ES2941768T3 - Compuestos de 2H-pirazolo[4,3-d]pirimidina como agonistas del receptor 7 tipo toll (TLR7) y métodos y usos para los mismos - Google Patents

Compuestos de 2H-pirazolo[4,3-d]pirimidina como agonistas del receptor 7 tipo toll (TLR7) y métodos y usos para los mismos Download PDF

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Abstract

Los compuestos según la fórmula II son útiles como agonistas del receptor tipo Toll 7 (TLR7). (II) Dichos compuestos se pueden usar en el tratamiento del cáncer, especialmente en combinación con un agente de inmunoterapia contra el cáncer, o como adyuvante de vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de 2H-pirazolo[4,3-d]pirimidina como agonistas del receptor 7 tipo toll (TLR7) y métodos y usos para los mismos
Esta solicitud reivindica el beneficio sobre 35 U.S.C. §119(e) de la solicitud provisional de Estados Unidos n.º Ser.
62/714,238, presentada el 3 de agosto de 2018
Antecedentes de la Invención
Esta descripción se refiere a los agonistas del receptor 7 de tipo Toll ("TLR7") y sus conjugados, y a los métodos para la preparación y uso de tales agonistas y sus conjugados.
Los receptores tipo Toll ("TLR") son receptores que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos ("PAMPs", por sus siglas en inglés), que son pequeños motivos moleculares conservados en ciertas clases de patógenos. Los TLRs pueden ubicarse en la superficie de una célula o intracelularmente. La activación de un TLR por la unión de su PAMP afín señala la presencia del patógeno asociado dentro del hospedero, es decir, una infección, y estimula el sistema inmunitario del hospedero para combatir la infección. Los seres humanos tienen 10 TLRs, denominados TLR1, TLR2, TLR3, etc.
La activación de un TLR -siendo el TLR7 el más estudiado- por un agonista puede tener un efecto positivo sobre la acción de las vacunas y los agentes de inmunoterapia en el tratamiento de varias afecciones distintas a la infección por patógenos reales, al estimular la respuesta inmunitaria en general. Por lo tanto, existe un interés considerable en el uso de agonistas de TLR7 como adyuvantes de vacunas o como potenciadores en la inmunoterapia del cáncer. Ver, por ejemplo, Vasilakos y Tomai.2013, Sato-Kaneko et al.2017, Smits et al.2008, y Ota et al.2019.
TLR7, un receptor intracelular ubicado en la membrana de los endosomas, reconoce los PAMPs asociados a los virus de ARN de una sola hebra. Su activación induce la secreción de interferones de Tipo I como el IFNα y el IFNβ (Lund el al. 2004). TLR7 tiene dos sitios de unión, uno para ligandos de ARN de cadena simple (Berghöfer et al.
2007) y uno para moléculas pequeñas como la guanosina (Zhang et al.2016).
TLR7 puede unirse a, y ser activado por, agonistas sintéticos similares a guanosina, como imiquimod, resiquimod y gardiquimod, que se basan en un andamio de 1H-imidazo [4,5-c] quinolina. Para una revisión de los agonistas de TLR7 de moléculas pequeñas, consulte Cortez y Va 2018.
Figure imgf000002_0001
Agonistas de TLR7 sintéticos basados en un andamio molecular de pteridinona también se conocen, como se ejemplifica por vesatolimod (Desai et al.2015).
Figure imgf000002_0002
Se han descrito otros agonistas sintéticos de TLR7 basados en un andamio tipo purina, frecuentemente de acuerdo con la fórmula general (A):
Figure imgf000003_0001
donde R, R' y R" son variables estructurales, con R" que normalmente contiene un anillo aromático o heteroaromático no sustituido o sustituido.
Las descripciones de moléculas bioactivas que tienen un andamio similar a la purina y sus usos en el tratamiento de afecciones como fibrosis, trastornos inflamatorios, cáncer o infecciones patógenas incluyen: Akinbobuyi et al.2015 y 2016; Barberis et al.2012; Carson et al.2014; Ding et al.2016, 2017a, y 2017b; Graupe et al.2015; Hashimoto et al.
2009; He et al.2019a y 2019b; Holldack et al. 2012; Isobe et al. 2009a y 2012; Poudel et al.2019a y 2019b; Pryde 2010; y Young et al.2019.
El grupo R” puede ser piridilo: Bonfanti et al. 2015a y 2015b; Halcomb et al. 2015; Hirota et al.2000; Isobe 2 et al.
002, 2004, 2006, 2009a, 2009b, 2011, y 2012; Kasibhatla et al. 2007; Koga-Yamakawa et al. 2013; Musmuca et al.
2009; Nakamura et al.2012; Ogita et al.2007; y Yu. et al.2013.
Hay descripciones de moléculas relacionadas en las que se modifica el sistema de anillo 6,5 fusionado de la fórmula (A) - un anillo de pirimidina de seis miembros fusionado con un anillo de cinco miembros de imidazol. (a) Dellaria et al. 2007, Jones et al. 2010 y 2012, y Pilatte et al. 2017 describen compuestos en los que el anillo de pirimidina se reemplaza por un anillo de piridina. (b) Chen et al.2011, Coe et al.2017, y Zhang et al.2018 describen compuestos en los que el anillo de imidazol se reemplaza por un anillo de pirazol. (c) Cortez et al.2017 y 2018; Li et al. 2018; y McGowan et al. 2016ª, 2016b y 2017 describen compuestos en los que el anillo de imidazol se reemplaza por un anillo de pirrola.
Bonfanti et al. 2015b y 2016 y Purandare et al.2019 describen moduladores de TLR7 en los cuales los dos anillos de una porción de purina están abarcados por un macrociclo:
Un agonista de TLR7 puede conjugarse con una molécula asociada, que puede ser, por ejemplo, un fosfolípido, un poli(etilenglicol) (“PEG”), un anticuerpo u otro TLR (comúnmente TLR2). Descripciones de ejemplo incluyen: Carson et al.2013, 2015, y 2016, Chan et al.2009 y 2011, Cortez et al.2017, Gadd et al.2015, Lioux et al.2016, Maj et al.
2015, Vernejoul et al. 2014, y Zurawski et al. 2012. Un sitio de conjugación frecuente está en el grupo R” de la fórmula (A).
Jensen et al.2015 describe el uso de vehículos lipídicos catiónicos para el suministro de agonistas de TLR7.
Algunos agonistas de TLR7, incluido el resiquimod, son agonistas duales de TLR7/TLR8. Véase, por ejemplo, Beesu et al.2017, Embrechts et al.2018, Lioux et al.2016, y Vernejoul et al.2014.
Las citas completas de los documentos citados en este documento por el primer autor o inventor y el año se enumeran al final de esta descripción.
Breve Descripción de la Invención
Esta invención se refiere a compuestos que tienen un sistema aromático de 2H-pirazolo [4,3-d] pirimidina, que tienen actividad como agonistas de TLR7.
Figure imgf000003_0002
pirazolo[4,3-d]pirimidina
En un aspecto, se proporciona un compuesto con una estructura de acuerdo con la fórmula II
Figure imgf000004_0001
en donde
cada X1 es independientemente N o CR2;
X2 es O, CH2, NH, S, o N(alquilo C1- C3);
R1 es H, CH3(CH2)1-3, CH3(CH2)0-1O(CH2)2-3, CH3(CH2)0-3C(=O), CH3(CH2)0-1O(CH2)2-3C(=O),
Figure imgf000004_0002
R2 es H, O(alquiloC1-C3), alquilo C1-C3, Cl, F, o CN;
R3 es H, halo, OH, CN, NH2, NH(alquilo C1-C5), N(alquilo C1-C5)2, NH(CH2)0-1(cicloalquilo C3-C6), NH(bicicloalquilo C4-C8), NH(espirocicloalquilo C6-C10), N(cicloalquilo C3-C6)2, NH(CH2)1-3(arilo), N((CH2)1-3(arilo))2, una porción de amina cíclica que tiene la estructura
Figure imgf000004_0003
una porción aromática o heteroaromática de 6 miembros o una porción heteroaromática de 5 miembros; en donde
un alquilo, cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo, amina cíclica, aromática o heteroaromática de 6 miembros, o una porción heteroaromática de 5 miembros es opcionalmente sustituida por uno o más sustituyentes seleccionados de OH, halo, CN, (alquilo C1-C3), O(alquilo C1-C3), C(=O)(Me), SO2(alquilo C1-C3), C(=O)(Et), NH2, NH(Me), N(Me)2, NH(Et), N(Et)2, y N(alquilo C1-C3), (CH2)1-2OH, (CH2)1-2OMe; y una porción de cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo, o amina cíclica puede tener un grupo CH2 sustituido por O, S, SO2, NH, C(=O), N(alquilo C1-C3), NC(=O)(alquilo C1-C3), o N(Boc);
m es 0 o 1;
y
n es 1, 2, o 3.
Los compuestos descritos en el presente documento tienen actividad como agonistas de TLR7 y algunos pueden conjugarse con un anticuerpo para el suministro dirigido a un tejido u órgano objetivo de acción prevista. También pueden PEGilados, para modular sus propiedades farmacéuticas.
Los compuestos descritos en el presente documento, o sus conjugados o sus derivados PEGilados, pueden usarse para tratar de un sujeto que padece una afección susceptible de tratamiento por activación del sistema inmune, administrando a el sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o conjugado del mismo o un derivado PEGilado del mismo, especialmente en combinación con una vacuna o un agente de inmunoterapia contra el cáncer.
Breve Descripción de las Figuras
Las Figuras 1, 2A, 2B, 3, 4A y 4B, muestran esquemas de reacción para preparar compuestos descritos en el presente documento.
Las Figuras 5 y 6 muestran esquemas de reacción para la unión de enlazadores a compuestos de esta descripción, haciéndolos adecuados para la conjugación.
Descripción Detallada de la Invención
DEFINICIONES
"Anticuerpo" significa anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "parte de unión a antígeno") o variantes de cadena única de los mismos. Un anticuerpo completo o de longitud completa es una proteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada que comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (VL o Vk) y una región constante de la cadena ligera que comprende un solo dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse aún más en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones marco más conservadas (FRs). Cada VH y VL comprende tres CDRs y cuatro FRs, dispuestos desde el extremo amino al carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. Las regiones variables contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes pueden mediar la unión del anticuerpo a los tejidos o factores del hospedero, incluidas varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Se dice que un anticuerpo se "une específicamente" a un antígeno X si el anticuerpo se une al antígeno X con una KD de 5 x 10-8 M o menos, más preferiblemente 1 x 10-8M o menos, más preferiblemente 6 x 10-9 M o menos, más preferiblemente 3 x 10-9 M o menos, incluso más preferiblemente 2 x 10-9 M o menos. El anticuerpo puede ser quimérico, humanizado o, preferiblemente, humano. La región constante de cadena pesada puede diseñarse para afectar el tipo o la extensión de la glicosilación, para prolongar la vida media del anticuerpo, para mejorar o reducir las interacciones con las células efectoras o el sistema del complemento, o para modular alguna otra propiedad. La ingeniería se puede realizar mediante la sustitución, adición o eliminación de uno o más aminoácidos o mediante la sustitución de un dominio con un dominio de otro tipo de inmunoglobulina, o una combinación de los anteriores.
"Fragmento de unión a antígeno" y "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo") significan uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa, como (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fab ', que es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (ver, por ejemplo, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, sexta Ed., Saunders Elsevier 2007); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH ; (vii) una región determinante de complementariedad aislada (CDR); y (viii) un nanocuerpo, una región variable de cadena pesada que contiene un único dominio variable y dos dominios constantes. Los fragmentos de unión a antígeno preferidos son los fragmentos Fab, F (ab')2, Fab', Fv y Fd. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite fabricarse como una cadena de proteína única en la que las regiones VL y VH se parean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple o scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Los anticuerpos de cadena única también están incluidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo.
A menos que se indique lo contrario, por ejemplo, con referencia a la numeración lineal en una SEC ID NO: listado, las referencias a la numeración de las posiciones de aminoácidos en una región variable de cadena pesada o ligera de anticuerpo (VH o VL) se ajustan al sistema de Kabat (Kabat et al., "Secuencias de proteínas de interés inmunológico, 5ª ed., Pub. No. 91-3242, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., NIH, Bethesda, Md., 1991, en adelante “Kabat”) y referencias a la numeración de las posiciones de aminoácidos en una región constante de cadena pesada o ligera de anticuerpo (CH1, CH2, CH3 o CL) están de acuerdo con el índice de la UE según lo establecido en Kabat. Ver Lazar et al., US 2008/0248028 A1, para ejemplos del uso. Además, el Sistema de información ImMunoGeneTics (IMGT) proporciona en su sitio web una tabla titulada "Cuadro científico IMGT: Correspondencia entre numeraciones C” que muestra la correspondencia entre su sistema de numeración, la numeración de la UE y la numeración de Kabat para la región constante de la cadena pesada.
Un "anticuerpo aislado" significa un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente al antígeno X está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a otros antígenos distintos del antígeno X). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente al antígeno X puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, como las moléculas del antígeno X de otras especies. En ciertas modalidades, un anticuerpo aislado se une específicamente al antígeno humano X y no reacciona de forma cruzada con otros antígenos del antígeno X (no humano). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.
"Anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" significa una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única, que muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítope particular.
"Anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene regiones variables en las que tanto el marco como las regiones CDR (y la región constante, si está presente) se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir modificaciones posteriores, incluidas modificaciones naturales o sintéticas. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica al sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el "anticuerpo humano" no incluye anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como un ratón, se hayan injertado en secuencias marco humanas.
"Anticuerpo monoclonal humano" significa un anticuerpo que muestra una especificidad de unión única, que tiene regiones variables en las que tanto el marco como las regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.
"Alifático" significa una porción de hidrocarburo no aromático de cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada que tiene el número especificado de átomos de carbono (por ejemplo, como en "alifático C3", " C1-5 alifático ", " C1-C5 alifático, " o " C1 a C5 alifático” las tres últimas frases son sinónimas para un porción alifática que tiene de 1 a 5 átomos de carbono) o, cuando el número de átomos de carbono no se especifica explícitamente, de 1 a 4 átomos de carbono (2 a 4 carbonos en el caso de porciones alifáticas insaturadas). Una comprensión similar se aplica al número de carbonos en otros tipos, como en el alqueno C2-4, cicloalifático C4-C7, etc. En una vena similar, un término como “(CH2)1-3” debe entenderse como la abreviatura para el subíndice 1, 2 o 3, de modo que el término representa CH2, CH2CH2, y CH2CH2CH2.
