CN115151546A - 作为Toll样受体7(TLR7)激动剂的C3-取代的1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶化合物 - Google Patents

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Abstract

根据式I的化合物可用作Toll样受体7(TLR7)的激动剂。此类化合物可以用于癌症治疗，尤其是与抗癌免疫治疗剂组合，或用作疫苗佐剂。

Description

作为Toll样受体7(TLR7)激动剂的C3-取代的1H-吡唑并[4,3- d]嘧啶化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月28日提交的美国临时申请序列号63/057,686和2020年1月27日提交的美国临时申请序列号62/966,103的在35U.S.C.§119(e)下的权益；将其公开内容通过引用并入本文。
背景技术
本公开文本涉及Toll样受体7(“TLR7”)激动剂及其缀合物以及用于此类激动剂及其缀合物的制备和使用方法。
Toll样受体(“TLR”)是识别病原体相关分子模式(“PAMP”)的受体，所述病原体相关分子模式是在某些种类的病原体中保守的小分子基序。TLR可以位于细胞表面或细胞内。通过结合其同源PAMP而激活TLR传递了宿主内存在相关病原体(即感染)的信号并且刺激宿主的免疫系统以抵抗感染。人具有10种TLR，称为TLR1、TLR2、TLR3等。
通过激动剂激活TLR(TLR7是被研究最多的)可以对疫苗和免疫治疗剂通过刺激总体免疫应答而在治疗除实际病原体感染以外的多种病症中的作用产生积极效果。因此，对TLR7激动剂在癌症免疫疗法中作为疫苗佐剂或作为增强剂的用途存在很大兴趣。参见，例如，Vasilakos和Tomai 2013，Sato-Kaneko等人2017，Smits等人2008以及Ota等人2019。
TLR7(位于内体膜上的细胞内受体)识别与单链RNA病毒相关的PAMP。它的激活诱导I型干扰素(诸如IFNα和IFNβ)的分泌(Lund等人2004)。TLR7具有两个结合位点，一个用于单链RNA配体(
Figure BDA0003810902030000013
等人2007)，并且一个用于小分子诸如鸟苷(Zhang等人2016)。
TLR7可以结合基于1H-咪唑并[4,5-c]喹啉骨架的鸟苷样合成激动剂(诸如咪喹莫特、瑞喹莫德和嘎德莫特(gardiquimod))并且被其激活。关于小分子TLR7激动剂的综述，参见Cortez和Va 2018。
Figure BDA0003810902030000011
基于喋啶酮分子骨架的合成TLR7激动剂也是已知的，如通过维沙莫德(vesatolimod)例示(Desai等人2015)。
Figure BDA0003810902030000012
经常根据通式(A)公开基于嘌呤样骨架的其他合成TLR7激动剂：
Figure BDA0003810902030000021
其中R、R’和R”是结构变量，并且R”典型地含有未取代的或取代的芳族或杂芳族环。
具有嘌呤样骨架的生物活性分子及其在治疗诸如纤维化、炎性障碍、癌症或病原体感染的病症中的用途的披露包括：Akinbobuyi等人2015和2016；Barberis等人2012；Carson等人2014；Ding等人2016,2017a,和2017b；Graupe等人2015；Hashimoto等人2009；He等人2019a和2019b；Holldack等人2012；Isobe等人2009a和2012；Poudel等人2019a和2019b；Pryde 2010；和Young等人2019。
基团R”可以是吡啶基：Bonfanti等人2015a和2015b；Halcomb等人2015；Hirota等人2000；Isobe等人2002,2004,2006,2009a,2009b,2011,和2012；Kasibhatla等人2007；Koga-Yamakawa等人2013；Musmuca等人2009；Nakamura 2012；Ogita等人2007；和Yu等人2013。
存在式(A)的6,5-稠合环系统(即与咪唑五元环稠合的嘧啶六元环)被修饰的相关分子的公开文本。(a)Dellaria等人2007，Jones等人2010和2012，以及Pilatte等人2017披露了嘧啶环被吡啶环替代的化合物。(b)Chen等人2011，Coe等人2017，Poudel等人2020a和2020b，以及Zhang等人2018披露了咪唑环被吡唑环替代的化合物。(c)Cortez等人2017和2018；Li等人2018；以及McGowan等人2016a,2016b和2017披露了咪唑环被吡咯环替代的化合物。
Bonfanti等人2015b和2016以及Purandare等人2019公开了其中大环跨越嘌呤部分的两个环的TLR7调节剂：
TLR7激动剂可以与配偶体分子缀合，所述配偶体分子可以是例如磷脂、聚(乙二醇)(“PEG”)、抗体或另一种TLR(通常是TLR2)。示例性的公开文本包括：Carson等人2013,2015,和2016，Chan等人2009和2011，Cortez等人2017，Gadd等人2015，Lioux等人2016，Maj等人2015，Vernejoul等人2014，以及Zurawski等人2012。频繁的缀合位点是在式(A)的R”基团处。
Jensen等人2015披露了阳离子脂质媒介物用于递送TLR7激动剂的用途。
一些TLR7激动剂(包括瑞喹莫德)是双重TLR7/TLR8激动剂。参见，例如，Beesu等人2017，Embrechts等人2018，Lioux等人2016，和Vernejoul等人2014。
本说明书的结尾处列出了通过第一作者或发明人和年份对本文中引用的文献的完全引用。
发明内容
本说明书涉及具有作为TLR7激动剂的活性的化合物，所述化合物具有1H-吡唑并[4,3d]嘧啶芳族系统，其中吡唑环的C3碳(箭头)被取代(即，不是H)。
Figure BDA0003810902030000022
在一方面，提供了一种具有根据式I的结构的化合物
Figure BDA0003810902030000031
其中
每个X1独立地是N或CR2；
X2是O、CH2、NH、S或N(C1-C3烷基)；
R1是(C1-C5烷基)、
(C2-C5烯基)、
(C1-C8烷二基)0-1(C3-C6环烷基)、
(C2-C8烷二基)OH、
(C2-C8烷二基)O(C1-C3烷基)、
(C1-C4烷二基)0-1(5-6元杂芳基)、
(C1-C4烷二基)0-1苯基、
(C1-C4烷二基)CF3、
(C2-C8烷二基)N[C(＝O)](C1-C3烷基)、
或
(C2-C8烷二基)NRxRy；
每个R2独立地是H、O(C1-C3烷基)、S(C1-C3烷基)、SO2(C1-C3烷基)、C1-C3烷基、O(C3-C4环烷基)、S(C3-C4环烷基)、SO2(C3-C4环烷基)、C3-C4环烷基、Cl、F、CN或[C(＝O)]0-1NRxRy；
R3是NH(C1-C5烷基)、N(C1-C5烷基)2、NH(C1-C4烷二基)0-1(C3-C6环烷基)、N(C3-C6环烷基)2、NH(C1-C4烷二基)0-1(芳基)、或具有以下结构的环状胺部分：
Figure BDA0003810902030000032
R5是H、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C3-C6环烷基、卤基、O(C1-C5烷基)、(C1-C4烷二基)OH、(C1-C4烷二基)O(C1-C3烷基)、苯基、NH(C1-C5烷基)、5或6元杂芳基、
Figure BDA0003810902030000033
Rx和Ry独立地是H或C1-C3烷基，或Rx和Ry与它们键合的氮组合以形成3至7元杂环；
m是0或1；
并且
n是1、2或3；
其中在R1、R2、R3和R5中
烷基部分、烷二基部分、环烷基部分、或以下式的部分
Figure BDA0003810902030000034
任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：OH、卤基、CN、(C1-C3烷基)、O(C1-C3烷基)、C(＝O)(C1-C3烷基)、SO2(C1-C3烷基)、NRxRy、(C1-C4烷二基)OH、(C1-C4烷二基)O(C1-C3烷基)；
并且
烷基、烷二基、环烷基、或以下式的部分
Figure BDA0003810902030000041
可以具有被以下替代的CH2基团：O、SO2、CF2、C(＝O)、NH、
N[C(＝O)]0-1(C1-C3烷基)、
N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)CF3、
N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)OH、
或
N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)0-1(C3-C5环烷基)。
本文公开的化合物具有作为TLR7激动剂的活性，并且一些化合物可以与抗体缀合，用于靶向递送至预期作用的靶组织或器官。还可以将其聚乙二醇化，以调节其药物特性。
本文公开的化合物或其缀合物或其聚乙二醇化衍生物可以用于通过向患有适于通过激活免疫系统治疗的病症的受试者施用治疗有效量的这种化合物或其缀合物或其聚乙二醇化衍生物(尤其是与疫苗或癌症免疫治疗剂组合)治疗这样的受试者。
具体实施方式
化合物
在一方面，本公开文本的化合物是根据式(Ia)，其中R1、R3和R5是如关于式(I)定义的：
Figure BDA0003810902030000042
在另一方面，本公开文本的化合物是根据式(Ib)，其中R1、R3、和R5是如关于式(I)定义的：
Figure BDA0003810902030000043
在一方面，本公开文本提供了一种具有根据式(Ib)的结构的化合物，其中R1是
Figure BDA0003810902030000044
R3是
Figure BDA0003810902030000045
并且
R5是Me或CH2OH。
在另一方面，提供了一种根据式(Ic)的化合物
Figure BDA0003810902030000051
其中R1、R3和R5是如关于式(I)定义的。
基团R1的例子是
Figure BDA0003810902030000052
优选地，R1是
Figure BDA0003810902030000053
基团R3的例子包括Cl、OH、
Figure BDA0003810902030000054
Figure BDA0003810902030000061
优选地，R3是
Figure BDA0003810902030000062
基团R5的例子是
Figure BDA0003810902030000063
优选地，R5是
Figure BDA0003810902030000064
通过示例而不是限制的方式，以下式的部分
Figure BDA0003810902030000065
包括
Figure BDA0003810902030000066
Figure BDA0003810902030000071
下式的以上示例性部分中的一些：
Figure BDA0003810902030000072
具有可选取代基和/或任选地具有一个或多个被O、SO2等替代的CH2基团，如在上述发明内容中描述的。
本文公开的化合物的具体例子在下表A中示出。该表还提供了按下文提供的程序确定的与以下生物活性有关的数据：人TLR7(hTRL7)激动性报告物测定和/或在人全血中CD69基因的诱导。最右边的列含有分析数据(质谱、LC/MS保留时间和NMR)。在一个实施方案中，本公开文本的化合物具有(a)小于1,000nM的人TLR7(hTLR7)报告物测定EC50值以及(b)小于1,000nM的人全血(hWB)CD69诱导EC50值。(如果测定进行多次，则报告值是平均值。)
Figure BDA0003810902030000073
Figure BDA0003810902030000074
Figure BDA0003810902030000081
Figure BDA0003810902030000091
Figure BDA0003810902030000101
Figure BDA0003810902030000111
Figure BDA0003810902030000121
Figure BDA0003810902030000131
Figure BDA0003810902030000141
Figure BDA0003810902030000151
Figure BDA0003810902030000161
本公开文本的其他化合物示于表B中。
Figure BDA0003810902030000162
Figure BDA0003810902030000171
药物组合物和施用
在另一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的如本文公开的化合物或其缀合物。它可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，诸如生物制剂或小分子药物。所述药物组合物可以在组合疗法中与另一种治疗剂(尤其是抗癌剂)一起施用。
所述药物组合物可以包含一种或多种赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂、及其组合。在下文中传授了合适的赋形剂的选择和使用：Gennaro,编,Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)。
优选地，药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物包被在材料中以保护所述化合物免受可能使其失活的酸和其他天然条件的作用。短语“肠胃外施用”意指除了肠施用和外用施用之外的施用方式，通常通过注射进行，并且包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。可替代地，所述药物组合物可以经由非肠胃外途径施用，所述非肠胃外途径诸如外用、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用。
药物组合物可以呈无菌水性溶液或分散体的形式。它们也可以配制成微乳液、脂质体、或适合于实现高药物浓度的其他有序结构。所述组合物也可以以冻干物(用于在施用前在水中重构)的形式提供。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据正在被治疗的受试者和特定的施用方式而变化并且将总体上是产生治疗效果的组合物量。通常，从百分比来说，该量范围在约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分内，所述活性成分与药学上可接受的载体相组合。
调整剂量方案以提供治疗反应。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以如根据情况的紧急程度所指示，按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和剂量的均匀。“剂量单位形式”是指适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每个单位含有与所需的药物载体联合的经计算产生所希望的治疗反应的预定量的活性化合物。
剂量在从约0.0001至100mg/kg宿主体重并且更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg或可替代地0.1至5mg/kg的范围内。示例性的治疗方案是每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、或每3至6个月一次的施用。优选的剂量方案包括使用以下给药时间表中的一种经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重：(i)每四周，持续六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，然后是每三周1mg/kg体重。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/mL的血浆抗体浓度，并且在一些方法中达到约25-300μg/mL。
本发明的化合物的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或对由于疾病困扰而引起的损伤或残疾的预防。例如，对于荷瘤受试者的治疗，相对于未经治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地抑制肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、以及仍更优选至少约80％。治疗有效量的治疗化合物可以减小受试者的肿瘤大小或在其他方面改善受试者的症状，所述受试者通常是人，但是可以是另一种哺乳动物。在组合治疗中施用两种或更多种治疗剂的情况下，“治疗有效量”是指组合作为整体的功效，而不是单独地每种药剂的功效。
所述药物组合物可以是控释或缓释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的可生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可以经由诸如(1)无针皮下注射装置；(2)微量输注泵；(3)透皮装置；(4)输注装置；和(5)渗透装置的医疗装置施用治疗组合物。
在某些实施方案中，可以配制所述药物组合物以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗化合物穿过血脑屏障，可以将它们配制在脂质体中，所述脂质体可以另外地包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。
工业实用性和用途
本文公开的TLR7激动剂化合物可以用于治疗可通过激活TLR7而改善的疾病或病症。
在一个实施方案中，将TLR7激动剂与抗癌免疫治疗剂(也称为免疫肿瘤学药剂)组合使用。抗癌免疫治疗剂通过刺激身体的免疫系统以攻击和破坏癌细胞，尤其是通过激活T细胞来工作。免疫系统具有许多检查点(调节)分子，以帮助维持其攻击正当的靶细胞与防止其攻击健康的正常细胞之间的平衡。一些分子是刺激剂(上调剂)，这意味着它们的参与促进T细胞激活并且增强免疫应答。其他分子是抑制剂(下调剂或制止剂)，这意味着它们的参与抑制T细胞激活并且减轻免疫应答。激动性免疫治疗剂与刺激性检查点分子的结合可以导致后者的激活和针对癌细胞的免疫应答增强。相反，拮抗性免疫治疗剂与抑制性检查点分子的结合可以防止免疫系统被后者下调并且帮助维持针对癌细胞的强烈应答。刺激性检查点分子的例子是B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、CD40、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。抑制性检查点分子的例子是CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、CD96和TIM-4。
无论抗癌免疫治疗剂的作用方式是哪种，均可以通过总体上调免疫系统(诸如通过激活TLR7)来提高其有效性。因此，在一个实施方案中，本说明书提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向患有这样的癌症的患者施用抗癌免疫治疗剂和如本文公开的TLR7激动剂的治疗有效组合。施用时间可以是同时的、顺序的或交替的。施用方式可以是全身的或局部的。可以经由缀合物以靶向的方式递送所述TLR7激动剂。
可以通过如上所述的组合治疗进行治疗的癌症包括急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因肉瘤、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、肝癌、下咽癌、胰腺癌、肾癌、喉癌、慢性髓细胞性白血病、唇和口腔癌、肺癌、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、口癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、咽喉癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
可以用于如本文公开的组合疗法的抗癌免疫治疗剂包括：AMG 557、AMP-224、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、BMS 936559、西米普利单抗(cemiplimab)、CP-870893、达西珠单抗(dacetuzumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、加利昔单抗(galiximab)、IMP321、伊匹单抗、鲁卡木单抗(lucatumumab)、MEDI-570、MEDI-6383、MEDI-6469、莫罗单抗(muromonab)-CD3、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、曲美目单抗(tremelimumab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌托鲁单抗(utomilumab)、瓦立鲁单抗(varlilumab)、珀伽利珠单抗(vonlerolizumab)。下表B列出了它们的一个或多个替代名称(商标名称、曾用名、研究代码或同义词)和各自的靶检查点分子。
Figure BDA0003810902030000191
Figure BDA0003810902030000201
