JP2023512230A - トール様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストとしてのＣ３置換１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン化合物 - Google Patents

トール様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストとしてのＣ３置換１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン化合物 Download PDF

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Abstract

下記の式（Ｉ）：【化１】TIFF2023512230000098.tif59115で表される化合物は、トール様受容体７（ＴＬＲ７）のアゴニストとして有用である。そのような化合物は、特に抗がん免疫療法剤と併用してがん治療に、またはワクチンアジュバントとして使用され得る。【選択図】なし

Description

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年７月２８日に提出された米国仮出願シリアル番号第６３／０５７，６８６号、および２０２０年１月２７日に提出された米国仮出願シリアル番号第６２／９６６，１０３号の利益を主張し；それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、トール様受容体７（「ＴＬＲ７」）アゴニストおよびその複合体、ならびに調製方法、並びにそのようなアゴニストおよびその複合体の使用に関する。
トール様受容体（「ＴＬＲｓ」）は、特定の種類の病原体に保存される小分子モチーフである病原体関連分子パターン（「ＰＡＭＰｓ」）を認識する受容体である。ＴＬＲは、細胞の表面上または細胞内のいずれかに存在し得る。同種のＰＡＭＰの結合によるＴＬＲの活性化は、宿主内の関連病原体の存在－すなわち感染を伝え、宿主の免疫系を刺激して感染と闘わせる。ヒトには１０のＴＬＲｓがあり、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３などと名付けられている。
アゴニストによるＴＬＲの活性化－ＴＬＲ７のものが最も研究されている－は、実際の病原体感染以外の様々な病態の治療において、免疫応答を全体的に刺激することにより、ワクチンおよび免疫療法剤の作用に対して良い効果を及ぼし得る。それゆえ、ワクチンアジュバントとしての、またはがん免疫療法におけるエンハンサーとしてのＴＬＲ７アゴニストの使用に大きな関心がある。例えば、Ｖａｓｉｌａｋｏｓ ａｎｄ Ｔｏｍａｉ ２０１３，Ｓａｔｏ－Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｓｍｉｔｓ ｅｔ ａｌ．２００８，およびＯｔａ ｅｔ ａｌ．２０１９を参照されたい。
ＴＬＲ７は、エンドソームの膜上に位置する細胞内受容体であり、一本鎖ＲＮＡウイルスと関連するＰＡＭＰsを認識する。その活性化は、ＩＦＮαおよびＩＦＮβなどのＩ型インターフェロンの分泌を誘導する（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．２００４）。ＴＬＲ７には２つの結合部位があり、一つは一本鎖ＲＮＡリガンド（Ｂｅｒｇｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）との、一つはグアノシンなどの小分子（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１６）との結合部位である。
ＴＬＲ７は、グアノシン様合成アゴニスト、例えば１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン骨格を基にしているイミキモド、レシキモド、およびガーディキモド（gardiquimod）などに結合し、活性化されることがある。小分子ＴＬＲ７アゴニストのレビューについてはＣｏｒｔｅｚ ａｎｄ Ｖａ ２０１８を参照されたい。
Figure 2023512230000002
ベサトリモドが挙げられるように、プテリジノン分子骨格を基にする合成ＴＬＲ７アゴニストもまた既知である（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。
Figure 2023512230000003
プリン様骨格を基にする他の合成ＴＬＲ７アゴニストは開示されており、しばしば下記の一般式（Ａ）：
Figure 2023512230000004
 ［式中、Ｒ、Ｒ’、およびＲ”は、構造的な可変要素であり、Ｒ”は一般に非置換または置換された芳香またはヘテロ芳香環を含む］で示される。
プリン様骨格を有する生物活性分子および線維症、炎症性疾患、がん、または病原性感染などの病態の治療におけるその使用の開示には：Ａｋｉｎｂｏｂｕｙｉ ｅｔ ａｌ．２０１５および２０１６；Ｂａｒｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１６、２０１７ａ、および２０１７ｂ；Ｇｒａｕｐｅ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１９ａおよび２０１９ｂ；Ｈｏｌｌｄａｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．２００９ａおよび２０１２；Ｐｏｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１９ａおよび２０１９ｂ；Ｐｒｙｄｅ ２０１０；ならびにＹｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９が挙げられる。
基Ｒ”は、ピリジルであり得る：Ｂｏｎｆａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１５ａおよび２０１５ｂ；Ｈａｌｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．２００２、２００４、２００６、２００９ａ、２００９ｂ、２０１１、および２０１２；Ｋａｓｉｂｈａｔｌａ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｏｇａ－Ｙａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍｕｓｍｕｃａ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｎａｋａｍｕｒａ ２０１２；Ｏｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．２００７；ならびにＹｕ ｅｔ ａｌ．２０１３。
式（Ａ）の６，５縮合環系－ピリミジン６員環とイミダゾール５員環が縮合した－が改変された関連分子の開示がある。（ａ）Ｄｅｌｌａｒｉａ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１０および２０１２、ならびにＰｉｌａｔｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１７は、ピリミジン環がピリジン環に置換された化合物を開示する。（ｂ）Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｃｏｅ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｐｏｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２０２０ａおよび２０２０ｂ、ならびにＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８は、イミダゾール環がピラゾール環に置換された化合物を開示する。（ｃ）Ｃｏｒｔｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１７および２０１８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８；ならびにＭｃＧｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６ａ、２０１６ｂ、および２０１７は、イミダゾール環がピロール環に置換された化合物を開示する。
Ｂｏｎｆａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１５ｂおよび２０１６ならびにＰｕｒａｎｄａｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１９は、プリン部分の２つの環が大環状分子により架橋されたＴＬＲ７モジュレーターを開示する。
ＴＬＲ７アゴニストは、パートナー分子に結合されることがあり、それは、例えば、リン脂質、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、抗体、または別のＴＬＲ（一般にＴＬＲ２）であり得る。代表的な開示には：Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１３、２０１５、および２０１６、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．２００９および２０１１、Ｃｏｒｔｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｇａｄｄ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｌｉｏｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｍａｊ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｖｅｒｎｅｊｏｕｌ ｅｔ ａｌ．２０１４、ならびにＺｕｒａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２が挙げられる。主な結合部位は、式（Ａ）のＲ”基である。
Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１５は、ＴＬＲ７アゴニストの送達のためのカチオン性脂質ビークルの使用を開示する。
レシキモドなどのいくつかのＴＬＲ７アゴニストは、ＴＬＲ７/ＴＬＲ８デュアルアゴニストである。例えば、Ｂｅｅｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｅｍｂｒｅｃｈｔｓ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｌｉｏｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１６、およびＶｅｒｎｅｊｏｕｌ ｅｔ ａｌ．２０１４を参照されたい。
筆頭著者または発明者および発行年により本明細書に引用される文書についての完全な引用が、本明細書の末尾に記載される。
本明細書は、ピラゾール環のＣ３炭素（矢印）が置換されている（すなわち、Ｈ以外である）１Ｈ－ピラゾロ［４，３ｄ］ピリミジン芳香族系を有する、ＴＬＲ７アゴニストとしての活性がある化合物に関する。
Figure 2023512230000005
一つの態様において、下記の式（Ｉ）：
Figure 2023512230000006
 ［式中、
各Ｘ１は、独立してＮまたはＣＲ２であり；
Ｘ２は、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、Ｓ、またはＮ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）であり；
Ｒ１は、（Ｃ１－Ｃ５アルキル）、
（Ｃ２－Ｃ５アルケニル）、
（Ｃ１－Ｃ８アルカンジイル）０－１（Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル）、
（Ｃ２－Ｃ８アルカンジイル）ＯＨ、
（Ｃ２－Ｃ８アルカンジイル）Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１（５－６員ヘテロアリール）、
（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１フェニル、
（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＣＦ３、
（Ｃ２－Ｃ８アルカンジイル）Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
または
（Ｃ２－Ｃ８アルカンジイル）ＮＲｘＲｙであり；
各Ｒ２は、独立してＨ、Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、Ｓ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、Ｃ１－Ｃ３アルキル、Ｏ（Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル）、
Ｓ（Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル）、ＳＯ２（Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル）、
Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、または［Ｃ（＝Ｏ）］０－１ＮＲｘＲｙであり；
Ｒ３は、ＮＨ（Ｃ１－Ｃ５アルキル）、Ｎ（Ｃ１－Ｃ５アルキル）２、
ＮＨ（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１（Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル）、
Ｎ（Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル）２、ＮＨ（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１（アリール）、または下記の構造：
Figure 2023512230000007
 を有する環状アミン部分であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ５アルキル、Ｃ２－Ｃ５アルケニル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、
ハロ、Ｏ（Ｃ１－Ｃ５アルキル）、（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＯＨ、
（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、フェニル、
ＮＨ（Ｃ１－Ｃ５アルキル）、５もしくは６員ヘテロアリール、
Figure 2023512230000008
 であり；
ＲｘおよびＲｙは、独立してＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、あるいはＲｘおよびＲｙは、それらに結合している窒素と結合して３から７員のヘテロ環を形成し；
ｍは、０または１であり；
ｎは、１、２、または３であり；
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ５において、
アルキル部分、アルカンジイル部分、シクロアルキル部分、または下記の式：
Figure 2023512230000009
 で示される部分は、
ＯＨ、ハロ、ＣＮ、（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、ＮＲｘＲｙ、
（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＯＨ、（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）
から選択される一つ以上の置換基で適宜置換されてもよく；
アルキル、アルカンジイル、シクロアルキル、または下記の式：
Figure 2023512230000010
 で示される部分は、
Ｏ、ＳＯ２、ＣＦ２、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＨ、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］０－１（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］０－１（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＣＦ３、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］０－１（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＯＨ、
または
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］０－１（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１（Ｃ３－Ｃ５シクロアルキル）
に置換されるＣＨ２基を有してもよい］
で示される構造を有する化合物が提供される。
本明細書に開示される化合物は、ＴＬＲ７アゴニストとしての活性を有し、いくつかは、目的とする作用の標的組織または臓器への標的化送達のための抗体に結合されることがある。それらはＰＥＧ化され、その医薬特性が調節されることもある。
本明細書に開示される化合物、またはその複合体あるいはそのＰＥＧ化誘導体は、免疫系の活性化による治療に適している病態を患う患者に対して、治療的有効量の、そのような化合物またはその複合体あるいはそのＰＥＧ化誘導体を、特にワクチンまたはがん免疫療法剤と併用して投与することによって、そのような患者を治療するのに使用され得る。
化合物
一つの態様において、本開示の化合物は、下記の式（Ｉａ）で示され、式中、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ５は、式（Ｉ）について定義される通りである：
Figure 2023512230000011
もう一つの態様において、本開示の化合物は、下記の式（Ｉｂ）で示され、式中、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ５は、式（Ｉ）について定義される通りである：
Figure 2023512230000012
一つの態様において、本開示は、式（Ｉｂ）：
［式中、
Ｒ１は、
Figure 2023512230000013
 であり；
Ｒ３は、
Figure 2023512230000014
 であり；
Ｒ５は、ＭｅまたはＣＨ２ＯＨである］
で示される構造を有する化合物を提供する。
もう一つの態様において、下記の式（Ｉｃ）：
Figure 2023512230000015
 ［式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は、式（Ｉ）について定義される通りである］
で示される化合物が提供される。
基Ｒ１の例は、
Figure 2023512230000016
 である。
好ましくは、Ｒ１は、
Figure 2023512230000017
 である。
基Ｒ３の例には、Ｃｌ、ＯＨ、
Figure 2023512230000018
 が挙げられる。
好ましくは、Ｒ３は、
Figure 2023512230000019
 である。
基Ｒ５の例は、
Figure 2023512230000020
 である。
好ましくは、Ｒ５は、
Figure 2023512230000021
 である。
例示であって限定ではないが、下記の式：
Figure 2023512230000022
 で示される部分には、
Figure 2023512230000023
 が挙げられる。
下記の式：
Figure 2023512230000024
 で示される上記の代表的な部分のいくつかは、任意の置換基を有する、および／または上記の「発明の概要」に記載されるように、Ｏ、ＳＯ２などに置換される一つ以上のＣＨ２基を適宜有してもよい。
本明細書に開示される化合物の具体例を以下の表Ａに示す。表は、以下に提供される手順を通じて割り出された、生物学的活性：ヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）アゴニズムレポーターアッセイおよび／またはヒト全血におけるＣＤ６９遺伝子の誘導に関するデータも提供する。最も右の列に解析データ（マススペクトル、ＬＣ／ＭＳ保持時間、およびＮＭＲ）を記載する。一つの実施形態において、本開示の化合物は、（ａ）１，０００ｎＭ未満のヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）レポーターアッセイＥＣ５０値および（ｂ）１，０００ｎＭ未満のヒト全血（ｈＷＢ）ＣＤ６９誘導ＥＣ５０値を有する。（アッセイが複数回行われた場合、報告される値は平均値である。）
Figure 2023512230000025
Figure 2023512230000026
Figure 2023512230000027
Figure 2023512230000028
Figure 2023512230000029
Figure 2023512230000030
Figure 2023512230000031
Figure 2023512230000032
Figure 2023512230000033
Figure 2023512230000034
Figure 2023512230000035
Figure 2023512230000036
Figure 2023512230000037
Figure 2023512230000038
Figure 2023512230000039
本開示の他の化合物を表Ｂに示す。
Figure 2023512230000040
Figure 2023512230000041
医薬組成物および投与
もう一つの態様において、薬学的に許容される担体または添加剤とともに製剤化される、本明細書に開示されるような化合物、またはその複合体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、一つ以上の追加の薬学的活性成分、例えば生物学的製剤または小分子薬剤などを適宜含んでもよい。医薬組成物は、別の治療剤、特に抗がん剤との併用療法で投与され得る。
医薬組成物は、一つ以上の添加剤を含むことがある。使用されることがある添加剤には、担体、界面活性剤、増粘または乳化剤、固体結合剤、分散または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、風味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、防腐剤、等張化剤、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適当な添加剤の選択および使用は、Gennaro編，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第２０版（Lippincott Williams ＆ Wilkins 2003）に記載されている。
好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適する。投与経路に応じて、活性化合物は、物質でコーティングされ、化合物を不活化することがある酸および他の自然条件の作用から保護されることがある。「非経口投与」という語句は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、例として、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、医薬組成物は、局所、上皮または粘膜投与経路などの非非経口経路（non-parenteral route）で、例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、経直腸的、舌下または局所的に投与され得る。
医薬組成物は、滅菌水溶液または滅菌水分散液の形であり得る。それらは、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度を達成するのに適当な他の秩序構造中で製剤化されることもある。組成物は、投与前に水で再調製する凍結乾燥物の形でも提供され得る。
担体物質と結合して単一剤形を生成し得る活性成分の量は、治療を受ける患者および特定の投与方法によって異なり、一般的には治療効果をもたらす組成物の量であろう。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、活性成分の約０．０１パーセントから約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは、薬学的に許容される担体との併用で活性成分の約１パーセントから約３０パーセントに及ぶであろう。
投与計画は、治療反応を提供するように調整される。例えば、単回のボーラス投与を行ってもよく、用量をいくつかに分けて時間をかけて投与してもよく、状況の緊急性に応じて比例的に用量を増減させてもよい。投与の簡便性および用量の均一性にとって、用量単位形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。「用量単位形態」は、治療を受ける患者に対する単一の用量として適当な、物理的に別々の単位を指し；各単位には、望ましい治療反応をもたらすように計算された、予め決められた量の活性化合物が、必要な医薬担体とともに含まれる。
用量は、宿主の体重に対して、約０.０００１から１００ｍｇ/ｋｇ、より一般的には０．０１から５ｍｇ/ｋｇに及ぶ。例えば、用量は、０．３ｍｇ/ｋｇ体重、１ｍｇ/ｋｇ体重、３ｍｇ/ｋｇ体重、５ｍｇ/ｋｇ体重または１０ｍｇ/ｋｇ体重であってもよく、１－１０ｍｇ/ｋｇ、あるいは０．１から５ｍｇ/ｋｇの範囲内であってもよい。代表的な治療レジメンは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回、または３から６か月に１回の投与である。好ましい投与計画には、以下の投薬スケジュール：（ｉ）４週間ごとに６用量を投与し、次に３か月ごとに投与；（ｉｉ）３週間ごとに投与；（ｉｉｉ）３ｍｇ/ｋｇ体重で１回投与し、続いて１ｍｇ/ｋｇ体重で３週間ごとに投与のうちの一つを用いて、１ｍｇ/ｋｇ体重または３ｍｇ/ｋｇ体重で静脈内投与する方法が挙げられる。いくつかの方法において、用量は、約１－１０００μｇ/ｍＬの、いくつかの方法においては約２５－３００μｇ/ｍＬの血漿中抗体濃度を達成するように調整される。
本発明の化合物の「治療有効量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の減少、疾患の無症状期間の回数および持続期間の上昇、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。例えば、がんを有する患者の治療については、「治療有効量」は、治療を受けていない患者と比較して、好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらに好ましくは少なくとも約60%、さらに好ましくは少なくとも約80%、腫瘍増殖を阻害する。治療有効量の治療化合物は、腫瘍の大きさを減少させるか、そうでなければ、患者における症状を寛解させることがあり、患者は、一般にはヒトであるが、別の哺乳動物であってもよい。２つ以上の治療剤が併用療法で投与される場合、「治療有効量」は、個々の薬剤としてではなく、全体としての組み合わせの有効性をいう。
