CN112513046A

CN112513046A - 作为TOLL样受体7(TLR7)激动剂的2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶化合物及其方法和用途

Info

Publication number: CN112513046A
Application number: CN201980051044.8A
Authority: CN
Inventors: Y·B·波德尔; S·冈沃; 何立崎; P·西瓦帕卡萨姆
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2019-08-01
Publication date: 2021-03-16
Also published as: EP3830090A1; CN112752759A; JP7337907B2; CO2021000942A2; US11554120B2; IL280473A; WO2020028608A1; US11400094B2; JP2021533135A; TW202019933A; KR20210039411A; EP3830089B1; WO2020028610A1; US20200038403A1; US20200039986A1; JP2023179420A; MX2021001311A; JP7337909B2; KR20210039410A; ES2941520T3

Abstract

根据式II的化合物可用作Toll样受体7(TLR7)的激动剂。

Description

作为TOLL样受体7(TLR7)激动剂的2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶化合物及其方法和用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月3日提交的美国临时申请序列号62/714,238的35 U.S.C.§119(e)下的权益；将其公开内容通过引用并入本文。

背景技术

本公开文本涉及Toll样受体7(“TLR7”)激动剂及其缀合物以及用于此类激动剂及其缀合物的制备和使用方法。

Toll样受体(“TLR”)是识别病原体相关分子模式(“PAMP”)的受体，所述病原体相关分子模式是在某些种类的病原体中保守的小分子基序。TLR可以位于细胞表面或细胞内。通过结合其同源PAMP而激活TLR传递了宿主内存在相关病原体(即感染)的信号并且刺激宿主的免疫系统以抵抗感染。人具有10种TLR，称为TLR1、TLR2、TLR3等。

通过激动剂激活TLR-TLR7是被研究最多的-可以对疫苗和免疫治疗剂通过刺激总体免疫应答而在治疗除实际病原体感染以外的多种病症中的作用产生积极效果。因此，对TLR7激动剂在癌症免疫疗法中作为疫苗佐剂或作为增强剂的用途存在很大兴趣。参见例如，Vasilakos和Tomai2013、Sato-Kaneko等人2017、Smits等人2008、和Ota等人2019。

TLR7(位于内体膜上的细胞内受体)识别与单链RNA病毒相关的PAMP。它的激活会诱导I型干扰素(诸如IFNα和IFNβ)的分泌(Lund等人2004)。TLR7具有两个结合位点，一个用于结合单链RNA配体(

等人2007)并且一个用于结合小分子(诸如鸟苷)(Zhang等人2016)。

TLR7可以结合基于1H-咪唑并[4,5-c]喹啉骨架的鸟苷样合成激动剂(诸如咪喹莫特、瑞喹莫德和嘎德莫特)并且被其激活。关于小分子TLR7激动剂的综述，参见Cortez和Va2018。

基于喋啶酮分子骨架的合成TLR7激动剂也是已知的，如通过维沙莫德(vesatolimod)例示(Desai等人2015)。

经常根据通式(A)公开基于嘌呤样骨架的其他合成TLR7激动剂：

其中R、R’和R”是结构变量，并且R”典型地含有未取代的或取代的芳族或杂芳族环。

具有嘌呤样骨架的生物活性分子及其在治疗诸如纤维化、炎性障碍、癌症或病原性感染的病症中的用途的公开文本包括：Akinbobuyi等人2015和2016；Barberis等人2012；Carson等人2014；Ding等人2016、2017a、和2017b；Graupe等人2015；Hashimoto等人2009；He等人2019a和2019b；Holl dack等人2012；Isobe等人2009a和2012；Poudel等人2019a和2019b；Pryde 2010；和Young等人2019。

基团R”可以是吡啶基：Bonfanti等人2015a和2015b；Halcomb等人2015；Hirota等人2000；Isobe等人2002、2004、2006、2009a、2009b、2011、和2012；Kasibhatla等人2007；Koga-Yamakawa等人2013；Musmuca等人2009；Nakamura 2012；Ogita等人2007；和Yu等人2013。

公开了其中式(A)的6,5-稠合环系统-与咪唑五元环稠合的嘧啶六元环-被修饰的相关分子。(a)Dellaria等人2007、Jones等人2010和2012、和Pilatte等人2017公开了其中嘧啶环被吡啶环替代的化合物。(b)Chen等人2011、Coe等人2017、和Zhang等人2018公开了其中咪唑环被吡唑环替代的化合物。(c)Cortez等人2017和2018；Li等人2018；和McGowan等人2016a、2016b、和2017公开了其中咪唑环被吡咯环替代的化合物。

Bonfanti等人2015b和2016以及Purandare等人2019公开了其中大环跨越嘌呤部分的两个环的TLR7调节剂：

TLR7激动剂可以与配偶体分子缀合，所述配偶体分子可以是例如磷脂、聚(乙二醇)(“PEG”)、抗体或另一种TLR(通常是TLR2)。示例性的公开文本包括：Carson等人2013、2015、和2016；Chan等人2009和2011；Cortez等人2017；Gadd等人2015；Lioux等人2016；Maj等人2015；Vernejoul等人2014；和Zurawski等人2012。频繁的缀合位点是在式(A)的R”基团处。

Jensen等人2015公开了阳离子脂质媒介物用于递送TLR7激动剂的用途。

一些TLR7激动剂(包括瑞喹莫德)是双重TLR7/TLR8激动剂。参见例如，Beesu等人2017、Embrechts等人2018、Lioux等人2016、和Vernejoul等人2014。

本说明书的结尾处列出了通过第一作者或发明人和年份对本文中引用的文献的完全引用。

发明内容

本说明书涉及具有2H-吡唑并[4,3-d]嘧啶芳族系统的化合物，其具有作为TLR7激动剂的活性

在一方面，提供了一种具有根据式II的结构的化合物

其中

每个X¹独立地是N或CR²；

X²是O、CH₂、NH、S或N(C₁-C₃烷基)；

R¹是H、CH₃(CH₂)_1-3、CH₃(CH₂)_0-1O(CH₂)_2-3、CH₃(CH₂)_0-3C(＝O)、CH₃(CH₂)_0-1O(CH₂)_2-3C(＝O)、

R²是H、O(C₁-C₃烷基)、C₁-C₃烷基、Cl、F或CN；

R³是H、卤代、OH、CN、NH₂、NH(C₁-C₅烷基)、N(C₁-C₅烷基)₂、NH(CH₂)_0-1(C₃-C₆环烷基)、NH(C₄-C₈二环烷基)、NH(C₆-C₁₀螺环烷基)、N(C₃-C₆环烷基)₂、NH(CH₂)_1-3(芳基)、N((CH₂)_1-3(芳基))₂、具有

结构的环胺部分、6元芳族或杂芳族部分或5元杂芳族部分；

其中

烷基、环烷基、二环烷基、螺环烷基、环胺、6元芳族或杂芳族或5元杂芳族部分任选地被选自以下的一种或多种取代基取代：OH、卤代、CN、(C₁-C₃烷基)、O(C₁-C₃烷基)、C(＝O)(Me)、SO₂(C₁-C₃烷基)、C(＝O)(Et)、NH₂、NH(Me)、N(Me)₂、NH(Et)、N(Et)₂、和N(C₁-C₃烷基)、(CH₂)_1-2OH、(CH₂)_1-2OMe；并且

环烷基、二环烷基、螺环烷基、或环胺部分可以具有被以下替代的CH₂基团：O、S、SO₂、NH、C(＝O)、N(C₁-C₃烷基)、NC(＝O)(C₁-C₃烷基)、或N(Boc)；

m是0或1；

并且

n是1、2或3。

本文公开的化合物具有作为TLR7激动剂的活性，并且一些化合物可以与抗体缀合，用于靶向递送至预期作用的靶组织或器官。还可以将其聚乙二醇化，以调节其药物特性。

本文公开的化合物或其缀合物或其聚乙二醇化衍生物可以用于通过向遭受顺从通过激活免疫系统的治疗的病症的受试者施用治疗有效量的此类化合物或其缀合物或其聚乙二醇化衍生物(尤其是与疫苗或癌症免疫治疗剂组合)来治疗此类受试者。

附图说明

图1、2A、2B、3、4A和4B示出了用于制备本文公开的化合物的反应方案。

图5和6示出了将接头与本公开文本的化合物附接而使其适合于缀合的方案。

具体实施方式

定义

“抗体”意指完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链变体。完整或全长抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链包含重链可变区(V_H)和包含三个结构域C_H1、C_H2和C_H3的重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(V_L或V_k)和包含一个单结构域的轻链恒定区C_L。V_H区和V_L区可以进一步细分为高变性区域，称为互补决定区(CDR)，散布有较保守的框架区(FR)。每个V_H和V_L包含三个CDR和四个FR，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。恒定区可以介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。如果抗体以5x 10^-8M或更小、更优选1x 10^-8M或更小、更优选6x 10^-9M或更小、更优选3x 10^-9M或更小、甚至更优选2x 10^-9M或更小的K_D与抗原X结合，则认为所述抗体“特异性结合至”抗原X。所述抗体可以是嵌合的、人源化的、或优选地是人的。重链恒定区可以经工程化以影响糖基化类型或程度，以延长抗体的半衰期、增强或减少与效应细胞或补体系统的相互作用、或调节一些其他特性。工程化可以通过替换、添加或缺失一个或多个氨基酸或通过用来自另一种免疫球蛋白类型的结构域替换结构域或前述的组合来完成。

抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”(或简单地，“抗体部分”或“抗体片段”)意指抗体的保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行，所述片段诸如(i)Fab片段，为由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，为包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，其实质上是具有铰链区的一部分的Fab(参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,第6版,Saunders Elsevier 2007)；(iv)由V_H结构域和C_H1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体的单臂的V_L结构域和V_H结构域组成的Fv片段，(vi)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由V_H结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，为含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。优选的抗原结合片段是Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv、和Fd片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由分开的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头能够将它们制成单个蛋白质链，在所述单个蛋白质链中V_L区和V_H区配对形成单价分子(称为单链Fv或scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”范围内。

除非另外指示(例如通过引用SEQ ID NO:列表中的线性编号)，否则对抗体重链或轻链可变区(V_H或V_L)中氨基酸位置的编号的引用是根据Kabat系统的(Kabat等人,“Sequences of proteins of immunological interest,第5版,公开号91-3242,U.S.Dept.Health&Human Services,NI H,贝塞斯达,马里兰州,1991，下文称为“Kabat”)并且对抗体重链或轻链恒定区(C_H1、C_H2、C_H3或C_L)中氨基酸位置的编号的引用是根据如Kabat中列出的EU索引。参见Lazar等人,US 2008/0248028A1，将其公开内容通过引用并入本文，例如此类使用。此外，ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)在其网站上提供了标题为“IMGTScientific Chart:Correspondence between C Numberings”的表，其示出了对于重链恒定区，其编号系统EU编号与Ka bat编号之间的对应关系。

“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合抗原X的分离的抗体基本上不含特异性结合除抗原X外的抗原的抗体)。然而，特异性结合抗原X的分离的抗体可以与其他抗原(诸如来自其他物种的抗原X分子)具有交叉反应性。在某些实施方案中，分离的抗体与人抗原X特异性结合并且不与其他(非人)抗原X抗原交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物。

“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”意指单一分子组成的抗体分子制剂，其对特定表位展示单一结合特异性和亲和力。

