+ 計算値1037.5、実測値1037.7。
(((E)-23-(((4-((S)-2-アミノプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-27-メチル-2,5,8,11,14,17,20,25-オクタオキサ-23-アザトリアコンタ-27-エン-30-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＣ８）
アジ化物ＸＣ７（１２１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１．１４ｍＬ）／水（０．１３ｍＬ）溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。０℃でトリブチルホスフィン（０．０７４ｍｌ、０．２９８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で５．５時間撹拌し、真空中で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１５％ＭｅＯＨ）で精製して、アミンＸＣ８（６２ｍｇ、５２％）を黄色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C49H74N4O15P+ [M+H]+ 計算値989.5、実測値989.8。
(((E)-23-(((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)-27-メチル-2,5,8,11,14,17,20,25-オクタオキサ-23-アザトリアコンタ-27-エン-30-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＣ９）
冷却（０℃）したアミンＸＣ８（６２ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）と(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-L-バリン（１９．５ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ、国際公開第2013/122823号に記載のとおりに製造）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（２８．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０２２ｍＬ、０．１２５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた黄色の混合物を室温で１．５時間撹拌し、真空下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液／水（１：１）、水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨ）で精製して、無色のオイル状物を得た。オイル状物をＭｅＣＮ／ミリＱ水（１：１）に溶解し、分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（水／ＭｅＣＮ、６０：４０から１０：９０勾配、修飾剤は使用せず）で精製した。生成物の画分をプールし、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去した。次いで、水性の混合物を凍結乾燥して、マレイミドＸＣ９（２５ｍｇ、３１％）を無色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C64H94N6O19P+ [M+H]+ 計算値1281.6、実測値1282.0。
実施例８ リンカー－薬物化合物ＸＣ１３の合成
(E)-((5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(4-ヨードフェノキシ)ホスホリル)アラニンベンジルエステル（ＸＳ４）の製造
Figure 2024524363000018
((4-ヨードフェノキシ)(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)アラニンベンジルエステル（ＸＳ３）
トルエン（２７ｍＬ）中の(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジクロリド（８３７ｍｇ、４．１６ｍｍｏｌ、一般手順ＸＸＢに従い、ホスホン酸ジエステルＸＤ１５（１．００ｇ、５．２０ｍｍｏｌ）から製造）に、－７８℃で、4-ヨードフェノール（１．８３ｇ、８．３３ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１．４５ｍＬ、８．３３ｍｍｏｌ）のトルエン（２７ｍＬ）溶液を滴下した。反応混合物を－７８℃で３０分間撹拌した。L-アラニンベンジルエステル塩酸塩（１．８９ｇ、８．７４ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（３．０５ｍＬ、１７．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温にして、２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、ＸＳ３（０．４９０ｇ、２２％、約３：２のジアステレオマー混合物）を黄色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.60-7.53 (m, 2H), 7.41-7.28 (m, 5H), 7.00-6.93 (m, 2H), 5.14-5.06 (m, 3H), 4.15-4.04 (m, 1H), 3.31 (t, J = 10.4 Hz, 0.6H), 3.22 (t, J = 10.5 Hz, 0.4H), 2.41-2.28 (m, 2H), 1.96-1.80 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.62 (s, 3H), 1.33 (d, J = 7.1 Hz, 1.9H), 1.27 (d, J = 7.1 Hz, 1.1H)。MS (ESI+) C22H28INO4P+ [M+H]+ 計算値528.08、実測値528.26。
(E)-((5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(4-ヨードフェノキシ)ホスホリル)アラニンベンジルエステル（ＸＳ４）
アルケンＸＳ３（０．４３４ｇ、０．８２３ｍｍｏｌ）のアリル酸化を、一般手順ＸＸＣに従って行った。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の４０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、アルコールＸＳ４（０．２５４ｇ、５７％、約３：２のジアステレオマー混合物）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.61-7.54 (m, 2H), 7.40-7.28 (m, 5H), 7.00-6.93 (m, 2H), 5.47-5.39 (m, 1H), 5.15-5.07 (m, 2H), 4.17-4.02 (m, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.36 (t, J = 10.3 Hz, 0.6H), 3.27 (dd, J = 11.6, 9.6 Hz, 0.4H), 2.49-2.35 (m, 2H), 2.01-1.83 (m, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 1.8H), 1.25 (d, J = 7.1 Hz, 1.2H)。MS (ESI+) C22H28INO5P+ [M+H]+ 計算値544.07、実測値544.32。
リンカー－薬物化合物ＸＣ１３をＸＳ４から以下の反応スキームに従って合成した。
Figure 2024524363000019
((4-(2,5,8,11,14,17,20,23-オクタオキサヘキサコス-25-イン-26-イル)フェノキシ)((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＣ１０）
ＸＳ４（５０ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）、2,5,8,11,14,17,20,23-オクタヘキサコス-25-イン（３４．８ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）、ビス(トリフェニルホスフィノ)パラジウムクロリド（３．２３ｍｇ、４．６０μｍｏｌ）及びＣｕ（Ｉ）Ｉ（１．７５３ｍｇ、９．２０μｍｏｌ）に、脱気したＥｔ３Ｎ（０．２ｍＬ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。濃縮後、粗生成物をＤＣＭに再度溶解し、再び濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１１％ＭｅＯＨ）で精製して、アルコールＸＣ１０（６７ｍｇ、８３％）を茶色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C40H61NO13P+ [M+H]+ 計算値794.4、実測値794.6。
((4-(2,5,8,11,14,17,20,23-オクタオキサヘキサコス-25-イン-26-イル)フェノキシ)((E)-5-(((((4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＣ１１）
アルコールＸＣ１０（６７ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従いカルバミン酸エステルＸＤ５と反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～８％ＭｅＯＨ）により、アジ化物ＸＣ１１（５４ｍｇ、６５％）を淡茶色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C54H78N6O16P+ [M+H]+ 計算値1097.5、実測値1097.8。
((4-(2,5,8,11,14,17,20,23-オクタオキサヘキサコス-25-イン-26-イル)フェノキシ)((E)-5-(((((4-((S)-2-アミノプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＣ１２）
アジ化物ＸＣ１１（５４ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．４７３ｍＬ）／水（０．０５３ｍＬ）溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。室温でトリブチルホスフィン（０．０３１ｍｌ、０．１２３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で５．５時間撹拌し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１５％ＭｅＯＨ）により、アミンＸＣ１２（４２ｍｇ、８０％）を淡黄色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C54H80N4O16P+ [M+H]+ 計算値1071.5、実測値1071.9。
((4-(2,5,8,11,14,17,20,23-オクタオキサヘキサコス-25-イン-26-イル)フェノキシ)((E)-5-(((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＣ１３）
冷却（０℃）したアミンＸＣ１２（４２ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）と(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-L-バリン（１２．２ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、国際公開第2013/122823号に記載のとおりに製造）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（１７．９ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０１４ｍＬ、０．０７８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた黄色の混合物を室温で１．５時間撹拌し、真空下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液／水（１：１）、水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨ）で精製して、無色のオイル状物を得た。オイル状物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（水／ＭｅＣＮ、６０：４０から１０：９０勾配、修飾剤は使用せず）で精製した。生成物の画分をプールし、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去した。次いで、水性の混合物を凍結乾燥してマレイミドＸＣ１３（２１ｍｇ、４０％）を白色の固体として得た。MS (ESI+) C69H100N6O20P+ [M+H]+ 計算値1363.7、実測値1364.1。
実施例９ リンカー－薬物化合物ＸＳ２の合成
(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)グリシルグリシル-L-フェニルアラニン 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル（ＸＤ２０）の製造
Figure 2024524363000020
(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル) グリシルグリシル-L-フェニルアラニン 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル（ＸＤ２０）
N,N′-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、４５９ｍｇ、２．２２２ｍｍｏｌ）を、ＸＤ１９（１．０５ｇ、２．２２ｍｍｏｌ）と1-ヒドロキシピロリジン-2,5-ジオン（２５６ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ、欧州特許出願公開第2907824号に記載のとおりに合成）のＴＨＦ（４０ｍＬ）懸濁液に室温で加えた。３．５時間撹拌した後、混合物をろ過し、残留物をＤＣＭで徹底的に洗浄した。ろ液をＥｔＯＡｃで希釈し、次いで濃縮した。白色の固体を少量のＥｔＯＡｃ中に懸濁し、次いでろ過してＯｓｕエステルＸＤ２０（６１２ｍｇ、４８％）を白色の固体として得た。MS (ESI+) C27H32N5O9 + [M+H]+ 計算値570.2、実測値570.4。
(((E)-5-((2-((S)-2-(2-(2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)アセトアミド)アセトアミド)-3-フェニルプロパンアミド)アセトアミド)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＳ２）の製造
Figure 2024524363000021
(((E)-5-((2-アミノアセトアミド)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＳ１）
工程１ フラスコに、酢酸(2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)アセトアミド)メチルエステル（０．１５２ｇ、０．６５９ｍｍｏｌ、Brailsford et al. Tetrahedron, 2018, 74, 1951-1956に記載のとおりに製造）とp-トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ；１０．６ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加えた。トルエン（１．３ｍＬ）中のアルコールＸＤ１（０．１１０ｇ、０．２６４ｍｍｏｌ、Kadri et al. J. Med. Chem. 2020, 63, 11258-11270に記載のとおりに製造）を加え、反応混合物を８０℃で１時間撹拌した。室温に冷却後、Ｅｔ３Ｎ（４滴）を加え、反応混合物を濃縮し、ＤＣＭ（１ｍＬ）と共に蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の２０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、(E)-((5-((2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)アセトアミド)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル-)アラニンベンジルエステル（０．１２０ｇ、収率６８％）を、ジアステレオマーの混合物として得た。MS (ESI+) C29H39N3O8P+ [M+H]+ 計算値588.25、実測値588.42。
工程２ １０ｍＬのバイアルを窒素ガスでパージし（３× 真空／窒素ガスのサイクル）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（４．２ｍｇ、０．００３６ｍｍｏｌ）を入れた。次いで、ＤＣＭ（１．８０ｍＬ）中のＡｌｌｏｃ保護アミン（０．１２０ｇ、０．１８０ｍｍｏｌ、工程１で製造）を加え、続いて、ＰｈＳｉＨ３（０．１５５ｍＬ、１．２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の５～１５％ＭｅＯＨ）で精製して、ＸＳ１（６３．７ｍｇ、７０％、約３：２のジアステレオマー混合物）を黄色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.01 (br s, 1H), 7.46-7.22 (m, 7H), 7.22-7.16 (m, 2H), 7.16-7.09 (m, 1H), 5.48 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 5.27-4.91 (m, 2H), 4.82-4.64 (m, 2H), 4.19-4.00 (m, 1H), 3.90 (s, 2H), 3.47 (t, J = 10.2 Hz, 1H), 3.42-3.28 (m, 2H), 2.49-2.34 (m, 2H), 2.02-1.84 (m, 4H), 1.65 (s, 3H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 1.8H), 1.25 (d, J = 7.1 Hz, 1.2H)。MS (ESI+) C25H35N3O6P+ [M+H]+ 計算値504.2、実測値504.4。
(((E)-5-((2-((S)-2-(2-(2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)アセトアミド)アセトアミド)-3-フェニルプロパンアミド)アセトアミド)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＳ２）
アミンＸＳ１（２５．７ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５１ｍＬ）溶液に、ＯｓｕエステルＸＤ２０（３１．７ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＰＥＡ（０．０２７ｍＬ、０．１５３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。ＯｓｕエステルＸＤ２０（５．８１ｍｇ、１０．２μｍｏｌ）を更に加え、４０分間撹拌した後、最後のＯｓｕエステルＸＤ２０（５．８１ｍｇ、１０．２μｍｏｌ）を加え、続いて３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、トルエン（２ｍＬ）と共に蒸発させて、真空中で乾燥した。粗生成物をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、シリンジフィルターでろ過し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～８％ＭｅＯＨ）で精製した。生成物をＲＰ－ＨＰＬＣ（水／ＭｅＣＮ、７０：３０から４５：５５勾配、修飾剤は使用せず）で更に精製した。ＭｅＣＮの蒸発、その後の凍結乾燥によりＸＳ２（１４．８ｍｇ、３０％、約３：２のジアステレオマー混合物）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.50-8.43 (m, 1H), 8.27 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.06 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.00 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.38-7.27 (m, 7H), 7.27-7.21 (m, 4H), 7.20-7.11 (m, 4H), 6.98 (s, 2H), 5.63 (dd, J = 12.5, 10.4 Hz, 0.4H), 5.52 (dd, J = 13.3, 10.0 Hz, 0.6H), 5.44-5.36 (m, 1H), 5.13-5.02 (m, 2H), 4.55-4.46 (m, 3H), 4.00-3.90 (m, 1H), 3.77 (s, 2H), 3.74-3.69 (m, 2H), 3.66 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.63-3.55 (m, 1H), 3.38-3.35 (m, 2H), 3.06 (dd, J = 13.8, 4.5 Hz, 1H), 2.81 (dd, J = 13.8, 9.8 Hz, 1H), 2.31-2.19 (m, 2H), 2.11 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.88-1.75 (m, 2H), 1.57-1.53 (m, 3H), 1.52-1.42 (m, 4H), 1.24-1.18 (m, 3H), 1.13 (d, J = 7.1 Hz, 2H)。MS (ESI+) C48H61N7O12P+ [M+H]+ 計算値958.4、実測値958.8。
実施例１０ リンカー－薬物化合物ＸＳ７の合成
Figure 2024524363000022
(2-(メチルスルホニル)エチル)カルバミン酸(S)-4-(2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＳ５）
工程１ ＸＤ７（１．１４ｇ、５．１８ｍｍｏｌ、実施例１に記載のとおりに製造）のＴＨＦ（１７ｍＬ）溶液に、炭酸ビス(4-ニトロフェニル)（３.１５ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＰＥＡ（１．３６ｍＬ、７．７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗生成物をＥｔ２Ｏ（２０ｍＬ）中で１５分間撹拌し、ろ過した。この工程を２回繰り返し、ろ液を合わせ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～５０％ＥｔＯＡｃ）により、対応する炭酸エステル（１．５７ｇ、７９％）を得た。MS (ESI+) C17H16N5O6 + [M+H]+ 計算値386.1、実測値386.2。
工程２ 炭酸エステル中間体（０．３４０ｇ、０．８８２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４．４ｍＬ）に溶解し、０℃で2-(メチルスルホニル)エタン-1-アミン塩酸塩（０．１４８ｇ、０．９２６ｍｍｏｌ）とＴＥＡ（０．２５８ｍＬ、１．８５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にして、３時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３× ２０ｍＬ）とブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、カルバミン酸エステルＸＳ５（０．２６０ｇ、８０％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.11 (br s, 1H), 7.57-7.51 (m, 2H), 7.33 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.42 (br s, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.24 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.72 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.93 (s, 3H), 1.65 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。MS (ESI+) C14H19N5NaO5S+ [M+Na]+ 計算値392.1、実測値392.1。
(((E)-5-(((((4-((S)-2-アミノプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(メチルスルホニル)エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＳ６）
工程１ カルバミン酸エステルＸＳ５（０．１８６ｇ、０．５０３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２．５ｍＬ）溶液に、パラホルムアルデヒド（１８ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５分間撹拌し、次いでＴＭＳＣｌ（０．０７０ｍＬ、０．５５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間撹拌し、濃縮し、ＤＣＭ（１ｍＬ）と共に蒸発させ、真空で１５分間乾燥し、ＤＣＭ（２．５ｍＬ）に溶解して、溶液Ａを得た。アリルアルコールＸＤ１（８４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、溶液Ａの一部（１．５ｍＬ）を加え、続いて2,6-ルチジン（０．０７０ｍＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にして、２時間撹拌した。溶液Ａ（０．５０ｍＬ）と2,6-ルチジン（０．０２３ｍＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を更に加え、混合物を１時間撹拌した。溶液Ａ（０．５０ｍＬ）と2,6-ルチジン（０．０２３ｍＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を更に加え、混合物を終夜撹拌した。数滴のn-ＢｕＯＨを加えて反応をクエンチし、混合物を濃縮し、ペプタン（１ｍＬ）、トルエン（１ｍＬ）及びＤＣＭ（１ｍＬ）と共に蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、(((E)-5-(((((4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(メチルスルホニル)エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステルの２つのジアステレオマー（０．１０４ｇ、６５％）を無色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C37H48N6O10PS+ [M+H]+ 計算値799.3、実測値799.6。
工程２ この中間体（６０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．６８ｍＬ）／水（０．０７５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。トリブチルホスフィン（０．０４７ｍＬ、０．１８８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＭｅＣＮ（２× ２ｍＬ）と共に蒸発させて、真空中で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２０％ＭｅＯＨ）で精製して、アミンＸＳ６（２７．５ｍｇ、４７％）をジアステレオマーの混合物として得た。MS (ESI+) C37H50N4O10PS+ [M+H]+ 計算値773.3、実測値773.6。
リンカー－薬物ＸＳ７