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムなどの放出制御または徐放性製剤であり得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用され得る。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson編，Marcel Dekker社，ニューヨーク，1978を参照されたい。
治療組成物は、（１）無針皮下注射器具；（２）マイクロ注入ポンプ；（３）経皮デバイス；（４）注入デバイス；および（５）浸透圧装置などの医療機器を用いて投与され得る。
ある実施形態において、医薬組成物は、インビボにおいて適切な分布を確保するように製剤化されることがある。例えば、本発明の治療化合物が血液脳関門を通過することを確実にするために、それらはリポソーム中で製剤化されることがあり、リポソームは、標的化部分をさらに含み、特定の細胞または臓器への選択的輸送を増強することがある。
産業上の利用可能性および用途
本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニスト化合物は、ＴＬＲ７の活性化により寛解し得る疾患または病態の治療のために使用され得る。
一つの実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストは、抗がん免疫療法剤－別名を免疫抗がん剤という－と組み合わせて使用される。抗がん免疫療法剤は、がん細胞を攻撃し、破壊する体の免疫系を刺激することにより、特にＴ細胞の活性化を介して効果を発揮する。免疫系には、それによる正当な標的細胞への攻撃、およびそれによる健康で正常な細胞への攻撃の抑止のバランスの維持を助ける、多数のチェックポイント（調節）分子がある。いくつかは刺激因子（上方調節因子）であり、それらの関与はＴ細胞活性化を促進し、免疫応答を増強するということを意味する。他は阻害因子（下方制御因子またはブレーキ）であり、それらの関与はＴ細胞活性化を阻害し、免疫応答を弱めるということを意味する。アゴニスト免疫療法剤の、刺激性チェックポイント分子への結合は、後者の活性化およびがん細胞に対する免疫応答の増強をもたらし得る。交換的に、アンタゴニスト免疫療法剤の、抑制性チェックポイント分子への結合は、後者による免疫系の下方制御を防ぎ、がん細胞に対する活発な応答の維持を助け得る。刺激性チェックポイント分子の例は、B7－1、B7－2、CD28、4－1BB （CD137）、4－1BBL、ICOS、CD40、ICOS－L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、ＤＲ３およびCD28Hである。抑制性チェックポイント分子の例は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、PD－L2、LAG－3、TIM－3、ガレクチン９、CEACAM－1、BTLA、CD69、ガレクチン－1、CD113、ＧＰＲ５６、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、ＬＡＩＲ１、TIM－1、CD96およびTIM－4である。
どちらの抗がん免疫療法剤の作用機序においても、その有効性は、ＴＬＲ７の活性化などの全身的な免疫系の上方制御により上昇し得る。それゆえ、一つの実施形態において、本明細書は、がんを患う患者に、抗がん免疫療法剤および本明細書に開示されるようなＴＬＲ７アゴニストの治療的に有効な組み合わせを投与することを特徴とする、がんの治療方法を提供する。投与のタイミングは、同時でも、連続的でも、交互であってもよい。投与方法は、全身的であっても、局所的であってもよい。ＴＬＲ７アゴニストは、対象を絞った方法で、複合体を用いて送達されることがある。
上記のような併用療法により治療され得るがんには、急性骨髄白血病、副腎皮質癌、カポジ肉腫、リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、奇形／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、胆管癌、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、眼癌、卵管癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、へアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝臓癌、下咽頭癌、膵臓癌、腎臓癌、喉頭癌、慢性骨髄性白血病、口唇および口腔癌（lip and oral cavity cancer）、肺癌、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、口腔癌（mouth cancer）、口腔癌（oral cancer）、骨肉腫、卵巣癌、陰茎癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、および外陰癌が挙げられる。
本明細書に開示されるような併用療法に使用され得る抗がん免疫療法剤には、AMG 557、AMP－224、アテゾリズマブ、アベルマブ、BMS 936559、セミプリマブ、CP－870893、ダセツズマブ、デュルバルマブ、エノブリツズマブ、ガリキシマブ、IMP321、イピリムマブ、ルカツムマブ、MEDI－570、MEDI－6383、MEDI－6469、ムロモナブ－CD3、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、スパルタリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、バルリルマブ、ボンレロリズマブが挙げられる。それらの代替名（商標名、旧名、研究コード、または同義語）およびそれぞれの標的チェックポイント分子を以下の表Ｂに示す。
Figure 2023512230000042
ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法の一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。がんは、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫を含む）、皮膚癌（黒色腫およびメルケル皮膚癌を含む）、尿路上皮癌（膀胱癌を含む）、胃癌、肝細胞癌、または結腸直腸癌であり得る。
ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法のもう一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、好ましくはイピリムマブである。
ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法のもう一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、好ましくはニボルマブまたはペムブロリズマブである。
本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニストは、ワクチンアジュバントとしても有用である。
本発明の実施は、限定ではなく実例として提供される以下の実施例を参照することによりさらに理解され得る。
解析手順
ＮＭＲ
プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを得るために以下の条件を用いた：溶媒および内部標準としてＤＭＳＯ－ｄ６またはＣＤＣｌ３のいずれかを用いて、４００Ｍｚまたは５００ＭｈｚのＢｒｕｋｅｒ装置のいずれかでＮＭＲスペクトルを得た。ＡＤＣ ＬａｂｓのＡＣＤ Ｓｐｅｃｔｒｕｓバージョン２０１５－０１またはＭｅｓｔＲｅＮｏｖａソフトウェアのいずれかを用いることにより、生のＮＭＲデータを解析した。
化学シフトは、内部のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）から、または重水素化ＮＭＲ溶媒により推測されるＴＭＳの位置を基準に、低磁場側が百万分率（ｐｐｍ）で報告される。明らかな多重度は：一重線－ｓ、二重線－ｄ、三重線－ｔ、四重線－ｑ、または多重線－ｍとして報告する。広幅化を示すピークをｂｒとしてさらに表す。積分値は近似値である。積分強度、ピーク形状、化学シフトおよび結合定数は、溶媒、濃度、温度、ｐＨ、および他の因子に依存し得るということに注意すべきである。さらに、ＮＭＲスペクトルにおいて水または溶媒ピークと重複するか、または交換が起こるピークは、信頼できる積分強度を提供しないことがある。場合によっては、ＮＭＲスペクトルは、水ピーク抑制を用いて得られることがあるが、重複するピークが目に見えなくなるか、またはその形状および／もしくは積分値が変化することがある。
液体クロマトグラフィー
以下のプレパラティブおよび／または分析（ＬＣ／ＭＳ）液体クロマトグラフィー法を用いた。
方法１：カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０％Ｂから１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５０分保持；流速：１ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）は特に表示のない限りポジティブモード
方法２：カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．１％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０％Ｂから１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５０分保持；流速：１ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）．ＭＳ（ＥＳＩ）は特に表示のない限りポジティブモード
方法３：カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．１％ ギ酸含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．１％ ギ酸水；温度：４０℃；グラジエント：５％Ｂで０．１分保持、２．３分かけて５％Ｂから９５％Ｂ、次いで９５％Ｂで０．２０分保持、０．０１分かけて９５％Ｂから５％Ｂ、５％Ｂで０．２８分保持．流速：０．６ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２５４ｎｍ）
方法４：カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:１０ｍＭ テトラブチルＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:１０ｍＭ テトラブチルＮＨ４ＯＡｃ含有水；温度：４０℃；グラジエント：５％Ｂで０．１分保持、２分かけて５％Ｂから９５％Ｂ、９５％Ｂで０．２分保持、０．０１分かけて９５％Ｂから５％Ｂ、次いで５％Ｂで０．６７分保持；流速：０．６ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２５４ｎｍ）
方法Ａ．カラム：BEH C18 2.1 x 50mm；移動相Ａ：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：０．０５％ ＴＦＡ含有アセトニトリル；温度：５０℃；グラジエント：１．７分かけて２－９８％Ｂ；次いで９８％Ｂで０．５０分保持；流速：０．８ｍＬ/分．検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）
方法Ｂ．カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；温度:５０℃；グラジエント：３分かけて０％Ｂから１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５０分保持；流速：１ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）．この方法は、超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ(商標)）法である。
方法Ｃ．カラム：BEH C18 2.1 x 50mm；移動相Ａ：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：０．０５％ ＴＦＡ含有アセトニトリル；温度：５０℃；グラジエント：３．０分かけて０から１００％Ｂ；流速：１．０ｍＬ/分
方法Ｄ．カラム：Xbridge BEH C18 XP (50 x 2.1 mm)、2.5 μｍ；移動相Ａ：5:95 ＣＨ３ＣＮ：１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有Ｈ２Ｏ；移動相Ｂ：95:5 ＣＨ３ＣＮ：１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有Ｈ２Ｏ；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０－１００％Ｂ；流速：1.１ｍＬ/分）
合成－一般的な手順
一般的に、本明細書に開示される手順は、ピラゾロピリミジン環系の１Ｈまたは２Ｈ位置でアルキル化された位置異性体の混合物をもたらす（それぞれＮ１およびＮ２位置異性体とも呼ばれ、アルキル化された窒素に言及している）。簡略化のために、Ｎ２位置異性体は示されないが、初期に生成される混合物中に存在し、例えばプレパラティブＨＰＬＣにより、後で分離されるということが理解されるべきである。
Figure 2023512230000043
位置異性体の混合物を合成の初期段階に分離し、１Ｈ位置異性体を用いて残りの合成段階を実行してもよく、あるいは、必要に応じて、位置異性体の混合物を用いて合成を進め、後期に分離を実行してもよい。
本開示の化合物は、有機合成化学の当業者に周知の多数の方法により調製され得る。これらの方法は、以下に記載される方法、またはそのバリエーションを含む。好ましい方法には、下記のスキームに記載される方法が挙げられるが、これらに限らない。スキームは、一般的であるように意図されているが、場合によっては、特徴が便宜上、具体的に示されることがある（例えば、メチルエステル、具体的な保護基、または特定の位置異性体）。
スキーム１
Figure 2023512230000044
化合物１３は、上記のスキーム１に記載される手順により合成され得る。ステップ１および２では、Ｈ２およびＰｄ／Ｃなどの適当な条件下で化合物１を還元した後、適当な条件下で（例えば、初めにＨＯＡｃで、次にＮａＯＭｅで処理）化合物３と反応させて化合物４を得る。ステップ３では、ＢＯＰなどのカップリング剤を用いて、化合物４を望ましいアミン（例えば、n－ブチルアミン）と結合させ、化合物５を得る。（ＲＸは、アルキルアミンまたは上に記載されるような他の適当な側鎖基であり得る）。
ステップ４では、ＮＢＳ、ＮＩＳ、ＮＣＳまたはＳｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（商標）などの適当なハロゲン化試薬を用いて、ハロゲンを化合物５のＣ３に導入する。ステップ５では、化合物７などの適当なアルキル化試薬により、化合物６のＮ１位をアルキル化する。（いくらかのＮ２アルキル化生成物も、図示しないが、生じることがある。）ステップ６では、化合物８上のハロゲンが、Ｃ３における基Ｒａ；例えば、アルキル、アルケニル、シクロ脂肪族、芳香族環、ヘテロ芳香族環および同類のものの導入の出発点として使用され得る。あるいは、ハロゲン化、アルキル化およびＲａの導入の３つのステップは、ステップ２（ピリミジン形成ステップ）の前に行われ得る。Ｒａは、最終生成物基であってもよく、その後修飾されて最終生成物基を提供する前駆体であってもよい。Ｒａは、トリメチルシリルエチニルなどの、合成過程の適切な段階で後に除去される保護基を有してもよい。Ｒａがフルオロの場合、それはナトリウムアルコキシドによりアルコキシド基に（例えば、ＮａＯＭｅによりＯＭｅに）変換されることがある。また、ステップ３において、カルバメート基は脱保護されてもよく、これはＮａＯＨなどの適当な塩基を用いて後の段階で行われてもよい。ステップ６でＣ３に導入される基Ｒａをさらに誘導体化し、例えば、ステップ７で、基Ｒｂを生成してもよい。Ｒａがトリメチルシリルエチニル基である場合、ＲｕＯ２および過ヨウ素酸ナトリウムでそれを酸化してカルボン酸基を得て、次にそれをヒドロキシメチル基に還元することがある。ステップ８および９では、化合物１０のメチルカルボキシレートをベンジルアルコールに還元し、塩化ベンジルまたはベンジルメシレート中間体およびアミンＲｃＲｄＮＨ２による置換を経て、ベンジルアミンにさらに変換する。ステップ１０では、例えば、二重結合の水素化または保護基の除去により、基Ｒｂを適宜基Ｒｅにさらに変化させて、化合物１３を得てもよい。
合成－具体例
上記の内容をさらに説明するために、以下の限定されない代表的な合成スキームが含まれる。請求項の範囲内にあるこれらの実施例のバリエーションは、当業者の範囲内であり、本開示の範囲内にあると見なされる。読者は、本開示を提供された、関連技術に熟練した当業者であれば、網羅的な実施例がなくとも、本明細書に開示される化合物を調製し、使用することができるであろうということを認識するであろう。
１００以上の番号がつけられた化合物についての解析データは、表ＡまたはＢで見つかる。
実施例１－化合物１０３
Figure 2023512230000045
ステップ１．１００ｍＬ フラスコに、メチル （7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（4.98 g、18.84 mmol）およびＤＭＦ（60.0 mL）を入れて、透明な溶液を得た。N－ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ、5.09 g、22.61 mmol）を５℃で（氷浴）、少量ずつ添加した。溶液を５℃で２時間撹拌した後、これを４００ｍＬ 水に注いだ。濾過した後、沈殿物を風乾し、回収して、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（6.46 g、15.73 mmol、収率８３％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１.２５１分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３９１.０、実測値 ３９１.１
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 12.96（s，1H），9.74（s，1H），7.52（s，1H），3.62（s，3H），3.53（q，J = 6.5 Hz，2H），1.68－1.55（m，2H），1.47－1.30（m，2H），0.94（t，J = 7.4 Hz，3H）
ステップ２．１００ｍＬ フラスコに、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（2.50 g、6.41 mmol）、５０．０ｍＬ ＤＭＦ、およびＣｓ２ＣＯ３（4.18 g、12.81 mmol）を入れた。反応混合物を５分間超音波処理した後、１０．０ｍＬ ＤＭＦ中、メチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（1.743 g、6.73 mmol）をＲＴで添加した。反応混合物をＲＴで１時間撹拌した後、これを２００ｍＬ ＤＣＭ中に入れた。ＤＣＭ溶液を２００ｍＬ １０％ クエン酸溶液（3X）およびブライン（30 mL）で洗浄した。分液操作の後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を蒸発させた後、残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝０－１００％）により精製した。目的物を含むフラクションをプールし、蒸発乾固させて、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1.41 g、1.86 mmol、収率29.1％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．７３８分（方法３）．ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ５６９．１、実測値 ５６９．２
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 9.81（s，1H），7.59－7.43（m，2H），7.23（t，J＝5.6 Hz，1H），6.72（d，J＝7.8 Hz，1H），5.80（s，2H），3.87（s，3H），3.85（s，3H），3.63（s，3H），3.50（q，J＝6.6 Hz，2H），1.54（p，J＝7.3 Hz，2H），1.24－1.17（m，2H），0.83（t，J＝7.4 Hz，3H）
ステップ３．２０ｍＬ マイクロウェーブバイアルに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1.007 g、1.771 mmol）、７．２ｍＬ ジオキサン、[1,1’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム（ＩＩ）（0.091 g、0.124 mmol）、トリメチルボロキシン（ＴＭＢ、1.000 g、7.97 mmol）およびＫ２ＣＯ３（0.734 g、5.31 mmol）を入れた。反応混合物を１２０℃で１時間レンジ加熱した。反応混合物を１００ｍＬ ＤＣＭで希釈し、１０％ クエン酸（3x20 mL）およびブライン（30 mL）で連続的に洗浄した。分液操作の後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。最終残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝０－１０％）により精製した。目的物を含むフラクションをプールし、蒸発乾固させて、メチル 4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（0.212 g、0.531 mmol、収率30％）を褐色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．４２６分（方法４）．ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ－Ｈ］ ３９７．２、実測値 ３９７．２
ステップ４．２０ｍＬ バイアルに、メチル 4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（407.2 mg、1.022 mmol）およびＤＣＭ（4 mL）を入れて、－７８℃に冷却した。ＤＩＢＡＬ－Ｈ（3.07 mL、3.07 mmol、ＴＨＦ中、１Ｍ）を滴下した。２時間後、０．５ｍＬ メタノールを添加し、温度をＲＴに上昇させた。酒石酸カリウムナトリウム溶液（4 mL、20%）を添加し、混合物を終夜撹拌し、次に１００ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相をブライン（2x20 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させた。残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝０－１０％）により精製し、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（285.0 mg、0.769 mmol、収率７５％）を得た。
分析サンプルをＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１１％Ｂで０分保持、２２分かけて１１－５１％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は20.4 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９９％であった。分析ＬＣ／ＭＳを用いて最終純度を割り出した。
ＬＣ／ＭＳ 方法１：実測質量：３７０．９；保持時間：１．３７分
ＬＣ／ＭＳ 方法２：実測質量：３７１．３；保持時間：１．２８分
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 6.99（s，1H），6.76（d，J＝7.8 Hz，1H），6.48（d，J＝7.7 Hz，1H），6.41（t，J＝5.5 Hz，1H），5.66（s，2H），5.52（s，2H），4.45（d，J＝5.5 Hz，2H），3.83（d，J＝1.3 Hz，3H），3.42（s，0H），2.23（d，J＝1.2 Hz，3H），1.54－1.44（m，2H），1.27－1.15（m，2H），0.89－0.82（m，3H）
ステップ５．２０ｍＬ バイアルに、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（70.0 mg、0.189 mmol）およびＤＣＭ（3.0 mL）を入れた。懸濁液に０℃でＳＯＣｌ２（0.034 mL、0.472 mmol）を入れた。０．５時間後、混合物を減圧蒸発させ、残留物（中間体Ａ）をそれ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．６０分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３８９．２、実測値 ３８９．２
ステップ６．バイアルに、N7－ブチル－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5,7－ジアミン（30 mg、0.077 mmol）、０．５ｍＬ ＤＭＦ、シクロブタンアミン（31.8 mg、0.447 mmol）およびＥｔ３Ｎ（0.022 mL、0.154 mmol）をＲＴで入れた。反応を終夜進行させた後、反応混合物をプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、化合物１０３（21.8 mg、0.051 mmol、収率66.7％）を得た。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１０％Ｂで０分保持、２３分かけて１０－５０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は21.8 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９８％であった。
以下の化合物を中間体Ａから類似的に調製した：
化合物１０４：（17.2 mg、0.037 mmol、収率49.0％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：９％Ｂで０分保持、２０分かけて９－４９％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は17.2 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９８％であった。
化合物１０５：（33.4 mg、0.074 mmol、収率９６％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 30 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：９％Ｂで０分保持、２０分かけて９－４９％Ｂ、次いで１００％Ｂで２分保持；流速：４５ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は33.4 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は１００％であった。