“人抗体”意指具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区(以及恒定区，如果存在的话)均源自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括随后的修饰，所述修饰包括天然修饰或合成修饰。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，“人抗体”不包括其中源自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。

“人单克隆抗体”意指显示出单一结合特异性的具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤产生的，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的获自具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞。

“脂族”意指直链或支链的饱和或不饱和的非芳族烃部分，其具有指定数量的碳原子(例如，如在“C₃脂族”、“C_1-5脂族”、“C₁-C₅脂族”、或“C₁至C₅脂族”中，后三个术语与具有从1至5个碳原子的脂族部分同义)或者在未明确指定碳原子数量的情况下从1至4个碳原子(在不饱和脂族部分的情况下2至4个碳)。相似的理解应用于其他类型中碳原子的数量，如在C_2-4烯烃、C₄-C₇脂环族等中。以类似的方式，诸如“(CH₂)_1-3”的术语应理解为对下标是1、2或3的简写，使得此类术语代表CH₂、CH₂CH₂、和CH₂CH₂CH₂。

“烷基”意指饱和脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同的惯例是可适用的。作为说明，C₁-C₄烷基部分包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基等。“亚烷基”意指烷基的二价对应物，诸如CH₂CH₂、CH₂CH₂CH₂、和CH₂CH₂CH₂CH₂。

“烯基”意指具有至少一个碳-碳双键的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同的惯例是可适用的。作为说明，C₂-C₄烯基部分包括但不限于乙烯基(ethenyl)(乙烯基(vinyl))、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、顺式-1-丙烯基、反式-1-丙烯基、E-(或Z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基(丁-1,3-二烯基)等。

“炔基”意指具有至少一个碳-碳三键的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同的惯例是可适用的。作为说明，C₂-C₄炔基包括乙炔基(ethynyl)(乙炔基(acetylenyl))、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。

“脂环族”意指具有从1至3个环的饱和或不饱和非芳族烃部分，每个环具有从3至8个(优选地从3至6个)碳原子。“环烷基”意指其中每个环是饱和的脂环族部分。“环烯基”意指其中至少一个环具有至少一个碳-碳双键的脂环族部分。“环炔基”意指其中至少一个环具有至少一个碳-碳三键的脂环族部分。作为说明，脂环族部分包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、和金刚烷基。优选的脂环族部分是环烷基部分，尤其是环丙基、环丁基、环戊基、和环己基。“环亚烷基”意指环烷基的二价对应物。类似地，“二环亚烷基”和“螺环亚烷基”(或“螺亚烷基”)是指二环烷基和螺环烷基/螺烷基的二价对应物。

“杂脂环族”意指这样的脂环族部分，其中在其至少一个环中，至多三个(优选1至2个)碳已经被独立地选自N、O或S的杂原子替代，其中N和S任选地可以被氧化并且N任选可以被季铵化。优选的脂环族部分由一个大小为5至6元的环组成。类似地，“杂环烷基”、“杂环烯基”和“杂环炔基”分别意指其中其至少一个环已经被如此修饰的环烷基、环烯基或环炔基部分。示例性杂脂环族部分包括氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、1,3-二噁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃基砜、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、1,3-二氧戊环基、四氢-1,1-二氧代噻吩基、1,4-二噁烷基、硫杂环丁烷基等。“杂环亚烷基”意指杂环烷基的二价对应物。

“烷氧基”、“芳氧基”、“烷硫基”和“芳硫基”分别意指-O(烷基)、-O(芳基)、-S(烷基)、和-S(芳基)。例子分别是甲氧基、苯氧基、甲硫基和苯硫基。

除非指示较窄的含义，否则“卤素”或“卤代”意指氟、氯、溴或碘。

“芳基”意指具有单、双或三环环系统(优选地单环)的烃部分，其中每个环具有从3至7个碳原子，并且至少一个环是芳族的。环系统中的环可以彼此稠合(如在萘基中)或彼此结合(如在联苯基中)，并且可以与非芳族环稠合或结合(如在茚满基或环己基苯基中)。作为进一步说明，芳基部分包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基、和苊基。“亚芳基”意指芳基的二价对应物，例如1,2-亚苯基、1,3-亚苯基、或1,4-亚苯基。

“杂芳基”意指具有单、双或三环环系统(优选地5至7元单环)的部分，其中每个环具有从3至7个碳原子，并且至少一个环是含有从1至4个独立地选自N、O或S的杂原子的芳族环，其中N和S任选地可以被氧化并且N任选地可以被季铵化。此类至少一个含有杂原子的芳族环可以与其他类型的环稠合(如在苯并呋喃基或四氢异喹啉基中)或直接结合至其他类型的环(如在苯基吡啶基或2-环戊基吡啶基中)。作为进一步说明，杂芳基部分包括吡咯基、呋喃基、噻吩基(thiophenyl)(噻吩基(thienyl))、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、N-氧代吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉炔基(isoquinolynyl)、喹唑啉基、噌啉基、喹唑啉基(quinozalinyl)、萘啶基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并噻吩基、噁二唑基、噻二唑基、吩噻嗪基(phenothiazolyl)、苯并咪唑基、苯并三唑基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基等。“杂亚芳基”意指杂芳基的二价对应物。

在表明部分可以被取代(诸如通过使用如在“未经取代或经取代的C₁-C₅烷基”或“任选经取代的杂芳基”中的短语“未经取代或经取代的”或“任选经取代的”)的情况下，这样的部分可以具有一个或多个独立选择的取代基，优选数量为1至5、更优选数量为1或2。考虑到取代基所附接的部分，本领域普通技术人员可以选择取代基和取代模式，以提供化学稳定的并且可以通过本领域已知的技术以及本文列出的方法合成的化合物。在部分被鉴定为“未经取代或经取代的”或“任选地经取代的”的情况下，在优选的实施方案中，这样的部分是未经取代的。

“芳基烷基”、“(杂脂环族)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“联芳基烷基”等意指被芳基、杂环脂族、联芳基等(视情况而定)取代的烷基、烯基或炔基部分(视情况而定)，其中开放的(未满足的)化合价在烷基、烯基或炔基部分上，例如如在苄基、苯乙基、N-咪唑基乙基、N-吗啉代乙基等中。相反，“烷基芳基”、“烯基环烷基”等意指被烷基、烯基等部分(视情况而定)取代的芳基、环烷基等部分(视情况而定)，例如如在甲基苯基(甲苯基)或烯丙基环己基中。“羟烷基”、“卤代烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”等意指被一个或多个鉴定的取代基(羟基、卤代等，视情况而定)取代的烷基、芳基等部分(视情况而定)。

例如，允许的取代基包括但不限于烷基(尤其是甲基或乙基)、烯基(尤其是烯丙基)、炔基、芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代(尤其是氟代)、卤代烷基(尤其是三氟甲基)、羟基、羟烷基(尤其是羟乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟烷基)、-O(卤代烷基)(尤其是-OCF₃)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)、-SO₂N(烷基)₂等。

在被取代的部分是脂族部分的情况下，优选的取代基是芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟烷基)、-O(卤代烷基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(＝O)烷基、-S(环烷基)、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)、和-SO₂N(烷基)₂。更优选的取代基是卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(芳基)、＝O、＝NOH、＝NO(烷基)、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、和-NHC(＝NH)NH₂。尤其优选的是苯基、氰基、卤代、羟基、硝基、C₁-C₄烷氧基、O(C₂-C₄亚烷基)OH、和O(C₂-C₄亚烷基)卤代。

在被取代的部分是脂环族、杂脂环族、芳基、或杂芳基部分的情况下，优选的取代基是烷基、烯基、炔基、卤代、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟烷基)、-O(卤代烷基)、-O(芳基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、烷硫基、芳硫基、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)、和-SO₂N(烷基)₂。更优选的取代基是烷基、烯基、卤代、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、和-NHC(＝NH)NH₂。尤其优选的是C₁-C₄烷基、氰基、硝基、卤代、和C₁-C₄烷氧基。

在陈述范围的情况下(如在“C₁-C₅烷基”或“5％至10％”中)，这样的范围包括所述范围的端点，如在第一实例中的C₁和C₅以及在第二实例中的5％和10％。

除非特别指示特定的立体异构体(例如，通过在结构式中的相关立体中心处的加粗或虚线键，通过在结构式中将双键描绘为具有E或Z构型，或通过使用立体化学指定的命名法或符号)，否则作为纯化合物及其混合物的所有立体异构体包括在本发明的范围内。除非另有指示，否则外消旋体、单独的对映体(不论是光学纯的或部分拆分的)、非对映体、几何异构体及其组合和混合物均被本发明涵盖。

本领域技术人员应认识到，化合物可以具有互变异构体形式(例如，酮和烯醇形式)、共振形式和两性离子形式，所述形式等效于在本文使用的结构式中描绘的那些，并且所述结构式涵盖此类互变异构体形式、共振形式或两性离子形式。

“药学上可接受的酯”意指在体内(例如，在人体中)水解产生母体化合物或其盐或本身具有与母体化合物相似的活性的酯。合适的酯包括C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基酯，尤其是甲基、乙基或正丙基。

“药学上可接受的盐”意指适用于药物配制品的化合物的盐。在化合物具有一个或多个碱性基团的情况下，所述盐可以是酸加成盐，诸如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、双羟萘酸盐(思波酸盐(embonate))、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、甲基硫酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乳糖醛酸盐、辛二酸盐、甲苯磺酸盐等。在化合物具有一个或多个酸性基团的情况下，所述盐可以是诸如以下的盐：钙盐、钾盐、镁盐、葡甲胺盐、铵盐、锌盐、哌嗪盐、氨丁三醇盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己胺盐、苯乍生盐、钠盐、四甲基铵盐等。多晶型形式和溶剂化物也涵盖在本发明的范围内。

“受试者”是指动物，包括但不限于灵长类动物(例如人)、猴、牛、猪、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠或小鼠。关于例如哺乳动物受试者(诸如人)的术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

在治疗疾病或障碍的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treating”、和“treatment”)意在包括减轻或消除障碍、疾病或病症，或与障碍、疾病或病症相关的一种或多种症状；或减慢障碍、疾病或病症或其一种或多种症状的进展、扩散或恶化。“癌症的治疗”是指以下作用中的一种或多种：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括(i)减慢和(ii)完全阻止生长；(2)减少肿瘤细胞的数量；(3)维持肿瘤大小；(4)减小肿瘤大小；(5)抑制，包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止肿瘤细胞浸润到外周器官中；(6)抑制，包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止转移；(7)增强抗肿瘤免疫应答，其可以导致(i)维持肿瘤大小、(ii)减小肿瘤大小、(iii)减慢肿瘤生长、(iv)减少、减慢或防止侵袭和/或(8)在一定程度上缓解与障碍相关的一种或多种症状的严重程度或数量。

在本说明书的式中，横穿键的波浪线

或在键末端的星号(*)表示共价附接位点。例如，在式

中R是

或R是

的陈述意指

在本说明书的式中，在其两个碳之间横穿芳族环的键意指附接至所述键的基团可以位于所述芳族环的任何位置，所述任何位置是通过除去隐含地在那里的氢而变得可用的。作为说明，式

