CN101790380A - 合成tlr激动剂的缀合物及其应用 - Google Patents

合成tlr激动剂的缀合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了适用于疫苗以及预防、抑制或治疗多种疾病包括病原体感染和哮喘的TLR激动剂及其缀合物。

Description

合成TLR激动剂的缀合物及其应用
相关申请的相互参引
本申请要求以2007年2月7日提交的序列号为60/888,699的美国申请作为优先权基础，该申请的内容以引用的方式纳入本说明书。
政府权利声明
本文所述发明是在美国国立卫生研究院颁布的授权号为AI056453的政府基金的资助下完成的。美国政府对于本发明享有一定权利。
背景技术
最近十年来已获悉很多关于微生物病原体的先天识别的分子机理。普遍接受的观点是，许多体细胞能够表达多种能检测潜在病原体的模式识别受体，而与适应性免疫系统无关(见Janeway et al.，Annu. Rev.Immunol.，20：197(2002))。所述受体被认为与被称为病原体相关分子模式(PAMP)的微生物组分相互作用。PAMP的实例包括肽聚糖、革兰氏阳性细胞壁中的脂磷壁酸、甘露糖(其通常存在于微生物的碳水化合物中，但在人体内罕有)、细菌的DNA、病毒的双链RNA，以及真菌细胞壁中的葡聚糖。PAMP通常满足某些标准，所述标准包括：(a)它们由微生物表达而不是由微生物的哺乳动物宿主表达，(b)在多种不同的病原体中都具有保持的结构，和(c)能够刺激先天免疫。已发现类铎受体(Toll-like receptor，TLR)在PAMP检测中和对微生物感染的早期应答中发挥关键性作用(见Underhill et al.，Curr. Opin.Immunol.，14：103(2002))。已经识别了十种哺乳动物TLR和许多这些TLR的激动剂。例如，TLR7和TLR9分别对咪喹莫特(imiquimod)和免疫刺激性CpG寡核苷酸(ISS-ODN)进行识别和应答。合成免疫调节剂R-848(瑞喹莫德(resiquimod))能够激活TLR7和TLR8。尽管TLR的激活能够引发共有的信号传导级联反应(包括衔接蛋白MyD88、转录因子NF-κB、以及促炎细胞因子和效应细胞因子)，但某些细胞类型仍倾向于产生特定的TLR。例如，TLR7和TLR9主要存在于树突细胞(DC)与B淋巴细胞中的内体的内表面上(在人体内；小鼠的巨噬细胞表达TLR7和TLR9)。另一方面，TLR8存在于人的血液单核细胞中(见Hornung et al.，J.Immunol.，168：4531(2002))。
干扰素(INF)类也参与免疫应答的有效诱导，尤其在病毒感染之后(Brassard et al.，J.Leukoc.Biol.，71：568(2002))。但是，许多病毒能产生多种在各种水平上阻碍干扰素的产生或作用的蛋白质。干扰素的拮抗被认为是一种规避先天性免疫以及适应性免疫的一般策略(见Levy et al.，Cytokine Growth Factor Rev.，12：143(2001))。尽管TLR激动剂对一些治疗方法来说可能具有足够的活性，但是在一些情况下微生物干扰素拮抗剂能够减弱合成TLR激动剂的辅助效果。
对微生物感染的更具特异性的反应是基于自动免疫接种和被动免疫接种。如果认为通用免疫接种不具有成本效益(或药物经济学上不可行)，那么对能得益于免疫预防的高危群体的识别可能具有成本效益，尽管可能无法直接识别该群体。但是，对于特定的细菌感染例如葡萄球菌感染，有一些定义明确的高危群体，包括透析患者、进行脑室腹膜分流术的患者、感染性心内膜炎高危患者以及疗养院的居住者，这些群体都遭受着慢性病症的困扰，这些病症使他们感染葡萄球菌的风险不断增加。而且，这些患者中，许多患者感染与医疗护理相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(healthcare-associatedmethicillin-resistant Staphylococcus aureus，HAMRSA)的风险也有增加。但是，与防止感染相比，阻止葡萄球菌群集可能更易做到。
使用多克隆抗体(Capparelli et al.，Antimicrob.Agents Chemo.，49：4121(2005))或单克隆抗体(mAb)(www.biosynexus.com/productcandidates.html)的被动免疫预防可即时(尽管是短期的)保护不能等待疫苗作用显现或免疫系统受损过度而不能对疫苗产生应答的患者。被动免疫预防的一种可能的适应症是MRSA相关感染的医院内的爆发。在该情形下，暴露于感染的个体可通过即时预防获益，而居住在同一个病区或长期疗养机构的个体可通过自动免疫接种获益。此外，重症监护病房患者是被动免疫预防的潜在受益者，因为他们都可能具有一种或多种葡萄球菌感染风险因素。
发明内容
本发明提供通过稳定的共价键与大分子相连的合成TLR激动剂的缀合物和包括所述缀合物的组合物，以及应用所述缀合物的方法。所述缀合物可包括与合成TLR激动剂(例如TLR7或TLR9激动剂)直接相连的大分子、或通过一种接头(例如氨基、羧基或丁二酰胺基团)与TLR激动剂相连的大分子。例如本发明的缀合物包括一种与以下大分子共价相连的合成TLR激动剂(药效团)：例如，肽；多肽，例如抗体或其抗原结合片段；脂质；聚合物，例如聚乙二醇；珠，例如聚苯乙烯珠；或树突状物(dendrimer)。本发明的缀合物为广谱、长效和无毒的合成免疫刺激剂，其适用于激活哺乳动物例如人类的免疫系统。具体而言，本发明的缀合物可使免疫应答最优化，同时抑制与非缀合TLR激动剂有关的不良的全身副作用。
合成TLR激动剂可有助于使该缀合物指向靶细胞内体内的TLR并促进大分子的送递。在一个实施方案中，合成TLR激动剂为特异性针对内体TLR的激动剂。在一个实施方案中，TLR激动剂可为TLR7、TLR8、TLR3或TLR9激动剂。此外，合成TLR激动剂可增强对大分子的应答(例如免疫应答)。类似地，大分子可适用于激活免疫系统和/或可使缀合物指向特定细胞。因此，大分子——例如具有与合成TLR激动剂相连的伯氨基的大分子——可增强合成TLR激动剂的活性或具有另外的有益的活性。例如，大分子可通过帮助激动剂指向靶细胞内体内的TLR、通过增强由TLR激动剂诱导的信号转导、或通过使受体交联、或上述方式的任何结合而强化TLR激动剂的活性。在一个实施方案中，大分子为一种自发纳入脂质体中的脂质。在一个实施方案中，大分子为一种表面具有胺基的纳米粒。在与TLR激动剂偶联之后，可驻留(或存在)于内体中的TLR激动剂-纳米粒缀合物的尺寸可为例如约100nm。
医院获得性金黄色葡萄球菌(SA)感染是造成发病和死亡的主要原因。然而，疫苗不能用于急性环境，这是因为它们需要太长的时间才能发挥作用，并且它们对于免疫受损患者无效。本发明提供了一种快速接种具有革兰氏阳性细菌感染例如SA感染风险的患者的方法，所述方法使用类铎受体-7(TLR7)激动剂和一种或多种革兰氏阳性细菌抗原(免疫原)。使用本发明的疫苗可在约6天内诱发免疫，由此可用于不适用标准接种方案(例如急性医疗环境)的应用中。
如本文所述，制备了一种包括革兰氏阳性细菌、炭疽杆菌(Bacillus anthracis，BA)和一种合成TLR7激动剂的组合物。所述组合物诱发体外的IL12和IL6分泌(骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)激活的表现)，并保护小鼠抵抗体内随后原本要发生的致命肺内BA攻击。具体而言，含有一种TLR7激动剂缀合物和一种免疫原(UC-IV199-白蛋白/经辐射的BA芽孢)的组合物的施用在6天内诱发对BA的保护性免疫。但是，仅使用BA芽孢或使用BA加一种常规佐剂(例如霍乱毒素(CT))注射动物体则不能保护该动物体免于致命攻击。在未经用药的动物体内保护性免疫应答的快速程度是出乎意料的。
因此，本发明提供了免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括：一种与革兰氏阳性细菌细胞偶联(例如，与灭活的金黄色葡萄球菌上的游离氨基偶联)的合成TLR激动剂，例如TLR7激动剂，例如UC-IV199；一种与分离的革兰氏阳性细菌抗原的细菌提取物偶联的合成TLR激动剂，例如TLR7激动剂；一种与分离的革兰氏阳性细菌蛋白(例如重组蛋白)偶联的合成TLR激动剂，例如TLR7激动剂；或一种与分离的革兰氏阳性细菌碳水化合物偶联的合成TLR激动剂，例如TLR7激动剂。例如可通过一些使金黄色葡萄球菌多糖与蛋白载体(例如用于破伤风类毒素的蛋白载体)相连的方法使合成TLR7激动剂与细菌碳水化合物偶联。灭活的细菌制剂可通过γ辐射、加热或化学处理制备。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括：一种与佐剂和一种含有灭活的革兰氏阳性细菌细胞的制剂偶联的合成TLR激动剂，例如TLR7激动剂；一种与佐剂和一种含有革兰氏阳性细菌提取物的制剂偶联的合成TLR激动剂，例如TLR7激动剂；或一种与佐剂和一种含有分离的革兰氏阳性细菌抗原(例如重组蛋白)的制剂偶联的合成TLR激动剂，例如TLR7激动剂。例如所述免疫原性组合物可包括与白蛋白和一种含有灭活的革兰氏阳性细菌(例如灭活的金黄色葡萄球菌)的制剂偶联的UC-IV199。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括一种与佐剂和一种含有重组革兰氏阳性细菌抗原或分离的革兰氏阳性细菌碳水化合物的制剂偶联的合成TLR7激动剂，所述重组革兰氏阳性细菌抗原例如分离的革兰氏阳性细菌蛋白或其肽。在一个实施方案中，单剂量的免疫原性组合物可在短时间例如少于约10天内表现出极强的活性，例如提供保护性免疫。
在一个实施方案中，在住院治疗之前0至7天对受试者施用无菌疫苗。在一个实施方案中，疫苗为肌内给药。在一个实施方案中，疫苗以10μg至10mg的剂量给药。
当可用的多用途化学方法允许进行与任何抗原的缀合、并且可修饰的缀合物具有确定的化学计量时，使用本发明的合成TLR激动剂(例如TLR7激动剂)的缀合物将非常有利。所述缀合物的制备花费低且药效强大，并由此提供快速的保护，故可在急性环境例如创伤、烧伤、术前或生物恐怖侵袭(bio-terrorism)时使用。
因此，提供一种如下的式(I)化合物，或其可药用盐：
Figure G2008800115258D00051
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Y为S或NH；
其中Rc为氢、C1-10烷基或被C3-6环烷基取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基或氰基；
其中R1为(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；
其中R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；
其中Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
其中X2为一个键或一个连接基团；
其中R3为一种大分子；
其中n为1、2、3或4；
其中m为1、2、3或更大；例如5、10、15或更大；
其中q为1、2、3，或最多达约1,000、约10,000或更大，例如约105、约106或更多。在一个实施方案中，q为1，且m为1至20或其间的任何整数。在另一个实施方案中，m为1，且q为＞2。在一个实施方案中，m为1，且R3可为一种病毒——例如一种非猿免疫缺陷病毒(SIV)的慢病毒、反转录病毒、立杆病毒、鼻病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一种革兰氏阳性细菌或细菌芽孢或者一种纳米粒或一种珠例如二氧化硅珠，并且q为102、103、104、105、106或更大。因此所述缀合物可包括TLR激动剂的多聚体、大分子的多聚体或上述两者。所述多聚体可为线状或分支状。
在一个实施方案中，R3可为一种包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阳性细菌的肽、革兰氏阳性细菌的蛋白质、革兰氏阳性细菌的碳水化合物或一种佐剂的大分子，所述佐剂例如为异源蛋白或肽，即源自革兰氏阳性细菌以外来源的蛋白质或肽，例如宿主细胞蛋白或肽，例如白蛋白或卵清蛋白；或异源脂质、异源核酸、珠例如聚苯乙烯珠、纳米粒或树突状物。
因此，在多个实施方案中，m可为1或2；且q可为1或2。在一些实施方案中，m为1，且R3基团的表面与成百上千或更多q个基团相连。例如，二氧化硅颗粒的反应活性位点可以用于将二氧化硅颗粒连接至本文上式的基团部分上。对于此构型而言，R3可为本文所述的其它任何大分子，例如纳米粒、珠、树突状物、脂质、芽孢或细菌细胞。在另一些实施方案中，上式与基团R3可形成一种具有3至约10个重复单元的交替重复链(例如式-R3-式-R3-式-R3等)。
本发明缀合物中的大分子与TLR激动剂形成一个稳定的键，即所述缀合物不发挥前药的作用。所述大分子可包括由碳、氧、氢、氮、硫、磷或其任何结合组成的有机分子，只要该大分子不危害身体组织即可(例如其无毒并且/或者不引发炎症)。所述大分子可使得靶向目标或增强免疫应答，例如所述大分子可为一种抗原，例如黑色素瘤特异性肽。
在多个实施方案中，当本文所述的任何结构式的分子中存在多于一个的R3时，R3可各自相同，或R3基团可彼此不同。因此，当存在多于一个的R3基团时，R3各自独立地为针对各式所定义的基团。
此外，本发明提供一种药用组合物，其包含至少一种式(I)的化合物或其可药用盐，并结合有可药用的稀释剂或载体。
除TLR激动剂缀合物和其它分子之外，本发明还包括合成TLR激动剂与大分子的缀合物的应用。所述缀合物可用于预防、抑制或治疗包括但不限于以下的疾病：过敏性哮喘；传染病，例如病毒性呼吸道感染，如与流感病毒或呼吸道合胞病毒(RSV)感染有关的病毒性呼吸道感染；狼疮；和其它的自身免疫疾病；并且所述缀合物可用作疫苗，例如癌症或传染病的疫苗。在一个实施方案中，单剂量的缀合物对于刺激免疫应答可表现出极强的活性。此外，由于缀合物的低毒性，在一些情况下可以以较高的剂量给药，例如在全身性给药的情况下；然而在另一些情况下可以以较低的剂量给药，例如，由于缀合物的定域作用。在一个实施方案中，当以高剂量给药时，合成TLR激动剂缀合物可诱发拮抗反应，因此可适用于抑制或治疗哮喘或自身免疫疾病。首次剂量可诱发高应答，该高应答转而抑制免疫应答，从而避免发生炎症。因此较高剂量和再次给药的应用可导致对免疫应答的抑制。
在一个实施方案中，本发明提供一种预防或抑制哺乳动物的革兰氏阳性细菌感染的方法。所述方法包括对哺乳动物施用一种有效量的组合物，所述组合物包含一种革兰氏阳性细菌的细菌抗原和一定量的式(IA)化合物或其可药用盐，所述盐包括其水合物，
Figure G2008800115258D00081
其中X1为-O-、-S-或-NRc-；
其中Rc为氢、C1-10烷基或取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R1为氢、(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
X2为一个键或一个连接基团；n为1、2、3或4；且R3为一种大分子，包括异源肽、异源蛋白质、异源脂质、珠例如聚苯乙烯珠、异源核酸分子或树突状物。
在某些实施方案中，上述基团R1的定义可与本文所述的其他任何式的基团R1的定义交互使用。