"Alquilo" significa una porción alifática saturada, con la misma convención para designar el número de átomos de carbono que es aplicable. A modo de ilustración, las porciones alquilo C1-C4 incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, t-butilo, 1-butilo, 2-butilo y similares. "Alquileno" significa una contraparte divalente de un grupo alquilo, como CH2CH2, CH2CH2CH2, y CH2CH2CH2CH2.
"Alquenilo" significa una porción alifática que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono, con la misma convención para designar el número de átomos de carbono que es aplicable. A modo de ilustración, las porciones alqueniloC2-C4 incluyen, pero no se limitan a, etenilo (vinilo), 2-propenilo (alilo o prop-2-enilo), cis-1-propenilo, trans-1-propenilo, E-(o Z) 2-butenilo, 3-butenilo, 1,3-butadienilo (but-1,3-dienilo) y similares.
"Alquinilo" significa una porción alifática que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono, con la misma convención para designar el número de átomos de carbono que es aplicable. A modo de ilustración, los grupos alquiniloC2-C4 incluyen etinilo (acetilenilo), propargilo (prop-2-inilo), 1-propinilo, but-2-inilo y similares.
"Cicloalifático" significa una porción de hidrocarburo no aromática saturada o insaturada que tiene de 1 a 3 anillos, cada anillo tiene de 3 a 8 (preferiblemente de 3 a 6) átomos de carbono. "Cicloalquilo" significa una porción cicloalifática en la que cada anillo está saturado. "Cicloalquenilo" significa una porción cicloalifática en el que al menos un anillo tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. "Cicloalquinilo" significa una porción cicloalifática en el que al menos un anillo tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. A modo de ilustración, las porciones cicloalifáticas incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo y adamantilo. Las porciones cicloalifáticas preferidas son los cicloalquilo, especialmente ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. "Cicloalquileno" significa una contraparte divalente de un grupo cicloalquilo. De manera similar, "bicicloalquileno" y "espirocicloalquileno" (o "espiroalquileno") se refieren a contrapartes divalentes de un grupo bicicloalquilo y espirocicloalquilo/espiroalquilo.
"Heterocicloalifático" significa una porción cicloalifática en donde, en al menos un anillo del mismo, se han reemplazado hasta tres carbonos (preferiblemente de 1 a 2) con un heteroátomo seleccionado independientemente de N, O o S, donde N y S pueden ser opcionalmente oxidados y el N opcionalmente puede ser cuaternizado. Las porciones cicloalifáticas preferidas consisten en un anillo de 5 a 6 miembros de tamaño. De manera similar, "heterocicloalquilo", "heterocicloalquenilo" y "heterocicloalquinilo" significan un cicloalquilo, cicloalquenilo o cicloalquinilo, respectivamente, en donde al menos uno de sus anillos ha sido modificado de este modo. Porciones heterocicloalifáticas de ejemplo incluyen, aziridinilo, azetidinilo, 1,3-dioxanilo, oxetanilo, tetrahidrofurilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidrotiopiranil sulfona, morfolinilo, tiomorfolinilo, tiomorfolinil sulfóxido, tiomorfolinil sulfona, 1,3-dioxolanilo, tetrahidro-1,1-dioxotienilo, 1,4-dioxanilo, tietanilo y similares. "Heterocicloalquileno" significa una contraparte divalente de un grupo heterocicloalquilo.
"Alcoxi", "aliloxi", "alquiltio" y "aliltio" significan O(alquilo), O(arilo), S (alquilo) y S(arilo), respectivamente. Los ejemplos son metoxi, fenoxi, metiltio y feniltio, respectivamente.
"Halógeno" o "halo" significa flúor, cloro, bromo o yodo, a menos que se indique un significado más estrecho.
"Arilo" significa una porción de hidrocarburo que tiene un sistema de anillo mono, bi o tricíclico (preferiblemente monocíclico) en el que cada anillo tiene de 3 a 7 átomos de carbono y al menos un anillo es aromático. Los anillos en el sistema de anillos pueden fusionarse entre sí (como en naftilo) o unirse entre sí (como en bifenilo) y pueden fusionarse o unirse a anillos no aromáticos (como en indanilo o ciclohexilfenilo). A modo de ilustración adicional, las porciones arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, bifenilo, fenantrilo, antracenilo y acenaftilo. "Arileno" significa una contraparte divalente de un grupo arilo, por ejemplo 1,2-fenileno, 1,3-fenileno o 1,4-fenileno.
"Heteroarilo" significa una porción que tiene un sistema de anillo mono, bi o tricíclico (preferiblemente monocíclico de 5 a 7 miembros) en el que cada anillo tiene de 3 a 7 átomos de carbono y al menos un anillo es un anillo aromático que contiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de entre N, O o S, donde el N y S opcionalmente pueden oxidarse y el N opcionalmente puede cuaternizarse. El al menos un anillo aromático que contiene un heteroátomo puede fusionarse con otros tipos de anillos (como en benzofuranilo o tetrahidroisoquinolilo) o directamente unirse a otros tipos de anillos (como en fenilpiridilo o 2-ciclopentilpiridilo). A modo de ilustración adicional, las porciones de heteroarilo incluyen pirrolilo, furanilo, tiofenilo (tienilo), imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, piridilo, N-oxopiridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, cinolinilo, quinozalinilo, naftiridinilo, benzofuranilo, indolilo, benzotiofenilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, fenotiazolilo, benzimidazolilo, benzotriazolilo, dibenzofuranilo, carbazolilo, dibenzotiofenilo, acridinilo y similares. "Heteroarileno" significa una contraparte divalente de un grupo heteroarilo.
Cuando se indique que una porción puede ser sustituida, como por ejemplo mediante el uso de la frase "no sustituido o sustituido" u "opcionalmente sustituido" como en "alquilo C1-C5 no sustituido o sustituido" o "heteroarilo opcionalmente sustituido", la porción puede tener uno o más sustituyentes seleccionados independientemente, preferiblemente de uno a cinco en número, más preferiblemente uno o dos en número. Los sustituyentes y los patrones de sustitución pueden ser seleccionados por un experto en la técnica, teniendo en cuenta la porción a la que está unido el sustituyente, para proporcionar compuestos que sean químicamente estables y que puedan sintetizarse mediante técnicas conocidas en la técnica, así como los métodos establecidos en el presente documento. Cuando una porción se identifica como "no sustituida o sustituida" o "opcionalmente sustituida", en una modalidad preferida, la porción no es sustituida.
"Arilalquilo", alquilo(heterocicloalifático), "arilalquenilo", "arilalquinilo", "bialilalquilo" y similares significan un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo, según sea el caso, sustituido con un arilo, heterocicloalifático, biarilo, etc., porción, según sea el caso, con la valencia abierta (no satisfecha) en la porción alquilo, alquenilo o alquinilo, por ejemplo como en bencilo, fenetilo, N-imidazoiletilo, N-morfolinoetilo y similares. A la inversa, "alquilarilo", "alquenilcicloalquilo" y similares significan una porción arilo, cicloalquilo, etc., según sea el caso, sustituido con una porción alquilo, alquenilo, etc., según sea el caso, por ejemplo como en metilfenilo (tolilo) o alilciclohexilo. "Hidroxialquilo", "haloalquilo", "alquilarilo", "cianoarilo" y similares significan una porción alquilo, arilo, etc., según sea el caso, sustituido con uno o más de los sustituyentes identificados (hidroxilo, halo, etc., según sea el caso).
Por ejemplo, los sustituyentes permisibles incluyen, pero no se limitan a, alquilo (especialmente metilo o etilo), alquenilo (especialmente alilo), alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalifático, heterocicloalifático, halo (especialmente fluoro), haloalquilo (especialmente trifluorometilo), hidroxilo, hidroxialquilo (especialmente hidroxietilo), ciano, nitro, alcoxi, O(hidroxialquilo), O(haloalquilo) (especialmente OCF3), O(cicloalquilo), O (heterocicloalquilo), O(arilo), alquiltio, ariltio, =O, =NH, =N(alquilo), =NOH, =NO(alquilo), -C(=O)(alquilo), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxoalquilol), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)2, -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)(hidroxialquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)O(hidroxialquilo), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)2, azido, -NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(alquilo), -SH, -S(alquilo), -S(arilo), -S(cicloalquilo), -S(=O)alquilo, -SO2(alquilo), -SO2NH2, -SO2NH(alquilo), -SO2N(alquilo)2, y similares.
Cuando la porción sustituida es una porción alifática, los sustituyentes preferidos son arilo, heteroarilo, cicloalifatico, heterocicloalifatico, halo, hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi -O(hidroxialquilo), -O(haloalquilo), -O(cicloalquilo), -O(heterocicloalquilo), -O(arilo), alquiltio, ariltio, =O, =NH, =N(alquilo), =NOH, =NO(alquilo), -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxialquilo), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)2, -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)(hidroxialquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)O(hidroxialquilo), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)2, azido, -NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(alquilo), -SH, -S(alquilo), -S(arilo), -S(=O)alquilo, -S(cicloalquilo), -SO2(alquilo), -SO2NH2, -SO2NH(alquilo), y -SO2N(alquilo)2. Los sustituyentes más preferidos son halo, hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi -O(arilo), =O, =NOH, =NO(alquilo), -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)2, azido, -NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(arilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)2, y -NHC(=NH)NH2. Especialmente preferidos son fenilo, ciano, halo, hidroxilo, nitro, alcoxiC1-C4, O(alquileno C2-C4)OH, y O(alquilenoC2-C4)halo.
Cuando la porción sustituida es una porción cicloalifática, heterocicloalifática, arilo, o heteroarilo, los sustituyentes preferidos son alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, ciano, nitro, alcoxi -O(hidroxialquilo), -O(haloalquilo), -O(arilo), -O(cicloalquilo), -O(heterocicloalquilo), alquiltio, ariltio, -C(=O)(alquilo), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxialquilo), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)2, -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)(hidroxialquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)O(hidroxialquilo), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)2, azido, -NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(arilo), -NH(hidroxialquilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(alquilo), -SH, -S(alquilo), -S(arilo), -S(cicloalquilo), -S(=O)alquilo, -SO2(alquilo), -SO2NH2, -SO2NH(alquilo), y -SO2N(alquilo)2. Sustituyentes más preferidos son alquilo, alquenilo, halo, haloalquilo, hidroxilo, hidroxialquilo, ciano, nitro, alcoxi -O(hidroxialquilo), -C(=O)(alquilo), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(alquilo), -C(=O)O(hidroxialquilo), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(alquilo), -C(=O)N(alquilo)2, -OC(=O)(alquilo), -OC(=O)(hidroxialquilo), -OC(=O)O(alquilo), -OC(=O)O(hidroxialquilo), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(alquilo), -OC(=O)N(alquilo)2, -NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(arilo), -NHC(=O)(alquilo), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(alquilo), -NHC(=O)N(alquilo)2, y -NHC(=NH)NH2. Especialmente preferidos son alquilo C1-C4, ciano, nitro, halo, y alcoxi C1-C4.
Cuando se indica un intervalo, como en “alquilo C1-C5” o “5 a 10 %,” tal intervalo incluye los puntos finales del intervalo, como en C1 y C5 en primera instancia y 5 % y 10 % en segunda instancia.
A menos que los estereoisómeros en particular estén indicados específicamente (por ejemplo, mediante un enlace en negrita o discontinuo en un estereocentro relevante en una fórmula estructural, mediante la representación de un doble enlace que tenga una configuración E o Z en una fórmula estructural, o mediante el uso de nomenclatura o símbolos que designen estereoquímica), todos los estereoisómeros están incluidos dentro del alcance de la invención, como compuestos puros así como mezclas de los mismos. A menos que se indique lo contrario, los racematos, enantiómeros individuales (ya sea ópticamente puros o parcialmente resueltos), diastereómeros, isómeros geométricos y sus combinaciones y mezclas de los mismos están todos abarcados por esta invención. Los expertos en la materia apreciarán que los compuestos pueden tener formas tautoméricas (por ejemplo, formas ceto y enol), formas de resonancia y formas zwitteriónicas que son equivalentes a las representadas en las fórmulas estructurales usadas en este documento y que las fórmulas estructurales abarcan la resonancia tautomérica., o formas zwitterionicas.
"Éster farmacéuticamente aceptable" significa un éster que se hidroliza in vivo (por ejemplo, en el cuerpo humano) para producir el compuesto precursor o una sal del mismo o tiene una actividad per se similar a la del compuesto precursor. Esteres adecuados incluyen alquilo C1-C5, alquenilo C2-C5 o alquinilo C2-C5, especialmente metilo, etilo o n-propilo.
"Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de un compuesto adecuado para la formulación farmacéutica. Cuando un compuesto tiene uno o más grupos básicos, la sal puede ser una sal de adición de ácido, tal como un sulfato, bromhidrato, tartrato, mesilato, maleato, citrato, fosfato, acetato, pamoato (embonato), hidroyoduro, nitrato, clorhidrato, lactato, metilsulfato, fumarato, benzoato, succinato, mesilato, lactobionato, suberato, tosilato y similares. Cuando un compuesto tiene uno o más grupos ácidos, la sal puede ser una sal tal como una sal de calcio, sal de potasio, sal de magnesio, sal de meglumina, sal de amonio, sal de zinc, sal de piperazina, sal de trometamina, sal de litio, sal de colina, sal de dietilamina, sal de 4-fenilciclohexilamina, sal de benzatina, sal de sodio, sal de tetrametilamonio y similares. Las formas cristalinas polimórficas y los solvatos también se incluyen dentro del alcance de esta invención.
"Sujeto" se refiere a un animal, que incluye, pero no se limita a, un primate (ej., humano), mono, vaca, cerdo, oveja, cabra, caballo, gato, conejo, rata o ratón. Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en este documento en referencia, por ejemplo, a un sujeto mamífero, tal como un ser humano.
Los términos “tratar”, “tratando” y “tratamiento”, en el contexto del tratamiento de una enfermedad o trastorno, incluyen aliviar o derogar un trastorno, enfermedad o afección, o uno o más de los síntomas asociados al trastorno, enfermedad o afección; o retardar la progresión, propagación o empeoramiento de una enfermedad, trastorno o afección o de uno o más de sus síntomas. El "tratamiento del cáncer" se refiere a uno o más de los siguientes efectos: (1) inhibición, hasta cierto punto, del crecimiento tumoral, que incluye (i) desaceleración y (ii) detención completa del crecimiento; (2) reducción en el número de células tumorales; (3) mantener el tamaño tumoral; (4) reducción en el tamaño tumoral; (5) inhibición, que incluye (i) reducción, (ii) desaceleración o (iii) prevención completa, de la infiltración de células tumorales en órganos periféricos; (6) inhibición, incluida (i) reducción, (ii) desaceleración o (iii) prevención completa de metástasis; (7) mejora de la respuesta inmune antitumoral, que puede resultar en (i) mantener el tamaño tumoral, (ii) reducción del tamaño tumoral, (iii) disminución del crecimiento tumoral, (iv) reducción, desaceleración o prevención de la invasión y/o (8) alivio, en cierta medida, de la gravedad o el número de uno o más síntomas asociados al trastorno.