化合物１０６：（27.8 mg、0.057 mmol、収率７４％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：８％Ｂで０分保持、２３分かけて８－４８％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は27.8 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９９％であった。
化合物１３６を化合物１０６から調製した：化合物１０６（50 mg、0.104 mmol）のＴＨＦ（2 mL）溶液を０℃で、ＮａＨ（9.94 mg、0.414 mmol）で処理し、１０分間撹拌した。ＭｅＩ（6.48 μl、0.104 mmol）を添加し、反応混合物をＲＴで３時間撹拌した。ＭｅＯＨをゆっくりと添加して反応物をクエンチした。溶媒を蒸発させた。粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１０％Ｂで０分保持、２０分かけて１０－５０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。化合物１３６を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。
実施例２－化合物１０７
Figure 2023512230000046
ステップ１．３０ｍＬ バイアルに、メチル （7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（972.2 mg、3.68 mmol）、６．０ｍＬ アセトニトリル、１．２ｍＬ ＨＯＡｃ、1－クロロメチル－4－フルオロ－1,4－ジアゾニアビシクロ[2.2.2]オクタン ビス（テトラフルオロボレート）（2606 mg、7.36 mmol）を入れた。反応混合物を８０℃で２４時間撹拌した。追加量のアセトニトリル（4.0 mL）、ＨＯＡｃ（0.4 mL）および1－クロロメチル－4－フルオロ－1,4－ジアゾニアビシクロ[2.2.2]オクタン ビス（テトラフルオロボレート）（5213 mg、14.71 mmol）を添加し、反応混合物を８０℃でさらに１５時間攪拌した後、揮発性物質を減圧蒸発させた。残留物を６０ｍＬ ＤＣＭ中に入れた。懸濁液を濾過し、固体を追加量のＤＣＭ（3x60mL）で洗浄した。合わせたＤＣＭ相を蒸発させて、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－フルオロ－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（886 mg、1.569 mmol、収率42.7％、純度５０％）を得た。物質のほとんどをそれ以上は精製せずに次のステップで使用した。分析サンプルをプレパラティブＨＰＬＣ（XBridge BEH C18 OBD Prep Column、130Å、5 μm、19 mm X 150 mm、グラジエント：水中、５％－９５％ アセトニトリル（調整剤として両溶媒中、１０ｍＭ ＴＥＡＡ）により精製した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．０９６分（方法４）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計測値 ２８１．１、実測値 ２８１．２
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 12.10（s，1H），9.73（s，1H），8.41－7.12（m，1H），3.63（s，3H），3.56－3.48（m，2H），1.71－1.53（m，2H），1.50－1.31（m，2H），0.94（t，J＝7.3 Hz，3H）
ステップ２．２０ｍＬ バイアルに、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－フルオロ－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（700.0 mg、1.24 mmol、純度５０％）、４．２ｍＬ ＤＭＦ、Ｃｓ２ＣＯ３（1616 mg、4.96 mmol）およびメチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（3.02 mL、1.612 mmol）をＲＴで入れた。１時間後、反応混合物を１００ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。ＥｔＯＡｃ相を１０％ クエン酸溶液（2x50 mL）およびブライン（30 mL）で洗浄した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させた。残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝０－１００％）により精製し、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－フルオロ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（300.1 mg、0.652 mmol、収率52.6％）を黄色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．９７２分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ４６１．２、実測値 ４６１．２
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 9.82（s，1H），7.49（d，J＝7.6 Hz，2H），7.35（t，J＝5.6 Hz，1H），6.78（d，J＝7.8 Hz，1H），5.65（s，2H），3.85（s，3H），3.84（s，3H），3.63（s，3H），3.50（td，J＝7.0，5.5 Hz，2H），1.61－1.49（m，2H），1.29－1.13（m，2H），0.84（t，J＝7.4 Hz，3H）
ステップ３．乾燥機で乾燥させた２０ｍＬ バイアルに、２．６ｍＬ ＤＣＭ中、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－フルオロ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（0.217 g、0.471 mmol）を入れた。ＤＩＢＡＬ－Ｈ（1.413 mL、1.413 mmol、ＴＨＦ中、１Ｍ）を－７８℃で添加した。２５分後、追加量のＤＩＢＡＬ－Ｈ（0.5 mL、0.5 mmol、ＴＨＦ中、１．０Ｍ）を添加した。さらに４０分後、０．５ｍＬ ＭｅＯＨを添加し、温度をＲＴに上昇させた。４．０ｍＬ ２０％ 酒石酸カリウムナトリウム溶液を添加し、反応混合物を終夜攪拌した。次にこれを１００ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相をブライン（2x20 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させて、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－フルオロ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.204 g、0.471 mmol、収率１００％と仮定）を得て、それ以上は精製せずに使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．５７１分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４３３．２、実測値 ４３３．２
ステップ４．バイアルに、ジオキサン（4.0 mL）中、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－フルオロ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（200.0 mg、0.462 mmol）をＲＴで入れた。ＮａＯＨ（0.139 mL、1.387 mmol 10.0 M）を添加した。溶液を６０℃で４時間撹拌し、次に冷却し、希ＨＣｌで酸性化した。沈殿物を濾過し、水で洗浄し、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－フルオロ－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（173 mg、0.462 mmol、収率１００％と仮定）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１.２８０分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３７５．２、実測値 ３７５．２
ステップ５．２０ｍＬ バイアルに、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－フルオロ－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（0.150 g、0.40 mmol）およびＤＣＭ（3 mL）を入れた。ＳＯＣｌ２（0.058 ml、0.800 mmol）を５℃で（氷浴）添加した。０．５時間後、溶媒を減圧蒸発させて、N7－ブチル－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－フルオロ－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5,7－ジアミン（中間体Ｂ）（0.157 g、0.400 mmol、収率１００％と仮定）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．５６２分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３９３．２、実測値 ３９３．１
ステップ６．中間体Ａからの化合物１０３と同様に、中間体Ｂから化合物１０７を得た（2.8 mg、0.006 mmol、収率１３％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１３％Ｂで０分保持、２０分かけて１３－５３％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は2.8 mg；ＬＣＭＳ分析による推定純度は９８％であった。
以下の化合物を中間体Ｂから類似的に調製した：
化合物１０８：（6.7 mg、0.015 mmol、収率２８％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１１％Ｂで０分保持、２４分かけて１１－５１％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は6.7 mg；ＬＣＭＳ分析による推定純度は９９％であった。
化合物１０９：（4.8 mg、0.010 mmol、収率２１％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１１％Ｂで０分保持、２４分かけて１１－５１％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は4.8 mg；ＬＣＭＳ分析による推定純度は９６％であった。
化合物１１０：（7.1 mg、0.015 mmol、収率２９％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：９％Ｂで０分保持、２４分かけて９－４９％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は7.1 mg；ＬＣＭＳ分析による推定純度は９８％であった。
実施例３－化合物１１５
Figure 2023512230000047
バイアルに、N7－ブチル－3－フルオロ－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5,7－ジアミン（化合物１０８）（15.0 mg、0.033 mmol）、１．０ｍＬ メタノールおよびＮａＯＭｅ（1 mL、4.37 mmol、4.37 M）を入れた。反応混合物を１２０℃で１時間レンジ加熱した後、これを１％ ＨＣｌで酸性化し、プレパラティブＨＰＬＣにより精製して、化合物１１５（9.7 mg、0.021 mmol、収率63.0％）を得た。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１２％Ｂで０分保持、２０分かけて１２－４８％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。化合物１１５を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は9.7 mg；ＬＣＭＳ分析による推定純度は１００％であった。
実施例４－化合物１１８
Figure 2023512230000048
ステップ１．２０ｍＬ マイクロウェーブバイアルに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1.201 g、2.113 mmol）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ） ジクロライド（0.148 g、0.211 mmol）、トリフェニルホスフィン（0.194 g、0.740 mmol）、ヨウ化銅（Ｉ）（0.089 g、0.465 mmol）、ＤＭＦ（9 mL）、ＴＥＡ（1.5 mL）およびエチニルトリメチルシラン（0.585 mL、4.23 mmol）を入れた。反応混合物を８０℃で２０分間レンジ加熱した。冷却した混合物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝０－６０％）により精製し、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－（（トリメチルシリル）エチニル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（0.933 g、1.733 mmol、収率８２％）を直接得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝２．１４１分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５３９．２、実測値 ５３９．４
ステップ２．フラスコに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－（（トリメチルシリル）エチニル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（2.018 g、3.75 mmol）および１２５ｍＬ アセトニトリルを入れて、５０℃の溶液を得た。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（4.01 g、18.73 mmol）を水溶液（50 mL）として、続いて酸化ルテニウム（ＩＶ）（0.050 g、0.375 mmol）を添加した。１．５時間後、追加量の（メタ）過ヨウ素酸ナトリウム（1 g、4.68 mmol）を添加した。さらに４時間後、反応混合物を冷却した。これをＲＴで終夜撹拌した後、３．０ｍＬ ＭｅＯＨを添加し、反応混合物をＣ１８シリカのパッドに通して濾過した。追加量のアセトニトリルを用いてシリカパッドを洗浄した。合わせた濾液を蒸発させて、粗製7－（ブチルアミノ）－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－3－カルボン酸（2.065 g、2.55 mmol、収率６８％、純度６０％）を得て、それ以上は精製せずに使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．３２４分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４８７．２、実測値 ４８７．４
ステップ３．２０ｍＬ バイアルに、7－（ブチルアミノ）－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－3－カルボン酸（500.0 mg、1.028 mmol）および１４ｍＬ ＴＨＦを入れて、懸濁液を得た。4－メチルモルホリン（0.339 mL、3.08 mmol）およびクロロギ酸イソブチル（0.202 mL、1.542 mmol）を５℃で添加した。１０分後、追加量の4－メチルモルホリン（0.339 mL、3.08 mmol）およびクロロギ酸イソブチル（0.202 mL、1.542 mmol）を添加した。さらに１０分後、水素化ホウ素ナトリウム（234 mg、61.6 mmol）、続いて６０ｕＬ 水を添加した。１時間後、ＨＣｌを添加し、溶液を酸性化した。次に、反応混合物を１００ｍＬ ＤＣＭ中に入れた。有機相をブライン（2x30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、粗製メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－（ヒドロキシメチル）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（486 mg、1.028 mmol、収率１００％と仮定）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．４９９分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４７３．２、実測値 ４７３．４
ステップ４．２００ｍＬ フラスコに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－（ヒドロキシルメチル）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（939 mg、1.988 mmol）、５．３ｍＬ アセトニトリル、イミダゾール（447 mg、6.56 mmol）およびＴＢＳ－Ｃｌ（599 mg、3.98 mmol）をＲＴで入れた。１５分後、ＭｅＯＨ（804 μl、19.88 mmol）を添加した。反応混合物を１００ｍＬ ＤＣＭ中に入れた。有機相を希ＨＣｌ（30 mL １％ ＨＣｌ）およびブライン（2x30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝０－２０％）により精製し、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－（（（tert－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（424.0 mg、0.506 mmol、収率25.4％、純度７０％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝２．３５５分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８７．３、実測値 ５８７．５
ステップ５．２０ｍＬ バイアルに、６ｍＬ ＴＨＦ中、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－（（（tert－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（186.0 mg、0.317 mmol）を入れた。ＬｉＡｌＨ４（951 μl、0.951 mmol、ＴＨＦ中、１Ｍ）を－５℃で、３回に分けて、１５分かけて添加した。４０分後、反応混合物を、－７８℃で冷却した１０ｍＬ アセトンに添加した。１０分後、７ｍＬ ２０％ ロッシェル塩を添加した。全混合物をＲＴに上昇させ、次に５０ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相を分離し、ブライン（2x30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－（（（tert－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（中間体Ｃ）（63.8 mg、0.114 mmol、収率３６％）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．９３２分（方法４）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ－Ｈ］ ５５７．３、実測値 ５５７．２
ステップ６．４ｍＬ バイアルに、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－（（（tert－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（38.2 mg、0.068 mmol）、１ｍＬ ＤＣＭ、ＤＩＰＥＡ（0.060 mL、0.342 mmol）および０．０８５ ｍＬ ＤＣＭ中、塩化メシル（8.52 μl、0.109 mmol）を５℃で入れた。２０分後、テトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（34.6 mg、0.342 mmol）を添加した。終夜攪拌した後、テトラ－n－ブチルアンモニウム フルオライド（0.205 mL、0.205 mmol）を添加した。２時間後、反応混合物を５０ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相を１０％ クエン酸（2x20 mL）、ブライン（30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－（ヒドロキシメチル）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（36.1 mg、0.068 mmol、収率１００％と仮定）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．２１３分（方法４）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ－Ｈ］ ５２６．３、実測値 ５２６．２
ステップ７．２０ｍＬ バイアルに、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－（ヒドロキシメチル）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.062 g、0.118 mmol）、２ｍＬ ＭｅＯＨおよびＮａＯＨ（4.72 mg、0.118 mmol）を入れた。反応混合物を６０℃で２時間撹拌した後、冷却し、蒸発乾固させた。水（3 mL）を添加し、４Ｍ ＨＣｌを用いて懸濁液を中和した。次に懸濁液を蒸発乾固させ、残留物をプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、化合物１１８（14.9 mg、0.030 mmol、収率２７％）を得た。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は14.9 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９９％であった。
以下の化合物を中間体Ｃから類似的に調製した：
化合物１１９：（27.2 mg、0.054 mmol、収率54％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は27.2 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９８％であった。
化合物１２０：（16.7 mg、0.035 mmol、収率３５％）。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は16.7 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９６％であった。
実施例５－化合物１２３
Figure 2023512230000049
ステップ１．マイクロウェーブバイアルに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（150 mg、0.264 mmol）、カリウム トリフルオロ（プロパ－1－エン－2－イル）ボレート（78.0 mg、0.528 mmol）、1,1’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン－パラジウム（ｉｉ）ジクロライド ジクロロメタン錯体（21.55 mg、0.026 mmol）、ＤＭＦ（1.6 mL）、水（0.４００ｍＬ）およびＣｓ２ＣＯ３（172.0 mg、0.528 mmol）を入れて、懸濁液を得た。反応混合物を１００℃で１時間レンジ加熱した。２０ｍＬ アセトニトリルを添加し、混合物を濾過した。濾液を蒸発させて減らし、残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝０－８０％）により精製して、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－（プロパ－1－エン－2－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（63.0 mg、0.131 mmol、収率49.5％）を生成物として得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝２．３７７分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４８３．２、実測値 ４８３．３
ステップ２．２０ｍＬ バイアルに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－（プロパ－1－エン－2－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（62.1 mg、0.129 mmol）、３．０ｍＬ ＴＨＦおよびＬｉＡｌＨ４（0.257 mL、0.257 mmol、ＴＨＦ中、１．０Ｍ）を５℃で入れた。１時間後、２００ｕＬ アセトン、続いて２ｍＬ ２０％ ロッシェル塩を添加した。終夜攪拌した後、反応混合物を５０ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相をブライン（2x20 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、分離し、減圧蒸発させて、メチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－（プロパ－1－エン－2－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（58.5 mg、0.129 mmol、収率１００％と仮定）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．６６６分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４５５．２、実測値 ４５５．４
