CN115151547A - 作为Toll样受体7(TLR7)激动剂的1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶化合物 - Google Patents

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Abstract

根据式I的化合物可用作Toll样受体7(TLR7)的激动剂。(I)此类化合物可以用于癌症治疗，尤其是与抗癌免疫治疗剂组合，或用作疫苗佐剂。

Description

作为Toll样受体7(TLR7)激动剂的1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶化 合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月27日提交的美国临时申请序列号62/966,119在35U.S.C. §119(e)下的权益，将其公开内容通过引用并入本文。
背景技术
本公开文本涉及Toll样受体7(“TLR7”)激动剂及其缀合物以及用于此类激动剂及其缀合物的制备和使用方法。
Toll样受体(“TLR”)是识别病原体相关分子模式(“PAMP”)的受体，所述病原体相关分子模式是在某些种类的病原体中保守的小分子基序。TLR可以位于细胞表面或细胞内。通过结合其同源PAMP而激活TLR传递了宿主内存在相关病原体(即感染)的信号并且刺激宿主的免疫系统以抵抗感染。人具有10种TLR，称为TLR1、TLR2、 TLR3等。
通过激动剂激活TLR(TLR7是被研究最多的)可以对疫苗和免疫治疗剂通过刺激总体免疫应答而在治疗除实际病原体感染以外的多种病症中的作用产生积极效果。因此，对TLR7激动剂在癌症免疫疗法中作为疫苗佐剂或作为增强剂的用途存在很大兴趣。参见，例如，Vasilakos和Tomai 2013，Sato-Kaneko等人2017，Smits等人2008以及Ota 等人2019。
TLR7(位于内体膜上的细胞内受体)识别与单链RNA病毒相关的PAMP。它的激活诱导I型干扰素(诸如IFNα和IFNβ)的分泌(Lund等人2004)。TLR7具有两个结合位点，一个用于单链RNA配体(
Figure BDA0003813242340000013
等人2007)，并且一个用于小分子诸如鸟苷 (Zhang等人2016)。
TLR7可以结合基于1H-咪唑并[4,5-c]喹啉骨架的鸟苷样合成激动剂(诸如咪喹莫特、瑞喹莫德和嘎德莫特(gardiquimod))并且被其激活。关于小分子TLR7激动剂的综述，参见Cortez和Va 2018。
Figure BDA0003813242340000011
基于喋啶酮分子骨架的合成TLR7激动剂也是已知的，如通过维沙莫德(vesatolimod)例示(Desai等人2015)。
Figure BDA0003813242340000012
经常根据通式(A)公开基于嘌呤样骨架的其他合成TLR7激动剂：
Figure BDA0003813242340000021
其中R、R’和R”是结构变量，并且R”典型地含有未取代的或取代的芳族或杂芳族环。
具有嘌呤样骨架的生物活性分子及其在治疗诸如纤维化、炎性障碍、癌症或病原体感染的病症中的用途的披露包括：Akinbobuyi等人2015和2016；Barberis等人2012；Carson等人2014；Ding等人2016,2017a,和2017b；Graupe等人2015；Hashimoto等人 2009；He等人2019a和2019b；Holldack等人2012；Isobe等人2009a和2012；Poudel等人 2019a和2019b；Pryde 2010；和Young等人2019。
基团R”可以是吡啶基：Bonfanti等人2015a和2015b；Halcomb等人2015；Hirota 等人2000；Isobe等人2002,2004,2006,2009a,2009b,2011,和2012；Kasibhatla等人2007；Koga-Yamakawa等人2013；Musmuca等人2009；Nakamura 2012；Ogita等人2007；和 Yu等人2013。
存在式(A)的6,5-稠合环系统(即与咪唑五元环稠合的嘧啶六元环)被修饰的相关分子的公开文本。(a)Dellaria等人2007，Jones等人2010和2012，以及Pilatte等人 2017披露了嘧啶环被吡啶环替代的化合物。(b)Chen等人2011，Coe等人2017，Poudel 等人2020a和2020b，以及Zhang等人2018披露了咪唑环被吡唑环替代的化合物。(c) Cortez等人2017和2018；Li等人2018；以及McGowan等人2016a,2016b和2017披露了咪唑环被吡咯环替代的化合物。
Bonfanti等人2015b和2016以及Purandare等人2019公开了其中大环跨越嘌呤部分的两个环的TLR7调节剂：
TLR7激动剂可以与配偶体分子缀合，所述配偶体分子可以是例如磷脂、聚(乙二醇)(“PEG”)、抗体或另一种TLR(通常是TLR2)。示例性的公开文本包括：Carson 等人2013,2015,和2016，Chan等人2009和2011，Cortez等人2017，Gadd等人2015， Lioux等人2016，Maj等人2015，Vernejoul等人2014，以及Zurawski等人2012。频繁的缀合位点是在式(A)的R”基团处。
Jensen等人2015披露了阳离子脂质媒介物用于递送TLR7激动剂的用途。
一些TLR7激动剂(包括瑞喹莫德)是双重TLR7/TLR8激动剂。参见，例如， Beesu等人2017，Embrechts等人2018，Lioux等人2016，和Vernejoul等人2014。
本说明书的结尾处列出了通过第一作者或发明人和年份对本文中引用的文献的完全引用。
发明内容
本说明书涉及具有1H-吡唑并[4,3d]嘧啶芳族系统的化合物，其具有作为TLR7 激动剂的活性。
Figure BDA0003813242340000022
在一方面，提供了一种具有根据式I的结构的化合物
Figure BDA0003813242340000031
其中
W是
Figure BDA0003813242340000032
每个X独立地是N或CR2；
R1是(C1-C5烷基)、
(C2-C5烯基)、
(C1-C8烷二基)0-1(C3-C6环烷基)、
(C2-C8烷二基)OH、
(C2-C8烷二基)O(C1-C3烷基)、
(C1-C4烷二基)0-1(5-6元杂芳基)、
(C1-C4烷二基)0-1苯基、
(C1-C4烷二基)CF3、
(C2-C8烷二基)N[C(＝O)](C1-C3烷基)、
(C2-C8烷二基)0-1(C3-C6环烷二基)(C3-C6环烷基)、
或
(C2-C8烷二基)NRxRy；
每个R2独立地是H、O(C1-C3烷基)、S(C1-C3烷基)、SO2(C1-C3烷基)、C1-C3烷基、O(C3-C4环烷基)、S(C3-C4环烷基)、SO2(C3-C4环烷基)、C3-C4环烷基、Cl、F、CN；
或[C(＝O)]0-1NRxRy；
R3是NH[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)0-1(C4-C10二环烷基)、
O(C1-C4烷二基)0-1(C4-C8二环烷基)、
或
具有以下结构的部分
Figure BDA0003813242340000033
R4是NH(C1-C4烷二基)0-1(C4-C10二环烷基)
或
具有以下结构的部分
Figure BDA0003813242340000034
R5是H、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C3-C6环烷基、卤基、O(C1-C5烷基)、(C1-C4烷二基)OH、(C1-C4烷二基)O(C1-C3烷基)、苯基、NH(C1-C5烷基)、5或6元杂芳基、
Figure BDA0003813242340000035
R6是(NH)0-1(C1-C4烷二基)0-1(C4-C10二环烷基)、
或
具有以下结构的部分
Figure BDA0003813242340000041
Rx和Ry独立地是H或C1-C3烷基，或Rx和Ry与它们键合的氮组合以形成3至7元杂环；
n是1、2或3；
并且
p是0、1、2或3；
其中在R1、R2、R3、R4、R5和R6中，
烷基、烯基、环烷基、烷二基、二环烷基、或以下式的部分
Figure BDA0003813242340000042
任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：OH、卤基、CN、(C1-C3烷基)、 O(C1-C3烷基)、C(＝O)(C1-C3烷基)、SO2(C1-C3烷基)、NRxRy、 (C1-C4烷二基)OH、(C1-C4烷二基)O(C1-C3烷基)；
并且
烷基、烯基、烷二基、环烷基、二环烷基、或以下式的部分
Figure BDA0003813242340000043
任选地可以具有被以下替代的CH2基团：O、SO2、CF2、C(＝O)、NH、
N[C(＝O)]0-1(C1-C5烷基)、
N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)CF3、
N[C(＝O)]0-1(C2-C4烷二基)OH
N(SO2)(C1-C3烷基)、
N(C1-C3烷二基)0-1[C(＝O)]N(C1-C3烷基)2、
或
N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)0-1(C3-C5环烷基)；
条件是式(I)的化合物不是
Figure BDA0003813242340000044
Figure BDA0003813242340000051
本文公开的化合物具有作为TLR7激动剂的活性，并且一些化合物可以与抗体缀合，用于靶向递送至预期作用的靶组织或器官。还可以将其聚乙二醇化，以调节其药物特性。
本文公开的化合物或其缀合物或其聚乙二醇化衍生物可以用于通过向患有适于通过激活免疫系统治疗的病症的受试者施用治疗有效量的这种化合物或其缀合物或其聚乙二醇化衍生物(尤其是与疫苗或癌症免疫治疗剂组合)治疗这样的受试者。
具体实施方式
化合物
在一方面，本公开文本的化合物是根据式(Ia)的，其中R1、R2、R5和W是如关于式(I)定义的：
Figure BDA0003813242340000052
其中R2优选是OMe。
在另一方面，本公开文本提供了一种具有根据式(Ia)的结构的化合物
Figure BDA0003813242340000053
其中
R1是
Figure BDA0003813242340000054
R2是OMe或OCHF2；
R5是H或Me；并且
W是
Figure BDA0003813242340000055
在另一方面，本公开文本的化合物是根据式(Ib)的，其中R1、R2、R3和R5是如关于式(I)定义的：
Figure BDA0003813242340000061
在另一方面，本公开文本的化合物是根据式(Ic)的，其中R1、R2、R4和R5是如关于式(I)定义的：
Figure BDA0003813242340000062
在另一方面，本公开文本提供了一种根据式(Id)的化合物，其中R1、R2、R3和R5是如关于式(I)定义的并且一个X是N并且另一个X是CH：
Figure BDA0003813242340000063
在式(Id)中，优选R1是
Figure BDA0003813242340000064
R2是OMe，并且R5是H。
合适的基团R1的例子包括：
Figure BDA0003813242340000065
在一方面，R1选自
Figure BDA0003813242340000066
R2优选是OMe、O(环丙基)、或OCHF2，更优选OMe或OCHF2，并且尤其优选 OMe。
R5优选是H、CH2OH、或Me，更优选H。
其中W是
Figure BDA0003813242340000067
并且n等于1的例子包括：
Figure BDA0003813242340000071
在一方面，
Figure BDA0003813242340000072
是
Figure BDA0003813242340000073
其中W是
Figure BDA0003813242340000074
的例子包括：
Figure BDA0003813242340000075
在一方面，W是
Figure BDA0003813242340000076
优选n等于1。
在一方面，W是
Figure BDA0003813242340000077
通过示例而不是限制的方式，二环烷基包括
Figure BDA0003813242340000078
通过示例而不是限制的方式，以下式的部分
Figure BDA0003813242340000079
包括
Figure BDA00038132423400000710
Figure BDA0003813242340000081
以下式的上述示例性二环烷基基团和部分中的一些：
Figure BDA0003813242340000082
具有可选取代基和/或任选地具有一个或多个被O、SO2等替代的CH2基团，如在上述发明内容中描述的。
本文公开的化合物的具体例子在下表A中示出。该表还提供了按下文提供的程序确定的与以下生物活性有关的数据：人TLR7报告物测定和/或在人全血中CD69基因的诱导。最右边的列含有分析数据(质谱、HPLC保留时间和NMR)。在一个实施方案中，本公开文本的化合物具有(a)小于1,000nM的人TLR7(hTLR7)报告物测定EC50值以及 (b)小于1,000nM的人全血(hWB)CD69诱导EC50值。(如果测定进行多次，则报告值是平均值。)
Figure BDA0003813242340000083
Figure BDA0003813242340000091
Figure BDA0003813242340000101
Figure BDA0003813242340000111
Figure BDA0003813242340000121
Figure BDA0003813242340000131
Figure BDA0003813242340000141
Figure BDA0003813242340000151
Figure BDA0003813242340000161
Figure BDA0003813242340000171
Figure BDA0003813242340000181
Figure BDA0003813242340000191
药物组合物和施用
在另一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的如本文公开的化合物或其缀合物。它可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，诸如生物制剂或小分子药物。所述药物组合物可以在组合疗法中与另一种治疗剂(尤其是抗癌剂)一起施用。
所述药物组合物可以包含一种或多种赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂、及其组合。在下文中传授了合适的赋形剂的选择和使用：Gennaro,编,Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第 20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)。
优选地，药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物包被在材料中以保护所述化合物免受可能使其失活的酸和其他天然条件的作用。短语“肠胃外施用”意指除了肠施用和外用施用之外的施用方式，通常通过注射进行，并且包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。可替代地，所述药物组合物可以经由非肠胃外途径施用，所述非肠胃外途径诸如外用、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用。
药物组合物可以呈无菌水性溶液或分散体的形式。它们也可以配制成微乳液、脂质体、或适合于实现高药物浓度的其他有序结构。所述组合物也可以以冻干物(用于在施用前在水中重构)的形式提供。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据正在被治疗的受试者和特定的施用方式而变化并且将总体上是产生治疗效果的组合物量。通常，从百分比来说，该量范围在约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分内，所述活性成分与药学上可接受的载体相组合。
调整剂量方案以提供治疗反应。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以如根据情况的紧急程度所指示，按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和剂量的均匀。“剂量单位形式”是指适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每个单位含有与所需的药物载体联合的经计算产生所希望的治疗反应的预定量的活性化合物。
剂量在从约0.0001至100mg/kg宿主体重并且更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或 10mg/kg体重或者在1-10mg/kg或可替代地0.1至5mg/kg的范围内。示例性的治疗方案是每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、或每3至6 个月一次的施用。优选的剂量方案包括使用以下给药时间表中的一种经由静脉内施用1 mg/kg体重或3mg/kg体重：(i)每四周，持续六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii) 一次3mg/kg体重，然后是每三周1mg/kg体重。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000 μg/mL的血浆抗体浓度，并且在一些方法中达到约25-300μg/mL。
本发明的化合物的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或对由于疾病困扰而引起的损伤或残疾的预防。例如，对于荷瘤受试者的治疗，相对于未经治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地抑制肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、以及仍更优选至少约80％。治疗有效量的治疗化合物可以减小受试者的肿瘤大小或在其他方面改善受试者的症状，所述受试者通常是人，但是可以是另一种哺乳动物。在组合治疗中施用两种或更多种治疗剂的情况下，“治疗有效量”是指组合作为整体的功效，而不是单独地每种药剂的功效。
所述药物组合物可以是控释或缓释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的可生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可以经由诸如(1)无针皮下注射装置；(2)微量输注泵；(3)透皮装置；(4)输注装置；和(5)渗透装置的医疗装置施用治疗组合物。
在某些实施方案中，可以配制所述药物组合物以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗化合物穿过血脑屏障，可以将它们配制在脂质体中，所述脂质体可以另外地包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。
工业实用性和用途
本文公开的TLR7激动剂化合物可以用于治疗可通过激活TLR7而改善的疾病或病症。
在一个实施方案中，将TLR7激动剂与抗癌免疫治疗剂(也称为免疫肿瘤学药剂)组合使用。抗癌免疫治疗剂通过刺激身体的免疫系统以攻击和破坏癌细胞，尤其是通过激活T细胞来工作。免疫系统具有许多检查点(调节)分子，以帮助维持其攻击正当的靶细胞与防止其攻击健康的正常细胞之间的平衡。一些分子是刺激剂(上调剂)，这意味着它们的参与促进T细胞激活并且增强免疫应答。其他分子是抑制剂(下调剂或制止剂)，这意味着它们的参与抑制T细胞激活并且减轻免疫应答。激动性免疫治疗剂与刺激性检查点分子的结合可以导致后者的激活和针对癌细胞的免疫应答增强。相反，拮抗性免疫治疗剂与抑制性检查点分子的结合可以防止免疫系统被后者下调并且帮助维持针对癌细胞的强烈应答。刺激性检查点分子的例子是B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、 4-1BBL、ICOS、CD40、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、 DR3和CD28H。抑制性检查点分子的例子是CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、 TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、CD113、GPR56、VISTA、 2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、CD96和TIM-4。
无论抗癌免疫治疗剂的作用方式是哪种，均可以通过总体上调免疫系统(诸如通过激活TLR7)来提高其有效性。因此，在一个实施方案中，本说明书提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向患有这样的癌症的患者施用抗癌免疫治疗剂和如本文公开的 TLR7激动剂的治疗有效组合。施用时间可以是同时的、顺序的或交替的。施用方式可以是全身的或局部的。可以经由缀合物以靶向的方式递送所述TLR7激动剂。
可以通过如上所述的组合治疗进行治疗的癌症包括急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因肉瘤、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、肝癌、下咽癌、胰腺癌、肾癌、喉癌、慢性髓细胞性白血病、唇和口腔癌、肺癌、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、口癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、咽喉癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
可以用于如本文公开的组合疗法的抗癌免疫治疗剂包括：AMG 557、AMP-224、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、BMS 936559、西米普利单抗(cemiplimab)、CP-870893、达西珠单抗(dacetuzumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、加利昔单抗(galiximab)、IMP321、伊匹单抗、鲁卡木单抗(lucatumumab)、MEDI-570、MEDI-6383、MEDI-6469、莫罗单抗(muromonab) -CD3、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、曲美目单抗(tremelimumab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌托鲁单抗(utomilumab)、瓦立鲁单抗(varlilumab)、珀伽利珠单抗(vonlerolizumab)。下表B列出了它们的一个或多个替代名称(商标名称、曾用名、研究代码或同义词)和各自的靶检查点分子。
