CN114401738A

CN114401738A - 作为疫苗佐剂的tlr4和tlr7配体制剂

Info

Publication number: CN114401738A
Application number: CN202080034106.7A
Authority: CN
Inventors: D·A·卡森; H·B·科塔姆; T·林; M·P·科尔
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2022-04-26
Also published as: CA3132994A1; EP3908316A4; IL286254A; EP3908316A1; JP2022525608A; KR20220035870A; AU2020236254A1; US20220152188A1; WO2020186229A1

Abstract

提供了一种增强哺乳动物免疫反应的方法和包括脂质体、TLR4激动剂和TLR7激动剂的组合物。

Description

作为疫苗佐剂的TLR4和TLR7配体制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月14日提交的美国申请第62/818,517号的权益，其公开内容通过引用纳入本申请中。

政府权利声明

本发明得到美国政府支持，是美国国立卫生研究院拨款项目HHSN272200900034C中完成的发明。美国政府享有本发明的某些权利。

背景技术

保护个体免受许多传染病潜在威胁的最有效方法是接种疫苗。有效的疫苗接种需要使用能够在宿主体内引发免疫反应，从而能够抵抗疫苗针对的特定病原体而提供后续保护的抗原。因此，疫苗抗原必须具有足够的免疫原性，从而诱导一定水平的体液和/或细胞介导的免疫反应—在宿主中具有保护作用。全球关注的病原体是流感病毒。季节性流感病毒每年都会引发流行病，造成全球250–500,000人死亡(WHO)，去年冬天仅美国就造成超过8万人死亡。此外，有时还会出现新的流行病，造成数百万人死亡—构成非常现实的全球威胁。特别容易遭受这些威胁的是老年人、新生儿和免疫受损个体等高危人群。如果与季节性流行的病毒株相匹配，针对季节性流感的疫苗接种可能具有适度的效果。然而，由于流感病毒不断发生变化(抗原漂移)，很难预测下一个流感季节或下一次大流行将传播什么亚型和病毒株，并且需要允许有充足的时间(约6个月)开展常规疫苗的生产和销售。

这些常规疫苗通常基于与流感血凝素(HA)蛋白相关的抗原，特别是该蛋白的头部球状结构域。这种高度免疫原性的头部结构域在流感病毒不同菌株和亚型之间是变化的，因此，针对一种头部球状结构域亚型的免疫反应可能仅限于该特定的头部结构域，无法针对具有不同头部结构域的病毒株提供适当的免疫反应。源自蛋白质的茎或杆状结构域的流感HA抗原在病毒株中具有更高的保守性，通常比在常规疫苗中占优势的头部结构域抗原的免疫原性要低得多，因此需要将这些HA杆状抗原的免疫原性提高到可以在宿主中产生足够免疫反应的水平，从而产生针对多种流感毒株的免疫反应。

发明内容

在对抗全球重要病原体(如流感病毒)的疫苗中，成功使用合适的佐剂组合制剂可能代表医学向前迈出了重要一步，扩大和加强了对个体的保护，使其免受这些病毒病原体不断变化的威胁。

本发明提供在同一脂质体纳米颗粒中配制作为佐剂的TLR4激动剂与TLR7激动剂的组合，提供优于激动剂单独配制再混合的组合和未配制激动剂的组合的若干优点。配制的组合在纳米颗粒中具有特定比例的TLR4与TLR7，从而获得所需的免疫活性。根据各种化合物组合比例得到的数据，单独配制每种化合物和组合配制每种化合物。将配制与未配制的组合，同一颗粒中混合和组合的组合一起进行比较。免疫研究的结果表明，脂质体中某些比例的组合化合物提供了比单独的化合物更大和更广泛的免疫活性，并且配制的组合比未配制的组合更好。使用的抗原是OVA和灭活流感病毒。

正如本文所公开的那样，将2B182C(示例性TLR4激动剂)和1V270(示例性TLR7激动剂)一起配制在一种制剂中，并在小鼠中开展免疫研究。根据各种化合物组合比例得到的数据，每种化合物都单独配制和组合配制。将配制与未配制的组合，同一颗粒中混合和组合的组合一起进行比较。免疫研究的结果表明，脂质体中某一比例的组合化合物提供了比单独的化合物更大和更广泛的免疫活性，并且配制的组合比未配制的组合更好。使用的抗原是OVA和灭活流感病毒。

在一个实施例中，本发明提供一种增强哺乳动物免疫反应的方法，包括向有需要的哺乳动物施用有效剂量的TLR4激动剂和TLR7激动剂。在一个实施例中，同时施用TLR4激动剂和TLR7激动剂。在一个实施例中，TLR4激动剂和TLR7激动剂以脂质体制剂形式施用。在一个实施例中，TLR4激动剂和TLR7激动剂在分开的脂质体制剂中施用。在一个实施例中，TLR4激动剂具有式(II)结构。在一个实施例中，TLR7激动剂具有式(I)结构。在一个实施例中，还施用一种或多种免疫原(抗原)，例如，与佐剂同时施用，并且任选在与佐剂相同的制剂中施用。在一个实施例中，免疫原是微生物免疫原。在一个实施例中，微生物是病毒，例如流感或水痘，或细菌。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，TLR7激动剂的用量是大约0.01至100nmol、大约0.1至10nmol或大约100nmol至大约1000nmol。在一个实施例中，TLR4激动剂的用量是大约2至20umol、大约20nmol至2umol，或大约2umol至约100umol。在一个实施例中，TLR7激动剂与TLR4激动剂的比例是大约1:10、1:100、1:200、5:20、5:100或5:200。在一个实施例中，所述制剂是注射施用。在一个实施例中，脂质体制剂包含DOPC、胆固醇或它们的组合。还提供包含脂质体、TLR4激动剂和TLR7激动剂的药物制剂，例如，其中脂质体包含DOPC、胆固醇或它们的组合，其中在一个实施例中，TLR7激动剂的用量是大约0.01至100nmol、约0.1至10nmol，或约100nmol至约1000nmol；其中TLR4激动剂的用量是约2nmol至20umol、约20nmol至2umol或约2umol至约100umol；或其中TLR7与TLR4激动剂的比例是约1:10、1:100、1:200、5:20、5:100或5:200。

附图说明

图1：示例性脂质体制剂。

图2：1V270(1μM)、2B182C(200μM)或1V270(1μM)和2B182C(200mM)组合的DMSO或脂质体制剂的体外免疫刺激活性。

将来自野生型C57BL/6小鼠的小鼠骨髓来源树突状细胞与1V270(1μM)、2B182C(200μM)或1V270(1μM)和2B182C(200mM)组合的DMSO或脂质体制剂一起培养18小时。采用ELISA测定培养物上清液中的IL-6释放情况。

图3：脂质体制剂减轻非TLR4依赖性细胞毒性。

将来自野生型C57BL/6小鼠或TLR4缺陷小鼠(C57BL/6背景)的小鼠骨髓衍生树突状细胞与1V270(1μM)、2B182C(200μM)或1V270(1μM)和2B182C(200mM)组合的DMSO或脂质体制剂一起培养18小时。采用MTT测定评估细胞活力。

图4：示例性实验方案。

图5：制剂的抗-HA IgG1和IgG2a水平。

图6：制剂的IgG2a/IgG1的比。

图7：GC细胞和浆母细胞的设门策略。

图8：通过施用1V270和/或2B182c或AddaVax诱导的细胞类型。配制的1V270和2B182c组合显著增加了GC B细胞和浆母细胞的数量。

图9：采用ELISA或BCR-seq测定的施用1V270和/或2B182c或AddaVax诱导的抗-HAIgG水平。通过组合处理，IgG2a的产生量显著增加，并且配制2B182c诱导了Th1反应。

图10：组合处理增加了BCR多样性。

图11：施用抗原和1V270和/或2B182c或AddaVax后的TCR克隆性。2B182c处理和Addavax后TCR克隆性增加。

图12：施用1V270和/或2B182c或AddaVax后的BCR多样性和TCR克隆性。BCR多样性通过组合处理增加，2B182c处理和Addavax后TCR克隆性增加。

图13：克隆相似性。

图14：共享克隆。

图15：聚类分析。

图16：与已知抗流感抗体具有相似序列的聚类数。

图17：细胞毒性和IL-12分泌分析。脂质体佐剂在BMDC中以较低的细胞毒性诱导IL-12分泌。

图18：施用1V270和/或2B182c(未配制和配制)或AddaVax后的抗-NA IgG1和IgG2a分析。

图19A-19B：2B182c和1V270的脂质体制剂使免疫反应偏向于Th1反应。(A)BALB/c小鼠在第0天和第28天采用与TLR4配体和/或TLR7配体的DMSO(D)或脂质体(L)制剂混合的灭活Cal 2009H1N1流感病毒(10μg/针)进行免疫。在第28天采集血清，并通过ELISA测定HA或NA特异性IgG1和IgG2a。(B)Th1/TH2平衡通过IgG2a/IgG1之比进行评估。^*P<0.05，^**P<0.001，Mann-Whitney检验。

图20A-20C：通过采用脂质体2B182c和1V270组合辅助处理，引流淋巴结中生发中心B细胞和浆母细胞的数量增加。(A)实验方案。(B)流式细胞术数据的设门策略。(C)计算了B细胞、生发中心B细胞(CD3^-CD19⁺CD95⁺GL7⁺)和浆母细胞(CD3^-CD19⁺CD138⁺)的总数量。BL；空白脂质体。^*；p<0.05，^**；p<0.01，^***；p<0.001，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验，与抗原+BL比较。

图21A-21B：2B182C在较低浓度下对人(A)和小鼠(B)TLR4均有效。HEK TLR报告细胞(HEK-Blue^TM hTLR4和HEK-Blue^TM mTLR4)采用化合物1Z105和2B182C(从10μM开始2倍连续稀释)处理20小时。根据制造商的方案评估培养物上清液中的NF-kB诱导型NF-kB SEAP水平。

图22A-22C：200nmol/针2B182c诱导更高水平的抗原特异性IgG1和抗-NA IgG2a。(A)比较1Z105和2B182C两种TLR激动剂的实验方案。对BALB/c小鼠(n＝5只/组)采用肌肉注射免疫，在第0天和第21天在两条后腿中采用IIAV(10μg/针)和TLR4激动剂1Z105或2B182C(40和200nmol/针)免疫，在第28天取血，并通过ELISA评估血清中的抗血凝素(HA)抗体和抗神经氨酸酶(NA)抗体。采用10％DMSO作为溶媒。(B)抗-HA和抗-NA IgG1抗体。(B)抗-HA和抗-NA IgG2a抗体。在每个箱线图中，箱内的线代表中位数，界限是上下四分位数，柱形表示最小值和最大值。^*P<0.05，^**P<0.01，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验(vs.抗原+溶媒)。

图23A-23C：2B182C和TLR7激动剂1V270的组合增加了抗原特异性IgG1和IgG2a。(A-C)BALB/c小鼠(n＝5-6)采用IIAV和佐剂免疫，如图2A所示。AddaVax^TM与MF59制剂相似，用作阳性对照。通过ELISA测定抗-HA和抗-NA IgG1产生量(A)、抗HA和抗-NA IgG2a产生量(B)。在每个箱线图中，箱内的线代表中位数，界限是上下四分位数，柱形表示最小值和最大值。^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验。比较了除无抗原和AddaVax之外的四组(所有配对)。(C)5-11只小鼠/组显示的所有组合处理诱导的抗-HAIgG1和IgG2a水平(归一化到溶媒)。每个点表示个体动物。黑色实线表示IgG2a/IgG1＝1。所有采用1V270和2B182C组合免疫的动物均分布在IgG2a/IgG1＝1以上，表明这些小鼠的免疫平衡偏向于Th1免疫反应。

图24A-24B：第28天抗原特异性IgM的产生量。(A和B)BALB/c小鼠(n＝5-6)采用IIAV(10μg/针)和图2A所示佐剂免疫。通过ELISA测定抗原特异性IgM水平。(A)由TLR4激动剂1Z105或2B182C(40和200nmol/针)诱导的抗-HA和抗-NA IgM的产生量。(B)TLR7激动剂1V270(1nmol/针)和TLR4激动剂1Z105或2B182C(200nmol/针)的组合对抗原特异性IgM诱导的影响很小。^*P<0.05，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验。

图25A-25B：脂质体1V270和2B182C诱导类似水平的IL-12释放，但细胞毒性更低。(A)IL-12分泌水平。(B)％活力。Muse原代骨髓来源树突状细胞(BMDC)采用1V270(0.0625uM)和2B182C(12.5uM)处理。1V270/2B182c的比例保持在1比200，这一比例在图3中被确定为最佳比例。培养1个晚上后，通过ELISA检测培养物上清液中的IL-12水平，并通过MTT测定评估细胞活力。^*P<0.05，^**P<0.01，单尾未配对t-检验，Welch校正，每种化合物的DMSO制剂(D)与脂质体制剂(L)比较。

图25C：注射组合佐剂后局部免疫细胞浸润的组织学分析。BALB/c小鼠肌肉注射1V270(1nmol/针)、2B182C(200nmol/针)或1V270(1nmol/针)和2B182C(200nmol/针)组合的脂质体制剂。采集组织，固定并包埋在石蜡块中。10μm切片采用H&E染色。分别采用20x和40x物镜获得低和高放大率。低倍率和高倍率图像中的比例尺分别表示50μm和20μm。

图25D：BALB/c小鼠(n＝5/组)通过肌肉注射溶媒、1V270、2B182C、1V270+2B182C的DMSO制剂或脂质体制剂[1nmol/针1V270和200nmol/针2B182C，体积为50μL]。AddaVax^TM(25μL/针)用作阳性对照。2小时和24小时后，采集血清并通Luminex多重细胞因子测定(A)测定IL-12p40、TNF和KC的分泌情况。显示的数据是平均值±SEM。^*P<0.05，^**P<0.01，双尾Mann-Whitney U检验。+P<0.05，++P<0.01，Kruskal-Wallis，Dunn事后检验，比较4组(同一制剂中的溶媒、1V270、2B182C、1V270+2B182C)。

图26A-26D：脂质体1V270和2B182C协同增强了抗-HA和抗-NA IgG1和IgG2a的产生。(A-C)BALB/c小鼠(n＝5/组)在第0天和第21天采用IIAV(10μg/针)和如图22A所示配制的佐剂肌肉注射开展免疫。注射脂质体TLR7激动剂1V270(lipo-1V270，1nmol/针)、脂质体TLR4激动剂2B182C(lipo-2B182C，200nmol/针)和脂质体组合佐剂1V270和2B182C(lipo-1V270+2B182C，1nmo/针+200nmo/针)。溶媒是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇(DOPC/Chol，对照脂质体)。AddaVax^TM用作阳性对照。在第28天采集血清，并通过ELISA测定HA或NA特异性IgG1、IgG2a和总IgG。^*P<0.05和^**P<0.01Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验。比较了除无抗原和AddaVax之外的四组(所有配对)。数据是具有相似结果的两个独立实验的代表性数据。

图27：配制佐剂诱导的抗原特异性IgM水平。BALB/c小鼠(n＝5/组)在第0天和第21天采用IIAV(10μg/针)和如图2A所示配制的佐剂肌肉注射开展免疫。注射脂质体TLR7激动剂1V270(lipo-1V270，1nmol/针)、脂质体TLR4激动剂2B182C(lipo-2B182C，200nmol/针)和脂质体组合佐剂1V270和2B182C(lipo-1V270+2B182C，1nmo/针+200nmo/针)。溶媒是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇(DOPC/Chol，对照脂质体)。AddaVax^TM用作阳性对照。在第28天采集血清，并测定HA或NA特异性IgM。^*P<0.05，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验。比较了除无抗原和AddaVax之外的四组处理(所有配对)。数据是具有相似结果的两个独立实验的代表性数据。

图28A-28C：配制的组合佐剂增加了Tfh和抗体分泌细胞。(A)BALB/c小鼠(n＝4-5/组)在第0天和第21天接种IIAV(10μg/针)和1V270(1nmol/针)和/或2B182C(200nmol/针)，总体积为50μL。28天后，采集腹股沟淋巴结中的淋巴细胞用于FACS分析。示出了Tfh细胞(CD3+CD4+PD-1+CXCR5+)、GC B细胞(CD3-CD19+CD95+GL7+)、浆母细胞(CD3-CD19+CD138+)和浆细胞(CD3-CD19-CD138+)的设门策略。(B)活细胞中Tfh细胞、GC B细胞、浆母细胞和浆细胞的百分含量。条形表示平均值±SEM。^*P<0.05，^**P<0.01，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验。比较了除AddaVax之外的四个条件(所有配对)。

图29A-29B：配制的组合佐剂增加了Tfh和抗体分泌细胞。(A)BALB/c小鼠(n＝4-5/组)在第0天和第21天接种IIAV(10μg/针)和1V270(1nmol/针)和/或2B182C(200nmol/针)，总体积为50μL。28天后，采集腹股沟淋巴结中的淋巴细胞用于FACS分析。Tfh细胞(CD3+CD4+PD-1+CXCR5+)、GC B细胞(CD3-CD19+CD95+GL7+)、浆母细胞(CD3-CD19+CD138+)和浆细胞(CD3-CD19-CD138+)的设门策略在图5B中示出。(A)Tfh细胞、GC B细胞、浆母细胞、浆细胞的数量。(B)总细胞数量。条形表示平均值±SEM。^*P<0.05，^**P<0.01，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验(所有配对)。

图30A-30C：1V270和2B182C的配制组合。(A和B)BALB/c小鼠在第0天和第21天接种IIAV和配制佐剂，并在第28天收获腹股沟淋巴结用于BCR库分析。(A)总IGH、IGHG1和IGHG2A的BCR多样性。(B)相似性分析。示出了雅卡尔(Jaccard)指数。(C)TCRα和TCRβ的TCR克隆以“1-pielou指数”表示。条形表示平均值±SEM。^*P<0.05，^**P<0.01，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验(vs.脂质体)。

图31A-31I：Lipo-2B182C和lipo-1V270+2B182C保护小鼠免受同源流感病毒的侵害。(A)同源流感病毒攻击的实验时间表。(B)平均体重变化以初始体重百分数表示。^*P<0.05，^**P<0.01，单因素方差分析，Dunn事后检验。(C)采用同源病毒(H1N1pdm)攻击后小鼠的存活率。示出了显示对数秩检验的Kaplan-Meier曲线。对肺病毒滴度(D)和肺液中的细胞因子水平(E)进行了评估。在第3天和第6天进行肺灌洗。^**P<0.01，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验(vs.脂质体)。(F)肺病毒滴度与促炎细胞因子、MCP-1(左)和IL-6(右)之间的关系。斯皮尔曼等级相关性检验，(MCP-1；^**P<0.0001，斯皮尔曼相关系数r＝0.83，IL-6；^***P<0.0001，斯皮尔曼相关系数r＝0.79)。针对同源病毒的HI滴度(G)和VN滴度(H)。^*P<0.01，^***P<0.001，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验(所有配对)。(I)VN滴度与肺病毒滴度的关系。每个点表示同一动物的VN滴度和肺病毒滴度。^**P<0.01，斯皮尔曼等级相关检验，斯皮尔曼相关系数r＝-0.59。

图32A-32C：采用H3N2病毒进行异源攻击。采用如图31A中所述的配制佐剂和IIAV(H1N1)免疫BALB/c小鼠，并用异源病毒A/Victoria3/75(H3N2)开展鼻内攻击。(A)监测体重减轻情况。单因素方差分析未检测到显著性。(B)采用异源病毒攻击后小鼠的存活率。示出了显示对数秩检验的Kaplan-Meier曲线。(C)第3天和第6天的肺病毒滴度。Kruskal-Wallis检验未检测到显著性。

图33A-33G：A和E)方案。B-C和F-G)体重及

施用1V270和/或2B182c或AddaVax的小鼠感染A/PuertoRico/8/1934或B/Florida/04/后随时间推移的体重及存活率。D)施用1V270和/或2B182c或AddaVax的小鼠的IgG2a/IgG1比例。

图34A-34B：A)施用1V270、1Z105、2B182c或AddaVax的小鼠的抗-HA IgG1、抗-HAIgG2a和抗-HA IgM。B)施用1V270、1Z105、2B182c或AddaVax的小鼠的抗-NA IgG1、抗-NAIgG2a和抗-NA IgM。

图35A-35F：施用1V270、1Z105、2B182c或AddaVax的小鼠的A和B)抗-HA和抗-NAIgG1，C-D)抗-HA和抗-NA IgG2a和E-F)抗-HA和抗-NA IgM。B)施用1V270、1Z105、2B182c或AddaVax的小鼠的抗-NA IgG1、抗-NA IgG2a和抗-NA IgM。

