KR20220035870A - 백신 어주번트로서의 tlr4 및 tlr7 리간드 제제 - Google Patents

백신 어주번트로서의 tlr4 및 tlr7 리간드 제제 Download PDF

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데니스 에이. 카슨
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토모코 하야시
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Abstract

포유동물에서 면역 반응을 향상시키는 방법, 및 리포솜, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제를 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

백신 어주번트로서의 TLR4 및 TLR7 리간드 제제
관련 출원에 대한 상호 참조(Cross-Reference to Related Applications)
본 출원은 2019년 3월 14일에 출원된 미국 출원 번호 62/818,517의 출원일의 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
정부 권리의 선언(Statement of Government Rights)
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 수여한 승인(grant) 번호 HHSN272200900034C 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
많은 전염병의 은밀히 퍼지는 위협으로부터 개인을 보호하는 가장 효과적인 방법은 백신 접종이다. 효과적인 백신 접종은 백신이 특이적인 특정 감염원에 대한 후속 보호를 제공할 수 있는 숙주에서 면역 반응을 유발할 수 있는 항원의 사용을 필요로 한다. 따라서 백신 항원은 - 체액성 및/또는 세포 매개성 - 면역 반응의 수준을 유도하여 숙주에서 보호될 수 있을 만큼 충분히 면역원성이어야 한다. 전세계적으로 우려되는 감염원은 인플루엔자 바이러스이다. 계절성 인플루엔자 바이러스는 전세계적으로 250-500,000명의 사망을 초래하는 연례의 전염병을 유발하며(WHO), 지난 겨울 미국에서만 80,000명 이상이 사망했다. 또한 수백만 명의 사망자를 유발한 새로운 전염병이 때때로 나타나 매우 현실적인 전세계적 위협이 된다. 이러한 위협에 특히 취약한 사람들은 노인, 신생아 및 면역 저하된 개인과 같은 고위험 집단이다. 계절성 인플루엔자에 대한 백신 접종은 계절의 순환 바이러스 균주와 일치하면 적당히 효과적일 수 있다. 그러나 인플루엔자 바이러스는 끊임없이 변화(항원 드리프트)를 하고 있기 때문에, 다음 인플루엔자 시즌이나 다음 대유행에 어떤 바이러스의 아형(subtype) 및 변종(strain)이 유행할지 예측하기 어렵고, 기존의 백신을 제조 및 유통하기 위한 충분한 시간(약 6개월)을 허용하기 어렵다.
이러한 기존의 백신은 전형적으로 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 단백질, 특히 단백질의 구형 헤드 도메인과 관련된 항원을 기반으로 한다. 이 고도의 면역원성 헤드 도메인은 인플루엔자 바이러스의 변종 및 아형에 따라 다양하므로, 하나의 구형 헤드 도메인 아형에 대한 면역 반응은 특정 헤드 도메인으로 제한될 수 있으며 다른 헤드 도메인을 갖는 바이러스 변종에 대한 적절한 면역 반응을 제공하지 못할 수 있다. 바이러스 변종들에 걸쳐 보다 고도로 보존된 단백질의 스템(stem) 또는 줄기(stalk) 도메인으로부터 유래된 인플루엔자 HA 항원은 일반적으로 기존 백신에서 전형적으로 우세한(dominant) 헤드 도메인 항원보다 면역원성이 훨씬 낮기 때문에, 이러한 HA 줄기 항원의 면역원성은 숙주에서 적절한 면역 반응을 발생시켜 여러 인플루엔자 변종들에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 수준으로 증진시킬 필요가 있다.
본 발명이 해결하려는 과제는 동일한 리포좀 나노입자에서 어주번트로서 TLR4 작용제와 TLR7 작용제의 조합을 제제화하는 것을 제공하는 것이다.
요약
인플루엔자 바이러스와 같은 세계적으로 중요한 감염원에 대한 백신에서 적절한 어주번트 조합 제제의 성공적인 사용은 이러한 바이러스 병원체의 끊임없이 변화하는 위협으로부터 개인의 보호를 확대하고 강화하기 위한 의학의 주요 발전을 잠재적으로 나타낸다.
본 개시 내용은 동일한 리포좀 나노입자에서 어주번트로서 TLR4 작용제와 TLR7 작용제의 조합을 제제화하는 것을 제공하며, 이는 별개의 제제화된 작용제 및 비제제화된 작용제의 혼합 조합에 비해 여러 이점을 제공한다. 제제화된 조합은 원하는 면역 활성을 위해 나노입자에서 TLR4 내지 TLR7의 특정 비율을 가질 수 있다. 각 화합물은 화합물의 다양한 조합 비율로 생성된 데이터를 기초로 단독 및 조합으로 제제화되었다. 제제화된 조합 대비 제제화되지 않은 조합, 동일한 입자에서 혼합 및 조합을 나란히 비교했다. 면역화 연구의 결과는 리포좀에 있는 특정 비율의 조합된 화합물이 단독의 화합물보다 더 크고 광범위한 면역활성을 제공하고, 제제화되지 않은 조합보다 제제화된 조합이 더 우수함을 보여주었다. 사용된 항원은 OVA 및 비활성화된 인플루엔자 바이러스였다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 2B182C(예시적인 TLR4 작용제) 및 1V270(예시적인 TLR7 작용제)을 하나의 제제로 함께 제제화하고 마우스에서 면역화 연구를 수행하였다. 각 화합물은 화합물의 다양한 조합 비율로 생성된 데이터를 기반으로 단독 및 조합으로 제제화되었다. 제제화된 조합 대비 제제화되지 않은 조합, 및 동일한 입자에서 혼합 및 조합을 나란히 비교했다. 면역화 연구의 결과는 리포좀에 결합된 화합물의 특정 비율이 단독의 화합물보다 더 크고 광범위한 면역활성을 제공하고, 제제화된 조합이 제제화되지 않은 조합보다 더 우수함을 보여주었다. 사용된 항원은 OVA 및 비활성화된 인플루엔자 바이러스였다.
한 실시양태에서, 본 개시 내용은 TLR4 작용제 및 TLR7 작용제를 유효량으로 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제는 동시에 투여된다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제는 리포좀 제제로 투여된다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제는 별개의 리포좀 제제 내에 있다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제는 화학식 (II)이다. 한 실시양태에서, TLR7 작용제는 화학식 (I)이다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 면역원(항원)이 또한 투여되며, 예를 들어 어주번트와 동시에 투여되며 선택적으로 어주번트와 동일한 제제로 투여된다. 한 실시양태에서, 면역원은 미생물 면역원이다. 한 실시양태에서, 상기 미생물은 인플루엔자 또는 바리셀라(varicella)와 같은 바이러스, 또는 박테리아이다. 한 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, TLR7 작용제의 양은 약 0.01 내지 100 nmol, 약 0.1 내지 10 nmol, 또는 약 100 nmol 내지 약 1000 nmol이다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제의 양은 약 2 내지 20 umol, 약 20 nmol 내지 2 umol, 또는 약 2 umol 내지 약 100 umol이다. 한 실시양태에서, TLR7 내지 TLR4 작용제의 비율은 약 1:10, 1:100, 1:200, 5:20, 5:100, 또는 5:200이다. 한 실시양태에서, 상기 제제는 주사된다. 한 실시양태에서, 상기 리포좀 제제는 DOPC, 콜레스테롤, 또는 이의 조합을 포함한다.
또한, 리포좀, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제를 포함하는 약학적 제제가 제공되며, 예를 들어, 여기서 상기 리포좀은 DOPC, 콜레스테롤 또는 이의 조합을 포함하며, 한 실시양태에서, TLR7 작용제의 양은 약 0.01 내지 100 nmol, 약 0.1 내지 10 nmol, 또는 약 100 nmol 내지 약 1000 nmol이며; TLR4 작용제의 양은 약 2 nmol 내지 20 umol, 약 20 nmol 내지 2 umol, 또는 약 2 umol 내지 약 100 umol이며; 또는 여기서 TLR7 내지 TLR4 작용제의 비율은 약 1:10, 1:100, 1:200, 5:20, 5:100, 또는 5:200이다.
본 발명의 방법은 리포솜, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제를 포함하는 조성물을 사용하여 포유동물에서 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
도 1. 예시적인 리포좀 제제.
도 2. DMSO 또는 리포좀 제제 내 1V270 (1μM), 2B182C (200μM), 또는 1V270 (1μM) 및 2B182C (200mM)의 조합의 인비트로 면역자극 활성.
야생형 C57BL/6 마우스로부터 뮤린(murine) 골수 유래 수지상 세포를 DMSO 또는 리포좀 제제에서 1V270 (1μM), 2B182C (200μM), 또는 1V270 (1μM) 및 2B182C (200mM)의 조합과 함께 18시간 배양했다. 배양 상청액에서 IL-6 방출을 ELISA로 측정하였다.
도 3. 리포좀 제제는 TLR4 독립적인 세포독성을 완화시킨다
야생형 C57BL/6 마우스 또는 TLR4 결핍 마우스(C57BL/6 백그라운드)로부터 뮤린 골수 유래 수지상 세포를 DMSO 또는 리포좀 제제에서 1V270 (1μM), 2B182C (200μM), 또는 1V270 (1μM) 및 2B182C (200mM)의 조합과 함께 18시간 배양했다. 세포 생존력은 MTT 분석에 의해 평가되었다.
도 4. 예시적인 실험 프로토콜.
도 5. 제제에 대한 항-HA IgG1 및 IgG2a 수준.
도 6. 제제에 대한 IgG2a/IgG1의 비율.
도 7. GC 세포 및 형질모세포(plasmablast)에 대한 게이팅 전략(Gating strategy).
도 8. 1V270 및/또는 2B182c 또는 AddaVax의 투여에 의해 유도된 세포 유형들. 제제화된 1V270 및 2B182c의 조합은 GC B 세포 및 형질모세포의 수를 현저하게 증가시켰다.
도 9. 1V270 및/또는 2B182c 또는 AddaVax의 투여에 의해 유도된 ELISA 또는 BCR-seq에 의해 측정된 항-HA IgG 수준. IgG2a 생산은 조합 처리에 의해 강하게 증가되었으며, Th1 반응은 제제화된 2B182c에 의해 유도되었다.
도 10. BCR 다양성은 조합 처리에 의해 증가되었다.
도 11. 항원 및 1V270 및/또는 2B182c 또는 AddaVax의 투여 이후 TCR 클론성. TCR 클론성은 2B182c 처리 및 Addavax 이후에 증가되었다.
도 12. 1V270 및/또는 2B182c 또는 AddaVax의 투여 이후 BCR 다양성 및 TCR 클론성.
BCR 다양성은 조합 처리에 의해 증가되었으며 TCR 클론성은 2B182c 처리 및 Addavax 이후에 증가되었다.
도 13. 클론 유사성.
도 14. 공유 클론.
도 15. 클러스터 분석.
도 16. 인플루엔자에 대해 알려진 항체와 유사한 서열을 갖는 클러스터의 수.
도 17. 세포독성 및 IL-12 분비 분석, 리포좀 어주번트는 BMDC에서 더 낮은 세포독성으로 IL-12 분비를 유도했다.
도 18. 1V270 및/또는 2B182c(비제제화된 것 및 제제화된 것) 또는 AddaVax 투여 후 항-NAIgG1 및 IgG2a 분석.
도 19A-19B. 2B182c 및 1V270의 리포좀 제제는 Th1 반응에 대한 면역 반응을 왜곡시킨다. (A) BALB/c 마우스는 0일 및 28일에 DMSO(D) 또는 리포좀(L) 제제에서 TLR4 리간드 및/또는 TLR7 리간드와 혼합된 비활성화된 Cal 2009 H1N1 인플루엔자 바이러스(10 ㎍/주사)로 면역화되었다. 혈청을 28일째에 수집하고 HA 또는 NA 특이적 IgG1 및 IgG2a를 ELISA에 의해 결정하였다. (B) Th1/TH2 균형은 IgG2a/IgG1 비율로 평가되었다. *P<0.05, **P<0.001, 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정에 의함.
도 20A-20C. 리포좀 2B182c 및 1V270과 함께 조합 어주번트 처리에 의해 드레이닝(draining) 림프절의 배중심(germinal center) B 세포 및 형질모세포의 수가 증가된다. (A) 실험 프로토콜. (B) 유세포 분석 데이터에 대한 게이팅 전략. (C) B 세포, 배중심 B 세포(CD3-CD19+CD95+GL7+) 및 형질모세포(CD3-CD19+CD138+)의 총 수를 계산했다. BL; 빈 리포좀. *;p<0.05, ** ;p<0.01, ***;p<0.001 Dunn의 사후 테스트(Dunn's post hoc tect)와 함께 크루스컬-월리스(Kruskal-Wallis) 테스트에 의함, 항원+BL과 비교.
도 21A-21B. 2B182C는 더 낮은 농도로 인간(A) 및 마우스(B) TLR4 모두에 효과적이다. HEK TLR 리포터 세포(HEK-BlueTM hTLR4 및 HEK-BlueTM mTLR4)를 화합물 1Z105 및 2B182C(10 mM로부터 2배 계열 희석)로 20시간 동안 처리했다. 배양 상청액에서 NF-kB 유도성 NF-kB SEAP 수준을 제조업체의 프로토콜에 따라 평가했다.
도 22A-22C. 200 nmol/주사 2B182c는 더 높은 수준의 항원 특이적 IgG1 및 항-NA IgG2a를 유도했다. (A) 2개의 TLR 작용제 1Z105 및 2B182C의 비교를 위한 실험 프로토콜. BALB/c 마우스(n=5/그룹)는 IIAV(10 mg/주사)와 TLR4 작용제 1Z105 또는 2B182C(40 및 200 nmol/주사)를 0일과 21일에 양쪽 뒷다리에 i.m. 면역화되었고, 28일에 채혈하고, 혈청을 ELISA에 의해 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)에 대한 항체에 대해 측정했다. 10% DMSO를 비히클로 사용하였다. (B) 항-HA 및 -NA IgG1 항체. (C) 항-HA 및 -NA IgG2a 항체. 각 상자 플롯(plo)에서 상자 안의 선은 중간값을 나타내고, 경계는 상한 및 하한 사분위수(quartiles)이며 막대는 최소값과 최대값을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스 테스트(vs. 항원+비히클).
도 23A-23C. 2B182C 및 TLR7 작용제 1V270과의 조합은 항원 특이적 IgG1 및 IgG2a 둘 모두를 증가시켰다. (A-C) BALB/c 마우스(n=5-6)를 도 2A에 나타낸 바와 같이 IIAV 및 어주번트로 면역화시켰다. MF59와 유사한 제제인 AddaVaxTM를 양성 대조군으로 사용하였다. 항-HA 및 -NA IgG1(A), 항-HA 및 -NA IgG2a 생성(B)은 ELISA에 의해 결정하였다. 각 상자 플롯에서 상자 안의 선은 중간값을 나타내고, 경계는 상한 및 하한 사분위수이며, 막대는 최소값과 최대값을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스 검정. 항원 없음 및 AddaVax를 제외한 4개 그룹을 비교했다(모든 쌍). (C) 모든 조합 처리에 의해 유도된 항-HA IgG1 및 IgG2a 수준(비히클에 대해 정규화됨)은 5-11마리의 마우스/그룹에 의해 표시된다. 각 점은 개별 동물을 나타낸다. 검은색 실선은 IgG2a/IgG1=1을 나타낸다. IgG2a/IgG1=1 위에 분포된 1V270 및 2B182C와 조합하여 면역화된 모든 동물은 이들 마우스의 면역 균형이 Th1 면역 반응에 편향되어 있음을 시사한다.
도 24A-24B. 28일째 항원 특이적 IgM 생산. (A 및 B) BALB/c 마우스(n=5-6)를 IIAV(10㎍/주사)로 면역화하고 도 2A에 나타낸 바와 같이 어주번트를 표시하였다. 항원 특이적 IgM 수준은 ELISA로 측정하였다. (A) TLR4 작용제 1Z105 또는 2B182C(40 및 200 nmol/주사)에 의해 유도된 항-HA 및 -NA IgM 생산. (B) TLR7 작용제 1V270(1 nmol/주사) 및 TLR4 작용제 1Z105 또는 2B182C(200 nmol/주사)의 조합은 항원 특이적 IgM 유도에 대한 최소 효과를 나타냈다. *P<0.05, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스 검정.
도 25A-25B. 리포좀 1V270 및 2B182C는 세포독성이 적으면서 유사한 수준의 IL-12 방출을 유도했다. (A) IL-12 분비 수준. (B) % 생존률. 뮤즈(Muse) 1차 BMDC는 1V270(0.0625uM) 및 2B182C(12.5uM)로 처리하였다. 1V270/2B182c 비율은 도 3에서 최선의(best) 비율로 결정된 1 대 200으로 유지되었다. 밤새 배양한 후, 배양 상청액의 IL-12 수준을 ELISA로 검사하고 세포 생존율을 MTT 분석으로 평가했다. *P<0.05, **P<0.01, Welch 보정(Welch's correction)과 함께 원-테일드 언페어드 t-테스트(One-tailed unpaired t-test), 각 화합물에서 DMSO 제제(D) 대 리포좀 제제(L).
도 25C. 조합 어주번트 주입 후 국소 면역 세포 침윤의 조직학적 분석. BALB/c 마우스에 1V270(1nmol/주사), 2B182C(200nmol/주사), 또는 1V270(1nmol/주사) 및 2B182C(200nmol/주사)의 조합의 리포좀 제제를 근육내 주사했다. 조직을 수집하고 고정하고 파라핀 블록에 포매했다(embedded). 10 μm 섹션은 H&E로 염색되었다. 저배율 및 고배율은 각각 20x 및 40x 대물렌즈를 사용하여 얻었다. 저배율 및 고배율 이미지의 스케일바는 각각 50 mm 및 20 mm를 나타낸다.
도 25D. BALB/c 마우스(n=5/그룹)는 DMSO 제제 또는 리포좀 제제와 함께 비히클, 1V270, 2B182C, 1V270+2B182C [50 μL 부피의 1 nmol/주사 1V270 및 200 nmol/주사 2B182C]로 i.m. 주사되었다. AddaVaxTM(25μL/주사)를 양성 대조군으로 사용했다. 2시간 및 24시간 후, 혈청을 수집하고 루미넥스 멀티플렉스 사이토카인 분석(Luminex multiplex cytokine assay)에 의해 IL-12p40, TNF 및 KC 분비에 대해 조사했다(A). 표시된 데이터는 평균 ± SEM이다. *P<0.05, **P<0.01, 투-테일드 만-휘트니 U 테스트(Two-tailed Mann-Whitney U test). +P<0.05, ++P<0.01, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스를 통해 4개 그룹(동일 제제에서 비히클, 1V270, 2B182C, 1V270+2B182C)을 비교한다.