Figure BDA0003813242340000211
Figure BDA0003813242340000221
在用TLR7激动剂的组合治疗的一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗CTLA-4、抗PD-1或抗PD-L1抗体。所述癌症可以是肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌、头颈癌、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤和梅克尔皮肤癌)、尿路上皮癌(包括膀胱癌)、胃癌、肝细胞癌或结直肠癌。
在用TLR7激动剂的组合治疗的另一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗CTLA-4抗体，优选伊匹单抗。
在用TLR7激动剂的组合治疗的另一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗PD-1抗体，优选纳武单抗或派姆单抗。
本文公开的TLR7激动剂还可用作疫苗佐剂。
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，所述实施例是通过说明而非限制的方式来提供的。
分析程序
NMR
以下条件用于获得质子核磁共振(NMR)谱：使用DMSO-d6或CDCl3作为溶剂和内标，在400Mz或500Mhz Bruker仪器中采集NMR谱。通过使用ADC Labs的ACD Spectrus版本2015-01或MestReNova软件分析原始NMR数据。
化学位移以相对于内部四甲基硅烷(TMS)或相对于由氘化NMR溶剂推断出的TMS位置的低场百万分率(ppm)报告。表观多重性报告为：单峰-s、双峰-d、三重峰 -t、四重峰-q或多重峰-m。表现出展宽的峰进一步表示为br。积分是近似的。应当注意，积分强度、峰形、化学位移和耦合常数可以取决于溶剂、浓度、温度、pH和其他因素。此外，在NMR谱中与水或溶剂峰重叠或交换的峰可能不能提供可靠的积分强度。在一些情况下，可以使用水峰抑制获得NMR谱，水峰抑制可能导致重叠峰不可见或具有改变的形状和/或积分。
液相色谱法
使用了以下制备型和分析型(LC/MS)液相色谱方法：
分析型LC/MS程序A：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM NH4OAc)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。
分析型LC/MS程序B：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％TFA)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。
LC/MS方法1：柱：BEH C18 2.1 x 50mm；流动相A：含0.05％TFA的水；流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：50℃；梯度：经1.0min 2％-98％B，然后在98％B下保持0.50min；流速：0.8mL/min。检测：MS和UV(220nm)。
LC/MS方法2：柱：BEH C18 2.1 x 50mm；流动相A：95:5H2O:乙腈(含0.01 MNH4OAc)；流动相B：5:95H2O:乙腈(含0.01M NH4OAc)；温度：50℃；梯度：经1min 5％-95％B；流速：0.8mL/min。
LC/MS方法3：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％TFA)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。
LC/MS方法4：柱：Waters XBridge BEH C18 XP(50x2.1 mm)2.5μm；流动相A： 5:95乙腈:水(含10mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM NH4OAc)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B；流速：1.1ml/min。
合成-通用程序
通常，本文公开的程序产生在吡唑并嘧啶环系统的1H或2H位置处烷基化的区域异构体(其也分别称为N1和N2区域异构体，暗指被烷基化的氮)的混合物。为简洁起见，出于便利未示出N2区域异构体，但是应理解的是它们存在于最初的产物混合物中，并且稍后例如通过制备型HPLC进行分离。
Figure BDA0003813242340000231
可以在合成的早期分离区域异构体的混合物，并且用1H区域异构体进行剩余的合成步骤，或者可替代地，可以携带区域异构体的混合物进行合成，并且根据需要在后期进行分离。
可以通过合成有机化学领域的技术人员熟知的多种方法制备本公开文本的化合物。这些方法包括下文描述的那些或其变体。优选的方法包括但不限于下文在以下方案中描述的那些。
方案1
Figure BDA0003813242340000232
Figure BDA0003813242340000241
在方案1中及其其他出现情况下，Ra可以是例如
Figure BDA0003813242340000242
或其他合适的部分。在方案1中及其其他出现情况下，Rb是例如C1-C3烷基。在方案1中及其其他出现情况下，RcNHRd是伯胺或仲胺。在合成过程期间，Ra、Rb、Rc和/或Rd可以具有被保护基团掩蔽的官能团，所述保护基团在适当的时候被去除。
可以通过以上方案1中概述的合成序列制备化合物11。还原硝基吡唑1以提供化合物2，然后用1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代异脲环化得到羟基吡唑并嘧啶3。使用BOP/DBU偶联条件引入胺RaNH2，并且随后使用NBS进行溴化或使用NIS进行碘化(步骤 4)得到溴或碘-吡唑并嘧啶5。使用苄基卤6进行烷基化得到N1和N2产物的混合物，将它们分离，从而得到N1中间体7。催化氢化(步骤6)，然后一锅法LiAlH4还原以及氨基甲酸酯水解得到中间体醇9。将醇9转化为苄基氯化物，然后将其用合适的胺置换得到化合物11。(与未经溴化的中间体4的烷基化相比，在步骤5中经溴化的中间体5的烷基化得到更好的N1/N2产物比)。
方案2
Figure BDA0003813242340000243
Figure BDA0003813242340000251
可替代地，可以使用在以上方案2中描述的途径获得中间体9。将中间体3使用 NBS或NIS溴化或碘化，然后烷基化以得到中间体酯12。然后使用BOP偶联条件进行胺化以得到中间体7。催化氢化，然后是LiAlH4还原为醇以及氨基甲酸甲酯去保护得到中间体 9。
方案3
Figure BDA0003813242340000252
到中间体8的替代途径开始于用苄基卤6烷基化硝基吡唑1，从而得到苄基吡唑13。还原硝基，然后用1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代异脲环化得到羟基吡唑并嘧啶15，将其使用BOP/DBU条件转化为适当的胺衍生物8。这在以上方案3中有说明。
方案4
Figure BDA0003813242340000261
到目标化合物的另一条替代途径在以上方案4中示出。从中间体15开始，将酯基团还原并且将氨基甲酸甲酯使用NaOH去除，得到醇16。醇16转化为氯化物然后用适当的胺置换得到17，并且随后使用BOP/DBU条件进行的胺化得到靶分子11。
在下文方案5中，在7/8或15中的甲酯的水解然后酰胺形成可以得到相应的胺 7a/8a或15a。7a的催化氢化然后氨基甲酸酯去保护产生化合物7b。在8a上的氨基甲酸酯去保护得到化合物8b。最后，氨基甲酸酯去保护后15a上的胺安置得到化合物15b。
方案5
Figure BDA0003813242340000262
合成-具体实施例
为了进一步说明上述内容，包括以下非限制性、以下示例性合成方案。在权利要求范围内的这些实施例的变化在本领域技术人员的能力范围内，并且被认为落入本公开文本的范围内。读者应认识到，被提供本公开文本并且是相关领域的技术人员的熟练技术人员将能够在没有穷举实施例的情况下制备和使用本文公开的化合物。
编号101以上的化合物的分析数据可见于表A。
实施例1-化合物101
Figure BDA0003813242340000263
Figure BDA0003813242340000271
步骤1.将(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(25mg，0.035mmol)与(1S,4S)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(35mg，0.175mmol)在2mL DMF中的溶液在70℃下加热30min。将碱和溶剂在V-10装置中蒸发。将残余物重新溶解于2mL DMF中并且用3HF·Et3N处理。搅拌过夜后，将反应混合物用饱和水性NaHCO3中和。将溶剂在V-10装置中蒸发并且在反相ISCO装置上在10g C-18柱上使用乙腈/水(0.05％甲酸) 纯化。将溶剂在V-10装置中蒸发并且将产物溶解于1mL二噁烷中，并且与175微升的1摩尔NaOH水溶液在70℃下一起加热2h。一旦氨基甲酸酯基团水解完成，则将溶剂在V-10 装置中蒸发。将残余物溶解于2mL DMF中并且经注射器过滤。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；梯度：在22％B下保持0分钟，经23min 22％-62％B，然后在100％B下保持4分钟；流速： 20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥以提供14.7mg的(1S,4S)-5-(4-((5-氨基-7-(((S)-1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苄基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯。
LCMS ESI：针对C30H44N8O4的计算值＝580.7(M+H+)，实测值580.9(M+H+)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.58(s,1H),7.02(s,1H),6.79(d,J＝7.9Hz,1H),6.38(d,J＝7.8Hz,1H),5.68(d,J＝26.6Hz,3H),5.55(d,J＝17.1Hz,1H),4.17(s,0H),4.13(s,1H),3.85(s,3H),3.63(s,1H),3.37(d,J＝40.2Hz,2H),3.07(dd,J＝19.7,10.3Hz,1H),2.79 –2.72(m,1H),2.55(s,4H),2.46(d,J＝9.7Hz,1H),2.39(s,1H),1.78(s,1H),1.61(dd,J＝ 23.0,10.5Hz,2H),1.50(d,J＝5.5Hz,1H),1.38(d,J＝4.2Hz,9H),1.04(s,1H),0.75(t,J＝ 7.3Hz,3H)。
步骤2.将(1S,4S)-5-(4-((5-氨基-7-(((S)-1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苄基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯1(9.16mg，0.016 mmol)在CH2Cl2(0.5mL)中的溶液用TFA(0.024mL，0.315mmol)处理。30min后， LCMS显示BOC保护基团的损失。将溶剂和TFA在V-10装置中蒸发。将残余物溶解于DMF(1mL)中，用Hunig碱(0.055mL，0.315mmol)处理，然后用Ac2O(1.5μL，0.016mmol) 处理。LCMS显示10min后反应完成。将碱通过蒸发去除。将残余物溶解于2mL DMF中。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-um 颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在6％B下保持0分钟，经20min6％-46％B，然后在100％B下保持4分钟；流速： 20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥以提供4.4mg的化合物101。
类似地制备以下化合物：化合物107、化合物108、化合物109、化合物121和化合物122。
实施例2-化合物102
Figure BDA0003813242340000281
将N7-丁基-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(20 mg，0,.53mmol)的溶液溶解于2mL DMF中，并且与3,6-二氮杂二环[3.1.1]庚烷-3-甲酸叔丁酯(53mg，0.267mmol)一起在70℃下加热1h。将过量的碱在V-10装置中蒸发。将粗产物用0.082mL TFA处理并且在室温下搅拌1h。将TFA在V-10装置中蒸发并且将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％TFA)；梯度：在0％B下保持0分钟，经20min0-40％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20 mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥以提供16.2mg的化合物102。
类似地制备以下化合物：化合物103、化合物104、化合物105和化合物143。
实施例3-化合物112
Figure BDA0003813242340000282
步骤1.将(7-羟基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(100mg，0.278mmol)和(3-环丙基环丁基)甲胺(69.7mg，0.557mmol)在DMSO(2mL)中的溶液用DBU(0.126mL，0.835mmol)和BOP(185mg，0.417mmol) 处理。在40℃下加热1h后，添加NaOH(0.278mL，1.391mmol)。将反应混合物在80℃下加热2h并且在反相ISCO上使用用0-50％水/乙腈洗脱的50g C-18柱直接纯化。将含有产物的级分冻干以产生90mg的所希望的产物。
LCMS ESI：针对C22H28N6O2的计算值＝409.5(M+H+)，实测值409.5(M+H+)。
步骤2.将(4-((5-氨基-7-(((3-环丙基环丁基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1- 基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(90mg，0.220mmol)在THF(1mL)中的溶液用SOCl2(0.032 mL，0.441mmol)处理并且在室温下搅拌1h。将溶剂蒸发并且将粗氯化物产物溶解于0.5 mL DMF中，并且在70℃下与(1S,4S)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(35mg， 0.175mmol)一起加热1h。将碱在V-10装置中蒸发并且将粗产物用0.5mL TFA处理并且在室温下搅拌1h。将TFA在V-10装置中蒸发并且将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含 NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在13％B下保持0分钟，经20min 13％-53％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以产生13.2mg的化合物112。
类似地制备化合物113。
实施例4-化合物110
Figure BDA0003813242340000291
步骤1.将NBS(6.94g，39.0mmol)在DMF(20mL)中的溶液添加至(7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(10g，37.8mmol)在DMF(80mL)中的搅拌悬浮液中。在室温下搅拌90min后，将反应混合物倒入水(400mL)中并且搅拌5 min。将产物通过过滤收集，用水(200mL)洗涤，并且放置风干过夜，得到呈固体的(3- 溴-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(7.5g，21.85mmol，57.8％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+＝343.0,345.0。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.87(br s,1H),9.80(s,1H),7.56(br s,1H),3.62(s,3H), 3.54(q,J＝6.6Hz,2H),1.62(quin,J＝7.2Hz,2H),1.40(dq,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.94(t,J＝7.4 Hz,3H)。
步骤2.在0℃下将4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.861g，7.18mmol)在DMF(5mL)中的溶液经5min分批添加至(3-溴-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(2.9g，8.45mmol)和Cs2CO3(3.30g，10.14mmol)在DMF(35mL)中的搅拌悬浮液中。允许将反应混合物加温至室温，搅拌过夜，倒入饱和NaHCO3溶液(300mL) 中并且用EtOAc(3x70mL)萃取。将合并的有机相用盐水(4x50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(SiO2柱，在己烷中的0至50％EtOAc)得到呈固体的4-((3- 溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.400g，2.69mmol，31.8％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+＝521.2,523.2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.88(s,1H),7.54-7.48(m,2H),7.32(t,J＝5.6Hz,1H),6.79(d,J＝7.7Hz,1H),5.78(s,2H),3.86(s,3H),3.85(s,3H),3.63(s,3H),3.52(q,J＝6.6Hz, 2H),1.56(quin,J＝7.3Hz,2H),1.28-1.15(m,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤3.将4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1- 基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.400g，2.69mmol)悬浮于EtOH(80mL)中。添加10％Pd/C(200mg)。将反应器皿抽空并且用氢气吹扫六次。将反应混合物在氢气气氛下搅拌1h。将反应器皿抽空并且用氮气吹扫，然后通过CELITETM过滤，用EtOH(100mL) 洗涤。将滤液蒸发至干，留下残余物，将其溶解于二噁烷(10mL)中。添加NaOH(3.22 mL，16.11mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌2h，冷却至室温，用水(10mL)稀释，并用5N HCL酸化。通过蒸发去除二噁烷。将残余物用更多的水(20mL)稀释，通过过滤收集，用水洗涤然后用乙腈洗涤，得到呈白色固体的4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(900mg，2.430mmol，90％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+371.2。
步骤4.向20mL闪烁小瓶中装入4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶 -1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(160mg，0.432mmol)、(1R,4R)-2-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1] 庚烷二氢溴化物(100mg，0.518mmol)、BOP(210mg，0.475mmol)和DMSO(3mL)。添加DBU(0.228mL，1.512mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌2h，倒入饱和NaHCO3溶液(20mL)中，并且用EtOAc(3x5mL)萃取。将有机相弃去。将水层蒸发至干。将残余物悬浮于DCM(5mL)中，过滤并且使用快速色谱法(40g SiO2柱，在DCM中的 0至50％MeOH)纯化，得到呈固体的化合物110(13.2mg，0.028mmol，6.5％产率)。
类似地制备化合物111。
实施例5-化合物114
Figure BDA0003813242340000301
步骤1.将(7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(4.98g，18.84mmol；US 2020/0038403 A1)在DMF(60mL)中的搅拌溶液在冰浴中冷却。分批添加NIS(5.09g，22.61mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h并且倒入水(400mL) 中。将沉淀物通过过滤收集，得到呈固体的(7-(丁基氨基)-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5- 基)氨基甲酸甲酯(6.46g，15.73mmol，83％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+＝391.1。