代表

在其他说明中，

代表

并且

代表

本领域技术人员应理解，某些结构可以绘制呈一种互变异构体形式或另一种互变异构体形式，例如酮基与烯醇，并且这两种形式是等效的。

化合物

在一个实施方案中：在以下部分中，每个X¹是CR²或不多于两个X¹是N

优选地是

优选地，基团R¹是

R³的例子包括Cl、OH、

其中基团R³具有以下结构的例子

(包括其中一个或多个亚甲基(CH₂)任选地被一个或多个O、S、SO₂、NH、C(＝O)、N(C₁-C₃烷基)、NC(＝O)(C₁-C₃烷基)或N(Boc)替代或具有与其稠和的另一个环(如上文所公开的)的例子)是：

在另一个实施方案中，R³选自：

在式II的一个实施方案中，m是0，在这种情况下，它简化为II’：

在式II中，优选地

是

根据式II的化合物的实施方案由式IIa表示，其中R¹和R³是如上文关于式II所定义的。此类化合物的例子在表A中示出。表A包括使用HEK-Blue^TMTLR7报告物测定的TLR7激动活性的生物活性数据，如下文所述。为了比较，还呈现了瑞喹莫德和嘎德莫特的活性。

根据式II(其中m是1)的化合物的实施方案由式IIb表示，其中R¹、R³和X¹是如上文关于式II所定义的。

优选地，在式IIb中

是

根据式IIb的化合物的例子在表B中示出：

本说明书进一步公开了化合物III-02(EC₅₀ 5,000nM)。

缀合物

概述

可以通过局部施用或通过在具有靶向部分的缀合物中靶向递送，将本文公开的TLR7激动剂递送至预期作用位点。优选地，靶向部分是抗体或其抗原结合部分，并且其抗原是在预期作用的位置发现的，例如，如果预期作用位点在肿瘤(癌症)处，则是肿瘤相关抗原。优选地，与正常细胞相比，肿瘤相关抗原由癌细胞唯一表达或过表达。肿瘤相关抗原可以位于癌细胞表面上或由癌细胞分泌到其周围。

在一方面，提供了一种包含本发明的化合物和由式(IV)表示的配体的缀合物

[D(X^D)_a(C)_c(X^Z)_b]_mZ (IV)

在Z是靶向部分的情况下，D是本发明的激动剂，并且-(X^D)_aC(X^Z)_b-统称为“接头部分”或“接头”，因为他们连接Z和D。在接头中，C是被设计为在D的预期生物作用位点处或其附近裂解的可裂解基团；X^D和X^Z是分别分隔开D与C以及C与Z的间隔子部分(或“间隔子”)；下标a、b和c独立地是0或1(即，X^D、X^Z和C的存在是任选的)。下标m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(优选地1、2、3或4)。D、X^D、C、X^Z和Z在下文中更完整地描述。

通过与其抗原或受体所在的靶组织或细胞结合，Z将缀合物引导到那里。在靶组织或细胞处基团C的裂解释放出D以在局部发挥其作用。以这种方式，在预期作用位点实现了D的精确递送，从而减少了所需的剂量。而且，D在其缀合状态下通常是无生物活性的(或显著较低活性的)，从而降低脱靶效应。

如由下标m所反映的，每个Z可以与多于一个的D缀合，这取决于Z的可用于缀合的位点的数量和所采用的实验条件。本领域技术人员应理解，尽管每个单独的Z与整数数量的D缀合，但是缀合物的制备可以分析D与Z的非整数比率，从而反映出统计平均值。此比率称为取代比率(“SR”)或药物-抗体比率(“DAR”)。

靶向部分Z

优选地，靶向部分Z是抗体。为了方便和简洁而非作为限制，在本说明书中关于Z及其缀合物的详细讨论编写在其为抗体的上下文中，但是本领域技术人员应理解，可以缀合其他类型的Z，细节上作必要的修改。例如，其中叶酸作为靶向部分的缀合物可以靶向在其表面具有叶酸受体的细胞(Leamon等人,Cancer Res.2008,68(23),9839)。出于相同的原因，本说明书中的详细讨论主要根据Z与D的比率为1:1(m＝1)而编写的。

可以在本发明的缀合物中使用的抗体包括识别以下抗原的那些：间皮素、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD19、CD22、CD30、CD70、B7H3、B7H4(也称为O8E)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、磷脂酰肌醇聚糖-3、RG1、岩藻糖基-GM1、CTLA-4、和CD44。抗体可以是动物的(例如，鼠)、嵌合的、人源化的、或优选是人的。抗体优选地是单克隆的，尤其是单克隆人抗体。以下公开了针对前述一些抗原的人单克隆抗体的制备：Korman等人,US 8,609,816 B2(2013；B7H4，也称为08E；特别是抗体2A7、1G11、和2F9)；Rao-Naik等人,8,097,703B2(2012；CD19；特别是抗体5G7、13F1、46E8、21D4、21D4a、47G4、27F3、和3C10)；King等人,US 8,481,683 B2(2013；CD22；特别是抗体12C5、19A3、16F7、和23C6)；Keler等人,US 7,387,776 B2(2008；CD30；特别是抗体5F11、2H9、和17G1)；Terrett等人,US 8,124,738 B2(2012；CD70；特别是抗体2H5、10B4、8B5、18E7、和69A7)；Korman等人,US 6,984,720 B1(2006；CTLA-4；特别是抗体10D1、4B6、和1E2)；Korman等人,US 8,008,449 B2(2011；PD-1；特别是抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3、和5F4)；Huang等人,US 2009/0297438 A1(2009；PSMA，特别是抗体1C3、2A10、2F5、2C6)；Cardarelli等人,US 7,875,278 B2(2011；PSMA；特别是抗体4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5、和1C3)；Terrett等人,US 8,222,375 B2(2012；PTK7；特别是抗体3G8、4D5、12C6、12C6a、和7C8)；Harkins等人,US 7,335,748 B2(2008；RG1；特别是抗体A、B、C、和D)；Terrett等人,US 8,268,970 B2(2012；间皮素；特别是抗体3C10、6A4、和7B1)；Xu等人,US 2010/0092484 A1(2010；CD44；特别是抗体14G9.B8.B4、2D1.A3.D12、和1A9.A6.B9)；Deshpande等人,US 8,258,266 B2(2012；IP10；特别是抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、7C10、8F6、10A12、10A12S、和13C4)；Kuhne等人,US 8,450,464 B2(2013；CXCR4；特别是抗体F7、F9、D1、和E2)；和Korman等人,US 7,943,743 B2(2011；PD-L1；特别是抗体3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7、和13G4)；将其公开内容通过引用并入本文。优选地，所述抗体是抗间皮素抗体。

除了是抗体外，Z还可以是抗体片段(诸如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd或Fv)或抗体模拟物，诸如亲和抗体(affibody)、结构域抗体(dAb)、纳米抗体、单抗体(unibody)、DARPin、anticalin、versabody、duocalin、脂质运载蛋白或avimer。

Z上几个不同的反应性基团中的任何一个都可以是缀合位点，包括赖氨酸残基中的ε-氨基、侧糖类部分、天冬氨酸或谷氨酸侧链上的羧酸基团、半胱氨酸-半胱氨酸二硫基团、和半胱氨酸硫醇基团。关于适合于缀合的抗体反应性基团的综述，参见例如，Garnett,Adv.Drug Delivery Rev.2001,53,171-216以及Dubowchik和Walker,Pharmacology&Therapeutics 1999,83,67-123，将其公开内容通过引用并入本文。

大多数抗体具有多个赖氨酸残基，所述赖氨酸残基可以经由其ε-氨基经由酰胺、脲、硫脲或氨基甲酸酯键进行缀合。

半胱氨酸侧链中的硫醇(-SH)基团可以通过几种方法用于形成缀合物。它可以用于在它与接头上的硫醇基团之间形成二硫键。另一种方法是经由将其迈克尔加成到接头上的马来酰亚胺基团上。

典型地，尽管抗体具有半胱氨酸残基，但是它们缺少游离的硫醇基团，因为它们的所有半胱氨酸均参与链内或链间二硫键。为了产生游离的硫醇基团，可以将天然二硫基团还原。参见例如，Packard等人,Biochemistry 1986,25,3548；King等人,Cancer Res.1994,54,6176；和Doronina等人,Nature Biotechnol.2003,21,778。可替代地，可以通过使抗体突变、将半胱氨酸取代为另一种氨基酸或将一个插入多肽链中来引入具有游离-SH基团的半胱氨酸。参见例如，Eigenbrot等人,US 7,521,541B2(2009)；Chilkoti等人,Bioconjugate Chem.1994,5,504；Urnovitz等人,US 4,698,420(1987)；Stimmel等人,J.Biol.Chem.2000,275,30445；Bam等人,US 7,311,902 B2(2007)；Kuan等人,J.Biol.Chem.1994,269,7610；Poon等人,J.Biol.Chem.1995,270,8571；Junutula等人,Nature Biotechnology 2008,26,925和Rajpal等人,2015年12月21日提交的美国临时申请号62/270245。在又另一种方法中，将半胱氨酸添加到轻链的重的C末端。参见例如，Liu等人,US 8,865,875 B2(2014)；Cumber等人,J.Immunol.1992,149,120；King等人,CancerRes.1994,54,6176；Li等人,Bioconjugate Chem.2002,13,985；Yang等人,ProteinEngineering 2003,16,761；和Olafson等人,Protein Engineering Design&Selection2004,17,21。将在此段中引用的文件的公开内容通过引用并入本文。

接头及其组分

如上所述，接头包含最多三个元件：可裂解基团C以及任选的间隔子X^Z和X^D。

基团C在生理条件下可裂解。优选地，当缀合物在血液中循环时它是相对稳定的，但是一旦缀合物到达其预期作用位点就容易被裂解。

优选的基团C是被靶细胞内部的蛋白酶(与被血清中的蛋白酶相反)选择性裂解的肽。典型地，所述肽包含从1至20个氨基酸，优选地从1至6个氨基酸，更优选地从2至3个氨基酸。所述一个或多个氨基酸可以是天然的和/或非天然的α-氨基酸。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及由其衍生的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸和O-磷酸丝氨酸。在本说明书中，术语“氨基酸”还包括氨基酸类似物和模拟物。类似物是具有与天然氨基酸相同的通用H₂N(R)CHCO₂H结构的化合物，不同之处在于R基团不是天然氨基酸中发现的基团。类似物的例子包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸-亚砜、和甲硫氨酸甲基锍。氨基酸模拟物是具有与α-氨基酸的通用化学结构不同的结构但是以类似于一种α-氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸可以具有遗传编码的氨基酸的“L”立体化学，以及对映异构体“D”的立体化学。

优选地，C含有作为蛋白酶裂解识别序列的氨基酸序列。许多裂解识别序列是本领域已知的。参见例如，Matayoshi等人Science 247:954(1990)；Dunn等人Meth.Enzymol.241:254(1994)；Seidah等人Meth.Enzymol.244:175(1994)；Thornberry,Meth.Enzymol.244:615(1994)；Weber等人Meth.Enzymol.244:595(1994)；Smith等人Meth.Enzymol.244:412(1994)；和Bouvier等人Meth.Enzymol.248:614(1995)；将其公开内容通过引用并入本文。