En las fórmulas de esta descripción, una línea ondulada.
Figure imgf000009_0001
transversal a un enlace o un asterisco (*) al final del enlace denota un sitio de unión covalente. Por ejemplo, una declaración que R es
Figure imgf000009_0002
o que R es
Figure imgf000009_0003
en la fórmula
Figure imgf000009_0004
significa
Figure imgf000009_0005
En las fórmulas de esta descripción, un enlace que atraviesa un anillo aromático entre sus dos carbonos significa que el grupo unido al enlace puede ubicarse en cualquiera de las posiciones del anillo aromático disponible mediante la eliminación del hidrógeno que está implícitamente allí. A modo de ilustración, la fórmula
Figure imgf000009_0006
representa
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En otras ilustraciones,
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representa
Figure imgf000009_0009
representa
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Los expertos en la materia apreciarán que ciertas estructuras se pueden dibujar en una forma tautomérica u otra, por ejemplo, ceto contra enol, y que las dos formas son equivalentes.
COMPUESTOS
En una modalidad, cualquiera X1 es CR2 o no más de dos X1’s son N en la porción
Figure imgf000010_0002
preferiblemente
Figure imgf000010_0003
Preferiblemente el grupo R1 es
Figure imgf000010_0004
Ejemplos de R3 incluyen Cl, OH,
Figure imgf000010_0005
Figure imgf000011_0001
Ejemplos de cuando el grupo R3 tiene la estructura
Figure imgf000011_0002
(incluyendo instancias con uno o más grupos metileno (CH2) opcionalmente reemplazados por uno o más de O, S, SO2, NH, C(=O), N(alquilo C1-C3), NC(=O)(alquilo C1-C3), o N(Boc), o tiene otro anillo fusionado al mismo, como se describió en la presente anteriormente) son:
Figure imgf000011_0003
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En otra modalidad, R3 se selecciona del grupo que consta de
Figure imgf000012_0006
En una modalidad de las fórmulas II, m es 0, en cuyo caso se simplifica a la fórmula II’:
Figure imgf000012_0002
En la fórmula II, preferiblemente
Figure imgf000012_0003
es
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Una modalidad de los compuestos según la fórmula II se representa por la fórmula IIa, en donde R1 y R3 son como se definen con respecto a la fórmula II anterior del presente documento. Los ejemplos de dichos compuestos se muestran en la tabla A. La tabla A incluye los datos de actividad biológica para la actividad de agonismo de TLR7 usando el ensayo informador HEK-Blue™ TLR7, como se describe a continuación en el presente documento. A modo de comparación, también se presentan las actividades de resiquimod y gardiquimod.
Figure imgf000012_0005
Figure imgf000013_0001
(continuación)
Figure imgf000014_0001
(continuación)
Figure imgf000015_0001
(continuación)
Figure imgf000016_0001
(continuación)
Figure imgf000017_0004
Una modalidad de compuestos de acuerdo con la fórmula II en donde m es 1 se representa por la fórmula IIb, en donde R1, R3 y X1 son como se definen con respecto a la fórmula II anterior en el presente documento.
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Preferiblemente, en la fórmula IIb
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es
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En la Tabla B se muestran ejemplos de compuestos de conformidad con la fórmula IIb:
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Esta descripción también divulga el compuesto III-02 (EC505.000 nM).
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CONJUGADOS
General
Los agonistas de TLR7 descritos en el presente documento pueden administrarse en el sitio de la acción prevista mediante administración localizada o mediante administración dirigida en un conjugado con una porción dirigida. Preferiblemente, la porción dirigida es un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo y su antígeno se encuentra en la localidad de la acción prevista, por ejemplo, un antígeno asociado a un tumor si el sitio de acción deseado es un tumor (cáncer). Preferiblemente, el antígeno asociado a tumor se expresa de forma única o se sobreexpresa por la célula cancerosa, en comparación con una célula normal. El antígeno asociado al tumor puede ubicarse en la superficie de la célula cancerosa o ser secretado por la célula cancerosa en sus alrededores.
En un aspecto, se proporciona un conjugado que comprende un compuesto de esta invención y un ligando, representado por la fórmula (IV)
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donde Z es una porción de direccionamiento, D es un agonista de esta invención, y (XD)aC(XZ)b se denominan colectivamente una "porción enlazadora" o "enlazador" porque enlazan Z y D. Dentro del enlazador, C es un grupo escindible diseñado para ser escindido en o cerca del sitio de la acción biológica deseada de D; XD y XZ son porciones espaciadoras (o "espaciadores") que separan D y C y C y Z, respectivamente; los subíndices a, b y c son independientemente 0 o 1 (es decir, la presencia de XD, XZ y C son opcionales). El subíndice m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 (preferiblemente 1, 2, 3, o 4). D, XD, C, XZ y Z se describen con más detalle a continuación.
Al unirse a un tejido o célula objetivo donde se localiza su antígeno o receptor, Z dirige el conjugado allí. La escisión del grupo C en el tejido o célula diana libera D para ejercer su efecto localmente. De esta manera, la entrega precisa de D se logra en el sitio de acción deseada, reduciendo la dosis necesaria. Además, D es normalmente biológicamente inactivo (o significativamente menos activo) en su estado conjugado, lo que reduce los efectos fuera no deseados.
Como se refleja en el subíndice m, cada Z puede conjugarse con más de una D, dependiendo del número de sitios que Z tiene disponibles para la conjugación y las condiciones experimentales empleadas. Los expertos en la materia apreciarán que, mientras que cada Z individual está conjugado con un número entero de Ds, una preparación del conjugado puede analizar una relación no entera de D a Z, lo que refleja un promedio estadístico. Esta relación se conoce como la proporción de sustitución ("SR") o la proporción de fármaco-anticuerpo ("DAR").
Porción dirigida Z
Preferiblemente, la porción dirigida Z es un anticuerpo. Por conveniencia y brevedad y no como limitación, la discusión detallada en esta descripción acerca de Z y sus conjugados se escribe en el contexto de que es un anticuerpo, pero los expertos en la técnica entenderán que otros tipos de Z pueden conjugarse, mutatis mutandis Por ejemplo, los conjugados con ácido fólico como la porción de direccionamiento pueden dirigirse a las células que tienen el receptor de folato en sus superficies (Leamon et al., Cancer Res. 2008, 68 (23), 9839). Por las mismas razones, la discusión detallada en esta descripción se escribe principalmente en términos de una relación 1:1 de Z a D (m = 1).
Los anticuerpos que se pueden usar en los conjugados de esta invención incluyen aquellos que reconocen los siguientes antígenos: mesotelina, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), CD19, CD22, CD30, CD70, B7H3, B7H4 (también conocido como O8E), proteína tirosina cinasa 7 (PTK7), glipican-3, RG1, fucosil-GM1, CTLA 4 y CD44. El anticuerpo puede ser animal (por ejemplo, murino), quimérico, humanizado o, preferiblemente, humano. El anticuerpo es preferiblemente monoclonal, especialmente un anticuerpo monoclonal humano. La preparación de anticuerpos monoclonales humanos contra algunos de los antígenos mencionados anteriormente se describe en Korman et al., US 8.609.816 B2 (2013; B7H4, también conocido como 08E; en particular los anticuerpos 2A7, 1G11 y 2F9); Rao-Naik et al., 8.097.703 B2 (2012; CD19; en particular los anticuerpos 5G7, 13F1, 46E8, 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3 y 3C10); King et al, US 8.481.683 B2 (2013; CD22; en particular los anticuerpos 12C5, 19A3, 16F7 y 23C6); Keler et al., US 7.387.776 B2 (2008; CD30; en particular los anticuerpos 5F11, 2H9 y 17G1); Terrett et al., US 8.124.738 B2 (2012; CD70; en particular los anticuerpos 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 y 69A7); Korman et al., US 6.984.720 B1 (2006; CTLA-4; en particular anticuerpos 10D1, 4B6 y 1E2); Korman et al., US 8.008.449 B2 (2011; PD-1; en particular los anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4); Huang et al., US 2009/0297438 A1 (2009; PSMA. En particular anticuerpos 1C3, 2A10, 2F5, 2C6); Cardarelli et al., US 7.875.278 B2 (2011; PSMA; en particular anticuerpos 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5 y 1C3); Terrett et al., US 8.222.375 B2 (2012; PTK7; en particular los anticuerpos 3G8, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8); Harkins et al., US 7.335.748 B2 (2008; RG1; en particular anticuerpos A, B, C y D); Terrett et al., US 8.268.970 B2 (2012; mesotelina; en particular los anticuerpos 3C10, 6A4 y 7B1); Xu et al., US 2010/0092484 A1 (2010; CD44; en particular los anticuerpos 14G9.B8.B4, 2D1.A3.D12 y 1A9.A6.B9); Deshpande et al., US 8.258.266 B2 (2012; IP10; en particular los anticuerpos 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S y 13C4); Kuhne et al., US 8.450.464 B2 (2013; CXCR4; en particular los anticuerpos F7, F9, D1 y E2); y Korman et al., US 7.943.743 B2 (2011; PD-L1; en particular los anticuerpos 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 y 13G4). Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-mesotelina.
Además de ser un anticuerpo, Z también puede ser un fragmento de anticuerpo (como Fab, Fab', F(ab')2, Fd o Fv) o un anticuerpo mimético, como un afficuerpo, un anticuerpo de dominio (dAb), un nanocuerpo, un unicuerpo, un DARPin, una anticalina, un versacuerpo, una duocalina, una lipocalina, o un avímero.
Cualquiera de varios grupos reactivos diferentes en Z puede ser un sitio de conjugación, que incluye grupos ε-amino en residuos de lisina, porciones de carbohidrato colgantes, grupos de ácido carboxílico en cadenas laterales de ácido aspártico o glutámico, grupos disulfuro de cisteína-cisteína y grupos tiol de cisteína. Para revisiones sobre grupos reactivos de anticuerpos adecuados para conjugación, vea, por ejemplo, Garnett, Adv. Drug Delivery Rev.
2001, 53, 171-216 y Dubowchik y Walker, Pharmacology & Therapeutics 1999, 83, 67-123.
La mayoría de los anticuerpos tienen múltiples residuos de lisina, que pueden conjugarse a través de sus grupos εamino a través de los enlaces de amida, urea, tiourea o carbamato.
Se puede usar un grupo tiol (-SH) en la cadena lateral de una cisteína para formar un conjugado por varios métodos. Puede usarse para formar un enlace disulfuro entre este y un grupo tiol en el enlazador. Otro método es a través de su adición de Michael a un grupo de maleimida en el enlazador.
Normalmente, aunque los anticuerpos tienen residuos de cisteína, carecen de grupos tiol libres porque todas sus cisteínas están involucradas en enlaces disulfuro intra o inter-catenarios. Para generar un grupo tiol libre, se puede reducir un grupo disulfuro nativo. Véase, ej., Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548; King et al., Cancer Res.
1994, 54, 6176; y Doronina et al., Nature Biotechnol. 2003, 21, 778. Alternativamente, una cisteína que tiene un grupo -SH libre puede introducirse mutando el anticuerpo, sustituyendo una cisteína por otro aminoácido o insertando uno en la cadena polipeptídica. Véase, por ejemplo, Figenbrot et al., US 7.521.541 B2 (2009); Chilkoti et al., Bioconjugate Chem.1994, 5, 504; Urnovitz et al., US 4.698.420 (1987); Stimmel et al., J. Biol. Chem.2000, 275, 30445; Bam et al., US 7.311.902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem.1994, 269, 7610; Poon et al., J. Biol. Chem.
1995, 270, 8571; Junutula et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925 y Rajpal et al., Solicitud Provisional estadounidense No.62/270245, presentada Dec.21, 2015. En otro enfoque, se agrega una cisteína al extremo C de la cadena pesada o ligera. Véase, ej., Liu et al., US 8.865.875 B2 (2014); Cumber et al., J. Immunol.1992, 149, 120; King, Cancer Res. 1994, 54, 6176; Li et al., Bioconjugate Chem. 2002, 13, 985; Yang et al., Protein Engineering 2003, 16, 761; y Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection 2004, 17, 21.
Enlazadores y sus Componentes
Como se indicó anteriormente, el enlazador comprende hasta tres elementos: un grupo C escindible y espaciadores opcionales XZ y XD.
El grupo C es escindible en condiciones fisiológicas. Preferiblemente, es relativamente estable mientras el conjugado está en circulación en la sangre, pero se escinde fácilmente una vez que el conjugado alcanza su sitio de acción deseado.
Un grupo C preferido es un péptido que se escinde selectivamente por una proteasa dentro de la célula diana, a diferencia de una proteasa en el suero. Normalmente, el péptido comprende de 1 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 6 aminoácidos, más preferiblemente de 2 a 3 aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser α-aminoácidos naturales y/o no naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como los aminoácidos derivados de ellos, por ejemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, citrulina y O-fosfoserina. En esta descripción, el término "aminoácido" también incluye análogos de aminoácidos y miméticos. Los análogos son compuestos que tienen la misma estructura general H2N (R)CHCO2H de un aminoácido natural, excepto que el grupo R no se encuentra entre los aminoácidos naturales. Los ejemplos de análogos incluyen homoserina, norleucina, metionina-sulfóxido y metionina metil sulfonio. Un mimético de aminoácidos es un compuesto que tiene una estructura diferente de la estructura química general de un α-aminoácido pero funciona de una manera similar a uno. El aminoácido puede ser de la estereoquímica "L" de los aminoácidos codificados genéticamente, así como de la estereoquímica enantiomérica "D".
Preferiblemente, C contiene una secuencia de aminoácidos que es una secuencia de reconocimiento de escisión para una proteasa. Se conocen muchas secuencias de reconocimiento de escisión en la técnica. Véase, ej., Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol.241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol.
244: 175 (1994); Thornberry et al., Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol.244: 412 (1994); y Bouvier et al. Meth. Enzymol.248: 614 (1995).
