JP2023512204A - トール様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストとしての１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン化合物 - Google Patents

Abstract

下記の式（Ｉ）：【化１】TIFF2023512204000092.tif61115で表される化合物は、トール様受容体７（ＴＬＲ７）のアゴニストとして有用である。そのような化合物は、特に抗がん免疫療法剤と併用してがん治療に、またはワクチンアジュバントとして使用され得る。【選択図】なし

Description

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年７月２８日に提出された米国仮出願シリアル番号第６３／０５７，６７５号、および２０２０年１月２７日に提出された米国仮出願シリアル番号第６２／９６６，０９８号の利益を主張し；それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、トール様受容体７（「ＴＬＲ７」）アゴニストおよびその複合体、ならびに調製方法、並びにそのようなアゴニストおよびその複合体の使用に関する。

トール様受容体（「ＴＬＲｓ」）は、特定の種類の病原体に保存される小分子モチーフである病原体関連分子パターン（「ＰＡＭＰｓ」）を認識する受容体である。ＴＬＲは、細胞の表面上または細胞内のいずれかに存在し得る。同種のＰＡＭＰの結合によるＴＬＲの活性化は、宿主内の関連病原体の存在－すなわち感染を伝え、宿主の免疫系を刺激して感染と闘わせる。ヒトには１０のＴＬＲｓがあり、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３などと名付けられている。

アゴニストによるＴＬＲの活性化－ＴＬＲ７のものが最も研究されている－は、実際の病原体感染以外の様々な病態の治療において、免疫応答を全体的に刺激することにより、ワクチンおよび免疫療法剤の作用に対して良い効果を及ぼし得る。それゆえ、ワクチンアジュバントとしての、またはがん免疫療法におけるエンハンサーとしてのＴＬＲ７アゴニストの使用に大きな関心がある。例えば、Ｖａｓｉｌａｋｏｓ ａｎｄ Ｔｏｍａｉ ２０１３，Ｓａｔｏ－Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｓｍｉｔｓ ｅｔ ａｌ．２００８，およびＯｔａ ｅｔ ａｌ．２０１９を参照されたい。

ＴＬＲ７は、エンドソームの膜上に位置する細胞内受容体であり、一本鎖ＲＮＡウイルスと関連するＰＡＭＰsを認識する。その活性化は、ＩＦＮαおよびＩＦＮβなどのＩ型インターフェロンの分泌を誘導する（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．２００４）。ＴＬＲ７には２つの結合部位があり、一つは一本鎖ＲＮＡリガンド（Ｂｅｒｇｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）との、一つはグアノシンなどの小分子（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１６）との結合部位である。

ＴＬＲ７は、グアノシン様合成アゴニスト、例えば１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン骨格を基にしているイミキモド、レシキモド、およびガーディキモド（gardiquimod）などに結合し、活性化されることがある。小分子ＴＬＲ７アゴニストのレビューについてはＣｏｒｔｅｚ ａｎｄ Ｖａ ２０１８を参照されたい。

ベサトリモドが挙げられるように、プテリジノン分子骨格を基にする合成ＴＬＲ７アゴニストもまた既知である（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。

プリン様骨格を基にする他の合成ＴＬＲ７アゴニストは開示されており、しばしば下記の一般式（Ａ）：

［式中、Ｒ、Ｒ’、およびＲ”は、構造的な可変要素であり、Ｒ”は一般に非置換または置換された芳香またはヘテロ芳香環を含む］で示される。

プリン様骨格を有する生物活性分子および線維症、炎症性疾患、がん、または病原性感染などの病態の治療におけるその使用の開示には：Ａｋｉｎｂｏｂｕｙｉ ｅｔ ａｌ．２０１５および２０１６；Ｂａｒｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１６、２０１７ａ、および２０１７ｂ；Ｇｒａｕｐｅ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１９ａおよび２０１９ｂ；Ｈｏｌｌｄａｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．２００９ａおよび２０１２；Ｐｏｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１９ａおよび２０１９ｂ；Ｐｒｙｄｅ ２０１０；ならびにＹｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９が挙げられる。

基Ｒ”は、ピリジルであり得る：Ｂｏｎｆａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１５ａおよび２０１５ｂ；Ｈａｌｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．２００２、２００４、２００６、２００９ａ、２００９ｂ、２０１１、および２０１２；Ｋａｓｉｂｈａｔｌａ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｏｇａ－Ｙａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍｕｓｍｕｃａ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｎａｋａｍｕｒａ ２０１２；Ｏｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．２００７；ならびにＹｕ ｅｔ ａｌ．２０１３。

式（Ａ）の６，５縮合環系－ピリミジン６員環とイミダゾール５員環が縮合した－が改変された関連分子の開示がある。（ａ）Ｄｅｌｌａｒｉａ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１０および２０１２、ならびにＰｉｌａｔｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１７は、ピリミジン環がピリジン環に置換された化合物を開示する。（ｂ）Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｃｏｅ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｐｏｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２０２０ａおよび２０２０ｂ、ならびにＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８は、イミダゾール環がピラゾール環に置換された化合物を開示する。（ｃ）Ｃｏｒｔｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１７および２０１８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８；ならびにＭｃＧｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６ａ、２０１６ｂ、および２０１７は、イミダゾール環がピロール環に置換された化合物を開示する。

Ｂｏｎｆａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１５ｂおよび２０１６ならびにＰｕｒａｎｄａｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１９は、プリン部分の２つの環が大環状分子により架橋されたＴＬＲ７モジュレーターを開示する。

ＴＬＲ７アゴニストは、パートナー分子に結合されることがあり、それは、例えば、リン脂質、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、抗体、または別のＴＬＲ（一般にＴＬＲ２）であり得る。代表的な開示には：Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１３、２０１５、および２０１６、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．２００９および２０１１、Ｃｏｒｔｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｇａｄｄ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｌｉｏｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｍａｊ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｖｅｒｎｅｊｏｕｌ ｅｔ ａｌ．２０１４、ならびにＺｕｒａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２が挙げられる。主な結合部位は、式（Ａ）のＲ”基である。

Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１５は、ＴＬＲ７アゴニストの送達のためのカチオン性脂質ビークルの使用を開示する。

レシキモドなどのいくつかのＴＬＲ７アゴニストは、ＴＬＲ７/ＴＬＲ８デュアルアゴニストである。例えば、Ｂｅｅｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｅｍｂｒｅｃｈｔｓ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｌｉｏｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１６、およびＶｅｒｎｅｊｏｕｌ ｅｔ ａｌ．２０１４を参照されたい。

筆頭著者または発明者および発行年により本明細書に引用される文書についての完全な引用が、本明細書の末尾に記載される。

本明細書は、１Ｈ－ピラゾロ［４，３ｄ］ピリミジン芳香族系を有する、ＴＬＲ７アゴニストとしての活性がある化合物に関する。

一つの態様において、下記の式（Ｉ）：

［式中、
各Ｘ^１は、独立してＮまたはＣＲ^２であり；
Ｘ^２は、Ｏ、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｓ、またはＮ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）であり；
Ｒ^１は、（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
（Ｃ_２－Ｃ_５アルケニル）、
（Ｃ_１－Ｃ_８アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）、
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）ＯＨ、
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（５－６員ヘテロアリール）、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１フェニル、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＣＦ_３、
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
または
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）ＮＲ^ｘＲ^ｙであり；
各Ｒ^２は、独立してＨ、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｓ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル、Ｏ（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、
Ｓ（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、ＳＯ_２（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、
Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、または［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１ＮＲ^ｘＲ^ｙであり；
Ｒ^４は、ＮＨ_２、
ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
または
下記の構造：

を有する部分であり；
Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル、Ｃ_２－Ｃ_５アルケニル、Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル、
ハロ、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、フェニル、
ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、５もしくは６員ヘテロアリール、

であり；
Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルであるか、あるいはＲ^ｘおよびＲ^ｙは、それらに結合している窒素と結合して３から７員のヘテロ環を形成し；
ｍは、０または１であり；
ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５において、
アルキル、アルカンジイル、シクロアルキル、フェニル、５もしくは６員ヘテロアリール、または下記の式：

で示される部分は、
ＯＨ、ハロ、ＣＮ、（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）
から選択される一つ以上の置換基で適宜置換されてもよく；
アルキル、アルカンジイル、シクロアルキル、または下記の式：

の環状部分は、
Ｏ、ＳＯ_２、ＣＦ_２、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＨ、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＣＦ_３、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、
または
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_５シクロアルキル）
に置換されるＣＨ_２基を有してもよい］
で示される構造を有する化合物が提供される。

本明細書に開示される化合物は、ＴＬＲ７アゴニストとしての活性を有し、いくつかは、目的とする作用の標的組織または臓器への標的化送達のための抗体に結合されることがある。それらはＰＥＧ化され、その医薬特性が調節されることもある。

本明細書に開示される化合物、またはその複合体あるいはそのＰＥＧ化誘導体は、免疫系の活性化による治療に適している病態を患う患者に対して、治療的有効量の、そのような化合物またはその複合体あるいはそのＰＥＧ化誘導体を、特にワクチンまたはがん免疫療法剤と併用して投与することによって、そのような患者を治療するのに使用され得る。

化合物
一つの態様において、式（Ｉ）中、下記の部分

は、

である。

一つの態様において、本開示の化合物は、下記の式（Ｉａ）で示され、式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、式（Ｉ）について定義される通りである：

もう一つの態様において、本開示の化合物は、下記の式（Ｉｂ）で示され、式中、Ｒ^１、Ｒ^４、およびＲ^５は、式（Ｉ）について定義される通りである：

式（Ｉｂ）において、Ｒ^５は、好ましくはＨである。

もう一つの態様において、本開示は、式（Ｉｂ）
［式中、
Ｒ^１は、

であり；
Ｒ^４は、

であり；
Ｒ^５は、Ｈ、Ｍｅ、またはＦである］
で示される構造を有する化合物を提供する。

好ましくは、Ｒ^１は、

からなる上記の群（「好ましいＲ^１基」)から選択される。

もう一つの実施形態において、Ｒ^１は、

である。

基Ｒ^２の例には、

が挙げられる（１番目が好ましい）。

基Ｒ^４の例には：

が挙げられる。

好ましくは、Ｒ^４は：

からなる上記の群（「好ましいＲ^４基」)から選択される。

適当な基Ｒ^５の例は、Ｈ、

である。

好ましくは、Ｒ^５は、ＨまたはＭｅである。

好ましくは、Ｒ^４は、好ましいＲ^３基から選択されるＲ^３と組み合わせて、好ましいＲ^４基から選択され；Ｒ^１は、好ましいＲ^１基から選択され、Ｒ^５は、ＨまたはＭｅである。

例示であって限定ではないが、下記の式：

の部分には、

が挙げられる。

前述の代表的な下記の式：

の部分のいくつかは、上記の「発明の概要」に記載されるように、任意の置換基を有する、および／またはＯ、ＳＯ_２などに置換される一つ以上のＣＨ_２基を適宜有してもよい。

本明細書に開示される化合物の具体例を以下の表Ａに示す。表は、以下に提供される手順を通じて割り出された、生物学的活性：ヒトＴＬＲ７アゴニズムレポーターアッセイおよび／またはヒト全血におけるＣＤ６９遺伝子の誘導に関するデータも提供する。最も右の列に解析データ（マススペクトル、ＬＣ／ＭＳ保持時間、およびＮＭＲ）を記載する。一つの実施形態において、本開示の化合物は、（ａ）１，０００ｎＭ未満のヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）レポーターアッセイＥＣ_５０値および（ｂ）１，０００ｎＭ未満のヒト全血（ｈＷＢ）ＣＤ６９誘導ＥＣ_５０値を有する。（アッセイが複数回行われた場合、報告される値は平均値である。）

医薬組成物および投与
もう一つの態様において、薬学的に許容される担体または添加剤とともに製剤化される、本明細書に開示されるような化合物、またはその複合体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、一つ以上の追加の薬学的活性成分、例えば生物学的製剤または小分子薬剤などを適宜含んでもよい。医薬組成物は、別の治療剤、特に抗がん剤との併用療法で投与され得る。

医薬組成物は、一つ以上の添加剤を含むことがある。使用されることがある添加剤には、担体、界面活性剤、増粘または乳化剤、固体結合剤、分散または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、風味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、防腐剤、等張化剤、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適当な添加剤の選択および使用は、Gennaro編，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第２０版（Lippincott Williams ＆ Wilkins 2003）に記載されている。

好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適する。投与経路に応じて、活性化合物は、物質でコーティングされ、化合物を不活化することがある酸および他の自然条件の作用から保護されることがある。「非経口投与」という語句は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、例として、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、医薬組成物は、局所、上皮または粘膜投与経路などの非非経口経路（non-parenteral route）で、例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、経直腸的、舌下または局所的に投与され得る。