可以选择基团C，使得其被存在于癌症附近的细胞外基质中的蛋白酶(例如，由附近垂死的癌细胞释放的蛋白酶或由癌细胞分泌的肿瘤相关蛋白酶)裂解。示例性的细胞外肿瘤相关蛋白酶是纤溶酶、基质金属蛋白酶(MMP)、西梅脱寡肽酶(thimetoligopeptidase)(TOP)和CD10。参见例如，Trouet等人,US 7,402,556 B2(2008)；Dubois等人,US 7,425,541 B2(2008)；和Bebbington等人,US 6,897,034 B2(2005)。组织蛋白酶D(通常是在细胞内部发现的溶酶体酶)有时在肿瘤的周围环境中被发现，可能是由垂死的癌细胞释放的。

对于设计为被酶的缀合物，C优选地包含选择用于被蛋白酶(此类组织蛋白酶B、C、D、H、L和S，尤其是组织蛋白酶B)裂解的氨基酸序列。示例性组织蛋白酶B可裂解的肽包括Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Lys-Val-Ala、Asp-Val-Ala、Val-Ala、Lys-Val-Cit、Ala-Val-Cit、Val-Gly、Val-Gln、和Asp-Val-Cit。(在本文中，氨基酸序列是以N至C方向编写的，如在H₂N-AA²-AA¹-CO₂H中，除非在上下文中另有明确地说明。)参见Dubowchik等人,Biorg.Med.Chem.Lett.1998,8,3341；Dubowchik等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.1998,8,3347；和Dubowchik等人,Bioconjugate Chem.2002,13,855；将其公开内容通过引用并入。

可以用于裂解肽基接头的另一种酶是豆类天冬氨酸蛋白内切酶(legumain)，其为优先在Ala-Ala-Asn处裂解的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。

在一个实施方案中，基团C是包含两氨基酸序列-AA²-AA¹-的肽，其中AA¹是赖氨酸、精氨酸或瓜氨酸，并且AA²是苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在另一个实施方案中，C由选自以下的一至三个氨基酸的序列组成：Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Ala-Asn、Lys、Cit、Ser和Glu。更优选地，它是来自前述基团的二至三氨基酸肽。

由单个氨基酸组成的可裂解基团C的制备和设计公开于Chen等人,US 8,664,407B2(2014)中，将其公开内容通过引用并入本文。

基团C可以直接结合至Z或D上；即视情况而定，间隔子X^Z或X^D可以不存在。

当存在时，间隔子X^Z在C与Z之间提供了空间间隔，以免前者在空间上干扰后者的抗原结合，或后者在空间上干扰前者的裂解。此外，间隔子X^Z可以用于赋予缀合物增加的溶解度或降低的聚集特性。间隔子X^Z可以包含一个或多个模块片段，其可以以任何数量的组合组装。用于间隔子X^Z的合适片段的例子是：

及其组合，

其中下标g是0或1，并且下标h是1至24，优选2至4。这些片段可以组合，诸如以下所展示：

间隔子X^D(如果存在)在C和D之间提供了空间间隔，以免后者在空间上或在电子上干扰前者的裂解。间隔子X^D还可以用于将另外的分子量和化学官能团引入缀合物。通常，另外的质量和官能团将影响缀合物的血清半衰期和其他特性。因此，通过明智地选择间隔子基团，可以调节缀合物的血清半衰期。间隔子X^D还可以从模块片段组装，类似于上文关于间隔子X^Z的描述。

间隔子X^Z和/或X^D(在存在的情况下)优选地在Z与C之间或在D与C之间分别提供从4至25个原子，更优选从4至20个原子的线性间隔。

除共价连接抗体和药物外，接头还可以执行其他功能。例如，接头可以含有聚(乙二醇)(“PEG”)基团。由于缀合步骤典型地涉及在水性介质中将药物接头与抗体偶联，因此PEG基团可以增强药物-接头的水溶解度。另外，在所得ADC中，PEG基团可以增强溶解度或减少聚集。在存在PEG基团的情况下，可以将PEG基团掺入间隔子X^Z或X^D或二者中。PEG基团中的重复单元的数量可以是从2至20，优选在4与10之间。

间隔子X^Z或X^D或二者可以包含自我牺牲(self-immolating)部分。自我牺牲部分是这样的部分，其(1)与C和Z或D结合，以及(2)具有这样的结构，使得从基团C的裂解引发导致自我牺牲部分将其自身与Z或D(视情况而定)解除结合的反应序列。换句话说，在远离Z或D的位点处的反应(从基团C的裂解)也导致X^Z-Z或X^D-D键断裂。在间隔子X^D的情况下，希望存在自我牺牲部分，因为如果在缀合物裂解后，间隔子X^D或其一部分仍保持与D附接，则D的生物活性可能受损。在可裂解基团C是多肽的情况下，尤其希望使用自我牺牲部分，在这种情况下，所述自我牺牲部分的位置典型地与其相邻，以便防止D在空间上或在电子上干扰肽裂解。

与D的羟基或氨基结合的示例性自我牺牲部分(i)-(v)在以下示出：

自我牺牲部分是在虚线a与b(或虚线b与c)之间的结构，其中示出了相邻的结构特征以提供背景。自我牺牲部分(i)和(v)结合至D-NH₂(即，缀合是经由氨基进行的)，而自我牺牲部分(ii)、(iii)和(iv)结合至D-OH(即，缀合是经由羟基或羧基进行的)。通过酶-在结构(i)-(v)的情况下是肽酶并且在结构(vi)的情况下是β-葡萄糖醛酸酶-在虚线b处的键裂解引发了自我牺牲的反应序列，所述反应序列导致在虚线a处的键的裂解和因此释放D-OH或D-NH₂，视情况而定。作为说明，结构(i)和(iv)的自我牺牲机制在以下示出：

换句话说，在自我牺牲基团的一部分处的第一化学键的裂解引发了一系列步骤，所述步骤导致在自我牺牲基团的不同部分处第二化学键-将自我牺牲基团与药物连接的化学键-的裂解，从而释放药物。

在一些情况下，可以串联使用自我牺牲基团，如结构(vii)所示。在这种情况下，在虚线c处的裂解触发了通过1,6-消除反应而在虚线b与c之间的部分的自我牺牲，然后是通过环化消除反应而在虚线a与b之间的部分的自我牺牲。关于自我牺牲部分的另外的公开内容，参见Carl等人,J.Med.Chem.1981,24,479；Carl等人,WO 81/01145(1981)；Dubowchik等人,Pharmacology&Therapeutics 1999,83,67；Firestone等人,US 6,214,345 B1(2001)；Toki等人,J.Org.Chem.2002,67,1866；Doronina等人,Nature Biotechnology 2003,21,778(erratum,第941页)；Boyd等人,US 7,691,962 B2；Boyd等人,US 2008/0279868 A1；Sufi等人,WO 2008/083312 A2；Feng,US 7,375,078 B2；Jeffrey等人,US 8,039,273；和Senter等人,US 2003/0096743 A1；将其公开内容通过引用并入。

在另一个实施方案中，Z和D通过不可裂解的接头连接，即，C不存在。D的代谢最终将接头还原为小的附加部分，所述附加部分不干扰D的生物活性。

缀合技术

本文公开的TLR7激动剂的缀合物优选地通过以下方式制造：首先制备包含D和接头(X^D)_a(C)_c(X^Z)_b(其中X^D、C、X^Z、a、b和c是如针对式(II)所定义的)的化合物以形成由式(V)表示的药物-接头化合物：

D-(X^D)_a(C)_c(X^Z)_b-R³¹ (V)

其中R³¹是适合于与在Z上的互补官能团反应以形成缀合物的官能团。合适的基团R³¹的例子包括氨基、叠氮化物、硫醇、环辛炔、

其中R³²是Cl、Br、F、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，并且R³³是Cl、Br、I、F、OH、-O-N-琥珀酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基。总体上可用于制备合适的部分D-(X^D)_aC(X^Z)_b-R³¹的化学公开于Ng等人,US 7,087,600 B2(2006)；Ng等人,US 6,989,452B2(2006)；Ng等人,US 7,129,261 B2(2006)；Ng等人,WO 02/096910 A1；Boyd等人,US 7,691,962 B2；Chen等人,US 7,517,903 B2(2009)；Gangwar等人,US 7,714,016 B2(2010)；Boyd等人,US 2008/0279868 A1；Gangwar等人,US 7,847,105 B2(2010)；Gangwar等人,US7,968,586 B2(2011)；Sufi等人,US 8,461,117 B2(2013)；和Chen等人,US 8,664,407 B2(2014)中；将其公开内容通过引用并入本文。

优选地，反应性官能团-R³¹是-NH₂、-OH、-CO₂H、-SH、马来酰亚胺基、环辛炔、叠氮基(-N₃)、羟基氨基(-ONH₂)或N-羟基琥珀酰亚胺基。尤其优选的官能团-R³¹是：

-OH基团可以被抗体上(例如在天冬氨酸或谷氨酸侧链上)的羧基酯化。

-CO₂H基团可以被抗体上的-OH基团酯化或被氨基(例如在赖氨酸侧链上的)酰胺化。

N-羟基琥珀酰亚胺基团在功能上是活化的羧基，并且可以方便地通过与氨基(例如，来自赖氨酸的)反应而被酰胺化。

马来酰亚胺基团可以在迈克尔加成反应中与抗体上的-SH基团(例如，来自半胱氨酸或来自对抗体进行的引入巯基官能团的化学修饰)缀合。

在抗体没有可用于缀合的半胱氨酸-SH的情况下，赖氨酸残基的侧链中的ε-氨基可以与2-亚氨基硫杂环戊烷或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(“SPDP”)反应以引入游离硫醇(-SH)基团-产生半胱氨酸替代物(如同就是)。硫醇基团可以与马来酰亚胺或其他亲核受体基团反应以进行缀合。下面用2-亚氨基硫杂环戊烷来说明机制。

典型地，达到2至3个硫醇/个抗体的硫醇化水平。对于代表性程序，参见Cong等人,US 8,980,824 B2(2015)，将其公开内容通过引用并入本文。

在相反的安排中，可以将抗体Z用N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)-环己烷甲酸酯(“SMCC”)或其磺化变体磺基-SMCC(两者均可从Sigma-Aldrich获得)修饰以向其中引入马来酰亚胺基团。然后，可以用在接头上具有-SH基团的药物-接头化合物进行缀合。

可替代的缀合方法采用无铜“点击化学”，其中叠氮化物基团跨过应变的环辛炔进行加成以形成1,2,3-三唑环。参见例如，Agard等人,J.Amer.Chem.Soc.2004,126,15046；Best,Biochemistry 2009,48,6571，将其公开内容通过引用并入本文。叠氮化物可以位于抗体上并且环辛炔可以位于药物-接头部分上，或者反之亦然。优选的环辛炔基团是二苯并环辛炔(DIBO)。具有DIBO基团的各种试剂可从俄勒冈州尤金(Eugene)的Invitrogen/Molecular Probes获得。以下反应展示了针对其中DIBO基团与抗体(Ab)附接的例子的点击化学缀合：

