JP2022525608A - ワクチンアジュバントとしてのｔｌｒ４およびｔｌｒ７リガンド製剤 - Google Patents

ワクチンアジュバントとしてのｔｌｒ４およびｔｌｒ７リガンド製剤 Download PDF

Info

Publication number
JP2022525608A
JP2022525608A JP2021555397A JP2021555397A JP2022525608A JP 2022525608 A JP2022525608 A JP 2022525608A JP 2021555397 A JP2021555397 A JP 2021555397A JP 2021555397 A JP2021555397 A JP 2021555397A JP 2022525608 A JP2022525608 A JP 2022525608A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substituted
alkyl
unsubstituted
aryl
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021555397A
Other languages
English (en)
Inventor
エー． カーソン，デニス
ビー． コタム，ハワード
公子 林
パトリシア コアー，メアリー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of JP2022525608A publication Critical patent/JP2022525608A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

哺乳動物における免疫応答を増強するための方法、ならびにリポソーム、ＴＬＲ４アゴニスト、およびＴＬＲ７アゴニストを含む組成物を提供する。

Description

発明の詳細な説明
〔関連出願の相互参照〕
本出願は２０１９年３月１４日に出願された米国特許出願第６２／８１８，５１７号の出願日の利益を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
〔政府の権利に関する声明〕
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＨＨＳＮ２７２２００９０００３４Ｃの下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
〔背景〕
多くの感染症の潜行性の脅威から個体を守る最も効果的な方法は、ワクチン接種によるものである。ワクチンが特異的である特定の感染症病原体に対する後の防御を提供することができる宿主において、免疫応答を誘発する抗原を使用することが、効果的なワクチン接種には必要とされる。したがって、ワクチン抗原は、宿主において、防御的であるレベルの免疫応答－体液性および／または細胞媒介性－を誘発するのに十分な免疫原生でなければならない。世界的に懸念される感染性病原体は、インフルエンザウイルスである。季節性インフルエンザウイルスは毎年流行し、世界中で２５０－５００，０００人が死亡する（ＷＨＯ）。昨冬では、米国だけで８０，０００人以上が死亡した。加えて、新たなパンデミックが時々発生し、数百万人の死亡を引き起こし、深刻な世界的脅威となっている。これらの脅威に特に脆弱なのは、高齢者、新生児、および免疫力の低下した個体などの高リスク集団である。季節性インフルエンザに対するワクチン接種は、その季節の循環ウイルス株と適合させれば、中程度の効果があり得る。しかし、インフルエンザウイルスは常に変化（抗原連続変異）していることから、次のインフルエンザの季節や次のパンデミックにおいて、どのような亜型および株のウイルスが広まるのかを予測し、従来のワクチンの製造および流通に十分な時間（約６ヶ月）を確保することは困難である。
これらの従来のワクチンは、典型的にはインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、特にタンパク質の球状頭部ドメインに関連する抗原に基づいている。この免疫原性の高い頭部ドメインは、インフルエンザウイルスの株および亜型によって多様である。したがって、１つの球状頭部ドメイン亜型に対する免疫応答は、その特定の頭部ドメインに限定され、異なる頭部ドメインを有するウイルス株に対して適切な免疫応答を提供できない可能性がある。ウイルス株間でより高度に保存されているタンパク質の幹ドメインまたは茎ドメインに由来するインフルエンザＨＡ抗原は、一般に、従来のワクチンにおいて典型的に優勢である頭部ドメイン抗原よりも免疫原性がはるかに低い。したがって、宿主において十分な免疫応答を生じさせ、その結果、複数のインフルエンザ株に対する免疫応答を生じさせるレベルまで、これらのＨＡ茎抗原の免疫原性を改善する必要がある。
〔発明の概要〕
インフルエンザウイルスのような世界的に重要な感染性病原体に対するワクチンにおける、適切なアジュバント組み合わせ製剤の使用の成功は、医学において大きな進歩を潜在的に表し、これらのウイルス性病原体が常に変化する脅威からの個体の防御を広げ、かつ強化する。
本開示は、ＴＬＲ４アゴニストとＴＬＲ７アゴニストとの組み合わせを製剤化する工程を提供し、同じリポソームナノ粒子中のアジュバントは、別々の製剤化アゴニストと製剤化されていないアゴニストとの混合した組み合わせを超えるいくつかの利点を提供する。製剤化された組み合わせは、所望の免疫活性のためにナノ粒子中にＴＬＲ４対ＴＬＲ７の特定の比を有し得る。化合物の様々な組み合わせ比率によって生成されたデータに基づいて、各化合物を、単独で、および組み合わせて製剤化した。製剤化された組み合わせと製剤化されていない組み合わせとを、同じ粒子中で混合し、かつ組み合わせて、並べて比較した。免疫付与研究の結果は、リポソーム中の特定の比率で組み合わせられた化合物がいずれかの化合物単独よりも大きくかつ広範な免疫活性を提供し、そして製剤化された組み合わせが、製剤化されていない組み合わせよりも良好であることを示した。使用した抗原は、ＯＶＡおよび不活化インフルエンザウイルスであった。
本明細書中に開示されるように、２Ｂ１８２Ｃ（例示的なＴＬＲ４アゴニスト）および１Ｖ２７０（例示的なＴＬＲ７アゴニスト）は１つの製剤において一緒に製剤化され、免疫付与研究がマウスにおいて行われた。化合物の様々な組み合わせ比率によって生成されたデータに基づいて、各化合物を、単独で、および組み合わせて製剤化した。製剤化された組み合わせと製剤化されていない組み合わせ、ならびに同じ粒子中における混合および組み合わせを並べて比較した。免疫付与研究の結果は、リポソーム中の特定の比率で組み合わせられた化合物がいずれかの化合物単独よりも大きくかつ広範な免疫活性を提供し、そして製剤化された組み合わせが、製剤化されていない組み合わせよりも良好であることを示した。使用した抗原は、ＯＶＡおよび不活化インフルエンザウイルスであった。
一実施形態において、本開示は、有効な量のＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストを、それらを必要とする哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における免疫応答を増強する方法を提供する。一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストは、同時投与される。一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストは、リポソーム製剤中で投与される。一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストは、別々のリポソーム製剤中に存在する。一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）を有する。一実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストは、式（Ｉ）を有する。一実施形態において、１つまたは複数の免疫原（抗原）を、例えば、アジュバントと同時に、および任意にアジュバントと同じ製剤中で投与する。一実施形態において、免疫原は、微生物免疫原である。一実施形態において、微生物は、インフルエンザまたは水痘などのウイルス、または細菌である。一実施形態において、哺乳動物はヒトである。一実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストの量は、約０．０１～１００ｎｍｏｌ、約０．１～１０ｎｍｏｌ、または約１００ｎｍｏｌ～約１０００ｎｍｏｌである。一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストの量は、約２～２０ｕｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ～２ｕｍｏｌ、または約２ｕｍｏｌ～約１００ｕｍｏｌである。一実施形態において、ＴＬＲ７アゴニスト対ＴＬＲ４アゴニストの比率は、約１：１０、１：１００、１：２００、５：２０、５：１００、または５：２００である。一実施形態において、製剤を注射する。一実施形態において、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ、コレステロール、またはそれらの組み合わせを含む。
リポソーム、ＴＬＲ４アゴニスト、およびＴＬＲ７アゴニストを含む、医薬製剤も提供され、例えば、リポソームはＤＯＰＣ、コレステロール、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストの量は約０．０１～１００ｎｍｏｌ、約０．１～１０ｎｍｏｌ、もしくは約１００ｎｍｏｌ～約１０００ｎｍｏｌであり、ＴＬＲ４アゴニストの量は約２ｎｍｏｌ～２０ｕｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ～２ｕｍｏｌ、もしくは約２ｕｍｏｌ～約１００ｕｍｏｌであり、またはＴＬＲ７アゴニスト対ＴＬＲ４アゴニストの比率は、約１：１０、１：１００、１：２００、５：２０、５：１００、もしくは５：２００である。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕例示的なリポソーム製剤。
〔図２〕ＤＭＳＯまたはリポソーム製剤中の１Ｖ２７０（１μＭ）、２Ｂ１８２Ｃ（２００μＭ）、または１Ｖ２７０（１μＭ）と２Ｂ１８２Ｃ（２００ｍＭ）との組み合わせのインビトロ免疫刺激活性。ＤＭＳＯまたはリポソーム製剤において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のマウス骨髄由来樹状細胞を１Ｖ２７０（１μＭ）、２Ｂ１８２Ｃ（２００μＭ）、または１Ｖ２７０（１μＭ）と２Ｂ１８２Ｃ（２００ｍＭ）との組み合わせと共に１８時間インキュベートした。培養上清におけるＩＬ－６の放出をＥＬＩＳＡによって測定した。
〔図３〕リポソーム製剤は、ＴＬＲ４非依存性細胞毒性を軽減する。ＤＭＳＯまたはリポソーム製剤において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬＲ４欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）由来のマウス骨髄由来樹状細胞を、１Ｖ２７０（１μＭ）、２Ｂ１８２Ｃ（２００μＭ）、または１Ｖ２７０（１μＭ）と２Ｂ１８２Ｃ（２００ｍＭ）との組み合わせとともに１８時間インキュベートした。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって評価した。
〔図４〕例示的な実験プロトコル。
〔図５〕製剤に対する抗ＨＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベル。
〔図６〕製剤に対するＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率。
〔図７〕ＧＣ細胞および形質芽球のゲーティング戦略。
〔図８〕１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘの投与によって誘導される細胞型。製剤化１Ｖ２７０と２Ｂ１８２ｃとの組み合わせは、ＧＣ Ｂ細胞および形質芽球の数を有意に増加させた。
〔図９〕１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘの投与により誘導される、ＥＬＩＳＡによって測定された抗－ＨＡ ＩｇＧレベル、またはＢＣＲ－ｓｅｑとしての抗－ＨＡ ＩｇＧレベル。ＩｇＧ２ａ生産は組み合わせ処置により強く増加し、Ｔｈ１応答は製剤化２Ｂ１８２ｃにより誘導された。
〔図１０〕ＢＣＲ多様性は、組み合わせ処置により増加した。
〔図１１〕抗原と、１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘとの投与後のＴＣＲクローナリティ。ＴＣＲクローナリティは、２Ｂ１８２ｃ処置およびＡｄｄａｖａｘの後に増加した。
〔図１２〕１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘの投与後のＢＣＲ多様性およびＴＣＲクローナリティ。ＢＣＲ多様性は組み合わせ処置によって増加し、ＴＣＲクローナリティは２Ｂ１８２ｃ処置およびＡｄｄａｖａｘの後に増加した。
〔図１３〕クローン類似性。
〔図１４〕共有クローン。
〔図１５〕クラスター解析。
〔図１６〕インフルエンザに対する既知の抗体として、類似する配列を有するクラスターの数。
〔図１７〕細胞毒性およびＩＬ－１２分泌の分析。リポソームアジュバントは、ＢＭＤＣにおいて、より低い細胞毒性を伴うＩＬ－１２分泌を誘導した。
〔図１８〕１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃ（未製剤化および製剤化）あるいはＡｄｄａＶａｘ投与後の、抗－ＮＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ分析。
〔図１９Ａ－１９Ｂ〕２Ｂ１８２ｃおよび１Ｖ２７０のリポソーム製剤は、免疫応答をＴｈ１応答へと偏らせる。（Ａ）０日目および２８日目に、ＤＭＳＯ（Ｄ）またはリポソーム（Ｌ）製剤中でＴＬＲ４リガンドおよび／またはＴＬＲ７リガンドと混合した、不活化Ｃａｌ ２００９ Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（１０μｇ／注射）を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫付与した。２８日目に血清を採取した。ＨＡまたはＮＡに特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを、ＥＬＩＳＡによって判断した。（Ｂ）Ｔｈ１／ＴＨ２バランスを、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率によって評価した。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１である。
〔図２０Ａ－２０Ｃ〕リポソーム２Ｂ１８２ｃおよびリポソーム１Ｖ２７０との組み合わせアジュバント処置により、流入領域リンパ節における胚中心Ｂ細胞および形質芽球の数は増加した。（Ａ）実験プロトコル。（Ｂ）フローサイトメトリーデータについてのゲーティング戦略。（Ｃ）Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ９５＋ ＧＬ７＋）、および形質芽球（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ１３８＋）の総数を計算した。ＢＬ；ブランクリポソーム。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、抗原＋ＢＬと比較して、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、＊＊＊；ｐ＜０．００１である。
〔図２１Ａ－２１Ｂ〕２Ｂ１８２Ｃは、より低い濃度でヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）の両方のＴＬＲ４に対して有効である。ＨＥＫ ＴＬＲレポーター細胞（ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭｈＴＬＲ４およびＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭｍＴＬＲ４）を、化合物１Ｚ１０５および２Ｂ１８２Ｃ（１０μＭから２倍連続希釈）を用いて２０時間処理した。培養上清中のＮＦ－ｋＢ誘導性ＮＦ－ｋＢ ＳＥＡＰレベルを、製造業者のプロトコルに従って評価した。
〔図２２Ａ－２２Ｃ〕２００ｎｍｏｌ／注射の２Ｂ１８２ｃは、抗原特異的ＩｇＧ１および抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａのより高いレベルを誘導した。（Ａ）２つのＴＬＲアゴニスト１Ｚ１０５と２Ｂ１８２Ｃとを比較するための実験プロトコル。０日目および２１日目に、ＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）に加えてＴＬＲ４アゴニストの１Ｚ１０５または２Ｂ１８２Ｃ（４０および２００ｎｍｏｌ／注射）を両後脚に筋肉内注射し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を免疫付与した。２８日目に採血し、血清はＥＬＩＳＡにより、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対する抗体について評価した。１０％ＤＭＳＯをビヒクルとして使用した。（Ｂ）抗－ＨＡ ＩｇＧ１抗体および抗－ＮＡ ＩｇＧ１抗体。（Ｃ）抗－ＨＡ ＩｇＧ２ａ抗体および抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ抗体。各ボックスプロットにおいて、ボックス内の線は中央値を表し、境界は上下の四分位値であり、バーは最小値および最大値を示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、抗原＋ビヒクルと比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１である。
〔図２３Ａ－２３Ｃ〕２Ｂ１８２ＣとＴＬＲ７アゴニストの１Ｖ２７０との組み合わせは、抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方を増加させた。（Ａ－Ｃ）図２Ａに示すように、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝５～６）をＩＩＡＶおよびアジュバントを用いて免疫付与した。ＭＦ５９と類似の製剤であるＡｄｄａＶａｘＴＭを、ポジティブコントロールとして使用した。抗－ＨＡ ＩｇＧ１生産および抗－ＮＡ ＩｇＧ１生産（Ａ）、抗－ＨＡ ＩｇＧ２ａ生産および抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ生産（Ｂ）を、ＥＬＩＳＡによって判断した。各ボックスプロットにおいて、ボックス内の線は中央値を表し、境界は上下の四分位値であり、バーは最小値および最大値を示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。抗原なしとＡｄｄａＶａｘ以外の４群を比較した（全てのペア）。（Ｃ）全ての組み合わせ処置によって誘導された抗－ＨＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベル（ビヒクルに正規化）を、５～１１匹のマウス／群の平均によって示す。各ドットは個々の動物を示す。黒の実線は、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１＝１を示す。１Ｖ２７０と２Ｂ１８２Ｃとの組み合わせによって免疫付与された全ての動物は、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１＝１より上に分布した。これは、これらのマウスにおける免疫バランスが、Ｔｈ１免疫応答に偏向していたことを示唆している。
〔図２４Ａ－２４Ｂ〕２８日目の抗原特異的ＩｇＭ生産。（ＡおよびＢ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５～６）をＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）で免疫付与し、図２Ａに示すアジュバントを示した。抗原特異的ＩｇＭレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。（Ａ）ＴＬＲ４アゴニストの１Ｚ１０５または２Ｂ１８２Ｃ（４０および２００ｎｍｏｌ／注射）によって誘導される、抗－ＨＡ ＩｇＭ生産および抗－ＮＡ ＩｇＭ生産。（Ｂ）ＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）と、ＴＬＲ４アゴニストの１Ｚ１０５または２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）との組み合わせは、抗原特異的ＩｇＭ誘導に対してわずかな影響を与えた。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５である。
〔図２５Ａ－２５Ｂ〕リポソーム１Ｖ２７０およびリポソーム２Ｂ１８２Ｃは、より低い毒性を伴う同等のレベルのＩＬ－１２放出を誘導した。（Ａ）ＩＬ－１２分泌レベル。（Ｂ）％生存率。マウス初代ＢＭＤＣを１Ｖ２７０（０．０６２５ｕＭ）および２Ｂ１８２Ｃ（１２．５ｕＭ）を用いて処置した。１Ｖ２７０／２Ｂ１８２ｃ比率を１：２００に保ち、図３における最良の比率として判断した。一晩インキュベートした後、培養上清中のＩＬ－１２レベルをＥＬＩＳＡによって調べ、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって評価した。Ｗｅｌｃｈ補正を伴う片側不対ｔ検定により、それぞれの化合物におけるＤＭＳＯ製剤（Ｄ）対リポソーム製剤（Ｌ）で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
〔図２５Ｃ〕組み合わせアジュバントの注射後の局所免疫細胞浸潤の組織学的分析。１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）、２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）、または１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）と２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）との組み合わせのリポソーム製剤を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内注射した。組織を採取して固定し、パラフィンブロックに包埋した。１０μｍ切片をＨ＆Ｅで染色した。低倍率および高倍率は、それぞれ２０×および４０×の対物レンズを用いて得た。低倍率画像と高倍率画像におけるスケールバーは、それぞれ５０μｍと２０μｍを示す。
〔図２５Ｄ〕ビヒクル、１Ｖ２７０、２Ｂ１８２Ｃ、１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２ＣをＤＭＳＯ製剤またはリポソーム製剤と共に（５０μＬの容量中、１ｎｍｏｌ／注射の１Ｖ２７０および２００ｎｍｏｌ／注射の２Ｂ１８２Ｃ）、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）に筋肉内注射した。ＡｄｄａＶａｘＴＭ（２５μＬ／注射）をポジティブコントロールとして使用した。２時間後および２４時間後に血清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘサイトカインアッセイによりＩＬ－１２ｐ４０、ＴＮＦ、およびＫＣの分泌を調べた（Ａ）。データは、平均±ＳＥＭで示される。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの両側Ｕ検定により、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、４群（同じ製剤中のビヒクル、１Ｖ２７０、２Ｂ１８２Ｃ、１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）を比較し、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１である。
〔図２６Ａ－２６Ｄ〕リポソーム１Ｖ２７０およびリポソーム２Ｂ１８２Ｃは、抗－ＨＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ生産、ならびに抗－ＮＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ生産を相乗的に増強した。（Ａ－Ｃ）図２２Ａに示すように、０日目および２１日目に、ＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）および製剤化アジュバントを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、筋肉内注射することにより免疫付与した。リポソームＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０（リポ－１Ｖ２７０、１ｎｍｏｌ／注射）、リポソームＴＬＲ４アゴニスト２Ｂ１８２Ｃ（リポ－２Ｂ１８２Ｃ、２００ｎｍｏｌ／注射）、ならびに１Ｖ２７０および２Ｂ１８２Ｃのリポソーム複合アジュバント（リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ、１ｎｍｏ／注射＋２００ｎｍｏ／注射）を注射した。ビヒクルは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンおよびコレステロール（ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、対照リポソーム）である。ＡｄｄａＶａｘＴＭをポジティブコントロールとして使用した。２８日目に血清を採取し、ＨＡまたはＮＡに特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、および総ＩｇＧを、ＥＬＩＳＡによって判断した。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である。抗原なしとＡｄｄａＶａｘ以外の４群を比較した（全てのペア）。データは、類似の結果を伴う２つの独立した実験の代表である。
〔図２７〕製剤化アジュバントによって誘導される、抗原特異的ＩｇＭレベル。０日目および２１日目に、図２Ａに示すように、製剤化アジュバントを伴うＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、筋肉内注射することにより免疫付与した。リポソームＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０（リポ－１Ｖ２７０、１ｎｍｏｌ／注射）、リポソームＴＬＲ４アゴニスト２Ｂ１８２Ｃ（リポ－２Ｂ１８２Ｃ、２００ｎｍｏｌ／注射）、ならびに１Ｖ２７０と２Ｂ１８２Ｃとの複合リポソームアジュバント（リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ、１ｎｍｏ／注射＋２００ｎｍｏ／注射）を注射した。ビヒクルは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンおよびコレステロール（ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、対照リポソーム）である。ＡｄｄａＶａｘＴＭをポジティブコントロールとして使用した。２８日目に血清を採取し、ＨＡまたはＮＡに特異的なＩｇＭを調べた。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５である。抗原なしとＡｄｄａＶａｘ以外の４つの処置を比較した（全てのペア）。データは、類似の結果を伴う２つの独立した実験の代表である。
〔図２８Ａ－２８Ｃ〕製剤化複合アジュバントは、Ｔｆｈおよび抗体分泌細胞を増加させた。（Ａ）０日目および２１日目に、５０μＬの全容量中、１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）および／または２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）を用いてＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４～５／群）にワクチン接種した。２８日目に、鼠径リンパ節中のリンパ球を採取してＦＡＣＳ分析を行った。Ｔｆｈ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＰＤ－１＋ ＣＸＣＲ５＋）、ＧＣ Ｂ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ９５＋ ＧＬ７＋）、形質芽球（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ１３８＋）、および形質細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９－ ＣＤ１３８＋）についてのゲーティング戦略を示す。（Ｂ）生細胞中の％Ｔｆｈ細胞、ＧＣ Ｂ細胞、形質芽球、および形質細胞。バーは、平均±ＳＥＭを示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である。ＡｄｄａＶａｘ以外の４つの条件を比較した（全てのペア）。
〔図２９Ａ－２９Ｂ〕製剤化複合アジュバントは、Ｔｆｈおよび抗体分泌細胞を増加させた。０日目および２１日目に、５０μＬの全容量中、１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）および／または２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）を用いてＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４～５／群）にワクチン接種した。２８日目に、鼠径リンパ節中のリンパ球を採取してＦＡＣＳ分析を行った（図５Ａ）。Ｔｆｈ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＰＤ－１＋ ＣＸＣＲ５＋）、ＧＣ Ｂ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ９５＋ ＧＬ７＋）、形質芽球（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ１３８＋）、および形質細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９－ ＣＤ１３８＋）についてのゲーティング戦略を図５Ｂに示す。（Ａ）Ｔｆｈ細胞、ＧＣ Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞の数。（Ｂ）細胞の総数。バーは、平均±ＳＥＭを示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である（全てのペア）。
〔図３０Ａ－３０Ｃ〕１Ｖ２７０と２Ｂ１８２Ｃとの製剤化された組み合わせ。（ＡおよびＢ）０日目および２１日目に、製剤化アジュバンドを用いてＩＩＡＶでＢＡＬＢ／ｃマウスにワクチン接種し、２８日目に鼠径リンパ節を採取してＢＣＲレパトア分析を行った。（Ａ）総ＩＧＨ、ＩＧＨＧ１、およびＩＧＨＧ２ＡのＢＣＲ多様性。（Ｂ）類似性解析。Ｊａｃｃａｒｄ指数を示す。（Ｃ）ＴＣＲαおよびＴＣＲβの「１－ｐｉｅｌｏｕ指数」によって示された、ＴＣＲクローナリティ。バーは、平均±ＳＥＭを示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、（リポソームと比較して）＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である。
〔図３１Ａ－３１Ｉ〕リポ－２Ｂ１８２Ｃおよびリポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃは、同種のインフルエンザウイルスからマウスを防御する。（Ａ）同種のインフルエンザウイルス攻撃の実験スケジュール。（Ｂ）平均体重変化は、％初期体重によって示される。Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡにより、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。（Ｃ）同種のウイルス（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）による攻撃後のマウスの生存率。ログランク検定を用いたＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。肺ウイルス力価（Ｄ）および肺液中のサイトカインレベル（Ｅ）を評価した。３日目および６日目に、肺洗浄を行った。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、（リポソームと比較して）＊＊Ｐ＜０．０１である。（Ｆ）肺ウイルス力価と、炎症誘発性サイトカインであるＭＣＰ－１（左）およびＩＬ－６（右）との関係。Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関検定（ＭＣＰ‐１；＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．８３、ＩＬ‐６；＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．７９）。ＨＩ力価（Ｇ）および同種のウイルスに対するＶＮ価（Ｈ）。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である（全てのペア）。（Ｉ）ＶＮ力価と肺ウイルス力価との関係。各ドットは、同一動物におけるＶＮ力価と肺ウイルス力価を示す。＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関検定、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝－０．５９。
〔図３２Ａ－３２Ｃ〕Ｈ３Ｎ２ウイルスによる異種攻撃。図３１Ａに記載されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＩＩＡＶ（Ｈ１Ｎ１）に加えて製剤化アジュバントを用いて免疫付与し、そして異種のウイルスＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ３／７５（Ｈ３Ｎ２）を用いて鼻腔内攻撃した。（Ａ）体重減少をモニターした。一元配置ＡＮＯＶＡにより、有意性は検出されなかった。（Ｂ）異種のウイルスによる攻撃後のマウスの生存率。ログランク検定（ｎ．ｓ．）を用いたＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。（Ｃ）３日目および６日目における、肺ウイルス力価。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、有意性は検出されなかった。
〔図３３Ａ－３３Ｇ〕ＡおよびＥ）プロトコル。Ｂ－ＣおよびＦ－Ｇ）１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ＣあるいはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／に感染後の経時的な体重および生存。Ｄ）１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率。
〔図３４Ａ－３４Ｂ〕Ａ）１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、抗－ＨＡ ＩｇＧ１、抗－ＨＡ ＩｇＧ２ａ、および抗－ＨＡ ＩｇＭ。Ｂ）１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、抗－ＮＡ ＩｇＧ１、抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ、および抗－ＮＡ ＩｇＭ。
〔図３５Ａ－３５Ｆ〕１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、ＡおよびＢ）抗－ＨＡおよび抗－ＮＡ ＩｇＧ１、Ｃ－Ｄ）抗－ＨＡおよび抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ、ならびにＥ－Ｆ）抗－ＨＡおよび抗－ＮＡ ＩｇＭ。Ｂ）１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、抗－ＮＡ ＩｇＧ１、抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ、および抗－ＮＡ ＩｇＭ。
〔図３６Ａ－３６Ｂ〕異なる投与量の１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはそれらの組み合わせを投与したマウスにおける抗－ＨＡ ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１。
〔図３７〕様々なリポソームの概略図および例示的なプロトコル。
〔図３８Ａ－３８Ｂ〕Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍのＨＡのペプチドアレイを使用するＥＬＩＳＡ。０日目および２１日目に、ＩＩＡＶに加えてＬｉｐｏ－Ｖｅｈ（ブランクリポソーム）、Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０、Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ、Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）（共カプセル化組み合わせ）、または（Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０）＋（Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ）（混合組み合わせ）を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５～１０）を免疫付与し、２８日目に採血した。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ（ＮＲ－１５４３３）のＨＡのペプチドアレイはＢＥＩリソースから入手した。５群のペプチドをプールし、２８個のペプチドプールを作製した。（Ａ）ＥＬＩＳＡの結果によるＯＤ４０５－５７０ｎｍのヒートマップ。各行および各列は、それぞれペプチドプールおよびマウスを示している。（Ｂ）統計分析を、個々のマウスにおける２８個のペプチドプールの平均について行った。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定。＋Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。
〔図３９Ａ－３９Ｄ〕抗体の交差反応性についてのＥＬＩＳＡ。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、０日目および２１日目に、ＩＩＡＶに加えてＬｉｐｏ－Ｖｅｈ、Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０、Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ、Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）、または（Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０）＋（Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ）を用いて免疫付与し、２８日目に採血した。血清を連続希釈（１：１００～１：４０９６００）し、ＥＬＩＳＡにより、Ｐｕｅｒｔｏ ＲｉｃｏＨ１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、およびＨ３Ｎ２のＨＡ、ならびにＨ５Ｎ１、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ７のＮＡに対する、総ＩｇＧレベルを評価した。（Ａ）本研究において使用したＡ型インフルエンザウイルスのＨＡの系統発生的関係。ＥＬＩＳＡにおいて使用したタンパク質のアミノ酸配列を、インフルエンザリサーチデータベース（https://www.fludb.org/brc/home.spg?decorator=influenza）を用いたＭＵＳＣＬＥアルゴリズムにより整列させた。系統樹は、ＭＥＧＡＸソフトウェア（https://www.megasoftware.net/）を用いた近隣結合法により構築した。（Ｂ）Ｈ１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ７のＨＡに対する総ＩｇＧ力価曲線。（Ｃ）ＮＡの系統発生的関係。（Ｄ）Ｈ５Ｎ１、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ７のＮＡに対する総ＩｇＧ力価曲線。血清を、１００倍から始めて４０９６００倍まで１：４に希釈し、総ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。示されるデータは、平均±ＳＥＭである。
〔図４０Ａ－４０Ｂ〕Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）は、交差反応性抗体を誘導した。（ＡおよびＢ）ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝５／群）マウスを、０日目および２１日目に、ＩＩＡＶ［Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９］に加えてＬｉｐｏ－Ｖｅｈ、Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０、Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ、Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）、または（Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０）＋（Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ）を用いて免疫付与し、２８日目に採血した。血清を連続希釈（１：１００～１：４０９６００）し、ＥＬＩＳＡにより、Ｐｕｅｒｔｏ ＲｉｃｏＨ１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、およびＨ３Ｎ２のＨＡ、ならびにＨ５Ｎ１、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ７のＮＡに対する、総ＩｇＧレベルを評価した。ｐｒｉｓｍ ５を用いて計算した個々のマウスの総ＩｇＧ力価曲線の幾何学的平均を示す。本研究で使用したＨＡタンパク質の総ＩｇＧ力価曲線および系統発生的関係を上記した内容に示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定。＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。
〔図４１〕例示的なＴＬＲ４およびＴＬＲ７アゴニスト。
〔詳細な説明〕
ワクチンにおけるアジュバントの使用は、弱い免疫原性抗原に対してより強い免疫応答を促進させるための十分に確立された方法である。さらに、アジュバントはまた、弱い免疫原性抗原の免疫原性を促進することによって免疫応答を増強し、そして潜在的に広げることができる。現在、ワクチンにおける使用が認可されているアジュバントは、ごくわずかである（O'Hagan, et al. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.01.088）。さらに、既存のワクチンの大半は単一のアジュバントを含んでおり、最近の証拠から、多くの新興感染症に対して防御免疫を導入するには十分ではないことが示唆されている（Underhill, doi: 10.1111/j.1600-065X.2007.00548.x）。
アジュバントとしてのＴＬＲアゴニストの組み合わせの使用によって、しばしば免疫応答は全体的に増強されてきた。しかし、インフルエンザのような感染症ワクチンの場合、Ｔｈ１（細胞媒介性）の増強またはＴｈ１型への応答の偏りは、Ｔｈ２（体液性または抗体）型を犠牲にする。実際、Ｔｈ１応答が増加しているにもかかわらず、防御Ｔｈ２抗体の生産が不十分になることがあり、インフルエンザ感染症に対しては、ある種の防御抗体力価が免疫付与を介して有効な防御を提供するための主要な因子であると考えられている。
本開示において、単一のナノ粒子製剤中のＴＬＲ４／ＴＬＲ７アゴニストの組み合わせの比率は、抗原に対する全体的な免疫応答を増強するだけでなく、マウスにおける致死性ウイルス攻撃に対する有効な防御のための十分な防御抗体生成を提供することも見出された。ヒトの免疫学的状態は、マウスのそれとはまったく異なるであろう。マウスは一般にインフルエンザのような抗原に曝露されないが、ヒトは通常、自然曝露とワクチン曝露の両方により、長年にわたってインフルエンザ抗原に曝露されてきた。ヒトにおいて帯状疱疹として後に現れ得る水痘（水痘帯状疱疹）など、他の感染性病原体についても同様のことがいえる。
１つの抗原による免疫付与は、第２の類似した抗原に対する強固な免疫応答を阻止することが知られている。これは、１）エピトープ排除（既存の抗体、特に粘膜ＩｇＡがワクチンをすべての抗原提示細胞から遮蔽する）；２）減少した樹状細胞（ＤＣ）アクセス（メモリーＢ細胞が新たなワクチンを内部に取り込み、ＤＣアクセスおよび活性化、並びにＴ細胞免疫付与が低下する）；３）Ｔ細胞競合（メモリーＢ細胞が活性化され、サイトカイン、補助因子を消費し、抗原をロードしたＤＣと反応し得るＴ細胞を捕捉する）による可能性がある。
本開示は、１）ワクチンをＤＣに優先的に送達するリポソームナノ粒子中にワクチンをカプセル化すること、および２）ワクチン抗原に対する活性化Ｔ細胞の数の多様性を増大させる特定の比率において、組み合わせＴＬＲアゴニストを使用してＤＣを活性化することによって、これらの負担を克服する。本発明は、同じリポソームナノ粒子中のＴＬＲ４アゴニストとＴＬＲ７アゴニストとの組み合わせをアジュバントとして製剤化することが、別々の製剤化アゴニストと非製剤化アゴニストとの混合組み合わせよりも、いくつかの利点を提供するという本発明者らの発見を開示する。製剤化された組み合わせは、免疫活性のためにナノ粒子中にＴＬＲ７に対するＴＬＲ４の特定の比率を有し得る。
この比率でのこれらの組み合わせの利点は、以下を含む：１）より優れたＴｈ１およびＴｈ２免疫応答を提供する、ＤＭＳＯ製剤に対する増強された活性化；２）ＤＭＳＯ製剤に対するより低い毒性；３）特に粘膜のインフルエンザ免疫付与のため、過免疫個体のＢ細胞およびＩｇＡに由来する（ワクチン使用に対する）抗原の遮蔽、および有効な防御応答のための重要なエピトープを樹状細胞が提示することを可能にすること；および／または４）免疫応答を広げることにより、インフルエンザにおけるＨＡ茎抗原の場合のような、より少ない免疫原性抗原に対する応答を含むこと、によって、より普遍的なワクチンが得られる。
アジュバントとしてのＴＬＲアゴニストの組み合わせの使用は、しばしば免疫応答の全体的な増強をもたらしている。しかし、インフルエンザのような感染症のワクチンの場合、Ｔｈ１（細胞媒介性）の増強またはＴｈ１型への応答の偏りは、Ｔｈ２（体液性または抗体）型を犠牲にする。実際、Ｔｈ１応答が増加しているにもかかわらず、防御Ｔｈ２抗体の生産が不十分になることがあり、インフルエンザ感染症に対しては、ある種の防御抗体力価が免疫付与を介して有効な防御を提供するための主要な因子であると考えられている。
本発明において単一のナノ粒子製剤中のＴＬＲ４／ＴＬＲ７アゴニストの組み合わせの比率は、抗原に対する全体的な免疫応答を増強するだけでなく、マウスにおける致死性ウイルス攻撃に対する有効な防御のための十分な防御抗体生成を提供することも見出された。ヒトの免疫学的状態は、マウスのそれとはまったく異なるであろう。マウスは一般にインフルエンザのような抗原に曝露されないが、ヒトは通常、自然曝露とワクチン曝露の両方により、長年にわたってインフルエンザ抗原に曝露されてきた。ヒトにおいて帯状疱疹として後に現れ得る水痘（水痘帯状疱疹）など、他の感染性病原体についても同様のことがいえる。
１つの抗原による免疫付与は、第２の、類似した抗原に対する強固な免疫応答を阻止することが知られている。これは、１）エピトープ排除（既存の抗体、特に粘膜ＩｇＡがワクチンをすべての抗原提示細胞から遮蔽する）；２）減少した樹状細胞（ＤＣ）アクセス（メモリーＢ細胞が新たなワクチンを内部に取り込み、ＤＣアクセスおよび活性化、並びにＴ細胞免疫付与が低下する）；３）Ｔ細胞競合（メモリーＢ細胞が活性化され、サイトカイン、補助因子を消費し、抗原をロードしたＤＣと反応し得るＴ細胞を捕捉する）による可能性がある。