在用TLR7激动剂的组合治疗的一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗CTLA-4、抗PD-1或抗PD-L1抗体。所述癌症可以是肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌、头颈癌、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤和梅克尔皮肤癌)、尿路上皮癌(包括膀胱癌)、胃癌、肝细胞癌或结直肠癌。
在用TLR7激动剂的组合治疗的另一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗CTLA-4抗体，优选伊匹单抗。
在用TLR7激动剂的组合治疗的另一个实施方案中，所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗PD-1抗体，优选纳武单抗或派姆单抗。
本文公开的TLR7激动剂还可用作疫苗佐剂。
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，所述实施例是通过说明而非限制的方式来提供的。
分析程序
NMR
以下条件用于获得质子核磁共振(NMR)谱：使用DMSO-d6或CDCl3作为溶剂和内标，在400Mz或500Mhz Bruker仪器中采集NMR谱。通过使用ADC Labs的ACD Spectrus版本2015-01或MestReNova软件分析原始NMR数据。
化学位移以相对于内部四甲基硅烷(TMS)或相对于由氘化NMR溶剂推断出的TMS位置的低场百万分率(ppm)报告。表观多重性报告为：单峰-s、双峰-d、三重峰-t、四重峰-q或多重峰-m。表现出展宽的峰进一步表示为br。积分是近似的。应当注意，积分强度、峰形、化学位移和耦合常数可以取决于溶剂、浓度、温度、pH和其他因素。此外，在NMR谱中与水或溶剂峰重叠或交换的峰可能不能提供可靠的积分强度。在一些情况下，可以使用水峰抑制获得NMR谱，水峰抑制可能导致重叠峰不可见或具有改变的形状和/或积分。
液相色谱法
使用了以下制备型和/或分析型(LC/MS)液相色谱方法。
方法1：柱：Waters XBridge C18，2.1mmx50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM NH4OAc)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。MS(ESI)，除非另有标记，否则为正离子模式。
方法2：柱：Waters XBridge C18，2.1mmx50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。MS(ESI)，除非另有标记，否则为正离子模式。
方法3：柱：Waters XBridge C18，2.1mmx50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％甲酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％甲酸)；温度：40℃；梯度：在5％B下保持0.1min，经2.3min 5％B至95％B，然后在95％B下保持0.20min，经0.01min 95％B至5％B，在5％B下保持0.28min，流速：0.6mL/min；检测：MS和UV(254nm)。
方法4：柱：Waters XBridge C18，2.1mmx50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM四丁基NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM四丁基NH4OAc)；温度：40℃；梯度：在5％B下保持0.1min，经2min 5％B至95％B，在95％B下保持0.2min，经0.01min 95％B至5％B，然后在5％B下保持0.67min；流速：0.6mL/min；检测：MS和UV(254nm)。
方法A.柱：BEH C18 2.1x 50mm；流动相A：含0.05％TFA的水；流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：50℃；梯度：经1.7min 2％-98％B；然后在98％B下保持0.50min；流速：0.8mL/min。检测：MS和UV(220nm)。
方法B.柱：Waters XBridge C18，2.1mmx50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM NH4OAc)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％B，然后在100％B下保持0.50min；流速：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。此方法是超高效液相色谱(UPLCTM)方法。
方法C.柱：BEH C18 2.1x 50mm；流动相A：含0.05％TFA的水；流动相B：含0.05％TFA的乙腈；温度：50℃；梯度：经3.0min 0至100％B；流速：1.0mL/min。
方法D.柱：Xbridge BEH C18 XP(50x 2.1mm)，2.5μm；流动相A：5:95CH3CN:H2O(含10mM NH4OAc)；流动相B：95:5CH3CN:H2O(含10mM NH4OAc)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B；流速：1.1mL/min)。
合成-通用程序
通常，本文公开的程序产生在吡唑并嘧啶环系统的1H或2H位置处烷基化的区域异构体(其也分别称为N1和N2区域异构体，暗指被烷基化的氮)的混合物。为简洁起见，未示出N2区域异构体，但是应理解的是它们存在于最初的产物混合物中，并且稍后例如通过制备型HPLC进行分离。
Figure BDA0003810902030000211
可以在合成的早期分离区域异构体的混合物，并且用1H区域异构体进行剩余的合成步骤，或者可替代地，可以携带区域异构体的混合物进行合成，并且根据需要在后期进行分离。
可以通过合成有机化学领域的技术人员熟知的多种方法制备本公开文本的化合物。这些方法包括下文描述的那些或其变体。优选的方法包括但不限于下文在以下方案中描述的那些。所述方案旨在是通用的，但是在一些情况下，为方便起见，可以具体描绘特征(例如，甲酯、特定保护基团或特定区域异构体)。
方案1
Figure BDA0003810902030000221
可以通过上述方案1中所述的步骤合成化合物13。在步骤1和2中，化合物1在合适的条件(诸如H2和Pd/C)下还原，然后在合适的条件下与化合物3反应(例如首先用HOAc处理，然后用NaOMe处理)以形成化合物4。在步骤3中，将化合物4与所需的胺(例如，正丁胺)使用偶联剂(诸如BOP)偶联以形成化合物5。(Rx可以是烷基胺或如上文所述的其他合适的侧链基团)。
在步骤4中，使用合适的卤化试剂(诸如NBS、NIS、NCS或SelectfluorTM)将卤素安置于化合物5的C3处。在步骤5中，化合物6的N1位置被合适的烷基化试剂(诸如化合物7)烷基化。(也可能产生一些N2烷基化产物，未示出。)在步骤6中，化合物8上的卤素可以用作用于在C3处引入以下基团Ra的起点：例如，烷基、烯基、脂环族、芳环、杂芳环等。可替代地，卤化、烷基化和引入Ra这三个步骤可以在步骤2(嘧啶形成步骤)之前完成。Ra可以是最终产物基团或可以是前体，随后被修饰以提供最终产物基团。Ra可以具有保护基团，诸如三甲基甲硅烷基乙炔基，随后在合成过程的适当阶段被去除。在Ra是氟的情况下，它可以用醇钠转化为醇盐基团(例如，用NaOMe转化为OMe)。同样在步骤3中，氨基甲酸酯基团可以被去保护，或者这可以在稍后的阶段用合适的碱(诸如NaOH)来完成。在步骤6中在C3处引入的基团Ra可以进一步衍生，例如在步骤7中，以生成基团Rb。在Ra是三甲基甲硅烷基乙炔基的情况下，它可以被RuO2和高碘酸钠氧化以形成羧酸基团，然后可以还原成羟基甲基。在步骤8和9中，化合物10的羧酸甲酯还原为苯甲醇，其经由苄基氯或甲磺酸苄酯中间体并且被胺RcRdNH2置换进一步变为苄胺。在步骤10中，基团Rb任选可以进一步转变为基团Re，例如通过双键的氢化或保护基团的去除以得到化合物13。
合成-具体实施例
为了进一步说明上述内容，包括以下非限制性、以下示例性合成方案。在权利要求范围内的这些实施例的变化在本领域技术人员的能力范围内，并且被认为落入本公开文本的范围内。读者应认识到，被提供本公开文本并且是相关领域的技术人员的熟练技术人员将能够在没有穷举实施例的情况下制备和使用本文公开的化合物。
编号100以上的化合物的分析数据见于表A或表B。
实施例1-化合物103
Figure BDA0003810902030000231
步骤1.向100mL烧瓶中装入(7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(4.98g，18.84mmol)和DMF(60.0mL)以形成澄清溶液。在5℃(冰浴)下以小部分添加N-碘代琥珀酰亚胺(NIS，5.09g，22.61mmol)。将溶液在5℃下搅拌2h，然后将其倒入400mL水中。过滤后，将沉淀物风干并且收集以得到(7-(丁基氨基)-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(6.46g，15.73mmol，83％产率)。
LC/MS的t＝1.251min(方法3)，MS(ESI)的计算值[M+H]+391.0，实测值391.1。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.96(s,1H),9.74(s,1H),7.52(s,1H),3.62(s,3H),3.53(q,J＝6.5Hz,2H),1.68–1.55(m,2H),1.47–1.30(m,2H),0.94(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤2.向100mL烧瓶中装入(7-(丁基氨基)-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(2.50g，6.41mmol)、50.0mL DMF和Cs2CO3(4.18g，12.81mmol)。将反应混合物声处理5min后，在室温下添加在10.0mL DMF中的4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.743g，6.73mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后将其吸收在200mL DCM中。将DCM溶液通过200mL 10％柠檬酸溶液(3X)和盐水(30mL)洗涤。分离后，将有机相用Na2SO4干燥并且过滤。将溶剂蒸发后的残余物通过色谱法(SiO2，EtOAc:己烷＝0-100％)纯化。将含有所希望产物的级分汇集并且蒸发至干以得到4-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.41g，1.86mmol，29.1％产率)。
LC/MS的t＝1.738min(方法3)。MS(ESI)计算值569.1，实测值569.2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.81(s,1H),7.59–7.43(m,2H),7.23(t,J＝5.6Hz,1H),6.72(d,J＝7.8Hz,1H),5.80(s,2H),3.87(s,3H),3.85(s,3H),3.63(s,3H),3.50(q,J＝6.6Hz,2H),1.54(p,J＝7.3Hz,2H),1.24–1.17(m,2H),0.83(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤3.向20mL微波小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.007g，1.771mmol)、7.2mL二噁烷、[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(0.091g，0.124mmol)、三甲基环三硼氧烷(TMB，1.000g，7.97mmol)和K2CO3(0.734g，5.31mmol)。将反应混合物在120℃下微波处理1h。将反应混合物用100mL DCM稀释并且用10％柠檬酸(3x20 mL)和盐水(30mL)依序洗涤。分离后，将有机相用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将最终残余物通过色谱法(SiO2，MeOH:DCM＝0-10％)纯化。将具有所希望产物的级分汇集并且蒸发至干以得到呈棕色固体的4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(0.212g，0.531mmol，30％产率)。
LC/MS的t＝1.426min(方法4)。MS(ESI)计算值[M-H]-397.2，实测值397.2。
步骤4.将装有4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(407.2mg，1.022mmol)和DCM(4mL)的20mL小瓶冷却至-78℃。逐滴添加DIBAL-H(3.07mL，3.07mmol，在THF中1M)。2h后，添加0.5mL甲醇并且将温度升至室温。添加酒石酸钾钠溶液(4mL，20％)，并且将混合物搅拌过夜，并且然后吸收在100mLEtOAc中。将有机相用盐水(2x20 mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下蒸发。将残余物通过色谱法(SiO2，MeOH:DCM＝0-10％)纯化以得到(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(285.0mg，0.769mmol，75％产率)。
将分析样品用以下条件通过LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在11％B下保持0分钟，经22分钟11％-51％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为20.4mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为99％。使用分析型LC/MS确定最终纯度。
LC/MS方法1：观测质量：370.9；保留时间：1.37min。
LC/MS方法2：观测质量：371.3；保留时间：1.28min。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ6.99(s,1H),6.76(d,J＝7.8Hz,1H),6.48(d,J＝7.7Hz,1H),6.41(t,J＝5.5Hz,1H),5.66(s,2H),5.52(s,2H),4.45(d,J＝5.5Hz,2H),3.83(d,J＝1.3Hz,3H),3.42(s,0H),2.23(d,J＝1.2Hz,3H),1.54–1.44(m,2H),1.27–1.15(m,2H),0.89–0.82(m,3H)。
步骤5.向20mL小瓶中装入(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(70.0mg，0.189mmol)和DCM(3.0mL)。在0℃下向悬浮液中添加SOCl2(0.034mL，0.472mmol)。0.5h后，将混合物在减压下蒸发并且将残余物(中间体A)不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.60min(方法3)，MS(ESI)的计算值[M+H]+389.2，实测值389.2。
步骤6.在室温下向小瓶中装入N7-丁基-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(30mg，0.077mmol)、0.5mL DMF、环丁胺(31.8mg，0.447mmol)和Et3N(0.022mL，0.154mmol)。允许反应进行过夜后，将反应混合物通过制备型HPLC纯化以得到化合物103(21.8mg，0.051mmol，66.7％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在10％B下保持0分钟，经23分钟10％-50％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为21.8mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。
从中间体A类似地制备以下化合物：
化合物104：(17.2mg，0.037mmol，49.0％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridgeC18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在9％B下保持0分钟，经20分钟9％-49％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为17.2mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。
化合物105：(33.4mg，0.074mmol，96％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx30mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在9％B下保持0分钟，经20分钟9％-49％B，然后在100％B下保持2分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为33.4mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
化合物106：(27.8mg，0.057mmol，74％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在8％B下保持0分钟，经23分钟8％-48％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为27.8mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为99％。
从化合物106制备化合物136：将在0℃下化合物106(50mg，0.104mmol)在THF(2mL)中的溶液用NaH(9.94mg，0.414mmol)处理并且搅拌10min。添加MeI(6.48μl，0.104mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌3h。通过缓慢添加MeOH将反应淬灭。将溶剂蒸发。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在10％B下保持0分钟，经20分钟10％-50％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有化合物136的级分合并并且经由离心蒸发干燥。
实施例2-化合物107
Figure BDA0003810902030000261
步骤1.向30mL小瓶中装入(7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(972.2mg，3.68mmol)、6.0mL乙腈、1.2mL HOAc、1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮鎓杂双环[2.2.2]辛烷双(四氟硼酸盐)(2606mg，7.36mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌24h。添加另外的乙腈(4.0mL)、HOAc(0.4mL)和1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮鎓杂双环[2.2.2]辛烷双(四氟硼酸盐)(5213mg，14.71mmol)，并且将反应混合物在80℃下搅拌另外的15h，然后将挥发物在减压下蒸发。将残余物吸收在60mL DCM中。将悬浮液过滤并且将固体用更多的DCM(3x60mL)洗涤。将合并的DCM相蒸发以得到(7-(丁基氨基)-3-氟-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(886mg，1.569mmol，42.7％产率，50％纯度)。将大部分材料不经进一步纯化用于下一步骤。将分析样品通过制备型HPLC(XBridge BEH C18 OBD Prep柱，
Figure BDA0003810902030000262
5μm，19mm X 150mm，梯度：在水中的5％-95％乙腈(10mM TEAA作为两种溶剂中的改性剂))纯化。
LC/MS的t＝1.096min(方法4)，MS(ESI)计算值281.1，实测值281.2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.10(s,1H),9.73(s,1H),8.41–7.12(m,1H),3.63(s,3H),3.56–3.48(m,2H),1.71–1.53(m,2H),1.50–1.31(m,2H),0.94(t,J＝7.3Hz,3H)。