医薬組成物は、滅菌水溶液または滅菌水分散液の形であり得る。それらは、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度を達成するのに適当な他の秩序構造中で製剤化されることもある。組成物は、投与前に水で再調製する凍結乾燥物の形でも提供され得る。

担体物質と結合して単一剤形を生成し得る活性成分の量は、治療を受ける患者および特定の投与方法によって異なり、一般的には治療効果をもたらす組成物の量であろう。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、活性成分の約０．０１パーセントから約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは、薬学的に許容される担体との併用で活性成分の約１パーセントから約３０パーセントに及ぶであろう。

投与計画は、治療反応を提供するように調整される。例えば、単回のボーラス投与を行ってもよく、用量をいくつかに分けて時間をかけて投与してもよく、状況の緊急性に応じて比例的に用量を増減させてもよい。投与の簡便性および用量の均一性にとって、用量単位形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。「用量単位形態」は、治療を受ける患者に対する単一の用量として適当な、物理的に別々の単位を指し；各単位には、望ましい治療反応をもたらすように計算された、予め決められた量の活性化合物が、必要な医薬担体とともに含まれる。

用量は、宿主の体重に対して、約０.０００１から１００ｍｇ/ｋｇ、より一般的には０．０１から５ｍｇ/ｋｇに及ぶ。例えば、用量は、０．３ｍｇ/ｋｇ体重、１ｍｇ/ｋｇ体重、３ｍｇ/ｋｇ体重、５ｍｇ/ｋｇ体重または１０ｍｇ/ｋｇ体重であってもよく、１－１０ｍｇ/ｋｇ、あるいは０．１から５ｍｇ/ｋｇの範囲内であってもよい。代表的な治療レジメンは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回、または３から６か月に１回の投与である。好ましい投与計画には、以下の投薬スケジュール：（ｉ）４週間ごとに６用量を投与し、次に３か月ごとに投与；（ｉｉ）３週間ごとに投与；（ｉｉｉ）３ｍｇ/ｋｇ体重で１回投与し、続いて１ｍｇ/ｋｇ体重で３週間ごとに投与のうちの一つを用いて、１ｍｇ/ｋｇ体重または３ｍｇ/ｋｇ体重で静脈内投与する方法が挙げられる。いくつかの方法において、用量は、約１－１０００μｇ/ｍＬの、いくつかの方法においては約２５－３００μｇ/ｍＬの血漿中抗体濃度を達成するように調整される。

本発明の化合物の「治療有効量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の減少、疾患の無症状期間の回数および持続期間の上昇、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。例えば、がんを有する患者の治療については、「治療有効量」は、治療を受けていない患者と比較して、好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらに好ましくは少なくとも約60%、さらに好ましくは少なくとも約80%、腫瘍増殖を阻害する。治療有効量の治療化合物は、腫瘍の大きさを減少させるか、そうでなければ、患者における症状を寛解させることがあり、患者は、一般にはヒトであるが、別の哺乳動物であってもよい。２つ以上の治療剤が併用療法で投与される場合、「治療有効量」は、個々の薬剤としてではなく、全体としての組み合わせの有効性をいう。

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムなどの放出制御または徐放性製剤であり得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用され得る。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson編，Marcel Dekker社，ニューヨーク，1978を参照されたい。

治療組成物は、（１）無針皮下注射器具；（２）マイクロ注入ポンプ；（３）経皮デバイス；（４）注入デバイス；および（５）浸透圧装置などの医療機器を用いて投与され得る。

ある実施形態において、医薬組成物は、インビボにおいて適切な分布を確保するように製剤化されることがある。例えば、本発明の治療化合物が血液脳関門を通過することを確実にするために、それらはリポソーム中で製剤化されることがあり、リポソームは、標的化部分をさらに含み、特定の細胞または臓器への選択的輸送を増強することがある。

産業上の利用可能性および用途
本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニスト化合物は、ＴＬＲ７の活性化により寛解し得る疾患または病態の治療のために使用され得る。

一つの実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストは、抗がん免疫療法剤－別名を免疫抗がん剤という－と組み合わせて使用される。抗がん免疫療法剤は、がん細胞を攻撃し、破壊する体の免疫系を刺激することにより、特にＴ細胞の活性化を介して効果を発揮する。免疫系には、それによる正当な標的細胞への攻撃、およびそれによる健康で正常な細胞への攻撃の抑止のバランスの維持を助ける、多数のチェックポイント（調節）分子がある。いくつかは刺激因子（上方調節因子）であり、それらの関与はＴ細胞活性化を促進し、免疫応答を増強するということを意味する。他は阻害因子（下方制御因子またはブレーキ）であり、それらの関与はＴ細胞活性化を阻害し、免疫応答を弱めるということを意味する。アゴニスト免疫療法剤の、刺激性チェックポイント分子への結合は、後者の活性化およびがん細胞に対する免疫応答の増強をもたらし得る。交換的に、アンタゴニスト免疫療法剤の、抑制性チェックポイント分子への結合は、後者による免疫系の下方制御を防ぎ、がん細胞に対する活発な応答の維持を助け得る。刺激性チェックポイント分子の例は、B7－1、B7－2、CD28、4－1BB （CD137）、4－1BBL、ICOS、CD40、ICOS－L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、ＤＲ３およびCD28Hである。抑制性チェックポイント分子の例は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、PD－L2、LAG－3、TIM－3、ガレクチン９、CEACAM－1、BTLA、CD69、ガレクチン－1、CD113、ＧＰＲ５６、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、ＬＡＩＲ１、TIM－1、CD96およびTIM－4である。

どちらの抗がん免疫療法剤の作用機序においても、その有効性は、ＴＬＲ７の活性化などの全身的な免疫系の上方制御により上昇し得る。それゆえ、一つの実施形態において、本明細書は、がんを患う患者に、抗がん免疫療法剤および本明細書に開示されるようなＴＬＲ７アゴニストの治療的に有効な組み合わせを投与することを特徴とする、がんの治療方法を提供する。投与のタイミングは、同時でも、連続的でも、交互であってもよい。投与方法は、全身的であっても、局所的であってもよい。ＴＬＲ７アゴニストは、対象を絞った方法で、複合体を用いて送達されることがある。

上記のような併用療法により治療され得るがんには、急性骨髄白血病、副腎皮質癌、カポジ肉腫、リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、奇形／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、胆管癌、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、眼癌、卵管癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、へアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝臓癌、下咽頭癌、膵臓癌、腎臓癌、喉頭癌、慢性骨髄性白血病、口唇および口腔癌（lip and oral cavity cancer）、肺癌、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、口腔癌（mouth cancer）、口腔癌（oral cancer）、骨肉腫、卵巣癌、陰茎癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、および外陰癌が挙げられる。

本明細書に開示されるような併用療法に使用され得る抗がん免疫療法剤には、AMG 557、AMP－224、アテゾリズマブ、アベルマブ、BMS 936559、セミプリマブ、CP－870893、ダセツズマブ、デュルバルマブ、エノブリツズマブ、ガリキシマブ、IMP321、イピリムマブ、ルカツムマブ、MEDI－570、MEDI－6383、MEDI－6469、ムロモナブ－CD3、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、スパルタリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、バルリルマブ、ボンレロリズマブが挙げられる。それらの代替名（商標名、旧名、研究コード、または同義語）およびそれぞれの標的チェックポイント分子を以下の表Ｂに示す。

ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法の一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。がんは、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫を含む）、皮膚癌（黒色腫およびメルケル皮膚癌を含む）、尿路上皮癌（膀胱癌を含む）、胃癌、肝細胞癌、または結腸直腸癌であり得る。

ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法のもう一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、好ましくはイピリムマブである。

ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法のもう一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、好ましくはニボルマブまたはペムブロリズマブである。

本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニストは、ワクチンアジュバントとしても有用である。

本発明の実施は、限定ではなく実例として提供される以下の実施例を参照することによりさらに理解され得る。

解析手順
ＮＭＲ
プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを得るために以下の条件を用いた：溶媒および内部標準としてＤＭＳＯ－ｄ６またはＣＤＣｌ_３のいずれかを用いて、４００Ｍｚまたは５００ＭｈｚのＢｒｕｋｅｒ装置のいずれかでＮＭＲスペクトルを得た。ＡＤＣ ＬａｂｓのＡＣＤ Ｓｐｅｃｔｒｕｓバージョン２０１５－０１またはＭｅｓｔＲｅＮｏｖａソフトウェアのいずれかを用いることにより、生のＮＭＲデータを解析した。

化学シフトは、内部のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）から、または重水素化ＮＭＲ溶媒により推測されるＴＭＳの位置を基準に、低磁場側が百万分率（ｐｐｍ）で報告される。明らかな多重度は：一重線－ｓ、二重線－ｄ、三重線－ｔ、四重線－ｑ、または多重線－ｍとして報告する。広幅化を示すピークをｂｒとしてさらに表す。積分値は近似値である。積分強度、ピーク形状、化学シフトおよび結合定数は、溶媒、濃度、温度、ｐＨ、および他の因子に依存し得るということに注意すべきである。さらに、ＮＭＲスペクトルにおいて水または溶媒ピークと重複するか、または交換が起こるピークは、信頼できる積分強度を提供しないことがある。場合によっては、ＮＭＲスペクトルは、水ピーク抑制を用いて得られることがあるが、重複するピークが目に見えなくなるか、またはその形状および／もしくは積分値が変化することがある。

液体クロマトグラフィー
以下の液体クロマトグラフィー法を用いた：

ＬＣ／ＭＳ方法Ａ．カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：６％Ｂで０分保持、２０分かけて６－４６％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃ フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。

ＬＣ／ＭＳ方法Ｂ．カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：１１％Ｂで０分保持、２５分かけて１１－５１％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃ フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。

ＬＣ／ＭＳ方法Ｃ．カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：２％Ｂで０分保持、２０分かけて２－４２％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃ フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。

ＬＣ／ＭＳ方法Ｄ．カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２０分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃ フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。

ＬＣ／ＭＳ方法Ｅ．カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：３％Ｂで０分保持、２０分かけて３－４３％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃ フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。

ＬＣ／ＭＳ方法Ｆ．カラム：Acquity BEH C18、2.1 mm x 50 mm、１.７μｍ粒子；移動相Ａ：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：０．０５％ ＴＦＡ含有アセトニトリル；グラジエント：１分かけて２％Ｂから９８％Ｂ、次いで９８％Ｂで０．５分保持；流速：０．８ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ

ＬＣ／ＭＳ方法Ｇ．カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、１.７μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０％Ｂから１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５０分保持；流速：１ｍＬ/分

ＬＣ／ＭＳ方法Ｈ．カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２０分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃ フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。

ＬＣ／ＭＳ方法Ｉ．カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで４分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃ フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。

ＬＣ／ＭＳ方法Ｊ．カラム：BEH C18 2.1 x 50mm；移動相Ａ：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：０．０５％ ＴＦＡ含有アセトニトリル；温度：５０℃；グラジエント：１．０分かけて２－９８％Ｂ、次いで９８％Ｂで０．５０分保持；流速：０．８ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）

ＬＣ／ＭＳ方法Ｋ．カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、１.７μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：０．１％ トリフルオロ酢酸含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：０．１％ トリフルオロ酢酸含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０％Ｂから１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５０分保持；流速：１ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）

ＬＣ／ＭＳ方法Ｌ．カラム：BEH C18 2.1 x 50mm；移動相Ａ：95:5 Ｈ_２Ｏ：０．０１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ含有ＡＣＮ；移動相Ｂ：5:95 Ｈ_２Ｏ：０．０１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ含有ＡＣＮ；温度：５０℃；グラジエント：１分かけて５－９５％Ｂ；流速：０．８ｍＬ/分

合成－一般的な手順
一般的に、本明細書に開示される手順は、ピラゾロピリミジン環系の１Ｈまたは２Ｈ位置でアルキル化された位置異性体の混合物をもたらす（それぞれＮ１およびＮ２位置異性体とも呼ばれ、アルキル化された窒素に言及している）。簡略化のために、Ｎ２位置異性体は示されないが、初期に生成される混合物中に存在し、例えばプレパラティブＨＰＬＣにより、後で分離されるということが理解されるべきである。

位置異性体の混合物を合成の初期段階に分離し、１Ｈ位置異性体を用いて残りの合成段階を実行してもよく、あるいは、必要に応じて、位置異性体の混合物を用いて合成を進め、後期に分離を実行してもよい。

本開示の化合物は、有機合成化学の当業者に周知の多数の方法により調製され得る。これらの方法は、以下に記載される方法、またはそのバリエーションを含む。好ましい方法には、下記のスキームに記載される方法が挙げられるが、これらに限らない。スキームは、一般的であるように意図されているが、場合によっては、特徴が便宜上、具体的に示されることがある（例えば、メチルエステルまたは特定の位置異性体）。
スキーム１