本開示は、１）ワクチンをＤＣに優先的に送達するリポソームナノ粒子中にワクチンをカプセル化すること、および２）ワクチン抗原に対する活性化Ｔ細胞の数の多様性を増加させる特定の比率において、組み合わせＴＬＲアゴニストを使用してＤＣを活性化することによって、これらの負担を克服する。
〔定義〕
組成物は、特定の化合物の「実質的に全て」、または組成物が質量基準で特定の組成物の少なくとも約９０％、ならびに少なくとも約９５％、９９％、および９９．９％を含む場合、特定の形態の化合物（例えば、異性体）から構成される。各化合物（例えば、異性体）が重量基準で組成物の少なくとも約１０％を表す場合、組成物は、化合物の「混合物」または同じ化合物の形態を含む。本発明のＴＬＲ７アゴニストまたはそのコンジュゲートは、遊離酸または遊離塩基形態においてと同様に、酸塩または塩基塩として調製され得る。溶液中では、本発明の化合物の特定のものは、双性イオンとして存在することができ、ここで、対イオンは溶媒分子自体によって、または溶媒中に溶解または懸濁された他のイオンから提供される。
用語「Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト」（ＴＬＲアゴニスト）は、ＴＬＲに結合する分子を意味する。合成ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲに結合して受容体を活性化するように設計された化学的化合物である。
本発明の範囲内で、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物、またはそれらの塩は、互変異性の現象を示し得、それによって、２つの原子の間で水素原子を交換することによって容易に相互変換することができる２つの化合物が共有結合を形成することを理解されたい。互変異性化合物は互いに移動平衡状態で存在するので、それらは同じ化合物の異なる異性体形態とみなすことができる。本明細書内の式図面は、可能性のある互変異性体形態のうちの１つのみを表し得ることを理解されたい。しかし、本発明は、任意の互変異性体形態を包含し、式図面内で利用される任意の１つの互変異性体形態に単に限定されるものではないことも理解されたい。本明細書内の式図面は、可能性のある互変異性体形態のうちの１つのみを表すことができ、当該明細書は、明細書中で図示することが好都合であった形態だけでなく、描かれた化合物のすべての可能性のある互変異性体形態を包含することを理解されたい。例えば、互変異性は、波線によって示されるように結合したピラゾリル基によって表してもよい。置換基の両方が４－ピラゾリル基と呼ばれるが、異なる窒素原子が各構造において水素原子を有することは明らかである。
Figure 2022525608000001
このような互変異性は、３－メチル、５－メチル、または３，５－ジメチルピラゾールなどの置換ピラゾールでも起こり得る。互変異性の別の例としては、環窒素原子に隣接する環酸素原子を有する複素環式化合物において見られるような、アミド－イミド（環状の場合、ラクタム－ラクチム）互変異性がある。例えば、平衡：
Figure 2022525608000002
は、互変異性の例である。したがって、１つの互変異性体として本明細書に示される構造は、他の互変異性体も含むことが意図される。
［光学異性］
本発明の化合物が１つ以上のキラル中心を含有する場合、化合物は、純粋なエナンチオマー形態もしくはジアステレオマー形態として、またはラセミ混合物として存在してもよく、単離されてもよいことが理解されるであろう。したがって、本発明には、当該発明の化合物の任意の可能性のあるエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、またはそれらの混合物が含まれる。
キラル中心の存在から生じる異性体は、「エナンチオマー」と呼ばれる一対の非重畳異性体を含む。純粋な化合物の単一エナンチオマーは光学的に活性であり、すなわち、それらは、平面偏光面を回転させることができる。単一エナンチオマーは、Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇシステムに従って指定される。置換基の優先順位は、原子量に基づいてランク付けされ、系統的手順によって判断されるように、より高い原子量は、より高い優先順位を有する。一度、４つの基の優先順位が判断されると、分子は、最も低い順位の基が観察者から離れて指し示されるように配置される。そして、他の基の降順が時計回りに進む場合には分子は（Ｒ）に指定され、他の基の降順が反時計回りに進む場合には分子は（Ｓ）に指定される。スキーム１４において、例えば、Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇ順位則はＡ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄであり、最低のランキング原子Ｄは観察者から離れている。
Figure 2022525608000003
本発明は、ジアステレオマー、ならびにそれらのラセミ体および分離体、ジアステレオマー的およびエナンチオマー的に純粋な形態およびそれらの塩を包含することを意味する。ジアステレオマー対は、順相クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー、ならびに結晶化を含む公知の分離技術によって分離され得る。
「単離された光学異性体」は、同じ式の対応する光学異性体から実質的に精製された化合物を意味する。一実施形態において、単離された異性体は、少なくとも約８０重量％、例えば、少なくとも９０重量％、９８重量％、または９９重量％純粋である。
単離された光学異性体は、周知のキラル分離技術によってラセミ混合物から精製することができる。そのような一方法によれば、本発明の化合物のラセミ混合物またはそのキラル中間体は、ＤＡＩＣＥＬ（登録商標）ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ファミリーカラム（ダイセル化学工業株式会社、東京、日本）のシリーズの１つのような、適当なキラルカラムを使用するＨＰＬＣによって、９９重量％の純度の光学異性体に分離される。カラムは、製造者の指示に従って操作される。
「薬学的に許容される」という語句は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的な利益／リスク比に相応する他の問題もしくは合併症なしに、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した化合物、成分、組成物、および／または剤形を指すために本明細書では使用される。
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物がその酸塩または塩基塩を作製することによって修飾される、開示された化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、塩基性残基（例えば、アミン）の無機酸塩または有機酸塩；酸性残基（例えば、カルボン酸）のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の、従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性塩には、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）から誘導されるもの；および有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、ベヘン酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸など）から調製される塩が含まれる。
本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸形態または遊離塩基形態を、化学量論的な量の適切な塩基または酸と、水中または有機溶媒中またはこれら２つの混合物中で反応させることによって調製され得る。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体を使用することができる。適切な塩のリストは、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985)に見出され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される式の化合物は溶媒和物であり得、いくつかの実施形態において水和物であり得る。用語「溶媒和物」とは、固体構造に１つまたは複数の溶媒分子が結合した固体化合物を指す。化合物を溶媒から結晶化させたときに、溶媒和物は形成され得る。固化により１つまたは複数の溶媒分子が固体結晶マトリックスの不可欠な部分になるときに、溶媒和物は形成される。本明細書に記載の式の化合物は、溶媒和物、例えば、エタノール溶媒和物であり得る。別の種類の溶媒和物は、水和物である。「水和物」とは、同様に、固体または結晶構造と分子レベルで密接に結合した１つまたは複数の水分子を有する、固体化合物を指す。化合物を水中で固化または結晶化させた時に、水和物は形成され得、ここで、１つまたは複数の水分子は、固体結晶マトリックスの不可欠な部分となる。
別段の記載がない限り、以下の定義が使用される；ハロまたはハロゲンは、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードである。アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニルなどは、直鎖基および分岐基の両方を意味するが、「プロピル」などの個々のラジカルへの言及は直鎖ラジカルのみを包含し、「イソプロピル」などの分岐鎖異性体は明確に言及される。アリールとは、少なくとも１つの環が芳香族である、約９～１０個の環原子を有するフェニルラジカルまたはオルト縮合二環式炭素環ラジカルを意味する。Ｈｅｔは、ヘテロアリール（炭素からなる５個または６個の環原子と、非過酸化物酸素、硫黄、およびＮ（Ｘ）（Ｘは、欠如しているか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、フェニル、またはベンジル、ならびにそれらから誘導される約８～１０個の環原子のオルト縮合二環式複素環式ラジカル、特にベンズ誘導体、またはプロピレン、トリメチレン、もしくはテトラメチレンジラジカルをそれに融合させることによって誘導されるものである）からなる群からそれぞれ選択される１～４個のヘテロ原子とを含む、単環式芳香族環の環炭素を介して結合したラジカルを包含する）であり得る。
キラル中心を有する本発明の化合物が、光学活性およびラセミ形態において存在し得、そして単離され得ることは、当業者によって理解されるであろう。いくつかの化合物は、多型を示し得る。本発明は、本明細書に記載の有益な特性を有する本発明の化合物の任意のラセミ、光学活性、多形、または立体異性形態、またはそれらの混合物を包含し、光学活性形態を調製する方法（例えば、再結晶技術によるラセミ形態の分割によって、光学活性出発物質からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離によって）、および本明細書に記載の標準試験を使用して、または当技術分野で周知の他の類似の試験を使用して、アゴニスト活性を判断する方法が、当技術分野で周知であることを理解されたい。また、本明細書に記載の化合物は、互いに様々な平衡状態で存在することができるそれらの様々な互変異性体を含むことが当業者には理解される。
本明細書中で使用される用語「処置する(treat)」および「処置すること(treating)」は、（ｉ）病的状態が起こることを防ぐこと（例えば、予防）；（ｉｉ）病的状態を阻害すること、またはその進行を停止(arresting)させること；（ｉｉｉ）病的状態を緩和(relieving)すること；および／または（ｉｖ）状態の症状を改善(ameliorating)、緩和(alleviating)、軽減(lessening)、および除去(removing)することを指す。本明細書に記載される候補分子または化合物は、製剤または薬剤中の量（生物学的効果をもたらし得るか、または例えば病気の症状を改善(ameliorating)、緩和(alleviating)、軽減(lessening)、緩和(relieving)、軽減(diminishing)、または除去(removing)することをもたらし得る量）で存在し得る。当該用語はまた、細胞増殖速度を減少(reducing)もしくは停止(stopping)させること（例えば、腫瘍増殖を減速(slowing)もしくは停止(halting)させること）、または増殖している癌細胞の数を減少させること（例えば、腫瘍の一部または全部を除去すること）を指し得る。これらの用語はまた、微生物に感染した系（例えば、細胞、組織、または被験体）における、微生物(microorganism)（微生物(microbe)）の力価を減少させること、微生物繁殖速度を減少させること、微生物感染に関連する症状の数または症状の影響を減少させること、および／または系から検出可能な量の微生物を除去することにも適用可能である。微生物の例としては、ウイルス、細菌、および真菌が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「治療有効量」は、被験体における疾患もしくは障害を処置もしくは予防するための、または疾患もしくは障害の症状を処置するための化合物の量、または化合物の組み合わせの量を指す。本明細書で使用される用語「被験体」および「患者」は、一般に、本明細書に記載される一方法に従って処置（例えば、化合物の投与）を受けるか、または受けた個体を指す。
「安定な化合物」および「安定な構造」は、反応混合物から有用な程度の純度まで単離され、有効な治療薬へと製剤化されるまで残存するのに十分に頑健である化合物を意味する。安定な化合物のみが、本発明によって意図される。
用語「被験体」、「患者」、または「それを必要とする被験体」は、本明細書中に提供されるような化合物、医薬組成物、混合物、またはワクチンの投与によって処置され得る疾患または状態に罹患しているか、あるいは罹患しやすい生体を指す。非限定的な例としては、ヒト、他の哺乳動物、ウシ属の動物、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、および他の非哺乳動物が含まれる。いくつかの実施形態おいて、患者はヒトである。いくつかの実施形態では患者は家畜化された動物である。いくつかの実施形態では患者はイヌである。いくつかの実施形態では患者はオウムである。いくつかの実施形態では患者は家畜である。いくつかの実施形態では患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態では患者はネコである。いくつかの実施形態では患者はウマである。いくつかの実施形態では患者はウシ属の動物である。いくつかの実施形態では患者はイヌ科の動物である。いくつかの実施形態では患者はネコ科の動物である。いくつかの実施形態では患者は類人猿である。いくつかの実施形態では患者はサルである。いくつかの実施形態では患者はマウスである。いくつかの実施形態では患者は実験動物である。いくつかの実施形態では患者はラットである。いくつかの実施形態では患者はハムスターである。いくつかの実施形態では患者は試験動物である。いくつかの実施形態では患者は新生動物である。いくつかの実施形態では患者は新生のヒトである。いくつかの実施形態では患者は新生哺乳動物である。いくつかの実施形態では患者は高齢動物である。いくつかの実施形態では患者は高齢のヒトである。いくつかの実施形態では患者は高齢哺乳動物である。いくつかの実施形態では患者は老人患者である。
本明細書中で使用される用語「有効量」は、意図される目的を達成するために有効な量を指す。したがって、用語「治療有効量」などは、疾患もしくは障害の処置もしくは予防、または疾患もしくは障害の症状の処置を、それらを必要とする被験体において行うための、化合物、混合物もしくはワクチンの量、またはそれらの組み合わせの量を指す。
用語「ＴＬＲ」は、ＮＦＫＢ活性化を調節する自然免疫系の構成要素であるＴｏｌｌ様受容体を指す。
本明細書で使用される用語「ＴＬＲモジュレーター」、「ＴＬＲ免疫モジュレーター」などは、通常のおよび慣習的な意味において、Ｔｏｌｌ様受容体を作動させるか、または阻害する化合物を指す。例えば、PCT/US2010/000369, Hennessy, E.J., et al., Nature Reviews 2010, 9:283- 307; PCT/US2008/001631; PCT/US2006/032371; PCT/US2011/000757を参照されたい。したがって、「ＴＬＲアゴニスト」はＴＬＲを作動させるＴＬＲモジュレーターであり、「ＴＬＲアンタゴニスト」はＴＬＲを阻害するＴＬＲモジュレーターである。
本明細書中で使用される用語「ＴＬＲ４」は、ＴＬＲ４遺伝子産物、およびホモログ、アイソフォーム、ならびにそれらの機能的断片を指す：アイソフォーム１（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿６１２５６４．１）；アイソフォーム２（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００３２５７．１）；アイソフォーム３（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿６１２５６７．１）。開示された製剤に含まれ得るＴＬＲ４のアゴニストとしては、式（ＩＩ）の化合物、例えば、ピリミドインドール、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、具体的には、ＣＲＸ－６０１およびＣＲＸ－５４７）、ＲＣ－２９、モノホスホリルリン脂質Ａ（ＭＰＬ）、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡおよびＳＬＡ）、ＯＭ－１７４、ＰＥＴ脂質Ａ、ＯＮＯ－４００７、ＩＮＩ－２００４（ジアミンアロースホスフェート）、ならびにＥ６０２０が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される用語「ＴＬＲ７」は、ＴＬＲ７遺伝子産物（ＮＣＢＩアクセッションＡＡＺ９９０２６）、およびホモログ、ならびにそれらの機能的断片を指す。開示された製剤に含まれ得るＴＬＲ７アゴニストとしては、式（Ｉ）の化合物、イミダゾキノリン、例えば、イミキモド、ＣＬ０９７もしくはガルジキミド、ＣＬ２６４、ＣＬ０８７などのアデニン類似体、３Ｍ００２（ＣＬ０７５）などのチアゾロキノリン、アスロキソリビンなどのグアノシン類似体、またはチオキノリンが挙げられるが、これらに限定されない。
〔ＴＬＲ４およびＴＬＲ７〕
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として知られる、保存された微生物産物を認識するパターン認識受容体である。ＴＬＲ４はＬＰＳを認識する。ＴＬＲ４シグナリングは、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦの依存性経路を活性化させる。ＭｙＤ８８経路は、ＮＦ－κＢおよびＪＮＫを活性化して炎症反応を誘導する。ＴＲＩＦ経路は、ＩＲＦ３を活性化してＩＦＮ－αの生産を誘導する。
ＴＬＲ４は、主に単球、成熟マクロファージ、ならびに樹状細胞、肥満細胞、および腸上皮において発現する。ＴＬＲ４についてのＴＬＲモジュレーター（アゴニスト）としては、ＮＩ－０１０１（Hennessy 2010, Id.）、１Ａ６（Ungaro, R., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2009, 296:G1167-G1179）、ＡＶ４１１（Ledeboer, A., et al., Neuron Glia Biol. 2006, 2:279-291; Ledeboer, A., et al., Expert Opin. Investig. Drugs 2007, 16:935-950）、Ｅｒｉｔｏｒａｎ（Mullarkey, M., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 305:1093-1102）、およびＴＡＫ－２４２（Li, M., et al., Mol. Pharmacol. 2006, 69:1288-1295）が挙げられる。ＴＬＲ４についてのＴＬＲモジュレーター（アゴニスト）としては、Ｐｏｌｌｉｎｅｘ（登録商標）Ｑｕａｔｔｒｏ（Baldrick, P., et al., J. Appl. Toxicol. 2007, 27:399-409; DuBuske, L., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2009, 123:S216）が挙げられる。ＴＬＲ７シグナリングは、ＭｙＤ８８依存性経路およびＩＲＦ７依存性シグナリングを活性化させる。ＩＲＦ７経路は、ＩＦＮ－α生産を誘導する。
ＴＬＲ７は、ｓｓ－ＲＮＡまたは合成化学物質（イミキモド、Ｒ８４８）を感知する。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、単球およびマクロファージのエンドソームに見られ、ＴＬＲ７は形質細胞様樹状細胞にも発現し、ＴＬＲ８は肥満細胞にも発現する。これらの受容体はどちらも、ウイルス由来の一本鎖ＲＮＡを認識する。合成リガンド（例えば、Ｒ－８４８およびイミキモド）は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のシグナリング経路を活性化するために使用され得る。例えば、Caron, G., et al., J. Immunol. 2005, 175:1551-1557を参照されたい。ＴＬＲ９は、単球、マクロファージ、および形質細胞様樹状細胞のエンドソームに発現し、細菌およびウイルスＤＮＡに見られる非メチル化ＣｐＧアイランドの受容体として作用する。非メチル化ＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドが、ＴＬＲ９を活性化するために用いられる。例えば、クラスＡオリゴヌクレオチドは、形質細胞様樹状細胞を標的とし、ＩＦＮａ生産および抗原提示細胞成熟を強く誘導しながら、ナチュラルキラー細胞を間接的に活性化する。クラスＢオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を標的とし、インターフェロン－ａ（ＩＦＮａ）をほとんど誘導しない。クラスＣオリゴヌクレオチドは、形質細胞様樹状細胞を標的とし、ＩＦＮａの強力な誘導因子である。このクラスのオリゴヌクレオチドは、抗原提示細胞の活性化および成熟に関与し、間接的にナチュラルキラー細胞を活性化し、Ｂ細胞を直接刺激する。例えば、Vollmer, J., et al., Eur. J. Immunol. 2004, 34:251-262; Strandskog, G., et al., Dev. Comp. Immunol. 2007, 31:39-51を参照されたい。
ＴＬＲ７について報告されているＴＬＲモジュレーター（アゴニスト）としては、ＡＮＡ７７２（Kronenberg, B. & Zeuzem, S., Ann. Hepatol. 2009, 8:103-112）、イミキモド（Somani, N. & Rivers, J.K., Skin Therapy Lett. 2005, 10:1-6）、およびＡＺＤ８８４８（Hennessey 2010, Id.）が挙げられる。ＴＬＲ８についてのＴＬＲモジュレーター（アゴニスト）としては、ＶＴＸ－１４６３(Hennessey 2010, Id.)が挙げられる。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８についてのＴＬＲモジュレーター（アゴニスト）としては、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ(Mark, K.E., et al., J. Infect. Dis. 2007, 195:1324-1331; Pockros, P.J., et al., J. Hepatol. 2007, 47:174-182)が挙げられる。ＴＬＲ７およびＴＬＲ９についてのＴＬＲモジュレーター（アンタゴニスト）としては、ＩＲＳ－９５４（Barrat, F.J., et al., Eur. J. Immunol. 2007, 37:3582-3586）およびＩＭＯ－３１００（Jiang, W., et al., J. Immunol. 2009, 182:48.25）が挙げられる。ＴＬＲ９アゴニストとしては、ＳＤ－１０１（Barry, M. & Cooper, C., Expert Opin. Biol. Ther. 2007, 7:1731-1737）、ＩＭＯ－２１２５（Agrawal, S. & Kandimalla, E.R., Biochem. Soc. Trans. 2007, 35:1461-1467）、Ｂｉｏ Ｔｈｒａｘ ｐｌｕｓ ＣｐＧ－７９０９（Gu, M., et al., Vaccine 2007, 25:526-534）、ＡＶＥ０６７５（Parkinson, T., Curr. Opin. Mol. Ther. 2008, 10:21-31）、ＱＡＸ－９３５（Panter, G., et al., Curr. Opin. Mol Ther. 2009, 11:133-145）、ＳＡＲ－２１６０９（Parkinson 2008, Id.）、およびＤＩＭＳ０１５０（Pastorelli, L., et al., Expert Opin. Emerg. Drugs 2009, 14:505-521）が挙げられる。
〔ＴＬＲ７リガンドおよびそのコンジュゲート〕
ＴＬＲ７リガンドおよびそのコンジュゲートに関して、本明細書中で使用される用語「アルキル」、「アルケニル」、および「アルキニル」は、直鎖、分岐鎖、および環状の一価ヒドロカルビルラジカル、ならびにこれらの組み合わせを含み得、これらは非置換である場合、ＣおよびＨのみを含有する。例えば、メチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２プロペニル、３ブチニルなどが挙げられる。このような各基における炭素原子の総数は、本明細書に記載されることがある。例えば、基が最大１０個の炭素原子を含み得るとき、１～１０Ｃ、またはＣ１～Ｃ１０もしくはＣ１～１０と表され得る。ヘテロ原子（典型的には、Ｎ、Ｏ、およびＳ）がヘテロアルキル基のように炭素原子を置換することを許される場合、例えば、基を記載する数は、依然として（例えばＣ１～Ｃ６と）記述されているが、基における炭素原子の数と、記述されている環または鎖の主鎖中の炭素原子の置換として含まれるそのようなヘテロ原子の数との合計を表す。
典型的には本発明のアルキル、アルケニル、およびアルキニルの置換基は、１個の１０Ｃ（アルキル）または２個の１０Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有する。例えば、それらは、１個の８Ｃ（アルキル）または２個の８Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有する。時には、それらは１個の４Ｃ（アルキル）または２個の４Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有する。単一基は、２つ以上の種類の多重結合、または２つ以上の多重結合を含み得る。そのような基が、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含む場合には用語「アルケニル」の定義内に含まれ、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を含む場合には用語「アルキニル」内に含まれる。
アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、しばしば、そのような置換が化学的に意味をなす程度に置換されている。代表的な置換基としては、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ－ＣＮ、＝Ｎ－ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１～Ｃ８アシル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２～Ｃ８アルキニル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、またはＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールである。また、各Ｒは、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ－ＣＮ、＝Ｎ－ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ２で任意に置換され、ここで、各Ｒ’は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１～Ｃ８アシル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、またはＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールである。アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基はまた、Ｃ１～Ｃ８アシル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、またはＣ５～Ｃ１０ヘテロアリールによって置換され得、それらの各々は、特定の基に適切な置換基によって置換され得る。
「アセチレン」置換基は、任意に置換される２～１０Ｃアルキニル基を含んでもよく、式－Ｃ≡Ｃ－Ｒｉで表される。式中、Ｒｉは、Ｈ、またはＣ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２～Ｃ８アルキニル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１～Ｃ８アシル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７～Ｃ１２アリールアルキル、もしくはＣ６～Ｃ１２ヘテロアリールアルキルである。各Ｒｉ基は、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ－ＣＮ、＝Ｎ－ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’２、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ２から選択される、１つまたは複数の置換基で任意に置換される。ここで、各Ｒ’は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アシル、Ｃ２～Ｃ６ヘテロアシル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７～１２アリールアルキル、またはＣ６～１２ヘテロアリールアルキルであり、それぞれ、ハロ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アシル、Ｃ１～Ｃ６ヘテロアシル、ヒドロキシ、アミノ、および＝Ｏから選択される１つまたは複数の基で任意に置換される。また、２つのＲ’は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される最大３個までのヘテロ原子を任意に含む、３～７員環を形成するように結合され得る。いくつかの実施形態では、－Ｃ≡Ｃ－ＲｉのＲｉは、ＨまたはＭｅである。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、および「ヘテロアルキニル」などは、対応するヒドロカルビル（アルキル、アルケニル、およびアルキニル）基と同様に定義される。しかし、用語「ヘテロ」は、骨格残基内に１～３個のＯ、Ｓ、もしくはＮのヘテロ原子またはそれらの組み合わせを含む基を指す。したがって、対応するアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の少なくとも１個の炭素原子は、特定のヘテロ原子の１個によって置換され、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル基を形成する。アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基のヘテロ型についての典型的なサイズは一般に、対応するヒドロカルビル基のサイズと同じである。ヘテロ型上に存在し得る置換基は、ヒドロカルビル基について上記したものと同じである。特に明記しない限り、化学的安定性の理由から、オキソ基がニトロまたはスルホニル基などにおけるＮまたはＳ上に存在する場合を除いて、このような基は３つ以上の連続するヘテロ原子を含まないことも理解されたい。
本明細書で使用される「アルキル」は、シクロアルキル基およびシクロアルキルアルキル基を含み、用語「シクロアルキル」は、環炭素原子を介して連結される炭素環非芳香族基を記載するために本明細書で使用されてもよく、「シクロアルキルアルキル」はアルキルリンカーを介して分子に連結される炭素環非芳香族基を記載するために使用されてもよい。同様に、「ヘテロシクリル」は、少なくとも１つのヘテロ原子を環員として含有し、ＣまたはＮであってもよい環原子を介して分子に連結される非芳香族環基を記載するために使用されてもよい。「ヘテロシクリルアルキル」は、リンカーを介して別の分子に連結されるそのような基を記載するために使用されてもよい。シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、ヘテロシクリル基、およびヘテロシクリルアルキル基に適したサイズおよび置換基は、アルキル基について上記したものと同じである。本明細書中で使用される場合、これらの用語はまた、環が芳香族でない限り、二重結合または２つを含有する環を含む。
本明細書中で使用される場合、「アシル」は、カルボニル炭素原子の２つの利用可能な原子価位置の１つに結合したアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはアリールアルキルラジカルを含む基を包含する。ヘテロアシルとは、カルボニル炭素以外の少なくとも１個の炭素がＮ、Ｏ、およびＳから選ばれるヘテロ原子で置換されている、対応する基を指す。ヘテロアシルは、例えば、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲおよび－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２を、－Ｃ（＝Ｏ）－ヘテロアリールと同様に含む。
アシル基およびヘテロアシル基は、カルボニル炭素原子の開放原子価を介してそれらが結合している任意の基または分子に結合している。典型的には、それらは、ホルミル、アセチル、ピバロイル、およびベンゾイルを含むＣ１～Ｃ８アシル基、ならびにメトキシアセチル、エトキシカルボニル、および４－ピリジノイルを含むＣ２～Ｃ８ヘテロアシル基である。アシルまたはヘテロアシル基を含む、ヒドロカルビル基、アリール基、およびそのような基のヘテロ形態は、本明細書に記載される置換基（アシルまたはヘテロアシル基と対応する構成要素の各々に対して、一般的に適切な置換基とされる）で置換され得る。
「芳香族」部分または「アリール」部分とは、芳香族性のよく知られた特性を有する単環式または縮合二環式部分を指し、例えば、フェニルおよびナフチルが挙げられる。同様に、「ヘテロ芳香族」および「ヘテロアリール」とは、Ｏ、Ｓ、およびＮから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を環員として含む、単環式または縮合二環式系を指す。ヘテロ原子を含めることにより、５員環ならびに６員環における芳香族性が可能になる。典型的なヘテロ芳香族系は、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、およびイミダゾリルなどの単環式Ｃ５～Ｃ６芳香族基、ならびにこれらの単環式基の１つをフェニル環またはヘテロ芳香族単環式基のいずれかと融合させることにより形成した縮合二環式部分を含み、インドリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピラゾロピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリルなどのＣ８～Ｃ１０二環式基を形成する。環系全体にわたる電子分布に関して芳香族性の特性を有する、任意の単環式または縮合二環式系が、この定義に含まれる。それはまた、少なくとも、分子の残りの部分に直接結合された環が芳香族性の特性を有する、二環式基を含む。典型的には、環系は５～１２個の環員原子を含有する。例えば、単環式ヘテロアリールは５～６個の環員を含有してもよく、二環式ヘテロアリールは８～１０個の環員を含有する。
アリールおよびヘテロアリール部分は、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ２～Ｃ８アルキニル、Ｃ５～Ｃ１２アリール、Ｃ１～Ｃ８アシル、およびこれらのヘテロ形態を含む様々な置換基で置換されてもよく、これらの各々はそれ自体さらに置換されてもよい。アリールおよびヘテロアリール部分に対する別の置換基は、ハロ、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ２を含む。ここで、各々のＲは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２～Ｃ８アルキニル、Ｃ２～Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７～Ｃ１２アリールアルキル、またはＣ６～Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各々のＲは、アルキル基について上記のように任意に置換される。アリールまたはヘテロアリール基における置換基はもちろん、そのような置換基の各型に、または置換基の各構成要素に適するように、本明細書に記載の基でさらに置換されてもよい。したがって、例えば、アリールアルキル置換基は、アリール基に典型的なものとして、本明細書に記載の置換基でアリール部分において置換されてもよく、アルキル基に典型的なものとしてまたは適するものとして、本明細書に記載の置換基でアルキル部分においてさらに置換されてもよい。
同様に、「アリールアルキル」および「ヘテロアリールアルキル」は、芳香族およびヘテロ芳香族環系を指し、当該芳香族およびヘテロ芳香族環系は、置換または非置換、飽和または不飽和、環式または非環式リンカーを含む、アルキレンなどの連結基を介して、それらの結合点に結合している。典型的には、リンカーは、Ｃ１～Ｃ８アルキルまたはそのヘテロ形態である。これらのリンカーはまた、カルボニル基を含んでもよく、したがって、それらは、アシルまたはヘテロアシル部分として置換基を提供することができる。アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基における、アリールまたはヘテロアリール環は、アリール基について上記したのと同じ置換基で置換されていてもよい。例えば、アリールアルキル基は、フェニル環（アリール基について上記で定義された基で任意に置換されている）およびＣ１～Ｃ４アルキレン（非置換であるか、あるいは１つまたは２つのＣ１～Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換されており、ここでアルキル基またはヘテロアルキル基は任意に環化され、シクロプロパン、ジオキソラン、またはオキサシクロペンタンのような環を形成し得る）を含んでいる。同様に、ヘテロアリールアルキル基は、Ｃ５～Ｃ６単環式ヘテロアリール基（アリール基に典型的な置換基として上記されている基で任意に置換されている）およびＣ１～Ｃ４アルキレン（非置換であるか、あるいは１つまたは２つのＣ１～Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換されている）を含んでいる。または、ヘテロアリールアルキル基は、任意に置換されているフェニル環、もしくはＣ５～Ｃ６単環ヘテロアリール、およびＣ１～Ｃ４ヘテロアルキレン（非置換であるか、あるいは１つまたは２つのＣ１～Ｃ４アルキル基またはヘテロアルキル基で置換されており、ここでアルキル基またはヘテロアルキル基は任意に環化され、シクロプロパン、ジオキソラン、またはオキサシクロペンタンのような環を形成し得る）を含んでいる。
アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基が任意に置換されていると記載されている場合、置換基は、基のアルキルもしくはヘテロアルキル部分、または基のアリールまたはヘテロアリール部分のいずれかにあってもよい。アルキルまたはヘテロアルキル部分に任意に存在する置換基は、一般にアルキル基について上記したものと同じであり、アリールまたはヘテロアリール部分に任意に存在する置換基は、一般にアリール基について上記したものと同じである。
本明細書で使用される「アリールアルキル」基は、それらが非置換の場合にはヒドロカルビル基であり、環およびアルキレン、または類似のリンカーにおける、炭素原子の総数によって記載される。したがって、ベンジル基はＣ７－アリールアルキル基であり、また、フェニルエチルはＣ８－アリールアルキルである。
上記の「ヘテロアリールアルキル」は、連結基を介して結合するアリール基を含む部分を指し、アリール部分の少なくとも一つの環原子または連結基の一つの原子がＮ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子である点で「アリールアルキル」と異なる。ヘテロアリールアルキル基は、環および結合するリンカーの総原子数に応じて本明細書に記載され、ヘテロアルキルリンカーを介して結合するアリール基；アルキレンのようなヒドロカルビルリンカーを介して結合するヘテロアリール基；およびヘテロアルキルリンカーを介して結合するヘテロアリール基を含む。したがって、例えば、Ｃ７－ヘテロアリールアルキルは、ピリジルメチル、フェノキシ、およびＮ－ピロリルメトキシを含む。
本明細書で使用される「アルキレン」は、二価のヒドロカルビル基を指し、二価であるため、２つの別の基を一緒に連結し得る。典型的には、－（ＣＨ２）ｎ－（式中、ｎは１～８であり、例えばｎは１～４であるが、特定される場合、アルキレンは別の基で置換され得、他の長さであり得、開放原子価は鎖の両端にある必要はない）を指す。したがって、－ＣＨ（Ｍｅ）－および－Ｃ（Ｍｅ）２－は、シクロプロパン－１，１－ジイルなどの環状基と同様に、アルキレンとも呼ばれる。アルキレン基が置換される場合、置換基は、本明細書に記載されるようなアルキル基において典型的に存在する置換基を含む。
一般に、置換基に含まれる任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、もしくはアリールもしくはアリールアルキル基、またはこれらの基のうちの１つの任意のヘテロ形態は、それ自体、任意に追加の置換基によって置換されてもよい。これらの置換基の性質は、置換基が他に記載されていない場合、本来の置換基自体に関して列挙されたものと同様である。したがって、例えば、Ｒ２の実施形態がアルキルである場合、このアルキルは、化学的に意味があるＲ２の実施形態として列挙された残りの置換基によって、任意に置換されてもよく、これはアルキル自体に提供される大きさの制限を損なわない；例えば、アルキルまたはアルケニルによって置換されたアルキルは、これらの実施形態の炭素原子の上限値を単に拡張するだけであり、当該アルキルは含まれない。しかしながら、アリール、アミノ、アルコキシ、＝Ｏなどによって置換されたアルキルは本発明の範囲内に含まれ、これらの置換基の原子は、記載されているアルキル、アルケニルなどの基を記載するために使用する数には数えられない。置換基の数が特定されない場合、そのようなアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、またはアリール基の各々は、その利用可能な原子価に従って、いくつかの置換基で置換されてもよく；特に、例えば、これらの基のいずれかは、その利用可能な原子価のいずれかまたはすべてにおいて、フッ素原子で置換されてもよい。
様々な実施形態において、本発明は、哺乳動物における炎症に関連するような肝臓疾患を予防、阻害、または処置するための方法を提供する。この方法は、それを必要とする哺乳動物に、有効な量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む：
Figure 2022525608000004
ここで、Ｘ１は、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＮＲｃ－であり；
Ｒ１は、水素、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、Ｃ６～１０アリール、または置換Ｃ６～１０アリール、Ｃ５～９複素環式、置換Ｃ５～９複素環式であり；
Ｒｃは、水素、Ｃ１～１０アルキル、もしくは置換Ｃ１～１０アルキルであり；またはＲｃおよびＲ１は、結合する窒素と共に複素環式環もしくは置換複素環式環を形成し；
各Ｒ２は、独立して、－ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（アルカノイル）、置換－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１０）アリール（アロイル）、置換－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１０）アリール、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（アルコキシカルボニル）、置換－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、－ＮＲａＲｂ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（カルバモイル）、ハロ、ニトロ、もしくはシアノであるか、またはＲ２は欠如しており；
各ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル、置換（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ６）アルカノイル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルカノイル、アリール、アリール（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシカルボニルであり；
ここで、任意のアルキル基、アリール基、または複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１～６アルキル、ヒドロキシＣ１～６アルキレン、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～６シクロアルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロ、またはアリールであり；
ｎは、０、１、２、３、または４であり；
Ｘ２は、結合または連結基であり；および
一実施形態において、ＲＸは１つまたは２つのカルボン酸エステルを含むリン脂質であるか、もしくは－（Ｒ３）ｒ－（Ｒ４）ｓ）ｐを含み、Ｒ３は独立してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であり、Ｒ４は独立してＨ、－Ｃ１～Ｃ６アルキル、－Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、－ＮＲａＲｂ、－Ｎ３、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＲ１、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＮＲａＲｂ、Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＣＮ、Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＣＯＯＲ１、５～６員環、置換５～６員環、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－５～６員環、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－置換５～６員環、Ｃ２～Ｃ９複素環式、もしくは置換Ｃ２～Ｃ９複素環式であり、ここで、ｒは１～１０００であり、ｓは１～１００であり、ｐは１～１００であり；
もしくはその互変異性体であり；
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。
一実施形態において、Ｒ３は、ＰＥＧ部分である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ反応物は、構造ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｘ－ＮＨＳ＊を有し、ここで、Ｘは－ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＨ２ＣＯＯ－，および－（ＣＨ２）５ＣＯＯ－であり得る。特定の実施形態において、ＰＥＧ反応物は以下の構造、
Figure 2022525608000005
を有する。
