ES2552471T3 - Conjugados de agonistas de TLR sintéticos y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Compuesto según la siguiente fórmula**Fórmula**

Description

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DESCRIPCION

Conjugados de agonistas de TLR sinteticos y usos de los mismos

Antecedentes

En la ultima decada hemos aprendido mucho sobre las bases moleculares del reconocimiento innato de patogenos microbianos. En general se admite que muchas celulas somaticas expresan una serie de receptores de reconocimiento de patrones que detectan patogenos potenciales independientemente del sistema inmunologico adaptativo (vease Janeway y col., Annu. Rev. Immunol., 20:197 (2002)). Se cree que estos receptores interaccionan con componentes microbianos denominados patrones moleculares asociados a patogenos (pathogenassociated molecular patterns - PAMP). Ejemplos de PAMP incluyen peptidoglicanos, acidos lipoteicoicos de paredes de celulas gram-positivas, el azucar manosa (que es comun en carbohidratos microbianos pero raro en humanos), ADN bacteriano, ARN viral bicatenario y glucanos de paredes de celulas fungicas. En general, los PAMP cumplen ciertos criterios, que incluyen (a) su expresion por microbios pero no sus huespedes mairnferos, (b) conservacion de la estructura en una amplia gama de patogenos y (c) capacidad de estimular la inmunidad innata. Se ha comprobado que los receptores tipo Toll (toll-like receptor TLR) desempenan un papel central en la deteccion de PAMP y en la respuesta temprana a infecciones microbianas (vease Underhill y col., Curr. Opin. Immunol., 14:103 (2002)). En este contexto se han identificado diez TLR de marnffero y una serie de sus agonistas. Por ejemplo, el TLR7 y el TLR9 reconocen y responden a imiquimod y oligonucleotidos CpGinmunoestimuladores (ISS-ODN), respectivamente. El inmunomodulador sintetico R-848 (resiquimod) activa tanto el TLR7 como el TLR8. Mientras que la estimulacion de TLR inicia una cascada de senales comun (que implica la protema adaptadora MyD88, el factor de transcripcion NF-kB y citoquinas proinflamatorias inductoras), determinados tipos de celulas tienden a producir determinados TLR. Por ejemplo, el TLR7 y el TLR9 se encuentran predominantemente en las caras internas de endosomas de celulas dendnticas (DC) y linfocitos B (en humanos; macrofagos de raton expresan TLR7 y TLR9). Por otro lado, el TLR8 se encuentra en monocitos sangumeos humanos (vease Homung y col., J. Immunol., 168:4531 (2002)).

A este respecto se conoce la smtesis y la actividad inmunoestimuladora de amino 9-benciladeninas 8- sustituidas como potentes agonistas del receptor tipo Toll 7 (vease Jin y col., BioorgMedChemLett. 16: 455963 (2006)).

Por otro lado, tambien se ha informado de que la conjugacion de una protema Gag de VIH con un agonista de TLR7/8 mejora la magnitud y calidad de las respuestas de celulas T Th1 y CD8+ en primates no humanos (vease Wille-Reece y col., ProcNatlAcadSci US A, 102 (42): 15190-4, (2005)).

Los interferones (INF) tambien intervienen en la induccion eficiente de la respuesta inmune, en especial despues de una infeccion viral (Brassard y col., J. Leukoc. Biol., 71: 568 (2002)). Sin embargo, muchos virus producen diversas protemas que bloquean la produccion o accion del interferon en diversos niveles. Se cree que el antagonismo de interferon forma parte de una estrategia general para eludir la inmunidad innata y tambien la inmunidad adaptativa (vease Levy y col., CytokineGrowth Factor Rev., 12:143 (2001)). La solicitud de patente internacional publicada WO 2007/024707 describe agonistas de TLR7 y TLR8. Tambien se han descrito conjugados de HIV Gag y un agonista de TLR7/8 (vease Wille-Reecey col.., PNAS, 102: 151190 (2005)). La smtesis y la actividad inmunoestimuladoraamino-9-benciladeninas8-sustituidascomo agonistas TLR7 tambien ha sido descrita (veaseJiny col., Bioorganic& Medicinal ChemistryLetters, 16: 4559 (2006)). Ademas, se han descrito agonistas de TLR complejados con liposomas como componentes de adyuvantes para vacunas (Zaksy col., J. Immunol., 176: 7335 (2006)).Si bien los agonistas de TLR pueden ser suficientemente activos en algunos metodos de tratamiento, en algunos casos los antagonistas de interferon microbiano podnan mitigar los efectos coadyuvantes de los agonistas de TLR sinteticos.

Una respuesta mas espedfica a infecciones microbianas se basa en la inmunizacion activa o pasiva. Si una inmunizacion universal no se considera rentable (o farmaco economicamente viable), la identificacion de una poblacion de riesgo que se beneficiana de una inmunoprofilaxis puede ser rentable, aunque la identificacion de dicha poblacion puede no ser sencilla. No obstante, existen ciertas poblaciones de riesgo claramente definidas para determinadas infecciones bacterianas, como infecciones estafilococicas, incluyendo pacientes de dialisis, con derivacion ventnculo peritoneal, con riesgo de endocarditis infecciosa y mayores en residencias. Todos ellos padecen condiciones cronicas que los exponen a un riesgo elevado y prolongado de infecciones estafilococicas. Muchos de estos pacientes tienen tambien un alto riesgo de adquirir Staphylococcusaureus resistente a la meticilina asociado a la asistencia sanitaria (healthcare- associatedmethicillin-resistantStaphylococcusaureus - HA-MRSA). Sin embargo, puede ser mas facil conseguir el bloqueo de la colonizacion de Staphylococcus que proteger contra la infeccion.

La inmunoprofilaxis pasiva utilizando anticuerpos policlonales (Capparelli y col., Antimicrob. AgentsChemo., 49:4121 (2005)) o anticuerpos monoclonales (mAbs) (
www.biosynexus.com/productcandidates.html) puede proporcionar una proteccion inmediata (aunque de corta duracion) a pacientes que no pueden esperar a que se produzca el efecto de una vacuna o cuyos sistemas inmunologicos estan demasiado comprometidos para 5 producir una respuesta a una vacuna. Una indicacion potencial para la inmunoprofilaxis pasiva es un brote hospitalario de infecciones relacionadas con el MRSA. En estos casos, para los individuos expuestos puede resultar beneficiosa una profilaxis inmediata, mientras que para los individuos que residen en la misma sala o instalacion de cuidados cronicos puede resultar beneficiosa una inmunizacion activa. Ademas, los pacientes de las unidades de cuidados intensivos son beneficiarios potenciales de la inmunoprofilaxis pasiva, ya que 10 cada uno de ellos tiene probabilidades de adquirir uno o mas factores de riesgo de infecciones por estafilococos.

Sumario de la invencion

La presente solicitud proporciona un compuesto de acuerdo con la siguiente formula

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15 El compuestode la invencionesun conjugado fosfolipido sintetico agonista de TLR (compuesto conugado) y actua como agente inmunoestimulador de amplio espectro, larga duracion y no toxico, que es util para activar el sistema inmunologico de un mairnfero, por ejemplo un humano. En particular, el compuestode la invencion optimiza la respuesta inmune y al mismo tiempo limitan los efectos secundarios sistemicos no deseados asociados a los agonistas de TLR no conjugados.

20 El agonista de TLR sintetico puede ayudar a dirigir el conjugado hacia TLR dentro de los endosomas de celulas diana y mejorar el suministro del componente macromolecular. En unarealizacion, el agonista de TLR puede ser un agonista de TLR7 o TLR8. Ademas, el agonista de TLR sintetico puede mejorar la respuesta al componente macromolecular del compuesto de la presente invencion (por ejemplo la respuesta inmune). Del mismo modo, la macromolecula puede ser util para activar el sistema inmune y/o puede dirigir el conjugado a 25 celulas particulares. Por consiguiente, el componente macromolecular del compuesto de la invencion puede aumentar la actividad del agonista de TLR sintetico o tener una actividad deseable independiente. Por ejemplo, el componente macromolecular puede aumentar la actividad del agonista de TLR ayudando a dirigir el agonista hacia el TLR dentro de los endosomas de celulas diana, mejorando la transduccion de senales inducida por el agonista de TLR, o reticulando el receptor, o una combinacion de ambos. De acuerdo con la 30 invencion, el componente macromolecular del compuesto de la invencion es un lfpido que puede incorporarse espontaneamente en liposomas. En una realizacion no reivindicada, la macromolecula es una nanopartfcula que tiene grupos amino en su superficie. Una vez acoplada a un agonista de TLR, el conjugado de agonista de TLR-nanopartfcula puede tener un tamano de, por ejemplo, aproximadamente 100 nm, que puede residir (estar presente) en endosomas.

35 Las infecciones por Staphylococcusaureus (SA) adquiridas en hospitales son una causa fundamental de morbilidad y mortalidad. Sin embargo, no se utilizan vacunas en las instalaciones de cuidado para enfermedades agudas, ya que tardan demasiado en actuar y no son eficaces en pacientes con deficiencias inmunitarias. La invencion proporciona una vacuna para la vacunacion rapida de pacientes en riesgo de

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infeccion bacteriana gram-positiva, por ejemplo infecciones por SA, empleando agonistas del receptor tipo Toll 7 (TLR7) y uno o mas antigenos (inmunogenos) de una bacteria gram-positiva. El uso de las vacunas de la invencion induce inmunidad en aproximadamente 6 dfas, lo que permite aplicaciones no susceptibles al protocolo de vacunacion estandar (por ejemplo instalaciones de cuidado para enfermedades agudas).

Tal como se describe aqm, se preparo una composicion que comprende una bacteria gram-positiva, Bacillusanthrads (BA), y un agonista de TLR7 sintetico. La composicion induda la secrecion de IL12 e IL6 (lo que es indicativo de la activacion de macrofagos derivados de medula osea (bonemarrowderivedmacrophages - BMDM)) in vitro y protegfa a ratones contra una posterior provocacion por BA intrapulmonarin vivo, que de lo contrario era letal. En particular, la administracion de una composicion que contema un conjugado de agonista de TLR7 y un inmunogeno (UC-IV199-albumina/esporas de BA irradiadas) indujo una inmunidad protectora frente al BA en un plazo de 6 dfas. En cambio, la inyeccion a los animales con esporas de BA solas, o con BA mas un adyuvante convencional, es decir, toxina del colera (cholera toxin - CT), no protegio los animales frente a una provocacion letal. La rapidez de la respuesta inmune protectora en un animal naive fue inesperada.

Asf, la invencion proporciona una composicion farmaceutica, preferentemente una composicion inmunogena, que comprende el compuesto se acuerdo con la formula

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En una realizacion no reivindicada, una composicion inmunogena de la invencion incluye un agonista de TLR sintetico, tal como un agonista de TLR7, por ejemplo UC-IV199, acoplado a una celula bacteriana gram- positiva, por ejemplo acoplado a los grupos amino libres de un Staphylococcusaureus inactivado; un agonista de TLR sintetico tal como un agonista de TLR7 acoplado a un extracto bacteriano de antfgenos bacterianos gram-positivos aislados; un agonista de TLR sintetico tal como un agonista de TLR7 acoplado a una protema bacteriana gram-positiva aislada, por ejemplo protema recombinante; o un agonista de TLR sintetico tal como un agonista de tLR7 acoplado a carbohidratos bacterianos gram-positivos aislados. Por ejemplo, un agonista de TLR7 sintetico se puede acoplar con carbohidratos bacterianos utilizando metodos para unir polisacaridos de Staphylococcusaureus a soportes protemicos (tales como los utilizados para el toxoide tetanico). La preparacion bacteriana inactivada se puede preparar utilizando irradiacion gamma, calor o tratamiento qmmico. En otra realizacion no reivindicada, una composicion inmunogena de la invencion incluye un agonista de TLR sintetico tal como un agonista de TLR7 acoplado a un adyuvante y una preparacion que comprende celulas bacterianas gram-positivas inactivadas; un agonista de TLR sintetico tal como un agonista de TLR7 acoplado a un adyuvante y una preparacion que comprende un extracto bacteriano gram-positivo; o un agonista de TLR sintetico tal como un agonista de TLR7 acoplado a un adyuvante y una preparacion que comprende un antfgeno bacteriano gram-positivo aislado, por ejemplo protema recombinante. Por ejemplo, la composicion inmunogena puede incluir UC-IV 199 acoplado a albumina y una preparacion con bacterias gram-positivas inactivadas, por ejemploStaphylococcusaureus inactivado. En una realizacion no reivindicada, una composicion inmunogena de la invencion incluye un agonista de TLR7 sintetico acoplado a un adyuvante y una preparacion que comprende un antfgeno bacteriano gram-positivo recombinante, tal como una protema bacteriana gram-positiva aislada o un peptido de la misma, o un carbohidrato bacteriano gram-positivo aislado. En una realizacion, una unica dosis de la composicion inmunogena puede presentar una actividad

muy potente, por ejemplo puede proporcionar inmunidad protectora, en un corto penodo de tiempo, por ejemplo menos de aproximadamente 10 d^as.

En una realizacion se administra una vacuna esterilizada a un sujeto 0 a 7 dfas antes de la hospitalizacion. En una realizacion, la vacuna se administra via intramuscular. En una realizacion, la vacuna se administra en 5 una dosis de entre 10 |jg y 10 mg.

El uso de conjugados de agonistas de TLR sinteticos, tal como agonistas de TLR7, de la invencion resulta ventajoso, ya que su qmmica accesible y versatil permite la conjugacion con cualquier antigeno, y los conjugados modificables tienen una estequiometna definida. La preparacion de los conjugados resulta economica y estos son potentes y proporcionan asf una proteccion rapida, lo que permite su uso en 10 instalaciones de cuidados de enfermedades agudas, como traumatologfa, quemados, precirugfa o bioterrorismo.

De acuerdo con lo anterior, se proporciona un compuesto de la siguiente formula:

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15 El componente macromolecular en los conjugados de la invencion forma un enlace estable con el agonista TLR, esto es el conjugado no actua como un pro-medicamento.

Ademas, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la formula anterior, preferentemente en combinacion con un diluyente o un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

La solicitud incluye el uso del compuesto conjugado segun la formula anterior. El conjugado puede ser util 20 para prevenir, inhibir o tratar afecciones incluyendo, de forma no limitativa, asma alergica, enfermedades infecciosas como infecciones virales respiratorias, por ejemplo las asociadas a una infeccion por el virus de la gripe o el virus respiratorio sincitial (respiratorysyncytial virus - RSV), lupus y otras enfermedades autoinmunes, y como una vacuna, por ejemplo para cancer o enfermedades infecciosas. En un aspecto, una sola dosis del conjugado puede presentar una actividad muy potente para estimular la respuesta inmune. 25 Ademas, debido a la baja toxicidad de los conjugados, en ciertas circunstancias se pueden administrar dosis mas altas, por ejemplo sistemicamente, mientras que en otras circunstancias se pueden administrar dosis mas bajas, por ejemplo debido a la localizacion del conjugado. En unarealizacion, cuando se administran en dosis altas, los conjugados de agonista de TLR sintetico pueden generar una composicion util en la respuesta antagonica y, en consecuencia, pueden ser utiles para inhibir o tratar el asma o enfermedades autoinmunes. 30 Una primera dosis puede provocar una hiper respuesta que, a su vez, suprime la respuesta inmune, evitando asf la inflamacion. Por consiguiente, el uso de dosis mas altas y readministracion puede conducir a una inhibicion de la respuesta inmune.

En una realizacion, la invencion proporciona una composicion para su uso en un metodo para prevenir o inhibir una infeccion bacteriana gram-positiva en un mairnfero.

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La invencion proporciona un compuesto segun la invencion para su uso en una terapia medica (por ejemplo, para la profilaxis de enfermedades bacterianas, como en una vacuna). Estos compuestos tambien pueden ser utilizados para la biodefensa, por ejemplo contra B. anthrax.

Tambien se proporcionala composicion y el compuesto de la invencion para su uso en una terapia medica, por ejemplo para tratar el asma o infecciones virales o para prevenir infecciones virales, asf como el uso de los conjugados para la produccion de un medicamento para el tratamiento de una afeccion o smtoma asociado a TLR o en el que esta indicado un aumento de la respuesta inmune o una supresion de la respuesta inmune.

Ademas, la invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion en combinacion con un diluyente o vehmulo farmaceuticamente aceptable, opcionalmente en combinacion con una preparacion de una bacteria gram-positiva seleccionada, por ejemplo una preparacion inactivada o un extracto, una protema aislada de una bacteria gram-positiva seleccionada o un carbohidrato (polisacarido) aislado de una bacteria gram-positiva seleccionada.

El compuesto conjugado puede optimizar la respuesta inmune y al mismo tiempo limitar los efectos secundarios sistemicos de los agonistas de TLR7.

En una realizacion, la invencion proporciona el compuesto reivindicado para su uso para prevenir o tratar una infeccion bacteriana gram-positiva en un mairnfero, como un humano. El uso incluye la administracion a un marnffero que lo requiera de una cantidad efectiva del compuesto de la invencion o de una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Tambien se proporciona un metodo no reivindicado para identificar conjugados utiles para prevenir, inhibir o tratar una afeccion o smtoma particular, por ejemplo identificando el perfil de citoquina inducido por el conjugado in vitro o in vivo o identificando el endosoma, por ejemplo en un tiempo temprano, medio o tardm, que tiene el TLR para el agonista de TLR. Dado que las diferentes celulas tienen endosomas diferentes, la identificacion de patrones endosomiales en celulas puede permitir dirigir conjugados a tipos de celulas espedficos o mejorar el acceso de los conjugados a los endosomas.