Ｒ^ａは、スキーム１およびそれが登場する他の事例において、例えば、

、または他の適当な部分であり得る。Ｒ^ｂは、スキーム１およびそれが登場する他の事例において、例えば、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルである。Ｒ^ｃＮＨＲ^ｄは、スキーム１およびそれが登場する他の事例において、第一級または第二級アミンである。Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、および／またはＲ^ｄは、合成過程の間の適切な時点で取り除かれる保護基により覆われた官能基を有してもよい。

化合物１０は、上記のスキーム１に図示される合成順序により調製され得る。ニトロピラゾール１の還元により化合物２が得られ、次いで１，３－ビス（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレアとの環化によりヒドロキシピラゾロピリミジン３が得られる。ＢＯＰ/ＤＢＵカップリング条件を用いてアミンＲ^ａＮＨ_２が導入され、次いで、ＮＢＳを用いる臭素化（ステップ４）によりブロモピラゾロピリミジン５が得られる。ベンジルハライド６を用いるアルキル化によりＮ１およびＮ２生成物の混合物が得られ、分離することでＮ１中間体７が得られる。接触水素化（ステップ６）の後、ワンポットでメチルカルバメート脱保護および鹸化を行うことで、中間体酸９が得られる。ＨＡＴＵ（またはＥＤＣ）条件を用いて、酸９をアミンとカップリングすることで標的化合物１０が得られる。（ステップ５における臭素化中間体５のアルキル化の方が、非臭素化中間体４のアルキル化と比較して、より好ましい比率でＮ１/Ｎ２生成物が得られる）。
スキーム２

あるいは、中間体９は、上記のスキーム２に記載される経路を用いて得られることがある。ＮＢＳを用いて中間体３を臭素化し、次いでアルキル化することで中間体エステル１２が得られる。次にＢＯＰカップリング条件を用いてアミノ化することで中間体７が得られる。接触水素化の後、鹸化およびメチルカルバメート脱保護を行うことで中間体９が得られる。
スキーム３

中間体８への代替経路は、ベンジルハライド６を用いるニトロピラゾール１のアルキル化から始まり、ベンジルピラゾール１３が得られる。ニトロ基の還元の後、１，３－ビス（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレアとの環化によりヒドロキシピラゾロピリミジン１５が得られ、ＢＯＰ/ＤＢＵ条件を用いて適切なアミン誘導体８に変換される。これが上記のスキーム３に図示される。
スキーム４

標的化合物への別の代替経路は、上記のスキーム４に示される。中間体１５のエステル基を加水分解し、水酸化ナトリウムを用いてメチルカルバメートを取り除くと酸１６が得られる。ＨＡＴＵ（またはＥＤＣ）を用いてアミドカップリングを行うとアミド１７が得られ、続いてＢＯＰ/ＤＢＵ条件を用いてアミノ化すると標的分子１０が得られる。

合成－具体例
上記の内容をさらに説明するために、以下の限定されない代表的な合成スキームが含まれる。請求項の範囲内にあるこれらの実施例のバリエーションは、当業者の範囲内であり、本開示の範囲内にあると見なされる。読者は、本開示を提供された、関連技術に熟練した当業者であれば、網羅的な実施例がなくとも、本明細書に開示される化合物を調製し、使用することができるであろうということを認識するであろう。

１００以上の番号がつけられた化合物についての解析データは、表Ａで見つかる。
実施例１－化合物１１１

ステップ１．ＮＢＳ（6.94 g、39.0 mmol）のＤＭＦ（20 mL）溶液を、メチル (7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（10 g、37.8 mmol）のＤＭＦ（80 mL）攪拌懸濁液に添加した。反応混合物をＲＴで９０分間攪拌し、水（400 mL）に注ぎ、５分間攪拌した。生成物を濾過により回収し、水（200 mL）で洗浄し、終夜風乾し、メチル (3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（7.5 g、21.85 mmol、収率57.8％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３４３．０，３４５．０
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 12.87（br s，1H），9.80（s，1H），7.56（br s，1H），3.62（s，3H），3.54（q，J=6.6 Hz，2H），1.62（quin，J=7.2 Hz，2H），1.40（dq，J=14.8，7.4 Hz，2H），0.94（t，J=7.4 Hz，3H）

ステップ２．メチル 4-(ブロモメチル）-3-メトキシベンゾエート（1.861 g、7.18 mmoL）のＤＭＦ（5 mL）溶液を複数回に分けて、５分かけて、メチル （3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（2.9 g、8.45 mmoL）およびＣｓ_２ＣＯ_３（3.30 g、10.14 mmol）のＤＭＦ（35 mL）溶液に０℃で添加した。反応混合物をＲＴに温め、終夜攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（300 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 70 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から５０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 4-((3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（1.400 g、2.69 mmol、収率31.8％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝５２１．２，５２３．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.88（s，1H），7.54－7.48（m，2H），7.32（t，J=5.6 Hz，1H），6.79（d，J=7.7 Hz，1H），5.78（s，2H），3.86（s，3H），3.85（s，3H），3.63（s，3H），3.52（q，J=6.6 Hz，2H），1.56（quin，J=7.3 Hz，2H），1.28－1.15（m，2H），0.84（t，J=7.4 Hz，3H）

ステップ３．メチル 4-((3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（1.400 g、2.69 mmol）をＥｔＯＨ（80 mL）中に懸濁した。１０％ Ｐｄ/Ｃ（200 mg）を添加した。反応槽を真空にし、Ｈ_２で６回パージした。反応混合物を１時間、Ｈ_２雰囲気下で攪拌した。反応槽を真空にし、Ｎ_２でパージし、ＣＥＬＩＴＥ（商標）濾材に通して濾過し、ＥｔＯＨ（100 mL）で洗浄した。濾液を蒸発乾固させ、残留物をジオキサン（10 mL）中に溶解した。ＮａＯＨ（3.22 mL、16.11 mmol）を添加し、反応混合物を８０℃で２時間攪拌し、ＲＴに冷ました。反応混合物を水（10 mL）で希釈し、５Ｎ ＨＣｌで酸性化し、ジオキサンを蒸発によって除去した。残留物を水（20 mL）でさらに希釈し、生成物を濾過により回収し、水、続いてアセトニトリルで洗浄し、4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（900 mg、2.430 mmol、収率90％）を白色固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３７１．２

ステップ４．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（30 mg、0.081 mmol）、ＨＡＴＵ（37.0 mg、0.097 mmol）、ＤＭＦ（2 mL）およびN,N-ジメチルエタン-1,2-ジアミン（7.14 mg、0.081 mmol）を入れた。ＤＩＰＥＡ（0.035 mL、0.202 mmol）を添加した。反応混合物を６５℃で終夜攪拌した。以下の条件下で、粗生成物をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：６％Ｂで０分保持、２０分かけて６－４６％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１１１（3.3 mg、0.0075 mmol、9.3％）を得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１０２、化合物１０３、化合物１０４、化合物１０５、化合物１０６、化合物１０７、化合物１０８、化合物１０９、化合物１１０、化合物１１２、化合物１１３、化合物１１４、化合物１１５、および化合物１１６。
実施例２－化合物１２４

ステップ１．(3-メチレンシクロブチル）メタンアミン ヒドロクロライド（4.5 g、33.7 mmol）をＤＣＭ（30 mL）中に懸濁した。ＤＩＰＥＡ（17.65 mL、101 mmol）、続いてＢｏｃ無水物（8.60 mL、37.0 mmol）を添加した。反応混合物を２時間、ＲＴで攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（100 mL）に注ぎ、ＤＣＭ（3 x 70 mL）で抽出した。合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（50 mL）およびブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１０％ ＥｔＯＡｃ）により、tert-ブチル（(3-メチレンシクロブチル）メチル）カルバメート（4.73 g、23.98 mmol、収率71.2％）を油として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ 4.77（quin，J=2.3 Hz，2H），3.20（br d，J=6.6 Hz，2H），2.81－2.72（m，2H），2.48－2.32（m，3H），1.45（s，9H）

ステップ２．tert-ブチル（(3-メチレンシクロブチル）メチル）カルバメート（2.1 g、10.64 mmol）のＤＣＥ（20 mL）溶液を氷浴で冷却した。クロロヨードメタン（2.318 mL、31.9 mmol）、続いてジエチル亜鉛（15.97 mL、15.97 mmol）を複数回に分けて、１０分かけて添加した。添加が終了した後、ゆっくりとＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、３時間攪拌した。水（5 mL）を注意深く添加し、反応物をクエンチした。反応混合物を１Ｎ ＨＣｌ（10 mL）で酸性化し、ＥｔＯＡｃ（3 x 40 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（10 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１８％ ＥｔＯＡｃ）により、tert-ブチル（スピロ[2.3]ヘキサン-5－イルメチル）カルバメート（812 mg、3.84 mmol、収率36.1％）を油として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３－ｄ）δ 4.53（br s，1H），3.25（br d，J=5.9 Hz，2H），2.53（dt，J=14.6，7.1 Hz，1H），2.18－2.11（m，2H），1.81（dd，J=12.4，6.1 Hz，2H），1.45（s，9H），0.39（s，4H）

ステップ３．tert-ブチル（スピロ[2.3]ヘキサン-5－イルメチル）カルバメート（800 mg、3.79 mmol）をジオキサン（3 mL）中に溶解し、ジオキサン中、ＨＣｌ（2.84 mL、11.36 mmol）を添加した。反応混合物を終夜、ＲＴで攪拌し、蒸発乾固させて、3-(2-クロロエチル）シクロブチル）メタンアミン ヒドロクロライド（680 mg、3.7 mmol、収率97％）を固体として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.97（br s，4H），3.54－3.39（m，1H），3.03－2.91（m，1H），2.91－2.79（m，2H），2.54－2.45（m，3H），2.45－2.26（m，3H），2.23－2.15（m，1H），1.91－1.79（m，3H），0.98（t，J=7.2 Hz，2H），0.92（t，J=7.3 Hz，2H）

ステップ４．Ｃｓ_２ＣＯ_３（11.42 g、35.1 mmol）を、メチル 4-ニトロ-1H-ピラゾール-5-カルボキシレート（5 g、29.2 mmol）のＤＭＦ（30 mL）攪拌溶液に添加した。氷浴で冷却した後、メチル 4-(ブロモメチル）-3-メトキシベンゾエート（7.57 g、29.2 mmol）のＤＭＦ（20 mL）溶液を複数回に分けて、５分かけて添加した。ゆっくりとＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、終夜攪拌し、水（150 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 70 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から５０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 1-(2-メトキシ-4-(メトキシカルボニル）ベンジル）-4-ニトロ-1H-ピラゾール-5-カルボキシレート（1.012 g、2.90 mmol、収率9.92％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３５０.１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.40（s，1H），7.57（d，J=7.6 Hz，1H），7.50（s，1H），7.27（d，J=7.9 Hz，1H），5.53（s，2H），3.96（s，3H），3.86（s，3H），3.82（s，3H）

ステップ５．メチル 1-(2-メトキシ-4-(メトキシカルボニル）ベンジル）-4-ニトロ-1H-ピラゾール-5-カルボキシレート（2 g、5.73 mmol）をＥｔＯＨ（100 mL）中に懸濁した。１０％ Ｐｄ/Ｃ（100 mg）を添加した。反応槽を真空にし、水素で６回パージした。反応混合物を終夜、水素雰囲気下で攪拌し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）濾材に通して濾過し、ＥｔＯＨ（100 mL）で洗浄した。濾液を蒸発乾固させて、メチル 4-アミノ-1-(2-メトキシ-4-(メトキシカルボニル）ベンジル）-1H-ピラゾール-5-カルボキシレート（1.764 g、5.52 mmol、収率96％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３２０.１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.50（s，1H），7.46（d，J=7.7 Hz，1H），7.18（s，1H），6.42（d，J=7.9 Hz，1H），5.55（s，2H），5.14（s，2H），3.91（s，3H），3.84（s，3H），3.70（s，3H）

ステップ６．メチル 4-アミノ-1-(2-メトキシ-4-(メトキシカルボニル）ベンジル）-1H-ピラゾール-5-カルボキシレート（1.75 g、5.48 mmol）をＭｅＯＨ（60 mL）中に懸濁した。1,3-ビス(メトキシカルボニル）-2-メチル-2-チオシュードウレア（1.243 g、6.03 mmol）、続いてＡｃＯＨ（1.882 mL、32.9 mmol）を添加した。反応混合物を１時間、ＲＴで攪拌した。ＴＦＡ（2 mL、26 mmol）を添加し、反応混合物を終夜攪拌した。ナトリウムメトキシド（23.69 g、110 mmol）を添加し、反応混合物を４時間、ＲＴで攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液をＡｃＯＨで酸性化した。ＭｅＯＨを蒸発させ、得られた沈殿物を濾過により回収し、ジオキサン（10 mL）中に懸濁した。水酸化ナトリウム（1.896 mL、9.48 mmol）を添加し、反応混合物を８０℃で４時間攪拌した。冷却後、反応混合物をＨＣｌで中和し、有機相を蒸発乾固させた。生成物を回収し、水で洗浄し、4-((5-アミノ-7-ヒドロキシ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（250 mg、0.793 mmol、収率13％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３１６.１