ステップ３．２０ｍＬ バイアルに、メチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－（プロパ－1－エン－2－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.059 g、0.129 mmol）、ＭｅＯＨ（2.0 mL）およびＮａＯＨ（0.20 mL、2.000 mmol、10 M）を入れた。懸濁液を６０℃で２時間撹拌した後、蒸発乾固させた。６．０ｍＬ 水を添加し、４．０Ｍ ＨＣｌを添加して溶液を中和した。次に反応混合物を５０ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相をブライン（2x30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－（プロパ－1－エン－2－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（0.051 g、0.129 mmol、収率１００％と仮定）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．５５１分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３９７．２、実測値 ３９７．４
ステップ４．２０ｍＬ バイアルに、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－（プロパ－1－エン－2－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（51.0 mg、0.129 mmol）、ＤＣＭ（3.0 mL）およびＳＯＣｌ２（100 μl、1.370 mmol）を５℃で（氷浴）入れた。１０分後、反応混合物をＲＴに温め、１時間攪拌した後、蒸発乾固させた。残留物に、２．０ｍＬ ＤＭＦ、テトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（13.05 mg、0.129 mmol）およびＤＩＰＥＡ（112 μl、0.643 mmol）をＲＴで添加した。反応混合物を終夜攪拌した後、逆相クロマトグラフィー（C18、水中、５％－９５％ アセトニトリル、調整剤として両溶媒中、０．１％ ＴＦＡ）により精製し、N7－ブチル－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－3－（プロパ－1－エン－2－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5,7－ジアミン（60.0 mg、0.125 mmol、収率９７％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．４５４分（方法４）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ－Ｈ］ ４７８．３、実測値 ４７８．３
ステップ５．窒素通気バイアルに、２０．０ｍｇ １０％ Ｐｄ/Ｃ（～５０％ 水）、N7－ブチル－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－3－（プロパ－1－エン－2－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5,7－ジアミン（20.0 mg、0.042 mmol）および５．０ ＭｅＯＨをＲＴで入れた。フラスコを真空にし、水素（3x）で満たした。次に反応混合物をＲＴで、水素バルーン下で攪拌した。１時間後、バイアルを真空にし、窒素（3x）で洗い流した。次に反応混合物を濾過した。濾液から溶媒を減圧蒸発させた。蒸発後、残留物をプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、化合物１２３（9.4 mg、0.020 mmol、収率46.8％）を得た。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１５％Ｂで０分保持、２０分かけて１５－５５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は9.4 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９８％であった。
実施例６－化合物１２１および化合物１２４
Figure 2023512230000050
ステップ１．マイクロウェーブバイアルに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（155.1 mg、0.273 mmol）、1,1’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン－パラジウム（ｉｉ）ジクロライド ジクロロメタン錯体（22.28 mg、0.027 mmol）、ジオキサン（3.6 mL）、2,5－ジヒドロフラン－3－ボロン酸 ピナコールエステル（53.5 mg、0.273 mmol）およびＮａ２ＣＯ３（1.228 mL、2.456 mmol）を入れた。反応混合物を１時間、１００℃でレンジ加熱し、次いで濾過した。濾液を減圧蒸発させた。残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝０－９０％）により精製し、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－（2,5－ジヒドロフラン－3－イル）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（99.0 mg、0.194 mmol、収率71.1％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．７７７分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５１１．２、実測値 ５１１．４
ステップ２．２０ｍＬ バイアルに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－（2,5－ジヒドロフラン－3－イル）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（98.0 mg、0.192 mmol）、３ｍＬ ＴＨＦおよびＬｉＡｌＨ４（0.384 mL、0.384 mmol、ＴＨＦ中、１．０Ｍ）を５℃で入れた。１時間後、２００ｕＬ アセトン、続いて２ｍＬ ２０％ ロッシェル塩を添加した。反応混合物をＲＴで終夜撹拌した後、これを５０ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相をブライン（2x30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させ、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－（2,5－ジヒドロフラン－3－イル）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（93 mg、0.192 mmol、収率１００％と仮定）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ，ｔ＝１．５３７分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４８３．２、実測値 ４８３．４
ステップ３．２０ｍＬ バイアルに、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－（2,5－ジヒドロフラン－3－イル）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.093 g、0.192 mmol）、ＮａＯＨ（0.20 mL、2.000 mmol、10.0 M）およびＭｅＯＨ（2.0 mL）を入れた。懸濁液を６０℃で２時間撹拌した後、追加量のＭｅＯＨ（2 mL）およびＮａＯＨ（0.20 mL、2.0 mmol、１０．０Ｍ ＮａＯＨ）を添加した。反応混合物をさらに１時間、６０℃で攪拌した後、これを冷却し、１％ ＨＣｌで中和した。次に反応混合物を５０ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相をブライン（2x30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－（2,5－ジヒドロフラン－3－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（0.082 g、0.192 mmol、収率１００％と仮定）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．４４２分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４２５．２、実測値 ４２５．４
ステップ４．２０ｍＬ バイアルに、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－（2,5－ジヒドロフラン－3－イル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（82 mg、0.192 mmol）、３ｍＬ ＤＣＭおよびＳＯＣｌ２（28.0 μl、0.384 mmol）を５℃で（氷浴）入れた。２０分後、反応混合物を蒸発乾固させた。残留物に、２．０ｍＬ ＤＭＦ、テトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（97 mg、0.960 mmol）およびＤＩＰＥＡ（168 μl、0.960 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで終夜撹拌した後、これをクロマトグラフィー（C18、アセトニトリル:水＝０－１００％、両溶媒中、０．１％ ＴＦＡ）により精製し、化合物１２１（68.0 mg、0.134 mmol、収率69.8％）を得た。２０ｍｇの物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件でさらに精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は14.0 mg；ＬＣＭＳ分析による推定純度は１００％であった。
ステップ５．窒素通気バイアルに、２０．０ｍｇ １０％ Ｐｄ/Ｃ（～５０％ 水）、N7－ブチル－3－（2,5－ジヒドロフラン－3－イル）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5,7－ジアミン（22.0 mg、0.043 mmol）および５．０ｍＬ ＭｅＯＨをＲＴで入れた。バイアルを真空にし、水素（3x）で満たした。反応混合物をＲＴで終夜、水素バルーン下で攪拌した。次にフラスコを真空にし、窒素（3x）で満たした。懸濁液を濾過し、濾液を減圧蒸発乾固させた。残留物をプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、化合物１２４（14.3 mg、0.028 mmol、収率64.7％）を得た。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１０％Ｂで０分保持、２０分かけて１０－５０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は14.3 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９７％であった。
実施例７－化合物１２２
Figure 2023512230000051
ステップ１．２０ｍＬ マイクロウェーブバイアルに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（255.2 mg、0.449 mmol）、[1,1’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム（ＩＩ）（32.9 mg、0.045 mmol）、ジオキサン（8 mL）、ビニルボロン酸 ピナコールエステル（135 mg、0.880 mmol）およびＮａ２ＣＯ３（2.021 mL、4.04 mmol、水中、２．０Ｍ）を入れた。混合物を１００℃で１時間レンジ加熱した。反応混合物を１００ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相を１０％ クエン酸（2x30 mL）およびブライン（30 mL）で洗浄した。次にこれをＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させた。残留物をクロマトグラフィー（C18、アセトニトリル:水＝０－１００％、両溶媒中、調整剤として０．１％ ＴＦＡ）により精製し、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－ビニル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（137.0 mg、0.292 mmol、収率65.1％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．８１８分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４６９．２、実測値 ４６９．２
ステップ２．２０ｍＬ バイアルに、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－ビニル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（130.1 mg、0.278 mmol）、５．０ｍＬ ＴＨＦおよびＬｉＡｌＨ４（555 μl、0.555 mmol、ＴＨＦ中、１．０Ｍ）を５℃で入れた。１時間後、０．５ｍＬ アセトン、続いて２ｍＬ ２０％ ロッシェル塩を添加した。反応混合物をＲＴで終夜撹拌し、１００ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相をブライン（3x30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させ、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－エチル－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（101.2 mg、0.229 mmol、収率８２％）を得て、それ以上は精製せずに使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．５７０分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４４３．５、実測値 ４４３．４
ステップ３．２０ｍＬ バイアルに、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－エチル－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（101.2 mg、0.229 mmol）、２．０ｍＬ ＭｅＯＨおよびＮａＯＨ（0.20 mL、2.000 mmol、10.0 M）を入れた。反応混合物を６０℃で３時間撹拌した後、冷却し、１％ ＨＣｌで中和した。反応混合物を１００ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相をブライン（2x30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－エチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（88 mg、0.229 mmol、収率１００％）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．４５４分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３８５．２、実測値 ３８５．４
ステップ４．２０ｍＬ バイアルに、（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－エチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（44.2 mg、0.115 mmol）、３．０ｍＬ ＤＣＭおよびＳＯＣｌ２（16.79 μl、0.230 mmol）を５℃で（氷浴）入れた。０．５時間後、反応混合物を蒸発乾固させた。残留物に、２．０ｍＬ ＤＭＦ、テトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（11.63 mg、0.115 mmol）およびＤＩＰＥＡ（100 μl、0.575 mmol）を添加した。反応混合物を６０℃で２時間撹拌した後、冷却し、１００ｍＬ ＥｔＯＡｃ中に入れた。有機相を飽和ＮＨ４ＯＡｃ（2x30 mL）、ブライン（30 mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させた。残留物をプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、化合物１２２（12.5 mg、0.027 mmol、収率23.24％）を得た。プレパラティブＬＣ／ＭＳ条件：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１０％Ｂで０分保持、２０分かけて１０－５０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。生成物の収量は12.5 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は９０％であった。
実施例８－化合物１０１
Figure 2023512230000052
ステップ１．メチル （7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（1500 mg、5.68 mmol）をＤＭＦ（28.4 mL）中に、ＲＴで懸濁した。N－ブロモスクシンイミド（1212 mg、6.81 mmol）を１回で添加し、反応物をＲＴで９０分間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２および半飽和ＮａＨＣＯ３溶液の間で分配した。有機相を分離し、半飽和ＮａＨＣＯ３でさらに２回、１０％ ＬｉＣｌ溶液（1X）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗生成物をＣＥＬＩＴＥ（商標）上で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（120 g SiO2、０から８％ ＭｅＯＨ－ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（1.76 g、９０％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 12.89（br s，1H），9.82（br s，1H），7.59（br s，1H），3.67－3.60（m，3H），3.60－3.46（m，2H），1.72－1.56（m，2H），1.40（dq，J=14.7，7.4 Hz，2H），0.94（br t，J=7.4 Hz，3H）
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ３４３．１／３４５．１；ＬＣ ＲＴ＝０．６２分（方法Ａ）
ステップ２．メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（1.76 g、5.13 mmol）およびＣｓ２ＣＯ３（4.18 g、12.82 mmol）をＤＭＦ中にＲＴで懸濁した。メチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（1.329 g、5.13 mmol）を添加し、反応物をＲＴで撹拌した。９０分後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（150 mL）で希釈し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過した。有機層をＨ２Ｏ（2x）、１０％ ＬｉＣｌ溶液（1x）、およびブライン（1x）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。Ｎ１およびＮ２異性体の混合物を含む粗生成物をカラムクロマトグラフィー（120g ＳｉＯ２、１０から１００％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）により精製した。Ｎ１異性体を逆相クロマトグラフィー（C18 100g Gold、０．０５％ ＴＦＡ含有 １０から９０％ ＣＨ３ＯＨ－Ｈ２Ｏ）によりさらに精製した。生成物を含むフラクションを濃縮し、全ての揮発性物質を除去した。残りの水溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で塩基性にし、ＣＨ２Ｃｌ２（3x）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、分析的に純粋なメチル 4－（（3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエートを得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 9.88（s，1H），7.59－7.46（m，2H），7.33（br t，J=5.4 Hz，1H），6.79（d，J=7.9 Hz，1H），5.86－5.72（m，2H），3.85（d，J=4.9 Hz，6H），3.63（s，3H），3.52（q，J=6.7 Hz，2H），1.55（quin，J=7.2 Hz，2H），1.21（sxt，J=7.4 Hz，2H），0.84（t，J=7.4 Hz，3H）
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ５２１．０／５２３．０；ＬＣ ＲＴ＝０．８２分（方法Ａ）
ステップ３．メチル 4－（（3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（180 mg、0.345 mmol）をＴＨＦ（1151 μl）中にＲＴで溶解した。ＬｉＡｌＨ４（ＴＨＦ中、１Ｍ）（690 μl、0.690 mmol）をゆっくりと滴下した。水素化物を添加している途中に、さらに１ｍＬのＴＨＦを反応混合物に添加し、攪拌しやすくした。２０分後、反応物をＭｅＯＨおよび飽和ロッシェル塩でクエンチした。ＥｔＯＡｃを添加し、二相混合物を２時間撹拌すると、層が透明になった。有機相を除去し、水相をＥｔＯＡｃ（3x）で抽出した。合わせた有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（133 mg）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 9.85（s，1H），7.28（t，J=5.5 Hz，1H），6.99（s，1H），6.86－6.81（m，1H），6.79－6.74（m，1H），5.67（s，2H），5.19（t，J=5.7 Hz，1H），4.47（d，J=5.7 Hz，2H），3.76（s，3H），3.63（s，3H），3.58－3.50（m，2H），1.58（sxt，J=7.4 Hz，2H），1.33－1.21（m，2H），0.89（t，J=7.4 Hz，3H）
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ４９３．０／４９５．０；ＬＣ ＲＴ＝０．７３分 （方法Ａ）
ステップ４．メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（113 mg、0.229 mmol）をＴＨＦ（2290 μl）中にＲＴで溶解した。ＳＯＣｌ２（84 μl、1.145 mmol）を添加し、反応物をＲＴで３０分間 した。濃縮および減圧乾燥により、メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（117 mg）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 10.23（br s，1H），7.71－7.56（m，1H），7.12（d，J=1.3 Hz，1H），6.97（dd，J=7.8，1.3 Hz，1H），6.80（d，J=7.7 Hz，1H），5.71（s，2H），4.73（s，2H），3.78（s，3H），3.67（s，3H），3.55（q，J=6.8 Hz，2H），1.59（quin，J=7.4 Hz，2H），1.33－1.18（m，2H），0.92－0.84（m，3H）
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ５１１．０／５１３．０；ＬＣ ＲＴ＝０．８６分（方法Ａ）
ステップ５．メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（115 mg、0.225 mmol）をＤＭＦ中にＲＴで溶解した。テトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（46.5 μl、0.449 mmol）を添加し、反応物をＲＴで攪拌した。４時間後、さらに１当量のテトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（46.5 μl、0.449 mmol）を添加し、反応物をさらに３時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃおよび半飽和重炭酸塩溶液の間で分配した。水相をＥｔＯＡｃ（3x）に抽出し、合わせた有機物を１０％ ＬｉＣｌ溶液、ブラインで洗浄し、次にＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮により、メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（96 mg）を得て、それ以上は精製せずに使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 9.85（s，1H），7.27（br t，J=5.6 Hz，1H），7.03（s，1H），6.85（br d，J=7.6 Hz，1H），6.72（d，J=7.5 Hz，1H），5.66（s，2H），3.85－3.74（m，5H），3.72－3.67（m，2H），3.63（s，3H），3.58－3.48（m，2H），3.29－3.18（m，2H），1.75（br d，J=13.0 Hz，2H），1.65－1.51（m，3H），1.33－1.22（m，4H），0.88（t，J=7.3 Hz，3H）
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ５７６．１／５７８．０；ＬＣ ＲＴ＝０．６２分（方法Ａ）
ステップ６．ＮａＯＨ（１０Ｍ 溶液）（13.88 μl、0.139 mmol）を、メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（16 mg、0.028 mmol）のジオキサン（278 μL）撹拌溶液に添加した。反応混合物を８０℃に加熱した。６時間後、反応混合物をＲＴに冷まし、酢酸（7.94 μl、0.139 mmol）で中和し、濃縮した。粗生成物をＤＭＦ中に再溶解し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:酢酸アンモニウム含有水；グラジエント：１３％Ｂで０分保持、２０分かけて１３－５３％Ｂ、次いで１００％Ｂで４分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させて、化合物１０１（3.2 mg）を得た。
化合物１１１を類似的に調製した。
実施例９－化合物１０２
Figure 2023512230000053