步骤2.在室温下向20mL小瓶中装入(7-(丁基氨基)-3-氟-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(700.0mg，1.24mmol，50％纯度)、4.2mL DMF、Cs2CO3(1616mg，4.96mmol)和4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(3.02mL，1.612mmol)。1h后，将反应混合物吸收在100mL EtOAc中。将EtOAc相用10％柠檬酸溶液(2x50 mL)和盐水(30mL)洗涤。将有机相分离，用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下蒸发。将残余物通过色谱法(SiO2，EtOAc:己烷＝0-100％)纯化以得到呈黄色固体的4-((7-(丁基氨基)-3-氟-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(300.1mg，0.652mmol，52.6％产率)。
LC/MS的t＝1.972min(方法3)，MS(ESI)计算值461.2，实测值461.2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.82(s,1H),7.49(d,J＝7.6Hz,2H),7.35(t,J＝5.6Hz,1H),6.78(d,J＝7.8Hz,1H),5.65(s,2H),3.85(s,3H),3.84(s,3H),3.63(s,3H),3.50(td,J＝7.0,5.5Hz,2H),1.61–1.49(m,2H),1.29–1.13(m,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤3.向烘箱干燥的20mL小瓶中装入在2.6mL DCM中的4-((7-(丁基氨基)-3-氟-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(0.217g，0.471mmol)。在-78℃下添加DIBAL-H(1.413mL，1.413mmol，在THF中的1M)。25min后，添加更多的DIBAL-H(0.5mL，0.5mmol，在THF中1.0M)。另外40min后，添加0.5mL MeOH并且将温度升至室温。添加4.0mL 20％酒石酸钾钠溶液并且将反应混合物搅拌过夜。然后将其吸收在100mL EtOAc中。将有机相用盐水(2x20 mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下蒸发以得到(7-(丁基氨基)-3-氟-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.204g，0.471mmol，假定100％产率)，不经进一步纯化使用。
LC/MS的t＝1.571min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+433.2，实测值433.2。
步骤4.在室温下向小瓶中装入在二噁烷(4.0mL)中的(7-(丁基氨基)-3-氟-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(200.0mg，0.462mmol)。添加NaOH(0.139mL，1.387mmol 10.0M)。将溶液在60℃下搅拌4h，然后冷却并且用稀HCl酸化。将沉淀物过滤并且用水洗涤以得到(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-氟-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(173mg，0.462mmol，假定100％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.280min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+375.2，实测值375.2。
步骤5.向20mL小瓶中装入(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-氟-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(0.150g，0.40mmol)和DCM(3mL)。在5℃(冰浴)下添加SOCl2(0.058ml，0.800mmol)。0.5h后，在减压下蒸发溶剂以得到N7-丁基-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-氟-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(中间体B)(0.157g，0.400mmol，假定100％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.562min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+393.2，实测值393.1。
步骤6.与从中间体A获得化合物103类似地从中间体B获得化合物107(2.8mg，0.006mmol，13％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；梯度：在13％B下保持0分钟，经20分钟13％-53％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为2.8mg；通过LCMS分析估计的纯度为98％。
从中间体B类似地制备以下化合物：化合物108：(6.7mg，0.015mmol，28％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10-mMNH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；梯度：在11％B下保持0分钟，经24分钟11％-51％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为6.7mg；通过LCMS分析估计的纯度为99％。
化合物109：(4.8mg，0.010mmol，21％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；梯度：在11％B下保持0分钟，经24分钟11％-51％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。
产物的产量为4.8mg；通过LCMS分析估计的纯度为96％。
化合物110：(7.1mg，0.015mmol，29％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；梯度：在9％B下保持0分钟，经24分钟9％-49％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为7.1mg；通过LCMS分析估计的纯度为98％。
实施例3-化合物115
Figure BDA0003810902030000281
向小瓶中装入N7-丁基-3-氟-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(化合物108)(15.0mg，0.033mmol)、1.0mL甲醇和NaOMe(1mL，4.37mmol，4.37M)。将反应混合物在120℃下微波处理1h，将其用1％HCl酸化并且通过制备型HPLC纯化以得到化合物115(9.7mg，0.021mmol，63.0％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在12％B下保持0分钟，经20分钟12％-48％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有化合物115的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为9.7mg；通过LCMS分析估计的纯度为100％。
实施例4-化合物118
Figure BDA0003810902030000282
Figure BDA0003810902030000291
步骤1.向20mL微波小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.201g，2.113mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(0.148g，0.211mmol)、三苯基膦(0.194g，0.740mmol)、碘化铜(I)(0.089g，0.465mmol)、DMF(9mL)、TEA(1.5mL)和乙炔基三甲基硅烷(0.585mL，4.23mmol)。将反应混合物在80℃下微波处理20min。将冷却的混合物通过色谱法(SiO2，EtOAc:己烷＝0-60％)直接纯化以得到4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(0.933g，1.733mmol，82％产率)。
LC/MS的t＝2.141min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+539.2，实测值539.4。
步骤2.在50℃下向烧瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(2.018g，3.75mmol)和125mL乙腈以形成溶液。添加呈在水(50mL)中的溶液的偏高碘酸钠(4.01g，18.73mmol)并且然后添加氧化钌(IV)(0.050g，0.375mmol)。1.5h后，添加更多的(偏)高碘酸钠(1g，4.68mmol)。另外的4h后，将反应混合物冷却下来。将其在室温下搅拌过夜后，添加3.0mL MeOH并且将反应混合物通过C18二氧化硅垫过滤。将更多的乙腈用于洗涤二氧化硅垫。将合并的滤液蒸发以得到粗7-(丁基氨基)-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-甲酸(2.065g，2.55mmol，68％产率，60％纯度)，不经进一步纯化使用。
LC/MS的t＝1.324min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+487.2，实测值487.4。
步骤3.向20mL小瓶中装入7-(丁基氨基)-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-3-甲酸(500.0mg，1.028mmol)和14mL THF，形成悬浮液。在5℃下添加4-甲基吗啉(0.339mL，3.08mmol)和氯甲酸异丁酯(0.202mL，1.542mmol)。10min后，添加更多的4-甲基吗啉(0.339mL，3.08mmol)和氯甲酸异丁酯(0.202mL，1.542mmol)。另外的10min后，添加硼氢化钠(234mg，61.6mmol)并且然后添加60uL水。1h后，添加HCl以酸化溶液。然后将反应混合物吸收在100mL DCM中。将有机相用盐水(2x 30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且蒸发以得到粗4-((7-(丁基氨基)-3-(羟基甲基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(486mg，1.028mmol，假定100％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.499min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+473.2，实测值473.4。
步骤4.在室温下向200mL烧瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-3-(羟基甲基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(939mg，1.988mmol)、5.3mL乙腈、咪唑(447mg，6.56mmol)和TBS-Cl(599mg，3.98mmol)。15min后，添加MeOH(804μl，19.88mmol)。将反应混合物吸收在100mL DCM中。将有机相用稀HCl(30mL1％HCl)和盐水(2x 30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且蒸发。将残余物通过色谱法(SiO2，MeOH:DCM＝0-20％)纯化以得到4-((7-(丁基氨基)-3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(424.0mg，0.506mmol，25.4％产率，70％纯度)。LC/MS的t＝2.355min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+587.3，实测值587.5。
步骤5.向20mL小瓶中装入在6mL THF中的4-((7-(丁基氨基)-3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(186.0mg，0.317mmol)。经15min分三部分在-5℃下添加LiAlH4(951μl，0.951mmol，在THF中1M)。40min后，将反应混合物添加到在-78℃下冷却的10mL丙酮中。10min后，添加7mL 20％罗谢尔盐(Rochelle salt)。将整个混合物升温至室温并且然后吸收在50mL EtOAc中。将有机相分离，用盐水(2x 30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且蒸发以得到(7-(丁基氨基)-3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(中间体C)(63.8mg，0.114mmol，36％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.932min(方法4)，MS(ESI)计算值[M-H]-557.3，实测值557.2。
步骤6.在5℃下向4mL小瓶中装入(7-(丁基氨基)-3-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(38.2mg，0.068mmol)、1mL DCM、DIPEA(0.060mL，0.342mmol)和在0.085mL DCM中的甲磺酰氯(8.52μl，0.109mmol)。20min后，添加四氢-2H-吡喃-4-胺(34.6mg，0.342mmol)。搅拌过夜后，添加四正丁基氟化铵(0.205mL，0.205mmol)。2h后，将反应混合物吸收在50mL EtOAc中。将有机相用10％柠檬酸(2x20 mL)、盐水(30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且蒸发以得到(7-(丁基氨基)-3-(羟基甲基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(36.1mg，0.068mmol，假定100％产率)。
LC/MS的t＝1.213,min(方法4)，MS(ESI)计算值[M-H]-526.3，实测值526.2。
步骤7.向20mL小瓶中装入(7-(丁基氨基)-3-(羟基甲基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.062g，0.118mmol)、2mL MeOH和NaOH(4.72mg，0.118mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌2h，然后将其冷却并且蒸发至干。添加水(3mL)并且使用4M HCl中和悬浮液。然后将悬浮液蒸发至干并且将残余物通过制备型HPLC纯化以得到化合物118(14.9mg，0.030mmol，27％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；梯度：在0％B下保持0分钟，经20分钟0-40％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为14.9mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为99％。
从中间体C类似地制备以下化合物：
化合物119：(27.2mg，0.054mmol，54％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；梯度：在0％B下保持0分钟，经20分钟0-40％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为27.2mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。
化合物120：(16.7mg，0.035mmol，35％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；梯度：在0％B下保持0分钟，经20分钟0-40％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为16.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96％。
实施例5-化合物123
Figure BDA0003810902030000311
步骤1.向微波小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(150mg，0.264mmol)、三氟(丙-1-烯-2-基)硼酸钾(78.0mg，0.528mmol)、1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(ii)二氯甲烷复合物(21.55mg，0.026mmol)、DMF(1.6mL)、水(0.400mL)和Cs2CO3(172.0mg，0.528mmol)以形成悬浮液。将反应混合物在100℃下微波处理1h。添加20mL乙腈并且将混合物过滤。将滤液蒸发掉并且将残余物通过色谱法(SiO2，EtOAc:己烷＝0-80％)纯化以得到作为产物的4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(63.0mg，0.131mmol，49.5％产率)。LC/MS的t＝2.377min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+483.2，实测值483.3。
步骤2.在5℃下向20mL小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(62.1mg，0.129mmol)、3.0mL THF和LiAlH4(0.257mL，0.257mmol，在THF中1.0M)。1h后，添加200uL丙酮，然后添加2mL 20％罗谢尔盐。搅拌过夜后，将反应混合物吸收在50mL EtOAc中。将有机相用盐水(2x20 mL)洗涤，用Na2SO4干燥，分离并且在减压下蒸发以得到(7-(丁基氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(58.5mg，0.129mmol，假定100％产率)。
LC/MS的t＝1.666min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+455.2，实测值455.4。
步骤3.向20mL小瓶中装入(7-(丁基氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.059g，0.129mmol)、MeOH(2.0mL)和NaOH(0.20mL，2.000mmol，10M)。将悬浮液在60℃下搅拌2h，然后将其蒸发至干。添加6.0mL水并且添加4.0M HCl以中和溶液。然后将反应混合物吸收在50mL EtOAc中。将有机相用盐水(2x 30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且蒸发以得到(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(0.051g，0.129mmol，假定100％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.551min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+397.2，实测值397.4。
步骤4.在5℃(冰浴)下向20mL小瓶中装入(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(51.0mg，0.129mmol)、DCM(3.0mL)和SOCl2(100μl，1.370mmol)。10min后，将反应混合物加温至室温并且搅拌1h，然后将其蒸发至干。在室温下向残余物中添加2.0mL DMF、四氢-2H-吡喃-4-胺(13.05mg，0.129mmol)和DIPEA(112μl，0.643mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后将其通过反相色谱法(C18，在水中的5％-95％乙腈，0.1％TFA作为两种溶剂中的改性剂)纯化以得到N7-丁基-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-3-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(60.0mg，0.125mmol，97％产率)。LC/MS的t＝1.454min(方法4)，MS(ESI)计算值[M-H]478.3，实测值478.3。