いくつかの実施形態において、特定のＰＥＧ反応物は、二官能性である。いくつかの実施形態において、二官能性ＰＥＧ反応物の例としては、構造Ｘ－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－Ｘを有し、ここで、Ｘは（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）メチル（－ＣＨ２ＣＯＯ－ＮＨＳ）、スクシンイミジルグルタレート（－ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－ＮＨＳ）、（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル（－（ＣＨ２）５ＣＯＯ－ＮＨＳ）、３－（ｎ－マレイミジル）プロパンアミド、（－ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２－ＭＡＬ）、アミノプロピル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、または２－スルファニルエチル（－ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ）である。
特定の実施形態において、いくつかのＰＥＧ反応物は、ヘテロ官能性である。ヘテロ官能性ＰＥＧ反応物の例としては、以下の構造、
Figure 2022525608000006
を有する。ここで、いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）メチル（－ＣＨ２ＣＯＯ－ＮＨＳ）、スクシンイミジルグルタレート（－ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－ＮＨＳ）、（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル（－（ＣＨ２）５ＣＯＯ－ＮＨＳ）、３－（ｎ－マレイミジル）プロパンアミド、（－ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２－ＭＡＬ）、３－アミノプロピル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２－スルファニルエチル（－ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ）、５－（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル（－（ＣＨ２）５ＣＯＯ－ＮＨＳ）、またはｐ－ニトロフェニルオキシカルボニル、（－ＣＯ２－ｐ－Ｃ６Ｈ４ＮＯ２）であり得る。
特定の分岐ＰＥＧ反応物（例えば、以下の構造を有するもの）もまた、利用され得る：
Figure 2022525608000007
ここで、Ｘはスペーサーであり、Ｙは官能基であり、いくつかの実施形態においてマレイミド、アミン、グルタリル－ＮＨＳ、炭酸－ＮＨＳ、または炭酸－ｐ－ニトロフェノールを含むが、これらに限定されない。分岐鎖ＰＥＧ反応物の利点は、それらが持続放出特性を有するコンジュゲート産物を生じ得ることである。
特定の実施形態において、ＰＥＧ反応物はまた、以下のようなヘテロ官能性反応物、
Figure 2022525608000008
であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｂｏｃ＊－保護－アミノ－ＰＥＧ－カルボキシル－ＮＨＳまたはマレイミド－ＰＥＧ－カルボキシル－ＮＨＳ反応物を利用し得る。
特定の実施形態において、櫛形ポリマーをＰＥＧ反応物として利用して、いくつかのＰＥＧ単位をコンジュゲートに組み込むことができる。櫛形ポリマーの例を以下に示す。
Figure 2022525608000009
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ反応物および／またはＰＥＧコンジュゲート産物は、１モルあたり約５グラム～１モルあたり約１００，０００グラムの範囲の分子量を有し得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ反応物および／またはＰＥＧコンジュゲート産物は、１モルあたり約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、または９００００グラムの平均(average)分子量、平均(mean)分子量、または公称分子量を有する。いくつかの実施形態において、本明細書の化合物におけるＰＥＧ部分は均一であり、ＰＥＧ部分の分子量は化合物の特定の群の各分子について同じである（例えば、Ｒ３は１つのＰＥＧ単位であり、ｒは２～１０である）。
様々な実施形態において、式（Ｉ）中のＸ２は、結合、または鎖中に１～約１０個の原子を有する鎖であり得、ここで、鎖の原子は、炭素、窒素、硫黄、および酸素からなる群より選択され、ここで、任意の炭素原子はオキソで置換され得、そして任意の硫黄原子は１つまたは２つのオキソ基で置換され得る。鎖には、１つまたは複数のシクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール環を散在させ得る。
式（Ｉ）におけるＸ２の特定の例としては、－（Ｙ）ｙ－、－（Ｙ）ｙ－Ｃ（Ｏ）Ｎ－（Ｚ）ｚ－、－（ＣＨ２）ｙ－Ｃ（Ｏ）Ｎ－（ＣＨ２）ｚ－、－（Ｙ）ｙ－ＮＣ（Ｏ）－（Ｚ）ｚ－、－（ＣＨ２）ｙ－ＮＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｚ－が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、各々のｙ（添え字）およびｚ（添え字）は、それぞれ独立して、０～２０であり、かつ、各々のＹおよびＺは、独立して、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３～Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３～Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５～Ｃ１０アリール、置換Ｃ５～Ｃ１０アリール、Ｃ５～Ｃ９複素環式、置換Ｃ５～Ｃ９複素環式、Ｃ１～Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、ＨｅｔＣ１～Ｃ６アルキル、またはＣ１～Ｃ６アルコキシカルボニルである。ここで、アルキル基、シクロアルキル基、アルカノイル基、アルコキシカルボニル基、Ｈｅｔ基、アリール基、または複素環式基における置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ１０アルキレン、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ３～Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５～Ｃ９複素環式、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである。特定の実施形態において、リンカーは、－Ｃ（Ｙ’）（Ｚ’）－Ｃ（Ｙ’’）（Ｚ’’）－リンカーの場合があり、ここで、各々のＹ’、Ｙ’’、Ｚ’、およびＺ’’は、独立して、水素Ｃ１～Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３～Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３～Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５～Ｃ１０アリール、置換Ｃ５～Ｃ１０アリール、Ｃ５～Ｃ９複素環式、置換Ｃ５～Ｃ９複素環式、Ｃ１～Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、ＨｅｔＣ１～Ｃ６アルキル、またはＣ１～Ｃ６アルコキシカルボニルである。ここで、アルキル基、シクロアルキル基、アルカノイル基、アルコキシカルボニル基、Ｈｅｔ基、アリール基、または複素環式基における置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ１０アルキレン、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ３～Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５～Ｃ９複素環式、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲン、またはアリールである。
式（Ｉ）のＸ２の別の具体的な価は、
Figure 2022525608000010
である。
Ｘ２の別の具体的な価は、
Figure 2022525608000011
である。
様々な実施形態において、Ｘ２は、Ｃ（Ｏ）または以下のいずれか
Figure 2022525608000012
であり得る。
様々な実施形態において、式（Ｉ）におけるＸ１は、酸素であり得る。
様々な実施形態において、式（Ｉ）におけるＸ１は、硫黄または－ＮＲｃ－であり得る。ここで、Ｒｃは水素、Ｃ１～６アルキル、または置換Ｃ１～６アルキルであり、アルキルの置換基はヒドロキシ、Ｃ３～６シクロアルキル、Ｃ１～６アルコキシ、アミノ、シアノ、またはアリールである。より具体的には、Ｘ１は－ＮＨ－であり得る。
様々な実施形態において、式（Ｉ）におけるＲ１およびＲｃは一緒になって、複素環式環もしくは置換複素環式環を形成し得る。より具体的には、Ｒ１およびＲｃは一緒になって、置換または非置換モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ、またはピペラジノ環を形成し得る。
様々な実施形態において、式（Ｉ）におけるＲ１は、Ｃ１～６アルコキシで置換されたＣ１～Ｃ１０アルキルであり得る。
様々な実施形態において、式（Ｉ）におけるＲ１は、水素、Ｃ１～４アルキル、または置換Ｃ１－４アルキルであり得る。より具体的には、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヒドロキシＣ１～４アルキレン、またはＣ１～４アルコキシＣ１～４アルキレンであり得る。さらにより具体的には、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、メトキシエチル、またはエトキシエチルであり得る。
様々な実施形態において、式（Ｉ）におけるＲ２は欠如し得、またはＲ２はハロゲンもしくはＣ１～４アルキルであり得る。より具体的には、Ｒ２は、クロロ、ブロモ、メチル、またはエチルであり得る。
一実施形態において、式（Ｉ）におけるＲｘは、（（Ｒ３）ｒ－（Ｒ４）ｓ）ｐ、またはＲ３である。一実施形態において、Ｒ３は、ＰＥＧ部分またはＰＥＧ部分の誘導体である。特定の実施形態において、Ｒ３は、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－である。一実施形態において、ＰＥＧ部分は、１つまたは複数のＰＥＧ単位を含み得る。ＰＥＧ部分は、約１～約１，０００個のＰＥＧ単位を含み得、いくつかの実施形態において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００個の単位であるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＰＥＧ部分は、約１から５～最大約２５個のＰＥＧ単位、約１から５～最大約１０個のＰＥＧ単位、約１０～最大約５０個のＰＥＧ単位、約１８～最大約５０個のＰＥＧ単位、約４７～最大約１５０個のＰＥＧ単位、約１１４～最大約３５０個のＰＥＧ単位、約２７１～最大約５５０個のＰＥＧ単位、約４７２～最大約９５０個のＰＥＧ単位、約５０～最大約１５０個のＰＥＧ単位、約１２０～最大約３５０個のＰＥＧ単位、約２５０～最大約５５０個のＰＥＧ単位、または約６５０～最大約９５０個のＰＥＧ単位を含み得る。特定の実施形態において、ＰＥＧ単位は、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｈ、－Ｃ１～Ｃ６アルキル、－Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、－ＮＲａＲｂ、－Ｎ３、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＲ１、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＮＲａＲｂ、Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＣＮ、Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＣＯＯＲ１、５～６員環、置換５～６員環、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－５～６員環、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－置換５～６員環Ｃ２～Ｃ９複素環式、または置換Ｃ２～Ｃ９複素環式である。
いくつかの実施形態において、ｒは約５～約１００であり、時にはｒは約５～約５０または約５～約２５である。特定の実施形態において、ｒは約５～約１５であり、時にはｒは約１０である。いくつかの実施形態において、Ｒ３はＰＥＧ単位（ＰＥＧ）ｒであり、ｒは約２～約１０（例えば、ｒは約２～約４）または約１８～約５００である。
いくつかの実施形態においてｓは約５～約１００であり、時にはｓは約５～約５０または約５～約２５である。特定の実施形態において、ｓは約５～約１５であり、時にはｓは約１０である。いくつかの実施形態において、ｓは約５またはそれ未満である（例えば、ｓは１である）。いくつかの実施形態において、（Ｒ３）ｒ置換基は直線状であり、特定の実施形態において、（Ｒ３）ｒ置換基は分岐している。直線状部分の場合、ｓはｒより小さい場合（例えば、Ｒ３が－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－の場合）があり、時にはｓは１である。いくつかの実施形態において、Ｒ３は直線状ＰＥＧ部分（例えば、約１～約１０００個のＰＥＧ単位を有する）であり、ｓは１であり、ｒは１である。分岐部分の場合、ｓはｒより小さいか、ｒより大きいか、またはｒと等しい場合（例えば、Ｒ３が－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－の場合）があり、時にはｒは１であり、ｓは１であり、ｐは約１から約１０００である（例えば、ｐが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００である）。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－であり、ｒは約１～約１０００（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００）である。
特定の実施形態において、Ｘ２は、アミド連結基（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－）；アルキルアミド連結基（例えば、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ１～Ｃ６アルキル－、－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－Ｃ１～Ｃ６アルキル－、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－－ＮＨ（Ｏ）Ｃ－Ｃ１～Ｃ６アルキル－、－Ｃ１～Ｃ６アルキル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｃ１～Ｃ６アルキル－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－（ＣＨ２）ｔ－であり、ここでｔは１、２、３、または４である）；置換５～６員環（例えば、アリール環、ヘテロアリール環（例えば、テトラゾール、ピリジル、２，５－ピロリジンジオン（例えば、置換フェニル部分で置換された２，５－ピロリジンジオン））、炭素環式環、または複素環式環）、または酸素含有部分（例えば、－Ｏ－、－Ｃ１～Ｃ６アルコキシ）である。
本明細書で使用される用語「リン脂質」は、下記一般式で表され、グリセロールヒドロキシル基に結合したリン酸基を有するグリセロールモノ－またはジエステルを指し、リン酸基にエステルとして結合しているアルカノールアミン基を有し、
Figure 2022525608000013
ここで、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素またはアシル基であり、Ｒ１３は、ｐＨに依存して、負電荷または水素である。Ｒ１３が負電荷である場合、ナトリウムイオンのような適切な対イオンが存在し得る。例えば、アルカノールアミン部分は、ｍ＝１であるようなエタノールアミン部分であり得る。ＮＨ基は、ｐＨに依存して、プロトン化され、正に荷電されるか、またはプロトン化されず、中性であり得ることも理解されたい。例えば、リン脂質は、負に荷電したリン酸オキシアニオンおよび正に荷電したプロトン化窒素原子を有する双性イオンとして存在し得る。ＯＲ１２を有する炭素原子はキラル炭素原子であるので、分子はＲ異性体、Ｓ異性体、またはそれらの任意の混合物として存在し得る。式（ＩＩ）の化合物のサンプルにおいて等量のＲおよびＳ異性体がある場合、サンプルを「ラセミ体」と呼ぶ。例えば、市販品１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンにおいて、Ｒ３基はキラル構造
Figure 2022525608000014
であり、これはＲ絶対配置のものである。
リン脂質は、遊離分子であるか、例えば以下に示されるように別の基に共有結合され得、
Figure 2022525608000015
ここで、波線は結合点を示す。
したがって、本明細書における式（Ｉ）の化合物のＲｘのような置換基が、リン脂質であると述べられている場合、これは、リン脂質基が本明細書中に開示されるようなＮ－ベンジル複素環式系のような別の基に、その構造によって特定されるように結合されることを意味する。リン脂質基の結合点は特に指定しない限り、構造的描写などによって、任意の化学的に実現可能な位置にあり得る。例えば、上記のリン脂質構造において、別の化学部分への結合点は、エタノールアミン窒素原子（例えば、他の化学部分のカルボニル基に結合することによるアミド基（例えば、
Figure 2022525608000016
ここで、Ｒは、リン脂質が結合される他の化学部分を表す））を介し得る。この結合したアミド誘導体において、Ｒ１３基は、陽子であり得るか、またはナトリウムイオンのような対イオンに関連した負電荷であり得る。アルカノールアミン基のアシル化窒素原子はもはや塩基性アミンではなく、電気的に中性アミドであり、それ自体、生理学的ｐＨでプロトン化されない。
「アシル」基は、当該用語が本明細書中で使用される場合、カルボニル基を有する有機構造を指し、これを介して、構造は、例えば、リン脂質のグリセロールヒドロキシル基に結合し、「カルボン酸エステル」基を形成する。アシル基の例としては、オレオイル基のような脂肪酸基が挙げられ、かくして、グリセロールヒドロキシル基と脂肪（例えば、オレオイル）エステルを形成する。したがって、Ｒ１１またはＲ１２の一方（両方ではない）がアシル基である場合、上述したリン脂質はモノ－カルボン酸エステルであり、Ｒ１１およびＲ１２の両方がアシル基である場合、上述したリン脂質はジ－カルボン酸エステルである。
一実施形態において、Ｒｘのリン脂質は２つのカルボン酸エステルを含み、それぞれのカルボン酸エステルは、不飽和、エポキシ化、ヒドロキシル化、またはそれらの組み合わせの１つ、２つ、３つ、または４つの部位を含む。
一実施形態において、Ｒｘのリン脂質は２つのカルボン酸エステルを含み、カルボン酸エステルは、同じであるかまたは異なっている。
一実施形態において、リン脂質の各カルボン酸エステルは、Ｃ８～Ｃ９に不飽和部位を有するＣ１７カルボン酸エステルである。
一実施形態において、リン脂質の各カルボン酸エステルは、Ｃ９～Ｃ１０に不飽和部位を有するＣ１８カルボン酸エステルである。
一実施形態において、Ｘ２は結合、または鎖中に１～約１０個の原子を有する鎖であり、鎖の原子は炭素、窒素、硫黄、および酸素からなる群から選択される（任意の炭素原子はオキソで置換され得、任意の硫黄原子は１つまたは２つのオキソ基で置換され得る）。
一実施形態において、Ｘ２は、Ｃ（Ｏ）、
Figure 2022525608000017
である。
一実施形態において、Ｒｘはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
一実施形態において、Ｒｘは１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンであり、Ｘ２はＣ（Ｏ）である。
一実施形態において、Ｘ１は、酸素または－ＮＨ－である。
一実施形態において、Ｒ１およびＲｃは一緒になって、複素環式または置換複素環式を形成し、例えば、置換または非置換モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ、またはピペラジノ環を形成する。
一実施形態において、Ｒ１はＣ１～６アルコキシで置換されたＣ１～Ｃ１０アルキルであり、Ｒ１は水素、Ｃ１～４アルキル、または置換Ｃ１～４アルキルであるか、Ｒ１は水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヒドロキシＣ１～４アルキレン、またはＣ１～４アルコキシＣ１～４アルキレンであるか、あるいはＲ１は水素、メチル、エチル、メトキシエチル、またはエトキシエチルである。
一実施形態において、組成物は、ある量の抗原をさらに含む。
様々な実施形態において、哺乳動物は、ヒトであり得る。
様々な実施形態において、組成物は、鼻腔内投与され得るか、または経皮投与され得るか、あるいは全身投与され得る。
〔ＴＬＲ４リガンド〕
ＴＬＲ４リガンドに関して本明細書中で使用される場合、用語「アルキル」は、単体で、または別の置換基の一部として、別段の記載がない限り、直鎖（すなわち、分岐していない）もしくは分岐鎖、またはそれらの組み合わせ（完全に飽和、一価不飽和、または多価不飽和であってもよく、指定された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１～Ｃ１０は１～１０個の炭素を意味する）二価および多価ラジカルを含むことができる）を意味する。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｔ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、（シクロヘキシル）メチル基などの基、例えばｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基などの相同体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２－プロペニル、クロチル、２－イソペンテニル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、エチニル、１－および３－プロピニル、３－ブチニル、ならびにより高い相同体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。アルコキシは、酸素リンカー（－Ｏ－）を介して分子の残りに結合したアルキルである。
用語「アルキレン」は単体で、または別の置換基の一部として、別段の記載がない限り、アルキルから誘導される二価ラジカルを意味し、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－が挙げられるが、これに限定されない。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１～２４個の炭素原子を有する。一実施形態において、これらの基は、１０個またはそれより少ない炭素原子を有する。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個またはそれより少ない炭素原子を有する、より短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
用語「ヘテロアルキル」は単体で、または別の用語と組み合わせることにより、特に断りがない限り、安定した直鎖もしくは分岐鎖、またはその組み合わせ（少なくとも１つの炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、およびＳから成る群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（ここで、窒素原子および硫黄原子は任意に酸素化され、窒素ヘテロ原子は任意に四価となる）から成る）を意味する。ヘテロ原子０、Ｎ、Ｐ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置、またはアルキル基が分子の残りに結合される位置に配置することができる。例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ３、－Ｓｉ（ＣＨ３）３、－ＣＨ２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－Ｏ－ＣＨ３、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３、および－ＣＮ。最大２個までのヘテロ原子が連続していてもよく、例えば、－ＣＨ２－ＮＨ－ＯＣＨ３である。
用語「ヘテロアルキレン」は単体で、または別の置換基の一部として、別段の記載がない限り、ヘテロアルキルから誘導される二価ラジカル（例えば、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－および－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－が挙げられるが、これらに限定されない）を意味する。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子はまた、鎖末端の一方または両方を占め得る（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。なお、さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、連結基の式が書かれている方向は、連結基の配向を含意しない。例えば、式－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－および－Ｒ’Ｃ（Ｏ）２－の両方を表す。上記のように、本明細書で使用されるヘテロアルキル基は、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＯＲ’、－ＳＲ’、および／または－ＳＯ２Ｒ’などのヘテロ原子を介して、分子の残りに結合する基を含む。「ヘテロアルキル」を列挙し、続いて－ＮＲ’Ｒ’’などの特定のヘテロアルキル基を列挙する場合、用語ヘテロアルキルおよび－ＮＲ’Ｒ’’は、重複または相互排他的ではないことが理解されるであろう。むしろ、特定のヘテロアルキル基は、明確さを増すために列挙されている。したがって、本明細書において用語「ヘテロアルキル」は、－ＮＲ’Ｒ’’などの特定のヘテロアルキル基を除外するものと解釈すべきではない。
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は単体で、または他の用語と組み合わせることにより、別段の記載がない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式バージョンを意味する。さらに、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、複素環式が分子の残りに結合する位置を占め得る。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」は、単独でまたは別の置換基の一部として、それぞれシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。
用語「ハロ」または「ハロゲン」は単体、または別の置換基の一部として、別段の記載がない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、用語「ハロ（Ｃ１～Ｃ４）アルキル」は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２－トリフルオロエチル、４－クロロブチル、３－ブロモプロピルなどを含むが、これらに限定されない。
用語「アシル」は、別段の記載がない限り、－Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、ここで、Ｒは置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを意味する。
用語「アリール」は、別段の記載がない限り、単一環または複数環（例えば、１～３環であり、共に縮合しているか（すなわち、縮合環アリール）または共有連結している）であり得る、多不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味する。縮合環アリールは、共に縮合した１５個の複数環を指し、ここで、縮合環のうちの少なくとも１つは、アリール環である。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子（ここで、窒素原子および硫黄原子は任意に酸素化され、窒素原子は任意に四価となる）を含有する、アリール基（または環）を指す。したがって、用語「ヘテロアリール」は、縮合環ヘテロアリール基を含む（すなわち、複数環は共に縮合し、縮合環の少なくとも１つがヘテロ芳香族環である）。５，６－縮合環ヘテロアリーレンは、共に縮合した２つの環を指す（ここで、一方の環は５員を有し、他方の環は６員を有し、そして、少なくとも１つの環がヘテロアリール環である）。同様に、６，６－縮合環ヘテロアリーレンは、共に縮合した２つの環を指す（ここで、一方の環は６員を有し、他方の環は６員を有し、そして少なくとも１つの環がヘテロアリール環である）。また、６，５－縮合環ヘテロアリーレンは、共に縮合した２つの環を指す（ここで、一方の環は６員を有し、他方の環は５員を有し、そして、少なくとも１つの環がヘテロアリール環である）。ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合し得る。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、４－ビフェニル、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンゾイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、および６－キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれの置換基は、以下に記載される許容される置換基の群から選択される。「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」単独で、または別の置換基の一部として、それぞれアリールおよびヘテロアリールから誘導される二価ラジカルを意味する。
簡潔にするために、用語「アリール」は、他の用語と組み合わせて使用する場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記で定義されたアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。したがって、用語「アリールアルキル」は、アルキル基にアリール基が結合したそれらのラジカル（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含み、および炭素原子（例えば、メチレン基）が例えば酸素原子によって置換されているそれらのアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２－ピリジルオキシメチル、３－（１－ナフチルオキシ）プロピルなど）を含むことを意味する。
用語「オキソ」は、本明細書で使用される場合、炭素原子に二重結合している酸素を意味する。
用語「アルキルスルホニル」は、本明細書で使用される場合、式－Ｓ（Ｏ２）－Ｒ’を有する部分を意味し、ここで、Ｒ’は上記で定義されたアルキル基である。Ｒ’は、特定の個数の炭素を有し得る（例えば、「Ｃ１－Ｃ４アルキルスルホニル」）。
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）の各々は、示されたラジカルの置換形態および非置換形態の両方を含む。
アルキルラジカルまたはヘテロアルキルラジカル（アルキレン基、アルケニル基、ヘテロアルキレン基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、シクロアルケニル基、およびヘテロシクロアルケニル基を含む）の置換基は、０から（２ｍ’＋１）の範囲の数（ここで、ｍ’はラジカル中の炭素原子の総数である）において、－ＯＲ’、＝０、＝ＮＲ’、＝Ｎ－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲＳＯ２Ｒ’、－ＣＮ、および－ＮＯ２から選択される様々な基の１つまたは複数であり得るが、これらに限定されない。一実施形態において、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素基、置換もしくは非置換ヘテロアルキル基、置換もしくは非置換シクロアルキル基、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル基、置換もしくは非置換アリール基（例えば、１～３個のハロゲンで置換されたアリール基）、置換もしくは非置換アルキル基、アルコキシ基、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、例えば、２つ以上の基が存在する場合、各Ｒ基は、独立して、それぞれＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基として選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合する場合、それらは窒素原子と組み合わさって４－、５－、６－、または７－員環を形成し得る。例えば、－ＮＲ’Ｒ’’としては、１－ピロリジニルおよび４－モルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。置換基についての上記の議論から、用語「アルキル」はハロアルキル（例えば、－ＣＦ３および－ＣＨ２ＣＦ３）ならびにアシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの水素基以外の基に結合した炭素原子を有する基を含むことを意味することを、当業者は理解するであろう。
アルキルラジカルについて記載した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基の置換基は、様々であり、０から芳香族環系における開放原子価の総数の範囲の数において、例えば、－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲＳＯ２Ｒ’、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｒ’、－Ｎ３、－ＣＨ（Ｐｈ）ｚ、フルオロ（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１～Ｃ４）アルキルから選択される。一実施形態において、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、独立して、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、例えば、２つ以上の基が存在する場合、各Ｒ基は、独立して、それぞれＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基として選択される。
２個またはそれより多い置換基は任意に、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、またはヘテロシクロアルキル基を形成してもよい。このようないわゆる環形成置換基は、必須ではないが、典型的には環式塩基構造に結合して見出される。一実施形態において、環形成置換基は、塩基構造の隣接する員に結合される。例えば、環式塩基構造の隣接する員に結合した２つの環形成置換基は、縮合環構造を作り出す。別の実施形態において、環形成置換基は、塩基構造の単一員に結合される。例えば、環式塩基構造の単一員に結合した２つの環形成置換基は、スピロ環式構造を作り出す。さらに別の実施形態において、環形成置換基は、塩基構造の隣接しない員に結合される。
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子における２つの置換基は、任意に、式－Ｔ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＲＲ’）ｑ－Ｕ－（ここで、ＴおよびＵは独立して、－ＮＲ－、－Ｏ－、－ＣＲＲ’－、または単結合であり、ｑは０～３の整数である）の環を形成してもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子における２つの置換基は、任意に、式－Ａ－（ＣＨ２）ｒ－Ｂ－（ここで、ＡおよびＢは独立して、－ＣＲＲ’－、－Ｏ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’－または単結合であり、ｒは１～４の整数である）の置換基で置換されていてもよい。そのように形成された新しい環の単結合の１つは、任意に二重結合によって置換されていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子における２つの置換基は、任意に、式－（ＣＲＲ’）ｓ－Ｘ’（Ｃ’’Ｒ’’’）ｄ－（ここで、ｓおよびｄは独立して、０～３の整数であり、Ｘ’は－Ｏ－、－ＮＲ’－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、または－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’－である）の置換基で置換されていてもよい。一実施形態において、置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、独立して、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択される。
本明細書で使用される用語「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。
「置換基」は、本明細書で使用される場合、以下の部分から選択される基を意味する：
（Ａ）－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＮＯ２、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに
（Ｂ）アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールであり、これらは以下から選択される少なくとも１つの基で置換されている：（ｉ）オキソ、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＮＯ２、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに（ｉｉ）アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールであり、これらは以下から選択される少なくとも１つの基で置換されている：（ａ）オキソ、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＮＯ２、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに（ｂ）アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、これらは以下から選択される少なくとも１つの基で置換されている：オキソ、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＮＯ２、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、および非置換ヘテロアリール。
「サイズ制限置換基(size-limited substituent)」または「サイズ制限置換基(size-limited substituent group)」は、本明細書中で使用される場合、「置換基」について上記される置換基のすべてから選択される基を意味する（ここで、置換または非置換アルキルの各々は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２０アルキルであり、置換または非置換ヘテロアルキルの各々は、置換または非置換２～２０員ヘテロアルキルであり、置換または非置換シクロアルキルの各々は、置換または非置換Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルであり、置換または非置換ヘテロシクロアルキルの各々は、置換または非置換４～８員ヘテロシクロアルキルである）。
「低級置換基(lower substituent)」または「低級置換基(lower substituent group)」は、本明細書中で使用される場合、「置換基」について上記される置換基のすべてから選択される基を意味する（ここで、例えば、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ８アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２～８員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ５～Ｃ７シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換５～７員ヘテロシクロアルキルである。）
いくつかの実施形態において、本明細書の化合物において記載される各置換基は、少なくとも１つの置換基で置換される。より具体的には、いくつかの実施形態において、本明細書の化合物において記載される、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレンの各々は、少なくとも１つの置換基で置換される。他の実施形態において、これらの基の少なくとも１つまたはすべては、少なくとも１つのサイズ制限置換基で置換される。他の実施形態において、これらの基の少なくとも１つまたはすべては、少なくとも１つの低級置換基で置換される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される化合物は、多数の置換基の例（例えば、Ｒ５、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ６Ａ、Ｒ６Ｂ、Ｒ６Ｃ、Ｒ７、Ｒ７Ａ、Ｒ７Ｂ、Ｒ７Ｃ、Ｒ８、Ｒ８Ａ、Ｒ８Ｂ、および／またはＲ８Ｃ）を含んでもよい。そのような実施形態において、各置換基は、任意に、各存在で異なっていてもよく、適宜標識することによって各基を区別し、より明確にしてもよい。例えば、各Ｒ５Ａが異なっている場合、それらは例えば、Ｒ５Ａ．１、Ｒ５Ａ．２、Ｒ５Ａ．３、Ｒ５Ａ．４、Ｒ５Ａ．５として参照することができる。同様に、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ６Ａ、Ｒ６Ｂ、Ｒ６Ｃ、Ｒ７、Ｒ７Ａ、Ｒ７Ｂ、Ｒ７Ｃ、Ｒ８、Ｒ８Ａ、Ｒ８Ｂ、および／またはＲ８Ｃのいずれかが複合的に存在する場合、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ６Ａ、Ｒ６Ｂ、Ｒ６Ｃ、Ｒ７、Ｒ７Ａ、Ｒ７Ｂ、Ｒ７Ｃ、Ｒ８、Ｒ８Ａ、Ｒ８Ｂ、および／またはＲ８Ｃの各々の存在の定義は、それぞれ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ６Ａ、Ｒ６Ｂ、Ｒ６Ｃ、Ｒ７、Ｒ７Ａ、Ｒ７Ｂ、Ｒ７Ｃ、Ｒ８、Ｒ８Ａ、Ｒ８Ｂ、および／またはＲ８Ｃの定義を想定する。
一態様において、式（ＩＩ）を有する化合物：
Figure 2022525608000018
またはその薬学的に許容される塩が提供される。式（ＩＩ）において、ｚ１は０～４の整数であり、ｚ２は０～５の整数であり、Ｒ５は置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ６は置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ７は水素、または置換もしくは非置換アルキルであり、Ｒ８は独立してハロゲン、－ＣＮ、－ＳＨ、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、ニトロ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
一実施形態において、Ｒ５はＲ５Ａ－置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ５Ａ置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ５Ａ置換もしくは非置換アリール、またはＲ５Ａ置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ５Ａは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、Ｒ５Ｂ－置換もしくは非置換アルキル、Ｒ５Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロアルキル、Ｒ５Ｂ－置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ５Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ５Ｂ－置換もしくは非置換アリール、またはＲ５Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ５Ｂは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、Ｒ５Ｃ－置換もしくは非置換アルキル、Ｒ５Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロアルキル、Ｒ５Ｃ－置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ５Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ５Ｃ－置換もしくは非置換アリール、またはＲ５Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ５Ｃは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。
さらに、本実施形態によれば、Ｒ６は、Ｒ６Ａ－置換もしくは非置換アルキル、Ｒ６Ａ置換もしくは非置換ヘテロアルキル、Ｒ６Ａ置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ６Ａ置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ６Ａ置換もしくは非置換アリール、またはＲ６Ａ置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ６Ａは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、Ｒ６Ｂ－置換もしくは非置換アルキル、Ｒ６Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロアルキル、Ｒ６Ｂ－置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ６Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ６Ｂ－置換もしくは非置換アリール、または１０Ｒ６Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ６Ｂは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、Ｒ６Ｃ－置換もしくは非置換アルキル、Ｒ６Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロアルキル、Ｒ６Ｃ－置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ６Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ６Ｃ－置換もしくは非置換アリール、またはＲ６Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ６Ｃは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。
さらに、本実施形態によれば、Ｒ７は、水素、またはＲ７Ａ－置換もしくは非置換アルキルである。Ｒ７Ａは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。