ステップ１．メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（694 μl、0.069 mmol）をジオキサン（694 μL）中にＲＴで溶解した。シクロプロピルボロン酸（7.15 mg、0.083 mmol）および２Ｍ Ｋ３ＰＯ４（69.4 μl、0.139 mmol）水溶液を添加した。反応混合物をＮ２で３分間スパージした。ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（5.7 mg、6.94 μＭ）を導入し、Ｎ２をさらに２分間通気した。反応バイアルを密閉し、電子レンジで４５分間、１２０℃に加熱した。部分反応が観察された。ＲＴに冷ました後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、濃縮した。１００℃で終夜撹拌するのを伴うこと除いて、残留物を反応条件に再びさらした。ＲＴに冷ました後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、濃縮した。粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１５％Ｂで０分保持、２０分かけて１５－５５％Ｂ、次いで１００％Ｂで４分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。ＭＳシグナルごとに目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させて、化合物１０２（3.4 mg）を得た。
実施例１０－化合物１１２
Figure 2023512230000054
ステップ１．メチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（30 mg、0.052 mmol）および4－（4,4,5,5－テトラメチル－1,3,2－ジオキサボロラン－2－イル）ピリジン（32.0 mg、0.156 mmol）をジオキサン（520 μl）中にＲＴで懸濁した。窒素を反応混合物に３分間通気した。Ｋ３ＰＯ４溶液（2M、26.0 μl、0.052 mmol）、続いてＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（4.25 mg、5.20 μmol）を添加した。窒素を反応混合物にさらに２分間通気した。反応バイアルを密閉し、１６時間、１００℃に加熱した。反応混合物をＲＴに冷まし、ＥｔＯＡｃで希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、濃縮した。残留物をＤＭＦ中に再溶解し、ＮａＯＨ溶液（10 M、26.0 μl、0.260 mmol）を添加した。反応混合物を１時間、１００℃に加熱し、ＡｃＯＨ（14.90 μl、0.260 mmol）で中和し、さらに０．５ｍＬのＤＭＦで希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過した。粗製残留物をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．１％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．１％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで３分保持、２８分かけて０－３０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させて、化合物１１２をそのＴＦＡ塩（4.7 mg）として得た。
化合物１１３、化合物１１４、および化合物１１６を類似的に調製した。
実施例１１－化合物１２６
Figure 2023512230000055
ステップ１．メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート，ＡｃＯＨ（1500 mg、3.25 mmol）およびＴＨＦ（１００ｍＬ）の溶液を０℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ４（１Ｍ ＴＨＦ、6.50 mL、6.50 mmol）を４回に分けて、２０分かけて添加して処理した。追加量のＬｉＡｌＨ４（１Ｍ ＴＨＦ、2 mL、2.000 mmol）を添加した。反応物を２０％ 酒石酸ナトリウムカリウム水溶液（１００ｍＬ）でクエンチし、１６時間撹拌した。飽和ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）を添加し、反応物をＥｔＯＡｃ（3 x ２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（80g ＳｉＯ２、０から２０％ ＭｅＯＨ－ＣＨ２Ｃｌ２、グラジエント溶出）により、メチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（873 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ３７４．１；ＬＣ ＲＴ＝１．１６分（方法Ｃ）
ステップ２．メチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（183.0 mg、0.490 mmol）をＤＭＳＯ（2451 μl）中にＲＴで溶解し、（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン，ＨＣｌ（250 mg、0.637 mmol）およびＢＯＰ（325 mg、0.735 mmol）が入った反応バイアルに添加した。ＤＢＵ（222 μl、1.470 mmol）を添加し、反応混合物を１６時間、５０℃に加熱した。ＮａＯＨ（10 M、735 μl、7.35 mmol）を反応物に添加し、温度を１６時間、７０℃に上昇させた。ＲＴに冷ました後、反応混合物をカラムクロマトグラフィー（100g C18 Gold Column、０．１％ ＴＦＡ含有 １０から９０％ ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ）により直接精製し、メチル （S）－（7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（120.0 mg）を粘着性の黄褐色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ４７３．４；ＬＣ ＲＴ＝０．７３分（方法Ａ）
ステップ３．メチル （S）－（7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（120 mg、0.254 mmol）をジオキサン（1270 μl）中にＲＴで懸濁した。ＮａＯＨ（10 M、127 μl、1.270 mmol）を添加し、反応物を１２時間、７０℃に加熱し、ＲＴに冷ました。ＡｃＯＨ（73 μL、1.270 mmol）を添加し、反応混合物の２０％を除去し、濃縮した。粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：７％Ｂで０分保持、２５分かけて７－４７％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させて、化合物１２６（8.5 mg）を得た。
実施例１２－化合物１２７
Figure 2023512230000056
ステップ１．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.65 g、4.95 mmol）をＣＨＣｌ３（49.5 ml）中に溶解し、０℃に冷却した。ＮＢＳ（0.925 g、5.20 mmol）を反応混合物に１回で添加した。１５分後、反応物をＣＨＣｌ３で希釈し、１０％ チオ硫酸ナトリウム水溶液とともに１０分間、勢いよく攪拌した。有機相を分離し、Ｈ２Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（80g SiO2、０から５０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）により精製し、エチル 4－アミノ－3－ブロモ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.32 g）を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ４１２．２／４１４．２；ＬＣ ＲＴ＝１．０２分（方法Ａ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 7.61－7.41（m，2H），6.55（d，J=8.3 Hz，1H），5.56（s，2H），5.02（s，2H），4.20（q，J=7.1 Hz，2H），3.90（s，3H），3.85（s，3H），1.15（t，J=7.1 Hz，3H）
ステップ２．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（741.2 mg、収率67.1％）、Ｋ２ＣＯ３（1.098 g、7.94 mmol）および2,4,6－トリメチル－1,3,5,2,4,6－トリオキサトリボリナン（ＴＭＢ、ＴＨＦ中、３．５Ｍ；1.816 ml、6.36 mmol）をジオキサン（26.5 ml）：水（5.30 ml）（5:1）中に懸濁した。Ｎ２気流を反応混合物に５分間通気させた後、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（0.052 g、0.064 mmol）を添加し、さらに４分間通気し続けた後、反応槽を密閉し、９０℃に加熱した。３時間後、追加量のＴＭＢ（ＴＨＦ中、３．５Ｍ；0.908 ml、3.18 mmol）およびＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ２Ｃｌ２付加物（0.052 g、0.064 mmol）を添加し、反応混合物を１００℃で１６時間攪拌した。冷却した反応混合物を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過し、追加量のＥｔＯＡｃで洗浄した。粗生成物を４ｇ ＣＥＬＩＴＥ（商標）上に濃縮した。カラムクロマトグラフィー（80g SiO2、０から３０％ ＥｔＯＡｃ－ＣＨ２Ｃｌ２ グラジエント溶出）により、期待される生成物、エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（741 mg）をクリーム色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ３４８．２；ＬＣ ＲＴ＝０．８９分（方法Ａ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 7.49（d，J=1.5 Hz，1H），7.46（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），6.40（d，J=7.8 Hz，1H），5.48（s，2H），4.94－4.86（m，2H），4.14（q，J=7.0 Hz，2H），3.90（s，3H），3.84（s，3H），2.10（s，3H），1.15－1.08（m，3H）
ステップ３．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（742 mg、2.136 mmol）をＭｅＯＨ（10.800 mL）中に懸濁し、勢いよく攪拌しながら加熱し、可溶化した。1,3－ビス－（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレア（661 mg、3.20 mmol）、続いてＡｃＯＨ（0.611 mL、10.68 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１６時間撹拌した。追加量のＡｃＯＨを添加（0.049 mL、0.854 mmol）し、続いてＲＴでさらに７２時間攪拌した後、ＮａＯＭｅ（ＭｅＯＨ中、２５％ ｗｔ、5.69 mL、25.6 mmol）を添加した。３時間撹拌した後、反応混合物をＡｃＯＨで再び酸性化した。生成物を濾過により回収し、１０分間風乾し、実験乾燥機で完全に乾燥させ、メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（722.0 mg）をクリーム色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ４０２．３；ＬＣ ＲＴ＝０．８６分（方法Ａ）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 11.58－11.17（m，2H），7.51（d，J=1.4 Hz，1H），7.49－7.42（m，1H），6.67（d，J=7.9 Hz，1H），5.67（s，2H），3.90（s，3H），3.84（s，3H），3.71（s，3H），2.31（s，3H）
ステップ４．メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（300 mg 、0.747 mmol）、（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン，ＨＣｌ（381 mg、0.972 mmol）およびＢＯＰ（496 mg、1.121 mmol）をＤＭＦ（3737 μL）中にＲＴで懸濁した。ＤＢＵ（４当量）（451 μl、2.99 mmol）を添加した後、反応混合物は均質になり、これを４０℃に加熱した。１５分後、追加量のＤＢＵ（２当量）（225 μl、1.495 mmol）を添加し、反応物を４０℃で１６時間攪拌した。（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン，ＨＣｌ（381 mg、0.972 mmol）、ＢＯＰ（496 mg、1.121）およびＤＢＵ（４当量）（451 μl、2.99 mmol）を添加し、反応物をさらに４８時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ２Ｏ（2x）、および１０％ ＬｉＣｌ溶液（1x）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（24g ＳｉＯ２、０から８０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）により精製し、次いでさらに精製（12g ＳｉＯ２、０から７０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）して、メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（270.6 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ７３９．７；ＬＣ ＲＴ＝１．０４分（方法Ａ）
ステップ５．メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（270 mg、0.365 mmol）をＴＨＦ（3654 μl）中にＲＴで溶解した。ＬｉＡｌＨ４（731 μl、0.731 mmol）を５分かけて滴下し、反応混合物を１５分間ＲＴで撹拌した。反応物をＭｅＯＨおよびロッシェル塩でクエンチした。ＥｔＯＡｃを添加し、反応混合物を３時間攪拌すると、層が透明になった。有機相を除去し、水層を追加量のＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（12g SiO2、０から１００％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出、次いで０から２０％ ＭｅＯＨ－ＣＨ２Ｃｌ２）により、期待される物質、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（61.7 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ７１１．４；ＬＣ ＲＴ＝１．０８分（方法Ａ）
ステップ６．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（60 mg、0.084 mmol）をＣＨ２Ｃｌ２（844 μl）中にＲＴで溶解した。ＳＯＣｌ２（30.8 μL、0.422 mmol）を添加し、反応物を 時間 した。濃縮により、期待される生成物、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（56.6 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ７２９．３；ＬＣ ＲＴ＝１．１８分（方法Ａ）
ステップ７．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（54 mg、0.074 mmol）をアセトニトリル（740 μl）中にＲＴで溶解した。テトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（22.47 mg、0.222 mmol）を添加した。反応混合物を８０℃で３時間加熱し、終夜そのままにしてＲＴに冷ました。追加量のテトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（5 mg、0.056 mmol）を添加し、続いて８０℃で２時間再び加熱した。反応混合物を濃縮し、残留物をジオキサン：ＭｅＯＨ：１０Ｍ ＮａＯＨ（6:2:2、1 mL）中に再溶解し、８０℃で攪拌した。ＡｃＯＨ（130 μL）を添加し、反応物を減圧濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ中に溶解し、ＮａＨＣＯ３溶液（５０％ 水溶液）で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃ（3x）に抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、再濃縮し、（S）－N7－（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5,7－ジアミン（25.3 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ （Ｍ＋Ｈ） ７３６．４；ＬＣ ＲＴ＝１．０３分（方法Ａ）
ステップ８．（S）－N7－（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）－1－（2－メトキシ－4－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5,7－ジアミン（25.3 mg、0.034 mmol）をＤＭＦ中にＲＴで溶解した。トリエチルアミントリヒドロフルオライド（ＴＲＥＡＴ－ＨＦ、16.79 μL、0.103 mmol）を添加し、続いてＲＴで５時間攪拌した。反応物をＮａＯＨ（1N）でクエンチし、ＰＴＦＥフリットに通して希釈し、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２０分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させて、化合物１２７（8.2 mg）をモノアセテートとして得た。
以下の化合物を類似的に調製した：化合物１２８、化合物１２９、および化合物１３０。
実施例１３－化合物１２５
Figure 2023512230000057
ステップ１．メチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（426 mg、1.141 mmol）のＴＨＦ（10 mL）溶液に、ＳＯＣｌ２（0.167 mL、2.282 mmol）を添加する。３０分後、反応混合物を濃縮し、高真空下で乾燥させた。次に粗製残留物をＤＭＦ（2 mL）で希釈し、2－（ピペラジン－1－イル）エタン－1－オール（743 mg、5.70 mmol）を添加した。３０分間８０℃に加熱した後、反応混合物をＲＴに冷まし、酢酸エチル（50 mL）およびＬｉＣｌ １０％水溶液（25 mL）の間で分配した。分液操作を行い、水相を酢酸エチル（2x50 mL）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝０－３０％）により精製し、メチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（（4－（2－ヒドロキシエチル）ピペラジン－1－イル）メチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（255.0 mg、0.52 mmol、収率４６％）を得た。
ステップ２．メチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（（4－（2－ヒドロキシエチル）ピペラジン－1－イル）メチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（25 mg、0.051 mmol）、（S）－2－アミノペンタン－1－オール（21.25 mg、0.206 mmol）、ＢＯＰ（34.2 mg、0.077 mmol）、およびＤＢＵ（0.016 ml、0.103 mmol）のジオキサン（2 mL）溶液をＲＴで１６時間撹拌した。ＮａＯＨ １０Ｍ（0.1 ml、1.000 mmol）を添加し、８０℃に加熱した。１時間後、酢酸（0.1 ml）を添加し、溶媒を減圧蒸発させる。残留物をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：３％Ｂで０分保持、２０分かけて３－４３％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。化合物１２５の収量は13.9 mgで、ＬＣＭＳ分析によるその推定純度は１００％であった。分析ＬＣ／ＭＳを用いて最終純度を割り出した。
実施例１４－化合物１１７
Figure 2023512230000058
ステップ１：磁気攪拌子を備えた８ｍＬ バイアル中で、メチル （7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.5g、1.892 mmol）およびリン酸二カリウム（0.983 g、5.64 mmol）を乾燥アセトニトリル（5mL）中に懸濁し、十分に攪拌した。Ｎ２ガスを反応物に通気することで、混合物を脱気した。トリス（4,7－ジフェニル－1,10－フェナントロリン）ルテニウム（II） ジクロライド錯体（0.11 g、0.094 mmol）を添加し、反応物をさらに１０分間Ｎ２でパージした。トリフルオロメタンスルホニルクロライド（0.199 ml、1.882 mmol）を添加し、次に反応物をきつくキャップし、Ｐａｒａｆｉｌｍで密閉した。２７Ｗ 青ＬＥＤランプを用いて、反応混合物を攪拌しながら１週間照射した。反応物を水でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（3 x 10 mL）で抽出した。有機層を水およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を質量基準プレパラティブＨＰＬＣにより、以下の条件で精製した：カラム：Sunfire C18、150 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：水中、１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＭｅＯＨ（1:1）；グラジエント：１０％Ｂで０分保持、２分かけて１０から４０％Ｂ、次いで２８分かけて４０から７５％Ｂ；流速：１９ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされ、生成物を含むフラクションを濃縮し、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－（トリフルオロメチル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメートをオフホワイト固体（130 mg）として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 13.4（br s，1H），9.86（s，1H），7.70（s，1H），3.65（s，3H），3.56（m，2H），1.63（m，2H），1.38（m，2H），0.96（t，J=7.2 Hz，3H）
ＬＣ／ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３３３．２；ＬＣ ＲＴ＝１．９１５分（カラム：Kinetex XB－C18 3 x 75 mm；2.6 μ；移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ:アセトニトリル（98:2）；移動相Ｂ：Ｈ２Ｏ中、１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ:アセトニトリル（2:98）；グラジエント：４．０分かけて２０－１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．６０分保持；流速：１．０ｍＬ/分 検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）
ステップ２：メチル （7－（ブチルアミノ）－3－（トリフルオロメチル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（120 mg、0.361 mmol）およびＣｓ２ＣＯ３（129 mg、0.397 mmol）をＤＭＦ（1806 μl）中にＲＴで懸濁し、メチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（89 mg、0.343 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで終夜撹拌し、ＥｔＯＡｃおよびＨ２Ｏの間で分配した。有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（2x）で抽出した。合わせた有機相を１０％ ＬｉＣｌ溶液およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（12g SiO2、１０から１００％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）により、粗生成物をＮ１およびＮ２異性体の混合物として得た。逆相精製（15.5g C18 Gold、０．０５％ ＴＦＡ含有１０から９０％ ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ、グラジエント溶出）により、異性体を分離した。生成物ピークを含むフラクションを部分的に濃縮し、ＭｅＯＨを除去した。残留水溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で処理し、ＣＨ２Ｃｌ２（3x）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、真空乾燥させて、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－（トリフルオロメチル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（52.4 mg）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 9.92（s，1H），7.54－7.48（m，2H），7.40（br t，J=5.4 Hz，1H），6.85（d，J=8.3 Hz，1H），5.87（s，2H），3.84（d，J=1.1 Hz，6H），3.62（s，3H），3.52（q，J=6.6 Hz，2H），1.55（quin，J=7.2 Hz，2H），1.20（dq，J=14.9、7.4 Hz，2H），0.83（t，J=7.4 Hz，3H）