图36A-36B：施用不同剂量的1V270、1Z105、2B182c或它们的组合的小鼠的抗-HAIgG2a和IgG1。

图37：各种脂质体和示例性方案的示意图。

图38A-38B：使用A/California/04/2009(H1N1)pdm的HA肽矩阵开展ELISA测定。BALB/c小鼠(n＝5-10)采用IIAV和Lipo-Veh(空白脂质体)、Lipo-1V270、Lipo-2B182C、Lipo-(1V270+2B182C)(共封装组合)或(Lipo-1V270)+(Lipo-2B182C)(混合组合)在第0天和第21天进行免疫，并在第28天取血。A/California/04/2009(H1N1)pdm(NR-15433)HA的肽矩阵从BEI资源获取。将5个组中的肽合并，生成28个肽库。(A)OD_405-570nm的热图和ELISA结果。每行和每列分别表示每个肽库和小鼠。(B)对单个小鼠的28个肽库的平均值进行统计分析。^**P<0.01，^***P<0.0001，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验。+P<0.05，Mann-Whitney检验。

图39A-39D：ELISA检测抗体的交叉反应性。BALB/c小鼠(n＝5/组)采用IIAV和Lipo-Veh、Lipo-1V270、Lipo-2B182C、Lipo-(1V270+2B182C)或(Lipo-1V270)+(Lipo-2B182C)在第0天和第21天进行免疫，并在第28天取血。将血清连续稀释(1:100至1:409600)，并通过ELISA评估抗Puerto Rico H1N1、H11N9、H12N5、H7N7和H3N2的HA以及抗H5N1、H10N8、H3N2和H7N7的NA的总IgG水平。(A)本研究中使用的甲型流感病毒HA的系统发育关系。利用流感研究数据库(https://www.fludb.org/brc/home.spg？decorator＝influenza)，通过MUSCLE算法对ELISA中使用的蛋白质的氨基酸序列进行比对。系统发育树使用MEGAX软件(https://www.megasoftware.net/)通过Neighbor-joining方法构建。(B)H1N1、H11N9、H12N5、H3N2和H7N7的HA的总IgG滴度曲线。(C)各NA的系统发育关系。(D)H5N1、H10N8、H3N2和H7N7的NA的总IgG滴度曲线。血清以1:4从100倍稀释至409600倍，并通过ELISA评估总IgG水平。显示的数据是平均值±SEM。

图40A-40B：Lipo-(1V270+2B182C)诱导交叉反应抗体。(A和B)BALB/c(n＝5/组)小鼠采用IIAV[A/California/04/2009(H1N1)pdm09]+Lipo-Veh、Lipo-1V270、Lipo-2B182C、Lipo-(1V270+2B182C)或(Lipo-1V270)+(Lipo-2B182C)在第0天和第21天进行免疫，并在第28天取血。将血清连续稀释(1:100至1:409600)，并通过ELISA评估抗Puerto Rico H1N1、H11N9、H12N5、H7N7和H3N2的HA以及抗H5N1、H10N8、H3N2和H7N7的NA的总IgG水平。示出了使用prism5计算的单个小鼠的总IgG滴度曲线的几何平均值。本研究中使用的HA蛋白的总IgG滴度曲线和系统发育关系如上所示。^*P<0.05，^**P<0.01，Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验。+P<0.05，++P<0.01，Mann-Whitney检验。

图41：示例性TLR4和TLR7激动剂。

具体实施方式

在疫苗中使用佐剂是一种成熟的方法，可以促进对弱免疫原性抗原的更强免疫反应。此外，佐剂还可以通过促进弱免疫原性抗原的免疫原性来增强和可能扩展免疫反应。目前只有少数佐剂获准用于疫苗(O'Hagan,et al.doi:10.1016/j.vaccine.2015.01.088)。此外，大多数现有疫苗都含有单一佐剂，最近的证据表明，单一佐剂可能不足以诱导抵抗许多新出现传染病的保护性免疫反应。(Underhill，doi:10.1111/j.1600-065X.2007.00548.x)。

使用TLR激动剂组合作为佐剂通常会导致免疫反应整体增强，但在流感等传染病疫苗的情况下，Th1(细胞介导的)的免疫反应增强或偏向于Th1类型的免疫反应是以牺牲Th2(体液或抗体)类型为代价。事实上，尽管Th1反应增加，但有时这会导致保护性Th2抗体产生量不足，对于流感感染，一定的保护性抗体滴度被认为是通过免疫提供有效保护的主要因素。

在本发明中，发现单一纳米颗粒制剂中TLR4/TLR7激动剂的组合比例不仅增强了对抗原的整体免疫反应，而且提供了足够的保护性抗体产生量，以有效保护小鼠免受致命性病毒的攻击。人类的免疫状态将与小鼠的免疫状态截然不同，小鼠通常对流感等抗原是初始接触，而人类通常通过自然接触和疫苗接触而接触流感抗原多年。水痘(水痘带状疱疹)等其他传染性病原体也是如此，水痘后续可能会以带状疱疹的形式出现在人类身上。

众所周知，用一种抗原进行免疫会阻断对第二种类似抗原的强烈免疫反应。这可能是由于1)表位排斥，其中预先存在的抗体，尤其是粘膜IgA，保护疫苗免受所有抗原呈递细胞的影响；2)减少树突状细胞(DC)通路，其中记忆B细胞内化新疫苗，减少DC通路和激活以及T细胞免疫；3)T细胞竞争，其中记忆B细胞被激活，消耗细胞因子、辅助因子和捕获可以与抗原负载DC反应的T细胞。

本发明通过以下方式克服了这些缺陷：1)将疫苗包封在脂质体纳米颗粒中，优先将疫苗递送至DC；2)使用特定比例的组合TLR激动剂激活DC，这将增加抵抗疫苗抗原的激活T细胞的数量多样性。本发明公开了我们的以下发现：比单独配制激动剂和未配制激动剂的混合组合相比，在同一脂质体纳米颗粒中配制TLR4激动剂与TLR7激动剂的组合作为佐剂具有若干优势。配制的组合可在纳米颗粒中具有一定比例的TLR4和TLR7以提供免疫活性。

这些比例的组合的优势包括：1)与DMSO制剂相比，活性增强，提供更强的Th1和Th2免疫反应；2)与DMSO制剂相比，毒性更低；3)保护抗原(用于疫苗使用)免受超免疫个体的B细胞和IgA的影响，对于粘膜流感免疫来说尤其如此，并允许树突状细胞呈递重要的表位而提供有效的保护反应；和/或4)扩大免疫反应，以包括对免疫原性较低的抗原具有免疫反应，如流感中的HA杆状抗原的情况，从而产生更通用的疫苗。

在本发明中，发现单个纳米颗粒制剂中TLR4/TLR7激动剂的组合比例不仅增强了对抗原的整体免疫反应，而且提供了足够的保护性抗体产生量，以有效保护小鼠免受致命性病毒的攻击。人类的免疫状态将与小鼠的免疫状态截然不同，小鼠通常对流感等抗原是初始接触，而人类通常通过自然接触和疫苗接触而接触流感抗原多年。水痘(水痘带状疱疹)等其他传染性病原体也是如此，水痘后续可能会以带状疱疹的形式出现在人类身上。

本发明通过以下方式克服了这些缺陷：1)将疫苗包封在脂质体纳米颗粒中，优先将疫苗递送至DC；2)使用特定比例的组合TLR激动剂激活DC，这将增加抵抗疫苗抗原的激活T细胞的数量多样性。

定义

当组合物包含至少约90％、至少约95％、99％和99.9％(重量)特定组合物时，则组合物“基本上全部”由特定化合物或特定形式的化合物(例如，异构体)组成。当每种化合物(例如，异构体)按重量计占组合物的至少约10％时，则组合物包含各种化合物或相同化合物各种形式的“混合物”。本发明的TLR7激动剂或其缀合物可制备为酸性盐或碱性盐，以及游离酸或游离碱形式。在溶液中，本发明的某些化合物可以作为两性离子存在，其中反离子由溶剂分子本身提供，或由溶解或悬浮在溶剂中的其他离子提供。

术语“toll样受体激动剂”(TLR激动剂)是指与TLR结合的分子。合成的TLR激动剂是设计与TLR结合并激活受体的化合物。

在本发明中，应该理解的是，式(I)或(II)化合物或其盐可表现出互变异构现象，由此两种化合物能够通过在两个原子之间交换氢原子，并与两个原子之中的任何一个原子形成共价键而容易相互转化。由于互变异构化合物彼此处于移动平衡状态，因此可以将它们视为同一化合物的不同异构形式。应当理解的是，本说明书中的结构式图形只能代表其中一种可能的互变异构形式。但是，还应当理解的是，本发明包括任何互变异构形式，并且不仅仅限于在结构式图形中使用的任何一种互变异构形式。本说明书中的结构式图形只能代表一种可能的互变异构形式，并且应当理解的是，本说明书涵盖所绘化合物的所有可能的互变异构形式，而不仅仅是本文方便图示的那些形式。例如，互变异构可能表现为如波浪线所示的键合的吡唑基。虽然两个取代基都被称为4-吡唑基，但很明显，每个结构中不同的氮原子带有氢原子。

取代吡唑如3-甲基、5-甲基或3，5-二甲基吡唑等也会发生这种互变异构。互变异构的另一个实例是酰胺-亚氨基(环状时为内酰胺-内酰亚胺)互变异构，例如在带有与环氮原子相邻的环氧原子的杂环化合物中所见到的那样。例如，所述平衡：

是互变异构的一个实例。因此，本文以一种互变异构体描述的结构还包括其它互变异构体。

光学异构

应当理解的是，当本发明的化合物含有一个或多个手性中心时，该化合物可以以纯的对映异构体或非对映异构体形式或作为外消旋混合物形式存在并且可以分离。因此，本发明包括本发明化合物的任何可能的对映异构体、非对映异构体、外消旋体或它们的混合物。

由于手性中心的存在而产生的异构体包括一对称为“对映异构体”的不可重叠的异构体。纯化合物的单一对映异构体具有光学活性，即它们能够旋转平面偏振光平面。单一对映异构体根据Cahn-Ingold-Prelog系统命名。取代基的优先顺序根据原子量排序，由系统程序确定的原子量越高，优先排序越高。一旦确定了四个基团的优先级排序，分子就会被定向，排序最低的基团远离观察者。然后，如果其他基团的降序顺时针进行，则分子命名为(R)，如果其他基团的降序逆时针进行，则分子命名为(S)。在方案14的示例中，Cahn-Ingold-Prelog排序是A>B>C>D。最低排序的原子D的方向远离观察者。

本发明旨在包括非对映异构体以及它们的外消旋和拆分形式、非对映异构和对映异构纯形式及其盐。一对非对映异构体可以通过已知的分离技术，包括正相和反相色谱以及结晶来拆分。

“分离的旋光异构体”是指已从相同结构式的相应旋光异构体中基本上纯化的化合物。在一个实施例中，分离异构体的纯度按重量计是至少约80％，例如至少90％、98％或99％。

分离的旋光异构体可以通过众所周知的手性分离技术从外消旋混合物中纯化。根据一种这样的方法，使用合适的手性柱，例如色谱柱

家族系列的成员(Daicel Chemical Industries有限公司，日本东京)，通过HPLC将本发明化合物或其手性中间体的外消旋混合物分离，得到纯度99wt％的旋光异构体。色谱柱根据制造商的说明进行操作。

本文使用的词语“药学上可以接受的”指的是那些在合理的医学判断范围之内，适合与人类和动物组织接触的用途、不会带来过大毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症且具有合理的益处/风险比的化合物、材料、组合物与/或剂型。

本文所述“药学上可接受的盐”是指其中母体化合物通过制备其酸性或碱性盐而改变的所公开化合物的衍生物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(如羧酸)的碱金属盐或有机盐等。药学上可接受的盐包括由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，这种常规的无毒盐包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些无毒盐；以及由有机酸，例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、山萮酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸等制备的盐。

可用于本发明化合物的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性单元的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过在水中或有机溶剂中或在两者的混合物中，将这些化合物的游离酸或碱与化学计量用量的合适的碱或酸反应而制备；通常，可以采用非水介质，例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的清单参见Remington' s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，17版，宾夕法尼亚州伊斯顿MackPublishing Company公司，p.1418(1985)，通过引用，其公开内容纳入本发明中。

本文所述结构式的化合物可以是溶剂化物，并且在一些实施例中，可以是水合物。术语“溶剂化物”是指具有一种或多种与其固体结构相结合的溶剂分子的固体化合物。当化合物从溶剂中结晶时会形成溶剂化物。当一种或多种溶剂分子在固化时成为固体结晶基质的组成部分时，就会形成溶剂化物。本文所述结构式的化合物可以是溶剂化物，例如乙醇溶剂化物。另一种溶剂化物是水合物。“水合物”同样是指具有一个或多个在分子水平与其固体或晶体结构密切结合的水分子的固体化合物。当化合物在水中固化或结晶时，可以形成水合物，其中一个或多个水分子成为固体结晶基质的组成部分。

除非另外说明，否则使用以下定义：卤或卤素是氟、氯、溴或碘。烷基、烷氧基、烯基、炔基等指直链和支链基团；但提到单个基团如“丙基”仅包括直链基团，支链异构体如“异丙基”会专门提及。芳基指苯基或具有约九至十个环原子，其中至少一个环是芳环的邻位稠合双环碳环基团。Het可以是杂芳基，其包含通过单环芳环的环碳连接的基团，所述单环芳环含有五个或六个由碳和1至4个杂原子组成的环原子，每个杂原子选自非过氧化物氧、硫和N(X)，其中X不存在或是H、O、(C₁-C₄)烷基、苯基或苄基，以及由其衍生的约八至十个环原子的邻位稠合双环杂环的基团，特别是苄基衍生物或稠合丙烯、三亚甲基或四亚甲基双基团而衍生的基团。

本领域技术人员应该理解的是，具有手性中心的本发明化合物可以以旋光和外消旋形式存在和分离。一些化合物可能表现出同素异构性。应当理解的是，本发明包括具有本文所述有用特性的本发明化合物的任何外消旋、旋光、同素异构或立体异构形式，或它们的混合物，如何制备旋光形式(例如，通过重结晶技术拆分外消旋形式、从旋光起始材料合成、手性合成或使用手性固定相进行色谱分离)以及如何使用本文描述的标准，或使用本领域众所周知的其他类似测试测定激动剂的活性都是本领域熟悉的。本领域技术人员还应该理解的是，本文所述的化合物包括它们的各种互变异构体，它们可以彼此以各种平衡状态存在。

本文所述术语“治疗”是指(i)防止病理状况的发生(例如，预防)；(ii)抑制病理状况或阻止其发展；(iii)缓解病理状况；和/或(iv)改善、缓和、减轻和消除疾病症状。本文所述的候选分子或化合物在制剂或药物中的含量是可导致生物学效应或导致改善、缓和、减轻、缓解、减弱或消除病症(例如疾病)症状的含量。此术语还可以指降低或阻止细胞增殖率(例如，减缓或阻止肿瘤生长)或减少增殖癌细胞的数量(例如，去除部分或全部肿瘤)。这些术语还适用于降低被微生物感染的系统(例如细胞、组织或受试者)中微生物(细菌)的滴度，降低微生物繁殖的速度，减少与微生物感染相关的症状的数量或症状的影响，和/或从系统中去除可检测出的微生物数量。微生物的实例包括但不限于病毒、细菌和真菌。

本文所述术语“治疗有效剂量”是指在受试者中治疗或预防疾病或失调或治疗疾病或失调症状的化合物的用量或化合物组合的用量。本文所述术语“受试者”和“患者”通常是指将接受或已经接受本文所述方法治疗(例如，施用化合物)的个体。

“稳定的化合物”和“稳定的结构”是指化合物足够稳定，可以经受从反应混合物中分离出有用的纯度，并配制成有效的治疗剂的一系列步骤。本发明仅考虑稳定的化合物。

术语“受试者”、“患者”或“有需要的受试者”是指患有或易患有可以通过施用本文提供的化合物、药物组合物、混合物或疫苗来治疗的疾病或病症的活生物体。非限制性实例包括人类、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿和其他非哺乳动物。在一些实施例中，患者是人类。在一些实施例中，患者是驯养动物。在一些实施例中，患者是狗。在一些实施例中，患者是鹦鹉。在一些实施例中，患者是家畜。在一些实施例中，患者是哺乳动物。在一些实施例中，患者是猫。在一些实施例中，患者是马。在一些实施例中，患者是牛。在一些实施例中，患者是犬科动物。在一些实施例中，患者是猫科动物。在一些实施例中，患者是猿。在一些实施例中，患者是猴。在一些实施例中，患者是小鼠。在一些实施例中，患者是实验动物。在一些实施例中，患者是大鼠。在一些实施例中，患者是仓鼠。在一些实施例中，患者是试验动物。在一些实施例中，患者是新生动物。在一些实施例中，患者是新生人类。在一些实施例中，患者是新生哺乳动物。在一些实施例中，患者是老年动物。在一些实施例中，患者是老年人。在一些实施例中，患者是老年哺乳动物。在一些实施例中，患者是老年患者。

本文所述术语“有效剂量”是指有效实现预期目的的用量。因此，本文所述术语“治疗有效剂量”等是指在有需要的受试者中治疗或预防疾病或失调或治疗疾病或失调症状的化合物、混合物或疫苗的用量或其组合的用量。

术语“TLR”是指Toll样受体，它们是调节NF_KB激活的先天免疫系统的组成部分。

本文所述术语“TLR调节剂”、“TLR免疫调节剂”等在通常和习惯意义上是指激动或拮抗Toll样受体的化合物。参见例如PCT/US2010/000369，Hennessy，E.J.，et al.，NatureReviews 2010，9:283-307；PCT/US2008/001631；PCT/US2006/032371；PCT/US2011/000757。因此，“TLR激动剂”是激动TLR的TLR调节剂，而“TLR拮抗剂”是拮抗TLR的TLR调节剂。

本文所述术语“TLR4”是指TLR4基因的产物及其同源物、亚型和功能片段：亚型1(NCBI登记号NP_612564.1)；亚型2(NCBI登记号NP_003257.1)；亚型3(NCBI登记号NP_612567.1)。可包含在所公开的制剂中的TLR4激动剂包括但不限于式(II)化合物，例如嘧啶并吲哚、氨基烷基氨基葡糖苷磷酸盐，例如CRX-601和CRX-547、RC-29、单磷酰脂A(MPL)、吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA和SLA)、OM-174、PET脂质A、ONO-4007、INI-2004(二胺阿洛糖磷酸盐)和E6020。

本文所述术语“TLR7”是指TLR7基因的产物及其同源物和功能片段(NCBI登记号AAZ99026)。可包含在所公开制剂中的TLR7激动剂包括但不限于式(I)化合物、咪唑并喹啉，例如咪喹莫特、CL097或嘎德莫特(gardiquimid)、CL264、腺嘌呤类似物如CL087、噻唑并喹啉如3M002(CL075)、鸟苷类似物如洛索立宾，或硫喹啉。

TLR4和TLR7

Toll样受体(TLR)是识别保守微生物产物的模式识别受体，称为病原体相关分子模式(PAMP)。TLR4识别LPS。TLR4信号激活MyD88和TRIF依赖性通路。MyD88通路激活NFNF-κB和JNK以诱导炎症反应。TRIF通路激活IRF3以诱导IFN-α产生。

TLR4主要在单核细胞、成熟巨噬细胞和树突状细胞、肥大细胞和肠上皮细胞上表达。TLR4的TLR调节剂(拮抗剂)包括NI-0101(Hennessy 2010，Id.)、1A6(Ungaro，R.，etal.，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.2009，296:G1167-G1179)、AV411(Ledeboer，A.，et al.，Neuron Glia Biol.2006，2:279-291；Ledeboer，A.，et al.，ExpertOpin.Investig.Drugs 2007，16:935-950)、Eritoran(Mullarkey，M.，et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.2003，305:1093-1102)，以及TAK-242(Li，M.，et al.，Mol.Pharmacol.2006，69:1288-1295)。TLR4的TLR调节剂(激动剂)包括

Quattro(Baldrick，P.，et al.，J.Appl.Toxicol.2007，27:399-409；DuBuske，L.，et al.，J.Allergy Clin.Immunol.2009，123:S216)。TLR7信号激活MyD88依赖性通路和IRF7依赖性信号。IRF7通路诱导IFN-α产生。

TLR7感知ss-RNA或合成化学物质(咪喹莫特，R848)。TLR7和TLR8存在于单核细胞和巨噬细胞的核内体中，TLR7也在浆细胞样树突状细胞上表达，TLR8也在肥大细胞中表达。这两种受体都能识别病毒的单链RNA。合成配体，如R-848和咪喹莫特，可用于激活TLR7和TLR8信号通路。参见例如Caron，G.，et al.，J.Immunol.2005，175:1551-1557。TLR9在单核细胞、巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞的核内体中表达，并充当细菌和病毒DNA中未甲基化CpG岛的受体。包含未甲基化CpG基序的合成寡核苷酸用于激活TLR9。例如，A类寡核苷酸靶向浆细胞样树突状细胞并强烈诱导IFNa产生和抗原呈递细胞成熟，同时间接激活自然杀伤细胞。B类寡核苷酸靶向B细胞和自然杀伤细胞并诱导很少的干扰素-a(IFNa)。C类寡核苷酸靶向浆细胞样树突状细胞并且是IFNa的有效诱导剂。这类寡核苷酸参与抗原呈递细胞的激活和成熟，间接激活自然杀伤细胞并直接刺激B细胞。参见例如Vollmer，J.，et al.，Eur.J.Immunol.2004，34:251-262；Strandskog，G.，et al.，Dev.Comp.Immunol.2007，31:39-51。