도 26A-26D. 리포좀 1V270 및 2B182C는 항-HA 및 항-NA IgG1 및 IgG2a 생산을 시너지적으로 향상시켰다. (A-C) BALB/c 마우스(n=5/그룹)는 0일 및 21일에 IIAV(10 mg/주사)로 도 22A에 나타낸 바와 같이 제제화된 어주번트와 함께 i.m. 면역화하였다. 리포좀 TLR7 작용제 1V270(Lipo-1V270, 1 nmol/주사), 리포좀 TLR4 작용제 2B182C(Lipo-2B182C, 200 nmol/주사) 및 1V270 및 2B182의 리포좀 조합된 어주번트(Lipo-1V270+2B182C, 1 nmol/주사 + 200 nmo/주사)가 주사되었다. 비히클은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 콜레스테롤(DOPC/Chol, 대조 리포좀)이다. AddaVax??를 양성 대조군으로 사용했다. 28일째에 혈청을 수집하고 HA 또는 NA 특이적 IgG1, IgG2a 및 전체 IgG를 ELISA로 결정했다. *P<0.05 및 **P<0.01, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스 테스트. 항원 없음 및 AddaVax를 제외한 4개 그룹을 비교했다(모든 쌍). 데이터는 유사한 결과를 가진 두 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 27. 제제화된 어주번트에 의해 유도된 항원 특이적 IgM 수준. BALB/c 마우스(n=5/그룹)는 0일 및 21일에 IIAV(10 mg/주사)로 도 2A에 나타낸 바와 같이 제제화된 어주번트와 함께 i.m. 면역화시켰다. 리포좀 TLR7 작용제 1V270(Lipo-1V270, 1 nmol/주사), 리포좀 TLR4 작용제 2B182C(Lipo-2B182C, 200 nmol/주사) 및 1V270 및 2B182 nm의 조합된 리포좀 어주번트(Lipo-1V270+2B182C, 1 nmo/주사 + 200 nmol/주사)가 주사되었다. 비히클은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 콜레스테롤(DOPC/Chol, 대조 리포좀)이다. AddaVax??를 양성 대조군으로 사용했다. 혈청을 28일째에 수집하고 HA 또는 NA 특이적 IgM에 대해 조사했다. *P<0.05, Dunn의 사후 테스트와 함게 크루스컬-월리스 테스트. 항원이 없는 경우와 AddaVax를 제외한 4개 처리군을 비교했다(모든 쌍). 데이터는 유사한 결과를 가진 두 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 28A-28C. 제제화된 조합된 어주번트는 Tfh 및 항체 분비 세포를 증가시켰다. (A) BALB/c 마우스(n=4-5/그룹)는 0일 및 21일에 총 50 mL의 부피로 IIAV(10㎍/주사) 및 1V270(1nmol/주사) 및/또는 2B182C(200nmol/주사)로 백신 접종되었다. 28일 후, FACS 분석을 위해 사타구니 림프절의 림프구를 채취했다. Tfh 세포(CD3+CD4+PD-1+CXCR5+), GC B 세포(CD3-CD19+CD95+GL7+), 형질모세포(CD3-CD19+CD138+) 및 형질 세포(CD3-CD19-CD138+)에 대한 게이팅 전략이 개시된다. (B) %Tfh 세포, GC B 세포, 형질모세포 및 살아있는 세포의 형질 세포. 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스. AddaVax를 제외한 4개의 조건을 비교했다(모든 쌍).
도 29A-29B. 제제화된 조합된 어주번트는 Tfh 및 항체 분비 세포를 증가시켰다. BALB/c 마우스(n=4-5/그룹)는 0일 및 21일에 50mL의 총 부피로 1V270(1 nmol/주사) 및/또는 2B182C(200 nmol/주사)와 함께 IIAV(10 ㎍/주사)로 백신 접종되었다. 28일 후, 사타구니 림프절의 림프구가 FACS 분석을 위해 수확되었다(도 5A). Tfh 세포(CD3+CD4+PD-1+CXCR5+), GC B 세포(CD3-CD19+CD95+GL7+), 형질모세포(CD3-CD19+CD138+) 및 형질 세포(CD3-CD19-CD138+)에 대한 게이팅 전략이 도 5B에 표시된다. (A) Tfh 세포, GC B 세포, 형질모세포, 형질 세포의 수. (B) 총 세포 수. 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스(모든 쌍).
도 30A-30C. 1V270 및 2B182C의 제제화된 조합. (A 및 B) BALB/c 마우스를 0일 및 21일에 제제화된 어주번트와 함께 IIAV로 백신 접종하고 BCR 레퍼토리 분석을 위해 28일에 사타구니 림프절을 수확하였다. (A) 총 IGH, IGHG1 및 IGHG2A의 BCR 다양성. (B) 유사성 분석. 자카드 지수가 표시된다. (C) TCRα 및 TCRβ에 대한 "1-피에루 지수(1- pielou's index)"로 표시된 TCR 클론성. 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스(vs. 리포좀).
도 31A-31I. Lipo-2B182C 및 Lipo-1V270+2B182C는 동종 인플루엔자 바이러스로부터 마우스를 보호한다. (A) 동종 인플루엔자 바이러스 챌린지의 실험 일정. (B) % 초기 체중으로 표시된 평균 체중 변화. *P<0.05, **P<0.01, Dunnett의 사후 테스트와 함께 원-웨이 ANOVA. (C) 동종 바이러스(H1N1pdm)로 챌린지 후 마우스의 생존율. 로그 순위 테스트와 함께 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 곡선이 표시된다. 폐 바이러스 역가(D) 및 폐액의 사이토카인 수준(E)을 평가했다. 폐 세척은 3일과 6일에 수행되었다. **P<0.01, Dunn의 사후 테스트와 함게 크루스컬-월리스(vs. 리포좀). (F) 폐 바이러스 역가와 전염증성 사이토카인 사이의 관계, MCP-1(왼쪽) 및 IL-6(오른쪽). 스피어맨(Spearman) 순위 상관 테스트, (MCP-1; **P<0.0001, 스피어맨 r= 0.83, IL-6; ***P<0.0001, 스피어맨 r= 0.79). HI 역가(G) 및 동종 바이러스에 대한 VN 역가(H). *P<0.01, ***P<0.001, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스(모든 쌍). (I) VN 역가와 폐 바이러스 역가 간의 관계. 각 점은 동일한 동물에서 VN 역가와 폐 바이러스 역가를 나타낸다. **P<0.01, 스피어맨 순위 상관 테스트, 스피어맨 r= -0.59.
도 32A-32C. H3N2 바이러스에 대한 이종 챌린지. BALB/c 마우스를 도 31A에 기술된 바와 같이 제제화된 어주번트와 IIAV(H1N1)로 면역화시키고 이종 바이러스 A/Victoria3/75(H3N2)로 비강내 챌린지했다. (A) 체중 감소를 모니터링했다. 원-웨이 ANOVA에서는 유의성이 발견되지 않았다. (B) 이종 바이러스로 챌린지 후 마우스의 생존율. 로그 순위 테스트를 사용한 카플란-메이어 곡선(n.s.)이 표시된다. (C) 3일 및 6일째 폐 바이러스 역가. 크루스컬-월리스 테스트에 의해 유의성이 검출되지 않았다.
도 33A-33G. A 및 E) 프로토콜. B-C 및 F-G) 체중 및 1V270 및/또는 2B182c 또는 AddaVax를 투여한 마우스에서 A/PuertoRico/8/1934 또는 B/Florida/04/로 감염 후 시간 경과에 따른 생존. D) 1V270 및/또는 2B182c 또는 AddaVax가 투여된 마우스에서 IgG2a/IgG1 비율.
도 34A-34B. A) 1V270, 1Z105, 2B182c 또는 AddaVax가 투여된 마우스에서 항-HA IgG1, 항-HA IgG2a 및 항-HA IgM. B) 1V270, 1Z105, 2B182c 또는 AddaVax가 투여된 마우스에서 항-NA IgG1, 항-NA IgG2a 및 항-NA IgM.
도 35A-35F. IV270, 1Z105, 2B182c 또는 AddaVax 투여된 마우스에서 A 및 B) 항-HA 및 항-NA IgG1, C-D) 항-HA 및 항-NA IgG2a 및 E-F) 항-HA 및 항-NA IgM. B) 1V270, 1Z105, 2B182c 또는 AddaVax 투여된 마우스에서 항-NA-IgG1, 항-NA IgG2a 및 항-NA IgM.
도 36A-36B. 1V270, 1Z105, 2B182c, 또는 이의 조합을 서로 다른 용량으로 투여한 마우스에서 항-HAIgG2a 및 IgG1.
도 37. 다양한 리포좀 및 예시적인 프로토콜의 개략도.
도 38A-38B. A/California/04/2009 (H1N1)pdm의 HA의 펩타이드 어레이를 사용한 ELISA. BALB/c 마우스(n=5-10)를 IIAV + Lipo-Veh(블랭크 리포좀), Lipo-1V270, Lipo-2B182C, Lipo-(1V270+2B182C)(공동 캡슐화된 조합) 또는 (Lipo-1V270)+(Lipo-2B182C)(혼합된 조합)를 0일과 21일에 면역화하고 28일에 채혈했다. A/California/04/2009(H1N1)pdm(NR-15433)의 HA 펩타이드 어레이는 BEI 리소스로부터 수득했다. 5개 그룹의 펩티드를 모으고(pooled) 28개의 펩티드 풀을 생성했다. (A) ELISA 결과와 함께 OD405-570 nm의 히트맵. 각 행과 열은 각 펩타이드 풀과 마우스를 각각 나타낸다. (B) 통계 분석은 개별 마우스에서 평균 28개의 펩타이드 풀에 대해 수행되었다. **P<0.01, ***P<0.0001, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스. +P<0.05, 만-휘트니 테스트.
도 39A-39D. 항체의 교차 반응성에 대한 ELISA. BALB/c 마우스(n=5/그룹)를 IIAV + Lipo-Veh, Lipo-1V270, Lipo-2B182C, Lipo-(1V270+2B182C), 또는 (Lipo-1V270)+(Lipo-2B182C)로 0일 및 21일째에 면역화시키고, 28일째에 채혈하였다. 혈청을 계열 희석시키고(1:100 내지 1:409600) ELISA에 의해 푸에르토리코 H1N1(Puerto RicoH1N1), H11N9, H12N5, H7N7 및 H3N2의 HA 및 H5N1, H10N8, H3N2 및 H7N7의 NA에 대한 총 IgG 수준에 대해 평가했다. (A) 이 연구에서 사용된 인플루엔자 A 바이러스의 HA의 계통발생적 관계. ELISA에 사용된 단백질의 아미노산 서열은 인플루엔자 리서치 데이터베이스(https://www.fludb.org/brc/home.spg?decorator=influenza)를 사용하여 MUSCLE 알고리즘에 의해 정렬되었다. 계통수는 MEGAX 소프트웨어(https://www.megasoftware.net/)를 사용하여 Neighbor-joining 방법으로 구성되었다. (B) H1N1, H11N9, H12N5, H3N2 및 H7N7의 HA에 대한 총 IgG 역가 곡선. (C) NA의 계통발생적 관계. (D) H5N1, H10N8, H3N2 및 H7N7의 NA에 대한 총 IgG 역가 곡선. 혈청은 x100에서 시작하여 409600까지 1:4로 희석되었고 총 IgG 수준은 ELISA에 의해 평가되었다. 표시된 데이터는 평균 ± SEM이다.
도 40A-40B. Lipo-(1V270+2B182C) 유도된 교차 반응성 항체. (A 및 B) BALB/c(n=5/그룹) 마우스는 IIAV [A/California/04/2009 (H1N1)pdm09] + Lipo-Veh, Lipo-1V270, Lipo-2B182C, Lipo-(1V270+2B182C), 또는 (Lipo-1V270)+(Lipo-2B182C)로 0일 및 21일에 면역화되었으며 28일에 채혈했다. 혈청을 계열 희석(1:100 내지 1:409600)하고 ELISA에 의해 푸에르토리코H1N1, H11N9, H12N5, H7N7 및 H3N2의 HA 및 H5N1, H10N8, H3N2 및 H7N7의 NA에 대한 총 IgG 수준을 평가했다. 프리즘5를 사용하여 계산된 개별 마우스의 총 IgG 역가 곡선의 기하학적 평균이 표시된다. 총 IgG 역가 곡선 및 HA 단백질의 계통발생적 관계가 이 연구에 사용되었으며 이는 상기와 같다. *P<0.05, **P<0.01, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬-월리스. +P<0.05, ++P<0.01, 만-휘트니 테스트.
도 41. 예시적인 TLR4 및 TLR7 작용제.
상세한 설명
백신에서 어주번트의 사용은 약한 면역원성 항원에 대한 더 강한 면역 반응을 촉진하기 위한 잘 확립된 방법이다. 또한, 어주번트는 약한 면역원성 항원의 면역원성을 촉진함으로써 면역 반응을 향상시키고 잠재적으로 확장할 수 있다. 현재 몇 개의 어주번트만이 백신에 사용하도록 허가되었다(O'Hagan, et al. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.01.088). 더욱이 기존 백신의 대부분은 단일 어주번트를 함유하고 있으며 최근의 증거는 많은 새로운 감염성 질병에 대한 보호 면역 반응의 유도에 충분하지 않을 수 있음을 시사한다(Underhill, doi: 10.1111/j.1600-065X.2007.00548.x).
TLR 작용제의 조합을 어주번트로 사용하면 종종 전반적인 면역 반응이 향상되지만 인플루엔자와 같은 감염성 질병 백신의 경우 Th1(세포 매개)의 향상 또는 Th1 유형에 대한 반응의 왜곡(skewing)은 Th2(체액 또는 항체) 유형을 희생시킨다(comes at the expense). 실제로, 때때로 이것은 증가된 Th1 반응에도 불구하고 불충분한 보호 Th2 항체 생성을 초래할 수 있으며, 인플루엔자 감염의 경우 특정 보호 항체 역가가 면역화를 통한 효과적인 보호를 제공하기 위한 주요 인자로 생각된다.
본 개시 내용에서, 단일 나노입자 제제에서 TLR4/TLR7 작용제의 조합 비율은 항원에 대한 전반적인 면역 반응을 향상시킬 뿐만 아니라 마우스에서 치명적인 바이러스 공격에 대한 효과적인 보호를 위한 충분한 보호 항체 생성을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 인간의 면역학적 상태는 쥐의 면역학적 상태와 상당히 다를 것이며, 일반적으로 쥐는 인플루엔자와 같은 항원에 대해 순수한(naive) 반면, 인간은 보통 자연 및 백신 노출을 통해 수년에 걸쳐 인플루엔자 항원에 노출된다. 나중에 인간에게 대상 포진(shingles)으로 나타날 수 있는 수두(chicken pox, varicella zoster)와 같은 다른 감염원의 경우에도 마찬가지이다.
하나의 항원으로 면역화하면 유사한 두 번째 항원에 대한 강력한 면역 반응을 차단하는 것으로 알려져 있다. 이것은 1) 기존 항체, 특히 점막 IgA가 모든 항원 제시 세포로부터 백신을 보호하는 에피토프 배제(epitope exclusion); 2) 기억 B 세포가 새로운 백신을 내재화하여(internalize) DC 접근 및 활성화 및 T 세포 면역화를 감소시키는 감소된 수지상 세포(DC) 접근; 3) 기억 B 세포가 활성화되는 T 세포 경쟁, 사이토카인, 보조 인자 및 항원 로딩된 DC와 반응할 수 있는 포획(trapping) T 세포를 소비한다.
본 개시 내용은 1) 백신을 DC에 우선적으로 전달하는 리포좀 나노입자에 백신을 캡슐화하고 2) 백신 항원에 대한 활성화된 T 세포의 수 다양성을 증가시킬 특정 비율로 조합 TLR 작용제를 사용하여 DC를 활성화함으로써 이러한 책임(liabilities)을 극복한다. 본 발명은 동일한 리포좀 나노입자에서 어주번트로서 TLR4 작용제와 TLR7 작용제의 조합을 제제화하는 것이 별개의 제제화 및 비-제제화 작용제의 혼합 조합에 비해 여러 이점을 제공한다는 우리의 발견을 개시한다. 제제화된 조합은 면역활성을 위해 나노입자에서 TLR4 대 TLR7의 특정 비율을 가질 수 있다.
상기 비율에서 이러한 조합의 장점은 다음과 같다: 1) 더 큰 Th1 및 Th2 면역 반응을 제공하는 DMSO 제제에 비해 향상된 활성; 2) DMSO 제제에 비해 더 낮은 독성; 3) 과면역 개체의 B-세포 및 IgA로부터 항원(백신 사용을 위한)의 보호, 특히 점막 인플루엔자 면역을 위해, 및 수지상 세포가 효과적인 보호 반응을 위한 중요한 에피토프를 제시할 수 있게 함; 및/또는 4) 인플루엔자의 HA 줄기(stalk) 항원의 경우와 같이 덜 면역원성인 항원에 대한 반응을 포함하도록 면역 반응을 확장하여 보다 보편적인 백신을 생성함.
TLR 작용제의 조합을 어주번트로 사용하면 종종 전반적인 면역 반응이 향상되지만 인플루엔자와 같은 감염성 질병 백신의 경우 Th1(세포 매개)의 향상 또는 Th1 유형에 대한 반응의 왜곡은 Th2(체액 또는 항체) 유형을 희생시킨다. 실제로, 때때로 이것은 증가된 Th1 반응에도 불구하고 불충분한 보호 Th2 항체 생성을 초래할 수 있으며, 인플루엔자 감염의 경우 특정 보호 항체 역가가 면역화를 통한 효과적인 보호를 제공하기 위한 주요 인자로 생각된다.
본 발명에서, 단일 나노입자 제제에서 TLR4/TLR7 작용제의 조합 비율은 항원에 대한 전반적인 면역 반응을 향상시킬 뿐만 아니라 마우스에서 치명적인 바이러스 공격에 대한 효과적인 보호를 위한 충분한 보호 항체 생성을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 인간의 면역학적 상태는 쥐의 면역학적 상태와 상당히 다를 것이며, 일반적으로 쥐는 인플루엔자와 같은 항원에 대해 순수한 반면, 인간은 보통 자연 및 백신 노출을 통해 수년에 걸쳐 인플루엔자 항원에 노출된다. 나중에 인간에게 대상 포진으로 나타날 수 있는 수두(varicella zoster)와 같은 다른 감염원의 경우에도 마찬가지이다.
하나의 항원으로 면역화하면 유사한 두 번째 항원에 대한 강력한 면역 반응을 차단하는 것으로 알려져 있다. 이것은 1) 기존 항체, 특히 점막 IgA가 모든 항원 제시 세포로부터 백신을 보호하는 에피토프 배제; 2) 기억 B 세포가 새로운 백신을 내재화하여 DC 접근 및 활성화 및 T 세포 면역화를 감소시키는 감소된 수지상 세포(DC) 접근; 3) 기억 B 세포가 활성화되는 T 세포 경쟁, 사이토카인, 보조 인자 및 항원 로딩된 DC와 반응할 수 있는 포획(trapping) T 세포를 소비한다.