アミンＸＳ６（２８ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）及び(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-L-バリン（１２ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、国際公開第2013/122823号に記載のとおりに製造）を、ＤＭＦ（０．３６ｍＬ）に溶解し、ＨＡＴＵ（１５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４０分間撹拌し、濃縮し、トルエン（２× １ｍＬ）と共に蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。水相をＥｔＯＡｃ（２× １０ｍＬ）で逆抽出し、合わせた有機相を、水（１０ｍＬ）とブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水／ＭｅＣＮ、７０：３０から２０：８０勾配、修飾剤は使用せず）で精製し、凍結乾燥後にＸＳ７（１７．１ｍｇ、４５％）をジアステレオマーの混合物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.94 (s, 1H), 8.14 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.38-7.27 (m, 9H), 7.20-7.10 (m, 3H), 6.99 (s, 2H), 5.62 (t, J = 11.4 Hz, 0.4H), 5.56-5.47 (m, 0.6H), 5.45-5.29 (m, 1H), 5.13-5.01 (m, 4H), 4.74 (s, 2H), 4.38 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.5, 6.9 Hz, 1H), 4.04-3.89 (m, 1H), 3.81-3.71 (m, 2H), 3.71-3.63 (m, 2H), 3.42-3.33 (m, 4H), 3.05-2.91 (m, 3H), 2.35-2.20 (m, 2H), 2.20-2.07 (m, 2H), 2.03-1.90 (m, 1H), 1.89-1.71 (m, 2H), 1.59-1.44 (m, 7H), 1.30 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.23-1.20 (m, 1H), 1.19-1.15 (m, 2H), 1.13 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI+) C52H70N6O14PS+ [M+H]+ 計算値1065.4、実測値1065.9。
実施例１１ リンカー－薬物化合物ＸＳ２５の合成
Figure 2024524363000023
(2-(ジメチルアミノ)エチル)カルバミン酸(S)-4-(2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＳ２３）
ＸＤ７のＰＮＰ炭酸エステルは、ＸＳ５の合成で記載したとおりに製造した。炭酸エステル（０．３９３ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５．１ｍＬ）に溶解し、０℃で、N,N-ジメチルエタン-1,2-ジアミン（０．１３７ｍＬ、１．２５ｍｍｏｌ）とＴＥＡ（０．２５８ｍＬ、１．８５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にして、４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３× １５ｍＬ）で洗浄した。合わせた水相をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）で逆抽出し、合わせた有機相をＮａＯＨ水溶液（２× １５ｍＬ、１Ｎ）、ブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させて、カルバミン酸エステルＸＳ２３（０．２９９ｇ、８８％）を淡黄色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.11 (br s, 1H), 7.56-7.51 (m, 2H), 7.37-7.32 (m, 2H), 5.26 (br s, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.23 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.26 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.39 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 1.64 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。MS (ESI+) C15H23N6O3 + [M+H]+ 計算値335.2、実測値335.3。
(((E)-5-(((((4-((S)-2-アミノプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(ジメチルアミノ)-エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステル（ＸＳ２４）
工程１ カルバミン酸エステルＸＳ２３（０．１６０ｇ、０．４７８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４．８ｍＬ）溶液に、パラホルムアルデヒド（２０ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１５分間撹拌し、次いでＴＭＳＣｌ（０．０９４ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間撹拌し、ＴＭＳＣｌ（０．０９４ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を２．５時間続けた。次いで、反応混合物を濃縮し、ＤＣＭ（１ｍＬ）と共に蒸発させて、１５分間真空中で乾燥した。粗製の中間体をＤＣＭ（４．８ｍＬ）中に懸濁し、ＸＤ１（０．４９３ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４．８ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を１５分間撹拌し、続いて2,6-ルチジン（０．１６７ｍＬ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。２０分後、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加え、反応混合物を濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２０％ＭｅＯＨ）で精製して、(((E)-5-(((((4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(ジメチルアミノ)エチル)アミノ)メトキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニンベンジルエステルのジアステレオマー混合物（０．２７２ｇ、７４％）を、淡黄色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.34 (s, 1H), 7.63 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.40-7.26 (m, 9H), 7.20-7.10 (m, 3H), 5.63 (t, J = 11.4 Hz, 0.6H), 5.53 (dd, J = 13.1, 10.2 Hz, 0.4H), 5.46-5.30 (m, 1H), 5.06 (d, J = 13.3 Hz, 4H), 4.71 (s, 2H), 4.09 (q, J = 5.3 Hz, 2H), 4.07-4.02 (m, 1H), 4.02-3.92 (m, 1H), 3.86-3.69 (m, 2H), 3.17 (d, J = 5.1 Hz, 4H), 2.73-2.59 (m, 4H), 2.33-2.16 (m, 2H), 1.87-1.72 (m, 2H), 1.59-1.49 (m, 3H), 1.49-1.40 (m, 3H), 1.28-1.15 (m, 2H), 1.13 (d, J = 7.3 Hz, 1H)。MS (ESI+) C38H51N7O8P+ [M+H]+ 計算値764.4、実測値764.7。
工程２ この中間体（７５ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．８８４ｍＬ）／水（０．０９８ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。トリブチルホスフィン（６１μＬ、０．２４５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＭｅＣＮ（２× ２ｍＬ）と共に蒸発させて、真空中で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２５％ＭｅＯＨ）で精製して、アミンＸＳ２４の２つのジアステレオマー（３３ｍｇ、４５％）を、黄色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C38H53N5O8P+ [M+H]+ 計算値738.4、実測値736.7。
リンカー－薬物ＸＳ２５
アミンＸＳ２４（３３ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）と(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-L-バリン（１４ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ、国際公開第2013/122823号に記載のとおりに製造）を、ＤＭＦ（０．４４ｍＬ）に溶解した。ＨＡＴＵ（１８ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３１μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮し、トルエン（１ｍＬ）と共に蒸発させた。水（１ｍＬ）を加え、得られた上清を除去し、沈殿を水で洗浄した。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水×０．１％ ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、８０：２０から３０：７０勾配）で精製し、凍結乾燥後にＸＳ２５（１８ｍｇ、３９％）をジアステレオマー混合物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.94 (s, 1H), 9.37 (br s, 1H), 8.14 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.38-7.27 (m, 9H), 7.19-7.10 (m, 3H), 6.99 (s, 2H), 5.63 (t, J = 11.4 Hz, 0.7H), 5.52 (dd, J = 13.1, 10.3 Hz, 0.3H), 5.46-5.30 (m, 1H), 5.10-5.06 (m, 2H), 5.06-5.04 (m, 2H), 4.71 (s, 2H), 4.38 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 8.5, 6.9 Hz, 1H), 4.06-3.88 (m, 1H), 3.84-3.73 (m, 2H), 3.64-3.55 (m, 2H), 3.39-3.36 (m, 2H), 3.29-3.18 (m, 2H), 2.85-2.70 (m, 6H), 2.31-2.21 (m, 2H), 2.21-2.08 (m, 2H), 1.95 (dq, J = 13.6, 6.8 Hz, 1H), 1.88-1.73 (m, 2H), 1.60-1.52 (m, 3H), 1.52-1.43 (m, 4H), 1.30 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.19-1.11 (m, 2H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI+) C53H73N7O12P+ [M+H]+ 計算値1030.5、実測値1030.9。
実施例１２ リンカー－薬物化合物ＸＳ１２の合成
Ａ アジ化物ＸＳ９の製造
Figure 2024524363000024
(4-アミノ-3-フルオロフェニル)メタノール（ＸＳ８）
(3-フルオロ-4-ニトロフェニル)メタノール（０．６１０ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（８．９ｍＬ）とＴＨＦ（８．９ｍＬ）溶液に、亜鉛粉末（２．３３ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）及び塩化アンモニウム（１．９１ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、セライトでろ過し、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨ）で精製して、アニリンＸＳ８（０．３１２ｇ、６２％）をオレンジ色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.01 (dd, J = 11.7, 1.9 Hz, 1H), 6.98-6.87 (m, 1H), 6.75 (dd, J = 9.0, 8.1 Hz, 1H), 4.55 (s, 2H)。MS (ESI+) C7H9FNO+ [M+H]+ 計算値142.1、実測値142.1。
(S)-2-アジド-N-(2-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル)プロペンアミド（ＸＳ９）
(S)-2-アジドプロピオン酸（０．１８０ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１．８ｍＬ）溶液を、アニリンＸＳ８（０．３０９ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５．９ｍＬ）溶液に加えた。溶液を０℃に冷却し、ＥＥＤＱ（０．７７４ｇ、３．１３ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、反応混合物を室温にして、終夜撹拌した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、アミドＸＳ９（０．４１６ｇ、１００％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.42-8.29 (m, 1H), 8.26 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 7.20-7.14 (m, 1H), 7.14-7.09 (m, 1H), 4.66 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.26 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 1.79 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 1.66 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。MS (ESI+) C10H12FN4O2 + [M+H]+ 計算値239.1、実測値239.2。
Ｂ リンカー－薬物化合物ＸＳ１２の製造
Figure 2024524363000025
N-(シクロプロピルメチル)-P-(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-アジドプロパンアミド)-3-フルオロベンジルエステル（ＸＳ１０）
シクロプロピルメタンアミン塩酸塩（０．１２８ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）中に懸濁し、－７８℃に冷却した。(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジクロリド（０．３００ｇ、１．１９ｍｍｏｌ、一般手順ＸＸＢに従いホスホン酸ジエステルＸＤ１５（０．３２３ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）から製造）のＤＣＭ（２．０ｍＬ）溶液を加え、続いて、ＴＥＡ（０．３３３ｍＬ、２．３９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を－７８℃で１時間撹拌し、室温にして、２時間撹拌した。反応混合物を－７８℃に冷却し、ベンジルアルコールＸＳ９（０．３７９ｇ、１．４３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４．０ｍＬ）溶液を加え、続いてＴＥＡ（０．２００ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にして、２時間撹拌した。ＴＥＡ（０．１００ｍＬ、０．７１７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１時間撹拌して濃縮した。粗生成物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）と塩酸（１５ｍＬ、１Ｍ）の間で分配し、水相をＥｔＯＡｃ（３× １５ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機相をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、ホスホンアミデートＸＳ１０の２つのジアステレオマー（０．１９４ｇ、３７％）を、無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.39 (br s, 1H), 8.28 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 7.21-7.10 (m, 2H), 5.16-5.10 (m, 1H), 5.06-4.99 (m, 1H), 4.93-4.87 (m, 1H), 4.30-4.23 (m, 1H), 2.80-2.69 (m, 2H), 2.63-2.54 (m, 1H), 2.37-2.24 (m, 2H), 1.89-1.77 (m, 2H), 1.77-1.61 (m, 9H), 0.99-0.86 (m, 1H), 0.53-0.46 (m, 2H), 0.18-0.10 (m, 2H)。MS (ESI+) C20H30FN5O3P+ [M+H]+ 計算値438.2、実測値438.4。
N-(シクロプロピルメチル)-P-((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-アジドプロパンアミド)-3-フルオロベンジルエステル（ＸＳ１１）
アルケンＸＳ１０（０．１８３ｇ、０．４１８ｍｍｏｌ）のアリル酸化を、一般手順ＸＸＣに従って行った。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ中の０～５％ ＭｅＯＨ）で精製して、アルコールＸＳ１１の２つのジアステレオマー（８０ｍｇ、４４％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.38 (br s, 1H), 8.28 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 11.4, 1.9 Hz, 1H), 7.15-7.09 (m, 1H), 5.49-5.40 (m, 1H), 5.07-4.99 (m, 1H), 4.94-4.86 (m, 1H), 4.27 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.99 (br s, 2H), 2.75 (dt, J = 8.5, 6.8 Hz, 2H), 2.64-2.55 (m, 1H), 2.43-2.31 (m, 2H), 1.92-1.74 (m, 2H), 1.68-1.65 (m, 6H), 1.62-1.51 (m, 1H), 0.98-0.86 (m, 1H), 0.53-0.47 (m, 2H), 0.15 (q, J = 4.8 Hz, 2H)。MS (ESI+) C20H30FN5O4P+ [M+H]+ 計算値454.2、実測値454.5。
リンカー－薬物ＸＳ１２
工程１ アジ化物ＸＳ１１（７４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．５ｍＬ）／水（０．１６ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。トリブチルホスフィン（０．１０２ｍＬ、０．４０８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＭｅＣＮ（３× １ｍＬ）と共に蒸発させ、真空中で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２０％ＭｅＯＨ）で精製して、N-(シクロプロピルメチル)-P-((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-アミノプロパンアミド)-3-フルオロベンジルエステルの２つのジアステレオマー（５１ｍｇ、７３％）を、オイル状物として得た。MS (ESI+) C20H32FN3O4P+ [M+H]+ 計算値428.2、実測値428.4。
工程２ 中間体アミン（４７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）と(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-L-バリン（３６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、国際公開第2013/122823号に記載のとおりに製造）を、ＤＭＦ（１．１ｍＬ）に溶解した。ＨＡＴＵ（４６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０７７ｍＬ、０．４４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。ＨＡＴＵ（４．２ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１５分間撹拌し、濃縮し、トルエン（１ｍＬ）と共に蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）間で分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２× １０ｍＬ）で逆抽出し、合わせた有機相を水（１０ｍＬ）／ブライン（５ｍＬ）とブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水／ＭｅＣＮ、９０：１０から４０：６０勾配、修飾剤は使用せず）で精製し、凍結乾燥後にＸＳ１２のジアステレオマー混合物（３０ｍｇ、３８％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.67 (s, 1H), 8.22 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.86 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 11.7, 1.8 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 8.4, 1.5 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 5.40-5.33 (m, 1H), 4.92-4.78 (m, 2H), 4.73 (dt, J = 11.4, 6.9 Hz, 1H), 4.64 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.52 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 4.22-4.15 (m, 1H), 3.79-3.73 (m, 2H), 3.37 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.73-2.63 (m, 2H), 2.25-2.06 (m, 4H), 2.02-1.89 (m, 1H), 1.73-1.62 (m, 2H), 1.53 (s, 3H), 1.52-1.43 (m, 4H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.23-1.13 (m, 2H), 0.94-0.86 (m, 1H), 0.84 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.81 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.42-0.35 (m, 2H), 0.17-0.11 (m, 2H)。MS (ESI+) C35H52FN5O8P+ [M+H]+ 計算値720.4、実測値720.7。
実施例１３ リンカー－薬物化合物ＸＳ１７の合成
Ａ アジ化物ＸＳ１４の製造
Figure 2024524363000026
(4-アミノ-2-フルオロフェニル)メタノール（ＸＳ１３）
工程１ 4-アミノ-2-フルオロ安息香酸（１．００ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３．２ｍＬ）中に懸濁し、０℃に冷却した。塩化チオニル（０．７０６ｍＬ、９．６７ｍｍｏｌ）を滴下し、次いで、反応混合物を１時間還流した。ＭｅＯＨ（５．０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）に加え、生成物をＥｔＯＡｃ（３× ７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（２× ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）と共に蒸発させて、真空中で乾燥し、4-アミノ-2-フルオロ安息香酸メチルエステル（１．０１ｇ、９３％）を茶色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.76 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 6.33 (dd, J = 12.9, 2.3 Hz, 1H), 4.15 (br s, 2H), 3.86 (s, 3H)。MS (ESI+) C8H9FNO2 + [M+H]+ 計算値170.1、実測値170.2。
工程２ ０℃の中間体エステル（０．４８６ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１９ｍＬ）溶液に、ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．５９ｍＬ、８．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
反応混合物を室温にして、３時間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、Ｎａ２ＳＯ４・１０Ｈ２Ｏ（３．５ｇ）とセライト（３．５ｇ）の混合物を少量ずつ加えてクエンチした。混合物をろ過し、残留物をＴＨＦ（１０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を真空中で濃縮して、ベンジルアルコールＸＳ１３（０．３６７ｇ、９１％）をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.13 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 6.45-6.40 (m, 1H), 6.40-6.35 (m, 1H), 4.61 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 3.82-3.68 (m, 2H), 1.61 (t, J = 5.9 Hz, 1H)。MS (ESI+) C7H9FNO+ [M+H]+ 計算値142.1、実測値142.1。
(S)-2-アジド-N-(3-フルオロ-4-(ヒドロキシメチル)フェニル)プロペンアミド（ＸＳ１４）
(S)-2-アジドプロピオン酸（０．２１０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２．１ｍＬ）溶液を、アニリンＸＳ１３（０．３６１ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（６．８ｍＬ）溶液に加えた。溶液を０℃に冷却し、ＥＥＤＱ（０．９０２ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、反応混合物を室温にして、終夜撹拌した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、アミドＸＳ１４（０．９０２ｇ、定量）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.21-8.08 (m, 1H), 7.55 (dd, J = 11.8, 2.1 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 8.3, 2.2 Hz, 1H), 4.75-4.69 (m, 2H), 4.29-4.19 (m, 1H), 1.81-1.74 (m, 1H), 1.65 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。MS (ESI+) C10H12FN4O2 + [M+H]+ 計算値239.1、実測値239.2。
Ｂ リンカー－薬物化合物ＸＳ１７の製造
Figure 2024524363000027
N-(シクロプロピルメチル)-P-(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-アジドプロパンアミド)-2-フルオロベンジルエステル（ＸＳ１５）