ステップ７．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、4-((5-アミノ-7-ヒドロキシ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（250 mg、0.793 mmol）、ＨＡＴＵ（332 mg、0.872 mmol）、ＤＩＰＥＡ（0.277 mL、1.586 mmol）およびＤＭＦ（5 mL）を入れた。反応混合物を終夜、５０℃で攪拌し、冷却し、濾過し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ_１８カラム、０.０５％ ギ酸含有水中、０から３０％ アセトニトリル）を用いて精製し、4-((5-アミノ-7-ヒドロキシ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ-N-(1-メチルピペリジン-4－イル）ベンズアミド（230 mg、0.559 mmol、収率70.5％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４１２．３
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.26－8.19（m，1H），7.56（s，1H），7.40（d，J=1.3 Hz，1H），7.31－7.27（m，1H），6.52（d，J=7.9 Hz，1H），6.08（s，2H），5.62（s，2H），3.87（s，3H），3.84－3.75（m，1H），2.99（br d，J=11.7 Hz，2H），2.36（s，4H），1.82（br d，J=10.3 Hz，2H），1.75－1.54（m，2H）

ステップ８．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、4-((5-アミノ-7-ヒドロキシ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ-N-(1-メチルピペリジン-4－イル）ベンズアミド（200 mg、0.486 mmol）、(3-(2-クロロエチル）シクロブチル）メタンアミン ヒドロクロライド（224 mg、1.215 mmol）、ＢＯＰ（322 mg、0.729 mmol）、ＤＢＵ（0.220 mL、1.458 mmol）およびＤＭＳＯ（5 mL）を入れた。反応混合物をＲＴで２時間攪拌し、水（2 mL）で希釈し、濾過し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ_１８カラム、１０ｍＭ ＴＥＡＡ含有水中、０から７５％ ＭｅＣＮ）を用いて精製し、4-((5-アミノ-7-(((3-(2-クロロエチル）シクロブチル）メチル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ-N-(1-メチルピペリジン-4－イル）ベンズアミド（227 mg、0.420 mmol、収率86％）を褐色固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５４１.４

ステップ９．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、4-((5-アミノ-7-(((3-(2-クロロエチル）シクロブチル）メチル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ-N-(1-メチルピペリジン-4－イル）ベンズアミド（150 mg、0.277 mmol）、酢酸ナトリウム（227 mg、2.77 mmol）およびＤＭＦ（3 mL）を入れた。反応混合物を１００℃で４日間攪拌し、冷却し、水（3 mL）で希釈した。逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ_１８カラム、０．０５％ ＴＦＡ含有水中、０から６５％ アセトニトリル）を用いて精製し、中間生成物を得た。中間生成物をＥｔＯＨ（5 mL）中に溶解し、１０％ Ｐｄ/Ｃ（10 mg）を添加した。反応槽を真空にし、水素で６回パージした。次に、その内容物を２時間、水素雰囲気下で攪拌した。反応混合物を濾過し、蒸発乾固させた。以下の条件で、粗生成物をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：１１％Ｂで０分保持、２５分かけて１１－５１％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１２４（42.6 mg、0.084 mmol、収率３０％）を得た。
実施例３－化合物１２１

ステップ１．マイクロウェーブバイアルに、メチル 3-ヒドロキシ-4-メチルベンゾエート（2 g、12.04 mmol）、ブロモシクロプロパン（1.747 g、14.44 mmol）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（4.71 g、14.44 mmol）およびＤＭＦ（15 mL）を入れた。反応混合物を電子レンジ内で、１６０℃で３時間加熱した。冷却後、反応混合物を水（150 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 50 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から５％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 3-シクロプロポキシ-4-メチルベンゾエート（980 mg、1.901 mmol、収率15.79％、純度40％）を油として得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２０７．１

ステップ２．メチル 3-シクロプロポキシ-4-メチルベンゾエート（1 g、1.939 mmol、純度40％）をＣＣｌ_４（5 mL）中に溶解した。ＮＢＳ（0.759 g、4.27 mmol）およびベンゾイルペルオキシド（0.103 g、0.427 mmol）を添加した。反応混合物を終夜、７０℃で攪拌した。冷却後、反応混合物を蒸発乾固させた。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 4-(ブロモメチル）-3-シクロプロポキシベンゾエート（550 mg、1.54 mmol、純度80％、収率80％）を固体として得た。生成物をそれ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２８５．０，２８７．０

ステップ３．メチル（3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（650 mg、1.894 mmol；US 2020/0038403 A1）のＤＭＦ（5 mL）攪拌溶液に、０℃で、Ｃｓ_２ＣＯ_３（1296 mg、3.98 mmol）、続いてメチル 4-(ブロモメチル）-3-シクロプロポキシベンゾエート（540 mg、1.515 mmol、純度80％）のＤＭＦ（2 mL）溶液を添加した。ＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、終夜攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（100 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 50 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から７０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 4-((3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-シクロプロポキシベンゾエート（153 mg、0.279 mmol、収率14.76％）を油として得て、これを静置すると凝固した。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５４７．２，５４９．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.86（s，1H），7.80（d，J=1.5 Hz，1H），7.53（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），7.32（t，J=5.5 Hz，1H），6.91（d，J=7.9 Hz，1H），5.72（s，2H），4.03－3.93（m，1H），3.85（s，3H），3.71－3.60（m，3H），3.56－3.45（m，2H），1.56（quin，J=7.3 Hz，2H），1.22（dq，J=14.8，7.4 Hz，2H），0.85（t，J=7.4 Hz，3H），0.81－0.73（m，2H），0.52－0.41（m，2H）

ステップ４．メチル 4-((3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-シクロプロポキシベンゾエート（150 mg、0.274 mmol）をＥｔＯＨ（5 mL）中に溶解した。１０％ Ｐｄ/Ｃ（15 mg）を添加した。反応槽を真空にし、水素で６回パージした。反応混合物を水素雰囲気下で１時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を蒸発乾固させた。残留物をジオキサン（3 mL）中に溶解し、水酸化ナトリウム（822 μl、4.11 mmol）を添加した。反応混合物を８０℃で２時間攪拌し、冷却し、５Ｎ ＨＣｌで酸性化し、水（5 mL）で希釈した。有機溶媒を蒸発させ、水溶性の残留物を、逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ_１８カラム、０．０５％ ＴＦＡ含有水中、０から７０％ ＭｅＣＮ）を用いて精製し、4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-シクロプロポキシ安息香酸（35 mg、0.088 mmol、収率３２％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３９７．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.21（br t，J=5.6 Hz，1H），7.81（br s，2H），7.73（s，1H），7.69（s，1H），7.42（dd，J=7.9，1.3 Hz，1H），6.81（d，J=7.9 Hz，1H），5.66（s，2H），3.87（tt，J=5.9，2.9 Hz，1H），3.48（q，J=6.7 Hz，2H），1.48（quin，J=7.3 Hz，2H），1.14（sxt，J=7.4 Hz，2H），0.78（t，J=7.4 Hz，3H），0.75－0.68（m，2H），0.48－0.38（m，2H）

ステップ５．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-シクロプロポキシ安息香酸（35 mg、0.088 mmol）、ＨＡＴＵ（40.3 mg、0.106 mmol）、1-メチルピペリジン-4-アミン（20.16 mg、0.177 mmol）およびＤＭＦ（2 mL）を入れた。ＤＩＰＥＡ（0.046 mL、0.265 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌した。反応混合物を濾過し、以下の条件で、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：２％Ｂで０分保持、２０分かけて２－４２％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１２１（31.2 mg、0.063 mmol、収率７２％）を得た。

化合物１２２を類似的に調製した。
実施例４－化合物１２０

ステップ１．ＫＯＨ（5N、24.07 mL、120 mmol）の水溶液を、メチル 3-ヒドロキシ-4-メチルベンゾエート（4 g、24.07 mmol）のアセトニトリル（150 mL）冷却（氷浴）溶液に添加した。０℃で５分間攪拌した後、ジエチル（ブロモジフルオロメチル）ホスホネート（12.85 g、48.1 mmol）を添加した。ゆっくりとＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、１６時間攪拌した。ＫＯＨ溶液（5N、16 mL、80 mmol）をさらに添加した。反応混合物をＲＴでさらに３０分間攪拌し、水（200 mL）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（3 x 50 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（2 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 3-(ジフルオロメトキシ)-4-メチルベンゾエート（2.552 g、11.80 mmol、収率49.0％）を油として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２１７．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.76（dd，J=7.8，1.7 Hz，1H），7.68（br．s，1H），7.51－7.10（m，2H），3.87（s，3H），2.31（s，3H）

ステップ２．ＮＢＳ（1.811 g、10.18 mmol）およびベンゾイルペルオキシド（0.448 g、1.850 mmol）を、メチル 3-(ジフルオロメトキシ)-4-メチルベンゾエート（2 g、9.25 mmol）の四塩化炭素（20 mL）攪拌溶液に添加した。反応物を７５℃で４時間、次にＲＴで終夜攪拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１５％ ＥｔＯＡｃ）を用いて精製し、メチル 4-(ブロモメチル）-3-(ジフルオロメトキシ)ベンゾエート（1.561 g、5.29 mmol、収率57.2％）を油として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２９５．０，２９７．０
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ 7.88（dd，J=8.1，1.5 Hz，1H），7.80（s，1H），7.52（d，J=8.1 Hz，1H），6.64（t，J=73.0 Hz，1H），4.57－4.51（m，2H），3.98－3.90（m，3H）

ステップ３．Ｃｓ_２ＣＯ_３（1329 mg、4.08 mmol）を、メチル（3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（700 mg、2.040 mmol）のＤＭＦ（5 mL）攪拌溶液に添加した。氷浴で冷却した後、メチル 4-(ブロモメチル）-3-(ジフルオロメトキシ)ベンゾエート（572 mg、1.938 mmol）のＤＭＦ（2 mL）溶液を添加した。ＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、３時間攪拌した。水（20 mL）を添加し、反応混合物をＥｔＯＡｃ（3 x 5 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 10 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ＤＣＭ充填、ヘキサン中、０から６０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 4-((3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-(ジフルオロメトキシ)ベンゾエート（275 mg、0.493 mmol、収率24.19％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５５７．１，５５９．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.89（s，1H），7.82－7.69（m，2H），7.61－7.14（m，2H），6.87（d，J=7.9 Hz，1H），5.88（s，2H），3.87（s，3H），3.64（s，3H），3.54－3.45（m，2H），1.58－1.46（m，2H），1.19（dq，J=15.0，7.4 Hz，2H），0.83（t，J=7.3 Hz，3H）

ステップ４．メチル 4-((3-ブロモ-7-(ブチルアミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-(ジフルオロメトキシ)ベンゾエート（275 mg、0.493 mmol）をＥｔＯＨ（15 mL）中に溶解した。１０％ Ｐｄ/Ｃ（27 mg）を添加した。反応槽を真空にし、水素で６回パージし、次に水素雰囲気下で２時間攪拌した。反応混合物を濾過し、蒸発乾固させた。残留物をジオキサン（2 mL）中に溶解した。水酸化ナトリウム（0.564 mL、2.82 mmol）を添加し、反応混合物を８０℃で２時間攪拌し、次に冷ました。反応混合物を５Ｎ ＨＣｌで中和し、蒸発乾固させた。残留物をＭｅＯＨ/水（1:1、8 mL）中に溶解した。メタノールを蒸発により除去した。残留水性懸濁液を濾過し、水で洗浄し、4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-(ジフルオロメトキシ)安息香酸（54 mg、0.133 mmol、収率２７％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４０７．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.50（br s，1H），7.84（s，2H），7.79－7.68（m，2H），7.63－7.05（t，J=73.2 Hz 1H），6.97（d，J=7.9 Hz，1H），5.94（s，2H），3.54（q，J=6.4 Hz，2H），1.54（quin，J=7.2 Hz，2H），1.19（dq，J=14.9，7.3 Hz，2H），0.84（t，J=7.3 Hz，3H）