ステップ３：メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－（トリフルオロメチル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（52 mg、0.102 mmol）をＴＨＦ中にＲＴで懸濁し、溶解するまで攪拌した。ＬｉＡｌＨ４（204 μL、0.204 mmol）をゆっくりと滴下した。反応物を超音波処理し、ＲＴで１０分間撹拌した後、２滴のＭｅＯＨでクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃおよびロッシェル塩で希釈し、ＲＴで９０分間撹拌した。有機相を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（3X）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製メチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－（トリフルオロメチル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメートをさらに真空乾燥させた（38 mg）。粗製物質をＴＨＦ中に溶解し、ＳＯＣｌ２（37 μL、0.05 mmol）で処理した。反応混合物を２．５時間攪拌し、濃縮し、アセトニトリル（1x）と共沸させて、メチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－（トリフルオロメチル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（41 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５０１．０ ＬＣ ＲＴ＝０．８９分（方法Ａ）
ステップ４：メチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－（トリフルオロメチル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（41 mg、0.082 mmol）をＤＭＦ（409 μl）中にＲＴで溶解し、テトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン（33.9 μl、0.327 mmol）で処理した。反応物をＲＴで終夜撹拌した。１０Ｍ ＮａＯＨ水溶液（41 μL）を添加し、反応物を１時間、８０℃に加熱した。粗生成物を含む冷却した反応混合物をＡｃＯＨ（23 μL）で処理し、ＤＭＦ（1 mL）で希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過した。粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：６％Ｂで０分保持、２０分かけて６－５６％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件でさらに精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１８％Ｂで０分保持、２０分かけて１８－５８％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させて、化合物１１７（1.4 mg）を得た。
実施例１５－化合物１３１
Figure 2023512230000059
ステップ１．メチル 5－メトキシ－6－メチルニコチネート（993.5 mg、5.48 mmol、Ｅｎａｍｉｎｅから市販されている）、ＮＢＳ（1074.0 mg、6.03 mmol）およびＡＩＢＮ（180.0 mg、1.10 mmol）の２０ｍＬ ＣＣｌ４懸濁液を６５℃で６時間撹拌した。次に溶液を冷却し、減圧蒸発させた。最終残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ:ヘキサン＝０－２０％）により精製し、メチル 6－（ブロモメチル）－5－メトキシニコチネート（917.0 mg、3.53 mmol、収率64.3％）を薄紅色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．６１４分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２６０．０、実測値 ２６０．２
ステップ２．１００ｍＬ フラスコに、メチル （7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（上記の実施例１を参照；1447 mg、3.71 mmol）、Ｃｓ２ＣＯ３（2416 mg、7.41 mmol）およびＤＭＦ（24 mL）を入れ、ＲＴの懸濁液を得た。メチル 6－（ブロモメチル）－5－メトキシニコチネート（916.0 mg、3.52 mmol）をＤＭＦ（6 mL）溶液として添加した。２０分後、１００ｍＬ ２０％ 塩化アンモニウムおよび２００ｍＬ ＥｔＯＡｃを添加した。ワークアップの間、白色固体が沈殿し、これを濾過により回収して、メチル 6－（（7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチネート（1.70 g、2.99 mmol、収率８１％）を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．７３８分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５７０.１、実測値 ５７０．０
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 9.77（s，1H），8.47（d，J＝1.7 Hz，1H），7.84（d，J＝1.7 Hz，1H），7.55（t，J＝5.6 Hz，1H），5.95（s，2H），3.98（s，3H），3.87（s，3H），3.63（s，3H），3.48（q，J＝6.6 Hz，2H），1.53（m，2H），1.27－1.13（m，2H），0.83（t，J＝7.4 Hz，3H）
ステップ３．１０ｍＬ マイクロウェーブバイアルに、メチル 6－（（7－（ブチルアミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチネート（320.7 mg、0.563 mmol）、Ｋ２ＣＯ３（389.0 mg、2.82 mmol）、ジオキサン（3 mL）およびＨ２Ｏ（0.3 mL）をＲＴで入れた。窒素を懸濁液に１０分間通気した後、[1,1'－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム（ＩＩ）（41.2 mg、0.056 mmol）を添加した。混合物を１２０℃で１時間レンジ加熱し、８ｍＬ ＭｅＯＨおよび２ｍＬ ＮａＯＨ（１０Ｍ）に入れた。次に混合物を７０℃で１時間撹拌した後、これを冷却し、濾過した。沈殿物を追加量のＭｅＯＨで洗浄し、濾液を蒸発させた。最終残留物をクロマトグラフィー（C18、アセトニトリル：水＝０－１００％、両溶離剤中、１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃを含有）により精製し、6－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチン酸（130 mg、0.338 mmol、収率６０％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１．６８３分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４５８．２、実測値 ４５８．２
ステップ４．１００ｍＬ フラスコに、6－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチン酸（96.0 mg、0.249 mmol）およびＴＨＦ（5 mL）を入れ、懸濁液を得た。ＬｉＡｌＨ４（ＴＨＦ中、２Ｍ）（0.374 mL、0.747 mmol）を５℃で（氷浴）添加した。１時間後、追加量のＬｉＡｌＨ４（0.374 mL、0.747 mmol）を添加した。さらに１時間後、３ｍＬ ２０％ ロッシェル塩を添加した。１００ｍＬ ＭｅＯＨも添加した。混合物をＲＴで週末にかけて攪拌した。ＭｅＯＨを蒸発させ、３ｍＬ ＤＭＳＯを添加した。混合物をクロマトグラフィー（C18、アセトニトリル：水＝０－１００％、両溶離剤中、０．１％ ＴＦＡを含有）により精製し、40.0 mgの生成物（純度約５０％）を得て、それ以上は精製せずに次のステップで使用した。
ＬＣ／ＭＳ ｔ＝１.３２１分（方法３）、ＭＳ（ＥＳＩ） 計算値 ［Ｍ＋Ｈ］＋ ３７２.２、実測値 ３７２.１
ステップ５．４ｍＬ バイアルに、（6－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシピリジン－3－イル）メタノール（40 mg、0.05 mmol、純度約５０％）およびジオキサン（1 mL）を入れ、懸濁液（この濃度では溶解度に少し問題がある）を得た。ＳＯＣｌ２（0.039 mL、0.538 mmol）を５℃で（氷浴）添加した。温度を５分間ＲＴに上昇させた。３０分後、混合物を蒸発させ、残留物を１ｍＬ ＤＭＦ中に溶解した。2－（ピペラジン－1－イル）エタン－1－オール（0.050 mL、0.390 mmol）およびヒューニッヒ塩基（0.030 mL、0.172 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌した後、これを蒸発させ、残留物をクロマトグラフィー（カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２０分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃）により精製した。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させて、化合物１３１（9.4 mg、0.019 mmol、収率３６％）を得た。
実施例１６－化合物１３２
Figure 2023512230000060
ステップ１．ＤＭＦ（15 mL）中、メチル （3－フルオロ－7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（1 g、4.40 mmol）に、Ｃｓ２ＣＯ３（4.30 g、13.21 mmol）を添加し、混合物を０℃で（氷浴）１０分間攪拌した。メチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（1.2 g、4.63 mmol）を添加し、氷浴を３０分後に取り除いた。反応混合物を２５℃で１２時間攪拌した。反応混合物を３００ｍＬ 水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去し、メチル 4－（（3－フルオロ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1.78 g、4.39 mmol、収率100％）を得た。物質を精製せずに使用した。
ステップ２．ＤＭＳＯ（10 mL）中、メチル 4－（（3－フルオロ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（.93 g、2.294 mmol）の混合物を、（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン（2.5 g、7.03 mmol）、2,3,4,6,7,8,9,10－オクタヒドロピリミド[1,2－a]アゼピン（ＤＢＵ、1.5 ml、9.95 mmol）、続いて（（1H－ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール－1－イル）オキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（ＢＯＰ、2.030 g、4.59 mmol）で処理し、７０℃で２時間加熱した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、水で洗浄した。溶媒混合物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去した。物質をシリカゲル（ドライロード） ヘキサン－ＥｔＯＡｃ ０－１００％により精製し、メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－フルオロ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1.7 g、2.288 mmol、収率100％）を得た。
ステップ３．メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－フルオロ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1.7 g、2.288 mmol）のＴＨＦ（20 ml）溶液に、リチウムジイソブチル－tert－ブトキシアルミニウムハイドライドの０．２５Ｍ ＴＨＦ/ヘキサン（24 ml、6.00 mmol）溶液（ＬＤＢＢＡ）を０℃で、５分で添加し、反応物をＲＴで１２時間攪拌し続けたままにした（３時間、９８％変換）。ＬＣＭＳは、１００％変換を示した。溶液を冷水で希釈し、ＡｃＯＥｔで３回抽出した。最後に、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空蒸発させた。物質をシリカゲル（ヘキサン－ＥｔＯＡｃ ０－１００％）により精製し、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－フルオロ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（300 mg、0.420 mmol、収率18.34％）を得た。
ステップ４．２０ドラムバイアル中で、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－フルオロ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（280 mg、0.392 mmol）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（4 ml）中に溶解し、ＲＴの透明な溶液を得た。溶液を０℃に冷却し；ＭｓＣｌ（0.164 ml、1.175 mmol）およびＥｔ３Ｎ（0.164 ml、1.175 mmol）を添加した。ＬＣＭＳは、３分で反応の完了を示した。反応物を氷水およびＤＣＭでクエンチした。ＤＣＭ層をブライン（ブラインを使用したとき、乳濁した水層が透明になった。）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、（S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－フルオロ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンジル メタンスルホネート（60 mg、収率19.32％）を得た。物質を精製せずに使用した。
ステップ５．ＤＭＦ（1 mL）中、（S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－フルオロ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンジル メタンスルホネート（60 mg、0.076 mmol）に、（3S,4R）－4－アミノテトラヒドロフラン－3－オール（25 mg、0.242 mmol）を添加し、反応物を１２時間、２５℃で攪拌した。ＬＣ／ＭＳによりアルキル化を確認し、1,4－ジオキサン（3 mL、12.00 mmol）中、ＨＣｌを添加し；混合物を２時間、２５℃で攪拌した。溶媒を除去し、ＬＣ／ＭＳによりシリル保護基の除去を確認した。物質をＭｅＯＨ中、ＮａＯＨ（2 mL、10.00 mmol）で希釈し、８０℃で１時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳにより目的物を確認し、溶媒を除去した。物質をＤＭＳＯ ４ｍｌで希釈し、濾過した。粗生成物をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．１％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．１％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで３０ １００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させて、化合物１３２（13.9 mg、0.028 mmol、収率36.5％）を得た。
化合物１３３を類似的に調製した。
実施例１７－化合物１３４
Figure 2023512230000061
ステップ１．5－ブロモ－2－メチルピリジン－3－オール（5.0 g、26.6 mmol）のアセトニトリル（25.0 mL）撹拌溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（17.33 g、53.2 mmol）およびＭｅＩ（3.33 mL、53.2 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで９０分間撹拌し、次にＥｔＯＡｃおよび水の間で分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮し、油性残留物を得て、これを石油エーテル中に溶解し、濾過した。濾液を減圧濃縮し、5－ブロモ－3－メトキシ－2－メチルピリジン（3.8 g、16.36 mmol、収率61.5％）を褐色油として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝8.16－8.06（m，1H），7.64－7.53（m，1H），3.85（s，3H），2.31（s，3H）
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ２０２．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ２．ＤＭＦ（50.0 mL）およびエタノール（50.0 mL）の溶媒混合物中、5－ブロモ－3－メトキシ－2－メチルピリジン（3.5 g、17.32 mmol）の撹拌溶液に、ＴＥＡ（7.24 mL、52.0 mmol）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）．ＣＨ２Ｃｌ２付加物（2.83 g、3.46 mmol）を窒素パージしながら添加した。反応混合物を１００℃で、１０ｂａｒ圧のＣＯガス下で、オートクレーブで１６時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残留物を得て、これをＤＣＭ中に入れ、ＣＥＬＩＴＥ（商標）ベッドに通して濾過し、その後、過剰量のＤＣＭで洗浄した。次に濾液を減圧濃縮し、残留物を得た。粗生成物をＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈクロマトグラフィーにより、石油エーテル中、０－１００％ 酢酸エチルで溶出して精製し、エチル 5－メトキシ－6－メチルニコチネート（2.92 g、13.46 mmol、収率７８％）を褐色油として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝8.58－8.53（m，1H），7.68－7.63（m，1H），4.35（q，J=7.2 Hz，2H），3.90（s，3H），2.45－2.40（m，3H），1.38－1.29（m，3H）
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ １９６．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ３．エチル 5－メトキシ－6－メチルニコチネート（6.5 g、33.3 mmol）のＣＣｌ４（65.0 mL）撹拌溶液に、ＮＢＳ（7.11 g、40.0 mmol）およびＡＩＢＮ（1.094 g、6.66 mmol）を添加した。反応混合物を６５℃で１８時間撹拌した。反応混合物をＣＥＬＩＴＥ（商標）ベッドに通して濾過し、次にこれを過剰のＤＣＭで洗浄した。濾液を減圧濃縮し、残留物を得た。粗生成物をＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈクロマトグラフィーにより、石油エーテル中、０－１００％ 酢酸エチルで溶出して精製し、エチル 6－（ブロモメチル）－5－メトキシニコチネート（3.72 g、13.03 mmol、収率39.1％）を薄茶色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝8.64（s，1H），7.83（d，J=1.9 Hz，1H），4.69－4.65（m，2H），4.42－4.32（m，2H），4.00－3.95（m，3H），1.39－1.30（m，3H）
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ２７６．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ４．メチル （7－ヒドロキシ－3－ヨード－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（5.5 g、16.41 mmol）のＤＭＦ（20.0 mL）撹拌溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（10.70 g、32.8 mmol）を添加した。混合物を０℃に冷却し、エチル 6－（ブロモメチル）－5－メトキシニコチネート（4.50 g、16.41 mmol）を添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌した。水を添加した。沈殿した固体を濾過し、過剰量の水、続いて石油エーテルで洗浄した。固体を真空乾燥させ、エチル 6－（（7－ヒドロキシ－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチネート（4.1 g、6.60 mmol、収率40.2％）を薄茶色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝11.68－11.35（m，1H），8.51－8.46（m，1H），7.98－7.93（m，1H），7.80（d，J=1.5 Hz，1H），5.90－5.84（m，2H），4.40－4.29（m，2H），3.96（s，3H），3.74－3.65（m，3H），2.89（s，3H），2.73（s，3H），1.67（s，3H），1.31（t，J=7.2 Hz，3H）
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ５２９．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ５．エチル 6－（（7－ヒドロキシ－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチネート（3.9 g、7.38 mmol）のＤＭＳＯ（30.0 mL）撹拌溶液に、ＤＢＵ（3.34 mL、22.15 mmol）、ＢＯＰ（4.90 g、11.07 mmol）および（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン（2.63 g、7.38 mmol）を添加した。反応混合物を４５℃で２時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃおよび水の間で分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、残留物を得た。粗製化合物をＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈクロマトグラフィーにより、石油エーテル中、０－１００％ 酢酸エチルで溶出して精製し、エチル （S）－6－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチネート（1.98 g、1.921 mmol、収率26.0％）を薄茶色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝9.75（s，1H），8.31－8.27（m，1H），7.82（d，J=1.5 Hz，1H），7.63－7.30（m，11H），7.29－7.13（m，4H），5.87（s，2H），4.69－4.56（m，1H），4.28（q，J=7.2 Hz，2H），3.97（s，3H），3.70－3.61（m，2H），3.58（s，3H），1.92－1.78（m，2H），1.52（q，J=7.8 Hz，2H），1.26－1.25（m，1H），1.28－1.22（m，4H），1.19（br d，J=7.2 Hz，2H），1.02－0.95（m，1H），0.91（s，9H），0.79（t，J=7.2 Hz，3H）
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ８６６．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ６．エチル （S）－6－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－ヨード－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチネート（1.8 g、2.079 mmol）の1,4－ジオキサン（15.0 mL）撹拌溶液に、Ｋ２ＣＯ３（0.575 g、4.16 mmol）、トリメチルボロキシン（ＴＭＢ、0.522 g、4.16 mmol）およびＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）．ＣＨ２Ｃｌ２付加物（0.170 g、0.208 mmol）を窒素パージ下で添加した。反応混合物を１００℃で６時間撹拌した。混合物をＣＥＬＩＴＥ（商標）ベッドに通して濾過し、次にこれを過剰のＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を減圧濃縮し、残留物を得て、これをＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈクロマトグラフィーにより、石油エーテル中、５０－９０％ 酢酸エチルで溶出して精製し、エチル （S）－6－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチネート（0.52 g、0.600 mmol、収率28.9％）を赤色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝9.54（s，1H），8.35－8.29（m，1H），7.84－7.77（m，1H），7.55（dd，J=1.5，7.9 Hz，2H），7.50－7.45（m，2H），7.40－7.28（m，5H），7.24－7.18（m，2H），7.12（br d，J=8.3 Hz，1H），5.75（s，2H），4.60（br d，J=7.2 Hz，1H），4.29（q，J=7.1 Hz，2H），3.96（s，3H），3.72－3.63（m，2H），3.57（s，3H），2.29（s，3H），1.91－1.77（m，2H），1.61－1.46（m，2H），1.25（t，J=7.2 Hz，5H），0.91（s，10H），0.84－0.76（m，3H）