シクロプロピルメタンアミン塩酸塩（０．１２８ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）中に懸濁し、－７８℃に冷却した。(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジクロリド（０．３００ｇ、１．１９ｍｍｏｌ、一般手順ＸＸＢに従いホスホン酸ジエステルＸＤ１５（０．３２３ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）から製造）のＤＣＭ（２．０ｍＬ）溶液を加え、続いて、ＴＥＡ（０．３３３ｍＬ、２．３９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を－７８℃で１時間撹拌し、室温にして、２時間撹拌した。反応混合物を－７８℃に冷却し、ベンジルアルコールＸＳ１４（０．３７９ｇ、１．４３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４．０ｍＬ）溶液を加え、続いて、ＴＥＡ（０．２００ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にして、２時間撹拌した。ＴＥＡ（０．０３０ｍＬ、０．２１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１時間撹拌して濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）と塩酸（１５ｍＬ、１Ｍ）の間で分配し、水相をＥｔＯＡｃ（３× １５ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機相をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、ホスホンアミデートＸＳ１５のジアステレオマー混合物（０．２９４ｇ、５６％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.27 (s, 1H), 7.60 (dd, J = 11.8, 2.1 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.3, 2.1 Hz, 1H), 5.14-5.09 (m, 1H), 5.09-4.96 (m, 2H), 4.27-4.20 (m, 1H), 2.83-2.69 (m, 2H), 2.64-2.52 (m, 1H), 2.35-2.22 (m, 2H), 1.88-1.76 (m, 2H), 1.75-1.62 (m, 9H), 1.00-0.88 (m, 1H), 0.54-0.45 (m, 2H), 0.18-0.12 (m, 2H)。MS (ESI+) C20H30FN5O3P+ [M+H]+ 計算値438.2、実測値438.4。
N-(シクロプロピルメチル)-P-((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-アジドプロパンアミド)-2-フルオロベンジルエステル（ＸＳ１６）
アルケンＸＳ１５（０．２８８ｇ、０．６５８ｍｍｏｌ）のアリル酸化を、一般手順ＸＸＣに従って行った。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ中に０～５％ ＭｅＯＨ）で精製して、ＸＳ１６（６４ｍｇ、３２％）をジアステレオマー混合物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.25 (s, 1H), 7.60 (dd, J = 11.7, 2.1 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.3, 2.1 Hz, 1H), 5.46-5.40 (m, 1H), 5.08-4.97 (m, 2H), 4.24 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.98 (s, 2H), 2.81-2.71 (m, 2H), 2.68-2.52 (m, 1H), 2.41-2.30 (m, 2H), 1.91-1.71 (m, 2H), 1.68-1.63 (m, 6H), 1.59-1.52 (m, 1H), 1.01-0.86 (m, 1H), 0.54-0.45 (m, 2H), 0.18-0.13 (m, 2H)。MS (ESI+) C20H30FN5O4P+ [M+H]+ 計算値454.2、実測値454.5。
リンカー－薬物ＸＳ１７
工程１ アジ化物ＸＳ１６（６１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．２ｍＬ）／水（０．１４ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。トリブチルホスフィン（８４μＬ、０．３３６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）と共に蒸発させて、真空中で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２０％ＭｅＯＨ）で精製して、N-(シクロプロピルメチル)-P-((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホンアミデート 4-((S)-2-アミノプロパンアミド)-2-フルオロベンジルエステルの２つのジアステレオマー（４４ｍｇ、７７％）を、オイル状物として得た。MS (ESI+) C20H32FN3O4P+ [M+H]+ 計算値428.2、実測値428.6。
工程２ 中間体アミン（４４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-L-バリン（３４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、国際公開第2013/122823号に記載のとおりに製造）を、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解した。ＨＡＴＵ（４３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（７２μＬ、０．４１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で９０分間撹拌し、濃縮し、トルエン（１ｍＬ）と共に蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）間で分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で逆抽出し、合わせた有機相を水（１０ｍＬ）とブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水／ＭｅＣＮ、９０：１０から４０：６０勾配、修飾剤は使用せず）で精製した。ＭｅＣＮの蒸発、その後の凍結乾燥によりＸＳ１７（３２ｍｇ、４３％）をジアステレオマー混合物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.13 (s, 1H), 8.19 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.59 (dd, J = 12.6, 1.9 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.38-5.31 (m, 1H), 4.91-4.79 (m, 2H), 4.70 (dt, J = 11.4, 6.8 Hz, 1H), 4.66-4.60 (m, 1H), 4.36 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 8.5, 6.9 Hz, 1H), 3.75 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.73-2.59 (m, 2H), 2.22-2.07 (m, 4H), 1.96 (dq, J = 13.6, 6.8 Hz, 1H), 1.70-1.58 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.51-1.42 (m, 4H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.23-1.13 (m, 2H), 0.90-0.88 (m, 1H), 0.86 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.41-0.34 (m, 2H), 0.18-0.09 (m, 2H)。MS (ESI+) C35H52FN5O8P+ [M+H]+ 計算値720.4、実測値720.7。
実施例１４ リンカー－薬物化合物ＸＳ２２の合成
Ａ アジ化物ＸＳ１９の製造
Figure 2024524363000028
L-アラニン4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＳ１９）
工程１ Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（０．３８６ｇ、１．２４０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１２ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ＤＭＡＰ（１２ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ＥＤＣ（０．２９１ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（０．１５５ｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を加えた。１５分間撹拌した後、アルコールＸＤ７（０．３００ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温にして、終夜撹拌した。反応混合物を水（１５ｍＬ）に加え、水相をＤＣＭ（２× １５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（１５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～８０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-L-アラニン 4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（０．４０６ｇ、６４％）を白色の固体として得た。MS (ESI+) C28H28N5O5 + [M+H]+ 計算値514.2、実測値514.5。
工程２ 中間体エステル（０．４０４ｇ、０．７８６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５．３ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（０．３８９ｍＬ、３．９３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２０分間撹拌し、次いで濃縮し、トルエン（２× ５ｍＬ）と共に蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１５％ＭｅＯＨ）で精製して、アミンＸＳ１９（０．２１９ｇ、９６％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.22 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.05 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 4.03 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 3.44 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 1.79 (br s, 2H), 1.45 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。MS (ESI+) C13H18N5O3 + [M+H]+ 計算値292.1、実測値292.3。
Ｂ リンカー－薬物化合物ＸＳ２２の製造
Figure 2024524363000029
((4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニン 4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＳ２０）
トルエン（４．５ｍＬ）中の(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジクロリド（０．１７６ｇ、０．７００ｍｍｏｌ、一般手順ＸＸＢに従いホスホン酸ジエステルＸＤ１５（０．１８９ｇ、０．８７５ｍｍｏｌ）から製造）に、－７８℃で、フェノール（６６ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１２２ｍＬ、０．７００ｍｍｏｌ）のトルエン（４．５ｍＬ）溶液を滴下した。反応混合物を室温にして、２．５時間撹拌した。アミンＸＳ１９（０．２１４ｇ、０．７３５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．１２８ｍＬ、０．７３５ｍｍｏｌ）を－７８℃で加え、反応混合物を室温にして、２時間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（０．１２８ｍＬ、０．７３５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を９０分間撹拌し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、ホスホンアミデートＸＳ２０のジアステレオマー混合物（０．１００ｇ、２８％）を淡黄色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.13 (br s, 1H), 7.57-7.51 (m, 2H), 7.37-7.27 (m, 4H), 7.22-7.08 (m, 3H), 5.17-5.08 (m, 1H), 5.07-5.01 (m, 2H), 4.24 (qd, J = 7.0, 1.6 Hz, 1H), 4.16-4.04 (m, 1H), 3.29 (t, J = 10.1 Hz, 0.5H), 3.18 (td, J = 10.4, 3.4 Hz, 0.5H), 2.40-2.30 (m, 2H), 1.96-1.81 (m, 2H), 1.77-1.73 (m, 3H), 1.69 (br s, 3H), 1.65 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.25 (q, J = 7.0 Hz, 3H)。MS (ESI+) C25H33N5O5P+ [M+H]+ 計算値514.2、実測値514.5。
(((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニン 4-((S)-2-アジドプロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＳ２１）
アルケンＸＳ２０（０．１００ｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）のアリル酸化を、一般手順ＸＸＣに従って行った。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、アルコールＸＳ２１の２つのジアステレオマー（２７ｍｇ、２６％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.48-8.34 (m, 1H), 7.58-7.51 (m, 2H), 7.32-7.23 (m, 4H), 7.22-7.16 (m, 2H), 7.15-7.09 (m, 1H), 5.44-5.35 (m, 1H), 5.12-5.01 (m, 2H), 4.22-4.16 (m, 1H), 4.16-3.99 (m, 1H), 3.98 (s, 2H), 3.45 (t, J = 10.2 Hz, 0.5H), 3.30 (dd, J = 11.4, 10.3 Hz, 0.5H), 2.49-2.32 (m, 2H), 2.00-1.80 (m, 2H), 1.65 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 1.62 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.29 (d, J = 7.1 Hz, 1.4H), 1.21 (d, J = 7.1 Hz, 1.6H)。MS (ESI+) C25H33N5O6P+ [M+H]+ 計算値530.2、実測値530.5。
リンカー－薬物ＸＳ２２
工程１ アジ化物ＸＳ２１（２７ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．４５ｍＬ）／水（０．０５０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を、窒素ガスで１５分間パージした。トリブチルホスフィン（０．０３２ｍＬ、０．１２６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＭｅＣＮ（３× １ｍＬ）と共に蒸発させて、真空中で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２０％ＭｅＯＨ）で精製して、(((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)(フェノキシ)ホスホリル)-L-アラニン 4-((S)-2-アミノプロパンアミド)ベンジルエステルの２つのジアステレオマー（１５ｍｇ、５８％）を、無色のオイル状物として得た。MS (ESI+) C25H35N3O6P+ [M+H]+ 計算値504.2、実測値504.6。
工程２ 中間体アミン（１５ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）及び(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-L-バリン（９．９ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、国際公開第2013/122823号に記載のとおりに製造）を、ＤＭＦ（０．２９ｍＬ）に溶解した。ＨＡＴＵ（１３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０２０ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で７５分間撹拌し、濃縮し、トルエン（１ｍＬ）と共に蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）間で分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２× １０ｍＬ）で逆抽出し、合わせた有機相を水（１０ｍＬ）とブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水／ＭｅＣＮ、８０：２０から３０：７０勾配、修飾剤は使用せず）で精製し、凍結乾燥後にリンカー－薬物化合物ＸＳ２２のジアステレオマー混合物（１０ｍｇ、４４％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.94 (s, 1H), 8.14 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.37-7.22 (m, 4H), 7.17-7.10 (m, 3H), 6.99 (s, 2H), 5.58 (dd, J = 12.5, 10.4 Hz, 0.5H), 5.48 (dd, J = 13.2, 10.1 Hz, 0.5H), 5.35 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 5.07-4.94 (m, 2H), 4.65 (td, J = 5.6, 0.8 Hz, 1H), 4.38 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.5, 6.9 Hz, 1H), 4.01-3.87 (m, 1H), 3.77 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.31-2.20 (m, 2H), 2.20-2.07 (m, 2H), 2.03-1.91 (m, 1H), 1.87-1.74 (m, 2H), 1.55-1.52 (m, 3H), 1.52-1.43 (m, 4H), 1.30 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.21-1.06 (m, 5H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI+) C40H55N5O10P+ [M+H]+ 計算値796.4、実測値796.6。
実施例１５ リンカー－薬物化合物ＸＤ２４の合成
Ａ カルバミン酸エステルＸＤ２６の製造
Figure 2024524363000030
エチルカルバミン酸(S)-4-(2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)プロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＤ２６）
工程１ アミドＸＤ２５（１１．４ｇ、６１．６ｍｍｏｌ、Z.P. Tachrim et al. Molecules, 2007, 22, 1748に記載のとおりに製造）のＤＣＭ（２７５ｍＬ）とＭｅＯＨ（１７５ｍＬ）の溶液を０℃に冷却し、ＥＥＤＱ（３０．５ｇ、１２３ｍｍｏｌ）と(4-アミノフェニル)メタノール（１０．６ｇ、８６．０ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、オレンジ色の溶液を室温に温め、終夜撹拌した。反応物を濃縮し、粗生成物を、エーテル（５００ｍＬ）中、室温で１時間撹拌した。混合物をろ過し、固体をエーテルで洗浄して、(S)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)プロパンアミドの最初の生産物（１０．８ｇ、６１％）を白色の固体として得た。ろ液を濃縮し、粗生成物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）に溶解した。溶液を塩酸（２Ｍ、９０ｍＬ）で洗浄し、水相をＥｔＯＡｃ（３× １２５ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機相をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物を少量のＤＣＭ中に懸濁し、３０分間撹拌し、次いで、この厚いケーキをろ過した。固体を集め、真空中で乾燥して、(S)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)プロパンアミドの第２の生産物（４．６６ｇ、収率２６％）をクリーム状の固体として得た。MS (ESI+) C12H14F3N2O3 [M+H]+ 計算値291.10、実測値291.24。
工程２ (S)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)プロパンアミド（３．２４ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（８０ｍＬ）溶液に、０℃でジラウリン酸ジブチルすず（１．６６ｍｌ、２．７９ｍｍｏｌ）とイソシアン酸エチル（１．３３ｍｌ、１６．７ｍｍｏｌ）を加えた。冷却浴を取り除き、混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物をシリカゲル上で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（最初にスタンナン不純物をヘプタン中の０～８０％勾配のエーテルで除去し、続いて、生成物をヘプタン中の０～１００％勾配のＥｔＯＡｃで溶出した）で精製して、カルバミン酸エステルＸＤ２６（３．６２ｇ、２工程で７８％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.18 (s, 1H), 9.71 (s, 1H), 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.16 (br t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.95 (s, 2H), 4.62-4.42 (m, 1H), 3.02 (qd, J = 7.2, 5.6 Hz, 2H), 1.42 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。MS (ESI+) C15H18F3N3NaO4 + [M+Na]+ 計算値384.1、実測値384.3。
Ｂ リンカー－薬物化合物ＸＤ２４の製造
Figure 2024524363000031
(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ビス(2-シアノエチル)（ＸＤ２１）
(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジクロリド（１．０４ｇ、５．２０ｍｍｏｌ、一般手順ＸＸＢに従いホスホン酸ジエステルＸＤ１５から製造）のＤＣＭ（３．３ｍＬ）溶液を、冷却（－７８℃）した3-ヒドロキシプロパンニトリル（０．７４６ｍｌ、１０．９ｍｍｏｌ）とピリジン（０．８８３ｍｌ、１０．９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１７ｍＬ）溶液に滴下した。３０分後、反応物を室温に温めた。４５分後に、室温で3-ヒドロキシプロパンニトリル（０．２６７ｍｌ、３．９０ｍｍｏｌ）とピリジン（０．３１５ｍｌ、３．９０ｍｍｏｌ）を更に加え、撹拌を３時間続けた。反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）と塩酸（１Ｍ、２０ｍＬ）の混合物に注いだ。各相を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（３× ３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）により、ホスホン酸ジアルキルＸＤ２１（９８６ｍｇ、７０％）を淡黄色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 5.12 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.37-4.20 (m, 4H), 2.77 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.33 (dq, J = 14.4, 7.4 Hz, 2H), 1.96-1.83 (m, 2H), 1.70 (s, 3H), 1.64 (s, 3H)。MS (ESI+) C12H20N2O3P+ [M+H]+ 計算値271.1、実測値271.2。
(E)-(5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ビス(2-シアノエチル)（ＸＤ２２）
アルケンＸＤ２１（０．９８６ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）のアリル酸化を、一般手順ＸＸＣに従って行った。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～６％ＭｅＯＨ）で精製して、アルコールＸＤ２２（０．５８６ｇ、５６％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 5.44 (td, J = 7.1, 1.3 Hz, 1H), 4.34-4.24 (m, 4H), 4.01 (s, 2H), 2.77 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 2.41 (dq, J = 15.5, 7.6 Hz, 2H), 2.01-1.87 (m, 2H), 1.69 (s, 3H)。MS (ESI+) C12H19N2NaO4P+ [M+Na]+ 計算値309.1、実測値309.2。
(E)-(((5-(ビス(2-シアノエトキシ)ホスホリル)-2-メチルペント-2-エン-1-イル)オキシ)メチル)(エチル)カルバミン酸(S)-4-(2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)プロパンアミド)ベンジルエステル（ＸＤ２３）
アルコールＸＤ２２（１００ｍｇ、０．３４９ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡに代えて2,6-ルチジンを使用する一般手順ＸＸＡに従い、カルバミン酸エステルＸＤ２６と反応させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～４％ＭｅＯＨ）で精製して、カルバミン酸エステルＸＤ２３（２１７ｍｇ、９４％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 330Kで測定) ppm = 10.11 (s, 1H), 9.60 (br d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.40 (br s, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.70 (s, 2H), 4.51 (quint, J = 7.1 Hz, 1H), 4.23-4.10 (m, 4H), 3.78 (br s, 2H), 3.30 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 2.26 (dq, J = 14.1, 7.2 Hz, 2H), 1.95-1.81 (m, 2H), 1.58 (br s, 3H), 1.43 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.09 (t, J = 7.1 Hz, 3H)。MS (ESI+) C28H38F3N5O8P+ [M+H]+ 計算値660.2、実測値660.6。
リンカー－薬物ＸＤ２４