步骤5.在室温下向氮气冲洗的小瓶中装入20.0mg 10％Pd/C(约50％水)、N7-丁基-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-3-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(20.0mg，0.042mmol)和5.0MeOH。将烧瓶抽空并且用氢气(3x)重新填充。然后将反应混合物在氢气气囊下在室温下搅拌。1h后，将小瓶抽空并且用氮气(3x)冲洗。然后将反应混合物过滤。将溶剂在减压下从滤液中蒸发。将蒸发后的残余物通过制备型HPLC纯化以得到化合物123(9.4mg，0.020mmol，46.8％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在15％B下保持0分钟，经20分钟15％-55％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为9.4mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98％。
实施例6–化合物121和化合物124
Figure BDA0003810902030000321
Figure BDA0003810902030000331
步骤1.向微波小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(155.1mg，0.273mmol)、1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(ii)二氯甲烷复合物(22.28mg，0.027mmol)、二噁烷(3.6mL)、2,5-二氢呋喃-3-硼酸频哪醇酯(53.5mg，0.273mmol)和Na2CO3(1.228mL，2.456mmol)。将反应混合物在100℃下微波处理1h并且然后过滤。将滤液在减压下蒸发。将残余物通过色谱法(SiO2，EtOAc:己烷＝0-90％)纯化以得到4-((7-(丁基氨基)-3-(2,5-二氢呋喃-3-基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(99.0mg，0.194mmol，71.1％产率)。
LC/MS的t＝1.777min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+511.2，实测值511.4。
步骤2.在5℃下向20mL小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-3-(2,5-二氢呋喃-3-基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(98.0mg，0.192mmol)、3mL THF和LiAlH4(0.384mL，0.384mmol，在THF中1.0M)。1h后，添加200uL丙酮并且然后添加2mL 20％罗谢尔盐。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后将其吸收在50mL EtOAc中。将有机相用盐水(2x 30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下蒸发以得到(7-(丁基氨基)-3-(2,5-二氢呋喃-3-基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(93mg，0.192mmol，假定100％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.537min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+483.2，实测值483.4。
步骤3.向20mL小瓶中装入(7-(丁基氨基)-3-(2,5-二氢呋喃-3-基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.093g，0.192mmol)、NaOH(0.20mL，2.000mmol，10.0M)和MeOH(2.0mL)。将悬浮液在60℃下搅拌2h后，添加更多的MeOH(2mL)和NaOH(0.20mL，2.0mmol，10.0M NaOH)。将反应混合物在60℃下搅拌另外的一小时，然后将其冷却并且用1％HCl中和。然后将反应混合物吸收在50mL EtOAc中。将有机相用盐水(2x 30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且蒸发以得到(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-(2,5-二氢呋喃-3-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(0.082g，0.192mmol，假定100％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.442min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+425.2，实测值425.4。
步骤4.在5℃(冰浴)下向20mL小瓶中装入(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-(2,5-二氢呋喃-3-基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(82mg，0.192mmol)、3mL DCM和SOCl2(28.0μl，0.384mmol)。20min后，将反应混合物蒸发至干。向残余物中添加2.0mL DMF、四氢-2H-吡喃-4-胺(97mg，0.960mmol)和DIPEA(168μl，0.960mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后将其通过色谱法(C18，乙腈:水＝0-100％，在两种溶剂中0.1％TFA)纯化以得到化合物121(68.0mg，0.134mmol，69.8％产率)。将20mg的材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；梯度：在0％B下保持0分钟，经20分钟0-40％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为14.0mg；通过LCMS分析估计的纯度为100％。
步骤5.在室温下向氮气冲洗的小瓶中装入20.0mg 10％Pd/C(约50％水)、N7-丁基-3-(2,5-二氢呋喃-3-基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(22.0mg，0.043mmol)和5.0mL MeOH。将小瓶抽空并且用氢气(3x)重新填充。将反应混合物在氢气气囊下在室温下搅拌过夜。然后将烧瓶抽空并且用氮气(3x)重新填充。将悬浮液过滤并且将滤液在减压下蒸发至干。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到化合物124(14.3mg，0.028mmol，64.7％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在10％B下保持0分钟，经20分钟10％-50％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为14.3mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为97％。
实施例7-化合物122
Figure BDA0003810902030000341
步骤1.向20mL微波小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(255.2mg，0.449mmol)、[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(32.9mg，0.045mmol)、二噁烷(8mL)、乙烯基硼酸频哪醇酯(135mg，0.880mmol)和Na2CO3(2.021mL，4.04mmol，在水中2.0M)。将混合物在100℃下微波处理1h。将反应混合物吸收在100mL EtOAc中。将有机相用10％柠檬酸(2x 30mL)和盐水(30mL)洗涤。然后将其用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下蒸发。将残余物通过色谱法(C18，乙腈:水＝0-100％，0.1％TFA在两种溶剂中作为改性剂)纯化以得到4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(137.0mg，0.292mmol，65.1％产率)。
LC/MS的t＝1.818min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+469.2，实测值469.2。
步骤2.在5℃下向20mL小瓶中装入4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(130.1mg，0.278mmol)、5.0mL THF和LiAlH4(555μl，0.555mmol，在THF中1.0M)。1h后，添加0.5mL丙酮，然后添加2mL20％罗谢尔盐。将反应混合物在室温下搅拌过夜并且吸收在100mL EtOAc中。将有机相用盐水(3x30 mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下蒸发以得到(7-(丁基氨基)-3-乙基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(101.2mg，0.229mmol，82％产率)，不经进一步纯化使用。
LC/MS的t＝1.570min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+443.5，实测值443.4。
步骤3.向20mL小瓶中装入(7-(丁基氨基)-3-乙基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(101.2mg，0.229mmol)、2.0mL MeOH和NaOH(0.20mL，2.000mmol，10.0M)。将反应混合物在60℃下搅拌3h，然后将其冷却并且用1％HCl中和。将反应混合物吸收在100mL EtOAc中。将有机相用盐水(2x 30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且蒸发以得到(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-乙基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(88mg，0.229mmol，100％产率)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
LC/MS的t＝1.454min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+385.2，实测值385.4。
步骤4.在5℃(冰浴)下向20mL小瓶中装入(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-乙基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(44.2mg，0.115mmol)、3.0mL DCM和SOCl2(16.79μl，0.230mmol)。0.5h后，将反应混合物蒸发至干。向残余物中添加2.0mLDMF、四氢-2H-吡喃-4-胺(11.63mg，0.115mmol)和DIPEA(100μl，0.575mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌2h，然后将其冷却并且吸收在100mL EtOAc中。将有机相用饱和NH4OAc(2x30mL)、盐水(30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且在减压下蒸发。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到化合物122(12.5mg，0.027mmol，23.24％产率)。制备型LC/MS条件：柱：XBridgeC18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在10％B下保持0分钟，经20分钟10％-50％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。产物的产量为12.5mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为90％。
实施例8-化合物101
Figure BDA0003810902030000351
步骤1.在室温下将(7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(1500mg，5.68mmol)悬浮于DMF(28.4mL)中。一次性添加N-溴代琥珀酰亚胺(1212mg，6.81mmol)并且将反应在室温下搅拌90分钟。使反应混合物在CH2Cl2与半饱和NaHCO3溶液之间分配。将有机相分离并且用2个另外部分的半饱和NaHCO3、10％LiCl溶液(1X)洗涤，并且经Na2SO4干燥。将粗产物浓缩到CELITETM上并且通过柱色谱法(120g SiO2，0至8％MeOH-CH2Cl2)纯化，以得到(3-溴-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(1.76g，90％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.89(br s,1H),9.82(br s,1H),7.59(br s,1H),3.67-3.60(m,3H),3.60-3.46(m,2H),1.72-1.56(m,2H),1.40(dq,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.94(br t,J＝7.4Hz,3H)。
LC/MS(M+H)343.1/345.1；LC RT＝0.62min(方法A)。
步骤2.在室温下将(3-溴-7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(1.76g，5.13mmol)和Cs2CO3(4.18g，12.82mmol)悬浮在DMF中。添加4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.329g，5.13mmol)并且将反应在室温下搅拌。90min后，将反应混合物用EtOAc(150mL)稀释并且通过CELITETM过滤。将有机层用H2O(2x)、10％LiCl溶液(1x)和盐水(1x)洗涤。将有机相经MgSO4干燥并且浓缩。将含有N1和N2异构体的混合物的粗产物通过柱色谱法(120g SiO2，10％至100％EtOAc-己烷梯度洗脱)纯化。将N1异构体通过反相色谱法(C18 100g Gold，10％至90％的含0.05％TFA的CH3OH-H2O)进一步纯化。将含有产物的级分浓缩直到去除所有的挥发物。将剩余的水溶液用饱和NaHCO3溶液变碱性并且用CH2Cl2(3x)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，并且浓缩以得到分析纯的4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.88(s,1H),7.59-7.46(m,2H),7.33(br t,J＝5.4Hz,1H),6.79(d,J＝7.9Hz,1H),5.86-5.72(m,2H),3.85(d,J＝4.9Hz,6H),3.63(s,3H),3.52(q,J＝6.7Hz,2H),1.55(quin,J＝7.2Hz,2H),1.21(sxt,J＝7.4Hz,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
LC/MS(M+H)521.0/523.0；LC RT＝0.82min(方法A)。
步骤3.在室温下将4-((3-溴-7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(180mg，0.345mmol)溶解于THF(1151μl)中。经由缓慢添加来逐滴添加LiAlH4(在THF中1M)(690μl，0.690mmol)。半途通过氰化物添加以帮助搅拌，将另外1mL的THF添加到反应混合物中。20分钟后，将反应用MeOH和饱和罗谢尔盐淬灭。添加EtOAc并且将双相混合物搅拌2h直到各层明晰。取出有机相并且将水相用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机物经Na2SO4干燥并且浓缩以得到(3-溴-7-(丁基氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(133mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.85(s,1H),7.28(t,J＝5.5Hz,1H),6.99(s,1H),6.86-6.81(m,1H),6.79-6.74(m,1H),5.67(s,2H),5.19(t,J＝5.7Hz,1H),4.47(d,J＝5.7Hz,2H),3.76(s,3H),3.63(s,3H),3.58-3.50(m,2H),1.58(sxt,J＝7.4Hz,2H),1.33-1.21(m,2H),0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。
LC/MS(M+H)493.0/495.0；LC RT＝0.73min方法A)。
步骤4.在室温下将(3-溴-7-(丁基氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(113mg，0.229mmol)溶解于THF(2290μl)中。添加SOCl2(84μl，1.145mmol)并且在室温下反应30min。在真空中浓缩并且干燥得到(3-溴-7-(丁基氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(117mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.23(br s,1H),7.71-7.56(m,1H),7.12(d,J＝1.3Hz,1H),6.97(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),6.80(d,J＝7.7Hz,1H),5.71(s,2H),4.73(s,2H),3.78(s,3H),3.67(s,3H),3.55(q,J＝6.8Hz,2H),1.59(quin,J＝7.4Hz,2H),1.33-1.18(m,2H),0.92-0.84(m,3H)。
LC/MS(M+H)511.0/513.0；LC RT＝0.86min(方法A)。
步骤5.在室温下将(3-溴-7-(丁基氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(115mg，0.225mmol)溶解于DMF中。添加四氢-2H-吡喃-4-胺(46.5μl，0.449mmol)并且将反应在室温下搅拌。4h后，添加另外当量的四氢-2H-吡喃-4-胺(46.5μl，0.449mmol)并且将反应搅拌另外的3h。使反应混合物在EtOAc与半饱和碳酸氢盐溶液之间分配。将水相萃取到EtOAc(3x)中并且将合并的有机物用10％LiCl溶液、盐水洗涤并且然后经Na2SO4干燥。浓缩得到(3-溴-7-(丁基氨基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(96mg)，将其不经进一步纯化使用。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.85(s,1H),7.27(br t,J＝5.6Hz,1H),7.03(s,1H),6.85(br d,J＝7.6Hz,1H),6.72(d,J＝7.5Hz,1H),5.66(s,2H),3.85-3.74(m,5H),3.72-3.67(m,2H),3.63(s,3H),3.58-3.48(m,2H),3.29-3.18(m,2H),1.75(br d,J＝13.0Hz,2H),1.65-1.51(m,3H),1.33-1.22(m,4H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H)。
LC/MS(M+H)576.1/578.0；LC RT＝0.62min(方法A)。
步骤6.将NaOH(10M溶液)(13.88μl，0.139mmol)添加到(3-溴-7-(丁基氨基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(16mg，0.028mmol)在二噁烷(278μL)中的搅拌溶液中。将反应混合物加热至80℃。6h后，将反应混合物冷却至室温，用乙酸(7.94μl，0.139mmol)中和并且浓缩。将粗产物重新溶解于DMF中，通过PTFE玻璃料过滤并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在13％B下保持0分钟，经20分钟13％-53％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到化合物101(3.2mg)。