Breve descripcion de las figuras

Las Figuras 1 a 5, 10 a 15, 17 a 25 y 27 se refieren a realizaciones no reivindicadas.

Figura 1: muestra un conjugado de agonista de TLR/alfa-galactosilceramida.

Figura 2: ilustra un conjugado UC-1V150 de G1 PAMAM con un nucleo de etilendiamina.

Figura 3A: ilustra un engarce (SANH) para conjugar una macromolecula y un agonista de TLR

sintetico.

Figura 3B: ilustra la smtesis de UC-1V150.

Figura 3C: ilustra la conjugacion de UC-1V-150 con MSA. Primero se mezclaron 200 pl de MSA (25

mg/ml) con 100 pl de tampon de conjugacion (fosfato 1M, pH = 7,2) y 690 pl de PBS. Luego se anadieron 844 pl de SANH en 10 pl de DMF (exceso molar en un factor 40 con respecto a la MSA) a la solucion de protema (la concentracion final de NP en la mezcla de reaccion es de 5 mg/ml). Despues de agitar la mezcla suavemente, se dejo que la reaccion procediera a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de retirar el exceso de SANH, la mezcla de reaccion se cargo en un dispositivo filtrante rotativo microcon (YM-3, Millipore) y se concentro a aproximadamente 70 pl. Luego se anadieron 460 pg de UC-1V150 disueltos en 10 pl de DMF a MSA modificada con SANH y la mezcla de reaccion se incubo a TA una noche. Para retirar el exceso de UC-1V150, la mezcla de reaccion primero se concentro a 50 pl utilizando un dispositivo filtrante rotativo microcon (YM-3: Millipore) y luego se cargo en una columna micro-spin G25 (GE Healthcare).

Figura 4: una ilustracion grafica del perfil de absorcion (a aproximadamente 350 nm) de un

compuesto de formula I (un conjugado OVA/SANH/UC-1V150).

Figura 5: ilustra el perfil de absorbancia de una reaccion de conjugacion de un agonista de TLR7

sintetico, UC-1V150, con seroalbumina de raton (mouse serumalbumin - MSA). La relacion entre UC-1V150 y MSA es aproximadamente 5:1.

Figura 6: ilustra un conjugado de agonista de TLR/fosfolfpido.

Figura 7: muestra el efecto de la administracion de UC-1V199/lfpido en diferentes dosis y tiempos.

Figura 8A-B: muestra que el UC-1V199/lfpido inhibe las senales de TLR7 y TLR2.

Figura 9: ilustra la dosis-respuesta bifasica a un agonista de TLR7 ultrapotente (un agonista

pico/nanomolar y agonistas micromoleculares).

Figuras 10A y B: muestran que los conjugados de UC-1V150/MSA activan tanto macrofagos derivados de medula osea murina (cuadro A) como celulas mononucleares de sangre periferica humana (cuadro B). Las celulas se incubaron con diversas concentraciones de los conjugados de 0,5 nM a 10 pM con BMDM o de 0,1 a 10 pM con PBMC. Los sobrenadantes de cultivo se

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recogieron despues de 24 horas y los niveles de citoquinas se analizaron mediante Luminex.

Figuras 11A, B y C: ilustran la eficacia in vivo de un conjugado de agonista de TLR7. A ratones C57BL/6 se inyecto (i.v. en la vena caudal) diversas cantidades de UC-1V150 (SM-360320 moldeado

Figura 12:

con aldehndo) o UC-1V150/MSA por raton. Se recogieron muestras de suero y se analizaron los niveles de citoquinas mediante Luminex. El efecto del agonista de TLR7 sintetico no conjugado, SM-360320, solo duro 2 horas, mientras que el efecto de UC-1V150/MSA se prolongo hasta al menos 6 horas. muestra la actividad local in vivo continua de un conjugado de UC-1V150/MSA sin efecto sistemico. Se anestesiaron ratones C57BL/6 y se les administraron (i.t.) 3 nmol de UC- 1V150/MSA. Una vez transcurridos los tiempos indicados, los ratones fueron sacrificados y se recogieron BALF y sueros. Se combinaron los datos de dos experimentos independientes con al menos seis ratones por grupo, Los resultados muestran los valores medios + SEM (standard error of the mean - error estandar de la media).

Figura 13:

muestra la induccion de citoquinas en BMDM mediante conjugados de esporas de antrax irradiadas-agonista de TLR7.

Figura 14:

graficos de supervivencia despues de la inmunizacion de ratones con UC-1V150/MSA y provocacion con esporas. A) a unos ratones A/J hembra emparejados por edad se les administro via i.n. solo solucion salina o solucion salina que contema MSA (una cantidad equivalente a UC-1V150/MSA), UC-1 V 150 o UC-1 V 150/MSA a 0,75 nmol/raton 1 dfa antes de la infeccion por B. anthracis, y se evaluo la supervivencia hasta los 13 dfas. B) a unos ratones Balb/c se les administro via i.n. una solucion salina o UC-1V150/MSA a 5

Figura 15:

nmol/raton 1 dfa antes de la infeccion por el virus de la gripe y se siguio la supervivencia durante 21 dfas. En cada modelo se realizaron curvas de supervivencia Kaplan-Meier y test log-rango para determinar la significancia. En cada grupo se analizaron al menos 8 ratones. grafico del porcentaje de supervivencia despues de una sola dosis de vacuna con agonistas de TLR7 y conjugados.

Figura 16:

muestra que la proteccion contra la exposicion a esporas de antrax depende de las celulas CD4+.

Figura 17:

muestra un perfil de citoquinas local en ratones. A unos ratones C57BL/6 se les administro via i.t. un conjugado de UC-1V150/MSA o UC-1V136 no conjugado en una cantidad de 3 nmol o 500 nmol por raton, respectivamente. Se recogieron BALF y sueros una vez transcurridos los tiempos indicados y los niveles de citoquinas se determinaron mediante inmunoensayo multiplex. Se muestran los valores medios de al menos 3-5 ratones por grupo + SEM.

Figura 18:

ilustra el espectro de absorbancia para la conjugacion directa de partfculas de VIS con UC- 1V150.

Figura 19:

ilustra la induccion de citoquinas en BMDC mediante un conjugado de un agonista de TLR7 sintetico y partmulas virales.

Figuras 20A-B:

ilustran los efectos de un conjugado de UC-1V150/VIS inactivado (cuadro A) o UC- 1V150/OVA/ODN (cuadro B) en la produccion de IL-12. Se incubaron BMDC mieloides durante 24 horas bajo diversas condiciones con 0,1 |jg/ml, tal como se indica. Los niveles de IL-12 en el sobrenadante celular se midieron mediante ELISA.

Figura 21:

una ilustracion grafica de la estimulacion de celulas dendnticas derivadas de medula osea (bonemarrowderiveddendriticcells - BMDC) con OVA/UC-1V150 u OVA/ODN (ODN=oligo- desoxinucleotido).

Figura 22: Figura 23:

una ilustracion del espectro UV de un conjugado doble (OVA/UC-1V150/ODN 1043). una ilustracion de la induccion de IL-12 en BMDC utilizando conjugados de OVA/ODN/UC- 1V150. OVA/1043 y OVA/1018 son conjugados de ODN.

Figura 24:

ilustra la conjugacion de un agonista de TLR sintetico con un componente lipfdico de un liposoma. El autoensamblaje del conjugado de TLR acoplado a traves de un espaciador- engarce con un lfpido C-15 condujo a la formacion de nanopartmulas 100 nM. El agonista de TLR y un ester NHS del lfpido se sometieron a reaccion en cantidades equimolares en DMF y 1 equivalente de trietilamina durante 6 horas. La mezcla de reaccion se purifico preparando HPLC bajo condiciones isocraticas en acetonitrilo/agua 50:50.j

Figura 25:

un esquema de un conjugado de agonista de TLR/liposoma. Los liposomas estan formados por colesterol:DOPE: DSPC:mPEG2000-DSPE:TLR-DSPE:BODIPY-DOPE 30:30:30:5:5:1,5; DSPE= diestearoilfosfatidiletanolamina; DOPE= dioleoilfosfatidiletanolamina; BODIPY= 6-(((4,4-difluor-5-(2-tienil)-4-bora-3a, 4a-diaza-s- indacen-3-il)estiriloxi)acetil)aminohexanamido-DOPE. Colesterol:DOPE: DSPC:DSPE- agonista de TLR:DSPE-mPEG (en relacion molar 1:1:1:0,16:0,16) en cloroformo se recogieron en tubos de cultivo de vidrio de 30 ml, se seco bajo una corriente de nitrogeno gas y se deseco en vacm durante un mmimo de 6 horas para eliminar todo el disolvente organico residual. La pelmula de lfpido seca se hidrato en agua desionizada esteril en un volumen total de 1 ml durante un mmimo de 12 horas. Los liposomas se sometieron a vortice durante 2-3 minutos para eliminar toda la pelmula de lfpido adherida y se sonicaron

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en un sonicador de bano (ULTRAsonik 28X) durante 2-3 minutos a temperatura ambiente para producir vesfculas multilaminares (multilamellarvesicles - MLV). Despues, las MLV se sonicaron con una sonda Ti (utilizando un sonificadorBranson 450 con un ciclo de servicio del 100% y 25 W de potencia de salida) en un bano de hielo y agua durante 1-2 minutos para producir vesfculas unilaminares pequenas (smallunilamellarvesicles - SUV) tal como indicaba la formacion de una solucion translucida clara. La solucion se filtro a presion en secuencia a traves de membranas de policarbonato nucleopore de 200 y despues 100 nm para obtener nanopartfculas de liposoma de 100 nm con un factor de polidispersibilidad inferior a 0,1.

Figura 26: muestra la smtesis de conjugado de lfpido WW-109. Primero se anadieron 0,45 mg (1 pmol)

de IV-199 a 100 pl de una solucion 10 mM de DOPE en cloroformo. A esta solucion se anadio 0,1 mg de trietilamina de una reserva en cloroformo. La mezcla se sometio a reaccion a temperatura ambiente durante 24 horas y el cloroformo se trato en el rotavapor. El residuo solido blanco se lavo tres veces en 60%/metanol/hexano y se centrifugo para obtener un solido blanco. La m/z en el espectro de masas era de 1086 y el compuesto tema una absorcion UV max a 268 nm. Se pueden utilizar fracciones de acido graso con diversas longitudes de cadena para preparar compuestos analogos, incluyendo acidos carboxflicos(C-i4-C22) con uno, dos, tres o cuatro sitios de insaturacion, epoxidacion, hidroxilacion, o una combinacion de los mismos, en cualquier lugar posible de la cadena de carbonos del acido carboxflico. En una realizacion espedfica, las fracciones de acido graso son acidos carboxflicos C17 con un sitio de insaturacion en Ca-Cg. En otra realizacion espedfica, las fracciones de acido graso son acidos carboxflicos C18 con un sitio de insaturacion en C9-C10. Las fracciones de acido carboxflico de cada fraccion de acido graso pueden ser iguales o pueden ser diferentes (vease, por ejemplo, la Figura 6).

Figura 27: un esquema de una partfcula de sflice con agonistas de TLR enlazados de forma covalente

a la misma.

Figura 28: ejemplos de compuestos para preparar conjugados de la invencion o para su uso en los

metodos de la invencion. Otros conjugados incluyen agonistas de TLR acoplados con seroalbumina humana, por ejemplo HSA/UC-1V150 o DOPE/UC-1 V199. El UC-1X-51 aumenta los niveles de TNF-alfa al triple (110 ng/ml).

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

Tal como se utiliza aqrn, el termino "anticuerpo" se refiere a una protema que tiene uno o mas polipeptidos codificados esencialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la region constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, asf como el sinnumero de genes de region variable de la inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o como lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, que definen a su vez las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Es sabido que la unidad estructural (anticuerpo) de una inmunoglobulina basica comprende un tetramero. Cada tetramero esta compuesto por dos pares identicos de cadenas de polipeptido, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos, que es la principal responsable del reconocimiento antigenico. Los conceptos "cadena ligera variable" (Vl) y "cadena pesada variable" (Vh) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente.

Los anticuerpos pueden existir como inmunoglobulinas intactas o como modificaciones de diversas formas, incluyendo, por ejemplo, FabFc2, Fab, Fv, Fd, (Fab')2, un fragmento Fv que solo contiene las regiones variables de cadena ligera y pesada, un fragmento Fab o (Fab)'2 que contiene las regiones variables y partes de las regiones constantes, un anticuerpo de cadena simple, por ejemplo anticuerpos scFv, injertados con CDR, y similares. La cadena pesada y la cadena ligera de un Fv se pueden derivar del mismo anticuerpo o de diferentes anticuerpos, produciendo asf una region Fv quimerica. El anticuerpo puede ser de origen animal (especialmente raton o rata) o humano, o puede ser quimerico o humanizado. Tal como se utiliza aqrn, el termino "anticuerpo" incluye estas formas diversas.

Una composicion que consiste "esencialmente por completo" en un compuesto particular o en una forma particular de un compuesto (por ejemplo un isomero) es una composicion comprende al menos aproximadamente un 90%, y preferentemente al menos aproximadamente un 95%, 99% y 99,9%, de la composicion particular, con respecto al peso. Una composicion comprende una "mezcla" de compuestos o formas del mismo compuesto cuando cada compuesto (por ejemplo isomero) representa al menos aproximadamente un 10% de la composicion, con respecto al peso. Un analogo de purina de la invencion o un conjugado del mismo se puede preparar como una sal de acido o de base, asf como en formas de acido o

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base libres. En solucion, determinados compuestos de la invencion pueden estar presentes como zwitteriones, siendo proporcionados contraiones por las propias moleculas de disolvente o por otros iones disueltos o suspendidos en el disolvente.

Tal como se utiliza aqm, el termino "aislado" se refiere a una preparacion in vitro, al aislamiento o purificacion de una molecula de acido nucleico, un peptido o protema u otra molecula que no esta asociada a sustancias in vivo o esta presente en una forma diferente a la encontrada en la naturaleza. Por consiguiente, el termino "aislado", cuando se utiliza en relacion con un acido nucleico, como en "oligonucleotido aislado" o "polinucleotido aislado", se refiere a una secuencia de acido nucleico que esta identificada y separada de al menos un contaminante con el que esta asociada normalmente en su origen. El acido nucleico aislado esta presente en una forma o composicion que es diferente a la hallada en la naturaleza. En cambio, los acidos nucleicos no aislados (por ejemplo aDn y ARN) se encuentran en el estado en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de ADN dada (por ejemplo un gen) se encuentra en el cromosoma de la celula huesped cerca de genes proximos; algunas secuencias de ARN (por ejemplo una secuencia de ARNm espedfica codificadora de una protema espedfica), se encuentran en la celula en forma de una mezcla con otros numerosos ARNm que codifican una multitud de protemas. Por tanto, con respecto a una "molecula de acido nucleico aislada", que incluye un polinucleotido de origen genomico, ADNc o sintetico o alguna combinacion de estos, la "molecula de acido nucleico aislada" (1) no esta asociada con todo o con parte del polinucleotido en el que la "molecula de acido nucleico aislada" se encuentra en la naturaleza, (2) esta unida operativamente a un polinucleotido al que no esta unida en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia mas grande. La molecula de acido nucleico aislada puede estar presente en una forma monocatenaria o bicatenaria. Cuando se va a utilizar una molecula de acido nucleico para expresar una protema, el acido nucleico contiene al menos la cadena sentido o codificadora (es decir, el acido nucleico puede ser monocatenario), pero puede contener tanto la cadena sentido como la cadena antisentido (es decir, el acido nucleico puede ser bicatenario).

Tal como se utiliza aqm, el termino "aminoacido" comprende residuos de aminoacidos naturales (por ejemplo, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Hyl, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val) en forma D o L, asf como aminoacidos no naturales (por ejemplo fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato; acido hipurico, acido octahidroindol-2-carboxflico, estatina, acido 1,2,3,4,-tetrahidroisoquinolina-3-carboxflico, penicilamina, ornitina, citrulina, metilalanina, para- benzoilfenilalanina, fenilglicina, propargilglicina, sarcosina y terc-butilglicina). El termino tambien incluye aminoacidos naturales y no naturales que portan un grupo protector amino convencional (por ejemplo acetilo o benciloxicarbonilo), asf como aminoacidos naturales y no naturales protegidos en el extremo carboxi (por ejemplo como un alquil(Ci-C6), fenil o bencil ester o amida; o como una metilbencilamida). Los expertos en la tecnica conocen otros grupos protectores amino y carboxi adecuados (vease, por ejemplo, T.W. Greene, ProtectingGroups In OrganicSynthesis; Wiley: Nueva York, 1981, y referencias citadas en dicho documento). Por ejemplo, un aminoacido puede estar unido a la parte restante de un compuesto de formula I por el extremo carboxi, por el extremo amino o por cualquier otro punto de union conveniente, por ejemplo por el azufre de la cistema.

El concepto "receptor tipo Toll" (toll-like receptor TLR) se refiere a un miembro de una familia de receptores que se unen a patrones moleculares asociados a patogenos (pathogenassociated molecular patterns - PAMP) y facilitan una respuesta inmune en un mairnfero. Se conocen diez TLR de mairnfero, por ejemplo TLR1-10.

El concepto "agonista de receptor tipo Toll" (agonista de TLR) se refiere a una molecula que se une a un TLR. Los agonistas de TLR sinteticos son compuestos qmmicos que estan disenados para que se unan a un TLR y activen el receptor. Los ejemplos de agonistas de TLR sinteticos que se proporcionan aqm incluyen "agonista de TLR-7", "agonista de TLR", "agonista de TLR-3" y "agonista de TLR-9". Los agonistas de TLR incluyen imiquimod, resiquimod, broprimina y loxoribina.