본 발명은 1) 백신을 DC에 우선적으로 전달하는 리포좀 나노입자에 백신을 캡슐화하고 2) 백신 항원에 대한 활성화된 T 세포의 수 다양성을 증가시킬 특정 비율로 조합 TLR 작용제를 사용하여 DC를 활성화함으로써 이러한 책임을 극복한다.
정의
조성물이 중량을 기준으로 특정 조성의 적어도 약 90%, 및 적어도 약 95%, 99% 및 99.9%를 포함할 때, 특정 화합물, 또는 특정한 형태의 화합물(예를 들어 이성질체)의 "실질적으로 모두"로 구성된다. 각 화합물(예를 들어 이성질체)이 중량 기준으로 조성물의 적어도 약 10%를 나타내는 경우, 조성물은 화합물 또는 동일한 화합물의 형태의 "혼합물"을 포함한다. 본 발명의 TLR7 작용제 또는 이의 접합체는 산 염 또는 염기 염으로서뿐만 아니라 유리 산 또는 유리 염기 형태로 제조될 수 있다. 용액에서, 본 발명의 특정 화합물은 쯔비터이온(zwitterions)으로 존재할 수 있으며, 여기서 카운터 이온은 용매 분자 자체에 의해, 또는 용매에 용해되거나 현탁된 다른 이온으로부터 제공된다.
"toll-유사 수용체 작용제"(TLR 작용제)라는 용어는 TLR에 결합하는 분자를 지칭한다. 합성 TLR 작용제는 TLR에 결합하고 수용체를 활성화하도록 설계된 화학적 화합물이다.
본 발명 내에서, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 그의 염이 호변이성질체화(tautomerism) 현상을 나타낼 수 있음을 이해해야 하며, 이에 의해 두 개의 원자 사이에 수소 원자를 교환함으로써 상호전환을 용이하게 할 수 있는 두 개의 화학적 화합물은 어느 쪽이든 공유 결합을 형성한다. 호변이성질체(tautomeric) 화합물은 서로 이동 평형 상태로 존재하기 때문에 동일한 화합물의 다른 이성질체 형태로 간주될 수 있다. 본 명세서 내의 화학식 도면은 가능한 호변이성질체 형태 중 하나만을 나타낼 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명은 임의의 호변이성질체 형태를 포함하고, 화학식 도면 내에서 사용되는 임의의 하나의 호변이성질체 형태에만 단순히 제한되지 않는다는 것도 이해되어야 한다. 본 명세서 내의 화학식 도면은 가능한 호변이성질체 형태 중 단지 하나만을 나타낼 수 있고, 본 명세서는 본 명세서에서 그래프로 나타내기에 편리한 형태뿐만 아니라 그려진 화합물의 모든 가능한 호변이성질체 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 호변이성질체는 물결선으로 표시된 바와 같이 결합된 피라졸릴기에 의해 나타낼 수 있다. 두 치환기 모두 4-피라졸릴기라고 칭할 수 있지만, 각 구조에서 다른 질소 원자가 수소 원자를 갖고 있음이 분명하다.
이러한 호변이성질체화는 3-메틸, 5-메틸 또는 3,5-디메틸피라졸 등과 같은 치환된 피라졸에서도 발생할 수 있다. 호변이성질체화의 또 다른 예시는 고리 질소 원자에 인접한 고리 산소 원자를 보유하는 헤테로고리 화합물에서 볼 수 있는 것과 같은 아미도-이미도(환식(cyclic)일 때 락탐-락팀) 호변이성질체화이다. 예를 들어, 평형:
은 호변이성질체화의 예시이다. 따라서, 본 명세서에서 하나의 호변이성질체로 도시된 구조는 다른 호변이성질체도 포함하도록 의도된다.
광학 이성질체
본 발명의 화합물이 하나 이상의 키랄 중심을 포함하는 경우, 상기 화합물은 순수한 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 형태 또는 라세미 혼합물로서 존재할 수 있고 단리될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 임의의 가능한 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
키랄 중심의 존재로 인한 이성질체는 "거울상이성질체"라고 하는 중첩되지 않는(non-superimposable) 한 쌍의 이성질체를 포함한다. 순수한 화합물의 단일 거울상이성질체는 광학적으로 활성이며, 즉 그들은 평면 편광의 평면을 회전할 수 있다. 단일 거울상이성질체는 Cahn-Ingold-Prelog 시스템에 따라 지정된다. 치환기의 우선순위는 원자량을 기준으로 하여 순위가 매겨지며, 체계적인 절차에 따라 결정되는 더 높은 원자량 일수록 더 높은 우선순위 순위를 갖는다. 4개의 그룹의 우선 순위가 결정되면 분자는 가장 낮은 순위의 그룹이 관찰자(viewer)에서 멀리 향하도록 배향된다. 그런 다음 다른 그룹의 내림차순이 시계 방향으로 진행하면 분자를 (R)로 지정하고 다른 그룹의 내림차순이 시계 반대 방향으로 진행하면 분자를 (S)로 지정한다. 스킴(Scheme) 14의 예시에서 Cahn-Ingold-Prelog 순위는 A > B > C > D이다. 가장 낮은 순위의 원자인 D는 관찰자에서 멀리 떨어져 있다.
본 발명은 부분입체이성질체 뿐만 아니라 그의 라세미체 및 분해된 부분입체이성질체적으로 및 거울상이성질체적으로 순수한 형태 및 그의 염을 포함하는 것을 의미한다. 부분입체이성질체 쌍은 일반상(normal phase) 및 역상(reverse phase) 크로마토그래피 및 결정화를 포함하는 공지된 분리 기술에 의해 분해될 수 있다.
"단리된 광학 이성질체"는 동일한 화학식의 상응하는 광학 이성질체(들)로부터 실질적으로 정제된 화합물을 의미한다. 한 실시양태에서, 단리된 이성질체는 중량 기준으로 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 90%, 98% 또는 99% 순수하다.
단리된 광학 이성질체는 잘 알려진 키랄 분리 기술에 의해 라세미 혼합물로부터 정제될 수 있다. 이러한 방법 중 하나에 따르면, 본 발명의 화합물 또는 이의 키랄 중간체의 라세미 혼합물은 컬럼의 DAICEL® CHIRALPAK® (Daicel Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan) 패밀리 시리즈의 구성원과 같은 적합한 키랄 컬럼을 사용하여 HPLC에 의해 99% 중량% 순수 광학 이성질체로 분리된다. 상기 컬럼은 제조업체의 지침에 따라 작동된다.
"약학적으로 허용되는"이라는 문구는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과량의 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 제제를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 염"은 모(parent) 화합물이 그의 산 또는 염기 염을 제조함으로써 변형된 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산염 또는 유기산염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염; 등에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용되는 염은 통상적인 무독성 염 또는 예를 들어 무독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 4차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 이러한 통상적인 무독성 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로부터 유도된 것; 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 베헨산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산, 이세티온산 등과 같은 유기산으로부터 제조된 염을 포함한다.
본 발명에 유용한 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 염기성 또는 산성 부분을 함유하는 모 화합물로부터 통상적인 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 둘의 혼합물에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조할 수 있으며; 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 사용될 수 있다. 적합한 염의 목록은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418(1985)에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본원에 기재된 화학식의 화합물은 용매화물일 수 있고, 일부 실시양태에서는 수화물일 수 있다. "용매화물"이라는 용어는 그의 고체 구조와 관련된 하나 이상의 용매 분자를 갖는 고체 화합물을 지칭한다. 용매화물은 화합물이 용매로부터 결정화될 때 형성될 수 있다. 하나 이상의 용매 분자가 응고(solidification) 시 고체 결정질 매트릭스의 내부(integral) 부분이 될 때 용매화물이 형성된다. 본원에 기재된 화학식의 화합물은 용매화물, 예를 들어 에탄올 용매화물일 수 있다. 용매화물의 또 다른 유형은 수화물이다. "수화물"은 마찬가지로 분자 수준에서 고체 또는 결정 구조와 밀접하게 관련된 하나 이상의 물 분자를 갖는 고체 화합물을 의미한다. 수화물은 화합물이 물에서 응고되거나 결정화될 때 형성될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 물 분자는 고체 결정질 매트릭스의 내부 부분이 된다.
달리 설명되지 않는 한 다음 정의가 사용된다. 할로 또는 할로겐은 플루오로(fluoro), 클로로(chloro), 브로모(bromo) 또는 요오도(iodo)이다. 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐 등은 직쇄 및 분지형 기 모두를 나타내며; 그러나 "프로필"과 같은 개별 라디칼에 대한 언급은 직쇄 라디칼만을 포함하며, "이소프로필"과 같은 분지쇄 이성질체는 구체적으로 언급된다. 아릴은 하나 이상의 고리가 방향족인 약 9 내지 10개의 고리 원자를 갖는 페닐 라디칼 또는 오르토-융합된 이환식 탄소환식 라디칼을 나타낸다. Het는 탄소로 이루어진 5개 또는 6개의 고리 원자 및 비-과산화물 산소, 황 및 N(X)(여기서 X는 존재하지 않거나 또는 H, O, (C1-C4)알킬, 페닐 또는 벤질임)로 이루어진 그룹으로부터 각각 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 단일환식 방향족 고리의 고리 탄소를 통해 부착된 라디칼뿐만 아니라, 이로부터 유도된, 특히 벤즈(benz)-유도체 또는 프로필렌, 트리메틸렌 또는 테트라메틸렌 디라디칼을 이에 융합함으로써 유도된, 약 8개 내지 10개 고리 원자의 오르소-융합된 바이사이클릭 헤테로사이클의 라디칼을 포함하는 헤테로아릴일 수 있다.
키랄 중심을 갖는 본 발명의 화합물은 광학 활성 및 라세미 형태로 존재할 수 있고 단리될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 일부 화합물은 다형성을 나타낼 수 있다. 본 발명은 본원에 기술된 유용한 특성을 갖는 본 발명의 화합물의 임의의 라세미, 광학 활성, 다형 또는 입체이성질체 형태, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 어떻게 광학 활성 형태를 제조하는지(예를 들어 재결정화 기술에 의한 라세미 형태의 분리(resolution), 광학 활성 출발 물질로부터 합성, 키랄 합성 또는 키랄 고정상을 사용한 크로마토그래피 분리에 의한) 및 어떻게 본원에 개시된 표준 테스트를 사용하여, 또는 기술분야에 잘 알려진 다른 유사한 테스트를 사용하여 작용제의 활성을 측정하는지는 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 화합물이 서로 평형의 다양한 상태로 존재할 수 있는 다양한 호변이성질체를 포함한다는 것이 당업자에 의해 이해된다.
본원에 사용된 "치료" 및 "치료하는"이라는 용어는 (i) 병적 상태가 발생하는 것을 방지(preventing)(예를 들어 예방(prophylaxis)); (ii) 병리학적 상태를 억제하거나 그 발달을 저지하는 것; (iii) 병리학적 상태의 완화; 및/또는 (iv) 증상의 개선, 완화, 경감 및 제거를 의미한다. 본원에 기재된 후보 분자 또는 화합물은 생물학적 효과를 일으킬 수 있거나, 또는 상태, 예를 들어 질병의 증상을 개선, 완화, 약화(lessening), 경감(relieving), 감소 또는 제거할 수 있는 양인 제제 또는 약제의 양으로 존재할 수 있다. 용어는 또한 세포 증식 속도를 감소 또는 중지(예를 들어, 종양 성장을 늦추거나 중지) 또는 증식하는 암 세포의 수를 감소(예를 들어, 종양의 일부 또는 전부 제거)를 지칭할 수 있다. 이러한 용어는 또한 미생물에 감염된 시스템(예를 들어 세포, 조직 또는 대상)에서 미생물(microorganism, microbe)의 역가를 감소시키고, 미생물 증식 속도를 감소시키고, 미생물 감염과 관련된 증상의 수 또는 증상의 영향을 감소시키고, 및/또는 상기 시스템으로부터 검출 가능한 양의 미생물을 제거하는데 적용될 수 있다. 미생물의 예시에는 바이러스, 박테리아 및 진균이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "치료학적 유효량"이라는 용어는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하거나 질병 또는 질환의 증상을 치료하기 위한 화합물의 양 또는 화합물의 조합의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 "대상체" 및 "환자"라는 용어는 일반적으로 본원에 기재된 방법에 따라 치료(예를 들어, 화합물의 투여)를 받을 또는 받은 개인을 지칭한다.
"안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로 단리되고 효과적인 치료제로의 제제화를 견디기에 충분히 견고한 화합물을 나타내는 것을 의미한다. 안정한 화합물만이 본 발명에 의해 고려된다.
"대상체", "환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"라는 용어는 본원에 제공된 바와 같은 화합물, 약학적 조성물, 혼합물 또는 백신의 투여에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 증상을 겪고 있거나 또는 이에 걸리기 쉬운 살아있는 유기체를 지칭한다. 비제한적인 예시로는 인간, 기타 포유류, 소, 쥐, 생쥐, 개, 원숭이, 염소, 양, 소, 사슴 및 기타 비포유동물이 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 가축이다. 일부 실시양태에서, 환자는 개이다. 일부 실시양태에서, 환자는 앵무새이다. 일부 실시양태에서, 환자는 가축이다. 일부 실시양태에서, 환자는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 환자는 고양이이다. 일부 실시양태에서, 환자는 말이다. 일부 실시양태에서, 환자는 소이다. 일부 실시양태에서, 환자는 개이다. 일부 실시양태에서, 환자는 고양이과이다. 일부 실시양태에서, 환자는 유인원이다. 일부 실시양태에서, 환자는 원숭이이다. 일부 실시양태에서, 환자는 마우스이다. 일부 실시양태에서, 환자는 실험 동물이다. 일부 실시양태에서, 환자는 쥐(rat)이다. 일부 실시양태에서, 환자는 햄스터이다. 일부 실시양태에서, 환자는 실험 동물이다. 일부 실시양태에서, 환자는 신생아 동물이다. 일부 실시양태에서, 환자는 신생아 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 신생아 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 환자는 나이든 동물이다. 일부 실시양태에서, 환자는 노인이다. 일부 실시양태에서, 환자는 나이든 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 환자는 노인(geriatric) 환자이다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"이라는 용어는 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 양을 의미한다. 따라서, "치료학적 유효량" 등의 용어는 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하거나 질병 또는 질환의 증상을 치료하기 위한 화합물, 혼합물 또는 백신, 또는 이들의 조합의 양을 지칭한다.
"TLR"이라는 용어는 NFκB 활성화를 조절하는 선천적 면역계의 구성요소인 Toll-유사 수용체를 지칭한다.
본원에 사용된 "TLR 조절제", "TLR 면역조절제" 등의 용어는 통상적이고 관례적인 의미에서 Toll 유사 수용체를 작용하거나 길항하는 화합물을 지칭한다. 예를 들어 PCT/US2010/000369, Hennessy, E.J., et al., Nature Reviews 2010, 9:283- 307; PCT/US2008/001631; PCT/US2006/032371; PCT/US2011/000757 참조. 따라서, "TLR 작용제"는 TLR을 작용시키는 TLR 조절제이고, "TLR 길항제"는 TLR을 길항하는 TLR 조절제이다.
본원에 사용된 "TLR4"이라는 용어는 TLR4 유전자의 생성물, 및 그의 상동체, 동형체 및 기능적 단편을 지칭한다: 동형 1(NCBI 수탁 NP_612564.1); 동형 2(NCBI 수탁 NP_003257.1); 동형 3(NCBI 수탁 NP_612567.1). 개시된 제제에 포함될 수 있는 TLR4의 작용제는 화학식 (II)의 화합물, 예를 들어 피리미도인돌, 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트, 예를 들어 CRX-601 및 CRX-547), RC-29, 모노포스포룰 지질 A(MPL), 글루코피라노실 지질 어주번트(GLA 및 SLA), OM-174, PET 지질 A, ONO-4007, INI-2004 (디-아민 알로스 포스페이트(di-amine allose phosphate)), 및 E6020을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "TLR7"이라는 용어는 TLR7 유전자의 산물(NCBI 수탁 AAZ99026), 이의 상동체, 및 기능적 단편을 지칭한다. 개시된 제제에 포함될 수 있는 TLR7의 작용제는 화학식 (I)의 화합물, 이미다조퀴놀린, 예를 들어 이미퀴모드, CL097 또는 가르디퀴미드(gardiquimid), CL264, CL087와 같은 아데닌 유사체, 3M0002(CL075)와 같은 티아졸로퀴놀린, 아슬록소리빈(asloxoribine)과 같은 구아노신 유사체, 또는 티오퀴놀린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
TLR4 및 TLR7
Toll 유사 수용체(TLR)는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)으로 알려진 보존된 미생물 제품을 인식하는 패턴 인식 수용체이다. TLR4는 LPS를 인식한다. TLR4 신호전달은 MyD88 및 TRIF 의존성 경로를 활성화한다. MyD88 경로는 NF-κB와 JNK를 활성화하여 염증 반응을 유도한다. TRIF 경로는 IRF3를 활성화하여 IFN-α 생성을 유도한다.
TLR4는 단핵구, 성숙한 대식세포 및 수지상 세포, 비만 세포 및 장 상피에서 주로 발현된다. TLR4에 대한 TLR 조절제(길항제)는 NI-0101 (Hennessy 2010, Id.), 1A6 (Ungaro, R., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2009, 296:G1167-G1179), AV411 (Ledeboer, A., et al., Neuron Glia Biol. 2006, 2:279-291; Ledeboer, A., et al., Expert Opin. Investig. Drugs 2007, 16:935-950), Eritoran (Mullarkey, M., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 305:1093-1102), 및 TAK-242 (Li, M., et al., Mol. Pharmacol. 2006, 69:1288-1295)을 포함한다. TLR4에 대한 TLR 조절제(작용제)는 Pollinex® Quattro (Baldrick, P., et al., J. Appl. Toxicol. 2007, 27:399-409; DuBuske, L., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2009, 123:S216)을 포함한다. TLR7 신호전달은 MyD88 의존성 경로 및 IRF7 의존성 신호전달을 활성화한다. IRF7 경로는 IFN-a 생산을 유도한다.