'H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.96(s,1H),9.74(s,1H),7.52(s,1H),3.62(s,3H),3.53 (q,J＝6.5Hz,2H),1.68–1.55(m,2H),1.40(m,2H),0.94(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤2.将Cs2CO3(4.18g，12.81mmol)添加至(7-(丁基氨基)-3-碘-1H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(2.5g，6.41mmol)在DMF(50mL)中的搅拌溶液中。声处理5min后，添加4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.743g，6.73mmol)在DMF(10 mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2h，倒入10％柠檬酸溶液(100mL)中并且用DCM(3x100mL)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(SiO2柱，在己烷中0至100％EtOAc)得到呈固体的4-((7-(丁基氨基)-3- 碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(2.26g， 2.98mmol，46％产率，75％纯度)，将其不经进一步纯化使用。
LC-MS(ES,m/z)：[M+H]+＝569.2。
步骤3.向20mL微波小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.34g，1.771mmol，75％纯度)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(91mg，0.124mmol)、三甲基环三硼氧烷(1001mg，7.97mmol)、K2CO3(734mg，5.31mmol)和二噁烷(7mL)。将反应混合物在120℃的微波炉中加热1h，并且用DCM和10％柠檬酸稀释。分离各相。将有机相用10％柠檬酸和盐水顺序洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并且在减压下浓缩。快速色谱法得到呈固体的4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(422mg，1.06mmol，59.8％产率)。
LC-MS(ES,m/z)：[M+H]+＝399.2。
步骤4.将NaOH(1.190mL，5.95mmol)添加到4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(237mg，0.595mmol)在二噁烷(5mL)中的悬浮液中。在80℃下搅拌1h后，将反应混合物冷却，用5N盐酸中和，并且蒸发至干。将残余物悬浮在DMSO(2mL)和水(20mL)中，并且通过过滤收集并且用水洗涤，得到呈固体的4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基) 甲基)-3-甲氧基苯甲酸(184mg，0.479mmol，80％产率)。
LC-MS(ES,m/z)：[M-H]+＝383.2。
步骤5.向20mL闪烁小瓶中装入4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(35mg，0.091mmol)、2-(1H-苯并三唑-1- 基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(“HBTU”，41.4mg，0.109mmol)、(1R,4R)-2-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷二氢溴化物(17.58mg，0.091mmol)和DMF(2mL)。添加DIPEA(0.048mL，0.273mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，过滤并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A： 5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在 4％B下保持0分钟，经20min 4％-44％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥，得到化合物114(15.1mg，0.032mmol，35％产率)。
类似地制备化合物115。
实施例6-化合物116，双三氟乙酸盐
Figure BDA0003813242340000311
Figure BDA0003813242340000321
步骤1.将氢氧化钾(5N，24.07mL，120mmol)在水中的溶液添加到3-羟基 -4-甲基苯甲酸甲酯(4g，24.07mmol)在乙腈(150mL)中的冷却(冰浴)溶液中。在 0℃下搅拌5min后，添加(溴二氟甲基)膦酸二乙酯(12.85g，48.1mmol)。允许将反应混合物缓慢加温至室温并且搅拌16h。添加更多的KOH溶液(5N，16mL，80mmol)。将反应混合物在室温下搅拌另外的30min，用水(200mL)稀释并且用EtOAc(3x 50mL) 萃取。将合并的有机相用盐水(2x50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(SiO2柱，在己烷中的0至10％EtOAc)得到呈油状物的3-(二氟甲氧基)-4-甲基苯甲酸甲酯(2.552g，11.80mmol，49.0％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+217.1。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),7.68(br.s,1H),7.51-7.10 (m,2H),3.87(s,3H),2.31(s,3H)。
步骤2.将NBS(1.811g，10.18mmol)和过氧化苯甲酰(0.448g，1.850mmol) 添加到3-(二氟甲氧基)-4-甲基苯甲酸甲酯(2g，9.25mmol)在CCl4(20mL)中的搅拌溶液中。将反应混合物在75℃下搅拌4h，然后在室温下搅拌过夜。然后将其蒸发至干并且使用快速色谱法(SiO2柱，在己烷中的0至15％EtOAc)纯化，得到呈油状物的4-(溴甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(1.561g，5.29mmol，57.2％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+295.0,297.0。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.80(s,1H),7.52(d,J＝8.1Hz, 1H),6.64(t,J＝73.0Hz,1H),4.57-4.51(m,2H),3.98-3.90(m,3H)。
步骤3.将Cs2CO3(1329mg，4.08mmol)添加到(3-溴-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(700mg，2.040mmol)在DMF(5mL)中的搅拌溶液中。在冰浴中冷却后，添加4-(溴甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(572mg，1.938mmol) 在DMF(2mL)中的溶液。允许将反应混合物加温至室温，搅拌3h，用水(20mL)稀释并且用EtOAc(3x5mL)萃取。将合并的有机相用盐水(4x10mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(SiO2柱，加载在DCM中，在己烷中的0至60％EtOAc)得到呈固体的4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(275mg，0.493mmol，24.19％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+557.1,559.1。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.89(s,1H),7.82-7.69(m,2H),7.61-7.14(m,2H),6.87(d,J＝7.9Hz,1H),5.88(s,2H),3.87(s,3H),3.64(s,3H),3.54-3.45(m,2H),1.58-1.46 (m,2H),1.19(dq,J＝15.0,7.4Hz,2H),0.83(t,J＝7.3Hz,3H)。
步骤4.将4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶 -1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(275mg，0.493mmol)溶解于乙醇(15mL)中。添加10％Pd/C(27mg)。将反应混合物抽空并且吹扫六次，在氢气气氛下搅拌2h，过滤并且蒸发至干。将残余物溶解在二噁烷(2mL)中。添加NaOH(0.564mL，2.82mmol)，并且将反应混合物在80℃下搅拌2h，然后允许冷却。将反应混合物用5N HCl中和并且蒸发至干。将残余物溶解在MeOH/水(1:1，8mL)中。将甲醇通过蒸发去除。将残余水性悬浮液过滤。将残余物用水洗涤，得到呈固体的4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸(54mg，0.133mmol，27％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+＝407.22。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.50(br s,1H),7.84(s,2H),7.79-7.68(m,2H),7.63-7.05(t,J＝73.2Hz 1H),6.97(d,J＝7.9Hz,1H),5.94(s,2H),3.54(q,J＝6.4Hz,2H),1.54(quin, J＝7.2Hz,2H),1.19(dq,J＝14.9,7.3Hz,2H),0.84(t,J＝7.3Hz,3H)。
步骤5.向20mL闪烁小瓶中装入4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸(35mg，0.086mmol)、HATU(39.3mg，0.103mmol)、(3aR,6aS)-2-甲基八氢吡咯并[3,4-c]吡咯(10.87mg，0.086mmol)和DMF(2mL)。添加DIPEA(0.045mL，0.258mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，过滤并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A： 5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；梯度：在5％B下保持0分钟，经20min 5％-45％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥，得到作为双三氟乙酸盐的化合物116(12.3mg，0.016mmol，19％产率)。
类似地制备化合物117和123：
实施例7-化合物118
Figure BDA0003813242340000331
步骤1.向微波小瓶中装入3-羟基-4-甲基苯甲酸甲酯(2g，12.04mmol)、溴环丙烷(1.747g，14.44mmol)、Cs2CO3(4.71g，14.44mmol)和DMF(15mL)。将反应混合物在160℃的微波炉中加热3h，冷却，倒入水(150mL)中，并且用EtOAc(3x 50mL)萃取。将合并的有机相用盐水(4x50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(SiO2柱，在己烷中的0至5％EtOAc)得到呈油状物的3-环丙氧基-4- 甲基苯甲酸甲酯(980mg，1.901mmol，15.79％产率，纯度40％)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+207.1。
步骤2.将3-环丙氧基-4-甲基苯甲酸甲酯(1g，1.939mmol，40％纯)溶解于CCl4(5mL)中。添加NBS(0.759g，4.27mmol)和过氧化苯甲酰(0.103g，0.427mmol)。将反应混合物在70℃下搅拌过夜，冷却，并且蒸发至干。快速色谱法(SiO2柱，在己烷中的0至10％EtOAc)得到呈固体的4-(溴甲基)-3-环丙氧基苯甲酸甲酯(550mg，1.54mmol，纯度80％，80％产率)。将产物不经进一步纯化用于下一步骤。
LC-MS(ES,m/z)：[M+H]+285.0，287.0。
步骤3.在0℃下向(3-溴-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(650mg，1.894mmol；US 2020/0038403 A1)在DMF(5mL)中的搅拌溶液中添加 Cs2CO3(1296mg，3.98mmol)，然后添加4-(溴甲基)-3-环丙氧基苯甲酸甲酯(540mg， 1.515mmol，80％纯)在DMF(2mL)中的溶液。允许将反应混合物加温至室温，搅拌过夜，倒入饱和NaHCO3溶液(100mL)中，并且用EtOAc(3x50mL)萃取。将合并的有机相用盐水(4x50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并且浓缩。快速色谱法(SiO2柱，在己烷中的0至70％EtOAc)得到呈油状物的4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基) 氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-环丙氧基苯甲酸甲酯(153mg，0.279mmol， 14.76％产率)，将其静置固化。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+547.2,549.2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),7.80(d,J＝1.5Hz,1H),7.53(dd,J＝7.9,1.5 Hz,1H),7.32(t,J＝5.5Hz,1H),6.91(d,J＝7.9Hz,1H),5.72(s,2H),4.03-3.93(m,1H),3.85 (s,3H),3.71-3.60(m,3H),3.56-3.45(m,2H),1.56(quin,J＝7.3Hz,2H),1.22(dq,J＝14.8, 7.4Hz,2H),0.85(t,J＝7.4Hz,3H),0.81-0.73(m,2H),0.52-0.41(m,2H)。
步骤4.将4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶 -1-基)甲基)-3-环丙氧基苯甲酸甲酯(150mg，0.274mmol)溶解于EtOH(5mL)中并且添加10％Pd/C(15mg)。将反应混合物抽空，用氢气吹扫六次，在氢气气氛下搅拌1h，并且过滤。然后将其蒸发至干。将残余物溶解于二噁烷(3mL)中并且添加NaOH(822μl， 4.11mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌2h，冷却，用5N HCl酸化，并且用水(5mL) 稀释。将有机挥发物蒸发掉，并且将水性残余物使用反相快速色谱法(C18柱，在水中的 0至70％乙腈，含0.05％TFA)纯化，得到呈固体的4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-1-基)甲基)-3-环丙氧基苯甲酸(35mg，0.088mmol，32％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+397.2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.21(br t,J＝5.6Hz,1H),7.81(br s,2H),7.73(s,1H), 7.69(s,1H),7.42(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),6.81(d,J＝7.9Hz,1H),5.66(s,2H),3.87(tt,J＝5.9, 2.9Hz,1H),3.48(q,J＝6.7Hz,2H),1.48(quin,J＝7.3Hz,2H),1.14(sxt,J＝7.4Hz,2H),0.78 (t,J＝7.4Hz,3H),0.75-0.68(m,2H),0.48-0.38(m,2H)。
步骤5.向20mL闪烁小瓶中装入4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-环丙氧基苯甲酸(35mg，0.088mmol)、HATU(40.3mg，0.106mmol)、 (3aR,6aS)-2-甲基八氢吡咯并[3,4-c]吡咯(22.28mg，0.177mmol)和DMF(2mL)。添加DIPEA(0.046mL，0.265mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，过滤，并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相 A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在6％B下保持0分钟，经20min 6％-46％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥，得到化合物118(17.4mg，0.034mmol，39％产率)。
实施例8-化合物124，双三氟乙酸盐
Figure BDA0003813242340000351
步骤1.将10％钯碳(0.622g，0.584mmol)添加至4-硝基-1H-吡唑-5-甲酸甲酯(10g，58.4mmol)在EtOH(100mL)中的搅拌溶液中。将反应器皿抽空并且用氢气吹扫六次。将反应混合物在H2(气囊)下搅拌2天，通过CELITETM过滤，并且用EtOH(100 mL)洗涤。将滤液蒸发至干并且与醚/己烷一起研磨以得到呈固体的4-氨基-1H-吡唑-5- 甲酸甲酯(8.012g，56.8mmol，97％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+142.1。
步骤2.将4-氨基-1H-吡唑-5-甲酸甲酯(4g，28.3mmol)溶解于MeOH(75mL) 中。添加1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代异脲(6.43g，31.2mmol)，然后添加HOAc (6.49mL，113mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5h。添加NaOMe(36.7g，170mmol，按重量计25％)，然后在室温下更多搅拌过夜。将反应混合物用HOAc酸化。将沉淀物通过过滤收集，用水(100mL)、THF(100mL)和醚(100mL)洗涤以得到呈固体的(7- 羟基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(5.098g，24.37mmol，86％产率)。
LC-MS(ES,m/z):[M+H]+210.0。
步骤3.将N-溴代琥珀酰亚胺(4.34g，24.38mmol)添加到(7-羟基-1H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(5.1g，24.38mmol)在DMF(100mL)中的悬浮液中。将反应混合物在室温下搅拌1h，用水(100mL)淬灭，搅拌10min，过滤并且用水(100 mL)、THF(2x50mL)和醚(2x50mL)洗涤，得到呈固体的(3-溴-7-羟基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(8.32g，23.11mmol，95％产率)。
LC-MS(ES,m/z)：[M+H]+288.0，290.0。
步骤4.将(3-溴-7-羟基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(2.169g，6.78 mmol)和Cs2CO3(2.429g，7.46mmol)在DMF(50mL)中的搅拌溶液在冰浴中冷却。添加4-(溴甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(2g，6.78mmol)在DMF(10mL)中的溶液。将反应混合物缓慢加温至室温，搅拌过夜，倒入水(400mL)和饱和NaHCO3溶液(40mL) 中，并且用EtOAc(3x100mL)萃取。将合并的有机相用盐水(4x50mL)洗涤，干燥 (MgSO4)，过滤并且浓缩。使用DCM/醚研磨得到呈固体的4-((3-溴-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(1.937g，3.86 mmol，56.9％产率)。
LCMS M+H 502.1,504.1。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.86-11.58(m,1H),11.58-11.29(m,1H),7.88-7.65(m,2H),7.57-7.07(m,2H),5.94-5.73(m,2H),3.99-3.81(m,3H),3.81-3.67(m,3H)。
步骤5.向20mL闪烁小瓶中装入4-((3-溴-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(1.15g，2.290mmol)、(S)-3-氨基己-1-醇盐酸盐(0.387g，2.52mmol)、BOP(1.215g，2.75mmol)和DMSO(10mL)。添加DBU(1.035mL，6.87mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜，冷却，倒入饱和 NaHCO3溶液(100mL)中，并且用EtOAc(3x50mL)萃取。将合并的有机相用盐水(4 x50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并且浓缩。反相快速色谱法(100g C18柱，在水中的0至100％乙腈，含0.05％TFA)得到呈固体的(S)-4-((3-溴-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯 (400mg，0.532mmol，23.24％产率)。
LC-MS(ES,m/z)：[M+H]+＝601.2，603.1。
步骤6.将10％钯碳(40mg)添加到(S)-4-((3-溴-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸甲酯(400mg， 0.532mmol)在乙醇(15mL)中的搅拌溶液中。将反应器皿抽空并且用氢气吹扫六次。将反应混合物在氢气气氛下搅拌过夜，过滤并且蒸发至干。将残余物溶解在二噁烷(8mL) 中。添加NaOH(1.596mL，7.98mmol)。在80℃下搅拌2h并且然后冷却后，将反应混合物使用5N HCl中和。通过蒸发去除二噁烷。将水性残余物使用反相快速色谱法(50g C18柱，在水中的0至50％乙腈，含10mM TEAA)纯化，得到呈固体的(S)-4-((5-氨基-7-((1- 羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸(80mg，0.18mmol，33％产率)。