又另一种缀合技术涉及将非天然氨基酸引入抗体中，其中所述非天然氨基酸提供了用于与药物部分中的反应性官能团缀合的功能。例如，可以将非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸结合到抗体或其他多肽中，如Tian等人,WO 2008/030612 A2(2008)中教导的。对乙酰基苯丙氨酸中的酮基可以经由与接头-药物部分上的羟基氨基形成肟而作为缀合位点。可替代地，可以将非天然氨基酸对叠氮基苯丙氨酸掺入抗体中以提供叠氮化物官能团，用于经由如上所讨论的点击化学进行缀合。也可以使用无细胞方法将非天然氨基酸结合到抗体或其他多肽中，如Goerke等人,US 2010/0093024 A1(2010)和Goerke等人,Biotechnol.Bioeng.2009,102(2),400-416中教导的。将前述公开内容通过引用并入本文。因此，在一个实施方案中，用于制造缀合物的抗体的一个或多个氨基酸被非天然氨基酸替代，所述非天然氨基酸优选是对乙酰基苯丙氨酸或对叠氮基苯丙氨酸，更优选对乙酰基苯丙氨酸。

再另一种缀合技术根据Jeger等人,Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9995，使用酶转谷氨酰胺酶(优选是来自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的细菌转谷氨酰胺酶或BTG)。BTG在谷氨酰胺的侧链甲酰胺(胺受体)与亚烷基氨基(胺供体)之间形成酰胺键，所述亚烷基氨基可以是例如赖氨酸的ε-氨基或5-氨基-正戊基。在典型的缀合反应中，谷氨酰胺残基位于抗体上，而亚烷基氨基位于接头-药物部分上，如下所示：

谷氨酰胺残基在多肽链上的定位对其对BTG介导的转酰胺基作用的易感性具有很大影响。抗体上的谷氨酰胺残基通常都不是BTG底物。然而，如果抗体是去糖基化的-糖基化位点是重链的天冬酰胺297(N297；根据如以下列出的EU索引编号：Kabat等人,“Sequencesof proteins of immunological interest,”第5版，公开号91-3242,U.S.Dept.Health&Human Services,NIH,贝塞斯达,马里兰州,1991；下文称为“Kabat”)-则使附近的谷氨酰胺295(Q295)易受BTG影响。可以通过用PNGase F(肽-N-糖苷酶F)处理将抗体酶促地去糖基化。可替代地，可以通过在恒定区中引入N297A突变以消除N297糖基化位点来合成无糖苷的抗体。此外，已经显示N297Q取代不仅消除糖基化，而且还引入也作为胺受体的第二谷氨酰胺残基(在位置297处)。因此，在一个实施方案中，抗体是去糖基化的。在另一个实施方案中，抗体具有N297Q取代。本领域技术人员应理解，通过合成后修饰或通过引入N297A突变进行的去糖基化产生两个BTG反应性谷氨酰胺残基/个抗体(每条重链一个，在位置295处)，而具有N297Q取代的抗体将具有四个BTG反应性谷氨酰胺残基(每条重链两个，在位置295和297处)。

还可以通过向其中引入含有谷氨酰胺的肽或“tag”使抗体对BTG介导的缀合易感，如例如在Pons等人,US 2013/0230543 A1(2013)和Rao-Naik等人,WO 2016/144608 A1中教导的。

在互补方法中，可以通过以下方式改变BTG的底物特异性：改变其氨基酸序列，使得它能够与未经修饰的抗体中的谷氨酰胺295反应，如在Rao-Naik等人,WO 2017/059158A1(2017)中教导的。

虽然最常可用的细菌转谷氨酰胺酶是来自茂原链霉菌(S.mobaraensis)的转谷氨酰胺酶，但是可以考虑具有稍微不同的底物特异性的来自其他细菌的转谷氨酰胺酶，诸如来自拉达卡轮枝链霉菌(Streptoverticillium ladakanum)的转谷氨酰胺酶(Hu等人,US2009/0318349 A1(2009)、US 2010/0099610A1(2010)和US 2010/0087371 A1(2010))。

具有伯或仲烷基胺的本公开文本的TLR7激动剂特别适用于缀合物，因为仲胺提供了用于接头附接的官能团。此类TLR7激动剂-接头化合物的例子是化合物41，所述化合物可以从化合物IIa-01制造并且含有酶可裂解的接头。图5示出了一种方案，根据所述方案可以制备化合物41。

含有非酶可裂解的接头的TLR7激动剂-接头化合物的例子是化合物43，所述化合物也可以由化合物IIa-01制造。图6示出了用于合成化合物43的途径。

化合物41和43均含有伯烷基氨基，使其顺从于与转谷氨酰胺酶的缀合。合适的缀合程序在下文实施例中描述。

也可以使用分选酶A的酶来进行缀合，如在如Levary等人,PLoS One 2011,6(4),e18342；Proft,Biotechnol.Lett.2010,32,1-10；Ploegh等人,WO 2010/087994 A2(2010)；和Mao等人,WO 2005/051976 A2(2005)中教导的。分选酶A识别基序(典型地是LPXTG，其中X是任何天然氨基酸)可以位于配体Z上，并且亲核受体基序(典型地是GGG)可以是式(III)中的基团R³¹，或反之亦然。

TLR7激动剂缀合物

应用上述技术，可以制备TLR7激动剂缀合物，诸如以下所示的缀合物：

其中m是1、2、3或4，并且Ab是抗体。

聚乙二醇化

聚(乙二醇)(PEG)链与药物的附接(“聚乙二醇化”)可以改善后者的药代动力学特性。药物的循环半衰期增加，有时增加一个数量级，从而伴随地减少达到所希望的治疗效果所需的剂量。聚乙二醇化还可以减少药物的代谢降解并且降低其免疫原性。关于综述，参见Kolate等人,J.Controlled Release 2014,192,167。

最初，将聚乙二醇化应用于生物药物。截至2016年，已批准了超过十种聚乙二醇化的生物制剂。Turecek等人,J.Pharmaceutical Sci.2016,105,460。最近，受所述概念在生物制剂中的成功应用的激发，注意力已经转向将其应用于小分子药物。除前述益处外，聚乙二醇化的小分子药物还可以具有增加的溶解度并且引起较少的毒性作用。Li等人Prog.Polymer Sci.2013,38,421。

本文公开的化合物可以是聚乙二醇化的。在化合物具有脂族伯胺或仲胺或脂族羟基的情况下，诸如以下在由箭头指示的位置处所示的化合物的情况，可以用含羧基的PEG分子利用常规技术(诸如二环己基碳二亚胺、HATU、N-羟基琥珀酰亚胺酯等)经由酯、酰胺、碳酸酯或氨基甲酸酯基团将其聚乙二醇化。用于将药物分子聚乙二醇化的多种其他方法公开于Alconcel等人,Polymer Chem.2011,2,1442中，将其公开内容通过引用并入本文。

如有希望，本文公开的TLR7激动剂可以经由包含自我牺牲部分的酶可裂解的接头进行聚乙二醇化，以允许以设计的方式释放未聚乙二醇化的激动剂。此外，如果含PEG的分子具有用于与蛋白质附接的合适官能团(诸如胺)，则可以将聚乙二醇化与到蛋白质(诸如抗体)的缀合组合。蛋白质可以提供另外的治疗功能，或如果是抗体，则可以提供靶向功能。这些概念在以下反应序列中说明，其中TLR7-NH-R总体上代表TLR7激动剂：

在以上反应序列中，缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)二肽可被组织蛋白酶B的酶裂解，其中对氨基苄基氧羰基(PABC)基团用作自我牺牲间隔子。用于缀合的官能团是胺基，所述氨基被Fmoc基团暂时保护。通过转谷氨酰胺酶的酶进行缀合，其中谷氨酰胺(Gln)侧链充当酰基受体。如下所讨论，下标x(表示PEG重复单元的数量)可以广泛变化，取决于聚乙二醇化的目的。出于一些目的，x可以是相对小的，诸如2、4、8、12或24。出于其他目的，x是大的，例如在约45与约910之间。

本领域技术人员应理解，所述序列是说明性的，并且如本领域中熟知的，可以采用其他元件-肽、自我牺牲基团、缀合方法、PEG长度等。他们还应理解，尽管以上序列组合了聚乙二醇化和缀合，但是聚乙二醇化不需要缀合，并且反之亦然。

在所述化合物缺少脂族羟基或脂族伯或仲胺的情况下，仍可以在嘧啶环上的芳族胺处将其聚乙二醇化。Zarraga,US 2017/0166384 A1(2007)公开了用于在此位置处进行聚乙二醇化的方法，将其公开内容通过引用并入。

在一些实施方案中，可能希望在单个分子中连接多个聚乙二醇化激动剂。例如，可以在季戊四醇(C(CH₂OH)₄)上构建四个聚乙二醇化臂，并且TLR7激动剂可以与每个聚乙二醇化臂附接。参见Gao等人,US 2013/0028857 A1(2013)，将其公开内容通过引用并入。

为了调节药代动力学，通常优选地是，PEG部分具有在约2kDa(对应于在约45个-(CH₂CH₂O)-重复单元)与约40kDa(对应于约910个-(CH₂CH₂O)-重复单元)之间，更优选在约5kDa与20kDa约之间的式量。即，上式中的下标x的范围是从约45至约910。应当理解，PEG组合物不是100％均匀的，而是展现出分子量的分布。因此，对例如“20kDa PEG”的引用意指具有20kDa的平均分子量的PEG。

聚乙二醇化也可以用于改善激动剂的溶解度。在这种情况下，可以使用较短的PEG链，例如包含2、4、8、12或24个重复单元。

药物组合物和施用

在另一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的如本文公开的化合物或其缀合物。它可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，诸如生物制剂或小分子药物。所述药物组合物可以在组合疗法中与另一种治疗剂(尤其是抗癌剂)一起施用。

所述药物组合物可以包含一种或多种赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂、及其组合。Gennaro,编辑,Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中教导了合适的赋形剂的选择和使用。

优选地，药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物包被在材料中以保护所述化合物免受可能使其失活的酸和其他天然条件的作用。短语“肠胃外施用”意指除了肠施用和外用施用之外的施用方式，通常通过注射进行，并且包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。可替代地，所述药物组合物可以经由非肠胃外途径施用，所述非肠胃外途径诸如外用、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用。

药物组合物可以呈无菌水性溶液或分散体的形式。它们也可以配制成微乳液、脂质体、或适合于实现高药物浓度的其他有序结构。所述组合物也可以以冻干物(用于在施用前在水中重构)的形式提供。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据正在被治疗的受试者和特定的施用方式而变化并且将总体上是产生治疗效果的组合物量。通常，从百分比来说，此量范围为约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分，所述活性成分与药学上可接受的载体相组合。

调整剂量方案以提供治疗反应。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以如根据情况的紧急程度所指示，按比例减少或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以便于施用和剂量的均匀性。“剂量单位形式”是指适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每个单位含有与所需的药物载体联合的经计算产生所希望的治疗反应的预定量的活性化合物。

剂量在从约0.0001至100mg/kg宿主体重并且更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg或可替代地0.1至5mg/kg的范围内。示例性的治疗方案是每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、或每3至6个月一次的施用。优选的剂量方案包括使用以下给药时间表中的一种经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重：(i)每四周，持续六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，然后是每三周1mg/kg体重。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/mL的血浆抗体浓度，并且在一些方法中达到约25-300μg/mL。

本发明的化合物的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或对由于疾病困扰而引起的损伤或残疾的预防。例如，对于荷瘤受试者的治疗，相对于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地抑制肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、以及还更优选至少约80％。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小、或在其他方面改善受试者的症状，所述受试者典型地是人，但是可以是另一种哺乳动物。在组合治疗中施用两种或更多种治疗剂的情况下，“治疗有效量”是指组合作为整体的功效，而不是单独地每种药剂的功效。