工程１ アミドＸＤ２３（４４．５ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１．１ｍＬ）に溶解した。水（０．１３５ｍＬ）を加え、混合物を０℃に冷却した。ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、０．１３５ｍｌ、０．２７０ｍｍｏｌ）を加え、２分後に氷浴を取り除き、室温で撹拌を続けた。２時間後に、ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、０．１３５ｍｌ、０．２７０ｍｍｏｌ）を更に加え、室温で反応を合計９時間続けた。反応物を０℃に冷却し、塩酸（１Ｍ、０．３０４ｍＬ）を加えた。次いで、更に精製することなく、溶液を次の工程で使用した。
工程２ 工程１の溶液をＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ、０．１７０ｍＬ）で処理し、混合物を濃縮した。粗生成物を水（０．４ｍＬ）に溶解し、固体のＮａＨＣＯ３（１６．９ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）を加え、続いて室温でＴＨＦ（０．４ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（２９．４ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで濃縮した。
工程３ 工程３で製造した粗生成物をＤＭＦ（２．０ｍＬ）中に懸濁し、ピペリジン（０．８ｍＬ）を室温で加えた。１時間撹拌した後、反応物を濃縮し、再度ＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（０．８ｍＬ）を加え、混合物を５分間撹拌し、最終懸濁液を得た。混合物を濃縮し、この工程を再度繰り返して残留するピペリジンを完全に除去した。白色の固体をエーテル（５ｍＬ）中に懸濁し、混合物を３０分間撹拌した。上清を注意深く除去し、ＵＰＬＣ－ＭＳ分析により上清中にＦｍｏｃ残基が存在しなくなるまで、この工程を繰り返した。固体を真空中で乾燥した。
工程４ 固体を水（０．４ｍＬ）に溶解し、固体のＮａＨＣＯ３（１７．０ｍｇ、０．２００ｍｍｏｌ）を加え、続いて、室温で、ＴＨＦ（０．４ｍＬ）中の6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル（２０．８ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を加えた。３時間撹拌した後、ＴＨＦの大半を、室温での短時間のロータリーエバポレーションで除去した。次いで、水溶液をミリＱ水中の１０％ＭｅＣＮ（８ｍＬ）で希釈し、透明な溶液を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（水×０．０２５％ ＮＨ４ＯＨ／ＭｅＣＮ、１０～４０％勾配）で精製した。塩基性溶出液の直接酸性化を確実にするために、生成物はあらかじめＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ、０．５ｍＬ）を入れた試験管に集めたことに留意されたい。生成物の画分を直ちに凍結し、続いて凍結乾燥して、表題化合物ＸＤ２４（１１．５ｍｇ）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 7.49-7.39 (m, 2H), 7.39-7.30 (m, 2H), 6.73 (s, 2H), 5.53-5.30 (m, 1H), 5.09 (br s, 2H), 4.70 (s, 2H; D2Oの残留溶媒のピークに隠れる。HSQCで観察された相関関係による), 4.39 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 4.03 (br d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.87-3.72 (m, 2H), 3.36 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.34-3.26 (m, 2H), 2.24 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.20-2.08 (m, J = 4.1 Hz, 2H), 2.01 (dq, J = 13.6, 6.8 Hz, 1H), 1.64-1.37 (m, 12H), 1.24-1.11 (m, 2H), 1.06 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 0.96-0.81 (m, 6H)。MS (ESI-) C35H51N5O11P- [M-H]- 計算値748.3、実測値748.8。
実施例１７ リンカー－薬物化合物ＸＤ４４、ＸＤ４５及びＸＤ４６の合成
Ａ ホスホクロリド酸ビス((9H-フルオレン-9-イル)メチル)（ＸＤ３４）の製造
Figure 2024524363000032
ホスホン酸ビス((9H-フルオレン-9-イル)メチル)（ＸＤ５０）
(9H-フルオレン-9-イル)メタノール（４．５５ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、室温で、ホスホン酸ジフェニル（２．１３ｍｌ、１０．６ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（２０ｍＬ）溶液に加え、混合物を２時間撹拌した。反応物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）に溶解した。有機相を塩酸（２×、１Ｍ）とブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、シリカゲル上で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～８５％ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ（１：４））により、ホスホン酸ＸＤ５０（３．４６ｇ、７５％）を無色のワックス状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.76-7.66 (m, 4H), 7.58-7.45 (m, 4H), 7.42-7.31 (m, 4H), 7.31-7.22 (m, 4H), 7.19-7.12 (m, 1H), 6.68 (d, J = 705.8 Hz, 1H), 4.34-4.21 (m, 4H), 4.15-4.08 (m, 2H)。MS (ESI+) C28H24O3P+ [M+H]+ 計算値439.2、実測値439.3。
ホスホクロリド酸ビス((9H-フルオレン-9-イル)メチル)（ＸＤ３４）
ホスホン酸ＸＤ５０（８．５７ｇ、１９．６ｍｍｏｌ）をトルエン（９８ｍＬ）に溶解し、オーバーヘッドスペースを窒素ガスでパージした。室温でＮＣＳ（３．１３ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）を加え、次いで、反応混合物を４０℃で２時間撹拌した。室温に冷却後、反応混合物をろ過し、濃縮した。残留物をＭｅＣＮ（１０ｍＬ）と共に蒸発させて白色の固体を得た。ヒートガンで穏やかに加熱して、全ての固体をＭｅＣＮ（２５ｍＬ）に溶解した。溶液を－３０℃まで徐々に冷却すると、白色の固体の沈殿が開始した。フラスコを－３０℃で一晩保管し、次いで室温に温めた後、ろ過した。氷冷ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）で固体を洗浄して、塩化物ＸＤ３４（８．０３ｇ、収率８７％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.76-7.71 (m, 4H), 7.56-7.48 (m, 4H), 7.43-7.36 (m, 4H), 7.33-7.25 (m, 4H), 4.46 (dt, J = 9.7, 7.1 Hz, 2H), 4.36-4.28 (m, 2H), 4.25-4.19 (m, 2H)。MS (ESI+) C28H24ClO4P+ [M+NH4]+ 計算値490.1、実測値490.3。
Ｂ ホスホン酸エステルＸＤ３７の製造
Figure 2024524363000033
(E)-(5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸水素トリエチルアンモニウム（ＸＤ３７）
ＤＢＵ（０．４０１ｍｌ、２．６６ｍｍｏｌ）を、０℃でＸＤ２２（３０５ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に加えた。冷却浴を２分後に取り除き、反応物を室温で４時間撹拌し、もっぱら、１つの保護基が脱保護された生成物を得た。混合物をエーテル（３０ｍＬ）で希釈し、１５分間撹拌した後、エマルションを沈殿させた（１５分間）。上清をデカンテーションし、残留物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）と水（１．２５ｍＬ）に溶解した。ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、３．２０ｍＬ、６．４０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、混合物をこの温度で３０分間撹拌した。氷浴を取り除き、室温で反応を３．５時間続けた。次いで、反応混合物をDOWEX 50WX8-200水素型カラム（５ｇ、溶出液が無色で中性になるまで、事前にメタノールで洗浄）にロードした。生成物をメタノールで溶出した。生成物の画分をプールし、Ｅｔ３Ｎ（０．１４８ｍＬ、１．０７ｍｍｏｌ）を加えた。メタノールをロータリーエバポレーターで除去し、水相をＭｅＣＮで希釈し、続いて凍結乾燥してＸＤ３７（２５９ｍｇ、９８％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) ppm = 5.51-5.42 (m, 1H), 3.91 (s, 2H), 3.19 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 2.40-2.27 (m, 2H), 1.67 (s, 3H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.31 (t, J = 7.3 Hz, 9H)。MS (ESI-) C6H12O4P- [M-H]- 計算値179.1、実測値179.1。
Ｃ リン酸エステルＸＤ３８の製造
Figure 2024524363000034
(E)-ビス((9H-フルオレン-9-イル)メチル) (4-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-3-メチルブタ-2-エン-1-イル) リン酸エステル（ＸＤ４８）
アルコールＸＤ４７（１．３５ｇ、３．９７ｍｍｏｌ、Serra, S. Tetrahedron: Asymmetry, 2014, 25, 1561-1572に記載のとおりに合成）、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール（０．０４３ｇ、０．３３１ｍｍｏｌ）及び2,6-ルチジン（１．５４ｍｌ、１３．２ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（５ｍＬ）溶液に、０℃で、ＭｅＣＮ／ＤＣＭ（１：１、５ｍＬ）中のＸＤ３４（１．４５ｇ、３．３１ｍｍｏｌ）を加えた。冷却浴を取り除き、反応物を室温で７５分間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解した。懸濁液を塩酸（１Ｍ、約５０ｍＬ）で洗浄し、水相をＥｔＯＡｃ（１×）で逆抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～６０％Ｅｔ２Ｏ／ＤＣＭ（１：１））で精製して、ＸＤ４８（１．９５ｇ、７６％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.76-7.69 (m, 4H), 7.67-7.61 (m, 4H), 7.58-7.49 (m, 4H), 7.45-7.31 (m, 10H), 7.30-7.22 (m, 4H), 5.75-5.67 (m, 1H), 4.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.30-4.23 (m, 4H), 4.20-4.13 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 1.56 (s, 3H), 1.04 (s, 9H)。MS (ESI+) C49H49NaO5PSi+ [M+H]+ 計算値799.3、実測値799.6。
(E)-4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エン-1-イル リン酸水素トリエチルアンモニウム（ＸＤ３８）
工程１ ＴＢＤＰＳ－エーテルＸＤ４８（９１１ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、テフロン（登録商標）製チューブ中のＴＨＦ／ピリジン（１：１、６ｍＬ）に溶解した。混合物を０℃に冷却し、ＨＦ・ｐｙ（２ｍＬ、７０％ ＨＦ）を加えた。０℃で８０分間撹拌した後、反応混合物を、撹拌しながら、冷却（０℃）した飽和ＮａＨＣＯ３水溶液とＥｔＯＡｃの混合物に注意深く注いだ。発泡の停止後、各相を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出した。合わせた有機相を塩酸（１Ｍ）とブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～５５％ＥｔＯＡｃ）により、対応するアルコール（４１８ｍｇ、６６％）を得た。
工程２ アルコール（３１３ｍｇ、０．５８１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１３ｍＬ）に溶解した。混合物を－７８℃に冷却し、ＤＢＵ（０．２１９ｍｌ、１．４５ｍｍｏｌ）を加えた。５分後に冷却浴を取り除き、混合物を室温で４５分間撹拌した。この間に粘着性の沈殿物が形成された。反応物をエーテル（約１０ｍＬ）で希釈し、２分間撹拌した後、反応物をデカンテーションした。残留物を少量のＭｅＣＮ（約２ｍＬ）に溶解し、少量のＭｅＯＨを加えて透明な溶液を得た。次いで反応物をエーテル（約７０ｍＬ）で希釈した。濁った混合物を５分間撹拌し、次いで、一晩静置した。上清をデカンテーションによって除去した後、ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨに溶解し、エーテルで沈殿させる工程を３回繰り返した。残留物を真空中で乾燥させて、２０９ｍｇのオイル状物を得た。この物質をエタノール（２ｍＬ）に溶解し、DOWEX 50WX8-200水素型カラム（５ｇ、溶出液が無色で中性になるまで、事前にエタノールで洗浄）にロードした。生成物をエタノールで溶出した。生成物の画分を合わせ、Ｅｔ３Ｎ（０．０８３ｍＬ）を加え、無色透明な溶液を濃縮してＸＤ３８（１２５ｍｇ、７６％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) ppm = 5.71-5.59 (m, 1H), 4.47 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.25-3.11 (m, 6H), 1.70 (s, 3H), 1.31 (t, J = 7.3 Hz, 9H)。MS (ESI-) C5H10O5P- [M-H]- 計算値181.0、実測値181.1。
Ｄ チオリン酸エステルＸＤ３９の製造
Figure 2024524363000035
(E)-tert-ブチル((4-クロロ-2-メチルブタ-2-エン-1-イル)オキシ)ジフェニルシラン（ＸＤ５１）
ＮＣＳ（１．０２ｇ、７．６３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（２５ｍＬ）に溶解し、混合物を－４０℃に冷却した。ＤＭＳ（０．６９５ｍｌ、９．４０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら滴下し、次いで反応物を０℃に温め、１０分間撹拌した。反応物を－４０℃に冷却し、乾燥ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解させたアルコールＸＤ４７（２．００ｇ、５．８７ｍｍｏｌ、Serra, S. Tetrahedron: Asymmetry, 2014, 25, 1561-1572に記載のとおりに合成）を加えた。反応物を２．５時間かけて０℃に温め、次いで、０℃で更に９０分間撹拌した。ブライン（３０ｍＬ）を０℃で加え、各相を分離した。水相をＤＣＭ（４０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮した。ほぼ無色の粗製のオイル状物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～２０％ＤＣＭ）で精製して、塩化物ＸＤ５１（１．９３ｇ、９２％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.72-7.64 (m, 4H), 7.47-7.36 (m, 6H), 5.85 (tq, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.09 (s, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.08 (s, 9H)。
チオリン酸（E)-O,O-ビス((9H-フルオレン-9-イル)メチル) S-(4-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-3-メチルブタ-2-エン-1-イル)エステル（ＸＤ５２）
工程１ メタンチオスルホン酸ナトリウム（２６２ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を、塩化物ＸＤ５１（７００ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液（室温）に加えた。
５時間撹拌した後、混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ、混合物をＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１：１、２× ３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を水（２× ３０ｍＬ）とブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～１５％ＥｔＯＡｃ）により、メタンチオスルホン酸(E)-S-(4-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-3-メチルブタ-2-エン-1-イル)エステル（７２５ｍｇ、８６％）を、無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.71-7.61 (m, 4H), 7.51-7.34 (m, 6H), 5.75 (tq, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 4.10 (s, 2H), 3.91 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 3.27 (s, 3H), 1.70 (s, 3H), 1.08 (s, 9H)。
工程２ ＸＤ５０（５７０ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下でＭｅＣＮ（２．７５ｍＬ）とピリジン（５．６ｍＬ）に溶解した。溶液を氷浴上で冷却し、ＴＭＳＣｌ（０．８２５ｍｌ、６．５１ｍｍｏｌ）を滴下した。５分後に冷却浴を取り除き、反応物を室温で４５分間撹拌した。続いてメタンチオスルホン酸(E)-S-(4-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-3-メチルブタ-2-エン-1-イル)エステル（７０６ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。トルエン（１０ｍＬ）を加え、混合物を濃縮した。再度、残留物をトルエン（１０ｍＬ）と共に蒸発させて、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～５０％の「１：１エーテル／ＤＣＭ」）で精製して、ＸＤ５２（８１８ｍｇ、７９％）を無色のワックス状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.73 (t, J = 6.9 Hz, 4H), 7.65-7.59 (m, 4H), 7.59-7.52 (m, 4H), 7.44-7.32 (m, 10H), 7.32-7.24 (m, 4H), 5.63-5.50 (m, 1H), 4.51-4.36 (m, 2H), 4.33-4.15 (m, 4H), 3.96 (s, 2H), 3.40 (dd, J = 12.0, 8.0 Hz, 2H), 1.53 (s, 3H), 1.02 (s, 9H)。
チオリン酸O-水素 (E)-S-(4-ヒドロキシ-3-メチルブタ-2-エン-1-イル)エステル トリエチルアンモニウム（ＸＤ３９）
工程１ ＴＢＤＰＳ－エーテルＸＤ５２（８００ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を、ＸＤ３８の手順と同様に、１時間４５分間、ＨＦ・ｐｙと反応させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～４０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、対応するアルコール（４５２ｍｇ、８１％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.75 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 7.61-7.53 (m, 4H), 7.45-7.36 (m, 4H), 7.36-7.27 (m, 4H), 5.45 (tq, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 4.48-4.39 (m, 2H), 4.31-4.19 (m, 4H), 3.89 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 3.36 (dd, J = 13.6, 7.9 Hz, 2H), 1.59 (s, 3H)。MS (ESI+) C33H32O4PS+ [M+H]+ 計算値555.2、実測値555.5。
工程２ アルコール（２７２ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ（０．７５ｍｌ、５．３８ｍｍｏｌ）を室温で加えた。７時間後にオイル状の沈殿が形成され、ＭｅＣＮ（２ｍＬ）を加え、続いてトリエチルアミン（０．５ｍｌ、３．５９ｍｍｏｌ）を加えて透明な溶液を得た。一晩撹拌を続け、続いて透明な溶液を約１ｍＬに濃縮し、トルエン（６ｍＬ）と共に蒸発させた。オイル状の残留物をＭｅＣＮ（約０．７ｍＬ）に溶解し、次いで、撹拌しながらエーテル（７ｍＬ）をゆっくりと加えることで、沈殿させた。５分間撹拌した後、エマルションを沈殿させ、次いで溶液をデカンテーションにより除去すると、オイル状の物質が残留した。ＭｅＣＮ／エーテル処理を４回繰り返し、次いで、残留物を真空中で乾燥てし、トリエチルアミン塩ＸＤ３９（１２３ｍｇ、８３％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) ppm = 5.63 (tq, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 3.93 (s, 2H), 3.48 (dd, J = 9.4, 8.4 Hz, 2H), 3.19 (q, J = 7.4 Hz, 6H), 1.71 (d, J = 0.8 Hz, 3H), 1.32 (t, J = 7.3 Hz, 9H)。MS (ESI-) C5H10O4PS- [M-H]- 計算値197.0、実測値197.0。
Ｅ アルキンリンカーＸＤ４３の製造
Figure 2024524363000036
プロパ-2-イン-1-イルカルバミン酸2-(2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エトキシ)エチルエステル（ＸＤ４３）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＰＮＰ炭酸エステルＸＤ５３（５１１ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ、Elgersma, R. C. et al. Mol. Pharm. 2015, 12, 1813-1835に従い合成）に、０℃でプロパルギルアミン（０．０９３ｍｌ、１．４６ｍｍｏｌ）を加えた。冷却浴を取り除き、混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～７０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、ＸＤ４３（２６５ｍｇ、６８％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 7.60 (br t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.02 (s, 2H), 4.07-3.96 (m, 2H), 3.74 (dd, J = 5.8, 2.4 Hz, 2H), 3.61-3.48 (m, 7H), 3.07 (t, J = 2.5 Hz, 1H)。
Ｆ 一般手順ＸＸＤ：リン酸エステルのＣＤＩ活性化と、ホスホン酸エステル、リン酸エステル又はチオリン酸エステルとのカップリング
リン酸のモノトリエチルアミン塩（１．０当量）を、窒素雰囲気下でＤＭＦ（０．１５Ｍ）に溶解し、ＣＤＩ（２．１当量）を室温で加えた。３０分間撹拌した後、乾燥ＭｅＯＨ（１．０当量）を加え、混合物を室温で１５分間撹拌し、濃縮した。残留物をＤＭＦと共に蒸発させて粗生成物Ａを得た。
別のフラスコで、ホスホン酸、リン酸又はチオリン酸反応物のモノトリエチルアミン塩（１．２当量）をＤＭＦと共に蒸発させ、次いで、窒素雰囲気下でＤＭＦ（０．３６Ｍ）に再度溶解した。次いで、粗生成物Ａが入ったフラスコ（室温）に、混合物をカニューレを使用して入れた。同量のＤＭＦを使用してフラスコをすすぎ、移し替えを完了した。混合物を、窒素雰囲気下、室温で撹拌し、ＵＰＬＣ－ＭＳによる分析が本質的に完全な変換を示したら（通常、２０～２４時間）、反応物を濃縮し、分取ＨＰＬＣで精製した。生成物画分の凍結乾燥により生成物を得た。
Ｇ 一般手順ＸＸＥ：クリック反応
窒素ガスでパージした水（０．０３４Ｍ）中の硫酸銅（ＩＩ）五水和物（０．７７当量）を、室温で、固体のアジ化物（１．０当量）とアルキン（１．４当量）が入ったフラスコに加えた。同量のＴＨＦを加えて均一な水／ＴＨＦ（１：１）溶液を得た。フラスコのヘッドスペースを、短時間、窒素ガスでパージし、窒素ガスでパージした水（０．１３Ｍ）中のアスコルビン酸ナトリウム（１．５当量）を加えた。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析により完全な変換が示されるまで（通常、１～２時間）、反応物を室温で撹拌した。ＴＨＦの大半を、室温での短時間のロータリーエバポレーションで除去し、水相をミリＱ水中のＭｅＣＮ／２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（１：９）に溶解した。不溶性の物質を、シリンジフィルターを使用して除去し、ろ液を分取ＨＰＬＣで精製した。生成物画分の凍結乾燥により生成物を得た。
Ｈ リンカー－薬物化合物ＸＤ４４、ＸＤ４５及びＸＤ４６の製造
Figure 2024524363000037
(4-((14S,17S)-1-アジド-14-イソプロピル-17-メチル-12,15-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,16-ジアザオクタデカン-18-アミド)ベンジル)リン酸ビス((9H-フルオレン-9-イル)メチル)エステル（ＸＤ３５）
工程１ 3-(2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)プロピオン酸（１４２ｍｇ、０．５７４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中のＶａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ（１６０ｍｇ、０．５４５ｍｍｏｌ）を加え、続いて、室温でＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６００ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．１４３ｍｌ、０．８１８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を３０分間撹拌し、濃縮した。粗生成物をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、溶液をメタノールで予め洗浄した短いDOWEX 50WX8プラグに通過させることで、塩基性不純物を除去した。生成物をメタノールで溶出し、粗生成物をシリカゲル上で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～８％ＭｅＯＨ）により、アミド（２６２ｍｇ、９２％）をクリーム状の固体として得た。MS (ESI+) C24H39N6O7 + [M+H]+ 計算値523.3、実測値523.6。