LC-MS(ES,m/z)：[M+H]+＝451.2。
步骤7.向20mL闪烁小瓶中装入(S)-4-((5-氨基-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(二氟甲氧基)苯甲酸(25mg，0.056mmol)、HATU(25.3mg，0.067mmol)、(3aR,6aS)-2-甲基八氢吡咯并[3,4-c]吡咯(10.51mg，0.083mmol)和 DMF(2mL)。添加DIPEA(0.024mL，0.139mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，过滤，并且用这些条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm 颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％ TFA)；梯度：在5％B下保持0-min，经20min 5％-45％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集；将含有产物的这些合并并且经由离心蒸发干燥，得到呈双三氟乙酸盐的化合物124(24.5mg，0.031mmol，55.2％产率)。
类似地制备化合物125。
实施例9-化合物119
Figure BDA0003813242340000371
步骤1.将DBU(0.856mL，5.68mmol)添加到4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(550mg，1.420mmol；NaOH 处理前参见实施例2的步骤6)和(S)-3-氨基己-1-醇盐酸盐2(327mg，2.130mmol)在DMSO (5mL)中的悬浮液中。将反应混合物在室温下搅拌10min，然后其变成澄清溶液。添加BOP(1256mg，2.84mmol)然后在70℃下搅拌2h。将反应混合物用5M NaOH(5mL， 25.00mmol)处理，在70℃下搅拌0.5h，冷却并且通过注射式过滤器盘过滤。将滤液在制备型反C18柱(150g)上，用乙腈:水(含0.05％TFA)0-50％梯度洗脱纯化。将所希望的级分冷冻并且冻干以得到(S)-4-((5-氨基-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(860.8mg，1.246mmol，88％产率)。
LCMS ESI：针对C20H27N6O4的计算值＝415.2(M+H+)，实测值415.2(M+H+)。
步骤2.将(S)-4-((5-氨基-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸(50mg，0.121mmol)、(1R,4R)-2-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷， 2-氢溴酸盐(66.1mg，0.241mmol)在DMF(1mL)中的混合物用Hunig碱(0.105mL， 0.603mmol)处理，然后用BOP(80mg，0.181mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌3h并且通过注射器玻璃料过滤。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在2％B下保持0分钟，经25min 2％-42％ B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以产生化合物119(6.8mg， 0.013mmol，11.08％产率)。
类似地制备化合物120。
实施例10-化合物106
Figure BDA0003813242340000372
Figure BDA0003813242340000381
步骤1.将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3- 甲氧基苯甲酸甲酯(300mg，0.774mmol；US 2020/0038403 A1)在DMSO(3.9mL)中的溶液用(5-甲基异噁唑-3-基)甲胺(174mg，1.55mmol)、BOP(411mg，0.929mmol) 和DBU(233μL，1.55mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌2h，用EtOAc稀释，并且用H2O(3x)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以得到3-甲氧基 -4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基) 甲基)苯甲酸甲酯(353mg，95％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.80(s,1H),7.99-7.93(m,1H),7.77(t,J＝5.9Hz,1H),7.49(d,J＝1.5Hz,1H),7.45(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),6.62(d,J＝7.9Hz,1H),6.10(d,J＝0.9Hz, 1H),5.80(s,2H),4.73(d,J＝5.9Hz,2H),3.84(s,3H),3.82(s,3H),3.64(s,3H),2.31(s,3H)。
LC RT：0.67min。LC/MS[M+H]+＝482.3(方法1)。
步骤2.将3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(190mg，0.395mmol)在THF(10mL) 中的溶液冷却至0℃，并且用LiAlH4(在THF中1M，691μL，0.691mmol)处理。将反应混合物在0℃下搅拌15min，用MeOH和罗谢尔盐(Rochelle's salt)(饱和水溶液)淬灭，并且在室温下搅拌1h。将混合物用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用H2O洗涤，经 Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以得到(1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(160mg，89％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.77-9.75(m,1H),7.90-7.88(m,1H),7.72(br t,J＝5.7 Hz,1H),6.94(s,1H),6.76(d,J＝7.5Hz,1H),6.61-6.57(m,1H),6.15(d,J＝0.8Hz,1H),5.68 (s,2H),5.16(t,J＝5.7Hz,1H),4.73(br d,J＝5.8Hz,2H),4.44(d,J＝5.6Hz,2H),3.70(s,3H), 3.62(s,3H),2.33(s,3H)。
LC RT：0.58min。LCMS[M+H]+＝454.3(方法1)。
步骤3.将(1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(159mg，0.350mmol)在DCM(3.5mL) 中的溶液用SOCl2(128μL，1.76mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌15min并且在真空中浓缩。将残余物重新溶解于DCM中并且在真空中浓缩，以得到(1-(4-(氯甲基)-2- 甲氧基苄基)-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(182mg，100％)。
LC RT：0.80min。LCMS[M+H]+＝472.3(方法1)。
步骤4.将(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H- 吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(25mg，0.053mmol)在DMF(1.1mL)中的溶液用(1S,4S)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(31.5mg，0.159mmol)处理。将反应混合物在70℃下搅拌2h并且在真空中浓缩。在室温下将残余物重新溶解于二噁烷(0.5mL)中，用NaOH(10M水溶液，26μL，0.26mmol)处理并且加热至70℃；在3h和6h 时将另外的NaOH(10M水溶液，100μL，1mmol)添加至反应混合物中。10h后，将反应混合物冷却至室温，用HOAc中和并且在真空中浓缩。将粗产物溶解于DMF中，通过 PTFE玻璃料过滤，并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM NH4OAc)；流动相B：95:5 乙腈:水(含10mM NH4OAc)；梯度：在20％B下保持0分钟，经23分钟20％-60％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到(1S,4S)-5-({4-[(5-氨基 -7-{[(5-甲基-1,2-噁唑-3-基)甲基]氨基}-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基]-3-甲氧基苯基} 甲基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(8.1mg，27％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.59(s,1H),7.27(br d,J＝2.5Hz,1H),6.96(s,1H),6.78 (br d,J＝7.4Hz,1H),6.50(d,J＝7.7Hz,1H),5.99(s,1H),5.75(s,2H),5.60(s,2H),4.64(br s, 2H),4.15(br d,J＝17.3Hz,1H),3.74(s,3H),3.40(br s,1H),3.35(br d,J＝9.6Hz,1H),3.07 (br dd,J＝19.1,9.5Hz,1H),2.77-2.71(m,1H),2.47-2.39(m,1H),2.33(s,3H),1.77(br d, J＝8.5Hz,1H),1.65-1.56(m,1H),1.38(br s,9H)
LC RT：1.12min。LCMS[M+H]+＝576.2(方法3)。
步骤5.将(1S,4S)-5-({4-[(5-氨基-7-{[(5-甲基-1,2-噁唑-3-基)甲基]氨基}-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基]-3-甲氧基苯基}甲基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯用DCM(1.0mL)和TFA(0.5mL，6mmol)处理，在50℃下搅拌30min并且浓缩。将粗产物溶解于DMF中，通过PTFE玻璃料过滤，并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM NH4OAc)；梯度：在5％B下保持0 分钟，经20分钟5％-45％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到化合物106(10.0mg，39％)。
类似地制备以下化合物：化合物126、化合物127和化合物128。
实施例11-化合物129
Figure BDA0003813242340000391
步骤1.将4-((5-((叔丁氧羰基)氨基)-7-羟基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3- 甲氧基苯甲酸甲酯(685mg，1.59mmol；US 2020/0038403 A1)在THF(16mL)中的溶液冷却至0℃并且用LiAlH4(在THF中1M，2.8mL，2.8mmol)处理。将反应混合物在0℃下搅拌15min，用H2O和罗谢尔盐(饱和水溶液)淬灭并且在室温下搅拌3h。将有机层吸收在CELITETM上并且经由柱色谱法(24g SiO2；0至20％MeOH-DCM梯度洗脱)纯化，以得到(7-羟基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(460mg，72％产率)。
1H(400MHz,DMSO-d6)δ11.69-11.43(m,1H),10.95-10.62(m,1H),7.87-7.79(m,1H),6.97(s,1H),6.77(d,J＝7.7Hz,1H),6.59(d,J＝7.8Hz,1H),5.66(s,2H),5.16(t,J＝5.8 Hz,1H),4.45(d,J＝5.8Hz,2H),3.79(s,3H),1.49(s,9H)。LC RT:0.77min。
LCMS[M+H]+＝402.2(方法1)。
步骤2.将(7-羟基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(460mg，1.15mmol)在DMSO(5.7mL)中的溶液用(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲胺·HCl(223mg，1.49mmol)、BOP(760mg，1.72mmol)和DBU(0.69mL， 4.6mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌2h，用EtOAc稀释，并且用H2O(2x)洗涤。将有机层吸收在CELITETM上并且经由柱色谱法(100g C18 gold柱；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；流速：60mL/min， 30％-50％梯度)纯化。将纯化的产物溶解于DCM中并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩，以得到(1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(190mg，33％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.24-9.15(m,1H),7.87(s,1H),7.72(t,J＝5.8Hz,1H),6.95(s,1H),6.82-6.75(m,1H),6.73-6.68(m,1H),5.68(s,2H),5.17(t,J＝5.7Hz,1H),4.87 (d,J＝5.7Hz,2H),4.44(d,J＝5.7Hz,2H),3.76(s,3H),2.55(s,3H),1.43(s,9H)。
LC RT：0.75min。LC/MS[M+H]+＝497.2(方法1)
步骤3.将(1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基) 氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(161mg，0.320mmol)在DCM(0.65 mL)中的溶液用SOCl2(71μL，0.97mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌15min 并且在真空中浓缩。将残余物重新溶解于DCM中并且在真空中浓缩以得到(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基) 氨基甲酸叔丁酯(166mg，100％)。
LC RT：0.89min。LCMS[M+H]+＝515.2(方法1)。
步骤4.将(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸叔丁酯(33mg，0.064mmol)在DMF(1.3mL)中的溶液用(1S,4S)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(38.3mg，0.193mmol)处理。将反应混合物在70℃下搅拌2h并且在真空中浓缩。将残余物溶解于二噁烷(1.3mL) 中并且用HCl(在二噁烷中4M，0.40mL，1.6mmol)处理，在40℃下搅拌30min，并且浓缩。将粗产物溶解于DMF中，通过PTFE玻璃料过滤，并且用以下条件经由制备型LC/MS 纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含 10mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM NH4OAc)；梯度：在0％B 下保持0分钟，经23分钟0-48％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温： 25℃。由MS信号触发级分的收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到化合物129(16.2mg，53％产率)。
类似地制备化合物130。
实施例12-化合物128
Figure BDA0003813242340000411
步骤1：在室温下将肼甲酸叔丁酯(12.75g，96mmol)和DIPEA在DMF(24mL) 中的溶液通过经由另外的漏斗经1小时逐滴添加在24mL DMF中的4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(5g，19.30mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加EtOAc(135 mL)和H2O(75mL)，并且将双相混合物搅拌30分钟。将反应混合物倒入分液漏斗中并且将水相去除。将有机层用2个另外部分的H2O(75mL)、2部分的10％LiCl溶液(75 mL)洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。柱色谱法(Isco，220g SiO2，0％CH2Cl2(5min) 然后15％EtOAc-CH2Cl2)提供呈澄清油状物的2-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)肼-1-甲酸叔丁酯(3.85g)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.64(dd,J＝7.7,1.5Hz,1H),7.56(d,J＝1.5Hz,1H),7.37(d, J＝7.7Hz,1H),6.08-5.87(m,1H),4.07(s,2H),3.94(d,J＝4.6Hz,6H),1.50-1.40(m,9H)。
LC/MS[M+H]+311.2；LC RT＝0.80min(方法1)。
步骤2：在室温下将2-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)肼-1-甲酸叔丁酯(25.4g，82mmol)溶解于MeOH(164mL)中。添加4N HCl-二噁烷(123ml，59.5mmol)，并且将反应在室温下搅拌过夜。将白色沉淀物通过过滤收集并且干燥，以得到4-(肼基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯，2·HCl(20g)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.12(br s),7.62-7.55(m,1H),7.53-7.47(m,2H),4.10 (s,2H),3.88(s,3H),3.87(s,3H)
LC/MS[M+H]+211.1；LC RT＝0.51min(方法1)。
步骤3：将(E)-N,N-二甲基-2-硝基乙烯-1-胺(46.4g，400mmol)和吡啶(420ml，5195mmol)在CH2Cl2(799ml)中的溶液冷却至-10℃，并且用2-氯-2-氧代乙酸乙酯(51.4 ml，460mmol)缓慢处理。允许将反应混合物经2h加温至25℃并且搅拌过夜。通过旋转蒸发去除CH2Cl2，并且将4-(肼基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯二盐酸盐(31.7g，112mmol) 一次性添加至反应混合物中。将溶液在室温下搅拌2h，并且将溶剂在真空下去除。将残余物用水、1NHCl水溶液洗涤，并且用EtOAc(3x)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，并且浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2中，通过短硅胶柱并且从乙醇中重结晶以得到1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-4-硝基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(29.4g)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.06(s,1H),7.64(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.56(d,J＝1.5Hz, 1H),7.13(d,J＝7.8Hz,1H),5.53(s,2H),4.45(q,J＝7.2Hz,2H),3.94(s,3H),3.88(s,3H), 1.37(t,J＝7.2Hz,3H)。
LC/MS[M+Na]+386.0；LC RT＝0.98min(方法1)。
步骤4：将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(3.04 g，9.12mmol，86％产率)和Pd-C(1.131g，0.531mmol)悬浮于EtOAc/MeOH(1:1)(152mL)中。将反应烧瓶在真空下抽空并且用H2(3X)吹扫，然后在H2的气囊压力(g) 下搅拌。5h后，将反应混合物通过CELITETM过滤，并且添加新鲜Pd-C(1.131g，0.531 mmol)。将反应烧瓶在真空下抽空并且用H2(3X)吹扫，然后在H2的气囊压力下搅拌16 h。将反应混合物通过CELITETM过滤，浓缩并且在真空下干燥，以得到呈奶油色粉末的 4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(3.04g)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.52-7.49(m,1H),7.47(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.19(s, 1H),6.40(d,J＝7.8Hz,1H),5.54(s,2H),5.10(s,1H),4.15(q,J＝7.1Hz,2H),3.91(s,3H), 3.84(s,3H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H)。
LC/MS[M+H]+334.1；LC/RT＝0.85min(方法2)。