Tal como se utiliza aqm, el concepto "acido nucleico" se refiere a ADN, ARN, motivos de hibridacion monocatenarios, bicatenarios o con mayor agregacion y cualquier modificacion qmmica de los mismos. Las modificaciones incluyen, de forma no exclusiva, aquellas que proporcionan grupos qmmicos que incorporan carga adicional, polarizabilidad, enlaces de hidrogeno, interaccion electrostatica y fluxionalidad a las bases de ligando de acido nucleico o al ligando de acido nucleico en conjunto. Estas modificaciones incluyen, de forma no exclusiva, acidos nucleicos de peptido (peptidenucleicacid - PNA), modificaciones de grupo fosfodiester (por ejemplo fosforotioatos, metilfosfonatos), modificaciones de azucar en posicion 2', modificaciones de pirimidina en posicion 5, modificaciones de purina en posicion 7, modificaciones de purina en posicion 8, modificaciones de purina en posicion 9, modificaciones en aminas exodclicas, sustitucion de 4-tiouridina, sustitucion de 5-bromo- o 5-yodo-uracilo; modificaciones de esqueleto, metilaciones, combinaciones inusuales de emparejamiento de bases tales como isobases, isocitidina e isoguanidina y similares. Los acidos nucleicos tambien pueden incluir bases no naturales, por ejemplo nitroindol. Las modificaciones tambien pueden incluir modificaciones 3' y 5' tales como formacion de caperuza con un BHQ, un fluoroforo u otra fraccion.

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Tal como se utiliza aqrn, el concepto "sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos descritos en los que el compuesto primario se modifica produciendo un acido o una base con el mismo. Ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables incluyen, de forma no exclusiva, sales de acidos inorganicos u organicos de residuos basicos tales como aminas; sales alcalinas u organicas de residuos acidos tales como acidos carboxflicos; y similares. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales no toxicas convencionales o sales de amonio cuaternario del compuesto primario formado, por ejemplo, a partir de acidos inorganicos u organicos no toxicos. Por ejemplo, dichas sales no toxicas convencionales incluyen las derivadas de acidos inorganicos tales como los acidos clorddrico, bromlddrico, sulfurico, sulfamico, fosforico, mtrico y similares; y las sales preparadas a partir de acidos organicos tales como los acidos acetico, propionico, sucdnico, glicolico, estearico, lactico, malico, tartarico, dtrico, ascorbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacetico, glutamico, benzoico, salidlico, sulfamlico, 2-acetoxibenzoico, fumarico, toluensulfonico, metanosulfonico, etanodisulfonico, oxalico, isetionico y similares.

Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos utiles en la presente invencion se pueden sintetizar a partir del compuesto primario, que contiene una fraccion basica o acida, mediante metodos qmmicos convencionales. En general, dichas sales se pueden preparar sometiendo a reaccion las formas de acido o base libres de estos compuestos con una cantidad estequiometrica de la base o el acido apropiado, en agua o en un disolvente organico o en una mezcla de ambos; en general son preferentes medios no acuosos, como eter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. En Remington'sPharmaceuticalSciences, 17 edicion, Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985), cuya descripcion se incorpora aqrn por referencia, se pueden encontrar listas de sales adecuadas.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" se emplea aqrn para hacer referencia a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificacion que, dentro del ambito del buen juicio medico, son adecuados para ser utilizados en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una toxicidad, irritacion o respuesta alergica excesiva, ni otro problema o complicacion en proporcion a una relacion razonable de beneficio/riesgo.

A no ser que se describa de otro modo, se utilizan las siguientes definiciones: halo o halogeno es fluor, cloro, bromo o yodo. Alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, etc. indican tanto grupos de cadena lineal como grupos de cadena ramificada. Sin embargo, la referencia a un grupo individual tal como "propilo" abarca unicamente el grupo de cadena lineal, mientras que para indicar un isomero de cadena ramificada, tal como "isopropilo", se hace referencia espedfica al mismo. El termino "arilo" indica un grupo fenilo o un grupo carbodclicobidclico orto-fusionado que tiene aproximadamente de nueve a diez atomos en el anillo, siendo al menos un anillo aromatico. El termino "het" puede ser heteroarilo, que incluye un grupo unido a traves de un carbono de un anillo aromatico monodclico de cinco o seis atomos de anillo consistentes en carbono y uno a cuatro heteroatomos seleccionados en cada caso de entre el grupo consistente en oxfgeno no peroxido, azufre y N(X), faltando X o siendo X igual a H, O, alquilo(C-i-C4), fenilo o bencilo, asf como un grupo de un heterociclo bidclico orto-fusionado de aproximadamente ocho a diez atomos de anillo derivado del mismo, en particular uno derivado de benzo o uno derivado fusionando un dirradicalpropileno, trimetileno o tetrametileno con el mismo.

Los especialistas en la tecnica entenderan que pueden existir compuestos de la invencion con un centro quiral que se pueden aislar en formas opticamente activas y racemicas. Algunos compuestos pueden presentar polimorfismo. Se ha de entender que la presente invencion incluye cualquier forma racemica, opticamente activa, polimorfica o estereoisomerica de un compuesto de la invencion, o mezclas de las mismas, que posea las propiedades utiles aqrn descritas, sabiendose en la tecnica como preparar formas opticamente activas (por ejemplo, mediante resolucion de la forma racemica por tecnicas de recristalizacion, smtesis de materiales de partida opticamente activos, smtesis quiral o por separacion cromatografica utilizando una fase estacionaria quiral) y como determinar la actividad de agonista utilizando las pruebas estandar aqrn descritas; o utilizando otras pruebas similares bien conocidas en la tecnica. Los especialistas en la tecnica tambien entenderan que los compuestos aqrn descritos incluyen sus diversos tautomeros, que pueden existir en diversos estados de equilibrio entre sf.

Una "cantidad terapeuticamente eficaz" incluye una cantidad de un compuesto util de la presente invencion o una cantidad de la combinacion de compuestos reivindicados, por ejemplo para tratar o prevenir la enfermedad o afeccion, o para tratar los smtomas de la enfermedad o afeccion, en un huesped. Tal como se utiliza aqrn, los terminos "tratamiento" o "tratar" incluyen (i) evitar que se produzca una condicion patologica (por ejemplo profilaxis); (ii) inhibir la condicion patologica o detener su desarrollo; (iii) aliviar la condicion patologica; y/o disminuir los smtomas asociados a la condicion patologica.

Tal como se utiliza aqrn, el termino "paciente" se refiere a organismos a tratar con los metodos de la presente invencion. Estos organismos incluyen, de forma no exclusiva, mamfferos, tales como humanos. En el contexto de la invencion, el termino "sujeto" se refiere en general a un individuo que va a recibir o que ha recibido tratamiento (por ejemplo, la administracion de un compuesto de la invencion).

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Las expresiones "compuesto estable" o "estructura estable" se utilizan para indicar un compuesto que es suficientemente robusto para soportar el aislamiento hasta un grado de pureza util de una mezcla de reaccion, y la formulacion en un agente terapeutico eficaz. La presente invencion unicamente tiene en cuenta compuestos estables.

Agonistas de TLR y conjugados de la invencion y usos de los mismos

En una realizacion, la solicitud proporcina el compuesto de la invencion para la prevencion o el tratamiento de una afeccion o smtoma patologico en un mairnfero, como un humano, en el que interviene la actividad de un agonista de TLR cuya accion se desea. El uso incluye la administracion a un mamffero que lo necesite de una cantidad efectiva del compuesto de la invencion o de una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Ejemplos no limitativos de afecciones o smtomas patologicos que son adecuados para el tratamiento incluyen canceres, enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal, cerebro, piel, articulaciones y otros tejidos, enfermedades bacterianas o virales, enfermedades autoinmunes y el tratamiento de la enfermedad de Crohn. Los compuestos de la invencion tambien pueden ser utilizados para preparar vacunas contra bacterias, virus, celulas cancerosas o peptidos espedficos de cancer, o para aumentar anticuerpos monoclonales anticancerosos, como estimulante del SNC o para la biodefensa. Asf, la invencionproporciona un compuesto de la invencion para su uso en la terapia medica (por ejemplo como agente anticanceroso, para tratar enfermedades antibacterianas, virales, como la hepatitis C y la hepatitis B, para tratar la enfermedad de Crohn, y en general como agente terapeutico para tratar enfermedades inmunologicas). Ademas, los compuestos de la invencion pueden prevenir la carcinogenesis, por ejemplo por virus de la hepatitis C y la hepatitis B, y pueden ser utilizados para la fabricacion de un medicamento util para el tratamiento del cancer, infecciones virales o bacterianas, enfermedad de Crohn y trastornos inmunologicos en un mamffero, tal como un humano.

En un aspecto, la presente solicitud describe un uso para tratar una infeccion viral en un mamffero mediante la administracion de un conjugado de agonista de TLR de la invencion. La infeccion viral puede estar causada por un ARN-virus, un producto del ARN-virus que actua como agonista de TLR y/o un ADN-virus. Un ejemplo de un ADN-virus es el virus de la hepatitis B. En un ejemplo, la infeccion viral esta causada por un coronavirus que provoca Smdrome Respiratorio Agudo Grave (SRAG), un virus de la hepatitis B o un virus de la hepatitis C.

En unarealizacion, la presente invencionproporcionael compuesto de la invencion para su uso en el tratamientodel cancer mediante la administracion de una cantidad efectiva del conjugado de agonista de TLR de la invencion. El cancer puede ser un cancer sensible al interferon, por ejemplo leucemia, linfoma, mieloma, melanoma o cancer renal. Los canceres espedficos que pueden ser tratados incluyen melanoma, cancer superficial de vejiga, queratosis actmicas, neoplasia intraepitelial y carcinoma de piel de celulas basales, escamoso y similares. Ademas, el metodo de la invencion incluye el tratamiento de una afeccion precancerosa, por ejemplo queratosis actmicas o neoplasia intraepitelial, poliposis familiar (polipos), displasia cervical, canceres cervicales, cancer superficial de vejiga y cualquier otro cancer asociado a infeccion (por ejemplo linfoma sarcoma de Karposi o leucemia); y similares.

En otrarealizacion, la presente invencion proporcionael compuesto segun la invencion para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz del conjugado de agonista de TLR de la invencion o de una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Enfermedades autoinmunes son, por ejemplo, esclerosis multiple, lupus, artritis reumatoide y similares.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona el compuesto de la invencion para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Crohn mediante la administracion del conjugado de agonista de TLR de la invencion.

En una realizacion no reivindicada, el conjugado de agonista de TLR puede incluir un polfmero de agonista de TLR homofuncional, por ejemplo formado a partir de un agonista de TLR7 o un agonista de TLR3. El agonista de TLR7 puede ser una fraccion 7-tia-8-oxoguanosinil (TOG), una fraccion 7-desazaguanosinil (7DG), una fraccion resiquimod o una fraccion imiquimod. En otra realizacion no reivindicada, el conjugado de agonista de TLR puede incluir un polfmero de agonista de TLR heterofuncional. El polfmero de agonista de TLR heterofuncional puede incluir un agonista de TLR7 y un agonista de TLR3 o un agonista de TLR9 o los tres agonistas. El polfmero de agonista de TLR heterofuncional puede incluir un agonista de TLR8 y un agonista de TLR9.

En un aspecto no reivindicado, la invencion incluye la conjugacion covalente de un agonista de TLR sintetico con macromoleculas para obtener, por ejemplo, una forma, un tamano y una valencia molecular deseados con el fin de optimizar las propiedades inmunologicas del conjugado resultante y/o de dirigir o suministrar el conjugado a celulas y tejidos deseados. Tal como se describe aqm, el conjugado esta disenado para ser util en una variedad de aplicaciones medicas, incluyendo, de forma no exclusiva, asma alergica, infecciones

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virales respiratorias (gripe y RSV), lupus y otras enfermedades autoinmunes, y como combinaciones antigeno-adyuvante para vacunas contra el cancer y enfermedades infecciosas. El conjugadoproporciona una respuesta inmune optima limitando al mismo tiempo efectos secundarios sistemicos no deseables, ligando el activador inmune (el agonista de TLR sintetico) a una macromolecula mediante un enlace covalente fuerte. La macromolecula puede servir como una entidad de fijacion de objetivo y/o como una parte integral de la respuesta inmune, como el antigeno en un conjugado adyuvante-antigeno. Una ventaja principal de la administracion del conjugado estable en un entorno localizado es que, con el tiempo, solo se liberan cantidades muy pequenas de agonista de TLR en el entorno sistemico.

En una realizacion no reivindicada, la macromolecula se selecciona de productos, como protemas, lfpidos o dendnmeros, o de polfmeros que tienen grupos amino en sus superficies, como "amino perlas” de poliestireno, que tienen en cada caso grupos amino primarios disponibles para la conjugacion con un engarce tal como SANH, o para la conjugacion directa con el agonista de TLR7 sintetico. Por ejemplo, despues de la conjugacion del engarce y la macromolecula, el agonista de TLR7, tal como UC-1V150, se somete a reaccion con el ester NHS del conjugado de SANH-macromolecula para obtener un conjugado de agonista de TLR7- SANH-macromolecula.

En general, en las instalaciones de cuidado para enfermedades agudas no se utilizan vacunas porque (1) tardan demasiado en actuar y (2) no son eficaces en pacientes con deficiencias inmunitarias. Por ejemplo, las infecciones por Staphylococcusaureus (SA) son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes hospitalizados. Los grupos que presentan un riesgo particular son aquellos con inmunosupresion debida a quemaduras, traumatismos, colocacion de cateteres, dialisis o edad avanzada en residencias. Ademas, muchas cepas de SA adquirido en hospitales son resistentes a los antibioticos convencionales.

La presente invencion supera estas dos barreras al tratamiento. Aqu se proporciona el uso de composiciones incluyendo el compuesto reivindicado. En general, los ligandos de TLR7 tienen mala farmacocinetica y una rapida absorcion y excrecion sistemica. Debido a la dispersion sistemica, resultan en smdrome de citoquinas. Los adyuvantes efectivos han de crear un "gradiente inmune" de citoquinas y quimioquinas. En una realizacion, la conjugacion de un agonista de TLR7 sintetico potente con una macromolecula aumenta las propiedades de suministro, mejora la farmacocinetica y evita la toxicidad sistemica por exposicion localizada.

En una realizacion no reivindicada, la invencion proporciona un metodo para prevenir o inhibir una infeccion bacteriana gram-positiva en un mairnfero, que incluye la administracion al marnffero de una cantidad efectiva de una composicion que comprende un antfgeno bacteriano de una bacteria gram-positiva y una cantidad de un agonista de TLR7 sintetico. En otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para prevenir o inhibir una infeccion bacteriana gram-positiva en un mamffero, que incluye la administracion al mamffero de una cantidad efectiva del compuesto reivindicado. Por ejemplo, un conjugado de 1V150-MSA (no reivindicado) mantiene su actividad de agonista de TLR7, tiene una mayor potencia y una toxicidad reducida, provoca la activacion local de la inmunidad innata e induce una proteccion inmune dependiente de celulas T en un plazo de 6 dfas despues de una unica vacunacion con un antfgeno bacteriano.

En una realizacion no reivindicada, se administra un agonista de TLR7 sintetico junto con uno o mas antfgenos de S. aureus o conjugado con estos. La Tabla 1 proporciona ejemplos de antigenos para S. aureus utiles con agonistas de TLR7 sinteticos, en particular en instalaciones de cuidado para enfermedades agudas. Inesperadamente, las vacunas de la invencion pueden proporcionar una respuesta inmune rapida y efectiva.