因此，大分子或接头的非限制性实例不仅包括氧原子、硫原子、氮原子或碳原子(如果需要，适当地附加氢原子以补充化合价)，还包括具有能增加溶解性的侧链的大分子或接头，例如含有吗啉代环、哌啶子基环、吡咯烷环或哌嗪环等的基团；氨基酸类、氨基酸聚合物类(蛋白质或肽)，例如二肽或三肽等；碳水化合物(多糖)；核苷酸，例如PNA、RNA和DNA等；有机物质聚合物，例如聚乙二醇、聚交酯等；单体脂质和聚合脂质；不溶性有机纳米粒；无毒的机体物质，例如细胞类、脂质类、抗原类，例如微生物，所述微生物例如病毒、细菌、真菌等。抗原类可包括失活的整个生物体或其亚组分等。
此外，还提供一种预防或抑制哺乳动物的革兰氏阳性细菌感染的方法。所述方法包括对哺乳动物施用一种有效量的式(IB)化合物或其可药用盐，所述可药用盐包括其水合物，
Figure G2008800115258D00091
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Rc为氢、C1-10烷基或取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R1为氢、(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
X2为一个键或一个连接基团；n为1、2、3或4；且R3为所述革兰氏阳性细菌、一种所述革兰氏阳性细菌的分离的抗原性蛋白或肽，或一种所述革兰氏阳性细菌的分离的多糖。在一个实施方案中，所述革兰氏阳性细菌为一种葡萄球菌。在一个实施方案中，R3为一种葡萄球菌的分离的抗原性蛋白质或肽，并且该化合物与一种灭活的葡萄球菌的制剂一起给药。
本发明提供了一种用于医学疗法的本发明化合物(例如，用于预防细菌性疾病，例如用于疫苗中)。本发明化合物还适用于生物防御，例如抵抗炭疽杆菌。
此外，还提供了用于医学疗法的本发明的组合物和化合物，例如用于治疗哮喘或病毒感染、或预防病毒感染；以及将所述缀合物用于制备治疗TLR相关病症或症状或表现出增强的免疫应答或抑制的免疫应答的病症或症状的药物的应用。
此外，本发明还提供一种药物组合物，其包含至少一种本发明的化合物或一种其可药用盐，并结合有可药用的稀释剂或载体；所述药物组合物还任选地结合有一种选定的革兰氏阳性细菌的制剂(例如灭活制剂或提取物)、选定革兰氏阳性细菌的分离的蛋白质、或选定革兰氏阳性细菌的分离的碳水化合物(多糖)。
本发明包括TLR7激动剂与一种大分子的缀合物的应用，所述大分子(例如具有伯氨基)能够增强激动剂的活性，例如白蛋白；或具有一种独立的所需活性，例如为革兰氏阳性细菌的抗原。缀合物可包括直接与TLR7激动剂连接的大分子、或通过接头与TLR7激动剂连接的大分子。缀合物可最优化免疫应答，同时限制TLR7激动剂的不良全身性副作用。
在一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗哺乳动物例如人的革兰氏阳性细菌感染的方法。所述方法包括对需要这类治疗的哺乳动物施用一种有效量的本发明化合物或一种其可药用盐，所述化合物或其可药用盐与一种佐剂或与至少一种革兰氏阳性细菌的抗原缀合。
此外，还提供了一种识别适用于预防、抑制或治疗特定病症或症状的缀合物的方法，例如通过识别体内或体外通过缀合物诱导的细胞因子谱，或识别例如早期、中期或晚期的具有针对TLR激动剂的TLR的内体。由于不同的细胞具有不同的内体，故对细胞中内体模式的识别可使缀合物靶向特定的细胞类型，或促进缀合物接近内体。
附图说明
图1示出一种TLR激动剂/α-半乳糖-神经酰胺缀合物。
图2示出一种G1 PAMAM与乙二胺母核的UC-1V150缀合物。
图3A示出一种连接大分子和合成TLR激动剂的接头(SANH)。
图3B示出UC-1V150的合成。
图3C示出UC-1V150与MSA的缀合。将200μl MSA(25mg/ml)与100μl缀合缓冲液(1M磷酸盐，pH＝7.2)和690μl PBS混合。将含844μg SANH的10μl DFM(40倍摩尔过量于MSA)加入至蛋白溶液中(反应混合物中NP的最终浓度为5mg/ml)。稍作混合后使反应在室温下进行2h。为除去过量的SANH，将反应混合物装载至微旋过滤装置(microcon spin filter device，YM-3，Millipore)，并浓缩至约70μL。将溶解于10μl DMF中的460μg UC-1V150加入经SANH修饰的MSA中，并将该反应混合物在室温下培养过夜。首先将反应混合物用微旋过滤装置(Millipore：YM-3)浓缩至50μl，然后装载至G25微旋柱上(GE Healthcare)，以除去过量的UC-1V150。
图4为式I化合物(OVA/SANH/UC-1V150缀合物)的吸收曲线(于约350nm处)的示图。
图5示出合成TLR7激动剂UC-1V150与小鼠血清白蛋白(MSA)的缀合反应的吸光度曲线。UC-1V150与鼠血清白蛋白(MSA)的比例约为5∶1。
图6示出TLR激动剂/磷脂缀合物。
图7示出以不同剂量和时间给药的UC-1V199/脂质的作用。
图8A-B示出UC-1V199/脂质抑制TLR7和TLR2信号传导。
图9示出对超强(ultrapotent)TLR7激动剂(皮摩尔/纳摩尔激动剂和小分子拮抗剂)的双相(biphasic)剂量反应。
图10A和B示出UC-1V150/MSA缀合物能够激活鼠类动物的骨髓来源巨噬细胞(图表A)和人外周血液单核细胞(图表B)。细胞用多种浓度的缀合物培养，对于BMDM，浓度为0.5nM至10μM，或者，对于PBMC，浓度为0.1-10μM。24h后收集培养上清液并用Luminex分析细胞因子水平。
图11A、B和C示出TLR7激动剂缀合物的体内药效。每只C57BL/6小鼠用不同量的UC-1V150(醛基修饰的SM-360320)或UC-1V150/MSA注射(尾静脉注射)。收集血清试样并用Luminex分析细胞因子水平。未缀合的合成TLR7激动剂SM-360320的作用仅持续2小时，而UC-1V150/MSA能持续作用至少6小时。
图12示出UC-1V150/MSA缀合物的体内持续局部活性，其无全身性效应。将C57BL/6小鼠麻醉并对其施用3nmol的UC-1V150/MSA(鞘内注射)。在指定时间点时处死小鼠并收集BALF和血清。将两组独立实验的数据合并，每组至少6只小鼠。结果以平均值±SEM示出。
图13示出经辐射的炭疽芽孢TLR7激动剂缀合物对BMDM中细胞因子的诱导。
图14提供了用UC-1V150/MSA免疫接种小鼠并用芽孢攻击后的小鼠存活率图。A)在炭疽杆菌感染前1天，年龄相当的雌性A/J小鼠以0.75nmol/小鼠的量用单纯的盐水或用含有MSA(与UC-1V150/MSA等量)、UC-1V150或UC-1V150/MSA的盐水鼻内(i.n.)给药，存活率最长评估13天。B)在流感病毒感染前1天，Balb/c小鼠以5nmol/小鼠的量用盐水或UC-1V150/MSA鼻内(i.n.)给药，评估21天的存活率。在每个模型中，使用Kaplan-Meier存活曲线和时序检验确定显著性。每组至少测试8只小鼠。
图15提供单剂量使用含TLR7激动剂和缀合物的疫苗后存活百分数的图表。
图16示出抵抗炭疽芽孢暴露的保护取决于CD4+细胞。
图17示出小鼠的局部细胞因子曲线。C57BL/6小鼠分别用UC-1V150/MSA缀合物或未缀合的UC-1V136以每只3nmol或500nmol的量鞘内(i.t.)给药。在指定时间点收集BALF和血清，并通过多重免疫分析确定细胞因子水平。示出了由每组至少3-5只小鼠得到的平均值±SEM。
图18示出SIV颗粒与UC-1V150直接缀合的吸光度谱线。
图19示出由合成TLR7激动剂和病毒颗粒的缀合物引起的BMDC中的细胞因子诱导。
图20A-B示出UC-1V150/失活SIV的缀合物(图表A)或UC-1V150/OVA/ODN(图表B)对IL-12的产生的作用。骨髓BMDC如所示出的以0.1μg/mL在不同条件下培养24小时。用ELISA测定该细胞培养上清液中的IL-12水平。
图21为OVA/UC-1V150或OVA/ODN(ODN＝寡聚脱氧核苷酸)对骨髓来源树突细胞(BMDC)的刺激作用的示图。
图22为双缀合物(OVA/UC-1V150/ODN 1043)的UV光谱的示意图。
图23为用OVA/ODN/UC-1V150缀合物在BMDC中诱导IL-12的示意图。OVA/1043和OVA/1018为ODN缀合物。
图24示出合成TLR激动剂与脂质体中脂质部分的缀合作用。经由间隔接头与C-15脂质偶联的TLR缀合物的自组装导致形成100nM的纳米粒。TLR激动剂与该脂质的NHS-酯以等摩尔量在DMF和1个当量的三乙胺中反应6小时。反应混合物在50∶50乙腈/水的无梯度洗脱条件下通过制备型HPLC纯化。
图25示出TLR激动剂/脂质体缀合物的示意图。脂质体用胆固醇∶DOPE∶DSPC∶mPEG2000-DSPE∶TLR-DSPE∶BODIPY-DOPE30∶30∶30∶5∶5∶1.5形成；DSPE＝二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；DOPE＝二油酰磷脂酰乙醇胺；BODIPY＝6-(((4-4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-吲丹烯-3-基)苯乙烯基氧基)乙酰基)氨基己酰氨基-DOPE。将胆固醇∶DOPE∶DSPC∶DSPE-TLR激动剂∶DSPE-mPEG(以1∶1∶1∶0.16∶0.16的摩尔比)的氯仿溶液加入30mL玻璃培养管中，于氮气流下干燥并真空干燥至少6小时，以除去全部残留的有机溶剂。将干燥的脂膜在总体积为1mL的无菌去离子水中水合至少12小时。将脂质体涡旋2-3分钟以除去所有粘附的脂膜，并在室温下于浴槽型超声波仪(ULTRAsonik 28X)中声处理2-3分钟以产生多层脂质体(MLV)。然后将MLV用Ti-探头(使用100％占空比(duty cycle)和25W输出功率的Branson 450超声波仪)在冰浴中声处理1-2分钟通过形成澄清半透明溶液以产生所述小单层脂质体(SUV)。该溶液依次通过200nm和100nm聚碳酸酯核微孔膜进行加压过滤以获得多分散因子小于0.1的100nm的脂质体纳米粒。
图26示出脂质缀合物WW-109的合成。将0.45mg(1μmol)的IV-199加入100μL的10mM DOPE氯仿溶液中。向该溶液中加入来自氯仿原液的0.1mg三乙胺。该混合物于室温反应24小时，然后旋蒸出氯仿。白色固体残留物用60％/甲醇/己烷洗涤3次，离心获得白色固体。质谱的m/z为1086且该化合物的紫外最大吸收波长为268nm。不同链长的脂肪酸部分可用来制备类似的化合物，包括在羧酸碳链的任何合适部位具有1个、2个、3个或4个不饱和、环氧化、羟基化或它们的结合的位点的C14-C22羧酸。在一个具体的实施方案中，脂肪酸部分为在C8-C9处具有不饱和位点的C17羧酸。在另一个实施方案中，脂肪酸部分为在C9-C10处具有不饱和位点的C18羧酸。各脂肪酸部分的羧酸部分可相同或不同(见例如图6)。
图27示出与TLR激动剂共价相连的二氧化硅颗粒的示意图。
图28提供了用于制备本发明缀合物或用于本发明方法的示例性化合物。其他缀合物包括与人血清白蛋白偶联的TLR激动剂，例如HSA/UC-1V150或DOPE/UC-1V199。UC-1X-51使α肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平增加3倍(110ng/mL)。
具体实施方式
定义
本文所用术语“抗体”是指具有一种或多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因、以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分作κ或λ。重链分作γ、μ、α、δ或ε，而它们又用来限定免疫球蛋白的类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
已知免疫球蛋白(抗体)的基本结构单元包括一种四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。各链的N-端限定一个可变区，所述可变区具有约100至110或更多个主要引起抗原识别的氨基酸。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指代这些轻链和重链。
抗体可作为完整的免疫球蛋白或各种形式的修饰物存在，所述修饰物包括，例如，FabFc2、Fab、Fv、Fd、(Fab’)2、一种仅含有轻链可变区和重链可变区的Fv片段、一种含有可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)’2片段、一种单链抗体例如scFv、CDR移植抗体等。Fv的重链和轻链可源自相同的抗体，或不同的抗体从而产生一个嵌合的Fv区。该抗体可为动物(特别是小鼠或大鼠)源性或人源性，或可为嵌合的或人源化的。本文所用术语“抗体”包括上述各种形式。
组合物包括一种特定化合物的“基本全部”或一种化合物的特定形式(例如异构体)，此时组合物包括至少约90重量％、优选至少约95重量％、99重量％和99.9重量％的该具体化合物。组合物包括多种化合物的“混合物”或相同化合物的各种形式的“混合物”，此时每种化合物(例如异构体)以重量计占组合物的至少约10％。本发明的嘌呤类似物或其缀合物可以以酸盐或碱盐、或以游离酸或游离碱的形式制备。在溶液中，本发明的某些化合物可作为两性离子存在，其中反荷离子由溶剂分子本身提供，或来自溶解或悬浮于溶剂中的其他离子。
本文所用术语“分离的”是指在体外制备、分离和/或纯化的核酸分子、肽或蛋白质、或其他分子，从而不与体内物质关联或以不同于天然存在方式存在。因此，当术语“分离的”用于核酸、例如“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”时，是指从至少一种通常在来源中与之关联的杂混物(contaminant)中识别和分离出的核酸序列。分离的核酸存在的形式和环境与天然存在时的不同。而非分离的核酸(例如DNA和RNA)以其天然存在的状态存在。例如，给定的DNA序列(例如基因)接近于邻近基因存在于宿主细胞的染色体上；RNA序列(例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)作为与编码各种蛋白质的大量其他mRNA的混合物存在于细胞中。因此，就“分离的核酸分子”而言——其包括染色体组源、cDNA源或合成源或它们的某种组合的多核苷酸，“分离的核酸分子”(1)不关联所述“分离的核酸分子”以天然方式存在于其中时的多核苷酸的全部或部分；(2)与在天然状态下不与其相连的多核苷酸可操作连接；或(3)不以较大序列的一部分天然存在。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。当核酸分子将用于表达蛋白质时，该核酸至少含有有义链或编码链(即该核酸可为单链)，但是也可以同时含有有义链和反义链(即该核酸可为双链)。