步骤5：将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(1.65 g，4.95mmol)溶解于CHCl3(49.5ml)中并且冷却至0℃。将NBS(0.925g，5.20mmol) 一次性添加至混合物中。15分钟后，将反应用CHCl3稀释并且与10％硫代硫酸钠水溶液一起剧烈搅拌10分钟。将有机相分离，用H2O洗涤，经MgSO4干燥并且浓缩。将粗产物通过柱色谱法(80g SiO2，0至50％EtOAc-己烷梯度洗脱)纯化以得到呈白色固体的4-氨基 -3-溴-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(1.32g)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.61-7.41(m,2H),6.55(d,J＝8.3Hz,1H),5.56(s,2H), 5.02(s,2H),4.20(q,J＝7.1Hz,2H),3.90(s,3H),3.85(s,3H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H)。
LC/MS[M+H]+412.2；LC RT＝1.02min(方法1)。
步骤6：将4-氨基-3-溴-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯 (741.2mg，67.1％产率)、K2CO3(1.098g，7.94mmol)和2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三硼杂六环(在THF中3.5M)(1.816ml，6.36mmol)悬浮于二噁烷(26.5ml):水 (5.30ml)(5:1)中。将N2流鼓泡通过反应混合物持续5min，然后添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(0.052g，0.064mmol)并且继续另外的4min，然后将反应器皿密封并且加热至 90℃。3h后，添加另外部分的2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三硼杂六环(在THF中3.5M)(0.908ml，3.18mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(0.052g，0.064mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌16h，冷却，用100mL的EtOAc稀释，并且通过CELITETM过滤，用另外的EtOAc洗涤。将粗产物浓缩到4g CELITETM上。柱色谱法(80g SiO2，0至30％ EtOAc-CH2Cl2梯度洗脱)得到呈奶油色固体的预期产物，4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(741mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.49(d,J＝1.5Hz,1H),7.46(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),6.40 (d,J＝7.8Hz,1H),5.48(s,2H),4.94-4.86(m,2H),4.14(q,J＝7.0Hz,2H),3.90(s,3H),3.84 (s,3H),2.10(s,3H),1.15-1.08(m,3H)。
LC/MS[M+H]+348.2；LC/RT＝0.89min(方法1)。
步骤7：将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯 (742mg，2.136mmol)悬浮于MeOH(10.800mL)中，并且在剧烈搅拌的情况下平缓地加热以使材料溶解。添加1,3-双-(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代异脲(661mg，3.20mmol)，然后添加AcOH(0.611mL，10.68mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。添加另外部分的AcOH(0.049mL，0.854mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌另外的72h，然后添加NaOMe(在MeOH中25％wt)(5.69mL，25.6mmol)。搅拌3h后，将反应混合物用AcOH重新酸化。将产物通过过滤收集，风干10分钟并且在化学干燥烘箱中彻底干燥，以得到呈奶油色固体的4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶 -1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(中间体A)(722.0mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.58-11.17(m,2H),7.51(d,J＝1.4Hz,1H),7.49-7.42 (m,1H),6.67(d,J＝7.9Hz,1H),5.67(s,2H),3.90(s,3H),3.84(s,3H),3.71(s,3H),2.31(s, 3H)。
LC/MS[M+H]+402.3；LC RT＝0.86min(方法1)。
步骤8.将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基) 甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(中间体A，200mg，0.498mmol)和BOP(331mg，0.747mmol)在DMF(2491μL)中的悬浮液在RR下用(5-甲基异噁唑-3-基)甲胺(72.6mg，0.648mmol) 和DBU(3当量)(225μl，1.495mmol)处理。将反应混合物加热至40℃。15分钟后，添加另外部分的DBU(2当量)(150μL，0.997mmol)。将反应在40℃下搅拌16h，冷却并且在EtOAc与半饱和NaHCO3水溶液之间分配。将有机相分离并且将水相用EtOAc(2x) 萃取。将合并的有机层用10％LiCl水溶液和盐水顺序洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。柱色谱法(12g SiO2，0至10％CH3OH-CH2Cl2梯度洗脱)得到3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基) 氨基)-3-甲基-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(201.1mg)。
LC/MS[M+H]+496.2；LC RT＝0.79min(方法1)。
步骤9.在室温下将3-甲氧基-4-((5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(200mg，0.404mmol) 悬浮于THF中，并且进行声处理以帮助溶解。经10min逐滴添加LiAlH4(在THF中1M) (807μl，0.807mmol)。20min后，将反应用MeOH淬灭并且在EtOAc与罗谢尔盐之间分配。将双相混合物在室温下搅拌2h。将水层分离并且用EtOAc(1X)重新萃取。将合并的有机层用盐水洗涤并且浓缩。柱色谱法(12g SiO2，0至10％CH3OH-CH2Cl2梯度洗脱)得到(1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H- 吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(73mg)。
LC/MS[M+H]+468.4；LC RT＝0.62min(方法1)。
步骤10.在室温下将(1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-7-(((5-甲基异噁唑 -3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(73mg，0.156mmol)溶解于 CH2Cl2(1562μL)中。添加SOCl2(57.0μl，0.781mmol)并且将反应混合物搅拌20min。浓缩得到足够纯度的(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基) 氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(80mg)，以不经进一步纯化使用。
LC/MS[M+H]+486.1；LC RT＝0.83min(方法1)。
步骤11.在2打兰小瓶中将(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-7-(((5-甲基异噁唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(20mg，0.041mmol)在乙腈(412μL)中的储备溶液添加到(1R,4R)-2-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷，2氢溴酸盐(33.8mg，0.123mmol)。添加DIPEA(21.57μl，0.123mmol)。将反应混合物加热至 70℃，冷却并且浓缩。将残余物重新溶解于二噁烷(400μL)中并且用10M NaOH溶液 (82μL，0.823mmol)处理。将反应混合物加热至80℃保持5h，冷却，用AcOH(42μL) 中和并且浓缩。将粗产物溶解于DMF-H2O中，通过PTFE玻璃料过滤并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95 乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在3％B 下保持0分钟，经20分钟3％-43％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到化合物128(8.6mg)。
经必要的修改后，上述方案中的中间体A也可用于制造根据本公开文本的其他化合物。
实施例13-化合物131
Figure BDA0003813242340000441
步骤1.在50-mL双颈烧瓶中在惰性气氛下在0℃下向氢化钠(5.92g，148mmol) 在乙醚(25mL)和DMF(25mL)中的悬浮液中添加甲醇(6.49mL，160mmol)。20min 后，逐滴添加2,4-二氯-5-甲基吡啶(可商购，20g，123mmol)在乙醚(25mL)中的溶液，并且然后允许将混合物加温至室温。12h后，将碎冰添加到反应混合物中，然后将其通过DCM(2x250mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并且蒸发以得到粗产物，将其通过使用80g硅胶柱和在石油醚中的5％-30％乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱法纯化，以得到2-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶(18g，93％)。
LC-MS m/z 158[M+H]+。
步骤2.将2-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶(19g，121mmol)在MeOH(350mL) 中的溶液添加到反应器中，然后添加DMF(350mL)。将混合物用氮气气体吹扫，然后添加Pd(dppf)Cl2-DCM(19.69g，24.11mmol)和三乙胺(50.3mL，362mmol)。用氮气气体吹扫后，将反应混合物在100℃下在10巴一氧化碳压力下搅拌18h。将反应混合物从反应器中收集并且蒸发以得到粗产物，将其通过使用80g硅胶柱和在石油醚中的5％-30％乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱法纯化，以得到4-甲氧基-5-甲基吡啶甲酸甲酯(18.4g， 84％)。
LC-MS m/z 182[M+H]+。
步骤3.向4-甲氧基-5-甲基吡啶甲酸甲酯(5.8g，32.0mmol)在CCl4(50mL) 中的混合物中添加NBS(5.70g，32.0mmol)和AIBN(1.051g，6.40mmol)，并且将反应混合物惰性气氛下在60℃下加热12h。添加另外的NBS(0.5当量)和AIBN(0.1当量)，并且将反应搅拌18h。将饱和碳酸氢钠水溶液添加到反应混合物中，然后将其通过DCM (2x150mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并且蒸发以得到粗产物，将其通过使用80g硅胶柱和在石油醚中的20％-50％乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱法纯化，以得到 5-(溴甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(5.5g，66％)。
LC-MS m/z 260/262[M+H]+。
步骤4.将(7-羟基-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(6g，17.91mmol)在DMF(10mL)中的混合物冷却至0℃，并且添加5-(溴甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(4.66g，17.91mmol)，然后添加Cs2CO3(11.67g，35.8mmol)。将反应混合物在相同温度下搅拌1h。将反应混合物在室温下搅拌2h。将碎冰添加到反应混合物中以得到浅黄色沉淀物，将其通过烧结漏斗滤出并且用在石油醚中的30％乙酸乙酯洗涤。将固体在真空下干燥以得到粗产物，将其通过使用80g硅胶柱和在DCM中的2％-10％甲醇作为洗脱剂的柱色谱法纯化，以得到5-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-1-基)甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(4g，43％)。
LC-MS m/z 515[M+H]+。
步骤5.向5-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(500mg，0.972mmol)在DMSO(5mL)中的搅拌溶液中相继添加(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺(415mg，1.167mmol)(US 2020/0038403A1，图8，化合物71a)、BOP(645mg，1.458mmol)和DBU(0.440mL， 2.92mmol)，并且将反应混合物在45℃下搅拌4h。将碎冰添加到反应混合物中，然后将其通过DCM(2x150mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并且蒸发以得到粗产物，将其通过使用80g硅胶柱和在石油醚中的15％-40％乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱法纯化，以得到(S)-5-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(400mg，48％)。
LC-MS m/z 852[M+H]+。
步骤6.脱气后，向(S)-5-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3- 碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(1.5g， 1.761mmol)在MeOH(10mL)和THF(10mL)中的混合物中添加干钯碳(0.937g，0.880mmol)。将反应混合物在氢气气氛下在25℃下搅拌12h并且通过CELITETM床过滤。将滤液蒸发以得到粗产物，(S)-5-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(1.1g，86％)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC-MS m/z 726[M+H]+。
步骤7.在冰冷的温度下向(S)-5-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基) 氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯 (270mg，0.372mmol)在THF(8mL)和MeOH(2mL)中的搅拌溶液中添加LiBH4(0.930mL，2M溶液，1.860mmol)。将反应混合物在氩气气氛下加热至45℃保持12h。添加另外的LiBH4(2.5当量)并且将反应搅拌5h。将反应冷却至室温然后添加碎冰以得到白色沉淀物。将澄清溶液使用棉花塞滤出然后蒸发至干，以得到(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((6-(羟基甲基)-4-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(220mg，85％)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC-MS m/z 698[M+H]+。
步骤8.向(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((6-(羟基甲基)-4-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(230mg，0.330 mmol)在THF(5mL)中的搅拌溶液中添加SOCl2(0.072mL，0.989mmol)，并且将反应混合物在0℃下搅拌1.5h。将溶剂蒸发以得到粗产物，(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((6-(氯甲基)-4-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5- 基)氨基甲酸甲酯(220mg，93％)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC-MS m/z 716[M+H]+。
步骤9.在惰性气氛下向(1S,4S)-2-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷，HCl(24.90 mg，0.168mmol)和K2CO3(57.9mg，0.419mmol)在DMF(2mL)中的0℃溶液中添加(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((6-(氯甲基)-4-甲氧基吡啶-3- 基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(100mg，0.140mmol)在DMF(2mL)中的溶液。将反应混合物在25℃下搅拌12h。将反应混合物通过CELITETM过滤并且将滤液蒸发以得到粗产物，(7-(((S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((4-甲氧基-6-(((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(100mg，0.126mmol，90％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC-MS m/z 792[M+H]+。
步骤10.向(7-(((S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((4-甲氧基-6-(((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(100mg，0.126mmol)在MeOH(5mL)中的溶液中添加HCl(0.033mL，35wt％，0.379mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌1h。将溶剂蒸发以得到粗产物，(7-(((S)-1-羟基己-3-基)氨基)-1-((4-甲氧基-6-(((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(60mg， 86％)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC-MS m/z 554[M+H]+。
步骤11.向(7-(((S)-1-羟基己-3-基)氨基)-1-((4-甲氧基-6-(((1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯 (60mg，0.108mmol)在1,4-二噁烷(1mL)和H2O(1mL)的混合物中的溶液中添加 NaOH(4.33mg，0.108mmol)，并且将混合物在75℃下加热12h。将反应混合物冷却至室温并且分离各层。经有机层蒸发并且将粗材料溶解于甲醇中并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：Waters XBridge C18，19x150mm，5-μm颗粒；流动相A：10-mM NH4OAc；流动相B：甲醇；梯度：经20分钟10％-35％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：Xbridge phenyl，250mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相 A：5:95甲醇:水(在水中含10mM碳酸氢铵PH-9.5)；流动相B：95:5甲醇:水(在水中含10mM碳酸氢铵PH-9.5)；梯度：在50％B下保持2分钟，经15分钟50％-70％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：19mL/min；柱温：通过定制的水浴维持的C。由MS 和UV信号触发级分的收集。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥以提供化合物131(1mg)。
类似地制备以下化合物：化合物132、化合物133和化合物134。
实施例14-化合物140
Figure BDA0003813242340000471
步骤1.在氮气气氛下向(1R,4R)-2,5-二氮杂-二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(500 mg，2.52mmol；可商购)在干乙腈(10mL)中的溶液中添加K2CO3(3485mg，25.2mmol) 和2-溴乙-1-醇(630mg，5.04mmol)。将反应混合物在80℃下加热12h并且在NH4Cl溶液与EtOAc之间分配。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并且浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法(60-120硅胶；在CHCl3中的1％-10％MeOH)纯化以得到呈浅黄色油状物的(1R,4R)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(600mg， 98％)。