本実施形態に加えて、Ｒ８は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＳＨ、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、ニトロ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、Ｒ８Ａ－置換もしくは非置換アルキル、Ｒ８Ａ－置換もしくは非置換ヘテロアルキル、Ｒ８Ａ置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ８Ａ－置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ８Ａ置換もしくは非置換アリール、またはＲ８Ａ－置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ８Ａは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、Ｒ８Ｂ－置換もしくは非置換アルキル、Ｒ８Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロアルキル、Ｒ８Ｂ－置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ８Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ８Ｂ－置換もしくは非置換アリール、またはＲ８Ｂ－置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ８Ｂは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、Ｒ８Ｃ－置換もしくは非置換アルキル、８４Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロアルキル、Ｒ８Ｃ－置換もしくは非置換シクロアルキル、Ｒ８Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、Ｒ８Ｃ－置換もしくは非置換アリール、またはＲ８Ｃ－置換もしくは非置換ヘテロアリールである。Ｒ８Ｃは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＯ２、－ＣＯＯＨ、オキソ、ニトロ、－ＳＨ、－ＣＯＮＨ２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。
別の態様において、上記に開示される式（ＩＩ）の化合物が提供されるが、ただし：（ｉ）式（ＩＩ）の化合物は、
Figure 2022525608000019
ではなく、ここで、Ｒ５は、ｐ－フルオロフェニルもしくはｐ－メチルフェニルであるか；（ｉｉ）該化合物は、
Figure 2022525608000020
ではなく、ここで、Ｒ６は、非置換アリール、非置換シクロヘキシル、非置換チアゾール、もしくは－ＣＨ２－フラニルであるか；または（ｉｉｉ）Ｒ７は、水素ではない。
上記に開示される任意の態様に加えて、一実施形態では、Ｒ５は、置換フェニルではない。一実施形態において、Ｒ５は、ｐ－フルオロフェニルおよびｐ－メチルフェニルではない。
一実施形態において、化合物は、Ｒ６が置換フェニルである式（ＩＩａ）の構造を有さない。一実施形態において、化合物は、Ｒ６がｐ－フルオロフェニルまたはｐ－メチルフェニルである式（ＩＩａ）の構造を有さない。
上記に開示される任意の態様に加えて、一実施形態では、Ｒ６は、置換もしくは非置換アリール、非置換シクロヘキシル、非置換チアゾール、および－ＣＨ２－フラニルではない。一実施形態において、化合物は、Ｒ６が置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換シクロヘキシル、置換もしくは非置換チアゾール、または置換もしくは非置換フラニルで置換されたアルキルである、式（ＩＩｂ）の構造を有さない。一実施形態において、Ｒ６は、非置換アリール、非置換シクロヘキシル、非置換チアゾール、および－ＣＨ２－フラニルではない。
上記に開示される任意の態様に加えて、一実施形態では、Ｒ５は、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換アリールである。一実施形態において、Ｒ５は、非置換シクロアルキルまたは非置換アリールである。
一実施形態において、Ｒ５は、置換もしくは非置換Ｃ６～Ｃ８シクロアルキルまたは置換もしくは非置換フェニルである。一実施形態において、Ｒ５は、置換または非置換Ｃ６、シクロアルキル、または置換もしくは非置換フェニルである。
一実施形態において、Ｒ５はＲ５Ａ－置換もしくは非置換Ｃ６シクロアルキルまたはＲ５Ａ置換もしくは非置換フェニルであり、ここで、Ｒ５Ａはハロゲンである。一実施形態において、Ｒ５はＲ５Ａ－置換または非置換フェニルであり、ここで、Ｒ５Ａはハロゲンである。一実施形態において、Ｒ５はＲ５Ａ－置換または非置換フェニルであり、ここで、Ｒ５Ａはフルオロである。一実施形態において、Ｒ５は非置換フェニルである。
上記に開示される任意の態様に加えて、一実施形態では、化合物は、Ｒ６が置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換シクロヘキシル、置換もしくは非置換チアゾール、または置換もしくは非置換フラニルで置換されたアルキルである、式（Ｉｂ）の構成を有さない。
一実施形態において、Ｒ６は、置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２シクロアルキル、置換もしくは非置換Ｃ３～Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。一実施形態において、Ｒ６は、置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２シクロアルキル、置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。一実施形態において、Ｒ６は、置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２シクロアルキル、置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２分岐アルキル、または置換もしくは非置換フェニルである。一実施形態において、Ｒ６は、Ｒ６Ａ－置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２シクロアルキル、Ｒ６Ａ－置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２分岐アルキル、またはＲ６Ａ置換もしくは非置換フェニルであり、ここで、Ｒ６Ａはハロゲンである。一実施形態において、Ｒ６は、Ｒ６Ａ－置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２シクロアルキル、Ｒ６Ａ－置換もしくは非置換Ｃ４～Ｃ１２分岐アルキル、またはＲ６Ａ－置換もしくは非置換フェニルであり、ここで、Ｒ６Ａはフルオロである。一実施形態において、Ｒ６は、非置換Ｃ４～Ｃ１２シクロアルキル、非置換Ｃ４～Ｃ１２分岐アルキル、またはＲ６Ａ－置換もしくは非置換フェニルであり、ここで、Ｒ６Ａはフルオロである。一実施形態において、Ｒ６は、非置換Ｃ６～Ｃ１２シクロアルキル、非置換Ｃ４～Ｃ１２分岐アルキル、または非置換フェニルである。一実施形態において、Ｒ６は、非置換Ｃ６～Ｃ１０シクロアルキルである。一実施形態において、Ｒ６は、非置換Ｃ６～Ｃ８シクロアルキルである。一実施形態において、Ｒ６は、非置換シクロヘキシルである。
一実施形態において、Ｒ７は水素または置換もしくは非置換アルキルである。１つの３０実施形態において、Ｒ７は水素または非置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ７は水素または非置換Ｃ１～Ｃ３アルキルである。一実施形態において、Ｒ７は水素、メチル、またはエチルである。一実施形態において、Ｒ３はメチルである。一実施形態において、Ｒ７はエチルである。一実施形態では、Ｒ７は水素である。
一実施形態において、ｚｌは０、１、２、３、または４である。一実施形態において、ｚｌは０または１である。一実施形態では、ｚｌは０である。一実施形態において、ｚｌは１である。一実施形態において、ｚ２は０、１、２、３、４、または５である。一実施形態において、ｚ２は１である。
一実施形態において、Ｒ８は、独立して、置換または非置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ８は、独立して、置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ８は、独立して、非置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ８は、独立して、置換または非置換ヘテロアルキルである。一実施形態において、Ｒ８は、独立して、置換ヘテロアルキルである。一実施形態において、Ｒ８は、独立して、非置換ヘテロアルキルである。一実施形態において、Ｒ８は、独立して、置換または非置換アリールである。一実施形態において、Ｒ８は、独立して、置換または非置換ヘテロアリールである。
Figure 2022525608000021
式（ＩＩｃ）（上記）について、Ｒ６は、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換シクロアルキルであり；Ｒ７は、置換もしくは非置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ６は非置換シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル、シクロヘプチル、またはシクロオクチル）である。一実施形態において、Ｒ６は非置換アルキル（例えば、３，３－ジメチルブチル）である。一実施形態において、Ｒ７は非置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ１０はアルキルエステルである。
別の態様において、式（ＩＩｄ）
Figure 2022525608000022
を有する化合物が提供される。
式（ＩＩｄ）について、Ｌ２はリンカーであり、Ｂ１はプリン塩基またはその類似体である。
一実施形態において、Ｌ２は置換もしくは非置換アルキレン、または置換もしくは非置換ヘテロアルキレンである。一実施形態において、Ｌ２は水溶性ポリマーを含む。「水溶性ポリマー」は、当技術分野で知られているように、生理学的条件下（例えば、温度、イオン濃度など）において、水に十分に溶解するポリマーを意味し、本明細書に記載の方法に有用である。例示的な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。
一実施形態において、水溶性ポリマーは、－（０Ｃ２ＣＨ２）ｍ－であり、ここで、ｍは１～１００である。一実施形態において、Ｌ２は開裂要素を含む。「開裂要素」は、化合物を放出するために開裂（例えば、加水分解）を受け得る化学官能基であり、リンカーＬ２の残留物およびＢ１を任意に含み、リンカーＬ２の残留物２０を任意に含む。
Figure 2022525608000023
Figure 2022525608000024
Figure 2022525608000025
Figure 2022525608000026
Figure 2022525608000027
Figure 2022525608000028
〔経路および製剤〕
１つまたは複数の抗原および１つまたは複数のアジュバントを有する組成物、ならびに任意の別の活性剤を有する組成物の投与、または１つまたは複数の抗原を有する組成物および１つまたは複数のアジュバントを有する組成物の投与は、適切な投与経路（特に、非経口、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、または皮下）のいずれかを介し得る。このような投与は、単回ボーラス注射、複数回注射、または短期間もしくは長期間の注入であり得る。埋め込み可能なデバイス（例えば、埋め込み可能な注入ポンプ）はまた、特定の製剤を同等のまたは様々な投与量で、経時的に非経口送達するために使用され得る。このような非経口投与のために、化合物（コンジュゲートまたは他の活性剤）は、水または別の適切な溶媒または溶媒の混合物中の滅菌溶液として製剤化することができる。溶液は、溶液を血液と等張にするための塩、糖（特にグルコースまたはマンニトール）、酢酸、クエン酸、および／またはリン酸などの緩衝剤、ならびにそれらのナトリウム塩、ならびに保存料などの他の物質を含有する可能性がある。
本発明の組成物は単独で、または他の活性剤と組み合せて、医薬組成物として製剤化され得、そしてヒト患者などの哺乳動物宿主に、選択された投与経路（例えば、経口または非経口（静脈内、筋肉内、局所、または皮下経路））に適合した様々な形態で、投与され得る。
したがって、組成物は単独で、または他の活性剤（例えば、抗原）と組み合わせて、（例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて経口によって）全身投与することができる。これらは、硬質ゼラチンカプセルもしくは軟質ゼラチンカプセルに内包されても、錠剤として圧縮されても、または患者の食事用の食物に直接加えられてもよい。経口治療投与のために、活性化合物と任意に組み合わせた組成物は、１つまたは複数の賦形剤と組み合わせることができ、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用することができる。かかる組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するべきである。組成物および調製物のパーセンテージは、もちろん変えることができ、所与の単位投薬形態の重量の約２～約６０％の間で好都合に変化させることができる。このような有用な組成物中のコンジュゲートおよび任意の他の活性化合物の量は、有効投与量レベルが得られるような量である。
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などは、以下のものを含有することもできる：トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトース、もしくはアスパルテームなどの甘味剤、またはペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはチェリー香味剤などの香味剤。単位投薬形態がカプセル剤の場合、上記物質以外に、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含有する可能性がある。様々な他の成分が、コーティングとして存在してもよく、または存在することにより、固体単位投薬形態の物理的な形態を改変してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラック、または糖などによりコートされてもよい。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、着色料、ならびにチェリーまたはオレンジフレーバーなどの香味剤を含有してよい。もちろん、任意の単位投薬形態の調製に使用される任意の成分は、その使用量で薬学的に許容されかつ実質的に非毒性であるべきである。さらに、リン脂質コンジュゲートは、任意に別の活性化合物と組み合わせて、徐放性調製物およびデバイスに組み込まれてもよい。
組成物は、任意に別の活性化合物と組み合わせて、注入または注射によって静脈内または腹腔内に投与することもできる。抗原（単数または複数）およびアジュバント（単数または複数）の溶液は、任意に別の活性化合物またはその塩と組み合わせて、水中で調製され得、任意に非毒性界面活性剤と混合され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物、ならびに油において調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は保存料を含むことにより、微生物の増殖を防ぐ。
注射または注入に適した薬学的投薬形態としては、滅菌水性溶液もしくは滅菌水性分散液、または滅菌注射もしくは滅菌注入が可能な溶液もしくは分散液の即時調製に適合する活性成分（任意にリポソーム中にカプセル化される）を含む滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、最終投薬形態は、製造および貯蔵の条件下で、滅菌、流動的、および安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または液体分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの生成、分散液の場合には必要な粒径の維持、または界面活性剤の使用により維持され得る。貯蔵中の微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝液、または塩化ナトリウムを含むことが有益であり得る。注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。
滅菌注射可能な溶液は、必要な量の化合物を、必要に応じて、上記に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。滅菌注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の１つの方法として、真空乾燥および凍結乾燥技術が挙げられ、これは、活性成分の粉末＋以前に滅菌濾過された溶液中に存在する任意のさらなる所望の成分を生じる。
局所投与のために、抗原（単数または複数）およびアジュバント（単数または複数）は、任意に別の活性化合物と組み合わされて、純粋な形態（例えば、それらが液体である）で適用され得る。しかしながら、一般に、それらを、固体または液体であり得る皮膚科学的に許容される担体と組み合わせて、組成物または製剤として皮膚に投与することが望ましい。
有用な固体担体としては、微細固体（例えばタルク）、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどが挙げられる。有用な液体担体としては、水、アルコールもしくはグリコール、または水－アルコール／グリコールのブレンドが挙げられ、その中で、本発明の化合物は、任意に非毒性界面活性剤を助剤として、有効なレベルで溶解または分散され得る。芳香剤および抗菌剤のようなアジュバントを添加して、所与の使用のための特性を増強し得る。得られる液体組成物は、含浸帯具およびその他の包帯に使用される吸収パッドによって適用され得るか、またはポンプ型噴霧器もしくはエアゾール噴霧器を用いて疾患領域に噴霧され得る。
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩および脂肪酸エステル、脂肪アルコール、修飾セルロース、または修飾無機物などの増粘剤もまた、液体担体と共に用いることにより、使用者の皮膚に直接適用するための展延性のペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成し得る。
さらに、一実施形態において、本発明は、吸入送達のために、任意に別の活性化合物と組み合わせた抗原（単数または複数）およびアジュバント（単数または複数）の様々な投薬製剤を提供する。例えば、製剤は、噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器、およびネブライザーなどの装置におけるエアゾール使用のために設計されてもよい。
化合物を皮膚に送達するために使用し得る、有用な皮膚科学的組成物の例は、当技術分野で公知であり、例えば、Jacquet et al. (U.S. Pat. No. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. No. 4,559,157)およびWortzman (U.S. Pat. No. 4,820,508)を参照されたい。
有用な投与量は、動物モデルにおけるそれらのインビトロ活性およびインビボ活性を比較することによって判断され得る。マウスおよび他の動物において有効な投与量のヒトに対する外挿の方法は、当該分野で公知である；例えば、米国特許第４，９３８，９４９を参照されたい。ＴＬＲアゴニストとして作用するアジュバントの能力は、Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 6646 (2003)によって開示される手順を含む、当該分野で周知の薬理学的モデルを使用して判断することができる。
一般に、ローションなどの液状組成物中の別の活性化合物と任意に組み合せたリン脂質の濃度は、約０．１～２５重量％、例えば、約０．５～１０重量％である。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１～５重量％、例えば、約０．５～２．５重量％である。
活性成分を投与することにより、約０．５～約７５μＭ、例えば、約１～５０μＭ（約２～約３０μＭなど）の活性化合物の最高血漿濃度に達成することができる。これは、例えば、活性成分の０．０５～５％溶液を、任意に生理食塩水中に静脈内注射することによって、または約１～１００ｍｇの活性成分を含むボーラスとして経口投与することによって達成することができる。望ましい血中レベルは、約０．０１～５．０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒを提供するための連続注入によって、または約０．４～１５ｍｇ／ｋｇの活性成分を含有する間欠的な注入によって維持され得る。
別の活性化合物、または活性塩もしくはその誘導体と任意に組み合わせられた、処置に使用するのに必要な抗原およびアジュバントの量は、選択される特定の塩だけでなく、投与経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変化し、最終的には担当医または臨床医の自由裁量である。しかしながら、概して、適切な投与量は、約０．５～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０～約７５ｍｇ／ｋｇ体重／日（３～約５０ｍｇ／ｋｇレシピエントの体重／日など）、例として、６～９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、例えば、１５～６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
別の活性化合物と任意に組み合わせた抗原（単数または複数）およびアジュバント（単数または複数）は、単位投薬形態で好都合に投与することができ；例えば、単位投薬形態当たり５～１０００ｍｇ、好都合には１０～７５０ｍｇ、最も好都合には５０～５００ｍｇの活性成分を含む。
所望の投与量は、好都合には単回用量であるか、または適切な間隔で（例えば、１日あたり２、３、４、またはそれ以上の回数で副投与量として投与される分割投与量として提示され得る。副投与量それ自体は、多数の別個の緩く間隔があいた投与（例えば、吸入器からの多数回の吸入、または眼への複数回の点滴薬の適用など）にさらに分割されてもよい。投与量、およびおそらく投与頻度もまた、個々の患者の年齢、体重、状態、および反応に応じて変化するであろう。一般に、本明細書に記載される状態に対する、活性剤の総１日投与量の範囲は、単回または分割投与量で、約５０ｍｇ～約５０００ｍｇであり得る。一実施形態において、一日投与量は、約１００ｍｇ～約４０００ｍｇの範囲（例えば、単回または分割投与量で約１０００～３０００ｍｇ、例えば、経口投与される化合物を６時間毎に７５０ｍｇ）であるべきである。これは、約５００～７５０ｕＭの血漿レベルを達成し得、これは癌細胞を死滅させるために有効であり得る。患者の管理において、治療は、低投与量から開始し、患者の全体的な応答に応じて増加させるべきである。
特異的な抗原としては、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、体内物質、または微生物などの細胞が挙げられる。
特異的なペプチドは、２～約２０個のアミノ酸残基を有する。
別の特異的なペプチドは、１０～約２０個のアミノ酸残基を有する。
特異的な抗原には、炭水化物が含まれる。
特異的な抗原は、微生物である。特定の微生物は、ウイルス、細菌、または真菌である。
特異的な細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである。特異的なＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓである。特異的なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓとしては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが挙げられる。
特異的なウイルスは、ＲＳＶおよびインフルエンザウイルスを含むＲＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスの産物、またはヘルペスウイルスを含むＤＮＡウイルスである。特異的なＤＮＡウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスである。
本発明は、抗原であってもなくてもよい他の活性剤（例えば、リバビリン、ミゾリビン、およびミコフェノール酸モフェチル）と任意に組み合わせた、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストのリン脂質コンジュゲートを含む組成物を含む。
〔例示的な実施形態〕
一実施形態において、哺乳動物における免疫応答を増強するための方法が提供される。
一実施形態において、上記方法は、有効な量のＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストを含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む。
一実施形態において、組成物は、リポソーム組成物である。
一実施形態において、組成物は、ＴＬＲ４アゴニストを含むリポソームと、ＴＬＲ７アゴニストを含むリポソームとを含む。
一実施形態において、組成物は、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストを含むリポソームを含む。
一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストは、同時投与される。
一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）を有する。
一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、ＩＮＩ－２００４、またはＣＲＸ６０１を含む。
一実施形態において、ＴＲＬ４アゴニストは、１Ｚ１０５ではない。一実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストは、式（Ｉ）を有する。
一実施形態において、リポソームは、ＰＣ、ＤＯＰＣ、またはＤＳＰＣを含む。
一実施形態において、リポソームは、コレステロールを含む。
一実施形態において、方法は、１つまたは複数の免疫原を投与する工程をさらに含む。
一実施形態において、免疫原は、微生物免疫原であり、例えば、１つまたは複数の微生物タンパク質、糖タンパク質、糖類および／またはリポ多糖類である。
一実施形態において、微生物は、インフルエンザまたは水痘などのウイルス、または細菌である。
一実施形態において、微生物は、寄生虫または真菌である。
一実施形態において、リポソームは、１つまたは複数の免疫原を含む。
一実施形態において、組成物は、１つまたは複数の免疫原を含む。
一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
一実施形態において、哺乳動物は、げっ歯類、ウマ科の動物、ウシ属の動物、ヤギ類、イヌ科の動物、ネコ科の動物、ブタ類またはヒツジ類である。
一実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストの量は、約０．０１～１００ｎｍｏｌ、約０．１～１０ｎｍｏｌ、または約１００ｎｍｏｌ～約１０００ｎｍｏｌである。
一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストの量は、約２～２０ｕｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ～２ｕｍｏｌ、または約２ｕｍｏｌ～約１００ｕｍｏｌである。
一実施形態において、ＴＬＲ７対ＴＬＲ４アゴニストの比率は、約１：１０、１：１００、１：２００、５：２０、５：１００、または５：２００である。
一実施形態において、組成物は、注射される。
一実施形態において、リポソームは、ＤＯＰＣおよびコレステロールを含む。
一実施形態において、免疫原は、細胞、タンパク質、または胞子である。一実施形態において、免疫原は、組成物の前または後に投与される。一実施形態において、投与は、微生物感染を予防するのに有効である。一実施形態において、組成物は、鼻腔内投与される。一実施形態において、組成物は皮内投与される。
一実施形態において、リポソーム、ＴＬＲ４アゴニスト、およびＴＬＲ７アゴニストを含む医薬製剤が提供される。一実施形態において、リポソームは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１８：１ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（１６：０ＰＥＧ－２０００ＰＥ）、１－オレオイル－２－［１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ラウロイル］－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１～１２：０ＮＢＤ ＰＣ）、１－パルミトイル－２－｛１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ラウロイル｝－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～１２：０ＮＢＤ ＰＣ）、およびそれらの混合物；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含む。一実施形態において、リポソームは、ＤＯＰＣ、コレステロール、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストの量は、約０．０１～１００ｎｍｏｌ、約０．１～１０ｎｍｏｌ、または約１００ｎｍｏｌ～約１０００ｎｍｏｌである。一実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストの量は、約２ｎｍｏｌ～２０ｕｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ～２ｕｍｏｌ、または約２ｕｍｏｌ～約１００ｕｍｏｌである。一実施形態において、ＴＬＲ７対ＴＬＲ４アゴニストの比率は、約１：１０、１：１００、１：２００、５：２０、５：１００、または５：２００である。一実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストは、式（Ｉ）の化合物を含む。一実施形態において、式（Ｉ）は、
Figure 2022525608000029
を含み、ここで、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素またはアシル基であり、Ｒ１３は負電荷または水素であり、ｍは１～８であり、波線は結合の位置を示し、ＯＲ１２を有する炭素原子における絶対配置は、Ｒ、Ｓ、またはそれらの任意の混合である。一実施形態において、ｍは１である。一実施形態において、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれオレオイル基である。
一実施形態において、Ｒ３のリン脂質は、２つのカルボン酸エステルを含み、各カルボン酸エステルは不飽和、エポキシ化、ヒドロキシル化、またはそれらの組合せの１つ、２つ、３つ、または４つの部位を含む。一実施形態において、Ｒ３のリン脂質は、２つのカルボン酸エステルを含み、カルボン酸エステルは類似または異なっている。一実施形態において、リン脂質の各カルボン酸エステルは、Ｃ８～Ｃ９に不飽和部位を有するＣ１７カルボン酸エステルである。一実施形態において、リン脂質の各カルボン酸エステルは、Ｃ９～Ｃ１０に不飽和部位を有するＣ１８カルボン酸エステルである。一実施形態において、Ｘ２は、結合、または鎖中に１～約１０個の原子を有する鎖であり、ここで、鎖の原子は炭素、窒素、硫黄、および酸素からなる群から選択され、任意の炭素原子はオキソで置換され得、任意の硫黄原子は１つまたは２つのオキソ基で置換され得る。一実施形態において、Ｘ２は、Ｃ（Ｏ）、
Figure 2022525608000030
である。
一実施形態において、Ｒ３は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。一実施形態において、Ｒ３は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンであり、Ｘ２はＣ（Ｏ）である。一実施形態において、Ｘ１は酸素である。一実施形態において、Ｘ１は硫黄、または－ＮＲｃであり、ここで、Ｒｃは水素、Ｃ１～６アルキル、または置換Ｃ１～６アルキルであり、ここで、アルキル置換基はヒドロキシ、Ｃ３～６シクロアルキル、Ｃ１～６アルコキシ、アミノ、シアノ、またはアリールである。一実施形態において、Ｘ１は、－ＮＨ－である。一実施形態において、Ｒ１およびＲｃは共に、複素環式環または置換複素環を形成する。一実施形態において、Ｒ１およびＲｃは共に、置換または非置換モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ、またはピペラジノ環を形成する。一実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１～６アルコキシで置換されたＣ１～Ｃ１０アルキルである。一実施形態において、Ｒ１は、水素、Ｃ１～４アルキル、または置換Ｃ１～４アルキルである。一実施形態において、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヒドロキシＣ１～４アルキレン、またはＣ１～４アルコキシＣ１～４アルキレンである。一実施形態において、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、メトキシエチル、またはエトキシエチルである。一実施形態において、Ｒ２は、ハロゲンもしくはＣ１～４アルキルであるか、またはＲ２は欠如している。一実施形態において、Ｒ２は、クロロ、ブロモ、メチル、またはエチルであるか、またはＲ２は欠如している。一実施形態において、Ｘ１はＯであり、Ｒ１はＣ１～４アルコキシ－エチルであり、ｎは０であり、Ｘ２はカルボニルであり、Ｒ３は１，２－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。一実施形態において、式（Ｉ）の化合物は：
Figure 2022525608000031
である。
一実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2022525608000032
である。
一実施形態において、式（ＩＩ）中、ｚ２は、１、２、または３である。一実施形態において、式（ＩＩ）中、ｚ１は１または２である。
一実施形態において、式（ＩＩ）中、ｚ１は、０である。
一実施形態において、式（ＩＩ）中、Ｒ５は、置換もしくは非置換アリール、またはヘテロアリール、例えば、非置換Ｃ５またはＣ６アリールである。
一実施形態において、式（ＩＩ）中、Ｒ６は、置換もしくは非置換シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル、例えば、５、６、または７個のシクロアルキルである。
一実施形態において、式（ＩＩ）中、Ｒ７は、置換または非置換アルキル、例えば、Ｃ１～Ｃ５アルキルである。
一実施形態において、式（ＩＩ）中、Ｒ８は、置換もしくは非置換アリール、またはヘテロアリール、例えば、５、６、または７個のヘテロアリール（フラニル、ピロリル、またはイミダゾリルなど）である。
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
〔実施例１〕
＜リポソーム製剤化２Ｂ１８２ｃ、ＴＬＲ４アゴニスト、および１Ｖ２７０、ＴＬＲ７アゴニストのアジュバントポテンシー(potency)＞
２Ｂ１８２ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）および１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）のリポソーム製剤単独、または２００ｎｍｏｌ ２Ｂ１８２ｃおよび１ｎｍｏｌ １Ｖ２７０の組み合わせを調製した（Inimmune Corp, Missoula, MT）。リポソーム製剤化アジュバントのアジュバントポテンシーをＤＭＳＯ製剤（１０％ＤＭＳＯ）と比較した。製剤化アジュバントを、同じプロトコルを使用して試験した。簡単に述べると、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目および２１日目に、リポソーム製剤化２Ｂ１８２ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）および／または１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）を用いて不活化インフルエンザウイルスで免疫付与した。ＥＬＩＳＡにより、抗ＨＡおよび抗ＮＡ抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）について血清を評価した。製剤化アゴニストが胚中心Ｂ細胞および形質芽球（抗原分泌細胞）集団に影響を及ぼすかどうかを調べるために、鼠径リンパ節を採取し、ＦＡＣＳによりＢ細胞集団について分析した。
ＴＬＲ４は細胞表面およびエンドソーム区画の両方に存在する。エンドソーム受容体を介するシグナル伝達は、ＬＰＳによるＮＦ－κＢの活性化を阻害する。エンドソームのＴＬＲ４活性化はＴＲＩＦ経路活性化を誘導し、ＩＲＦ３活性化を介してＩ型ＩＦＮの放出を導く。したがって、２Ｂ１８２ｃのアジュバント活性は、リポソーム製剤によって弱められる可能性がある。リポソーム製剤化２Ｂ１８２ｃはＤＭＳＯ製剤化アジュバントと比較して、２Ｂ１８２ｃ単独または２Ｂ１８２ｃに加えて１Ｖ２７０を用いて免疫付与したマウスにおいて、有意に高い抗ＨＡ ＩｇＧ２ａを誘導し、一方、リポソーム２Ｂ１８２ｃは、ＨＡおよびＮＡ特異的ＩｇＧ１を減少させた（図１９Ａ）。リポソーム製剤は、２Ｂ１８２ｃおよび２Ｂ１８２ｃと１Ｖ２７０との複合アジュバントにおいてＩｇＧ２ａレベルに影響を及ぼさなかった（図１９Ａ）。リポソーム製剤によるＩｇＧ１レベルの減少は、リポソーム製剤化２Ｂ１８２ｃおよび２Ｂ１８２／１Ｖ２７０複合アジュバントによるＴｈ１に偏った免疫応答に起因する（図１９Ｂ）。これらのデータは、ＴＬＲ４リガンドの細胞内送達がＩ型ＩＦＮ依存的に有効なＴｈ１免疫応答を誘導するという報告と一致する。
抗原暴露後、活性化されたナイーブおよびメモリーＢ細胞は増殖し、胚中心（ＧＣ）で成熟する。長期的なワクチンのエフィカシー(efficacy)に必要な高い抗原特異的Ａｂ力価の維持は、ＧＣ形成と相関する。活性化されたＢ細胞はさらに抗原特異的なＡｂ分泌細胞（ＡＳＣ；形質芽球および形質細胞）、メモリーＢ細胞および他のサブセットを形成する。形質芽球は季節性インフルエンザウイルスワクチン接種後に誘導され、ワクチン接種後７日目に急激にピークに達した。不活化ウイルスによるワクチン接種後の末梢血における形質芽球の頻度は、ヒトにおける防御的血球凝集素抑制タイトルの程度と相関する。そこで、流入領域リンパ節のＧＣ Ｂ細胞および形質芽球を調べた。胚中心Ｂ細胞および形質芽球の数は、リポソーム２Ｂ１８２ｃおよび１Ｖ２７０との組み合わせによって増加した（図２０）。
要約すると、リポソーム製剤化ＴＬＲ４およびＴＬＲ７のリガンドアジュバンドは、Ｔｈ１に偏った免疫応答を誘導し、ＧＣ中心Ｂ細胞および形質芽球を増加させた。リポソーム製剤中の複合アジュバントによって誘導されるＢ細胞応答の質を評価するために、現在、リンパ節細胞のＢＣＲおよびＴＣＲレパトア分析を行っている。さらに、ワクチンアジュバントの機能評価は、生ウイルス（同種および異種攻撃）によって評価される。
〔実施例２〕
合成小分子であるＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストの組み合わせは、組換えインフルエンザウイルス血球凝集素の強力なアジュバントであり、同種、異種、および異種サブタイプのマウス攻撃モデルにおいてインフルエンザウイルスに対して防御的である迅速かつ持続的な免疫を誘導する。しかしながら、これらの研究で用いられたＴＬＲ４アゴニストは、ピリミドインドールクラスの第一世代の主要な合成ＴＬＲ４アゴニスト、１Ｚ１０５であり、自然免疫受容体アゴニストとして作用するアジュバントを発見するためのハイスループットスクリーニングキャンペーンで特定されたヒットから最適化されたものであった。１Ｚ１０５はマウス細胞において良好な免疫活性を有することが分かったが、ヒト細胞において有意な活性はなかった。より最近の研究ではＣ８－アリール置換基を含む第２世代のシリーズの化合物がマウス細胞において１Ｚ１０５よりも強力であったが、ヒト細胞においても非常に活性であった。Ｃ８－アリール誘導体のこの活性なグループ内で、Ｃ８－フラン－２－イル誘導体（２Ｂ１８２Ｃ）を、ポテンシーおよび好ましい予備製剤データに基づいて、さらなる研究のために選択した（図３４および３６）。比較のために、ピリミドインドール２Ｂ１８２Ｃを１Ｖ２７０と組み合わせて評価した。強力なＴＬＲ４アゴニストであるＭＰＬＡアナログ（ＭＰＬＡ－１）は、インビボでの同種および異種インフルエンザ攻撃に対して良好な防御を示した。
ＴＬＲ７アゴニスト、１Ｖ２７０は、既知のＴＬＲ７アゴニストのリン脂質コンジュゲートである。アゴニストコンジュゲートのリン脂質部分によって付与される、対応する非コンジュゲートアゴニストに対する主な利点としては、より大きなポテンシー、およびサイトカイン症候群としてしばしば観察される局所または全身毒性がないことが挙げられる。エフィカシーおよび安全性を実証するこれらの好ましい特性は、この技術的提案に記載される組み合わせアジュバント研究のための主要なＴＬＲ７アゴニストとしての１Ｖ２７０の選択を支持する。
前述のように、ＴＬＲ４アゴニスト１Ｚ１０５およびＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０を含む複合アジュバントは、インフルエンザウイルスワクチンで広範な防御応答を誘導した。ＳＡＲの研究では、ＴＨＰ－１細胞およびインビトロでのヒトおよびマウスの初代細胞において、１Ｚ１０５よりも高いアゴニストポテンシーを示す２Ｂ１８２Ｃが得られた。不活化インフルエンザウイルス［Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９（Ｃａｌ／０９）］を用いたワクチンモデルにおいて、２Ｂ１８２Ｃのアジュバントポテンシーを検討し、１Ｚ１０５と比較した。これらの研究は、ＴＬＲアゴニストの単純なＤＭＳＯ－水製剤を用いて行われた。
＜ＴＬＲ４－アゴニストおよびＴＬＲ７－アゴニストを用いた複合アジュバントは、インフルエンザウイルス感染に対して迅速かつ広範な防御免疫応答を誘導する＞
ＴＬＲ４／ＴＬＲ７アゴニスト複合アジュバントによって誘導される、インフルエンザウイルス感染に対する防御免疫応答のプロファイルを評価するために、マウスに低用量（０．２μｇ／注射）の組換え血球凝集素（ｒＨＡ）、体液性応答および致死性ウイルス攻撃に対する防御で免疫付与した（図３４Ａ－２Ｄ）。複合アジュバントを用いてｒＨＡで免疫付与されたマウスは、最小の体重減少およびより高い生存率を示した（図３４Ｂおよび２Ｃ）。複合アジュバントおよび、１Ｖ２７０、ＴＬＲ７アゴニスト単独で、Ｔｈ１偏向免疫応答を引き起こした。
ＴＬＲ４／ＴＬＲ７複合アジュバントが異型インフルエンザウイルス攻撃に対して交差防御を提供するかどうかをさらに調べるために、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）を含む２００９－２０１０ Ｆｌｕｚｏｎｅでマウスに免疫付与し、異種マウス適応ウイルスＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／２００６（Ｙａｍａｇａｔａ系統）の２５ｍＬのＤ５０でそれらを攻撃した。９０％を超えるマウスは１Ｖ２７０単独または１Ｚ１０５との組み合わせを用いたＦｌｕｚｏｎｅアジュバントの接種後、生存した（図３４Ｅ－２Ｇ）。これらのデータは、１Ｖ２７０が単独で、または１Ｚ１０５と組み合わせると、異種インフルエンザウイルスに対して迅速かつ交差防御的な免疫を誘導することを示した。
＜ＴＬＲ４－アゴニストおよびＴＬＲ７－アゴニストに対する用量の判断＞
前述したように、ＳＡＲ研究では、ヒトおよびマウスの免疫細胞において、１Ｚ１０５に比べて、インビトロでより高いポテンシーを示す２Ｂ１８２Ｃが得られた。インビトロの研究で観察されたより高いポテンシーがインビボでも再現性があるかどうかを調べるために、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＴＬＲ４アゴニスト（１Ｚ１０５または２Ｂ１８２Ｃ、４０または２００ｎｍｏｌ／注射）および１Ｖ２７０（リン脂質ＴＬＲ７アゴニストコンジュゲート、０．２または１ｎｍｏｌ／注射）を用いて０日および２１日に、不活化インフルエンザウイルス（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９、Ｃａｔ＃ ＮＲ－４９４５０、ＢＥＩリソース）で筋内（ＩＭ）免疫付与した（図３４Ａ）。２８日目に血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗血球凝集素（ＨＡ）および抗ノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）を測定した。１Ｖ２７０、１Ｚ１０５および２Ｂ１８２ＣをＤＭＳＯに溶解し、希釈し、ＤＭＳＯの最終濃度をビヒクル対照として１０％使用した。同様の結果を示す４つの独立した実験からデータをプールした。
＜ＴＬＲアゴニスト単剤による抗体分泌への効果＞
単一のアジュバントとして、０．２ｎｍｏｌおよび１ｎｍｏｌの１Ｖ２７０、並びに４０ｎｍｏｌおよび２００ｎｍｏｌの２Ｂ１８２Ｃまたは１Ｚ１０５を比較した（図３４Ｂ）。ＴＬＲ４アゴニスト、１Ｚ１０５および２Ｂ１８２Ｃは共に、ＨＡおよびＮＡに対して有意に高いレベルのＩｇＧ１を誘導した。ＩｇＧ２ａ誘導については、０．２および１ｎｍｏｌ／注射の１Ｖ２７０の両方が抗ＨＡを有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。一方、２００ｎｍｏｌ／注射では、１Ｚ１０５ではなく、２Ｂ１８２Ｃのみが抗ＮＡ Ａｂｓを増強した（ｐ＜０．０１）（図３４Ｂ）。２Ｂ１８２Ｃおよび１Ｚ１０５は類似のレベルのＨＡ特異的ＩｇＧ２ａを誘導した。いずれのアジュバント処置によっても、ＩｇＭ応答に差は認められなかった。これらのデータはＴＬＲ４アゴニストがＩｇＧ１の生産量を増加させ、ＴＬＲ７アゴニストがＩｇＧ２ａの分泌に効果を発揮し、２Ｂ１８２Ｃがインビボの１Ｚ１０５と同等またはやや高いポテンシーを発揮したとの報告を支持する。
＜２Ｂ１８２Ｃおよび１Ｖ２７０との組み合わせ処置による抗体分泌への効果＞
次に、ＤＭＳＯ－水製剤を用いて、複合アジュバントのポテンシーを評価した。１Ｖ２７０と１Ｚ１０５および２Ｂ１８２Ｃとの複合アジュバントはいずれも、ＨＡおよびＮＡの両方に対するＩｇＧ１の誘導を改善した。２Ｂ１８２Ｃは４０および２００ｎｍｏｌの両方で１Ｚ１０５より有意に高いＩｇＧ１を増強した（ｐ＜０．０５、図３５Ａおよび３５Ｂ）。ＩｇＧ２ａの誘導では、２Ｂ１８２Ｃは抗ＨＡおよび抗ＮＡのＡｂｓのレベルを上昇させたが、１Ｚ１０５はほとんどのケースで失敗した（図３５Ｃおよび３５Ｄ）。これらのアジュバントは、ＩｇＭ放出に対して最小の効果を示した（図３５Ｅおよび３５Ｆ）。
試験した全ての組み合わせの抗体力価を比較するために、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価の平均を図３６Ａにプロットする。２００ｎｍｏｌの２Ｂ１８２Ｃ＋０．２または１ｎｍｏｌの１Ｖ２７０は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方の最も高い誘導を示した（図３６Ａ）。さらに、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫バランスを評価するために、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比率を個々の動物で計算した（図３６Ｂ）。１ｎｍｏｌの１Ｖ２７０は、１Ｚ１０５または２Ｂ１８２ＣによるＴｈ２偏向免疫応答を有意にシフトさせ、１Ｖ２７０が免疫応答をＴｈ１偏向へシフトさせたことを示した（図３６Ｂ）。要約すると、以上の結果から、２００ｎｍｏｌ／注射の２Ｂ１８２Ｃと１ｎｍｏｌ／注射の１Ｖ２７０との組み合わせは、最も高い量のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを誘導し、インフルエンザウイルス感染における異種の防御にはＴｈ１に偏った免疫応答が望ましいことが示された。したがって、本発明者らは、さらなる前臨床製剤のためにこの組み合わせを選択した。
＜ＴＬＲ４アゴニストによる予備データ＞
ナノ粒子製剤中のＭＰＬＡ－２、ＭＰＬＡの硫酸アナログ、組み合わせ、およびすべての主要なＴＬＲアゴニストについてのインビボ評価を行う。ＮＩＡＩＤアジュバントの発見・開発契約の中で、強力なＴＬＲ４アゴニストが発見された。そこでは、インビトロ（ｈＰＢＭＣ）におけるインフルエンザ関連サイトカイン生産の相乗的な増強、マウス及びブタでの１Ｖ２７０を用いたインビボのＩｇＧ２Ａ抗体およびＨＩ力価の増強がないにしても、添加剤が実証された。アジュバントとしてのＭＰＬＡ－１の主な弱点は、水性媒体中で加水分解しやすいので、化学的安定性がないことである。非特異的抵抗の予備的マウス研究において、ＭＰＬＡ－２は等量のＭＰＬＡ－１よりも致死的なインフルエンザ攻撃からマウスを防御した。したがって、ＭＰＬＡ－２は次世代ＴＬＲ４アゴニストを代表する。