ステップ５．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-(ジフルオロメトキシ)安息香酸（30 mg、0.074 mmol）、ＨＡＴＵ（33.7 mg、0.089 mmol）、2-(ピペラジン-1－イル）エタン-1－オール（9.61 mg、0.074 mmol）およびＤＭＦ（2 mL）を入れた。ＤＩＰＥＡ（0.039 mL、0.221 mmol）を添加した。反応物をＲＴで１時間攪拌し、濾過し、以下の条件で、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２０分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１２０，２ＴＦＡ塩（28.1 mg、0.037 mmol、収率５１％）を得た。
実施例５－化合物１１７

ステップ１．メチル （7-(ブチルアミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（4.98 g、18.84 mmol；US 2020/0038403 A1）のＤＭＦ（60 mL）攪拌溶液を氷浴で冷却した。ＮＩＳ（5.09 g、22.61 mmol）を複数回に分けて添加した。反応混合物をＲＴで２時間攪拌し、水（400 mL）に注いだ。生成物を濾過により回収し、メチル （7-(ブチルアミノ)-3-ヨード-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（6.46 g、15.73 mmol、収率８３％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３９１．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 12.96（s，1H），9.74（s，1H），7.52（s，1H），3.62（s，3H），3.53（q，J = 6.5 Hz，2H），1.68－1.55（m，2H），1.40（m，2H），0.94（t，J = 7.4 Hz，3H）

ステップ２．Ｃｓ_２ＣＯ_３（4.18 g、12.81 mmol）を、メチル （7-(ブチルアミノ)-3-ヨード-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（2.5 g、6.41 mmol）のＤＭＦ（50 mL）攪拌溶液に添加した。５分間超音波処理した後、メチル 4-(ブロモメチル）-3-メトキシベンゾエート（1.743 g、6.73 mmol）のＤＭＦ（10 mL）溶液を添加した。反応混合物をＲＴで２時間攪拌し、１０％ クエン酸溶液（100 mL）に注ぎ、ＤＣＭ（3 x 100 mL）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１００％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 4-((7-(ブチルアミノ)-3-ヨード-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（2.26 g、2.98 mmol、収率４６％、純度７５％）を固体として得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝５６９．２

ステップ３．２０ｍＬマイクロウェーブバイアルに、メチル 4-((7-(ブチルアミノ)-3-ヨード-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（1.34 g、1.771 mmol、純度75％）、[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)（Ｐｄ(ｄｐｐｆ)Ｃｌ_２、91 mg、0.124 mmol）、トリメチルボロキシン（ＴＭＢ、1001 mg、7.97 mmol）、Ｋ_２ＣＯ_３（734 mg、5.31 mmol）およびジオキサン（7 mL）を入れた。反応混合物を電子レンジ内で、１２０℃で１時間加熱し、ＤＣＭおよび１０％ クエン酸で希釈した。分液操作を行った。有機相を１０％ クエン酸およびブラインで連続的に洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、減圧濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーにより、メチル 4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-3-メチル-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（422 mg、1.06 mmol、収率59.8％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３９９．２

ステップ４．ＮａＯＨ（1.190 mL、5.95 mmol）を、メチル 4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-3-メチル-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（237 mg、0.595 mmol）のジオキサン（5 mL）懸濁液に添加した。反応混合物を８０℃で１時間攪拌し、冷却し、５Ｎ 塩酸で中和し、蒸発乾固させた。残留物をＤＭＳＯ（2 mL）および水（20 mL）中に懸濁し、濾過し、水で洗浄して、4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-3-メチル-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（184 mg、0.479 mmol、収率80％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ－Ｈ］^＋＝３８３．２

ステップ５．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、4-((5-アミノ-7-(ブチルアミノ)-3-メチル-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（35 mg、0.091 mmol）、ＨＢＴＵ（41.4 mg、0.109 mmol）、1-メチルピペリジン-4-アミン（20.79 mg、0.182 mmol）およびＤＭＦ（2 mL）を入れた。ＤＩＰＥＡ（0.048 mL、0.273 mmol）を添加した。反応物をＲＴで終夜攪拌した。反応混合物を濾過し、以下の条件で、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：３％Ｂで０分保持、２０分かけて３－４３％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１１７（37.6 mg、0.78 mmol、85％）を得た。

化合物１１８および化合物１１９を類似的に調製した。
実施例６－化合物１２６，ＴＦＡ塩

ステップ１：ＮａＯＨ（651 mg、16.26 mmol）を、メチル 3-メトキシ-4-((5-((メトキシカルボニル）アミノ)-7－オキソ-6,7-ジヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）ベンゾエート（630 mg、1.626 mmol；US 2020/0038403 A1）のジオキサン（16 mL）および水（3.3 mL）懸濁液に添加した。反応混合物を８０℃で２時間加熱し、冷却した。ジオキサンを蒸発させた。反応混合物を水で希釈し、濃ＨＣｌでｐＨ４に酸性化した。沈殿物を濾過し、水で洗浄し、乾燥させた。この物質をトルエンと共沸させ、さらに乾燥させて、4-((5-アミノ-7－オキソ-6,7-ジヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（500 mg、1.586 mmol、収率９８％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｆ）：ＲＴ＝０．５０分 Ｍ/Ｚ＝３１６．０

ステップ２：ヒューニッヒ塩基（0.277 mL、1.586 mmol）およびＨＡＴＵ（332 mg、0.872 mmol）を、1-メチルピペリジン-4-アミン（136 mg、1.189 mmol）および4-((5-アミノ-7－オキソ-6,7-ジヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（250 mg、0.793 mmol）のＤＭＦ（5 mL）懸濁液に添加した。反応混合物を５０℃に加熱した。４．５時間後、1-メチルピペリジン-4-アミン（136 mg、1.189 mmol）および１６０ｍｇ ＨＡＴＵを添加し、反応混合物を終夜加熱した。２００ｍｇ ピペリジン、ＨＡＴＵ（332 mg、0.872 mmol）、およびヒューニッヒ塩基（0.277 mL、1.586 mmol）を添加し、加熱を５時間続けた。1-メチルピペリジン-4-アミン（136 mg、1.189 mmol）およびＨＡＴＵ（332 mg、0.872 mmol）を添加し、加熱を終夜続けた。1-メチルピペリジン-4-アミン（136 mg、1.189 mmol）および１６５ｍｇ ＨＡＴＵを添加した。５時間後、反応混合物を冷却し、水で希釈した。固体を濾過により回収し、水で洗浄し、乾燥させて、4-((5-アミノ-7－オキソ-6,7-ジヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ-N-(1-メチルピペリジン-4－イル）ベンズアミド（126 mg、0.306 mmol、収率38.6％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.16（d，J=7.6 Hz，1H），7.57（s，1H），7.41（d，J=1.3 Hz，1H），7.32－7.26（m，1H），6.52（d，J=8.0 Hz，1H），6.05（br d，J=1.8 Hz，2H），5.63（s，2H），3.88（s，3H），3.74－3.63（m，1H），2.80－2.71（m，2H），2.15（s，3H），1.97－1.86（m，2H），1.79－1.68（m，2H），1.62－1.49（m，2H）
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ＲＴ＝０．５２分 Ｍ/Ｚ＝４１２．４

ステップ３．ＤＢＵ（0.022 mL、0.146 mmol）およびＢＯＰ（48.4 mg、0.109 mmol）を、（S)-2-アミノペンタン-1－オール（37.6 mg、0.365 mmol）および4-((5-アミノ-7－オキソ-6,7-ジヒドロ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ-N-(1-メチルピペリジン-4－イル）ベンズアミド（30 mg、0.073 mmol）のＤＭＦ（0.5 mL）懸濁液に添加した。全ての懸濁物質は数分で溶解した。１．７５時間後、反応混合物を冷却し、ＭｅＯＨで希釈し、シリンジフィルターに通して濾過した。以下の条件で、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２５分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１２６をそのＴＦＡ塩として得た（16 mg、0.025 mmol、収率34.2％）。
実施例７－化合物１２３

ステップ１．ＤＢＵ（0.856 mL、5.68 mmol）を、メチル 4-((7-ヒドロキシ-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（550 mg、1.420 mmol；実施例２のステップ６のＮａＯＨ処理前を参照）および（S)-3-アミノヘキサン-1－オール ヒドロクロライド ２（327 mg、2.130 mmol）のＤＭＳＯ（5 mL）懸濁液に添加した。反応混合物をＲＴで１０分間攪拌すると、透明な溶液となった。ＢＯＰ（1256 mg、2.84 mmol）を添加した。反応混合物を７０℃で２時間攪拌した。５Ｍ ＮａＯＨ（5 mL、25.00 mmol）を添加し、反応混合物を７０℃で０．５時間攪拌した。冷却後、これをシリンジフィルターディスクに通して濾過した。濾液を、プレパラティブ逆相Ｃ１８カラム（150g）で、アセトニトリル：水（０．０５％ ＴＦＡ調整剤を含む）、０－５０％グラジエントで溶出させて精製した。目的のフラクションを凍結および凍結乾燥させて、（S)-4-((5-アミノ-7-((1-ヒドロキシヘキサン-3－イル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（860.8 mg、1.246 mmol、収率８８％）を得た。
ＬＣＭＳ ＥＳＩ：計算値 Ｃ_２０Ｈ_２７Ｎ_６Ｏ_４＝４１５．２（Ｍ＋Ｈ^＋）、実測値 ４１５．２（Ｍ＋Ｈ^＋）

ステップ２．ＤＭＦ（1 mL）中、（S)-4-((5-アミノ-7-((1-ヒドロキシヘキサン-3－イル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（30 mg、0.072 mmol）、2-(ピペラジン-1－イル）エタン-1－オール（18.85 mg、0.145 mmol）の混合物を、ヒューニッヒ塩基（0.063 mL、0.362 mmol）、続いてＢＯＰ（48.0 mg、0.109 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで３時間攪拌し、シリンジフリットディスクに通して濾過した。濾液をＬＣ／ＭＳ方法Ｈで精製した。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１２３（12.1 mg、0.022 mmol、収率30.1％）を得た。

化合物１２５を類似的に調製した。
実施例８－化合物１０１

ステップ１．メチル （S)-4-((7-((1-((tert-ブチルジフェニルシリル）オキシ)ヘキサン-3－イル）アミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（30 mg、0.041 mmol；US 2020/0038403 A1）のジオキサン（1 mL）溶液を、ＮａＯＨ（0.207 mL、0.207 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。６Ｍ ＨＣｌ水溶液をゆっくりと添加することで、反応混合物をｐＨ７に中和した。溶媒をＶ－１０装置内で蒸発させ、残留物をＤＭＦ（2 mL）中に溶解し、濾過した。濾液を、逆相ISCO（50g カラム）で、０－５０％ アセトニトリル/水 ９０．０５％）ギ酸で溶出させて精製した。生成物を含むフラクションを凍結乾燥し、目的物を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ ＥＳＩ：計算値 Ｃ_３６Ｈ_４４Ｎ_６Ｏ_４Ｓｉ＝６５３．８（Ｍ＋Ｈ^＋）、実測値 ６５３．４（Ｍ＋Ｈ^＋）

ステップ２．（S)-4-((5-アミノ-7-((1-((tert-ブチルジフェニルシリル）オキシ)ヘキサン-3－イル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（26 mg、0.040 mmol）のＤＭＦ（1 mL）溶液を、ＨＡＴＵ（22.71 mg、0.060 mmol）で処理し、１０分間攪拌し、次にピペリジン-4－イルメタンアミン（4.55 mg、0.040 mmol）を添加した。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ＝７４９．６）は、３０分後に反応の完了を示した。溶液をトリエチルアミントリヒドロフルオライド（0.065 mL、0.398 mmol）で処理し、２時間攪拌した後、ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ＝５１１．３）は、ＴＢＤＰＳ保護基の脱落を示した。過剰のトリエチルアミントリヒドロフルオライド（0.065 mL、0.398 mmol）を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（1 mL）により中和し、溶媒をＶ－１０装置内で蒸発させた。粗製物質をＬＣ／ＭＳ方法Ｉで精製した。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１０１（6.7 mg、収率３２％）を得た。
実施例９－化合物１２７

ステップ１：メチル 4-((7-ヒドロキシ-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（US 2020/0038403 A1；300 mg、0.774 mmol）のＤＭＳＯ（3.9 mL）溶液を、（5-メチルイソキサゾール-3－イル）メタンアミン（174 mg、1.55 mmol）、ＢＯＰ（411 mg、0.929 mmol）およびＤＢＵ（233 μl、1.549 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで２時間攪拌し、ＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ_２Ｏ（3x）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、メチル 3-メトキシ-4-((5-((メトキシカルボニル）アミノ)-7-(((5-メチルイソキサゾール-3－イル）メチル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）ベンゾエート（353 mg、収率95％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.80（s，1H），7.99－7.93（m，1H），7.77（t，J=5.9 Hz，1H），7.49（d，J=1.5 Hz，1H），7.45（dd，J=7.8，1.5 Hz，1H），6.62（d，J=7.9 Hz，1H），6.10（d，J=0.9 Hz，1H），5.80（s，2H），4.73（d，J=5.9 Hz，2H），3.84（s，3H），3.82（s，3H），3.64（s，3H），2.31（s，3H）
ＬＣ ＲＴ：０．６７分 ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４８２．３（方法Ｊ）