TLR7은 ss-RNA 또는 합성 화학물질(Imiquimod, R848)을 감지한다. TLR7 및 TLR8은 단핵구 및 대식세포의 엔도솜에서 발견되며, TLR7은 또한 형질세포양(plasmacytoid) 수지상 세포에서도 발현되고, TLR8은 비만 세포에서도 발현된다. 이 두 수용체는 모두 바이러스로부터 단일 가닥 RNA를 인식한다. R-848 및 이미퀴모드와 같은 합성 리간드를 사용하여 TLR7 및 TLR8 신호전달 경로를 활성화할 수 있다. 예를 들어 Caron, G., et al., J. Immunol. 2005, 175:1551-1557 참조. TLR9는 단핵구, 대식세포 및 형질세포양 수지상 세포의 엔도솜에서 발현되며, 박테리아 및 바이러스 DNA에서 발견되는 메틸화되지 않은 CpG 섬에 대한 수용체로 작용한다. 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 TLR9를 활성화한다. 예를 들어, 클래스 A 올리고뉴클레오타이드는 형질세포양 수지상 세포를 표적으로 하여 IFNα 생성 및 항원 제시 세포 성숙을 강력하게 유도하는 반면, 간접적으로는 자연 살해 세포를 활성화한다. 클래스 B 올리고뉴클레오타이드는 B 세포와 자연 살해 세포를 표적으로 하고 인터페론-α(IFNa)를 거의 유도하지 않는다. 클래스 C 올리고뉴클레오티드는 형질세포양 수지상 세포를 표적으로 하며 IFNa의 강력한 유도제이다. 이 종류의 올리고뉴클레오티드는 항원 제시 세포의 활성화 및 성숙에 관여하고 간접적으로 자연 살해 세포를 활성화하고 B 세포를 직접 자극한다. 예를 들어 Vollmer, J., et al., Eur. J. Immunol. 2004, 34:251-262; Strandskog, G., et al., Dev. Comp. Immunol. 2007, 31:39-51 참조.
보고된 TLR7에 대한 TLR 조절제(작용제)는 ANA772 (Kronenberg, B. & Zeuzem, S., Ann. Hepatol. 2009, 8:103-112), 이미퀴모드(Imiquimod) (Somani, N. & Rivers, J.K., Skin Therapy Lett. 2005, 10:1-6), 및 AZD8848 (Hennessey 2010, Id.)을 포함한다 TLR8에 대한 TLR 조절제(작용제)는 VTX-1463 (Hennessey 2010, Id.)을 포함한다 TLR7 및 TLR8에 대한 TLR 조절제(작용제)는 레시퀴모드(Resiquimod)(Mark, K.E., et al., J. Infect. Dis. 2007, 195:1324-1331; Pockros, P.J., et al., J. Hepatol. 2007, 47:174-182)를 포함한다. TLR7 및 TLR9에 대한 TLR 조절제(길항제)는 IRS-954 (Barrat, F.J., et al., Eur. J. Immunol. 2007, 37:3582-3586), 및 IMO-3100 (Jiang, W., et al., J. Immunol. 2009, 182:48.25)을 포함한다. TLR9 작용제는 SD-101 (Barry, M. & Cooper, C., Expert Opin. Biol. Ther. 2007, 7:1731-1737), IMO-2125 (Agrawal, S. & Kandimalla, E.R., Biochem. Soc. Trans. 2007, 35:1461-1467), Bio Thrax plus CpG-7909 (Gu, M., et al., Vaccine 2007, 25:526-534), AVE0675 (Parkinson, T., Curr. Opin. Mol. Ther. 2008, 10:21-31), QAX-935 (Panter, G., et al., Curr. Opin. Mol Ther. 2009, 11:133-145), SAR-21609 (Parkinson 2008, Id.), 및 DIMS0150 (Pastorelli, L., et al., Expert Opin. Emerg. Drugs 2009, 14:505-521)을 포함한다.
TLR7 리간드 및 이의 접합체(Conjugates)
TLR7 리간드 및 이의 접합체와 관련하여, 본원에 사용된 "알킬", "알케닐" 및 "알키닐"이라는 용어는 직쇄, 분지쇄 및 환형 1가 히드로카르빌 라디칼, 및 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이들이 비치환된 경우에는 오직 C 및 H만을 포함한다. 예시들은 메틸, 에틸, 이소부틸, 사이클로헥실, 사이클로펜틸에틸, 2 프로페닐, 및 3 부티닐 등을 포함한다. 이러한 각 그룹 내 탄소 원자의 총 수는 종종 본원에 개시되며, 예를 들어 상기 그룹은 10개까지의 탄소 원자를 포함할 수 있으며 1-10C 또는 C1-C10 또는 C1-10으로 나타낼 수 있다. 헤테로원자(일반적으로 N, O 및 S)가 헤테로알킬 기(group)에서와 같이 탄소 원자를 대체하도록 허용되는 경우, 예를 들어 상기 기(group)를 설명하는 숫자는, 여전히 예를 들어 C1-C6로 기재되더라도, 상기 기의 탄소 원자 수 + 설명되는 고리 또는 사슬의 백본에 있는 탄소 원자에 대한 대체물로 포함된 이러한 헤테로원자의 수를 더한 값의 합계를 나타낸다.
통상적으로, 본 발명의 알킬, 알케닐 및 알키닐 치환기는 1개의 10C(알킬) 또는 2개의 10C(알케닐 또는 알키닐)를 포함한다. 예를 들어, 그들은 하나의 8C(알킬) 또는 두 개의 8C(알케닐 또는 알키닐)를 포함한다. 종종 그들은 하나의 4C(알킬) 또는 두 개의 4C(알케닐 또는 알키닐)를 포함한다. 단일 기는 하나 이상의 유형의 다중 결합 또는 하나 이상의 다중 결합을 포함할 수 있다; 이러한 기는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함할 때 "알케닐"이라는 용어의 정의에 포함되고, 그들이 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함할 때 "알키닐"이라는 용어에 포함된다.
알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 종종 그러한 치환이 화학적으로 의미가 있는 정도로 선택적으로 치환된다. 통상적인 치환기들은 할로, =O, =N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR, 및 NO2을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C6-C10 아릴, 또는 C5-C10 헤테로아릴이며, 각각의 R는 선택적으로 할로, =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR', 및 NO2로 치환되며, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C1-C8 acyl, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴 또는 C5-C10 헤테로아릴이다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 또한 C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴 또는 C5-C10 헤테로아릴에 의해 치환될 수 있으며, 이들 각각은 특정 기에 적합한 치환기에 의해 치환될 수 있다.
"아세틸렌" 치환기는 선택적으로 치환된 2-10C 알키닐기를 포함할 수 있으며 화학식 -C≡C-Ri이며, 여기서 Ri는 H 또는 C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-C12 아릴알킬, 또는 C6-C12 헤테로아릴알킬이며, 각각의 Ri기는 할로, =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR', 및 NO2로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되며, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 헤테로알킬, C1-C6 아실, C2-C6 헤테로아실, C6-C10 aryl, C5-C10 헤테로아릴, C7-12 아릴알킬, 또는 C6-12 헤테로아릴알킬이며, 이들 각각은 할로, C1-C4 알킬, C1-C4 헤테로알킬, C1-C6 아실, C1-C6 헤테로아실, 하이드록시, 아미노, 및 =O로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되며; 여기서 2개의 R'는 연결되어 N, O 및 S로부터 선택되는 최대 3개의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 3-7개 원자 고리를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, -C≡C-Ri의 Ri는 H 또는 Me이다.
"헤테로알킬", "헤테로알케닐", 및 "헤테로알키닐" 등은 해당 하이드로카빌(알킬, 알케닐 및 알키닐) 기와 유사하게 정의되지만, '헤테로'라는 용어는 백본 잔기 내에 1~3개의 O, S 또는 N 헤테로원자 또는 이들의 조합을 포함하는 기를 의미하며; 이에 따라 상응하는 알킬, 알케닐, 또는 알키닐기의 적어도 하나의 탄소 원자는 헤테로알킬, 헤테로알케닐 또는 헤테로알키닐기를 형성하기 위해 지정된 헤테로원자의 하나로 치환된다. 알킬, 알케닐 및 알키닐기의 헤테로형태에 대한 전형적인 크기는 일반적으로 상응하는 히드로카르빌기에 대한 것과 동일하고, 헤테로형태에 존재할 수 있는 치환기는 하이드로카르빌기에 대해 상기 기재된 것과 동일하다. 화학적 안정성의 이유로, 달리 명시되지 않는 한, 이러한 기는 니트로 또는 설포닐기에서와 같이 N 또는 S에 옥소기가 존재하는 경우를 제외하고는 2개 이상의 연속 헤테로원자를 포함하지 않는 것으로 또한 이해된다.
본원에 사용된 "알킬"은 사이클로알킬 및 사이클로알킬알킬기를 포함하지만, "사이클로알킬"이라는 용어는 고리 탄소 원자를 통해 연결된 탄소환식 비방향족기를 기술하기 위해 본원에서 사용될 수 있고, "사이클로알킬알킬"은 알킬 링커를 통해 분자에 연결된 탄소환식 비방향족기를 기술하는데 사용될 수 있다. 유사하게, "헤테로시클릴"은 고리 구성원으로서 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 C 또는 N일 수 있는 고리 원자를 통해 분자에 연결된 비방향족 고리기를 기술하는 데 사용될 수 있고; 및 "헤테로시클릴알킬"은 링커를 통해 다른 분자에 연결된 이러한 기를 기술하는 데 사용될 수 있다. 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 헤테로시클릴 및 헤테로시클릴알킬기에 적합한 크기 및 치환기는 알킬기에 대해 상기 기재된 것과 동일하다. 본원에 사용된 바와 같이, 이러한 용어들은 고리가 방향족이 아닌 한 이중 결합 또는 2개를 함유하는 고리도 포함한다.
본원에 사용된 "아실"은 카르보닐 탄소 원자의 2개의 이용 가능한 원자가(valence) 위치 중 하나에 부착된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 아릴알킬 라디칼을 포함하는 기를 포함하고, 헤테로아실은 카르보닐 탄소 외에 적어도 하나의 탄소가 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자로 치환된 상응하는 기를 지칭한다. 따라서 헤테로아실은 예를 들어 -C(=O)OR 및 -C(=O)NR2 뿐만 아니라 -C(=O)-헤테로아릴을 포함한다.
아실 및 헤테로아실기는 카르보닐 탄소 원자의 열린 원자가를 통해 부착된 임의의 기 또는 분자에 결합된다. 통상적으로, 그들은 포르밀, 아세틸, 피발로일 및 벤조일을 포함하는 C1-C8 아실기 및 C2-C8 헤테로아실기를 포함하며, 이는 메톡시아세틸, 에톡시카르보닐 및 4-피리디노일을 포함한다. 히드로카르빌기, 아릴기, 및 아실 또는 헤테로아실기를 포함하는 이러한 기의 헤테로형태는 아실 또는 헤테로아실기의 상응하는 성분 각각에 대해 일반적으로 적합한 치환기로서 본원에 기재된 치환기로 치환될 수 있다.
"방향족" 모이어티(moiety) 또는 "아릴" 모이어티는 방향족성의 잘 알려진 특성을 갖는 모노사이클릭 또는 융합된 바이사이클릭 모이어티를 지칭하고; 예시들은 페닐 및 나프틸을 포함한다. 유사하게, "헤테로방향족" 및 "헤테로아릴"은 고리 구성원으로서 O, S 및 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 이러한 모노사이클릭 또는 융합된 바이사이클릭 고리 시스템을 지칭한다. 헤테로원자의 포함은 5원자 고리뿐만 아니라 6원자 고리에서 방향족성을 허용한다. 통상적인 헤테로방향족 시스템은 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴 및 이미다졸릴과 같은 모노사이클릭 C5-C6 방향족 그룹, 및 이들 모노사이클릭 그룹 중 하나를 페닐 고리 또는 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 피라졸로피리딜, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 신놀리닐 등과 같은 C8-C10 바이사이클릭기를 형성하는 헤테로방향족 모노사이클릭기 중 어느 것과 융합함으로써 형성된 융합된 바이사이클릭 모이어티를 포함한다. 고리 시스템 전체에 전자 분포의 관점에서 방향족성의 특성을 갖는 모든 모노사이클릭 또는 융합된 고리 바이사이클릭 시스템이 이 정의에 포함된다. 또한 분자의 나머지 부분에 직접 부착된 고리가 방향족성의 특성을 갖는 바이사이클릭기를 포함한다. 통상적으로, 고리 시스템은 5-12개의 고리 구성원 원자를 함유한다. 예를 들어, 모노사이클릭 헤테로아릴은 5-6개의 고리 멤버를 함유할 수 있고, 바이사이클릭 헤테로아릴은 8-10개의 고리 멤버를 함유할 수 있다.
아릴 및 헤테로아릴 모이어티는 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-C12 아릴, C1-C8 아실, 및 이들의 헤테로형태를 포함하는 다양한 치환기로 치환될 수 있으며, 이들 각각은 그 자체가 추가로 치환될 수 있으며; 아릴 및 헤테로아릴 모이어티에 대한 다른 치환기는 할로, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR, 및 NO2를 포함하고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-C12 아릴알킬, 또는 C6-C12 헤테로아릴알킬이며, 및 각각의 R은 알킬기에 대해 상기 기술된 바와 같이 선택적으로 치환된다. 아릴 또는 헤테로아릴기 상의 치환기는 물론 이러한 치환기의 각 유형 또는 치환기의 각 성분에 적합한 것으로서 본원에 기재된 기로 추가로 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 아릴알킬 치환기는 아릴 부분 상에서 아릴기에 대해 전형적인 것으로서 본원에 기재된 치환기로 치환될 수 있고, 이는 알킬기에 대해 전형적이거나 적합한 것으로서 본원에 기재된 치환기로 알킬 부분 상에서 추가로 치환될 수 있다.
유사하게, "아릴알킬" 및 "헤테로아릴알킬"은 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화, 환형 또는 비환형 링커를 포함하는 알킬렌과 같은 연결기를 통해 그들의 부착점에 결합된 방향족 및 헤테로방향족 고리 시스템을 지칭한다. 통상적으로 링커는 C1-C8 알킬 또는 이의 헤테로 형태이다. 이러한 링커는 또한 카르보닐기를 포함할 수 있으며, 이에 따라 이들이 아실 또는 헤테로아실 모이어티로서 치환기를 제공할 수 있다. 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬기에서 아릴 또는 헤테로아릴 고리는 아릴기에 대해 전술한 동일한 치환기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 아릴알킬기는 아릴기에 대해 위에서 정의된 기로 선택적으로 치환된 페닐 고리 및 비치환되거나 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬기 또는 헤테로알킬기로 치환된 C1-C4 알킬렌을 포함하며, 여기서 알킬 또는 헤테로알킬기는 선택적으로 고리화되어 사이클로프로판, 디옥솔란 또는 옥사사이클로펜탄과 같은 고리를 형성할 수 있다. 유사하게, 헤테로아릴알킬기는 아릴기에 전형적인 치환기로서 상기 기재된 기로 선택적으로 치환된 C5-C6 모노사이클릭 헤테로아릴기 및 비치환되거나 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬기 또는 헤테로알킬기로 치환된 C1-C4 알킬렌을 포함할 수 있으며, 또는 선택적으로 치환된 페닐 고리 또는 C5-C6 모노사이클릭 헤테로아릴 및 비치환되거나 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬 또는 헤테로알킬기로 치환된 C1-C4 헤테로알킬렌을 포함하고, 여기서 알킬 또는 헤테로알킬기는 선택적으로 고리화되어 사이클로프로판, 디옥솔란 또는 옥사사이클로펜탄과 같은 고리를 형성할 수 있다.
아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬기가 선택적으로 치환된 것으로 기술되는 경우, 치환기는 기의 알킬 또는 헤테로알킬 부분 또는 아릴 또는 헤테로아릴 부분 상에 있을 수 있다. 알킬 또는 헤테로알킬 부분에 선택적으로 존재하는 치환기는 일반적으로 알킬기에 대해 상기 기재된 것과 동일하고; 아릴 또는 헤테로아릴 부분에 선택적으로 존재하는 치환기는 일반적으로 아릴기에 대해 상기 기재된 것과 동일하다.
본원에 사용된 "아릴알킬" 기는 이들이 비치환된 경우 히드로카르빌기이고, 고리 및 알킬렌 또는 유사한 링커 내의 탄소 원자의 총 수로 기술된다. 따라서, 벤질기는 C7-아릴알킬기이고, 페닐에틸은 C8-아릴알킬이다.
상기 기재된 "헤테로아릴알킬"은 연결기를 통해 부착된 아릴기를 포함하는 모이어티를 지칭하며, 아릴 모이어티의 적어도 하나의 고리 원자 또는 연결기의 하나의 원자가 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자라는 점에서 "아릴알킬"과 상이하다. 헤테로아릴알킬기는 조합된 고리 및 링커의 총 원자 수에 따라 본원에서 설명되며, 이들은 헤테로알킬 링커를 통해 연결된 아릴기; 알킬렌과 같은 히드로카르빌 링커를 통해 연결된 헤테로아릴기; 및 헤테로알킬 링커를 통해 연결된 헤테로아릴기를 포함한다. 따라서, 예를 들어, C7-헤테로아릴알킬은 피리딜메틸, 페녹시 및 N-피롤릴메톡시를 포함할 것이다.
본원에 사용된 "알킬렌"은 2가 히드로카르빌기를 지칭하고; 2가이기 때문에 두 개의 다른 그룹을 함께 연결할 수 있다. 통상적으로 이것은 n이 1-8이고 예를 들어 n이 1-4인 -(CH2)ㅠ-을 지칭하며, 지정된 경우라도 알킬렌은 다른 기로도 치환될 수 있으며, 다른 길이를 가질 수 있으며, 개방 원자가는 사슬의 반대쪽 끝에 있을 필요는 없다. 따라서 -CH(Me)- 및 -C(Me)2-는 사이클로프로판-1,1-디일과 같은 고리형 기와 마찬가지로 알킬렌으로 지칭될 수 있다. 알킬렌 기가 치환되는 경우, 치환기는 본원에 기재된 바와 같은 알킬 기에 전형적으로 존재하는 것을 포함한다.