工程２ ＭｅＣＮ（３．７ｍＬ）中の、生成したアミド（９７７ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）と5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール（１９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）に、窒素雰囲気下、室温で2,6-ルチジン（７１９μｌ、６．１７ｍｍｏｌ）を加え、続いて塩化物ＸＤ３４（８８４ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３．７ｍＬ）溶液を加え、混合物を室温で撹拌した。塩化物ＸＤ３４を、８０分後（８８ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）と１４０分後（１７７ｍｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）に、更に加えた。反応時間が１８５分となった後に、2,6-ルチジン（２１８μｌ、１．８７ｍｍｏｌ）を更に加え、反応を２時間続けた後に、メタノール（１ｍＬ）でクエンチした。混合物を濃縮し、粗生成物をＥｔＯＡｃ（８０ｍＬ）と塩酸（４０ｍＬ、１Ｍ）に溶解した。少量のＭｅＣＮ（４ｍＬ）を加えて残留する固体を溶かし、各相を分離した。水相をＥｔＯＡｃ（８０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨ）で精製して、リン酸エステルＸＤ３５（１．４０ｇ、収率６６％）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.94 (s, 1H), 8.18 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.89-7.82 (m, 5H), 7.55 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.52-7.44 (m, 4H), 7.42-7.34 (m, 4H), 7.30-7.24 (m, 4H), 7.09 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.60 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.40 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 4.25-4.17 (m, 5H), 4.15-4.11 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 4H), 3.55-3.46 (m, 8H), 3.39-3.36 (m, 2H), 2.50-2.36 (m, 2H), 2.02-1.93 (m, 1H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI+) C52H59N6O10PNa+ [M+H]+ 計算値981.4、実測値981.8。
4-((14S,17S)-1-アジド-14-イソプロピル-17-メチル-12,15-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,16-ジアザオクタデカン-18-アミド)ベンジルリン酸（ＸＤ３６）
トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）を、リン酸エステルＸＤ３５（１６０ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１ｍＬ）溶液（室温）に加え、反応物を２４時間撹拌した。
反応物をトルエン（８ｍＬ）で希釈し、次いで濃縮した。粗生成物をエーテル（１０ｍＬ）中に懸濁し、ろ過し、固体をエーテルで繰り返し洗浄して、リン酸アルキルエステルＸＤ３６（１０８ｍｇ、９２％）をモノトリエチルアンモニウム塩として得た。（注：この生成物は不純物（m/z 606）を含み、これはリン酸エステルからのアルコールの脱離と、トリエチルアミンによる中間体アザキノンメチドの捕捉で形成された可能性がある。この不純物は次の工程では反応しないので、更に精製する必要はない。）MS (ESI-) C24H38N6O10P- [M-H]- 計算値601.2、実測値601.7。
アジ化物ＸＤ４０
リン酸アルキルエステルＸＤ３６（１０７ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＤに従いホスホン酸エステルＸＤ３７と反応させた。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）で精製し、凍結乾燥後にホスホノホスフェートＸＤ４０（６０．５ｍｇ、５０％）をふわふわした白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 7.44-7.39 (m, 4H), 5.38 (br t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.40 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.12 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.73 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.66-3.55 (m, 10H), 3.42 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 2.63-2.48 (m, 2H), 2.26-2.14 (m, 2H), 2.11-1.99 (m, 1H), 1.74-1.61 (m, 2H), 1.56 (s, 3H), 1.43 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3H)。MS (ESI-) C30H49N6O13P2 - [M-H]- 計算値763.3、実測値763.7。
アジ化物ＸＤ４１
リン酸アルキルエステルＸＤ３６（１４２ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＤに従いリン酸アルキルエステルＸＤ３８と反応させた。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）で精製し、凍結乾燥後にピロリン酸エステルＸＤ４１（６５．９ｍｇ、４１％）をふわふわした白色の固体として得た。MS (ESI-) C29H47N6O14P2 - [M-H]- 計算値765.3、実測値765.6。
アジ化物ＸＤ４２
リン酸アルキルエステルＸＤ３６（１４２ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＤに従いリン酸アルキルエステルＸＤ３９と反応させた。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）で精製し、凍結乾燥後にアジ化物ＸＤ４２（８８．６ｍｇ、５４％）をふわふわした白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 7.48-7.39 (m, 4H), 5.51 (td, J = 7.9, 1.1 Hz, 1H), 4.96 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.40 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.12 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.73 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.67-3.54 (m, 10H), 3.47-3.36 (m, 4H), 2.63-2.48 (m, 2H), 2.13-1.98 (m, 1H), 1.59 (s, 3H), 1.43 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.92 (br d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.91 (br d, J = 6.6 Hz, 3H)。MS (ESI-) C29H47N6O13P2S- [M-H]- 計算値781.3、実測値781.5。
リンカー－薬物ＸＤ４４
アジ化物ＸＤ４０（１８．５ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＥに従いアルキンＸＤ４３と反応させた。分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）による精製で、凍結乾燥後にホスホノホスフェートＸＤ４４（１１．６ｍｇ、４７％）をふわふわした白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 7.88 (s, 1H), 7.41 (s, 4H), 6.74 (s, 2H), 5.38 (br t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.91 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.53 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 4.38 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.31 (s, 2H), 4.17-4.04 (m, 3H), 3.92-3.83 (m, 4H), 3.70 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.66-3.57 (m, 6H), 3.57-3.43 (m, 8H), 2.62-2.47 (m, 2H), 2.27-2.14 (m, 2H), 2.10-1.97 (m, 1H), 1.74-1.61 (m, 2H), 1.55 (s, 3H), 1.41 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 7.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 7.6 Hz, 3H)。MS (ESI-) C42H63N8O18P2 - [M-H]- 計算値1029.4、実測値1029.8。
リンカー－薬物ＸＤ４５
アジ化物ＸＤ４１（３０．２ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＥに従いアルキンＸＤ４３と反応させた。分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）による精製で、凍結乾燥後にピロリン酸エステルＸＤ４５（３６．２ｍｇ、９０％）をふわふわした白色の固体として得た。MS (ESI-) C41H61N8O19P2 - [M-H]- 計算値1031.4、実測値1031.7。
リンカー－薬物ＸＤ４６
アジ化物ＸＤ４２（２７．１ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＥに従いアルキンＸＤ４３と反応させた。分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）による精製で、凍結乾燥後にリンカー－薬物化合物ＸＤ４６（２２．６ｍｇ、６３％）をふわふわした白色の固体として得た。MS (ESI-) C41H61N8O18P2S- [M-H]- 計算値1047.3、実測値1047.7。
実施例１８ リンカー－薬物化合物ＸＤ５８の合成
Ａ アジ化物ＸＤ５７の製造
Figure 2024524363000038
(4-((S)-2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)プロパンアミド)ベンジル) (4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸2-シアノエチル（ＸＤ５４）
(4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジクロリド（５４０ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ、一般手順ＸＸＢに従いホスホン酸ジエステルＸＤ１５から製造）のＤＣＭ（４．３ｍＬ）溶液を、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール（３５．０ｍｇ、０．２６９ｍｍｏｌ）が入った、窒素ガスでパージしたバイアルに加えた。溶液を－７８℃に冷却し、3-ヒドロキシプロパンニトリル（０．１８４ｍｌ、２．６９ｍｍｏｌ）と2,6-ルチジン（０．３１３ｍｌ、２．６９ｍｍｏｌ）を順次加えた。－７８℃で３０分間撹拌した後、反応物を室温に温め、２．５時間撹拌した。次いで、ＸＤ４９（７８０ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ、ＸＤ２６の合成で記載のとおりに製造）のＴＨＦ／ＤＣＭ（１１ｍＬ、３：１、透明な溶液を得るにはヒートガンによる穏やかな加熱が必要で、その後室温に冷却する）溶液を、室温で急速に反応混合物に加えた。３時間後、2,6-ルチジン（０．３１３ｍｌ、２．６９ｍｍｏｌ）を更に加え、反応を９０分間続けた。混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、塩酸（５０ｍＬ、１Ｍ）で洗浄した。水相をＥｔＯＡｃ（２× ２５ｍＬ）で逆抽出し、合わせた有機相をブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～４０％アセトン）で不完全に分離し、純粋ではない生成物を、再度、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～４％ＭｅＯＨ）で精製して、純粋なＸＤ５４（６３０ｍｇ、４８％）を得た。MS (ESI+) C21H27F3N3NaO5P+ [M+Na]+ 計算値512.2、実測値512.5。
(4-((S)-2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)プロパンアミド)ベンジル) ((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸2-シアノエチル（ＸＤ５５）
アルケンＸＤ５４（０．６２５ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）のアリル酸化を、一般手順ＸＸＣに従って行った。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～８％ＭｅＯＨ）で精製して、アルコールＸＤ５５（０．４１１ｇ、６４％）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.22 (s, 1H), 9.73 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.39-5.29 (m, 1H), 5.05-4.91 (m, 2H), 4.66 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.48 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.18-4.02 (m, 2H), 3.76 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.26-2.13 (m, 2H), 1.90-1.76 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.41 (d, J = 7.3 Hz, 3H)。MS (ESI+) C21H27F3N3NaO6P+ [M+Na]+ 計算値528.2、実測値528.4。
アジ化物ＸＤ５７
工程１ ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、１．３１ｍｌ、２．６２ｍｍｏｌ）を、ＸＤ５５（３９６ｍｇ、０．６５５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４．６ｍＬ）／水（０．６ｍＬ）溶液（０℃）に加えた。１０分後、ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、１．３１ｍｌ、２．６２ｍｍｏｌ）を更に加え、次いで、冷却浴を取り除いた。２時間後、反応物を０℃に冷却し、塩酸（１Ｍ、２．９５ｍＬ、４．５当量）を加え、続いてＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ、１．９７ｍＬ、３．０当量）を加えた。次いで混合物を濃縮した。MS (ESI+) C16H26N2O5P+ [M+H]+ 計算値357.2、実測値357.4。
工程２ 粗生成物を水（５ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３（１６５ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）とｉＰｒＯＨ（５ｍＬ）を加えた。Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（２８６ｍｇ、０．６５５ｍｍｏｌ）を、室温で撹拌しながら加え、続いてＴＨＦ（２．５ｍＬ）を加えた。２．５時間後、反応をＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ、２ｍＬ）でクエンチし、濃縮した。粗生成物をＭｅＣＮ（３×）と共に蒸発させてわずかな水を除去した。得られた固体を、上清中にＯＳｕエステルが検出されなくなるまで、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）により、４０℃で撹拌しながら、繰り返し洗浄し、白色の固体を得た。
工程３ 精製していない固体のＭｅＯＨ／水（１０ｍＬ、９：１）溶液（０℃）にＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、１．３１ｍＬ、２．６２ｍｍｏｌ）を加え、次いで、混合物を室温で４５分間撹拌した。反応を０℃でＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ、３．９ｍＬ）によりクエンチした。次いで、メタノールをロータリーエバポレーターで除去し水性懸濁液を水で希釈し、ろ過した。固体を水で洗浄し、水相を凍結乾燥して中間体ＸＤ５６（８４０ｍｇ）を白色の固体として得た。今後の反応では、精製していないＸＤ５６の純度３５wt％に相当する定量的変換を工程１～３で想定した。MS (ESI+) C21H35N3O6P+ [M+H]+ 計算値456.2、実測値456.5。
工程４ 中間体ＸＤ５６の一部（４９０ｍｇ粗製、理論上の最大値０．３６５ｍｍｏｌ）を室温でＤＭＦ（４ｍＬ）中に懸濁した。ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（０．２５４ｍｌ、１．４６ｍｍｏｌ）及び3-(2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)プロパン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル（１４６ｍｇ、０．４２４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を７０分間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）で直ちに精製し、凍結乾燥後にアジ化物ＸＤ５７（１６３．６ｍｇ、６４％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 7.52-7.41 (m, 4H), 5.40 (br t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 4.45 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.91 (s, 2H), 3.78 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.71-3.61 (m, 10H), 3.51-3.44 (m, 2H), 2.69-2.55 (m, 2H), 2.28-2.16 (m, 2H), 2.16-2.04 (m, 1H), 1.77-1.65 (m, 2H), 1.58 (s, 3H), 1.49 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.98 (br d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.96 (br d, J = 6.4 Hz, 3H)。MS (ESI-) C30H48N6O10P- [M-H]- 計算値683.3、実測値683.6。
Ｂ リンカー－薬物化合物ＸＤ５８の製造
Figure 2024524363000039
リンカー－薬物ＸＤ５８
アジ化物ＸＤ５７（２１．４ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＥに従いアルキンＸＤ４３と反応させた。分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）による精製で、凍結乾燥後にリンカー－薬物化合物ＸＤ５８（１９．７ｍｇ、６７％）をふわふわした白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 7.92 (br s, 1H), 7.39 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.70 (s, 2H), 5.30 (br t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.83 (br d, J = 4.6 Hz, 2H), 4.49 (br t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.35 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.27 (br s, 2H), 4.08 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.05 (br s, 2H), 3.87-3.82 (m, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.67 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.63-3.53 (m, 6H), 3.53-3.40 (m, 8H), 2.61-2.42 (m, 2H), 2.11 (br s, 2H), 2.06-1.92 (m, 1H), 1.69-1.54 (m, 2H), 1.49 (s, 3H), 1.38 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 7.6 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 7.4 Hz, 3H)。MS (ESI-) C42H62N8O15P- [M-H]- 計算値949.4、実測値949.8。
実施例１９ リンカー－薬物化合物ＸＤ５９の合成
Ａ ジアルキンリンカーＸＳ３０の製造
Figure 2024524363000040
1-(プロパ-2-イン-1-イル)ピペラジン（ＸＳ２８）
工程１ ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（３．４４ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１７ｍＬ）溶液（０℃）に、ＤＩＰＥＡ（５．８７ｍＬ、３３．６ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化プロパルギル（トルエン中に８０％、１．８０ｍＬ、１６．８ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温にして、２時間撹拌した。次いで、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）及び水（２５ｍＬ）間で分配した。水相をＥｔＯＡｃ（１２ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～５０％ＥｔＯＡｃ）により、4-(プロパ-2-イン-1-イル)ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（３．５６ｇ、１５．９ｍｍｏｌ、９４％）を淡黄色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 3.47 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.32 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 2.51 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.26 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 1.46 (s, 9H)。MS (ESI+) C12H21N2O2 + [M+H]+ 計算値225.2、実測値225.2。
工程２ 生成物の一部（２．８２ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（６．３ｍＬ）に溶解し、４Ｍ ＨＣｌのジオキサン（２８．３ｍＬ、１１３ｍｍｏｌ）溶液を、撹拌しながら滴下した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、残留物をＤＣＭ（２×５ｍＬ）で洗浄した。白色の固体を真空中で乾燥させて、アミンＸＳ２８（２．４８ｇ、定量）を塩酸塩として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 3.98 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 3.52 (br s, 8H), 3.06 (t, J = 2.5 Hz, 1H)。MS (ESI+) C7H13N2 + [M+H]+ 計算値125.1、実測値125.1。
((S)-1-(((S)-1-((4-(ヒドロキシメチル)フェニル)アミノ)-1-オキソ-5-ウレイドペンタン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸アリルエステル（ＸＳ２９）
6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル) ヘキサン酸（１．９０ｇ、９．００ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４５ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（６．２８ｍＬ、３６．０ｍｍｏｌ）を加え、続いてＨＡＴＵ（３．５９ｇ、９．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間撹拌し、次いでアミンＸＳ２８（１．８７ｇ、９．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、その後、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）の間で分配した。水相をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を水（５０ｍＬ）とブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ中の０～０．１％ Ｅｔ３Ｎ）で精製して、アミドＸＳ２９（２．２０ｇ、７７％）を淡黄色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 7.00 (s, 2H), 3.43 (d, 4H), 3.38 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.29 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.16 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.45-2.33 (m, 4H), 2.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.54-1.42 (m, 4H), 1.29-1.25 (m, 2H)。MS (ESI+) C17H24N3O3 + [M+H]+ 計算値318.2、実測値318.3。
臭化4-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)-1,1-ジ(プロパ-2-イン-1-イル)ピペラジン-1-イウム（ＸＳ３０）
０℃のアミンＸＳ２９（０．５２８ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（３．３ｍＬ）溶液に、臭化プロパルギル（トルエン０．９２６ｍＬ中に８０％、８．３２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にし、終夜撹拌し、その後、エーテル（４５ｍＬ）に撹拌しながら滴下した。オイル状の沈殿が形成され、上清をデカンテーションにより除去した。残留物をエーテル（５ｍＬ）で洗浄し、続いてＭｅＣＮ／トルエン（４：１）混合物に溶解し、濃縮して、四級アミンＸＳ３０（０．７１０ｇ、７９％）を淡黄色のオイル状物として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 7.01 (s, 2H), 4.59 (d, J = 2.1 Hz, 4H), 4.15 (t, J = 2.2 Hz, 2H), 3.90-3.79 (m, 4H), 3.60-3.48 (m, 4H), 3.39 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.55-1.44 (m, 4H), 1.30-1.25 (m, 2H)。MS (ESI+) C20H26N3O3 + [M]+ 計算値356.2、実測値356.4。
Ｂ リンカー－薬物化合物ＸＤ５９の製造
Figure 2024524363000041