_________________________Tabla 1

Inmunogenos de Staphylococcusaureus

Arma______________________________

Toxina exfoliativa B

Toxina exfoliativa A

Toxina de smdrome de shock toxico

Enterotoxina A-E, H-U

Protema de union de sialoprotema osea

Protema de union de colageno

Factor aglutinante A

Factor aglutinante B

a-hemolisina

y-hemolisina

Protema A

Factor aglutinante A

Protema de union de fibronectina A

Protema de union de fibronectina B

Protema de union de colageno

Acido lipoteicoico

Peptidoglicano

Protema A

Protema de union de fibronectina B a-hemolisina

Leucocidina de Panton-Valentine Protema de union de colageno Acido lipoteicoico Peptidoglicano Polisacarido capsular Factor aglutinante A Protema A

Protemas de union de fibronectina

En una realizacion no reivindicada, la invencion proporciona los siguientes conjugados

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5 un compuesto de formula (II) un compuesto de formula (III)

Tiazolopirimidinas Purinas

X1 = -O-, -S-, o NRc-; siendo Rc hidrogeno, alquilo(C-Mo) o alquilo(Ci-io) sustituido con cicloalquilo(C3-6), o Rc y R1, junto con el atomo de nitrogeno, pueden formar un anillo heterodclico sustituido o no sustituido, siendo los sustituyentes hidroxilo, alquilo(Ci-6), hidroxialquileno( Ci-a), alcoxi(Ci-6), alcoxi(C1-a)alquileno(C1-a) o ciano;

10 siendo R1 alquilo(Ci-Cio), alquilo(Ci-Cio) sustituido, arilo(Ca-io) o arilo(Ca-io) sustituido, heterociclilo(C5-g), heterciclilo(C5-g) sustituido; siendo los sustituyentes para los grupos alquilo, arilo o heterodclicos hidroxilo, alquilo(Ci-a), hidroxialquileno(Ci-a), alcoxi(Ci-a), alcoxi(Ci_a)alquileno(Ci_a), amino, ciano, halogeno o arilo;

cada R2 es, independientemente, hidrogeno, -OH, alquilo(Ci-Ca), alquilo(Ci-Ca) sustituido, alcoxi(Ci-Ca), alcoxi(Ci-Ca) sustituido, -C(O)-alquilo(Ci-Ca) (alcanoMo), -C(O)-alquilo(Ci-Ca) sustituido, -C(O)-arilo(Ca-Cio) 15 (aroMo), -C(O)-arilo(Ca-Cio) sustituido, -C(O)OH (carboxilo), -C(O)Oalquilo(Ci-Ca) (alcoxi-carbonilo),

-C(O)Oalquilo(Ci-Ca) sustituido, -NRaRb, -C(O)NRaRb (carbamoflo), -O-C(O)NRaRb, -alquilen(Ci-Ca)-NRaRb, - alquilen(Ci-Ca)-C(O)NRaRb, halo, nitro o ciano;

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cada Ra y Rb es, independientemente, hidrogeno, alquilo(Ci-C6), cicloalquilo(C3-C8), alcoxi(Ci-C6), haloalquilo(Ci-C6), cicloalquil(C3-C8)alquilo(Ci-C6), alcanoMo(C-i-Ca), hidroxialquilo(Ci-C6), arilo, arilalquilo(Ci- Ca), Het, Het-alquilo(C1-C6) o alcoxicarbonilo(C-i-Ca); siendo X2 un enlace o un grupo enlazante;

R3 es una macromolecula; n es 1,2, 3, o 4; m es 1 o 2; q tiene un valor de 1 a 1.000, 104, 105, 10a o mas; o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos. Los grupos macromoleculares pueden incluir moleculas organicas compuestas por carbono, oxfgeno, hidrogeno, nitrogeno, azufre, fosforo o combinaciones de estos, que no son nocivas para los tejidos corporales (por ejemplo no son toxicos y/o no provocan inflamacion), y pueden incluir, de forma no exclusiva, dendnmeros, protemas, peptidos, Kpidos y sus formulaciones (por ejemplo nanopartmulas de liposomas), con o sin engarces (grupos X2), y polfmeros aminomodificados, como granulos de poliestireno, asf como a-galactosilceramidas (vease la Figura 1).

Los compuestos se pueden preparar utilizando los compuestos de formula (IA-1):

donde X2 es un grupo que puede reaccionar para formar un grupo espedfico de compuestos, por ejemplo los dados a conocer en la Patente US 6.329.381 (Kurimoto y col.), o formar un enlace con un grupo de enlace o reaccionar para formar un enlace con una macromolecula, y las variables restantes son tal como se definen mas arriba en relacion con la formula (IA). Ejemplos no limitativos de macromoleculas incluyen macromoleculas con cadenas laterales que aumentan la solubilidad, por ejemplo grupos que contienen anillos morfolino, piperidino, pirrolidino o piperazino y similares; aminoacidos, polfmeros de aminoacidos (protemas o peptidos), por ejemplo dipeptidos o tripeptidos y similares; carbohidratos (polisacaridos), nucleotidos tales como, por ejemplo, PNA, ARN y ADN y similares; polfmeros de materiales organicos, por ejemplo polietilenglicol, polilactida y similares; lfpidos monomericos y polimericos; nanopartmulas organicas insolubles; sustancias corporales no toxicas, por ejemplo celulas, lfpidos, vitaminas, cofactores, antfgenos, por ejemplo microbios, por ejemplo virus, bacterias, hongos y similares. Los antfgenos pueden incluir organismos completos inactivados o subcomponentes de los mismos, por ejemplo celulas y similares.

En una realizacion no reivindicada, un compuesto de la invencion tiene la formula (IC):

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(IA-l)

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(R2)n

(IC)

donde

X es N o CRx, con Rx hidrogeno, halogeno, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido o heteroalquilo no sustituido;

Y es S o N;

las lmeas discontinuas (------) indican enlaces opcionales; y

cuando el enlace entre Y y el carbono marcado con un asterisco es un enlace doble, Q2 no esta presente;

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cuando el enlace entre Q1 y el carbono marcado con un asterisco es un enlace doble, Q1 es O, S, NY1, o NNY2Y3; y

cuando el enlace entre Q1 y el carbono marcado con un asterisco es un enlace simple, Q1 es hidrogeno,

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ciano, nitro, O-Y , S-Y , NY Y , o NY NY Y ; donde Y es hidrogeno, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, cicloalquilo sustituido, cicloalquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, -C(=O)-alquilo sustituido, - C(=O)-alquilo no sustituido, -C(=O)O-alquilo sustituido, - C(=O)O-alquilo no sustituido, ciano, nitro, hidroxilo u

O-Y2;

Y2, Y3, e Y4 son en cada caso independientemente hidrogeno, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido;

Z es O, S, o NY5, siendo Y5 hidrogeno, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido;

Q2 y Q3 son en cada caso independientemente hidrogeno, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido;

X1 es -O-, -S-, o -NRc-;

Rc es hidrogeno, alquilo(C1-1o) o alquilo(C1-1o) sustituido, o Rc y R1, junto con el atomo de nitrogeno,

pueden formar un anillo heterodclico o un anillo heterodclico sustituido;

R1 es hidrogeno, alquilo(C1-C1o), alquilo(C1-C1o) sustituido, arilo(C6-1o) o arilo(C6-1o) sustituido o un anillo

heterodclico(C5-9) o heterodclico(C5-9) sustituido;

cada R2 es, independientemente, hidrogeno, -OH, alquilo(C1-C6), alquilo(C1-C6) sustituido, alcoxi(C1-C6), alcoxi(C1-C6) sustituido, -C(O)-alquilo(C1-C6) (alcanoMo), -C(O)-alquilo(C1-C6) sustituido, -C(O)-arilo(C6-C1o) (aroMo), -c(O)-arilo(C6-C1o) sustituido, -C(O)OH (carboxilo), -C(O)Oalquilo(C1-C6) (alcoxicarbonilo), - C(O)Oalquilo(C1-Ca) sustituido, -NRaRb, -C(O)NRaRb (carbamoflo), -O-C(O)NRaRb, -alquilen(C1-Ca)-NRaRb, - alquilen(C1-C6)-C(O)NRaRb, halo, nitro o ciano;

cada Ra y Rb es, independientemente, hidrogeno, alquilo(C1-C6), cicloalquilo(C3-C8), heteroalquilo(C1-C6), alcoxi(C1-C6), haloalquilo(C1-C6), cicloalquil(C3-C8)alquilo(C1-C6), alcanoflo(CrC6), hidroxialquilo(C1-C6), arilo, arilalquilo(C1-C6), Het, Het-alquilo(C1-C6) o alcoxicarbonilo(C1-C6);

siendo los sustituyentes para cualquiera de los grupos alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, amino, alcoxi, alcanoflo, arilo, heteroarilo o heterodclico uno o mas (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6) de entre hidroxilo, alquilo(C1-6), hidroxialquileno(C1-6), alcoxi(C1-6), cicloalquilo(C3-6), alcoxi(C1-6)alquileno(C1-6), amino, ciano, halogeno, heterociclo (como piperidinilo o morfolinilo) o arilo;

X2 es un enlace o un grupo enlazante;

k es 0, 1, 2, 3 o 4;

n es 0, 1, 2, 3 o 4; y

R3 es una macromolecula que incluye una celula, virus, vitamina, cofactor, peptido, protema, molecula

de acido nucleico, lfpido, granulo o partfcula, como un granulo de poliestireno o nanopartfculas, o un dendnmero;

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, incluyendo sus hidratos.

En determinadas realizaciones no reivindicadas, los grupos X2-R3 pueden formar un engarce con una segunda fraccion de la formula (IC), formando un dfmero. Por ejemplo, el engarce puede ser cualquier engarce aqrn descrito, como un arilo o heteroarilo divalente, bis-amida arilo, bis-amida heteroarilo, bis- hidrazida arilo, bis- hidrazidaheteroarilo, o similares. Alternativamente, Q1 puede formar un engarce con una segunda fraccion de la formula (IC), formando un dfmero mediante un enlace disulfuro. Vease por ejemplo la Figura 28.

Cuando los compuestos son lo suficientemente basicos o acidos para formar sales de acido o base, puede resultar apropiado utilizar los compuestos en forma de sales. Ejemplos de sales aceptables son sales de adicion de acidos organicos formadas con acidos que forman un anion fisiologicamente aceptable, por

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ejemplo tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, a- cetoglutarato y a-glicerofosfato. Tambien se pueden formar sales inorganicas adecuadas, incluyendo sales clorhidrato, sulfato, nitrato, bicarbonato y carbonato.

Se pueden obtener sales aceptables utilizando procedimientos estandar bien conocidos en la tecnica, por ejemplo sometiendo a reaccion un compuesto suficientemente basico, como una amina, con un acido adecuado que aporte un anion fisiologicamente aceptable. Tambien se pueden preparar sales de metales alcalinos (por ejemplo de sodio, potasio o litio) o de metales alcalinoterreos (por ejemplo de calcio) de acidos carboxflicos.

El termino "alquilo" incluye grupos alquilo(Ci-io) lineales o ramificados, por ejemplo metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, 1-metilpropilo, 3-metilbutilo, hexilo y similares.

El concepto "alquilo inferior" incluye grupos alquilo(Ci-6) lineales o ramificados, por ejemplo metilo, etilo, propilo, 1 -metiletilo, butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1 -dimetiletilo, pentilo, 1 -metilbutilo, 2-metilbutilo, 3- metilbutilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 2,2-dimetilpropilo y similares.

El termino "alquileno" se refiere a una cadena de hidrocarburo divalente lineal o ramificada (por ejemplo etileno: -CH2-CH2).

Un cicloalquilo(C3-7) incluye grupos tales como ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares, y un grupo cicloalquilo(C3-7) sustituido con alquilo preferentemente con un grupo alquilo(C1-6) lineal o ramificado tal como metilo, etilo, propilo, butilo o pentilo, y un grupo cicloalquilo(C5-7) tal como ciclopentilo o ciclohexilo y similares.

El concepto "alcoxi inferior" incluye grupos alcoxi(C1-6), como metoxi, etoxi o propoxi y similares.

El concepto "alcanoflo inferior" incluye grupos alcanoflo(C1_6), como formilo, acetilo, propanoflo, butanoflo, pentanoflo o hexanoflo y similares.

Un aroflo(C7-11) incluye grupos tales como benzoflo o naftoflo.

El concepto "alcoxicarbonilo inferior" incluye grupos alcoxicarbonilo(C2-7) como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo o propoxicarbonilo y similares.

El concepto "grupo alquilamino inferior" significa un grupo amino sustituido con un grupo alquilo(C1-6), como metilamino, etilamino, propilamino, butilamino y similares.

El concepto "grupo di(alquilo inferior)amino" significa un grupo amino sustituido con el mismo o diferente grupo alquilo(C1-6) (por ejemplo dimetilamino, dietilamino, etilmetilamino).

El concepto "grupo alquilcarbamoflo inferior" significa un grupo carbamoflo sustituido con un grupo alquilo(C1- 6) (por ejemplometilcarbamoflo, etilcarbamoflo, propilcarbamoflo, butilcarbamoMo).

El concepto "grupo di(alquilcarbamoflo) inferior significa un grupo carbamoflo sustituido por el mismo o diferente grupo alquilo(C1-6) (por ejemplodimetilcarbamoflo, dietilcarbamoMo, etilmetilcarbamoflo).

El concepto "atomo halogeno" significa un atomo halogeno, como un atomo de fluor, de cloro, de bromo o de yodo.

El termino "arilo" se refiere a un grupo arilo(C6-1o) monodclico o a un arilo fusionado con un grupo dclico, como fenilo, indenilo o naftilo y similares.

El concepto "heterodclico" o "heterociclo" se refiere a grupos heterodclicos saturados monodclicos o a un grupo heterodclico fusionado o monodclico insaturado que contiene al menos un heteroatomo, por ejemplo 0-3 atomos de nitrogeno (-NRd-, siendo Rd igual a H, alquilo, o Y2 tal como se define aqrn), 0-1 atomos de ox^geno (-O-) y 0-1 atomos de azufre (-S-). Ejemplos no limitativos de grupos heterodclicos monodclicos saturados incluyen grupos heterodclicos saturados de 5 o 6 miembros, como tetrahidrofuranilo, pirrolidinilo, morfolinilo, piperidilo, piperazinilo o pirazolidinilo. Ejemplos no limitativos de grupos heterodclicos monodclicos insaturados incluyen grupos heterodclicos insaturados de 5 o 6 miembros, como furilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, tienilo, piridilo o pirimidinilo. Ejemplos no limitativos de grupos heterodclicos fusionados insaturados incluyen grupos heterodclicos bidclicos insaturados, como indolilo, isoindolilo, quinolilo, benzotizolilo, cromanilo, benzofuranilo y similares. Un grupo Het puede ser un grupo heterodclico saturado o un grupo heterodclico insaturado, como un grupo heteroarilo.

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Rc y R1, junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos, pueden formar un anillo heterodclico. Ejemplos no limitativos de anillos heterodclicos incluyen anillos heterodclicos saturados de 5 o 6 miembros, como 1- pirrolidinilo, 4-morfolinilo, 1-piperidilo, 1-piperazinilo o 1-pirazolidinilo, anillos heterodclicos insaturados de 5 o 6 miembros, como 1-imidazolilo, y similares.

Los grupos heterodclicos, alquilo, arilo de R1 pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes, iguales o diferentes, que incluyen alquilo inferior; cicloalquilo, hidroxilo; hidroxialquileno(Ci-6), como hidroximetilo, 2-hidroxietilo o 3-hidroxipropilo; alcoxi inferior; alcoxi(Ci_6)alquilo(Ci_6), como 2- metoxietilo, 2-etoxietilo o 3-metoxipropilo; amino; alquilamino; dialquilamino; ciano; nitro; acilo; carboxilo; alcoxicarbonilo inferior; halogeno; mercapto; alquiltio(Ci-6), como metiltfo, etiltio, propiltfo o butiltio; alquiltio(Ci-6) sustituido, como metoxietiltio, metiltioetiltio, hidroxietiltfo o cloroetiltfo; arilo; arilo(C6-io) monodclico o fusionado con un ciclo sustituido, como 4-hidroxifenilo, 4-metoxifenilo, 4-fluorofenilo, 4- clorofenilo o 3,4-diclorofenilo; heterodclico insaturado de 5-6 miembros, como furilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, tienilo, piridilo o pirimidinilo; y heterodclico insaturado bidclico, como indolilo, isoindolilo, quinolilo, benzotiazolilo, cromanilo, benzofuranilo o ftalimino. En determinados ejemplos, uno o mas de los grupos arriba indicados pueden ser excluidos expresamente como sustituyente de otros grupos diversos de las formulas.

En algunas realizaciones no reivindicadas, el anillo de cinco miembros de la formula es un anillo tiazol, por ejemplo donde Y de la formula IA arriba mostrada es S y Q2 no esta presente.

Los grupos heterodclicos, alquilo, arilo de R2 pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes, iguales o diferentes, que incluyen hidroxilo; alcoxi(Ci-6), como metoxi, etoxi o propoxi; carboxilo; alcoxicarbonilo(C2-7), como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo o propoxicarbonilo, y halogeno.

Los grupos heterodclicos, alquilo o arilo de Rc pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes, iguales o diferentes, que incluyen cicloalquilo(C3-6); hidroxilo; alcoxi(Ci-6); amino; ciano; arilo; arilo sustituido, como 4-hidroxifenilo, 4-metoxifenilo, 4-clorofenilo o 3,4-diclorofenilo; nitro y halogeno.

El anillo heterodclico formado junto con Rc y R1 y el atomo de nitrogeno al que estan unidos puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes, sustituyentes, iguales o diferentes, que incluyen alquilo(C1-6); hidroxialquileno(C1-6); alcoxi(C1-6)alquileno(C1-6); hidroxilo; alcoxi(C1-6); y ciano.

En algunas realizaciones, cuando Q1 es O-Y2, Y2 no es hidrogeno.

Un valor espedfico de X es N.

Otro valor espedfico de X es CH.

Evidentemente, unicamente uno de los dos enlaces indicados con lmeas discontinuas puede estar presente en una molecula de un compuesto de la formula indicada. En una realizacion no reivindicada, el enlace entre Y v el carbono marcado con asterisco es un enlace doble. En otra realizacion no reivindicada, el enlace entre Q1 y el carbono marcado con asterisco es un enlace doble.

Un valor espedfico de Q1 es O.

Otro valor espedfico de Q1 es S.

Otro valor espedfico de Q1 es NY1, por ejemplo =NH.

Otro valor espedfico de Q1 es NNY2Y3.

En una realizacion no reivindicada, el enlace entre Q1 y el carbono marcado con asterisco es un enlace simple.

Un valor espedfico de Q1 es hidrogeno.

Otro valor espedfico de Q1 es NH2.

Otro valor espedfico de Q1 es O-Y2.

Un valor espedfico de Y1 es hidrogeno.

Otro valor espedfico de Y1 es alquilo, por ejemplo alquilo(C1-C6), como metilo.

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Otro valor espedfico de Y1 es arilo, como fenilo.

Un valor espedfico de cada uno de Y2, Y3 e Y4 es hidrogeno.

Otro valor espedfico de cada uno de Y2, Y3 e Y4 (independientemente) es alquilo, por ejemplo alquilo(C1-C6), como metilo.

Otro valor espedfico de cada uno de Y2, Y3 e Y4 (independientemente) es arilo, como fenilo.

Un valor espedfico de Z es O.