일반적으로, 치환기에 포함된 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 또는 아릴 또는 아릴알킬 기 또는 이들 기 중 하나의 헤테로 형태는 그 자체가 추가 치환기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. 이들 치환기의 성질은 치환기가 달리 기술되지 않는 경우 1차 치환기 자체와 관련하여 언급된 것과 유사하다. 따라서, 예를 들어, R2의 실시양태가 알킬인 경우, 이 알킬은 이것이 화학적으로 의미가 있고 이것이 알킬 자체에 대해 제공된 크기 제한을 훼손하지 않는 경우, R2에 대한 실시양태로서 나열된 나머지 치환기에 의해 선택적으로 치환될 수 있으며; 예를 들어, 알킬에 의해 또는 알케닐에 의해 치환된 알킬은 이러한 실시양태에 대한 탄소 원자의 상한을 단순히 연장할 것이고 포함되지 않는다. 그러나, 아릴, 아미노, 알콕시, =O 등으로 치환된 알킬은 본 발명의 범위에 포함되며, 이러한 치환기의 원자는 설명되는 알킬, 알케닐 등을 설명하는 데 사용된 수에 카운트되지 않는다. 치환기의 수가 지정되지 않은 경우, 이러한 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 또는 아릴기는 사용 가능한 원자가에 따라 다수의 치환기로 치환될 수 있으며; 특히, 이들 기 중 임의의 것은, 예를 들어 그의 임의의 또는 모든 원자가에서 불소 원자로 치환될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에서 염증과 관련된 것과 같은 간 질병을 예방, 억제 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 호변이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다:
여기서 X1은 -O-, -S-, 또는 -NRc-이며;
R1은 수소, (C1-C10)알킬, 치환된 (C1-C10)알킬, C6-10아릴, 또는 치환된 C6-10아릴, C5-9헤테로사이클릭, 치환된 C5-9헤테로사이클릭이며;
Rc는 수소, C1-10알킬, 또는 치환된 C1-10알킬이며; 또는 Rc 및 R1은 이들이 부착된 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리 또는 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
각각의 R2는 독립적으로 -OH, (C1-C6)알킬, 치환된 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, 치환된 (C1-C6)알콕시, -C(O)-(C1-C6)알킬 (알카노일), 치환된 -C(O)-(C1-C6)알킬, -C(O)-(C6-C10)아릴 (아로일), 치환된 -C(O)-(C6-C10)아릴, -C(O)OH (카르복실), -C(O)O(C1-C6)알킬 (알콕시카르보닐), 치환된 -C(O)O(C1-C6)알킬, -NRaRb, -C(O)NRaRb (카르바모일), 할로, 니트로, 또는 시아노이며, 또는 R2는 부재하고;
각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, 치환된 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 치환된 (C3-C8)사이클로알킬, (C1-C6)알콕시, 치환된 (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알카노일, 치환된 (C1-C6)알카노일, 아릴, 아릴(C1-C6)알킬, Het, Het (C1-C6)알킬, 또는 (C1-C6)알콕시카르보닐이며;
여기서 상기 임의의 알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릭 기의 치환기는 하이드록시, C1-6알킬, 하이드록시C1-6알킬렌, C1-6알콕시, C3-6-사이클로알킬, C1-6알콕시C1-6알킬렌, 아미노, 시아노, 할로, 또는 아릴이며;
n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이며;
X2는 결합 또는 연결기이며; 및
한 실시양태에서, Rx는 하나 또는 두 개의 카르복실산 에스테르를 포함하는 인지질이거나 또는 -(R3)r - (R4)s)p를 포함하며, 여기서 각각의 R3은 독립적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티이고; 여기서 각각의 R4는 독립적으로 H, -C1-C6 알킬, -C1-C6 알콕시, -NRaRb, -N3, -OH, -CN, -COOH, -COOR1, -C1-C6 알킬-NRaRb, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-COOH, C1-C6 알킬-COOR1, 5-6 멤버 고리, 치환된 5-6 멤버 고리, -C1-C6 알킬-5-6 멤버 고리, -C1-C6 알킬-치환된 5-6 멤버 고리 C2-C9 헤테로사이클릭, 또는 치환된 C2-C2 헤테로사이클릭이며; 여기서 r은 1 내지 1000이고, s는 1 내지 100이고, p는 1 내지 100임.
한 실시양태에서, R3은 PEG 모이어티이다.
일부 실시양태에서, PEG 반응물은 구조 CH3O(CH2CH2O)n - X - NHS*를 가지며, 여기서 X는 -COCH2CH2COO-, -COCH2CH2CH2 COO-, -CH2COO-, 및 -(CH2)5COO-일 수 있다. 특정한 실시양태에서, PEG 반응물은 하기 구조를 갖는다
특정 PEG 반응물은 일부 실시양태에서 이작용성이다(bifunctional). 이작용성 PEG 반응물의 예시는 구조 X - (OCH2CH2)n - X를 가지며, 여기서 X는 일부 실시양태에서 (N-숙신이미딜옥시카르보닐)메틸 (-CH2COO-NHS), 숙신이미딜글루타레이트 (-COCH2CH2CH2COO-NHS), (N-숙신이미딜옥시카르보닐)펜틸 (-(CH2)5COO-NHS), 3-(N-말레이미딜)프로판아미도, (-NHCOCH2CH2-MAL), 아미노프로필 (-CH2CH2CH2NH2) 또는 2-설파닐에틸 (-CH2CH2SH)이다.
특정 실시양태에서, 일부 PEG 반응물은 이종작용성(heterofunctional)이다. 이종작용성 PEG 반응물의 예시는 하기 구조를 갖는다
여기서 X는 일부 실시양태에서 (N-숙신이미딜옥시카르보닐)메틸 (-CH2COO-NHS), 숙신이미딜글루타레이트 (-COCH2CH2CH2COO-NHS), (N-숙신이미딜옥시카르보닐)펜틸 (-(CH2)5COO-NHS), 3-(N-말레이미딜)프로판아미도, (-NHCOCH2CH2-MAL), 3-아미노프로필 (-CH2CH2CH2NH2), 2-설파닐에틸 (-CH2CH2SH), 5-(N-숙신이미딜옥시카르보닐)펜틸 (-(CH2)5COO-NHS], 또는 p-니트로페닐옥시카르보닐, (-CO2-p-C6H4NO2)일 수 있다.
다음 구조를 갖는 것과 같은 특정 분지형 PEG 반응물도 사용할 수 있다:
여기서 X는 스페이서이고 Y는 일부 실시양태에서 말레이미드, 아민, 글루타릴-NHS, 카보네이트-NHS 또는 카보네이트-p-니트로페놀을 포함하나 이에 제한되지 않는 작용기이다.
분지쇄 PEG 반응물의 장점은 지속 방출 특성을 갖는 접합 생성물을 생성할 수 있다는 것이다.
PEG 반응물은 또한 특정 실시양태에서 아래와 같은 이종작용성 반응물일 수 있다
일부 실시양태에서, Boc*-보호된-아미노-PEG-카르복실-NHS 또는 말레이미드-PEG-카르복실-NHS 반응물이 이용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 빗형(comb-shaped) 중합체는 다수의 PEG 단위를 접합체에 혼입하기 위한 PEG 반응물로 사용될 수 있다. 빗형 중합체의 예시를 이하에 나타낸다.
PEG 반응물 및/또는 PEG 접합체 생성물은 일부 실시양태에서 약 5g/몰 내지 약 100,000g/몰 범위의 분자량을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG 반응물 및/또는 PEG 접합체 생성물은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000 또는 90000 몰 당 그램(grams per mole)의 평균(average), 중간(mean) 또는 명목(nominal) 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원의 화합물에서 PEG 모이어티는 균질하고 PEG 모이어티의 분자량은 화합물의 특정 배치의 각 분자에 대해 동일하다(예를 들어, R3은 1개의 PEG 단위이고 r은 2 내지 10임).
다양한 실시양태에서, 화학식 (I)의 X2는 결합 또는 사슬에 1 내지 약 10개의 원자를 갖는 사슬일 수 있고 여기서 사슬의 원자는 탄소, 질소, 황 및 산소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 임의의 탄소 원자는 옥소(oxo)로 치환될 수 있고, 여기서 임의의 황 원자는 1개 또는 2개의 옥소 기로 치환될 수 있다. 상기 사슬은 하나 이상의 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 고리에 산재될 수 있다.
화학식 (I)의 X2의 특정한 비제한적 예시들은 -(Y)y-, -(Y)y-C(O)N-(Z)z-, -(CH2)y-C(O)N-(CH2)z-, -(Y)y-NC(O)-(Z)z-, -(CH2)y-NC(O)-(CH2)z-을 포함하며, 여기서 각각의 y(아래첨자) 및 z(아래첨자)는 독립적으로 0 내지 20이고 각각의 Y 및 Z는 독립적으로 C1-C10 알킬, 치환된 C1-C10 알킬, C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알콕시, C3-C9 사이클로알킬, 치환된 C3-C9 사이클로알킬, C5-C10 아릴, 치환된 C5-C10 아릴, C5-C9 헤테로사이클릭, 치환된 C5-C9 헤테로사이클릭, C1-C6 알카노일, Het, Het C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시카르보닐이며, 여기서 알킬, 사이클로알킬, 알카노일, 알콕시카보닐, Het, 아릴 또는 헤테로사이클릭 기 상의 치환기는 하이드록실, C1-C10 알킬, 하이드록실 C1-C10 알킬렌, C1-C6 알콕시, C3-C9 사이클로알킬, C5-C9 헤테로사이클릭, C1-6 알콕시 C1-6 알케닐, 아미노, 시아노, 할로겐 또는 아릴이다. 특정 실시양태에서, 링커는 종종 -C(Y')(Z')-C(Y")(Z")- 링커이며, 여기서 각각의 Y', Y", Z' 및 Z"는 독립적으로 수소 C1-C10 알킬, 치환된 C1-C10 알킬, C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알콕시, C3-C9 사이클로알킬, 치환된 C3-C9 사이클로알킬, C5-C10 아릴, 치환된 C5-C10 아릴, C5-C9 헤테로사이클릭, 치환된 C5-C9 헤테로사이클릭, C1-C6 알카노일, Het, Het C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시카르보닐이며, 여기서, 알킬, 사이클로알킬, 알카노일, 알콕시카르보닐, Het, 아릴 또는 헤테로사이클릭 기 상의 치환기는 하이드록실, C1-C10 알킬, 하이드록실 C1-C10 알킬렌, C1-C6 알콕시, C3-C9 사이클로알킬, C5-C9 헤테로사이클릭, C1-6 알콕시 C1-6 알케닐, 아미노, 시아노, 할로겐 또는 아릴이다.
화학식 (I) 내 X2에 대한 다른 특정한 값은 아래와 같다
X2에 대한 다른 특정한 값은 아래와 같다
다양한 실시양태에서, X2는 C(O), 또는 하기 중 어느 것일 수 있다
다양한 실시양태에서, 화학식 (I) 내 X1은 산소일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 화학식 (I) 내 X1은 황일 수 있으며, 또는 -NRc-일 수 있으며 여기서 Rc는 수소, C1-6 알킬 또는 치환된 C1-6 알킬이며, 여기서 알킬 치환기는 하이드록시, C3-6사이클로알킬, C1-6알콕시, 아미노, 시아노, 또는 아릴이다.
다양한 실시양태에서, 화학식 (I)의 R1 및 Rc는 함께 헤테로사이클릭 고리 또는 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있다. 보다 구체적으로, R1 및 Rc는 함께 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리디노 또는 피페라지노 고리를 형성할 수 있다.
다양한 실시양태에서 화학식 (I) 내 R1은 C1-6 알콕시로 치환된 C1-C10 알킬일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 화학식 (I) 내 R1은 수소, C1-4알킬, 또는 치환된 C1-4알킬일 수 있다. 보다 구체적으로, R1은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 히드록시C1-4알킬렌, 또는 C1-4알콕시C1-4알킬렌일 수 있다. 더욱 더 구체적으로, R1은 수소, 메틸, 에틸, 메톡시에틸 또는 에톡시에틸일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 화학식 (I)의 R2는 부재할 수 있거나, 또는 R2는 할로겐 또는 C1-4 알킬일 수 있다. 보다 구체적으로, R2는 클로로, 브로모, 메틸 또는 에틸일 수 있다.
한 실시양태에서, 화학식 (I)의 Rx는 ((R3)r - (R4)s)p 또는 R3이다. 한 실시양태에서, R3은 PEG 모이어티 또는 PEG 모이어티의 유도체이다. 특정 실시양태에서 R3는 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이다. 한 실시양태에서 PEG 모이어티는 하나 이상의 PEG 단위를 포함할 수 있다. PEG 모이어티는 일부 실시양태에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900 단위를 포함하는 약 1 내지 약 1,000 PEG 단위를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 1 내지 5개 내지 약 25개 PEG 단위, 약 1 내지 5개 내지 약 10개 PEG 단위, 약 10개 내지 약 50개 PEG 단위, 약 18개 내지 약 50개 PEG 단위, 47 내지 약 150개 PEG 단위, 약 114개 내지 약 350개 PEG 단위, 약 271개 내지 약 550개 PEG 단위, 약 472개 내지 약 950개 PEG 단위, 약 50개 내지 약 150개 PEG 단위, 약 120개 내지 약 350개 PEG 단위, 약 250개 내지 약 550개 PEG 단위 또는 약 650개 내지 약 950개 PEG 단위를 포함할 수 있다. PEG 단위는 특정 실시양태에서 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이다. 일부 실시양태에서 R4는 H, -C1-C6 알킬, -C1-C6 알콕시, -NRaRb, -N3, -OH, -CN, -COOH, -COOR1, -C1-C6 알킬-NRaRb, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-COOH, C1-C6 알킬-COOR1, 5-6 멤버 고리, 치환된 5-6 멤버 고리, -C1-C6 알킬- 5-6 멤버 고리, -C1-C6 알킬- 치환된 5-6 멤버 고리 C2-C9 헤테로사이클릭, 또는 치환된 C2-C9 헤테로사이클릭이다.
일부 실시양태에서, r은 약 5 내지 약 100이고, 종종 r은 약 5 내지 약 50 또는 약 5 내지 약 25이다. 특정 실시양태에서, r은 약 5 내지 약 15이고 종종 r은 약 10이다. 일부 실시양태에서, R3은 PEG 단위(PEG)r이고 r은 약 2 내지 약 10(예를 들어, r은 약 2 내지 약 4) 또는 약 18 내지 약 500이다.
일부 실시양태에서, s는 약 5 내지 약 100이고, 종종 s는 약 5 내지 약 50 또는 약 5 내지 약 25이다. 특정 실시양태에서, s는 약 5 내지 약 15이고 종종 s는 약 10이다. 일부 실시양태에서, s는 약 5 이하이다(예를 들어, s는 1이다). 일부 실시양태에서, (R3)r 치환기는 선형이고, 특정 실시양태에서 (R3)r 치환기는 분지형이다. 선형 모이어티의 경우, s는 때때로 r보다 작고(예를 들어 R3이 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-인 경우) s가 1인 경우도 있다. 일부 실시양태에서 R3은 선형 PEG 모이어티(예를 들어, 약 1 내지 약 1000 PEG 단위를 가짐)이고, s는 1이고 r은 1이다. 분지된 모이어티의 경우, s는 때때로 r보다 작거나, 크거나 또는 같고(예를 들어, R3이 -O-CH2-CH2- or -CH2-CH2-O-인 경우), 때때로 r이 1일 때, s는 1이고 p는 약 1 내지 약 1000이다(예를 들어 p는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000임).
일부 실시양태에서 R3은 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이며 r는 약 1 내지 약 1000이다(예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000).
특정 실시양태에서, X2는 아미도 연결기(예를 들어 -C(O)NH- 또는 -NH(O)C-); 알킬 아미도 연결기 (예를 들어 -C1-C6 알킬-C(O)NH-, -C1-C6 알킬-NH(O)C-, -C(O)NH-C1-C6 알킬-, -NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬--NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬-C(O)NH-C1-C6 알킬-, 또는 -C(O)NH-(CH2)t-, 여기서 t는 1, 2, 3, 또는 4); 치환된 5-6 멤버 고리 (예를 들어, 아릴 고리, 헤테로아릴 고리 (예를 들어 테트라졸, 피리딜, 2,5-피롤리딘디온 (예를 들어 치환된 페닐 모이어티로 치환된 2,5-피롤리딘디온)), 카르복실릭 고리, 또는 헤테로사이클릭 고리) 또는 산소 포함 모이어티 (예를 들어 -O-, -C1-C6 알콕시)이다.
본원에 사용된 "인지질"이라는 용어는 하기 일반 화학식의 포스페이트기에 에스테르로 결합된 알카놀아민기와 함께 글리세롤 히드록실기에 결합된 포스페이트기를 보유하는 글리세롤 모노- 또는 디에스테르를 지칭한다
여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 수소 또는 아실기이고, R13은 pH에 따라 음전하 또는 수소이다. R13이 음전하일 때, 나트륨 이온과 같은 적절한 카운터 이온이 존재할 수 있다. 예를 들어 알칸올아민 모이어티는 m=1이 되도록 하는 에탄올아민 모이어티일 수 있다. 또한 NH기는 pH에 따라 양성자화되고 양전하를 띠거나, 양성자화되지 않고 중성일 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 인지질은 음으로 하전된 포스페이트 옥시 음이온 및 양으로 하전된 양성자화 질소 원자를 갖는 쯔비터이온으로 존재할 수 있다. OR12를 포함하는 탄소 원자는 키랄 탄소 원자이므로 분자는 R 이성질체, S 이성질체 또는 이들의 임의의 혼합물로 존재할 수 있다. 화학식 (II)의 화합물의 샘플에 동일한 양의 R 및 S 이성질체가 있는 경우, 샘플은 "라세미체"로 지칭된다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 제품 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민에서 R3 기는 하기 키랄 구조이다.
, 이는 R 절대 배열이다.
인지질은 자유 분자이거나, 예를 들어 하기와 같이 다른 그룹에 공유 결합될 수 있다.
여기서 물결선은 결합 지점을 가리킨다.
이에 따라, 본원에서 화학식 (I)의 화합물의 Rx와 같은 치환기가 인지질이라고 언급되는 경우, 인지질 기가 구조에 의해 특정된 바와 같이 본원에 개시된 N-벤질 헤테로사이클릭 고리 시스템과 같은 다른 기에 결합된다는 것을 의미한다. 인지질 기의 부착 지점은 구조적 묘사와 같이 달리 명시되지 않는 한 화학적으로 가능한 임의의 위치에 있을 수 있다. 예를 들어, 위에 표시된 인지질 구조에서 다른 화학 모이어티에 대한 부착 지점은 예를 들어 다른 화학 모이어티의 카르보닐 기에 결합함으로써 아미드 기로서 에탄올아민 질소 원자를 통해 있을 수 있으며, 예를 들어
여기서 R은 인지질이 결합된 다른 화학적 모이어티를 나타낸다. 이 결합된 아미드 유도체에서 R13기는 양성자일 수 있거나 나트륨 이온과 같은 카운터이온과 관련된 음전하일 수 있다. 알칸올아민기의 아실화된 질소 원자는 더 이상 염기성 아민이 아니라 중성 아미드이므로 생리학적 pH에서 양성자화되지 않는다.
본원에 사용된 "아실" 기라는 용어는 구조가 예를 들어 인지질의 글리세롤 히드록실기에 결합되어 "카르복실산 에스테르" 기를 형성하는 카르보닐 기를 보유하는 유기 구조를 지칭한다. 아실기의 예시에는 글리세롤 히드록실기와 함께 지방(예를 들어, 올레오일) 에스테르를 형성하는 올레오일기와 같은 지방산기가 포함된다. 따라서, R11 또는 R12가 둘 다 아닌 아실기인 경우, 상기 나타낸 인지질은 모노-카르복실산 에스테르이고, R11 및 R12가 모두 아실기인 경우, 상기 나타낸 인지질은 디-카르복실산 에스테르이다.