ステップ２．メチル 3-メトキシ-4-((5-((メトキシカルボニル）アミノ)-7-(((5-メチルイソキサゾール-3－イル）メチル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）ベンゾエート（125 mg、0.260 mmol）のジオキサン（1.3 mL）溶液を、ＮａＯＨ（１０Ｍ 水溶液、0.2 mL、2.0 mmol）で処理し、７５℃に加熱した。２時間後、反応混合物をＲＴに冷まし、ＨＣｌ（ジオキサン中、４Ｍ、0.52 mL、2.1 mmol）で処理し、減圧濃縮した。残留物をＭｅＯＨ/ＤＣＭ中に再溶解し、減圧濃縮した。４０ｍｇのこの粗製物質をＤＭＦ（469 μl）中に溶解し、2-(ピペラジン-1－イル）エタン-1－オール（12 mg、0.094 mmol）、ＤＩＥＡ（41 μl、0.23 mmol）および2,4,6-トリプロピル-1,3,5,2,4,6-トリオキサトリホスホリナン-2,4,6-トリオキシド（５０％ ＥｔＯＡｃ溶液、55.8 μL、0.094 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌し、ＤＭＦ（1 mL）およびＨ_２Ｏ（0.2 mL）で希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過した。以下の条件で、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－３０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。生成物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１２７をビスＴＦＡ塩として得た（11.7 mg、収率３９％）。

化合物１２９、化合物１３０、および化合物１３１を類似的に調製した。
実施例１０－化合物１２８

ステップ１．メチル （7-ヒドロキシ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（1 g、4.78 mmol）およびＳｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（商標）（5.08 g、14.34 mmol）をアセトニトリル（20 mL）中に懸濁した。酢酸（2 mL）を添加した。反応混合物を７０℃で２４時間攪拌し、冷却し、水（100 mL）に注いだ。得られた混合物をフリーザー（－２０℃）内で３０分間冷却し、次に生成物を濾過し、水（40 mL）で洗浄し、メチル （3-フルオロ-7-ヒドロキシ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（623 mg、2.74 mmol、収率57.4％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２２８．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 13.69（s，1H），11.63（s，1H），11.26（s，1H），3.76（s，3H）

ステップ２．メチル （3-フルオロ-7-ヒドロキシ-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5－イル）カルバメート（620 mg、2.73 mmol）およびＣｓ_２ＣＯ_３（1030 mg、3.16 mmol）のＤＭＦ（5 mL）攪拌懸濁液を氷浴で冷却した。メチル 4-(ブロモメチル）-3-メトキシベンゾエート（744 mg、2.87 mmol）のＤＭＦ（5 mL）溶液を添加した。ゆっくりとＲＴに温まるまで反応物をそのままにし、２時間攪拌し、水（100 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 100 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（40 g ＳｉＯ_２カラム、シリカ充填、ヘキサン中、０から１００％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 4-((3-フルオロ-7-ヒドロキシ-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（342 mg、純度約60％、0.506 mmol、収率17.6％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４０６．２

ステップ３．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、メチル 4-((3-フルオロ-7-ヒドロキシ-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（340 mg、0.839 mmol）、(S)-3-アミノヘキサン-1－オール，ＨＣｌ（193 mg、1.258 mmol）、ＢＯＰ（742 mg、1.678 mmol）、ＤＭＳＯ（4 mL）およびＤＢＵ（0.379 mL、2.52 mmol）を入れた。反応混合物を７０℃で１５分間加熱し、冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（100 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 40 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 40 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（40 g ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１００％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル （S)-4-((3-フルオロ-7-((1-ヒドロキシヘキサン-3－イル）アミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（105 mg、0.208 mmol、収率24.8％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝５０５．３
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.90（s，1H），7.52（s，1H），7.49（d，J=8.2 Hz，1H），6.74（d，J=7.7 Hz，1H），6.69（d，J=7.9 Hz，1H），5.77（d，J=17.2 Hz，1H），5.61（d，J=16.9 Hz，1H），4.54－4.43（m，1H），4.38（t，J=5.5 Hz，1H），3.87（s，3H），3.85（s，3H），3.63（s，3H），3.45－3.34（m，2H），1.75－1.62（m，2H），1.58－1.40（m，2H），1.18－1.01（m，2H），0.75（t，J=7.4 Hz，3H）

ステップ４．メチル （S)-4-((3-フルオロ-7-((1-ヒドロキシヘキサン-3－イル）アミノ)-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（100 mg、0.198 mmol）をジオキサン（2 mL）中に溶解し、水酸化ナトリウム（0.595 mL、2.97 mmol）を添加した。反応混合物を８０℃で２時間、次にＲＴで終夜攪拌した。５Ｎ ＨＣｌを用いて反応混合物を中和し、蒸発乾固させ、（S)-4-((5-アミノ-3-フルオロ-7-((1-ヒドロキシヘキサン-3－イル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（210 mg、純度約40％、0.19 mmol、収率98％）を得て、精製せずに次に使用した
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４３３．２

ステップ５．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、（S)-4-((5-アミノ-3-フルオロ-7-((1-ヒドロキシヘキサン-3－イル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸（70 mg、0.081 mmol）、ＨＡＴＵ（36.9 mg、0.097 mmol）およびＤＭＦ（2 mL）を入れた。1-メチルピペリジン-4-アミン（18.48 mg、0.162 mmol）、続いてＤＩＰＥＡ（0.042 mL、0.243 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌し、濾過し、以下の条件で、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：４％Ｂで０分保持、２０分かけて４－４４％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１２８（15.1 mg、0.028 mmol、収率34.7％）を得た。
実施例１１－化合物１３２

ステップ１．メチル 4-((7-ヒドロキシ-5-((メトキシカルボニル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシベンゾエート（510 mg、1.32 mmol；US 2020/0038403 A1、図２Ａ、化合物１６）のＤＭＳＯ（6.6 mL）溶液を、（5-メチル-1,2,4-オキサジアゾール-3－イル）メタンアミン・ＨＣｌ（236 mg、1.58 mmol）、ＢＯＰ（698 mg、1.58 mmol）およびＤＢＵ（595 μL、3.95 mmol）で処理した。反応物をＲＴで攪拌した。１６時間後、（5-メチル-1,2,4-オキサジアゾール-3－イル）メタンアミン・ＨＣｌ（50 mg、0.33 mmol）、ＢＯＰ（50 mg、0.11 mmol）およびＤＢＵ（200 μL、1.33 mmol）をさらに添加した。反応物をＲＴで２時間攪拌し、ＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ_２Ｏ（4x)で洗浄した。有機層をＣｅｌｉｔｅ上に吸収させ、カラムクロマトグラフィー（100g C18 gold column；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：０．０５％ トリフルオロ酢酸含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：０．０５％ トリフルオロ酢酸含有水；流速：６０ｍＬ/分、２０－６０％グラジエント）で精製した。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、ＨＣｌ（１Ｍ Ｈ_２Ｏ中、2 mL、2 mmol）で処理し、減圧濃縮して、メチル 3-メトキシ-4-((5-((メトキシカルボニル）アミノ)-7-(((5-メチル-1,2,4-オキサジアゾール-3－イル）メチル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）ベンゾエート（382 mg、収率60％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.72－9.70（m，1H），7.96－7.94（m，1H），7.83－7.76（m，1H），7.49（d，J=1.4 Hz，1H），7.46（dd，J=7.8，1.5 Hz，1H），6.74（d，J=7.8 Hz，1H），5.79（s，2H），4.86（d，J=5.8 Hz，2H），3.86（s，3H），3.84（s，3H），3.60（s，3H），2.54（s，3H） ＬＣ ＲＴ：０．６４分 LＣ/ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４８３．３（方法Ｊ）

ステップ２．メチル 3-メトキシ-4-((5-((メトキシカルボニル）アミノ)-7-(((5-メチル-1,2,4-オキサジアゾール-3－イル）メチル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）ベンゾエート（382 mg、0.791 mmol）のジオキサン（9.0 mL）溶液をＮａＯＨ（１０Ｍ 水溶液、0.32 mL、3.2 mmol）で処理し、４０℃に加熱した。３０分後、温度を６０℃に上昇させた。追加量のＮａＯＨ（１０Ｍ 水溶液、450 μL、3 mmol）およびＭｅＯＨ（1 mL）を反応混合物に、６時間かけて添加した。反応混合物をＲＴに冷まし、ＨＯＡｃで中和し、減圧濃縮した。粗生成物をＭｅＯＨ中に溶解し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、以下の条件で、プレパラティブＨＰＬＣにより精製した：カラム：Axia C18 100 mm x 30 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：10:90 メタノール：０．１％ トリフルオロ酢酸含有水；移動相Ｂ：90:10 メタノール：０．１％ トリフルオロ酢酸含有水；グラジエント：１５％Ｂで０分保持、１０分かけて１５－３０％Ｂ、次いで３０％Ｂで４分保持；流速：４０ｍＬ/分；２２０ｎｍでＵＶ検出；カラム温度：２５℃。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、ＨＣｌ（１Ｍ Ｈ_２Ｏ中、2 mL、2 mmol）で処理し、減圧濃縮して、4-((5-アミノ-7-(((5-メチル-1,2,4-オキサジアゾール-3－イル）メチル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸・ＨＣｌ（98.9 mg、収率28％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 13.23－12.93（m，1H），12.67－12.43（m，1H），9.06－8.92（m，1H），8.03－7.87（m，2H），7.83（s，1H），7.51－7.46（m，2H），6.98（d，J=8.2 Hz，1H），5.80（s，2H），4.91（d，J=5.7 Hz，2H），3.82（s，3H），2.57（s，3H） ＬＣ ＲＴ：０．５２分 ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４１１．３（方法Ｊ）

ステップ３．4-((5-アミノ-7-(((5-メチル-1,2,4-オキサジアゾール-3－イル）メチル）アミノ)-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-1－イル）メチル）-3-メトキシ安息香酸・ＨＣｌ（25 mg、0.056 mmol）のＤＭＦ（0.6 mL）溶液を、1-メチルピペラジン（11.2 mg、0.112 mmol）、ＤＩＥＡ（49 μL、0.28 mmol）および2,4,6-トリプロピル-1,3,5,2,4,6-トリオキサトリホスホリナン-2,4,6-トリオキシド（５０％ ＥｔＯＡｃ溶液、67 μL、0.11 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで１６時間攪拌し、追加量の1-メチルピペラジン（11.2 mg、0.112 mmol）、ＤＩＥＡ（49 μL、0.28 mmol）および2,4,6-トリプロピル-1,3,5,2,4,6-トリオキサトリホスホリナン-2,4,6-トリオキシド（５０％ ＥｔＯＡｃ溶液、67 μL、0.11 mmol）で処理し、ＲＴで終夜攪拌した。反応混合物をＤＭＦ（1 mL）およびＨ_２Ｏ（0.2 mL）で希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過した。以下の条件で、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１３２（16.6 mg、収率５９％）を得た。

化合物１３３を類似的に調製した。
実施例１２－出発物質および中間体

下記のチャートは、本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニストの調製用の出発物質または中間体として有用なことがある化合物を作成するためのスキームを示す。スキームは、出発物質または中間体として使用されることがある他の類似化合物の作成に適用され得る。使用される試薬は当技術分野において周知であり、多くの場合、その使用は前述の実施例に示されている。
チャート１

チャート２

チャート３

生物学的活性
ＴＬＲ７アゴニストとして本明細書に開示される化合物の生物学的活性は、以下の手順により定量されることがある。

ヒトＴＬＲ７アゴニスト活性アッセイ
この手順は、本明細書に開示される化合物のヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）アゴニスト活性を定量する方法を説明する。

ヒトＴＬＲ７分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータートランスジーンを有する改変ヒト胚性腎臓ブルー細胞（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ細胞；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、非選択培地（１０％ウシ胎児血清（Sigma）を添加したＤＭＥＭ高グルコース（Invitrogen））中に懸濁した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ７細胞を３８４ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加し（１ウェルあたり１５，０００細胞）、１６－１８時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ細胞が入ったウェルに化合物（100 nl）を添加し、処置した細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。処理から１８時間後、１０マイクロリットルの新たに調製したＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Invivogen）を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ_２）、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＯＤ＝６２０ｎｍ）を用いてＳＥＡＰレベルを測定した。半数効果濃度値（ＥＣ_５０；アッセイ基準値および最大値の中間の応答を引き起こす化合物濃度）を算出した。