类似地制备化合物111。
实施例9-化合物102
Figure BDA0003810902030000371
步骤1.在室温下将(3-溴-7-(丁基氨基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(694μl，0.069mmol)溶解于二噁烷(694μL)中。添加环丙基硼酸(7.15mg，0.083mmol)和2M K3PO4(69.4μl，0.139mmol)水溶液。将反应混合物用N2喷雾3min。引入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(5.7mg，6.94μM)并且将N2鼓泡通过另外的2min。将反应小瓶密封并且在微波炉中加热至120℃保持45min。观察到部分反应。冷却至室温后，将反应混合物用EtOAc稀释，通过PTFE玻璃料过滤并且浓缩。使残余物再次经受除了在100℃下搅拌过夜之外的反应条件。冷却至室温后，将反应混合物用EtOAc稀释，通过PTFE玻璃料过滤并且浓缩。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10-mMNH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含10-mM NH4OAc)；梯度：在15％B下保持0分钟，经20分钟15％-55％B，然后在100％B下保持4-min；流速：20mL/min；柱温：25℃。将根据MS信号的含有所希望产物的级分合并并且，经由离心蒸发干燥，以得到化合物102(3.4mg)。
实施例10-化合物112
Figure BDA0003810902030000381
步骤1.在室温下将(3-溴-7-(丁基氨基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(30mg，0.052mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶(32.0mg，0.156mmol)悬浮于二噁烷(520μl)中。将氮气鼓泡通过反应混合物3min。添加K3PO4溶液(2M，26.0μl，0.052mmol)，然后添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(4.25mg，5.20μmol)。将氮气鼓泡通过反应混合物另外的2min。将反应小瓶密封并且加热至100℃持续16h。将反应混合物冷却至室温，用EtOAc稀释，通过PTFE玻璃料过滤并且浓缩。将残余物重新溶解于DMF中，添加NaOH溶液(10M，26.0μl，0.260mmol)。将反应混合物加热至100℃保持1h，用AcOH(14.90μl，0.260mmol)中和，用另外0.5mL的DMF稀释，并且通过PTFE玻璃料过滤。将粗残余物用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％TFA；梯度：在0％B下保持3分钟，经28分钟0-30％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到呈其TFA盐的化合物112(4.7mg)。
类似地制备化合物113、化合物114和化合物116。
实施例11-化合物126
Figure BDA0003810902030000382
步骤1.将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯，AcOH(1500mg，3.25mmol)和THF(100ml)的溶液冷却至0℃并且用LiAlH4(1M THF，6.50mL，6.50mmol)处理，经20min分4部分添加。添加另外部分的LiAlH4(1M THF，2mL，2.000mmol)。将反应用20％酒石酸钠钾水溶液(100mL)淬灭并且搅拌16h。添加饱和NaCl水溶液(100mL)并且将反应用EtOAc(3x 200mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并且浓缩。柱色谱法(80g SiO2，0至20％MeOH-CH2Cl2，梯度洗脱)得到(7-羟基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(873mg)。
LC/MS(M+H)374.1；LC RT＝1.16min(方法C)。
步骤2.在室温下将(7-羟基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(183.0mg，0.490mmol)溶解于DMSO(2451μl)中，并且添加到含有(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺，HCl(250mg，0.637mmol)和BOP(325mg，0.735mmol)的反应小瓶中。添加DBU(222μl，1.470mmol)并且将反应混合物加热至50℃保持16h。将NaOH(10M，735μl，7.35mmol)添加到反应中并且将温度升至70℃持续16h。冷却至室温后，将反应混合物通过柱色谱法(100g C18 Gold柱，含0.1％TFA的10％至90％MeOH-H2O)直接纯化以得到呈粘稠棕褐色固体的(S)-(7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(120.0mg)。
LC/MS(M+H)473.4；LC RT＝0.73min(方法A)。
步骤3.在室温下将(S)-(7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(120mg，0.254mmol)悬浮于二噁烷(1270μl)中。添加NaOH(10M，127μl，1.270mmol)，并且将反应加热至70℃保持12h并且冷却至室温。添加AcOH(73μL，1.270mmol)并且将20％的反应混合物取出并且浓缩。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在7％B下保持0分钟，经25分钟7％-47％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到化合物126(8.5mg)。
实施例12-化合物127
Figure BDA0003810902030000391
步骤1.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(1.65g，4.95mmol)溶解于CHCl3(49.5ml)中并且冷却至0℃。将NBS(0.925g，5.20mmol)一次性添加至反应混合物中。15分钟后，将反应用CHCl3稀释并且与10％硫代硫酸钠水溶液一起剧烈搅拌10分钟。将有机相分离，用H2O洗涤，经MgSO4干燥并且浓缩。将粗产物通过柱色谱法(80g SiO2，0至50％EtOAc-己烷梯度洗脱)纯化以得到呈白色固体的4-氨基-3-溴-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(1.32g)。
LC/MS(M+H)412.2/414.2；LC RT＝1.02min(方法A)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.61-7.41(m,2H),6.55(d,J＝8.3Hz,1H),5.56(s,2H),5.02(s,2H),4.20(q,J＝7.1Hz,2H),3.90(s,3H),3.85(s,3H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H)。
步骤2.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(741.2mg，67.1％产率)、K2CO3(1.098g，7.94mmol)和2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三硼杂六环(TMB，在THF中3.5M；1.816ml，6.36mmol)悬浮于二噁烷(26.5ml):水(5.30ml)(5:1)中。将N2流鼓泡通过反应混合物持续5min之后添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(0.052g，0.064mmol)，并且继续另外的4min，然后将反应容器密封并且加热至90℃。3h后，添加另外部分的TMB(在THF中3.5M；0.908ml，3.18mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(0.052g，0.064mmol)，并且将反应混合物在100℃下搅拌16小时。将冷却的反应混合物用100mL的EtOAc稀释并且通过CELITETM过滤，用另外的EtOAc洗涤。将粗产物浓缩到4gCELITETM上。柱色谱法(80g SiO2，0至30％EtOAc-CH2Cl2梯度洗脱)得到呈奶油色固体的预期产物，4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(741mg)。
LC/MS(M+H)348.2；LC RT＝0.89min(方法A)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.49(d,J＝1.5Hz,1H),7.46(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),6.40(d,J＝7.8Hz,1H),5.48(s,2H),4.94-4.86(m,2H),4.14(q,J＝7.0Hz,2H),3.90(s,3H),3.84(s,3H),2.10(s,3H),1.15-1.08(m,3H)。
步骤3.将4-氨基-1-(2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苄基)-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(742mg，2.136mmol)悬浮于MeOH(10.800mL)中，并且在剧烈搅拌的情况下加热以使其固化。添加1,3-双-(甲氧基羰基)-2-甲基-2-硫代异脲(661mg，3.20mmol)，然后添加AcOH(0.611mL，10.68mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。添加另外部分的AcOH(0.049mL，0.854mmol)，然后在室温下搅拌另外的72h，然后添加NaOMe(在MeOH中25％wt，5.69mL，25.6mmol)。搅拌3h后，将反应混合物用AcOH重新酸化。将产物通过过滤收集，风干10分钟并且在化学干燥烘箱中彻底干燥，以得到呈奶油色固体的4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(722.0mg)。
LC/MS(M+H)402.3；LC RT＝0.86min(方法A)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.58-11.17(m,2H),7.51(d,J＝1.4Hz,1H),7.49-7.42(m,1H),6.67(d,J＝7.9Hz,1H),5.67(s,2H),3.90(s,3H),3.84(s,3H),3.71(s,3H),2.31(s,3H)。
步骤4.在室温下将4-((7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(300mg，0.747mmol)、(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺，HCl(381mg，0.972mmol)和BOP(496mg，1.121mmol)悬浮于DMF(3737μL)中。添加DBU(4当量)(451μl，2.99mmol)后，反应混合物变得均匀并且将其加热至40℃。15min后，添加另外部分的DBU(2当量)(225μl，1.495mmol)，并且将反应在40℃下搅拌16h。添加(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺，HCl(381mg，0.972mmol)、BOP(496mg，1.121)和DBU(4当量)(451μl，2.99mmol)，并且将反应搅拌另外的48h。将反应混合物用EtOAc稀释并且用H2O(2x)和10％LiCl溶液(1x)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并且浓缩。将粗产物通过柱色谱法(24g SiO2，0至80％EtOAc-己烷梯度洗脱)纯化，然后进一步纯化(12gSiO2，0至70％EtOAc-己烷梯度洗脱)，以提供(S)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(270.6mg)。LC/MS(M+H)739.7；LC RT＝1.04min(方法A)。
步骤5.在室温下将(S)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(270mg，0.365mmol)溶解于THF(3654μl)中。经5分钟逐滴添加LiAlH4(731μl，0.731mmol)并且在室温下将反应混合物搅拌15min。将反应用MeOH和罗谢尔盐淬灭。添加EtOAc并且将反应混合物搅拌3h，直到各层明晰。取出有机相并且将水层用三个另外部分的EtOAc萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。柱色谱法(12g SiO2，0至100％EtOAc-己烷梯度洗脱，然后0至20％MeOH-CH2Cl2)提供预期的材料，(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(61.7mg)。
LC/MS(M+H)711.4；LC RT＝1.08min(方法A)。
步骤6.在室温下将(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(60mg，0.084mmol)溶解于CH2Cl2(844μl)中。添加SOCl2(30.8μL，0.422mmol)并且反应小时。浓缩得到预期产物，(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(56.6mg)。
LC/MS(M+H)729.3；LC RT＝1.18min(方法A)。
步骤7.在室温下将(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(54mg，0.074mmol)溶解于乙腈(740μl)中。添加四氢-2H-吡喃-4-胺(22.47mg，0.222mmol)。将反应混合物在80℃下加热3h并且允许冷却过夜至室温。添加另外部分的四氢-2H-吡喃-4-胺(5mg，0.056mmol)，然后在80℃下重新加热2h。将反应混合物浓缩，并且将残余物重新溶解于二噁烷:MeOH:10M NaOH(6:2:2，1mL)中并且在80℃下搅拌。添加AcOH(130μL)，并且将反应在真空中浓缩。将残余物溶解于EtOAc中并且用NaHCO3溶液(50％水溶液)洗涤。将水层萃取到EtOAc(3x)中。将合并的有机相经Na2SO4干燥并且重新浓缩以提供(S)-N7-(1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(25.3mg)。
LC/MS(M+H)736.4；LC RT＝1.03min(方法A)。
步骤8.在室温下将(S)-N7-(1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)-1-(2-甲氧基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(25.3mg，0.034mmol)溶解于DMF中。添加三乙胺三氢氟酸盐(TREAT-HF，16.79μL，0.103mmol)，然后在室温下搅拌5h。将反应用NaOH(1N)淬灭，通过在PTFE玻璃料下稀释并且用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在5％B下保持0分钟，经20分钟5％-45％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以提供呈单乙酸酯的化合物127(8.2mg)。
类似地制备以下化合物：化合物128、化合物129和化合物130。
实施例13-化合物125
Figure BDA0003810902030000421
步骤1.向(7-羟基-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(426mg，1.141mmol)在THF(10mL)中的溶液中添加SOCl2(0.167mL，2.282mmol)。30min后，将反应混合物浓缩并且在高真空下干燥。然后将粗残余物用DMF(2mL)稀释并且添加2-(哌嗪-1-基)乙-1-醇(743mg，5.70mmol)。加热至80℃持续30分钟后，将反应混合物冷却至室温并且在乙酸乙酯(50mL)与LiCl 10％水溶液(25mL)之间分配。分离各相并且将水相用乙酸乙酯(2x50 mL)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过色谱法(SiO2，MeOH:DCM＝0-30％)纯化以得到(7-羟基-1-(4-((4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(255.0mg，0.52mmol，46％产率)。
步骤2.将(7-羟基-1-(4-((4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(25mg，0.051mmol)、(S)-2-氨基戊-1-醇(21.25mg，0.206mmol)、BOP(34.2mg，0.077mmol)和DBU(0.016ml，0.103mmol)在二噁烷(2mL)中的溶液在室温下搅拌16h。添加NaOH 10M(0.1ml，1.000mmol)并且加热至80℃。一小时后添加乙酸(0.1ml)并且在减压下蒸发溶剂。将残余物用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在3％B下保持0分钟，经20分钟3％-43％B,然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。化合物125的产量是13.9mg，并且它通过LCMS分析估计的纯度是100％。使用分析型LC/MS确定最终纯度。
实施例14-化合物117
Figure BDA0003810902030000422
Figure BDA0003810902030000431
步骤1：在配备有磁力搅拌棒的8mL小瓶中，将(7-(丁基氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.5g，1.892mmol)和磷酸氢二钾(0.983g，5.64mmol)悬浮于干乙腈(5mL)中并且充分搅拌。将混合物通过将N2气体鼓泡通过反应进行脱气。添加三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II)复合物(0.11g，0.094mmol)，并且将反应用N2吹扫另外的10min。添加三氟甲烷磺酰氯(0.199ml，1.882mmol)，并且然后将反应盖紧并且用石蜡膜(Parafilm)密封。将反应混合物在搅拌的情况下使用27W蓝色LED灯辐照1周。将反应用水淬灭并且用CH2Cl2(3x 10mL)萃取。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并且浓缩。将粗产物用以下条件经由基于质量的制备型HPLC纯化：柱：Sunfire C18，150mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：在水中的10mM NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:MeOH(1:1)；梯度：在10％B下保持0分钟，经2分钟10％至40％B，然后经28分钟40％至75％B；流速：19mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集并且将含有产物的级分浓缩以得到呈灰白色固体的(7-(丁基氨基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(130mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.4(br s,1H),9.86(s,1H),7.70(s,1H),3.65(s,3H),3.56(m,2H),1.63(m,2H),1.38(m,2H),0.96(t,J＝7.2Hz,3H)。
LC/MS[M+H]+333.2；LC RT＝1.915min(柱：Kinetex XB-C18 3x 75mm；2.6μ；流动相A：在H2O中的10mM NH4OAc:乙腈(98:2))；流动相B：在H2O中的10mM NH4OAc:乙腈(2:98)；梯度：经4.0min20％-100％B，然后在100％B下保持0.60min；流速：1.0mL/min。检测：MS和UV(220nm)。