Otro valor espedfico de Z es S.

Otro valor espedfico de Z es NY5, siendo Y5 igual a hidrogeno, metilo o fenilo.

Otro valor espedfico de Q2 es hidrogeno.

Otro valor espedfico de Q2 es metilo o fenilo.

Un valor espedfico de Q3 es hidrogeno.

Otro valor espedfico de Q3 es metilo o fenilo.

Un valor espedfico de X1 es un atomo de azufre, un atomo de oxfgeno o -NRc-.

Otro valor espedfico de X1 es un atomo de azufre.

Otro valor espedfico de X1 es un atomo de oxfgeno.

Otro valor espedfico de X1 es -NRc-.

Otro valor espedfico de X1 es -NH-.

Un valor espedfico de Y es N.

Otro valor espedfico de Y es S.

Un valor espedfico de Rc es hidrogeno, alquilo(C1-4) o alquilo(C1-4) sustituido.

En un valor espedfico de R1 y Rc juntos, estos forman un anillo heterodclico o un anillo heterodclico sustituido.

Otro valor espedfico de R1 y Rc juntos es un anillo morfolino, piperidino, pirrolidino o piperazino, sustituido o no sustituido.

Un valor espedfico de R1 es hidrogeno, alquilo(C1-4) o alquilo(C1-4) sustituido.

Otro valor espedfico de R1 es 2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo, 4-hidroxibutilo, 2-aminoetilo, 3-aminopropilo, 4- aminobutilo, metoximetilo, 2-metoxietilo, 3-metoxipropilo, etoximetilo, 2-etoxietilo, metiltiometilo, 2-metiltioetilo, 3-metiltiopropilo, 2-fluoroetilo, 3-fluoropropilo, 2,2,2-trifluoroetilo, cianometilo, 2-cianoetilo, 3-cianopropilo, metoxicarbonilmetilo, 2-metoxicarboniletilo, 3-metoxicarbonilpropilo, bencilo, fenetilo, 4-piridilmetilo, ciclohexilmetilo, 2-tienilmetilo, 4-metoxifenilmetilo, 4-hidroxifenilmetilo, 4-fluorofenilmetilo o 4-clorofenilmetilo.

Otro valor espedfico de R1 es hidrogeno, CH3-, CH3-CH2-, CH3CH2CH2-, hidroxialquileno(C1-4) o alcoxi(C1- 4)alquileno(C1-4).

Otro valor espedfico de R1 es hidrogeno, CH3-, CH3-CH2-, CH3-O-CH2CH2- o CH3-CH2-O-CH2CH2-.

Un valor espedfico de R2 es hidrogeno, halogeno o alquilo(C1-4).

Otro valor espedfico de R2 es hidrogeno, cloro, bromo, CH3- o CH3-CH2-.

Sustituyentes espedficos para la sustitucion de los grupos alquilo, arilo o heterodclicos son hidroxi, alquilo(C1-6), hidroxialquileno(C1-6), alcoxi(C1-6), alcoxi(C1-6)alquileno(C1-6), cicloalquilo(C3-6), amino, ciano, halogeno o arilo.

Un valor espedfico de X2 es un enlace o una cadena que tiene hasta aproximadamente 24 atomos; seleccionandose los atomos de entre el grupo consistente en carbono, nitrogeno, azufre, oxfgeno no peroxido y fosforo.

Otro valor espedfico de X2 es un enlace o una cadena que tiene entre aproximadamente 4 y 5 aproximadamente 12 atomos.

Otro valor espedfico de X2 es un enlace o una cadena que tiene entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9 atomos.

Otro valor espedfico de X2 es

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Otro valor espedfico de X2 es

imagen8

En determinadas realizaciones no reivindicadas, el engarce o el grupo X2 no es un engarce dado a conocer 15 en la Publicacion de Solicitud PCT n° WO 2007/024707. Adicionalmente, en algunas realizaciones no reivindicadas, R3 no es un auxiliar dado a conocer en la Publicacion de Solicitud PCT n° WO 2007/024707.

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Una macromolecula espedfica es un aminoacido, un carbohidrato, un peptido, una protema, un antigeno, un acido nucleico, un Ifpido, un dendnmero, una sustancia corporal o una celula tal como un microbio.

Un peptido espedfico tiene de 2 a aproximadamente 20 residuos aminoacidos.

Otro peptido espedfico tiene de 10 a aproximadamente 20 residuos aminoacidos.

Una macromolecula espedfica incluye un carbohidrato.

Un acido nucleico espedfico es ADN, ARN o PNA.

Una macromolecula espedfica es una celula, lfpido, vitamina, lfpido o cofactor.

Un antfgeno espedfico es un microbio.

Un microbio espedfico es un virus, bacteria u hongo.

Otro microbio espedfico es un virus o una bacteria.

Bacterias espedficas son Bacillusanthracis, Listeria monocytogenes, Francisellatularensis, Salmonella o Staphylococcus.

Salmonella espedficas son S. typhimurium o S. enteritidis.

Staphylococcus espedficos incluyen S. aureus.

Virus espedficos son ARN-virus, incluyendo RSV y virus de la gripe, un producto del ARN-virus o un ADN- virus, incluyendo el virus del herpes.

Un ADN-virus espedfico es el virus de la hepatitis B.

En otras realizaciones no reivindicadas, la macromolecula no es un aminoacido, un carbohidrato, un peptido, un antfgeno tal como un microbio, por ejemplo un virus (por ejemplo ARN-virus como VIS, virus de la hepatitis C o un coronavirus, un producto del ARN-virus, un ADN-virus como el virus de la hepatitis B), hongos o bacterias como Bacillusanthracis (antrax), Listeria monocytogenes, Francisellatularensis, o Salmonella (por ejemplo, typhimurium o enteritidis), un acido nucleico tal como ADN, ARN o una sustancia corporal tal como una celula o lfpido.

Un valor espedfico de k es 0. Otro valor espedfico de k es 1. Otro valor espedfico de k es 2. En algunas realizaciones, k no es 1.

Compuestos espedficos tienen la formula general IA-L-A1;

IA-L-(A1)2;

IA-L-A1-A1;

IA-L-A1-L-A1;

(IA)2-L-A1-A1;

(IA)2-L-A1-L-A1;

(IA)2-L-A1; o (IA)2-L-(A1)2;

siendo IA tal como se da a conocer aqrn; L no esta presente o es un grupo de engarce; y cada grupo A1 representa independientemente una macromolecula.

La invencion incluye composiciones del compuesto de la invencion opcionalmente en combinacion con otros agentes activos, por ejemplo ribavirina, mizoribina y micofenolatomofetilo. Tambien se conocen otros ejemplos no limitativos que se describen en la solicitud de patente publicada US 20050004144.

Tambien se proporcionan como realizaciones adicionales de la invencion procesos para preparar los compuestos de la invencion y para preparar intermedios utiles para la preparacion de los compuestos de la invencion. Tambien se proporcionan como realizaciones adicionales de la invencion productos intermedios para la preparacion de los compuestos de la invencion.

5 Por ejemplo, los compuestos (conjugados) de la invencion se pueden preparar utilizando metodos de smtesis estandar conocidos en la tecnica. Mas abajo se ilustra una smtesis general de ester y aldehndo. El UC-1V150 se sintetizo en siete pasos a partir de 2,6-dicloropurina. El grupo aldelmdo libre en la fraccion de bencilo del UC-1V150 nos ha permitido acoplar el agonista con muchas entidades qmmicas auxiliares diferentes, incluyendo protemas, oligonucleotidos, moleculas aromaticas, Kpidos, virus y celulas, a traves de una 10 molecula de engarce que contema una hidrazina o un grupo amino.

Smtesis General

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a-bromo-p- tolunitrilo DMF, K2CO3 Temp. Amb. 12

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a

2,6-dicloro-9H-purina

4-(2,6-dicloropurina-9- ilmetil)benzomtrilo (-70%)

Sodio; 2-metoxi-etanolato 100°C, 12 horas M

4-(6-amino-2-cloropurma-9-

ilmetil)benzonitrilo

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hi (3

HHI

Cloruro de metileno Temp. Amb. 3 horas

Metoxido de sodio metanol, reflujo, 8 horas

IVL4S

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4-[6-amino-2-(2-metoxietoxi)- metanol, reflujo, 8

purin-9-ilmetil]benzonitrilo

4-[6-amino-8-bromo-2-(2-metoxi-

etoxi)-purin-9-ilmetil]-benzonitrilo

imagen14

O

4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-

metoxietoxi)purina-9-ilmetil)benzonitrilo

4-((6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)- 9H-purina-9-il)metil)benzoato de metilo

Smtesis de ester NHS

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4-((6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)-

9H-purin-9-il)metil)benzoato

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Acido 4-((6-amino-8-hidroxi-2-(2-metoxietoxi)- 9H-purin-9-il)metil)benzoico

2,5-dioxopirrolidin-1-il-4-((6-amino-8-

hidroxi-2-(2-metoxietoxi)-9H-purin-9-

il)metil)benzoato

Sintesis de aldehido

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4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purina-9-

ilmetil]benzaldehido

4-[6-amino-8-hidroxi-2-(2-hidroxietoxi)-

purina-9-ilmetil]enzaldehido

Quimica de UC-1V150. La smtesis de UC-1V150 (no reivindicada) y la preparacion de los compuestos 2-8 5 indicados (no reivindicada) se llevaron a cabo tal como se describe a continuacion. Compuesto 2: 4-(2,6- dicloropurin-9-ilmetM)benzonitrilo. Se disolvio 2,6-dicloro-9H-purina (1,16 mmol) en DMF (50 ml) anadiendo carbonato de potasio (50 mmol), y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 16 horas despues de anadir a-bromo-p-tolunitrilo (22 mmol). Despues de filtracion para eliminar sales inorganicas insolubles, el filtrado se vertio en agua (1500 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 400 ml), se seco sobre sulfato de 10 magnesio y se evaporo para obtener un residuo, que se sometio a cromatograffa flash en gel de sflice

utilizando acetato de etilo/acetona/hexanos 1:2:10. Rendimiento 3,33 g (69%). Los UV, NMR y MS eran coherentes con la asignacion de estructura. Compuesto 3: 4-(6-amino-2-cloropurin-9-ilmetilbenzonitrilo. El compuesto 2 (1,9 g) se dispuso en un recipiente de reaccion de acero y se anadio amomaco metanolico (80 ml, 7 N). El recipiente sellado se calento a 60°C durante 12 horas, se enfrio en hielo y el producto solido se 15 filtro. Rendimiento 1,09 g. Los UV, NMR y MS eran coherentes con la asignacion de estructura. Compuesto

4: 4-[6-amino-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil]benzonitrilo. Primero se preparo la sal sodica de 2-metoxietanol disolviendo metal sodio (81 mg) en 2-metoxietanol (30 ml) con calor y despues se anadio el compuesto 3 (1,0 g) disuelto en metoxietanol (300 ml, con calor). La mezcla de reaccion se calento durante 8 horas a una temperatura de bano de 115°C, se concentro en vacfo hasta cerca de sequedad y el residuo se dividio entre 20 acetato de etilo y agua. Una cromatograffa flash en gel de sflice utilizando 5% metanol en diclorometano dio como resultado 763 mg de producto. La NMR era coherente con la asignacion de estructura. Compuesto 5: 4-[6-amino-8-bromo-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil]benzonitrilo. El compuesto 4 (700 mg) se disolvio en diclorometano (400 ml) y se anadio bromo (7 ml) gota a gota. La mezcla se agito una noche a temperatura ambiente y se extrajo primero con una disolucion acuosa de tiosulfato de sodio (2 l de 0,1 M) y despues con

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bicarbonato de sodio acuoso (500 ml, saturado). El residuo de la capa organica se cromatografio en gel de sflice utilizando 3% metanol en diclorometano para obtener 460 mg de producto de bromo. Los NMR, W y MS eran coherentes con la asignacion de estructura. Compuesto 6: 4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin- 9-ilmetil]benzonitrilo. Se preparo metoxido de sodio mediante reaccion de metal sodio (81 mg) en metanol seco (30 ml) y se combino con una solucion del compuesto 5 (700 mg) disuelto en dimetoxietano seco, y la temperatura se aumento a 100°C. Despues de una noche de reaccion, la mezcla se concentro en vado y el residuo se cromatografio en sflice utilizando 5% metanol en diclorometano. Rendimiento 120 mg. La NMR era coherente con la asignacion de estructura. Compuesto 7: 4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9- ilmeti^benzaldelddo. El compuesto 6 (100 mg) se disolvio en THF seco (3 ml) y se enfrio a 0°C bajo argon. El agente reductor N,N'-(dimetiletilenodiamino)aluminio hidruro de litio se utilizo para convertir el nitrilo en la funcion aldehfdo. Se preparo una solucion 0,5M en THF seco y 0,72 ml de la misma se anadieron al matraz de reaccion. La mezcla se agito a 0-5°C durante 1 hora, se extinguio mediante adicion de HCl 3M, se extrajo con acetato de etilo seguido por diclorometano, y se concentro en vado para obtener 85 mg. La NMR era coherente con la asignacion de estructura. Compuesto 8: 4-[6-amino-8-hidroxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9- ilmetiljbenzaldel'ndo (UC-1V150). El compuesto 7 (800 mg) se combino con yoduro de sodio (504 mg) y acetonitrilo (40 ml), y se anadio lentamente clorotrimetilsilano (0,5 ml). La mezcla se calento a 70°C durante 3,5 horas, se enfrio y se filtro. El producto solido se lavo con agua y despues con eter para obtener 406 mg. Los NMR, UV y MS eran coherentes con la asignacion de estructura.

Aqu se incluyen ejemplos adicionales para preparar compuestos espedficos.

Tal como se describe aqu en los ejemplos, se preparo un agonista de TLR7 soluble capaz de acoplarse covalentemente con aminas primarias bajo condiciones fisiologicas. Despues se analizo la actividad in vitro de varios compuestos y complejos antfgeno-adyuvante utilizando celulas murinas derivadas de medula osea o celulas dendnticas (DC) derivadas de celulas mononucleares de sangre periferica para caracterizar la maduracion de DC y la secrecion de citoquina (por ejemplo IL-12, IL-6, TGF-beta e IFN-gamma). Se vacunaron de forma profilactica ratones C57/B1 singeneicosinmunocompetentes con complejos de antfgeno- agonista de TLR7 intradermicos y despues fueron provocados con celulas tumorales de melanoma B 16 que expresan el transgencOVA.

En general, la concentracion efectiva (EC50) de cada compuesto segrna una distribucion en campana, siendo las dosis mayores inhibidoras. La estimulacion maxima se produjo entre 10 y 1.000 nM. Las moleculas adyuvantes acopladas de forma covalente con el agonista de TLR manteman la actividad, pero con valores EC50 generalmente mas bajos. El acoplamiento de UC-1V199 con ovoalbumina de pollo practicamente duplico la supervivencia media de 22 a 35 dfas despues de la provocacion tumoral subcutanea en comparacion con la ovoalbumina de pollo sola.

Por consiguiente, el enlace covalente de un agonista de TLR7 con un antfgeno tumoral estimulo la produccion de citoquina de DC y protegio los ratones contra la provocacion tumoral. El uso de un agonista de TLR7 adecuado que mantiene sus propiedades de estimulacion inmunologica bajo condiciones fisiologicas despues de su acoplamiento con una macromolecula, como un antfgeno, puede resultar util para el desarrollo de una vacuna in situ en la terapia de tumores solidos.

Diversas purinas, piridinas e imidazoquinolinas, con pesos moleculares de 200-400 kD, han demostrado activar TLR7 y compuestos que eran ligandos de TLR7 espedficos eran de 100 a 1.000 veces mas potentes que el imiquimod en una base molar (Lee y col., infra). Dado que estos agonistas de tLR7 son estructuralmente muy similares a componentes normales de nucleotidos, es muy poco probable que induzcan una reaccion inmunologica haptenica despues de una administracion reiterada.

Un TLR7 pharmacore basado en adenina puede tener que estar unido de forma covalente con un "grupo auxiliar" (macromolecula) para promover la absorcion en los endosomas de celulas dendnticas, donde se expresa TLR7, y para retener el agonista de TLR. Por consiguiente, se preparo el agonista de TLR7 UC- 1V150 y se acoplo por su funcion aldehfdo y un engarce con grupos amino libres en diversas protemas, incluyendo albumina de raton (MSA) (Figura 3). Los conjugados eran 100 veces mas potentes in vitro e in vivo que el analogo de adenina no acoplado. Ademas, la administracion intrapulmonar del conjugado de albumina (UC-1V150/MSA) a ratones indujo una produccion de citoquinas local en el lfquido de lavado alveolar bronquial (bronchial alveolar lavage fluid - BALF) sin liberacion de citoquina sistemica. Por el contrario, el suministro del farmaco no ligado a las vfas respiratorias disparo rapidamente la liberacion de citoquinas en la corriente sangumea.

En una realizacion, un agonista de TLR7 aumenta al maximo la produccion de citoquinas estimuladoras de Th1 (interferones e IL-12) en comparacion con TNFa e IL-1. El TLR7 esta localizado sobre las superficies interiores de las vesfculas endosomicas que son sintetizadas constantemente y experimentan maduracion en DC. Por ejemplo, para prevenir el asma es preferible un agonista de TLR estable y potente que se desplaza a los endosomas tempranos de celulas dendnticas e induce principalmente interferones de Tipo I. Un agonista de TLR se unio de forma covalente con un grupo auxiliar de fosfolfpido previendo que el conjugado UC-

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1V199/L (Figura 6) se insertana rapidamente y de forma estable en membranas lip^dicas de las celulas, incluyendo en las vesmulas endosomicas. Sorprendentemente, una cantidad tan baja como 30 picomolar UC- 1V199/L indujo la smtesis de citoquinas en celulas mononucleares de raton derivadas de medula osea. Las Figuras 7-8 muestran datos de la smtesis de IL-12.