本文所用术语“氨基酸”，包括D型或L型的天然氨基酸(例如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu，Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val)残基，以及非天然氨基酸(例如，磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯；马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、施德丁(statine)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺、鸟氨酸、瓜氨酸、-甲基-丙氨酸、对苯甲酰基苯丙氨酸、苯甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸，以及叔丁基甘氨酸)残基。该术语也包括带有一种常规氨基保护基(例如，乙酰基或苯甲氧基羰基)的天然及非天然氨基酸类，以及羧基端被保护(例如，以(C1-C6)烷基、苯基或苯甲基酯或酰胺；或以-甲基苯甲基酰胺的形式)的天然及非天然氨基酸类。其他合适的氨基和羧基保护基为本领域技术人员已知(见，例如，T.W.Greene，Protecting Groups In Organic Synthesis；Wiley：New York，1981，及其中引用的参考文献)。例如，氨基酸可以通过羧基端、氨基端，或通过任何其他常规连接点，例如通过半胱氨酸的硫，连接到式I化合物的残余部位。
术语“类铎受体”(TLR)是指可以与病原体相关分子模式(PAMP)结合并且促进哺乳动物免疫应答的一类受体家族的成员。已经知道十种哺乳动物TLR，例如TLR1-10。
术语“类铎受体激动剂”(TLR激动剂)是指可以与TLR结合的分子。合成TLR激动剂是被设计成可以与TLR结合并且激活该受体的化学化合物。本文提供的示例性合成TLR激动剂包括“TLR-7激动剂”“TLR激动剂”、“TLR-3激动剂”和“TLR-9激动剂”。TLR激动剂包括咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)、溴匹立明(broprimine)和罗唑利宾(loxoribine)。
本文所用术语“核酸”指的是DNA、RNA、单链的、双链的或更高聚集度的杂合基序(hybridization motif)，及其任何化学修饰物。化学修饰物包括但不限于，为核酸配体碱基或对整个核酸配体提供附加电荷、极性、氢键、静电相互作用及流变性的化学基团的化学修饰物。这类修饰物包括但不限于肽核酸(PNA)、磷酸二酯基修饰物(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2’-位糖修饰物、5-位嘧啶修饰物、7-位嘌呤修饰物、8-位嘌呤修饰物、9-位嘌呤修饰物、环外胺的修饰物、4-硫代尿苷的取代物、5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶的取代物；主链修饰物、甲基化物、异常碱基配对的结合物，例如异碱基、异胞苷(isocytidine)和异胍等。核酸还可包括非天然碱基，例如硝基吲哚。修饰物还可包括3’位和5’位修饰物，例如用BHQ、荧光团或其他部分封端。
本文所用术语“可药用盐”是指其中母体化合物通过制成其酸盐或碱盐而被修饰的公开化合物的衍生物。可药用盐的实例包括但不限于，碱性残基(例如胺类)的无机酸盐或有机酸盐、酸性残基(例如羧酸类)的碱盐或有机盐等。可药用盐包括，例如，由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，所述常规无毒盐包括，由无机酸衍生的无毒盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，所述有机酸例如乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。
适用于本发明的化合物的可药用盐可由含有碱性部分或酸性部分的母体化合物通过常规方法合成。通常，所述盐可通过使这些化合物的游离酸形式或游离碱形式与化学计量的合适的碱或酸在水或有机溶剂、或二者的混合物中反应而制备；通常，优选非水性介质，例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列举见Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，p.1418(1985)，其公开内容在此通过引用的方式纳入。
本文所用词语“可药用”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、变应性应答、或以合理的有效/风险比例使用时的其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型。
除非另有指明，使用以下定义：卤代或卤素指氟代、氯代、溴代或碘代。烷基、烷氧基、烯基、炔基等表示直链和支链两种基团；但涉及具体基团例如“丙基”时，只包括直链基团，支链异构基团会被具体指明，例如“异丙基”。芳基表示苯基基团或具有约9至10个环原子并且环中至少一个环是芳香族环的单边稠合双环碳环基团。Het可为杂芳基，其包括，经由含5或6个环原子的单环芳环的环碳原子连接的基团，所述环原子由碳原子和1-4个杂原子组成，所述杂原子各自选自非过氧化物型氧、硫和N(X)，其中X不存在或为H、O、(C1-C4)烷基、苯基或苯甲基；以及由上述基团衍生出的约8至10个环原子的单边稠合双环杂环基团，特别是苯并衍生物，或者通过将丙烯、三甲撑或四甲撑稠合而得到的衍生物。
本领域技术人员应理解，具有手性中心的本发明的化合物可以光学活性形式和消旋形式存在或分离。某些化合物可能具有同质多晶现象。应理解，本发明包括本发明化合物的任何消旋、光学活性、多晶态、或立体异构体形式或其混合物，它们具有本文所述的有用性能，本领域公知如何制备各种光学活性形式(例如，通过采用重结晶技术拆分消旋形式、由光学活性原料进行合成、手性合成、或使用手性固定相进行色谱分离)以及如何使用本文所述的标准测试或本领域公知的其他类似测试确定激动剂活性。本领域技术人员还应理解，本文所述的化合物包括它们的各种互变异构体，其可以各种彼此相互平衡的状态存在。
“治疗有效量”意欲包括用于例如治疗或预防宿主的疾病或失调、或治疗宿主的疾病或失调症状的本发明适用的化合物的量或要求保护的化合物组合物的量。本文使用的“治疗”包括：(i)防止病理病症的发生(例如预防)；(ii)抑制病理病症或阻止其发展；(iii)缓解病理病症和/或减轻与病理病症有关的症状。
本文所用术语“患者”是指待使用本发明方法治疗的生物体。所述生物体包括但不限于，哺乳动物，例如人。在本发明的上下文中，术语“受试者”通常指将接受或已经接受治疗(例如给予本发明的化合物)的个体。
“稳定化合物”和“稳定结构”意指足够稳定以至于在从反应混合物分离为适用纯度之后、以及在配置成有效治疗剂后仍存在的化合物。本文只考虑稳定的化合物。
本发明的TLR激动剂和缀合物及其应用
在一个实施方案中，本发明提供一种预防或治疗哺乳动物例如人的病理病症或症状的治疗方法，其中涉及TLR激动剂的活性并且需要其发挥作用。所述方法包括将有效量的本发明化合物或其可药用盐给药至需要所述治疗的哺乳动物。适于治疗的病理病症或症状的非限制性实例包括癌症；胃肠道、脑、皮肤、关节和其他组织的炎性疾病；细菌性或病毒性疾病；自身免疫性疾病；以及克罗恩病(Crohn’sDisease)。本发明的化合物也可适用于制备抵抗细菌、病毒、癌细胞或癌特异性肽的疫苗，或用于增强抗癌的单克隆抗体，用作CNS兴奋物或用于生物防御。因此，本发明提供用于医学疗法的本发明化合物(例如，用作抗癌剂，用于细菌性疾病的治疗、病毒性疾病例如丙型肝炎和乙型肝炎的治疗、克罗恩病的治疗，并且通常用作治疗免疫性疾病的治疗剂)。此外，本发明化合物可预防癌变，例如丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒所致的癌变，并适用于制备适用于治疗哺乳动物例如人的癌症、病毒性或细菌性感染、克罗恩病和免疫失调的药物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种通过给予本发明的TLR激动剂缀合物治疗哺乳动物的病毒感染的方法。所述病毒感染可以由RNA病毒、作为TLR激动剂起作用的RNA病毒的产物和/或DNA病毒引起。DNA病毒例如为乙型肝炎病毒。在一个实施方案中，所述病毒感染是由可导致严重急性呼吸系统综合征(SARS)的冠状病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒引起。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过给予有效量的本发明的TLR激动剂缀合物来治疗癌症的方法。所述癌症可为干扰素敏感性癌症，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤或肾癌。可治疗的具体癌症包括黑素瘤、浅表性膀胱癌(superficial bladder cancer)、光化性角化症、上皮内瘤样病变(intraepithelial neoplasia)，以及基底细胞皮肤癌、鳞状细胞癌(squamous)等。此外，本发明的方法包括治疗癌症前期病症，例如，光化性角化症或上皮内瘤样病变、家族性息肉病(息肉)、宫颈非典型增生(cervical dysplasia)、宫颈癌、浅表性膀胱癌，以及与感染有关的任何其他癌症(例如淋巴瘤、卡波西氏肉瘤(Karposi’ssarcoma)或白血病)等。
在另一个实施方案中，本发明提供一种通过给予治疗有效量的本发明的TLR激动剂缀合物或这种化合物的可药用盐来治疗自身免疫性疾病的方法。示例性的自身免疫性疾病包括多发性硬化症、狼疮、类风湿性关节炎等。
在另一个实施方案中，本发明提供一种通过给予本发明的TLR激动剂缀合物来治疗克罗恩病的方法。
所述TLR激动剂缀合物可包括一种同功能性(homofunctional)TLR激动剂聚合物，例如由TLR7激动剂或TLR3激动剂形成。TLR7激动剂可为7-硫代-8-氧鸟苷基(TOG)部分、7-去氮杂鸟苷基(7DG)部分、瑞喹莫德部分或咪喹莫特部分。在另一个实施方案中，TLR激动剂可包括杂功能性(heterofunctional)TLR激动剂聚合物。杂功能性TLR激动剂聚合物可包括TLR7激动剂和TLR 3激动剂或TLR9激动剂或所有这三种激动剂。杂功能性TLR激动剂聚合物可包括TLR8激动剂和TLR9激动剂。
本发明包括使选定的大分子与合成TLR激动剂共价缀合，以满足例如所需形状、尺寸和价态，从而最优化所得缀合物的免疫性能、以及/或者使该缀合物靶向或送递至所需细胞或组织。如本文所述，缀合物被设计为适用于多种医疗用途，例如但不限于变应性哮喘、病毒性呼吸道感染(流行性感冒和RSV)、狼疮和其他自身免疫性疾病；以及适用作癌症和传染病疫苗的抗原-佐剂结合物。所述缀合物可提供最优化的免疫应答，同时通过将免疫激活剂(合成TLR激动剂)以稳定共价键系于大分子上而限制不良的全身性副作用。所述大分子可起到免疫应答的靶向实体和/或组成部分的作用，例如作为佐剂-抗原缀合物中的抗原。在局部环境中给予稳定缀合物的主要优点在于仅随时间释放极少量的TLR激动剂进入全身性环境。
在一个实施方案中，所述大分子选自各种产物，例如蛋白质类、脂质类或树突状物，或其表面具有氨基基团的聚合物，例如聚苯乙烯“氨基珠”，其各自具有可用与接头例如SANH缀合、或与合成TLR7激动剂直接缀合的伯氨基。例如，在接头与大分子缀合之后，TLR7激动剂，例如UC-1V150，与SANH-大分子缀合物的NHS酯反应以提供TLR7激动剂-SANH-大分子缀合物。
疫苗通常不能用于急性环境，这是因为：(1)它们需要长时间才能发挥作用；以及(2)它们对于免疫受损患者无效。例如金黄色葡萄球菌(SA)感染是住院患者发病和死亡的主要原因。特别的高危组群是由于烧伤、创伤、导管布置、透析而导致免疫抑制的群组，或疗养院中的因高龄而导致免疫抑制的组群。此外，许多院内获得性SA的菌株对常规的抗生素具有耐药性。
本发明克服上述两方面障碍以进行治疗。本文提供了包括合成TLR7激动剂和合成TLR7激动剂的缀合物、并结合革兰氏阳性细菌抗原的组合物的应用。TLR7配体通常具有不佳的药物代谢动力学，以及快速的全身性吸收和排泄。由于全身性扩散，它们导致细胞因子综合征。有效的佐剂必须产生对细胞因子和趋化因子的“免疫梯度(immunegradient)”。在一个实施方案中，强效的合成TLR7激动剂与大分子的缀合可增强送递特性，改善药物代谢动力学，并通过局域化曝露避免全身性毒性。
在一个实施方案中，本发明提供了一种预防或抑制哺乳动物革兰氏阳性细菌感染的方法，包括给予所述哺乳动物一种有效量的含有革兰氏阳性细菌的细菌抗原和一定量的合成TLR7激动剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或抑制哺乳动物革兰氏阳性细菌感染的方法，包括给予所述哺乳动物一种有效量的与革兰氏阳性细菌抗原缀合的合成TLR7激动剂。例如，1V150-MSA缀合物保留了其TLR7激动剂活性，具有增强的药效和降低的毒性，引起先天性免疫的局部激活，并于单次免疫接种细菌抗原后6天诱发T细胞依赖性免疫保护。
在一个实施方案中，合成TLR7激动剂与一种或多种金黄色葡萄球菌抗原一起给药，或与一种或多种金黄色葡萄球菌抗原缀合。表1提供了与合成TLR7激动剂一并使用——特别是在急性治疗环境中——的金黄色葡萄球菌的示例性抗原。本发明的疫苗意想不到地可获得快速有效的免疫应答。
表1
Figure G2008800115258D00221
Figure G2008800115258D00231
在一个实施方案中，本发明提供以下的缀合物或其可药用盐：
        式(II)化合物                            式(III)化合物
        噻唑并嘧啶                                  嘌呤
X1为-O-、-S-或-NRc-；
其中Rc为氢、C1-10烷基或被C3-6环烷基取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、或氰基；
其中R1为(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-O(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨基甲酰基)、-O-C(O)NRaRb、-(C1-C6)亚烷基-NRaRb、-(C1-C6)亚烷基-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；
其中Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；其中X2为一个键或一个连接基团；其中R3为一种大分子；其中n为1、2、3或4；其中m为1或2；其中q为1至1,000、104、105、106或更大。所述大分子可包括由碳、氧、氢、氮、硫、磷或其结合物构成的有机分子，其对机体组织无害(例如它们无毒和/或不会引发炎症)，并且可包括但不限于，具有或不具有接头(X2基团)的树突状物、蛋白质、肽、脂质或它们的制剂(例如脂质体纳米粒)；及氨基修饰的聚合物，例如聚苯乙烯珠；以及α-半乳糖苷神经酰胺(见图1)。
本发明化合物可使用具有式(IA-1)的化合物制备：
Figure G2008800115258D00241
其中X2为一个可反应至例如美国专利6,329,381(Kurimoto etal.)中所述的化合物的特定基团上、或形成与连接基团连接的键、或反应而形成与大分子连接的键的基团，剩余的变量如上述式(IA)所定义。大分子的非限制性实例包括具有能增加溶解性的侧链的大分子，例如含有吗啉代环、哌啶子基环、吡咯烷环或哌嗪环等的基团；氨基酸类、氨基酸聚合物类(蛋白质或肽)，例如二肽或三肽等；碳水化合物(多糖)；核苷酸，例如PNA、RNA和DNA等；有机物质聚合物，例如聚乙二醇、聚交酯等；单体脂质和聚合脂质；不溶性有机纳米粒；无毒的机体物质，例如细胞类、脂质类、维生素类、辅因子类、抗原类，例如微生物，所述微生物例如病毒、细菌、真菌等。所述抗原类可包括失活的整个生物体或其亚组成部分，例如细胞等。