已报道的TLR7调节剂(激动剂)包括ANA772(Kronenberg，B.&Zeuzem，S.，Ann.Hepatol.2009，8:103-112)、咪喹莫特(Somani，N.&Rivers，J.K.，Skin TherapyLett.2005，10:1-6)和AZD8848(Hennessey 2010，Id.)。TLR8的TLR调节剂(激动剂)包括VTX-1463(Hennessey 2010，Id.)。TLR7和TLR8的TLR调节剂(激动剂)包括雷西莫特(Mark，K.E.，et al.，J.Infect.Dis.2007，195:1324-1331；Pockros，P.J.，et al.，J.Hepatol.2007，47:174-182)。TLR7和TLR9的TLR调节剂(拮抗剂)包括IRS-954(Barrat，F.J.，et al.，Eur.J.Immunol.2007，37:3582-3586)，和IMO-3100(Jiang，W.，et al.，J.Immunol.2009，182:48.25)。TLR9激动剂包括SD-101(Barry，M.&Cooper，C.，ExpertOpin.Biol.Ther.2007，7:1731-1737)、IMO-2125(Agrawal，S.&Kandimalla，E.R.，Biochem.Soc.Trans.2007，35:1461-1467)、Bio Thrax plus CpG-7909(Gu，M.，et al.，Vaccine 2007，25:526-534)、AVE0675(Parkinson，T.，Curr.Opin.Mol.Ther.2008，10:21-31)、QAX-935(Panter，G.，et al.，Curr.Opin.Mol Ther.2009，11:133-145)、SAR-21609(Parkinson 2008，Id.)和DIMS0150(Pastorelli，L.，et al.，Expert Opin.Emerg.Drugs2009，14:505-521)。

TLR7配体及其缀合物

谈到TLR7配体及其缀合物时，本文所述的术语“烷基”、“烯基”和“炔基”可包括直链、支链和环状单价烃基，以及它们的组合，未被取代时它们仅包含C和H。实例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。本文有时会描述每个此类基团中碳原子的总数，例如，当该基团可包含多达十个碳原子时，它可以以1-10C或C₁-C₁₀或C_1-10表示。例如，当允许杂原子(通常为N、O和S)代替杂烷基中的碳原子时，描述该基团的数字，尽管仍写为例如C₁-C₆，代表基团中的碳原子数加上作为所描述的环或链的主链中碳原子的替代包括在内的所述杂原子数的总和。

通常，本发明的烷基、烯基和炔基取代基含有一个10C(烷基)或两个10C(烯基或炔基)。例如，它们包含一个8C(烷基)或两个8C(烯基或炔基)。例如，它们包含一个4C(烷基)或两个4C(烯基或炔基)。一个单基团可以包括一种以上的多重键，或一个以上的多重键；当它们含有至少一个碳-碳双键时，这些基团包括在术语“烯基”的定义内，当它们含有至少一个碳-碳三键时，这些基团包括在术语“炔基”内。

烷基、烯基和炔基通常任选被取代到所述取代在化学上有意义的程度。典型的取代基包括但不限于卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR、＝NR、OR、NR₂、SR、SO₂R、SO₂NR₂、NRSO₂R、NRCONR₂、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR₂、OOCR、COR和NO₂，其中每个R独立地是H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈杂烷基、C₁-C₈酰基、C₂-C₈杂酰基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈杂烯基、C₂-C₈炔基、C₂-C₈杂炔基、C₆-C₁₀芳基或C₅-C₁₀杂芳基，和R任选被卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR’、＝NR’、OR’、NR’₂、SR’、SO₂R’、SO₂NR’₂、NR’SO₂R’、NR’CONR’₂、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’₂、OOCR’、COR’和NO₂取代，其中R’独立地是H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈杂烷基、C₁-C₈酰基、C₂-C₈杂酰基、C₆-C₁₀芳基或C₅-C₁₀杂芳基。烷基、烯基和炔基也可以被C₁-C₈酰基、C₂-C₈杂酰基、C₆-C₁₀芳基或C₅-C₁₀杂芳基取代，其中每个取代基都可以被适合于该特定基团的取代基取代。

“炔基”取代基可包括任选被取代的2-10C炔基，并且具有下式-C≡C-Ri，其中Ri是H或C₁-C₈烷基、C₂-C₈杂烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈杂烯基、C₂-C₈炔基、C₂-C₈杂炔基、C₁-C₈酰基、C₂-C₈杂酰基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₇-C₁₂芳烷基或C₆-C₁₂杂芳烷基，并且每个Ri基团任选被选自卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR’、＝NR’、OR’、NR’2、SR’、SO₂R’、SO₂NR’₂、NR’SO₂R’、NR’CONR’₂、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’₂、OOCR’、COR’和NO₂中的一个或多个取代基取代，其中每个R’独立地是H、C₁-C₆烷基、C₂-C₆杂烷基、C₁-C₆酰基、C₂-C₆杂酰基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C_7-12芳烷基或C_6-12杂芳烷基，其中它们中的每个任选被选自卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄杂烷基、C₁-C₆酰基、C₁-C₆杂酰基、羟基、氨基和＝O中的一个或多个基团取代；并且其中两个R’可以连接形成任选包含不超过3个选自N、O和S的杂原子的3-7元环。在一个实施例中，-C≡C-Ri中的Ri是H或Me。

“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”等定义与相应的烃基(烷基、烯基和炔基)相似，但“杂”术语是指在主链残基内含有1到3个O、S或N杂原子或其组合的基团；因此，相应烷基、烯基或炔基的至少一个碳原子被指定的杂原子之一取代而形成杂烷基、杂烯基或杂炔基。烷基、烯基和炔基的杂形的典型尺寸通常与相应的烃基相同，并且杂形上可能存在的取代基与上文烃基所述的那些相同。出于化学稳定性的原因，还应理解的是，除非另外说明，否则此类基团不包括超过两个连续的杂原子，除非氧代基团存在于N或S上，如硝基或磺酰基中。

虽然本文使用的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基，但术语“环烷基”在本文可用于描述通过环碳原子连接的碳环非芳族基团，并且“环烷基烷基”可用于描述通过烷基连接基团连接到分子的碳环非芳族基团。类似地，“杂环基”可用于描述包含至少一个杂原子作为环成员并通过环原子连接到分子的非芳香环基团，环原子可以是C或N；和“杂环基烷基”可用于描述通过连接基团连接至另一分子的此类基团。适用于环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基的大小和取代基与上述烷基所述相同。本文所述这些术语还包括含有一个或两个双键的环，只要该环不是芳族环即可。

本文所述“酰基”包括包含在羰基碳原子的两个可用价数位置之一处连接的烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的基团，并且杂酰基是指其中除羰基碳外的至少一个碳已被选自N、O和S的杂原子取代的相应基团。因此杂酰基包括，例如，-C(＝O)OR和–C(＝O)NR₂以及–C(＝O)-杂芳基。

酰基和杂酰基通过羰基碳原子的开放价数连接到它们所连接的任何基团或分子上。通常，它们是C₁-C₈酰基，包括甲酰基、乙酰基、新戊酰基和苯甲酰基，以及C₂-C₈杂酰基，包括甲氧基乙酰基、乙氧基羰基和4-吡啶酰基。烃基、芳基和包含酰基或杂酰基的此类基团的杂形可以被本文所述通常作为酰基或杂酰基每个相应部分合适取代基的取代基取代。

“芳香”部分或“芳基”部分是指具有众所周知的芳香性特征的单环或稠合双环部分；实例包括苯基和萘基。类似地，“杂芳族”和“杂芳基”是指含有一个或多个选自O、S和N的杂原子作为环成员的单环或稠合双环系统。包含杂原子允许5元环以及6元环的芳香性。典型的杂芳族系统包括单环C₅-C₆芳基，例如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、恶唑基和咪唑基，以及通过将这些单环基团之一与苯环或与任何杂芳族单环基团稠合形成C₈-C₁₀双环基团的稠合双环部分，例如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑并吡啶基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基等。在整个环系统的电子分布方面具有芳香性特征的任何单环或稠环双环系统都包括在该定义中。它还包括其中至少直接连接到分子其余部分的环具有芳香性特征的双环基团。通常，环系统包含5-12个环成员原子。例如，单环杂芳基可包含5-6个环成员，而双环杂芳基可包含8-10个环成员。

芳基和杂芳基部分可以被多种取代基取代，包括C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、C₅-C₁₂芳基、C₁-C₈酰基及这些取代基的杂形，其中每个取代基本身可以进一步被取代；芳基和杂芳基部分的其它取代基包括卤素、OR、NR₂、SR、SO₂R、SO₂NR₂、NRSO₂R、NRCONR₂、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR₂、OOCR、COR和NO₂，其中每个R独立地是H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈杂烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈杂烯基、C₂-C₈炔基、C₂-C₈杂炔基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₇-C₁₂芳烷基或C₆-C₁₂杂芳烷基，并且每个R如上文对烷基所述任选被取代。芳基或杂芳基上的取代基当然可以进一步被本文所述的适合于每种类型的此类取代基或此类取代基每个部分的基团取代。因此，例如，芳烷基取代基可以在芳基部分上被本文描述的芳基典型取代基取代，并且它可以在烷基部分上进一步被本文描述的典型的或适合烷基的取代基取代。

类似地，“芳烷基”和“杂芳烷基”是指通过连接基团，例如亚烷基键合到它们的连接点的芳族和杂芳族环系统，包括取代的或未取代的、饱和的或不饱和的、环状的或非环状的连接基团。通常连接基团是C₁-C₈烷基或其杂形。这些连接基团还可包括羰基，从而使它们能够提供取代基作为酰基或杂酰基部分。芳烷基或杂芳烷基中的芳基或杂芳基环可以被芳基所述的相同的取代基取代。例如，芳烷基包括苯环，任选被上面芳基所定义的基团取代及被未取代的或被一个或两个C₁-C₄烷基或杂烷基取代的C₁-C₄亚烷基取代，其中烷基或杂烷基基团可以任选环化形成环，例如环丙烷、二氧戊环或氧杂环戊烷。类似地，杂芳烷基可包括任选被上述芳基典型取代基取代的C₅-C₆单环杂芳基和未被取代或被一个或两个C₁-C₄烷基或杂烷基取代的C₁-C₄亚烷基，或者包括任选取代的苯环或C₅-C₆单环杂芳基和未取代的或被一个或两个C₁-C₄烷基或杂烷基取代的C₁-C₄杂亚烷基，其中烷基或杂烷基可以任选环化形成环，例如环丙烷、二氧戊环或氧杂环戊烷。

在芳烷基或杂芳烷基被描述为任选取代的情况下，取代基可以在该基团的烷基或杂烷基部分或芳基或杂芳基部分上。任选存在于烷基或杂烷基部分上的取代基通常与上文针对烷基所述的那些相同；任选存在于芳基或杂芳基部分上的取代基通常与上文针对芳基描述的那些相同。

本文所述的“芳烷基”基团是烃基，如果它们是未取代的话，并且通过环和亚烷基或类似连接基团中的碳原子总数来描述。因此，苄基是C₇-芳烷基，而苯乙基是C₈-芳烷基。

如上所述的“杂芳烷基”是指包含通过连接基团连接的芳基的部分，并且与“芳烷基”的不同之处在于芳基部分的至少一个环原子或连接基团中的一个原子是选自N、O和S的杂原子。杂芳烷基在本文根据环和连接基团组合中的原子总数进行描述，它们包括通过杂烷基连接基团连接的芳基；通过烃基连接基团如亚烷基连接的杂芳基；和通过杂烷基连接基团连接的杂芳基。因此，例如，C₇-杂芳烷基将包括吡啶甲基、苯氧基和N-吡咯基甲氧基。

本文所述“亚烷基”是指二价烃基；因为它是二价的，可以将另外两个基团连接在一起。通常它指的是–(CH₂)_n-，其中n是1-8，例如n是1-4，尽管在指定的情况下，亚烷基也可以被其他基团取代，并且可以是其他长度，并且开放价数不必在链的两端。因此-CH(Me)-和–C(Me)₂-也可称为亚烷基，环状基团如环丙-1，1-二基也可称为亚烷基。当亚烷基被取代时，取代基包括通常本文所述烷基上存在的那些。

通常，包含在取代基中的任何烷基、烯基、炔基、酰基或芳基或芳烷基或这些基团之一的任何杂形本身可以任选被另外的取代基取代。如果没有另外描述取代基，则这些取代基的性质类似于关于主要取代基本身所列举的那些。因此，在例如R²是烷基的的实施例中，该烷基可以任选被作为R²的实施例列出的其余取代基取代，其中这样应具有化学意义，并且不会破坏为烷基本身的大小限制；例如，被烷基或被烯基取代的烷基将简单地扩展这些实施例的碳原子上限，并且不包括在内。但是，被芳基、氨基、烷氧基、＝O等取代的烷基也包括在本发明的范围内，这些取代基的原子数不计入用于描述烷基、烯基等基团的原子数。在没有指定取代基数量的情况下，每个这样的烷基、烯基、炔基、酰基或芳基可以根据其可用的价数被许多取代基取代；特别是，例如，这些基团中的任何基团可以在其任何或所有可用价数被氟原子取代。

在各种实施例中，本发明提供一种预防、抑制或治疗肝脏疾病，例如与哺乳动物炎症相关的肝脏疾病的方法。所述方法包括向有需要的哺乳动物施用有效剂量的式(I)化合物：

其中X¹是-O-、-S-或-NR^c-；

R¹是氢、(C₁-C₁₀)烷基、取代(C₁-C₁₀)烷基、C_6-10芳基，或取代C_6-10芳基、C_5-9杂环基、取代C_5-9杂环基；

R^c是氢、C_1-10烷基，或取代C_1-10烷基；或R^c和R¹与两者所连接的氮一起形成杂环或取代杂环；

每个R²独立地是-OH、(C₁-C₆)烷基、取代(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷氧基、取代(C₁-C₆)烷氧基、-C(O)-(C₁-C₆)烷基(烷酰基)、取代-C(O)-(C₁-C₆)烷基、-C(O)-(C₆-C₁₀)芳基(芳酰基)、取代-C(O)-(C₆-C₁₀)芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O(C₁-C₆)烷基(烷氧羰基)、取代-C(O)O(C₁-C₆)烷基、-NR^aR^b、-C(O)NR^aR^b(氨基甲酰基)、卤素、硝基或氰基，或没有R²；

每个R^a和R^b独立地是氢、(C₁-C₆)烷基、取代(C₁-C₆)烷基、(C₃-C₈)环烷基、取代(C₃-C₈)环烷基、(C₁-C₆)烷氧基、取代(C₁-C₆)烷氧基、(C₁-C₆)烷酰基、取代(C₁-C₆)烷酰基、芳基、芳基(C₁-C₆)烷基、Het、Het(C₁-C₆)烷基或(C₁-C₆)烷氧羰基；

其中任何烷基、芳基或杂环基上的取代基是羟基、C_1-6烷基、羟基C_1-6亚烷基、C_1-6烷氧基、C_3-6环烷基、C_1-6烷氧基C_1-6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；

n是0、1、2、3或4。

X²是键或连接基团；和

在一个实施例中，R^x是包含一个或两个羧酸酯，或包含–(R³)_r–(R⁴)_s)_p的磷脂，其中每个R³独立地是聚乙二醇(PEG)部分；其中每个R⁴独立地是H、-C₁-C₆烷基、-C₁-C₆烷氧基、-NR^aR^b、-N₃、-OH、-CN、-COOH、-COOR¹、-C₁-C₆烷基-NR^aR^b、C₁-C₆烷基-OH、C₁-C₆烷基-CN、C₁-C₆烷基-COOH、C₁-C₆烷基-COOR¹、5-6元环、取代5-6元环、-C₁-C₆烷基-5-6元环、-C₁-C₆烷基-取代5-6元环C₂-C₉杂环基，或取代C₂-C₉杂环基；其中r是1至1000，其中s是1至100，并且其中p是1至100；

或它们的互变异构体；

或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一个实施例中，R³是PEG部分。

在一些实施例中，PEG反应物具有结构CH₃O(CH₂CH₂O)_n-X-NHS*，其中X可以是-COCH₂CH₂COO-、-COCH₂CH₂CH₂COO-、-CH₂COO-和–(CH₂)₅COO-。在某些实施例中，PEG反应物具有结构：

在一些实施例中，某些PEG反应物是双官能团的。在一些实施例中，双官能团PEG反应物的实例具有结构X-(OCH₂CH₂)n–X，其中X是(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)甲基(-CH₂COO-NHS)、琥珀酰亚胺戊二酸酯(-COCH₂CH₂CH₂COO-NHS)、(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)戊基(-(CH₂)₅COO-NHS)、3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基、(-NHCOCH₂CH₂-MAL)、氨基丙基(-CH₂CH₂CH₂NH₂)或2-巯乙基(-CH₂CH₂SH)。

在某些实施例中，一些PEG反应物是杂官能团的。杂官能团PEG反应物的实例具有结构

其中在一些实施例中，X可以是(N-N-琥珀酰亚胺氧基羰基)甲基(-CH₂COO-NHS)、琥珀酰亚胺戊二酸酯(-COCH2CH2CH2COO-NHS)、(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)戊基(-(CH2)5COO-NHS)、3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基、(-NHCOCH2CH2-MAL)、3-氨基丙基(-CH2CH2CH2NH2)、2-巯乙基(-CH2CH2SH)、5-(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)戊基(-(CH₂)₅COO-NHS]，或p-硝基苯氧羰基、(-CO₂-p-C₆H₄NO₂)。

也可以使用某些支链PEG反应物，例如具有以下结构的那些：

在一些实施例中，其中X是间隔基团，并且Y是官能团，包括但不限于马来酰亚胺、胺、戊二酰-NHS、碳酸酯-NHS或碳酸酯-对硝基苯酚。支链PEG反应物的一个优点是它们可以产生具有持续释放特性的缀合产物。

在一些实施例中PEG反应物也可以是杂官能团反应物，例如

HO(CH2CH2O)_n-CH₂CH₂CH₂NH₂，

HCl·H₂N-CH₂CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₅COOH和

HO(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂CHO。

在一些实施例中，可以使用Boc^*-保护的-氨基-PEG-羧基-NHS或马来酰亚胺-PEG-羧基-NHS反应物。

在某些实施例中，梳状聚合物可用作PEG反应物以将多个PEG单元并入缀合物中。梳状聚合物的实例在下文中示出。

在一些实施例中，PEG反应物和/或PEG缀合物产物可具有范围在约5克/摩尔至约100，000克/摩尔之间的分子量。在一些实施例中，PEG反应物和/或PEG缀合产物的平均、中位数或标称分子量是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000或90000克/摩尔。在一些实施例中，本文化合物中的PEG部分是均质的，并且对于特定批次化合物每个分子来说，PEG部分的分子量是相同的(例如，R³是一个PEG单元，r是2至10)。

在各种实施例中，式(I)中的X²可以是键或链中具有1个至约10个原子的链，其中所述链的原子选自碳、氮、硫和氧，其中任何碳原子可以被氧取代，其中任何硫原子可以被一个或两个氧基取代。所述链可以插入一个或多个环烷基、芳基、杂环基或杂芳基环。

式(I)中X²的某些非限制性实例包括–(Y)_y-、–(Y)_y-C(O)N-(Z)_z-、-(CH₂)_y-C(O)N-(CH₂)_z-、–(Y)_y-NC(O)-(Z)_z-、-(CH₂)_y-NC(O)-(CH₂)_z-，其中每个y(下标)和z(上标)独立地是0至20，每个Y和Z独立地是C₁-C₁₀烷基、取代C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、取代C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₉环烷基、取代C₃-C₉环烷基、C₅-C₁₀芳基、取代C₅-C₁₀芳基、C₅-C₉杂环基、取代C₅-C₉杂环基、C₁-C₆烷酰基、Het、HetC₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧羰基，其中烷基、环烷基、烷酰基、烷氧羰基、Het、芳基或杂环基上的取代基是羟基、C₁-C₁₀烷基、羟基C₁-C₁₀亚烷基、C₁-C₆烷氧基、C₃-C₉环烷基、C₅-C₉杂环基、C_1-6烷氧基C_1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。在一些实施例中，连接基团有时是–C(Y')(Z')-C(Y")(Z")-连接基团，其中每个Y'、Y"、Z’和Z”独立地是C₁-C₁₀烷基、取代C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、取代C₁-C₁₀烷氧基、C₃-C₉环烷基、取代C₃-C₉环烷基、C₅-C₁₀芳基、取代C₅-C₁₀芳基、C₅-C₉杂环基、取代C₅-C₉杂环基、C₁-C₆烷酰基、Het、HetC₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧羰基，其中烷基、环烷基、烷酰基、烷氧羰基、Het、芳基或杂环基上的取代基是羟基、C₁-C₁₀烷基、羟基C₁-C₁₀亚烷基、C₁-C₆烷氧基、C₃-C₉环烷基、C₅-C₉杂环基、C_1-6烷氧基C_1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。