한 실시양태에서, Rx의 인지질은 2개의 카르복실산 에스테르를 포함하고 각각의 카르복실산 에스테르는 불포화, 에폭시화, 히드록실화, 또는 이들의 조합의 1, 2, 3 또는 4개의 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, Rx의 인지질은 2개의 카르복실산 에스테르를 포함하고 이의 카르복실산 에스테르는 동일하거나 상이하다.
한 실시양태에서, 인지질의 각각의 카르복실산 에스테르는 C8-C9에 불포화 부위를 갖는 C17 카르복실산 에스테르이다.
한 실시양태에서, 인지질의 각각의 카르복실산 에스테르는 C9-C10에서 불포화 부위를 갖는 C18 카르복실산 에스테르이다.
한 실시양태에서, X2는 결합 또는 사슬에 1 내지 약 10개의 원자를 갖는 사슬이고, 여기서 사슬의 원자는 탄소, 질소, 황 및 산소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 임의의 탄소 원자는 옥소이고, 여기서 임의의 황 원자는 1개 또는 2개의 옥소 기로 치환될 수 있다.
한 실시양태에서, X2는 C(O),
이다.
한 실시양태에서, Rx는 디올레일포스파티닐 에탄올아민(DOPE)를 포함한다.
한 실시양태에서, Rx는 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포 에탄올아민이며 X2는 C(O)이다.
한 실시양태에서, X1은 산소이거나 또는 -NH-이다.
한 실시양태에서, R1 및 Rc는 함께 헤테로사이클릭 고리 또는 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성하며, 예를 들어 치환된 또는 비치환된 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리디노, 또는 피페라지노 고리를 형성한다.
한 실시양태에서, R1은 C1-6 알콕시로 치환된 C1-C10 알킬이며, R1은 수소, C1-4알킬, 또는 치환된 C1-4알킬이며, R1은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 하이드록시C1-4알킬렌, 또는 C1-4알콕시C1-4알킬렌이며, 또는 R1는 수소, 메틸, 에틸, 메톡시에틸, 또는 에톡시에틸이다.
한 실시양태에서, 상기 조성물은 일정량의 항원을 추가로 포함한다.
다양한 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 상기 조성물은 비강내 투여될 수 있거나, 피부 투여될 수 있거나, 전신 투여될 수 있다.
TLR4 리간드
TLR4 리간드와 관련하여 본원에 사용된 "알킬"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, 완전히 포화되거나 단일 또는 다중불포화될 수 있고 지정된 탄소 원자 수를 갖는(즉, C1-C10은 1개 내지 10개 탄소를 의미함) 2가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있는 직쇄(즉, 비분지형) 또는 분지쇄, 또는 이들의 조합을 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예ㅅ시는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, (사이클로헥실)메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 상동체 및 이성질체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬 기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급(higher) 상동체 및 이성질체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 알콕시는 산소 링커(-O-)를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된 알킬이다.
그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서의 "알킬렌"이라는 용어는 달리 언급되지 않는 한 -CH2CH2CH2CH2-로 예시되지만 이에 제한되지 않는 알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 통상적으로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이다. 한 실시양태에서 이러한 기는 10개 이하의 탄소 원자를 갖는다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 단쇄 알킬 또는 알킬렌 기이다.
"헤테로알킬"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여, 달리 언급되지 않는 한, 1개 이상의 탄소 원자 및 O, N, P, Si, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 이루어진 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 이들의 조합이며, 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화(quaternized)될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, P, S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치 또는 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 예시에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
-CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O-CH3, -O-CH2-CH3, 및 -CN. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3와 같이 2개 이하의 헤테로원자가 연속적일 수 있다.
"헤테로알킬렌"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-로 예시되지만 이에 제한되지 않는 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 헤테로원자는 또한 사슬 말단 중 하나 또는 둘 모두를 차지할 수 있다 (예를 들어, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기의 경우, 연결기의 화학식이 쓰여진 방향에 의해 연결기의 배향이 암시되지 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2-를 모두 나타낸다. 상기 기재된 바와 같이, 본원에 사용된 헤테로알킬기는 -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R", -OR', -SR', 및/또는 -SO2R'과 같은 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된 기들을 포함한다. "헤테로알킬"이 언급된 후 -NR'R" 등과 같은 특정 헤테로알킬 그룹이 언급되는 경우, 헤테로알킬 및 -NR'R" 용어는 중복되거나 상호 배타적이지 않은 것으로 이해될 것이다. 오히려, 명확성을 추가하기 위해 특정 헤테로알킬 기가 인용된다. 따라서, "헤테로알킬"이라는 용어는 본원에서 -NR'R" 등과 같은 특정 헤테로알킬 기를 배제하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
"사이클로알킬" 및 "헤테로사이클로알킬"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여, 달리 언급되지 않는 한, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 환형 버전을 의미한다. 추가적으로, 헤테로사이클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치를 차지할 수 있다. 사이클로알킬의 예시는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 헤테로사이클로알킬의 예시는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. "사이클로알킬렌" 및 "헤테로사이클로알킬렌"은 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서 각각 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.
"할로" 또는 "할로겐"이라는 용어는 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 추가로, "할로알킬"과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "할로(C1-C4)알킬"이라는 용어는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"아실"이라는 용어는 달리 언급되지 않는 한 -C(O)R을 의미하며, 여기서 R은 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이다.
"아릴"이라는 용어는 달리 언급되지 않는 한 서로 융합되는(즉 융합된 고리 아릴) 또는 공유 결합된 단일 고리 또는 다중 고리(예를 들어 1 내지 3개의 고리)일 수 있는 다중불포화 방향족 탄화수소 치환기를 의미한다. 융합된 고리 아릴은 융합된 고리 중 적어도 하나가 아릴 고리인 서로 융합된 15개의 다중 고리를 지칭한다. "헤테로아릴"이라는 용어는 N, O 및 S로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 아릴 기(또는 고리)를 지칭하며, 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고 질소 원자(들)는 선택적으로 4차화된다. 따라서, "헤테로아릴"이라는 용어는 융합된 고리 헤테로아릴 기를 포함한다(즉, 융합된 고리 중 적어도 하나가 헤테로방향족 고리인 함께 융합된 다중 고리). 5,6-융합 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하며, 여기서 하나의 고리는 5개 멤버를 갖고 다른 고리는 6개 멤버를 가지며, 여기서 적어도 하나의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 마찬가지로, 6,6-융합 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하며, 여기서 하나의 고리는 6개 멤버를 갖고 다른 고리는 6개 멤버를 가지며, 여기서 적어도 하나의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 그리고 6,5-융합 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하며, 여기서 하나의 고리는 6개 멤버를 갖고 다른 고리는 5개 멤버를 가지며, 여기서 적어도 하나의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 헤테로아릴기는 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적인 예시는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5- 이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템 각각에 대한 치환기는 하기에 기재된 허용가능한 치환기의 군으로부터 선택된다. "아릴렌" 및 "헤테로아릴렌"은 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서 각각 아릴 및 헤테로아릴로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.
간결함을 위해, 다른 용어(예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)와 조합하여 사용될 때 "아릴"이라는 용어는 상기 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘 다를 포함한다. 따라서, "아릴알킬"이라는 용어는 탄소 원자가 예를 들어 산소 원자로 대체된(예를 들어, 메틸렌기) 이들 알킬기를 포함하는 알킬기(예를 들어 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등)에 부착된 아릴기에 이들 라디칼을 포함하는 것을 의미한다(예를 들어, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등).
본원에 사용된 "옥소"라는 용어는 탄소 원자에 이중 결합된 산소를 의미한다.
본원에 사용된 "알킬술포닐"이라는 용어는 화학식 -S(O2)-R'를 갖는 모이어티를 의미하며, 여기서 R'는 상기 정의된 바와 같은 알킬기이다. R'는 지정된 수의 탄소를 가질 수 있다(예를 들어 "C1-C4 알킬설포닐").
각각의 상기 용어(예를 들어, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴")는 표시된 라디칼의 치환 및 비치환 형태 둘 다를 포함한다.
알킬 및 헤테로알키리 라디칼에 대한 치환기(종종 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로 지칭되는 기들을 포함)는 0에서 (2m'+1) 범위의 수로 -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogen, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C( O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR -C(NR'R"R"')=NR"", -NR -C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택된 다양한 기들의 하나 이상일 수 있으며, 여기서 m'은 이러한 라디칼 내 탄소 원자의 총 수이다. 한 실시양태에서 R', R", R"', 및 R""은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴(예를 들어, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴), 치환 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 2개 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R 기는 이들 기 중 2개 이상이 존재할 때, 독립적으로 각각 R', R", R"', 및 R""로 선택된다. R' 및 R"이 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이들은 질소 원자와 결합하여 4-, 5-, 6- 또는 7-멤버 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치환기에 대한 상기 논의로부터, 당업자는 "알킬"이라는 용어가 할로알킬(예를 들어 -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예를 들어 -C(O)CH3, -C(O)CF3, 및 -C(O)CH2OCH3 등)과 같이 수소기가 아닌 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 그룹을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기술된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하고, 예를 들어 방향족 고리 시스템 상의 열린 원자가의 0 내지 총 수의 범위의 수로, -OR', -NR'R", -SR', -halogen, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)z, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되며; 여기서 R', R", R"', 및 R""은 한 실시양태에서 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 화합물이 2개 이상의 R기를 포함하는 경우, 예를 들어 각각의 R기는, 이들 기가 2개 이상 존재하는 경우, 각각 R', R", R"', 및 R"" 기로 독립적으로 선택된다.
2개 이상의 치환기는 선택적으로 연결되어 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클로알킬 기를 형성할 수 있다. 이러한 소위 고리-형성 치환기는 반드시는 아니지만 통상적으로 사이클릭 염기 구조에 부착된 것으로 발견된다. 한 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기본 구조의 인접한 구성원에 부착된다. 예를 들어, 고리형 기본(base) 구조의 인접한 멤버에 부착된 2개의 고리 형성 치환기는 융합 고리 구조를 생성한다. 또 다른 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기본 구조의 단일 멤버에 부착된다. 예를 들어, 고리형 기본 구조의 단일 멤버에 부착된 2개의 고리 형성 치환기는 스피로사이클릭 구조를 생성한다. 또 다른 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기본 구조의 인접하지 않은 구성원에 부착된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기 중 2개는 선택적으로 화학식 -T-C(O)-(CRR')q-U-의 고리를 형성할 수 있으며, 여기서 T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR '- 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 3의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기 중 2개는 선택적으로 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 대체될 수 있으며, 여기서 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 4의 정수이다. 이렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 선택적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기 중 2개는 선택적으로 화학식 -(CRR')s-X'-(C"R"')d-의 치환기로 대체될 수 있으며, 여기서 샌드 데어(sand dare)는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X'는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환기 R, R', R", 및 R"'는 한 실시양태에서 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다.
본원에 사용된 "헤테로원자" 또는 "고리 헤테로원자"라는 용어는 산소(O), 질소(N), 황(S), 인(P) 및 규소(Si)를 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "치환기"는 하기 모이어티로부터 선택된 기를 의미한다:
(A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -CCl3, -NO2, 옥소, 할로겐, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 아릴, 비치환 헤테로아릴, 및
(B) (i) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -CCl3, -NO2, 할로겐, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 아릴, 비치환된 헤테로아릴로부터 선택된 적어도 하나의 치환기로 치환된 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴, 및 (ii) (a) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -CCl3, -NO2, 할로겐, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 아릴, 비치환 헤테로아릴로부터 선택된 적어도 하나의 치환기로 치환된 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴, 및 (b) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -CCl3, -NO2, 할로겐, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 아릴 및 비치환 헤테로아릴로부터 선택된 적어도 하나의 치환기로 치환된 알킬, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴.
본원에 사용된 "크기-제한된 치환기" 또는 "크기-제한된 치환기 그룹"은 "치환기"에 대해 상기 기재된 모든 치환기로부터 선택된 기를 의미하고, 여기서 각각의 치환 또는 비치환된 알킬은 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환 또는 비치환된 2 내지 20 멤버 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 사이클로알킬은 치환 또는 비치환된 C4-C8 사이클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬은 치환 또는 비치환된 4 내지 8 멤버 헤테로사이클로알킬이다.
본원에 사용된 "저급 치환기" 또는 "저급 치환기 그룹"은 "치환기 그룹"에 대해 상기 기재된 모든 치환기로부터 선택된 기를 의미하고, 여기서 각각의 치환 또는 비치환된 알킬은 예를 들어 치환 또는 비치환 C1-C8 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬은 치환 또는 비치환 2 내지 8개 멤버 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 사이클로알킬은 치환 또는 비치환 C5-C7 사이클로알킬이며, 및 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬은 치환 또는 비치환된 5 내지 7개 멤버 헤테로사이클로알킬1이다.
일부 실시양태에서, 본원의 화합물에 기재된 각각의 치환된 기는 적어도 하나의 치환기로 치환된다. 보다 구체적으로, 일부 실시양태에서, 본원의 화합물에 기재된 각각의 치환된 알킬, 치환된 헤테로알킬, 치환된 사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 치환된 사이클로알킬렌, 치환된 헤테로사이클로알킬렌, 치환된 아릴렌, 및/또는 치환된 헤테로아릴렌은 적어도 하나의 치환기로 치환된다. 다른 실시양태에서, 이들 기 중 적어도 하나 또는 모두는 적어도 하나의 크기-제한된 치환기로 치환된다. 다른 실시양태에서, 이들 기 중 적어도 하나 또는 모두는 하나 이상의 저급 치환기로 치환된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물은 다수의 경우의 치환체, 예를 들어 R5, R5A, R5B, R5C, R6A, R6B, R6C, R7, R7A, R7B, R7C , R8, R8A, R8B, 및/또는 R8C을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 각각의 치환기는 선택적으로 각각의 경우에 상이할 수 있고 보다 명확성을 위해 각 기를 구별하기 위해 적절하게 표지될 수 있다. 예를 들어 각각의 R5A가 다른 경우, 그들은 예를 들어 R5A.1, R5A.2, R5A.3, R5A.4, R5A.5로 지칭될 수 있다. 유사하게, 임의의 R5A, R5B, R5C, R6A, R6B, R6C, R7, R7A, R7B, R7C , R8, R8A, R8B, 및/또는 R8C가 다중 발생하는 경우, R5A, R5B, R5C, R6A, R6B, R6C, R7, R7A, R7B, R7C , R8, R8A, R8B, 및/또는 R8C의 각각의 발생의 정의는 각각 R5A, R5B, R5C, R6A, R6B, R6C, R7, R7A, R7B, R7C , R8, R8A, R8B, 및/또는 R8C의 정의를 추정한다.
한 측면에서, 하기 화학식 (II)를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다:
화학식 (II)에서, z1은 0 내지 4의 정수이고, z2는 0 내지 5의 정수이고, R5는 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R6는 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R7은 수소, 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고, 및 R8은 독립적으로 할로겐, -CN, -SH, -OH, -COOH, -NH2, -CONH2, 니트로, -CF3, -CCl3, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
한 실시양태에서, R5는 R5A-치환 또는 비치환 사이클로알킬, R5A 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, R5A 치환 또는 비치환 아릴, 또는 R5A 치환 또는 비치환 헤테로아릴이다. R5A는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, R5B-치환된 또는 비치환된 알킬, R5B-치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, R5B-치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, R5B-치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, R5B-치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 R5B-치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다. R5B는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, R5C-치환된 또는 비치환된 알킬, R5C- 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, R5C- 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, R5C- 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, R5C- 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 R5C- 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다. R5C는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 사이클로알킬, 비치환된 헤테로사이클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
이 실시양태에 추가로, R6은 R6A-치환 또는 비치환 알킬, R6A 치환 또는 비치환 헤테로알킬, R6A 치환 또는 비치환 사이클로알킬, R6A 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, R6A 치환 또는 비치환 아릴, 또는 R6A 치환 또는 비치환 헤테로아릴이다. R6는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, R6B-치환된 또는 비치환된 알킬, R6B- 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, R6B- 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, R6B- 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, R6B- 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 10 R6B- 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다. R6B는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, R6C-치환된 또는 비치환된 알킬, R6C- 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, R6C- 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, R6C- 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, R6C- 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 R6C- 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다. R6C는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 사이클로알킬, 비치환된 헤테로사이클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
이 실시양태에 추가로, R7은 수소이거나, 또는 R7A-치환된 또는 비치환된 알킬이다. R7A은 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 사이클로알킬, 비치환된 헤테로사이클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
이 실시양태에 추가로, R8은 독립적으로 할로겐, -CN, -SH, -OH, -COOH, -NH2, -CONH2, 니트로, -CF3, -CCl3, R8A-치환 또는 비치환 알킬, R8A-치환 또는 비치환 헤테로알킬, R8A 치환 또는 비치환 사이클로알킬, R8A 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, R8A 치환 또는 비치환 아릴, 또는 R8A 치환 또는 비치환 헤테로아릴이다. R8A는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2이며, R8B-치환 또는 비치환 알킬, R8B-치환 또는 비치환 헤테로알킬, R8B-치환 또는 비치환된 사이클로알킬, R8B-치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, R8B-치환 또는 비치환된 아릴, 또는 R8B-치환 또는 비치환된 헤테로아릴이다. R8B는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, R8C-치환 또는 비치환 알킬, 84C-치환 또는 비치환 헤테로알킬, R8C-치환 또는 비치환 사이클로알킬, R8C-치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, R8C-치환 또는 비치환 아릴, 또는 R8C-치환 또는 비치환 헤테로아릴이다. R8C는 독립적으로 할로겐, -CN, -CF3, -CCl3, -OH, -NH2, -SO2, -COOH, 옥소, 니트로, -SH, -CONH2, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
다른 측면에서, 상기 개시된 화학식 (II)의 화합물이 제공되나, (i) 화학식 (II)의 화합물은 하기 화합물이 아니며
여기서 R5는 p-플루오로페닐 또는 p-메틸페닐이며; (ii) 상기 화합물은 하기 화합물이 아니며
여기서 R6은 비치환 아릴, 비치환 사이클로헥실, 비치환 티아졸, 또는 -CH2-푸라닐이며; 또는 (iii) R-7은 수소가 아니다.
상기 개시된 임의의 측면에 추가로, 한 실시양태에서, R5는 치환된 페닐이 아니다. 한 실시양태에서, R5는 p-플루오로페닐 또는 p-메틸페닐이 아니다.
한 실시양태에서, 상기 화합물은 R6이 치환된 페닐인 화학식 (IIa)의 구조를 갖지 않는다. 한 실시양태에서, 화합물은 R6이 p-플루오로페닐 또는 p-메틸페닐인 화학식 (IIa)의 구조를 갖지 않는다.