在一个实施方案中，本发明的化合物具有式(IC)的结构；或一种其可药用盐，所述可药用盐包括其水合物，
Figure G2008800115258D00251
其中
X为N或CRx，其中Rx为氢、卤素、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基或未取代的杂烷基；
Y为S或N；
虚线(----)表示任选的键；其中
当Y和标星号的碳之间的键是双键时，Q2不存在；
当Q1和标星号的碳之间的键是双键时，Q1为O、S、NY1或NNY2Y3；并且
当Q1和标星号的碳之间的键是单键时，Q1为氢、氰基、硝基、O-Y2、S-Y2、NY1Y2或NY2NY3Y4；其中
Y1为氢、取代的烷基、未取代的烷基、取代的环烷基、未取代的环烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、-C(＝O)-取代的烷基、-C(＝O)-未取代的烷基、-C(＝O)O-取代的烷基、-C(＝O)O-未取代的烷基、氰基、硝基、羟基或O-Y2；
Y2、Y3和Y4各自独立地为氢、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基；
Z为O、S或NY5，其中Y5为氢、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基；
Q2和Q3各自独立地为氢、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基；
X1为-O-、-S-或-NRc-；
Rc为氢、C1-10烷基或取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环；
R1为氢、(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基或取代的C5-9杂环基；
R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨基甲酰基)、-O-C(O)NRaRb、-(C1-C6)亚烷基-NRaRb、-(C1-C6)亚烷基-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；
Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)杂烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
其中位于任何烷基、环烷基、杂烷基、氨基、烷氧基、烷酰基、芳基、杂芳基或杂环基团上的取代基为一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素、杂环基(例如哌啶基或吗啉基)、或芳基；
X2为一个键或一个连接基团；
k为0、1、2、3或4；
n为0、1、2、3或4；
R3为一种大分子，其包括细胞、病毒、维生素、辅因子、肽、蛋白质、核酸分子、脂质、珠或颗粒例如聚苯乙烯珠或纳米粒、或者树突状物。
在某些实施方案中，基团X2-R3可构成一个与另一个式(IC)部分相连的接头，从而形成二聚物。例如，所述接头可为本文所述的任何接头，例如二价的芳基或杂芳基、双酰胺芳基、双酰胺杂芳基、双酰肼芳基或双酰肼杂芳基等。或者，Q1可构成一个与另一个式(IC)部分相连的接头，从而经由二硫键形成二聚物。见例如图28。
在化合物的碱性或酸性足以形成酸盐或碱盐的情况下，将所述化合物以盐的形式使用可能是合适的。可药用的盐的实例为与能形成生理上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如，甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、丁二酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。也可形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。
可药用的盐可用本领域公知的标准方法制备，例如通过使一种具有足够碱性的化合物(例如一种胺)与一种适宜的可提供生理上可接受的阴离子的酸反应来制备。还可制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)盐或碱土金属(例如钙)盐。
烷基包括直链或支链的C1-10烷基基团，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、1-甲基丙基、3-甲基丁基、己基等。
低级烷基包括直链的或支链的C1-6烷基，例如，甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基等。
术语“亚烷基”指的是二价的直链的或支链的烃链(例如亚乙基-CH2-CH2-)。
C3-7环烷基包括例如环丙基、环戊基、环己基、环庚基等基团和烷基取代的C3-7环烷基，优选直链的或支链的C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基或戊基)与C5-7环烷基(例如环戊基或环己基等)。
低级烷氧基包括C1-6烷氧基，例如甲氧基、乙氧基或丙氧基等。
低级烷酰基包括C1-6烷酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基或己酰基等。
C7-11芳酰基包括例如苯甲酰基或萘甲酰基等基团；
低级烷氧基羰基包括C2-7烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或丙氧基羰基等。
低级烷基氨基意指被C1-6烷基取代的氨基，例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基等。
二(低级烷基)氨基意指被相同或不同的C1-6烷基取代的氨基(例如二甲基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基)。
低级烷基氨甲酰基意指被C1-6烷基取代的氨甲酰基(例如甲基氨甲酰基、乙基氨甲酰基、丙基氨甲酰基、丁基氨甲酰基)。
二(低级烷基)氨甲酰基意指被相同或不同的C1-6烷基取代的氨甲酰基(例如二甲基氨甲酰基、二乙基氨甲酰基、乙基甲基氨甲酰基)。
卤原子意指例如氟原子、氯原子、溴原子或碘原子等卤原子。
芳基指C6-10单环或稠环芳基，例如苯基、茚基或萘基等。
杂环基或杂环指含有至少一个杂原子的饱和的单环杂环基或不饱和的单环或稠环杂环基，所述杂原子例如为0-3个氮原子(-NRd-，其中Rd为H、烷基或本文所定义的Y2)、0-1个氧原子(-O-)和0-1个硫原子(-S-)。饱和单环杂环基的非限制性实例包括5元或6元的饱和杂环基，例如四氢呋喃基、吡咯烷基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基或吡唑烷基。不饱和单环杂环基的非限制性实例包括5元或6元的不饱和杂环基，例如呋喃基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噻吩基、吡啶基或嘧啶基。不饱和稠杂环基的非限制性实例包括不饱和的双环杂环基，例如吲哚基、异吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并二氢吡喃基、苯并呋喃基等。Het可为饱和杂环基或不饱和杂环基，例如杂芳基。
Rc和R1可与其所连接的氮原子一起形成一个杂环。杂环的非限制性的实例包括5元或6元的饱和杂环，例如1-吡咯烷基、4-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基或1-吡唑烷基，5元或6元的不饱和杂环例如1-咪唑基等。
R1的烷基、芳基、杂环基可任选被一个或多个取代基取代，其中所述取代基可相同或不同，并且包括低级烷基；环烷基、羟基；羟基C1-6亚烷基，例如羟基甲基、2-羟基乙基或3-羟基丙基；低级烷氧基；C1-6烷氧基C1-6烷基，例如2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基或3-甲氧基丙基；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；氰基；硝基；酰基；羧基；低级烷氧基羰基；卤素；巯基；C1-6烷硫基，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基或丁硫基；取代的C1-6烷硫基，例如甲氧基乙硫基、甲硫基乙硫基、羟基乙硫基或氯代乙硫基；芳基；取代的C6-10单环或稠环芳基，例如4-羟基苯基、4-甲氧基苯基、4-氟苯基、4-氯苯基或3，4-二氯苯基；5-6元的不饱和杂环，例如呋喃基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噻吩基、吡啶基或嘧啶基；以及不饱和的双环杂环基，例如吲哚基、异吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并二氢吡喃基、苯并呋喃基或邻苯二甲酰亚氨基。在某些实施方案中，可明确排除一种或多种上述基团作为各式的各种其他基团的取代基。
在一些实施方案中，所述式的5元环为噻唑环，例如，其中上述式IA的Y为S且Q2不存在。
R2的烷基、芳基、杂环基团可任选被一个或多个取代基取代，其中所述取代基可相同或不同，并且包括羟基；C1-6烷氧基，例如甲氧基、乙氧基或丙氧基；羧基；C2-7烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或丙氧基羰基；和卤素。
Rc的烷基、芳基、杂环基团可任选被一个或多个取代基取代，其中所述取代基可相同或不同，并且包括C3-6环烷基；羟基；C1-6烷氧基；氨基；氰基；芳基；取代的芳基，例如4-羟基苯基、4-甲氧基苯基、4-氯苯基或3，4-二氯苯基；硝基和卤素。
由Rc和R1以及它们所连接的氮原子一起形成的杂环可任选被一个或多个取代基取代，其中所述取代基可相同或不同，并且包括C1-6烷基；羟基C1-6亚烷基；C1-6烷氧基C1-6亚烷基；羟基；C1-6烷氧基；和氰基。
在一些实施方案中，当Q1为O-Y2时，Y2不为氢。
X的一个具体含义为N。
X的另一个具体含义为CH。
当然，在所示式化合物的一个分子中，虚线示出的两个键只可能存在一个。在一个实施方案中，Y和标星号的碳原子之间的键为双键。在另一个实施方案中，Q1和标星号的碳原子之间的键为双键。
Q1的一个具体含义为O。
Q1的另一个具体含义为S。
Q1的另一个具体含义为NY1，例如，＝NH。
Q1的另一个具体含义为NNY2Y3。
在一个实施方案中，Q1和标星号的碳之间的键为单键。
Q1的一个具体含义为氢。
Q1的另一个具体含义为NH2。
Q1的另一个具体含义为O-Y2。
Y1的一个具体含义为氢。
Y1的另一个具体含义为烷基，例如(C1-C6)烷基，例如甲基。
Y1的另一个具体含义为芳基，例如苯基。
Y2、Y3和Y4各自的一个具体含义为氢。
Y2、Y3和Y4各自的另一个具体含义(独立地)为烷基，例如(C1-C6)烷基，例如甲基。
Y2、Y3和Y4各自的另一个具体含义(独立地)为芳基，例如苯基。
Z的一个具体含义为O。
Z的另一个具体含义为S。
Z的另一个具体含义为NY5，其中Y5为氢、甲基或苯基。
Q2的一个具体含义为氢。
Q2的另一个具体含义为甲基或苯基。
Q3的一个具体含义为氢。
Q3的另一个具体含义为甲基或苯基。
X1的一个具体含义为硫原子、氧原子或-NRc-。
另一个具体的X1为硫原子。
另一个具体的X1为氧原子。
另一个具体的X1为-NRc-。
另一个具体的X1为-NH-。
Y的一个具体含义为N。
Y的另一个具体含义为S。
Rc的一个具体含义为氢、C1-4烷基或取代的C1-4烷基。
连接在一起的R1和Rc的一个具体含义为它们形成一个杂环或一个取代的杂环。
连接在一起的R1和Rc的另一具体含义为取代的或未取代的吗啉代环、哌啶子基环、吡咯烷基环或哌嗪基环。
R1的一个具体含义为氢、C1-4烷基或取代的C1-4烷基。
另一个具体的R1为2-羟基乙基、3-羟基丙基、4-羟基丁基、2-氨基乙基、3-氨基丙基、4-氨基丁基、甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、3-甲氧基丙基、乙氧基甲基、2-乙氧基乙基、甲硫基甲基、2-甲硫基乙基、3-甲硫基丙基、2-氟乙基、3-氟丙基、2，2，2-三氟乙基、氰基甲基、2-氰基乙基、3-氰基丙基、甲氧基羰基甲基、2-甲氧基羰基乙基、3-甲氧基羰基丙基、苯甲基、苯乙基、4-吡啶基甲基、环己基甲基、2-噻吩基甲基、4-甲氧基苯基甲基、4-羟基苯基甲基、4-氟苯基甲基或4-氯苯基甲基。
另一个具体的R1为氢、CH3-、CH3-CH2-、CH3CH2CH2-、羟基C1-4亚烷基或C1-4烷氧基C1-4亚烷基。
R1的另一具体含义为氢、CH3-、CH3-CH2-、CH3-O-CH2CH2-或CH3-CH2-O-CH2CH2-。
R2的一个具体含义为氢、卤素或C1-4烷基。
R2的另一具体含义为氢、氯、溴、CH3-或CH3-CH2-。
适用于烷基、芳基或杂环基上取代的具体取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、C3-6环烷基、氨基、氰基、卤素或芳基。
X2的一个具体含义为键或具有最多约24个原子的链；其中所述原子选自碳、氮、硫、非过氧化物型氧及磷。
X2的另一具体含义为键或具有约4至约12个原子的链。
X2的另一具体含义为键或具有约6至约9个原子的链。
X2的另一具体含义为
Figure G2008800115258D00311
Figure G2008800115258D00321
X2的另一具体含义为
Figure G2008800115258D00322
在某些实施方案中，所述接头或基团X2不是公布号为WO2007/024707的PCT申请中所述的接头。此外，在一些实施方案中，R3不是公布号为WO 2007/024707的PCT申请中所述的辅助基团。
一种具体的大分子为氨基酸、碳水化合物、肽、蛋白质、抗原、核酸、脂质、树突状物、机体物质或细胞例如微生物。
一种具体的肽具有2至约20个氨基酸残基。
另一种具体的肽具有10至约20个氨基酸残基。
一种具体的大分子包括碳水化合物。
一种具体的核酸为DNA、RNA或PNA。
一种具体的大分子为细胞、脂质、维生素、脂质或辅因子。
一种具体的抗原为微生物。
一种具体的微生物为病毒、细菌或真菌。
另一种具体的微生物为病毒或细菌。
具体的细菌为炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、沙门氏菌(Salmonella)或葡萄球菌(Staphylococcus)。
具体的沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)或肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)。
具体的葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌。
具体的病毒为RNA病毒，包括RSV和流感病毒；RNA病毒的产物；或DNA病毒，包括疱疹病毒。