式(I)中X²的另一个特定值是

X²的另一个特定值是

在各种实施例中，X²可以是C(O)，或可以是

中的任一个。

在各种实施例中，式(I)中X¹的可以是氧。

在各种实施例中，式(I)中的X¹可以是硫，或者可以是-NR^c-，其中R^c是氢、C_1-6烷基或取代C_1-6烷基，其中烷基取代基是羟基、C_3-6环烷基、C_1-6烷氧基、氨基、氰基或芳基。更具体地说，X¹可以是-NH-。

在各种实施例中，式(I)中的R¹和R^c一起可以形成杂环或取代杂环。更具体地说，R¹和R^c一起可形成取代或未取代吗啉、哌啶、吡咯烷或哌嗪环。

在各种实施例中，式(I)中的R¹可以是被C_1-6烷氧基取代的C₁-C₁₀烷基。

在各种实施例中，式(I)中的R¹可以是氢、C_1-4烷基或取代C_1-4烷基。更具体地说，R¹可以是氢、甲基、乙基、丙基、丁基、羟基C_1-4亚烷基或C_1-4烷氧基C_1-4亚烷基。甚至更具体地说，R¹可以是氢、甲基、乙基、甲氧基乙基或乙氧基乙基。

在各种实施例中，式(I)中R²可以不存在，或R²可以是卤素或C_1-4烷基。更具体地说，R²可以是氯、溴、甲基或乙基。

在一个实施例中，式(I)中R^x是((R³)_r–(R⁴)_s)_p或R³。在一个实施例中，R³是PEG部分或PEG部分衍生物。在某些实施例中，R³是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-。在一个实施例中，PEG部分可以包括一个或多个PEG单元。在一些实施例中，PEG部分可包括约1至约1000个PEG单元，包括但不限于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900个PEG单元。在某些实施例中，PEG部分可包含约1至5至约25个PEG单元、约1至5至约10个PEG单元、约10至约50个PEG单元、约18至约50个PEG单元、约47至约150个PEG单元、约114至约350个PEG单元、约271至约550个PEG单元、约472至约950个PEG单元、约50至约150个PEG单元、约120至约350个PEG单元，约250至约550个PEG单元或约650至约950个PEG单元。在某些实施例中，PEG单元是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-。在一些实施例中，R⁴是H、-C₁-C₆烷基、-C₁-C₆烷氧基、-NR^aR^b、-N₃、-OH、-CN、-COOH、-COOR¹、-C₁-C₆烷基-NR^aR^b、C₁-C₆烷基-OH、C₁-C₆烷基-CN、C₁-C₆烷基-COOH、C₁-C₆烷基-COOR¹、5-6元环、取代5-6元环、-C₁-C₆烷基-5-6元环、-C₁-C₆烷基-取代5-6元环、C₂-C₉杂环，或取代C₂-C₉杂环。

在一些实施例中，r是约5至约100，有时r是约5至约50或约5至约25。在某些实施例中，r是约5至约15，有时r是约10。在一些实施例中，R³是PEG单元(PEG)_r，且r是约2至约10(例如，r是约2至约4)或约18至约500。

在一些实施例中，s是约5至约100，有时s是约5至约50或约5至约25。在某些实施例中，s是约5至约15，有时s是约10。在一些实施例中，s是约5或更小(例如，s是1)。在一些实施例中，(R³)_r取代基是线性的，在某些实施例中，(R³)_r取代基是支化的。对于线性部分，s有时小于r(例如，当R₃是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-时)，有时s是1。在一些实施例中，R³是线性PEG部分(例如，具有约1至约1000个PEG单元)，s是1和r是1。对于支链部分，s有时小于、大于或等于r(例如，当R³是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-时)，有时r是1，s是1并且p是约1至约1000(例如，p是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000)。

在一些实施例中，R³是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-，r是约1至约1000(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000)。

在某些实施例中，X²是酰氨基连接基团(例如-C(O)NH-或-NH(O)C-)；烷基酰氨基连接基团(例如-C₁-C₆烷基-C(O)NH-、-C₁-C₆烷基-NH(O)C-、-C(O)NH-C₁-C₆烷基-、-NH(O))C-C₁-C₆烷基-、-C₁-C₆烷基--NH(O)C-C₁-C₆烷基-、-C₁-C₆烷基-C(O)NH-C₁-C₆烷基-或-C(O)NH-(CH₂)_t-，其中t为1、2、3或4)；取代5-6元环(例如，芳环、杂芳环(例如，四唑、吡啶基、2，5-吡咯烷二酮(例如，被取代苯基部分取代的2，5-吡咯烷二酮))、碳环或杂环)或含氧部分(例如，-O-、-C₁-C₆烷氧基)。

本文使用的术语“磷脂”是指具有以下通式带有与甘油羟基键合的磷酸基团的甘油单酯或二酯，其中烷醇胺基团作为酯键合到磷酸酯基团：

其中R¹¹和R¹²各自独立地是氢或酰基，并且根据pH，R¹³是负电荷或氢。当R¹³是负电荷时，可以存在合适的反离子，例如钠离子。例如，烷醇胺部分可以是乙醇胺部分，从而m＝1。还应理解的是，NH基团可以质子化并带正电，或未质子化和中性，这取决于pH值。例如，磷脂可以作为具有带负电荷的磷酸氧阴离子和带正电荷的质子化氮原子的两性离子存在。带有OR¹²的碳原子是手性碳原子，因此该分子可以作为R异构体、S异构体或其任意混合物存在。当式(II)化合物的样品中存在等量的R和S异构体时，该样品被称为“外消旋体”。例如，在市售产品1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺中，R³基团是手性结构

这是R绝对构型。

磷脂可以是游离分子，也可以是与另一个基团共价连接的分子，例如如图所示

其中波浪线表示键合点。

因此，当取代基，例如本文式(I)化合物的R^x被称为磷脂时，这意味着磷脂基团如结构所指定的那样与另一个基团，例如本文所公开的N-苄基杂环系统键合。除非另外说明，例如结构描述，否则磷脂基团的连接点可以在任何化学上可行的位置。例如，在上面显示的磷脂结构中，与另一个化学部分的连接点可以是通过乙醇胺氮原子，例如作为通过与另一个化学部分的羰基键合的酰胺基团，例如

其中R是与磷脂结合的其他化学部分。在这种键合的酰胺衍生物中，R¹³基团可以是质子或可以是与反离子(例如钠离子)连接的负电荷。烷醇胺基团的酰化氮原子不再是碱性胺，而是中性酰胺，因此在生理pH值下不会质子化。

本文使用的术语“酰基”是指带有羰基的有机结构，该结构通过所述羰基与例如磷脂的甘油羟基键合，形成“羧酸酯”基团。酰基的实例包括脂肪酸基团，例如油酰基，其因此与甘油羟基形成脂肪(例如油酰基)酯。因此，当R¹¹或R¹²，但不是两者都是酰基时，上文所示的磷脂是单羧酸酯，当R¹¹和R¹²都是酰基时，上文所示的磷脂是二羧酸酯。

在一个实施例中，R^x的磷脂包含两个羧酸酯，每个羧酸酯包括1个、2个、3个或4个不饱和、环氧化、羟基化或它们的组合的位点。

在一个实施例中，R^x的磷脂包含两个羧酸酯，这两个羧酸酯相同或不同。

在一个实施例中，磷脂的每个羧酸酯是在C8-C9处具有不饱和位点的C17羧酸酯。

在一个实施例中，磷脂的每个羧酸酯是在C9-C10处具有不饱和位点的C18羧酸酯。

在一个实施例中，X²可以是键或链中具有1个至约10个原子的链，其中所述链的原子选自碳、氮、硫和氧，其中任何碳原子可以被氧取代，其中任何硫原子可以被一个或两个氧基取代。

在一个实施例中，X²是C(O)，

在一个实施例中，R^x包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

在一个实施例中，R^x是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，X²是C(O)。

在一个实施例中，X¹是氧或-NH-。

在一个实施例中，R¹和R^c一起形成杂环或取代杂环，例如，形成取代或未取代吗啉、哌啶、吡咯烷或哌嗪环。

在一个实施例中，R¹是被C_1-6烷氧基取代的C1-C10烷基，R¹是氢、C_1-4烷基或取代C_1-4烷基，R¹是氢、甲基、乙基、丙基、丁基、羟基C_1-4亚烷基或C_1-4烷氧基C_1-4亚烷基，或R¹是氢、甲基、乙基、甲氧基乙基或乙氧基乙基。

在一个实施例中，所述组合物进一步包括一定数量的抗原。

在各种实施例中，哺乳动物可以是人类。

在各种实施例中，组合物可以鼻内施用，或者可以经皮施用，或者可以全身施用。

TLR4配体

正如谈到TLR4配体时所述，术语“烷基”，其本身或作为另一取代基的一部分，除非另外说明，是指直链(即，未支化的)或支链，或它们的组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的及可以包括二价和多价基团，具有指定的碳原子数(即，C₁-C₁₀指1到10个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、(环己基)甲基，它们的同系物和异构体等基团，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高的同系物和异构体。烷氧基是通过氧连接基团(-O-)连接到分子其余部分的烷基。

除非另外说明，术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷基的二价基团，例如但不限于-CH₂CH₂CH₂CH₂-。通常，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子。在一个实施例中，这些基团具有10个或更少的碳原子。“低级烷基”或“低级亚烷基”是链较短的烷基或亚烷基，通常具有八个或更少的碳原子。

除非另外说明，术语“杂烷基”本身或与另一术语组合是指由至少一个碳原子和至少一个选自O、N、P、Si和S的杂原子组成的稳定的直链或支链，或它们的组合，其中氮原子和硫原子可以任选被氧化，并且氮杂原子可以任选被季铵化。杂原子0、N、P、S和Si可位于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子其余部分连接的位置。实例包括但不限于：

-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂、-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃、-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃、-O-CH₃，-O-CH₂-CH₃和-CN。最多两个杂原子可以是连续的，例如-CH₂-NH-OCH₃。

除非另外说明，术语“杂亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于杂亚烷基，杂原子也可以占据一个或两个链末端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。更进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的结构式书写方向并不暗示连接基团的取向。例如，结构式-C(O)₂R'-代表-C(O)₂R'-和-R'C(O)₂-。如上所述，本文所述的杂烷基包括通过杂原子连接到分子其余部分的那些基团，例如-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R"、-OR'、-SR'和/或-SO₂R'。当谈到“杂烷基”，接着列举特定的杂烷基，例如-NR'R"等时，应该理解的是，术语杂烷基和-NR'R”不是冗余的或相互排斥的。相反，列举特定的杂烷基是为了更清楚。因此，术语“杂烷基”在本文不应被解释为排除特定的杂烷基，例如-NR'R”等。

除非另外说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。此外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。“环亚烷基”和“杂环亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指分别衍生自环烷基和杂环烷基的二价基团。

除非另外说明，术语“卤”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”之类的术语旨在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C₁-C₄)烷基”包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另外说明，否则术语“酰基”是指-C(O)R，其中R是取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。

除非另外说明，否则术语“芳基”是指多不饱和芳烃取代基，其可以是单环或稠合在一起(即稠环芳基)或共价连接的多环(例如，1至3个环)。稠环芳基是指稠合在一起的多个环，其中至少一个稠环是芳环。术语“杂芳基”是指包含至少一个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮原子和硫原子任选被氧化，并且氮原子任选被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即稠合在一起的多个环，其中至少一个稠环是杂芳环)。5,6-稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环有5个成员，另一个环有6个成员，其中至少一个环是杂芳环。同样，6,6-稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环有6个成员，另一个环有6个成员，其中至少一个环是杂芳环。此外，6,5-稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环有6个成员，另一个环有5个成员，其中至少一个环是杂芳环。杂芳基可以通过碳原子或杂原子连接到分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每个芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的取代基。“亚芳基”和“杂亚芳基”独自或作为另一取代基的一部分是指分别衍生自芳基和杂芳基的二价基团。

为了简单起见，术语“芳基”在与其他术语(例如，芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)组合使用时包括如上定义的芳基环和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”旨在包括其中芳基连接至烷基的那些基团(例如苄基、苯乙基、吡啶甲基等)，其中所述烷基包括其中碳原子(例如，亚甲基)已被例如氧原子取代的那些烷基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。

本文所述术语“氧代”是指与碳原子双键连接的氧。

本文所述术语“烷基磺酰基”是指具有结构式-S(O₂)-R'的部分，其中R'是如上定义的烷基。R'可以具有指定数量的碳(例如，“C₁-C₄烷基磺酰基”)。

上述每个术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)包括指定基团的取代和未取代形式。

烷基和杂烷基基团(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自以下多种基团中的一种或多种，但不限于这些基团：-OR'、＝0、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO₂R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)₂R'、-NR-C(NR'R"R"')＝NR""、-NR-C(NR'R")＝NR"'、-S(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)₂NR'R"、-NRSO₂R'、-CN和-NO₂，其数量是0至(2m'+1)，其中m'是所述基团中的碳原子的总数。在一个实施例中，R'、R"、R"'和R""各自独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如，被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳烷基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，每一个R基团被独立地选择，正如当存在1个以上R'、R"、R"'和R""这些基团时，独立地选择每一个R'、R"、R"'和R""基团一样。当R'和R"连接到同一个氮原子时，它们可以与氮原子组合形成4-、5-、6-或7-元环。例如，-NR'R"包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述讨论，本领域技术人员将理解术语“烷基”旨在包括包含与除氢基团之外的基团键合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如，-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(例如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

与描述的烷基取代基类似，芳基和杂芳基的取代基是多种多样的，并且选自，例如：-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO₂R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)₂R'、-NR-C(NR'R"R"')＝NR""、-NR-C(NR'R")＝NR"'、-S(O)R'、-S(O)₂R'、-S(O)₂NR'R"、-NRSO₂R'、-CN、-NO₂、-R'、-N₃、-CH(Ph)z、氟(C₁-C₄)烷氧基和氟(C₁-C₄)烷基，其数量是0到芳环系统上的开放价数总数；其中在一个实施例中，R'、R"、R"'和R""独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，每一个R基团被独立地选择，正如当存在1个以上R'、R"、R"’和R""这些基团时，独立地选择每一个R'、R"、R"'和R""基团一样。

两个或更多个取代基可任选连接以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基。这种所谓的成环取代基通常(尽管不是必须)与环状基础结构相连。在一个实施例中，成环取代基与基础结构的相邻成员相连。例如，与环状基础结构的相邻成员相连的两个成环取代基形成稠环结构。在另一个实施例中，成环取代基与基础结构的单个成员相连。例如，与环状基础结构的单个成员相连的两个成环取代基形成螺环结构。在另一个实施例中，成环取代基与基础结构的非相邻成员相连。

芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选形成结构式-T-C(O)-(CRR')_q-U-的环，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR'-，或单键，q是0～3的整数。或者，芳基或杂芳基环相邻原子上的两个取代基可任选被结构式-A-(CH₂)_r-B-的取代基取代，其中A和B独立地是-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR'-或单键，r是1至4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选被双键替代。或者，芳基或杂芳基环相邻原子上的两个取代基可以任选被结构式-(CRR')_s-X'-(C"R"')_d-的取代基取代，其中s和d可以独立地是整数0至3，且X'是-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR'-。在一个实施例中，取代基R、R'、R”和R”'独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。

本文所述术语“杂原子”或“环杂原子”旨在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。

本文所述“取代基”是指选自以下部分的基团：

(A)-OH、-NH₂、-SH、-CN、-CF₃、-CCl₃、-NO₂、氧代、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，及

(B)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，被至少一个选自以下的取代基取代：(i)氧代、-OH、-NH₂、-SH、-CN、-CF₃、-CCl₃、-NO₂、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，和(ii)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，被至少一个选自以下的取代基取代：(a)氧代、-OH、-NH₂、-SH、-CN、-CF₃、-CCl₃、-NO₂、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，和(b)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，被至少一个选自以下的取代基取代：氧代、-OH、-NH₂、-SH、-CN、-CF₃、-CCl₃、-NO₂、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基和未取代的杂芳基。

本文所述“大小受限的取代基”或“大小受限的取代基团”是指选自上文“取代基团”描述的所有取代基的基团，其中每个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C₁-C₂₀烷基，每个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2-20元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C₄-C₈环烷基，每个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的4-8元杂环烷基。

本文所述“低级取代基”或“低级取代基团”是指选自上文“取代基团”描述的所有取代基的基团，其中每个取代或未取代的烷基例如是取代或未取代的C₁-C₈烷基，每个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至8元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C₅-C₇环烷基，每个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的5-7元杂环烷基。

在一些实施例中，本文化合物中描述的每个取代基被至少一个取代基取代。更具体地说，在一些实施例中，本文所述化合物中描述的每个取代烷基、取代杂烷基、取代环烷基、取代杂环烷基、取代芳基、取代杂芳基、取代亚烷基、取代杂亚烷基、取代环亚烷基、取代杂环亚烷基、取代亚芳基和/或取代杂亚芳基被至少一个取代基取代。在其他实施例中，这些基团中的至少一个或全部基团被至少一个大小受限的取代基取代。在其他实施例中，这些基团中的至少一个或全部基团被至少一个低级取代基取代。

在一些实施例中，本文所述的化合物可包括取代基的多个实例，例如，R⁵、R^5A、R^5B、R^5C、R^6A、R^6B、R^6C、R⁷、R^7A、R^7B、R^7C、R⁸、R^8A、R^8B，和/或R^8C。在这些的实施例中，每个取代基在每次出现时可以任选不同，并且被适当地标记，以更清楚地区分每个基团。例如，当每个R^5A不同时，它们可以被称为例如，R^5A.1、R^5A.2、R^5A.3、R^5A.4、R^5A.5。类似地，R^5A、R^5B、R^5C、R^6A、R^6B、R^6C、R⁷、R^7A、R^7B、R^7C、R⁸、R^8A、R^8B和/或R^8C中的每个可以多次出现，R^5A、R^5B、R^5C、R^6A、R^6B、R^6C、R⁷、R^7A、R^7B、R^7C、R⁸、R^8A、R^8B和/或R^8C的每次出现的定义分别采用R^5A、R^5B、R^5C、R^6A、R^6B、R^6C、R⁷、R^7A、R^7B、R^7C、R⁸、R^8A、R^8B和/或R^8C的定义。

一方面，提供了式(II)化合物：

或其药学上可接受的盐。式(II)中，zl是0～4的整数，z2是0～5的整数，R⁵是取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基，R⁶是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基，R⁷是氢，或者取代或未取代的烷基，R⁸独立地是卤素、-CN、-SH、-OH、-COOH、-NH₂、-CONH₂、硝基、-CF₃、-CCl₃、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基。

在一个实施例中，R⁵是R^5A-取代或未取代的环烷基、R^5A-取代或未取代的杂环烷基、R^5A-取代或未取代的芳基，或者R^5A-取代或未取代的杂芳基。R^5A独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、R^5B-取代或未取代的烷基、R^5B-取代或未取代的杂烷基、R^5B-取代或未取代的环烷基、R^5B-取代或未取代的杂环烷基、R^5B-取代或未取代的芳基，或者R^5B-取代或未取代的杂芳基。R^5B独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、R^5C-取代或未取代的烷基、R^5C-取代或未取代的杂烷基、R^5C-取代或未取代的环烷基、R^5C-取代或未取代的杂环烷基、R^5C-取代或未取代的芳基，或者R^5C-取代或未取代的杂芳基。R^5C独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基，或未取代的杂芳基。

此外，对于此实施例，R⁶是R^6A-取代或未取代的烷基、R^6A-取代或未取代的杂烷基、R^6A-取代或未取代的环烷基、R^6A-取代或未取代的杂环烷基、R^6A-取代或未取代的芳基，或者R^6A-取代或未取代的杂芳基。R^6A独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、R^6B-取代或未取代的烷基、R^6B-取代或未取代的杂烷基、R^6B-取代或未取代的环烷基、R^6B-取代或未取代的杂环烷基、R^6B-取代或未取代的芳基，或者R^6B-取代或未取代的杂芳基。R^6B独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、R^6C-取代或未取代的烷基、R^6C-取代或未取代的杂烷基、R^6C-取代或未取代的环烷基、R^6C-取代或未取代的杂环烷基、R^6C-取代或未取代的芳基，或者R^6C-取代或未取代的杂芳基。R^6C独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基，或未取代的杂芳基。