药物组合物可以是控释或缓释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

可以经由诸如(1)无针皮下注射装置；(2)微量输注泵；(3)透皮装置；(4)输注装置；和(5)渗透装置的医疗装置施用治疗组合物。

在某些实施方案中，可以配制所述药物组合物以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗化合物穿过血脑屏障，可以将它们配制在脂质体中，所述脂质体可以另外地包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。

工业适用性

本文公开的TLR7激动剂化合物可以用于治疗可通过激活TLR7而改善的疾病或病症。

在一个实施方案中，将TLR7激动剂与抗癌免疫治疗剂-也称为免疫肿瘤学药剂-组合使用。抗癌免疫治疗剂通过刺激身体的免疫系统以攻击和破坏癌细胞，尤其是通过激活T细胞来工作。免疫系统具有许多检查点(调节)分子，以帮助维持其攻击正当的靶细胞与防止其攻击健康的正常细胞之间的平衡。一些分子是刺激剂(上调剂)，这意味着它们的参与会促进T细胞激活并且增强免疫应答。其他分子是抑制剂(下调剂或制止剂)，这意味着它们的参与会抑制T细胞激活并且减轻免疫应答。激动性免疫治疗剂与刺激性检查点分子的结合可以导致后者的激活和针对癌细胞的免疫应答增强。相反，拮抗性免疫治疗剂与抑制性检查点分子的结合可以防止免疫系统被后者下调并且帮助维持针对癌细胞的强烈应答。刺激性检查点分子的例子是B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、CD40、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。抑制性检查点分子的例子是CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、CD96和TIM-4。

无论抗癌免疫治疗剂的作用方式是哪种，均可以通过总体上调免疫系统(诸如通过激活TLR7)来提高其有效性。因此，在一个实施方案中，本说明书提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向遭受此类癌症的患者施用抗癌免疫治疗剂和如本文公开的TLR7激动剂的治疗有效组合。施用时间可以是同时、顺序或交替的。施用方式可以是全身的或局部的。所述TLR7激动剂可以经由缀合物以靶向的方式递送。

可以通过如上所述的组合治疗进行治疗的癌症包括急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、子宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因肉瘤、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、下咽癌、胰腺癌、肾癌、喉癌、慢性髓性白血病、唇和口腔癌、肺癌、黑素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、鼻咽癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。

可用于如上所公开的组合疗法的包括抗癌免疫治疗剂包括：AMG 557、AMP-224、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗、BMS936559、西米普利单抗(cemiplimab)、CP-870893、达塞妥珠单抗(dacetuzumab)、度伐单抗、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、加利昔单抗(galiximab)、IMP321、伊匹单抗、鲁卡木单抗(lucatumumab)、MEDI-570、MEDI-6383、MEDI-6469、莫罗单抗(muromonab)-CD3、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、曲美目单抗(tremelimumab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌托鲁单抗(utomilumab)、伐立鲁单抗、珀伽利珠单抗(vonlerolizumab)。下表C列出了它们的一个或多个替代名称(商标名称、曾用名、研究代码或同义词)和各自的靶检查点分子。

在用TLR7激动剂的组合治疗的一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗CTLA-4、抗PD-1或抗PD-L1抗体。所述癌症可以是肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌、头颈癌、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤和默克尔皮肤癌)、尿路上皮癌(包括膀胱癌)、胃癌、肝细胞癌、或结直肠癌。

在用TLR7激动剂的组合治疗的另一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗CTLA-4抗体，优选伊匹单抗。

在用TLR7激动剂的组合治疗的另一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗PD-1抗体，优选纳武单抗或派姆单抗。

本文公开的TLR7激动剂还可用作疫苗佐剂。

生物活性

本文公开作为TLR7激动剂的化合物的生物活性可以通过以下程序测定。

人TLR7激动剂活性测定

此程序描述了一种用于测定在本说明书中公开的化合物的人TLR7(hTLR7)激动剂活性的方法。

将具有人TLR7分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告转基因的工程化人胚肾蓝细胞(HEK-Blue^TMTLR细胞；Invivogen)悬浮于非选择性培养基(补充有10％胎牛血清(Sigma)的DMEM高葡萄糖(Invitrogen))中。将HEK-Blue^TMTLR7细胞添加到384孔组织培养板的每个孔中(15,000个细胞/孔)，并且在37℃5％CO₂下孵育16-18h。将化合物(100nl)分配到含HEK-Blue^TMTLR细胞的孔中，并且将处理的孔在37℃5％CO₂下孵育。处理18h后，将十微升的新鲜制备的Quanti-Blue^TM试剂(Invivogen)添加到每个孔中，孵育30min(37℃，5％CO₂)，并且使用Envision读板仪(OD＝620nm)测量SEAP水平。计算半数最大有效浓度值(EC₅₀；在测定基线与最大浓度之间引起响应的一半的化合物浓度)。报告的活性可以是多个测量值的平均值。

人血液中I型干扰素基因(MX-1)和CD69的诱导

I型干扰素(IFN)MX-1基因和B细胞激活标记CD69的诱导是在TLR7途径激活后发生的下游事件。以下是人全血测定，其测量响应于TLR7激动剂的诱导。

从人受试者中收集肝素化的人全血，并且用1mM的测试TLR7激动剂化合物处理。将血液用RPMI 1640培养基稀释，并且使用Echo预加样(predot)10nL/孔，给出1uM的最终浓度(在10nL血液中10uL)。在摇床上混合30秒后，将板盖住并且置于37℃室中o/n＝17h。制备固定/裂解缓冲液(在H₂0中5x->1x，在37℃下温热；目录号BD 558049)，并且保持perm缓冲液(在冰上)，以备后用。

对于表面标记染色(CD69)：制备表面Ab：0.045ul hCD14-F ITC(ThermoFisher目录号MHCD1401)+0.6ul hCD19-ef450(ThermoFis her目录号48-0198-42)+1.5ul hCD69-PE(目录号BD555531)+0.855ul FACS缓冲液。添加3ul/孔，1000rpm旋转1min，并且在摇床上混合30秒，置于冰上30min。在用70uL预温热的1x固定/裂解缓冲液30分钟后停止刺激，并且使用Feliex伴侣重悬(15次，对每个板更换吸头)并且在37C下孵育10分钟。

在2000rpm下离心5分钟，用HCS板清洗器抽出，在摇床上混合30秒，并且然后在dPBS中用70uL洗涤并且沉淀2次(2000rpm，持续5min)，并且在FACS缓冲液中用50ul洗涤，沉淀1次(2000rpm，持续5min)。在摇床上混合30秒。对于细胞内标记染色(MX-1)：添加50ul的BD Perm缓冲液III，并且在摇床上混合30秒。在冰上孵育30分钟(在黑暗中)。用50uL的FACS缓冲液洗涤2次(在perm后，在2300rpm下旋转5min)，然后在摇床上混合30秒。在20ul的FACS缓冲液中重悬，所述FACS缓冲液含有MX1抗体()(4812)-Alexa 647：Novus Biologicals#NBP2-43704AF647)20ul FACS bf+0.8ul hIgG+0.04ul MX-1。1000rpm旋转1min，在摇床上混合30秒，并且将样品在黑暗中在室温下孵育45分钟，然后FACS缓冲液洗涤2次(在perm后，在2300rpm下旋转5min)。20ul(每孔总计35uL)的FACS缓冲液重悬，并且用箔纸覆盖，并且置于4℃下，以在第二天读数。在iQuePlus上读取板。将结果加载到工具集中，并且在curvemaster中生成IC50曲线。将y轴100％设置为1uM的瑞喹莫德。

在小鼠血液中的TNF-α和I型IFN反应基因的诱导

TNF-α和I型IFN反应基因的诱导是在TLR7途径激活后发生的下游事件。以下是测量在全小鼠血液中响应于TLR7激动剂的其诱导的测定。

将肝素化的小鼠全血用具有Pen-Strep的RPMI 1640培养基以5:4的比率稀释(50uL全血和40uL培养基)。将体积为90uL的稀释的血液转移至Falcon平底96孔组织培养板的孔中，并且将板在4℃下孵育1h。将在100％DMSO储备液中的测试化合物在相同的培养基中稀释20倍用于浓度响应测定，并且然后将10uL的稀释的测试化合物添加到孔中，使得最终DMSO浓度为0.5％。对照孔接受10uL含5％DMSO的培养基。然后在5％CO₂培养箱中在37℃下将板孵育17h。孵育后，将100uL的培养基添加到每个孔中。将板离心，并且除去130uL的上清液用于通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7324，Thermo-Fisher Scientific)测定TNFa的产生。将来自Invitrogen mRNA Catcher Plus试剂盒(目录号K1570-02)的70uL体积的含DTT的mRNA捕获裂解缓冲液(1x)添加到孔中剩余的70uL样品中，并且通过上下移液5次进行混合。然后在室温下将板摇动5-10min，然后向每个孔中添加2uL的蛋白酶K(20mg/mL)。然后在室温下，将板摇动15-20min。然后将板在-80℃下储存直到进一步处理。

将冷冻样品解冻，并且根据制造商的说明书，使用Invitrogen mRNA CatcherPlus试剂盒(目录号K1570-02)提取mRNA。使用Invitrogen SuperScript IV VILO MasterMix(目录号11756500)，将来自RNA提取的一半产率的mRNA用于在20μL逆转录酶反应中合成cDNA。使用来自ThermoFisher(Applied Biosystems)的QuantStudio实时PCR系统，进行

实时PCR。使用针对小鼠IFIT1、IFIT3、MX1和PPIA基因表达的商业化预设计的TaqMan测定和TaqMan Master Mix，一式两份地运行所有实时PCR反应。将PPIA用作管家基因。遵循制造商的建议。将所有原始数据(Ct)通过平均管家基因(Ct)进行归一化，并且然后使用对比Ct(ΔΔCt)方法量化相对基因表达(RQ)，用于实验分析。

合成

通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，所述实施例是作为说明而非限制来提供的。

实施例后的表列出了本文使用的首字母缩略词和缩写及其含义。

实施例1-根据图1的化合物的合成

此实施例和图1涉及化合物IIa-01的合成。

化合物3.将在甲醇(50mL)中的4-氨基-1H-吡唑-5-甲酸甲酯2(4g，28.3mmol)和(Z)-4-(2,3-双(甲氧基羰基)胍基)-1H-吡唑-5-甲酸甲酯1用乙酸(8.11mL，142mmol)处理，此时形成沉淀。将反应混合物搅拌过夜。添加甲醇钠(64.8mL，283mmol)并且继续搅拌过夜。LCMS显示反应完成。通过缓慢添加乙酸将pH调节至5，由此形成沉淀，将沉淀用水然后用乙腈洗涤并且干燥，以提供5.2g的呈灰白色固体的化合物3。LCMS ESI：针对C₇H₇N₅O₃的计算值＝210.16(M+H⁺)，实测值210.0(M+H⁺)。

化合物4.将在DMSO(10mL)中的化合物3(2g，9.56mmol)、丁-1-胺(1.8mL，9mmol)和DBU(1.6mL，10mmol)用BOP(5g，11mmol)缓慢处理。将反应混合物在60℃下加热2h，此时LCMS显示反应完成。将反应直接在使用80g C-18柱的反相COMBIFLASH^TM仪器上，用0-100％乙腈/水(0.1％甲酸)洗脱进行纯化，以得到呈白色固体的化合物4。LCMS ESI：针对C₁₁H₁₆N₆O₂的计算值＝265.28(M+H⁺)，实测值265.2(M+H⁺)。¹H NMR(400MHz,dmso-d6)δ8.02(s,1H),3.97(s,3H),1.74-1.66(m,2H),1.49-1.38(m,2H),1.25(s,1H),0.95(t,J＝7.4Hz,3H)。