一种具体的DNA病毒为乙型肝炎病毒。
在另一些实施方案中，所述大分子不为氨基酸；碳水化合物；肽；抗原，例如微生物，例如病毒(例如RNA病毒，例如SIV、丙型肝炎病毒或冠状病毒；RNA病毒的产物；或DNA病毒例如乙型肝炎病毒；真菌；或细菌例如炭疽杆菌(炭疽(anthrax))、单核细胞增生性李斯特菌、土拉热弗朗西丝氏菌或沙门氏菌(例如鼠伤寒或肠炎))；核酸，例如DNA、RNA、PNA；或机体物质，例如细胞或脂质。
k的一个具体值为0。k的另一个具体值为1。k的另一个具体值为2。在一些实施方案中，k不为1。
本发明的具体化合物具有以下通式：
IA-L-A1；
IA-L-(A1)2；
IA-L-A1-A1；
IA-L-A1-L-A1；
(IA)2-L-A1-A1；
(IA)2-L-A1-L-A1；
(IA)2-L-A1；或
(IA)2-L-(A1)2；
其中I A如本文所公开；L不存在或为一个连接基团；并且A1基团各自独立地代表一种大分子。
本发明包括任选与其他活性剂结合的本发明化合物的组合物，所述活性剂例如三氮唑核苷(ribavirin)、咪唑立宾(mizoribine)和麦考酚酸莫酯(mycophenolate mofetil)。其他非限制性实例是已知的并公开于美国公开的专利申请20050004144中。
制备本发明的化合物制备适用于制备本发明化合物的中间体的方法于本发明的以下实施方案中提供。适用于制备本发明化合物的中间体也于本发明的以下实施方案中提供。
例如，本发明的化合物(缀合物)可用本领域公知的标准合成方法制备。以下对常规的酯和醛合成进行了说明。UC-1V150由2，6-二氯嘌呤经7个步骤合成。UC-1V150苄基部分上的游离醛基使我们可以通过含有肼基和氨基的接头分子将该激动剂与许多不同的辅助化学实体偶联，所述辅助化学实体包括蛋白质类、寡核苷酸类、芳香族分子、脂质类、病毒类和细胞类。
常规合成
Figure G2008800115258D00341
NHS酯的合成
Figure G2008800115258D00351
醛的合成
Figure G2008800115258D00352
UC-1V150化学。UC-1V150的合成和所示化合物2-8的制备如下。
化合物2：4-(2，6-二氯嘌呤-9-基甲基)苯基氰。将2，6-二氯-9H-嘌呤(1，16mmol)溶解在DMF(50mL)中并加入碳酸钾(50mmol)。加入α-溴-对甲苯基腈(22mmol)，然后将该混合物在室温下搅拌16小时。过滤除去不溶性无机盐后，将滤液倒入水(1500mL)中并用乙酸乙酯萃取(2x400mL)，用硫酸镁干燥，蒸发得到剩余物，该剩余物通过使用1∶2∶10的乙酸乙酯/丙酮/己烷进行快速硅胶色谱纯化。产率3.33g(69％)。UV、NMR和MS与所示结构一致。
化合物3：4-(6-氨基-2-氯嘌呤-9-基甲基)苯基氰。将化合物2(1.9g)放入钢反应容器中并加入氨甲醇溶液(80mL，7N)。将密封的容器在60℃下加热12小时，在冰中冷却并滤除固体产物。产率1.09g。UV、NMR和MS与所示结构一致。
化合物4：4-[6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰。首先将金属钠(81mg)在加热条件下溶解于2-甲氧基乙醇(30mL)中以生成2-甲氧基乙醇的钠盐。然后向该溶液中加入溶解在甲氧基乙醇(300mL)中的化合物3(1.0g)(加热条件下)。将反应混合物在115℃浴槽温度下加热8小时，真空浓缩至近干燥状态，将剩余物在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层通过使用含5％甲醇的二氯甲烷溶液进行快速硅胶色谱纯化，得到763mg产物。NMR与所示结构一致。
化合物5：4-[6-氨基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰。将化合物4(700mg)溶解在二氯甲烷(400mL)中并逐滴加入溴(7mL)。混合物在室温下搅拌过夜并先用硫代硫酸钠水溶液(0.1M，2L)萃取，然后用碳酸氢钠水溶液(500mL，饱和)萃取。有机层剩余物通过使用含3％甲醇的二氯甲烷溶液进行硅胶色谱纯化，得到460mg溴代产物。NMR、UV和MS与所示结构一致。
化合物6：4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰。通过钠金属(81mg)在无水甲醇(30ml)中的反应生成甲醇钠。将化合物5(700mg)溶解在无水二甲氧基乙烷中，将其与上述甲醇钠混合，并将温度升至100℃。反应过夜后，将混合物真空浓缩，剩余物通过使用含5％甲醇的二氯甲烷溶液进行硅胶色谱纯化，产量120mg。NMR与所示结构一致。
化合物7：4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲醛。将化合物6(100mg)溶解于无水THF(3mL)中并在氩气下冷却至0℃。使用还原剂氢化N，N’-(二甲基亚乙基二氨基)铝锂将腈转化成醛官能团。制备含0.5M该还原剂的无水THF溶液并将0.72mL该溶液加入反应烧瓶中。将混合物在0-5℃搅拌1小时，加入3MHCl终止反应，依次用乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，然后真空浓缩，得到85mg产物。NMR与所示结构一致。
化合物8：4-[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲醛(UC-1V150)。将化合物7(800mg)与碘化钠(504mg)和乙腈(40mL)混合，然后缓慢加入三甲基氯硅烷(0.5mL)。将混合物在70℃下加热3.5h，冷却并过滤。固体产物用水洗涤，然后用乙醚洗涤，得到406mg产物。NMR、UV、MS与所述结构一致。
制备特定化合物的附加实施例也包括在本文。
如本文实施例中所述，制备了能够在生理条件下与伯胺共价偶联的可溶性TLR7激动剂。然后使用骨髓来源鼠类或外周血液单核细胞来源的树突细胞(DC)测试多种化合物和抗原佐剂复合物的体外活性，以表征DC的成熟和细胞因子的分泌(例如，IL-12、IL-6、TGF-β和IFN-γ)。同源免疫活性C57/B1小鼠用皮内抗原-TLR7激动剂复合物预防性接种，并用表达cOVA转基因的B16黑色素肿瘤细胞攻击。
各化合物的有效浓度(EC50)总体上呈钟形分布，而较高的剂量具有抑制性。最大刺激发生在10至1000nM之间。与TLR激动剂共价偶联的佐剂分子保留了活性，但通常具有较低的EC50值。与单独的鸡卵清蛋白相比，被皮下瘤攻击后，UC-1V199与鸡卵清蛋白偶联时的存活中值从22天延长至35天，几乎翻倍。
因此，TLR7激动剂与肿瘤抗原的共价连接刺激了DC细胞因子的产生并保护小鼠免受肿瘤攻击。与大分子(例如抗原)偶联后在生理条件下保留其免疫刺激性的合适的TLR7激动剂的应用可能会对实体瘤治疗的原位疫苗的开发有意义。
已发现分子量为200-400kD的各种嘌呤、吡啶和咪唑喹啉可激活TLR7，以摩尔为单位，特异性的TLR7配体化合物比咪喹莫特要强100-1000倍(Lee at al.，见下文)。因为这些TLR激动剂与正常核苷酸组分的结构非常相似，故它们在反复给药后极难诱发半抗原免疫反应。
基于腺嘌呤的TLR7药物核心(pharmacore)可能需要共价连接至一种“辅助基团”(大分子)上以促进表达TLR7的树突细胞内体进行摄取以及保存TLR激动剂。因此，制备了TLR7激动剂UC-1V150并经由其醛基官能团和接头与多种蛋白质(包括小鼠白蛋白MSA)上的游离氨基偶联(图3)。该缀合物在体内和体外的药效比未偶联的腺嘌呤类似物强100倍。此外，白蛋白缀合物(UC-1V150/MSA)的小鼠肺内给药诱发了支气管肺泡灌洗液(BALF)中局部细胞因子的产生，而非全身性的细胞因子释放。与此明显不同的是，未予连接的药物在气道中的送递迅速引发了血流中细胞因子的释放。
在一个实施方案中，与TNFα和IL-1相比，TLR7激动剂能够最大限度地产生Th1刺激细胞因子(干扰素和IL-12)。TLR7位于DC中不断合成和成熟的内体小泡的内表面。例如，对于预防哮喘而言，优选运输至树突细胞早期内体并主要诱导I型干扰素的稳定有效的TLR激动剂。将TLR激动剂与磷脂辅助基团共价连接，期冀该缀合物即UC-1V199/L(图6)可快速并稳定地嵌入细胞的脂质膜，包括内体小泡中。值得注意的是，仅30皮摩尔的UC-1V199/L即诱导了骨髓来源小鼠单核细胞中的细胞因子的合成。图7-8示出IL-12合成的数据。
TLR7配体嘌呤或咪唑喹啉具有特有的性质，即双相剂量反应曲线。在高浓度时，该药物不能诱发细胞因子合成。这种双相作用在高纯度的树突细胞中可观测到，并似乎为细胞自发性的。然而，使用可药用药物浓度时，UC1V199/L的显著效力使该现象得到重新审视(图9)。浓度为10nM UC-1V199/L时观测到最多细胞因子的产生，而更高的浓度逐渐诱发更低的IL-12(和TNF)释放。
已经知道持续高浓度的TLR7激动剂能够诱发可持续24小时或更长时间的对TLR重复刺激的不应性。这种复杂的调节体系显然构成防止细胞和组织在炎症应答期间自我毁灭的保险机制的一部分。因此，重要的是确定无法诱发显著细胞因子合成的UC-1V199/L浓度是否仍然会诱发“TLR耐受性”。实际上，当骨髓来源的单核细胞暴露在非激活浓度的UC-1V199/L(1μM)下，然后再用相同的化合物、UC-1V150或pam3Cys(P3C，一种TLR2激活剂)重复刺激24小时时，它们表现出明显减弱的细胞因子响应。相反地，经UC-1V199/L治疗的细胞通过TRIF途径仍对TLR3和TLR4配体保持响应(结果未示出)。初步试验表明，不应答性也在体内引发。因此，UC-1V199/L及相关药物的每日给药可抑制由依赖MyD88的刺激诱发的炎症，同时没有与TLR激活有关的全身性副作用。
在一个实施方案中，本发明的缀合物可适用于预防、抑制或治疗哮喘。哮喘的特征在于间歇性可逆气道收缩、支气管平滑肌增生和慢性炎症的发生。尽管特应性疾病容易诱发哮喘，但达到半数的受侵袭患者不具有特应性。哮喘的其他环境风险因素包括烟草烟雾和空气污染物。此外，受侵袭的哮喘患者的疾病爆发不只是变应原所致，还可以是气道刺激物、温度变化和感染导致。
最初发生的变应性应答部分地通过Th1和Th2淋巴细胞之间的平衡、以及它们各自的细胞因子(特别是干扰素和IL-4)间的平衡来调节。使用与TLR7或TLR9激动剂结合的变应原对动物接种会优先扩增变应原特异性Th1记忆细胞。因此，使用与Th2为主的佐剂连接的抗原进行后续免疫不易引发IgE应答。用抗原和TLR7或TLR9激动剂接种的小鼠能抵抗实验性的哮喘。
用TLR激动剂治疗哮喘与预防哮喘需要的方法不同。在患病患者中，气道和肺部组织已有多种炎性细胞群浸润，包括许多淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性细胞和中性粒细胞亚群。在这种情况下，TLR激动剂可能通过增加炎性介质例如TNF-α和IL-1释放而加重疾病。实际上，各种微生物制剂激活TLR的能力可解释它们引起哮喘发作的原因。
与TNF-α和IL-1相比，用于预防哮喘的TLR激动剂优选局限于肺部，但也能最大限度地产生Th1刺激细胞因子(干扰素和IL-12)。TLR7和TLR9都位于树突细胞中不断合成和成熟的内体小泡的内表面。聚集的TLR9激活寡核苷酸即磷酸二酯寡核苷酸在早期内体小泡中保留时间较长，并因而诱发与成熟小泡中未聚集的磷酸二酯寡核苷酸相比更多的I型干扰素。结果显示了TLR激动剂的空间结构决定了其运输和其诱发细胞因子合成的模式。对于预防哮喘而言，优选可输送至树突细胞早期内体并主要诱发I型干扰素的稳定、强效且具有分子特征的TLR激动剂。
为了研究本发明的缀合物对变应性哮喘的作用，通过在第0天和第7天对每只小鼠皮下注射20μg沉浸于500μg明矾中的卵清蛋白的盐水溶液以敏化小鼠诱发气道炎症。在第16天和第21天，以每只小鼠5μg卵清蛋白的量鼻内给药以攻击小鼠。在第16天首次卵清蛋白激发之前，缀合物在不同的时间点以鼻内、口服或静脉注射方式给药。在最后一次激发(第22天)后24小时，测量气道反应性，处死小鼠，并收集BALF细胞、肺和脾样品。用未经用药的小鼠和卵清蛋白/铝敏化小鼠作为对照。计算BALF中细胞的总数并进行瑞特-姬姆萨(Wright-Giemsa)染色以确定嗜酸性细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和肥大细胞。通过Luminex分析确定BALF中的细胞因子水平。在最后一次激发后24小时，使用单室整体体积描记器(whole bodyplethysmograph)评估对乙酰甲胆碱的气道反应性。Penh-即一个通过常规双室描记器测量的与肺阻力密切相关的无量纲值-用来监测气道反应性。
本发明化合物以治疗有效量给药至需要治疗的受试者。本发明组合物的给药可通过合适的任何给药途径进行，特别是胃肠外给药，例如静脉、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内或皮下途径的给药。所述给药可为单次快速浓注、多次注射、或短期或长期持续输注。植入式医疗器械(例如植入式输液泵)也适用于具体剂型的剂量随时间不变或改变的周期性胃肠外送递。对于所述胃肠外给药而言，化合物优选配制成一种以水、其他合适溶剂或多种溶剂的混合物作为溶剂的无菌溶液。所述溶液可含有使溶液与血液等渗的诸如盐类、糖类(特别是葡萄糖或甘露醇)等其他物质，缓冲剂——例如乙酸、柠檬酸和/或磷酸和它们的钠盐，以及防腐剂。
本发明的化合物可配制成药物组合物并以与选择的给药途径相适应的各种形式给予哺乳动物宿主，例如人类患者，所述给药途径即，口服或通过静脉内、肌内、局部或皮下途径进行肠胃外给药。
因此，本发明化合物可与一种可药用的载体(例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体)相结合进行全身给药，例如口服给药。可将化合物包入硬壳或软壳明胶胶囊中，可压缩成片剂，或可直接与患者饮食的食物相混合。对于治疗性口服给药，活性化合物可与一种或多种赋形剂混合并以可吸收的片剂、口含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、薄片剂等形式使用。所述组合物和制剂应该含有至少0.1％的活性化合物。组合物和制剂的百分数当然是可以变化的，通常可方便地为给定单位剂型重量的约2％至约60％。在这类治疗有用的组合物中活性化合物的量应为能够获得有效剂量水平的量。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可含有以下物质：粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸氢二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或增香剂，例如薄荷、冬绿油，或可以添加樱桃调味剂。单位剂型为胶囊时，除上述类型的物质外，其还可含有一种液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其他物质可以包衣形式存在，或用以改变固体单位剂型的物理形态。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可用明胶、蜡、紫胶或糖等进行包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、染料及调味剂例如樱桃或橙味调味剂。当然，制备任何单位剂型所用的所有物质应该是可药用的并且在所使用的量下是基本上无毒的。此外，可将活性化合物引入持续释放的制剂和装置中。