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ７５４．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ７．エチル （S）－6－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－5－メトキシニコチネート（0.4 g、0.531 mmol）のＴＨＦ（7.0 mL）およびＭｅＯＨ（3.0 mL）撹拌溶液に、ＬｉＢＨ４（ＴＨＦ中、２．０Ｍ）（2.65 mL、5.31 mmol）を添加した。反応混合物を４５℃で１６時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム溶液でクエンチし、次に酢酸エチルおよび水の間で分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、残留物を得た。粗生成物をＩＳＣＯ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈクロマトグラフィーにより、クロロホルム中、５－２０％ メタノールで溶出して精製し、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（5－（ヒドロキシメチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（358 mg、0.357 mmol、収率67.3％）を薄茶色固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ７１２．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ８．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（5－（ヒドロキシメチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.1 g、0.140 mmol）のＴＨＦ（3.0 mL）撹拌溶液に、ＳＯＣｌ２（0.2 mL、2.74 mmol）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（5－（クロロメチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.118 g、収率１００％と仮定）を薄茶色固体として得た。粗生成物をそのまま次のステップで使用した。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ７３０．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ９．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（5－（クロロメチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.11 g、0.151 mmol）のアセトニトリル（3.0 mL）撹拌溶液に、テトラヒドロ－2H－ピラン－4－アミン ヒドロクロライド（0.031 g、0.226 mmol）、Ｎａ２ＣＯ３（0.048 g、0.452 mmol）およびＫＩ（0.025 g、0.151 mmol）を添加した。反応混合物を５０℃で１６時間撹拌し、次にＣＥＬＩＴＥ（商標）ベッドに通して濾過し、過剰のＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を減圧濃縮し、残留物を得て、これをジエチルエーテルおよび石油エーテルでトリチュレートした。溶媒をデカントした後、残留物を真空乾燥させて、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（3－メトキシ－5－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（206 mg、0.018 mmol、収率12.04％）を褐色半固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ７９５．４ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ１０．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（3－メトキシ－5－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.2 g、0.252 mmol）のＭｅＯＨ（2.0 mL）撹拌溶液に、濃ＨＣｌ（1.0 mL、1.500 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで２時間撹拌した。混合物を減圧濃縮し、残留物を得て、これをジエチルエーテルおよび石油エーテルでトリチュレートした。溶媒をデカントした後、残留物を真空乾燥させて、メチル （S）－（7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（3－メトキシ－5－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（209 mg、0.086 mmol、収率34.3％）を褐色固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ５５７．４ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ１１．メチル （S）－（7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（3－メトキシ－5－（（（テトラヒドロ－2H－ピラン－4－イル）アミノ）メチル）ピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.2 g、0.359 mmol）の1,4－ジオキサン（2.0 mL）撹拌溶液に、ＮａＯＨ（1.0 mL、0.359 mmol）を添加した。反応混合物を８０℃で２時間撹拌し、ＲＴに冷ました。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相プレパラティブＬＣ／ＭＳ（カラム：Waters XBridge C18、19 x 150 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ；移動相Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：２０分かけて１０－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分保持；流速：１５ｍＬ/分）により精製した。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、Ｇｅｎｅｖａｃ装置を用いて遠心蒸発で乾燥させて、化合物１３４（27.2 mg、0.051 mmol、収率14.07％）を得た。
実施例１８－化合物１３５
Figure 2023512230000062
ステップ１．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（5－（クロロメチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.25 g、0.342 mmol）のＤＭＦ（3.0 mL）撹拌溶液に、2－（ピペラジン－1－イル）エタン－1－オール（0.089 g、0.685 mmol）およびＫ２ＣＯ３（0.142 g、1.027 mmol）を添加した。反応混合物を４５℃で３時間撹拌した。混合物をＣＥＬＩＴＥ（商標）ベッドに通して濾過し、その後、これを過剰量の酢酸エチルで洗浄した。濾液を減圧濃縮し、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（5－（（4－（2－ヒドロキシエチル）ピペラジン－1－イル）メチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（252 mg、0.260 mmol、収率７６％）を褐色固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ８２４．４ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ２．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（（5－（（4－（2－ヒドロキシエチル）ピペラジン－1－イル）メチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（200.0 mg、0.243 mmol）のＭｅＯＨ（2.0 mL）撹拌溶液に、濃ＨＣｌ（水中、１．５Ｎ ＨＣｌ）（2.0 mL、3.00 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残留物を得て、これをジエチルエーテルおよび石油エーテルでトリチュレートした。沈殿した固体を真空乾燥させ、メチル （S）－（1－（（5－（（4－（2－ヒドロキシエチル）ピペラジン－1－イル）メチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（210 mg、0.201 mmol、収率８３％）を得た。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ５８６．４ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ３．メチル （S）－（1－（（5－（（4－（2－ヒドロキシエチル）ピペラジン－1－イル）メチル）－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.25 g、0.427 mmol）の1,4－ジオキサン（2.0 mL）撹拌溶液に、ＮａＯＨ（2.5 mL、0.427 mmol）を添加した。反応混合物を７０℃で２時間撹拌し、ＲＴに冷ました。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、残留物を得た。残留物を逆相プレパラティブＬＣ／ＭＳ（カラム：Waters XBridge C18、19 x 150 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ；移動相Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：２０分かけて２０－７５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分保持；流速：１５ｍＬ/分）により精製した。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、Ｇｅｎｅｖａｃ装置を用いて遠心蒸発で乾燥させて、化合物１３５（37.0 mg、0.070 mmol、収率16.43％）を得た。
実施例１９－化合物１３７
Figure 2023512230000063
（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ[4,3－d]ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（30 mg、0.081 mmol）のＴＨＦ（1 mL）溶液をＳＯＣｌ２（0.012 mL、0.162 mmol）で処理し、ＲＴで３０分間撹拌した。溶媒をＶ－１０エバポレーターで蒸発させた。粗製塩化物をＤＭＳＯ（1 mL）中に溶解した。反応混合物を2－メチル－1－（ピペラジン－1－イル）プロパン－2－オール（25.6 mg、0.162 mmol）で処理し、７０℃で２時間加熱した。粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件で精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:ＮＨ４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１４％Ｂで０分保持、２０分かけて１４－５４％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件でさらに精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5:95 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95:5 アセトニトリル:０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。ＭＳシグナルにより収集がトリガーされる、化合物１３７を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。
実施例２０－出発物質および中間体
下記のチャートは、本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニストの調製用の出発物質または中間体として有用なことがある化合物を作成するためのスキームを示す。スキームは、出発物質または中間体として使用されることがある他の類似化合物の作成に適用され得る。使用される試薬は当技術分野において周知であり、多くの場合、その使用は前述の実施例に示されている。
チャート１
Figure 2023512230000064
 チャート２
Figure 2023512230000065
 チャート３
Figure 2023512230000066
生物学的活性
ＴＬＲ７アゴニストとして本明細書に開示される化合物の生物学的活性は、以下の手順により定量されることがある。
ヒトＴＬＲ７アゴニスト活性アッセイ
この手順は、本明細書に開示される化合物のヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）アゴニスト活性を定量する方法を説明する。
ヒトＴＬＲ７分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータートランスジーンを有する改変ヒト胚性腎臓ブルー細胞（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ細胞；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、非選択培地（１０％ウシ胎児血清（Sigma）を添加したＤＭＥＭ高グルコース（Invitrogen））中に懸濁した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ７細胞を３８４ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加し（１ウェルあたり１５，０００細胞）、１６－１８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ細胞が入ったウェルに化合物（100 nl）を添加し、処置した細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。処理から１８時間後、１０マイクロリットルの新たに調製したＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Invivogen）を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ２）、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＯＤ＝６２０ｎｍ）を用いてＳＥＡＰレベルを測定した。半数効果濃度値（ＥＣ５０；アッセイ基準値および最大値の中間の応答を引き起こす化合物濃度）を算出した。
ヒト血液におけるＩ型インターフェロン遺伝子（ＭＸ－１）およびＣＤ６９の誘導
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）ＭＸ－１遺伝子およびＢ細胞活性化マーカーＣＤ６９の誘導は、ＴＬＲ７経路の活性化で起こる下流のイベントである。以下は、ＴＬＲ７アゴニストに対する応答におけるそれらの誘導を測定するヒト全血アッセイである。
ヘパリン処置したヒト全血をヒト患者から回収し、１ｍＭで、ＴＬＲ７アゴニスト試験化合物で処置した。血液をＲＰＭＩ １６４０培地で希釈し、Ｅｃｈｏを使用して１ウェルあたり１０ｎＬプレドット（predot）し、最終濃度を１μＭとした（１０μＬの血液中に１０ｎＬ）。３０秒間振盪機で混合した後、プレートを覆い、３７℃のチャンバー内に終夜＝１７時間置いた。固定／溶解バッファーを調製し（Ｈ２０中５ｘ→１ｘ、３７℃で温める；Ｃａｔ＃ ＢＤ ５５８０４９）、後で使用するためにパームバッファーを（氷上で）維持した。
表面マーカー染色（ＣＤ６９）のために表面抗体を調製した：０．０４５μｌ ｈＣＤ１４－ＦＩＴＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ ＃ ＭＨＣＤ１４０１）＋０．６μｌ ｈＣＤ１９－ｅｆ４５０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ ＃ ４８－０１９８－４２）＋１．５μｌ ｈＣＤ６９－ＰＥ（ｃａｔ＃ ＢＤ５５５５３１）＋０．８５５μｌ ＦＡＣＳバッファー。３μｌ/ウェルで添加し、１０００ｒｐｍで１分間遠心し、振盪機で３０秒間混合し、氷上に３０分間置いた。３０分後、７０μＬの予め温めた１ｘ固定／溶解バッファーで刺激を停止させ、Feliex mateを用いて再懸濁し（１５回、プレートごとにチップを変えた）、３７℃で１０分間インキュベートした。
２０００ｒｐｍで５分間遠心し、ＨＣＳプレートウォッシャーで吸引し、振盪機で３０秒間混合し、次いで７０μＬのｄＰＢＳで洗浄し、ペレット状にすること２回（２０００ｒｐｍ、５分間）、５０μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ペレット状にすること１回（２０００ｒｐｍ、５分間）を行った。振盪機で３０秒間混合した。細胞内マーカー染色（ＭＸ－１）については：５０μｌのＢＤ ＰｅｒｍバッファーＩＩＩを添加し、振盪機で３０秒間混合した。氷上で３０分間インキュベートした（遮光）。５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し（透過処理後２３００ｒｐｍで５分間遠心）、続いて振盪機で３０秒間混合した。ＭＸ１抗体（(4812)－Ａｌｅｘａ ６４７：Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃ＮＢＰ２－４３７０４ＡＦ６４７）を含む２０μＬのＦＡＣＳバッファーで再懸濁した（２０μｌ ＦＡＣＳバッファー＋０．８ｕｌ ｈＩｇＧ＋０．０４μｌ ＭＸ－１）。１０００ｒｐｍで１分間遠心し、振盪機で３０秒間混合し、サンプルをＲＴで、暗所で４５分間インキュベートし、続いて２ｘＦＡＣＳバッファーで洗浄した（透過処理後２３００ｒｐｍで５分間遠心）。２０μｌのＦＡＣＳバッファーで再懸濁し（１ウェルあたり合計３５μＬ）、ホイルで覆い、４℃に置き、翌日に読み取った。プレートをｉＱｕｅＰｌｕｓで読み取った。結果をツールセットにロードし、カーブマスターでＩＣ５０曲線を作成した。ｙ軸の１００％は１μＭのレシキモドに設定されている。
マウス血液におけるＴＮＦ－アルファおよびＩ型ＩＦＮ応答遺伝子の誘導
ＴＮＦ－アルファおよびＩ型ＩＦＮ応答遺伝子の誘導は、ＴＬＲ７経路の活性化で起こる下流のイベントである。以下は、ＴＬＲ７アゴニストに対する応答における、マウス全血中のそれらの誘導を測定するアッセイである。
ヘパリン処置したマウス全血を、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ １６４０培地で、５：４の比率で希釈した（５０μＬの全血および４０μＬの培地）。体積９０μＬの希釈血液をＦａｌｃｏｎ平底９６ウェル組織培養プレートのウェルに移し、プレートを４℃で１時間インキュべートした。１００％ ＤＭＳＯストック中の試験化合物を、濃度応答アッセイのために同じ培地で２０倍希釈し、次いで１０μＬの希釈した試験化合物をウェルに添加し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．５％となるようにした。コントールウェルに、５％ ＤＭＳＯを含む１０μＬの培地を添加した。次にプレートを３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター内で１７時間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬの培地を各ウェルに添加した。プレートを遠心し、１３０μＬの上清を除去し、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦα産生のアッセイに使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号 ８８－７３２４ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより）。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｍＲＮＡ Ｃａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓキット（Ｃａｔ＃ Ｋ１５７０－０２）に由来する、ＤＴＴを含む体積７０μＬのｍＲＮＡキャッチャー溶解バッファー（１ｘ）を、ウェル中の残りの７０μＬサンプルに添加し、ピペッティングにより５回混合した。次にプレートをＲＴで５－１０分間振盪し、続いて２μＬのプロテイナーゼＫ（20 mg/mL）を各ウェルに添加した。次にプレートを１５－２０分間、ＲＴで振盪した。次に、さらに処理するまでの間、プレートを－８０℃で保存した。
冷凍サンプルを解凍し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｍＲＮＡ Ｃａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓキット（Ｃａｔ＃ Ｋ１５７０－０２）を用いて、製造業者の説明書に従ってｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出から得られたｍＲＮＡの半量を用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｃａｔ＃ １１７５６５００）を使用して、２０μＬの逆転写酵素反応でｃＤＮＡを合成した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲを行った。全てのリアルタイムＰＣＲ反応を、市販のマウスＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＭＸ１およびＰＰＩＡ遺伝子発現用プレデザインＴａｑＭａｎアッセイ並びにＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、２回繰り返して行った。ＰＰＩＡは、ハウスキーピング遺伝子として利用した。製造業者からの勧告に従った。全ての生データ（Ｃｔ）を平均ハウスキーピング遺伝子（Ｃｔ）で正規化し、次に比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法を利用して、実験解析のために、相対的な遺伝子発現量（ＲＱ）を定量化した。
定義
「脂肪族」は、特定の数の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和非芳香族炭化水素部分を意味し（例えば、「Ｃ３脂肪族」、「Ｃ１－５脂肪族」、「Ｃ１－Ｃ５脂肪族」、または「Ｃ１からＣ５脂肪族」のように。後者３つの表現は１から５個の炭素原子を有する脂肪族部分と同義である）、炭素原子の数が明確に特定されない場合は、１から４個の炭素原子（不飽和脂肪族部分の場合は２から４個の炭素）である。同様の理解が、他の種類における炭素の数、つまりＣ２－４アルケン、Ｃ４－Ｃ７シクロ脂肪族などに適用される。同様に、「（ＣＨ２）１－３」などの用語は、下付き文字が１、２、または３であることの省略表現として理解されるべきであり、そのため、かかる用語は、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２を表すことになる。
「アルキル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う飽和脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ１－Ｃ４アルキル部分には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、t－ブチル、1－ブチル、2－ブチル、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。「アルカンジイル」（時として「アルキレン」とも呼ばれる）は、アルキル基の２価の対応物を意味し、例えば、
Figure 2023512230000067
 などがある。
「アルケニル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う、少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ２－Ｃ４アルケニル部分には、エテニル（ビニル）、2－プロペニル（アリルまたはプロプ－2－エニル）、シス－1－プロペニル、トランス－1－プロペニル、Ｅ－（またはＺ－）2－ブテニル、3－ブテニル、1,3－ブタジエニル（ブト－1,3－ジエニル）、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。
「アルキニル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う、少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ２－Ｃ４アルキニル基には、エチニル（アセチレニル）、プロパルギル（プロプ－2－イニル）、1－プロピニル、ブト－2－イニル、および同類のものが挙げられる。
「シクロ脂肪族」は、１から３個の環を有し、各環が、３から８個（好ましくは３から６個）の炭素原子を有する、飽和または不飽和非芳香族炭化水素部分を意味する。「シクロアルキル」は、各環が飽和であるシクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルケニル」は、少なくとも一つの環が少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する、シクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルキニル」は、少なくとも一つの環が少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する、シクロ脂肪族部分を意味する。実例として、シクロ脂肪族部分には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、およびアダマンチルが挙げられるが、これらに限らない。好ましいシクロ脂肪族部分は、シクロアルキル部分、特にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルである。「シクロアルカンジイル」（時として「シクロアルキレン」とも呼ばれる）は、シクロアルキル基の２価の対応物を意味する。同様に、「ビシクロアルカンジイル」（または「ビシクロアルキレン」）および「スピロアルカンジイル」（または「スピロアルキレン」）は、ビシクロアルキルおよびスピロアルキル（または「スピロシクロアルキル」）基の２価の対応物を指す。