上記に概説した目的を裏付けるために、以下に詳述する実験を実施する。
＜研究領域１：主要なＴＬＲアゴニストの組み合わせの製剤化および分析アッセイ開発＞
＜ＴＬＲ４／ＴＬＲ７の組み合わせの製剤の開発＞
＜タスク１Ａ：主要な化合物単独および組み合わせのコロイド安定性ナノ粒子製剤の開発＞
粒子送達システムは、我々の免疫系がパターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して認識し、闘うために進化したウイルス性および細菌性の病原体のサイズおよび形状を模倣することを介してアジュバントとして作用する。過去３０年間にわたる研究により、生分解性であり、ワクチン抗原送達に適した多数のナノ粒子およびマイクロ粒子ベースのシステムがもたらされた。ワクチン送達システムとしてのそれらの有用性はリポソーム、ビロソーム、Ｉｓｃｏｍ、エマルジョン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）およびポリ乳酸コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用いて文献で実証されており、それぞれのタイプの例はヒトの臨床試験に進んでいる。粒子状送達ビヒクルの主要なアジュバント機構は、ＡＰＣによって取り込まれた粒子または関連する抗原の取り込みの増強であると考えられる。抗原へのＰＡＭＰの添加は、自然免疫細胞の活性化につながるＴＬＲおよび他のＰＲＲのライゲーションを介して、強固な自然免疫応答および適応免疫応答を促進することが現在十分に確立されている。多くのＰＡＭＰ（細菌性リポタンパク質、糖脂質、ＤＮＡおよびウイルスＲＮＡなど）が同定され、ウイルス性および細菌性の病原体から分離されている。これらのアゴニストの多くは強力なアジュバントであるが、許容できないレベルの炎症をもたらすか、または臨床開発のために好ましくない物理的／化学的特性を有する。これに応答して、研究者らは改善された安全性および化学的プロファイルを有する合成アナログを首尾よく生産し、そしてこれらの多くは、ＰＲＲライゲーションを介してそれらの病原体模倣を増強するために、粒子送達システムに添加されている。粒子送達システムはまた、インビボでのアジュバントの生体内分布動態を改善し、アジュバントの免疫原性を犠牲にすることなくアジュバントの副作用を低減するために使用され得る。
二重層に組み込まれたＴＬＲ４アゴニストＭＰＬＡ－１を有するＰＥＧ化リポソームの有効な舌下ワクチン使用は、インフルエンザのマウスモデルにおいて示されている。この製剤は、インビボでアジュバントのポテンシーを全く失うことなく、ＭＰＬＡ－１の発熱性を２００倍減少させる。これは、水性分散液に対してリポソームに組み込まれた場合に観察されたＬＰＳの発熱性の減少に類似している。ＴＬＲ４アゴニストについても同様の発熱性の低下が期待される。
ナノ粒子／マイクロ粒子形成、ＡＰＩ取り込み、ＡＰＩ安定性およびコロイド安定性のための多数の異なる脂質および成分を評価した。一連の市販のカチオン性（ＤＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣコレステロール）、アニオン性（ＤＰＧ、ＰＳ、ＰＯＰＧ）および中性脂質（ＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ）を、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストを用いて試験する。他の製剤は、ＰＬＧＡ、ポリカプロラクトン、ポリ（プロパルギルメタクリレート）またはＰＬＭＡを使用し得る。粒子サイズおよび電荷は、ＤＣによるナノ粒子の取り込みおよび処理に著しく影響することが示されているため、上記の品質特性に対する送達ビヒクル設計を促進するためのこれらの変数の影響が探求される。小規模リポソーム製剤は、滅菌血清バイアルに適合させた薄膜法を用いて調製して、規模および廃棄物をさらに低減することができる。
簡単に言えば、これは、以下によって行われる：
１．脂質にＡＰＩを添加し、それらをクロロホルムに溶解する（蛍光マーカーは所望であれば、例えばＮＢＤ、ＢＯＤＩＰＹ、ＦＩＴＣなどのために、この工程で添加されてもよい）
２．設定速度での回転蒸発および真空化により乾燥薄膜を得る
３．水性緩衝液（０．１Ｍリン酸塩、トリスまたはＨＥＰＥＳ）による再水和
４．動的光散乱（ＤＬＳ）による粒子サイズ、多分散性および表面電荷（ゼータ電位）のプロセスモニタリングを伴う、脂質転移温度（Ｔｍ）を超える浴超音波処理による粒子サイズ減少
５．３～１０ｍＬスケールの主要な製剤のロットを、超音波処理法よりも粒度均一性（多分散指数、ＰＤＩ）を改善するＬｉｐｅｘ押出機を用いて調製する。
＜タスク１Ｂ：製剤のコロイド及び物理的安定性を評価するための安定性試験＞
製剤の安定性は製品の貯蔵、出荷、および貯蔵寿命に影響を及ぼし、すべてが製品コストに直接寄与するので、成功する市販製品の開発に必要である。製剤は特に、さらに追求する主要な候補を選択する場合に、潜在的な製品として、並びに安定性として適切であることが実証される。
主要な製剤を、短期加速（２５および４０℃）および長期リアルタイム安定性（２～８℃および２５℃）について評価して、選択された製剤が、潜在的な製品開発のために十分な安定性を提供することを確実にする（好ましい貯蔵条件で最低１２ヶ月）。
ナノ粒子送達システムへのアジュバントの組み込みの正確な定量は、適切な投薬、ワクチンのエフィカシーおよび安全性のために必須である。リポソームを含むナノ粒子に組み込まれたＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７／８アゴニストの定量のためのＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣ法を開発した。ＲＰ－ＨＰＬＣは、試料が十分に低いバックグラウンドＵＶ吸光度を有する水混和性有機溶媒（メタノール、テトラヒドロフランなど）で溶解される場合、ナノ粒子中に存在する総アゴニスト含量の分析に有効である。有機溶媒による溶解はナノ粒子を破壊し、５点標準曲線に対するＲＰ－ＨＰＬＣによる正確な定量のために、組み込まれたまたは表面に結合したアゴニストを放出する。
リポソームに組み込まれた（二重層または水性コア）アゴニストの定量化には、無傷の脂質リポソームおよびリポソーム外の水相を解析できる方法が必要である。２９６、２２５、および３１０ｎｍ（それぞれ２Ｂ１８２Ｃ、ＭＰＬＡ－２、および１Ｖ２７０について）でのＵＶ検出で「遊離」ＴＬＲアゴニストを定量することができるＳＥＣ－ＨＰＬＣ法を使用した。ＴＳＫゲルＳＷｘ１シリーズカラムは、３０～２００ｎｍ範囲のナノ粒子製剤に対して優れたサイズベースの解像度を提供する。使用される移動相は、リポソーム外の流体とリポソームコア中の水相との間の一定の浸透ポテンシャルを維持するためにリポソーム再水和に利用される緩衝液と同じである。この方法は、水性の組み込まれていないＴＬＲ４アゴニストのみを検出する、インビトロポテンシーアッセイに対する相補的な方法として適格であった。
これらの分析方法を用いて予備的研究を行い、それぞれ単独および組み合わせて調製した（共カプセル化した）２Ｂ１８２Ｃおよび１Ｖ２７０のリポソーム製剤を評価した。ワークフローは、以下のように実行された：
１）ＩＭ注射用に５０ｕＬ中に含まれる２Ｂ１８２Ｃについて２００ｎｍｏｌ、および１ｎｍｏｌの１Ｖ２７０の標的濃度を有する２ｍＬスケールでの主要なアジュバント製剤スクリーニング（薬学的に許容される共溶媒、賦形剤、リポソーム）。
２）主要な製剤について、基本的な分析法開発と分析を行い、製剤が品質基準を満たしていることを確認する。
３）好ましい製剤の安定性をリアルタイムおよび加速法により評価し、必要に応じて適切な賦形剤を安定剤として添加する。
４）最終製剤のエンドトキシン汚染がないことを確認するためのｒＦＣ試験。
すべてのリポソーム製剤を、化合物２Ｂ１８２Ｃおよび１Ｖ２７０について２ｍＬスケールで調製した。
簡潔には、以下の手順を使用してリポソームを調製し、そして以下の組成物を評価した：１Ｖ２７０ありおよびなしの２Ｂ１８２（ＤＯＰＣ／それぞれ、コレステロールありおよびなし、２：１）。試験したＤＯＰＣの濃度を４０ｍｇ／ｍＬで一定に保ち、１０ｍｇ／ｍＬのコレステロール濃度をもたらした。リポソームは、９：１クロロホルム：メタノールを溶媒として用いた脂質膜再水和法に従って製造した。最初に使用した再水和緩衝液は、５０ｍＭ ＮａＰＢ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝６．１であった。試験したアゴニスト濃度は標的濃度であった。高温での超音波処理を用いて、リポソーム粒子サイズを減少させた。分析結果の要約を表４に示す。
Figure 2022525608000033
Figure 2022525608000034
ＴＬＲアゴニスト、他の脂質成分、およびナノ粒子形成のための様々な量のコレステロールの他の比率を評価する。少なくとも１０種の異なる製剤を調製し、タスク２Ａの下のプロセスにおける適合性についてスクリーニングし、上記の単純なＤＭＳＯ－水製剤を用いて得られた結果と比較する。
ナノ粒子：ＴＬＲ７およびＴＬＲ４アゴニストは、ナノ粒子製剤（リポソーム、ＳＬＮ、ＰＬＧＡ、エマルジョンなど）として調製される。最終的な主要製剤は、免疫学、安定性および製造データに基づいて選択される。ＤＯＰＣ／コレステロールリポソーム製剤は、予備免疫学および安定性データに基づいて非常に有望であると思われる。ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストで予想される課題の１つは、制御された一貫した様式での同じナノ粒子中への両方のアゴニストの共組み込みである。互いに対するアゴニストの比率は一旦共カプセル化されると固定され、その点での任意の用量調節は両方のアゴニストを一緒に変化させる。
分析方法：タスク１Ｃに記載された分析方法のすべてが、本発明者らの脂質化ＴＬＲ－７／８アゴニストおよびＴＬＲ４アゴニストと共に使用され、本発明者らはさらなる最適化により、それらの特異性、線形性および範囲をさらに改善することを期待する。ＴＬＲ４およびＴＬＲ７アゴニスト製剤中のアジュバントの定量のためのＲＰ－ＨＰＬＣ法は、ピーク形状、ＬＯＤおよびＬＯＱについて最適化される。これらの同じ方法は生成物の安定性の正確なモニタリングを可能にするために、安定性研究から検出された任意の分解物について、ベースライン分解能および最適なＬＯＤ／ＬＯＱを達成するために、勾配およびカラム最適化される。ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストの組み合わせの各アゴニストについてのナノ粒子組み込みパーセンテージの正確な定量は、ＳＥＣＨＰＬＣが流体力学的体積のみに基づいて分離するので、困難であることが証明され得る。リポソームおよび組み込まれていないアゴニストは類似の粒子サイズを有し得、これは組み込み判断のためのＳＥＣ－ＨＰＬＣの有用性を制限する。これは、代替のアプローチにおいて以下に議論される。
代替アプローチ：共カプセル化したＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストの開発がナノ粒子中のアゴニストのレベルが一貫していないためにあまりに困難であることが判明した場合、本発明者らの免疫学的データは、リポソーム中のＴＬＲ７アゴニストとリポソーム中のＴＬＲ４アゴニストとを単に混合することによって、アジュバント相乗効果が依然として達成され得ることを示した。このアプローチは、アゴニストのシグナルが互いに干渉する可能性を低減することによって、その分析的特徴付けがより容易になる、より単純で信頼性のある生成物を生成する可能性を有する。
別の選択肢は、水相および油相がナノ液滴に混合されるので、デフォルトでアゴニストの１００％が組み込まれるナノエマルジョンなどの共カプセル化のための他の製剤を探索することである。エマルジョンはまた、投与部位にデポを形成するという利点を有し、これは、免疫応答をさらに増強し得る。研究領域２で論じるように、共カプセル化されたＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストと混合アゴニストとをインビトロおよびインビボで比較して、これらのアプローチの長所および短所を評価する。ナノ粒子へのアゴニストの組み込みを判断するためにＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用する別のアプローチは、ナノ粒子をペレット化し、確立されたＲＰ－ＨＰＬＣ方法を使用して組み込まれていないアゴニストについて上清を分析するための高速密度勾配遠心分離であろう。
進歩のための許容可能な特性を有する標的比率範囲の製剤は、免疫付与およびウイルス攻撃研究を含むインビボ研究に供される。
＜研究領域２：主要なアジュバント製剤による致死性インフルエンザウイルス攻撃からの防御の免疫学的バイオマーカーを確立する＞
信頼性の高いバイオマーカーを明らかにすることは、安全で有効なワクチンの開発を成功させるために必要である。ワクチン開発プログラムには、安全性に問題がなく、効果的に感染を予防するプロファイルを有するワクチン候補を選択することが不可欠である。ワクチンの臨床試験では、反応原性を最小限に抑えて抗原特異的な適応免疫応答を予測するバイオマーカーの同定が必要である。このプロジェクトでは、バイオマーカーが１）抗原の有無にかかわらず、製剤化主要なアジュバントによって誘導される自然免疫バイオマーカー、および２）適応免疫応答に相関するバイオマーカーの２つのステップで同定される。したがって、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７／８リガンドの両方の生物学的活性に相関し、かつ反応原性にも関連するバイオマーカー候補を同定するために、インビトロおよびインビボの研究が実施される。
＜タスク２Ａ：免疫活性及び反応原性のインビボ抗体生産研究に基づく組み合わせ製剤＞
ワクチン接種を介した感染症からの防御の特徴は、有効な抗体生産の誘導である。ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストを併用すると、抗原特異的抗体価が有意に増加した。免疫応答のＴｈ１偏向へ向かう傾向が観察された。製剤化アジュバントおよびそれらの組み合わせの有効性を、単純なＤＭＳＯ－水調製物と比較する。
＜タスク２Ａ．１：主要なコンボ製剤のマウスにおける免疫付与研究＞
主要なアジュバントの製剤は、ＤＭＳＯ－水製剤について以前に完了したのと同様の様式で、単独で、および様々な比率のＴＬＲアゴニストと組み合わせて、免疫付与試験で評価される。ＨＡおよびＮＡの両方に特異的なＩｇＭ、総ＩｇＧ、並びにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのレベルを評価する。抗原特異的抗体の最大力価を提供する組み合わせにおけるＴＬＲアゴニストの１つ以上の比率を同定する。この製剤は、研究領域３の下での研究に挑戦するために進められるだろう。
＜タスク２Ａ．２：マウスにおける主要なコンボ製剤の反応原性および毒性の評価＞
感染症ワクチンは、健常者の集団において予防効果があるように設計されているため、ワクチンの安全性は開発目標の中で最も優先度が高いものでなければならない。したがって、候補製剤の毒性および反応原性を評価するための適切な実験が行われる。これらの実験および一般に、明白な毒性は、初期毒性評価として厳密に評価される。マウスにおける何らかの苦痛の徴候（すなわち、毛づくろいの欠如、可動性の問題、結膜、異常行動、反応性など）に注意する。全体的な観察に加えて、毒性測定は、完全血球数、血清化学評価（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、アミラーゼ、血中尿素窒素、クレアチニン、総タンパク質、グルコース、カリウム、カルシウム、ナトリウム、総ビリルビン）および剖検評価（ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した脾臓、肝臓および腎臓の切片）を含む。さらに、注射部位について、炎症の目に見える徴候および他の異常所見がないか評価する。剖検評価の一環として、注射部位の組織も組織学的に評価する。これらの研究を以下の表６に要約する。
＜タスク２Ｂ：防御的適応免疫応答を予測できる免疫マーカーの同定＞
前述したように、抗原特異的な適応免疫応答を最小限の反応原性で予測するバイオマーカーの同定は、臨床試験の設計および方法を容易にする。
＜タスク２Ｂ．１：自然免疫応答シグネチャー（サイトカイン、ケモカイン）＞
ケモカインによる局所的ワクチン投与部位への免疫細胞動員は抗原提示細胞（ＡＰＣ）を動員し、その後の適応免疫応答の誘導に影響を与えるために必須である。しかし、注射部位、すなわち筋肉組織は比較的少数の免疫細胞を含んでいるので、効果的なアジュバントは局所への免疫細胞の動員を誘導しなければならない。ＴＬＲ４はＴＬＲ７／８とは異なり、非免疫細胞上に豊富に発現し、炎症細胞を動員するのに十分なケモカインを発現することができる。ＴＬＲ刺激の後、ＡＰＣの動員は通常、炎症細胞に付随するため、炎症反応をアジュバント効果と区別することは困難である。これらの免疫活性化の複雑なカスケードは、インビトロアッセイだけでは研究できない。従って、マーカーのパネルは、マウスにおけるインビボ研究から得られたサンプルにおける上記のインビトロ実験から選択される。
主要なアジュバント製剤をマウスに筋肉内（ＩＭ）投与し、注射後１日目、３日目および７日目に血清を採取し、全身性サイトカイン／ケモカインのレベルを調べる。局所筋組織については上記のタスク２Ａ．２で述べたように、サイトカイン／ケモカインおよび共刺激分子遺伝子の発現は、ｑＰＣＲまたはＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイによって調べる。免疫細胞浸潤を、ヘマトキシリン－エオシン染色および免疫組織化学染色を用いた、選択されたサンプルの組織学的試験によって評価する。脾臓細胞またはＰＢＭＣを用いて、フローサイトメトリーによって評価される共刺激分子の発現を評価する。流入領域リンパ節を指示された時点で採取し、各実験群でプールし、免疫細胞集団およびケモカイン受容体、共刺激分子の発現について分析する。研究デザインの概要を表６に示す。「グループ５：抗原ありの複合アジュバント」グループは、サイトカイン／ケモカイン誘導の所望のプロファイルを提供するために必要に応じて、異なる比率のＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストの組み合わせを含み得ることに留意されたい。ＴＬＲ４リガンドおよびＴＬＲ７リガンドの両方の生物学的活性を示し、また反応原性にも関連する自然免疫シグネチャーが選択される。
Figure 2022525608000035
＜タスク２Ｂ．２：適応免疫応答シグネチャー＞
適応免疫応答を評価するための実験は、上記のタスク２Ａ．１と併せて実施される。次の基準を満たすバイオマーカー候補が同定される：１）末梢血で検出される、２）各ＴＬＲリガンドの作用機序により駆動され、それらの生物学的効果を相関させる、３）長期的な抗原特異的抗体誘導および広範な防御を予測する、４）反応原性を予測する。
＜結果および代替アプローチ＞
組み合わせたＴＬＲアゴニストの１つ以上の比率は、抗原特異的抗体の最大力価を提供する。さらに、２つのクラスのＴＬＲリガンドの組み合わせの使用は、ＴＬＲ４アゴニスト単独の使用と比較して、適応免疫応答のＴｈ１偏向応答へのシフトをもたらす。したがって、Ｔｈ１／Ｔｈ２応答比は増加する可能性が高い。このＴｈ１偏向は、異種ウイルス防御を含むように応答を広げるのに有利であり得る。毒性に関しては、イミダゾキノリンクラスのＴＬＲ７／８リガンドの全身および経口投与が高レベルの血清ＴＮＦαおよびＩＬ－１βを伴うインフルエンザ様症状、悪心およびリンパ球減少症を含む重篤な副作用を示している。これは、１Ｖ２７０がメンバーであるオキソアデニンクラスにも当てはまる。しかしながら、これらの望ましくない副作用の大部分は、ワクチン接種のための通常の局所投与経路、ＩＭを使用することによって回避することができる。さらに、ＴＬＲ７／８リガンドは、脂質部分へのコンジュゲーションによって、並びに製剤をカスタマイズすることによって調製され、アジュバント活性を維持しながら全身性サイトカイン放出を首尾よく減少させた。したがって、炎症性サイトカインへの全身暴露が低いため、主要な製剤化の組み合わせに関連する反応原性はほとんどまたは全くないであろう。
＜研究領域３：製剤の選択および免疫付与－マウスを用いたウイルス攻撃研究（Ｉｎｉｍｍｕｎｅ）＞
マウスを用いた前臨床免疫付与／ウイルス攻撃研究では、安定性（タスク１Ｂ）、免疫活性（タスク２Ａ．１）および反応原性プロファイル（タスク２Ａ．２）を含む製剤研究の結果に基づき、バックアップの組み合わせとともに主要な製剤の組み合わせが選択される。研究に使用されるウイルス抗原は、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルスおよびＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）様ウイルスなどのライセンスされた市販ワクチンに使用されている組換えワクチン抗原または不活化された全ウイルスのいずれかから選択され得る。
＜タスク３Ａ：主要なコンボ製剤の選択＞
主要な選択基準は、１）製剤化組み合わせの安定性、２）所望の抗原特異的抗体レベルを提供するＴＬＲアゴニストの比率、および３）局所および全身の両方での低い反応原性プロファイルに基づく。これらの基準に関連する特定の研究を表７に要約する。
主要な製剤化組み合わせおよびバックアップの主要な組み合わせの選択に続いて、マウスにおける免疫付与／ウイルス攻撃モデルにおける選択の評価を実施する（タスク３Ｂ）。
Figure 2022525608000036
＜タスク３Ｂ：主要な製剤による免疫付与／ウイルス攻撃研究＞
＜タスク３Ｂ．１：ウイルス攻撃研究のための最小防御用量の判断＞
不活化インフルエンザウイルスは自然免疫受容体リガンド（ＰＡＭＰＳ）を含むため、十分な抗原のみでマウスに免疫付与した後、一定の低レベルの防御が期待できると思われる。したがって、（もしあれば）不活化ウイルスを用いて、最小防御用量を判断するための研究を実施する。抗原の最小防御用量は、活性ウイルスの適合株によるその後の攻撃時に部分的防御（生存率３０％未満）しかもたらさない用量である。この戦略は、選択された主要な製剤化アジュバントの組み合わせで観察されるべき範囲の活性を可能にする。さらに、攻撃ウイルスの量はまた、免疫付与されていないマウスについて完全な死亡率（代表的には、約５ＬＤ５０の用量）をもたらすことが確認され得る。
＜タスク３Ｂ．２：同種ウイルス防御研究＞
抗原用量の範囲を見出す研究に続いて、マウスモデルを用いて、同種インフルエンザワクチン抗原とともに主要なアジュバントの組み合わせの免疫原性を評価する。成功の主な判断因子は、１）血清中の持続性インフルエンザ特異的ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１、２）致死性インフルエンザウイルス攻撃からの防御、３）低い反応原性、４）細胞内ＩＦＮγ／ＴＮＦα染色で評価した多機能性ＣＤ４＋対ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導である。副次的評価項目は、ワクチン接種またはインフルエンザウイルス攻撃後の体重増加／減少および観察可能な臨床症状（波状被毛、円背姿勢および努力性呼吸）のモニタリングによる疾患重症度のスコア化である。
＜一般的なインビボの方法＞
免疫学的評価：マウス（雌雄）にワクチン接種（アジュバント＋Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）等のインフルエンザ抗原）を１回又は２回、１回目接種と２回目接種との間に２１日間をおいてＩＭ投与する（図１２）。細胞性免疫（ＣＭＩ）は脾臓細胞培養物におけるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン誘導（ＥＬＩＳＡにより分析）および多機能性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ＦＡＣＳにより分析、１０色細胞内サイトカイン染色）を測定することにより、１群４匹のマウスのサブセットで評価される。さらに、四量体染色および細胞表面表現型検査を行い、インフルエンザ特異的メモリーＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定する。インフルエンザ特異的体液性応答は血清中（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）で測定され、ＨＩ力価は機能的抗体価を測定するために用いられる。ワクチン接種したマウスおよび対照のマウスの各群は５ＬＤ５０のＡ／ＨＫ／６８（Ｈ３Ｎ２）で攻撃され、生存率、体重増減、及び疾病重症度を２１日間評価した。これらのマウス研究における反応原性は、体重減少および症状スコアと注射部位浸潤の評価とによって測定される。ｐ値の差が＜０．０５であれば、有意であるとみなす。すべてのデータについて分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＴｕｋｅｙ ＡＮＯＶＡを実施し、頑健な統計的有意性を実証する。
＜タスク３Ｂ．３：異種ウイルス防御研究＞
同種防御研究に続いて、異種または異種サブタイプ防御のマウスモデルにおける主要なアジュバントの組み合わせを評価するために同じ研究デザインが用いられる。マウスに上記のように免疫付与するが（タスク３Ｂ．２）、異なったＨＡ／ＮＡタイプのインフルエンザウイルス株（例えばＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１））で攻撃する。このような攻撃モデルにおいて観察される防御は、ＨＡタンパク質の茎領域のような、両方の株に共通の抗原を含む抗原特異的応答の広がりを示唆する。このような広がりを確認するために、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の配列の研究が行われる。
＜結果および代替アプローチ＞
前述したように、増えつつある文献報告では、ワクチンを介した免疫の大きさを相乗的に増大させ、それによって生じた下流の適応免疫応答のタイプを変更させ、それによってこれらのワクチンのエフィカシーを高めることができる様々なＴＬＲアゴニストの組み合わせが引用されている。インフルエンザウイルス攻撃防御のためのアジュバントの組み合わせは、本明細書中に記載される。
〔実施例３〕
＜ワクチン抗原としてのインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）＞
広範に中和茎抗体を増強する戦略には、１）頭部ドメイン全体を除去して茎ドメインをより「利用可能」にし、従って茎ドメインに対する抗体応答を誘導するヘッドレスＨＡに焦点を当てること、または２）Ｈ１、Ｈ３またはＢ型インフルエンザウイルス由来の茎ドメインからなるキメラＨＡを組み合わせて使用すること、が含まれる。
１つの抗原での免疫付与は、第２の類似の抗原に対する強力な免疫応答をブロックすることが知られている（「抗原原罪」）。これは、感染を繰り返す感染症（インフルエンザ）、あるいは抗原進化がある感染症（ＨＩＶ、マラリア）にとって重要である。インフルエンザについて、主要な中和抗体はウイルスの血球凝集素（ＨＡ）の頭部領域に対して作られる。異なるウイルス株は異なるＨＡ頭部領域を有し、抗体と弱く交差反応するが、新しいエピトープに対する応答を阻害する。ＨＩＶについては、ウイルス上の変異エピトープはエピトープ抑制のために抗体またはＴ細胞を刺激しない。
ワクチンにおける抗原原罪の機序はエピトープ排除（既存の抗体、特に粘膜ＩｇＡがワクチンをすべての抗原提示細胞（ＡＰＣ）から遮蔽する）；樹状細胞アクセス（メモリーＢ細胞が新たなワクチンを内部に取り込み、ＤＣ活性化およびＴ細胞免疫付与が低下する）；および／またはＴ細胞競合（メモリーＢ細胞が活性化され、サイトカイン、補助因子を消費し、抗原をロードしたＤＣと反応し得るＴ細胞を捕捉する）による可能性がある。
ワクチン中の抗原原罪を克服するために、投与量を増やすことがある（例えば、大量のワクチン用量（６０歳を超える患者には３倍量のインフルエンザワクチンを投与する））；カプセル化（ワクチンを樹状細胞に優先的に送達するエマルジョンまたはリポソームの中にワクチンを入れる（Ｓｈｉｎｇｒｉｘ、帯状疱疹に対する水痘ワクチン））；および／または樹状細胞活性化因子（ＴＬＲアゴニストはワクチン抗原に対する活性化Ｔ細胞の数の多様性を増大させる可能性がある）。
マウスモデルにおいて抗原原罪を研究するために、以下が使用され得る：ハプテン－タンパク質コンジュゲート（ハプテンはオボアルブミンおよびＫＬＳのようなタンパク質抗原に結合され得る、フルオレセインまたはＤＮＰのような小分子である）；または非コンジュゲートタンパク質抗原での予備免疫付与はハプテン－タンパク質コンジュゲートによる免疫付与に対する抗体応答を阻害する。これらのモデルにおけるインフルエンザについては、１つのウイルス株について、インフルエンザＨＡなどの１つのタンパク質で過剰免疫付与し、別の株由来の部分的交差反応性ＨＡで追加免疫し、次に、認識されたエピトープ、ｎｅｘｇｅｎＲＮＡシーケンシングによるクローンの多様性、および中和能を含む、２つ目のＨＡに対するＢ細胞およびＴ細胞の免疫応答を分析し、その後インビボ防御との相互関係を明らかにする。
Ｓｈｉｎｇｒｉｘは、使用時に再構成される、緩衝食塩水中のジオレオイルホスファチジルコリンおよびコレステロールから作製されたリポソーム製剤中の組換えＶＳＶ糖タンパクＥ、サルモネラ由来のノノホスホリル脂質Ａ、およびＱＳ－２１サポニン分子である。Ｓｈｉｎｇｒｉｘに類似したインフルエンザワクチンを作製するために、このワクチンは、タンパク質抗原、リポソーム製剤中の２つのアジュバントを有する。
〔実施例４〕
毎年のインフルエンザワクチンの有効性は、インフルエンザウイルスの抗原浮動のため、依然として１０～６０％と評価されている。合成ＴＬＲ４およびＴＬＲ７アゴニスト（１Ｚ１０５および１Ｖ２７０）は、それぞれＴｈ２およびＴｈ１を介した抗血球凝集素抗体生産を増強した。１Ｚ１０５と１Ｖ２７０との組み合わせは、インフルエンザウイルス感染を防御するために、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫を促進した。アジュバントのエフィカシーを高めるために、１Ｚ１０５および２Ｂ１８２Ｃについて構造活性相関研究を実施した。これは、インビトロでよりポテンシーの高い誘導体であった。モデル抗原であるオボアルブミンを用いたインビボワクチン研究では、２Ｂ１８２Ｃは、より高い血清ＩｇＧ１レベルを誘導し、１Ｖ２７０によって誘導される抗原特異的ＩｇＧ２ａの放出を追加的に増強した。さらに、２Ｂ１８２Ｃおよび１Ｖ２７０のリポソーム製剤は、細胞毒性および反応原性を低下させ、Ｔｈ１を介した抗体生産およびＴｈ２を介した抗体生産の両方を増強する活性を維持した。不活化Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ｐｄｍ０９）を抗原としたインビボワクチン接種研究において、リポソーム組み合わせアジュバントはＴ濾胞ヘルパー細胞、胚中心Ｂ細胞及び抗体分泌形質細胞の集団を増加させた。流入鼠径リンパ節におけるＢおよびＴリンパ球の次世代配列分析は、複合アジュバントが免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）遺伝子のＢ細胞クローン型を増加させ、Ｂ細胞クローンおよびＴＣＲクローナリティを共有することを示した。これらの知見は、組み合わせが抗原特異的Ｔｈ１免疫応答を増強することに寄与することを示唆した。最後に、組み合わせアジュバントを有するワクチンは、肺のダメージがより少ない致死的な同種ウイルス攻撃に対して防御した。
＜方法＞
＜マウス＞
雌の６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ（Bar Harbor, MA）から購入した。カリフォルニア大学サンディエゴ校動物施設において、オボアルブミンまたは不活化インフルエンザウイルスを抗原とし、生ウイルス攻撃を必要としない動物実験を実施した。インフルエンザ攻撃研究はユタ州立大学のＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒにより、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）を用いて行った。すべての動物実験は、ＵＣ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏまたはユタ州立大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）による事前承認を受けた。
＜細胞および試薬＞
ＴＬＲ４／ＮＦ－ｋＢレポーター細胞株ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭヒトＴＬＲ４およびＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭマウスＴＬＲ４細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号、San Diego, CA）から購入した。マウス初代ＢＭＤＣを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨から採取した骨髄細胞から調製した。ＢＭＤＣを、１０％ＦＢＳ（Omega, Tarzana, CA）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００ユニット／ｍＬ／１００μｇ／ｍＬ、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を補充したＲＰＭＩ中の示された化合物で処理した。モノリン脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、ＡｄｄａＶａｘは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カタログ番号San Diego, CA）から購入した。不活化インフルエンザＡ型ウイルス［Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９］（ＩＩＡＶ）は、ＢＥＩリソース（#NR-49450, Manassas, VA）から入手した。ＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０、ＴＬＲ４アゴニスト１Ｚ１０５および２Ｂ１８２Ｃを含むその誘導体を合成した。１Ｖ２７０（２０μＭ）、２Ｂ１８２Ｃ（４ｍＭ）および１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ（２０μＭ＋４ｍＭ）のリポソーム製剤をＩｎｎｉｍｕｎｅ ｃｏｒｐ．（Missoula, MT）で行った。
＜ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢレポーター細胞アッセイ＞
ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢ活性化を、ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ４およびＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｍＴＬＲ４（InvivoGen）を用いて評価した。細胞を１Ｚ１０５および２Ｂ１８２Ｃ（１０μＭから始まる２倍連続希釈）で２０時間処理した。培養上清中のＮＦ－κＢ誘導性分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）タンパク質を、製造業者のプロトコルに従って測定した。
＜インビボにおける抗体生産の評価＞
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目および２１日目に、ＩＡＶ（１０μｇ／注射）に加えて指示されたアジュバントを後肢の腓腹筋に、筋肉内（ｉ．ｍ．）で免疫付与した。各処置におけるアジュバントの詳細な濃度および動物の数を、各図の凡例に記載する。２８日目に血清を採取し、抗原特異的抗体（抗ＨＡ ＩｇＧ１、抗ＮＡ ＩｇＧ１、抗ＨＡ ＩｇＧ２ａ、抗ＮＡ ＩｇＧ２ａ、抗ＨＡ ＩｇＭおよび抗ＮＡ ＩｇＭ）について評価した。これらの抗体についてのＥＬＩＳＡを、以前に記載されたように行った（参考文献）。ＤＭＳＯ製剤を用いた研究のために、１０％ＤＭＳＯをビヒクルとして使用した。リポソーム製剤化アジュバントを使用する実験において、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンおよびコレステロール（ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、対照リポソーム）をビヒクルとして使用した。
＜ＢＣＲおよびＴＣＲレパトアのＮＧＳアッセイ＞
免疫付与プロトコルを図２８Ａに示した。簡潔には、マウスを２８日目に屠殺し、鼠径リンパ節を採取した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてリンパ球（バルク）から全ＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Agilent, Santa Clara, CA）によりＲＮＡの品質を確認した。次世代シーケンシングを、偏りのないＴＣＲレパトア分析技術（Repertoire Genesis Inc., 大阪、日本）を用いて行った。
＜致死性インフルエンザウイルス攻撃からの防御の評価＞
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、製剤化１Ｖ２７０および２Ｂ１８２Ｃを用いてＩＩＡＶ（３ｕｇ／注射）で０日目にｉ．ｍ．ワクチン接種し、２１日目に同種または異種インフルエンザＡ型ウイルス、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（ｐｄｍＨ１Ｎ１）およびＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）それぞれを鼻腔内に感染させた。同種ウイルスの攻撃から３０～５０％の動物を防御するＩＩＡＶ；３μｇ／注射の免疫付与用量を予備実験で判断した。インフルエンザウイルス攻撃のために、マウスの群を、ケタミン／キシラジン（５０ｍｇ／ｋｇ／５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔した後、マウス１匹あたり１×１０５（３×ＬＤ５０）の細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）のインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）ウイルス；マウス１匹あたり５×１０２（３×ＬＤ５０）ＣＣＩＤ５０のインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを９０μＬ懸濁液中で鼻腔内攻撃した。研究２１日目に全てのマウスにウイルス攻撃を行った。株指定１７５１９０のインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）は、Ｄｒ．Ｅｌｅｎａ Ｇｏｖｏｒｋｏｖａ（Department of Infectious Diseases, St. Jude Children’s jemResearch Hospital, Memphis TN）から受領した。このウイルスはマウスの９継代によりＢＡＬＢ／ｃマウスの肺での複製に適応した。ウイルスはＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞においてプラーク精製され、そしてウイルスストックは胚化ニワトリ卵、次いでＭＤＣＫ細胞における増殖によって調製された。インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Manassas, VA）から入手した。このウイルスは当初マウスには致死的ではなかったが、感染動物の肺で７回連続継代すると致死となった。マウス適応後、ウイルスストックを、ＭＤＣＫ細胞中での増殖によって調製した。
＜肺ウイルス力価および肺炎症の測定＞
ウイルス攻撃６日後、採血直後に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）処置を行い、各動物の死亡から５～１０分以内に終了した。０．７５ｍＬの体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、気管チューブを通して肺にゆっくりと送達した。送達直後に、穏やかな吸引によって流体をゆっくりと引き出し、サンプルを－８０℃で保存した。この手順を合計３回繰り返し、各マウスからの洗浄液をプールした。肺ウイルス力価を測定するために、ＢＡＬサンプルを２０００ｇで５分間遠心分離した。様々な１０倍希釈のＢＡＬ上清を、ＭＤＣＫ細胞中の感染性ウイルスについて３連でアッセイし、ウイルス力価を計算した。肺サイトカインレベルの測定のために、各々の肺洗浄からのサンプル（２００μＬ）を、製造業者の指示書に従って、化学発光多重ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して、ＭＣＰ－１およびＩＬ－６について試験した（Quansys Biosciences Q-PlexTM Array, Logan, UT）。
＜血球凝集抑制力価＞
血球凝集抑制（ＨＩ）力価については、血清を受容体破壊酵素ＩＩ（RDE;Vibrio cholerae neuraminidase;YCC-340;Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY）で前処理して、１部の血清を３部の酵素で希釈し、３７℃で１８時間インキュベートすることによって非特異的阻害剤を除去した。続いて、ＲＤＥを５６℃で４５分間加熱することによって不活性化した。血清サンプルを、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Fisher Scientific, Pittsburg, PA）中のＰＢＳ中で希釈した。血清の希釈後、８ＨＡユニット／ウェルのインフルエンザＡ／ＣＡ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）またはインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスに加えて七面鳥赤血球（Lampire Biological Laboratories, Pipersville, PA）を添加し（ウェル当たり５０μＬ）、短時間混合し、室温で６０分間インキュベートした。血清サンプルのＨＩ力価は、血球凝集が完全に阻害された最高血清希釈の逆数として示される。
＜ウイルス中和力価＞
抗インフルエンザウイルス中和抗体アッセイのために、ＭＤＣＫ細胞を、使用の２４時間前に、５％ＦＢＳ（Hyclone, Logan, UT）を含むＭＥＭ中、１ウェルあたり１×１０４細胞で９６ウェルプレートに播種した。血清サンプルの連続２倍希釈物を、１：３２希釈で開始し、１：４０９６で終了する、１０ユニット／ｍＬトリプシンおよび１μｇ／ｍＬ ＥＤＴＡを含有する無血清培地中で調製した。各血清希釈物を、約１００ＣＣＩＤ５０／ウェルＨ１Ｎ１ｐｄｍまたはインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスを含有する無血清培地（トリプシンおよびＥＤＴＡを含む）と１：１（０．１ｍＬ）で混合した。室温で１時間インキュベートした後、血清－インフルエンザウイルス混合物（０．２ｍＬ）を、ＭＤＣＫ細胞を含むウェルに移し、３日間インキュベートした。抗インフルエンザウイルス中和抗体を細胞変性効果（ＣＰＥ）阻害として測定した。感染後３日目に光学顕微鏡下でＭＤＣＫ細胞単層を調べることによって、ＣＰＥを二重サンプルからスコア付けした。
＜統計解析＞
インビボ研究で得られたデータは平均標準誤差（ＳＥＭ）とともに平均値として提示され、インビトロデータは標準偏差（ＳＤ）とともに平均値として示される。インビトロデータについては、Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定を用いて２群を比較した。抗原特異的抗体については免疫細胞集団に対するフローサイトメトリー解析、ＢＣＲ－ｓｅｑ、ＴＣＲ－ｓｅｑ、肺ウイルス力価、ＨＩエンドポイント力価及びＶＮエンドポイント力価についてはＤｕｎｎの事後検定とともにＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を適用した。肺ウイルス力価とサイトカイン／ケモカインレベルとの相関を、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関検定を用いて解析した。体重については、曲線下面積を各マウスについて計算し、一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析に使用した。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線間の有意差の検定にはログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いた。Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA）を使用した。Ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意であるとみなした。
Figure 2022525608000037
Figure 2022525608000038
Figure 2022525608000039
Figure 2022525608000040
＜結果＞
＜１Ｚ１０５の構造活性相関の研究から２Ｂ１８２Ｃが得られた＞
小分子ピリミドインドールＴＬＲ４リガンド、１Ｚ１０５に対するポテンシーを改善するために、構造活性相関分析を行った（化学者が補うであろう）。合計５６の化合物を合成し、ヒトおよびマウスのＨＥＫ ＴＬＲ４レポーター細胞（それぞれ、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｍＴＬＲ４およびｈＴＬＲ４）によってスクリーニングした。これらのＳＡＲ化合物の中で、２Ｂ１８２Ｃは、マウスおよびヒトの両方のレポーター細胞において、より高いＴＬＲ４刺激ポテンシーを有する誘導体として発見された。２Ｂ１８２ＣのＥＣ５０を、ＨＥＫ ＴＬＲ４レポーター細胞を用いて調べ、１Ｚ１０５のＥＣ５０と比較した（図２１Ｂ）。マウスおよびヒトのＴＬＲ４レポーター細胞における２Ｂ１８２ＣのＥＣ５０は、１Ｚ１０５のＥＣ５０と比較して、それぞれ５．８倍および８７０倍増加した。これらのデータは、ＳＡＲ研究がより高いＴＬＲ４刺激ポテンシー、特にヒトＴＬＲ４ポテンシーを示す誘導体を首尾よく生じたことを示す。
＜ＴＬＲ４アゴニスト２Ｂ１８２ｃは抗原特異的ＩｇＧ１の生産を増強した＞
ＴＬＲ４アゴニスト１Ｚ１０５はＴｈ２を介したＩｇＧ１生産を誘導し、ＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０はインフルエンザウイルスに対するＴｈ１細胞免疫を増強した（Goff et al., J. Virol., 89:3221 (2015); Goff et al., J. Virol., 91:e01050 (2017)）。１Ｖ２７０と組み合わせることで、インフルエンザワクチンアジュバントとしてのＴＬＲ４アゴニスト２Ｂ１８２Ｃのエフィカシーを向上できると仮定した。したがって、１Ｖ２７０を伴う２Ｂ１８２Ｃが、１Ｚ１０５と１Ｖ２７０とを用いたコンボアジュバントと比較して、インビボでのアジュバント性を改善するかどうかを調べた。
効果的な複合ワクチンアジュバントを開発するために、１Ｚ１０５および２Ｂ１８２Ｃのポテンシーおよび単剤としての最適な用量を、不活化インフルエンザＡウイルス［Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９］（ＩＩＡＶ）を抗原として用いて比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＴＬＲ４アゴニスト、１Ｚ１０５または２Ｂ１８２Ｃと混合したＩＩＡＶで０日目および２１日目に免疫付与し、２８日目に採血した（図２２Ａ）。血清はＥＬＩＳＡにより、ウイルス表面の２種類の糖タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対する抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）について評価した。１Ｚ１０５および２Ｂ１８２ＣはＤＭＳＯ中で溶解され、ＤＭＳＯの最終濃度は１０％であった。結果は、２００ｎｍｏｌ／注射というより高い用量を有する２Ｂ１８２ＣがＨＡおよびＮＡの両方に対するＩｇＧ１抗体を有意に増加させたことを示した（図２２Ｂ）。興味深いことに、２Ｂ１８２Ｃは抗ＮＡ特異的ＩｇＧ２ａを増強したが、１Ｚ１０５は増強しなかった（図１２Ｃ）。抗ＨＡ ＩｇＭレベルは、２Ｂ１８２Ｃによってほんのわずかに増加した（図２４Ａ）。
＜２Ｂ１８２ＣとＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０との組み合わせは抗原特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方を増加させた＞