상기 개시된 임의의 측면에 추가로, 한 실시양태에서, R6은 치환 또는 비치환된 아릴, 비치환된 사이클로헥실, 비치환된 티아졸, 또는 -CH2-푸라닐이 아니다. 한 실시양태에서, 상기 화합물은 화학식 (IIb)의 구조를 갖지 않으며 여기서 R6은 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 사이클로헥실, 치환 또는 비치환된 티아졸, 또는 치환 또는 비치환된 푸라닐로 치환된 알킬이다. 한 실시양태에서, R6은 비치환된 아릴, 비치환된 사이클로헥실, 비치환된 티아졸, 또는 -CH2-푸라닐이 아니다.
상기 개시된 임의의 측면에 추가로, 한 실시양태에서 R5는 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환 또는 비치환된 아릴이다. 한 실시양태에서, R5는 비치환된 사이클로알킬 또는 비치환된 아릴이다.
한 실시양태에서, R5는 치환 또는 비치환된 C6-C8 사이클로알킬 또는 치환 또는 비치환된 페닐이다. 한 실시양태에서, R5는 치환 또는 비치환된 C6, 사이클로알킬 또는 치환 또는 비치환된 페닐이다.
한 실시양태에서, R5는 R5A-치환 또는 비치환된 C6 사이클로알킬 또는 R5A-치환 또는 비치환된 페닐이고, 여기서 R5A는 할로겐이다. 한 실시양태에서, R5는 R5A-치환 또는 비치환된 페닐이고, 여기서 R5A는 할로겐이다. 한 실시양태에서, R5는 R5A-치환 또는 비치환된 페닐이고, 여기서 R5A는 플루오로이다. 한 실시양태에서, R5는 비치환된 페닐이다.
상기 개시된 임의의 측면에 추가로, 한 실시양태에서 화합물은 R6이 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 사이클로헥실, 치환 또는 비치환된 티아졸, 또는 치환 또는 비치환된 푸라닐로 치환된 알킬인 화학식 (Ib)의 구조를 갖지 않는다.
한 실시양태에서, R6은 치환 또는 비치환된 C4-C12 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C3-C12 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 한 실시양태에서, R6은 치환 또는 비치환된 C4-C12 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C12 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 한 실시양태에서, R6은 치환 또는 비치환된 C4-C12 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C12 분지형 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 페닐이다. 한 실시양태에서, R6은 R6A-치환 또는 비치환된 C4-C12 사이클로알킬, R6A-치환 또는 비치환된 C4-C12 분지형 알킬, 또는 R6A-치환 또는 비치환된 페닐이고, 여기서 R6A는 할로겐이다. 한 실시양태에서, R6은 R6A-치환 또는 비치환 C4-C12 사이클로알킬, R6A-치환 또는 비치환 C4-C12 분지형 알킬, 또는 R6A-치환 또는 비치환 페닐이고, 여기서 R6A는 플루오로이다. 한 실시양태에서, R6은 비치환된 C4-C12 사이클로알킬, 비치환된 C4-C12 분지형 알킬, 또는 R6A-치환 또는 비치환된 페닐이고, 여기서 R6A는 플루오로이다. 한 실시양태에서, R6은 비치환된 C6-C12 사이클로알킬, 비치환된 C4-C12 분지형 알킬, 또는 비치환된 페닐이다. 한 실시양태에서, R6은 비치환된 C6-C10사이클로알킬이다. 한 실시양태에서, R6은 비치환된 C6-C8 사이클로알킬이다. 한 실시양태에서, R6은 비치환된 사이클로헥실이다.
한 실시양태에서, R7은 수소 또는 치환 또는 비치환된 알킬이다. 한 30 실시양태에서, R7은 수소 또는 비치환된 알킬이다. 한 실시양태에서, R7은 수소 또는 비치환된 C1-C3알킬이다. 한 실시양태에서, R7은 수소, 메틸 또는 에틸이다. 한 실시양태에서, R3은 메틸이다. 한 실시양태에서, R7은 에틸이다. 한 실시양태에서, R7은 수소이다.
한 실시양태에서, z1은 0, 1, 2, 3, 또는 4이다. 한 실시양태에서, z1은 0 또는 1이다. 한 실시양태에서, z1은 0이다. 한 실시양태에서, z1은 1이다. 한 실시양태에서, z2는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다. 한 실시양태에서, z2는 1이다.
한 실시양태에서, R8은 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬이다. 한 실시양태에서, R8은 독립적으로 치환된 알킬이다. 한 실시양태에서, R8은 독립적으로 비치환된 알킬이다. 한 실시양태에서, R8은 독립적으로 치환 또는 비치환된 헤테로알킬이다. 한 실시양태에서, R8은 독립적으로 치환된 헤테로알킬이다. 한 실시양태에서, R8은 독립적으로 비치환된 헤테로알킬이다. 한 실시양태에서, R8은 독립적으로 치환 또는 비치환된 아릴이다. 한 실시양태에서, R8은 독립적으로 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
화학식 (IIc)(상기)의 경우, R6은 치환 또는 비치환된 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 사이클로알킬이고; R7은 치환 또는 비치환된 알킬이다. 한 실시양태에서, R6은 비치환된 사이클로알킬, 예를 들어 사이클로헥실, 사이클로헵틸 또는 사이클로옥틸이다. 한 실시양태에서, R6은 비치환된 알킬, 예를 들어 3,3-디메틸부틸이다. 한 실시양태에서, R7은 비치환된 알킬이다. 한 실시양태에서, R10은 알킬 에스테르이다.
또 다른 측면에서, 하기 화학식 (IId)를 갖는 화합물이 제공된다:
화학식 (IId)의 경우, L2는 링커이고 B1은 퓨린 염기 또는 이의 유사체이다.
한 실시양태에서, L2는 치환 또는 비치환된 알킬렌, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌이다. 한 실시양태에서, L2는 수용성 중합체를 포함한다. "수용성 중합체"는 본원에 기재된 방법에 유용하도록 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어 온도, 이온 농도 등의 생리학적 조건 하에서 물에 충분히 용해되는 중합체를 의미한다. 예시적인 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
한 실시양태에서, 수용성 중합체는 -(0C2CH2)m-이고, 여기서 m은 1 내지 100이다. 한 실시양태에서, L2는 절단 요소를 포함한다. "절단 요소"는 화합물, 선택적으로 링커 L2의 잔여물을 포함하는 화합물, 및 B1, 선택적으로 링커 L2의 잔여물 20을 포함하는 B1을 방출하기 위해 절단(예를 들어, 가수분해)을 겪을 수 있는 화학적 작용기(functionality)이다.
경로(Routes) 및 제제(Formulations)
하나 이상의 항원 및 하나 이상의 어주번트 및 선택적으로 또 다른 활성제를 갖는 조성물의 투여 또는 하나 이상의 항원을 갖는 조성물 및 하나 이상의 어주번트를 갖는 조성물의 투여는 임의의 적합한 투여 경로를 통해, 특히 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 척추강내, 뇌실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하를 통할 수 있다. 이러한 투여는 단일 한 회(bolus) 주사, 다중 주사 또는 단기 또는 장기 주입일 수 있다. 이식 가능한 장치(예를 들어, 이식 가능한 주입 펌프)는 또한 특정 제제의 등가 또는 다양한 투여량의 시간 경과에 따른 주기적인 비경구 전달을 위해 사용될 수 있다. 이러한 비경구 투여를 위해, 화합물(컨쥬게이트 또는 기타 활성제)은 물 또는 다른 적합한 용매 또는 용매 혼합물 중의 멸균 용액으로 제제화될 수 있다. 상기 용액은 용액을 혈액과 등장성으로 만들기 위해 염, 설탕(특히 포도당 또는 만니톨)과 같은 다른 물질, 아세트산, 구연산 및/또는 인산 및 이들의 나트륨 염과 같은 완충제 및 방부제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 활성제와 조합하여 약제학적 조성물로서 제제화될 수 있고, 예를 들어 경구 또는 비경구적으로, 정맥내로, 근육내로, 국소적으로 또는 피하 경로로 투여의 선택된 경로에 적합한 다양한 형태로 인간 환자와 같은 포유동물 숙주에 투여될 수 있다.
따라서, 상기 조성물 단독으로 또는 또 다른 활성제, 예를 들어 항원과 조합하여, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 같은 약학적으로 허용되는 비히클과 조합하여 전신으로, 예를 들어 경구 투여될 수 있다. 그들은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압축될 수 있거나 환자의 식단에 직접 포함될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 선택적으로 활성 화합물과 조합된 상기 조성물은 하나 이상의 부형제와 조합될 수 있고 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 활성 화합물을 적어도 0.1% 함유해야 한다. 물론, 상기 조성물 및 제제의 백분율은 다양할 수 있고 편리하게는 주어진 단위 투여 형태의 중량의 약 2 내지 약 60%일 수 있다. 이러한 유용한 조성물에서 접합체 및 선택적으로 다른 활성 화합물의 양은 효과적인 투여량 수준이 얻어질 정도이다.
정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 또한 다음을 함유할 수 있다: 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 자당, 과당, 유당 또는 아스파탐과 같은 감미제 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리 향료와 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 단위 제제가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 이외에 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로 존재하거나 그렇지 않으면 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐제는 젤라틴, 왁스, 셸락 또는 설탕 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서는 활성 화합물, 감미료로 자당 또는 과당, 방부제로 메틸 및 프로필파라벤, 체리 또는 오렌지 향과 같은 염료 및 향료를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태를 제조하는 데 사용되는 모든 물질은 사용되는 양에서 약학적으로 허용 가능하고 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 인지질 접합체는 선택적으로 또 다른 활성 화합물과 조합되어 서방성 제제 및 장치에 포함될 수 있다.
다른 활성 화합물과 선택적으로 조합된 조성물은 또한 주입 또는 주사에 의해 정맥내 또는 복강내 투여될 수 있다. 항원(들), 및 선택적으로 다른 활성 화합물 또는 이의 염과 조합된 어주번트(들)의 용액은 선택적으로 무독성 계면활성제와 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 및 이들의 혼합물과 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건에서 이러한 제제에는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제가 포함되어 있다.
주사 또는 주입에 적합한 약제학적 투여 형태는 선택적으로 리포좀에 캡슐화되는 멸균 주사가능 또는 주입가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조에 적합한 활성 성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에 최종 투여 형태는 제조 및 보관 조건에서 멸균되고 유동적이며 안정적이어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스테르, 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용제 또는 액체 현탁액일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 리포좀의 형성, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 저장 중 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에 등장화제, 예를 들어 설탕, 완충액 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 유용할 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 야기될 수 있다.
멸균 주사용액은 필요에 따라 위에 열거한 다양한 기타 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 화합물을 혼입한 후 필터 멸균하여 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 한 가지 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술을 포함하며, 이는 활성 성분의 분말과 이전에 멸균 여과된 용액에 존재하는 임의의 추가의 원하는 성분을 생성한다.
국소 투여를 위해, 항원(들) 및 어주번트(들)는 선택적으로 또 다른 활성 화합물과 조합하여 순수한 형태로 적용될 수 있으며, 예를 들어 액체일 때 순수한 형태로 적용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 고체 또는 액체일 수 있는 피부과적으로 허용되는 담체와 조합하여 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 바람직할 것이다.
유용한 고체 담체는 활석, 점토, 미세결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등과 같은 미분된 고체를 포함한다. 유용한 액체 담체는 물, 알코올 또는 글리콜 또는 물-알코올/글리콜 블렌드를 포함하며, 여기서 본 화합물은 선택적으로 무독성 계면활성제의 도움으로 효과적인 수준으로 용해 또는 분산될 수 있다. 향료 및 항균제와 같은 어주번트를 첨가하여 주어진 용도에 대한 특성을 향상시킬 수 있다. 생성된 액체 조성물은 붕대 및 기타 드레싱을 함침시키는 데 사용되는 흡수 패드로부터 적용되거나, 또는 펌프형 또는 에어로졸 분무기를 사용하여 환부(affected area)에 분무될 수 있다.
합성 폴리머, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알코올, 변형 셀룰로오스 또는 변형 미네랄 물질과 같은 증점제를 액체 담체와 함께 사용하여 사용자의 피부에 직접 도포할 수 있는 퍼짐성(spreadable) 페이스트, 겔, 연고, 비누 등을 형성할 수 있다.
또한, 한 실시양태에서, 본 발명은 흡입 전달을 위한 또 다른 활성 화합물과 선택적으로 조합된 항원(들) 및 어주번트(들)의 다양한 투여 제제를 제공한다. 예를 들어, 제제는 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기 및 분무기와 같은 장치에서 에어로졸 사용을 위해 설계될 수 있다.
화합물을 피부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 유용한 피부과 조성물의 예시는 당업계에 공지되어 있고; 예를 들어 Jacquet et al. (미국특허번호 제4,608,392호), Geria (미국특허번호 제4,992,478호), Smith et al. (미국특허번호　제4,559,157호) 및 Wortzman (미국특허번호 제4,820,508호) 참조.
유용한 투여량은 인비트로(in vitro) 활성과 동물 모델에서의 생체내(in vivo) 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 인간에 대한 마우스 및 기타 동물의 유효 투여량을 외삽(extrapolation)하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 미국특허번호 제4,938,949호 참조. TLR 작용제로 작용하는 어주번트의 능력은 Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 6646 (2003)에 개시된 절차를 포함하는 당업계에 알려진 약리학적 모델을 사용하여 결정될 수 있다.
일반적으로, 로션과 같은 액체 조성물 중 다른 활성 화합물과 선택적으로 조합된 인지질의 농도는 약 0.1-25 중량%, 예를 들어 약 0.5-10 중량%일 것이다. 겔 또는 분말과 같은 반고체 또는 고체 조성물의 농도는 약 0.1-5 중량%, 예를 들어 약 0.5-2.5 중량%일 것이다.
활성 성분은 약 0.5 내지 약 75 μM, 예를 들어, 약 1 내지 50 μM, 예를 들어, 약 2 내지 약 30 μM의 활성 화합물의 피크 혈장 농도를 달성하기 위해 투여될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 선택적으로 식염수 중 활성 성분의 0.05 내지 5% 용액을 정맥내 주사하거나, 약 1-100 mg의 활성 성분을 함유하는 볼루스(bolus)로 경구 투여함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 혈액 수준은 약 0.01-5.0 mg/kg/hr을 제공하기 위한 연속 주입에 의해 또는 활성 성분(들)의 약 0.4-15 mg/kg을 함유하는 간헐적 주입에 의해 유지될 수 있다.
선택적으로 다른 활성 화합물 또는 이의 활성 염 또는 유도체와 조합된 항원(들) 및 어주번트(들)의 치료에 필요한 양은 선택된 특정 염뿐만 아니라 투여 경로, 치료되는 증상의 본질 및 환자의 연령 및 상태에 따라 다양할 것이며, 궁극적으로 담당 의사 또는 임상의의 판단에 따를 것이다. 그러나 일반적으로 적절한 용량은 1일 약 0.5 내지 약 100mg/kg, 예를 들어 약 10 내지 약 75mg/kg 체중, 예를 들어 당일 수용자의 체중 킬로그램당 3 내지 약 50mg의 범위일 것이며, 예를 들어 6 내지 90 mg/kg/일 범위, 예를 들어 15 내지 60 mg/kg/일 범위일 것이다.
항원(들) 및 어주번트(들)는 선택적으로 또 다른 활성 화합물과 조합하여 단위 투여 형태로 편리하게 투여될 수 있으며; 예를 들어, 단위 투여 형태당 5 내지 1000 mg, 편리하게는 10 내지 750 mg, 가장 편리하게는 50 내지 500 mg의 활성 성분을 함유한다.
원하는 용량은 단일 용량으로 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 하루에 2, 3, 4 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여되는 분할 용량으로 편리하게 제공될 수 있다. 하위 용량 자체는 예를 들어 수회의 별개의 느슨한 간격의 투여로 추가로 분할될 수 있으며; 예를 들어 취입기(insufflator)로부터 여러 번 흡입하거나 눈에 여러 방울을 떨어뜨려 적용한다. 용량, 그리고 아마도 용량 빈도도 개별 환자의 연령, 체중, 상태 및 반응에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 상태에 대한 활성제의 총 1일 용량 범위는 단일 또는 분할 용량으로 약 50 mg 내지 약 5000 mg일 수 있다. 한 실시양태에서, 1일 용량 범위는 경구 투여된 화합물의 단일 또는 분할 용량으로, 예를 들어 6시간마다 750 mg으로 약 100 mg 내지 약 4000 mg, 예를 들어, 약 1000-3000 mg이어야 한다. 이것은 약 500-750 uM의 혈장 수준을 달성할 수 있으며 이는 암세포를 죽이는 데 효과적일 수 있다. 환자를 관리함에 있어 치료는 환자의 전반적인 반응에 따라 더 낮은 용량 및 incd로 시작해야 한다.
특정 항원은 아미노산, 탄수화물, 펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 신체 물질 또는 미생물과 같은 세포를 포함한다.
특정 펩티드는 2 내지 약 20개의 아미노산 잔기를 갖는다.
또 다른 특정 펩티드는 10 내지 약 20개의 아미노산 잔기를 갖는다.
특정 항원에는 탄수화물이 포함된다.
특정 항원은 미생물이다. 특정 미생물은 바이러스, 박테리아 또는 곰팡이다.
특정 박테리아는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 살모넬라(Salmonella), 또는 스타필로코커스(Staphylococcus)이다. 특정 살모넬라는 S.티피무리엄(S. typhimurium) 또는 S.엔테리티디스(S. enteritidis)이다. 특정 스타필로코커스는 S.아우레우스(S. aureus)를 포함한다.
특정 바이러스는 RSV 및 인플루엔자 바이러스를 포함하는 RNA 바이러스, RNA 바이러스의 산물 또는 헤르페스 바이러스를 포함하는 DNA 바이러스이다. 특정 DNA 바이러스는 B형 간염 바이러스이다.
본 발명은 항원일 수도 있고 아닐 수도 있는 다른 활성제, 예를 들어 리바비린, 미조리빈 및 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)과 선택적으로 조합된 TLR4 작용제 및 TLR7 작용제 인지질 접합체를 포함하는 조성물을 포함한다.