活性化合物也可通过输注或注射进行静脉内或腹膜内给药。活性化合物或其盐的溶液可在水中制备，水任选地与一种无毒的表面活性剂混合。分散剂也可在甘油、液态聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中，以及油中制备。在常规贮存及使用条件下，所述制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散系，或者含有活性成分的适于临时配制为无菌可注射或可输注的溶液或分散系的无菌粉末，所述无菌粉末任选地被包封在脂质体中。在所有情况下，最终剂型在生产和贮存条件下均应该是无菌的、流动的并且稳定。液体载体或运载体可以是溶剂或液体分散介质，包括例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯、以及它们的合适的混合物。可例如通过形成脂质体、在分散剂情形下通过维持所需的粒度或通过使用表面活性剂从而保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，防止微生物的作用。在许多情况下，还优选地含有等渗剂，例如糖类、缓冲剂或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，从而延长可注射组合物的吸收。
无菌注射溶液通过将所需量的活性化合物，根据需要与多种以上所列举的其他成分一起加入适当溶剂中，接着进行过滤灭菌来制备。在制备无菌可注射溶液用无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，该方法产生前述过滤灭菌溶液的活性成分与任何其他所需成分的粉末。
对于局部给药，本发明化合物可以纯的形式施用，即，此时为液体。但是，通常希望将本发明化合物与一种皮肤学上可接受的载体相结合，以组合物或制剂形式给药至皮肤上，所述皮肤学上可接受的载体可为固体或液体。
可用的固体载体包括精细分散的固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。可用的液体载体包括水、醇或二醇或水-醇/二醇掺合物，本发明化合物可任选借助无毒的表面活性剂以有效水平溶解或分散于液体载体中。可添加辅剂例如芳香剂及其他抗微生物剂来优化针对给定用途的性质。得到的液体组合物可通过吸收衬垫施用，用于浸渍绷带及其他敷料，或用泵型喷雾器或气溶胶喷雾器喷洒在病患区域。
增稠剂例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料，也可与液体载体一起使用来形成可延展的膏剂、凝胶剂、软膏、皂剂等，直接应用至使用者的皮肤。
此外，在一个实施方案中，本发明提供了多种用于缀合物吸入送递的剂型。例如，制剂可设计成通过例如定量剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器等装置使用的气雾剂。
适用于将本发明化合物送递至皮肤的皮肤学上可用的组合物的实例为本领域已知；例如，见Jacquet等人的美国专利4,608,392、Geria的美国专利4,992,478、Smith等人的美国专利4,559,157和Wortzman的美国专利4,820,508。
本发明化合物的可用剂量可通过比较它们在动物模型中的体外活性和体内活性而确定。将小鼠及其他动物的有效剂量外推至人类的方法是本领域已知的；例如，见美国专利4,938,949。本发明化合物作为TLR激动剂的能力可使用本领域公知的药理学模型确定，所述药理学模型包括Lee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：6646(2003)中公开的方法。
通常，本发明化合物在液体组合物例如洗剂中的浓度可为约0.1-25重量％、优选约0.5-10重量％。在半固体或固体组合物例如凝胶或粉末中的浓度可为约0.1-5重量％，优选约0.5-2.5重量％。
可施用活性成分以获得约0.5至约75μM，优选约1至50μM，最优选约2至约30μM的活性化合物峰值血浆浓度。这可以通过例如静脉内注射0.05至5％活性成分的溶液，任选其盐溶液而实现，或者通过口服含有约1-100mg活性成分的大丸剂进行给药。可通过连续输注提供约0.01-5.0mg/kg/h的活性成分，或通过间歇性输注含有约0.4-15mg/kg的活性成分，从而保持需要的血液水平。
用于治疗所需的化合物或其活性盐或其衍生物的量，不仅随所选的具体的盐而变化，而且随给药途径、所治疗病症的性质及患者年龄及状况而变化，并最终应由治疗的内科医生或临床医生决定。但是，通常的适宜剂量为每天约0.5至约100mg/kg体重，例如约10至约75mg/kg体重的范围，例如每天3至约50mg/kg受治疗者体重，优选6至90mg/kg/天的范围，最优选15至60mg/kg/天的范围。
化合物通常方便地以单位剂型给药；例如，每单位剂型含有5至1000mg、通常10至750mg、最常用的为50至500mg的活性成分。
所需剂量通常可以单剂量或以合适的时间间隔给药的分剂量存在，例如每天两次、三次、四次或更多次的亚剂量。所述亚剂量本身还可再分成例如多个不连续的疏散间隔的给药；例如通过吹药器多次吸入或通过多次滴入眼中来施用。所述剂量还应根据患者个体的年龄、体重、状况和反应而改变，剂量频率可能也是如此。通常，对于本文所述病症而言，式(I)化合物的日总剂量范围可为约50至约5000mg，并以单剂量或分剂量给药。优选地，日剂量范围应为约100mg至约4000mg、最优选为约1000-3000mg，并以单剂量或分剂量给药，例如每6小时750mg口服化合物。这可达到约500-750uM的血浆水平，该血浆水平可有效地杀死癌细胞。在处理患者过程中，治疗应当以较低剂量开始并根据患者的整体反应而增加。
如上所述，含有本发明化合物的组合物适用于治疗或预防例如人类或其它哺乳动物(例如牛、犬、马、猫、羊和猪等动物)以及可能的其它动物的疾病或失调。根据具体的化合物，所述组合物将例如用于治疗癌症、感染，作为疫苗用于增强适应性免疫(例如抗体的产生、T细胞的活化等)，和/或刺激中枢神经系统。
本发明将通过以下非限制性实施例进行进一步说明。
实施例I
给出了作为本发明的又一些实施方案的制备式(I)化合物的方法，并且通过以下步骤进行说明，在以下步骤中除非另有指明，一般的基团含义如上所述。
普通化学。试剂和溶剂购于Aldrich，Milwaukee，WI.。未校正的熔点用Laboratory Device Mel-Temp II毛细管熔点装置测定。用Varian Unity 500NMR光谱仪记录499.8MHz处的质子核磁共振光谱或用Varian Mercury NMR光谱仪记录400.06MHz处的质子核磁共振光谱。化学位移以ppm记录距离指定参考基准的标度。阳离子和阴离子回路质谱由Department of Chemistry UCSD，San Diego，CA进行。元素分析由NuMega Resonance Labs，San Diego，CA进行。柱色谱分析用指定的溶剂体系在E Merck硅胶(230-400目)上进行。分析性薄层色谱(TLC)在硅胶60F-254板(EM Reagents)上进行。
4-(2，6-二氯嘌呤-9-基甲基)苯基氰的制备。将2，6-二氯-9H-嘌呤(16mmol)溶解在DMF(50mL)中并加入碳酸钾(50mmol)。然后加入α-溴-对甲苯基氰(22mmol)，并将该混合物在室温下搅拌16小时。过滤除去不溶性无机盐后，将滤液倒入水(1500mL)中并用乙酸乙酯萃取(2x400mL)，用硫酸镁干燥，蒸发得到剩余物，该剩余物通过使用1∶2∶10的乙酸乙酯/丙酮/己烷进行快速硅胶色谱纯化。产量3.33g(69％)。UV、NMR和MS与所示结构一致。
4-(6-氨基-2-氯嘌呤-9-基甲基)苯基氰的制备。将上述产物(1.9g)放入钢反应容器中并加入氨甲醇溶液(80mL，7N)。将密封的容器在60℃下加热12小时，在冰中冷却并滤除固体产物。产量1.09g。UV、NMR和MS与所示结构一致。
4-[6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰的制备。将金属钠(81mg)在加热条件下溶解于2-甲氧基乙醇(30mL)中以生成2-甲氧基乙醇的钠盐。向该溶液中加入溶解在甲氧基乙醇(300mL)中的实施例2的产物(1.0g)(加热条件下)。将反应混合物在115℃浴槽温度下加热8小时，真空浓缩至近干燥状态，将剩余物在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层通过使用含5％甲醇的二氯甲烷溶液进行快速硅胶色谱纯化，得到763mg产物。NMR与所示结构一致。
4-[6-氨基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰的 制备。将上述产物(700mg)溶解在二氯甲烷(400mL)中并逐滴加入溴(7mL)。混合物在室温下搅拌过夜并用硫代硫酸钠水溶液(0.1M，2L)萃取，然后用碳酸氢钠水溶液(500mL，饱和)萃取。有机层剩余物通过使用含3％甲醇的二氯甲烷溶液进行硅胶色谱纯化，得到460mg溴代产物。NMR、UV和MS与所示结构一致。
4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基 氰的制备。通过钠金属(81mg)在无水甲醇(30ml)中的反应生成甲醇钠。将上述产物(700mg)溶解在无水二甲氧基乙烷中并将温度升至100℃。反应过夜后，将混合物真空浓缩，剩余物通过使用含5％甲醇的二氯甲烷溶液进行硅胶色谱纯化，产量120mg。NMR与所示结构一致。
氢化N，N′-(二甲基亚乙基二氨基)铝锂的制备。该用于将腈转化成醛官能团的还原剂大致按Bull.Korean Chem.Soc.，23：1697(2002)中所述进行制备。制备含0.5M该还原剂的无水THF溶液。
4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲 醛的制备。将4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯基氰(100mg)溶解于无水THF(3mL)中并在氩气下冷却至0℃。将上述产生的氢化铝试剂(0.72mL)加入反应烧瓶中。将混合物在0-5℃搅拌1小时，然后加入3M HCl终止反应。依次用乙酸乙酯和二氯甲烷萃取混合物，然后真空浓缩，得到85mg产物。NMR与所示结构一致。
4-[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲醛 (UC-1V150)的制备。将上述产物(800mg)与碘化钠(504mg)和乙腈(40mL)混合，然后缓慢加入三甲基氯硅烷(0.5mL)。将混合物在70℃下加热3.5h，冷却并过滤。固体产物用水洗涤，然后用乙醚洗涤，得到406mg产物。NMR、UV、MS与所述结构一致。该材料适用于接头和大分子之间的缀合反应。
4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲 酸甲酯的制备。该方法按Jayachitra et al.，Synth.Comm.，33：3461(2003)中所述制备。将4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苄腈(1mmol)溶解于无水甲醇(5mL)中，并将新蒸的BF3乙醚合物(4mmol)加入该溶液中。所得混合物在氩气下回流20小时。真空除去溶剂，将剩余物溶解在二氯甲烷(10mL)中，并用稀的碳酸氢钠水溶液萃取(2×10mL)，有机层用硫酸镁干燥。蒸发后，产物使用含5％甲醇的二氯甲烷溶液进行硅胶色谱纯化，产量0.8mmol。
4-[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲酸 的制备。将4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲酸酯(100mg)与碘化钠(63mg)和乙腈(10mL)混合，然后缓慢加入三甲基氯硅烷(120mL)。将该混合物在70℃下加热6小时，冷却并过滤。固体产物用水洗涤，然后用乙醚洗涤，得到51mg产物。
4-[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9基甲基]苯甲酸 2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯的制备。将4-[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)嘌呤-9-基甲基]苯甲酸酯(2mmol)溶解于二氯甲烷或二噁烷(10mL)中并加入EDC(2mmol)。向该溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(2mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌1小时。将混合物真空干燥，并将粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得到2mmol产物，该产物适用于与伯胺有关的缀合反应。
实施例II
UC-1V150与首先经丁二酰亚胺基6-肼基-烟酰胺丙酮腙(SANH)接头修饰的MSA共价偶联，得到一种UV光谱特征改变了的稳定分子。UC-1V150/MSA缀合物通过由于腙的形成而出现在342nm处——而SANH本身的吸收峰在322nm处——的UV吸收峰识别。每分子MSA缀合的UC-1V150分子的量由UC-1V150-SANH标准曲线(图1)外推得出。相应地，UC-1V150/MSA缀合物以约5∶1的比例得到。本文所报道的生物研究使用5∶1的UC-1V150/MSA完成。
SANH对MSA的修饰。将200μl MSA(25mg/ml)与100μl缀合缓冲液(1M NaPi，pH＝7.2)和690μl PBS进行混合。将含844μg SANH的10μl DFM溶液(40倍摩尔过量于MSA)添加至蛋白溶液中(反应混合物中MSA的最终浓度为5mg/ml)。稍作混合后使反应在室温下进行2小时。将反应混合物装载至用PBS平衡的NAP-10柱上，用1.5ml的PBS洗脱经修饰的MSA，以除去过量的SANH。
IV150与经SANH修饰的MSA的连接。将460μg IV150溶解在10μl的DMF中，并加入经SANH修饰的MSA中，该反应混合物在室温下培养过夜。首先将反应混合物用微旋柱(Millipore：BIOMAX 5K)浓缩至1ml，然后装载至如上所述的NAP-10柱上，以除去过量的IV150。
同样使TLR7激动剂与寡聚脱氧核苷酸(ODN)(图20-21)、病毒(图18-19)以及一种随后可纳入脂质体中的脂质成分(图24-25)缀合。
空间调控(spatially regulated)TLR7激动剂的合成。缀合物各自通过生物缀合化学领域公知的标准技术制备。通过定量UV、LC/MS和PAGE方法表征各缀合物，来确定与辅助基团(大分子)缀合的TLR激动剂的“价态”或比例。由该信息，可通过建模技术容易地估计出缀合物的尺寸和形状。缀合物的尺寸、形状和价态的多样化可通过对大分子的选择实现，所述大分子在结构示意图中表示为R3。例如，当R3为树突状物、例如常规聚(氨基胺)类时，用于连接TLR激动剂的表面官能团的数量可以基于该具体树突状物的分支点和分级(generation)的数量而精确地确定。第一分级(G1)具有8个表面氨基基团，G2具有16个等等，从而导致对缀合物价态和尺寸的高度控制(见图2)。此外，一些树突状物纳米粒可同时含有靶向配体和TLR7激动剂。TLR7激动剂-脂质缀合物也可根据选择的脂质而具有多种“价态”。例如，强效缀合物UV-1V199/L(图6)通过使TLR7激动剂(UV-1V199)的羧基衍生物与市售可得的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的乙醇氨基基团偶联而制备。