此外，对于此实施例，R⁷是氢，或R^7A-取代或未取代的烷基。R^7A独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基，或未取代的杂芳基。

此外，对于此实施例，R⁸独立地是卤素、-CN、-SH、-OH、-COOH、-NH₂、-CONH₂、硝基、-CF₃、-CCl₃，R^8A-取代或未取代的烷基、R^8A-取代或未取代的杂烷基、R^8A-取代或未取代的环烷基、R^8A-取代或未取代的杂环烷基、R^8A-取代或未取代的芳基，或者R^8A-取代或未取代的杂芳基。R^8A独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、R^8B-取代或未取代的烷基、R^8B-取代或未取代的杂烷基、R^8B-取代或未取代的环烷基、R^8B-取代或未取代的杂环烷基、R^8B-取代或未取代的芳基，或者R^8B-取代或未取代的杂芳基。R^8B独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、R^8C-取代或未取代的烷基、R^8C-取代或未取代的杂烷基、R^8C-取代或未取代的环烷基、R^8C-取代或未取代的杂环烷基、R^8C-取代或未取代的芳基，或者R^8C-取代或未取代的杂芳基。R^8C独立地是卤素、-CN、-CF₃、-CCl₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、氧代、硝基、-SH、-CONH₂、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基，或未取代的杂芳基。

另一方面，提供如上所公开的式(II)化合物，然而，条件是：(i)式(II)化合物不是

其中R⁵是对氟苯基或对甲基苯基；(ii)所述化合物不是

其中R⁶是未取代的芳基、未取代的环己基、未取代的噻唑或-CH₂-呋喃基；或(iii)R⁷不是氢。

进一步关于上文公开的任何方面，在一个实施例中，R⁵不是取代苯基。在一个实施例中，R⁵不是对-氟苯基或对-甲基苯基。

在一个实施例中，所述化合物不具有式(IIa)的结构，其中R⁶是取代苯基。在一个实施例中，所述化合物不具有式(IIa)的结构，其中R⁶是对-氟苯基或对-甲基苯基。

进一步关于上文公开的任何方面，在一个实施例中，R⁶不是取代或未取代的芳基、未取代的环己基、未取代的噻唑或-CH₂-呋喃基。在一个实施例中，所述化合物不具有式(IIb)的结构，其中R⁶是取代或未取代的芳基、取代或未取代的环己基、取代或未取代的噻唑，或者取代或未取代的呋喃基取代的烷基。在一个实施例中，R⁶不是未取代的芳基、未取代的环己基、未取代的噻唑或-CH₂-呋喃基。

进一步关于上文公开的任何方面，在一个实施例中，R⁵是取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的芳基。在一个实施例中，R⁵是未取代的环烷基或未取代的芳基。

在一个实施例中，R⁵是取代或未取代的C₆-C₈环烷基或者取代或未取代的苯基。在一个实施例中，R⁵是取代或未取代的C₆环烷基或者取代或未取代的苯基。

在一个实施例中，R⁵是R^5A-取代或未取代的C6环烷基或R^5A-取代或未取代的苯基，其中R^5A是卤素。在一个实施例中，R⁵是R^5A-取代或未取代的的苯基，其中R^5A是卤素。在一个实施例中，R⁵是R^5A-取代或未取代的的苯基，其中R^5A是氟。在一个实施例中，R⁵是未取代的苯基。

进一步关于上文公开的任何方面，在一个实施例中，所述化合物不具有式(Ib)的结构，其中R⁶是取代或未取代的芳基、取代或未取代的环己基、取代或未取代的噻唑，或被取代或未取代的呋喃基取代的烷基。

在一个实施例中，R⁶是取代或未取代的C₄-C₁₂环烷基、取代或未取代的C₃-C₁₂烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基。在一个实施例中，R⁶是取代或未取代的C₄-C₁₂环烷基、取代或未取代的C₄-C₁₂烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基。在一个实施例中，R⁶是取代或未取代的C₄-C₁₂环烷基、取代或未取代的C₄-C₁₂支链烷基，或者取代或未取代的苯基。在一个实施例中，R⁶是R^6A-取代或未取代的C₄-C₁₂环烷基、R^6A-取代或未取代的C₄-C₁₂支链烷基，或者R^6A-取代或未取代的苯基，其中R^6A是卤素。在一个实施例中，R⁶是R^6A-取代或未取代的C₄-C₁₂环烷基、R^6A-取代或未取代的C₄-C₁₂支链烷基，或者R^6A-取代或未取代的苯基，其中R^6A是氟。在一个实施例中，R⁶是未取代的C₄-C₁₂环烷基、未取代的C₄-C₁₂支链烷基，或者R^6A-取代或未取代的苯基，其中R^6A是氟。在一个实施例中，R⁶是未取代的C₆-C₁₂环烷基、未取代的C₄-C₁₂支链烷基，或未取代的苯基。在一个实施例中，R⁶是未取代的C₆-C₁₀环烷基。在一个实施例中，R⁶是未取代的C₆-C₈环烷基。在一个实施例中，R⁶是未取代的环己基。

在一个实施例中，R⁷是氢或者取代或未取代的烷基。在一个实施例中，R⁷是氢或未取代的烷基。在一个实施例中，R⁷是氢或未取代的C1-C3烷基。在一个实施例中，R⁷是氢、甲基或乙基。在一个实施例中，R³是甲基。在一个实施例中，R⁷是乙基。在一个实施例中，R⁷是氢。

在一个实施例中，zl是0、1、2、3或4。在一个实施例中，zl是0或1。在一个实施例中，zl是0。在一个实施例中，zl是1。在一个实施例中，z2是0、1、2、3、4或5。在一个实施例中，z2是1。

在一个实施例中，R⁸独立地是取代或未取代的烷基。在一个实施例中，R⁸独立地是取代烷基。在一个实施例中，R⁸独立地是未取代的烷基。在一个实施例中，R⁸独立地是取代或未取代的杂烷基。在一个实施例中，R⁸独立地是取代杂烷基。在一个实施例中，R⁸独立地是未取代的杂烷基。在一个实施例中，R⁸独立地是取代或未取代的芳基。在一个实施例中，R⁸独立地是取代或未取代的杂芳基。

对于式(IIc)(上文)，R⁶是取代或未取代的烷基，或者取代或未取代的环烷基；R⁷是取代或未取代的烷基。在一个实施例中，R⁶是未取代的环烷基，例如，环己基、环庚基或环辛基。在一个实施例中，R⁶是未取代的烷基，例如，3，3-二甲基丁基。在一个实施例中，R⁷是未取代的烷基。在一个实施例中，R¹⁰是烷基酯。

另一方面，提供一种式(IId)化合物：

对于式(IId)，L2是连接基团，B1是嘌呤碱或其类似物。

在一个实施例中，L2是取代或未取代的亚烷基，或者取代或未取代的杂亚烷基。在一个实施例中，L2包括水溶性聚合物。“水溶性聚合物”是指在本领域已知的例如温度、离子浓度等生理条件下在水中充分溶解以用于本文所述方法的聚合物。示例性的水溶性聚合物是聚乙二醇。

在一个实施例中，水溶性聚合物是-(OC₂CH₂)_m-，其中m是1至100。在一个实施例中，L²包括裂解元素。“裂解元素”是可以经历裂解(例如水解)以释放所述化合物的化学官能团，任选包括连接基团L²的残余物，和B¹，任选包括连接基团L²的残余物。

表1

表2

表3

途径和制剂

施用具有一种或多种抗原和一种或多种佐剂及任选另一种活性剂的组合物或施用具有一种或多种抗原的组合物和具有一种或多种佐剂的组合物可以通过任何合适的施用途径，特别是肠胃外，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下。所述施用可以是单次大剂量注射、多次注射，或作为短期或长期输注。可植入装置(例如，可植入输液泵)也可用于特定制剂随时间等剂量或不同剂量周期性肠胃外递送。对于这种肠胃外施用，所述化合物(缀合物或其他活性剂)可以配制成在水或其他合适的溶剂或溶剂混合物中的无菌溶液。所述溶液可能含有其他物质，如使溶液与血液等渗的盐、糖(特别是葡萄糖或甘露醇)，缓冲剂如乙酸、柠檬酸和/或磷酸及它们的钠盐，以及防腐剂。

本发明的组合物单独或与其他活性剂组合可配制成药物组合物，并以适合所选给药途径(例如口服或肠胃外，通过静脉内、肌内、局部或皮下途径给药)的多种形式施用于哺乳动物宿主，例如人类患者。

因此，单独或与另一种活性剂(例如抗原)组合的所述组合物可以与药学上可接受的载体(例如惰性稀释剂或可同化的食用载体)组合全身给药，例如口服。它们可以被包裹在硬壳或软壳明胶胶囊中，可以被压成片剂，或者可以直接与患者饮食中的食物混合。对于口服治疗给药，任选与活性化合物组合的所述组合物可与一种或多种赋形剂组合，并以可摄取片剂、口腔片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆、薄片等形式使用。所述组合物和制剂应包含至少0.1％的活性化合物。当然，所述组合物和配制品的百分含量可以变化，一般是给定剂型重量的大约2至大约60％。所述有用组合物中缀合物和任选其它活性化合物的含量是获得有效剂量水平所需的含量。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以包含下述成分；可以加入粘结剂，如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、果糖、乳糖或糖精，或香味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香精。当剂型是胶囊时，除上述材料外，还可以包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。其它各种材料可以以包衣的形式存在，或可以改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂，丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和香味剂如樱桃或甜橙香精等。当然，制备任何单位剂型的任何材料都应是药学上可接受的，且在其用量时基本无毒。此外，可以将任选与另一种活性化合物组合的磷脂缀合物掺入到缓释制剂和装置中。

任选与另一种活性化合物组合的所述组合物也可以通过输注或注射经静脉内或腹膜内给药。抗原和佐剂任选与另一种活性化合物或其盐组合的溶液可以在水中制备，任选与无毒表面活性剂混合。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及它们的混合物中制备和在油中制备。在正常贮存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂防止微生物生长。

适于注射或输注的药物剂型可包括含活性成分的无菌水溶液或分散液或无菌粉末，其适于即时制备无菌注射或输注溶液或分散液，任选包封在脂质体中。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下均应无菌、流动且稳定。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及它们的合适混合物。例如，可以通过脂质体的形成、在分散体的情况下通过维持所需的粒度或通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。储存期间可以采用各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等来防止微生物作用。在许多情况下，包括等渗剂，如糖、缓冲剂、氯化钠是有用的。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

将要求数量的化合物及上面列举的其它各种成分(根据需要)加入到合适的溶剂中，然后进行过滤除菌，制备无菌可注射液。采用无菌粉末制备无菌可注射液时，一种制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，这些方法将得到活性成分加前面无菌过滤溶液中存在的任何其它所需成分的粉末。

对于局部给药，任选与另一种活性化合物组合的抗原和佐剂可以以纯形式施用，例如，当它们是液体时。然而，通常希望将它们作为组合物或制剂与皮肤可接受的载体(其可以是固体或液体)组合施用于皮肤。

有用的固体载体包括细碎的固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载体包括水、醇或二醇或水-醇/二醇混合物，其中任选在无毒表面活性剂的帮助下，本发明的化合物可以以有效含量溶解或分散在其中。可以添加芳香剂和抗微生物剂等佐剂来增强给定用途的特性。所得液体组合物可以从吸收垫施用，用于浸渍绷带和其他敷料，或使用泵类或气雾剂喷雾器喷洒到受影响的区域上。

增稠剂，例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料也可以与液体载体一起使用而形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接施用于使用者的皮肤。

此外，在一个实施例中，本发明提供用于吸入递送的抗原和佐剂任选与另一种活性化合物组合的各种剂型。例如，可以将制剂设计为在定量吸入器、干粉吸入器和雾化器之类的装置中使用的气雾剂。

可用于将化合物递送至皮肤的有用的皮肤组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等.(美国专利No.4,608,392)，Geria(美国专利No.4,992,478)，Smith等(美国专利No.4,559,157)和Wortzman(美国专利No.4,820,508)。

有用剂量可通过比较其体外活性和动物模型体内活性确定。将小鼠和其他动物的有效剂量外推至人类的方法是本领域已知的；例如参见美国专利第4，938，949号。佐剂作为TLR激动剂的能力可以使用本领域众所周知的药理学模型来确定，包括Lee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100:6646(2003)公开的程序。

通常，在液体组合物(例如洗剂)中任选与另一种活性化合物组合的磷脂的浓度是约0.1-25重量％，例如约0.5-10重量％。半固体或固体组合物(例如凝胶或粉末)中的浓度将是约0.1-5重量％，例如约0.5-2.5重量-％。

可施用活性成分，从而达到约0.5至约75μM，例如约1至50μM，例如约2至约30μM的活性化合物的峰值血浆浓度。例如，这可以通过静脉注射0.05-5％的活性成分溶液来实现，任选在盐水中，或作为含约1-100mg活性成分的大丸剂口服给药。可通过提供约0.01-5.0mg/kg/hr的连续输注，或通过含约0.4-15mg/kg活性成分的间歇输注来维持所需的血液浓度。

治疗所需的任选与另一种活性化合物或其活性盐或衍生物组合的抗原和佐剂的用量不仅随所选的特定盐，而且随给药途径、所治疗疾病的性质以及患者的年龄和状况而变化，最终将由主治医师或临床医生自行决定。然而，一般而言，合适的剂量范围是约0.5至约100mg/kg体重，例如约10至约75mg/kg体重/天，例如3至约50mg/kg接受者体重每天，例如6至90mg/kg/天，例如15至60mg/kg/天。

任选与另一种活性化合物组合的抗原和佐剂可以方便地以单位剂型给药；例如，每单位剂型含5至1000mg，方便地含10至750mg，最方便地含50至500mg的活性成分。

所需剂量可方便地以适当间隔施用的单剂量或分剂量形式存在，例如，以每天2、3、4或更多次亚剂量形式存在。亚剂量本身可以进一步分成例如多个分散的松散间隔给药；例如从吹药器多次吸入或向眼中滴入多滴。剂量，可能还有给药频次，也将根据个体患者的年龄、体重、状况和反应而变化。一般而言，用于本文所述疾病的活性剂的总的日剂量范围可以是约50mg至约5000mg，单次或分次服用。在一个实施例中，每日剂量范围应该是约100mg至约4000mg，例如约1000-3000mg，单次或分次服用，例如每6小时口服化合物750mg。这可以达到约500-750uM的血浆浓度，可以有效杀死癌细胞。在管理患者时，应根据患者的整体反应以较低的剂量开始治疗。

特定抗原包括氨基酸、碳水化合物、肽、蛋白质、核酸、脂质、身体物质或细胞例如微生物。

特定肽具有2个至约20个氨基酸残基。

另一种特定肽具有10个至约20个氨基酸残基。

特定抗原包括碳水化合物。

特定抗原是微生物。特定微生物是病毒、细菌或真菌。

具体的细菌有炭疽芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、土拉弗朗西斯菌、沙门氏菌或葡萄球菌。具体的沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌或肠炎沙门氏菌。具体的葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌。

具体病毒有RNA病毒，包括RSV和流感病毒，RNA病毒的产物，或DNA病毒，包括疱疹病毒。一种具体的DNA病毒是乙型肝炎病毒。

本发明包括包含TLR4激动剂和TLR7激动剂磷脂缀合物的组合物，任选与可以是或可以不是抗原的其他活性剂组合，例如利巴韦林、咪唑立宾和霉酚酸酯。

示例性实施例

在一个实施例中，提供一种增强哺乳动物免疫反应的方法。在一个实施例中，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用一种包含有效剂量的TLR4激动剂和TLR7激动剂的组合物。在一个实施例中，所述组合物是脂质体组合物。在一个实施例中，所述组合物包含含TLR4激动剂的脂质体和含TLR7激动剂的脂质体。在一个实施例中，所述组合物包含含TLR4激动剂和TLR7激动剂的脂质体。在一个实施例中，同时施用TLR4激动剂和TLR7激动剂。在一个实施例中，TLR4激动剂具有式(II)结构。在一个实施例中，TLR4激动剂包括1Z105、2B182c、INI-2004或CRX601。在一个实施例中，TRL4激动剂不是1Z105。在一个实施例中，TLR7激动剂具有式(I)结构。在一个实施例中，脂质体包括PC、DOPC或DSPC。在一个实施例中，脂质体包括胆固醇。在一个实施例中，所述方法进一步包括施用一种或多种免疫原。在一个实施例中，免疫原是微生物免疫原，例如一种或多种微生物蛋白、糖蛋白、糖类和/或脂多糖。在一个实施例中，微生物是病毒，例如流感或水痘，或细菌。在一个实施例中，微生物是寄生虫或真菌。在一个实施例中，所述脂质体包含一种或多种免疫原。在一个实施例中，所述组合物包含一种或多种免疫原。在一个实施例中，所述哺乳动物是人类。在一个实施例中，所述哺乳动物是啮齿动物、马、牛、山羊、犬、猫、猪或绵羊。在一个实施例中，TLR7激动剂的含量是约0.01至100nmol，约0.1至10nmol，或约100nmol至约1000nmol。在一个实施例中，TLR4激动剂的含量是约2至20umol，约20nmol至2umol，或约2umol至约100umol。在一个实施例中，TLR7和TLR4激动剂的比例是约1:10、1:100、1:200、5:20、5:100或5:200。在一个实施例中，所述组合物注射施用。在一个实施例中，脂质体包含DOPC和胆固醇。

在一个实施例中，免疫原是细胞、蛋白质或孢子。在一个实施例中，免疫原在组合物施用之前或之后施用。在一个实施例中，施用有效预防微生物感染。在一个实施例中，所述组合物是鼻内施用。在一个实施例中，所述组合物是皮内施用。

在一个实施例中，提供一种包含脂质体、TLR4激动剂和TLR7激动剂的药物制剂。在一个实施例中，脂质体包括1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰-(1'-外消旋-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]月桂酰]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]月桂酰}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)及其混合物；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇或其混合物。在一个实施例中，脂质体包括DOPC、胆固醇或其组合。在一个实施例中，TLR7激动剂的含量是大约0.01至100nmol、大约0.1至10nmol或大约100nmol至大约1000nmol。在一个实施例中，TLR4激动剂的含量是大约2nmol至20umol、大约20nmol至2umol，或约2umol至约100umol。在一个实施例中，TLR7和TLR4激动剂的比例是约1:10、1:100、1:200、5:20、5:100或5:200。在一个实施例中，TLR7激动剂包含式(I)化合物。在一个实施例中，式(I)包含

其中R¹¹和R¹²各自独立地是氢或酰基，R¹³是负电荷或氢，且m是1至8，其中波浪线表示键合位置，其中在带有OR¹²的碳原子处的绝对构型是R、S或其任何混合物。在一个实施例中，m是1。在一个实施例中，R¹¹和R¹²是油酰基。在一个实施例中，

R³的磷脂包含两个羧酸酯，每个羧酸酯包括1个、2个、3个或4个不饱和、环氧化、羟基化或它们的组合的位点。在一个实施例中，R³的磷脂包含两个羧酸酯，这两个羧酸酯类似或不同。在一个实施例中，磷脂的每个羧酸酯是在C8-C9处具有不饱和位点的C17羧酸酯。在一个实施例中，磷脂的每个羧酸酯是在C9-C10处具有不饱和位点的C18羧酸酯。在一个实施例中，X²可以是键或链中具有1个至约10个原子的链，其中所述链的原子选自碳、氮、硫和氧，其中任何碳原子可以被氧取代，其中任何硫原子可以被一个或两个氧基取代。在一个实施例中，X²是C(O)，

在一个实施例中，R³包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。在一个实施例中，R³是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，X²是C(O)。在一个实施例中，X¹是氧。在一个实施例中，X¹是硫，或-NR^c-，其中R^c是氢、C_1-6烷基或取代C_1-6烷基，其中烷基取代基是羟基、C_3-6环烷基、C_1-6烷氧基、氨基、氰基或芳基。在一个实施例中，X¹是-NH-。在一个实施例中，R¹和R^c一起形成杂环或取代杂环。在一个实施例中，R¹和R^c一起形成取代或未取代吗啉、哌啶、吡咯烷或哌嗪环。在一个实施例中，R¹是C1-6烷氧基取代的C1-C10烷基。在一个实施例中，R¹是氢、C_1-4烷基或取代C_1-4烷基。在一个实施例中，R¹是氢、甲基、乙基、丙基、丁基、羟基C_1-4亚烷基或C_1-4烷氧基C_1-4亚烷基。在一个实施例中，R¹是氢、甲基、乙基、甲氧基乙基或乙氧基乙基。在一个实施例中，R²是卤素或C_1-4烷基，或R²不存在。在一个实施例中，R²是氯、溴、甲基或乙基，或R²不存在。在一个实施例中，X¹是O，R¹是C_1-4烷氧基-乙基，n是0，X²是羰基，且R³是1,2-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。在一个实施例中，所述式(I)化合物是：