リンカー－薬物ＸＤ５９
水を、撹拌しながら２０分間窒素ガスでパージした後で、使用した。ＴＨＦ／水（１：１０、０．５５ｍＬ）中のアルキンＸＳ３０（９．２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、室温で固体のＸＤ５７（３０．１ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）に加えた。次に、水（１．０ｍＬ）中の硫酸銅（ＩＩ）五水和物（８．３ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を加えて透明な溶液を得た。バイアルの上部空間を窒素ガスでパージし、続いて、水（０．４８ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（０．０１３ｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を室温で加えて、不透明な懸濁液を得た。さらに、アルキンＸＳ３０（ＴＨＦ／水（１：１０、０．５４０ｍＬ）中に１０ｍｇ）を、４回に分けて、３時間かけて加え、その時点でＵＰＬＣ－ＭＳ分析で完全な変換が示された。ＴＨＦを、短時間のロータリーエバポレーションで除去し、水溶液を２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（１０ｍＬ）中の１０％ ＭｅＣＮで希釈し、分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から５０：５０勾配）で精製し、凍結乾燥後にリンカー－薬物化合物ＸＤ５９（２３．０ｍｇ）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 8.56 (s, 2H), 7.46 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.41 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 6.81 (s, 2H), 5.39 (br t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.89 (br d, J = 7.0 Hz, 4H), 4.74 (s, 4H), 4.69 (br t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.42 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.16 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.10-4.01 (m, 4H), 3.98 (br t, J = 4.7 Hz, 4H), 3.90 (s, 4H), 3.74 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.68-3.62 (m, 4H), 3.62-3.52 (m, 14H), 3.52-3.43 (m, 4H), 2.68-2.52 (m, 4H), 2.42 (br t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.26-2.14 (m, 4H), 2.09 (dq, J = 13.6, 6.8 Hz, 2H), 1.67 (dt, J = 16.3, 8.2 Hz, 4H), 1.60-1.51 (m, 10H), 1.46 (d, J = 7.3 Hz, 6H), 1.34-1.20 (m, 2H), 0.96 (d, J = 7.1 Hz, 6H), 0.93 (d, J = 7.1 Hz, 6H)。MS (ESI-) C80H122N15O23P2 - [M-H]- 計算値1722.8、実測値1723.2。
実施例２０ リンカー－薬物化合物ＸＤ６３の合成
Ａ ホスホン酸エステルＸＤ６１の製造
Figure 2024524363000042
(E)-(5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ジメチルエステル（ＸＬ１）
メチルホスホン酸ジメチルエステル（１３．１ｍｌ、１２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４４０ｍＬ）に溶解し、－７８℃に冷却し、n-ブチルリチウム（７５ｍｌ、１２１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を－７８℃で１時間撹拌し、次いで、－５０℃に温め、続いてＣｕＩ（１１．５ｇ、６０．４ｍｍｏｌ）を加え、この温度で１時間撹拌した。混合物を再び－７８℃に冷却し、ＴＨＦ（１１０ｍＬ）に溶解したＸＤ５１（１９．７ｇ、５４．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を一晩、室温に温め、次いで、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５００ｍＬ）でクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃ（２× ５００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮した。粗製の材料をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、ＸＬ１（２３．２ｇ、収率９５％）を黄色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.69-7.63 (m, J = 7.9, 1.5 Hz, 4H), 7.44-7.34 (m, 6H), 5.46-5.41 (m, 1H), 4.04 (br s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 2.38-2.28 (m, 2H), 1.83-1.73 (m, 2H), 1.60 (s, 3H), 1.06 (s, 9H)。MS (ESI+) C24H36O4PSi+ [M+H]+ 計算値447.2、実測値447.4。
Ｂ リンカー－薬物化合物ＸＤ６３の製造
(E)-(5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸ビス(2-シアノエチル)（ＸＤ６０）
ホスホン酸エステルＸＬ１（５８０ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＢに記載のとおりに、ホスホン酸ジクロリドに変換した。次いで、粗生成物を、ピリジンの代わりに2,6-ルチジンを使用した点を除きＸＤ２１の合成で説明したように、3-ヒドロキシプロピオニトリルと反応させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の２０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、ホスホン酸エステルＸＤ６０（３６０ｍｇ、５３％）を無色のオイル状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.69-7.62 (m, 4H), 7.46-7.34 (m, 6H), 5.44 (br t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.34-4.20 (m, 4H), 4.05 (s, 2H), 2.74 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.45-2.33 (m, 2H), 1.97-1.83 (m, 2H), 1.61 (s, 3H), 1.06 (s, 9H)。MS (ESI+) C28H37N2NaO4PSi+ [M+H]+ 計算値547.2、実測値547.5。
(E)-(5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホン酸2-シアノエチルエステル トリエチルアミン（ＸＤ６１）
ＤＢＵ（０．０５３ｍｌ、０．３４９ｍｍｏｌ）を、室温でホスホン酸エステルＸＤ６０（１２２ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液に加えた。３０分間撹拌した後、混合物を約０．５ｍＬに濃縮し、溶液をＭｅＯＨ（１ｍＬ）で希釈した。次いで、溶液を短いDOWEX 50WX8（H+型）プラグに通過させ、メタノールで生成物を溶出することで、ＤＢＵを除去した。
トリエチルアミン（０．０３２ｍｌ、０．２３３ｍｍｏｌ）を溶出物に加え、混合物を濃縮し、ＭｅＣＮ（２×）と共に蒸発させた。ホスホン酸エステルＸＤ６１（１２０ｍｇ、９７％）を、ホスホン酸エステル：Ｅｔ３Ｎの比が１：０．６のトリエチルアミン塩として単離した。1H NMR (400 MHz, CD3OD) ppm = 7.71-7.62 (m, 4H), 7.46-7.36 (m, 6H), 5.43 (td, J = 7.3, 1.3 Hz, 1H), 4.08 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 4.05 (s, 2H), 3.20 (q, J = 7.3 Hz, 4H), 2.78 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.38-2.28 (m, 2H), 1.65 (s, 3H), 1.71-1.61 (m, 2H), 1.31 (t, J = 7.3 Hz, 5H), 1.04 (s, 9H)。MS (ESI-) C25H33NO4PSi- [M-H]- 計算値470.2、実測値470.4。
Figure 2024524363000043
((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-シアノエトキシ)((E)-5-ヒドロキシ-4-メチルペンタ-3-エン-1-イル)ホスホリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-1-オキソ-5-ウレイドペンタン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチルエステル（ＸＤ６２）
工程１ ホスホン酸エステルＸＤ６１（１８７ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（２９５ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ中で合わせ、ＤＭＦ（３× ８ｍＬ）と共に蒸発させた。次いで、ＤＭＦ（３．２ｍＬ）を窒素雰囲気下で加え、続いて室温でＰｙＢＯＰ（２５５ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０５７ｍｌ、０．３２６ｍｍｏｌ）を加えた。５分後にＤＩＰＥＡ（０．１１４ｍｌ、０．６５３ｍｍｏｌ）を更に加え、混合物を２時間撹拌した。次いで、反応混合物を、水（７０ｍＬ、０℃）に、ゆっくりと滴下した。ゲルの形成を避けるために、撹拌は穏やかに行う必要がある。白色の懸濁液を５分間穏やかに撹拌し、次いで、ろ過した。固体を集め、ＭｅＣＮ（２×）と共に蒸発させてわずかな水を除去した。固体をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１２％ＭｅＯＨ）で精製して、生成物（２６３ｍｇ、７６％）を白色の固体として得た。MS (ESI+) C58H72N6O9PSi+ [M+H]+ 計算値1055.5、実測値1056.0。
工程２ 生成物の一部（２５７ｍｇ、０．２４４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、ＰＦＡ製バイアル中のＴＨＦ（３．８ｍＬ）とピリジン（０．３７０ｍＬ）に懸濁した。バイアルを０℃に冷却し、ＨＦ・ピリジン（０．２５ｍｌ、７０％）を加えた。混合物をこの温度で６時間撹拌し、次いで、冷却した懸濁液をＥｔＯＡｃ中の飽和ＮａＨＣＯ３水溶液／１０％ｉＰｒＯＨ混合物（０℃）に、注意深く加えた。５分間撹拌した後、各相を分離し、有機相を塩酸（１Ｍ）とブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、シリカゲル上で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１５％ＭｅＯＨ）により、アルコールＸＤ６２（１４８ｍｇ、７４％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.10 (s, 1H), 8.12 (br d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.45-7.37 (m, 3H), 7.36-7.29 (m, 4H), 5.97 (br t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.34 (td, J = 7.1, 1.0 Hz, 1H), 5.03-4.91 (m, 2H), 4.67 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.46-4.37 (m, 1H), 4.34-4.18 (m, 3H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.98-3.87 (m, 1H), 3.75 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.07-2.90 (m, 2H), 2.88 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.27-2.12 (m, 2H), 2.05-1.93 (m, 1H), 1.91-1.77 (m, 2H), 1.75-1.54 (m, 2H), 1.51 (s, 3H), 1.49-1.29 (m, 2H), 0.88 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI+) C42H54N6O9P+ [M+H]+ 計算値817.4、実測値817.8。
リンカー－薬物ＸＤ６３
ＮａＯＨによるホスホン酸エステルＸＤ６２の脱保護、その後の6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステルとのアミドカップリング、及びＲＰ－ＨＰＬＣによる精製を、ＸＤ５７の合成の工程３及び４に、以下の変更を加えて行った。工程３では、５当量のＮａＯＨ（２Ｍ）を使用して、反応時間を２時間とした。工程４では、２当量ＯＳｕエステルを使用した。リンカー－薬物ＸＤ６３（４７．９ｍｇ、３６％）を白色の固体として得た。1H NMR (400 MHz, D2O) ppm = 7.46 (s, 4H), 6.82 (s, 2H), 5.40 (br t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.90 (br d, J = 7.5 Hz, 2H), 4.45 (br t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.10 (br d, J = 7.9 Hz, 1H), 3.91 (s, 2H), 3.46 (br t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.14 (br t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.31 (br t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.24-2.13 (m, 2H), 2.11-2.00 (m, 1H), 1.99-1.75 (m, 2H), 1.71-1.47 (m, 11H), 1.31-1.19 (m, 2H), 0.95 (br dd, J = 6.4, 2.8 Hz, 6H)。MS (ESI+) C34H52N6O10P+ [M+H]+ 計算値735.4、実測値735.7。
実施例２１ リンカー－薬物化合物ＸＤ６５の製造
Figure 2024524363000044
((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((((E)-4-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-3-メチルブタ-2-エン-1-イル)オキシ)(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-1-オキソ-5-ウレイドペンタン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチルエステル（ＸＤ６４）
Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（３００ｍｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、室温でＤＭＦ（７．０ｍＬ）に溶解し、(3-((ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル)オキシ)プロパンニトリル（０．１７４ｍｌ、０．５４８ｍｍｏｌ）を加え、続いてＭｅＣＮ中のテトラゾール（０．４５Ｍ、１．２２ｍｌ、０．５４８ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を室温で２時間撹拌した。一方、アルコールＸＤ４７（２８２ｍｇ、０．８２８ｍｍｏｌ、Serra, S. Tetrahedron: Asymmetry, 2014, 25, 1561-1572に記載のとおりに合成）と5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール（１４３ｍｇ、１．０９７ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの丸底フラスコに入れ、乾燥ＭｅＣＮと共に蒸発させた。残留物を、窒素雰囲気下でＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、次いで、混合物を、室温でカニューレを使用して加えた。一晩撹拌した後、ｔＢｕＯＯＨ（デカン中に５．５Ｍ、０．１９９ｍｌ、１．０９７ｍｍｏｌ）を０℃で加え、２分後、反応物を室温に温め、９０分間撹拌した。次いで反応物を撹拌しながら氷で冷やした水（７０ｍＬ）に注ぎ、５分後に懸濁液をろ過し、少量の水（２× ６ｍＬ）で洗浄した。次いで、固体をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨ）で精製して、生成物とＦｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（３５４ｍｇ）の混合物を得た。この物質を更に精製することなく次の工程で使用した。MS (ESI+) C57H69N6NaO10PSi+ [M+Na]+ 計算値1079.5、実測値1079.9。
リンカー－薬物ＸＤ６５
((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((((E)-4-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-3-メチルブタ-2-エン-1-イル)オキシ)(2-シアノエトキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)-1-オキソ-5-ウレイドペンタン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチルエステル（１６２ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解した。ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中に１．０Ｍ、４５８μｌ、０．４５８ｍｍｏｌ）を室温で加えた。３５分後、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中に１．０Ｍ、１．３０ｍＬ、１．３０ｍｍｏｌ）を更に加え、反応を４５分間続けた。エーテル（約５０ｍＬ）を加えて、上清が濁ったオイル状物を得た。上清を除去し、残ったオイル状物をエーテルで２回処理した（エーテルの添加、撹拌、デカンテーション）。オイル状の残留物をＤＭＦ（０．３ｍＬ）に溶解し、酢酸（０．０４４ｍＬ、０．７６４ｍｍｏｌ）を加え、続いて、室温でＤＩＰＥＡ（０．０８０ｍＬ、０．４５８ｍｍｏｌ）と6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル（７０．６ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ）を加えた。２５分後、反応が完全に終了したことが観察された。酢酸（０．０４４ｍＬ、０．７６４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を濃縮した。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水×０．１％ ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、９０：１０から４０：６０勾配）で精製し、生成物の画分を凍結乾燥した。このような酸性条件で凍結乾燥すると、部分的な分解が観察された。純粋ではない生成物の一部を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（ミリＱ水中の１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３／ＭｅＣＮ、９０：１０から６５：３５勾配）で再度精製し、凍結乾燥後にリンカー－薬物化合物ＸＤ６５（１５．３ｍｇ）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.09 (s, 1H), 8.12 (br d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.85 (br d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.11-6.03 (m, 1H), 5.58-5.50 (m, 1H), 5.45 (br s, 2H), 4.75 (br d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.43-4.28 (m, 3H), 4.19 (dd, J = 8.7, 6.9 Hz, 1H), 3.78 (s, 2H), 3.39-3.34 (m, 2H), 2.97 (dtt, J = 18.9, 12.8, 6.3 Hz, 2H), 2.23-2.06 (m, 2H), 2.02-1.91 (m, 1H), 1.78-1.65 (m, 1H), 1.65-1.29 (m, 10H), 1.22-1.12 (m, 2H), 0.85 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.81 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI-) C33H48N6O11P- [M-H]- 計算値735.3、実測値735.9。
実施例２２ リンカー－薬物化合物（ＬＤ）からの複合体の合成
表１に記載のＡＤＣ番号は、実施例で開示したように合成した対応するリンカー－プロドラッグと使用する抗体を示す。
表１に示す複合体で使用した抗体は以下のとおり：
・抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）リツキシマブ（ｒ）
・抗Ｈｅｒ２ ＭｏＡｂトラスツズマブ（ｔ）、又は抗体の重鎖（ＨＣ）の４１位のアミノ酸がシステインに置換されているトラスツズマブ－４１Ｃ（ｔ４１Ｃ）
・抗ＣＤ１２３ ＭｏＡｂ（Byondis社独自のＭｏＡｂであるＣＤ１２３）
・Ｈ８－ＨＣ４１Ｃ（重鎖は配列番号８に示すアミノ酸配列を含み、軽鎖は配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む）として国際公開第2015/177360号に開示されている抗５Ｔ４抗体である、抗５Ｔ４ ＭｏＡｂ（５Ｔ４）
・ＳＹＤ１０３０（重鎖は配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、軽鎖は配列番号５に示すアミノ酸配列を含む）として国際公開第2015/177360号に開示されている重鎖の４１位（すなわち、ＨＣ４１Ｃ）に操作されたシステインを有する抗ＰＳＭＡ抗体である、抗ＰＳＭＡ ＭｏＡｂ ＳＹＤ１０３０ ４１Ｃ（ｐ４１Ｃ）
・アイソタイプ対照抗体（ｉ）。
使用したアイソタイプ対照抗体は、受託番号2NY7のヒト抗ＨＩＶ１ ｐｇ１２０抗体Ｂ１２の可変ドメイン配列を有し（Zhou et al, 2007,Nature, 445, 732-737）、ＩｇＧ１κアイソタイプ対照抗体として使用されている（それぞれ、受託番号P01857及びP01834）。
それぞれの複合体を実施例２２ａ～ｃに記載の方法に従い合成した。実施例２２ｂに記載したように部位特異的複合化によって製造したＤＡＲ２の複合体を除き、表１に示すＤＡＲが８未満の全ての複合体は、実施例２２ａに記載の手順に従って合成した。高いＤＡＲ（８以上）の複合体は、実施例２２ｃに記載の手順に従って製造した。ＤＡＲ（複合体中のｐＡｇ抗体比）も表１に示す。
実施例２２ａ ＤＡＲ２の複合体の合成
抗体の溶液（１０～１２ｍｇ／ｍＬ）に、ＴＲＩＳ（１体積％、１Ｍ、ｐＨ８）、ＥＤＴＡ（４体積％、２５ｍＭ）及びＴＣＥＰ（水中に５ｍＭ）を加えた。得られた溶液を室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、還元された抗体を、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース（ｐＨ６）で再度緩衝化し、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）及びリンカー－薬物化合物（ＬＤ）（ＤＭＡ中に１０ｍＭ、１つのＳＨにつき１．５当量以上）で処理した。最終的なＤＭＡ含有量は約１０体積％であった。得られた混合物を、暗所、室温で一晩ローラー混合した。活性炭を加え、懸濁液を暗所で１時間ローラー混合し、ろ過し、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース（ｐＨ６）で洗浄した。溶液を、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース（ｐＨ６）で再度緩衝化し、滅菌ろ過した。
実施例２２ｂ 部位特異的複合化によるＤＡＲ２の複合体の合成
ＤＡＲ２の複合体の一部（表１に示すＡＤＣ－ＸＤ１８－ＣＤ１２３４１Ｃ、ＡＤＣ－ＸＤ１８－５Ｔ４４１）は、部位特異的複合化で合成し、リンカー－薬物分子は、Kabatナンバリングシステムで抗体重鎖の４１位（「４１Ｃ」）の操作されたシステインによってのみ結合している。これらの複合体は、国際公開第2015/177360号及び同第2017/137628号に開示された方法で製造した。
実施例２２ｃ ＤＡＲが高い（ＤＡＲ８、ＤＡＲ１６及びＤＡＲ１０、ＤＡＲ２０）複合体の合成
抗体の溶液（４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース（ｐＨ６）中に１２ｍｇ／ｍＬ）に、ＥＤＴＡ（水中に２５ｍＭ、４％v/v）及びＴＲＩＳ（水中に１Ｍ、ｐＨ８、２％v/v）を加えた。
ＤＡＲ８又はＤＡＲ１６の複合体では、野生型抗体を使用した。ＤＡＲ１０又はＤＡＲ２０の複合体では、重鎖のKabatナンバリングシステムで４１位のアミノ酸がシステインに置換されている４１Ｃ修飾抗体を使用した。この修飾により、抗体のアミノ酸配列中に、２つのシステインが更に導入され、これは、次の工程においてＴＣＥＰで還元され、リンカー－薬物（ＬＤ）と結合可能な位置が合計１０となる。
ＴＣＥＰ（水中に１０ｍＭ、３０当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。反応物を、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース（ｐＨ６）を使用して遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）で除去した。
ＤＭＡを加え、続いてリンカー－薬物の溶液を加えた。ＤＡＲ８及びＤＡＲ１６の複合体では、ＤＭＡ中に１０ｍＭ、１６当量を加えた。ＤＡＲ１０及びＤＡＲ２０の複合体では、ＤＭＡ中に１０ｍＭ、２０当量を加えた。
ＤＡＲ１６及びＤＡＲ２０の複合体は、分岐リンカーを有するリンカー－薬物を用いて製造し、各分岐リンカーは２つのｐＡｇを有する（表１に示すリンカー－薬物ＸＤ５９）。ＤＭＡの最終濃度は１０％であった。
得られた混合物を、遮光下、室温で３時間又は一晩インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。活性炭を、０．２ｍｍのＰＥＳ又はＰＶＤＦフィルターを使用して除去し、得られたＡＤＣを、Vivaspin遠心分離濃縮器（分子量カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース（ｐＨ６）中に加えた。最後に、ＡＤＣ溶液を、０．２ｍｍのＰＶＤＦフィルターを使用して滅菌ろ過した。
実施例２２ａ又は２２ｂに記載のとおりに合成した複合体のＤＡＲ（ｐＡｇ抗体比）を、目標とするＤＡＲ２に近似するために、ＨＩＣによる簡単なＤＡＲの決定を可能にする疎水性のseco-ＤＵＢＡ（ＳＹＤ９８０、国際公開第2015/177360号に記載）を使用して、代わりの複合化を行った。
目標とするＤＡＲが２である複合体で得られた近似ＤＡＲを表１に示す。実施例２２ｃに記載のとおりに合成した高いＤＡＲの複合体では、目標とするＤＡＲは、表１で「目標値」として示している。実際のＤＡＲは、この値から多少ずれる場合がある（これは、ピークが重複する（目標とするＤＡＲが２のＡＤＣ）か、製造されたＡＤＣが完全に還元され／複合化されている（目標とするＤＡＲが８、１０、１６及び２０のＡＤＣ）ため、標準的な方法（ＨＩＣ）で測定できなかったことを意味する）。
ＤＡＲ又は％ＨＭＷにおいて、複数の値がコンマで区切られて記載されている場合、これらは同じＡＤＣの異なるバッチを指す。
表１において、「＜ＬＯＤ」は、検出限界未満を意味する。