Se puede elegir un grupo C de modo que sea escindido por una proteasa presente en la matriz extracelular en la vecindad de un cáncer, por ejemplo, una proteasa liberada por células cancerosas cercanas moribundas o una proteasa asociada a un tumor secretada por células cancerosas. Las proteasas asociadas a tumores extracelulares de ejemplo son plasmina, metaloproteasas de matriz (MMP), oligopeptidasa de thimet (TOP) y CD10. Véase, ej., Trouet et al., US 7.402.556 B2 (2008); Dubois et al., US 7.425.541 B2 (2008); y Bebbington et al., US 6.897.034 B2 (2005). La catepsina D, una enzima normalmente lisosomal que se encuentra dentro de las células, a veces se encuentra en el entorno de un tumor, posiblemente liberado por células cancerosas moribundas.
Para conjugados diseñados para ser por una enzima, C comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada para escisión por proteasas tales como catepsinas B, C, D, H, L y S, especialmente catepsina B. Los péptidos escindibles de catepsina B a modo de ejemplo incluyen Val-Ala, Val Cit, Val-Lys, Lys-Val-Ala, Asp-Val-Ala, Val-Ala, Lys-Val-Cit, Ala-Val-Cit, Val Gly, Val Gln y Asp-Val-Cit. (Aquí, las secuencias de aminoácidos se escriben en la dirección N a C, como en H2NAA2AA1CO2H, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.) Véase Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett.1998, 8, 3341; Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.1998, 8, 3347; y Dubowchik et al., Bioconjugate Chem.2002, 13, 855.
Otra enzima que se puede usar para escindir los enlaces peptidílicos es la legumaina, una cisteína proteasa lisosomal que se escinde preferentemente en AlaAlaAsn.
En una modalidad, el Grupo C es un péptido que comprende una secuencia de dos aminoácidos AA2AA1 en donde AA1 es lisina, arginina o citrulina y AA2 es fenilalanina, valina, alanina, leucina o isoleucina. En otra modalidad, C consiste en una secuencia de uno a tres aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en ValCit, AlaVal, ValAlaVal, LysLys, AlaAsnVal, ValLeuLys, CitCit, Val Lys, AlaAlaAsn, Lys, Cit, Ser y Glu. Más preferiblemente, es un péptido de dos a tres aminoácidos del grupo anterior.
La preparación y diseño de los grupos C escindibles que consisten en un solo aminoácido se describe en Chen et al., US 8.664.407 B2 (2014).
El grupo C puede unirse directamente a Z o D; es decir, los espaciadores XZ o XD, según sea el caso, pueden estar ausentes.
Cuando está presente, el espaciador XZ proporciona separación espacial entre C y Z, para que el primero no interfiera estéricamente con la unión del antígeno por este último o este último interfiera estéricamente con la escisión del primero. Además, el espaciador XZ se puede usar para conferir solubilidad incrementada o propiedades de agregación disminuidas a los conjugados. Un espaciador XZ puede comprender uno o más segmentos modulares, que se pueden ensamblar en cualquier número de combinaciones. Ejemplos de segmentos adecuados para un espaciador XZ son:
Figure imgf000021_0001
y combinaciones de los mismos,
donde el subíndice g es 0 o 1 y el subíndice h es 1 a 24, preferiblemente 2 a 4. Estos segmentos se pueden combinar, como se ilustra a continuación:
Figure imgf000021_0002
El espaciador XD, si está presente, proporciona una separación espacial entre C y D, para que este no interfiera estéricamente o electrónicamente con la escisión del primero. El espaciador XD también puede servir para introducir una masa molecular adicional y una funcionalidad química en un conjugado. Generalmente, la masa adicional y la funcionalidad afectarán la vida media del suero y otras propiedades del conjugado. De este modo, a través de una selección juiciosa de grupos espaciadores, se puede modular la vida media en suero de un conjugado. El espaciador XD también se puede ensamblar a partir de segmentos modulares, de manera análoga a la descripción anterior para el espaciador XZ.
Los espaciadores XZ y/o XD, cuando están presentes, proporcionan preferiblemente una separación lineal de 4 a 25 átomos, más preferiblemente de 4 a 20 átomos, entre Z y C o D y C, respectivamente.
El enlazador puede realizar otras funciones además de enlazar covalentemente el anticuerpo y el fármaco. Por ejemplo, el enlazador puede contener un grupo poli(etilenglicol) ("PEG"). Dado que la etapa de conjugación generalmente implica el acoplamiento de un fármaco-enlazador a un anticuerpo en un medio acuoso, un grupo PEG puede aumentar la solubilidad acuosa del fármaco-enlazador. Además, un grupo de PEG puede aumentar la solubilidad o reducir la agregación en el ADC resultante. Cuando un grupo PEG está presente, puede incorporarse en el espaciador XZ o XD, o en ambos. El número de unidades repetidas en un grupo PEG puede ser de 2 a 20, preferiblemente de 4 a 10.
El espaciador XZ o XD, o ambos, pueden comprender un fragmento autoinmolante. Una porción autoinmolable es una porción que (1) está unida a C y cualquiera Z o D y (2) tiene una estructura tal que la escisión del grupo C inicia una secuencia de reacción que resulta en la porción autoinmolante que se separa de Z o D, según sea el caso. En otras palabras, la reacción en un sitio distal de Z o D (escisión del grupo C) hace que el enlace XZ-Z o XD-D también se rompa. La presencia de una porción autoinmolante es deseable en el caso del espaciador XD porque, si, después de la escisión del conjugado, el espaciador XD o una porción del mismo permaneciera unido a D, la actividad biológica de D puede verse afectada. El uso de una porción autoinmolante es especialmente deseable cuando el grupo C escindible es un polipéptido, en cuyo caso la porción autoinmolante está normalmente ubicado adyacente al mismo, para evitar que D interfiera estéricamente o electrónicamente con la escisión del péptido.
Ejemplos de porciones autoinmolables (i)-(v) unidas a un grupo hidroxilo o amino de D se muestran a continuación:
Figure imgf000022_0001
La porción autoinmolante es la estructura entre las líneas de puntos a y b (o las líneas de puntos b y c), con características estructurales adyacentes que se muestran para proporcionar contexto. Las porciones autoinmolables (i) y (v) están unidas a un DNH2 (es decir, la conjugación es a través de un grupo amino), mientras que los fragmentos autoinmolantes (ii), (iii) y (iv) están unidas a una DOH (es decir, la conjugación es a través de un grupo hidroxilo o carboxilo). La escisión del enlace en la línea de puntos b por una enzima - una peptidasa en el caso de las estructuras (i)-(v) y una β-glucuronidasa en el caso de la estructura (vi) - inicia una secuencia de reacción de autoinmolación que resulta en la escisión del enlace en la línea punteada a y la consiguiente liberación de DOH o DNH2, según sea el caso. A modo de ilustración, a continuación, se muestran los mecanismos de autoinmolación para las estructuras (i) y (iv):
Figure imgf000023_0001
En otras palabras, la escisión de un primer enlace químico en una parte de un grupo autoinmolado inicia una secuencia de pasos que resulta en la escisión de un segundo enlace químico - que conecta el grupo autoinmolante con el fármaco - en una parte diferente del grupo autoinmolado, liberando así el fármaco.
En algunos casos, los grupos autoinmolables se pueden usar en tándem, como lo muestra la estructura (vii). En tal caso, la escisión en la línea de puntos c desencadena la autoinmolación de la porción entre las líneas de puntos b y c por una reacción de eliminación 1,6, seguida de la autoinmolación de la porción entre las líneas de puntos a y b por una reacción de ciclado-eliminación. Para descripciones adicionales con respecto a porciones de autoinmolación, consulte Carl, J. Med. Chem. 1981, 24, 479; Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics 1999, 83, 67; Firestone et al., US 6.214.345 B1 (2001); Toki et al., J. Org. Chem.
2002, 67, 1866; Doronina et al., Nature Biotechnology 2003, 21, 778 (erratum, p.941); Boyd et al., US 7.691.962 B2; Boyd et al. US 2008/0279868 A1; Sufi, WO 2008/083312 A2; Feng, US 7.375.078 B2; Jeffrey et al., US 8.039.273; y Senter et al. US 2003/0096743 A1.
En otra modalidad, Z y D están unidos por un enlazador no escindible, es decir, C está ausente. El metabolismo de D eventualmente reduce el enlazador a una pequeña porción adjunta que no interfiere con la actividad biológica de D.
Técnicas de Conjugación
Los conjugados de agonistas de TLR7 descritos en el presente documento se fabrican preferiblemente preparando primero un compuesto que comprende D y el enlazador (XD)a(C)c(XZ)b (donde XD, C, XZ, a, b, y c son los definidos para la fórmula (II)) para formar un compuesto fármaco-enlazador representado por la fórmula (V):
Figure imgf000023_0002
donde R31 es un grupo funcional adecuado para reaccionar con un grupo funcional complementario en Z para formar el conjugado. Ejemplos de grupos adecuados R31 incluyen amino, azida, tiol, ciclooctina,
Figure imgf000023_0003
donde R32 es Cl, Br, F, mesilato, o tosilato y R33 es Cl, Br, I, F, OH, -O-N-succinimidilo, -O-(4-nitrofenilo), -O-pentafluorofenilo, o –O-tetrafluorofenilo. La química generalmente usable para la preparación de porciones D (XD) aC(XZ)bR31 adecuados se describe en Ng et al., US 7.087.600 B2 (2006); Ng et al., US 6.989.52 B2 (2006); Ng et al., US 7.129.261 B2 (2006); Ng et al, WO 02/096910 A1; Boyd et al., US 7.691.962 B2; Chen et al., US 7.517.903 B2 (2009); Gangwar et al., US 7.714.016 B2 (2010); Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Gangwar et al., US 7.847.105 B2 (2010); Gangwar et al., US 7.968.586 B2 (2011); Sufi et al., EE.UU 8.461.117 B2 (2013); y Chen et al., US 8.664.407 B2 (2014.
Preferiblemente, el grupo funcional reactivo R31 es NH2, OH, CO2H, SH, maleimido, ciclooctina, azido(N3), hidroxilamino (ONH2) o N hidroxisuccinimido. Los grupos funcionales R31 especialmente preferidos son:
Figure imgf000024_0001
Un grupo –OH puede esterificarse con un grupo carboxi en el anticuerpo, por ejemplo, en una cadena lateral de ácido aspártico o glutámico.
Un grupo –CO2H puede esterificarse con un grupo –OH o amidarse con un grupo amino (por ejemplo, en una cadena lateral de lisina) en el anticuerpo.
Un grupo N-hidroxisuccinimida es funcionalmente un grupo carboxilo activado y puede ser amidado convenientemente por reacción con un grupo amino (por ejemplo, a partir de lisina).
Un grupo maleimida se puede conjugar con un grupo SH en el anticuerpo (por ejemplo, a partir de cisteína o de la modificación química del anticuerpo para introducir una funcionalidad sulfhidrilo), en una reacción de adición de Michael.
Cuando un anticuerpo no tiene una cisteína -SH disponible para conjugación, un grupo ε-amino en la cadena lateral de un residuo de lisina puede reaccionar con 2-iminotiolano o N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (“SPDP”) para introducir un grupo tiol libre (-SH)- creando un sustituto de cisteína, por así decirlo. El grupo tiol puede reaccionar con una maleimida u otro grupo aceptor de nucleófilos para efectuar la conjugación. El mecanismo se ilustra a continuación con 2-iminotiolano.
Figure imgf000024_0002
Normalmente, se alcanza un nivel de tiolación de dos a tres tioles por anticuerpo. Para un procedimiento representativo, consulte Cong et al., US 8.980.824 B2 (2015).
En una disposición invertida, un anticuerpo Z puede modificarse con 4-(maleimidometil)-ciclohexanocarboxilato de succinimidilo ("SMCC") o su variante sulfo-SMCC sulfonada, ambos disponibles en Sigma-Aldrich, para introducir un grupo maleimida del mismo. Luego, la conjugación puede efectuarse con un compuesto de fármaco-enlazador que tenga un grupo –SH en el enlazador.
Un método alternativo de conjugación emplea una "química de clic" libre de cobre, en la que un grupo azida se agrega a través de un ciclooctino tenso para formar un anillo de 1,2,3-triazol. Véase, por ejemplo, Agard et al., J. Amer. Chem. Soc.2004, 126, 15046; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571. La azida se puede ubicar en el anticuerpo y el ciclooctino en la porción de fármaco - enlazador, o viceversa. Un grupo ciclooctino preferido es dibenzociclooctino (DIBO). Varios reactivos que tienen un grupo DIBO están disponibles en Invitrogen / Sondas Moleculares, Eugene, Oregon. La siguiente reacción ilustra la conjugación química de clics para el caso en el que el grupo DIBO está unido al anticuerpo (Ab):
Figure imgf000025_0001
Aún otra técnica de conjugación implica la introducción de un aminoácido no natural en un anticuerpo, con el aminoácido no natural que proporciona una funcionalidad para la conjugación con un grupo funcional reactivo en la porción de fármaco. Por ejemplo, el aminoácido no natural p-acetilfenilalanina puede incorporarse en un anticuerpo u otro polipéptido, como se enseña en Tian et al., WO 2008/030612 A2 (2008). El grupo cetona en p-acetilfenilalanina puede ser un sitio de conjugación a través de la formación de una oxima con un grupo hidroxilamino en la porción de enlazador-fármaco. Alternativamente, el aminoácido no natural p-azidofenilalanina puede incorporarse en un anticuerpo para proporcionar un grupo funcional azida para la conjugación mediante química de clics, como se discutió anteriormente. Los aminoácidos no naturales también pueden incorporarse en un anticuerpo u otro polipéptido usando métodos sin células, como se describe en Goerke et al., US 2010/0093024 A1 (2010) y Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416. Por lo tanto, en una modalidad, un anticuerpo que se usa para hacer un conjugado tiene uno o más aminoácidos reemplazados por un aminoácido no natural, que preferiblemente es p-acetilfenilalanina o p-azidofenilalanina, más preferiblemente p-acetilfenilalanina.