在一个实施例中，所述式(I)化合物是：

在一个实施例中，在式(II)中，z2是1、2或3。在一个实施例中，在式(II)中，z1是1或2。在一个实施例中，在式(II)中，z1是0。在一个实施例中，在式(II)中，R⁵是取代或未取代的芳基或杂芳基，例如，未取代的C5或C6芳基。在一个实施例中，在式(II)中，R⁶是取代或未取代的环烷基或杂环烷基，例如C5、C6或C7环烷基。在一个实施例中，在式(II)中，R⁷是取代或未取代的烷基，例如C1至C5烷基。在一个实施例中，在式(II)中，R⁸是取代或未取代的芳基或杂芳基，例如，C5、C6或C7杂芳基，例如，呋喃基、吡咯基或咪唑基。

本发明将通过以下非限制性实例进一步说明。

实例1

脂质体配制的2B182c(TLR4激动剂)和1V270(TLR7激动剂)佐剂的效力

制备单独的2B182c(200nmol/针)和1V270(1nmol/针)的脂质体制剂或200nmol2B182c和1nmol 1V270组合的脂质体制剂(蒙大拿州米苏拉Inimmune Corp)。将脂质体配制佐剂的辅助效力与DMSO制剂(10％DMSO)进行比较。配制佐剂采用相同的方案进行测试。简而言之，雌性BALB/c小鼠在第0天和第21天采用脂质体配制的2B182c(200nmol/针)和/或1V270(1nmol/针)与灭活的流感病毒进行免疫，并通过ELISA评估血清的抗-HA和抗-NA抗体(IgM、IgG1和IgG2a)。收获腹股沟淋巴结，并通过FACS分析B细胞数量，以考察配制的激动剂是否影响生发中心B细胞和浆母细胞(抗原分泌细胞)的数量。

TLR4位于细胞表面和内体腔中。通过内体受体的信号传导抑制LPS对NF-κB的激活。内体TLR4激活触发TRIF通路激活，通过IRF3激活导致1型IFN释放。因此，脂质体制剂可能会减弱2B182c的佐剂活性。单独采用2B182c或采用2B182c+1V270对小鼠进行免疫，与DMSO配制的佐剂相比，脂质体配制的2B182c诱导明显更高的抗-HA IgG2a，而脂质体2B182c降低了HA和NA特异性IgG1(图19A)。脂质体制剂不影响2B182c及2B182c+1V270组合佐剂的IgG2a水平(图19A)。脂质体制剂降低IgG1水平是因为脂质体配制的2B182c及2B182/1V270组合佐剂引起偏向于Th1的免疫反应(图19B)。这些数据与报告所描述的一致：即TLR4配体的细胞内递送诱导依赖于1型IFN依赖方式的有效Th1免疫反应。

接触抗原后，活化的初始和记忆B细胞在生发中心(GC)中扩增和成熟。维持长期疫苗效力所需的高抗原特异性抗体滴度与GC形成相关。活化的B细胞进一步形成抗原特异性抗体分泌细胞(ASC；浆母细胞和浆细胞)、记忆B细胞和其他亚群。在季节性流感病毒疫苗接种后诱导浆母细胞，并在接种后第7天达到峰值。接种灭活病毒后外周血中浆母细胞的频率与人类保护性血凝素抑制滴度的大小相关。因此，测定了引流淋巴结中的GC B细胞和浆母细胞。通过脂质体2B182c和1V270组合，增加了生发中心B细胞和浆母细胞的数量(图20)。

总之，脂质体配制的TLR4和TLR7配体佐剂诱导了Th1偏向免疫反应，并增加了GC中心B细胞和浆母细胞的数量。为了评估脂质体制剂中组合佐剂诱导的B细胞反应的质量，我们目前正在对淋巴结细胞进行BCR和TCR库分析。此外，疫苗佐剂的功能评估通过活病毒(同源和异源攻击)进行评估。

实例2

合成小分子TLR4和TLR7激动剂的组合是重组流感病毒血凝素的有效佐剂，诱导快速和持续的免疫性，在同源、异源和异亚型小鼠攻击模型中针对流感病毒具有保护作用。然而，这些研究中使用的TLR4激动剂是1Z105，这是嘧啶并吲哚类中的第一代先导合成TLR4激动剂，其是将高通量筛选活动鉴定的命中进行优化，从而发现充当先天免疫受体激动剂的佐剂而得到的。人们发现1Z105在鼠细胞中具有良好的免疫活性，但在人类细胞中没有显著的活性。在最近的研究中，含有C8-芳基取代基的第二代系列化合物在鼠细胞中比1Z105更有效，但在人类细胞中的活性也非常强。在这个C8-芳基衍生物的活性组中，根据效力和有利的初步制剂数据，C8-呋喃-2-基衍生物(2B182C)被选择用于进一步研究(图34和36)。嘧啶并吲哚2B182C与1V270组合进行评估以进行比较。MPLA类似物(MPLA-1)是一种有效的TLR4激动剂，在体内表现出对同源和异源流感攻击具有良好的保护作用。

TLR7激动剂1V270是已知TLR7激动剂的磷脂缀合物。相对于相应的未缀合激动剂，激动剂缀合物的磷脂部分提供的主要优点包括效力更强，并且没有通常作为细胞因子综合征观察到的局部或全身毒性。这些表明效力和安全性的有利特性支持选择1V270作为主要的TLR7激动剂，用于本技术方案中描述的组合佐剂研究。

如前所述，包含TLR4激动剂1Z105和TLR7激动剂1V270的组合佐剂使流感病毒疫苗诱导广泛的保护性反应。SAR研究得到的2B182C在THP-1细胞以及体外人类和鼠原代细胞中表现出比1Z105更高的激动效力。在使用灭活流感病毒[A/California/04/09(Cal/09)]的疫苗接种模型中考察了2B182C的佐剂效力，并与1Z105进行了比较。这些研究使用TLR激动剂的简单DMSO-水制剂进行。

TLR4激动剂和TLR7激动剂的组合佐剂诱导对流感病毒感染引发快速广泛的保护性免疫反应

为了评估TLR4/TLR7激动剂组合佐剂针对流感病毒感染诱导保护性免疫反应的概况，采用低剂量(0.2μg/针)重组血凝素(rHA)对小鼠进行免疫接种，考察体液反应和对致死病毒攻击提供保护的情况(图34A-2D)。采用rHA与组合佐剂免疫的小鼠表现出最小的体重减轻和更高的存活率(图34B和2C)。组合佐剂和单独的TLR7激动剂1V270都诱导Th1偏向免疫反应。

为了进一步考察TLR4/TLR7组合佐剂是否提供针对异型流感病毒攻击的交叉保护，我们采用含有B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)的2009-2010Fluzone免疫小鼠，并采用25mLD50的异源小鼠-适应病毒B/Florida/04/2006(Yamagata谱系)对其进行攻击。在采用单独以1V270为佐剂或其与1Z105组合为佐剂的Fluzone接种疫苗后，超过90％的小鼠存活下来(图34E-2G)。这些数据表明1V270单独使用或与1Z105组合使用可诱导对异源流感病毒的快速交叉保护性免疫。

确定TLR4和TLR7激动剂的剂量

如前所述，SAR研究得到了2B182C，与1Z105在人类和小鼠免疫细胞中的表现相比，2B182C在体外表现出更高的效力。为了考察体外研究观察到的更高效力是否也可在体内重现，雌性Balb/c小鼠在第0天和第21天采用活化流感病毒(A/California/04/2009(H1N1)pdm09，Cat^#NR-49450，BEI资源)内的TLR4激动剂(1Z105或2B182C，40或200nmol/针)和1V270(磷脂TLR7激动剂缀合物，0.2或1nmol/针)开展肌内(IM)免疫(图34A)。在第28天采集血清，并通过ELISA测定抗-血凝素(HA)和抗-神经氨酸酶(NA)的抗体(IgM、IgG1和IgG2a)。将1V270、1Z105和2B182C溶解在DMSO中并稀释，其在DMSO中的最终浓度为10％，用作溶媒对照。数据是从显示类似结果的四个独立实验汇总的。

TLR激动剂单一佐剂对抗体分泌的影响

比较了0.2nmol和1nmol 1V270，以及40nmol和200nmol 2B182C或1Z105作为单一佐剂使用时的情况(图34B)。TLR4激动剂1Z105和2B182C均诱导明显更高水平的抗HA和NA的IgG1。关于IgG2a诱导，0.2和1nmol/针1V270均显著增加了抗-HA(p<0.05)，而只有200nmol/针2B182C，而不是1Z105，增强了抗-NA Abs(p<0.01)(图34B)。2B182C和1Z105诱导相似水平的HA特异性IgG2a。任何佐剂治疗引发的IgM反应并不存在任何差异。这些数据支持这一报告：TLR4激动剂增加IgG1的产生，TLR7激动剂对IgG2a分泌有效，2B182C在体内显示出与1Z105相似或适当更高的效力。

2B182C和1V270组合治疗对抗体分泌的影响

接下来，采用DMSO-水制剂评估组合佐剂的效力。1V270与1Z105及2B182C组合的两种组合佐剂均改善了抗HA和抗NA的IgG1诱导。与1Z105相比，2B182C在40和200nmol两种用量下IgG1均明显提高更多(p<0.05，图35A和35B)。在IgG2a诱导中，2B182C增加了抗HA-和抗NA-Abs的水平；然而，1Z105在大多数情况下都未能增加它们的水平(图35C和35D)。佐剂对IgM释放的影响很小(图35E和35F)。

为了比较所有测试组合的抗体滴度，将平均IgG1和IgG2a滴度绘制在图36A中。200nmol 2B182C+0.2或1nmol 1V270显示出对IgG1和IgG2a的最高诱导(图36A)。此外，为了评估Th1/Th2免疫平衡，计算了个体动物的IgG2a：IgG1(图36B)。1nmol 1V270通过1Z105或2B182C显著改变了Th2偏向性免疫反应，表明1V270将免疫反应转变为Th1偏向性(图36B)。总之，这些结果表明，200nmol/针2B182C+1nmol/针1V270的组合诱导了最高数量的IgG1和IgG2a，并且Th1偏向性免疫反应对于流感病毒感染中的异源保护来说是可取的。因此，我们选择这种组合用于进一步的临床前制剂。

TLR4激动剂的初步数据

对MPLA-2(MPLA的硫酸盐类似物)、组合以及纳米颗粒制剂中的所有主要TLR激动剂进行了体内评估。在NIAID佐剂发现和开发合同期间发现了一种有效的TLR4激动剂，它在体外(在hPBMC中)证明了对流感相关细胞因子产生具有相加(如果不是协同)增强性、在小鼠和猪体内与1V270增强IgG2A抗体和HI滴度。MPLA-1作为佐剂的一个主要弱点是其在水性介质中容易水解，缺乏化学稳定性。在非特异性抗性的初步鼠类研究中，MPLA-2比等效剂量的MPLA-1更好地保护小鼠免受致命流感攻击，因此，MPLA-2代表了下一代TLR4激动剂。

为了支持上面概述的目标，将进行下面详述的实验。

研究领域1：主要TLR激动剂组合的制剂和分析检测开发

TLR4/TLR7组合制剂的开发

任务1A：单独和组合先导化合物的胶体稳定纳米颗粒制剂的开发

微粒递送系统通过模仿病毒和细菌病原体的大小和形状来充当佐剂，我们的免疫系统进化为通过模式识别受体(PRR)识别和对抗。过去30年的研究开发了许多基于纳米和微米粒子的系统，这些系统可生物降解，适用于疫苗抗原递送。文献中已经证明了它们作为疫苗递送系统的效用，其包括脂质体、病毒体、免疫刺激复合物、乳液、病毒样颗粒(VLP)、固体脂质纳米颗粒(SLN)和聚乳酸共乙醇酸(PLGA)聚合物，每种类型的实例都进入了人体临床试验。微粒递送载体的主要佐剂机制被认为是增强APC对掺入或结合抗原的颗粒的吸收。现在已经确定，将PAMP添加到抗原中可通过连接TLR和其他PRR，引起先天免疫细胞激活，促进强大的先天性和适应性免疫反应。许多PAMP(细菌脂蛋白、糖脂、DNA和病毒RNA等)已被鉴定并从病毒和细菌病原体中分离出来。许多这些激动剂是强大的佐剂，但会产生不可接受的炎症水平或对临床开发具有不利的物理/化学特性。作为回应，研究人员已成功生产出安全性和化学特性改进的合成类似物，其中许多已被添加到微粒递送系统中，以通过PRR连接增强其病原体模拟。微粒递送系统还可用于改善佐剂的体内生物分布动力学，减少佐剂副作用而不牺牲佐剂免疫原性。

在流感小鼠模型中，已经证明了含双层TLR4激动剂MPLA-1的聚乙二醇化脂质体作为舌下疫苗的有效使用。这种制剂将MPLA-1的产热原性降低了200倍，而没有任何体内佐剂效力的损失。这与掺入脂质体与水分散体对比时观察到的LPS产热原性降低类似。预计TLR4激动剂的产热原性也会同样降低。

对许多不同脂质和成分开展了纳米颗粒/微粒形成、API掺入、API稳定性和胶体稳定性的评估。采用TLR4和TLR7激动剂测试了一系列市售阳离子(DDA、DOTAP、DC-胆固醇)、阴离子(DPPG、PS、POPG)和中性脂质(PC、DOPC、DSPC)。其他制剂可以使用PLGA、聚己内酯、聚(甲基丙烯酸炔丙酯)或PLMA。由于颗粒大小和电荷已被证明显著影响DC对纳米颗粒的吸收和加工，因此探讨了这些变量对增强上述质量特性的递送载体设计的影响。可以使用适用于无菌血清瓶的薄膜方法制备少量脂质体制剂，以进一步减少规模和浪费。

简而言之，这将通过以下方式完成：

1.将API添加到脂质中，并将它们溶解在氯仿中(如果需要，也可以在此步骤添加荧光标记，例如NBD、BODIPY、FITC等)。

2.以设定的速度和真空度旋转蒸发至干燥的薄膜。

3.采用水性缓冲液(0.1M磷酸盐、TRIS或HEPES)重新水化。

4.通过高于脂质转变温度(Tm)的超声浴处理减小粒径，并通过动态光散射(DLS)对粒径、多分散性和表面电荷(δ-电位)进行过程监测。

5.使用Lipex挤出机制备3至10mL规模批次的先导制剂，与超声处理方法相比，该挤出机改善了粒度均匀性(多分散指数，PDI)。

任务1B：评估制剂胶体和物理稳定性的稳定性研究

开发成功的商业产品需要制剂稳定性，因为它会影响产品的储存、运输和保质期，这些都会直接影响产品成本。这些制剂被证明适合作为潜在产品，以及稳定，特别是在选择主要候选者进一步试验时。

对先导制剂的短期加速(25和40℃)和长期实时稳定性(2–8℃和25℃)进行评估，以确保所选制剂为潜在产品开发提供足够的稳定性(优选储存条件下至少12个月)。

将佐剂准确定量掺入到纳米微粒递送系统中对于正确剂量、疫苗效力和安全性至关重要。开发了SEC-HPLC和RP-HPLC方法，用于对掺入到纳米颗粒(包括脂质体)中的TLR4和TLR7/8激动剂进行定量。当样品采用具有足够低背景紫外吸收的水混溶性有机溶剂(甲醇、四氢呋喃等)溶解时，RP-HPLC可有效分析纳米颗粒中存在的总激动剂含量。采用有机溶剂溶解会破坏纳米颗粒，并释放出任何掺入或表面结合的激动剂，通过RP-HPLC对照5点标准曲线对其进行准确定量。

对于脂质体掺入(双层或水核)激动剂的定量，需要一种能够分析完整脂质体和脂质体外水相的方法。采用了一种SEC-HPLC方法，能够通过紫外检测在296、225和310nm(分别针对2B182C、MPLA-2和1V270)对“游离”TLR激动剂进行定量。TSK gelSWxl系列色谱柱为30–200nm范围内的纳米颗粒制剂提供了优异的基于尺寸的分离。使用的流动相与脂质体重新水化时所使用的缓冲液相同，以在脂质体外流体和脂质体核心中的水相之间保持恒定的渗透势。该方法可作为体外效力测定的补充方法，体外效力测定仅检测含水未掺入的TLR4激动剂。

使用这些分析方法开展初步研究，以评估2B182C和1V270的脂质体制剂，每种制剂单独制备和组合制备(共包封)。工作流程如下：

1)2mL规模的先导佐剂制剂筛选(药学上可接受的共溶剂、赋形剂、脂质体)，目标浓度是1nmol 1V270和200nmol的2B182C，包含在50uL中，用于肌肉注射(IM)。

2)对先导制剂进行基本的分析方法开发和分析，以确保制剂符合质量标准。

3)通过实时和加速方法评估优选制剂的稳定性，必要时添加适当的赋形剂作为稳定剂。

4)开展rFC测试，以确保成品制剂没有内毒素污染。

对于化合物2B182C和1V270，所有脂质体制剂均以2mL规模制备。

简而言之，使用以下程序制备脂质体，并评估以下组合物：2B182，组合使用和不使用1V270(使用DOPC/含和不含胆固醇，分别为2:1)。测试的DOPC浓度保持恒定在40mg/mL，这导致胆固醇浓度是10mg/mL。脂质体是按照脂质膜重新水化方法生产的，采用9:1的氯仿:甲醇作为溶剂。最初使用的重新水化缓冲液是50mM NaBP、100mM NaCl，pH＝6.1。测试的激动剂浓度是目标浓度。在较高温度下超声处理减小脂质体粒度。分析结果的总结如表4所示。

表5。对2B182C和1V270的初步脂质体制剂的分析证明了先导制剂的全面分析表征。

对于纳米颗粒形成的其它TLR激动剂比例、其他脂质成分和胆固醇的不同用量进行了评估。至少配制了10种不同的制剂，并筛选了在任务2A过程中的适用性，并与我们使用上述简单的DMSO–水制剂获得的结果进行了比较。

纳米颗粒：TLR7和TLR4激动剂制备为纳米颗粒制剂(脂质体、SLN、PLGA、乳液等)。根据免疫学、稳定性和生产数据选择最终的先导制剂的。根据初步免疫学和稳定性数据，DOPC/胆固醇脂质体制剂似乎非常有前景。TLR4和TLR7激动剂的预期挑战之一是两种激动剂以受控且始终如一的方式共掺入到同一纳米颗粒中。一旦共包封，激动剂彼此的比例就固定了，因此此时的任何剂量调整都会同时改变两种激动剂。

分析方法：任务1C中描述的所有分析方法都已用于我们的脂化TLR-7/8激动剂和TLR4激动剂，我们希望通过进一步优化进一步提高它们的特异性、线性和范围。用于定量TLR4和TLR7激动剂制剂中佐剂的RP-HPLC方法将针对峰形、LOD和LOQ进行优化。这些相同的方法将进行梯度-和色谱柱-优化，以实现稳定性研究中检测到的任何降解物的基线分离和最佳LOD/LOQ，从而实现对产品稳定性的准确监测。准确定量TLR4和TLR7激动剂组合中每种激动剂的纳米颗粒掺入百分数可能具有挑战性，因为SEC-HPLC仅根据流体动力学体积进行分离。脂质体和未掺入的激动剂可能具有相似的粒径，这将限制SEC-HPLC用于掺入测定的实用性。这将在下面的替代方法中讨论。

替代方法：如果由于纳米颗粒中激动剂水平不一致而导致共包封的TLR4和TLR7激动剂的开发被证明太难，我们的免疫学数据表明，通过简单地将脂质体中的TLR4激动剂与脂质体中的TLR7激动剂混合，仍然可以实现佐剂协同作用。这种方法有可能产生一种更简单、可靠的产品，通过减少激动剂信号相互干扰的可能性，可以更容易地进行分析表征。

另一种选择是探索其他共包封制剂，例如纳米乳液，其中因为水相和油相混合形成纳米液滴，默认激动剂100％掺入。乳液还具有在给药部位形成贮库的优点，可以进一步增强免疫反应。正如研究领域2中所讨论的，在体外和体内对共包封的TLR4和TLR7激动剂与混合的TLR4和TLR7激动剂进行比较，以权衡这些方法的利弊。使用SEC-HPLC确定掺入到纳米颗粒中的激动剂的另一种方法是采用高速密度梯度离心法沉淀纳米颗粒，并采用已建立的RP-HPLC方法分析上清液中未掺入的激动剂。