步骤2：在室温下将(7-(丁基氨基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(120mg，0.361mmol)和Cs2CO3(129mg，0.397mmol)悬浮于DMF(1806μl)中，并且用4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(89mg，0.343mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌过夜并且在EtOAc与H2O之间分配。分离有机层并且将水层用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机相用10％LiCl溶液和盐水洗涤并且经Na2SO4干燥。柱色谱法(12g SiO2，10％至100％EtOAc-己烷梯度洗脱)得到作为N1和N2异构体的混合物的粗产物。将异构体经由反相纯化(15.5gC18 Gold，10％至90％MeOH-H2O(含0.05％TFA)，梯度洗脱)分离。将含有产物峰的级分部分地浓缩以去除MeOH。将残余水溶液用饱和NaHCO3溶液处理并且用CH2Cl2(3x)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，浓缩并且在真空下干燥以得到4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(52.4mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.92(s,1H),7.54-7.48(m,2H),7.40(br t,J＝5.4Hz,1H),6.85(d,J＝8.3Hz,1H),5.87(s,2H),3.84(d,J＝1.1Hz,6H),3.62(s,3H),3.52(q,J＝6.6Hz,2H),1.55(quin,J＝7.2Hz,2H),1.20(dq,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.83(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤3：在室温下将4-((7-(丁基氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(52mg，0.102mmol)悬浮于THF中并且搅拌直到溶解。逐滴缓慢添加LiAlH4(204μL，0.204mmol)。将反应进行声处理并且在室温下搅拌10min，然后用2滴MeOH淬灭。将反应混合物用EtOAc和罗谢尔盐稀释并且在室温下搅拌90min。分离有机相并且将水相用EtOAc(3X)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥并且浓缩。将粗(7-(丁基氨基)-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯在真空中进一步干燥(38mg)。将粗材料溶解于THF中并且用SOCl2(37μL，0.05mmol)处理。将反应混合物搅拌2.5h，浓缩并且与乙腈(1x)共沸以得到(7-(丁基氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(41mg)。
LC/MS[M+H]+501.0。LC RT＝0.89min(方法A)。
步骤4：在室温下将(7-(丁基氨基)-1-(4-(氯甲基)-2-甲氧基苄基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(41mg，0.082mmol)溶解于DMF(409μl)中并且用四氢-2H-吡喃-4-胺(33.9μl，0.327mmol)处理。将反应在室温下搅拌过夜。添加10MNaOH水溶液(41μL)并且将反应加热至80℃持续1h。将含有粗产物的冷却的反应混合物用AcOH(23μL)处理，用DMF(1mL)稀释并且通过PTFE玻璃料过滤。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；梯度：在6％B下保持0分钟，经20分钟6％-56％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在18％B下保持0分钟，经20分钟18％-58％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到化合物117(1.4mg)。
实施例15-化合物131
Figure BDA0003810902030000441
步骤1.将5-甲氧基-6-甲基烟酸甲酯(993.5mg，5.48mmol，可从Enamine商购获得)、NBS(1074.0mg，6.03mmol)和AIBN(180.0mg，1.10mmol)在20mL CCl4中的悬浮液在65℃下搅拌6h。然后将溶液冷却并且在减压下蒸发。将最终残余物通过色谱法(SiO2，EtOAc:己烷＝0-20％)纯化以得到呈粉色固体的6-(溴甲基)-5-甲氧基烟酸甲酯(917.0mg，3.53mmol，64.3％产率)。
LC/MS的t＝1.614min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+260.0，实测值260.2。
步骤2.在室温下向100mL烧瓶中装入(7-(丁基氨基)-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(参见上文实施例1；1447mg，3.71mmol)、Cs2CO3(2416mg，7.41mmol)和DMF(24mL)以形成悬浮液。添加作为DMF(6mL)溶液的6-(溴甲基)-5-甲氧基烟酸甲酯(916.0mg，3.52mmol)。20min后，添加100mL 20％氯化铵和200mL EtOAc。在后处理期间，白色固体沉淀出来并且通过过滤收集以得到呈白色固体的6-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸甲酯(1.70g，2.99mmol，81％产率)。
LC/MS的t＝1.738min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+570.1，实测值570.0。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.77(s,1H),8.47(d,J＝1.7Hz,1H),7.84(d,J＝1.7Hz,1H),7.55(t,J＝5.6Hz,1H),5.95(s,2H),3.98(s,3H),3.87(s,3H),3.63(s,3H),3.48(q,J＝6.6Hz,2H),1.53(m,2H),1.27–1.13(m,2H),0.83(t,J＝7.4Hz,3H)。
步骤3.在室温下向10mL微波小瓶中装入6-((7-(丁基氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸甲酯(320.7mg，0.563mmol)、K2CO3(389.0mg，2.82mmol)、二噁烷(3mL)和H2O(0.3mL)。将氮气鼓泡通过悬浮液10min，然后添加[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(41.2mg，0.056mmol)。将混合物在120℃下微波处理1h并且由8mL MeOH和2mL NaOH(10M)吸收。然后将混合物在70℃下搅拌1h，然后将其冷却下来并且过滤。将沉淀物用更多的MeOH洗涤并且将滤液蒸发。将最终残余物通过色谱法(C18，乙腈:水＝0-100％，在两种洗脱液中均含10mM NH4OAc)纯化以得到6-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸(130mg，0.338mmol，60％产率)。
LC/MS的t＝1.683min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+458.2，实测值458.2。
步骤4.向100mL烧瓶中装入6-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸(96.0mg，0.249mmol)和THF(5mL)以形成悬浮液。在5℃(冰浴)下添加LiAlH4(在THF中2M)(0.374mL，0.747mmol)。1h后，添加更多的LiAlH4(0.374mL，0.747mmol)。另外的1h后，添加3mL 20％罗谢尔盐。还添加100mL MeOH。将混合物在室温下搅拌过周末。将MeOH蒸发掉并且添加3mL DMSO。将混合物通过色谱法(C18，乙腈:水＝0-100％，两种洗脱液中均含0.1％TFA)纯化以得到40.0mg产物(约50％纯度)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。LC/MS的t＝1.321min(方法3)，MS(ESI)计算值[M+H]+372.2，实测值372.1。
步骤5.向4mL小瓶中装入(6-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基吡啶-3-基)甲醇(40mg，0.05mmol，约50％纯度)和二噁烷(1mL)以形成悬浮液(在此浓度下存在一点溶解度问题)。在5℃(冰浴)下添加SOCl2(0.039mL，0.538mmol)。在5min内将温度升至室温。30min后，将混合物蒸发并且将残余物溶解于1mLDMF中。添加2-(哌嗪-1-基)乙-1-醇(0.050mL，0.390mmol)和Hunig碱(0.030mL，0.172mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后将其蒸发掉并且将残余物通过色谱法(柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在5％B下保持0分钟，经20分钟5％-45％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃)纯化。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥以得到化合物131(9.4mg，0.019mmol，36％产率)。
实施例16-化合物132
Figure BDA0003810902030000451
Figure BDA0003810902030000461
步骤1.向在DMF(15mL)中的(3-氟-7-羟基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(1g，4.40mmol)中添加Cs2CO3(4.30g，13.21mmol)，并且将混合物在0℃(冰浴)下搅拌10min。添加4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.2g，4.63mmol)，并且30min后去除冰浴。将反应混合物在25℃下搅拌12h。将反应混合物用300mL水稀释；用EtOAc萃取，并且经Na2SO4干燥。去除溶剂以得到4-((3-氟-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.78g，4.39mmol，100％产率)。将材料不经纯化使用。
步骤2.将4-((3-氟-7-羟基-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(.93g，2.294mmol)在DMSO(10mL)中的混合物用(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺(2.5g，7.03mmol)、2,3,4,6,7,8,9,10-八氢嘧啶并[1,2-a]氮杂卓(DBU，1.5ml，9.95mmol)处理，然后用((1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(V)(BOP，2.030g，4.59mmol)处理，并且在70℃下加热2h。将反应用EtOAc稀释并且用水洗涤。将溶剂混合物经Na2SO4干燥并且去除溶剂。将材料在硅胶(干负载)己烷-EtOAc 0-100％上纯化以得到(S)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-氟-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.7g，2.288mmol，100％产率)。
步骤3.在0℃下在5min内向(S)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-氟-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯(1.7g，2.288mmol)在THF(20ml)中的溶液中添加二异丁基-叔丁氧基氢化铝锂溶液(LDBBA)(在THF/己烷中0.25M)(24ml，6.00mmol)，并且允许将反应在室温下保持搅拌12h(3h，98％转化)。LCMS显示100％转化。将溶液用冷水稀释并且用AcOEt萃取3次。最终，将有机层经Na2SO4干燥并且在真空下蒸发。将材料在硅胶(己烷-EtOAc0-100％)上纯化以得到(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-氟-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(300mg，0.420mmol，18.34％产率)。
步骤4.在20打兰小瓶中，在室温下将(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-氟-1-(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(280mg，0.392mmol)溶解于无水CH2Cl2(4ml)中以得到澄清溶液。将溶液冷却至0℃；添加MsCl(0.164ml，1.175mmol)和Et3N(0.164ml，1.175mmol)。3min时的LCMS显示反应完成。将反应用冰水和DCM淬灭。将DCM层用盐水(当使用盐水时乳状水层变澄清)洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩以得到(S)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-氟-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苄基甲烷磺酸酯(60mg，19.32％产率)。将材料不经纯化使用。
步骤5.向在DMF(1mL)中的(S)-4-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-氟-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苄基甲烷磺酸酯(60mg，0.076mmol)中添加(3S,4R)-4-氨基四氢呋喃-3-醇(25mg，0.242mmol)，并且将反应在25℃下搅拌12h。LC/MS确认烷基化，并且添加在1,4-二噁烷中的HCl(3mL，12.00mmol)；将混合物在25℃下搅拌2h。去除溶剂，并且LC/MS确认去除甲硅烷基保护基团。将材料用在MeOH中的NaOH(2mL，10.00mmol)稀释并且在80℃下搅拌1h。LC/MS确认所希望的材料并且去除溶剂。将材料用DMSO 4ml稀释并且过滤。将粗产物用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％TFA)；梯度：在0％B下保持0分钟，经20分钟0-40％B，然后在30 100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所希望产物的级分合并，并且经由离心蒸发干燥，以得到化合物132(13.9mg，0.028mmol，36.5％产率)。
类似地制备化合物133。
实施例17-化合物134
Figure BDA0003810902030000471
Figure BDA0003810902030000481
步骤1.向5-溴-2-甲基吡啶-3-醇(5.0g，26.6mmol)在乙腈(25.0mL)中的搅拌溶液中添加Cs2CO3(17.33g，53.2mmol)和MeI(3.33mL，53.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌90min并且然后在EtOAc与水之间分配。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到油状残余物，将其溶解于石油醚中并且过滤。将滤液在减压下浓缩以得到呈棕色油状物的5-溴-3-甲氧基-2-甲基吡啶(3.8g，16.36mmol，61.5％产率)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ＝8.16-8.06(m,1H),7.64-7.53(m,1H),3.85(s,3H),2.31(s,3H)。
LC-MS m/z 202.0[M+H]+。
步骤2.在氮气吹扫的情况下向5-溴-3-甲氧基-2-甲基吡啶(3.5g，17.32mmol)在DMF(50.0mL)和乙醇(50.0mL)的溶剂混合物中的搅拌溶液中添加TEA(7.24mL，52.0mmol)、PdCl2(dppf).CH2Cl2加合物(2.83g，3.46mmol)。在高压釜中在具有10巴压力的CO气体下在100℃下将反应混合物搅拌16h。将反应混合物在减压下浓缩以得到残余物，将其吸收在DCM中并且通过CELITETM床过滤，随后将所述床用过量DCM洗涤。然后将滤液在减压下浓缩以得到残余物。将粗产物通过ISCO Combiflash色谱法通过用在石油醚中的0-100％乙酸乙酯洗脱纯化以得到呈棕色油状物的5-甲氧基-6-甲基烟酸乙酯(2.92g，13.46mmol，78％产率)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ＝8.58-8.53(m,1H),7.68-7.63(m,1H),4.35(q,J＝7.2Hz,2H),3.90(s,3H),2.45-2.40(m,3H),1.38-1.29(m,3H)。
LC-MS m/z 196.0[M+H]+。
步骤3.向5-甲氧基-6-甲基烟酸乙酯(6.5g，33.3mmol)在CCl4(65.0mL)中的搅拌溶液中添加NBS(7.11g，40.0mmol)和AIBN(1.094g，6.66mmol)。将反应混合物在65℃下搅拌18h。将反应混合物通过CELITETM床过滤，然后将所述床用过量DCM洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到残余物。将粗产物通过ISCO Combiflash色谱法通过用在石油醚中的0-100％乙酸乙酯洗脱纯化以得到呈浅棕色固体的6-(溴甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(3.72g，13.03mmol，39.1％产率)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ＝8.64(s,1H),7.83(d,J＝1.9Hz,1H),4.69-4.65(m,2H),4.42-4.32(m,2H),4.00-3.95(m,3H),1.39-1.30(m,3H)。
LC-MS m/z 276.0[M+H]+。
步骤4.向(7-羟基-3-碘-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(5.5g，16.41mmol)在DMF(20.0mL)中的搅拌溶液中添加Cs2CO3(10.70g，32.8mmol)。将混合物冷却至0℃并且添加6-(溴甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(4.50g，16.41mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1h。添加水。将沉淀的固体过滤并且用过量水洗涤，然后用石油醚洗涤。将固体在真空下干燥以得到呈浅棕色固体的6-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(4.1g，6.60mmol，40.2％产率)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ＝11.68-11.35(m,1H),8.51-8.46(m,1H),7.98-7.93(m,1H),7.80(d,J＝1.5Hz,1H),5.90-5.84(m,2H),4.40-4.29(m,2H),3.96(s,3H),3.74-3.65(m,3H),2.89(s,3H),2.73(s,3H),1.67(s,3H),1.31(t,J＝7.2Hz,3H)。
LC-MS m/z 529.0[M+H]+。