Todavía otra técnica de conjugación usa la enzima transglutaminasa (preferiblemente transglutaminasa bacteriana de Streptomyces mobaraensis o BTG), según Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995. BTG forma un enlace amida entre la carboxamida de la cadena lateral de una glutamina (el aceptor de amina) y un grupo alquilenamino (el donante de amina), que puede ser, por ejemplo, el grupo ε-amino de una lisina o un grupo 5-amino-n -pentilo. En una reacción de conjugación típica, el residuo de glutamina se localiza en el anticuerpo, mientras que el grupo alquilenamino se ubica en la porción de enlazador-fármaco, como se muestra a continuación:
Figure imgf000025_0002
La colocación de un residuo de glutamina en una cadena polipeptídica tiene un gran efecto sobre su susceptibilidad a la transamidación mediada por BTG. Ninguno de los residuos de glutamina en un anticuerpo son normalmente sustratos BTG. Sin embargo, si el anticuerpo está desglicosilado, el sitio de glicosilación es la asparagina 297 (N297; la numeración por índice de la UE como se establece en Kabat et al., "Secuencias de proteínas de interés inmunológico", 5ª ed., Pub. No.91-3242, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH, Bethesda, Md., 1991; en lo sucesivo, "Kabat") de la cadena pesada, la glutamina 295 (Q295) cercana se vuelve susceptible a BTG. Un anticuerpo puede desglicosilarse enzimáticamente por tratamiento con PNGasa F (péptido-N-glicosidasa F). Alternativamente, un anticuerpo puede sintetizarse libre de glucósidos mediante la introducción de una mutación N297A en la región constante, para eliminar el sitio de glicosilación N297. Además, se ha demostrado que una sustitución N297Q no solo elimina la glicosilación, sino que también introduce un segundo residuo de glutamina (en la posición 297) que también es un aceptor de amina. De este modo, en una modalidad, el anticuerpo está desglicosilado. En otra modalidad, el anticuerpo tiene una sustitución N297Q. Los expertos en la materia apreciarán que la desglicosilación mediante la modificación posterior a la síntesis o tras introducir una mutación N297A genera dos residuos de glutamina reactivos a BTG por anticuerpo (uno por cadena pesada, en la posición 295), mientras que un anticuerpo con una sustitución N297Q tendrá cuatro residuos de glutamina reactivos a BTG (dos por cadena pesada, en las posiciones 295 y 297).
Un anticuerpo también puede volverse susceptible a la conjugación mediada por BTG introduciendo en él un péptido que contiene glutamina, o "etiqueta", como se describe, por ejemplo, en Pons et al., US 2013/0230543 A1 (2013) y Rao-Naik et al., documento WO 2016/144608 A1.
En un enfoque complementario, la especificidad de sustrato de BTG se puede alterar variando su secuencia de aminoácidos, de modo que sea capaz de reaccionar con glutamina 295 en un anticuerpo no modificado, como se describe en Rao-Naik et al., WO 2017/059158 A1 (2017).
Si bien la transglutaminasa bacteriana más comúnmente disponible es la de S. mobaraensis, se puede considerar la transglutaminasa de otras bacterias, que tienen especificidades de sustrato algo diferentes, como la transglutaminasa de Streptoverticillium ladakanum (Hu, US 2009/0318349 A1 (2009), US 2010/0099610 A1 (2010), y US 2010/0087371 A1 (2010)).
Los agonistas de TLR7 de esta descripción que tienen una amina de alquilo primaria o secundaria son particularmente adecuados para su uso en conjugados, ya que la amina secundaria proporciona un grupo funcional para la unión del enlazador. Un ejemplo del compuesto agonista-enlazador TLR7 es el compuesto 41, el cual se puede obtener a partir del compuesto IIa-01 y contiene un enlazador enzimáticamente escindible. La FIG.5 muestra un esquema de reacción según el cual se puede preparar el compuesto 41.
Figure imgf000026_0001
Un ejemplo de un compuesto agonista-enlazador TLR7 que contiene un enlazador no enzimáticamente escindible es el compuesto 43, el cual también se puede obtener a partir del compuesto IIa-01. La FIG. 6 muestra una ruta para sintetizar el compuesto 43.
Figure imgf000026_0002
Ambos compuestos 41 y 43 contienen un grupo alquilamino primario, haciéndolos susceptibles a la conjugación con transglutaminasa. Un procedimiento de conjugación adecuado se describe en los Ejemplos a continuación.
La conjugación también puede efectuarse usando la enzima Sortasa A, como se describe en Levary et al., PLoS One 2011, 6 (4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett.2010, 32, 1-10; Ploegh et al., WO 2010/087994 A2 (2010); y Mao et al., WO 2005/051976 A2 (2005). El motivo de reconocimiento de la Sortasa A (normalmente LPXTG, donde X es cualquier aminoácido natural) puede estar ubicado en el ligando Z y el motivo del aceptor nucleófilo (normalmente GGG) puede ser el grupo R31 en la Fórmula (III), o viceversa.
Conjugados Agonistas de TLR7
Aplicando las técnicas anteriormente descritas, se pueden preparar conjugados agonistas de TLR7 tales como los que se muestran a continuación:
Figure imgf000027_0001
Conjugado 2
donde m es 1, 2, 3 o 4 y Ab es un anticuerpo.
PEGILACIÓN
La unión de una cadena de poli(etilenglicol) (PEG) a un fármaco ("PEGilación") puede mejorar las propiedades farmacocinéticas de este último. La vida media de circulación del fármaco aumenta, a veces en más de un orden de magnitud, reduciendo concomitantemente la dosis necesaria para lograr un efecto terapéutico deseado. La PEGilación también puede disminuir la degradación metabólica de un fármaco y reducir su inmunogenicidad. Para una revisión, véase Kolate et al., J. Controlled Release 2014, 192, 167.
Inicialmente, la PEGilación se aplicó a fármacos biológicos. A partir de 2016, más de diez biológicos PEGilados habían sido aprobados. Turecek et al., J. Pharmaceutical Sci.2016, 105, 460. Más recientemente, estimulada por la aplicación exitosa del concepto a los productos biológicos, la atención se ha dirigido hacia su aplicación a fármacos de moléculas pequeñas. Además de los beneficios mencionados anteriormente, los fármacos de molécula pequeña PEGilada pueden tener mayor solubilidad y causar menos efectos tóxicos. Li et al. Prog. Polymer Sci.2013, 38, 421. Los compuestos descritos en el presente documento pueden ser PEGilados. Cuando un compuesto tiene una amina primaria o secundaria alifática o un hidroxilo alifático, como el caso del compuesto que se muestra a continuación en las posiciones indicadas por las flechas, puede PEGilarse a través de un grupo éster, amida, carbonato o carbamato con una molécula de PEG que contiene carboxi usando técnicas convencionales tales como diciclohexilcarbodiimida, HATU, ésteres de N-hidroxisuccinimida, y similares. Otros métodos para PEGilar moléculas farmacéuticas se describen en Alconcel et al., Polymer Chem.2011, 2, 1442.
Figure imgf000027_0002
Si se desea, un agonista de TLR7 descrito en el presente documento puede PEGilarse mediante un enlazador escindible enzimáticamente que comprende una porción autoinmolante, para permitir la liberación del agonista no PEGilado de una manera diseñada. Además, la PEGilación se puede combinar con la conjugación a una proteína tal como un anticuerpo, si la molécula que contiene PEG tiene un grupo funcional adecuado, tal como una amina, para unirse a la proteína. La proteína puede proporcionar una función terapéutica adicional o, si es un anticuerpo, puede proporcionar una función de direccionamiento. Estos conceptos se ilustran en la siguiente secuencia de reacción, donde TLR7-NH-R representa genéricamente un agonista de TLR7:
Figure imgf000028_0001
En la secuencia de reacción anterior, el dipéptido valina-citrulina (Val-Cit) es escindible por la enzima catepsina B, con un grupo p-aminobencil oxicarbonilo (PABC) que actúa como un espaciador autoinmolante. El grupo funcional para la conjugación es un grupo amina, que está temporalmente protegido por un grupo Fmoc. La conjugación se efectúa por la enzima transglutaminasa, con una cadena lateral de glutamina (Gln) que actúa como el aceptor de acilo. El subíndice x, que denota el número de unidades de repetición de PEG, puede variar ampliamente, dependiendo del propósito de la PEGilación, como se explica a continuación. Para algunos propósitos, x puede ser relativamente pequeño, como 2, 4, 8, 12 o 24. Para otros fines, x es grande, por ejemplo, entre 45 y 910 aproximadamente.
Los expertos en la técnica entenderán que la secuencia es ilustrativa y que se pueden emplear otros elementos -péptido, grupo autoinmolante, método de conjugación, longitud de PEG, etc.-, como es bien conocido en la técnica. También entenderán que, mientras que la secuencia anterior combina PEGilación y conjugación, la PEGilación no requiere conjugación, y viceversa.
Cuando el compuesto carece de hidroxilo alifático o amina primaria o secundaria alifática, todavía puede PEGilarse en la amina aromática en el anillo de pirimidina. Un método de PEGilación en esta posición se describe en Zarraga, US 2017/0166384 A1 (2007).
En algunas modalidades, puede ser deseable tener múltiples agonistas PEGilados unidos en una única molécula. Por ejemplo, cuatro brazos PEGilados se pueden construir sobre pentaeritritol (C(CH2OH)4) y se puede unir un agonista de TLR7 a cada brazo PEGilado. Véase Gao et al., US 2013/0028857 A1 (2013).
Para modular la farmacocinética, generalmente se prefiere que la porción PEG tenga un peso de fórmula de entre 2 kDa aproximadamente (correspondiente a 45 unidades de repetición aproximadamente (CH2CH2O)) y entre 40 kDa aproximadamente (que corresponde a 910 unidades de repetición aproximadamente (CH2CH2O)), más preferiblemente entre 5 kDa y 20 kDa aproximadamente. Es decir, el intervalo del subíndice x en la fórmula anterior es de 45 a 910 aproximadamente. Debe entenderse que las composiciones de PEG no son 100 % homogéneas, sino que, más bien, exhiben una distribución de pesos moleculares. Por lo tanto, una referencia a, por ejemplo, "PEG de 20 kDa" significa PEG que tiene un peso molecular promedio de 20 kDa.
La PEGilación también se puede usar para mejorar la solubilidad de un agonista. En tales casos, se puede usar una cadena PEG más corta, por ejemplo, que comprende 2, 4, 8, 12 o 24 unidades de repetición.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y ADMINISTRACIÓN
En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se describe en el presente documento, o un conjugado del mismo, formulado junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, puede contener uno o más ingredientes farmacéuticamente activos adicionales, tales como un fármaco biológico o de moléculas pequeñas. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una terapia de combinación con otro agente terapéutico, especialmente un agente anticancerígeno.
La composición farmacéutica puede comprender uno o más excipientes. Los excipientes que pueden usarse incluyen vehículos, agentes de superficie activa, agentes espesantes o emulsionantes, aglutinantes sólidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, solubilizantes, colorantes, agentes aromatizantes, revestimientos, agentes desintegrantes, lubricantes, edulcorantes, conservadores, agentes isotónicos y combinaciones de los mismos. La selección y el uso de excipientes adecuados se enseña en Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003).
Preferiblemente, una composición farmacéutica es adecuada para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo se puede recubrir con un material para protegerlo de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivarlo. La expresión “administración parenteral” se refiere a modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal. Alternativamente, la composición farmacéutica se puede administrar por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles. También pueden formularse en una microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para lograr una alta concentración de fármaco. Las composiciones también se pueden proporcionar en la forma de liofilizados, para la reconstitución en agua antes de la administración.
La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración y generalmente será esa cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, del cien por ciento, esta cantidad oscilará entre el 0,01 por ciento y noventa y nueve por ciento aproximadamente del ingrediente activo, preferiblemente entre aproximadamente el 0,1 por ciento y aproximadamente el 70 por ciento, lo más preferiblemente entre aproximadamente el 1 por ciento y aproximadamente el 30 por ciento. Porcentaje de ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar una respuesta terapéutica. Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, varias dosis divididas pueden ser administradas con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación. Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. “Forma de dosificación unitaria” se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir la respuesta terapéutica deseada, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
La dosificación oscila de 0,0001 a 100 mg/kg aproximadamente, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedero. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, o alternativamente de 0,1 a 5 mg/kg. Los regímenes de tratamiento de ejemplo se administran una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, usando uno de los siguientes esquemas de reacción de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpos en plasma de aproximadamente 1-1000 μg/ml y en algunos métodos de aproximadamente 25-300 μg/ml.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto de la invención produce preferiblemente una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de sujetos con tumores, una "cantidad terapéuticamente eficaz" inhibe preferiblemente el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente el 20 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente el 40 %, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente el 60 %, y aún así más preferiblemente en al menos aproximadamente el 80 % en relación con los sujetos no tratados. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejorar los síntomas en un sujeto, que es normalmente un ser humano pero puede ser otro mamífero. Cuando dos o más agentes terapéuticos se administran en un tratamiento de combinación, la "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la eficacia de la combinación en un conjunto, y no a cada agente individualmente.
La composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación controlada o sostenida, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Polímeros biodegradables, biocompatibles se pueden usar, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Véase, ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Las composiciones terapéuticas pueden administrarse a través de dispositivos médicos tales como (1) dispositivos de inyección hipodérmica sin agujas; (2) bombas de micro-infusión; (3) dispositivos transdérmicos; (4) dispositivos de infusión; y (5) dispositivos osmóticos.
En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, para garantizar que los compuestos terapéuticos de la invención atraviesen la barrera hematoencefálica, pueden formularse en liposomas, que pueden comprender adicionalmente grupos dirigidos para mejorar el transporte selectivo a células u órganos específicos.
Aplicabilidad industrial
Los compuestos agonistas de TLR7 descritos en el presente documento pueden usarse para el tratamiento de una enfermedad o afección que puede mejorarse mediante la activación de TLR7.
En una modalidad, el agonista de TLR7 se usa en combinación con un agente de inmunoterapia anticancerígeno, también conocido como un agente de inmunooncología. Un agente de inmunoterapia contra el cáncer actúa estimulando el sistema inmunitario del cuerpo para atacar y destruir las células cancerígenas, especialmente a través de la activación de las células T. El sistema inmunológico tiene numerosas moléculas de punto de control (reguladoras), que ayudan a mantener un equilibrio entre las células diana legítimas que atacan y evitan que ataquen a las células normales y sanas. Algunos son estimuladores (reguladores por aumento), lo que significa que su compromiso promueve la activación de las células T y mejora la respuesta inmunológica. Otros son inhibidores (reguladores por disminución o frenos), lo que significa que su compromiso inhibe la activación de las células T y disminuye la respuesta inmune. La unión de un agente de inmunoterapia agonista a una molécula de punto de control estimulante puede conducir a la activación de esta última y a una respuesta inmune mejorada contra las células cancerígenas. Recíprocamente, la unión de un agente de inmunoterapia antagonista a una molécula de punto de control inhibitoria puede prevenir la regulación negativa del sistema inmunológico por parte de este último y ayudar a mantener una respuesta vigorosa contra las células cancerígenas. Ejemplos de moléculas de punto de control estimuladoras son B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, CD40, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 y CD28H. Ejemplos de moléculas de punto de control inhibitorias son CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, CD96 y TIM-4.