对目标比例范围内具有可接受的改进特性的制剂进行体内研究，包括免疫和病毒攻击研究。

研究领域2：确定通过先导佐剂制剂防止致命流感病毒攻击

的免疫学生物标志物

成功开发安全有效的疫苗需要定义可靠的生物标志物。对于疫苗开发计划来说，选择有效预防感染且没有任何安全问题的候选疫苗至关重要。在疫苗临床试验中，需要鉴定以最小反应原性预测抗原特异性适应性免疫反应的生物标志物。在该项目中，生物标志物的鉴定分两步进行：1)鉴定含和不含抗原的配制先导佐剂诱导的先天免疫生物标志物，以及2)与适应性免疫反应相关的生物标志物。因此，进行体外和体内研究，以鉴定与TLR4和TLR7/8配体的生物活性相关并且也与反应原性相关的生物标志物候选物。

任务2A：基于体内抗体产生的的组合制剂免疫活性和反应原性研究

通过疫苗接种预防传染病的标志是诱导有效的抗体产生。TLR4与TLR7激动剂的组合导致抗原特异性抗体滴度显著增加。观察到免疫反应的Th1偏向趋势。将配制佐剂及其组合的有效性与简单的DMSO-水制剂进行比较。

任务2A.1：先导组合制剂的小鼠免疫研究

采用先前针对DMSO-水制剂完成的类似方式，在单独的及不同比例的TLR激动剂组合的免疫研究中对先导佐剂的制剂进行评估。评估了对HA和NA具有特异性的IgM、总IgG和IgG1和IgG2a的水平。鉴定了提供最大滴度抗原特异性抗体的一种或多种比例的TLR激动剂组合。该制剂将进一步用于研究领域3中的攻击研究。

任务2A.2：先导组合制剂在小鼠体内的反应原性和毒性评估

由于传染病疫苗旨在为健康个体提供保护，因此疫苗安全性必须是开发目标中最优先考虑的事项。因此，进行适当的实验来评估候选制剂的毒性和反应原性。在这些实验中，一般来说，明显毒性作为初始毒性评估被密切评估。将记录小鼠任何痛苦的迹象(即不理毛、行动不便、结膜、异常行为、反应能力等)。除了总体观察外，毒性测定还包括全血细胞计数、血清化学评估(AST、ALT、ALP、淀粉酶、血尿素氮、肌酐、总蛋白、葡萄糖、钾、钙、钠、总胆红素)和尸检评估(采用苏木精和伊红染色的脾、肝和肾切片)。此外，评估注射部位的可见炎症迹象和任何其他异常发现。注射部位的组织也作为尸检评估的一部分进行组织学评估。结果研究总结在下面的表6中。

任务2B：鉴定可预测保护性适应性免疫反应的免疫标志物

如上所述，鉴定以最小反应原性预测抗原特异性适应性免疫反应的生物标志物有助于临床试验设计和方法。

任务2B.1：先天免疫反应特征(细胞因子、趋化因子)

趋化因子将免疫细胞募集到局部疫苗给药部位对于募集抗原呈递细胞(APC)和影响后续适应性免疫反应的诱导至关重要。然而，注射部位，即肌肉组织，含有相对较少的免疫细胞，因此有效的佐剂必须诱导免疫细胞募集到局部部位。与TLR7/8不同，TLR4在非免疫细胞上大量表达，能够表达足够的趋化因子来募集炎症细胞。在TLR刺激后，很难将炎症反应与佐剂作用区分开来，因为APC的募集通常伴随着炎症细胞。这些复杂的免疫激活级联无法单独在体外试验中进行研究。因此，从小鼠体内研究所获样品的上述体外实验中选择标志物组。

将先导佐剂制剂肌肉注射(IM)到小鼠体内，并在注射后第1、3和7天采集血清用于考察全身细胞因子/趋化因子的水平。正如上面针对局部肌肉组织的任务2A.2所述，细胞因子/趋化因子和共刺激分子基因的表达将通过qPCR或NanoString分析进行考察。采用苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色对所选样品进行组织学检查，评估免疫细胞浸润性。通过流式细胞术，采用脾细胞或PBMC评估共刺激分子的表达。在指定的时间点采集引流淋巴结并汇集到每个实验组中，并分析免疫细胞数量和趋化因子受体和共刺激分子的表达。研究设计的总结如表6所示。请注意“第5组：组合佐剂与抗原组”，可根据需要包括不同比例的TLR4和TLR7激动剂的组合，以提供所需的细胞因子/趋化因子诱导特性。选择显示TLR4和TLR7配体生物活性并且还与反应原性相关的先天免疫特征。

表6

任务2B.2：适应性免疫反应特征。

评估适应性免疫反应的实验结合上述任务2A.1进行。确定满足以下标准的候选生物标志物：1)在外周血中检出，2)由每个TLR配体的作用机制驱动并关联其生物学效应，3)预测长期抗原特异性抗体诱导和广泛保护，4)预测反应原性。

结果和替代方法

一种或多种比例的TLR激动剂组合提供最大滴度的抗原特异性抗体。此外，与单独使用TLR4激动剂相比，使用两类TLR配体的组合导致适应性免疫反应向Th1偏向反应转变。因此，Th1/Th2反应比例可能会增加。这种Th1偏向可能有利于扩展反应从而包括异源病毒保护。至于毒性，咪唑喹啉类TLR7/8配体的全身和口服给药已显示出严重的副作用，包括流感样症状、恶心和淋巴细胞减少以及高水平的血清TNFα和IL-1β。这对于1V270是其中成员的氧代腺嘌呤类的情况也是如此。然而，疫苗接种采用通常的局部注射给药途径，即肌肉注射可以避免大多数这些不希望出现的副作用。此外，TLR7/8配体是通过与脂质部分结合以及定制制剂制备的，成功地减少了全身细胞因子的释放，同时保持了佐剂活性。因此，由于对炎性细胞因子的全身暴露较低，与先导配制组合相关的反应原性可能很少或没有。

研究领域3：制剂的选择和免疫-小鼠病毒攻击研究(免疫)

根据包括稳定性(任务1B)、免疫活性(任务2A.1)和反应原性特征(任务2A.2)在内的制剂研究结果，选择先导配制组合以及备用组合用于小鼠临床前免疫/病毒攻击研究。用于研究的病毒抗原可以选自重组疫苗抗原或已用于许可商业疫苗的灭活完整病毒，例如A/Victoria/3/75(H3N2)、A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09-likevirus和A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)-like病毒。

任务3A：先导组合制剂的选择

先导选择标准依据：1)配制组合的稳定性，2)提供所需抗原特异性抗体水平的TLR激动剂的比例，以及3)局部和全身的低反应原性特征。与这些标准相关的具体研究总结在表7中。

在选择先导配制组合和备用先导组合后，将对小鼠免疫/病毒攻击模型中的选择进行评估(任务3B)。

表7.测定结果总结

任务3B：使用先导制剂进行免疫/病毒攻击研究

任务3B.1：确定病毒攻击研究的最低保护剂量

由于灭活的流感病毒包含先天免疫受体配体(PAMPS)，因此在仅用足够抗原对小鼠进行免疫后，预期可能会产生一定程度的低水平保护。因此，进行了一项研究，以确定灭活病毒的最低保护剂量(如果有的话)。抗原的最低保护剂量是在随后用匹配的活性病毒株攻击时仅提供部分保护(低于30％存活率)的剂量。该策略允许使用选择的先导配制佐剂组合观察一系列活性。此外，还可以确认导致未免疫小鼠全部死亡的攻击病毒量，通常剂量约为5LD50。

任务3B.2：同源病毒保护研究

在抗原剂量范围发现研究之后，使用小鼠模型来评估先导佐剂组合以及同源流感疫苗抗原的免疫原性。成功的主要决定因素是：1)血清中持久的流感特异性IgG2a和IgG1，2)对致命流感病毒攻击的保护，3)低反应原性，以及4)通过细胞内IFNγ/TNFα染色评估的多功能CD4+与CD8+T细胞的诱导。次要终点包括体重增加/减少和通过监测疫苗接种或流感病毒攻击后可观察到的临床症状(竖起皮毛、弓背和呼吸困难)对疾病严重程度给出的评分。

一般体内方法

免疫学评估：(雄性和雌性)小鼠通过肌肉注射接种(佐剂+流感抗原，例如A/Victoria/3/75(H3N2))1到2次，初次接种和二次接种之间间隔21天(图12)。通过测量脾细胞培养物中的Th1/Th2细胞因子诱导(通过ELISA测定)和多功能CD4+和CD8+T细胞反应(通过FACS测定，10-色细胞内细胞因子染色)，在每组4只小鼠的子集中评估细胞介导的免疫(CMI)。此外，还进行了四聚体染色和细胞表面表型分析，以确定流感特异性记忆CD4+和CD8+T细胞的频率。流感特异性体液反应在血清中测定(IgG1和IgG2a)，HI滴度用于衡量功能性抗体滴度。接种疫苗小鼠和对照小鼠采用5LD50的A/HK/68(H3N2)进行攻击，并在21天内评估存活率、体重增加/减轻和疾病严重程度评分。这些小鼠研究中的反应原性通过体重减轻和症状评分以及注射部位浸润评估来衡量。p值差异<0.05被认为是显著的。对所有数据进行方差分析(ANOVA)和Tukey ANOVA分析，以证明稳健的统计显著性。

任务3B.3：异源病毒保护研究

在同源保护研究之后，使用相同的研究设计在异源或异亚型保护小鼠模型中对先导佐剂组合进行评估。小鼠按上述方式(任务3B.2)进行免疫，但其接受不同HA/NA类型(例如，A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))的流感病毒株的攻击。在这种攻击模型中观察到的保护表明抗原特异性反应扩展，从而包括两种菌株共有的抗原，例如HA蛋白的茎区。为了证实这种扩展，进行了B细胞受体(BCR)和T细胞受体(TCR)序列的研究。

结果和替代方法

如前所述，越来越多的文献报道列举了各种TLR激动剂的组合，这些激动剂组合能够协同增加疫苗介导的免疫强度，改变产生的下游适应性免疫反应的类型，从而提高这些疫苗的功效。本文描述了用于流感病毒攻击保护的佐剂组合。

实例3

流感血凝素(HA)作为疫苗抗原提高广泛中和茎抗体的策略包括：1)专注于无头HA，去除整个头部结构域，使茎部结构域更“可用”，从而诱导针对茎部结构域的抗体反应，或2)使用由H1、H3或B型流感病毒组合的茎部结构域组成的嵌合HA。

众所周知，用一种抗原进行免疫会阻断对第二种类似抗原的强烈免疫反应(“原始抗原痕迹”)。这对于反复感染(流感)或抗原进化(HIV、疟疾)的传染病很重要。对于流感，主要针对病毒血凝素(HA)头部结构域产生中和抗体。不同病毒株具有不同的HA头部区域，它们与抗体的交叉反应较弱，但会抑制对新表位的反应。对于HIV，由于表位抑制，病毒上的突变表位不会刺激抗体或T细胞。

疫苗中原始抗原痕迹的机制可能是由于表位排斥(预先存在的抗体，尤其是粘膜IgA，使疫苗免受所有抗原呈递细胞(APC)的影响；树突状细胞通路(记忆B细胞内化新疫苗，减少DC激活和T细胞免疫)；和/或T细胞竞争(记忆B细胞被激活，消耗细胞因子、辅助因子，并捕获可与抗原负载DC反应的T细胞)。

为克服疫苗中的原始抗原痕迹，可以增加剂量(例如，大剂量疫苗(60岁以上的患者接种3倍剂量的流感疫苗))；封装(将疫苗放入乳液或脂质体中，优先将疫苗递送至树突状细胞(Shingrix，带状疱疹水痘疫苗))；和/或树突状细胞激活剂(TLR激动剂可能会增加针对疫苗抗原的激活T细胞的数量多样性)。

为了在小鼠模型中研究原始抗原痕迹，可以使用以下方法：半抗原-蛋白质偶联物(半抗原是一种小分子，如荧光素或DNP，可以与蛋白质抗原如卵清蛋白和KLS偶联)；或采用未偶联的蛋白质抗原进行预免疫，抑制抗体对半抗原-蛋白质偶联物的免疫反应。对于这些模型中的流感，使用一种蛋白质(例如流感HA)对一种病毒株进行超免疫，采用另一种病毒株的部分交叉反应性HA加强免疫，然后分析对第二种HA的B和T细胞免疫反应，包括识别的表位、通过nexgen RNA测序的克隆多样性，及中和能力，然后与体内保护相关联。

Shingrix是重组VSV糖蛋白E、来自沙门氏菌的非磷酰脂质A和脂质体制剂中的QS-21皂苷分子，脂质体制剂由二油酰磷脂酰胆碱和胆固醇在缓冲盐水中制成，在使用时重构。为了制造类似于Shingrix的流感疫苗，疫苗具有蛋白质抗原、脂质体制剂中的两种佐剂。

实例4

由于流感病毒的抗原漂移，每年流感疫苗的有效性仍为10-60％。合成的TLR4和TLR7激动剂(1Z105和1V270)分别增强了Th2和Th1介导的抗血凝素抗体的产生。1Z105和1V270的组合促进平衡的Th1/Th2免疫，防止流感病毒感染。为增强佐剂功效，对1Z105进行构效关系研究，鉴定出一种体外效力更高的衍生物2B182C。在使用模型抗原卵清蛋白的体内疫苗接种研究中，2B182C诱导了更高的血清IgG1水平，并额外增强了1V270诱导的抗原特异性IgG2a的释放。此外，2B182C和1V270的脂质体制剂降低了细胞毒性和反应原性，并保持增强Th1和Th2介导的抗体产生的活性。在使用灭活的A/California/04/2009(H1N1)(pdm09)作为抗原的体内疫苗接种研究中，这种脂质体组合佐剂增加了T滤泡辅助细胞、生发中心B细胞和抗体分泌浆细胞的数量。引流腹股沟淋巴结中B和T淋巴细胞的下一代序列分析表明，这种组合佐剂增加了免疫球蛋白重链(IGH)基因的B细胞克隆型、共享B细胞克隆和TCR克隆性。这些发现表明该组合有助于增强抗原特异性Th1免疫反应。最后，具有组合佐剂的疫苗可以保护免受致命同源病毒攻击，同时肺损伤更小。

方法

小鼠

雌性6-8周龄BALB/c小鼠购自Jackson实验室(马萨诸塞州巴尔港)。开展动物实验，使用卵清蛋白或灭活流感病毒作为不需要活病毒攻击的抗原，该动物实验在加利福尼亚大学圣地亚哥动物设施进行。流感攻击研究由犹他州立大学动物研究中心(马萨诸塞州威尔明顿市查尔斯河实验室)使用6周龄雌性BALB/c小鼠进行。所有动物实验均获得加州大学圣地亚哥分校或犹他州立大学动物护理和使用机构委员会(IACUC)的事先批准。

细胞和试剂

TLR4/NF-kB报告细胞系HEK-Blue^TM humanTLR4和HEK-Blue^TMmurineTLR4细胞购自InvivoGen(目录号，加利福尼亚州圣地亚哥)。小鼠原代BMDC采用从C57BL/6小鼠股骨收获的骨髓细胞制备。BMDC采用RPMI中的指定化合物处理，RPMI中添加10％FBS(加利福尼亚州塔扎纳市Omega)和青霉素/链霉素(100单位/mL/100μg/mL，马萨诸塞州沃尔瑟姆市ThermoFisher Scientific)。单磷脂A(MPLA)，AddaVax购自InvivoGen(目录号，加利福尼亚州圣地亚哥)。灭活甲型流感病毒[A/California/04/2009(H1N1)pdm09](IIAV)从BEI资源公司(#NR-49450，弗吉尼亚州马纳萨斯市)获得。合成了TLR7激动剂1V270、TLR4激动剂1Z105及其衍生物，包括2B182C。1V270(20μM)、2B182C(4mM)和1V270+2B182C(20μM+4mM)的脂质体制剂在Innimune公司(蒙大拿州米苏拉市)制备。

TLR4/NF-κB报告细胞检测

TLR4/NF-κB激活使用HEK-Blue^TM hTLR4和HEK-Blue^TM mTLR4(InvivoGen)进行评估。将细胞用1Z105和2B182C(从10μM开始2倍连续稀释)处理20小时。根据制造商的方案，测定培养物上清液中的NF-κB诱导型分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)蛋白。

体内抗体产生的评价

BALB/c小鼠在第0天和第21天采用IAV((10μg/针)加上指定佐剂在后腿腓肠肌内进行肌内(i.m.)免疫。每个图例中描述了每种处理中详细的佐剂浓度和动物数量。在第28天采集血清并评估抗原特异性抗体(抗-HA IgG1、抗-NA IgG1、抗-HA IgG2a、抗-NA IgG2a、抗-HA IgM和抗-NA IgM)。如前所述(参考)对这些抗体进行ELISA分析。对于使用DMSO制剂的研究，使用10％DMSO作为溶媒。在使用脂质体配制佐剂的实验中，采用1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇(DOPC/Chol，对照脂质体)作为溶媒。

BCR和TCR库的NGS检测

免疫方案如图28A所示。简单地说，在第28天处死小鼠并收获腹股沟淋巴结。使用RNeasy Mini Kit(德国希尔登Qiagen)从淋巴细胞(散装)中提取总RNA，并通过安捷伦4200TapeStation(加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦公司)确认RNA质量。使用无偏TCR库分析技术(日本大阪市Repertoire Genesis Inc.)进行新一代测序。

评估对致死性流感病毒攻击的保护

BALB/c小鼠在第0天肌肉注射接种配制的1V270和2B182C和IIAV(3ug/针)，并在第21天分别鼻内感染同源或异源甲型流感病毒A/California/04/2009(pdmH1N1)和A/Victoria/3/75(H3N2)。IIAV的免疫剂量；在初步实验中确定了3μg/针，可保护30-50％的动物免受同源病毒的攻击。对于流感病毒攻击，通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪(50mg/kg//5mg/kg)麻醉组中小鼠，然后每只小鼠采用1×10⁵(3×LD₅₀)细胞培养感染剂量(CCID₅₀)的流感A/California/04/2009(H1N1pdm)病毒，每只小鼠注射90-μL悬浮液中的5×10²(3×LD₅₀)CCID₅₀流感A/Victoria/3/75(H3N2)病毒进行鼻内攻击。在研究的第21天对所有小鼠进行病毒攻击。流感病毒(H1N1pdm)，毒株编号175190，来自Elena Govorkova博士(田纳西州孟菲斯圣犹达儿童研究医院传染病科)。通过在小鼠中连续9次传代，该病毒适应了在BALB/c小鼠肺中复制。在马丁达比狗肾(Madin-Darby Canine Kidney)(MDCK)细胞中对病毒进行空斑纯化，并通过在鸡胚中生长，然后在MDCK细胞中生长来制备病毒原液。甲型流感/Victoria/3/75(H3N2)病毒从美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯市)获取。该病毒最初对小鼠不致命，但在受感染动物的肺部连续传代7次后变得致命。在小鼠中适应之后，通过在MDCK细胞中生长来制备病毒原液。

测定肺病毒滴度和肺部炎症

病毒攻击后6天，在采血后立即进行支气管肺泡灌洗(BAL)程序，并在每只动物死亡后5至10分钟内完成。将0.75mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过气管导管缓慢输送到肺部。递送后，立即通过温和抽吸缓慢抽出液体，并将样品储存在-80℃。该程序总共重复3次，并且将来自每只小鼠的灌洗液进行汇集。为了测定肺病毒滴度，将BAL样品以2000g离心5分钟。对BAL上清液的不同10倍稀释液进行三次测定，测定MDCK细胞中的感染性病毒，并计算病毒滴度。为了测定肺细胞因子水平，根据制造商(犹他州洛根市Quansys Biosciences Q-PlexTM Array)的说明，使用基于化学发光多重ELISA分析的方法，测试了来自每个肺灌洗液的样品(200μL)中的MCP-1和IL-6。

血凝抑制滴度

对于血凝抑制(HI)滴度，采用受体破坏酶II(RDE；霍乱弧菌神经氨酸酶；YCC-340；纽约韦斯特伯里Accurate Chemical and Scientific)，三份酶稀释一份血清，在37℃培养18小时，对血清进行预处理，去除非特异性抑制剂。随后通过在56℃下加热45分钟来灭活RDE。在96孔圆底微量滴定板(宾夕法尼亚州匹兹堡市Fisher Scientific公司)中用PBS稀释血清样品。稀释血清后，加入8HA单位/孔的甲型流感A/CA/04/2009(H1N1pdm)或甲型流感A/Victoria/3/75(H3N2)病毒+火鸡红细胞(宾夕法尼亚州派普斯维尔市Lampire生物实验室)(每孔50μL)，简单混合，并在室温下培养60分钟。血清样品的HI滴度以完全抑制血凝的最高血清稀释度的倒数表示。