LC-MS m/z 243[M+H]+。
步骤2.在氮气气氛下在0℃下向在1,4-二噁烷(1mL)中的(1R,4R)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(700mg，2.89mmol)中添加在二噁烷中的4N HCl(7.22mL，28.9mmol)。在0℃下搅拌3h后，将反应混合物在30℃下在真空中浓缩。将残余物与醚一起搅拌。小心倾析溶剂。将所得固体在真空下干燥。将固体溶解于乙腈和水的混合物中，并且然后将其冷冻并且冻干以得到呈白色固体的2-((1R,4R)-2,5- 二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)乙-1-醇，HCl(500mg，97％)。
LC-MS m/z 143[M+H]+。
步骤3.向2-((1R,4R)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)乙-1-醇(55.6mg，0.391mmol)和K2CO3(81mg，0.584mmol)在DMF(2mL)中的搅拌混合物中添加(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((6-(氯甲基)-4-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(140mg，0.195mmol)在DMF(2mL)中的溶液。将反应混合物在60℃下搅拌12h，冷却至室温，并且通过CELITETM床过滤。将滤液蒸发以得到粗(7-(((S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((6-(((1R,4R)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)-4-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(100mg，62％)，将其不经进一步纯化使用。
步骤4.向(7-(((S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((6-(((1R,4R)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)-4-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(140mg，0.170mmol)在MeOH(5mL)中的混合物中添加HCl(0.026mL，0.851mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1.5h。将溶剂蒸发以得到粗(1-((6-(((1R,4R)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)-4- 甲氧基吡啶-3-基)甲基)-7-(((S)-1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(60mg，60％)，将其不经进一步纯化使用。
步骤5.向(1-((6-(((1R,4R)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)-4-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-7-(((S)-1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(65mg，0.111mmol)在1,4-二噁烷(1mL)中的搅拌溶液中添加NaOH(13.36 mg，0.334mmol)在H2O(1mL)中的溶液。将反应混合物在80℃下搅拌6h。分离各层并且将有机层蒸发，溶解于甲醇中并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：gemimi nx；流动相A：10-mM NH4OAc；流动相B：乙腈；梯度：10％-70％B；流速：20mL/min。将含有所希望产物的级分浓缩以提供化合物140(2.3mg)。
实施例15-化合物135
Figure BDA0003813242340000481
Figure BDA0003813242340000491
步骤1.在氮气吹扫下向5-溴-6-甲基烟酸(10.0g，46.3mmol)在1,4-二噁烷(100.0mL)和MeOH(18.73mL，463mmol)中的搅拌溶液中添加Cs2CO3(30.2g，93 mmol)、Pd2(dba)3(4.24g，4.63mmol)和tBuXPhos(3.93g，9.26mmol)。将反应混合物在70℃下搅拌16h。将反应混合物通过CELITETM床过滤并且用EtOAc洗涤，并且将滤液在减压下浓缩。将粗化合物用DCM处理并且然后过滤。将固体用石油醚洗涤并且然后在真空下干燥以得到呈浅棕色固体的5-甲氧基-6-甲基烟酸(7.6g，98％)。
LC-MS m/z 168[M+H]+。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.42-8.32(m,1H),7.64-7.55(m,1H),3.79(s,3H),2.32(s,3H)。
步骤2.向5-甲氧基-6-甲基烟酸(8.0g，47.9mmol)在乙醇(80.0mL)中的搅拌溶液中添加H2SO4(7.65mL，144mmol)。将反应混合物在90℃下搅拌20h并且在减压下浓缩以得到残余物，将其用饱和碳酸氢钠溶液淬灭并且然后在DCM与水之间分配。将有机层用盐水溶液洗涤并且经Na2SO4干燥，过滤，并且在减压下浓缩以得到呈棕色油状物的5-甲氧基-6-甲基烟酸乙酯(8.1g，80％)。
LC-MS m/z 196[M+H]+
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.56(d,J＝1.5Hz,1H),7.66(d,J＝1.9Hz,1H),4.35(q,J＝7.2Hz,2H),3.90(s,3H),2.43(s,3H),1.34(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤3.将5-甲氧基-6-甲基烟酸乙酯(7.1g，36.4mmol)、AIBN(1.194g，7.27 mmol)和NBS(7.12g，40.0mmol)在无水CCl4(140mL)中的搅拌悬浮液加热至65℃持续16h。将反应混合物浓缩并且将残余物通过快速色谱法(硅胶60-120目；在石油醚中的15％乙酸乙酯作为洗脱剂)纯化，以得到呈灰白色固体的6-(溴甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯 (5.7g，57％)。
LC-MS m/z 276[M+H]+。
步骤4.向(7-羟基-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(3.4g，10.15 mmol)在无水DMF(50mL)中的0℃搅拌溶液中添加Cs2CO3(6.61g，20.29mmol)和 6-(溴甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(2.92g，10.65mmol)。在0℃下搅拌1h后，将反应混合物逐滴添加到冰冷的水中。将所得悬浮液搅拌5min，过滤。将收集的固体在高真空下干燥。将此材料通过快速色谱法(硅胶60-120目；在氯仿中的5％甲醇作为洗脱剂)纯化以得到呈浅黄色固体的6-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(4.3g，64％)。
LC-MS m/z 529[M+H]+。
步骤5.在室温下向6-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(700mg，1.325mmol)在无水DMSO(8mL)中的搅拌溶液中添加DBU(0.599mL，3.98mmol)、BOP(1758mg，3.98mmol)，并且最终添加(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺(471mg，1.325mmol)。将反应混合物加热至45℃，搅拌1h，并且在水与乙酸乙酯之间分配。将有机层用H2O和饱和NaCl溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将残余物通过快速色谱法(硅胶60-120 目；在石油醚中的55％乙酸乙酯作为洗脱剂)纯化以得到呈浅黄色半固体的 (S)-6-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H- 吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(850mg，52％)。
LC-MS m/z 866[M+H]+。
步骤6.在室温下向(S)-6-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(830 mg，0.959mmol)在无水甲醇(25mL)中的搅拌溶液中添加Pd/C(510mg，0.479mmol)。在室温下将反应在氢气囊袋下搅拌16h。将悬浮液通过CELITETM床过滤并且将床用乙酸乙酯洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到呈浅黄色半固体的(S)-6-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(800mg，90％)。
LC-MS m/z 740[M+H]+。
步骤7.向(S)-6-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(800mg，1.081mmol) 在THF(20mL)和甲醇(3.0mL)中的0℃搅拌溶液中逐滴添加LiBH4(2.70mL，2M溶液，5.41mmol)。将冰浴去除并且将反应混合物加热至40℃并且搅拌16h。将反应混合物放到室温，并且添加另外的LiBH4(2mL)。将反应混合物加热至45℃，搅拌3h，并且冷却至0℃。逐滴添加冰冷的水和乙酸乙酯。将有机层用H2O和饱和NaCl溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩，以得到呈棕色固体的(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(羟基甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-1H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(750mg，99％)。
LC-MS m/z 698[M+H]+。
步骤8.向(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(羟基甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(90mg，0.129 mmol)在无水THF(4mL)中的0℃搅拌溶液中添加SOCl2(0.047mL，0.645mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30min并且在高真空下浓缩至干以得到呈黄色固体的 (S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(氯甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基) 甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(95mg，93％)。无需进一步纯化使用此物质。
LC-MS m/z 716[M+H]+。
步骤9.向(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(氯甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(90mg，0.126 mmol)在无水DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加K2CO3(52.1mg，0.377mmol)和 2-((1S,4S)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)乙-1-醇(35.7mg，0.251mmol)。将反应混合物加热至75℃，搅拌16h，并且在高真空下浓缩至干以得到粗(7-(((S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(((1S,4S)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(120mg)，将其不经进一步纯化使用。
LC-MS m/z 822[M+H]+。
步骤10.在室温下向(7-(((S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(((1S,4S)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基) 甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(110mg，0.134mmol)在无水MeOH(2 mL)中的搅拌溶液中添加HCl(0.5mL，16.46mmol)。将反应混合物搅拌2h并且在高真空下浓缩至干以得到粗(1-((5-(((1S,4S)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-(((S)-1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(90mg)，将其不经进一步纯化使用。
LC-MS m/z 584[M+H]+。
步骤11.向(1-((5-(((1S,4S)-5-(2-羟基乙基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-(((S)-1-羟基己-3-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(90mg，0.154mmol)在二噁烷(2mL)和水(1mL)的混合物中的搅拌溶液中添加NaOH(61.7mg，1.542mmol)。将反应混合物加热至75℃并且搅拌3h。将二噁烷层从反应混合物中分离并且浓缩至干以得到粗产物，将其用以下条件经由制备型 LC/MS纯化：柱：Waters XBridge C18，19x 150mm，5-μm颗粒；流动相A：10-mM NH4OAc；流动相B：乙腈；梯度：经20分钟7％-22％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥以提供化合物135(12.3mg)。
类似地制备化合物138。
实施例16-化合物141
Figure BDA0003813242340000511
步骤1.向(7-羟基-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(5.00g，14.92 mmol)在DMF(50mL)中的搅拌溶液中添加Cs2CO3(9.72g，29.8mmol)和4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(3.87g，14.92mmol；可商购)。将反应混合物在0℃下搅拌1h并且在水与乙酸乙酯之间分配。将有机层用盐水溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在真空下浓缩以得到粗产物，将其使用快速色谱法(硅胶60-120目；在氯仿中的10％乙酸乙酯作为洗脱剂)纯化。将级分在50℃下使用高真空浓缩以得到呈灰白色固体的4-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(3.3g，41％)。
LC-MS m/z 514[M+H]+。
步骤2.在室温下在氮气气氛下向4-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(5g，9.74mmol)在干DMSO(10mL) 中的搅拌溶液中添加在DMSO中的DBU(4.41mL，29.2mmol)、BOP(6.46g，14.61mmol) 和(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺(3.46g，9.74mmol)。将反应混合物在45℃下搅拌2h并且在乙酸乙酯与冰冷的水之间分配。将有机层用水和盐水洗涤，经无水 Na2SO4干燥并且在45℃下在真空中浓缩。将粗产物通过快速色谱法(60-120硅胶；在石油醚中的20％-60％乙酸乙酯作为洗脱剂)纯化以得到呈浅黄色油状物的(S)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(4.5g，54％)。
LC-MS m/z 851[M+H]+。
步骤3.将(S)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(0.5g， 0.588mmol)在干1,4-二噁烷(5mL)中的溶液用氩气吹扫3min，然后在氮气气氛下添加三甲基环三硼氧烷(TMB，0.246mL，1.763mmol)、K2CO3(0.162g，1.175mmol) 和PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(0.038g，0.047mmol)。将反应混合物在100℃下加热12h 并且在碳酸氢钠溶液与DCM之间分配。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并且浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法(60-120硅胶；在石油醚中的10％-50％乙酸乙酯)纯化以得到呈浅黄色油状物的(S)-4-((5-氨基-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己 -3-基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(0.2g，50％)。
LC-MS m/z 681[M+H]+。
步骤4.在氮气气氛下向(S)-4-((5-氨基-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己 -3-基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(0.2g，0.294 mmol)在干四氢呋喃(3mL)和MeOH(1mL)中的溶液中添加LiBH4(0.734mL，2M溶液，1.469mmol)。将反应混合物在45℃下加热12h并且在氯化铵溶液与EtOAc之间分配。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并且浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法(60-120硅胶；在石油醚中的5％-55％乙酸乙酯作为洗脱剂)纯化以得到呈浅黄色固体的(S)-(4-((5-氨基-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(0.3g)。
LC-MS m/z 653[M+H]+。
步骤5.向(S)-(4-((5-氨基-7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3- 甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(50mg，0.077mmol)在THF (0.5mL)中的在0℃下在N2气氛下的搅拌溶液中添加SOCl2(0.011mL，0.153mmol)。在N2气氛下将反应混合物在0℃下搅拌1h并且在真空中浓缩以得到呈浅黄色油状物的粗(S)-N7-(1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基 -1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺，将其不经进一步纯化使用。
LC-MS m/z 671[M+H]+。
步骤6.向(S)-N7-(1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(100mg，0.149mmol)在DMF(1mL)中的搅拌溶液中添加2-((1R,4R)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)乙-1-醇，HCl(53.2mg，0.298mmol)和K2CO3(61.8mg，0.447mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌12h并且过滤以去除固体。将滤液在真空中浓缩以得到呈灰白色固体的粗2-((1R,4R)-5-(4-((5-氨基-7-(((S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1- 基)甲基)-3-甲氧基苄基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)乙-1-醇，将其不经进一步纯化使用。
LC-MS m/z 777[M+H]+。
步骤7.向2-((1R,4R)-5-(4-((5-氨基-7-(((S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己 -3-基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苄基)-2,5-二氮杂二环[2.2.1] 庚-2-基)乙-1-醇(100mg，0.129mmol)在MeOH(3mL)中的搅拌溶液中添加HCl(0.3 mL，9.87mmol)。在N2气氛下将反应混合物在0℃至室温下搅拌2h并且在真空中浓缩。将残余物溶解于在水中的MeOH中。将溶液用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：WatersXBridge C18，150mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；梯度：在5％B下保持0 分钟，经20分钟5％-25％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥以提供化合物141(10.6mg)。
实施例17-化合物137
Figure BDA0003813242340000531