Cualquiera que sea el modo de acción de un agente de inmunoterapia contra el cáncer, su efectividad puede incrementarse mediante una regulación general del sistema inmunitario, tal como mediante la activación de TLR7.
Así, en una modalidad, esta descripción proporciona una combinación de un compuesto de la invención y un agonista de TLR7 como se describe en el presente documento para su uso en un método para tratar un cáncer. El momento de la administración puede ser simultáneo, secuencial o alterno. El modo de administración puede ser sistémico o local. El agonista TLR7 se puede administrar de manera específica, a través de un conjugado. Todos los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento forman parte de la invención en la medida en que esos métodos de tratamiento se refieren a los compuestos reivindicados para su uso en esos métodos de tratamiento. De forma similar, los tratamientos de combinación divulgados en el presente documento forman parte de la invención en la medida en que esos tratamientos se refieren a la combinación reivindicada para su uso en un método para tratar cáncer.
Los cánceres que pueden ser tratados mediante un tratamiento de combinación como se describe anteriormente incluyen leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, sarcoma de Kaposi, linfoma, cáncer anal, cáncer de apéndice, tumor teratoide/rabdoide, carcinoma de células basales, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, Tumor bronquial, tumor carcinoide, tumor cardíaco, cáncer cervical, cordoma, leucemia linfocítica crónica, neoplasia mieloproliferativa crónica, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, cáncer de conducto biliar, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer de esófago, estiopeuroblastoma, sarcoma de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de la trompa de Falopio, cáncer de vesícula biliar, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer de hígado, cáncer de hipofaringe, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia mielógena crónica, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de pulmón, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de boca, cáncer oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de pene, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de la glándula salival, cáncer de piel, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer vaginal, y cáncer de vulva.
Agentes de inmunoterapia contra el cáncer que se pueden usar en terapias de combinación como se describe en el presente documento incluyen: AMG 557, AMP-224, atezolizumab, avelumab, BMS 936559, cemiplimab, CP-870893, dacetuzumab, durvalumab, enoblituzumab, galiximab, IMP321, ipilimumab, lucatumumab, MEDI-570, MEDI-6383, MEDI-6469, muromonab-CD3, nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, spartalizumab, tremelimumab, urelumab, utomilumab, varlilumab, vonlerolizumab. La tabla C a continuación enumera sus nombres alternativos (nombre de marca, nombre anterior, código de investigación o sinónimo) y la molécula objetivo del punto de control respectivo.
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En una modalidad de un tratamiento de combinación con un agonista de TLR7, el agente de inmunoterapia anticancerígeno es un anticuerpo antagonista anti-CTLA-4, anti-PD-1 o anti-PD-L1. El cáncer puede ser cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, linfoma (incluyendo linfoma de Hodgkin), cáncer de piel (incluyendo melanoma y cáncer de piel de Merkel), cáncer urotelial (incluyendo cáncer de vejiga), cáncer gástrico, cáncer hepatocelular o cáncer colorrectal. En otra modalidad de un tratamiento de combinación con un agonista de TLR7, el agente de inmunoterapia anticanceroso es un anticuerpo antagonista anti-CTLA-4, preferiblemente ipilimumab.
En otra modalidad de un tratamiento de combinación con un agonista de TLR7, el agente de inmunoterapia anticanceroso es un anticuerpo antagonista anti-PD-1, preferiblemente nivolumab o pembrolizumab.
Los agonistas de TLR7 descritos en este documento también son útiles como adyuvantes de vacunas.
ACTIVIDAD BIOLÓGICA
La actividad biológica de los compuestos descritos en el presente documento como agonistas de TLR7 puede analizarse mediante los siguientes procedimientos.
Ensayo de Actividad Agonista de TLR7 Humano
Este procedimiento describe un método para ensayar la actividad agonista de TLR7 (hTLR7) de los compuestos descritos en esta descripción.
Células azules de riñón humano embrionario modificadas (células HEK-Blue ™ TLR; Invivogen) que poseen un transgén reportero fosfatado alcalino embrionario secretado por el TLR7 humano (SEAP) se suspendieron en un medio de cultivo no selectivo (DMEM de alto contenido de glucosa (Invitrogen), suplementado con un 10 % de suero bovino fetal (Sigma)). Se agregaron células HEK-Blue™ TLR7 a cada pozo de una placa de cultivo de tejidos de 384 pozos (15,000 células por pozo) y se incubaron 16-18 h a 37 °C, CO2 al 5 %. Los compuestos (100 nl) se dispensaron en pozos que contenían células TLR HEK-Blue™ y las células tratadas se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 %. Después de 18 h de tratamiento, se agregaron diez microlitros de reactivo Quanti-Blue™ recién preparado (Invivogen) a cada pozo, se incubaron durante 30 min (37 °C, CO2 al 5 %) y se midieron los niveles de SEAP usando un lector de placas Envision (OD = 620 nm). Se calcularon los valores de la concentración máxima efectiva media (EC50; concentración del compuesto que indujo una respuesta a mitad de camino entre la línea de base del ensayo y el máximo). Las actividades indicadas pueden ser el promedio de múltiples medidas.
Inducción de Genes de Interferón Tipo I (MX-1) y CD69 en Sangre Humana
La inducción de los genes MX-1 de interferón de Tipo I (IFN) y el marcador de activación de células B CD69 son eventos posteriores que se producen con la activación de la vía TLR7. El siguiente es un análisis de sangre total humana que mide su inducción en respuesta a un agonista de TLR7.
Se recolectó sangre entera humana heparinizada de sujetos humanos y se trató con compuestos agonistas de TLR7 de prueba a 1 mM. La sangre se diluyó con medio RPMI 1640 y se usó un prepot Eco 10 nL por pozo, proporcionando una concentración final de 1 uM (10 nL en 10 uL de sangre). Después de mezclar en un agitador durante 30 segundos, las placas se cubrieron y se colocaron en una cámara a 37 °C durante o/n = 17 h. Se preparó el amortiguador de fijación/lisis (5x-> 1x en H2O, se calentó a 37 °C; Nº de cat. BD 558049) y se mantuvo el amortiguador permanente (en hielo) para su uso posterior.
Para tinción de marcadores de superficie (CD69): Abs preparados de superficie: 0,045ul hCD14-FITC (ThermoFisher No. Cat. MHCD1401) 0,6ul hCD19-ef450 (ThermoFisher No. Cat. 48-0198-42) 1,5ul hCD69-PE (No. Cat. BD555531) 0,855ul amortiguador FACS. Agregar 3 ul/pozo, centrifugar 1000 rpm durante 1 minuto y mezclar en un agitador durante 30 segundos, colocar en hielo durante 30 minutos. Detener la estimulación después de 30 minutos con 70 uL de amortiguador de fijación/lisis precalentado 1x y usar Feliex mate para resuspender (15 veces, cambiar las puntas de cada placa) e incubar a 37 ºC durante 10 minutos.
Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos, aspirar con un lavador de placas HCS, mezclar en un agitador durante 30 segundos y luego lavar con 70 µL en dPBS y granular 2xs (2000 rpm durante 5 min) y 50ul lavar en amortiguador FACS 1x granular (2000 rpm por 5 min). Mezclar en el agitador durante 30 seg. Para tinción de marcadores intracelulares (MX-1): Agregar 50 ul de amortiguador BD Perm III y mezcle en un agitador durante 30 seg. Incubar en hielo durante 30 minutos (en la oscuridad). Lavar con 50 uL de amortiguador FACS 2X (centrifugado @ 2300rpm x 5min después de la perm), seguido de la mezcla en el agitador durante 30 seg. Resuspender en 20 uL de amortiguador FACS que contiene el anticuerpo MX1 () (4812) -Alexa 647: Novus Biologicals No. NBP2-43704AF647) 20ul FACS bf 0,8ul hIgG 0,04ul MX-1. Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto, mezcle en un agitador durante 30 segundos e incube las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 minutos, seguido de un lavado de amortiguador FACS 2 veces (centrifugar a 2300 rpm cada 5 minutos después de la perm). Resuspender 20uL (35 uL en total por pozo) de amortiguador FACS y cubrir con papel de aluminio y colocar a 4 °C para leer el día siguiente. Las placas se leyeron en iQuePlus. Los resultados se cargaron en el conjunto de herramientas y las curvas IC50 se generaron en la curva maestra. El 100 % del eje-y se establece en 1 uM de resiquimod.
Inducción de los Genes de Respuesta IFN de tipo I y TNF-alfa en Sangre de Ratón
La inducción de TNF-alfa y los genes de respuesta de IFN Tipo I son eventos posteriores que se producen con la activación de la vía TLR7. El siguiente es un ensayo que mide su inducción en sangre entera de ratón en respuesta a un agonista de TLR7.
La sangre entera de ratón heparinizada se diluyó con RPMI 1640 con Pen-Strep en una proporción de 5:4 (50 uL de sangre entera y 40 uL de medio). Se transfirió un volumen de 90 uL de sangre diluida a los pozos de las placas de cultivo de tejidos de 96 pozos de fondo plano Falcon, y las placas se incubaron a 4 °C durante 1 h. Los compuestos de ensayo en DMSO al 100 % se diluyeron 20 veces en el mismo medio para los ensayos de respuesta de concentración, y luego se agregaron 10 µL de los compuestos de ensayo diluidos a los pozos, de modo que la concentración final de DMSO fue del 0,5 %. Los pozos de control recibieron 10 uL de medio que contenía DMSO al 5 %. Luego, las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO2 durante 17 h. Después de la incubación, se agregó a cada pozo 100 uL del medio de cultivo. Las placas se centrifugaron y se retiró 130 uL de sobrenadante para usar en ensayos de producción de TNFa por ELISA (Invitrogen, número de catálogo 88-7324 de Thermo-Fisher Scientific). Se añadió un volumen de 70 uL de amortiguador de lisis del receptor de ARNm (1 x) con DTT del kit Invitrogen ARNm Catcher Plus (No. Cat. K1570-02) a la muestra restante de 70 uL en el pozo, y se mezcló pipeteando hacia abajo y hacia arriba 5 veces. Luego, la placa se agitó a temperatura ambiente durante 5-10 minutos, seguido de la adición de 2 uL de proteinasa K (20 mg/ml) a cada pozo. Las placas se agitaron durante 15-20 min a temperatura ambiente. Las placas se almacenaron a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
Las muestras congeladas se descongelaron y el ARNm se extrajo usando el kit Invitrogen ARNm Catcher Plus (No. Cat. K1570-02) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó la mitad del rendimiento de ARNm a partir de la extracción de ARN para sintetizar ADNc en 20 μL de reacciones de transcriptasa inversa usando la mezcla maestra Vitrol SuperScript IV de Invitrogen (No. Cat.11756500). La PCR en tiempo real TaqMan® se realizó usando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio de ThermoFisher (Applied Biosystems). Todas las reacciones de PCR en tiempo real se ejecutaron por duplicado usando ensayos comerciales TaqMan prediseñados para la expresión de los genes IFIT1, IFIT3, MX1 y PPIA de ratón y la mezcla maestra TaqMan. PPIA fue usado como el gen de mantenimiento. Se siguieron las recomendaciones del fabricante. Todos los datos sin procesar (Ct) se normalizaron mediante el gen de mantenimiento promedio (Ct) y luego se usó el método Ct (CCt) comparativo para cuantificar la expresión génica relativa (RQ) para el análisis experimental.
SÍNTESIS
La práctica de esta invención puede entenderse adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no de limitación.
Una tabla después de los ejemplos enumera los acrónimos y abreviaturas usados en el presente documento y sus significados.
Ejemplo 1 – Síntesis de los compuestos de acuerdo con la figura 1
Este ejemplo y la FIG.1 se refieren a la síntesis del compuesto IIa-01.
Compuesto 3. Se trató 4-amino-1H-pirazol-5-carboxilato de metilo 2 (4 g, 28,3 mmol) y (Z)-4-(2,3-bis(metoxicarbonil)guanidino)-1H-pirazol-5-carboxilato de metilo 1 en metanol (50 ml) con ácido acético (8,11 ml, 142 mmol), momento en el cual se formó un precipitado. La mezcla de reacción se agitó durante la noche. Se añadió metóxido de sodio (64,8 ml, 283 mmol) y la agitación se continuó durante la noche. LCMS mostró la finalización de la reacción. El pH se ajustó a 5 mediante la adición lenta de ácido acético, por lo que se formó un precipitado que se lavó con agua y luego con acetonitrilo y se secó para proporcionar 5,2 g del compuesto 3 en forma de un sólido blancuzco. LCMS ESI: calculado para C7H7N5O3 = 210,16 (M+H+), encontró 210,0 (M+H+).
Compuesto 4 . El compuesto 3 (2 g, 9,56 mmol), butan-1-amina (1,8 ml, 9 mmol) y DBU (1,6 ml, 10 mmol) en DMSO (10 ml) se trató lentamente con BOP (5 g, 11 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 60 °C durante 2 horas, momento en el cual LCMS mostró la finalización de la reacción. La reacción se purificó directamente en el aparato COMBIFLASH ™ de fase inversa usando 80 g de columna C-18 eluyendo con 0-100 % de acetonitrilo/agua (ácido fórmico al 0,1 %) para producir el compuesto 4 como un sólido blanco. LCMS ESI: calculado para C11H16N6O2 = 265,28 (M+H+), encontró 265,2 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, dmso-d6) δ 8,02 (s, 1H), 3,97 (s, 3H), 1,74 – 1,66 (m, 2H), 1,49 – 1,38 (m, 2H), 1,25 (s, 1H), 0,95 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
Compuesto 6. Una mezcla de 4-(bromometil)-2-metoxibenzoato de metilo 5 (1 g, 3,86 mmol) y ciclobutanamina 5a (0,659 ml, 7,72 mmol) en DMF (2 ml) se calentó a 70 °C durante 30 minutos, momento en el cual se observó LCMS.
La formación de un producto de amina. El exceso de base se evaporó y se agregó Base de Hunig (1,348 ml, 7,72 mmol), seguido de la adición de Boc-anhídrido (0,896 ml, 3,86 mmol). LCMS mostró la finalización de la reacción. El disolvente se evaporó y el producto crudo se purificó mediante un aparato COMBIFLASH ™ usando EtOAc/hexanos para proporcionar 0,82 g del producto deseado 6 en forma de un aceite incoloro. LCMS ESI: calculado para C19H27NO5 = 350,42 (M+H+), encontró 350,1 (M+H+).