ヒト血液におけるＩ型インターフェロン遺伝子（ＭＸ－１）およびＣＤ６９の誘導
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）ＭＸ－１遺伝子およびＢ細胞活性化マーカーＣＤ６９の誘導は、ＴＬＲ７経路の活性化で起こる下流のイベントである。以下は、ＴＬＲ７アゴニストに対する応答におけるそれらの誘導を測定するヒト全血アッセイである。

ヘパリン処置したヒト全血をヒト患者から回収し、１ｍＭで、ＴＬＲ７アゴニスト試験化合物で処置した。血液をＲＰＭＩ １６４０培地で希釈し、Ｅｃｈｏを使用して１ウェルあたり１０ｎＬプレドット（predot）し、最終濃度を１μＭとした（１０μＬの血液中に１０ｎＬ）。３０秒間振盪機で混合した後、プレートを覆い、３７℃のチャンバー内に終夜＝１７時間置いた。固定／溶解バッファーを調製し（Ｈ_２０中５ｘ→１ｘ、３７℃で温める；Ｃａｔ＃ ＢＤ ５５８０４９）、後で使用するためにパームバッファーを（氷上で）維持した。

表面マーカー染色（ＣＤ６９）のために表面抗体を調製した：０．０４５μｌ ｈＣＤ１４－ＦＩＴＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ ＃ ＭＨＣＤ１４０１）＋０．６μｌ ｈＣＤ１９－ｅｆ４５０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ ＃ ４８－０１９８－４２）＋１．５μｌ ｈＣＤ６９－ＰＥ（ｃａｔ＃ ＢＤ５５５５３１）＋０．８５５μｌ ＦＡＣＳバッファー。３μｌ/ウェルで添加し、１０００ｒｐｍで１分間遠心し、振盪機で３０秒間混合し、氷上に３０分間置いた。３０分後、７０μＬの予め温めた１ｘ固定／溶解バッファーで刺激を停止させ、Feliex mateを用いて再懸濁し（１５回、プレートごとにチップを変えた）、３７℃で１０分間インキュベートした。

２０００ｒｐｍで５分間遠心し、ＨＣＳプレートウォッシャーで吸引し、振盪機で３０秒間混合し、次いで７０μＬのｄＰＢＳで洗浄し、ペレット状にすること２回（２０００ｒｐｍ、５分間）、５０μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ペレット状にすること１回（２０００ｒｐｍ、５分間）を行った。振盪機で３０秒間混合した。細胞内マーカー染色（ＭＸ－１）については：５０μｌのＢＤ ＰｅｒｍバッファーＩＩＩを添加し、振盪機で３０秒間混合した。氷上で３０分間インキュベートした（遮光）。５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し（透過処理後２３００ｒｐｍで５分間遠心）、続いて振盪機で３０秒間混合した。ＭＸ１抗体（(4812)－Ａｌｅｘａ ６４７：Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃ＮＢＰ２－４３７０４ＡＦ６４７）を含む２０μＬのＦＡＣＳバッファーで再懸濁した（２０μｌ ＦＡＣＳバッファー＋０．８ｕｌ ｈＩｇＧ＋０．０４μｌ ＭＸ－１）。１０００ｒｐｍで１分間遠心し、振盪機で３０秒間混合し、サンプルをＲＴで、暗所で４５分間インキュベートし、続いて２ｘＦＡＣＳバッファーで洗浄した（透過処理後２３００ｒｐｍで５分間遠心）。２０μｌのＦＡＣＳバッファーで再懸濁し（１ウェルあたり合計３５μＬ）、ホイルで覆い、４℃に置き、翌日に読み取った。プレートをｉＱｕｅＰｌｕｓで読み取った。結果をツールセットにロードし、カーブマスターでＩＣ５０曲線を作成した。ｙ軸の１００％は１μＭのレシキモドに設定されている。

マウス血液におけるＴＮＦ－アルファおよびＩ型ＩＦＮ応答遺伝子の誘導
ＴＮＦ－アルファおよびＩ型ＩＦＮ応答遺伝子の誘導は、ＴＬＲ７経路の活性化で起こる下流のイベントである。以下は、ＴＬＲ７アゴニストに対する応答における、マウス全血中のそれらの誘導を測定するアッセイである。

ヘパリン処置したマウス全血を、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ １６４０培地で、５：４の比率で希釈した（５０μＬの全血および４０μＬの培地）。体積９０μＬの希釈血液をＦａｌｃｏｎ平底９６ウェル組織培養プレートのウェルに移し、プレートを４℃で１時間インキュべートした。１００％ ＤＭＳＯストック中の試験化合物を、濃度応答アッセイのために同じ培地で２０倍希釈し、次いで１０μＬの希釈した試験化合物をウェルに添加し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．５％となるようにした。コントールウェルに、５％ ＤＭＳＯを含む１０μＬの培地を添加した。次にプレートを３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１７時間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬの培地を各ウェルに添加した。プレートを遠心し、１３０μＬの上清を除去し、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦα産生のアッセイに使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号 ８８－７３２４ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより）。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｍＲＮＡ Ｃａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓキット（Ｃａｔ＃ Ｋ１５７０－０２）に由来する、ＤＴＴを含む体積７０μＬのｍＲＮＡキャッチャー溶解バッファー（１ｘ）を、ウェル中の残りの７０μＬサンプルに添加し、ピペッティングにより５回混合した。次にプレートをＲＴで５－１０分間振盪し、続いて２μＬのプロテイナーゼＫ（20 mg/mL）を各ウェルに添加した。次にプレートを１５－２０分間、ＲＴで振盪した。次に、さらに処理するまでの間、プレートを－８０℃で保存した。

冷凍サンプルを解凍し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｍＲＮＡ Ｃａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓキット（Ｃａｔ＃ Ｋ１５７０－０２）を用いて、製造業者の説明書に従ってｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出から得られたｍＲＮＡの半量を用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｃａｔ＃ １１７５６５００）を使用して、２０μＬの逆転写酵素反応でｃＤＮＡを合成した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲを行った。全てのリアルタイムＰＣＲ反応を、市販のマウスＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＭＸ１およびＰＰＩＡ遺伝子発現用プレデザインＴａｑＭａｎアッセイ並びにＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、２回繰り返して行った。ＰＰＩＡは、ハウスキーピング遺伝子として利用した。製造業者からの勧告に従った。全ての生データ（Ｃｔ）を平均ハウスキーピング遺伝子（Ｃｔ）で正規化し、次に比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法を利用して、実験解析のために、相対的な遺伝子発現量（ＲＱ）を定量化した。

定義
「脂肪族」は、特定の数の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和非芳香族炭化水素部分を意味し（例えば、「Ｃ_３脂肪族」、「Ｃ_１－５脂肪族」、「Ｃ_１－Ｃ_５脂肪族」、または「Ｃ_１からＣ_５脂肪族」のように。後者３つの表現は１から５個の炭素原子を有する脂肪族部分と同義である）、炭素原子の数が明確に特定されない場合は、１から４個の炭素原子（不飽和脂肪族部分の場合は２から４個の炭素）である。同様の理解が、他の種類における炭素の数、つまりＣ_２－４アルケン、Ｃ_４－Ｃ_７シクロ脂肪族などに適用される。同様に、「（ＣＨ_２）_１－３」などの用語は、下付き文字が１、２、または３であることの省略表現として理解されるべきであり、そのため、かかる用語は、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２を表すことになる。

「アルキル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う飽和脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル部分には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、t－ブチル、1－ブチル、2－ブチル、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。「アルカンジイル」（時として「アルキレン」とも呼ばれる）は、アルキル基の２価の対応物を意味し、例えば、

などがある。

「アルケニル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う、少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ_２－Ｃ_４アルケニル部分には、エテニル（ビニル）、2－プロペニル（アリルまたはプロプ－2－エニル）、シス－1－プロペニル、トランス－1－プロペニル、Ｅ－（またはＺ－）2－ブテニル、3－ブテニル、1,3－ブタジエニル（ブト－1,3－ジエニル）、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。

「アルキニル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う、少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ_２－Ｃ_４アルキニル基には、エチニル（アセチレニル）、プロパルギル（プロプ－2－イニル）、1－プロピニル、ブト－2－イニル、および同類のものが挙げられる。

「シクロ脂肪族」は、１から３個の環を有し、各環が、３から８個（好ましくは３から６個）の炭素原子を有する、飽和または不飽和非芳香族炭化水素部分を意味する。「シクロアルキル」は、各環が飽和であるシクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルケニル」は、少なくとも一つの環が少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する、シクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルキニル」は、少なくとも一つの環が少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する、シクロ脂肪族部分を意味する。実例として、シクロ脂肪族部分には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、およびアダマンチルが挙げられるが、これらに限らない。好ましいシクロ脂肪族部分は、シクロアルキル部分、特にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルである。「シクロアルカンジイル」（時として「シクロアルキレン」とも呼ばれる）は、シクロアルキル基の２価の対応物を意味する。同様に、「ビシクロアルカンジイル」（または「ビシクロアルキレン」）および「スピロアルカンジイル」（または「スピロアルキレン」）は、ビシクロアルキルおよびスピロアルキル（または「スピロシクロアルキル」）基の２価の対応物を指す。

「ヘテロシクロ脂肪族」は、少なくとも一つのその環において、最大３個（好ましくは１から２個）の炭素が、Ｎ、ＯまたはＳから独立して選択されるヘテロ原子で置換されており、ここでＮおよびＳは、適宜酸化されてもよく、Ｎは、適宜四級化されてもよい、シクロ脂肪族部分を意味する。好ましいシクロ脂肪族部分は、５から６員の大きさの１つの環からなる。同様に、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」、および「ヘテロシクロアルキニル」は、少なくとも一つのその環が、そのように修飾されている、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはシクロアルキニル部分をそれぞれ意味する。代表的なヘテロシクロ脂肪族部分には、アジリジニル、アゼチジニル、1,3－ジオキサニル、オキセタニル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニルスルホン、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルスルホキシド、チオモルホリニルスルホン、1,3－ジオキソラニル、テトラヒドロ－1,1－ジオキソチエニル、1,4－ジオキサニル、チエタニル、および同類のものが挙げられる。「ヘテロシクロアルキレン」は、ヘテロシクロアルキル基の２価の対応物を意味する。

「アルコキシ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」、および「アリールチオ」は、それぞれ、－Ｏ（アルキル）、－Ｏ（アリール）、－Ｓ（アルキル）、および－Ｓ（アリール）を意味する。例は、それぞれ、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、およびフェニルチオである。

「ハロゲン」または「ハロ」は、より狭い意味が指示されない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。

「アリール」は、各環が３から７個の炭素原子を有し、少なくとも一つの環が芳香族である、単、二、または三環式環系（好ましくは単環式）を有する、炭化水素部分を意味する。環系中の環は、（ナフチルのように）互いに縮合していてもよく、（ビフェニルのように）互いに結合していてもよく、（インダニルまたはシクロヘキシルフェニルのように）非芳香環と縮合または結合していてもよい。さらなる実例として、アリール部分には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントラセニル、およびアセナフチルが挙げられるが、これらに限らない。「アリーレン」は、アリール基の２価の対応物、例えば1,2－フェニレン、1,3－フェニレン、または1,4－フェニレンを意味する。

「ヘテロアリール」は、各環が３から７個の炭素原子を有し、少なくとも一つの環が、Ｎ、Ｏ、またはＳから独立して選択される１から４個のヘテロ原子を含む芳香環であり、ここでＮおよびＳは、適宜酸化されてもよく、Ｎは、適宜四級化されてもよい、単、二、または三環式環系（好ましくは５から７員の単環式）を有する部分を意味する。そのような少なくとも一つのヘテロ原子を含む芳香環は、（ベンゾフラニルまたはテトラヒドロイソキノリルのように）他の種類の環と縮合してもよく、（フェニルピリジルまたは2－シクロペンチルピリジルのように）他の種類の環と直接結合してもよい。さらなる実例として、ヘテロアリール部分には、ピロリル、フラニル、チオフェニル（チエニル）、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、N－オキソピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、シンノリニル、キノザリニル、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フェノチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、ジベンゾチオフェニル、アクリジニル、および同類のものが挙げられる。「ヘテロアリーレン」は、ヘテロアリール基の２価の対応物を意味する。

例えば「非置換の、または置換された」あるいは「適宜置換されてもよい」を用いる、つまり「非置換の、または置換されたＣ_１－Ｃ_５アルキル」あるいは「適宜置換されてもよいヘテロアリール」と表現するなどして、部分が置換されてもよいということが示される場合、かかる部分は、一つ以上の独立して選択される置換基、好ましくは数にして１から５個、より好ましくは数にして１から２個の置換基を有してもよい。置換基および置換パターンは、置換基が結合する部分を考慮して当業者により選択されることがあり、化学的に安定で、当技術分野で既知の技術、ならびに本明細書に記載される方法により合成され得る化合物を提供する。部分が、「非置換の、または置換された」あるいは「適宜置換されてもよい」ものとして特定される場合、好ましい実施形態において、かかる部分は非置換である。