步骤5.向6-((7-羟基-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(3.9g，7.38mmol)在DMSO(30.0mL)中的搅拌溶液中添加DBU(3.34mL，22.15mmol)、BOP(4.90g，11.07mmol)和(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-胺(2.63g，7.38mmol)。将反应混合物在45℃下搅拌2h。将混合物在EtOAc与水之间分配。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到残余物。将粗化合物通过ISCO Combiflash色谱法通过用在石油醚中的0-100％乙酸乙酯洗脱纯化以得到呈浅棕色固体的(S)-6-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(1.98g，1.921mmol，26.0％产率)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ＝9.75(s,1H),8.31-8.27(m,1H),7.82(d,J＝1.5Hz,1H),7.63-7.30(m,11H),7.29-7.13(m,4H),5.87(s,2H),4.69-4.56(m,1H),4.28(q,J＝7.2Hz,2H),3.97(s,3H),3.70-3.61(m,2H),3.58(s,3H),1.92-1.78(m,2H),1.52(q,J＝7.8Hz,2H),1.26-1.25(m,1H),1.28-1.22(m,4H),1.19(br d,J＝7.2Hz,2H),1.02-0.95(m,1H),0.91(s,9H),0.79(t,J＝7.2Hz,3H)。
LC-MS m/z 866.1[M+H]+。
步骤6.在氮气吹扫下向(S)-6-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-3-碘-5-((甲氧基羰基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(1.8g，2.079mmol)在1,4-二噁烷(15.0mL)中的搅拌溶液中添加K2CO3(0.575g，4.16mmol)、三甲基环三硼氧烷(TMB，0.522g，4.16mmol)和PdCl2(dppf).CH2Cl2加合物(0.170g，0.208mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌6h。将混合物通过CELITETM床过滤，然后将所述床用过量EtOAc洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到残余物，将其通过ISCOCombiflash色谱法通过用在石油醚中的50％-90％洗脱纯化以得到呈红色固体的(S)-6-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(0.52g，0.600mmol，28.9％产率)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ＝9.54(s,1H),8.35-8.29(m,1H),7.84-7.77(m,1H),7.55(dd,J＝1.5,7.9Hz,2H),7.50-7.45(m,2H),7.40-7.28(m,5H),7.24-7.18(m,2H),7.12(brd,J＝8.3Hz,1H),5.75(s,2H),4.60(br d,J＝7.2Hz,1H),4.29(q,J＝7.1Hz,2H),3.96(s,3H),3.72-3.63(m,2H),3.57(s,3H),2.29(s,3H),1.91-1.77(m,2H),1.61-1.46(m,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,5H),0.91(s,10H),0.84-0.76(m,3H)。
LC-MS m/z 754.3[M+H]+。
步骤7.向(S)-6-((7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-5-((甲氧基羰基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-甲氧基烟酸乙酯(0.4g，0.531mmol)在THF(7.0mL)和MeOH(3.0mL)中的搅拌溶液中添加LiBH4(在THF中2.0M)(2.65mL，5.31mmol)。将反应混合物在45℃下搅拌16h。将反应混合物用饱和氯化铵溶液淬灭并且然后在乙酸乙酯与水之间分配。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到残余物。将粗产物通过ISCO Combiflash色谱法通过用在氯仿中的5％-20％甲醇洗脱纯化以得到呈浅棕色固体的(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(羟基甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(358mg，0.357mmol，67.3％产率)。
LC-MS m/z 712.3[M+H]+。
步骤8.在0℃下向(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(羟基甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.1g，0.140mmol)在THF(3.0mL)中的搅拌溶液中添加SOCl2(0.2mL，2.74mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30min。将混合物在减压下浓缩以得到呈浅棕色固体的(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(氯甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.118g，假定100％产率)。将粗产物按原样用于下一步骤。
LC-MS m/z 730.2[M+H]+。
步骤9.向(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(氯甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.11g，0.151mmol)在乙腈(3.0mL)中的搅拌溶液中添加四氢-2H-吡喃-4-胺盐酸盐(0.031g，0.226mmol)、Na2CO3(0.048g，0.452mmol)和KI(0.025g，0.151mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌16h并且然后通过CELITETM床过滤并且用过量EtOAc洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到残余物，将其与乙醚和石油醚一起研磨。将溶剂倾析后，将残余物在真空下干燥以得到呈棕色半固体的(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((3-甲氧基-5-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(206mg，0.018mmol，12.04％产率)。
LC-MS m/z 795.4[M+H]+。
步骤10.向(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((3-甲氧基-5-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.2g，0.252mmol)在MeOH(2.0mL)中的搅拌溶液中添加浓HCl(1.0mL，1.500mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。将混合物在减压下浓缩以得到残余物，将其与乙醚和石油醚一起研磨。将溶剂倾析后，将残余物在真空下干燥以得到呈棕色固体的(S)-(7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1-((3-甲氧基-5-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(209mg，0.086mmol，34.3％产率)。
LC-MS m/z 557.4[M+H]+。
步骤11.向(S)-(7-((1-羟基己-3-基)氨基)-1-((3-甲氧基-5-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.2g，0.359mmol)在1,4-二噁烷(2.0mL)中的搅拌溶液中添加NaOH(1.0mL，0.359mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌2h并且冷却至室温。将有机层分离，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到残余物。将粗产物通过反相制备型LC/MS(柱：Waters XBridge C18，19x150mm，5-μm颗粒；流动相A：10mM NH4OAc；流动相B：乙腈；梯度：经20分钟10％-45％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：15mL/min)纯化。由MS和UV信号触发级分的收集。将含有所希望产物的级分合并并且使用Genevac装置经由离心蒸发干燥以得到化合物134(27.2mg，0.051mmol，14.07％产率)。
实施例18-化合物135
Figure BDA0003810902030000501
Figure BDA0003810902030000511
步骤1.向(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-(氯甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.25g，0.342mmol)在DMF(3.0mL)中的搅拌溶液中添加2-(哌嗪-1-基)乙-1-醇(0.089g，0.685mmol)和K2CO3(0.142g，1.027mmol)。将反应混合物在45℃下搅拌3h。将混合物通过CELITETM床过滤，随后将所述床用过量乙酸乙酯洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到呈棕色固体的(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-((4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(252mg，0.260mmol，76％产率)。
LC-MS m/z 824.4[M+H]+。
步骤2.向(S)-(7-((1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己-3-基)氨基)-1-((5-((4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(200.0mg，0.243mmol)在MeOH(2.0mL)中的搅拌溶液中添加浓HCl(在水中的1.5N HCl)(2.0mL，3.00mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物在减压下浓缩以得到残余物，将其与乙醚和石油醚一起研磨。将沉淀的固体在真空下干燥以得到(S)-(1-((5-((4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(210mg，0.201mmol，83％产率)。
LC-MS m/z 586.4[M+H]+。
步骤3.向(S)-(1-((5-((4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-7-((1-羟基己-3-基)氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(0.25g，0.427mmol)在1,4-二噁烷(2.0mL)中的搅拌溶液中添加NaOH(2.5mL，0.427mmol)。将反应混合物在70℃下搅拌2h并且冷却至室温。将有机层分离，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩以得到残余物。将残余物通过反相制备型LC/MS(柱：Waters XBridge C18，19x150mm，5-μm颗粒；流动相A：10-mM NH4OAc；流动相B：乙腈；梯度：经20分钟20％-75％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：15mL/min)纯化。由MS和UV信号触发级分的收集。将含有所希望产物的级分合并并且使用Genevac装置经由离心蒸发干燥以得到化合物135(37.0mg，0.070mmol，16.43％产率)。
实施例19-化合物137
Figure BDA0003810902030000512
将(4-((5-氨基-7-(丁基氨基)-3-甲基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(30mg，0.081mmol)在THF(1mL)中的溶液用SOCl2(0.012mL，0.162mmol)处理并且在室温下搅拌30min。将溶剂在V-10蒸发器中蒸发。将粗产物溶解于DMSO(1mL)中。将反应混合物用2-甲基-1-(哌嗪-1-基)丙-2-醇(25.6mg，0.162mmol)处理并且在70℃下加热2h。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含NH4OAc)；流动相B：95:5乙腈:水(含NH4OAc)；梯度：在14％B下保持0分钟，经20分钟14％-54％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且通过离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5-μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％TFA)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％TFA)；梯度：在0％B下保持0分钟，经20分钟0-40％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。将含有化合物137的级分(通过MS信号触发收集)合并并且经由离心蒸发干燥。
实施例20-起始材料和中间体
下文的图示出了用于制备可用作用于制备本文公开的TLR7激动剂的起始材料或中间体的化合物的方案。所述方案可以适用于制备其他类似的可以用作起始材料或中间体的化合物。所采用的试剂是本领域熟知的，并且在许多情况下，它们的使用已经在前述实施例中进行了展示。
图表1
Figure BDA0003810902030000521
图表2
Figure BDA0003810902030000522
Figure BDA0003810902030000531
图表3
Figure BDA0003810902030000532
Figure BDA0003810902030000541
生物活性
可以通过以下程序测定本文公开的作为TLR7激动剂的化合物的生物活性。
人TLR7激动剂活性测定
此程序描述了用于测定在本说明书中公开的化合物的人TLR7(hTLR7)激动剂活性的方法。
将具有人TLR7分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告转基因的工程化人胚肾蓝细胞(HEK-BlueTMTLR细胞；Invivogen)悬浮在非选择性培养基(补充有10％胎牛血清(Sigma)的DMEM高葡萄糖(Invitrogen))中。将HEK-BlueTMTLR7细胞添加到384孔组织培养板的每个孔中(15,000个细胞/孔)，并且在37℃、5％CO2下孵育16-18h。将化合物(100nl)分配到含有HEK-BlueTMTLR细胞的孔中，并且将经处理的孔在37℃、5％CO2下孵育。在处理18h后，将十微升的新鲜制备的Quanti-BlueTM试剂(Invivogen)添加到每个孔中，孵育30min(37℃，5％CO2)，并且使用Envision读板仪(OD＝620nm)测量SEAP水平。计算半数最大有效浓度值(EC50；在测定基线与最大值之间引起反应的一半的化合物浓度)。
人血液中I型干扰素基因(MX-1)和CD69的诱导
I型干扰素(IFN)MX-1基因和B细胞激活标记物CD69的诱导是在TLR7途径激活后发生的下游事件。以下是人全血测定，其测量响应于TLR7激动剂的诱导。
从人类受试者中收获肝素化的人全血，并且将其用1mM的测试TLR7激动剂化合物处理。将血液用RPMI 1640培养基稀释，并且使用Echo预加样(predot)10nL/孔，从而得到1uM的最终浓度(在10uL血液中有10nL)。在摇床上混合30秒后，将板盖住并且置于37℃室中过夜＝17h。制备固定/裂解缓冲液(在H20中5x->1x，在37℃下加温；目录号BD 558049)，并且保持perm缓冲液(在冰上)，以备后用。
对于表面标记物(CD69)染色：制备表面Ab：0.045ul hCD14-FITC(ThermoFisher目录号MHCD1401)+0.6ul hCD19-ef450(ThermoFisher目录号48-0198-42)+1.5ul hCD69-PE(目录号BD555531)+0.855ul FACS缓冲液。添加3ul/孔，1000rpm旋转1min，并且在摇床上混合30秒，置于冰上30min。在用70uL预加温的1x固定/裂解缓冲液30分钟后停止刺激，并且使用Feliex伴侣重悬(15次，对每个板更换吸头)并且在37C下孵育10分钟。
在2000rpm下离心5分钟，用HCS板清洗器抽出，在摇床上混合30秒，然后用在dPBS中的70uL洗涤并且沉淀2次(2000rpm，持续5min)，并且在FACS缓冲液中用50ul洗涤，沉淀1次(2000rpm，持续5min)。在摇床上混合30秒。对于细胞内标记物(MX-1)染色：添加50ul BDPerm缓冲液III，并且在摇床上混合30秒。在冰上孵育30分钟(在黑暗中)。用50uL FACS缓冲液洗涤2次(在perm后，在2300rpm下旋转5min)，然后在摇床上混合30秒。在20ul含有MX1抗体()(4812)-Alexa 647：Novus Biologicals#NBP2-43704AF647)20ul FACS缓冲液+0.8ulhIgG+0.04ul MX-1的FACS缓冲液中重悬。1000rpm旋转1min，在摇床上混合30秒，并且将样品在黑暗中在室温下孵育45分钟，然后用FACS缓冲液洗涤2次(在perm后，在2300rpm下旋转5min)。在20ul(每孔总计35uL)FACS缓冲液重悬，并且用箔纸覆盖，并且置于4℃下，以在第二天读数。在iQuePlus上读取板。将结果加载到工具集中，并且在curve master中生成IC50曲线。将y轴100％设置为1uM瑞喹莫德。
小鼠血液中TNF-α和I型IFN反应基因的诱导
TNF-α和I型IFN反应基因的诱导是在TLR7途径激活后发生的下游事件。以下是测量在小鼠全血中响应于TLR7激动剂的诱导的测定。
将肝素化的小鼠全血用含青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基以5:4的比率稀释(50uL全血和40uL培养基)。将90uL体积的经稀释的血液转移到Falcon平底96孔组织培养板的孔中，并且将板在4℃下孵育1h。将100％DMSO储备溶液中的测试化合物在相同培养基中稀释20倍用于进行浓度反应测定，然后将10uL经稀释的测试化合物添加到孔中，使得最终DMSO浓度为0.5％。对照孔接受10uL含有5％DMSO的培养基。然后将板在37℃下在5％CO2培养箱中孵育17h。在孵育后，将100uL培养基添加到每个孔中。将板离心，并且取出130uL上清液用于通过ELISA(Invitrogen，目录号88-7324，Thermo-Fisher Scientific)测定TNFa的产生。将来自Invitrogen mRNA Catcher Plus试剂盒(目录号K1570-02)的70uL体积的含DTT的mRNA捕获裂解缓冲液(1x)添加到孔中剩余的70uL样品中，并且通过上下移液5次进行混合。然后在室温下将板摇动5-10min，然后向每个孔中添加2uL的蛋白酶K(20mg/mL)。然后将板在室温下摇动15-20min。然后将板在-80℃下储存直到进一步处理。
将冷冻样品解冻，并且根据制造商的说明书，使用Invitrogen mRNA CatcherPlus试剂盒(目录号K1570-02)提取mRNA。使用Invitrogen SuperScript IV VILO MasterMix(目录号11756500)，使用来自RNA提取的一半产率的mRNA在20μL逆转录酶反应中合成cDNA。使用来自ThermoFisher(Applied Biosystems)的QuantStudio实时PCR系统进行
Figure BDA0003810902030000551
实时PCR。使用针对小鼠IFIT1、IFIT3、MX1和PPIA基因表达的商业化预设计的TaqMan测定和TaqMan Master Mix一式两份地运行所有实时PCR反应。将PPIA用作管家基因。遵循来自制造商的建议。通过平均管家基因(Ct)归一化所有原始数据(Ct)，然后利用比较Ct(ΔΔCt)方法量化相对基因表达(RQ)用于进行实验分析。
定义
“脂族”意指直链或支链的饱和或不饱和的非芳族烃部分，其具有指定数量的碳原子(例如，如在“C3脂族”、“C1-5脂族”、“C1-C5脂族”或“C1至C5脂族”中，后三个短语与具有从1至5个碳原子的脂族部分同义)或者在未明确指定碳原子数量的情况下从1至4个碳原子(在不饱和脂族部分的情况下2至4个碳)。类似的理解适用于其他类型中的碳数量，如在C2-4烯烃、C4-C7脂环族等中。以类似的方式，诸如“(CH2)1-3”的术语应理解为对下标是1、2或3的简写，使得这样的术语代表CH2、CH2CH2、和CH2CH2CH2。