病毒中和滴度

为了开展抗流感病毒中和抗体测定，在使用前24小时，将MDCK细胞以每孔1×10⁴个细胞接种在96孔板内含5％FBS(犹他州洛根市Hyclone公司)的MEM培养基(最低必需培养基)中。在含有10单位/mL胰蛋白酶和1μg/mL EDTA的无血清培养基中制备血清样品的连续2倍稀释液，从1:32稀释开始，到1:4096稀释结束。将每个血清稀释液以1:1(0.1mL)与含有大约100CCID50/孔H1N1pdm或甲型流感A/Victoria/3/75(H3N2)病毒的无血清培养基(含有胰蛋白酶和EDTA)混合。在室温下培养1小时后，将血清-流感病毒混合物(0.2mL)转移到含有MDCK细胞的孔中并培养3天。抗流感病毒中和抗体以细胞病变效应(CPE)抑制来衡量。通过在感染后第3天在光学显微镜下检查MDCK细胞单层，根据重复样品对CPE进行评分。

统计分析

体内研究中获得的数据以平均值和平均值标准误差(SEM)表示，体外数据以平均值和平均值标准偏差(SD)表示。对于体外数据，使用双尾Welch t检验来比较两组。对于抗原特异性抗体，采用测定免疫细胞数量的流式细胞术分析、BCR-seq、TCR-seq、肺病毒滴度、HI终点滴度和VN终点滴度，Kruskal-Wallis检验，配合Dunn事后检验。使用斯皮尔曼等级相关检验分析肺病毒滴度和细胞因子/趋化因子水平之间的相关性。对于体重，计算每只小鼠的曲线下面积，并使用单因素方差分析进行统计分析。对数秩(Mantel-Cox)检验用于检验Kaplan-Meier存活率曲线之间的显著差异。使用Prism 5软件(加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad软件公司)。P值小于0.05被认为具有统计学意义上的显著。

表8.ELISA测定hIL-8、mIL-12和mIL-6采用的试剂

表9.ELISA测定hIL-8、mIL-12和mIL-6采用的试剂

表10.ELISA测定IgG采用的试剂

结果

1Z105的构效关系研究得到2B182C

为了提高小分子嘧啶并吲哚TLR4配体1Z105的效力，进行了构效关系分析(化学家将填写)。总共合成了56种化合物，并通过人和鼠HEK TLR4报告细胞(分别是HEK-BluemTLR4和hTLR4)进行筛选。在这些SAR化合物中，发现2B182C作为一种衍生物，在鼠和人类报告细胞中都具有更高的TLR4刺激效力。使用HEK TLR4报告细胞考察2B182C的EC₅₀并与1Z105的EC₅₀进行比较(图21B)。与1Z105的EC₅₀相比，2B182C在鼠和人TLR4报告细胞中的EC₅₀分别增加了5.8倍和870倍。这些数据表明SAR研究成功地得到一种衍生物，其表现出更高的TLR4刺激效力，尤其是人类TLR4效力。

TLR4激动剂2B182c增强抗原特异性IgG1的产生

TLR4激动剂1Z105诱导Th2-介导的IgG1产生，TLR7激动剂1V270增强Th1细胞对流感病毒的免疫(Goff et al.，J.Virol.，89:3221(2015)；Goff et al.，J.Virol.，91:e01050(2017))。假设通过与1V270组合，可以提高TLR4激动剂2B182C作为流感疫苗佐剂的功效。因此，考察了与1Z105+1V270的组合佐剂相比，2B182C和1V270组合是否提高了体内佐剂的功效。

为了开发有效的组合疫苗佐剂，使用灭活的甲型流感病毒[A/California/04/2009(H1N1)pdm09](IIAV)作为抗原，比较了1Z105和2B182C的效力以及作为单一药剂的最佳剂量。BALB/c小鼠在第0天和第21天采用与TLR4激动剂1Z105或2B182C混合的IIAV进行免疫，在第28天取血(图22A)。通过ELISA评估血清中针对病毒表面两种糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗体(IgM、IgG1和IgG2a)。将1Z105和2B182C在DMSO中溶解，DMSO中终浓度为10％。结果表明，200nmol/针较高剂量的2B182C显著增加了抗HA和抗NA的IgG1抗体(图22B)。有趣的是，2B182C而非1Z105增强了抗NA特异性IgG2a(图12C)。2B182C仅略微增加了抗HA IgM水平(图24A)。

2B182C和TLR7激动剂1V270的组合增加了抗原特异性IgG1和IgG2a

接下来分析了这些TLR4激动剂与1nmol/针剂量TLR7激动剂1V270组合时对抗体产生的共佐剂作用，据报道，TLR7激动剂1V270会诱导IgG2a产生，增强Th1免疫反应(Goff等人，2017)。结果表明，虽然单独的1V270仅诱导抗HA IgG2a产生，但当其与2B182C组合时，抗HA和抗NA的IgG1和IgG2a抗体均被显著诱导。这表明这些化合物可能以加和的方式起作用(图23A和23B)。另一方面，1Z105未能增强1V270诱导的IgG2a产生。1V270+2B182C-组中的动物产生更高数量的IgG1和IgG2a，并且免疫平衡偏向Th1-介导的IgG2a产生，表明这种处理有助于增强Th1免疫反应(图23C)。1V270和2B182C的组合显示出对抗-HA IgM产生的中等影响(图24B)。

总之，200nmol/针2B182C+1nmol/针1V270的组合诱导了最高数量的抗原特异性IgG1和IgG2a，以及Th1-偏向性免疫反应，这些对于流感病毒感染中的保护来说是可取的。因此，选择此组合用于下一个制剂。

脂质体制剂升级的2B182C降低了细胞毒性

鉴于上述结果，采用1/200(TLR4/TLR7)的1V270/2B182C比例([1nmol/针(20μM)1V270和200nmol/针(4mM)2B182C]。在疫苗佐剂的开发中，为了在保持对疫苗反应的同时避免不需要的细胞毒性和反应原性，调整化合物的配制可能很重要。因此，1V270和2B182c由Inimmune公司(蒙大拿州米苏拉市)在脂质体中配制。在小鼠原代BMDC中测试配制化合物的活性。这些配制化合物保持了与DMSO配制化合物相似的IL-12分泌水平(图25A)。脂质体制剂显著改善了DMSO-2B182C或DMSO-1V270+2B182C诱导的细胞毒性。(图25B)。通过注射部位肌肉的H&E染色开展的组织学分析如图25C所示。施用化合物后血清的多重细胞因子/趋化因子分析如图25D所示。

脂质体1V270和2B182C协同增强抗-HA和抗-NA IgG1和IgG2a的产生

采用图22A中描述的初免-加强方案评估化合物的体内佐剂性。通过ELISA评估第28天收获的血清的抗原特异性抗体。结果表明，lipo-2B182C诱导了更高水平的IgG1，这与DMSO-2B182C一致(图26A)。与DMSO-1V270不同，单独的lipo-1V270并未促进IgG2a的产生(图26B)。尽管每种激动剂对IgG2a的影响很小，但当两种佐剂组合时，抗原特异性抗体的产生得到协同增强(图26B)。另一方面，脂质体载体1V270、2B182C和1V270+2B182C诱导的总IgG水平相当(图26C)。抗原特异性IgM水平不受任何处理的影响(图27)。与采用DMSO制剂观察到的趋势一致，脂质体组合佐剂产生了偏向Th1的免疫平衡(图26D)。

配制的1V270+2B182C增强抗体分泌反应

为了研究配制的佐剂是否诱导促进抗原特异性抗体分泌的B细胞活化，使用流式细胞术考察腹股沟淋巴结中淋巴细胞的Tfh细胞、GC B细胞、浆母细胞和浆细胞情况。使用上述免疫方案，在第28天收获腹股沟淋巴结中的淋巴细胞，并通过流式细胞术进行分析(图28A和28B)。结果，采用lipo-1V270+2B182C，以CD3+CD4+PD-1+CXCR5+细胞鉴定的Tfh细胞的百分数大大增加(图28B和图29)。此外，组合佐剂增加了GC B细胞(CD3-CD19+CD95+GL7+)的百分数。在采用lipo-1V270+2B182C免疫的小鼠中观察到浆母细胞和浆细胞增加。结果表明，与单一药剂相比，组合佐剂增强了GC反应。

1V270和2B182C组合佐剂增加BCR多样性和TCR克隆性

为了考察组合佐剂是否影响BCR的多样性，对IGH基因开展了下一代测序分析(由日本大阪市Repertoire Genesis公司进行)。采用初免-加强IIAV模型，并在第28天采集腹股沟淋巴结中的淋巴细胞(图30A)。BCR序列分析表明，通过lipo-1V270+2B182C，归一化到Pielou指数指示总读长(Total reads)的BCR多样性显著增加(图30A)。IgG基因的克隆型通过相似性分析进行分析，该分析比较组内两只小鼠的IGH克隆，查看是否存在共享克隆，并计算雅卡尔指数；雅卡尔指数：J(A，B)＝(A∩B)/(A∪B)(图30B)。lipo-1V270+2B182C显著增加了IGH、IGHG1和IGHG2A的雅卡尔指数，表明该组内两只小鼠共享的克隆增加。此外，在lipo-1V270+2B182c组中，3只小鼠共有6个克隆(0.03％)。这些结果表明，脂质体组合佐剂增加了总IGH和IGHG2A的BCR多样性。这与组合佐剂免疫后较高的IgG2a水平一致。在组合佐剂免疫组中检测到的共用克隆可能识别抗原的显性表位。开展TCR测序以考察配制佐剂是否有助于增加针对抗原的f TCR克隆性。预期组合佐剂及lipo-2B182C增加了TCRα和TCRβ的克隆性(图30C)。总的来说，lipo-1V270+2B182C免疫的动物表现出更高的BCR多样性和TCR克隆性。这可能支持组合佐剂增强Th1反应的数据。

Lipo-2B182C和lipo-1V270+2B182C保护小鼠免受同源流感病毒的侵害。

组合佐剂诱导Th1偏向免疫反应，伴随多样的BCR和TCR的高克隆性。为了测试这种多样性是否可以表明针对流感病毒的免疫反应，在同源和异源流感病毒攻击模型中测试了配制的1V270和2B182c。接种IIAV加脂质体1V270、2B182C或1V270+2B182C的Balb/c小鼠在接种后的第21天采用(单剂量)同源(H1N1)流感病毒开展鼻内攻击。通过另外的21天监测小鼠的体重和存活率(图31A)。Lipo-2B182C和lipo-1V270+2B182C显著抑制病毒感染后的体重减轻(图31B)。此外，lipo-1V270显示出90％的保护，并且lipo-2B182C和lipo-1V270+2B182C完全保护小鼠免受同源流感病毒的侵害(图31C)。为了评估小鼠的存活是否与肺中的病毒滴度相关，开展支气管肺泡灌洗，以测定灌洗液中的病毒滴度。结果表明，lipo-1V270+2B182C在第6天有效地抑制了肺中的病毒滴度(图31D)。在人类中，在与致死性肺损伤和肺炎相关的气道上皮细胞(例如MCP-1、IL-6等)中存在细胞因子和趋化因子上调(Gurczynski et al.，Mucosal Immun.，12:518(2019)；Zhou et al.，Nature，499:500(2013))。因此，我们使用Quansys multiplex ELISA评估了肺液中的促炎细胞因子(IL-6)和趋化因子(MCP-1)的水平。结果表明，组合的脂质体佐剂显著抑制MCP-1和IL-6的产生(图31E)。促炎细胞因子的水平与肺病毒滴度相关[MCP-1(P<0.0001，斯皮尔曼相关系数r＝0.83)、IL-6(P<0.0001，斯皮尔曼相关系数r＝0.79)(图31F)。这种趋势在lipo-1V270+2B182C组中进一步增强。这些结果表明，组合佐剂通过感染后抑制病毒进入和增殖，减少了肺损伤。为了评估保护是否与血凝抑制滴度(HI)和病毒中和滴度(VN)有关，在免疫后第21天采集血清并检查HI和VN(图31A)。与未免疫组相比，在lip-1V270、lipo-2B182C和lipo-1V270+2B182C组20只小鼠中有19只观察到HI滴度增加(图31G)。此外，与脂质体对照相比，lipo-2B182c和lipo-1V270+2B182C诱导明显更高的VN(图31H)。VN滴度与肺病毒滴度呈负相关(P<0.01，斯皮尔曼相关系数r＝-0.59，图27I)。使用与同源攻击实验相同的方案评估对异源流感病毒A/Victoria3/75(H3N2)的保护(图31A)。与脂质体对照组相比，体重减轻、存活率和肺病毒滴度没有明显差异(图32A-C)。总的来说，配制的组合佐剂显示出对同源H1N1病毒的明显保护，而没有不利的炎症作用，尽管其并不足以提供异源保护。

表11.BCR-seq中总IgG基因的共享克隆数

实例5

1V270(TLR7配体)和2B182C(TLR4配体)的脂质体共包封拓宽了抗体表位

流感病毒感染的通用疫苗需要诱导识别主要抗原分子、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)广泛表位的抗体。因此，考察了组合佐剂(1V270和2B182C)诱导的抗体的表位扩展和交叉反应性。BALB/c小鼠(n＝5-10)采用灭活病毒与脂质体制剂1V270(Lipo-1V270)、2B182C(Lipo-2B182C)、共封装脂质体1V270+2B182C[Lipo-(1V270+2B182C)]，以及单独脂质体Lipo-1V270和单独脂质体Lipo-2B182C混合添加进行免疫。空白脂质体用作对照，在第0天(初次免疫)和第21天(加强免疫)进行免疫，并在第28天采集血清。

通过HA肽ELISA评估表位扩展。甲型流感(H1N1)pdm09病毒的首尾相搭HA肽矩阵(139个肽)从BEI Resources获得。将包含5个连续肽的汇集肽(总共28个肽库)接种到ELISA板上。通过OD405-570测试1:200稀释血清对每个肽库的反应性。将每种血清的OD绘制在热图上(图38A)，并比较个体动物的平均OD。与单一配体或混合的脂质体制剂相比，采用共包封脂质体1V270+2B182C[Lipo-(1V270+2B182C)]接种的小鼠的血清显示出明显更高的OD(图38B)。这些数据表明，Lipo-(1V270+2B182C)诱导了识别多种HA表位的抗体反应。

为了测试Lipo-(1V270+2B182C)诱导的广泛HA表位的识别是否与流感病毒感染不同亚型的交叉保护相关，我们通过ELISA测试了抗体对HA和NA的各种亚型的交叉反应性(图39和40)。属于不同系统发育距离的亚型HA和NA。与脂质体单一配体相比，或与两种单独脂质体混合加入相比，采用共包封Lipo-(1V270+2B182C)免疫的小鼠的IgG几何平均滴度(GMT)表明其不仅与第1组(H1、H11、H12)中的HA具有较高反应性，而且还显示与第2组(H3和H7)中的HA具有较高反应性。还观察到反应性拓宽到不同亚型NA。总之，接种IIAV+Lipo-(1V270+2B182C)的动物产生的抗体对不同亚型的HA和NA具有高度交叉反应性。

所有出版物、专利和专利申请均通过引用纳入本发明中。虽然在前面的说明书中已经相对本发明的某些优选实施例描述了本发明，并且为了说明的目的已经阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明易受另外的实施例的影响，并且这里描述的某些细节可以有很大的变化，但并不背离本发明的基本原理。

Claims

1.一种增强哺乳动物免疫反应的方法，包括向有需要的哺乳动物施用包含脂质体的组合物，所述脂质体包含有效剂量的TLR4激动剂和TLR7激动剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR4激动剂和TLR7激动剂同时施用。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述TLR4激动剂具有式(II)结构：

其中zl是0～4的整数，其中z2是0～5的整数，其中R⁵是取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基，其中R⁶是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基，其中R⁷是氢，或者取代或未取代的烷基，并且其中每个R⁸独立地是卤素、-CN、-SH、-OH、-COOH、-NH₂、-CONH₂、硝基、-CF₃、-CCl₃、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述TLR7激动剂具有式(I)结构：

其中X¹是-O-、-S-或-NR^c-；

n是0、1、2、3或4。

X²是键或连接基团；和

在一个实施例中，R^x是包含一个或两个羧酸酯的磷脂；

或它们的互变异构体；

或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述脂质体包括PC、DOPC或DSPC。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述脂质体包括胆固醇。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，进一步包括施用一种或多种免疫原。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述免疫原是微生物免疫原。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述微生物是病毒或细菌。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述脂质体包含一种或多种免疫原。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中TLR7激动剂的含量是大约0.01至100nmol、大约0.1至10nmol或大约100nmol至大约1000nmol。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中TLR4激动剂的含量是大约2至20umol、大约20nmol至2umol或大约2umol至大约100umol。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中TLR7和TLR4激动剂的比例是约1:10、1:100、1:200、5:20、5:100或5:200。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述组合物注射给药、肌内给药、鼻内给药或静脉内给药。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述脂质体包含DOPC和胆固醇。

17.一种药物制剂，包含脂质体、TLR4激动剂和TLR7激动剂。

18.根据权利要求17所述的制剂，其中所述脂质体包括1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷-L-丝氨酸](DOPS)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(18:1DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰-(1'-外消旋-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-PE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油酰基-2-[12-[(7-硝基-2-1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]月桂酰]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-12:0NBD PC)、1-棕榈酰基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]月桂酰}-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-12:0NBD PC)，及其混合物；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇，或其混合物。

19.根据权利要求17所述的制剂，其中所述脂质体包含DOPC、胆固醇或其组合。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的制剂，其中TLR7激动剂的含量是大约0.01至100nmol、大约0.1至10nmol或大约100nmol至大约1000nmol。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的制剂，其中TLR4激动剂的含量是大约2nmol至20umol、大约20nmol至2umol或大约2umol至大约100umol。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的制剂，其中TLR7和TLR4激动剂的比例是约1:10、1:100、1:200、5:20、5:100或5:200。

23.根据权利要求17至22中任一项所述的制剂，其中所述TLR7激动剂包括式(I)化合物：

其中X¹是-O-、-S-或-NR^c-；

n是0、1、2、3或4。

X²是键或连接基团；和

R³是包含一个或两个羧酸酯的磷脂；

或它们的互变异构体；

或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

24.根据权利要求23所述的制剂，其中式(I)中的R³包括：

其中R¹¹和R¹²各自独立地是氢或酰基，R¹³是负电荷或氢，且m是1至8，其中波浪线表示键合位置，其中在带有OR¹²的碳原子处的绝对构型是R、S或其任何混合物。

25.根据权利要求23或24所述的制剂，其中m是1或其中R¹¹和R¹²各自是油酰基。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的制剂，其中R³的磷脂包含两个羧酸酯，每个羧酸酯包括1个、2个、3个或4个不饱和、环氧化、羟基化或它们的组合的位点。

27.根据权利要求23至26中任一项所述的制剂，其中R³的磷脂包含两个羧酸酯，这两个羧酸酯相同或不同。

28.根据权利要求27所述的制剂，其中所述磷脂的每个羧酸酯是在C8-C9处具有不饱和位点的C17羧酸酯。

29.根据权利要求27所述的制剂，其中所述磷脂的每个羧酸酯是在C9-C10处具有不饱和位点的C18羧酸酯。

30.根据权利要求23至29中任一项所述的制剂，其中X²可以是键或链中具有1个至约10个原子的链，其中所述链的原子选自碳、氮、硫和氧，其中任何碳原子可以被氧取代，其中任何硫原子可以被一个或两个氧基取代。

31.根据权利要求23至30中任一项所述的制剂，其中R³包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

32.根据权利要求23至31中任一项所述的制剂，其中R³是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，X²是C(O)。

33.根据权利要求23至32中任一项所述的制剂，其中X¹是氧。

34.根据权利要求23至33中任一项所述的制剂，其中X¹是O，R¹是C_1-4烷氧基-乙基，n是0，X²是羰基，且R³是1,2-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

35.根据权利要求23至33中任一项所述的制剂，其中所述式(I)的化合物是：

36.根据权利要求23至33中任一项所述的制剂，其中所述式(I)的化合物是：

37.根据权利要求17至36中任一项所述的制剂，其中所述TLR4激动剂包括式(II)的化合物：

其中zl是0～4的整数，其中z2是0～5的整数，其中R⁵是取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基，其中R⁶是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基，其中R⁷是氢，或者取代或未取代的烷基，及其中每个R⁸独立地是卤素、-CN、-SH、-OH、-COOH、-NH₂、-CONH₂、硝基、-CF₃、-CCl₃、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基。

38.根据权利要求37所述的制剂，其中z2是1、2或3。

39.根据权利要求37或38所述的制剂，其中z1是1或2。

40.根据权利要求37或38所述的制剂，其中z1是0。

41.根据权利要求37至40中任一项所述的制剂，其中R⁵是取代或未取代芳基。

42.根据权利要求37至41中任一项所述的制剂，其中R⁶是取代或未取代环烷基。

43.根据权利要求37至42中任一项所述的制剂，其中R⁷是取代或未取代烷基。

44.根据权利要求37至39或40至43中任一项所述的制剂，其中z1＝1且R⁸是取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。