次に、抗体生産に対するこれらのＴＬＲ４アゴニストの共アジュバント効果を、１ｎｍｏｌ／注射の用量でＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０と組み合わせた場合に分析した。１Ｖ２７０は、Ｔｈ１免疫応答を増強するＩｇＧ２ａ生産を誘導することが報告された（Goff et al., 2017）。結果は１Ｖ２７０単独では抗ＨＡ ＩｇＧ２ａ生産のみを誘導したが、２Ｂ１８２Ｃと組み合わせると、ＨＡおよびＮＡの両方に対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体が有意に誘導されたことを示した。これは、これらの化合物が付加的な様式で作用し得ることを示唆する（図２３Ａおよび２３Ｂ）。一方、１Ｚ１０５は、１Ｖ２７０によって誘導されたＩｇＧ２ａ生産を増強しなかった。１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃグループの動物はより多くの量のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方を生産し、免疫バランスはＴｈ１を介したＩｇＧ２ａ生産に向かう傾向があり、この治療はＴｈ１免疫応答を増強することに寄与することを示唆している（図２３Ｃ）。１Ｖ２７０と２Ｂ１８２Ｃとの組み合わせは、抗ＨＡ ＩｇＭ生産に対して中程度の効果を示した（図２４Ｂ）。
まとめると、２００ｎｍｏｌ／注射の２Ｂ１８２Ｃと１ｎｍｏｌ／注射の１Ｖ２７０との組み合わせは、最高量の抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ並びにＴｈ１に偏った免疫応答を誘導し、インフルエンザウイルス感染における防御に望ましいものであった。従って、この組み合わせを次の製剤のために選択した。
＜リポソーム製剤は、細胞毒性を低減させる２Ｂ１８２Ｃを改良した＞
上記の結果を考慮して、１／２００の１Ｖ２７０／２Ｂ１８２Ｃ比率（ＴＬＲ４／ＴＬＲ７）［１ｎｍｏｌ／注射（２０μｍＭ）の１Ｖ２７０および２００ｎｍｏｌ／注射（４ｍＭ）の２Ｂ１８２Ｃ］を使用した。ワクチンに対する応答を維持しながら、望ましくない細胞毒性および反応原性を回避するために、化合物の製剤を調整することは、ワクチンアジュバントの開発において重要であり得る。従って、１Ｖ２７０および２Ｂ１８２ｃは、Ｉｎｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｒｐ（Missoula, MT）によってリポソーム中に製剤化。製剤化化合物の活性を、マウス初代ＢＭＤＣにおいて試験した。これらの製剤化化合物は、ＤＭＳＯ製剤化合物と同様のレベルのＩＬ－１２分泌を維持した（図２５Ａ）。ＤＭＳＯ－２Ｂ１８２ＣまたはＤＭＳＯ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃにより誘導された細胞毒性はリポソーム製剤により有意に改善された（図２５Ｂ）。注射部位における筋肉のＨ＆Ｅ染色による組織学的分析を図２５Ｃに示す。化合物の投与後の血清の多重サイトカイン／ケモカイン分析を図２５Ｄに示す。
＜リポソーム１Ｖ２７０および２Ｂ１８２Ｃは、抗ＨＡおよび抗ＮＡ ＩｇＧ１、並びにＩｇＧ２ａの生産を相乗的に強化した＞
インビボでの化合物のアジュバント性を、図２２Ａに記載のプライム－ブーストレジメンを用いて評価した。２８日目に採取した血清を、ＥＬＩＳＡによって抗原特異的抗体について評価した。結果はリポ－２Ｂ１８２Ｃがより高いレベルのＩｇＧ１を誘導することを示し、これはＤＭＳＯ－２Ｂ１８２Ｃと一致した（図２６Ａ）。ＤＭＳＯ－１Ｖ２７０とは異なり、リポ－１Ｖ２７０単独ではＩｇＧ２ａ生産を促進しなかった（図２６Ｂ）。各アゴニストによるＩｇＧ２ａに対するこれらの最小の効果にもかかわらず、２つのアジュバントを組み合わせた場合、抗原特異的抗体の生産は相乗的に増強された（図２６Ｂ）。一方、リポソームビヒクル、１Ｖ２７０、２Ｂ１８２Ｃおよび１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃによって誘導された総ＩｇＧレベルは同等であった（図２６Ｃ）。抗原特異的ＩｇＭレベルはいずれの処置によっても影響を受けなかった（図２７）。ＤＭＳＯ製剤で観察された傾向と一致して、リポソーム複合アジュバントは、Ｔｈ１偏向免疫バランスを発現した（図２６Ｄ）。
＜製剤化１Ｖ２７０プラス２Ｂ１８２Ｃは抗体分泌応答を増強した＞
製剤化アジュバントが抗原特異的抗体分泌を促進するＢ細胞の活性化を誘導するかを調査するために、鼠径リンパ節のリンパ球を、フローサイトメトリーを用いてＴｆｈ細胞、ＧＣ Ｂ細胞、形質芽球および形質細胞について調べた。上記の免疫付与プロトコルを使用し、鼠径リンパ節中のリンパ球を２８日目に採取し、フローサイトメトリーによって分析した（図Ｓ２８Ａおよび２８Ｂ）。その結果、ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＰＤ－１＋ ＣＸＣＲ５＋細胞として確認されたＴｆｈ細胞の割合は、リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃによって大幅に増加した（図２８Ｂおよび図２９）。さらに、複合アジュバントは、ＧＣ Ｂ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ９５＋ ＧＬ７＋）のパーセンテージを増加させた。リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃを接種したマウスでは、形質芽球および形質細胞の増加が観察された。これらの結果は、複合アジュバントが単一の薬剤と比較してＧＣ反応を増強することを示唆する。
＜１Ｖ２７０と２Ｂ１８２Ｃとを用いたコンボアジュバントによるＢＣＲ多様性およびＴＣＲクローナリティの増加＞
複合アジュバントがＢＣＲの多様性に影響するかどうかを調べるために、ＩＧＨ遺伝子について次世代シークエンス分析を行った（Repertoire Genesis Inc, 大阪、日本による）。プライムブーストＩＩＡＶモデルを用い、２８日目に鼠径リンパ節のリンパ球を採取した（図３０Ａ）。ＢＣＲ配列分析から、Ｐｉｅｌｏｕの指数で示される総リード数に正規化されたＢＣＲ多様性は、リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃによって有意に増加したことが示された（図３０Ａ）。同様の分析によってＩｇＧ遺伝子のクローン型を分析し、グループ内の２つのマウス間でＩＧＨクローンを比較し、共有クローンがあるかどうかを調べ、Ｊａｃｃａｒｄ指数を算出した；Ｊａｃｃａｒｄ指数；Ｊ（Ａ、Ｂ）＝（Ａ∩Ｂ）／（Ａ∪Ｂ）（図３０Ｂ）。ＩＧＨ、ＩＧＨＧ１およびＩＧＨＧ２ＡのＪａｃｃａｒｄ指数はリポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃにより有意に増加し、このグループ内で２つのマウス間で共有されたクローンが増加したことを示した。さらに、リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２ｃグループでは、６クローン（０．０３％）が３つのマウス間で共有された。これらの結果は、リポソーム複合アジュバントが総ＩＧＨおよびＩＧＨＧ２ＡにおけるＢＣＲ多様性を増加させたことを示唆する。これは、複合アジュバントの免疫付与後のより高いＩｇＧ２ａレベルと一致する。複合アジュバントで免疫付与されたグループで検出された共通のクローンは、抗原の優性エピトープを認識し得る。ＴＣＲシーケンシングを行い、製剤化アジュバントが抗原に対するｆ ＴＣＲクローナリティの増加に寄与するかどうかを調べた。予想された通り、複合アジュバントおよびリポ－２Ｂ１８２ＣはＴＣＲαおよびＴＣＲβのクローナリティを増加させた（図３０Ｃ）。まとめると、リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃの動物は、より高いＢＣＲ多様性およびＴＣＲクローナリティを示した。これは、Ｔｈ１応答が複合アジュバントによって増強されるというデータを支持し得る。
＜リポ－２Ｂ１８２Ｃおよびリポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃは、同種インフルエンザウイルスに対して、マウスを防御する。＞
複合アジュバントは、多様なＢＣＲおよびＴＣＲの高いクローナリティを伴うＴｈ１偏向免疫応答を誘導した。この多様性がインフルエンザウイルスに対する免疫応答の兆候となり得るかどうかを試験するために、製剤化１Ｖ２７０および２Ｂ１８２ｃを、同種および異種のインフルエンザウイルス攻撃モデルで試験した。ＩＩＡＶに加えてリポソーム１Ｖ２７０、２Ｂ１８２Ｃまたは１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃをワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスは、ワクチン接種（単回接種）後２１日目に、同種（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスで鼻腔内を攻撃した。マウスの体重および生存率をさらに２１日間モニターした（図３１Ａ）。リポ－２Ｂ１８２Ｃおよびリポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃは、ウイルス感染後の体重減少を有意に抑制した（図３１Ｂ）。さらに、同種インフルエンザウイルスに対して、リポ－１Ｖ２７０は９０％の防御を示し、リポ－２Ｂ１８２Ｃおよびリポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃはマウスを完全に防御した（図３１Ｃ）。マウスの生存率が肺におけるウイルス力価と相関するかどうかを評価するために、気管支肺胞洗浄を、洗浄液中のウイルス力価のために実施した。その結果、リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃは、６日目において、ウイルス力価を効果的に抑制することを示した（図３１Ｄ）。ヒトでは、気道上皮細胞（例えばＭＣＰ－１、ＩＬ－６など）におけるサイトカインおよびケモカインのアップレギュレーションが致死的な肺損傷および肺炎と相関している（Gurczynski et al., Mucosal Immun., 12:518 (2019); Zhou et al., Nature, 499:500 (2013)）。そこで、Ｑｕａｎｓｙｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＥＬＩＳＡを用いて肺液中の炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－６）およびケモカイン（ＭＣＰ－１）のレベルを評価した。結果は、複合リポソームアジュバントがＭＣＰ－１およびＩＬ－６の両方の生産を有意に抑制したことを示した（図３１Ｅ）。炎症誘発性サイトカインのレベルは、肺ウイルス力価と相関していた［ＭＣＰ－１（Ｐ＜０．０００１、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．８３）、ＩＬ－６（Ｐ＜０．０００１、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．７９）］（図３１Ｆ）。この傾向は、リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃグループにおいてさらに増強された。これらの結果は、複合アジュバントが感染後のウイルスの侵入および増殖を阻害することにより肺のダメージを減少させることを示唆した。防御が血球凝集抑制力価（ＨＩ）およびウイルス中和力価（ＶＮ）に関連しているかどうかを評価するため、免疫付与後２１日目に血清を採取し、ＨＩおよびＶＮについて調べた（図３１Ａ）。非免疫付与グループと比較したＨＩ力価の増加は、リポ－１Ｖ２７０、リポ－２Ｂ１８２Ｃ、およびリポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃの２０匹中１９匹のマウスで観察された（図３１Ｇ）。さらに、リポ－２Ｂ１８２ｃおよびリポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃは、リポソーム対照と比較して有意に高いＶＮを誘導した（図３１Ｈ）。ＶＮ力価は肺ウイルス力価と負の相関を示した（Ｐ＜０．０１、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝－０．５９、図２７Ｉ）。異種インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ３／７５（Ｈ３Ｎ２）に対する防御は、同種攻撃実験と同じプロトコルを用いて評価した（図３１Ａ）。リポソーム対照群と比較して、体重減少、生存率および肺ウイルス力価に有意差はなかった（図３２Ａ～Ｃ）。まとめると、製剤化複合アジュバントは異種防御には不十分であるが、有害な炎症作用なしに同種Ｈ１Ｎ１ウイルスに対して有意な防御を示した。
Figure 2022525608000041
〔実施例５〕
＜１Ｖ２７０（ＴＬＲ７リガンド）および２Ｂ１８２Ｃ（ＴＬＲ４リガンド）のリポソーム共カプセル化は抗体エピトープを広げる＞
インフルエンザウイルス感染の普遍的ワクチンは、主要抗原分子である血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の広範なエピトープを認識する抗体の誘導を必要とする。従って、複合アジュバント（１Ｖ２７０および２Ｂ１８２Ｃ）によって誘導された抗体のエピトープの広がりおよび交差反応性を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５～１０）を、１Ｖ２７０（Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０）、２Ｂ１８２Ｃ（Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ）、共カプセル化リポソーム１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ［Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）］のリポソーム製剤と混合した不活化ウイルスで免疫付与し、別々のリポソーム中のＬｉｐｏ－１Ｖ２７０とＬｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃとを添加混合した。ブランクリポソームを対照として使用し、０日目（プライム）および２１日目（ブースト）に免疫付与を行い、２８日目に血清を収集した。
エピトープの広がりは、ＨＡペプチドＥＬＩＳＡによって評価した。インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスの重複ＨＡペプチドアレイ（１３９ペプチド）を、ＢＥＩリソースから入手した。５つの連続したペプチドからなるプールしたペプチド（合計２８プール）をＥＬＩＳＡプレート上に配置した。１：２００で希釈した血清を、ＯＤ４０５～５７０によって各ペプチドプールに対する反応性について試験した。各血清のＯＤをヒートマップ上にプロットし（図３８Ａ）、個々の動物の平均ＯＤを比較した。共カプセル化リポソーム１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ［Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）］でワクチン接種されたマウスからの血清は、単一リガンドまたは混合物のリポソーム製剤と比較して有意に高いＯＤを示した（図３８Ｂ）。これらのデータは、Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）が広範囲のＨＡエピトープを認識する抗体応答を誘導したことを示す。
Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）によって誘導された広範なＨＡエピソープの認識が異なったインフルエンザウイルス感染のサブタイプの交差防御と関連しているかどうかを調べるために、ＥＬＩＳＡによってＨＡおよびＮＡの様々なサブタイプに対する抗体の交差反応性を検証した（図３９および４０）。異なる系統発生的距離に属するＨＡおよびＮＡのサブタイプ。共カプセル化Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）で免疫付与したマウスからのＩｇＧの幾何平均力価（ＧＭＴ）は、リポソーム単一リガンドまたは追加混合した２つの別々のリポソームと比較して、グループ１（Ｈ１、Ｈ１１、Ｈ１２）からのＨＡだけでなく、グループ２（Ｈ３およびＨ７）のＨＡとも高い反応性を示した。広範な反応性は、ＮＡの異なるサブタイプに対しても観察された。要約すると、ＩＩＡＶとＬｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）とをワクチン接種した動物で生産された抗体は、ＨＡおよびＮＡの異なるサブタイプに対して高度に交差反応性を示した。
全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して記載されており、多くの詳細が例示の目的で記載されているが、本発明は追加の実施形態が可能であり、本明細書に記載される特定の詳細は本発明の基本原理から逸脱することなく、かなり変更されてもよいことが、当業者には明らかであろう。
例示的なリポソーム製剤。 ＤＭＳＯまたはリポソーム製剤中の１Ｖ２７０（１μＭ）、２Ｂ１８２Ｃ（２００μＭ）、または１Ｖ２７０（１μＭ）と２Ｂ１８２Ｃ（２００ｍＭ）との組み合わせのインビトロ免疫刺激活性。ＤＭＳＯまたはリポソーム製剤において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のマウス骨髄由来樹状細胞を１Ｖ２７０（１μＭ）、２Ｂ１８２Ｃ（２００μＭ）、または１Ｖ２７０（１μＭ）と２Ｂ１８２Ｃ（２００ｍＭ）との組み合わせと共に１８時間インキュベートした。培養上清におけるＩＬ－６の放出をＥＬＩＳＡによって測定した。 リポソーム製剤は、ＴＬＲ４非依存性細胞毒性を軽減する。ＤＭＳＯまたはリポソーム製剤において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬＲ４欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）由来のマウス骨髄由来樹状細胞を、１Ｖ２７０（１μＭ）、２Ｂ１８２Ｃ（２００μＭ）、または１Ｖ２７０（１μＭ）と２Ｂ１８２Ｃ（２００ｍＭ）との組み合わせとともに１８時間インキュベートした。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって評価した。 例示的な実験プロトコル。 製剤に対する抗ＨＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベル。 製剤に対するＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率。 ＧＣ細胞および形質芽球のゲーティング戦略。 １Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘの投与によって誘導される細胞型。製剤化１Ｖ２７０と２Ｂ１８２ｃとの組み合わせは、ＧＣ Ｂ細胞および形質芽球の数を有意に増加させた。 １Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘの投与により誘導される、ＥＬＩＳＡによって測定された抗－ＨＡ ＩｇＧレベル、またはＢＣＲ－ｓｅｑとしての抗－ＨＡ ＩｇＧレベル。ＩｇＧ２ａ生産は組み合わせ処置により強く増加し、Ｔｈ１応答は製剤化２Ｂ１８２ｃにより誘導された。 ＢＣＲ多様性は、組み合わせ処置により増加した。 抗原と、Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘとの投与後のＴＣＲクローナリティ。ＴＣＲクローナリティは、２Ｂ１８２ｃ処置およびＡｄｄａｖａｘ後に増加した。 １Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘの投与後のＢＣＲ多様性およびＴＣＲクローナリティ。ＢＣＲ多様性は組み合わせ処置によって増加し、ＴＣＲクローナリティは２Ｂ１８２ｃ処置およびＡｄｄａｖａｘ後に増加した。 クローン類似性。 共有クローン。 クラスター解析。 インフルエンザに対する既知の抗体として、類似する配列を有するクラスターの数。 細胞毒性およびＩＬ－１２分泌の分析。リポソームアジュバントは、ＢＭＤＣにおいて、より低い細胞毒性を伴うＩＬ－１２分泌を誘導した。 １Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃ（未製剤化および製剤化）あるいはＡｄｄａＶａｘ投与後の、抗－ＮＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ分析。 ２Ｂ１８２ｃおよび１Ｖ２７０のリポソーム製剤は、免疫応答をＴｈ１応答へと偏らせる。（Ａ）０日目および２８日目に、ＤＭＳＯ（Ｄ）またはリポソーム（Ｌ）製剤中でＴＬＲ４リガンドおよび／またはＴＬＲ７リガンドと混合した、不活化Ｃａｌ ２００９ Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（１０μｇ／注射）を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫付与した。２８日目に血清を採取した。ＨＡまたはＮＡに特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを、ＥＬＩＳＡによって判断した。（Ｂ）Ｔｈ１／ＴＨ２バランスを、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率によって評価した。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１である。 リポソーム２Ｂ１８２ｃおよびリポソーム１Ｖ２７０との組み合わせアジュバント処置により、流入領域リンパ節における胚中心Ｂ細胞および形質芽球の数は増加した。（Ａ）実験プロトコル。（Ｂ）フローサイトメトリーデータについてのゲーティング戦略。（図２０Ｃ）Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ９５＋ ＧＬ７＋）、および形質芽球（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ１３８＋）の総数を計算した。ＢＬ；ブランクリポソーム。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、抗原＋ＢＬと比較して、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、＊＊＊；ｐ＜０．００１である。 ２Ｂ１８２Ｃは、より低い濃度でヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）の両方のＴＬＲ４に対して有効である。ＨＥＫ ＴＬＲレポーター細胞（ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭｈＴＬＲ４およびＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭｍＴＬＲ４）を、化合物１Ｚ１０５および２Ｂ１８２Ｃ（１０μＭから２倍連続希釈）を用いて２０時間処理した。培養上清中のＮＦ－ｋＢ誘導性ＮＦ－ｋＢ ＳＥＡＰレベルを、製造業者のプロトコルに従って評価した。 ２００ｎｍｏｌ／注射の２Ｂ１８２ｃは、抗原特異的ＩｇＧ１および抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａのより高いレベルを誘導した。（Ａ）２つのＴＬＲアゴニスト１Ｚ１０５と２Ｂ１８２Ｃとを比較するための実験プロトコル。０日目および２１日目に、ＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）に加えてＴＬＲ４アゴニストの１Ｚ１０５または２Ｂ１８２Ｃ（４０および２００ｎｍｏｌ／注射）を両後脚に筋肉内注射し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を免疫付与した。２８日目に採血し、血清はＥＬＩＳＡにより、血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対する抗体について評価した。１０％ＤＭＳＯをビヒクルとして使用した。（Ｂ）抗－ＨＡ ＩｇＧ１抗体および抗－ＮＡ ＩｇＧ１抗体。（Ｃ）抗－ＨＡ ＩｇＧ２ａ抗体および抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ抗体。各ボックスプロットにおいて、ボックス内の線は中央値を表し、境界は上下の四分位値であり、バーは最小値および最大値を示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、抗原＋ビヒクルと比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１である。 ２Ｂ１８２ＣとＴＬＲ７アゴニストの１Ｖ２７０との組み合わせは、抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両方を増加させた。（Ａ－Ｃ）図２Ａに示すように、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝５～６）をＩＩＡＶおよびアジュバントを用いて免疫付与した。ＭＦ５９と類似の製剤であるＡｄｄａＶａｘＴＭを、ポジティブコントロールとして使用した。抗－ＨＡ ＩｇＧ１生産および抗－ＮＡ ＩｇＧ１生産（Ａ）、抗－ＨＡ ＩｇＧ２ａ生産および抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ生産（Ｂ）を、ＥＬＩＳＡによって判断した。各ボックスプロットにおいて、ボックス内の線は中央値を表し、境界は上下の四分位値であり、バーは最小値および最大値を示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。抗原なしとＡｄｄａＶａｘ以外の４群を比較した（全てのペア）。（Ｃ）全ての組み合わせ処置によって誘導された抗－ＨＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベル（ビヒクルに正規化）を、５～１１匹のマウス／群の平均によって示す。各ドットは個々の動物を示す。黒の実線は、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１＝１を示す。１Ｖ２７０と２Ｂ１８２Ｃとの組み合わせによって免疫付与された全ての動物は、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１＝１より上に分布した。これは、これらのマウスにおける免疫バランスが、Ｔｈ１免疫応答に偏向していたことを示唆している。 ２８日目の抗原特異的ＩｇＭ生産。（ＡおよびＢ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５～６）をＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）で免疫付与し、図２Ａに示すアジュバントを示した。抗原特異的ＩｇＭレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。（Ａ）ＴＬＲ４アゴニストの１Ｚ１０５または２Ｂ１８２Ｃ（４０および２００ｎｍｏｌ／注射）によって誘導される、抗－ＨＡ ＩｇＭ生産および抗－ＮＡ ＩｇＭ生産。（Ｂ）ＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）と、ＴＬＲ４アゴニストの１Ｚ１０５または２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）との組み合わせは、抗原特異的ＩｇＭ誘導に対してわずかな影響を与えた。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５である。 リポソーム１Ｖ２７０およびリポソーム２Ｂ１８２Ｃは、より低い毒性を伴う同等のレベルのＩＬ－１２放出を誘導した。（Ａ）ＩＬ－１２分泌レベル。（Ｂ）％生存率。マウス初代ＢＭＤＣを１Ｖ２７０（０．０６２５ｕＭ）および２Ｂ１８２Ｃ（１２．５ｕＭ）を用いて処置した。１Ｖ２７０／２Ｂ１８２ｃ比率を１：２００に保ち、図３における最良の比率として判断した。一晩インキュベートした後、培養上清中のＩＬ－１２レベルをＥＬＩＳＡによって調べ、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって評価した。Ｗｅｌｃｈ補正を伴う片側不対ｔ検定により、それぞれの化合物におけるＤＭＳＯ製剤（Ｄ）対リポソーム製剤（Ｌ）で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 組み合わせアジュバントの注射後の局所免疫細胞浸潤の組織学的分析。１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）、２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）、または１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）と２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）との組み合わせのリポソーム製剤を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内注射した。組織を採取して固定し、パラフィンブロックに包埋した。１０μｍ切片をＨ＆Ｅで染色した。低倍率および高倍率は、それぞれ２０×および４０×の対物レンズを用いて得た。低倍率画像と高倍率画像におけるスケールバーは、それぞれ５０μｍと２０μｍを示す。 ビヒクル、１Ｖ２７０、２Ｂ１８２Ｃ、１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２ＣをＤＭＳＯ製剤またはリポソーム製剤と共に（５０μＬの容量中、１ｎｍｏｌ／注射の１Ｖ２７０および２００ｎｍｏｌ／注射の２Ｂ１８２Ｃ）、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）に筋肉内注射した。ＡｄｄａＶａｘＴＭ（２５μＬ／注射）をポジティブコントロールとして使用した。２時間後および２４時間後に血清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘサイトカインアッセイによりＩＬ－１２ｐ４０、ＴＮＦ、およびＫＣ分泌を調べた（Ａ）。データは、平均±ＳＥＭで示される。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの両側Ｕ検定により、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、４群（同じ製剤中のビヒクル、１Ｖ２７０、２Ｂ１８２Ｃ、１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）を比較し、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１である。 リポソーム１Ｖ２７０およびリポソーム２Ｂ１８２Ｃは、抗－ＨＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ生産、ならびに抗－ＮＡ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ生産を相乗的に増強した。（Ａ－Ｃ）図２２Ａに示すように、０日目および２１日目に、ＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）および製剤化アジュバントを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、筋肉内注射することにより免疫付与した。リポソームＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０（リポ－１Ｖ２７０、１ｎｍｏｌ／注射）、リポソームＴＬＲ４アゴニスト２Ｂ１８２Ｃ（リポ－２Ｂ１８２Ｃ、２００ｎｍｏｌ／注射）、ならびに１Ｖ２７０および２Ｂ１８２Ｃのリポソーム複合アジュバント（リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ、１ｎｍｏ／注射＋２００ｎｍｏ／注射）を注射した。ビヒクルは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンおよびコレステロール（ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、対照リポソーム）である。ＡｄｄａＶａｘＴＭをポジティブコントロールとして使用した。２８日目に血清を採取し、ＨＡまたはＮＡに特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、および総ＩｇＧを、ＥＬＩＳＡによって判断した。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である。抗原なしとＡｄｄａＶａｘ以外の４群を比較した（全てのペア）。データは、類似の結果を伴う２つの独立した実験の代表である。 製剤化アジュバントによって誘導される、抗原特異的ＩｇＭレベル。０日目および２１日目に、図２Ａに示すように、製剤化アジュバントを伴うＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、筋肉内注射することにより免疫付与した。リポソームＴＬＲ７アゴニスト１Ｖ２７０（リポ－１Ｖ２７０、１ｎｍｏｌ／注射）、リポソームＴＬＲ４アゴニスト２Ｂ１８２Ｃ（リポ－２Ｂ１８２Ｃ、２００ｎｍｏｌ／注射）、ならびに１Ｖ２７０と２Ｂ１８２Ｃとの複合リポソームアジュバント（リポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ、１ｎｍｏ／注射＋２００ｎｍｏ／注射）を注射した。ビヒクルは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンおよびコレステロール（ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、対照リポソーム）である。ＡｄｄａＶａｘＴＭをポジティブコントロールとして使用した。２８日目に血清を採取し、ＨＡまたはＮＡに特異的なＩｇＭを調べた。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５である。抗原なしとＡｄｄａＶａｘ以外の４つの処置を比較した（全てのペア）。データは、類似の結果を伴う２つの独立した実験の代表である。 製剤化複合アジュバントは、Ｔｆｈおよび抗体分泌細胞を増加させた。（Ａ）０日目および２１日目に、５０μＬの全容量中、１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）および／または２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）を用いてＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４～５／群）にワクチン接種した。２８日目に、鼠径リンパ節中のリンパ球を採取してＦＡＣＳ分析を行った。Ｔｆｈ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＰＤ－１＋ ＣＸＣＲ５＋）、ＧＣ Ｂ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ９５＋ ＧＬ７＋）、形質芽球（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ１３８＋）、および形質細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９－ ＣＤ１３８＋）についてのゲーティング戦略を示す。（Ｂ）生細胞中の％Ｔｆｈ細胞、ＧＣ Ｂ細胞、形質芽球、および形質細胞。バーは、平均±ＳＥＭを示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である。ＡｄｄａＶａｘ以外の４つの条件を比較した（全てのペア）。 製剤化複合アジュバントは、Ｔｆｈおよび抗体分泌細胞を増加させた。０日目および２１日目に、５０μＬの全容量中、１Ｖ２７０（１ｎｍｏｌ／注射）および／または２Ｂ１８２Ｃ（２００ｎｍｏｌ／注射）を用いてＩＩＡＶ（１０μｇ／注射）で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４～５／群）にワクチン接種した。２８日目に、鼠径リンパ節中のリンパ球を採取してＦＡＣＳ分析を行った（図５Ａ）。Ｔｆｈ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＰＤ－１＋ ＣＸＣＲ５＋）、ＧＣ Ｂ細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ９５＋ ＧＬ７＋）、形質芽球（ＣＤ３－ ＣＤ１９＋ ＣＤ１３８＋）、および形質細胞（ＣＤ３－ ＣＤ１９－ ＣＤ１３８＋）についてのゲーティング戦略を図５Ｂに示す。（Ａ）Ｔｆｈ細胞、ＧＣ Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞の数。（Ｂ）細胞の総数。バーは、平均±ＳＥＭを示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である（全てのペア）。 １Ｖ２７０と２Ｂ１８２Ｃとの製剤化された組み合わせ。（ＡおよびＢ）０日目および２１日目に、製剤化アジュバンドを用いてＩＩＡＶでＢＡＬＢ／ｃマウスにワクチン接種し、２８日目に鼠径リンパ節を採取してＢＣＲレパトア分析を行った。（Ａ）総ＩＧＨ、ＩＧＨＧ１、およびＩＧＨＧ２ＡのＢＣＲ多様性。（Ｂ）類似性解析。Ｊａｃｃａｒｄ指数を示す。（Ｃ）ＴＣＲαおよびＴＣＲβの「１－ｐｉｅｌｏｕ指数」によって示された、ＴＣＲクローナリティ。バーは、平均±ＳＥＭを示す。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、（リポソームと比較して）＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である。 リポ－２Ｂ１８２Ｃおよびリポ－１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃは、同種のインフルエンザウイルスからマウスを防御する。（Ａ）同種のインフルエンザウイルス攻撃の実験スケジュール。（Ｂ）平均体重変化は、％初期体重によって示される。Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡにより、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。（Ｃ）同種のウイルス（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）による攻撃後のマウスの生存率。ログランク検定を用いたＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。肺ウイルス力価（Ｄ）および肺液中のサイトカインレベル（Ｅ）を評価した。３日目および６日目に、肺洗浄を行った。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、（リポソームと比較して）＊＊Ｐ＜０．０１である。（Ｆ）肺ウイルス力価と、炎症誘発性サイトカインであるＭＣＰ－１（左）およびＩＬ－６（右）との関係。Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関検定（ＭＣＰ‐１；＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．８３、ＩＬ‐６；＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．７９）。ＨＩ力価（Ｇ）および同種のウイルスに対するＶＮ価（Ｈ）。Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である（全てのペア）。（Ｉ）ＶＮ力価と肺ウイルス力価との関係。各ドットは、同一動物におけるＶＮ力価と肺ウイルス力価を示す。＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関検定、Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝－０．５９。 Ｈ３Ｎ２ウイルスによる異種攻撃。図３１Ａに記載されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＩＩＡＶ（Ｈ１Ｎ１）に加えて製剤化アジュバントを用いて免疫付与し、そして異種のウイルスＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ３／７５（Ｈ３Ｎ２）を用いて鼻腔内攻撃した。（Ａ）体重減少をモニターした。一元配置ＡＮＯＶＡにより、有意性は検出されなかった。（Ｂ）異種のウイルスによる攻撃後のマウスの生存率。ログランク検定（ｎ．ｓ．）を用いたＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。（Ｃ）３日目および６日目における、肺ウイルス力価。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定により、有意性は検出されなかった。 ＡおよびＥ）プロトコル。Ｂ－ＣおよびＦ－Ｇ）１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ＣあるいはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／１９３４またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／に感染後の経時的な体重および生存。Ｄ）１Ｖ２７０および／または２Ｂ１８２ｃあるいはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率。 Ａ）１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、抗－ＨＡ ＩｇＧ１、抗－ＨＡ ＩｇＧ２ａ、および抗－ＨＡ ＩｇＭ。Ｂ）１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、抗－ＮＡ ＩｇＧ１、抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ、および抗－ＮＡ ＩｇＭ。 １Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、ＡおよびＢ）抗－ＨＡおよび抗－ＮＡ ＩｇＧ１、Ｃ－Ｄ）抗－ＨＡおよび抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ、ならびにＥ－Ｆ）抗－ＨＡおよび抗－ＮＡ ＩｇＭ。Ｂ）１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはＡｄｄａＶａｘを投与したマウスにおける、抗－ＮＡ ＩｇＧ１、抗－ＮＡ ＩｇＧ２ａ、および抗－ＮＡ ＩｇＭ。 異なる投与量の１Ｖ２７０、１Ｚ１０５、２Ｂ１８２ｃ、またはそれらの組み合わせを投与したマウスにおける抗－ＨＡ ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１。 様々なリポソームの概略図および例示的なプロトコル。 Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍのＨＡのペプチドアレイを使用するＥＬＩＳＡ。０日目および２１日目に、ＩＩＡＶに加えてＬｉｐｏ－Ｖｅｈ（ブランクリポソーム）、Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０、Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ、Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）（共カプセル化組み合わせ）、または（Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０）＋（Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ）（混合組み合わせ）を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５～１０）を免疫付与し、２８日目に採血した。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ（ＮＲ－１５４３３）のＨＡのペプチドアレイはＢＥＩリソースから入手した。５群のペプチドをプールし、２８個のペプチドプールを作製した。（Ａ）ＥＬＩＳＡの結果によるＯＤ４０５－５７０ｎｍのヒートマップ。各行および各列は、それぞれペプチドプールおよびマウスを示している。（Ｂ）統計分析を、個々のマウスにおける２８個のペプチドプールの平均について行った。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定。＋Ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。 抗体の交差反応性についてのＥＬＩＳＡ。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を、０日目および２１日目に、ＩＩＡＶに加えてＬｉｐｏ－Ｖｅｈ、Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０、Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ、Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）、または（Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０）＋（Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ）を用いて免疫付与し、２８日目に採血した。血清を連続希釈（１：１００～１：４０９６００）し、ＥＬＩＳＡにより、Ｐｕｅｒｔｏ ＲｉｃｏＨ１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、およびＨ３Ｎ２のＨＡ、ならびにＨ５Ｎ１、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ７のＮＡに対する、総ＩｇＧレベルを評価した。（Ａ）本研究において使用したＡ型インフルエンザウイルスのＨＡの系統発生的関係。ＥＬＩＳＡにおいて使用したタンパク質のアミノ酸配列を、インフルエンザリサーチデータベース（https://www.fludb.org/brc/home.spg?decorator=influenza）を用いたＭＵＳＣＬＥアルゴリズムにより整列させた。系統樹は、ＭＥＧＡＸソフトウェア（https://www.megasoftware.net/）を用いた近隣結合法により構築した。（Ｂ）Ｈ１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ７のＨＡに対する総ＩｇＧ力価曲線。（Ｃ）ＮＡの系統発生的関係。（Ｄ）Ｈ５Ｎ１、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ７のＮＡに対する総ＩｇＧ力価曲線。血清を、１００倍から始めて４０９６００倍まで１：４に希釈し、総ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。示されるデータは、平均±ＳＥＭである。 Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）は、交差反応性抗体を誘導した。（ＡおよびＢ）ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝５／群）マウスを、０日目および２１日目に、ＩＩＡＶ［Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９］に加えてＬｉｐｏ－Ｖｅｈ、Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０、Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ、Ｌｉｐｏ－（１Ｖ２７０＋２Ｂ１８２Ｃ）、または（Ｌｉｐｏ－１Ｖ２７０）＋（Ｌｉｐｏ－２Ｂ１８２Ｃ）を用いて免疫付与し、２８日に採血した。血清を連続希釈（１：１００～１：４０９６００）し、ＥＬＩＳＡにより、Ｐｕｅｒｔｏ ＲｉｃｏＨ１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、およびＨ３Ｎ２のＨＡ、ならびにＨ５Ｎ１、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ３Ｎ２、およびＨ７Ｎ７のＮＡに対する、総ＩｇＧレベルを評価した。ｐｒｉｓｍ ５を用いて計算した個々のマウスの総ＩｇＧ力価曲線の幾何学的平均を示す。本研究で使用したＨＡタンパク質の総ＩｇＧ力価曲線および系統発生的関係を上記した内容に示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｄｕｎｎの事後検定を伴うＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定。＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。 例示的なＴＬＲ４およびＴＬＲ７アゴニスト。