这些脂质缀合物通过与胆固醇、DOPE和其它脂质混合而配制成各种脂质体纳米粒，以制备流体动力学直径为约100nm的颗粒(图24-25)。该图中的六边形代表UV-1V199/L和相关的具有磷脂尾基的TLR7激动剂。
通过诸如本文公开的分析试验测定，TLR7激动剂和二聚物以及TLR缀合物已经表现出具有体内细胞因子释放和/或细胞因子活性。例如，所有以下物质均表现出活性：咪喹莫特、溴匹立明、UC-1V138、UC-1V136、UC-1V150、UC-1X105、UC-1V199、UC-1W236、UC-1X51、UC-1W247、UC-1X113、UC-1V199/L、UC-1V150/BSA，以及具有或不具有接头的UC-1V150与MSA、OVA、病毒体和/或ODN的缀合物，以及UC-1V199与DOPE、二氧化硅、脂质或经辐射的芽孢的缀合物，以及UC-1V1043和UC-1V1018与OVA的缀合物。
实施例III
材料和方法
化合物体外评估。评估了TLR7缀合物刺激和/或抑制鼠骨髓来源的单核细胞(BMDM)中以及人外周血液单核细胞(PBMC)中的细胞因子产生的能力，所述鼠骨髓来源单核细胞高度富集树突细胞。将BMDM置于96孔板中并用赋形剂或以三倍增量稀释的起始于10μM至皮摩尔浓度的各种剂量处理，进行三次平行重复操作。24小时后，收集上清液并使用Luminex珠分析系统和市售可得的试剂，对最多达30种不同的细胞因子、化学趋化因子和其它介质进行检测。用定量mRNA表达测定和二维磷蛋白分析补充细胞因子/趋化因子ELISA结果，以深入探讨耐受性诱导的范围和机制。在收集上清液时，将孔内的培养基更换为MTT，以作为细胞存活的比色评估。人PBMC从市售的袋装血液中分离，并类似地进行处理。
各纳米粒用一种荧光染料加载或修饰，以评估TLR激动剂缀合的纳米脂质体和树突状物的运输。亚细胞定位通过显微镜确定，在某些情况下是在已经过内体成熟抑制剂处理的细胞中。
首先用最强效的化合物在预先确定的对促炎细胞因子刺激(TNFα，IL-1)作用最小的浓度下对BMDM进行处理，以比较具有不同辅助基团的TLR7缀合物的抗炎活性。24小时后，更换培养基，并且在能有效引发模拟处理细胞中的细胞因子产生的浓度下用不同TLR家族成员(TLR2为Pam3Cys、TLR3为聚(I:C)、TLR4为LPS、TLR5为鞭毛蛋白、TLR6为Malp-2、TLR7为UV-1V150、TLR7/8为R848、TLR9为CpG寡核苷酸等)的激活配体激发细胞。所述细胞通过多重免疫测定法、定量PCR和磷蛋白印迹进行测定。TLR缀合物致敏的细胞也以不同的时间间隔激发并分析细胞因子产生的模式，以更好地了解耐受性诱发和维持的动力学。
化合物体内评估。在小鼠气道给药后评估支气管肺泡灌洗液(BALF)相对于全身细胞因子的产生。经麻醉的年龄相当的雌性C57BL/6小鼠用不同量的上述TLR7缀合物、或合适赋形剂中的脂质体或树突状物进行鼻内(i.n.)、口服(p.o.)或静脉内(i.v.)给药。麻醉恢复后在不同的时间点收集血清和BALF，并用Luminex分析细胞因子和趋化因子。记录经处理动物的重量、体温和液体摄入模式作为全身性“细胞因子综合征”的临床指标。
通过血清和BALF细胞因子的测定，随后的实验评估了不同药剂在高剂量鼻内、口服或静脉给药后产生TLR活化的局部或全身不应性(TLR耐受性)的能力。选择不会显著诱发体内细胞因子以及细胞因子综合征临床症候的各种高剂量的TLR7缀合物。小鼠用选定的高剂量以不同的给药途径处理，然后在多个时间点用不同的TLR激活剂激发。收集并分析血清和BALF并记录临床症状。缀合物抗炎活性用之前用于研究LPS和CpG的致死性休克模型确认。在该模型中，预先经D-半乳糖胺腹膜内(i.p.)注射给药的Balb/c小鼠在用不同的TLR激活剂全身性激发后因细胞因子刺激和肝损伤而死亡。活性抗炎药物不会诱发致敏动物的临床症状，而且还能防止由其它TLR配体引起的休克。在有确定的终点时，该模型尤其适用于确定TLR耐受性的动力学和持续时间。
实施例IV
材料和方法
小鼠。雌性C57BL/6小鼠(5-6周龄)从Harlan West Coast(Germantown，CA)获得，雌性A/J小鼠(6-8周龄)购自The JacksonLaboratories(Bar Harbor，ME)。A/J小鼠用于接受炭疽杆菌Sterne菌株感染(Kenney et al.，J.Infect.Dis.，190：774(2004))。小鼠在标准条件下于加利福尼亚大学的圣迭戈动物中心饲养，该动物中心经美国实验动物管理认证协会(American Association forAccreditation of Laboratory Animal Care)认证。所有动物实验方案均经过试验机构伦理委员会(Institutional Review Board)预先批准。对于H1N1流感的研究，从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)获得雌性BALB/c小鼠(16-18g)，并在经美国实验动物管理认证协会认证的犹他州立大学实验动物研究中心饲养。
BMDM的体外刺激。从各品系的小鼠中分离BMDM并以每孔5×104细胞的密度接种于96孔板中。将化合物加入最终浓度为0.01至10μM或另外指明的浓度的10日龄培养物中。培养24小时后，收集培养上清液，并使用Beadlyte Mouse MultiCytokine定制试剂盒(Upstate，Charlottesville，VA和eBiosciences，SanDiego，CA)根据制造商的说明书通过夹心酶联免疫分析法(BD Pharmingen，San Diego，CA)或多重Luminex(Austin，TX)分析法分析了细胞因子的诱导。
化合物的小鼠给药。年龄相当的雌性C57BL/6小鼠通过尾静脉注射100μL含有UC-1V150或UC-1V150/MSN的盐溶液，每一种溶液含有0.38-38nmol当量的药物核心。对于肺内给药而言，小鼠用阿佛丁溶液实施腹膜内麻醉并沿着颈部脱毛。气管切开一个小切口并注射50μL含有不同量的UC-1V150/MSA或非缀合药物的盐溶液。麻醉恢复后在不同的时间点收集血清和BALF，并通过Luminex分析法分析IL-6、IL-12p40、IFN-γ、RANTES和MCP-1。在其它实验中，小鼠用氯胺酮/二甲苯溶液肌内麻醉，并以鞘内注射(i.t.)50μL的剂量或鼻内给药(i.n.)20μL的剂量给予相同量的UC-1V150/MSA。由于以任何方法给药后24小时在BALF中均观测到相似的细胞因子水平，故在感染模型研究中采用更方便的鼻内给药(i.n.)途径。
A/J小鼠的炭疽杆菌芽孢感染。芽孢由炭疽杆菌Sterne菌株(pXO1+pXO2-)按照前人方法(Sabet et al.，FEMS Immunol.Med. Microbiol.，47：369(2006)；Guidi-Rontani et al.，Mol. Microbiol.，42：931(2002))制备。纯化的芽孢于4℃以1×108至4×108cfu/mL储存在PBS中。注射前，将芽孢在65℃加热30分钟以引发萌芽。A/J小鼠用氯胺酮/二甲苯溶液肌内麻醉，并在感染炭疽前1天以每只小鼠0.75nmol的UC-1V150或UC-1V150/MSA的量鼻内给药(i.n.)。对照小鼠以与UC-1V150/MSA中相同的量仅接受盐溶液或含MSA的盐溶液。感染使用20μL体积的2×105至8×105的炭疽杆菌芽孢进行。观测13天存活情况，这是因为大多数经盐溶液处理的小鼠在3-6天内死亡。结果通过每组8只小鼠测得。
Balb/c小鼠的流感病毒感染。流感A/New Caledonia/20/29(H1N1)病毒从美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control andPrevention)(Atlanta，GA)获得。将该病毒在马-达二氏犬肾(MDCK)细胞中增殖两倍，并在小鼠中进一步传代7次以使其具有致命毒力，然后再在细胞培养物中进行又一次传代而扩增。小鼠用氯胺酮(100mg/kg)腹膜内(i.p.)麻醉，并用病毒以每只小鼠约105.0细胞培养感染剂量使用50μL的接种量鼻内(i.n.)感染。在暴露于病毒前24h，每只小鼠以75μL的单纯的盐溶液或含有5nmol UC-1V150/MSA的盐溶液的单次鼻内剂量给药。观察每个处理组的10只受感染的小鼠以及20只安慰剂对照动物的21天存活情况。
统计。通过非参数秩和检验(Mann Whitney U-test)(p≤0.05)比较各细胞因子水平以确定统计学显著性。使用GraphPd Prism软件(4.0c版，San Diego，CA)获得Kaplan-Meier存活曲线并进行时序检验以比较存活差异。
结果
UC-1V150/MSA缀合物导致的体外和体内有效细胞因子释放。单独使用UC-1V150对骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的培养刺激了细胞因子的释放(图10)。当与MSA缀合时，以10倍低于TLR7激动剂等量浓度的浓度检测到相似或更高的细胞因子水平。如前所述实施的使用TLR转化株的实验证实了，与缺少醛基修饰的化合物(UV-1V136)类似，UC-1V150是一种特异性TLR7激动剂(Lee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：1828(2006))。在对小鼠静脉给药(i.v.)后，UC-1V150诱发了血清细胞因子水平，该细胞因子水平在注射后约2小时达到峰值，然后快速下降至接近基线水平(数据未示出)。以不同剂量i.v.注射UC-1V150与UC-1V150/MSA后2小时的细胞因子产生曲线间的比较证实了，MSA缀合物的药效增强了10至100倍(图11)。盐水或MSA对照组的血清未表现或几乎未表现出可检测的细胞因子水平(未示出)。
UC-1V150/MSA缀合物提供肺部延长的局部活性。首先使TLR7激动剂直接进入气管以确保药物在呼吸系统的充分送递。在从经过UC-1V150/MSA鞘内(i.t.)给药处理的小鼠中提取的支气管肺泡灌洗液(BALF)中发现了大量的细胞因子诱导，而相同动物中血清细胞因子的量极低且接近基线水平(图12)。明显不同的是，在用小分子TLR7激动剂进行鞘内注射(i.t.)注射的小鼠的BALF和血清中观测到了相似的细胞因子水平，该激动剂有时诱导行为变化，例如毛发直立和颤抖，这暗示了细胞因子综合征(表2)。随后用UC-1V150进行的研究表明，可能是由于药物的吸入，鼻内(i.n.)送递也诱导了BALF中选择性细胞因子的产生。因此，使用鼻内(i.n.)给药在两种肺炎感染动物模型中评估UC-1V150缀合物。与对照小鼠(P＜0.025)的5天平均存活寿命相比，在炭疽杆菌芽胞感染之前一天用UC-1V150/MSA鼻内预处理的小鼠的平均存活寿命延长至7.5天(图14A)。与此相反，在用盐水、等量的MSA或单独的UC-1V150处理的小鼠中，未观测到明显差异。这些数据证实了，UC-1V150缀合物而非游离药物，具有肺内免疫治疗活性。因此，在呼吸道局部送递之后，TLR7激动剂与MSA的缀合增强了它的药效，并降低了它的毒性。
在另一项研究中，在流感病毒感染(H1N1株)前1天，BALB/c小鼠用UC-1V150/MSA缀合物进行鼻内(i.n.)预处理。与未处理的对照(P＜0.0001)的7天平均寿命相比，经处理的小鼠的平均寿命延长至11.5天(图14B)。所有的这些结果表明，在呼吸道局部送递之后，TLR7激动剂与MSA的缀合增强了它的药效，并降低了它的毒性。
在炭疽感染前，用UC-1V150/MSA鼻内(i.n.)给药，然后在第4天时用环丙沙星(ciprofloxacin)(25mg/kg)处理。安慰剂处理后接着用环丙沙星处理导致了约15-25％的存活率，而用缀合物和环丙沙星进行的处理导致了约90％的存活率。因此，所述缀合物特别适于用作一种炭疽疫苗的协佐剂(coadjuvant)。
讨论
化合物UC-1V150是目前发现的一种最强效且通用的合成小分子TLR7配体，这是因为：(i)其在纳摩尔浓度即具有活性；(ii)其可与多种大分子偶联且在某些情况下具有增强的活性；以及(iii)其药物代谢动力学特性可通过辅助基团的修饰而改变。TLR7-蛋白质缀合物UC-1V150/MSA的特征在于，具有约5个与各MSA蛋白质分子共价连接的小分子。所述缀合物保留了TLR7激动剂的活性，而且与游离单体药物相比，所述缀合物确实更高效且具有更长的作用持续时间。此外，所述缀合物可通过鼻内(i.n.)给药或鞘内(i.t.)给药有效地送递至呼吸系统。已证实了通过鼻内(i.n.)给药的药物送递在细菌感染的小鼠模型中的有效性。当考虑向呼吸系统送递时，制备作为大分子缀合物的TLR7激动剂的潜在重要优点在于，可通过将免疫刺激活性限制在局部粘膜环境内而避免全身性副作用。
预计所述大分子缀合物与游离药物相比，被体循环吸收的速度更慢，并且，事实上它可通过表达TLR7的定居巨噬细胞和树突细胞贪婪地清除。因此，所述缀合物应当可以减少与TLR7/TLR8激动剂的全身送递有关的严重副作用的类型。当给药至粘膜部位、例如泌尿生殖道和胃肠道时，UC-1V150/MSA缀合物还可提供有益的免疫治疗活性，以防治传染病、变应性疾病或恶性疾病。TLR7激动剂的大分子载体还可提供用于对特定的器官或组织进行免疫治疗的改善的选择性送递方法。例如，UC-1V150的脂质缀合物可纳入不同尺寸和组成的脂质体中，而TLR7激动剂的蛋白质缀合物可靶向不同的树突细胞亚群。与用TLR9-活性寡核苷酸观察到的作用(Rothenfusser et al.，Hum. Immunol.，63：111(2002))类似，不同的UC-1V150缀合物的细胞内运输可诱发不同的细胞因子产生模式。
一个使用与蛋白质缀合的药物时所观察到的潜在的问题是，针对分子的低分子量类半抗原(hapten-like)部分的抗体的发展。然而，与早期研究的TLR7/TLR8疫苗不同，UC-1V150具有简单的类腺嘌呤(adenine-like)结构，该结构不太可能诱发超敏反应。事实上，在施用蛋白质缀合物后，除使用完全弗氏佐剂(Freud’s adjuvant)中的钥孔虫戚血兰素载体反复给药外，未观察到抗UC1V150抗体(未公布数据)。
人们一直寻求预防和治疗流感病毒感染的新药物，特别是随着来自亚洲的高致病性株系的传播。每年由普遍流行的株系造成的发病率和死亡率都很高。这类感染的治疗可通过使用经批准的早期开始即具有中度有效性的抗病毒药物来完成。人们还一直研究免疫系统的强化，将其作为能够促进保护性抗病毒反应的策略，特别是对于免疫功能受损宿主而言。通过TLR信号传导的全身免疫激活有可能不会产生将免疫细胞调动到感染部位所需的局部细胞因子和趋化因子梯度。未缀合的UC-1V150可通过粘膜迅速吸收，但却不能保护小鼠免受炭疽杆菌感染，而UC-1V150缀合物则是有效的这一事实支持了上述假设。