化合物6.将在DMF(2mL)中的4-(溴甲基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯5(1g，3.86mmol)和环丁胺5a(0.659mL，7.72mmol)的混合物在70℃下加热经30min，此时LCMS显示形成胺产物。将过量的碱蒸发，并且添加Hunig碱(1.348mL，7.72mmol)，然后添加Boc-酸酐(0.896mL，3.86mmol)。LCMS显示反应完成。将溶剂蒸发，并且将粗产物通过COMBIFLASH^TM仪器使用EtOAc/己烷进行纯化，以提供0.82g呈无色油状物的希望产物6。LCMS ESI：针对C₁₉H₂₇NO₅的计算值＝350.42(M+H⁺)，实测值350.1(M+H⁺)。

化合物7.将在0℃下的化合物6(0.82g，2.347mmol)在THF(5mL)中的溶液用LiAlH₄(在THF中2M，1.173mL，2.347mmol)缓慢处理并且搅拌30min，此时LCMS显示反应完成。通过缓慢添加甲醇将反应淬灭，并且与罗谢尔盐溶液一起搅拌2h。分离有机层，并且将粗产物7在COMBIFLASH^TM仪器上使用EtOAc/己烷，硅胶柱进行纯化。LCMS ESI：针对C₁₈H₂₇NO₄的计算值＝322.41(M+H⁺)，实测值322.1(M+H⁺)。

化合物8和9.将化合物4(100mg，0.378mmol)、化合物7(182mg，0.568mmol)和三苯基膦(248mg，0.946mmol)在THF(3mL)中的混合物用DIAD(0.110mL，0.568mmol)缓慢处理经5min，并且在N₂下在室温下搅拌30min，此时LCMS显示反应完成。将溶剂蒸发，并且将粗产物在使用80g C-18柱的反相COMBIFLASH^TM仪器上用0-100％乙腈/水(1mM TEAA)洗脱进行纯化，以提供呈白色固体的化合物8和9的混合物。LCMS ESI：针对C₂₉H₄₁N₇O₅的计算值＝566.69(M-H⁺)，实测值566.3(M-H⁺)。

将异构体通过手性超临界流体色谱分离以提供17mg的化合物8和25mg的化合物9，所述手性超临界流体色谱使用柱：Kromasil 5-CelluCoat，21x 250mm，5微米，流动相：15％MeOH-DEA/85％％CO₂，流速条件：45mL/min，150巴，40℃，检测器波长：230nm，注入细节：0.5mL的在MeOH中的约25mg/mL。

针对化合物8的分析数据：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.61(s,2H),7.86(s,2H),6.94(s,2H),6.83(s,2H),6.63(d,J＝7.9Hz,2H),6.51(d,J＝7.5Hz,2H),5.69(s,4H),4.39(s,4H),3.79(s,6H),3.63(s,6H),3.48(d,J＝6.2Hz,4H),3.33(s,20H),3.18(d,J＝5.3Hz,1H),2.05-1.95(m,8H),1.53(t,J＝7.5Hz,7H),1.35(s,11H),1.23(q,J＝7.2Hz,6H),0.86(t,J＝7.4Hz,6H)。

针对化合物9的分析数据：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.37(s,1H),8.08(s,1H),6.90(s,1H),6.84(s,1H),6.71(d,J＝7.7Hz,1H),5.48(s,2H),4.42(s,3H),3.78(d,J＝18.0Hz,4H),3.69(s,1H),3.61(s,3H),3.51-3.42(m,3H),2.06-1.97(m,6H),1.61-1.47(m,6H),1.36(s,8H),1.34-1.26(m,6H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H),0.94-0.85(m,4H)。

化合物8a.将化合物8(13mg，0.023mmol)的溶液溶解于THF(0.5mL)中，并且用TFA(0.018mL，0.229mmol)处理。LCMS在30min内显示Boc脱保护。将TFA蒸发，并且将此混合物用氢氧化钠(9.16mg，0.229mmol)处理，并且在60℃下加热2h，此时LCMS显示反应完成。将碱通过缓慢添加6M HCl中和，并且用EtOAc/水后处理。在以下条件下经由制备型HPLC纯化粗材料：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10-mM乙酸铵的水；梯度：在7％B下保持0分钟，经20分钟7％-47％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min。LCMS ESI：针对C₂₂H₃₁N₇O的计算值＝410.5(M+H⁺)，实测值410.2(M+H⁺)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ7.54(s,3H),7.02(s,3H),6.76(d,J＝7.6Hz,3H),6.47-6.38(m,5H),5.60(d,J＝11.5Hz,10H),3.58(s,2H),3.47(s,1H),3.42(s,2H),3.38(s,2H),3.18-3.11(m,2H),2.02(s,4H),1.90(s,5H),1.70(t,J＝9.5Hz,5H),1.60(d,J＝9.8Hz,3H),1.49(dt,J＝24.2,8.3Hz,9H),1.36(d,J＝19.4Hz,4H),1.20(dt,J＝15.0,7.2Hz,6H),0.84(t,J＝7.4Hz,9H)。

化合物IIa-01.以类似于用于化合物8a的方式制备化合物IIa-01。LCMS ESI：针对C₂₂H₃₁N₇O的计算值＝410.5(M-H⁺)，实测值410.2(M-H⁺)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ7.64(s,1H),7.02(s,1H),6.90(d,J＝7.7Hz,1H),6.85(d,J＝7.6Hz,1H),5.75(s,1H),5.37(s,2H),3.56(s,1H),3.18-3.11(m,1H),2.55(s,3H),2.04(d,J＝9.0Hz,2H),1.88(s,6H),1.71(t,J＝9.7Hz,2H),1.56(dq,J＝19.1,10.6,10.2Hz,4H),1.31(q,J＝7.7Hz,2H),0.88(t,J＝7.4Hz,3H)。

实施例2-根据图2A-2B的化合物的合成

此实施例和图2A-2B涉及化合物IIa-14和IIa-19及类似制造的其他化合物的合成。

化合物12和13.将4-硝基-1H-吡唑-5-甲酸甲酯10(3.27g，19.11mmol)在DMF(20mL)中的溶液用K₂CO₃(2.90g，21.02mmol)和4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯11(5g，19.30mmol)处理。反应在0℃下开始并且允许进行1h，此时LCMS显示反应完成，约1:5的产物混合物。将碱过滤，并且将反应用EtOAc稀释并且用水洗涤2次。将溶剂蒸发，并且将粗产物原样用于下一步骤。LCMS ESI：针对C₁₅H₁₅N₃O₇的计算值＝350.2(M-H⁺)，实测值350.0(M-H⁺)。

出于表征的目的，将少量产物混合物使用硅胶柱色谱使用0-50％EtOAc/己烷进行分离。

针对化合物12的分析数据：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.40(s,1H),7.57(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.50(d,J＝1.6Hz,1H),7.27(d,J＝7.9Hz,1H),5.53(s,2H),3.96(s,3H),3.84(d,J＝16.2Hz,6H)。

针对化合物13的分析数据：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.05(s,1H),7.62-7.51(m,2H),7.28(d,J＝7.9Hz,1H),5.47(s,2H),3.87(s,8H),3.31(s,1H)。

化合物14和15.将化合物12和13(2g，5.73mmol)、锌和甲酸铵的溶液在室温下搅拌2h，此后LCMS显示反应完成。过滤并且浓缩，得到化合物14和15的粗混合物。LCMS ESI：针对C₁₅H₁₇N₃O₅的计算值＝320.3(M+H⁺)，实测值320.2(M+H⁺)。

化合物16和17.将化合物14和15(1.830g，5.73mmol)和化合物1在MeOH(20mL)中的混合物用乙酸(1.640mL，28.7mmol)处理并且搅拌过夜。将此溶液用甲醇钠(13.11mL，57.3mmol)处理并且搅拌过夜。LCMS显示转化为产物。将pH调节至5，并且将所得的沉淀物用水洗涤。将残余物干燥，以得到化合物16和17的混合物。LCMS ESI：针对C₁₇H₁₇N₅O₆的计算值＝388.3(M+H⁺)，实测值388.1(M+H⁺)。

化合物18和19.将化合物16和17(1g，2.58mmol)在DMSO(10mL)中的混合物用丁-1-胺(0.510mL，5.16mmol)、DBU(0.428mL，2.84mmol)处理，然后缓慢用BOP(1.370g，3.10mmol)处理。将反应在70℃下加热2h，此时LCMS显示反应完成。将反应用水稀释并且用EtOAc萃取。将合并的有机相经Na₂SO₄干燥，并且原样用于下一步骤。LCMS ESI：针对C₂₁H₂₆N₆O₅的计算值＝443.4(M+H⁺)，实测值443.2(M+H⁺)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.41(s,1H),8.20(s,1H),8.08(s,1H),7.57-7.42(m,3H),6.93(d,J＝8.1Hz,1H),5.80(s,1H),5.60(s,2H),4.04(q,J＝7.1Hz,1H),3.95-3.82(m,10H),3.62(d,J＝6.1Hz,4H),3.45(q,J＝7.0Hz,3H),2.68(d,J＝9.9Hz,1H),2.57-2.50(m,6H),2.00(s,1H),1.59(p,J＝7.3Hz,3H),1.54-1.48(m,1H),1.39-1.26(m,3H),1.18(t,J＝7.1Hz,2H),0.86(dt,J＝29.5,7.3Hz,5H)。

化合物18a和IIa-14.将在0℃下的化合物18和19(1.142g，2.58mmol)在THF(2.58mL，5.16mmol)中的溶液用LiAlH₄(THF，2.58mL，5.16mmol)处理并且搅拌1h，此后LCMS显示反应完成。将反应用MeOH淬灭，并且用罗谢尔盐溶液搅拌过夜。将产物用EtOAc萃取并且以粗化合物还原的中间体的混合物用于下一步骤。LCMS ESI：针对C₂₀H₂₆N₆O₄的计算值＝415.4(M+H⁺)，实测值415.2(M+H⁺)。

将还原的中间体(1069mg，2.58mmol)在1,4-二噁烷(10mL)中的混合物用水性氢氧化钠(2.58mL，25.8mmol)处理，并且在80℃下加热5h，此后LCMS显示形成产物。将碱用6MHCl中和，并且将溶剂蒸发。将残余物吸收在5mL DMF中，并且进行注射器过滤。将溶剂蒸发，以得到化合物18a和IIa-14的3:1混合物。LCMS ESI：针对C₁₈H₂₄N₆O₂的计算值＝357.4(M+H+)，实测值357.2(M+H+)。

化合物18b和IIa-19.将化合物Ia-38和IIa-14(420mg，1.178mmol)在THF(1mL)中的溶液用亚硫酰氯(0.172mL，2.357mmol)处理，并且搅拌30min，此后LCMS显示反应完成。将溶剂蒸发，并且将粗产物原样用于下一步骤。LCMS ESI：针对C₁₈H₂₃ClN₆O的计算值＝375.8(M+H⁺)，实测值375.2(M+H⁺)。