「ヘテロシクロ脂肪族」は、少なくとも一つのその環において、最大３個（好ましくは１から２個）の炭素が、Ｎ、ＯまたはＳから独立して選択されるヘテロ原子で置換されており、ここでＮおよびＳは、適宜酸化されてもよく、Ｎは、適宜四級化されてもよい、シクロ脂肪族部分を意味する。好ましいシクロ脂肪族部分は、５から６員の大きさの１つの環からなる。同様に、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」、および「ヘテロシクロアルキニル」は、少なくとも一つのその環が、そのように修飾されている、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはシクロアルキニル部分をそれぞれ意味する。代表的なヘテロシクロ脂肪族部分には、アジリジニル、アゼチジニル、1,3－ジオキサニル、オキセタニル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニルスルホン、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルスルホキシド、チオモルホリニルスルホン、1,3－ジオキソラニル、テトラヒドロ－1,1－ジオキソチエニル、1,4－ジオキサニル、チエタニル、および同類のものが挙げられる。「ヘテロシクロアルキレン」は、ヘテロシクロアルキル基の２価の対応物を意味する。
「アルコキシ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」、および「アリールチオ」は、それぞれ、－Ｏ（アルキル）、－Ｏ（アリール）、－Ｓ（アルキル）、および－Ｓ（アリール）を意味する。例は、それぞれ、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、およびフェニルチオである。
「ハロゲン」または「ハロ」は、より狭い意味が指示されない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
「アリール」は、各環が３から７個の炭素原子を有し、少なくとも一つの環が芳香族である、単、二、または三環式環系（好ましくは単環式）を有する、炭化水素部分を意味する。環系中の環は、（ナフチルのように）互いに縮合していてもよく、（ビフェニルのように）互いに結合していてもよく、（インダニルまたはシクロヘキシルフェニルのように）非芳香環と縮合または結合していてもよい。さらなる実例として、アリール部分には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントラセニル、およびアセナフチルが挙げられるが、これらに限らない。「アリーレン」は、アリール基の２価の対応物、例えば1,2－フェニレン、1,3－フェニレン、または1,4－フェニレンを意味する。
「ヘテロアリール」は、各環が３から７個の炭素原子を有し、少なくとも一つの環が、Ｎ、Ｏ、またはＳから独立して選択される１から４個のヘテロ原子を含む芳香環であり、ここでＮおよびＳは、適宜酸化されてもよく、Ｎは、適宜四級化されてもよい、単、二、または三環式環系（好ましくは５から７員の単環式）を有する部分を意味する。そのような少なくとも一つのヘテロ原子を含む芳香環は、（ベンゾフラニルまたはテトラヒドロイソキノリルのように）他の種類の環と縮合してもよく、（フェニルピリジルまたは2－シクロペンチルピリジルのように）他の種類の環と直接結合してもよい。さらなる実例として、ヘテロアリール部分には、ピロリル、フラニル、チオフェニル（チエニル）、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、N－オキソピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、シンノリニル、キノザリニル、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フェノチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、ジベンゾチオフェニル、アクリジニル、および同類のものが挙げられる。「ヘテロアリーレン」は、ヘテロアリール基の２価の対応物を意味する。
例えば「非置換の、または置換された」あるいは「適宜置換されてもよい」を用いる、つまり「非置換の、または置換されたＣ１－Ｃ５アルキル」あるいは「適宜置換されてもよいヘテロアリール」と表現するなどして、部分が置換されてもよいということが示される場合、かかる部分は、一つ以上の独立して選択される置換基、好ましくは数にして１から５個、より好ましくは数にして１から２個の置換基を有してもよい。置換基および置換パターンは、置換基が結合する部分を考慮して当業者により選択されることがあり、化学的に安定で、当技術分野で既知の技術、ならびに本明細書に記載される方法により合成され得る化合物を提供する。部分が、「非置換の、または置換された」あるいは「適宜置換されてもよい」ものとして特定される場合、好ましい実施形態において、かかる部分は非置換である。
「アリールアルキル」、「（ヘテロシクロ脂肪族）アルキル」、「アリールアルケニル」、「アリールアルキニル」、「ビアリールアルキル」、および同類のものは、場合によっては、アリール、ヘテロシクロ脂肪族、ビアリールなどで置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニル部分を、場合によっては、例えば、ベンジル、フェネチル、N－イミダゾイルエチル、N－モルホリノエチル、および同類のもののように、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分で開いた（不満足な）原子価を有する部分を意味する。反対に、「アルキルアリール」、「アルケニルシクロアルキル」、および同類のものは、場合によっては、アルキル、アルケニルなどで置換されたアリール、シクロアルキル、その他の部分、場合によっては、例えば、メチルフェニル（トリル）またはアリルシクロヘキシルのような部分を意味する。「ヒドロキシアルキル」、「ハロアルキル」、「アルキルアリール」、「シアノアリール」、および同類のものは、場合によっては、一つ以上の特定の置換基（場合によっては、ヒドロキシル、ハロなど）で置換されたアルキル、アリール、その他の部分を意味する。
例えば、許容される置換基には、アルキル（特にメチルまたはエチル）、アルケニル（特にアリル）、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ（特にフルオロ）、ハロアルキル（特にトリフルオロメチル）、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル（特にヒドロキシエチル）、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）（特に－ＯＣＦ３）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、－Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、－ＮＨ２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＯＳＯ２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（シクロアルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－ＳＯ２（アルキル）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（アルキル）２、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。
置換される部分が脂肪族部分の場合、好ましい置換基は、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、－Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、－ＮＨ２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＯＳＯ２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－Ｓ（シクロアルキル）、－ＳＯ２（アルキル）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、および－ＳＯ２Ｎ（アルキル）２である。より好ましい置換基は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（アリール）、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、－ＮＨ２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、および－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。特に好ましい置換基は、フェニル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ、Ｏ（Ｃ２－Ｃ４アルカンジイル）ＯＨ、およびＯ（Ｃ２－Ｃ４アルカンジイル）ハロである。
置換される部分がシクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、またはヘテロアリール部分の場合、好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）、－Ｏ（アリール）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、アルキルチオ、アリールチオ、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、－ＮＨ２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＯＳＯ２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（シクロアルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－ＳＯ２（アルキル）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、および－ＳＯ２Ｎ（アルキル）２である。より好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－ＮＨ２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、および－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。特に好ましい置換基は、Ｃ１－Ｃ４アルキル、シアノ、ニトロ、ハロ、およびＣ１－Ｃ４アルコキシである。
「Ｃ１－Ｃ５アルキル」または「５から１０％」のように範囲が述べられる場合、かかる範囲は、範囲の終点、つまり第一の例においてはＣ１およびＣ５、並びに第二の例においては５％および１０％を含む。
（例えば、構造式中の関連する立体中心における価標を太線にするか、または破線にすることにより、構造式中で、二重結合をＥまたはＺ配置を有するものとして描くことにより、あるいは立体化学を指定する命名法または記号を用いることにより）特定の立体異性体が明確に指示されない限り、全ての立体異性体が、純粋化合物ならびにその混合物として本発明の範囲内に含まれる。特に断らない限り、ラセミ体、個々のエナンチオマー（光学的に純粋であろうと部分的に分割されていようと）、ジアステレオマー、幾何異性体、およびそれらの組み合わせ、並びにそれらの混合物は、本発明により全て包含される。
当業者は、化合物が、本明細書で使用される構造式に描かれるものと同等の互変異性体（例えば、ケトおよびエノール形）、共鳴構造、および双性イオン型を有することがあり、構造式は、そのような互変異性体、共鳴構造、双性イオン型を包含するということを認識するであろう。
「薬学的に許容されるエステル」は、インビボで（例えば人体内で）加水分解し、親化合物またはその塩を生成するか、あるいはそれ自体が親化合物の活性と類似のそれを有するエステルを意味する。適当なエステルには、Ｃ１－Ｃ５アルキル、Ｃ２－Ｃ５アルケニルまたはＣ２－Ｃ５アルキニルエステル、特にメチル、エチルまたはｎ－プロピルエステルが挙げられる。
「薬学的に許容される塩」は、医薬製剤に適する化合物の塩を意味する。化合物が一つ以上の塩基性基を有する場合、塩は、酸付加塩、例えば、硫酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、塩酸塩、乳酸塩、メチル硫酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、メシル酸塩、ラクトビオン酸塩、スベリン酸塩、トシル酸塩、および同類のものなどであり得る。化合物が一つ以上の酸性基を有する場合、塩は、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、アンモニウム塩、亜鉛塩、ピペラジン塩、トロメタミン塩、リチウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、4－フェニルシクロヘキシルアミン塩、ベンザチン塩、ナトリウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、および同類のものなどの塩であり得る。多形結晶性形態および溶媒和物も本発明の範囲内に包含される。
「患者（subject）」は動物を指し、霊長類（例えば、ヒト）、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウスを含むが、これらに限らない。「患者（subject）」および「患者（patient）」という用語は、例えば、ヒトなどの哺乳動物の患者に関して、本明細書で互換的に使用される。
「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、および「治療（treatment）」という用語は、疾患または障害の治療の文脈において、障害、疾患、または病態、あるいは障害、疾患、もしくは病態に関連する症状のうちの一つ以上を軽減するか、または抑制すること；あるいは疾患、障害、または病態の、あるいは一つ以上のそれらの症状の進行、拡大または悪化を遅らせることを含むように意図される。「がんの治療」は、以下の効果のうちの一つ以上を指す：（１）（ｉ）遅延および（ｉｉ）完全な増殖停止を含む、ある程度の腫瘍増殖の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍の大きさの維持；（４）腫瘍の大きさの減少；（５）末梢臓器への腫瘍細胞浸潤の（ｉ）減少、（ｉｉ）遅延または（ｉｉｉ）完全な予防を含む阻害；（６）転移の（ｉ）減少、（ｉｉ）遅延または（ｉｉｉ）完全な予防を含む阻害；（７）（ｉ）腫瘍の大きさの維持、（ｉｉ）腫瘍の大きさの減少、（ｉｉｉ）腫瘍の増殖の遅延、（ｉｖ）浸潤の減少、遅延または予防をもたらすことがある、抗腫瘍免疫応答の増強および／または（８）ある程度の、障害に関連する一つ以上の症状の重症度または数の軽減。
本明細書の式において、価標に対して横方向の波線（
Figure 2023512230000068
 ）または価標の末端にあるアスタリスク（＊）は、共有結合部位を意味する。例えば、式
Figure 2023512230000069
 において、Ｒは
Figure 2023512230000070
 である、またはＲは
Figure 2023512230000071
 であるという記述は、
Figure 2023512230000072
 を意味する。
本明細書の式において、その２つの炭素の間で芳香環を横切る価標は、その価標に結合する基が、黙示的にそこにある（または、完全に書かれている場合、明示的にそこにある）水素の除去によって空きができる芳香環の位置のうちのどこにあってもよいということを意味する。実例として、下記の式：
Figure 2023512230000073
 は、
Figure 2023512230000074
 を表す。
他の実例において、
Figure 2023512230000075
 は、
Figure 2023512230000076
 を表し、
Figure 2023512230000077
 は、
Figure 2023512230000078
 を表す。
本開示は、本明細書に記載される化合物で生じる原子の全ての同位体を含む。同位体は、原子番号は同じだが異なる質量数を有する原子を含む。一般的な例であり、限定ではないが、水素の同位体には重水素およびトリチウムが挙げられる。炭素の同位体には、１３Ｃおよび１４Ｃが挙げられる。同位体標識した本発明の化合物は、一般的に、他の場合に使用される非標識試薬の代わりに、同位体標識した適切な試薬を用いて、当業者に既知の従来の技術により、または本明細書に記載されるものと類似の工程により調製され得る。例として、Ｃ１－Ｃ３アルキル基は、重水素化されていなくても、部分的に重水素化されていても、完全に重水素化されていてもよく、「ＣＨ３」には、ＣＨ３、１３ＣＨ３、１４ＣＨ３、ＣＨ２Ｔ、ＣＨ２Ｄ、ＣＨＤ２、ＣＤ３などが含まれる。一つの実施形態において、化合物中の様々な元素は、それらの天然の同位体存在度で存在する。
当業者は、特定の構造はどちらの互変異性体－例えば、ケトかエノールか－で描かれてもよく、その２つの形態は等価であるということを認識するであろう。
アクロニムおよび略語
これは、本明細書で使用されるアクロニムおよび略語にその意味を添えた表である。
Figure 2023512230000079
Figure 2023512230000080
参考文献
本明細書の初めの方で、筆頭著者（または発明者）および日付により省略された形で引用される以下の参考文献に対する完全な引用を以下に提供する。これらの参考文献のそれぞれは、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
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前述の本発明の詳細な説明は、本発明の特定の部分または態様に、主にまたは排他的に関係する節を含む。これは、明確化のため、および便宜のためであり、特定の特徴は、それが開示される節だけでなくその他の節においても関連していることがあり、本明細書における開示は、異なる節に記載される情報の、全ての適切な組み合わせを含むことが理解されるべきである。同様に、本明細書における様々な図および説明は、本発明の特定の実施形態に関するが、具体的な特徴が、特定の図または実施形態の文脈で開示される場合、かかる特徴は、適切な範囲で、別の図または実施形態の文脈で、別の特徴と組み合わせて、または本発明一般においても使用され得るということが理解されるべきである。
さらに、本発明は、特定の好ましい実施形態について特に記載されているが、本発明は、かかる好ましい実施形態に限定されない。それどころか、本発明の範囲は、添付の請求項により定義される。

Claims (13)

  1. 下記の式（Ｉ）：
    Figure 2023512230000081
     ［式中、
    各Ｘ１は、独立してＮまたはＣＲ２であり；
    Ｘ２は、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、Ｓ、またはＮ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）であり；
    Ｒ１は、（Ｃ１－Ｃ５アルキル）、
    （Ｃ２－Ｃ５アルケニル）、
    （Ｃ１－Ｃ８アルカンジイル）０－１（Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル）、
    （Ｃ２－Ｃ８アルカンジイル）ＯＨ、
    （Ｃ２－Ｃ８アルカンジイル）Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
    （Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１（５－６員ヘテロアリール）、
    （Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１フェニル、
    （Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＣＦ３、
    （Ｃ２－Ｃ８アルカンジイル）Ｎ［Ｃ（=Ｏ）］（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
    または
    （Ｃ２－Ｃ８アルカンジイル）ＮＲｘＲｙであり；
    各Ｒ２は、独立してＨ、Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、Ｓ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
    ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、Ｃ１－Ｃ３アルキル、Ｏ（Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル）、
    Ｓ（Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル）、ＳＯ２（Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル）、
    Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、または［Ｃ（=Ｏ）］０－１ＮＲｘＲｙであり；
    Ｒ３は、ＮＨ（Ｃ１－Ｃ５アルキル）、Ｎ（Ｃ１－Ｃ５アルキル）２、
    ＮＨ（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１（Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル）、
    Ｎ（Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル）２、ＮＨ（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１（アリール）、または下記の構造：
    Figure 2023512230000082
     を有する環状アミン部分であり；
    Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ５アルキル、Ｃ２－Ｃ５アルケニル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、
    ハロ、Ｏ（Ｃ１－Ｃ５アルキル）、（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＯＨ、
    （Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、フェニル、
    ＮＨ（Ｃ１－Ｃ５アルキル）、５もしくは６員ヘテロアリール、
    Figure 2023512230000083
     であり；
    ＲｘおよびＲｙは、独立してＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、あるいはＲｘおよびＲｙは、それらに結合している窒素と結合して３から７員のヘテロ環を形成し；
    ｍは、０または１であり；
    ｎは、１、２、または３であり；
    ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ５において、
    アルキル部分、アルカンジイル部分、シクロアルキル部分、または下記の式：
    Figure 2023512230000084
     で示される部分は、
    ＯＨ、ハロ、ＣＮ、（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
    Ｃ（=Ｏ）（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、ＮＲｘＲｙ、
    （Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＯＨ、（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）
    から選択される一つ以上の置換基で適宜置換されてもよく；
    アルキル、アルカンジイル、シクロアルキル、または下記の式：
    Figure 2023512230000085
     で示される部分は、
    Ｏ、ＳＯ２、ＣＦ２、Ｃ（=Ｏ）、ＮＨ、
    Ｎ［Ｃ（=Ｏ）］０－１（Ｃ１－Ｃ３アルキル）、
    Ｎ［Ｃ（=Ｏ）］０－１（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＣＦ３、
    Ｎ［Ｃ（=Ｏ）］０－１（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）ＯＨ、
    または
    Ｎ［Ｃ（=Ｏ）］０－１（Ｃ１－Ｃ４アルカンジイル）０－１（Ｃ３－Ｃ５シクロアルキル）
    に置換されるＣＨ２基を有してもよい］
    で示される構造を有する化合物。
  2. 下記の式（Ｉａ）：
    Figure 2023512230000086
     で示される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
  3. 下記の式（Ｉｂ）：
    Figure 2023512230000087
     で示される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
  4. Ｒ１が、
    Figure 2023512230000088
     である、請求項３に記載の化合物。
  5. Ｒ３が、
    Figure 2023512230000089
     である、請求項３に記載の化合物。
  6. Ｒ５が、
    Figure 2023512230000090
     である、請求項１に記載の化合物。
  7. Ｒ１が、
    Figure 2023512230000091
     であり、
    Ｒ３が、
    Figure 2023512230000092
     であり、
    Ｒ５が、
    Figure 2023512230000093
     である、請求項６に記載の化合物。
  8. 下記の式（Ｉｂ）：
    Figure 2023512230000094
     ［式中、
    Ｒ１が、
    Figure 2023512230000095
     であり；
    Ｒ３が、
    Figure 2023512230000096
     であり；
    Ｒ５が、ＭｅまたはＣＨ２ＯＨである］
    で示される構造を有する化合物。
  9. がんを患う患者に、抗がん免疫療法剤および請求項１または８に記載の化合物の治療的に有効な組み合わせを投与することを特徴とする、がんの治療方法。
  10. 前記抗がん免疫療法剤が、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記がんが、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫を含む）、皮膚癌（黒色腫およびメルケル皮膚癌を含む）、尿路上皮癌（膀胱癌を含む）、胃癌、肝細胞癌、または結腸直腸癌である、請求項９に記載の方法。
  12. 前記抗がん免疫療法剤が、イピリムマブ、ニボルマブ、またはペムブロリズマブである、請求項１１に記載の方法。
  13. 下記の式（Ｉｃ）：
    Figure 2023512230000097
     で示される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
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