Compuesto 7. Una solución del compuesto 6 (0,82 g, 2,347 mmol) en THF (5 ml) a 0 °C se trató lentamente con LiAlH4 (2 M en THF, 1,173 ml, 2,347 mmol) y se agitó durante 30 minutos, momento en el cual se observó LCMS. finalización de la reacción. La reacción se detuvo mediante la adición lenta de metanol y se agitó con solución de sal de Rochelle durante 2 horas. Las capas orgánicas se separaron y el producto crudo 7 se purificó en un aparato COMBIFLASH™ usando EtOAc/hexanos, columna de gel de sílice. LCMS ESI: calculado para C18H27NO4 = 322,41 (M+H+), encontró 322,1 (M+H+).
Compuestos 8 y 9. Una mezcla del compuesto 4 (100 mg, 0,378 mmol), compuesto 7 (182 mg, 0,568 mmol) y trifenilfosfina (248 mg, 0,946 mmol) en THF (3 ml) se trató lentamente con DIAD (0,110 ml, 0,568 mmol) sobre 5 min y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min bajo N2, momento en el cual LCMS mostró la finalización de la reacción. El solvente se evaporó y el producto crudo se purificó en un aparato COMBIFLASH™ de fase inversa usando 80 g de columna C-18 eluyendo con 0-100 % de acetonitrilo/agua (TEAA 1 mM) para proporcionar una mezcla de los compuestos 8 y 9 como un sólido blanco. LCMS ESI: calculado para C29H41N7O5 = 566,69 (M-H+), encontrado 566,3 (M-H+).
Los isómeros se separaron mediante cromatografía de fluidos supercríticos quirales usando Columna: Kromasil 5-CelluCoat, 21 x 250 mm, 5 micras, Fase móvil: 15 % MeOH-DEA / 85 % CO2, Tasa de flujo: 45 ml/min, 150 bar, 40 °C, longitud de onda del detector: 230 nm, Detalles de la inyección: 0,5 ml de ~25 mg/ml en MeOH para proporcionar 17 mg del compuesto 8 y 25 mg del compuesto 9.
Datos analíticos para el compuesto 8: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9,61 (s, 2H), 7,86 (s, 2H), 6,94 (s, 2H), 6,83 (s, 2H), 6,63 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 6,51 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 5,69 (s, 4H), 4,39 (s, 4H), 3,79 (s, 6H), 3,63 (s, 6H), 3,48 (d, J = 6,2 Hz, 4H), 3,33 (s, 20H), 3,18 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 2,05 – 1,95 (m, 8H), 1,53 (t, J = 7,5 Hz, 7H), 1,35 (s, 11H), 1,23 (q, J = 7,2 Hz, 6H), 0,86 (t, J = 7,4 Hz, 6H).
Datos analíticos para el compuesto 9: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9,37 (s, 1H), 8,08 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,71 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 5,48 (s, 2H), 4,42 (s, 3H), 3,78 (d, J = 18,0 Hz, 4H), 3,69 (s, 1H), 3,61 (s, 3H), 3,51 – 3,42 (m, 3H), 2,06 – 1,97 (m, 6H), 1,61 – 1,47 (m, 6H), 1,36 (s, 8H), 1,34 – 1,26 (m, 6H), 0,99 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 0,94 – 0,85 (m, 4H).
Compuesto 8a . Se disolvió una solución de compuesto 8 (13 mg, 0,023 mmol) en THF (0,5 ml) y se trató con TFA (0,018 ml, 0,229 mmol). LCMS en 30 min mostró desprotección Boc. El TFA se evaporó y esta mezcla se trató con hidróxido de sodio (9,16 mg, 0,229 mmol) y se calentó a 60 °C durante 2 h, momento en el cual LCMS mostró la finalización de la reacción. La base se neutralizó mediante la adición lenta de HCl 6 M y se trató con EtOAc/agua. El material crudo se purificó mediante HPLC preparativa en las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 200 mm x 19 mm, partículas de 5 μm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Gradiente: parada a 0 minutos al 7 % de B, B al 7-47 % durante 20 minutos, después una parada de a 4 minutos al 100 % de B; Caudal: 20 ml/min. LCMS ESI: calculado para C22H31N7O = 410,5 (M+H+), encontrado 410,2 (M+H+). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6 ) δ 7,54 (s, 3H), 7,02 (s, 3H), 6,76 (d, J= 7,6 Hz, 3H), 6,47 - 6,38 (m, 5H), 5,60 (d, J=11,5 Hz, 10H), 3,58 (s, 2H), 3,47 (s, 1H), 3,42 (s, 2H), 3,38 (s, 2H), 3,18 - 3,11 (m, 2H), 2,02 (s, 4H), 1,90 (s, 5H), 1,70 (t, J= 9,5 Hz, 5H), 1,60 (d, J= 9,8 Hz, 3H), 1,49 (dt, J= 24,2, 8,3 Hz, 9H), 1,36 (d, J= 19,4 Hz, 4H), 1,20 (dt, J= 15,0, 7,2 Hz, 6H), 0,84 (t, J= 7,4 Hz, 9H).
Compuesto IIa-01. El compuesto IIa-01 se preparó de un modo similar al usado para el compuesto 8a. LCMS ESI: calculado para C22H31N7O = 410,5 (M-H+), encontrado 410,2 (M- H+). RMN 1H (500 MHz, DMSO- d6 ) δ 7,64 (s, 1H), 7,02 (s, 1H), 6,90 (d, J= 7,7 Hz, 1H), 6,85 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 5,75 (s, 1H), 5,37 (s, 2H), 3,56 (s, 1H), 3,18 - 3,11 (m, 1H), 2,55 (s, 3H), 2,04 (d, J= 9,0 Hz, 2H), 1,88 (s, 6H), 1,71 (t, J= 9,7 Hz, 2H), 1,56 (dq, J= 19,1, 10,6, 10,2 Hz, 4H), 1,31 (q, J= 7,7 Hz, 2H), 0,88 (t, J= 7,4 Hz, 3H).
Ejemplo 2- Síntesis de compuestos de acuerdo con las figuras 2A-2B
Este ejemplo y las Figs.2A-2B se refieren a la síntesis de los compuestos IIa-14 y IIa-19 y otro compuesto fabricado de manera análoga.
Compuestos 12 y 13. Una solución de 4-nitro-1H-pirazol-5-carboxilato de metilo 10 (3,27 g, 19,11 mmol) en DMF (20 ml) se trató con K2CO3 (2,90 g, 21,02 mmol) y 4-(bromometil)-3-metoxibenzoato de metilo 11 (5 g, 19,30 mmol). La reacción se inició a 0 °C y se dejó proceder durante 1 h, momento en el cual LCMS mostró la finalización de la reacción con aproximadamente 1:5 mezcla de productos. La base se filtró y la reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con agua 2 veces. El solvente se evaporó y el producto crudo se llevó a la siguiente etapa como está. LCMS ESI: calculado para C15H15N3O7 = 350,2 (M-H+), encontrado 350,0 (M-H+).
Para fines de caracterización, se separó una pequeña cantidad de la mezcla de productos usando cromatografía en columna de gel de sílice usando EtOAc a 0-50 % /hexanos.
Datos analíticos para el compuesto 12: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8,40 (s, 1H), 7,57 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,27 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,53 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,84 (d, J = 16,2 Hz, 6H).
Datos analíticos para el compuesto 13: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9,05 (s, 1H), 7,62 – 7,51 (m, 2H), 7,28 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,47 (s, 2H), 3,87 (s, 8H), 3,31 (s, 1H).
Compuestos 14 y 15. Una solución de los compuestos 12 y 13 (2 g, 5,73 mmol), zinc y formiato de amonio se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual LCMS mostró la finalización de la reacción. La filtración y la concentración produjeron una mezcla cruda de los compuestos 14 y 15. LCMS ESI: calculado para C15H17N3O5 = 320,3 (M+H+), encontró 320,2 (M+H+).
Compuestos 16 y 17. Una mezcla de los compuestos 14 y 15 (1,830 g, 5,73 mmol) y el compuesto 1 en MeOH (20 ml) se trató con ácido acético (1,640 ml, 28,7 mmol) y se agitó durante la noche. La solución se trató con metóxido de sodio (13,11 ml, 57,3 mmol) y se agitó durante la noche. LCMS mostró conversión al producto. El pH se ajustó a 5 y el precipitado resultante se lavó con agua. El residuo se secó para proporcionar una mezcla de los compuestos 16 y 17. LCMS ESI: calculado para C17H17N5O6 = 388,3 (M+H+), encontró 388,1 (M+H+).
Compuestos 18 y 19. Una mezcla de los compuestos 16 y 17 (1 g, 2,58 mmol) en DMSO (10 ml) se trató con butan-1-amina (0,510 ml, 5,16 mmol), DBU (0,428 ml, 2,84 mmol) seguido lentamente por BOP (1,370 g., 3,10 mmol). La reacción se calentó a 70 °C durante 2 h, momento en el cual LCMS mostró la finalización de la reacción. La reacción se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se tomaron tal como están en la siguiente etapa. LCMS ESI: calculado para C21H26N6O5 = 443,4 (M+H+), encontró 443,2 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9,41 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 8,08 (s, 1H), 7,57 – 7,42 (m, 3H), 6,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,80 (s, 1H), 5,60 (s, 2H), 4,04 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 3,95 – 3,82 (m, 10H), 3,62 (d, J = 6,1 Hz, 4H), 3,45 (q, J = 7,0 Hz, 3H), 2,68 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 2,57 – 2,50 (m, 6H), 2,00 (s, 1H), 1,59 (p, J = 7,3 Hz, 3H), 1,54 – 1,48 (m, 1H), 1,39 – 1,26 (m, 3H), 1,18 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 0,86 (dt, J = 29,5, 7,3 Hz, 5H).
Compuestos 18a y IIa-14. Una solución de los compuestos 18 y 19 (1,142 g, 2,58 mmol) en THF (2,58 ml, 5,16 mmol) a 0 °C se trató con LiAlH4 (THF, 2,58 ml, 5,16 mmol) y se agitó durante 1 h, después de lo cual, LCMS mostró la finalización de la reacción. La reacción se detuvo con MeOH y se agitó con solución de sal de Rochelle durante la noche. El producto se extrajo con EtOAc y se llevó a la siguiente etapa como una mezcla de compuestos crudos que reducen el producto intermedio. LCMS ESI: calculado para C20H26N6O4 = 415,4 (M+H+), encontró 415,2 (M+H+). Una mezcla de los productos intermedios reducidos (1069 mg, 2,58 mmol) en 1,4-dioxano (10 ml) se trató con hidróxido de sodio acuoso (2,58 ml, 25,8 mmol) y se calentó a 80 °C durante 5 horas, después de lo cual, LCMS mostró formación de producto. La base se neutralizó con HCl 6 M y el solvente se evaporó. El residuo se absorbió en 5 ml de DMF y la jeringa se filtró. El solvente se evaporó para proporcionar una mezcla 3:1 de los compuestos 18a y IIa-14. LCMS ESI: calculado para C18H24N6O2 = 357,4 (M+H+), encontrado 357,2 (M+H+).
Compuestos 18b y IIa-19. Una solución de los compuestos Ia-38 y IIa-14 (420 mg, 1,178 mmol) en THF (1 ml) se trató con cloruro de tionilo (0,172 ml, 2,357 mmol) y se agitó durante 30 minutos, después de lo cual LCMS mostró la finalización de la reacción. El solvente se evaporó y el producto en crudo se llevó a la siguiente etapa como está. LCMS ESI: calculado para C18H23ClN6O = 375,8 (M+H+), encontrado 375,2 (M+H+).
Una mezcla de la mezcla del producto crudo anterior (20 mg, 0,053 mmol) y tetrahidro-2H-piran-4-amina 22 (5,40 mg, 0,053 mmol) en DMF (1 ml) se calentó a 70 °C durante 1 h, después de cual LCMS mostró la finalización de la reacción. La reacción se filtró con jeringa y los productos crudos se purificaron y se separaron mediante LC/MS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 200 mm x 19 mm, partículas de 5 μm; Fase móvil A: 5:95 acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Gradiente: una retención de 2 minutos al 6 % B, 6-27 % B durante 25 minutos, luego se mantuvo 2 minutos a 100 % B; Tasa de flujo: 20 ml/min; Temperatura de columna: 25 C. La recolección de fracciones fue activada por señales de MS. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga.
Datos analíticos para IIa-19: LCMS ESI: calculado para C23H33N7O2 = 440,5 (M+H+), encontrado 440,1 (M+H+). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 9,39 (s, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,94 (s, 0H), 7,86 (s, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,14-7,03 (m, 2H), 5,51 (s, 2H), 4,16 (s, 2H), 3,96-3,90 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,29 (d, J= 11,6 Hz, 2H), 2,89 (s, 1H), 2,73 (s, 1H), 2,55 (s, 1H), 2,00 (d, J= 12,6 Hz, 2H), 1,58 (p, J= 7,5 Hz, 4H), 1,31 (q, J=7,5 Hz, 2H), 0,89 (t, J= 7,4 Hz, 3H).
Se prepararon otros compuestos de forma simular a la del compuesto IIa-19, pero usando la amina indicada en la tabla D en lugar de la tetrahidro-2H-piran-4-amina 22 en la última etapa.
Figure imgf000036_0001
Ejemplo 3 – Síntesis de los compuestos de acuerdo con la FIG.3
El compuesto IIa-35 se fabricó siguiendo el esquema de síntesis de la FIG. 3. Masa esperada (M+H) 401,4, observada 401,1.
Ejemplo 4 – Síntesis de compuestos de acuerdo con las figuras 4A-4B
Este ejemplo y las FIG. 4A-4B se refiere a la síntesis de los compuestos IIb-01 y IIb-04 y otros compuestos fabricados de manera similar.
Compuesto 30 . Una suspensión del compuesto 4 (400 mg, 1,513 mmol) en dioxano (5 ml) se trató con hidróxido de sodio (10 N en agua, 1,513 ml, 15,13 mmol) y se agitó a 60 ºC durante 45 minutos. La mezcla de reacción se concentró. El producto crudo se disolvió en agua y se purificó por cromatografía de fase inversa en una unidad COMBIFLASH™ usando una columna C-18 de 150 g eluyendo con TEAA 10 mM en acetonitrilo: 10 mM en agua, gradiente 0-70 %. Las fracciones deseadas se congelaron y se liofilizaron para proporcionar el compuesto 30 (150 mg, 0,727 mmol, 48,1 % de rendimiento). LCMS ESI: calculado para C9H15N6 = 207,1 (M+H+), encontrado 207,2 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,56 (s a, 1H), 5,53 (s a, 2H), 3,43 (d a, J=6,2 Hz, 2H), 1,57 (t, J=7,2 Hz, 2H), 1,44 - 1,29 (m, 2H), 0,95 - 0,76 (m, 3H).