“烷基”意指饱和的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，C1-C4烷基部分包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基等。“烷二基”(有时也称为“亚烷基”)意指烷基的二价对应物，诸如
Figure BDA0003810902030000561
“烯基”意指具有至少一个碳-碳双键的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，C2-C4烯基部分包括但不限于乙烯基(ethenyl/vinyl)、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、顺式-1-丙烯基、反式-1-丙烯基、E-(或Z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基(丁-1,3-二烯基)等。
“炔基”意指具有至少一个碳-碳三键的脂族部分，其中用于指定碳原子数量的相同惯例是可适用的。通过说明的方式，C2-C4炔基包括乙炔基(ethynyl/acetylenyl)、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。
“脂环族”意指具有从1至3个环的饱和或不饱和的非芳族烃部分，每个环具有从3至8个(优选地从3至6个)碳原子。“环烷基”意指每个环是饱和的脂环族部分。“环烯基”意指至少一个环具有至少一个碳-碳双键的脂环族部分。“环炔基”意指至少一个环具有至少一个碳-碳三键的脂环族部分。通过说明的方式，脂环族部分包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基和金刚烷基。优选的脂环族部分是环烷基部分，尤其是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。“环烷二基”(有时也称为“环亚烷基”)意指环烷基的二价对应物。类似地，“二环烷二基”(或“二环亚烷基”)和“螺烷二基”(或“螺亚烷基”)是指二环烷基和螺烷基(或“螺环烷基”)的二价对应物。
“杂脂环族”意指这样的脂环族部分，其中在其至少一个环中，至多三个(优选地1至2个)碳已经被独立地选自N、O或S的杂原子替代，其中N和S任选地可以被氧化并且N任选地可以被季铵化。优选的脂环族部分由一个大小为5至6元的环组成。类似地，“杂环烷基”、“杂环烯基”和“杂环炔基”分别意指其至少一个环已经被如此修饰的环烷基、环烯基或环炔基部分。示例性杂脂环族部分包括氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、1,3-二噁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃基砜、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、1,3-二氧戊环基、四氢-1,1-二氧代噻吩基、1,4-二噁烷基、硫杂环丁烷基等。“杂环亚烷基”意指杂环烷基的二价对应物。
“烷氧基”、“芳氧基”、“烷硫基”和“芳硫基”分别意指-O(烷基)、-O(芳基)、-S(烷基)和-S(芳基)。例子分别是甲氧基、苯氧基、甲硫基和苯硫基。
除非指示较窄的含义，否则“卤素”或“卤代”意指氟、氯、溴或碘。
“芳基”意指具有单、双或三环环系统(优选地单环)的烃部分，其中每个环具有从3至7个碳原子，并且至少一个环是芳族的。环系统中的环可以彼此稠合(如在萘基中)或彼此键合(如在联苯基中)，并且可以与非芳族环稠合或键合(如在茚满基或环己基苯基中)。通过进一步说明的方式，芳基部分包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基和苊基。“亚芳基”意指芳基的二价对应物，例如1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基。
“杂芳基”意指具有单、双或三环环系统(优选地5至7元单环)的部分，其中每个环具有从3至7个碳原子，并且至少一个环是含有从1至4个独立地选自N、O或S的杂原子的芳族环，其中N和S任选地可以被氧化并且N任选地可以被季铵化。这样的至少一个含有杂原子的芳族环可以与其他类型的环稠合(如在苯并呋喃基或四氢异喹啉基中)，或者与其他类型的环直接键合(如在苯基吡啶基或2-环戊基吡啶基中)。通过进一步说明的方式，杂芳基部分包括吡咯基、呋喃基、噻吩基(thiophenyl/thienyl)、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、N-氧代吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉炔基(isoquinolynyl)、喹唑啉基、噌啉基、喹唑啉基(quinozalinyl)、萘啶基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并噻吩基、噁二唑基、噻二唑基、吩噻唑基(phenothiazolyl)、苯并咪唑基、苯并三唑基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基等。“杂亚芳基”意指杂芳基的二价对应物。
在指示部分可以被取代(诸如通过使用如在“未经取代或经取代的C1-C5烷基”或“任选经取代的杂芳基”中的短语“未经取代或经取代的”或“任选经取代的”)的情况下，这样的部分可以具有一个或多个独立选择的取代基，优选地数量为1至5、更优选地数量为1或2。考虑到取代基所附接的部分，本领域普通技术人员可以选择取代基和取代模式，以提供化学稳定的并且可以通过本领域已知的技术以及本文列出的方法合成的化合物。在部分被鉴定为“未经取代或经取代的”或“任选经取代的”的情况下，在一个优选实施方案中，这样的部分是未经取代的。
“芳基烷基”、“(杂脂环族)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“联芳基烷基”等意指被芳基、杂脂环族、联芳基等部分(视情况而定)取代的烷基、烯基或炔基部分(视情况而定)，其中开放的(未满足的)化合价在烷基、烯基或炔基部分处，例如如在苄基、苯乙基、N-咪唑基乙基、N-吗啉代乙基等中。相反，“烷基芳基”、“烯基环烷基”等意指被烷基、烯基等部分(视情况而定)取代的芳基、环烷基等部分(视情况而定)，例如如在甲基苯基(甲苯基)或烯丙基环己基中。“羟基烷基”、“卤代烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”等意指被一个或多个鉴定的取代基(羟基、卤代等，视情况而定)取代的烷基、芳基等部分(视情况而定)。
例如，允许的取代基包括但不限于烷基(尤其是甲基或乙基)、烯基(尤其是烯丙基)、炔基、芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代(尤其是氟)、卤代烷基(尤其是三氟甲基)、羟基、羟基烷基(尤其是羟基乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)(尤其是-OCF3)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)、-SO2N(烷基)2等。
在被取代的部分是脂族部分的情况下，优选的取代基是芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(＝O)烷基、-S(环烷基)、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)和-SO2N(烷基)2。更优选的取代基是卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(芳基)、＝O、＝NOH、＝NO(烷基)、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2和-NHC(＝NH)NH2。尤其优选的是苯基、氰基、卤代、羟基、硝基、C1-C4烷氧基、O(C2-C4烷二基)OH和O(C2-C4烷二基)卤代。
在被取代的部分是脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基部分的情况下，优选的取代基是烷基、烯基、炔基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)、-O(芳基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、烷硫基、芳硫基、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)和-SO2N(烷基)2。更优选的取代基是烷基、烯基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2和-NHC(＝NH)NH2。尤其优选的是C1-C4烷基、氰基、硝基、卤代和C1-C4烷氧基。
在陈述范围的情况下，如在“C1-C5烷基”或“5％至10％”中，这样的范围包括所述范围的端点，如在第一个实例中的C1和C5以及在第二个实例中的5％和10％。
除非具体指示特定的立体异构体(例如，通过在结构式中的相关立体中心处的加粗或加虚线的键，通过在结构式中将双键描绘为具有E或Z构型，或通过使用立体化学指定的命名法或符号)，否则作为纯化合物及其混合物的所有立体异构体都包括在本发明的范围内。除非另外指示，否则外消旋体、单独的对映体(不论是光学纯的还是部分拆分的)、非对映体、几何异构体及其组合和混合物都被本发明涵盖。
本领域技术人员应理解，化合物可以具有互变异构体形式(例如，酮和烯醇形式)、共振形式和两性离子形式，所述形式等效于在本文使用的结构式中描绘的那些，并且所述结构式涵盖此类互变异构体形式、共振形式或两性离子形式。
“药学上可接受的酯”意指在体内(例如在人体中)水解产生母体化合物或其盐或者本身具有与母体化合物类似的活性的酯。合适的酯包括C1-C5烷基、C2-C5烯基或C2-C5炔基酯，尤其是甲基、乙基或正丙基酯。
“药学上可接受的盐”意指适用于药物配制品的化合物的盐。在化合物具有一个或多个碱性基团的情况下，所述盐可以是酸加成盐，诸如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐(embonate))、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、甲基硫酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乳糖醛酸盐、辛二酸盐、甲苯磺酸盐等。在化合物具有一个或多个酸性基团的情况下，所述盐可以是诸如以下的盐：钙盐、钾盐、镁盐、葡甲胺盐、铵盐、锌盐、哌嗪盐、氨丁三醇盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己胺盐、苯乍生盐、钠盐、四甲基铵盐等。多晶型结晶形式和溶剂化物也涵盖在本发明的范围内。
“受试者”是指动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、猴、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。关于例如哺乳动物受试者(诸如人)的术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。
在治疗疾病或障碍的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)意在包括减轻或消除障碍、疾病或病症，或与障碍、疾病或病症相关的一种或多种症状；或减慢障碍、疾病或病症或其一种或多种症状的进展、扩散或恶化。“癌症的治疗”是指以下作用中的一种或多种：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括(i)减慢和(ii)完全阻止生长；(2)减少肿瘤细胞的数量；(3)维持肿瘤大小；(4)减小肿瘤大小；(5)抑制，包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止肿瘤细胞浸润到外周器官中；(6)抑制，包括(i)减少、(ii)减慢或(iii)完全防止转移；(7)增强抗肿瘤免疫应答，这可以导致(i)维持肿瘤大小、(ii)减小肿瘤大小、(iii)减慢肿瘤生长、(iv)减少、减慢或防止侵袭和/或(8)在一定程度上缓解与障碍相关的一种或多种症状的严重程度或数量。
在本说明书的式中，横向于键的波浪线
Figure BDA0003810902030000591
或在键末端的星号(*)表示共价附接位点。例如，在式
Figure BDA0003810902030000592
中R是
Figure BDA0003810902030000593
或R是
Figure BDA0003810902030000594
的陈述意指
Figure BDA0003810902030000595
在本说明书的式中，在其两个碳之间横穿芳族环的键意指附接至所述键的基团可以位于所述芳族环的任何位置，所述任何位置是通过除去隐含地在那里(或明确地在那里，如果画出来的话)的氢而变得可用的。通过说明的方式，下式：
Figure BDA0003810902030000596
代表
Figure BDA0003810902030000597
在其他说明中，
Figure BDA0003810902030000598
代表
Figure BDA0003810902030000599
并且
Figure BDA00038109020300005910
代表
Figure BDA00038109020300005911
本公开文本包括在本文描述的化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的那些原子。通过一般举例而非限制的方式，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本发明的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述的那些类似的方法使用适当的同位素标记的试剂代替原本采用的未标记的试剂来制备。通过举例的方式，C1-C3烷基可以是未氘化的、部分氘化的或完全氘化的，并且“CH3”包括CH3、13CH3、14CH3、CH2T、CH2D、CHD2、CD3等。在一个实施方案中，化合物中的各种元素以其天然同位素丰度存在。
本领域技术人员应理解，某些结构可以绘制呈一种互变异构体形式或另一种互变异构体形式，例如酮与烯醇，并且这两种形式是等效的。
首字母缩略词和缩写
这是在本说明书中使用的首字母缩略词和缩写及其含义的列表。
Figure BDA00038109020300005912
Figure BDA0003810902030000601
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以下提供了在本说明书中较早以缩写方式通过第一作者(或发明人)和日期引用的以下参考文献的完整引用。将这些参考文献的每一个出于所有目的通过引用并入本文。
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前述具体实施方式包括主要或专门涉及本发明的特定部分或方面的段落。应当理解，这是为了清楚和方便，特定特征可能在不只是公开它的段落中是相关的，并且本文所公开的内容包括在不同段落中找到的信息的所有适当组合。类似地，尽管本文中的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但是应当理解，在特定附图或实施方案的背景下公开了特定特征的情况下，也可以在另一个附图或实施方案的背景下、与另一个特征组合、或总体上在本发明中在适当的程度上使用这样的特征。
此外，尽管已经根据某些优选实施方案具体描述了本发明，但是本发明不限于此类优选实施方案。而是，本发明的范围由所附权利要求限定。

Claims (13)

1.一种化合物，所述化合物具有根据式I的结构
Figure FDA0003810902020000011
其中
每个X1独立地是N或CR2；
X2是O、CH2、NH、S或N(C1-C3烷基)；
R1是(C1-C5烷基)、(C2-C5烯基)、(C1-C8烷二基)0-1(C3-C6环烷基)、(C2-C8烷二基)OH、(C2-C8烷二基)O(C1-C3烷基)、(C1-C4烷二基)0-1(5-6元杂芳基)、(C1-C4烷二基)0-1苯基、(C1-C4烷二基)CF3、(C2-C8烷二基)N[C(＝O)](C1-C3烷基)、或(C2-C8烷二基)NRxRy；
每个R2独立地是H、O(C1-C3烷基)、S(C1-C3烷基)、SO2(C1-C3烷基)、C1-C3烷基、O(C3-C4环烷基)、S(C3-C4环烷基)、SO2(C3-C4环烷基)、C3-C4环烷基、Cl、F、CN或[C(＝O)]0-1NRxRy；
R3是NH(C1-C5烷基)、N(C1-C5烷基)2、NH(C1-C4烷二基)0-1(C3-C6环烷基)、N(C3-C6环烷基)2、NH(C1-C4烷二基)0-1(芳基)、或具有以下结构的环状胺部分：
Figure FDA0003810902020000012
R5是H、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C3-C6环烷基、卤基、O(C1-C5烷基)、(C1-C4烷二基)OH、(C1-C4烷二基)O(C1-C3烷基)、苯基、NH(C1-C5烷基)、5或6元杂芳基、
Figure FDA0003810902020000013
Rx和Ry独立地是H或C1-C3烷基，或Rx和Ry与它们键合的氮组合以形成3至7元杂环；
m是0或1；
并且
n是1、2或3；
其中在R1、R2、R3和R5中
烷基部分、烷二基部分、环烷基部分、或以下式的部分
Figure FDA0003810902020000014
任选地被选自以下的一个或多个取代基取代：OH、卤基、CN、(C1-C3烷基)、O(C1-C3烷基)、C(＝O)(C1-C3烷基)、SO2(C1-C3烷基)、NRxRy、(C1-C4烷二基)OH、(C1-C4烷二基)O(C1-C3烷基)；
并且
烷基、烷二基、环烷基、或以下式的部分
Figure FDA0003810902020000021
可以具有被以下替代的CH2基团：O、SO2、CF2、C(＝O)、NH、N[C(＝O)]0-1(C1-C3烷基)、N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)CF3、N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)OH、或N[C(＝O)]0-1(C1-C4烷二基)0-1(C3-C5环烷基)。
2.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有根据式(Ia)的结构：
Figure FDA0003810902020000022
3.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有根据式(Ib)的结构：
Figure FDA0003810902020000023
4.根据权利要求3所述的化合物，其中R1是
Figure FDA0003810902020000024
5.根据权利要求3所述的化合物，其中R3是
Figure FDA0003810902020000025
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R5是
Figure FDA0003810902020000026
Figure FDA0003810902020000031
7.根据权利要求6所述的化合物，其中
R1是
Figure FDA0003810902020000032
R3是
Figure FDA0003810902020000033
并且
R5是
Figure FDA0003810902020000034
8.一种化合物，所述化合物具有根据式(Ib)的结构
Figure FDA0003810902020000035
其中
R1是
Figure FDA0003810902020000036
R3是
Figure FDA0003810902020000037
并且
R5是Me或CH2OH。
9.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有这种癌症的患者施用抗癌免疫治疗剂和根据权利要求1或8所述的化合物的治疗有效组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗癌免疫治疗剂是拮抗性抗CTLA-4、抗PD-1、或抗PD-L1抗体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症是肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌、头颈癌、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤和梅克尔皮肤癌)、尿路上皮癌(包括膀胱癌)、胃癌、肝细胞癌或结直肠癌。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗癌免疫治疗剂是伊匹单抗、纳武单抗或派姆单抗。
13.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物具有由式(Ic)表示的结构
Figure FDA0003810902020000038
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