将前述粗产物混合物(20mg，0.053mmol)和四氢-2H-吡喃-4-胺22(5.40mg，0.053mmol)在DMF(1mL)中的混合物在70℃下加热1h，此后LCMS显示反应完成。将反应进行注射器过滤，并且将粗产物经由制备型LC/MS用以下条件纯化和分离：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：在6％B保持2分钟，经25分钟6％-27％B，然后在100％B下保持2分钟；流速：20mL/min；柱温：25C。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望的产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。

针对IIa-19的分析数据：LCMS ESI：针对C₂₃H₃₃N₇O₂的计算值＝440.5(M+H⁺)，实测值440.1(M+H⁺)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.39(s,1H),7.98(s,1H),7.94(s,0H),7.86(s,1H),7.24(s,1H),7.14-7.03(m,2H),5.51(s,2H),4.16(s,2H),3.96-3.90(m,2H),3.84(s,3H),3.29(d,J＝11.6Hz,2H),2.89(s,1H),2.73(s,1H),2.55(s,1H),2.00(d,J＝12.6Hz,2H),1.58(p,J＝7.5Hz,4H),1.31(q,J＝7.5Hz,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。

与化合物IIa-19类似地，但是在最后的步骤中使用表D中所指示的胺代替四氢-2H-吡喃-4-胺22，制备另外的化合物。

实施例3-根据图3的化合物的合成

按照图3的合成方案制造化合物IIa-35。预期质量(M+H)401.4；观测值401.1。

实施例4-根据图4A-4B的化合物的合成

此实施例和图4A-4B涉及化合物IIb-01和IIb-04及类似制造的其他化合物的合成。

化合物30.将化合物4(400mg，1.513mmol)在二噁烷(5mL)中的悬浮液用氢氧化钠(在水中10N，1.513mL，15.13mmol)处理并且在60℃下搅拌45min。将反应混合物浓缩。将粗产物溶解于水中，并且通过在使用150g C-18柱的COMBIFLASH^TM单元上的反相色谱，用在乙腈中的10mM TEAA:在水中的10mM，0-70％梯度洗脱进行纯化。将所希望的级分冷冻并且冻干，以产生化合物30(150mg，0.727lmmol，48.1％产率)。LCMS ESI：针对C₉H₁₅N₆的计算值＝207.1(M+H⁺)，实测值207.2(M+H⁺)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.56(br s,1H),5.53(br s,2H),3.43(br d,J＝6.2Hz,2H),1.57(t,J＝7.2Hz,2H),1.44-1.29(m,2H),0.95-0.76(m,3H)。

化合物33.将6-氟烟碱醛31(1.809g，14.46mmol)、4-羟基苯甲酸甲酯32(2g，13.15mmol)和K₂CO₃(1.998g，14.46mmol)在DMF(26.3ml)中的悬浮液在110℃下搅拌4h。LCMS指示反应完成。冷却后，将反应用水淬灭。通过过滤收集所得的固体，并且将其用水冲洗并且在真空中干燥，以产生化合物33(3.30g，12.84mmol，95.1％产率)。LCMS ESI：针对C₁₄H₁₁NO₄的计算值＝258.1(M+H⁺)，实测值258.0(M+H⁺)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ10.01(s,1H),8.63(d,J＝2.4Hz,1H),8.23(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),8.17-7.97(m,2H),7.27-7.22(m,2H),7.10(d,J＝8.6Hz,1H),3.93(s,3H)。

化合物34.将化合物33(3.76g，14.62mmol)在MeOH(100ml)中的溶液用NaBH₄(0.553g，14.62mmol)在0℃下分批处理，并且然后在持续冷却下搅拌10min。LCMS指示反应完成。通过缓慢添加半饱和的NH₄Cl将反应淬灭。在室温下继续搅拌30min。将反应混合物用乙酸乙酯萃取。将有机萃取物经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩。将粗固体浆化到水中，并且通过过滤收集并且将其在真空中干燥，以产生化合物34(3.37g，13.00mmol，89％产率)。LCMSESI：针对C₁₄H₁₃NO₄的计算值＝260.1(M+H⁺)，实测值260.0(M+H⁺)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.21(d,J＝2.2Hz,1H),8.12-8.04(m,2H),7.81(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.21-7.13(m,2H),6.99(d,J＝8.4Hz,1H),4.71(s,2H),3.91(s,3H)。

化合物35.在0℃下，将在DCM(75mL)中的化合物34(7.9g，30.5mmol)用MsCl(2.61mL，33.5mmol)处理。在室温下搅拌16h后，反应完成。将反应用水淬灭。用DCM(3x20mL)萃取后，将合并的有机萃取物经Na₂SO₄干燥、过滤并且浓缩。将粗产物在ISCO硅胶柱(80g)上用乙酸乙酯:己烷0-70％梯度洗脱进行纯化。将所希望的级分浓缩以产生化合物35(7.47g，26.9mmol，88％产率)。LCMS ESI：针对C₁₄H₁₃ClNO₃的计算值＝278.1(M+H⁺)，实测值278.0(M+H⁺)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.19(d,J＝2.2Hz,1H),8.13-8.02(m,2H),7.79(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),7.22-7.14(m,2H),6.99(d,J＝8.6Hz,1H),4.57(s,2H),3.92(s,3H)。

化合物36和37.将在DMF(1mL)中的化合物30(70mg，0.339mmol)用碳酸铯(332mg，1.018mmol)处理，然后用化合物35(94mg，0.339mmol)处理。在室温下搅拌5h后，反应完成。用水淬灭并且用乙酸乙酯(3x 10mL)萃取后，将合并的有机萃取物经Na₂SO₄干燥、过滤并且浓缩。将粗产物在ISCO硅胶柱(24g)上用在DCM中的20％MeOH:DCM 0-60％梯度洗脱进行纯化。将所希望的级分浓缩，以产生以1:4比率的化合物36和37(120mg，0.080mmol，79％产率)的混合物。LCMS ESI：针对C₂₃H₂₆N₇O₃的计算值＝448.2(M+H⁺)，实测值448.3(M+H⁺)。

化合物36a和IIb-01.在N₂下在0℃下，将化合物36和37(60mg，0.114mmol)在THF(2mL)中的混合物用LiAlH₄(在THF中1.0M，0.22mL，0.22mmol)缓慢处理。将反应混合物在0℃下搅拌1h，此时LCMS显示反应完成。通过缓慢添加Na₂SO₄·10H₂0将反应淬灭，然后添加MeOH，并且在室温下搅拌3h。将固体滤出。将滤液浓缩。将残余物溶解于DMF中，并且用以下条件经由制备型LC/MS将产物纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％三氟乙酸的水；梯度：在10％B下保持0分钟，经20分钟10％-45％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望的产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。

针对化合物IIb-01的分析数据：LCMS ESI：针对C₂₂H₂₆N₇O₂的计算值＝420.2(M+H⁺)，实测值420.2(M+H⁺)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.45-9.29(m,1H),8.21-8.15(m,1H),8.13(s,1H),7.86-7.78(m,1H),7.78-7.68(m,1H),7.35(br d,J＝8.2Hz,2H),7.08-7.03(m,2H),7.03-6.99(m,1H),5.52(s,2H),4.50(br d,J＝4.9Hz,2H),2.98-2.82(m,2H),1.65-1.51(m,2H),1.40-1.27(m,2H),0.90(br t,J＝7.2Hz,3H)。

化合物IIb-04.将化合物36a和化合物IIb-04(40mg，0.095mmol)在THF(1mL)中的混合物用亚硫酰氯(0.14mL，1.9mmol)处理。在室温下搅拌3h后，LCMS显示反应完成。将溶剂蒸发，并且用DCM共沸地除去过量的亚硫酰氯。将粗氯化物材料不经进一步纯化而直接用于下一步骤。LCMS ESI：针对C₂₂H₂₅N₇O的计算值＝438.2(M+H⁺)，实测值438.1(M+H⁺)。

将来自上一段落的前述氯化物(40mg，0.091mmol)的混合物溶解于DMF(1.0mL)中，并且用2-氨基乙-1-醇(55.0μl，0.91mmol)处理，然后在室温下搅拌16h。LCMS显示反应完成。将混合物用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含10mM乙酸铵的水；流动相B：95:5乙腈:含10mM乙酸铵的水；梯度：在8％B下保持0分钟，经25分钟8％-48％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望的产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。

针对化合物IIb-04的分析数据：LCMS ESI：针对C₂₄H₃₁N₈O₂的计算值＝463.2(M+H⁺)，实测值463.3(M+H⁺)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.18(br s,2H),7.91(br s,1H),7.84(br d,J＝8.7Hz,1H),7.55(br d,J＝8.1Hz,2H),7.18(br d,J＝8.3Hz,2H),7.09(br d,J＝8.7Hz,1H),5.55(s,2H),4.18(s,2H),3.73-3.63(m,2H),3.12-2.74(m,4H),1.69-1.50(m,2H),1.38-1.25(m,2H),0.91(br t,J＝7.3Hz,3H)。

在图4A-4B的方案中用4-氟-2-甲氧基苯甲醛替代6-氟烟碱醛31，并且总体上按照以上程序，使用指示的胺类似地制备表E中的化合物。

实施例5-化合物III-01和III-02的合成

此实施例涉及化合物III-01和III-02的制备。通过使化合物36和37与MeMgCl格氏试剂反应制备这些化合物。

在0℃下，向化合物36和37(60mg，0.134mmol)在THF(1mL)中的混合物中添加MeMgCl(0.171mL，0.513mmol)。1h后，LCMS显示反应完成。将混合物用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:含0.1％TFA的水；流动相B：95:5乙腈:含0.1％TFA的水；梯度：在10％B下保持0分钟，经20分钟10％-45％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望的产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥。

针对III-02的分析数据。LCMS ESI：针对C₂₄H₃₀N₇O₂的计算值＝448.2(M+H⁺)，实测值448.2(M+H⁺)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.22(d,J＝1.8Hz,1H),8.06-7.97(m,2H),7.87(br dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),7.23(d,J＝8.8Hz,2H),7.15(d,J＝8.5Hz,1H),5.99-5.97(m,1H),5.56(s,2H),3.58-3.54(m,2H),1.64-1.49(m,2H),1.37-1.25(m,2H),1.17(s,6H),0.90(t,J＝7.4Hz,3H),0.71-0.70(m,1H)

前述具体实施方式包括主要或专门涉及本发明的特定部分或方面的段落。应当理解，这是为了清楚和方便，特定特征可能在不只是公开它的段落中是相关的，并且本文所公开的内容包括在不同段落中找到的信息的所有适当组合。类似地，尽管本文中的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但是应当理解，在特定附图或实施方案的背景下公开了具体特征的情况下，也可以在另一个附图或实施方案的背景下、与另一个特征组合、或总体上在本发明中在适当的程度上使用此类特征。

此外，尽管已经根据某些优选实施方案具体描述了本发明，但是本发明不限于此类优选实施方案。而是，本发明的范围由所附权利要求限定。

首字母缩略词和缩写

这是本说明书中使用的首字母缩略词和缩写及其含义的列表。

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以下提供了在本说明书中较早以缩写方式通过第一作者(或发明人)和日期引用的以下参考文献的完整引用。将这些参考文献的每一个出于所有目的通过引用并入本文。

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1.一种化合物，所述化合物具有根据式II的结构

其中