Claims (44)

  1. 哺乳動物における免疫応答を増強するための方法であって、リポソームを含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与する工程を含み、前記リポソームを含む組成物は、有効な量のＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストを含む、方法。
  2. 前記ＴＬＲ４アゴニストおよび前記ＴＬＲ７アゴニストを同時に投与する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＴＬＲ４アゴニストは式（ＩＩ）を有する、請求項１または２に記載の方法：
    Figure 2022525608000042
    ここで、ｚ１は０～４の整数であり、ｚ２は０～５の整数であり、Ｒ５は置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ６は置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ７は水素、または置換もしくは非置換アルキルであり、およびＲ８の各々は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＳＨ、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２，ニトロ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
  4. 前記ＴＬＲ７アゴニストは式（Ｉ）を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法：
    Figure 2022525608000043
    ここで、Ｘ１は、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＮＲｃ－であり；
    Ｒ１は、水素、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、Ｃ６～１０アリール、または置換Ｃ６～１０アリール、Ｃ５～９複素環式、置換Ｃ５～９複素環式であり；
    Ｒｃは、水素、Ｃ１－１０アルキル、もしくは置換Ｃ１－１０アルキルであり；またはＲｃおよびＲ１は、結合する窒素と共に複素環式環もしくは置換複素環式環を形成し；
    各Ｒ２は、独立して、－ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（アルカノイル）、置換－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１０）アリール（アロイル）、置換－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１０）アリール、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（アルコキシカルボニル）、置換－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、－ＮＲａＲｂ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（カルバモイル）、ハロ、ニトロ、もしくはシアノであるか、またはＲ２は欠如しており；
    各ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル、置換（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ６）アルカノイル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルカノイル、アリール、アリール（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシカルボニルであり；
    ここで、任意のアルキル基、アリール基、または複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１～６アルキル、ヒドロキシＣ１～６アルキレン、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～６シクロアルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロ、またはアリールであり；
    ｎは、０、１、２、３、または４であり；
    Ｘ２は、結合または連結基であり；および
    一実施形態において、ＲＸは１つまたは２つのカルボン酸エステルを含むリン脂質であり；
    もしくはその互変異性体であり；
    またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物である。
  5. 前記リポソームは、ＰＣ、ＤＯＰＣ、またはＤＳＰＣを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記リポソームは、コレステロールを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. １つまたは複数の免疫原を投与する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記免疫原は、微生物免疫原である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記微生物は、ウイルスまたは細菌である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記リポソームは、１つまたは複数の免疫原を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記哺乳動物は、ヒトである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ＴＬＲ７アゴニストの量は、約０．０１～１００ｎｍｏｌ、約０．１～１０ｎｍｏｌ、または約１００ｎｍｏｌ～約１０００ｎｍｏｌである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ＴＬＲ４アゴニストの量は、約２～２０ｕｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ～２ｕｍｏｌ、または約２ｕｍｏｌ～約１００ｕｍｏｌである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記ＴＬＲ７アゴニスト対前記ＴＬＲ４アゴニストの比率は、約１：１０、１：１００、１：２００、５：２０、５：１００、または５：２００である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記組成物を、注射、筋肉内投与、鼻腔内投与、または静脈内投与する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記リポソームは、ＤＯＰＣおよびコレステロールを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. リポソーム、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７アゴニストを含む、医薬製剤。
  18. 前記リポソームは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］（ＤＯＰＳ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１８：１ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（１６：０ＰＥＧ－２０００ＰＥ）、１－オレオイル－２－［１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ラウロイル］－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１～１２：０ ＮＢＤ ＰＣ）、１－パルミトイル－２－｛１２－［（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）アミノ］ラウロイル｝－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～１２：０ ＮＢＤ ＰＣ）、およびそれらの混合物；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含む、請求項１７に記載の製剤。
  19. 前記リポソームは、ＤＯＰＣ、コレステロール、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載の製剤。
  20. 前記ＴＬＲ７アゴニストの量は、約０．０１～１００ｎｍｏｌ、約０．１～１０ｎｍｏｌ、または約１００ｎｍｏｌ～約１０００ｎｍｏｌである、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の製剤。
  21. 前記ＴＬＲ４アゴニストの量は、約２ｎｍｏｌ～２０ｕｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ～２ｕｍｏｌ、または約２ｕｍｏｌ～約１００ｕｍｏｌである、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の製剤。
  22. 前記ＴＬＲ７アゴニスト対前記ＴＬＲ４アゴニストの比率は、約１：１０、１：１００、１：２００、５：２０、５：１００、または５：２００である、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の製剤。
  23. 前記ＴＬＲ７アゴニストは、式（Ｉ）の化合物を含む、前記１７～２２のいずれか１項に記載の製剤：
    Figure 2022525608000044
    式（Ｉ）中、Ｘ１は－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＮＲｃ－であり；
    Ｒ１は、水素、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、Ｃ６～１０アリール、または置換Ｃ６～１０アリール、Ｃ５～９複素環式、置換Ｃ５～９複素環式であり；
    Ｒｃは、水素、Ｃ１－１０アルキル、もしくは置換Ｃ１－１０アルキルであり；またはＲｃおよびＲ１は、結合する窒素と共に複素環式環もしくは置換複素環式環を形成し；
    各Ｒ２は、独立して、－ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（アルカノイル）、置換－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１０）アリール（アロイル）、置換－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１０）アリール、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（アルコキシカルボニル）、置換－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、－ＮＲａＲｂ、－Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ（カルバモイル）、ハロ、ニトロ、もしくはシアノであるか、またはＲ２は欠如しており；
    各ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル、置換（Ｃ３～Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ６）アルカノイル、置換（Ｃ１～Ｃ６）アルカノイル、アリール、アリール（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシカルボニルであり；
    式（Ｉ）中、任意のアルキル基、アリール基、または複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１～６アルキル、ヒドロキシＣ１～６アルキレン、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～６シクロアルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロ、またはアリールであり；
    ｎは、０、１、２、３、または４であり；
    Ｘ２は、結合または連結基であり；および
    Ｒ３は、１つまたは２つのカルボン酸エステルを含むリン脂質であり；
    もしくはその互変異性体であり；
    またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物である。
  24. 前記式（Ｉ）中の前記Ｒ３は、以下を含む、請求項２３に記載の製剤；
    Figure 2022525608000045
    ここで、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素、またはアシル基であり、Ｒ１３は負電荷または水素であり、ｍは１～８であり、波線は結合の位置を示し、ＯＲ１２を有する炭素原子における絶対配置は、Ｒ、Ｓ、またはそれらの任意の混合である。
  25. 前記ｍは１であるか、またはＲ１１およびＲ１２はそれぞれオレオイル基である、請求項２３または２４に記載の製剤。
  26. 前記Ｒ３のリン脂質は、２つのカルボン酸エステルを含み、前記カルボン酸エステルの各々は、不飽和、エポキシ化、ヒドロキシル化、またはそれらの組み合わせの１つ、２つ、３つ、または４つの部位を含む、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の製剤。
  27. 前記Ｒ３のリン脂質は、２つのカルボン酸エステルを含み、前記カルボン酸エステルは、同じであるかまたは異なっている、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の製剤。
  28. 前記リン脂質のカルボン酸エステルの各々は、Ｃ８～Ｃ９において不飽和部位を有する、Ｃ１７カルボン酸エステルである、請求項２７に記載の製剤。
  29. 前記リン脂質のカルボン酸エステルの各々は、Ｃ９～Ｃ１０において不飽和部位を有する、Ｃ１８カルボン酸エステルである、請求項２７に記載の製剤。
  30. 前記Ｘ２は、結合、または鎖中に１～約１０個の原子を有する鎖であり、ここで、前記鎖の原子は炭素、窒素、硫黄、および酸素からなる群から選択され、任意の炭素原子はオキソで置換され得、任意の硫黄原子は１個または２個のオキソ基で置換され得る、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の製剤。
  31. 前記Ｒ３は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項２３～３０のいずれか１項に記載の製剤。
  32. 前記Ｒ３は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンであり、前記Ｘ２はＣ（Ｏ）である、請求項２３から３１のいずれか１項に記載の製剤。
  33. 前記Ｘ１は、酸素である、請求項２３～３２のいずれか１項に記載の製剤。
  34. 前記Ｘ１はＯであり、前記Ｒ１はＣ１－４アルコキシ－エチルであり、前記ｎは０であり、Ｘ２はカルボニルであり、Ｒ３は１，２－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項２３～３３のいずれか一項に記載の製剤。
  35. 前記式（Ｉ）の化合物は、以下である、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の製剤；
    Figure 2022525608000046
    。
  36. 前記式（Ｉ）の化合物は、以下である、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の製剤；
    Figure 2022525608000047
    。
  37. 前記ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）を含む、請求項１７～３６のいずれか１項に記載の製剤：
    Figure 2022525608000048
    式（ＩＩ）中、ｚ１は０～４の整数であり、ｚ２は０～５の整数であり、Ｒ５は置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ６は置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ７は水素、または置換もしくは非置換アルキルであり、およびＲ８の各々は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＳＨ、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２，ニトロ、－ＣＦ３、－ＣＣｌ３、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
  38. 前記ｚ２は、１、２、または３である、請求項３７に記載の製剤。
  39. 前記ｚ１は、１または２である、請求項３７または３８に記載の製剤。
  40. 前記ｚ１は、０である、請求項３７または３８に記載の製剤。
  41. 前記Ｒ５は、置換または非置換アリールである、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の製剤。
  42. 前記Ｒ６は、置換または非置換シクロアルキルである、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の製剤。
  43. 前記Ｒ７は、置換または非置換アルキルである、請求項３７～４２のいずれか１項に記載の製剤。
  44. 前記ｚ１＝１であり、前記Ｒ８は置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである、請求項３７～３９または４０～４３のいずれか１項に記載の製剤。
JP2021555397A 2019-03-14 2020-03-13 ワクチンアジュバントとしてのｔｌｒ４およびｔｌｒ７リガンド製剤 Pending JP2022525608A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962818517P 2019-03-14 2019-03-14
US62/818,517 2019-03-14
PCT/US2020/022786 WO2020186229A1 (en) 2019-03-14 2020-03-13 Tlr4-tlr7 ligand formulations as vaccine adjuvants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022525608A true JP2022525608A (ja) 2022-05-18