步骤1.将(7-羟基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基) 氨基甲酸甲酯(304mg，0.846mmol)悬浮于CH2Cl2(4230μL)中。添加SOCl2(309μl，4.23mmol)并且将反应在室温下搅拌3h，并且浓缩以得到(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-7- 羟基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(311mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.38-10.97(m,1H),7.88(s,1H),7.11(d,J＝1.3Hz,1H),6.92(dd,J＝7.7,1.3Hz,1H),6.63(d,J＝7.7Hz,1H),5.69(s,2H),4.72(s,2H),3.83(s, 3H),3.76(s,3H)。LC RT：0.80min。LC/MS[M+H]+＝378.1(方法1)。
步骤2.将(1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-7-羟基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(50mg，0.132mmol)和(1R,4R)-2-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷，2氢溴酸盐(39.9mg，0.146mmol)悬浮于乙腈(660μL)中，并且用DIPEA(46.2μl，0.265mmol) 处理。将反应混合物加热至70℃持续16h，冷却并且在N2流下浓缩。将粗材料溶解于 MeOH-DMSO中并且使用以下条件经由制备型色谱法纯化：柱：Phen Axia Luna C18， 21.2mm x100mm，5-μm颗粒；流动相A：90％H2O/10％MeOH/0.1％TFA；流动相B： 10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA；梯度：经10分钟0-100％B，然后在100％B下保持2分钟；流速：25mL/min；柱温：25℃。UV检测：220nm。将含有预期产物的级分浓缩，并且然后从乙腈(2X)中共沸以得到(7-羟基-1-(2-甲氧基-4-(((1R,4R)-5-甲基-2,5-二氮杂二环 [2.2.1]庚-2-基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯，2TFA(22.3mg)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.77(s,1H),7.21(br s,1H),7.01(br d,J＝7.8Hz,1H), 6.84(d,J＝7.7Hz,1H),5.81(s,2H),4.49-4.42(m,1H),4.42-4.33(m,2H),4.32-4.22(m, 1H),4.03-3.93(m,1H),3.91(s,3H),3.87(s,3H),3.55-3.40(m,2H),3.01(s,3H),2.66- 2.56(m,1H),2.45(br d,J＝3.6Hz,1H)。
LC RT：0.58min。LC/MS[M+H]+＝454.2(方法1)。
步骤3.在室温下将(7-羟基-1-(2-甲氧基-4-(((1R,4R)-5-甲基-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(19.5mg，0.043mmol)、(S)-2-氨基-3-环丙基丙-1-醇，HCl(13.04mg，0.086mmol)和BOP，98％，25g(33.6mg，0.064mmol)悬浮于二噁烷(430μl)中。将反应混合物用DBU(25.9μl，0.172 mmol)处理并且在室温下搅拌72h。添加另外部分的7mg的(S)-2-氨基-3-环丙基丙-1-醇， HCl(13.04mg，0.086mmol)和13μL的DBU，并且将反应加热至40℃保持约4h。添加 10M NaOH水溶液(43.0μl，0.430mmol)。将温度升至60℃并且将反应混合物搅拌过夜。将含有粗产物的混合物浓缩，用DMF/1N HCl溶液(430μL)稀释。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A： 5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在 0％B下保持0分钟，经25分钟0-40％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥以提供呈游离碱的化合物137(1.7mg)。
实施例18-化合物139
Figure BDA0003813242340000541
将化合物812(US 2020/0038403；18mg，0.040mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液用K2CO3(16.56mg，0.120mmol)和2-溴乙-1-醇(5.66μl，0.080mmol)处理。将反应混合物在50℃下加热2h。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相 B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在7％B下保持0分钟，经20分钟7％-47％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge Phenyl，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A： 5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；梯度：在0％B下保持0分钟，经20分钟0-40％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥以提供4.3mg的化合物139。
实施例19-化合物142
Figure BDA0003813242340000542
Figure BDA0003813242340000551
步骤1.向(7-羟基-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(5.0g，14.92 mmol)在DMF(50.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加Cs2CO3(9.72g，29.8mmol)和4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(3.87g，14.92mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1h并且添加水。将沉淀的固体过滤，用过量水洗涤，然后用石油醚洗涤并且在真空下干燥。将粗化合物通过用在氯仿中的0-100％乙酸乙酯洗脱的ISCO combiflash色谱法纯化以得到呈灰白色固体的4-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(3.88g，6.20mmol，41.5％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:11.69(br s,1H),11.38(s,1H),7.56-7.45(m,2H),6.87-6.78(m,1H),5.75(s,2H),3.88(s,3H),3.85(s,3H),3.75(s,3H)。LC-MS m/z 514.0[M+H]+。
步骤2.在氮气吹扫下，向4-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(3.5g，6.82mmol)在1,4-二噁烷(35.0mL)中的搅拌溶液中添加K2CO3(1.885g，13.64mmol)、三甲基环三硼氧烷(TMB，1.907mL，13.64mmol)和PdCl2(dppf).CH2Cl2加合物(0.557g，0.682mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌6h。将反应混合物通过CELITETM床过滤，随后将所述床用过量乙酸乙酯洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到残余物。将粗化合物通过ISCO combiflash色谱法(在氯仿中的 0-20％甲醇)纯化以得到呈棕色固体的4-((5-氨基-7-羟基-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1- 基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(2.1g，4.10mmol，60.1％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.90(s,1H),7.51(s,1H),7.46(d,J＝8.0Hz,1H),6.63-6.50(m,1H),6.18-6.01(m,2H),5.71-5.54(m,2H),3.91(s,3H),3.87-3.78(s,3H),2.23(s,3H)。
LC-MS m/z 344.0[M+H]+。
步骤3.向4-((5-氨基-7-羟基-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(0.5g，1.456mmol)在THF(5.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加LiAlH4(1.214mL，2.91mmol)。将反应混合物加温至室温，搅拌1h，用冰冷的水淬灭，并且通过 CELITETM床过滤，将所述床用过量乙酸乙酯洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到呈棕色半固体的5-氨基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-醇(0.31g，0.551mmol，37.8％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝6.99-6.95(m,1H),6.73(br d,J＝7.5Hz,1H),6.44-6.38(m,1H),5.75-5.49(m,2H),5.26-4.99(m,1H),4.44(s,2H),3.87-3.80(m,3H),2.23(s,3H)。
LC-MS m/z 316.3[M+H]+。
步骤4.向5-氨基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶 -7-醇(1.1g，3.49mmol)在DMSO(10.0mL)中的搅拌溶液中添加DBU(1.577mL，10.47mmol)、BOP(2.314g，5.23mmol)和(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲胺盐酸盐(0.522g，3.49mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。添加(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲胺盐酸盐(0.3g，2.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h并且在EtOAc与水之间分配。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到残余物。将粗化合物通过ISCOcombiflash色谱法通过用在氯仿中的0-20％甲醇洗脱纯化以得到呈棕色固体的(4-((5-氨基-3-甲基-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(0.81g，1.243mmol，35.6％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝7.60-7.55(m,1H),7.26(br t,J＝5.8Hz,1H),6.98-6.93(m,1H),6.77(br d,J＝7.5Hz,1H),6.68-6.60(m,1H),5.68(s,2H),5.55-5.48(m,1H),5.20-5.13(m,1H),4.78(br d,J＝5.5Hz,2H),4.49-4.42(m,2H),3.82-3.77(m,3H),2.56(d,J＝2.0Hz,4H),2.55-2.50(m,6H)。
LC-MS m/z 411.2[M+H]+。
步骤5.向(4-((5-氨基-3-甲基-7-(((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(0.45g，1.096mmol)在THF(10.0mL)中的0℃搅拌溶液中添加SOCl2(1.0ml，13.70mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1h，加温至室温并且在减压下浓缩以得到呈棕色固体的1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基 -N7-((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(0.51g，假定100％产率)。将粗产物按原样用于下一步骤。
LC-MS m/z 429.4[M+H]+。
步骤6.向1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-N7-((5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基) 甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(0.15g，0.350mmol)在DMF(3.0mL)中的搅拌溶液中添加2-((1S,4S)-2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基)乙-1-醇盐酸盐(0.094g，0.525mmol) 和K2CO3(0.048g，0.350mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌90min。将反应混合物通过CELITETM床过滤，随后将所述床用过量乙酸乙酯洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到残余物。将粗化合物通过反相制备型LC/MS(柱：TRIART-YMC EXRS-(250x 19mm)，流动相A：10mM NH4HCO3；流动相B：乙腈:MeOH(1:1)；梯度：0/20、2/20 10/40、15/40 18/100 20/20，流速：19mL/min)纯化。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且使用Genevac装置经由离心蒸发干燥以得到化合物142(33.2 mg，0.062mmol，17.76％产率)。
实施例20-起始材料和中间体
下文的图示出了用于制备可用作用于制备本文公开的TLR7激动剂的起始材料或中间体的化合物的方案。所述方案可以适用于制备其他类似的可以用作起始材料或中间体的化合物。所采用的试剂是本领域熟知的，并且在许多情况下，它们的使用已经在前述实施例中进行了展示。
图表1
Figure BDA0003813242340000571
图表2
Figure BDA0003813242340000572
Figure BDA0003813242340000581
图表3
Figure BDA0003813242340000582
Figure BDA0003813242340000591
生物活性
可以通过以下程序测定本文公开的作为TLR7激动剂的化合物的生物活性。
人TLR7激动剂活性测定
此程序描述了用于测定在本说明书中公开的化合物的人TLR7(hTLR7)激动剂活性的方法。
将具有人TLR7分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告转基因的工程化人胚肾蓝细胞(HEK-BlueTMTLR细胞；Invivogen)悬浮在非选择性培养基(补充有10％胎牛血清 (Sigma)的DMEM高葡萄糖(Invitrogen))中。将HEK-BlueTMTLR7细胞添加到384孔组织培养板的每个孔中(15,000个细胞/孔)，并且在37℃、5％CO2下孵育16-18h。将化合物(100nl)分配到含有HEK-BlueTMTLR细胞的孔中，并且将经处理的孔在37℃、5％CO2下孵育。在处理18h后，将十微升的新鲜制备的Quanti-BlueTM试剂(Invivogen)添加到每个孔中，孵育30min(37℃，5％CO2)，并且使用Envision读板仪(OD＝620nm)测量 SEAP水平。计算半数最大有效浓度值(EC50；在测定基线与最大值之间引起反应的一半的化合物浓度)。
人血液中I型干扰素基因(MX-1)和CD69的诱导
I型干扰素(IFN)MX-1基因和B细胞激活标记物CD69的诱导是在TLR7途径激活后发生的下游事件。以下是人全血测定，其测量响应于TLR7激动剂的诱导。
从人类受试者中收获肝素化的人全血，并且将其用1mM的测试TLR7激动剂化合物处理。将血液用RPMI 1640培养基稀释，并且使用Echo预加样(predot)10nL/孔，从而得到1uM的最终浓度(在10uL血液中有10nL)。在摇床上混合30秒后，将板盖住并且置于37℃室中过夜＝17h。制备固定/裂解缓冲液(在H20中5x->1x，在37℃下加温；目录号BD 558049)，并且保持perm缓冲液(在冰上)，以备后用。
对于表面标记物(CD69)染色：制备表面Ab：0.045ul hCD14-FITC (ThermoFisher目录号MHCD1401)+0.6ul hCD19-ef450(ThermoFisher目录号 48-0198-42)+1.5ul hCD69-PE(目录号BD555531)+0.855ul FACS缓冲液。添加3ul/ 孔，1000rpm旋转1min，并且在摇床上混合30秒，置于冰上30min。在用70uL预加温的 1x固定/裂解缓冲液30min后停止刺激，并且使用Feliex伴侣重悬(15次，对每个板更换吸头)并且在37C下孵育10min。
在2000rpm下离心5min，用HCS板清洗器抽出，在摇床上混合30秒，并且然后在dPBS中用70uL洗涤并且沉淀2x(2000rpm，持续5min)，并且在FACS缓冲液中用 50ul洗涤，沉淀1x(2000rpm，持续5min)。在摇床上混合30秒。对于细胞内标记物(MX-1) 染色：添加50ul BDPerm缓冲液III，并且在摇床上混合30秒。在冰上孵育30min(在黑暗中)。用50uL FACS缓冲液洗涤2次(在perm后，在2300rpm下旋转5min)，然后在摇床上混合30秒。在20ul含有MX1抗体()(4812)-Alexa 647：Novus Biologicals #NBP2-43704AF647)20ul FACS缓冲液+0.8ul hIgG+0.04ul MX-1的FACS缓冲液中重悬。1000rpm旋转1min，在摇床上混合30秒，并且将样品在黑暗中在室温下孵育45min，然后用FACS缓冲液洗涤2次(在perm后，在2300rpm下旋转5min)。在20ul(每孔总计 35uL)FACS缓冲液重悬，并且用箔纸覆盖，并且置于4℃下，以在第二天读数。在iQuePlus 上读取板。将结果加载到工具集中，并且在curve master中生成IC50曲线。将y轴100％设置为1uM瑞喹莫德。
小鼠血液中TNF-α和I型IFN反应基因的诱导
TNF-α和I型IFN反应基因的诱导是在TLR7途径激活后发生的下游事件。以下是测量在小鼠全血中响应于TLR7激动剂的诱导的测定。
将肝素化的小鼠全血用含青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基以5:4的比率稀释(50uL全血和40uL培养基)。将90uL体积的经稀释的血液转移到Falcon平底96孔组织培养板的孔中，并且将板在4℃下孵育1h。将100％DMSO储备溶液中的测试化合物在相同培养基中稀释20倍用于进行浓度反应测定，然后将10uL经稀释的测试化合物添加到孔中，使得最终DMSO浓度为0.5％。对照孔接受10uL含有5％DMSO的培养基。然后将板在37℃下在5％CO2培养箱中孵育17h。在孵育后，将100uL培养基添加到每个孔中。将板离心，并且取出130uL上清液用于通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7324， Thermo-Fisher Scientific)测定TNFa的产生。将来自Invitrogen mRNA Catcher Plus试剂盒 (目录号K1570-02)的70uL体积的含DTT的mRNA捕获裂解缓冲液(1x)添加到孔中剩余的70uL样品中，并且通过上下移液5次进行混合。然后在室温下将板摇动5-10min，然后向每个孔中添加2uL的蛋白酶K(20mg/mL)。然后将板在室温下摇动15-20min。然后将板在-80℃下储存直到进一步处理。
将冷冻样品解冻，并且根据制造商的说明书，使用Invitrogen mRNA CatcherPlus试剂盒(目录号K1570-02)提取mRNA。使用Invitrogen SuperScript IV VILO MasterMix (目录号11756500)，使用来自RNA提取的一半产率的mRNA在20μL逆转录酶反应中合成cDNA。使用来自ThermoFisher(Applied Biosystems)的QuantStudio实时PCR系统进行
Figure BDA0003813242340000601
实时PCR。使用针对小鼠IFIT1、IFIT3、MX1和PPIA基因表达的商业化预设计的TaqMan测定和TaqMan Master Mix一式两份地运行所有实时PCR反应。将PPIA用作管家基因。遵循来自制造商的建议。通过平均管家基因(Ct)归一化所有原始数据(Ct)，然后利用比较Ct(ΔΔCt)方法量化相对基因表达(RQ)用于进行实验分析。
定义
“脂族”意指直链或支链的饱和或不饱和的非芳族烃部分，其具有指定数量的碳原子(例如，如在“C3脂族”、“C1-5脂族”、“C1-C5脂族”或“C1至C5脂族”中，后三个短语与具有从1至5个碳原子的脂族部分同义)或者在未明确指定碳原子数量的情况下从1至4个碳原子(在不饱和脂族部分的情况下2至4个碳)。类似的理解适用于其他类型中的碳数量，如在C2-4烯烃、C4-C7脂环族等中。以类似的方式，诸如“(CH2)1-3”的术语应理解为对下标是1、2或3的简写，使得这样的术语代表CH2、CH2CH2和CH2CH2CH2。
“烷基”意指饱和的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，C1-C4烷基部分包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基等。“烷二基”(有时也称为“亚烷基”)意指烷基的二价对应物，诸如
Figure BDA0003813242340000611
“烯基”意指具有至少一个碳-碳双键的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，C2-C4烯基部分包括但不限于乙烯基 (ethenyl/vinyl)、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、顺式-1-丙烯基、反式-1-丙烯基、E- (或Z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基(丁-1,3-二烯基)等。