Los ligandos de TLR7 que son purinas o imidazoquilolinas tienen una propiedad peculiar, esto es una curva dosis-respuesta bifasica. En altas concentraciones, el farmaco no induce smtesis de citoquinas. El efecto bifasico se observa en celulas dendnticas altamente purificadas y parece ser autonomo con respecto a la celula. Sin embargo, la notable potencia del UC-1V199/L ha posibilitado el reexamen del fenomeno, utilizando concentraciones de farmaco farmacologicamente aceptables (Figura 9). La produccion maxima de citoquinas se observo con UC-1V199/L 10 nM, mientras que las concentraciones mayores indudan progresivamente menos liberacion de IL-12 (y TNF).

Es sabido que, si se mantienen altas concentraciones de agonistas de TLR7, estos inducen una refractariedad a la reestimulacion de TLR que puede durar 24 horas o mas. Aparentemente, este complejo sistema de regulacion forma parte de un mecanismo fiable que evita la autodestruccion de celulas y tejidos durante la respuesta inflamatoria. Por consiguiente, era interesante determinar si algunas concentraciones de UC-1V199/L que no indudan una smtesis significativa de citoquinas podnan no obstante inducir "tolerancia al TLR". De hecho, al exponer celulas mononucleares derivadas de medula osea a una concentracion no activadora de UC-1V199/L (1 mM) y reestimularlas 24 horas despues con el mismo compuesto, con UC- 1V150 (no reivindicado) o con pam3Cis (P3C, un activador de TLR2, no reivindicado), estas mostraron una notable disminucion de la respuesta a las citoquinas. En cambio, las celulas tratadas con UC-1V199/L mantuvieron su nivel de respuesta a ligandos de TLR3 y TLR4, que van a traves de la via TRIF (resultados no mostrados). Los experimentos preliminares indicaban que tambien se induda una falta de respuesta in vivo. Por consiguiente, la administracion diaria de UC-1V199/L, y farmacos relacionados, puede suprimir la inflamacion inducida por estfmulos dependientes de MiD88, sin los efectos secundarios sistemicos asociados a la activacion de TLR.

En una realizacion, los conjugados de la invencion pueden ser utiles para prevenir, inhibir o tratar el asma. El asma se caracteriza por episodios de constriccion intermitentes y reversibles de las vfas respiratorias, hiperplasia de los musculos lisos bronquiales e inflamacion cronica. La enfermedad atopica predispone al asma, pero la mitad de los pacientes afectados no son atopicos. Otros factores de riesgo ambientales para el asma incluyen el tabaco y los contaminantes atmosfericos. Ademas, los accesos de la enfermedad en pacientes asmaticos afectados no solo pueden estar provocados por alergenos, sino tambien por sustancias irritantes de las vfas respiratorias, cambios de temperatura e infecciones.

El desarrollo inicial de una respuesta alergica esta regulado en parte por un equilibrio entre los linfocitos Th1 y Th2 y sus respectivas citoquinas, especialmente los interferones y la IL-4. La vacunacion de animales con un alergeno junto con un agonista de TLR7 o TLR9 expande preferentemente celulas de memoria Th1 espedficas del alergeno. Por consiguiente, la inmunizacion subsiguiente con antfgeno junto con un adyuvante con propension a Th2 no provoca facilmente una respuesta a la IgE. Los ratones vacunados con antfgeno y agonistas de TLR7 o TLR9 eran resistentes al asma experimental.

Para el tratamiento del asma con agonistas de TLR se requiere un enfoque diferente al de la prevencion del asma. En pacientes afectados, las vfas respiratorias y los tejidos pulmonares ya estan infiltrados con una poblacion diversa de celulas inflamatorias, incluyendo muchos subgrupos de linfocitos, macrofagos, celulas dendnticas, mastocitos, eosinofilos y neutrofilos. En esta situacion, los agonistas de TLR pueden exacerbar potencialmente la enfermedad aumentando la liberacion de mediadores inflamatorios, como TNF-alfa e IL-1. De hecho, la capacidad de diversos agentes microbianos para activar los TLR puede explicar por que provocan ataques asmaticos.

Un agonista de TLR para la prevencion del asma preferentemente esta limitado a los pulmones, pero tambien aumenta al maximo la produccion de citoquinas estimuladoras de Th1 (interferones e IL-2), en comparacion con TNF-alfa e IL-1. Tanto el TLR7 como el TLR9 estan localizados sobre las superficies interiores de las vesmulas endosomicas que son sintetizadas constantemente y experimentan maduracion en celulas dendnticas. Los oligonucleotidos activadores de TLR9 que son oligonucleotidos de fosfodiester agregados permanecen mas tiempo en las vesmulas endosomicas tempranas y, en consecuencia, inducen mas interferones de Tipo I que los oligonucleotidos de fosforotioato no agregados, que van a vesmulas maduras. Los resultados indican que la organizacion espacial de los agonistas de TLR rige su transmision y su patron de smtesis de citoquinas inducida. Para prevenir el asma es preferible un agonista de TLR estable, potente y caracterizado molecularmente, que se dirige a los endosomas tempranos de celulas dendnticas e induce principalmente interferones de Tipo I.

Para estudiar el efecto del conjugado de la invencion sobre el asma alergica se induce una inflamacion de las vfas respiratorias sensibilizando ratones por una inyeccion subcutanea de 20 |jg de ovoalbumina absorbida con 500 jg de alumbre por raton, en solucion salina, el dfa 0 y el dfa 7. Los dfas 16 y 21, los ratones son

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provocados v^a i.n. con 5 |jg de ovoalbumina por raton. Los conjugados se administran v^a i.n., p.o. o i.v. en diferentes momentos antes de la primera provocacion con ovoalbumina el dfa 16. Veinticuatro horas despues de la ultima provocacion (dfa 22) se mide la capacidad de respuesta de las vfas respiratorias, los ratones son sacrificados y se recogen celulas BALF y muestras de pulmon y bazo. Como controles se utilizan ratones naive y ratones sensibilizados con respecto a la ovoalbumina/alumbre. La cantidad total de celulas en el BALF se recuenta y se tine con Wright-Giemsa para determinar la cantidad de eosinofilos, linfocitos, neutrofilos y mastocitos. Los niveles de citoquinas en el BALF se determinan mediante ensayos Luminex. La capacidad de respuesta de las vfas respiratorias a la metacolina se evalua 24 horas despues de la ultima provocacion utilizando un pletismografo de cuerpo entero y camara simple. Para controlar la capacidad de respuesta de las vfas respiratorias se utiliza el Penh, un valor adimensional que presenta una buena correlacion con la resistencia pulmonar medida por pletismograffa de dos camaras convencional.

El compuesto de esta invencion se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz a un sujeto que requiere tratamiento. La administracion de las composiciones de la invencion puede tener lugar por cualquier via de administracion adecuada, en particular via parenteral, por ejemplo intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraestomal, intracraneal, intramuscular o subcutanea. Dicha administracion puede tener lugar en forma de una unica inyeccion de bolo, multiples inyecciones o como una infusion de corta o larga duracion. Tambien se pueden emplear dispositivos implantables (por ejemplo bombas de infusion implantables) para el suministro parenteral periodico a lo largo del tiempo de dosis equivalentes o variables de la formulacion particular. Para dicha administracion parenteral, el compuesto se formula preferentemente como solucion esteril en agua u otro disolvente o mezcla de disolventes adecuados. La solucion puede contener otras sustancias, como sales, azucares (en particular glucosa o manitol), para hacer la solucion isotonica con la sangre, agentes tampon como los acidos acetico, cftrico y/o fosforico y sus sales de sodio, asf como conservantes.

Los compuestos de la invencion se pueden formular como composiciones farmaceuticas y administrar a un huesped mairnfero, tal como un paciente humano, en diversas formas adaptadas a la via de administracion elegida, es decir, via oral o parenteral, intravenosa, intramuscular, topica o subcutanea.

Por consiguiente, los presentes compuestos pueden ser administrados sistemicamente, por ejemplo via oral, en combinacion con un vehuculo farmaceuticamente aceptable, tal como un diluyente inerte o un soporte comestible asimilable. Puede estar encerrado en capsulas de gelatina dura o blanda, puede estar comprimido en tabletas o se puede incorporar directamente en el alimento de la dieta del paciente. Para la administracion terapeutica oral, el compuesto activo se puede combinar con uno o mas excipientes y utilizar en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones debenan contener al menos un 0,1% de compuesto activo. Evidentemente, el porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variar y puede oscilar convenientemente entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 60% del peso de una forma de dosificacion unitaria dada. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapeuticamente utiles es tal que se obtendra un nivel de dosis eficaz.

Las tabletas, pastillas, pfldoras, capsulas y similares pueden contener tambien los siguientes ingredientes: aglutinantes como goma tragacanto, acacia, almidon de mafz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicalcico; un agente disgregante como almidon de mafz, almidon de patata, acido algmico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo, o se puede anadir un agente aromatizante tal como menta, aceite de gaulteria, o aromatizante de cereza. Cuando la forma de dosificacion unitaria es una capsula, ademas de los materiales del tipo arriba indicado tambien puede contener un vetuculo lfquido, como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Otros materiales diversos pueden estar presentes como revestimientos o para modificar de otro modo la forma ffsica de la forma de dosificacion unitaria solida. Por ejemplo, las tabletas, pfldoras o capsulas pueden estar revestidas con gelatina, cera, goma laca o azucar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metil- y propil-parabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como aromatizante de cereza o naranja. Evidentemente, cualquier material utilizado en la preparacion de cualquier forma de dosificacion unitaria debe ser farmaceuticamente aceptable y esencialmente no toxico en las cantidades empleadas. Ademas, el compuesto activo se puede incorporar en preparaciones y dispositivos de liberacion controlada.

El compuesto activo tambien puede ser administrado via intravenosa o intraperitoneal, mediante infusion o inyeccion. Las soluciones del compuesto activo o sus sales se pueden preparar en agua, opcionalmente mezclada con un agente tensioactivo no toxico. Tambien se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, triacetina y mezclas de las mismas y en aceites. Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el desarrollo de microorganismos.

Las formas de dosificacion farmaceutica adecuadas para inyeccion o infusion pueden incluir soluciones acuosas esteriles o dispersiones de polvos esteriles que comprenden el ingrediente activo y que estan

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adaptadas para la preparacion magistral de soluciones o dispersiones esteriles inyectables o administrables por infusion, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la forma de dosificacion final ha de ser esteril, fluida y estable bajo las condiciones de produccion y almacenamiento. El soporte o vehuculo Kquido puede ser un disolvente o un medio de dispersion lfquido, incluyendo, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles lfquidos, y similares), aceites vegetales, glicerilesteres no toxicos y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante la formacion de liposomas, manteniendo el tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones, o usando agentes tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede ser llevada a cabo mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemploparabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo azucares, tampones o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante el uso en las composiciones de agentes de retraso de absorcion, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes arriba enumerados, segun sea necesario, seguido de esterilizacion por filtro. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferentes son las tecnicas de secado en vacfo y liofilizacion, que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado presente en las soluciones previamente filtradas de forma esteril.

Para la administracion topica, los presentes compuestos se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando estan en estado lfquido. Sin embargo, en general sera deseable aplicarlos a la piel en forma de composiciones o formulaciones en combinacion con un soporte dermatologicamente aceptable, que puede consistir en un solido o un lfquido.

Los vehuculos solidos utiles incluyen solidos finamente divididos, como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sflice, alumina y similares. Los soportes lfquidos utiles incluyen agua, alcoholes o glicoles o mezclas de agua- alcohol/glicol, en los que los presentes compuestos se pueden disolver o dispersar en niveles efectivos, opcionalmente con ayuda de agentes tensioactivos no toxicos. Tambien se pueden anadir adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales para optimizar las propiedades para un uso dado. Las composiciones lfquidas resultantes se pueden aplicar desde tampones absorbentes, utilizar para impregnar vendajes y otros apositos, o pulverizar sobre el area afectada utilizando pulverizadores de aerosol de tipo bomba.

Tambien es posible utilizar espesantes tales como polfmeros sinteticos, acidos grasos, sales y esteres de acidos grasos, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados, con soportes lfquidos para formar pastas untables, geles, unguentos, jabones y similares, para una aplicacion directa en la piel del usuario.

Ademas, en una realizacion, la invencion proporciona diversas formulaciones de dosificacion de los conjugados para administracion por inhalacion. Por ejemplo, se pueden disenar formulaciones para uso en aerosol en dispositivos tales como inhaladores dosificadores, inhaladores de polvo seco y nebulizadores.

En la tecnica se conocen ejemplos de composiciones dermatologicas utiles que pueden ser utilizadas para administrar los compuestos de la invencion en la piel; vease, por ejemplo, Jacquet y col. (Pat. US n° 4.608.392), Geria (Pat. US n° 4.992.478), Smith y col. (Pat. US n° 4.559.157) y Wortzman (Pat. US n° 4.820.508).

Las dosis utiles de los compuestos de la invencion se pueden determinar comparando su actividad in vitro e in vivo en modelos animales. Los metodos para extrapolar las dosis efectivas en ratones y otros animales a humanos son conocidos en la tecnica; vease, por ejemplo, la Pat. US n° 4.938.949. La capacidad de un compuesto de la invencion para actuar como agonista de TLR se puede determinar utilizando modelos farmacologicos bien conocidos en la tecnica, incluyendo los procesos dados a conocer por Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 6646 (2003).

En general, la concentracion del compuesto de la invencion en una composicion lfquida, como una locion, oscilara entre aproximadamente el 0,1 y el 25% en peso, preferentemente entre aproximadamente el 0,5 y el 10% en peso. La concentracion en una composicion semisolida o solida tal como un gel o un polvo oscilara entre aproximadamente el 0,1 y el 5% en peso, preferentemente entre aproximadamente el 0,5 y el 2,5% en peso.

El ingrediente activo se puede administrar para alcanzar concentraciones en plasma maximas de compuesto activo entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 75 pM, preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 pM, de forma especialmente preferente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 30 pM. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la inyeccion intravenosa de una solucion del 0,05 al 5%

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del ingrediente activo, opcionalmente en solucion salina, o la administracion oral en forma de un bolo que contiene aproximadamente 1-100 mg del ingrediente activo. Los niveles deseables en sangre se pueden mantener mediante infusion continua para proporcionar aproximadamente 0,01-5,0 mg/kg o mediante infusiones intermitentes que contienen aproximadamente 0,4-15 mg/kg del ingrediente o los ingredientes activos.

La cantidad del compuesto, o de una sal o derivado activo del mismo, necesaria para el uso en un tratamiento variara no solo en funcion de la sal particular seleccionada, sino tambien de la via de administracion, la naturaleza de la afeccion tratada y la edad y el estado del paciente, y finalmente estara a discrecion del medico o clmico que ordena el tratamiento. No obstante, una dosis adecuada oscilara en general entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo entre aproximadamente 10 y aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal al dfa, por ejemplo entre 3 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del receptor al dfa, preferentemente entre 6 y 90 mg/kg/dfa, de forma especialmente preferente entre 15 y 60 mg/kgMa.

El compuesto se administra convenientemente en forma de dosis unitarias que contienen, por ejemplo, de 5 a 1.000 mg, convenientemente de 10 a 750 mg, de forma especialmente conveniente de 50 a 500 mg del ingrediente activo por forma de dosis unitaria.

La dosis deseada se puede presentar convenientemente en una unica dosis o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo dos, tres, cuatro o mas subdosis por dfa. Las propia subdosis puede estar dividida, por ejemplo en una serie de administraciones discretas separadas por intervalos libres; como multiples inhalaciones desde un insuflador o mediante la aplicacion de multiples gotas en el ojo. La dosis, y quiza la frecuencia de las dosis, tambien variara en funcion de la edad, el peso, el estado y la respuesta del paciente individual. En general, la dosis diaria total de uno o mas compuestos de formula (I), para las afecciones aqrn descritas, puede oscilar entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 5.000 mg, en dosis unitarias o divididas. Preferentemente, una dosis diaria debena oscilar entre aproximadamente 100 mg y aproximadamente 4.000 mg, de forma especialmente preferente entre aproximadamente 1.000 y 3.000 mg, en dosis unitarias o divididas, por ejemplo 750 mg de compuesto administrado via oral cada 6 horas. Esto permite alcanzar niveles en plasma de aproximadamente 500-750 |jM, que pueden ser eficaces para matar celulas cancerosas. En la gestion del paciente, la terapia debena iniciarse con una dosis baja y aumentar esta despues en funcion de la respuesta general del paciente.

Tal como se describe mas arriba, las composiciones que contienen un compuesto de la invencion son utiles para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad o afeccion, por ejemplo en humanos u otros mairnferos (por ejemplo animales bovinos, caninos, equinos, felinos, ovinos y porcinos), y quiza tambien en otros animales. La composicion sera util por ejemplo ffpicamente para tratar cancer, una infeccion, aumentar la inmunidad adaptativa (por ejemplo produccion de anticuerpos, activacion de celulas T, etc.), y vacunas, y/o para estimular el sistema nervioso central.

La invencion se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo I

Aqrn se proporcionan procesospara preparar compuestos de formula (I) reivindicados y no reivindicados como realizaciones adicionales de la invencion, que se ilustran mediante los siguientes procedimientos en los que los significados de los grupos genericos son tal como se indican mas arriba, a no ser que se senale algo distinto.