Compuesto 33 . Una suspensión de 6-fluoronicotinaldehído 31 (1,809 g, 14,46 mmol), 4-hidroxibenzoato de metilo 32 (2 g, 13,15 mmol) y K2CO3 (1,998 g, 14,46 mmol) en DMF (26,3 ml) se agitó a 110 °C durante 4 horas. LCMS indicó que la reacción se completó. Al enfriar, la reacción se apagó con agua. El sólido resultante se recolectó mediante filtración y se enjuagó con agua y se secó al vacío para producir el compuesto 33 (3,30 g, 12,84 mmol, 95,1 % de rendimiento). LCMS ESI: calculado para C14H11NO4 = 258,1 (M+H+), encontrado 258,0 (M+H+). RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ 10,01 (s, 1H), 8,63 (d, J=2,4 Hz, 1H), 8,23 (dd, J=8,6, 2,4 Hz, 1H), 8,17 - 7,97 (m, 2H), 7,27 -7,22 (m, 2H), 7,10 (d, J=8,6 Hz, 1H), 3,93 (s, 3H).
Compuesto 34. Una solución del compuesto 33 (3,76 g, 14,62 mmol) en MeOH (100 ml) se trató con NaBH4 (0,553 g, 14,62 mmol) en porciones a 0 °C y luego se agitó durante 10 minutos con enfriamiento continuo. LCMS indicó que la reacción se había completado. La reacción se detuvo agregando lentamente la mitad de NH4Cl saturado. Se continuó la agitación durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El sólido crudo se suspendió en agua y se recolectó por filtración y se secó al vacío para producir el compuesto 34 (3,37 g, 13,00 mmol, 89 % de rendimiento). LCMS ESI: calculado para C14H13NO4 = 260,1 (M+H+), encontrado 260,0(M+H+). RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ 8,21 (d, J=2,2 Hz, 1H), 8,12 - 8,04 (m, 2H), 7,81 (dd, J=8,4, 2,4 Hz, 1H), 7,21 - 7,13 (m, 2H), 6,99 (d, J=8,4 Hz, 1H), 4,71 (s, 2H), 3,91 (s, 3H).
Compuesto 35 . El compuesto 34 (7,9 g, 30,5 mmol) en DCM (75 ml) se trató con MsCl (2,61 ml, 33,5 mmol) a 0 ºC. Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 horas, la reacción se realizó. La reacción se inactivó con agua. Después de la extracción con DCM (3 x 20 ml), los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó en una columna de sílice ISCO (80 g), eluyendo con acetato de etilo: hexanos, gradiente 0-70 %. Las fracciones deseadas se concentraron para producir el compuesto 35 (7,47 g, 26,9 mmol, rendimiento del 88 %). LCMS ESI: calculado para C14H13ClNO3 = 278,1 (M+H+), encontrado 278,0(M+H+). RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ 8,19 (d, J=2,2 Hz, 1H), 8,13 - 8,02 (m, 2H), 7,79 (dd, J=8,5, 2,5 Hz, 1H), 7,22 - 7,14 (m, 2H), 6,99 (d, J=8,6 Hz, 1H), 4,57 (s, 2H), 3,92 (s, 3H).
Compuestos 36 y 37 . El compuesto 30 (70 mg, 0,339 mmol) en DMF (1 ml) se trató con carbonato de cesio (332 mg, 1,018 mmol), seguido del compuesto 35 (94 mg, 0,339 mmol). Después de agitar durante 5 horas a temperatura ambiente, la reacción se completó. Después de enfriar con agua y extraer con acetato de etilo (3 x 10 ml), los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó en una columna de sílice ISCO (24 g), se eluyó con MeOH al 20 % en DCM: DCM, 0 -60 % gradiente. Las fracciones deseadas se concentraron para producir una mezcla de los compuestos 36 y 37 (120 mg, 0,080 mmol, 79 % de rendimiento), en una proporción de 1:4. LCMS ESI: calculado para C23H26N7O3 = 448,2 (M+H+), encontró 448,3 (M+H+).
Compuestos 36a y IIb-01. Una mezcla de los compuestos 36 y 37 (60 mg, 0,114 mmol) en THF (2 ml) se trató con LiAlH4 (1,0 M en THF, 0,22 ml, 0,22 mmol) lentamente a 0 °C bajo N2. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 1 h, momento en el cual LCMS mostró la finalización de la reacción. La reacción se detuvo mediante la adición de Na2SO4•10 H20 lentamente, seguido de MeOH y agitando a temperatura ambiente durante 3 horas. El sólido se filtró. El filtrado se concentró. El residuo se disolvió en DMF y los productos se purificaron mediante LC/MS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 200 mm x 19 mm, partículas de 5 μm; Fase móvil A: 5:95 acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Gradiente: una retención de 0 minutos al 10 % B, 10-45 % B durante 20 minutos, luego se mantuvo 4 minutos a 100 % B; Tasa de flujo: 20 ml/min. La recolección de fracciones fue activada por señales de MS y UV. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga.
Datos analíticos para el compuesto IIb-01: LCMS ESI: calculada para C22H26N7O2 = 420,2 (M+H+), encontrada 420,2 (M+H+). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 9,45 - 9.29 (m, 1H), 8,21 – 8,15 (m, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,86 – 7,78 (m, 1H), 7,78 – 7,68 (m, 1H), 7,35 (d a, J = 8,2 Hz, 2H), 7,08 – 7,03 (m, 2H), 7,03 – 6,99 (m, 1H), 5,52 (s, 2H), 4,50 (d a, J = 4,9 Hz, 2H), 2,98 – 2,82 (m, 2H), 1,65 – 1,51 (m, 2H), 1,40 – 1,27 (m, 2H), 0,90 (t a, J = 12 Hz, 3H).
Compuesto IIb-04. Una mezcla de compuesto 36a y compuesto IIb-04 (40 mg, 0,095 mmol) en THF (1 ml) se trató con cloruro de tionilo (0,14 ml, 1,9 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 horas, LCMS mostró la finalización de la reacción. El solvente se evaporó y el exceso de cloruro de tionilo se eliminó azeotrópicamente con DCM. El material de cloruro crudo se llevó directamente al siguiente paso sin purificación adicional. LCMS ESI: calculado para C22H25N7O = 438,2 (M+H+), encontrado 438,1 (M+H+).
Una mezcla de los cloruros anteriores (40 mg, 0,091 mmol) del párrafo anterior se disolvió en DMF (1,0 ml) y se trató con 2-aminoetan-1-ol (55,0 µl, 0,91 mmol), seguido de agitación a temperatura ambiente durante 16 horas. LCMS mostró la finalización de la reacción. La mezcla se purificó mediante LC/MS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 200 mm x 19 mm, partículas de 5 μm; Fase móvil A: acetonitrilo al 5:95: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95: 5 acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: una retención de 0 minutos al 8 % B, 8-48 % B durante 25 minutos, luego una retención de 4 minutos al 100 % B; Tasa de flujo: 20 ml/min; Temperatura de columna: 25 °C. La recolección de fracciones fue activada por señales de MS. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. Datos analíticos para el compuesto IIb-04: LCMS ESI: calculado para C24H31N8O2 = 463,2 (M+H+), encontrado 463,3 (M+H+). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,18 (s a, 2H), 7,91 (s a, 1H), 7,84 (d a, J = 8,7 Hz, 1H), 7,55 (d a, J = 8,1 Hz, 2H), 7,18 (d a, J = 8,3 Hz, 2H), 7,09 (d a, J = 8,7 Hz, 1H), 5,55 (s, 2H), 4,18 (s, 2H), 3,73 - 3,63 (m, 2H), 3,12 -2,74 (m, 4H), 1,69 - 1,50 (m, 2H), 1,38 - 1,25 (m, 2H), 0,91 (t a, J = 7,3 Hz, 3H).
Reemplazo del 6-fluoronicotinaldehído 31 con 4-fluoro-2-metoxibenzaldehído en el esquema de reacción de las FIG.
4A-4B y generalmente siguiendo los procedimientos anteriores, los compuestos de la tabla E se prepararon de manera análoga, usando la amina indicada.
Figure imgf000038_0002
Ejemplo 5 – Síntesis de los compuestos III-01 y III-02
Este ejemplo se refiere a la preparación de los compuestos III-01 y III-02. Estos compuestos se prepararon haciendo reaccionar los compuestos 36 y 37 con el reactivo de MeMgCl Grignard.
Figure imgf000038_0001
A una mezcla de los compuestos 36 y 37 (60 mg, 0,134 mmol) en THF (1 ml) se añadió MeMgCl (0,171 ml, 0,513 mmol) a 0 ºC. Después de 1 hora, LCMS mostró que la reacción se completó. La mezcla se purificó mediante LC/MS preparativa con las siguientes condiciones: Columna: XBridge C18, 200 mm x 19 mm, partículas de 5 μm; Fase móvil A: 5:95 acetonitrilo: agua con TFA al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 acetonitrilo: agua con TFA al 0,1 %; Gradiente: una retención de 0 minutos al 10 % B, 10-45 % B durante 20 minutos, luego se mantuvo 4 minutos a 100 % B; Tasa de flujo: 20 ml/min; Temperatura de la columna: 25 °C. La recolección de fracciones fue activada por señales de MS. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación centrífuga. Datos analíticos para III-02. LCMS ESI: calculado para C24H30N7O2 = 448,2 (M+H+), encontrado 448,2 (M+H+). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,22 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,06 – 7,97 (m, 2H), 7,87 (dd a, J = 8,5, 2,4 Hz, 2H), 7,23 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,15 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,99 – 5,97 (m, 1H), 5,56 (s, 2H), 3,58 – 3,54 (m, 2H), 1,64 – 1,49 (m, 2H), 1,37 – 1,25 (m, 2H), 1,17 (s, 6H), 0,90 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,71 – 0,70 (m, 1H).
La descripción detallada anterior de la invención incluye pasajes que están relacionados principal o exclusivamente con partes o aspectos particulares de la invención. Debe entenderse que esto es por claridad y conveniencia, que una característica particular puede ser relevante en más que solo el pasaje en el que se describe, y que la descripción aquí incluye todas las combinaciones apropiadas de información que se encuentra en los diferentes pasajes. De manera similar, aunque las diversas figuras y descripciones en el presente documento se refieren a modalidades específicas de la invención, debe entenderse que cuando se describe una característica específica en el contexto de una figura o modalidad particular, la característica también se puede usar, en la medida apropiada, en el contexto de otra figura o modalidad, en combinación con otra característica, o en la invención en general.
Además, aunque la presente invención se ha descrito particularmente en términos de ciertas modalidades preferidas, la invención no se limita a tales modalidades preferidas. Más bien, el alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
SIGLAS Y ABREVIATURAS
Esta es una lista de siglas y abreviaturas usadas en esta descripción, junto con sus significados.
Figure imgf000039_0001
REFERENCIAS
A continuación, se proporcionan citas completas de las siguientes referencias citadas de manera abreviada por el primer autor (o inventor) y citadas antes en esta descripción.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula II
Figure imgf000042_0001
en la que
cada X1 es independientemente N o CR2;
X2 es O, CH2, NH, S, o N(alquilo C1-C3);
R1 es H, CH3(CH2)1-3, CH3(CH2)0-1O(CH2)2-3, CH3(CH2)0-3C(=O), CH3(CH2)0-1O(CH2)2-3C(=O),
Figure imgf000042_0002
R2 es H, O(alquiloC1- C3), alquilo C1-C3, Cl, F, o CN;
R3 es H, halo, OH, CN, NH2, NH(alquilo C1-C5), N(alquilo C1-C5)2, NH(CH2)0-1(cicloalquilo C3-C6), NH(bicicloalquilo C4-C8), NH(espirocicloalquilo C6-C10), N(cicloalquilo C3-C6)2, NH(CH2)1-3(arilo), N((CH2)1-3(arilo))2, una porción de amina cíclica que tiene la estructura
Figure imgf000042_0003
una porción aromática o heteroaromática de 6 miembros o una porción heteroaromática de 5 miembros; en donde
un alquilo, un cicloalquilo, un bicicloalquilo, un espirocicloalquilo, una amina cíclica, una porción aromática o heteroaromática de 6 miembros o heteroaromática de 5 miembros están opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de OH, halo, CN, (alquilo C1-C3), O(alquilo C1-C3), C(=O)(Me), SO2(alquilo C1-C3), C(=O)(Et), NH2, NH(Me), N(Me)2, NH(Et), N(Et)2 y N(alquilo C1-C3), (CH2)1-2OH, (CH2)1-2OMe; y
una porción de cicloalquilo, bicicloalquilo, espirocicloalquilo o amina cíclica puede tener un grupo CH2 sustituido por O, S, SO2, NH, C(=O), N (alquilo C1-C3), NC(=O)( (alquilo C1-C3) o N(Boc);
m es 0 o 1;
y
n es 1, 2, o 3.
2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en donde el grupo R1 es
Figure imgf000042_0004
3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en donde la porción
Figure imgf000042_0005
o cada X1 es CR2 o no más de dos X1 son N.
4. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en donde la porción
Figure imgf000043_0001
5. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en donde el grupo R3 se selecciona del grupo que consiste en Cl, H,
Figure imgf000043_0002
Figure imgf000044_0001
6. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una estructura de conformidad con la Fórmula II’
Figure imgf000045_0001
7. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una estructura de conformidad con la Fórmula IIa
Figure imgf000045_0002
8. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula IIb
Figure imgf000045_0003
9. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que está unido covalentemente a una porción de poli(etilenglicol) con un tamaño de entre 2 kDa y 40 kDa.
10. Una combinación de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un agente de inmunoterapia anticancerígena para su uso en un método para tratar el cáncer.
11. Una combinación para su uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el agente de inmunoterapia anti-cáncer es un anticuerpo antagonista anti-CTLA-4, anti-PD-1 o anti-PD-L1.
12. Una combinación para su uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, linfoma, cáncer de piel, cáncer urotelial, cáncer gástrico, cáncer hepatocelular o cáncer colorrectal.
13. Una combinación para su uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde el cáncer es cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, linfoma de Hodgkin, melanoma, cáncer de piel de Merkel, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer hepatocelular o cáncer colorrectal.
14. Una combinación para su uso de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13, en donde el agente de inmunoterapia contra el cáncer es ipilimumab, nivolumab o pembrolizumab.
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