「アリールアルキル」、「（ヘテロシクロ脂肪族）アルキル」、「アリールアルケニル」、「アリールアルキニル」、「ビアリールアルキル」、および同類のものは、場合によっては、アリール、ヘテロシクロ脂肪族、ビアリールなどで置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニル部分を、場合によっては、例えば、ベンジル、フェネチル、N－イミダゾイルエチル、N－モルホリノエチル、および同類のもののように、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分で開いた（不満足な）原子価を有する部分を意味する。反対に、「アルキルアリール」、「アルケニルシクロアルキル」、および同類のものは、場合によっては、アルキル、アルケニルなどで置換されたアリール、シクロアルキル、その他の部分、場合によっては、例えば、メチルフェニル（トリル）またはアリルシクロヘキシルのような部分を意味する。「ヒドロキシアルキル」、「ハロアルキル」、「アルキルアリール」、「シアノアリール」、および同類のものは、場合によっては、一つ以上の特定の置換基（場合によっては、ヒドロキシル、ハロなど）で置換されたアルキル、アリール、その他の部分を意味する。

例えば、許容される置換基には、アルキル（特にメチルまたはエチル）、アルケニル（特にアリル）、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ（特にフルオロ）、ハロアルキル（特にトリフルオロメチル）、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル（特にヒドロキシエチル）、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）（特に－ＯＣＦ_３）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、－Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、アジド、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＯＳＯ_２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（シクロアルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－ＳＯ_２（アルキル）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（アルキル）、－ＳＯ_２Ｎ（アルキル）_２、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。

置換される部分が脂肪族部分の場合、好ましい置換基は、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、－Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、アジド、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＯＳＯ_２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－Ｓ（シクロアルキル）、－ＳＯ_２（アルキル）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（アルキル）、および－ＳＯ_２Ｎ（アルキル）_２である。より好ましい置換基は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（アリール）、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、アジド、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、および－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２である。特に好ましい置換基は、フェニル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、Ｃ_１－Ｃ_４アルコキシ、Ｏ（Ｃ_２－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、およびＯ（Ｃ_２－Ｃ_４アルカンジイル）ハロである。

置換される部分がシクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、またはヘテロアリール部分の場合、好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）、－Ｏ（アリール）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、アルキルチオ、アリールチオ、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、アジド、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＯＳＯ_２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（シクロアルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－ＳＯ_２（アルキル）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（アルキル）、および－ＳＯ_２Ｎ（アルキル）_２である。より好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、および－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２である。特に好ましい置換基は、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、シアノ、ニトロ、ハロ、およびＣ_１－Ｃ_４アルコキシである。

「Ｃ_１－Ｃ_５アルキル」または「５から１０％」のように範囲が述べられる場合、かかる範囲は、範囲の終点、つまり第一の例においてはＣ_１およびＣ_５、並びに第二の例においては５％および１０％を含む。

（例えば、構造式中の関連する立体中心における価標を太線にするか、または破線にすることにより、構造式中で、二重結合をＥまたはＺ配置を有するものとして描くことにより、あるいは立体化学を指定する命名法または記号を用いることにより）特定の立体異性体が明確に指示されない限り、全ての立体異性体が、純粋化合物ならびにその混合物として本発明の範囲内に含まれる。特に断らない限り、ラセミ体、個々のエナンチオマー（光学的に純粋であろうと部分的に分割されていようと）、ジアステレオマー、幾何異性体、およびそれらの組み合わせ、並びにそれらの混合物は、本発明により全て包含される。

当業者は、化合物が、本明細書で使用される構造式に描かれるものと同等の互変異性体（例えば、ケトおよびエノール形）、共鳴構造、および双性イオン型を有することがあり、構造式は、そのような互変異性体、共鳴構造、双性イオン型を包含するということを認識するであろう。

「薬学的に許容されるエステル」は、インビボで（例えば人体内で）加水分解し、親化合物またはその塩を生成するか、あるいはそれ自体が親化合物の活性と類似のそれを有するエステルを意味する。適当なエステルには、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル、Ｃ_２－Ｃ_５アルケニルまたはＣ_２－Ｃ_５アルキニルエステル、特にメチル、エチルまたはｎ－プロピルエステルが挙げられる。

「薬学的に許容される塩」は、医薬製剤に適する化合物の塩を意味する。化合物が一つ以上の塩基性基を有する場合、塩は、酸付加塩、例えば、硫酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、塩酸塩、乳酸塩、メチル硫酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、メシル酸塩、ラクトビオン酸塩、スベリン酸塩、トシル酸塩、および同類のものなどであり得る。化合物が一つ以上の酸性基を有する場合、塩は、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、アンモニウム塩、亜鉛塩、ピペラジン塩、トロメタミン塩、リチウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、4－フェニルシクロヘキシルアミン塩、ベンザチン塩、ナトリウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、および同類のものなどの塩であり得る。多形結晶性形態および溶媒和物も本発明の範囲内に包含される。

「患者（subject）」は動物を指し、霊長類（例えば、ヒト）、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウスを含むが、これらに限らない。「患者（subject）」および「患者（patient）」という用語は、例えば、ヒトなどの哺乳動物の患者に関して、本明細書で互換的に使用される。

「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、および「治療（treatment）」という用語は、疾患または障害の治療の文脈において、障害、疾患、または病態、あるいは障害、疾患、もしくは病態に関連する症状のうちの一つ以上を軽減するか、または抑制すること；あるいは疾患、障害、または病態の、あるいは一つ以上のそれらの症状の進行、拡大または悪化を遅らせることを含むように意図される。「がんの治療」は、以下の効果のうちの一つ以上を指す：（１）（ｉ）遅延および（ｉｉ）完全な増殖停止を含む、ある程度の腫瘍増殖の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍の大きさの維持；（４）腫瘍の大きさの減少；（５）末梢臓器への腫瘍細胞浸潤の（ｉ）減少、（ｉｉ）遅延または（ｉｉｉ）完全な予防を含む阻害；（６）転移の（ｉ）減少、（ｉｉ）遅延または（ｉｉｉ）完全な予防を含む阻害；（７）（ｉ）腫瘍の大きさの維持、（ｉｉ）腫瘍の大きさの減少、（ｉｉｉ）腫瘍の増殖の遅延、（ｉｖ）浸潤の減少、遅延または予防をもたらすことがある、抗腫瘍免疫応答の増強および／または（８）ある程度の、障害に関連する一つ以上の症状の重症度または数の軽減。

本明細書の式において、価標に対して横方向の波線（

）または価標の末端にあるアスタリスク（＊）は、共有結合部位を意味する。例えば、式

において、Ｒは

である、またはＲは

であるという記述は、

を意味する。

本明細書の式において、その２つの炭素の間で芳香環を横切る価標は、その価標に結合する基が、黙示的にそこにある（または、完全に書かれている場合、明示的にそこにある）水素の除去によって空きができる芳香環の位置のうちのどこにあってもよいということを意味する。実例として、下記の式：

は、

を表す。

他の実例において、

は、

を表し、

は、

を表す。

本開示は、本明細書に記載される化合物で生じる原子の全ての同位体を含む。同位体は、原子番号は同じだが異なる質量数を有する原子を含む。一般的な例であり、限定ではないが、水素の同位体には重水素およびトリチウムが挙げられる。炭素の同位体には、^１３Ｃおよび^１４Ｃが挙げられる。同位体標識した本発明の化合物は、一般的に、他の場合に使用される非標識試薬の代わりに、同位体標識した適切な試薬を用いて、当業者に既知の従来の技術により、または本明細書に記載されるものと類似の工程により調製され得る。例として、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル基は、重水素化されていなくても、部分的に重水素化されていても、完全に重水素化されていてもよく、「ＣＨ_３」には、ＣＨ_３、^１３ＣＨ_３、^１４ＣＨ_３、ＣＨ_２Ｔ、ＣＨ_２Ｄ、ＣＨＤ_２、ＣＤ_３などが含まれる。一つの実施形態において、化合物中の様々な元素は、それらの天然の同位体存在度で存在する。

当業者は、特定の構造はどちらの互変異性体－例えば、ケトかエノールか－で描かれてもよく、その２つの形態は等価であるということを認識するであろう。

アクロニムおよび略語
これは、本明細書で使用されるアクロニムおよび略語にその意味を添えた表である。

参考文献
本明細書の初めの方で、筆頭著者（または発明者）および日付により省略された形で引用される以下の参考文献に対する完全な引用を以下に提供する。これらの参考文献のそれぞれは、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。

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前述の本発明の詳細な説明は、本発明の特定の部分または態様に、主にまたは排他的に関係する節を含む。これは、明確化のため、および便宜のためであり、特定の特徴は、それが開示される節だけでなくその他の節においても関連していることがあり、本明細書における開示は、異なる節に記載される情報の、全ての適切な組み合わせを含むことが理解されるべきである。同様に、本明細書における様々な図および説明は、本発明の特定の実施形態に関するが、具体的な特徴が、特定の図または実施形態の文脈で開示される場合、かかる特徴は、適切な範囲で、別の図または実施形態の文脈で、別の特徴と組み合わせて、または本発明一般においても使用され得るということが理解されるべきである。

さらに、本発明は、特定の好ましい実施形態について特に記載されているが、本発明は、かかる好ましい実施形態に限定されない。それどころか、本発明の範囲は、添付の請求項により定義される。

Claims (14)

1. 下記の式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、
   各Ｘ^１は、独立してＮまたはＣＲ^２であり；
   Ｘ^２は、Ｏ、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｓ、またはＮ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）であり；
   Ｒ^１は、（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
   （Ｃ_２－Ｃ_５アルケニル）、
   （Ｃ_１－Ｃ_８アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）、
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）ＯＨ、
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（５－６員ヘテロアリール）、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１フェニル、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＣＦ_３、
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   または
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）ＮＲ^ｘＲ^ｙであり；
   各Ｒ^２は、独立してＨ、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｓ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル、Ｏ（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、
   Ｓ（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、ＳＯ_２（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、
   Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、または［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１ＮＲ^ｘＲ^ｙであり；
   Ｒ^４は、ＮＨ_２、
   ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
   Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
   ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
   Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
   または
   下記の構造：
   

   

   を有する部分であり；
   Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル、Ｃ_２－Ｃ_５アルケニル、Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル、
   ハロ、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、フェニル、
   ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、５もしくは６員ヘテロアリール、
   

   

   であり；
   Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルであるか、あるいはＲ^ｘおよびＲ^ｙは、それらに結合している窒素と結合して３から７員のヘテロ環を形成し；
   ｍは、０または１であり；
   ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５において、
   アルキル、アルカンジイル、シクロアルキル、フェニル、５もしくは６員ヘテロアリール、または下記の式：
   

   

   で示される部分は、
   ＯＨ、ハロ、ＣＮ、（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）
   から選択される一つ以上の置換基で適宜置換されてもよく；
   アルキル、アルカンジイル、シクロアルキル、または下記の式：
   

   

   の環状部分は、
   Ｏ、ＳＯ_２、ＣＦ_２、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＨ、
   Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＣＦ_３、
   Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、
   または
   Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_５シクロアルキル）
   に置換されるＣＨ_２基を有してもよい］
   で示される構造を有する化合物。
2. 式（Ｉ）において、下記の部分：
   

   

   が、
   

   

   である、請求項１に記載の化合物。
3. 下記の式（Ｉａ）：
   

   

   で示される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
4. Ｒ^１が、
   

   

   からなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
5. Ｒ^２が、
   

   

   である、請求項３に記載の化合物。
6. Ｒ^５が、ＨまたはＭｅである、請求項３に記載の化合物。
7. Ｒ^４が、
   

   

   である、請求項３に記載の化合物。
8. Ｒ^１が、
   

   

   からなる群から選択され、
   Ｒ^５が、ＨまたはＭｅである、請求項７に記載の化合物。
9. 下記の式（Ｉｂ）：
   

   

   で示される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
10. Ｒ^１が、
    

    

    であり；
    Ｒ^４が、
    

    

    であり；
    Ｒ^５が、Ｈ、Ｍｅ、またはＦである、請求項９に記載の化合物。
11. がんを患う患者に、抗がん免疫療法剤および請求項１または１０に記載の化合物の治療的に有効な組み合わせを投与することを特徴とする、がんの治療方法。
12. 前記抗がん免疫療法剤が、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記がんが、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫を含む）、皮膚癌（黒色腫およびメルケル皮膚癌を含む）、尿路上皮癌（膀胱癌を含む）、胃癌、肝細胞癌、または結腸直腸癌である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記抗がん免疫療法剤が、イピリムマブ、ニボルマブ、またはペムブロリズマブである、請求項１３に記載の方法。