Family

ID=72428054

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021555397A Pending JP2022525608A (ja) 2019-03-14 2020-03-13 ワクチンアジュバントとしてのｔｌｒ４およびｔｌｒ７リガンド製剤

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220152188A1 (ja)
EP (1) EP3908316A4 (ja)
JP (1) JP2022525608A (ja)
KR (1) KR20220035870A (ja)
CN (1) CN114401738A (ja)
AU (1) AU2020236254A1 (ja)
CA (1) CA3132994A1 (ja)
IL (1) IL286254A (ja)
WO (1) WO2020186229A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11697851B2 (en) 2016-05-24 2023-07-11 The Regents Of The University Of California Early ovarian cancer detection diagnostic test based on mRNA isoforms
CN116847830A (zh) * 2020-10-28 2023-10-03 赛诺菲巴斯德有限公司 含tlr4激动剂的脂质体、其制备和用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011136828A1 (en) * 2010-04-27 2011-11-03 The Johns Hopkins University Immunogenic compositions and methods for treating neoplasia
US10881729B2 (en) * 2014-04-18 2021-01-05 Children's Medical Center Corporation Vaccine adjuvant compositions
US20150366962A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-24 The Regents Of The University Of California Synthetic tlr4 and tlr7 ligands as vaccine adjuvants
WO2016164640A1 (en) * 2015-04-09 2016-10-13 Carson Dennis A Synthetic tlr4 and tlr7 ligands to prevent, inhibit or treat liver disease
WO2018053508A1 (en) * 2016-09-19 2018-03-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for inducing an immune response
CA3099419A1 (en) * 2018-05-04 2019-11-07 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Tetrazines for high click conjugation yield in vivo and high click release yield

Also Published As

Publication number Publication date
EP3908316A1 (en) 2021-11-17
CN114401738A (zh) 2022-04-26
AU2020236254A1 (en) 2021-10-07
KR20220035870A (ko) 2022-03-22
US20220152188A1 (en) 2022-05-19
WO2020186229A1 (en) 2020-09-17
IL286254A (en) 2021-10-31
EP3908316A4 (en) 2023-03-29
CA3132994A1 (en) 2020-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2008227128B2 (en) Conjugates of synthetic TLR agonists and uses therefor
JP6360026B2 (ja) 脂質付加された免疫反応調節化合物の組成物、製剤及び方法
US20160068533A1 (en) Immunomodulators and immunomodulator conjugates
US9505768B2 (en) Compositions and methods for modulating TLR4
US20140212442A1 (en) Immunomodulators and immunomodulator conjugates
KR102353413B1 (ko) 인플루엔자 바이러스 복제 억제제
JP7395461B2 (ja) インフルエンザワクチンを含む組成物
JP7169968B2 (ja) ワクチンアジュバント製剤
TW200813055A (en) Spiro-conjugated cyclic group containing compound and use thereof
JP2022525608A (ja) ワクチンアジュバントとしてのｔｌｒ４およびｔｌｒ７リガンド製剤
WO2016057618A1 (en) Vaccine compositions and methods of use to treat neonatal subjects
Chan et al. Structure–activity relationship studies to identify affinity probes in bis-aryl sulfonamides that prolong immune stimuli
TW202128687A (zh) ４－胺基－咪唑并喹啉化合物及其用途
AU2018202168B2 (en) Lipidated immune response modifier compound compositions, formulations, and methods
Hunt Further Exploration of the Structure-Activity Relationship of C7-Substituted Imidazoquinolines and Esters of Oxaloacetate to Increase Bioenergetic Flux
Yoo Exploration of Toll-like Receptor 7 and 8 Agonists as Potential Vaccine Adjuvants
AU2015202390A1 (en) Lipidated immune response modifier compound compositions, formulations, and methods

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211029

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210913

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230118

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240123

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240418