“炔基”意指具有至少一个碳-碳三键的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，C2-C4炔基包括乙炔基(ethynyl/acetylenyl)、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。
“脂环族”意指具有从1至3个环的饱和或不饱和的非芳族烃部分，每个环具有从3至8个(优选地从3至6个)碳原子。“环烷基”意指每个环是饱和的脂环族部分。“环烯基”意指至少一个环具有至少一个碳-碳双键的脂环族部分。“环炔基”意指至少一个环具有至少一个碳-碳三键的脂环族部分。通过说明的方式，脂环族部分包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基和金刚烷基。优选的脂环族部分是环烷基部分，尤其是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。“环烷二基”(有时也称为“环亚烷基”)意指环烷基的二价对应物。类似地，“二环烷二基” (或“二环亚烷基”)和“螺烷二基”(或“螺亚烷基”)是指二环烷基和螺烷基(或“螺环烷基”)的二价对应物。
“杂脂环族”意指这样的脂环族部分，其中在其至少一个环中，至多三个(优选地1至2个)碳已经被独立地选自N、O或S的杂原子替代，其中N和S任选地可以被氧化并且N任选地可以被季铵化。优选的脂环族部分由一个大小为5至6元的环组成。类似地，“杂环烷基”、“杂环烯基”和“杂环炔基”分别意指其至少一个环已经被如此修饰的环烷基、环烯基或环炔基部分。示例性杂脂环族部分包括氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、 1,3-二噁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃基砜、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、 1,3-二氧戊环基、四氢-1,1-二氧代噻吩基、1,4-二噁烷基、硫杂环丁烷基等。“杂环亚烷基”意指杂环烷基的二价对应物。
“烷氧基”、“芳氧基”、“烷硫基”和“芳硫基”分别意指-O(烷基)、-O(芳基)、-S(烷基)和-S(芳基)。例子分别是甲氧基、苯氧基、甲硫基和苯硫基。
除非指示较窄的含义，否则“卤素”或“卤代”意指氟、氯、溴或碘。
“芳基”意指具有单、双或三环环系统(优选地单环)的烃部分，其中每个环具有从3至7个碳原子，并且至少一个环是芳族的。环系统中的环可以彼此稠合(如在萘基中)或彼此键合(如在联苯基中)，并且可以与非芳族环稠合或键合(如在茚满基或环己基苯基中)。通过进一步说明的方式，芳基部分包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基和苊基。“亚芳基”意指芳基的二价对应物，例如1,2- 亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基。
“杂芳基”意指具有单、双或三环环系统(优选地5至7元单环)的部分，其中每个环具有从3至7个碳原子，并且至少一个环是含有从1至4个独立地选自N、O或S的杂原子的芳族环，其中N和S任选地可以被氧化并且N任选地可以被季铵化。这样的至少一个含有杂原子的芳族环可以与其他类型的环稠合(如在苯并呋喃基或四氢异喹啉基中)，或者与其他类型的环直接键合(如在苯基吡啶基或2-环戊基吡啶基中)。通过进一步说明的方式，杂芳基部分包括吡咯基、呋喃基、噻吩基(thiophenyl/thienyl)、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、N-氧代吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉炔基(isoquinolynyl)、喹唑啉基、噌啉基、喹唑啉基(quinozalinyl)、萘啶基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并噻吩基、噁二唑基、噻二唑基、吩噻唑基(phenothiazolyl)、苯并咪唑基、苯并三唑基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基等。“杂亚芳基”意指杂芳基的二价对应物。
在指示部分可以被取代(诸如通过使用如在“未经取代或经取代的C1-C5烷基”或“任选经取代的杂芳基”中的短语“未经取代或经取代的”或“任选经取代的”)的情况下，这样的部分可以具有一个或多个独立选择的取代基，优选地数量为1至5、更优选地数量为1或2。考虑到取代基所附接的部分，本领域普通技术人员可以选择取代基和取代模式，以提供化学稳定的并且可以通过本领域已知的技术以及本文列出的方法合成的化合物。在部分被鉴定为“未经取代或经取代的”或“任选经取代的”的情况下，在一个优选实施方案中，这样的部分是未经取代的。
“芳基烷基”、“(杂脂环族)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“联芳基烷基”等意指被芳基、杂脂环族、联芳基等部分(视情况而定)取代的烷基、烯基或炔基部分(视情况而定)，其中开放的(未满足的)化合价在烷基、烯基或炔基部分处，例如如在苄基、苯乙基、N-咪唑基乙基、N-吗啉代乙基等中。相反，“烷基芳基”、“烯基环烷基”等意指被烷基、烯基等部分(视情况而定)取代的芳基、环烷基等部分(视情况而定)，例如如在甲基苯基(甲苯基)或烯丙基环己基中。“羟基烷基”、“卤代烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”等意指被一个或多个鉴定的取代基(羟基、卤代等，视情况而定)取代的烷基、芳基等部分(视情况而定)。
例如，允许的取代基包括但不限于烷基(尤其是甲基或乙基)、烯基(尤其是烯丙基)、炔基、芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代(尤其是氟)、卤代烷基(尤其是三氟甲基)、羟基、羟基烷基(尤其是羟基乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)(尤其是-OCF3)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO2H、 -C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、 -C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、 -NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、 -S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)、-SO2N(烷基)2等。
在被取代的部分是脂族部分的情况下，优选的取代基是芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、 -NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、 -S(芳基)、-S(＝O)烷基、-S(环烷基)、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)和-SO2N(烷基)2。更优选的取代基是卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(芳基)、＝O、＝NOH、＝NO(烷基)、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2和-NHC(＝NH)NH2。尤其优选的是苯基、氰基、卤代、羟基、硝基、C1-C4烷氧基、O(C2-C4烷二基)OH和O(C2-C4烷二基) 卤代。
在被取代的部分是脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基部分的情况下，优选的取代基是烷基、烯基、炔基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、 -O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)、-O(芳基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、烷硫基、芳硫基、 -C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、 -C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、 -OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、 -NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)和-SO2N(烷基)2。更优选的取代基是烷基、烯基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、 -CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、 -NHC(＝O)N(烷基)2和-NHC(＝NH)NH2。尤其优选的是C1-C4烷基、氰基、硝基、卤代和C1-C4烷氧基。
在陈述范围的情况下，如在“C1-C5烷基”或“5％至10％”中，这样的范围包括所述范围的端点，如在第一个实例中的C1和C5以及在第二个实例中的5％和10％。
除非具体指示特定的立体异构体(例如，通过在结构式中的相关立体中心处的加粗或加虚线的键，通过在结构式中将双键描绘为具有E或Z构型，或通过使用立体化学指定的命名法或符号)，否则作为纯化合物及其混合物的所有立体异构体都包括在本发明的范围内。除非另外指示，否则外消旋体、单独的对映体(不论是光学纯的还是部分拆分的)、非对映体、几何异构体及其组合和混合物都被本发明涵盖。
本领域技术人员应理解，化合物可以具有互变异构体形式(例如，酮和烯醇形式)、共振形式和两性离子形式，所述形式等效于在本文使用的结构式中描绘的那些，并且所述结构式涵盖此类互变异构体形式、共振形式或两性离子形式。
“药学上可接受的酯”意指在体内(例如在人体中)水解产生母体化合物或其盐或者本身具有与母体化合物类似的活性的酯。合适的酯包括C1-C5烷基、C2-C5烯基或 C2-C5炔基酯，尤其是甲基、乙基或正丙基酯。
“药学上可接受的盐”意指适用于药物配制品的化合物的盐。在化合物具有一个或多个碱性基团的情况下，所述盐可以是酸加成盐，诸如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐(embonate))、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、甲基硫酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乳糖醛酸盐、辛二酸盐、甲苯磺酸盐等。在化合物具有一个或多个酸性基团的情况下，所述盐可以是诸如以下的盐：钙盐、钾盐、镁盐、葡甲胺盐、铵盐、锌盐、哌嗪盐、氨丁三醇盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己胺盐、苯乍生盐、钠盐、四甲基铵盐等。多晶型结晶形式和溶剂化物也涵盖在本发明的范围内。
“受试者”是指动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、猴、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。关于例如哺乳动物受试者(诸如人)的术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。
在治疗疾病或障碍的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)意在包括减轻或消除障碍、疾病或病症，或与障碍、疾病或病症相关的一种或多种症状；或减慢障碍、疾病或病症或其一种或多种症状的进展、扩散或恶化。“癌症的治疗”是指以下作用中的一种或多种：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括(i) 减慢和(ii)完全阻止生长；(2)减少肿瘤细胞的数量；(3)维持肿瘤大小；(4)减小肿瘤大小；(5)抑制，包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止肿瘤细胞浸润到外周器官中； (6)抑制，包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止转移；(7)增强抗肿瘤免疫应答，这可以导致(i)维持肿瘤大小、(ii)减小肿瘤大小、(iii)减慢肿瘤生长、(iv)减少、减慢或防止侵袭和/或(8)在一定程度上缓解与障碍相关的一种或多种症状的严重程度或数量。
在本说明书的式中，横向于键的波浪线
Figure BDA0003813242340000641
或在键末端的星号(*)表示共价附接位点。例如，
在式
Figure BDA0003813242340000642
中R是
Figure BDA0003813242340000643
或R是
Figure BDA0003813242340000644
的陈述意指
Figure BDA0003813242340000645
在本说明书的式中，在其两个碳之间横穿芳族环的键意指附接至所述键的基团可以位于所述芳族环的任何位置，所述任何位置是通过除去隐含地在那里(或明确地在那里，如果写出来的话)的氢而变得可用的。通过说明方式：
Figure BDA0003813242340000646
代表
Figure BDA0003813242340000647
Figure BDA0003813242340000648
代表
Figure BDA0003813242340000649
并且
Figure BDA00038132423400006410
代表
Figure BDA00038132423400006411
本公开文本包括在本文描述的化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的那些原子。通过一般举例而非限制的方式，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本发明的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述的那些类似的方法使用适当的同位素标记的试剂代替原本采用的未标记的试剂来制备。通过举例的方式，C1-C3烷基可以是未氘化的、部分氘化的或完全氘化的，并且“CH3”包括CH3、13CH3、14CH3、CH2T、CH2D、 CHD2、CD3等。在一个实施方案中，化合物中的各种元素以其天然同位素丰度存在。
本领域技术人员应理解，某些结构可以绘制呈一种互变异构体形式或另一种互变异构体形式，例如酮与烯醇，并且这两种形式是等效的。
首字母缩略词和缩写
表C提供了在本说明书中使用的首字母缩略词和缩写及其含义的列表。
Figure BDA00038132423400006412
Figure BDA0003813242340000651
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以下提供了在本说明书中较早以缩写方式通过第一作者(或发明人)和日期引用的以下参考文献的完整引用。将这些参考文献的每一个出于所有目的通过引用并入本文。
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前述具体实施方式包括主要或专门涉及本发明的特定部分或方面的段落。应当理解，这是为了清楚和方便，特定特征可能在不只是公开它的段落中是相关的，并且本文所公开的内容包括在不同段落中找到的信息的所有适当组合。类似地，尽管本文中的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但是应当理解，在特定附图或实施方案的背景下公开了特定特征的情况下，也可以在另一个附图或实施方案的背景下、与另一个特征组合、或总体上在本发明中在适当的程度上使用这样的特征。
此外，尽管已经根据某些优选实施方案具体描述了本发明，但是本发明不限于此类优选实施方案。而是，本发明的范围由所附权利要求限定。

Claims (17)

1.一种化合物，所述化合物具有根据式I的结构
Figure FDA0003813242330000011
其中
W是
Figure FDA0003813242330000012
每个X独立地是N或CR2；
R1是(C1-C5烷基)、
(C2-C5烯基)、
(C1-C8烷二基)0-1(C3-C6环烷基)、
(C2-C8烷二基)OH、
(C2-C8烷二基)O(C1-C3烷基)、
(C1-C4烷二基)0-1(5-6元杂芳基)、
(C1-C4烷二基)0-1苯基、
(C1-C4烷二基)CF3、
(C2-C8烷二基)N[C(＝O)](C1-C3烷基)、
(C2-C8烷二基)0-1(C3-C6环烷二基)(C3-C6环烷基)、
或
(C2-C8烷二基)NRxRy；
每个R2独立地是H、O(C1-C3烷基)、S(C1-C3烷基)、SO2(C1-C3烷基)、C1-C3烷基、O(C3-C4环烷基)、S(C3-C4环烷基)、SO2(C3-C4环烷基)、C3-C4环烷基、Cl、F、CN；或[C(＝O)]0-1NRxRy；
R3是NH[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)0-1(C4-C10二环烷基)、
O(C1-C4烷二基)0-1(C4-C8二环烷基)、
或
具有以下结构的部分
Figure FDA0003813242330000013
R4是NH(C1-C4烷二基)0-1(C4-C10二环烷基)
或
具有以下结构的部分
Figure FDA0003813242330000014
R5是H、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C3-C6环烷基、卤基、O(C1-C5烷基)、(C1-C4烷二基)OH、(C1-C4烷二基)O(C1-C3烷基)、苯基、NH(C1-C5烷基)、5或6元杂芳基、
Figure FDA0003813242330000015
R6是(NH)0-1(C1-C4烷二基)0-1(C4-C10二环烷基)、
或
具有以下结构的部分
Figure FDA0003813242330000021
Rx和Ry独立地是H或C1-C3烷基，或Rx和Ry与它们键合的氮组合以形成3至7元杂环；
n是1、2或3；
并且
p是0、1、2或3；
其中在R1、R2、R3、R4、R5和R6中，
烷基、烯基、环烷基、烷二基、二环烷基、或以下式的部分
Figure FDA0003813242330000022
任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：OH、卤基、CN、(C1-C3烷基)、O(C1-C3烷基)、C(＝O)(C1-C3烷基)、SO2(C1-C3烷基)、NRxRy、
(C1-C4烷二基)OH、(C1-C4烷二基)O(C1-C3烷基)；
并且
烷基、烯基、烷二基、环烷基、二环烷基、或以下式的部分
Figure FDA0003813242330000023
任选地可以具有被以下替代的CH2基团：O、SO2、CF2、C(＝O)、NH、
N[C(＝O)]0-1(C1-C5烷基)、
N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)CF3、
N[C(＝O)]0-1(C2-C4烷二基)OH
N(SO2)(C1-C3烷基)、
N(C1-C3烷二基)0-1[C(＝O)]N(C1-C3烷基)2、
或
N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)0-1(C3-C5环烷基)；
条件是式(I)的化合物不是
Figure FDA0003813242330000024
Figure FDA0003813242330000031
2.根据权利要求1所述的化合物，其中W是
Figure FDA0003813242330000032
3.根据权利要求2所述的化合物，其中W选自
Figure FDA0003813242330000033
4.根据权利要求1所述的化合物，其中W是
Figure FDA0003813242330000034
5.根据权利要求4所述的化合物，其中W选自
Figure FDA0003813242330000035
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R1选自：
Figure FDA0003813242330000036
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R2是OMe、O(环丙基)、或OCHF2。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中R5是H、CH2OH、或Me。
9.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有根据式(Ia)的结构
Figure FDA0003813242330000041
10.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有根据式(Ib)的结构：
Figure FDA0003813242330000042
11.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有根据式(Ic)的结构：
Figure FDA0003813242330000043
12.一种化合物，所述化合物具有根据式(Ia)的结构
Figure FDA0003813242330000044
其中
R1是
Figure FDA0003813242330000045
R2是OMe或OCHF2；
R5是H或Me；并且
W是
Figure FDA0003813242330000046
13.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有这种癌症的患者施用抗癌免疫治疗剂和根据权利要求1或12所述的化合物的治疗有效组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗CTLA-4、抗PD-1、或抗PD-L1抗体。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述癌症是肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌、头颈癌、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤和梅克尔皮肤癌)、尿路上皮癌(包括膀胱癌)、胃癌、肝细胞癌或结直肠癌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗癌免疫治疗剂是伊匹单抗、纳武单抗或派姆单抗。
17.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有由式(Id)表示的结构：
Figure FDA0003813242330000051
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