Figure 2024524363000045
Figure 2024524363000046
Figure 2024524363000047
Figure 2024524363000048
Figure 2024524363000049
Figure 2024524363000050
実施例２３ プロドラッグ及び複合体のγδＴ細胞に対する活性
（複合化していない）ホスホ抗原プロドラッグの活性を決定するために、Ｒａｊｉ標的細胞を、エフェクター細胞を含有する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共培養する前に、ＸＣ１及びＸＤ１とプレインキュベートした。ホスホ抗原ＨＭＢＰＰ、ホスホ抗原プロドラッグＸＣ１、ＸＤ１、又は表１に列挙した複合体で前処理した（ＣＤ２０陽性バーキットリンパ腫ヒト腫瘍細胞株Ｒａｊｉに由来する）腫瘍細胞と、ＰＢＭＣを共培養した後に、選択的なγδＴ細胞の活性化をin vitroで調べた。試験を行ったプロドラッグの構造を表２に示す。
Figure 2024524363000051
免疫細胞の供給源として、健康なヒトドナーのＰＢＭＣを用いた。
活性化されると、Ｖγ９Ｖδ２γδＴ細胞は、サイトカインを産生して免疫を活性化し、細胞毒性顆粒を放出（脱顆粒）して標的細胞を殺傷する。Ｖγ９Ｖδ２γδＴ細胞のみが、ホスホ抗原レベルの変動を感知することが知られているが、誘導されるエフェクター機構の一部は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞の他のサブセットを含む他の免疫細胞と共有される。これらの免疫細胞集団は全て、健康なドナーの血液から単離したＰＢＭＣ中に存在する。したがって、ＰＢＭＣは、in vitroで実験を行い、γδＴ細胞の選択的な活性化を決定する際の良好な細胞供給源である。
異なる免疫細胞集団の同定は、蛍光標識したモノクローナル抗体による特異的な染色で達成できる。モネンシン及び／又はブレフェルジンＡを、ＰＢＭＣと標的の共培養物中に加えると、産生されたＩＦＮγが活性化した細胞に捕捉される。抗ＩＦＮγ抗体が細胞内へ移行することを可能にするサポニンの存在下での蛍光標識抗体による染色は、ＩＦＮγ産生細胞を同定する。ＣＤ１０７ａに対する蛍光標識抗体も、共培養物中に加えることができ、脱顆粒を起こしている細胞を染色する。したがって、蛍光標識した免疫細胞特異的マーカー、ＣＤ１０７ａマーカー及びＩＦＮγマーカーと組み合わせることで、前処理した標的細胞と共培養した後のγδＴ細胞及び／又は他の免疫細胞サブセットの活性化状態の決定が可能である。
材料及び方法
ＣＤ２０陽性バーキットリンパ腫ヒト腫瘍細胞株Ｒａｊｉ（ＤＳＭＺ、the German collection of Microorganisms and cell cultures GmbH（Leibniz Institute, Germany））をin vitro実験に用いた。Ｒａｊｉ細胞を、完全増殖培地（ＣＧＭ）（１０％熱不活化（ＨＩ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco- Life Technologies; Carlsbad, CA）及び８０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Lonza Group Ltd, Basel Switzerland）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Lonza, Walkersville, MD, USA））中で培養した。Ｒａｊｉ細胞を、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持し、週２回、継代した。
本発明の複合体（ＡＤＣ）、非複合体型ホスホ抗原プロドラッグ及びＨＭＢＰＰでの刺激について、Ｒａｊｉ細胞を収集し、５×１０６細胞／ｍＬまで希釈し、この細胞懸濁液の５０μＬ（２５０，０００細胞／ウェルに相当）を、９６ウェルプレートへ播種した。２倍濃縮した、プロドラッグ及びＡＤＣの１０倍段階希釈物をＣＧＭで調製した。播種したＲａｊｉ細胞を、段階希釈化合物の５０μＬ／ウェルと共に、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで一晩インキュベートした。
次の日、過剰の結合していない化合物を除去するために、Ｒａｊｉ細胞及び化合物（ＡＤＣ、結合していないホスホ抗原プロドラッグ又はＨＭＢＰＰ）を含む９６ウェルプレートにＣＧＭを１ウェルにつき１００μＬ加えて洗浄し、室温、３００×ｇで３分間遠心分離し、上清を除去した。
免疫細胞の供給源として、健康なヒトドナーの凍結した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍し、ＣＧＭ中に再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに一晩置いて、細胞を回復させた。
回復したＰＢＭＣを収集し、カウントし、ＣＧＭで１０×１０６細胞／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ウェル（０．５×１０６細胞／ウェルに相当）をＲａｊｉ細胞に加えた。２倍濃縮した抗ＣＤ１０７ａ－AlexaFluor 647溶液を、GolgiStop（モネンシン）及びGolgiPlug（ブレフェルジンＡ）（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を含有するＣＧＭ中で調製し、５０μＬ／ウェルを、Ｒａｊｉ－ＰＢＭＣ共培養物に加えた。全ての実験において、免疫細胞の非特異的アクチベーターとして知られた１％フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ－Ｍ、Gibco-ThermoFisher）も陽性対照としてウェルに含めた。試料を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで６時間インキュベートした。
免疫細胞サブセットの特異的な染色について、マルチカラー抗体染色カクテルを、抗ＣＤ３ ＢＵＶ３９６（全てに含まれるものではない）、抗ＣＤ８ ＢＶ４２１、抗ＣＤ５６ ＰＥ－Ｃｙ７、生死判別染色７８０（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）、抗ＴＣＲ Ｖδ１ ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００、ＦｃＲブロッキング試薬（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）、及び抗ＴＣＲ Ｖδ２ ＢＶ７１１（Biolegend, San Diego, USA）を含有するブリリアント染色緩衝液中で調製した。６時間のインキュベーション後、プレートを、室温、３００×ｇで３分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを抗体カクテル５０μＬ中に再懸濁し、遮光下、氷上で３０分間インキュベートした。プレートを、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×、０．１％v/w ＢＳＡ、０．０２％v/v アジ化ナトリウム（ＮａＮ３））１００μＬで２回洗浄し、続いて、３００×ｇで３分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を固定し、１００μＬ／ウェルのCytofix/Cytoperm溶液（BD bioscience, San Jose, CA, USA）を用いて透過処理し、遮光下、氷上で２０分間インキュベートした。細胞を、サポニンを含有するBD Perm/wash溶液（１０倍のBD Perm/Wash緩衝液を蒸留水で希釈し、使用前に１倍溶液を製造）１５０μＬで３回洗浄し、続いて３００×ｇで３分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、遮光下、４℃の冷蔵庫で一晩保存した。
３日目、染色したＰＢＭＣ／Ｒａｊｉ細胞を、BD Perm/wash溶液１５０μＬで１回洗浄し、続いて、３００×ｇで３分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、Perm/Wash溶液で希釈した抗ＩＦＮγ ＢＶ６５０（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）の混合物５０μＬ中に再懸濁し、遮光下、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬで１回洗浄し、続いて、３００×ｇで３分間遠心分離し、上清を捨てた。その後、細胞ペレットを、ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬに再懸濁し、試料を、９６ウェルプレートで分析するために、ハイスループットサンプラーと備えたBD FACSymphony A3細胞アナライザー（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で分析した。
ゲーティングストラテジー
FlowJo V10.7で分析し、得られた試料をゲーティングし、さまざまな免疫細胞集団を特定した（図１）。まず、時間ゲートを適用して一定の流れを確保し（図１Ａ）、潜在的な不規則さを排除し、その後、ＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈ及びＳＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ｈプロットで、ダブレット及び死細胞を除外した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。
生存細胞を選択し（図１Ｄ）、続いて、ＦＳＣ／ＳＳＣに基づいてリンパ球を選択した（図１Ｅ）。次いで、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞をＮＫ細胞として同定した（図１Ｆ）。ＣＤ３陽性細胞を、Ｖδ２陽性細胞とＶδ１陽性細胞に更に分けた（図１Ｇ）。リンパ球も、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞へ細分し（図１Ｈ）、４つのファミリーを得た：
－ ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞として特定、
－ ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３＋Ｖδ１－Ｖδ２－ＣＤ８＋として特定、
－ Ｖδ１ γδＴ細胞は、ＣＤ３＋Ｖδ１＋Ｖδ２－として特定、
－ Ｖδ２γδＴ細胞は、ＣＤ３＋Ｖδ１－Ｖδ２＋として特定。
注意すべきことは、Ｖδ２γδＴ細胞を染色するためにこの明細書で使用したＢ６クローンは、Ｖγ９Ｖδ２γδＴ細胞のみを染色し、Ｖδ２γδＴ細胞のＶγ９－集団を染色しない。これらの４つの免疫細胞集団について、ＣＤ１０７ａ＋又はＩＦＮγ＋細胞の割合を決定した。さらに、ＣＤ１０７＋又はＩＦＮγ＋細胞集団の蛍光強度の中央値を、細胞あたりの活性の尺度として求めた。ＣＤ１０７ａは、脱顆粒についてのマーカーとして説明されており、標的細胞の殺傷と強く相関する。分泌を防ぐブレフェルジンＡ／モネンシン処理により引き起こされるＩＦＮγの蓄積は、ＩＦＮγサイトカイン産生の尺度である。
結果／結論
細胞膜透過性プロドラッグはＶδ２γδＴ細胞の活性化を誘導する
プロドラッグＸＣ１及びＸＤ１のいずれも、他の免疫細胞（ＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｖδ１ γδＴ細胞）の直接的活性化を誘導することなく（図２Ｂ、図２Ｄ）、初代ヒトＰＢＭＣでＶδ２γδＴ細胞集団のＩＦＮγ産生及び脱顆粒（ずなわち、ＣＤ１０７ａ）を用量依存的に誘導した（図２Ａ、図２Ｃ）。陽性対照フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ－Ｍ）は、全ての免疫細胞を活性化でき（図３Ａ～３Ｄ、３Ｉ～３Ｌ）、それらが免疫原としての可能性を保持することを示した。Ｖδ２γδＴ細胞のＩＦＮγ産生及び脱顆粒は、ＨＭＢＰＰでの前処理と比較して、ＸＣ１及びＸＤ１で前処理したＲａｊｉ細胞によって、より強力に誘導された（図２Ａ、図２Ｃ）。
実施例４に記載のとおりに、３つのプロドラッグを、リツキシマブ又は非結合アイソタイプ対照と、切断可能なリンカーを介して複合化した。ＣＤ２０ターゲティングＡＤＣ－ＸＣ４－ｒ、ＡＤＣ－ＸＤ４－ｒ及びＡＤＣ－ＸＤ１３－ｒとプレインキュベートしたＲａｊｉ細胞は、Ｖδ２γδＴ細胞によるＩＦＮγ産生を、それぞれ１６９ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２６２２ｎｇ／ｍｌの平均ＥＣ５０で、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）を、それぞれ５１．３ｎｇ／ｍｌ、４５．５、４７０ｎｇ／ｍｌの平均ＥＣ５０で、用量依存的に誘導した（図４、図５Ａ、図５Ｂ、図６，表３）。それぞれの非結合対照ＡＤＣ－ＸＣ４－ｉ及びＡＤＣ－ＸＤ４－ｉは、Ｖδ２γδＴ細胞活性化を誘導する作用が小さく、かつ非結合対照ＡＤＣ－ＸＤ１３－ｉはＶδ２γδＴ細胞のＩＦＮγ産生も脱顆粒も誘導しなかったので、強力なＶδ２γδＴ細胞活性化は、標的細胞媒介ＡＤＣ活性化に依存した（図４）。
予測のとおり、ＣＤ２０結合抗体リツキシマブで前処理したＲａｊｉ細胞もＶδ２γδＴ細胞を活性化した。しかし、リツキシマブ－ＡＤＣは、リツキシマブ自体より多くのＶδ２γδＴ細胞において脱顆粒及びＩＦＮγ産生を誘導し（図５Ｃ、図５Ｄ）、細胞あたりの高いＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγ発現も誘導した（図５Ｅ、図５Ｆ、図６）。
リツキシマブで前処理したＲａｊｉ細胞は、おそらくＮＫ細胞で発現することがよく知られているＦｃγＲを介して、ＮＫ細胞も活性化した。ＡＤＣで前処理したＲａｊｉ細胞は、活性化されたＮＫ細胞の割合を更に増強しなかった（図４Ｂ、図４Ｆ）。これらの結果は、腫瘍細胞のＣＤ２０結合ＡＤＣでの前処理が、リツキシマブよりも、用量依存的、かつ、より強力に、Ｖδ２γδＴ細胞のＩＦＮγ誘導及び脱顆粒をもたらし、標的との結合と内部移行に依存して、この出願のＡＤＣが、抗腫瘍免疫応答を向上できることを示した。ＡＤＣは、おそらく十分に説明されたＦｃγＲ相互作用により他の免疫細胞を活性化する活性Ｆｃテールを有する。
Figure 2024524363000052
実施例２４ さまざまなｐＡｇ複合体が誘導するＶδ２γδＴ細胞活性
複数の合成ホスホ抗原（ｐＡｇ）複合体をリツキシマブ（抗ＣＤ２０）と結合させ、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞と一晩インキュベーションした後に、Ｖδ２γδＴ細胞を選択的に活性化する能力を試験した。試験を行った複合体は、表１に記載した。前処理したＲａｊｉ細胞をＰＢＭＣと共培養し、Ｖδ２γδＴ細胞、Ｖδ１γδＴ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化（ＩＦＮγ及びＴＮＦα産生）及び脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）を、実施例２３に記載のとおりに、マルチカラーフローサイトメトリーを用いて決定した。
材料及び方法
細胞結合
Ｒａｊｉ細胞を、実施例２３に記載のとおりに培養した。９６ウェルプレートにおける細胞結合について、１００，０００Ｒａｊｉ細胞／ウェルを、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×、０．１％v/w ＢＳＡ、０．０２％v/v アジ化ナトリウム（ＮａＮ３））で２回洗浄し、続いて、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した、さまざまな濃度のｐＡｇ複合体、抗体（例．リツキシマブ）単独、又は非結合アイソタイプ対照ｐＡｇ複合体を１ウェルにつき５０μＬ加えた。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。その後、ＡＰＣ複合体型二次Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的、Jackson Immuno research, 109-136-098, １：６０００又は１：５００）を１ウェルにつき５０μＬ加えた。４℃で３０分後、細胞を２回洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬ中に再懸濁した。蛍光強度を、FACSVerse又はFACSymphony（BD Biosciences）を用いるフローサイトメトリーで決定し、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として示した。曲線を、GraphPad Prism version 9において、可変勾配（４変数）の非線形回帰によりフィッティングさせた。ＥＣ５０を、GraphPad Prismにおいて曲線のボトムとトップの間の応答の中間の濃度（μｇ／ｍＬ）として計算した。結合実験は、２又は３回実施した。
直接的な化合物関連細胞死の決定
Ｒａｊｉ細胞を、９６ウェルプレート（９０μＬ／ウェル、１０００細胞／ウェル）又は３８４ウェルプレート（４５μＬ／ウェル、５００細胞／ウェル）におけるＣＧＭ（完全増殖培地、RPMI-1640（Gibco-Life Technologies; Carlsbad, CA）、１０％熱不活化（ＨＩ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco-Life Technologies; Carlsbad, CA）及び８０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Gibco-Life Technologies; Carlsbad, CA）を添加）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターでインキュベートした。一晩のインキュベーション後、さまざまな濃度の抗体（例．リツキシマブ）、ｐＡｇ複合体又は対照化合物（毒素（デュオカルマイシン型）：シクロプロピルＤＣ１）を１０μＬ又は５μＬ加えた。６日後に、Promega Corporation（Madison, WI）製のCellTiter-Glo（商標）（ＣＴＧ）ルミネセンスアッセイキットを製造元の使用説明書に従い、代謝活性を評価した。細胞生存率は、未処理細胞又はビヒクル処理細胞（増殖培地のみ又は１％ＤＭＳＯ）の平均に１００を掛けたものに対する生存率として表した。効力は、用量反応曲線（ＤＲＣ）のボトムを１００％から引くことで計算した。
機能アッセイ（さまざまなｐＡｇ複合体で誘導されるγδＴ細胞活性の決定）
機能アッセイを、実施例２３に開示したように実施した。大半の実験では、抗ＩＦＮγ ＢＶ６５０に加えて、抗ＴＮＦα ＰＥ（BD Biosciences, San Jose, CA, USA, clone Mab11）も細胞内サイトカイン染色工程に含めた。Ｒａｊｉ細胞の前処理で使用した最も高い化合物濃度は、抗体／複合体について１５０μｇ／ｍＬであった。ＥＣ５０を、GraphPad Prismにおいて曲線のボトムとトップの間の応答の中間の濃度（μｇ／ｍＬ）として計算した。まとめたグラフにおいて、「（細胞）活性化率（％）」、並びにＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ及びＴＮＦα ＭＦＩは、最も高い化合物濃度（例．抗体及びｐＡｇ複合体の場合は１５０μｇ／ｍＬ、又は、最も高い化合物のデータに技術的な問題が発生した場合は３０μｇ／ｍＬ若しくは６μｇ／ｍＬ）で前処理したＲａｊｉ細胞と共培養した試料から決定した。
結果／結論
リツキシマブ－複合体は、リツキシマブより高い効力及び作用強度でＶδ２γδＴ細胞を活性化する
リツキシマブ及び非結合対照と結合した複数のｐＡｇ複合体を、約２の薬物抗体比で製造した。それらのＲａｊｉ細胞との結合はリツキシマブ単独（表４）に匹敵し、非結合アイソタイプ対照は結合を示さなかった。ｐＡｇ複合体がＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ腫瘍細胞に対し直接的に細胞毒性を示すかどうかも確認した。さまざまな濃度の、ｐＡｇ複合体、ＡＤＣ－ＸＣ４－ｒ、ＡＤＣ－ＸＤ４－ｒ、ＡＤＣ－ＸＤ－１３－ｒ、ＡＤＣ－ＸＳ２－ｒ、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒ、ＡＤＣ－ＸＣ９－ｒ、ＡＤＣ－ＸＣ１３－ｒ、ＡＤＣ－ＸＳ７－ｒ、ＡＤＣ－ＸＳ１２－ｒ、ＡＤＣ－ＸＳ１７及びＡＤＣ－ＸＳ２２－ｒ、並びにそれぞれの非結合対照ｐＡｇ複合体を、Ｒａｊｉ細胞と６日間インキュベートし、細胞生存率を、CellTiter-Glo（登録商標）を用いて求めた。試験を行ったｐＡｇ複合体、ＨＭＢＰＰ及びゾレドロネートのいずれも、実質的な（＞１５％）直接的化合物関連細胞死を誘導しなかったが、陽性対照であるデュオカルマイシン型毒素は非常に有効であった（図７）。したがって、他のｐＡｇ複合体は試験を行わなかった。
Figure 2024524363000053
製造したｐＡｇ複合体を、Ｒａｊｉ細胞と一晩インキュベーションし、続いて、Ｖδ２γδＴ細胞を含むＰＢＭＣと共培養を６時間した後に、選択的Ｖδ２γδＴ細胞活性化を誘導する能力を試験した。Ｖδ２γδＴ細胞の脱顆粒、ＩＦＮγ及びＴＮＦα産生についての用量反応曲線を作成した（図８におけるＣＤ１０７ａ産生により例示）。これらの結果は、非結合アイソタイプ対照ｐＡｇ複合体で前処理したＲａｊｉ細胞は、Ｖδ２γδＴ細胞を活性化する程度は小さく、ＥＣ５０が信頼性をもって計算できないことが示された。リツキシマブｐＡｇ複合体について、ＥＣ５０及び効力を計算した（表５～１０）。箱ひげ図は、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ及びＴＮＦα ＥＣ５０、効力、並びにＭＦＩの概要を示す（図９）。ｐＡｇ複合体が誘導した脱顆粒は、ＩＦＮγ産生と相関した（図１０）。ＴＮＦα産生は、全ての実験で評価しなかったため、このサイトカインの相関グラフは作成しなかった。
図８～図１０及び表５～表１０が示した結果は、ｐＡｇ複合体で前処理したＲａｊｉ細胞が、用量依存的にＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ及びＴＮＦα産生を誘導し、その産生が、リツキシマブによる前処理と比較した場合、ＡＤＣ－ＸＤ６５－ｒ（より高いＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ及びＴＮＦαのＥＣ５０）、ＡＤＣ－ＸＤ４４－ｒ（より高いＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγのＥＣ５０）、並びにＡＤＣ－ＸＤ１３－ｒ及びＡＤＣ－ＸＳ１２－ｒ（より高いＩＦＮγのＥＣ５０）を除く大半のｐＡｇ複合体についてより強力（低いＥＣ５０）であったことを示している。ＡＤＣ－ＸＤ６５－ｒを除く全てのｐＡｇ複合体は、リツキシマブよりも多くのＶδ２γδＴ細胞を活性化（活性化率（％））し、産生されたサイトカイン及び脱顆粒の量（ＭＦＩ）はより多かった。全体として、これらの結果は、ｐＡｇ複合体とプレインキュベートしたＲａｊｉ細胞が、Ｖδ２γδＴ細胞を強力かつ効果的に活性化することを示した。
大半のｐＡｇ複合体は、Ｖδ２γδＴ細胞活性の誘導において強力かつ効果的であったが、ＡＤＣ－ＸＤ６５－ｒはリツキシマブより強力でも効果的でもなかった。したがって、この化合物のＤＡＲ８を製造した。Ｒａｊｉ細胞で前処理した場合、ＡＤＣ８－ＸＤ６５－ｒは、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ及びＴＮＦα産生で測定するＶδ２γδＴ細胞活性化の誘導において、ＡＤＣ－ＸＤ６５－ｒと比較してより強力かつ効果的であった（図１１）。したがって、ＤＡＲを増加させることは、活性が弱いｐＡｇ複合体の活性の改善につながる。
Figure 2024524363000054
Figure 2024524363000055
Figure 2024524363000056
Figure 2024524363000057
Figure 2024524363000058
Figure 2024524363000059
実施例２５ ｐＡｇ ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒで前処理したＶδ２γδＴ細胞によるＲａｊｉ細胞の効果的殺傷
Ｖδ２γδＴ細胞は、リツキシマブのような治療用抗体でオプソニン化された腫瘍細胞を、δＴ細胞で発現したＣＤ１６（古典的な抗体依存性細胞傷害、ＡＤＣＣ）によって、溶解すると考えられる（Sabrina Braza et al., 2011, Haematologica, 96(3), 400-407）。しかし、全てのγδＴ細胞がＣＤ１６を発現するとは限らない（Sabrina Braza et al, 前掲）。Ｖδ２γδＴ細胞は、高レベルのｐＡｇを有する腫瘍細胞を強力に殺傷することもできる。これらのｐＡｇは、細胞内でＢＴＮ３Ａ１／ＢＴＮ２Ａ１受容体複合体の立体構造の変化を誘導し、γδＴ細胞を活性化し、標的細胞を殺傷する（Rigau et al., 前掲）。この例では、腫瘍ターゲティング抗体がｐＡｇを腫瘍細胞へ送達する媒体として使用でき、Ｖδ２γδＴ細胞による特異的な腫瘍細胞殺傷につながるかどうかを確認した。このため、Ｒａｊｉ細胞をリツキシマブｐＡｇ複合体で前処理し、Ｖδ２γδＴ細胞と１時間共培養した後に、細胞毒性を調べた。
材料及び方法
γδＴ細胞増殖
多数のＶδ２γδＴ細胞を得るために、標準プロトコールを用いて、ＩＬ－２及びゾレドロネートでＶδ２γδＴ細胞を増殖させた（Kondo et al., 2008, Cytotherapy, 10(8):842-56. doi: 10.1080/14653240802419328）。健康なドナーのバフィーコートから単離した凍結ＰＢＭＣ（Sanquin, Nijmegen, The Netherlands）を解凍し、１０００国際単位（ＩＵ）の組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－２（Miltenyi, 130-097-746）と５μＭのゾレドロネート（Merck）に加えた、CTS（商標）OpTmizer（商標）Ｔ細胞増殖無血清培地（ＣＴＳ培地、Gibco, A3705001；基本培地及び濃縮培地は、製造元の使用説明書に従って使用前にあらかじめ混合し、１０％熱不活化（ＨＩ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco）、８０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Gibco）及びグルタマックス（Gibco）を添加）１０ｍＬが入ったＴ２５に、１２５０万細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで３日間培養した。３日後、細胞をＴ７５フラスコへ移し、１０００ＩＵのｒｈＩＬ－２を添加したＣＴＳ培地を加えた。８日目、細胞をＴ１７５フラスコへ移し、１０００ＩＵのｒｈＩＬ－２を添加したＣＴＳ培地を加えた。１３日又は１４日後、細胞の純度と表現型をフローサイトメトリーにより評価した。Ｖδ２γδＴ細胞の純度は、使用した９人の健康なドナーの生細胞に対して、６７．３、８１．７、８２．８、８４．５、８７、９０．６、９１．２、９２及び９５．４％であった。１４日後、増殖したＶδ２γδＴ細胞で殺傷アッセイを行った。このため、細胞をペレット化し、完全増殖培地（ＣＧＭ；RPMI-1640 (Gibco)、１０％熱不活化（ＨＩ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco）及び８０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Gibco）を添加）で２００万細胞／ｍＬに再懸濁した。
増殖させたＶδ２γδＴ細胞の表現型及び純度を決定するために、５００，０００細胞／ウェルをＵ底９６ウェルプレートに加え、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １×、０．１％v/w ＢＳＡ、０．０２％v/v アジ化ナトリウム（ＮａＮ３））で２回洗浄し、細胞ペレットを、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した抗体カクテル：抗Ｖδ２ ＢＶ７１１（clone B6, Biolegend, 1:300）、抗ＣＤ５６ AlexaFluor647（clone B159, BD Bioscience, 1:200）、抗ＣＤ１６ ＦＩＴＣ（clone 3G8, BD Biosciences, 1:50）、生死判別染色７８０（ThermoFisher Scientific, 1:1000）、１００μＬ中に再懸濁した。暗所、氷上で３０分間インキュベーションした後、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、続いて、３００×ｇで３分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬ中に再懸濁し、BD FACSymphony A3細胞アナライザー（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で分析した。FlowJo V10.7により更に分析した。Ｖδ２γδＴ細胞は、生きているＶδ２＋細胞として定義した。
殺傷アッセイ
Ｒａｊｉ細胞を、実施例２３に記載のとおりに培養した。