Quimica general. Los reactivos y disolventes se adquirieron de Aldrich, Milwaukee, WI. Los puntos de fusion no corregidos se determinaron en un aparato de punto de fusion de capilares LaboratoryDeviceMel-Temp II. Los espectros de resonancia magnetica nuclear se registraron en un espectrofotometro VarianUnity 500 NMR a 499,8 MHz o en un espectrofotometro Varian Mercury NMR a 400,06 MHz. Los desplazamientos qmmicos se registraron en ppm en la escala de la referencia indicada. El Department of Chemistry UCSD, San Diego, CA llevo a cabo espectros de masas de bucle de iones positivos y negativos. NuMegaResonanceLabs, San Diego, CA llevo a cabo analisis elementales. La cromatograffa en columna se llevo a cabo en E Merck gel de sflice (malla 230-400) con el sistema disolvente indicado. La cromatograffa en capa fina (thinlayerchromatography - TLC) se llevo a cabo en placas 60 F-254 de gel de sflice (EM Reagents).

Preparacion de 4-(2,6-dicloropurin-9-ilmetil)benzonitrilo (no reivindicado). Se disuelve 2,6-dicloro-9H-purina (16 mmol) en DMF (50 ml) y se anade carbonato de potasio (50 mmol). Luego se anade a-bromo-p-tolunitrilo (22 mmol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. Despues de filtracion para eliminar sales inorganicas insolubles, el filtrado se vierte en agua (1500 ml) y se extrae con acetato de etilo (2 x 400 ml), se seca sobre sulfato de magnesio y se evapora, para obtener un residuo que se somete a cromatograffa flash en gel de sflice utilizando acetato de etilo/acetona/hexanos 1:2:10. Rendimiento 3,33 g (69%). UV, NMR y MS son coherentes con la asignacion de estructura.

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Preparacion de 4-(6-amino-2-cloropurin-9-ilmetilbenzonitrilo (no reivindicado). El producto arriba indicado (1,9 g) se dispone en un recipiente de reaccion de acero y se anade amomaco metanolico (80 ml, 7N). El recipiente sellado se calienta a 60°C durante 12 horas, se enfffa con hielo y se filtra el producto solido. Rendimiento 1,09 g. UV, NMR y MS son coherentes con la asignacion de estructura.

Preparacion de 4-[6-amino-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzonitrilo (no reivindicado). Se prepara una sal sodica de 2-metoxietanol disolviendo metal sodio (81 mg) en 2-metoxietanol (30 ml) con calor. A esta solucion se anade el producto del ejemplo 2 (1,0 g) disuelto en metoxietanol (300 ml, con calor). La mezcla de reaccion se calienta durante 8 horas a una temperatura del bano de 115°C, se concentra en vado hasta cerca de la sequedad y el residuo se divide entre acetato de etilo y agua. Una cromatograffa flash en gel de sflice utilizando 5% metanol en diclorometano da como resultado 763 mg de producto. La NMR es coherente con la asignacion de estructura.

Preparacion de 4-[6-amino-8-bromo-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzonitrilo (no reivindicado). El producto inmediatamente anterior (700 mg) se disuelve en diclorometano (400 ml) y se anade bromo (7 ml) gota a gota. La mezcla se agita una noche a temperatura ambiente y se extrae con una disolucion acuosa de tiosulfato de sodio (2 l 0,1M) y despues con bicarbonato de sodio acuoso (500 ml, saturado). El residuo de la capa organica se cromatograffa en gel de sflice utilizando 3% metanol en diclorometano para obtener 460 mg de producto de bromo. NMR, UV y MS son coherentes con la asignacion de estructura.

Preparacion de 4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzonitrilo (no reivindicado). Se prepara metoxido de sodio por reaccion de metal sodio (81 mg) en metanol seco (30 ml). El producto inmediatamente anterior (700 mg) se disuelve en dimetoxietano seco y la temperatura se aumenta a 100°C. Despues de una noche de reaccion, la mezcla se concentra en vado y el residuo se cromatograffa en sflice utilizando 5% metanol en diclorometano. Rendimiento 120 mg. La NMR es coherente con la asignacion de estructura.

Preparacion de hidruro de N,N'-(dimetiletilendiamino)aluminio-litio (no reivindicado). Este agente reductor utilizado para convertir el nitrilo en la funcion aldehfdo se prepara esencialmente tal como se describe en Bull. KoreanChem. Soc., 23:1697 (2002). Se prepara una solucion 0,5 M en THF seco.

Preparacion de 4-r6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzaldehido (no reivindicado). Se disuelve 4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil]benzonitrilo (100 mg) en THF seco (3 ml) y se enfffa a 0°C bajo argon. El reactivo de hidruro de aluminio preparado mas arriba (0,72 ml) se anade al matraz de reaccion y la mezcla se agita a 0-5°C durante 1 hora y despues se extingue mediante adicion de HCl 3M. Luego se extrae la mezcla con acetato de etilo seguido por diclorometano, y se concentra en vado para obtener 85 mg. La NMR es coherente con la asignacion de estructura.

Preparacion de 4-[6-amino-8-hidroxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzaldehido (UC-1V150) (no reivindicado). El producto inmediatamente anterior (800 mg) se combina con yoduro de sodio (504 mg) y acetonitrilo (40 ml), y despues se anade lentamente clorotrimetilsilano (0,5 ml). La mezcla se calienta a 70°C durante 3,5 horas, se enfffa y se filtra. El producto solido se lava con agua y despues con eter para obtener 406 mg. NMR, UV y MS son coherentes con la asignacion de estructura. Este material es adecuado para reacciones de conjugacion entre engarces y macromoleculas.

Preparacion de 4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzoato de metilo (no reivindicado). El procedimiento es conforme a la descripcion de Jayachitra y col., Synth. Comm., 33: 3461 (2003)). Se disuelve 4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzonitrilo (1 mmol) en metanol seco (5 ml) y despues se anade a la solucion BFaeterato (4 mmol) recien destilado. La mezcla resultante se somete a reflujo bajo argon durante 20 horas. El disolvente se retira en vado, el residuo se recoge en diclorometano (10 ml) y se extrae con bicarbonato de sodio acuoso diluido (2 x 10 ml), y la capa organica se seca sobre sulfato de magnesio. Despues de evaporacion, el producto se purifica mediante cromatograffa en columna de gel de sflice utilizando 5% metanol en diclorometano para obtener 0,8 mmol.

Preparacion de acido 4-[6-amino-8-hidroxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1-benzoico (no reivindicado). Se combina 4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzoato (100 mg) con yoduro de sodio (63 mg) y acetonitrilo (10 ml), y despues se anade lentamente clorotrimetilsilano (120 ml). La mezcla se calienta a 70°C durante 6 horas, se enfffa y se filtra. El producto solido se lava con agua y despues con eter para obtener 51 mg.

Preparacion de 4-[6-amino-8-hidroxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (no reivindicado). Se disuelve 4-[6-amino-8-metoxi-2-(2-metoxietoxi)purin-9-ilmetil1benzoato (2 mmol) en diclorometano o dioxano (10 ml) y se anade EDC (2 mmol). A esta solucion se anade N-hidroxisuccinimida (2 mmol) y la mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se lleva a sequedad en vado y el producto crudo se purifica mediante cromatograffa en gel de sflice para obtener 2 mmol de producto, que es adecuado para reacciones de conjugacion en las que intervienen aminas primarias.

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Ejemplo II

Se acoplo UC-1V 150 de forma covalente con MSA previamente modificada con un engarce de succinimidil 6- hidrazin-nicotinamida acetona hidrazona (SANH) para obtener una molecula estable con un espectro UV alterado de forma caractenstica. El conjugado de UC-1V150/MSA (no reivindicado) se identifico mediante un pico de absorcion UV a 342 nm debido a la formacion de hidrazona, mientras que el SANH solo se absorbfa a 322 nm. La cuantificacion de moleculas de UC-1V150 conjugadas por MSA se extrapolo a partir de una curva estandar de UC-1V150-SANH (Figura 1). Consecuentemente, los conjugados de UC-1V150/MSA se obtuvieron en una relacion aproximadamente 5:1. Los estudios biologicos aqrn presentados se realizaron utilizando UC-1V150/MSA 5:1.

Modificacion de MSA con SANH. 200 pl de MSA (25 mg/ml) se mezclaron con 100 pl de tampon de conjugacion (NaPi 1M, pH = 7,2) y 690 ml de PBS. A la solucion de protema se anadieron 844 pg de SANH en 10 pl de DFM (exceso molar en un factor 40 con respecto a la MSA) (la concentracion final de MSA en la mezcla de reaccion es de 5 mg/ml). Despues de mezclar suavemente, la reaccion continuo a temperatura ambiente durante 2 horas. Para eliminar el exceso de SANH, la mezcla de reaccion se cargo en una columna NAP-10 equilibrada con PBS y la MSA modificada se eluyo con 1,5 ml de PBS.

Union de IV150 a MSA modificada con SANH. 460 mg de IV150 disuelto en 10 ml de DMF se anadieron a MSA modificada con SANH y la mezcla de reaccion se incubo a TA una noche. Para eliminar el exceso de IV150, la mezcla de reaccion se concentro en primer lugar a 1 ml utilizando una columna micro-spin (Millipore: BIOMAX 5K) y se cargo en una columna NAP-10 tal como se menciona mas arriba. Tambien se conjugaron agonistas de TLR7 con oligodesoxinucleotidos (ODN) (Figuras 20-21), un virus (Figuras 18-19), y con un componente lfpido que se puede incorporar despues en un liposoma (Figuras 24-25).

Sintesis de agonistas de TLR7 regulados espacialmente. Cada conjugado se prepara mediante tecnicas estandar bien conocidas en la qmmica de la bioconjugacion. La caracterizacion de cada uno mediante metodos UV, LC/MS y PAGE determina la 'Valencia" o relacion de agonista de TLR con respecto a su grupo auxiliar (macromolecula). A partir de esta informacion, se estiman facilmente el tamano y la forma de los conjugados mediante tecnicas de modelado. La diversidad de tamano, forma y valencia de los conjugados se introduce a traves de la seleccion de la macromolecula, representada en el esquema estructural como R3. Por ejemplo, cuando R3 es un dendnmero, tal como la variedad de poli(amidoamina) comun, la cantidad de grupos funcionales superficiales para la union del agonista de TLR se define precisamente segun el numero de puntos de ramificacion o generaciones de dicho dendnmero particular. Una primera generacion (G1) tiene 8 grupos amino superficiales, una G2 tiene 16, etc., lo que resulta en un alto nivel de control de la valencia y el tamano de los conjugados (vease la Figura 2). Adicionalmente, algunas nanopartfculas de dendnmero pueden contener tanto un ligando de fijacion de objetivo como el agonista de TLR7. Los conjugados de agonista de TLR7-lfpido tambien pueden tener una variedad de "valencias", dependiendo de la seleccion de los lfpidos. Por ejemplo, el potente conjugado UV-1V199/L (Figura 6) se preparo acoplando un derivado carboxi del agonista de TLR7 (UC-1V199) con el grupo etanolamino de una dioleanilfosfatidiletanolamina (DOPE) comercial.

Estos conjugados de lfpido se formulan en varias nanopartfculas de liposoma mediante combinacion con colesterol, DOPE y otros lfpidos para producir partfculas con un diametro hidrodinamico de aproximadamente 100 nm (Figuras 24-25). Los hexagonos de la figura representan UC-1V199/L y agonista de TLR7 relacionado con colas de fosfolfpido.

Se ha comprobado que los agonistas de TLR7 y dfmeros, asf como los conjugados de TLR, presentan liberacion de citoquinas y/o actividad de citoquinas in vivo de acuerdo con la determinacion a traves de ensayos tales como los aqrn descritos. Por ejemplo, han demostrado actividad todas las siguientes sustancias: imiquimod, bropirimina, UC-1V138, UC-1V136, UC-1V150, UC-1X105, UC-1V199, UC-1W236, UC-1X51, UC-1W247, UC-1X113, UC-1V199/L, UC-1V150/BSA, conjugados de UC-1V150 con o sin engarce y MSA, OVA, viriones, y/u ODN, conjugados de UC-1V199 y DOPE, sflice, lfpido, o esporas irradiadas, y conjugados de UC-1V1043 y UC-1V1018 con OVA.

Ejemplo III

Materiales y metodos

Evaluacion de compuestos in vitro. La capacidad de los conjugados de TLR7 para estimular y/o inhibir la produccion de citoquinas se evalua en celulas mononucleares derivadas de medula osea murina (bonemarrowderived mononuclear cells - BMDM), muy ricas en celulas dendnticas, asf como en celulas mononucleares de sangre periferica (peripheralblood mononuclear cells - PBMC) humana. Las BMDM se disponen en placas de 96 pocillos y se tratan por triplicado con vehfculo o con diversas dosis partiendo de 10 pM diluidas, bajando en incrementos de un factor 3 hasta concentraciones picomolares. Despues de 24 horas, los sobrenadantes se recogen y ensayan en relacion con hasta 30 citoquinas diferentes, quimioquinas

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y otros mediadores, utilizando un sistema de ensayo de granulos Luminex, y reactivos comerciales. Los resultados ELISA de citoquinas/quimioquinas se complementan con medidas de la expresion de ARNm cuantitativa y con analisis de fosfoprotema bidimensionales, para comprender mejor el alcance y el mecanismo de la induccion de tolerancia. En el momento de la recogida del sobrenadante, los medios son sustituidos en los pocillos por MTT, como evaluacion colorimetrica de la supervivencia celular. Las PBMC humanas se afslan de paquetes de sangre comerciales y se tratan de modo similar.

Para evaluar el trafico de los dendnmeros y nanoliposomas conjugados con agonista de TLR, las nanopartmulas respectivas se cargan o modifican con un fluorocromo. La localizacion subcelular se determina microscopicamente, en algunos casos en celulas que han sido tratadas con inhibidores de maduracion endosomica.

Para comparar las actividades antiinflamatorias de los conjugados de TLR7 con diferentes grupos auxiliares, las BMDM se tratan primero con los compuestos mas potentes a concentraciones previamente determinadas que teman efectos mmimos en la estimulacion de citoquinas proinflamatorias (TNFa. IL-1). Despues de 24 horas, el medio se sustituye y las celulas se provocan con ligandos activadores de diferentes miembros de la familia de los TLR (Pam3Cys para TLR2, poli(I:C) para TLR3, LPS para TLR4, flagelina para TLR5, Malp-2 para TRL6, UC-1V150 para TlR7, R848 para TLR7/8, oligonucleotidos CpG para TlR9, y similares) en concentraciones que inducen eficazmente la produccion de citoquinas en celulas con tratamiento simulado. Las celulas se evaluan mediante inmunoensayo multiplex, PCR cuantitativa y transferencia de fosfoprotema. Para entender mejor la cinetica de induccion y mantenimiento de tolerancia, tambien se provocan celulas cebadas con conjugado de TLR7 en diferentes intervalos de tiempo y se analizan en cuanto al patron de produccion de citoquinas.

Evaluacion de compuestos in vivo. Aqu se evalua la produccion de lfquido de lavado alveolar bronquial (BALF) frente a las citoquinas sistemicas despues de la administracion en las vfas respiratorias de ratones. A unos ratones C57BL/6 hembra emparejados por edades y anestesiados se les administran via nasal (i.n.), oral (p.o.) o intravenosa (i.v.) diversas cantidades de los conjugados de TLR7 tal como se describe mas arriba, o los liposomas o dendnmeros en vehmulos apropiados. Despues de la recuperacion en diferentes momentos, se recogen suero y BALF y se analizan en cuanto a citoquinas y quimioquinas mediante un ensayo Luminex. Los pesos, temperaturas y patrones de absorcion de fluido de los animales tratados se registran como sucedaneo clmico de un "smdrome de citoquinas" sistemico.

Experimentos posteriores evaluan la capacidad de los diferentes agentes para producir refractariedad local y sistemica (tolerancia a TLR) a la activacion de TLR despues de una administracion de una alta dosis i.n., p.o. o i.v., de acuerdo con la determinacion de citoquinas en suero y BALF. Se seleccionan altas dosis de los diversos conjugados de TLR7, que no inducen una produccion significativa de citoquinas in vivo ni signos clmicos de smdrome de citoquinas. Se tratan ratones con las altas dosis seleccionadas administradas por las diferentes vfas de administracion, y despues son provocados con activadores de diferentes TLR en diferentes momentos. Luego se recogen y analizan suero y BALF y se registran los smtomas clmicos. Las actividades antiinflamatorias de los conjugados se confirman con un modelo de shock letal previamente utilizado para estudiar LPS y CpG. En este modelo, ratones Balb/c a los que previamente se les ha administrado D- galactosamina via i.p. sucumben despues de una provocacion sistemica con diferentes activadores de TLR, debido a la estimulacion de citoquinas y el dano hepatico. Los farmacos antiinflamatorios activos no logran inducir smtomas clmicos en animales sensibilizados y tambien evitara el shock causado por otros ligandos de TLR. Con un desenlace definido, este modelo es especialmente util para determinar la cinetica y duracion de la tolerancia a TLR.