炭疽杆菌已成为一种生物恐怖性试剂。对微生物病原体的迅速反应是有效生物防御的关键。通常，抗体或细胞免疫反应可抵抗这些病原体；然而，快速产生这些保护性反应需要早先即暴露在各生物体的特定抗原下。虽然已知流感病毒可接合TLR7(Barchet et al.，Eur. J.Immunol.，35：360(2005))，但是炭疽菌最可能接合的是TLR2、TLR4和TLR9。除了作为TLR的常规信号传导媒介外，MyD88也已表现出是抵抗炭疽小鼠模型感染所必需的(Hughes et al.，Infect.Immun.， 73：7535(2005))。因为UC-1V150缀合物作为抵抗不同途径的感染的佐剂非常有效，其可作为一种生物防御策略使用而无需特异地针对特定微生物的抗原，并可适用于混合药剂或单独药剂的攻击。
实施例V
尚未获悉存在效力强或作用快至足以在住院治疗之前预防“高危”患者SA感染的SA疫苗。强效TLR7激动剂和灭活的革兰氏阳性细菌(例如SA或其亚单位)的单次注射可在给药一周内增强对细菌的保护性免疫。所述注射可包括，例如：1)一种直接与灭活的革兰氏阳性细菌的游离氨基缀合的TLR7激动剂，例如UC-IV199；2)一种与结合灭活的革兰氏阳性细菌的白蛋白缀合的TLR7激动剂，例如UC-IV199；3)一种与重组革兰氏阳性细菌蛋白质缀合的TLR7激动剂，例如UC-IV199；或4)一种与革兰氏阳性细菌多糖缀合的TLR7激动剂，例如UC-IV199(例如，经由本领域已知的接头，例如使用
Figure G2008800115258D00541
的接头)。
如上文所述，TLR7激动剂与炭疽杆菌(BA)Sterne疫苗株的经致死性辐射的芽孢缀合。同SA一样，BA是一种革兰氏阳性细菌。通过细胞因子(IL-12和IL-6)分泌测量可知，与单独的芽孢相比，缀合的细菌是一种小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDB)的强效激活剂。在另一个实验中，BA的Sterne菌株的经致死性辐射的芽孢-混合了与小鼠白蛋白(MSA)缀合的TLR7激动剂-对小鼠的单次注射仅在6天后即保护了该动物免受施予的肺内BA致死性攻击。相反地，仅用BA芽孢、或用BA加一种常规佐剂即霍乱毒素(CT)对该动物的注射则不能保护该动物。因此，TLR7-激动剂白蛋白/经辐射的芽孢疫苗在6天内诱发抵抗炭疽杆菌的保护性免疫。在未经用药的动物中的反应快速程度完全出乎意料。相同的疫苗技术将很可能保护人类免受院内获得性SA感染。
本说明书中引用的所有出版物、专利及专利文献以引用的方式纳入本文，如同逐一地通过引用而纳入的一样。对于任何不一致的情况，以本发明公开的内容为准，包括其中的任何定义。已参照多种具体的和优选的实施方案和技术对本发明进行了描述。但应理解，可作出多种变化方案和改进方案而依然在本发明的主旨和范围内。

Claims (44)

1.一种预防或抑制哺乳动物的革兰氏阳性细菌感染的方法，包括对所述哺乳动物施用一种有效量的组合物，所述组合物包含一种革兰氏阳性细菌的细菌抗原和一定量的式(IA)化合物或其可药用盐，所述可药用盐包括其水合物，
Figure F2008800115258C00011
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Rc为氢、C1-10烷基或取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R1为氢、(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
X2为一个键或一个连接基团；n为1、2、3或4；并且
R3为一种大分子，其包括异源肽、异源蛋白质、异源脂质、珠例如聚苯乙烯珠、异源核酸分子或树突状物。
2.一种预防或抑制哺乳动物的革兰氏阳性细菌感染的方法，包括对所述哺乳动物施用一种有效量的式(IB)化合物，或者其可药用盐，所述可药用盐包括其水合物，
Figure F2008800115258C00021
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Rc为氢、C1-10烷基或取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R1为氢、(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
X2为一个键或一个连接基团；n为1、2、3或4；并且
R3为所述革兰氏阳性细菌、一种所述革兰氏阳性细菌的分离的抗原性蛋白质或肽、或一种所述革兰氏阳性细菌的分离的多糖；
其中所述革兰氏阳性细菌不是杆菌属(Bacillus)或李斯特菌属(Listeria)。
3.权利要求1或2的方法，其中X1为硫原子。
4.权利要求1或2的方法，其中X1为氧原子。
5.权利要求1或2的方法，其中X1为-NRc-，其中Rc为氢、C1-6烷基或取代的C1-6烷基；其中所述烷基取代基为C3-6环烷基、羟基、C1-6烷氧基、氨基、氰基或芳基。
6.权利要求5的方法，其中X1为-NH-。
7.权利要求1至6之一的方法，其中R1和Rc一起形成一个杂环或一个取代的杂环。
8.权利要求7的方法，其中R1和Rc一起形成一个取代或未取代的吗啉代环、哌啶子基环、吡咯烷环或哌嗪环。
9.权利要求1至6之一的方法，其中R1为氢、C1-4烷基或取代的C1-4烷基。
10.权利要求9的方法，其中R1为氢、CH3-、CH3-CH2-、CH3CH2CH2-、羟基C1-4亚烷基或C1-4烷氧基C1-4亚烷基。
11.权利要求10的方法，其中R1为氢、CH3-、CH3-CH2-、CH3-O-CH2CH2-或CH3-CH2-O-CH2CH2-。
12.权利要求1至11之一的方法，其中R2为氢、卤素或C1-4烷基。
13.权利要求12的方法，其中R2为氢、氯、溴、CH3-或CH3-CH2-。
14.权利要求1至13之一的方法，其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、C3-6环烷基、氨基、氰基、卤素或芳基。
15.权利要求1至14之一的方法，其中X2为一个键或一个具有最高至约24个原子的链；其中所述原子选自碳、氮、硫、非过氧化物型氧和磷。
16.权利要求15的方法，其中X2为一个键或一个具有约4至约12个原子的链。
17.权利要求15的方法，其中X2为一个键或一个具有约6至约9个原子的链。
18.权利要求15的方法，其中X2为
Figure F2008800115258C00041
19.权利要求1或3至18之一的方法，其中所述大分子为一种磷脂、一种脂质体或一种树突状物。
20.权利要求1或3至18之一的方法，其中所述异源肽具有2至约200个氨基酸残基。
21.权利要求2至18之一的方法，其中所述肽具有2至约200个氨基酸残基。
22.权利要求1或3至18之一的方法，其中所述异源肽具有10至约200个氨基酸残基。
23.权利要求2至18之一的方法，其中所述肽具有10至约200个氨基酸残基。
24.权利要求1或3至18之一的方法，其中所述大分子包括碳水化合物。
25.权利要求1或3至18之一的方法，其中所述核酸分子包括DNA、RNA或PNA。
26.权利要求1至25之一的方法，其中所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌。
27.权利要求1至26之一的方法，其中所述哺乳动物为人。
28.权利要求1至27之一的方法，其中所述哺乳动物有革兰氏阳性细菌感染的风险。
29.权利要求1至28之一的方法，其中所述哺乳动物为免疫系统受损者。
30.权利要求1至29之一的方法，其中所述哺乳动物在给药后约6天对给药具有有效的免疫应答。
31.权利要求1或3至30之一的方法，其中所述组合物包括一种灭活的革兰氏阳性细菌的制剂。
32.权利要求1至31之一的方法，其中所述量在给药后约6天对预防感染有效。
33.权利要求2或3至32之一的方法，进一步包括施用一种灭活的革兰氏阳性细菌的制剂。
34.权利要求1、3至25或27至33之一的方法，其中所述组合物包括一种革兰氏阳性细菌的芽孢。
35.一种疫苗，包含一种组合物，所述组合物包含一种金黄色葡萄球菌的细菌抗原和一定量的式(IA)化合物或其可药用盐，所述可药用盐包括其水合物，
Figure F2008800115258C00051
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Rc为氢、C1-10烷基或取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R1为氢、(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
X2为一个键或一个连接基团；n为1、2、3或4；并且
R3为一种大分子，其包括异源肽、异源蛋白质、异源脂质、珠例如聚苯乙烯珠、异源核酸分子或树突状物。
36.一种疫苗，包含一种式(IB)化合物，或者其可药用盐，所述可药用盐包括其水合物，
Figure F2008800115258C00061
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Rc为氢、C1-10烷基或取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R1为氢、(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；其中位于所述烷基、芳基或杂环基上的取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；
Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
X2为一个键或一个连接基团；n为1、2、3或4；并且
R3为金黄色葡萄球菌细菌、一种所述金黄色葡萄球菌细菌的分离的抗原性蛋白质或肽、或一种所述金黄色葡萄球菌细菌的分离的多糖。
37.一种式(I)化合物，或者其可药用盐，
Figure F2008800115258C00071
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Y为S或NH；
其中Rc为氢、C1-10烷基或被C3-6环烷基取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中所述取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基或氰基；
其中R1为(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；
其中R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；
其中Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
其中X2为一个键或一个连接基团；
其中R3为一种大分子；
其中n为1、2、3或4；
其中m为1；
其中q＞2。
38.一种式(ID)化合物，或者其可药用盐，
Figure F2008800115258C00081
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Y为S或NH；
其中Rc为氢、C1-10烷基或被C3-6环烷基取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中所述取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基或氰基；
其中R1为(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；
其中R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；
其中Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
其中X2为一个键或一个连接基团；
其中R3为一种大分子；
其中n为1、2、3或4；
其中m为1；
其中q为1、2、3或最多至约1,000、约10,000或更大，例如约105、约106或更大；
其中R3为一种除乙型肝炎病毒以外的DNA病毒，一种除SIV、丙型肝炎病毒或冠状病毒以外的RNA病毒，一种纳米粒，一种除聚苯乙烯珠以外的珠，或一种除杆菌属、李斯特菌属、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)或沙门氏菌属(Salmonella)之外的细菌，或为一种包括连接至X2的脂质的脂质体。
39.权利要求38的化合物，其中所述病毒为一种慢病毒或疱疹病毒。
40.权利要求37或38的化合物，其中R3为一种二氧化硅珠。
41.权利要求37的化合物，其中R3为一种纳米粒。
42.权利要求38或41的化合物，其中所述纳米粒包括二氧化硅、聚丙烯酸酯、聚(丙交酯共乙交酯)、多聚谷氨酸或多聚赖氨酸。
43.权利要求38或41的化合物，其中所述纳米粒为一种聚合物胶束或碳纳米管。
44.一种预防、治疗或抑制哮喘的方法，包括对需要预防、治疗或抑制哮喘的哺乳动物施用一种有效量的式(I)化合物或其可药用盐，
其中X1为-O-、-S-、或-NRc-；
其中Y为S或NH；
其中Rc为氢、C1-10烷基或被C3-6环烷基取代的C1-10烷基，或者Rc和R1可与氮原子一起形成一个杂环或一个取代的杂环，其中所述取代基为羟基、C1-6烷基、羟基C1-6亚烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基C1-6亚烷基或氰基；
其中R1为(C1-C10)烷基、取代的(C1-C10)烷基、C6-10芳基、或取代的C6-10芳基、C5-9杂环基、取代的C5-9杂环基；
其中R2各自独立地为氢、-OH、(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、取代的(C1-C6)烷氧基、-C(O)-(C1-C6)烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-(C1-C6)烷基、-C(O)-(C6-C10)芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-(C6-C10)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C1-C6)烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O(C1-C6)烷基、-NRaRb、-C(O)NRaRb(氨甲酰基)、取代的-C(O)NRaRb、卤素、硝基或氰基；
其中Ra和Rb各自独立地为氢、(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C6)烷氧基、卤代(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷酰基、羟基(C1-C6)烷基、芳基、芳基(C1-C6)烷基、Het、Het(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷氧基羰基；
其中X2为一个键或一个连接基团；
其中R3为一种大分子；
其中n为1、2、3或4；
其中m为1、2、3或更大，例如5、10、15或更大；
其中q为1、2、3或最高至约1,000、约10,000或更大，例如约105、约106或更大。
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