殺傷アッセイについて、Ｒａｊｉ細胞を、まず、ＰＢＳ（Gibco, 2326202）で２回洗浄し、その後、暗所、３７℃で、１０μＭ細胞増殖色素eFluor 450（Thermofisher Scientific, 65-0842-85）によって１０分間標識した。４～５倍量のＣＧＭを氷上で５分間かけて添加した後、細胞を、１０％ＨＩ－ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ－１６４０で３回洗浄し、ＣＧＭで２００．０００細胞／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ウェルを９６ウェルプレート（Greiner Bio-one, 650185, U-bottom）に播種した。その後、ＣＧＭで希釈した、さまざまな濃度のリツキシマブ－ｐＡｇ複合体、リツキシマブ、又は、０．１ｍＭ若しくは０．０１３ｍＭのＨＭＢＰＰを、１ウェルにつき５０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで１６時間インキュベートした。使用したＨＭＢＰＰの濃度が、最大効力を誘導することが示された点に留意されたい（データは示さず）。１６時間後、１ウェルにつきＣＧＭを１００μｌ加え、細胞を３００×ｇの遠心分離でペレット化し、上清を除去し、１００，０００個の増殖したＶδ２γδＴ細胞（培養１４日目）を各ウェルへ１ウェルにつき５０μＬ加えた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで、１時間インキュベートした。その後、細胞を、３００×ｇで３分間の遠心分離によりペレット化し、上清を除去した。細胞を、抗ＣＤ１９ ＦＩＴＣ（Miltenyi 130-113-645）を加えた生死判別染色７８０（BD Biosciences, １０００× 氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で希釈）５０μＬ中に再懸濁し、暗所、氷上で３０分間インキュベートし、細胞を、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬの添加及び３００×ｇで３分間の遠心分離により、洗浄した。その後、細胞ペレットを、BD cytofix溶液（554655）５０μＬに再懸濁し、暗所、氷上で１５分間のインキュベーションした後、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬで２回洗浄し、遠心分離（３００×ｇ、３分）して上清を除去した。最後に、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬ中に再懸濁し、BD FACSymphony A3細胞アナライザー（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で分析した。Ｒａｊｉ細胞を、eFluor450色素を用いてゲーティングし、死んだＲａｊｉ細胞の割合を、生死判別染色で決定した。FlowJo V10.7により更に分析した。
効力＝最高濃度の化合物で前処理した死んだＲａｊｉ細胞の割合（％）－化合物を添加しないで前処理した死んだＲａｊｉ細胞の割合（％）
結果／結論
Ｒａｊｉ細胞をリツキシマブで前処理した場合、大半のドナーに由来する増殖させたＶδ２γδＴ細胞によって用量依存的な殺傷が検出された（図１２）。リツキシマブ効力は変動し、予測のとおり、Ｖδ２γδＴ細胞上のＣＤ１６の発現と相関し、ドナー間で大きく変動した（図１２Ｂ）。リツキシマブによる前処理が誘導した効力は、ＨＭＢＰＰ前処理と比較して、常に低かった。Ｖδ２γδＴ細胞を、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒで前処理したＲａｊｉ細胞に曝露した場合、用量依存的なＲａｊｉ細胞の殺傷が観察され、その効力は、ＨＭＢＰＰで前処理したＲａｊｉ細胞と同様の範囲で、リツキシマブよりも高かった（図１２Ａ及び図１２Ｄ）。非結合アイソタイプｐＡｇ複合体の活性は低く、Ｖδ２γδＴ細胞活性化についての信頼できるＥＣ５０の計算ができなかった（図１２Ａ及び図１２Ｃ）。全体として、これらの結果は、リツキシマブｐＡｇ複合体が、ＴＡＡに特異的な様式で、強力かつ効果的に、腫瘍細胞を、Ｖδ２γδＴ細胞による破壊の標的にできることを示している。
実施例２６ さまざまなＢ細胞悪性腫瘍に由来したＣＤ２０陽性細胞株は、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒとのプレインキュベーション後、Ｖδ２γδＴ細胞を強力かつ効果的に活性化する
ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒの活性を、ＣＤ２０の発現レベルが異なるＢ細胞悪性腫瘍（ＣＬＬ、ＮＨＬ）を代表する複数のＣＤ２０陽性細胞株を用いて試験した（表１１）。これについて、そのＢ細胞株を、最初に１６時間、化合物で前処理し、その後、ＰＢＭＣと共培養した。Ｖδ２γδＴ細胞の活性化を、脱顆粒のレベル（ＣＤ１０７ａ産生）を決定することにより評価した。
材料及び方法
機能アッセイ
Ｒａｊｉ細胞を実施例２３に記載のとおりに培養した。ヒト腫瘍細胞株ＭＥＣ－１、ＨＧ－３、ＳＵ－ＤＨＬ－４及びＳＵ－ＤＨＬ－８細胞は、German collection of Microorganisms and cell cultures GmbH（ＤＳＭＺ、Leibniz Institute, Germany）から得た。ＨＧ－３及びＳＵ－ＤＨＬ－４細胞を、ＣＧＭ中で培養した。ＳＵ－ＤＨＬ－８を、２０％熱不活化（HI）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco）及び８０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Lonza）を追加したＲＰＭＩ－１６４０（Lonza）中で培養した。ＭＥＣ－１細胞を、１０％熱不活化（ＨＩ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco- Life Technologies; Carlsbad, CA）及び８０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Lonza Group Ltd, Basel Switzerland）を追加したＩＭＤＭ（12-722F, IMDM, Lonza）中で培養した。全ての細胞を、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで３７℃に維持し、週２回、継代した。
機能アッセイの材料及び方法については、脱顆粒レベルのみを求め、ＩＦＮγ発現レベルを求めなかったことを除いて、実施例２３を参照されたい。したがって、実験の３日目、細胞をBD Perm/washとインキュベーションする前に、BD FACSymphony A3細胞アナライザー（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で直接的に分析した。Ｒａｊｉ細胞の前処理に用いた最も高い化合物濃度は、抗体／ＡＤＣについて１５０μｇ／ｍＬ、ＨＭＢＰＰについて０．１ｍＭであった。ＥＣ５０を、GraphPad Prismにおいて曲線のボトムとトップの間の応答の中間の濃度（μｇ／ｍＬ）として計算した。まとめたグラフにおいて、「Ｖδ２γδＴ細胞活性化率（％）」は、最も高い化合物濃度（例．抗体及びＡＤＣで１５０μｇ／ｍＬ）で前処理したＲａｊｉ細胞と共培養した試料から決定した。
ＣＤ２０発現レベルの決定
ＣＤ２０受容体の発現レベルを、ヒトキャリブレーターキット（Biocytex, CP010）を用いて決定した。標的細胞（９６ウェルプレート中に１００，０００細胞／ウェル）を、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％v/w ＢＳＡ＋０．０２％v/v アジ化ナトリウム（ＮａＮ３））で２回洗浄し、続いて、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した、さまざまな濃度のリツキシマブ（抗ＣＤ２０）を１ウェルにつき５０μＬ加えた。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ中に再懸濁した。その後、ヒトキャリブレーターキットからのビーズ５０μＬを、９６ウェルプレートの別個のウェルに加えた。ＡＰＣ複合体型二次Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的、Jackson ImmunoResearch、１：３０００、最終１：６０００）の２倍濃縮ストックを製造し、５０μＬ／ウェルで細胞及びビーズに加えた。暗所、４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞及びビーズを、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬ中に再懸濁した。蛍光強度を、FACSymphony（BD Biosciences）を用いるフローサイトメトリーにより決定し、受容体の絶対数を、製造元の使用説明書に従って決定した。実験は２回実施した。
結果／結論
この実施例に用いられたＢ細胞株は、ＣＤ２０をさまざまなレベルで発現した（表１１）。
Figure 2024524363000060
試験を行った全てのＢ細胞株は、ＨＭＢＰＰ前処理がＶδ２γδＴ細胞の脱顆粒を誘導したため（図１３Ａ）、Ｖδ２γδＴ細胞を活性化する能力を有した。Ｂ細胞株をさまざまな濃度のＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒで前処理した場合、それらは全て、リツキシマブ自体より高い効力（活性化率（％））及び作用強度で、Ｖδ２γδＴ細胞の強力な活性化を誘導した（図１３Ｂ～１３Ｆ、表１１）。非結合対照ＡＤＣは、Ｖδ２γδＴ細胞活性化を、低い／無視できる作用強度及び効力で誘導した。これらの結果は、ＣＤ２０の発現レベルが低い／高い複数のＢ細胞悪性腫瘍とプレインキュベートした場合に、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｒはＶδ２γδＴ細胞を活性化したが、非結合ｐＡｇ複合体での前処理は、Ｖδ２γδＴ細胞を活性化できなかったことを示した。
実施例２７ トラスツズマブ－ＡＤＣで前処理したＨＥＲ２ｈｉｇｈ細胞はＶδ２γδＴ細胞活性化を誘導する
リツキシマブを超えるｐＡｇ複合体の活性を示すために、リンカー－薬物ＸＤ１８をトラスツズマブと複合化して、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｔを製造した。ＨＥＲ２陽性細胞株（表１２に記載）のこれらの新規のＡＤＣでの前処理及びＰＢＭＣとの共インキュベーションにおいて、Ｖδ２γδＴ細胞活性を決定した。
材料及び方法
機能アッセイ
機能アッセイを、実施例２３に開示したように実施した。抗ＩＦＮγ ＢＶ６５０に加えて、抗ＴＮＦα ＰＥ（BD Biosciences, San Jose, CA, USA, clone Mab11）も、大半の実験において、細胞内サイトカイン染色工程に含めた。Ｒａｊｉ細胞の前処理で使用した最も高い化合物濃度は、抗体／ＡＤＣについて１５０μｇ／ｍＬ、ＨＭＢＰＰについて０．１ｍＭであった。ＥＣ５０を、GraphPad Prismにおいて曲線のボトムとトップの間の応答の中間の濃度（μｇ／ｍＬ）として計算した。まとめたグラフにおいて、「Ｖδ２γδＴ細胞活性化率（％）」は、最も高い化合物濃度（例．抗体及びｐＡｇ複合体で１５０μｇ／ｍＬ）で前処理したＲａｊｉ細胞と共培養した試料から決定した。
ヒト腫瘍細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＯＶ－３は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、Rockville, MD）から、ＨＣＴ－１１６はGerman collection of Microorganisms and cell cultures GmbH（ＤＳＭＺ、Leibniz Institute, Germany）から入手した。ＢＴ－４７４（ＡＴＣＣ；ATCC-HTB-20）をＣＧＭ中で培養し、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持し、週２回、継代した。ＳＫ－ＢＲ－３、ＳＫ－ＯＶ－３及びＨＣＴ－１１６を、１０％v/w ＦＢＳ ＨＩ及び８０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Lonza）を含有するMcCoys 5A培地（Lonza）中で維持した。
ＨＥＲ２発現レベルの決定
トラスツズマブを用いて、細胞上のＨＥＲ２レベルを決定するように調整した実施例２５を参照されたい。実験は２回実施し、平均ｓＡＢＣを報告する。
結果／結論
これらの細胞株は、高い（ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３及びＳＫ－ＯＶ－３）、又は低い（ＨＣＴ－１１６）レベルのＨＥＲ２を発現した（表１２）。
Figure 2024524363000061
４つの異なる細胞株を、まず、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｔ、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｉ又はトラスツズマブとプレインキュベートし、その後、Ｖδ２γδＴ細胞を含むＰＢＭＣと共培養し、免疫細胞の活性化を決定した。代表するドナーからの結果を図１４に示し、全てのドナーの作用強度（ＥＣ５０）及び効力を図１５にまとめた。トラスツズマブとプレインキュベートしたＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３及びＳＫ－ＯＶ－３細胞は、Ｖδ２γδＴ細胞の活性化を、おそらくトラスツズマブ－ＦｃγＲ相互作用により、用量依存的様式で誘導した。トラスツズマブで前処理したＨＣＴ－１１６細胞は、ＨＣＴ－１１６細胞の細胞表面上の少数のＨＥＲ２受容体のために、Ｖδ２γδＴ細胞を顕著に活性化できなかったと考えられる（表１２）。ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３及びＳＫ－ＯＶ－３細胞とプレインキュベートした場合、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｔは、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）、ＩＦＮγ及びＴＮＦα産生を、トラスツズマブそれ自体より多いＶδ２γδＴ細胞において誘導した。ＨＣＴ－１１６細胞は、ＡＤＣ－ＸＤ１８－ｔとプレインキュベートした場合、Ｖδ２γδＴ細胞を活性化できなかった。これは、ＨＭＢＰＰで前処理したＨＣＴ－１１６がＶδ２γδＴ細胞を活性化できたため（図１６）、Ｖδ２γδＴ細胞を活性化するＨＣＴ－１１６細胞の能力の欠如のためではなかった。ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、ＳＫ－ＯＶ－３及びＨＣＴ－１１６細胞の非結合アイソタイプ対照－ＡＤＣによる前処理では、Ｖδ２γδＴ細胞の活性化は無視できるか、その程度は小さかった（図１４に例示）。トラスツズマブで前処理したＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３及びＳＫ－ＯＶ－３は、おそらくＮＫ細胞で発現することがよく知られているＦｃγＲを介して、ＮＫ細胞も活性化した。トラスツズマブｐＡｇ複合体で前処理したＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３及びＳＫ－ＯＶ－３細胞も、ＮＫ細胞を、類似した程度で活性化でき（図１７）、トラスツズマブにより誘導されるエフェクター機能が、ｐＡｇ複合体の付加後も損なわれないことを示した。ＨＣＴ－１１６細胞は、トラスツズマブ又はトラスツズマブ－ＡＤＣとプレインキュベーションした後、ＮＫ細胞を顕著に活性化せず、免疫細胞を活性化するには、ＨＥＲ２の発現レベルは、この細胞株では低すぎることが再び示された。全体として、これらの結果は、ｐＡｇ複合体が、複数の悪性腫瘍を標的とするさまざまな腫瘍ターゲティング抗体と結合して、Ｖδ２γδＴ細胞活性化を誘導できることを示している。
実施例２８ 高いｐＡｇ薬抗体比（ＤＡＲ）は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現が低い細胞に対するＶδ２γδＴ細胞の活性を向上させる
ＤＡＲを増加させることが、特にＴＡＡが少数の細胞株おいて、Ｖδ２γδＴ細胞を強力かつ効果的に活性化するかどうかを調べた。
材料及び方法
Ｖδ２γδＴ細胞活性化アッセイ
機能アッセイ
Ｒａｊｉ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を抗体／ＡＤＣ／対照で１６時間又は４０時間前処理することを除いて、実施例２３に開示したように機能アッセイを実施した（表１３）。さらに、ＣＤ１０７ａ脱顆粒のレベルのみを決定し、ＩＦＮγ発現のレベルは決定しなかった。したがって、実験の３日目、細胞を、BD Perm/washとインキュベーションする前に、BD FACSymphony A3細胞アナライザー（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で直接分析した。Ｒａｊｉ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞の前処理に用いた最も高い化合物濃度は、抗体／ＡＤＣで１５０μｇ／ｍＬ、ＨＭＢＰＰで０．１ｍＭであった。ＥＣ５０を、GraphPad Prismにおいて曲線のボトムとトップの間の応答の中間の濃度（μｇ／ｍＬ）として計算した。まとめたグラフにおいて、「Ｖδ２γδＴ細胞活性化率（％）」は、最も高い化合物濃度（例．抗体及びＡＤＣで１５０μｇ／ｍＬ）で前処理したＲａｊｉ細胞又はＭＯＬＭ－１３細胞と共培養した試料から決定した。
Figure 2024524363000062
ＣＤ１２３発現レベルの決定
ＣＤ１２３受容体の発現レベルを、Qifiキット（DAKO, agilent, USA）を用いて決定した。細胞（９６ウェルプレート中に１００，０００細胞／ウェル）を、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％v/w ＢＳＡ＋０．０２％v/v アジ化ナトリウム（ＮａＮ３））で２回洗浄し、続いて、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で希釈したさまざまな濃度の抗ＣＤ１２３（clone 6H6, ThermoFisher Scientific）を１ウェルにつき５０μＬ加えた。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中のＡＰＣ複合体型二次Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的、Jackson ImmunoResearch、最終１：６０００）５０μＬに再懸濁した。二次抗体の希釈液を、Qifiキットからのペレット化ビーズにも加えた。二次抗体とのインキュベーションを、暗所、氷上、４℃で３０分間実施し、その後、細胞及びビーズを、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬ中に再懸濁した。蛍光強度を、FACSVerse又はFACSymphony（BD Biosciences）を用いるフローサイトメトリーにより決定し、受容体の絶対数を、製造元の使用説明書に従って決定した。
ＭＯＬＭ－１３細胞及びＲａｊｉ細胞培養
Ｒａｊｉ細胞を、実施例２３に記載のとおりに培養した。ＣＤ１２３陽性急性単球性白血病細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＤＳＭＺ、ACC 554, the German collection of Microorganisms and cell cultures GmbH（Leibniz Institute, Germany））をＣＧＭ中で培養し、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持し、週２回、継代した。
結果／結論
ＭＯＬＭ－１３細胞株は、ＣＤ１２３の発現が低レベルであった（表１４）。Ｒａｊｉ細胞のＣＤ２０発現レベルを表１２に示す。
Figure 2024524363000063
ＭＯＬＭ－１３細胞とＲａｊｉ細胞のいずれも、ＨＭＢＰＰでの前処理後、Ｖδ２γδＴ細胞を活性化できた（図１８Ａ）。製造したｐＡｇ複合体及び対照化合物を、ＭＯＬＭ－１３細胞又はＲａｊｉ細胞と一晩インキュベーションし、続いて、Ｖδ２γδＴ細胞を含むＰＢＭＣと６時間共培養した後に、選択的Ｖδ２γδＴ細胞活性化を誘導する能力を試験した。Ｖδ２γδＴ細胞の脱顆粒についての用量反応曲線を作成した（図１８Ｂ～１８Ｅ）。これらの結果は、非結合アイソタイプ対照ｐＡｇ複合体で前処理した細胞がＶδ２γδＴ細胞を活性化する程度が小さかったことを示した。したがって、ＥＣ５０値が信頼性をもって計算できなかった。リツキシマブ／抗ＣＤ１２３４１Ｃ ＭｏＡｂ ｐＡｇ複合体について、ＥＣ５０、効力及びＭＦＩを計算した（図１８Ｆ～Ｈ）。
抗ＣＤ１２３４１Ｃ ＭｏＡｂで前処理したＭＯＬＭ－１３細胞をＰＢＭＣと共培養した場合、Ｖδ２γδＴ細胞の活性化は、４人のドナーのうち３人で測定されなかった。ＡＤＣ－ＸＤ１８－ＣＤ１２３４１Ｃで前処理したＭＯＬＭ－１３細胞をＰＢＭＣと共培養した場合、活性化されたＶδ２γδＴ細胞の割合は増加した。加えて、細胞あたりの産生されたＣＤ１０７ａの量は、ｍＡｂ単独と比較してｐＡｇ複合体でより高かった（図１８Ｈ）。ＤＡＲを増加させることは、ＣＤ１０７ａ陽性Ｖδ２γδＴ細胞の割合のさらなる増加をもたらした（図１８Ｇ、ＣＤ１２３４１Ｃ ＡＤＣ）。高いＤＡＲは、抗ＣＤ２０に基づくＡＤＣの効力を向上させず（図４Ｇ）、これは、ＤＡＲ２で既に最大活性に達していたためと考えられる。抗ＣＤ２０ ＡＤＣの作用強度は高いＤＡＲで向上したが、非結合アイソタイプ対照の作用強度も向上した。全体として、これらの結果は、抗ＣＤ１２３ ｐＡｇ複合体が、ｍＡｂ単独と比較して、Ｖδ２γδＴ細胞を良く活性化できること、及び、高いＤＡＲが、抗ＣＤ１２３ ｐＡｇ複合体の効力を向上させることを示している。

Claims (25)

  1. 免疫調節部分と共有結合したターゲティング部分を含む複合体であって、前記免疫調節部分がホスホ抗原である、複合体。
  2. 前記ターゲティング部分が腫瘍ターゲティング抗体又はその抗原結合断片である、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記ホスホ抗原が、ピロホスフェート、ピロホスホネート、ビスホスホネート、モノホスフェート若しくはモノホスホネート又はそのプロドラッグであり、かつ、アリルアルコール基を含む、請求項２に記載の複合体。
  4. 前記ターゲティング部分が連結部分を介して前記ホスホ抗原と結合している、請求項１～３のいずれか一項に記載の複合体。
  5. 式Ｉ：
    Ｔｍ－（Ｌ－（ｐＡｇ）ｘ）ｙ （Ｉ）
    （式中、
    Ｔｍは、ターゲティング部分を表し、
    Ｌは、連結部分を表し、
    ｐＡｇは、ホスホ抗原を表し、
    ｘは、連結部分あたりのホスホ抗原の数を表し、かつ１～５の整数であり、
    ｙは、Ｔｍ（ターゲティング部分）あたりのＬ－（ｐＡｇ）ｘの数を表し、かつ１～１０である）
    で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体。
  6. ｙが１～８である、請求項５に記載の複合体。
  7. 前記連結部分が切断可能なリンカーを含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の複合体。
  8. 式（ＩＩ）：
    Figure 2024524363000064
     （式中、
    Ｑは、式ＩＩａ又は式ＩＩｂ：
    Figure 2024524363000065
     で示す構造であり；
    Ｙはハロゲンであり；
    Ｗ１は、Ｎ、ＣＨ又はＣＦ、好ましくはＣＨであり；
    Ｗ２は、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦ２又はＯであり；
    Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、ＣＨＦ又はＣＦ２であり；
    Ｘ２は、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＦ又はＣＦ２であり；
    Ｘ３は、存在しないか又はＯ若しくはＮＨであり；
    Ｘ４ａ～ｄは、それぞれ独立してＯ及びＳから選択され；
    Ｘ５は、ＣＨ３、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３又はＣＣｌ３であり；
    ｘは、１～５の整数であり；
    ｍは、１、２又は３であり；
    ｎは、０、１又は２であり；
    Ｒ１は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
    Ｒ２は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
    Ｒ３は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
    Ｒ４は、Ｈ、又は、連結部分（Ｌ）、Ｃａｔ＋若しくはプロドラッグ部分との接続部であり；
    ｎが０である場合、Ｒ３とＲ２はＣ１～６（ヘテロ）アルキル基によって接続しており；
    ｎが１又は２である場合、Ｒ３とＲ４はＣ１～６（ヘテロ）アルキル基によって接続している）
    で表される構造を有する、連結部分（Ｌ）と共有結合した１個以上のホスホ抗原を含むリンカー－薬物化合物。
  9. Ｑが式ＩＩａで示す構造である、請求項８に記載のリンカー－薬物化合物。
  10. Ｗ１がＣＨであり、Ｘ５がＣＨ３であり、Ｒ１がＨ又は連結部分（Ｌ）との接続部である、請求項９に記載のリンカー－薬物化合物。
  11. Ｘ３がＯであり、Ｒ３が切断可能な連結部分との接続部であり、Ｒ１がＨである、請求項９又は１０に記載のリンカー－薬物化合物。
  12. Ｗ２がＣＨ２であり、ｍが１である、請求項８～１１のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  13. Ｘ１がＣＨ２である、請求項８～１２のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  14. Ｘ３がＯであり、Ｒ３が切断可能な連結部分との接続部であり、Ｗ１がＣＨであり、Ｘ５がＣＨ３であり、Ｒ１がＨであり、Ｗ２がＣＨ２であり、ｍが１であり、Ｘ１がＣＨ２である、請求項９～１３のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  15. ｎが０又は１であり、Ｘ４ａ～ｂ及びＸ４ｃ～ｄ（存在する場合）がＯであり、Ｒ２及びＲ４（存在する場合）がＨである、請求項８～１４のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  16. Ｒ２及びＲ３が、
    － ピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）基及びイソプロピルオキシカルボニルオキシメチル（ＰＯＣ）基、
    － 置換又は非置換（ヘテロ）アリール基、並びに
    － 式ＩＶ又は式Ｖ：
    Figure 2024524363000066
     （式中；
    Ｒａ及びＲａ’は、Ｈ、置換されていてもよいアミノ酸側鎖及び置換されていてもよいＣ１～１４アルキル鎖を含む無極性側鎖から独立して選択され、
    Ｒｂは、Ｈ、ベンジル又は置換若しくは非置換（Ｃ１～８）アルキルであり、
    Ｒｃ及びＲｃ’は、Ｈ、及び、置換されていてもよい、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから独立して選択される）
    で示す構造、
    からなる群から選択されるプロドラッグ部分である、請求項８に記載のリンカー－薬物化合物。
  17. Ｒ２及びＲ３が、ＰＯＭ基及びＰＯＣ基から独立して選択される、請求項１６に記載のリンカー－薬物化合物。
  18. ｎが０であり、Ｒ２が置換若しくは非置換の５員環若しくは６員環（ヘテロ）アリール基で、Ｒ３が式ＩＶ若しくは式Ｖで示す構造であるか、又はその逆である、請求項１６に記載のリンカー－薬物化合物。
  19. 前記連結部分（Ｌ）が、式ＶＩ又は式ＶＩＩ：
    Figure 2024524363000067
     （式中、
    ｍは１～１０の整数、好ましくは５であり；
    ＡＡはアミノ酸、好ましくは天然アミノ酸であり；
    ｐは、０、１、２、３又は４であり；
    ｑは１～１２の整数、好ましくは２であり；
    ＥＳは、存在しないか、又は以下から選択される延長スペーサーである：
    Figure 2024524363000068
     （式中、Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、Ｃ１～４アルキル、Ｃ２～４アルケニル、Ｃ２～４アルキニル、Ｃ１～４アルコキシル又はＣ１～４アルキルチオ、好ましくはＨ、Ｆ、ＣＨ３、ＣＦ３、より好ましくはＨ又はＦであり；
    Ｖは、Ｈ、エチル、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ－ＯＭｅ、ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２Ｍｅ又はＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｍｅ）２であり；
    ｐは１～１２の整数である））
    で示す構造を含む、請求項８～１８のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  20. 以下の構造
    Figure 2024524363000069
     を有する、請求項８に記載のリンカー－薬物化合物。
  21. 請求項１～７のいずれか一項に記載の複合体の製造における、請求項８～２０のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物の使用。
  22. 医薬品として使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の複合体。
  23. がん、自己免疫疾患又は感染症を治療するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の複合体。
  24. 請求項８～２０のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物と複合化された、腫瘍ターゲティング抗体又はその抗原結合断片を含む、複合体。
  25. 請求項１～７のいずれか一項に記載の複合体及び１つ以上の薬学的添加剤を含む、医薬組成物。
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