Ejemplo IV

Materiales y metodos

Ratones. De Harlan West Coast (Germantown, CA) se obtuvieron ratones C57BL/6 hembra (5-6 semanas de edad) y de The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) se compraron ratones A/J hembra (6-8 semanas de edad). Los ratones A/J se utilizaron para infeccion con la cepa Sterne de B. anthracis (Kenney y col., J. Infect. Dis., 190:774 (2004)). Los ratones se criaron y mantuvieron bajo condiciones estandar en la Universidad de California en la San Diego Animal Facility, que esta autorizada por la American AssociationforAccreditation of Laboratory Animal Care. Todos los protocolos animales recibieron la aprobacion previa por el InstitutionalReviewBoard. Para el estudio de la gripe HaN1 se obtuvieron ratones BALB/c hembra (16-18 g) de Charles RiverLaboratories (Wilmington, MA) y se mantuvieron en el Laboratory Animal Research Center de la Universidad del Estado de Utah, autorizado por la American AssociationforAccreditation of Laboratory Animal Care.

Estimulacion in vitro de BMDM. BMDM aisladas de diversas cepas de raton se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5x104 celulas por pocillo. Los compuestos se anadieron a cultivos de 10 dfas de antiguedad a una concentracion final entre 0,01 y 10 pM o tal como se indica de otro modo. Despues de 24

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horas de incubacion, los sobrenadantes del cultivo se recogieron y analizaron en cuanto a inducciones de citoquinas mediante ELISA en sandwich (BD Pharmingen, San Diego, CA) o mediante ensayo Luminex multiplex (Austin, TX) utilizando el kit personalizado Beadlyte Mouse MultiCytokine (Upstate, Charlottesville, VA, y eBiosciences, San Diego, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Administracion de compuestos a ratones. A ratones C57BL/6 hembra emparejados por edad se les inyectaron 100 |jl de solucion salina que contema UC-1V150 (no reivindicado) o UC-1V150/MSA (no reivindicado), que inclrnan en cada caso el equivalente de 0,38-38 nmol del pharmacore a traves de la vena caudal. Para la administracion intrapulmonar, los ratones fueron anestesiados con solucion i.p. de Avertin y afeitados alrededor del area del cuello. Se expuso la traquea con una pequena incision y se inyectaron 50 jl de solucion salina que contema diversas cantidades de UC-1V 150/MsA o el farmaco no conjugado. Despues de la recuperacion en diferentes momentos, se recogieron suero y BALF y se analizaron en cuanto a IL-6, IL- 12p40, IFN-y, RANTES y MCP-1 mediante un ensayo Luminex. En otros experimentos, los ratones fueron anestesiados con una solucion intramuscular de ketamina/sileno y se les administro la misma cantidad de UC-1V150/MSA en dosis i.t. de 50 jl o dosis i.n. de 20 jl. Dado que en el BALF se observaron niveles similares de citoquinas 24 horas despues de la administracion mediante cualquiera de los dos metodos, en los estudios con modelos infecciosos se utilizo la via i.n., mas conveniente.

Infeccion de ratones A/J con esporas de B. anthracis. Se prepararon esporas de la cepa Sterne de B. anthracis (pXO1+pXO2") tal como se describe mas arriba (Sabet y col., FEMS Immunol. Med. Microbiol., 47:369 (2006); Guidi-Rontani y col., Mol. Microbiol., 42:931 (2001)). Las esporas purificadas se conservaron en PBS entre 1x108 y 4x108cfu/ml a 4°C. Antes de la infeccion, las esporas se calentaron a 65°C durante 30 minutos para iniciar la germinacion. Se anestesiaron ratones A/J via intramuscular con una solucion de ketamina/xileno y se les administraron via i.n. 0,75 nmol de UC-1V150 o UC-1V150/MSA por raton 1 dfa antes de infectarlos con antrax. Los ratones control recibieron solo una solucion salina o una solucion salina que contema MSA en cantidades equivalentes a las de UC-1V 150/MSA. La infeccion se llevo a cabo via i.n. con 2x105 a 8x105 esporas de B. anthracis en un volumen de 20 ml. Se observo la supervivencia durante 13 dfas, ya que la mayona de los ratones tratados con solucion salina murieron en 3-6 dfas. Se obtuvieron resultados de ocho ratones por grupo.

Infeccion de ratones Balb/c con virus de la gripe. En los Centers forDisease Control and Prevention (Atlanta, GA) se obtuvo un virus de la gripe A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1). El virus se propago dos veces en celulas renales caninas MadinDarbi (MadinDarbicaninekidney - MDCK) y ademas se paso 7 veces por ratones para hacerlo virulento, seguido de otro paso por cultivo celular para amplificarlo. Los ratones fueron anestesiados via i.p. con ketamina (100 mg/kg) e infectados via i.n. con el virus en una cantidad de aproximadamente 105,0 dosis infecciosas de cultivo celular por raton, en un volumen de inoculo de 50 jl. Veinticuatro horas antes de la exposicion al virus, se administro una sola dosis intranasal de 75 jl de solucion salina sola o de solucion salina que contema UC-1V10/MSA, hasta 5 nmol por raton. Se hizo un seguimiento de la supervivencia durante 21 dfas de diez ratones infectados por grupo tratado y 20 animales de control con placebo.

Estadistica. Los niveles de citoquinas se compararon mediante el ensayo U de Mann Whitney con p < 0,05 para determinar la significancia estadistica. Para comparar las diferencias en la supervivencia se realizaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y pruebas log rank utilizando el so/fwareGraphPadPrism version 4.0c (San Diego, CA).

Resultados

Potente liberacion de citoquinas in vitro e in vivo en respuesta a conjugados de UC-1V 150/MSA (no reivindicados). La incubacion de macrofagos derivados de medula osea (BMDM) exclusivamente con UC- 1V150m estimulo la liberacion de citoquinas (Figura 10). Cuando se conjugaron con MSA se detectaron niveles similares o mayores de citoquinas con una concentracion equivalente 10 veces menor del agonista de TLR7. Los experimentos con transformantes de TLR, realizados tal como se describe mas arriba, confirmaron que el UC-1V150, similar al compuesto que carece de la modificacion de aldehfdo (UC-1V136), era un agonista de TLR7 espedfico (Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:1828 (2006)). Despues de una inyeccion i.v. en ratones, el UC-1V150 indujo niveles de citoquinas en suero que alcanzaron un valor maximo aproximadamente 2 horas despues de la inyeccion y luego disminuyeron rapidamente hasta cerca de niveles basales (datos no mostrados). La comparacion de los perfiles de produccion de citoquinas del UC-1V150 frente al UC-1V150/MSA 2 horas despues de la inyeccion i.v. en diversas dosis demostro que el conjugado de MSA aumento la potencia en un factor entre 10 y 100 (Figura 11). Los sueros de grupos de control de solucion salina o MSA mostraron niveles de citoquinas muy bajos o no detectables (datos no mostrados).

Los conjugados de UC-1V150/MSA (no reivindicados) proporcionan actividad pulmonar prolongada y localizada. Para asegurar el suministro adecuado de los agonistas de TLR7 al sistema respiratorio, inicialmente los farmacos se administraron directamente en la traquea. En el lfquido de lavado alveolar bronquial (BALF) extrafdo de ratones tratados via intratraqueal (i.t.) con UC-1V 150/MSA se observo una

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induccion esencial de citoquinas, mientras que los niveles de citoquinas en suero eran muy bajos y cercanos a los niveles basales en los mismos animales (Figura 12). Por el contrario, se observaron niveles similares de citoquinas tanto en BALF como en sueros de ratones inyectados v^a i.t. con agonistas de TLR7 de moleculas pequenas, que a veces indudan cambios de comportamiento, como pelo de punta al final y escalofnos, lo que sugiere un smdrome de citoquinas (Tabla 2). Estudios posteriores con UC-1V150 mostraron que la administracion intranasal (i.n.) tambien induda una produccion selectiva de citoquinas en el BALF, probablemente debido a la aspiracion de farmaco. Por consiguiente, para evaluar los conjugados de UC- 1V150 en dos modelos animales infecciosos de neumoma se utilizo una administracion i.n. Los ratones tratados previamente via i.n. con UC-1V 150/MSA un dfa antes de la infeccion con esporas de B. anthracis presentaron una supervivencia media prolongada de 7,5 dfas, en comparacion con 5 dfas en los ratones de control (P < 0,025) (Figura 14A). En cambio, en ratones tratados con solucion salina, con la cantidad equivalente de MSA o con UC-1V150 no se observo ninguna diferencia significativa. Estos datos confirmaron que el conjugado de UC-1V150 tema actividad inmunoterapeutica intrapulmonar, pero no el farmaco libre. Por consiguiente, la conjugacion del agonista de TLR7 con MSA aumento su potencia y redujo su toxicidad despues del suministro local al tracto respiratorio.

En otro estudio, se trataron ratones BALB/c previamente via i.n. con el conjugado de UC-1V150/MSA 1 dfa antes de infectarlos con el virus de la gripe (cepa H1N1). La supervivencia media de los ratones tratados se prolongo a 11,5 dfas, en comparacion con 7 dfas en los controles no tratados (P < 0,0001) (Figura 14B). En conjunto, estos resultados sugieren que la conjugacion del agonista de TLR7 con MSA aumentaba su potencia y reduda su toxicidad despues de una administracion local en el tracto respiratorio.

El UC-1V 150/MSA se administro via i.n. antes de la infeccion con antrax, seguida de tratamiento con ciprofloxacina (25 mg/kg) el dfa 4. Un tratamiento con placebo seguido por un tratamiento con ciprofloxacina resulto en una supervivencia de aproximadamente el 15-25%, mientras que un tratamiento con un conjugado y ciprofloxacina resulto en una supervivencia de aproximadamente el 90%. Por consiguiente, el conjugado es particularmente util como coadyuvante con una vacuna del antrax.

Discusion

El compuesto UC-1V150 (no reivindicado) es uno de los ligandos de TLR7 de moleculas pequenas sintetico mas potente y versatil descubierto hasta la fecha porque (i) es activo a concentraciones nanomolares; (ii) se puede acoplar a diversas macromoleculas con intensificacion de la actividad en algunos casos; y (iii) sus propiedades farmacocineticas se pueden cambiar modificando los grupos auxiliares. El conjugado de protema de TLR7 UC-1V150/MSA (no reivindicado) se caracterizaba por tener aproximadamente cinco moleculas pequenas unidas de forma covalente a cada molecula de protema de MSA. El conjugado retema la actividad de agonista de TLR7 y de hecho era mas potente y tema una mayor duracion de accion, en comparacion con el farmaco monomerico libre. Ademas, este conjugado se podfa suministrar eficazmente al sistema respiratorio mediante administracion i.n. o i.t. Se comprobo que la administracion del farmaco via i.n. era eficaz en un modelo de raton de infeccion bacteriana. Cuando se considera el suministro al sistema respiratorio, una ventaja potencialmente importante de la preparacion de agonistas de TLR7 como conjugados de macromoleculas es que es posible evitar los efectos secundarios sistemicos limitando la actividad inmunoestimuladora al entorno de mucosa local.

Es de esperar que el conjugado macromolecular sea absorbido en la circulacion sistemica mas lentamente que el farmaco libre y, de hecho, puede ser capturado avidamente por macrofagos residentes y celulas dendnticas que expresan TLR7. Por consiguiente, el conjugado debena mitigar el tipo de efectos secundarios graves asociados al suministro sistemico de agonistas de TLR7/8. El conjugado UC-1V150/MSA tambien puede proporcionar una actividad inmunoterapeutica beneficiosa cuando se administra a mucosas, como los tractos genitourinario y gastrointestinal, para el control de enfermedades infecciosas, alergicas o malignas. El soporte macromolecular del agonista de TLR7 tambien puede proporcionar un metodo mejorado para suministrar selectivamente el agente inmunoterapeutico a un organo o tejido espedfico. Por ejemplo, los conjugados de lfpido de UC-1V150 se pueden incorporar en liposomas de diferentes tamanos y composiciones, mientras que los conjugados de protema del agonista de TLR7 pueden estar dirigidos a diferentes subgrupos de celulas dendnticas. Las diferencias en el trafico intracelular del conjugado de UC- 1V150 pueden inducir distintos patrones de produccion de citoquinas, analogamente a los efectos observados con oligonucleotidos activadores de TLR9 (Rothenfusser y col., Hum. Immunol., 63:111 (2002)).

Un problema potencial observado con los farmacos conjugados con protemas es el desarrollo de anticuerpos contra la parte similar a hapteno de bajo peso molecular de la molecula. Sin embargo, el UC-1V150, a diferencia de los conjugados de vacuna de TLR7/8 anteriormente estudiados, tiene una estructura simple similar a la adenina, que es poco probable que induzca reacciones de hipersensibilidad. De hecho, no se han observado anticuerpos anti-UC-1V150 despues de la administracion de los conjugados de protema, excepto despues de la administracion reiterada de un soporte de hemocianina de Megathuracrenulata (lapa californiana) en adyuvante completo de Freud (datos no publicados).

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Actualmente se buscan nuevos agentes para la prevencion y el tratamiento de infecciones por el virus de la gripe, en particular con la propagacion de cepas altamente patogenas de Asia. Todos los anos se produce una alta morbilidad y mortalidad por las cepas que circulan normalmente. El tratamiento de la infeccion se puede llevar a cabo mediante farmacos antivirales aprobados, que son moderadamente eficaces si se inician de forma temprana. Tambien se esta investigando un reforzamiento del sistema inmunologico como una estrategia que podna acelerar las respuestas antivirales protectoras, en especial en huespedes con el sistema inmunologico comprometido. Es posible que la activacion inmunologica sistemica a traves de senales de TLR no cree el gradiente de citoquinas y quimioquinas local necesario para movilizar celulas inmunologicas hacia el lugar de infeccion. Apoyando esta hipotesis, el UC-1V150, que es rapidamente absorbido a traves de la mucosa, no protegio los ratones frente a la infeccion por B. anthracis, mientras que el conjugado de UC-1V150 sf fue eficaz.

El B. anthracis se ha convertido en un agente de bioterrorismo. Una respuesta rapida contra patogenos microbianos es cntica para una biodefensa eficaz. En general, un anticuerpo o respuesta inmune celular puede proteger contra estos patogenos; sin embargo, la generacion de estas respuestas protectoras requiere rapidamente una exposicion previa a antfgenos espedficos para cada organismo. Aunque es sabido que el virus de la gripe se acopla con TLR7 (Barchet y col., Eur. J. Immunol., 35: 360 (2005)), el antrax bacteriano muy probablemente se pueda acoplar con TLR2, TLR4 y TLR9. Ademas de ser un producto intermedio de senales comun para los TLR, tambien se ha demostrado que el MyD88 es necesario para la resistencia a la infeccion en un modelo de antrax en ratones (Hughes y col., Infect. Immun., 73: 7535 (2005)). Dado que el conjugado de UC-1V150 funciona eficazmente como adyuvante contra infecciones que utilizan diferentes vfas, puede ser aplicado como una estrategia de biodefensa que no necesitana ser espedfica para los antfgenos de un microbio en particular y que sena util tanto en caso de ataques mixtos como de ataques simples.

Ejemplo V

No existe ninguna vacuna de SA conocida que sea suficientemente potente o que pueda actuar con suficiente rapidez para prevenir infecciones por SA en pacientes "de riesgo" antes de la hospitalizacion. Una sola inyeccion de un agonista de TLR7 potente y bacterias gram-positivas inactivadas, por ejemplo SA, o una subunidad de las mismas, puede estimular una inmunidad protectora frente a las bacterias en un plazo de una semana desde la administracion. La inyeccion puede incluir, por ejemplo, 1) un agonista de TLR7, tal como UC-IV199 (no reivindicado), conjugado directamente con grupos amino libres en bacterias gram positivas inactivadas, 2) un agonista de TLR7, tal como UC-IV199, conjugado con albumina en combinacion con bacterias gram-positivas inactivadas, 3) un agonista de TLR7, tal como UC-IV199, conjugado con una protema bacteriana gram-positiva recombinante, o 4) un agonista de TLR7, tal como UC-IV199, conjugado con polisacaridos bacterianos gram-positivos (por ejemplo a traves de engarces conocidos en la tecnica, tal como el utilizado en StaphVax®).

Tal como se describe mas arriba, un agonista de TLR7 se conjugo con esporas irradiadas letalmente de la cepa de vacuna Sterne de Bacillusanthrads (BA). Como el SA, el BA es una bacteria gram-positiva. En comparacion con las esporas solas, la bacteria conjugada era un potente activador de macrofagos derivados de medula osea (BMDM) de raton de acuerdo con la medicion mediante secrecion de citoquinas (IL-12 e IL- 6). En otro experimento, una sola inyeccion en ratones de esporas irradiadas letalmente de la cepa Sterne de BA, mezcladas con un agonista de TLR7 conjugado con albumina de raton (MSA) protegio los animales contra una provocacion letal con BA intrapulmonar administrada solo seis dfas despues. En cambio, la inyeccion de los animales solo con esporas de BA, o con BA mas un adyuvante convencional, toxina del colera (CT), no protegio los animales. Por consiguiente, una vacuna de albumina de agonista de TLR7/esporas irradiadas indujo una inmunidad protectora frente al Bacillusanthrads en un plazo de 6 dfas. Esta rapidez de la respuesta en un animal naive era totalmente inesperada. La misma tecnologfa de vacuna probablemente protegera a los humanos frente a las infecciones por Sa adquiridos en hospital.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Compuesto segun la siguiente formula

   imagen1

   5 2. Composicion farmaceutica que comprende el compuesto segun la reivindicacion 1.
2. 3. Composicion segun la reivindicacion 2, que incluye nanopartfculas de liposoma que comprenden el compuesto segun la reivindicacion 1 con colesterol, DOPE y otros Kpidos con un diametro hidrodinamico de aproximadamente 100 nm.
3. 4. Compuesto segun la reivindicacion 1 para su uso como agente inmunoestimador.

   10 5. Compuesto segun la reivindicacion 1 para su uso en la prevencion, tratamiento o inhibicion del

   asma.