예시적인 실시양태
한 실시양태에서, 포유동물에서 면역 반응을 향상시키는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 TLR4 작용제 및 TLR7 작용제의 유효량을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 리포좀 조성물이다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 TLR4 작용제를 포함하는 리포좀 및 TLR7 작용제를 포함하는 리포좀을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 TLR4 작용제 및 TLR7 작용제를 포함하는 리포좀을 포함한다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제는 동시에 투여된다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제는 화학식 (II)를 갖는다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제는 1Z105, 2B182c, INI-2004, 또는 CRX601을 포함한다. 한 실시양태에서, TRL4 작용제는 1Z105가 아니다. 한 실시양태에서, TLR7 작용제는 화학식 (I)이다. 한 실시양태에서, 리포좀은 PC, DOPC 또는 DSPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 리포좀은 콜레스테롤을 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역원을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 면역원은 미생물 면역원, 예를 들어, 하나 이상의 미생물 단백질, 당단백질, 당류 및/또는 지질다당류이다. 한 실시양태에서, 미생물은 인플루엔자 또는 수두와 같은 바이러스, 또는 박테리아이다. 한 실시양태에서, 미생물은 기생충 또는 진균이다. 한 실시양태에서, 리포좀은 하나 이상의 면역원을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역원을 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 설치류, 말, 소, 염소, 개, 고양이, 돼지 또는 양이다. 한 실시양태에서, TLR7 작용제의 양은 약 0.01 내지 100 nmol, 약 0.1 내지 10 nmol, 또는 약 100 nmol 내지 약 1000 nmol이다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제의 양은 약 2 내지 20 umol, 약 20 nmol 내지 2 umol, 또는 약 2 umol 내지 약 100 umol이다. 한 실시양태에서, TLR7 대 TLR4 작용제의 비는 약 1:10, 1:100, 1:200, 5:20, 5:100, 또는 5:200이다. 한 실시양태에서, 조성물이 주사된다. 한 실시양태에서, 리포좀은 DOPC 및 콜레스테롤을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원은 세포, 단백질 또는 포자이다. 한 실시양태에서, 면역원은 조성물 전 또는 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 투여는 미생물 감염을 예방하는데 효과적이다. 한 실시양태에서, 조성물은 비강내 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 피내 투여된다.
한 실시양태에서, 리포좀, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제를 포함하는 약학적 제제가 제공된다. 한 실시양태에서, 리포좀은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3- PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-릴)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-릴)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 및 이의 혼합물; 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 또는 이의 혼합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 리포좀은 DOPC, 콜레스테롤 또는 이들의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, TLR7 작용제의 양은 약 0.01 내지 100 nmol, 약 0.1 내지 10 nmol, 또는 약 100 nmol 내지 약 1000 nmol이다. 한 실시양태에서, TLR4 작용제의 양은 약 2 nmol 내지 20 umol, 약 20 nmol 내지 2 umol, 또는 약 2 umol 내지 약 100 umol이다. 한 실시양태에서, TLR7 대 TLR4 작용제의 비율은 약 1:10, 1:100, 1:200, 5:20, 5:100, 또는 5:200이다. 일 실시예에서, TLR7 작용제는 화학식 (I)의 화합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 화학식 (I)은 하기를 포함하며
상기 식에서, R11 및 R12는 각각 독립적으로 수소 또는 아실기이고, R13은 음전하 또는 수소이고, m은 1 내지 8이며, 여기서 물결선은 결합 위치를 나타내고, 여기서 OR12를 포함하는 탄소 원자에서의 절대 배열은 R, S, 또는 이들의 임의의 혼합물이다. 한 실시양태에서, m은 1이다. 한 실시양태에서, R11 및 R12는 각각 올레오일 기이다. 일 실시예에서, R3의 인지질은 2개의 카르복실산 에스테르를 포함하고 각각의 카르복실산 에스테르는 불포화, 에폭시화, 히드록실화 또는 이들의 조합의 1, 2, 3 또는 4개의 부위를 포함한다. 한 실시양태에서, R3의 인지질은 2개의 카르복실산 에스테르를 포함하고 이의 카르복실산 에스테르는 유사하거나 상이하다. 한 실시양태에서, 인지질의 각각의 카르복실산 에스테르는 C8-C9에 불포화 부위를 갖는 C17 카르복실산 에스테르이다. 한 실시양태에서, 인지질의 각각의 카르복실산 에스테르는 C9-C10에서 불포화 부위를 갖는 C18 카르복실산 에스테르이다. 한 실시양태에서, X2는 결합 또는 사슬에 1 내지 약 10개의 원자를 갖는 사슬이고, 여기서 사슬의 원자는 탄소, 질소, 황 및 산소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 임의의 탄소 원자는 옥소로 치환될 수 있고, 여기서 임의의 황 원자는 1개 또는 2개의 옥소 기로 치환될 수 있다. 한 실시양태에서, X2는 C(O),
이다.
한 실시양태에서, R3은 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)을 포함한다. 한 실시양태에서, R3은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포 에탄올아민이고, X2는 C(O)이다. 한 실시양태에서, X1은 산소이다. 한 실시양태에서, X1은 황, 또는 -NRc-이고, 여기서 Rc는 수소, C1-6알킬 또는 치환된 C1-6알킬이고, 여기서 알킬 치환기는 히드록시, C3-6사이클로알킬, C1-6알콕시, 아미노, 시아노 또는 아릴이다. 한 실시양태에서, X1은 -NH-이다. 한 실시양태에서, R1 및 Rc는 함께 헤테로시클릭 고리 또는 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 한 실시양태에서, R1 및 Rc는 함께 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리디노, 또는 피페라지노 고리를 형성한다. 한 실시양태에서, R1은 C1-6알콕시로 치환된 C1-C10알킬이다. 한 실시양태에서, R1은 수소, C1-4알킬, 또는 치환된 C1-4알킬이다. 한 실시양태에서, R1은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 히드록시C1-4알킬렌, 또는 C1-4알콕시C1-4알킬렌이다. 한 실시양태에서, R1은 수소, 메틸, 에틸, 메톡시에틸 또는 에톡시에틸이다. 한 실시양태에서, R2는 할로겐 또는 C1-4알킬이거나, 또는 R2는 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, R2는 클로로, 브로모, 메틸 또는 에틸이거나, 또는 R2는 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, X1은 O이고, R1은 C1-4알콕시-에틸이고, n은 0이고, X2는 카르보닐이고, R3은 1,2-디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)이다. 한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기와 같다:
한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기와 같다.
한 실시양태에서, 화학식 (II)에서, z2는 1, 2 또는 3이다. 한 실시양태에서, 화학식 (II)에서, z1은 1 또는 2이다. 한 실시양태에서, 화학식 (II)에서, z1은 0이다. 실시양태에서, 화학식 (II)에서, R5는 치환 또는 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴, 예를 들어 비치환된 C5 또는 C6 아릴이다. 한 실시양태에서, 화학식 (II)에서, R6은 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬, 예를 들어 5, 6 또는 7개 사이클로알킬이다. 한 실시양태에서, 화학식 (II)에서, R7은 치환 또는 비치환된 알킬, 예를 들어 C1 내지 C5 알킬이다. 한 실시양태에서, 화학식 (II)에서, R8은 치환 또는 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴, 예를 들어 5, 6 또는 7개 헤테로아릴, 예를 들어 푸라닐, 피롤릴 또는 이미다졸릴이다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예 1
리포좀-제제 2B182c, TLR4 작용제 및 1V270, TLR7 작용제의 어주번트 효능
2B182c(200nmol/주사) 및 1V270(1nmol/주사) 단독 또는 200nmol 2B182c 및 1nmol 1V270의 조합의 리포좀 제제가 제조되었다(Inimmune Corp, Missoula, MT). 리포좀-제제화된 어주번트의 어주번트 효능을 DMSO 제제(10% DMSO)와 비교하였다. 제제화된 어주번트는 동일한 프로토콜을 사용하여 테스트되었다. 간단히, 암컷 BALB/c 마우스를 0일 및 21일에 리포좀-제제화된 2B182c (200 nmol/주사) 및/또는 1V270(1 nmol/주사)으로 불활성화된 인플루엔자 바이러스로 면역화하고 혈청을 항-HA 및 항-NA 항체(IgM, IgG1 및 IgG2a)에 대해 ELISA를 통해 평가하였다. 사타구니 림프절을 수확하고 FACS에 의해 B 세포 집단에 대해 분석하여 제제화된 작용제가 배 중심 B 세포 및 형질모세포(항원 분비 세포) 집단에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.
TLR4는 세포 표면과 엔도솜 구획 모두에 위치한다. 엔도솜 수용체를 통한 신호전달은 LPS에 의한 NF-κB 활성화를 억제한다. 엔도솜 TLR4 활성화는 TRIF 경로 활성화를 유발하여 IRF3 활성화를 통해 유형 1 IFN 방출을 유도한다. 따라서 2B182c의 어주번트 활성은 리포좀 제제에 의해 약화될 수 있다. 리포좀 제제화된 2B182c는 DMSO 제제화된 어주번트와 비교하여 2B182c 단독 또는 2B182c + 1V270으로 면역화된 마우스에서 HA 및 NA 특이적 IgG1을 감소시킨 반면, 리포좀 제제화된 2B182c는 상당히 더 높은 항-HA IgG2a를 유도한다(도 19A). 리포좀 제제는 2B182c 및 2B182c + 1V270 조합된 어주번트에서 IgG2a 수준에 영향을 미치지 않았다(도 19A). 리포좀 제제에 의한 감소된 수준의 IgG1은 리포좀 제제화된 2B182c 및 2B182/1V270 조합된 어주번트에 의한 Th1 왜곡 면역 반응에 기인한다(도 19B). 이들 데이터는 기술된 TLR4 리간드의 세포내 전달이 유형 1 IFN 의존 방식에 의존하는 효과적인 Th1 면역 반응을 유도한다는 보고와 일치한다.
항원 노출 후 활성화된 나이브 및 기억 B 세포는 배 중심(GC)에서 확장되고 성숙된다. 장기간 백신 효능에 필요한 높은 항원 특이적 Ab 역가의 유지는 GC 형성과 상관관계가 있다. 활성화된 B 세포는 항원 특이적 Ab-분비 세포(ASC, 형질모세포 및 형질 세포), 기억 B 세포 및 기타 하위 집합을 추가로 형성한다. 형질모세포는 계절성 인플루엔자 바이러스 백신 접종 후 유도되었으며 백신 접종 후 7일째에 급격히 정점을 이뤘다. 비활성화된 바이러스 백신 접종 후 말초 혈액에서 형질모세포의 빈도는 인간의 보호 혈구응집소 억제 타이틀(titles)의 규모와 상관 관계가 있다. 따라서, 드레이닝(draining) 림프절의 GC B 세포 및 형질모세포를 조사하였다. 리포좀 2B182c 및 1V270의 조합에 의해 배중심 B 세포 및 형질모세포의 수가 증가하였다(도 20).
요약하면, 리포좀-제제화된 TLR4 및 TLR7 리간드 어주번트는 Th1 왜곡된 면역 반응을 유도하고 GC 중심 B 세포 및 형질모세포를 증가시켰다. 리포좀 제제에서 결합된 어주번트에 의해 유도된 B 세포 반응의 질을 평가하기 위해, 현재 림프절 세포의 BCR 및 TCR 레퍼토리 분석을 수행하고 있다. 또한, 백신 어주번트의 기능적 평가는 살아있는 바이러스(동종 및 이종 챌린지)에 의해 평가된다.
실시예 2
합성 소분자 TLR4 및 TLR7 작용제의 조합은 재조합 인플루엔자 바이러스 혈구응집소에 대한 강력한 어주번트로서 동종, 이종 및 이종아형(heterosubtypic) 뮤린(murine) 챌린지 모델에서 인플루엔자 바이러스에 대해 보호하는 신속하고 지속적인 면역을 유도한다. 그러나 이러한 연구에 사용된 TLR4 작용제는 1세대 주요 합성 TLR4 작용제인 피리미도인돌 계열로, 선천성 면역 수용체 작용제 역할을 하는 어주번트를 발견하기 위해 고처리량(high throughput) 스크리닝 캠페인에서 확인된 히트(hits)에서 최적화되었다. 1Z105는 뮤린 세포에서 우수한 면역활성을 갖는 것으로 밝혀졌지만 인간 세포에서는 유의미한 활성이 없었다. 보다 최근의 연구에서 C8-아릴 치환기를 포함하는 2세대 화합물 시리즈는 뮤린 세포에서 1Z105보다 더 강력했지만, 인간 세포에서도 매우 활성이었다. C8-아릴 유도체의 활성 그룹 내에서 C8-퓨란-2-일 유도체(2B182C)는 효능 및 유리한 예비 제제 데이터를 기반으로 추가 연구를 위해 선택되었다(도 34 및 36). 피리미도인돌 2B182C는 비교를 위해 1V270과 조합하여 평가되었다. 강력한 TLR4 작용제인 MPLA 유사체(MPLA-1)는 생체내(in vivo)에서 동종 및 이종 독감 감염에 대한 우수한 보호를 보여주었다.
TLR7 작용제인 1V270은 알려진 TLR7 작용제의 인지질 접합체이다. 상응하는 비접합 작용제에 비해 작용제 접합체의 인지질 모이어티에 의해 부여되는 주요 이점은 종종 사이토카인 증후군으로 관찰되는 더 큰 효능 및 국소 또는 전신 독성의 결여를 포함한다. 효능과 안전성을 입증하는 이러한 유리한 특성은 이 기술 제안서에 설명된 조합 어주번트 연구를 위한 주요 TLR7 작용제로 1V270의 선택을 뒷받침한다.
앞서 언급한 바와 같이, TLR4 작용제 1Z105 및 TLR7 작용제 1V270을 포함하는 조합된 어주번트는 인플루엔자-바이러스 백신으로 광범위하게 보호 반응을 유도하였다. SAR 연구는 인비트로(in vitro) THP-1 세포와 인간 및 뮤린 1차 세포에서 1Z105보다 더 높은 작용제 효능을 입증한 2B182C를 산출했다. 2B182C의 어주번트 효능은 비활성화된 인플루엔자 바이러스[A/California/04/09(Cal/09)]를 사용하는 백신 접종 모델에서 조사되었고 1Z105와 비교되었다. 이러한 연구는 TLR 작용제의 단순한 DMSO-물 제제를 사용하여 수행되었다.
TLR4 및 TLR7 작용제와 조합된 어주번트는 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 신속하고 광범위하게 보호 면역 반응을 유도한다
TLR4/TLR7 작용제-결합 어주번트에 의해 유도된 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 보호 면역 반응의 프로파일을 평가하기 위해, 마우스를 저용량(0.2 ㎍/주사) 재조합 혈구응집소(rHA) 및 체액 반응으로 면역화하고 치명적인 바이러스 공격에 대한 보호를 하였다(도 34A-2D). 조합된 어주번트와 함께 rHA로 면역화된 마우스는 최소 체중 감소 및 더 높은 생존율을 나타내었다(도 34B 및 2C). 조합된 어주번트 및 1V270, TLR7 작용제는 단독으로 Th1 편향된 면역 반응을 유도하였다.
TLR4/TLR7 조합 어주번트가 이형 인플루엔자 바이러스 챌린지에 대한 교차 보호를 제공하는지 여부를 추가로 조사하기 위해, B/Brisbane/60/2008(Victoria 계통)을 포함하는 2009-2010 Fluzone으로 마우스를 면역화하고, 그들을 25 mLD50의 이종 마우스 적응된 바이러스 B/Florida/04/2006(Yamagata 계통)으로 챌린지하였다. 1V270 단독으로 또는 1Z105와 조합하여 어주번트가 첨가된 Fluzone의 백신 접종 후 90% 이상의 마우스가 생존하였다(도 34E-2G). 이러한 데이터는 1V270이 단독으로 또는 1Z105와 조합하여 이종 인플루엔자 바이러스에 대한 신속하고 교차 보호적인 면역을 유도함을 나타낸다.
TLR4 및 TLR7 작용제의 용량 결정
언급한 바와 같이, SAR 연구는 인간 및 마우스 면역 세포에서 1Z105와 비교하여 인비트로에서 더 높은 효능을 나타내는 2B182C를 산출했다. 관찰된 더 높은 효능의 인비트로 연구가 생체 내에서도 재현 가능한지 여부를 조사하기 위해, 암컷 Balb/c 마우스를 0일과 21일에 불활성화된 인플루엔자 바이러스(A/California/04/2009(H1N1) pdm09, Cat# NR-49450, BEI 자원)과 함께 TLR4 작용제(1Z105 또는 2B182C, 40 또는 200 nmol/주사) 및 1V270(인지질 TLR7 작용제 접합체, 0.2 또는 1 nmol/주사)로 근육내(IM) 면역화했다 (도 34A). 혈청을 28일째에 수집하고 항-헤마글루티닌(HA) 및 항-뉴라미니다제(NA) 항체(IgM, IgG1 및 IgG2a)를 ELISA에 의해 결정하였다. 1V270, 1Z105 및 2B182C를 DMSO에 용해시키고 희석하고 DMSO의 최종 농도는 비히클 대조군으로 10%로 사용하였다. 유사한 결과를 보여주는 4개의 독립적인 실험에서 데이터를 수집했다.
항체 분비에 대한 TLR 작용제 단일 제제의 효과
단일 어주번트로서, 0.2 nmol 및 1 nmol 1V270, 및 40 nmol 및 200 nmol 2B182C 또는 1Z105를 비교하였다(도 34B). TLR4 작용제인 1Z105 및 2B182C는 모두 HA 및 NA에 대해 훨씬 더 높은 수준의 IgG1을 유도했다. IgG2a 유도와 관련하여, 0.2 및 1 nmol/주사 1V270 모두 항-HA를 유의하게 증가시킨 반면(p<0.05), 200 nmol/주사 2B182C만이 1Z105가 아닌 항-NA Ab를 증가시켰다(p<0.01)(도 34B). 2B182C 및 1Z105는 유사한 수준의 HA 특이적 IgG2a를 유도했다. 임의의 어주번트 치료에 의한 IgM 반응에는 차이가 없었다. 이러한 데이터는 TLR4 작용제가 IgG1 생산을 증가시키고 TLR7 작용제가 IgG2a 분비에 효과적이며 2B182C가 생체내 1Z105와 유사하거나 약간 더 높은 효능을 나타냈다는 보고를 뒷받침한다.
항체 분비에 대한 2B182C 및 1V270의 병용 치료 효과
다음으로, DMSO-물 제제를 사용하여 조합된 어주번트의 효능을 평가하였다. 1V270과 1Z105 및 2B182C의 조합된 어주번트는 HA 및 NA 모두에 대한 IgG1의 유도를 개선했다. 2B182C는 40 및 200 nmol 둘 다에서 1Z105와 비교하여 훨씬 더 높은 IgG1을 향상시켰다(p<0.05, 도 35A 및 35B). IgG2a 유도에서 2B182C는 항 HA- 및 항 NA-Ab의 수준을 증가시켰다. 그러나 1Z105는 대부분의 경우 실패했다(도 35C 및 35D). 어주번트는 IgM 방출에 대한 최소한의 효과를 나타내었다(도 35E 및 35F).
시험된 모든 조합의 항체 역가를 비교하기 위해 평균 IgG1 및 IgG2a 역가를 도 36A에 플롯팅하였다. 200 nmol 2B182C + 0.2 또는 1 nmol 1V270은 IgG1 및 IgG2a 둘 다의 가장 높은 유도를 나타냈다(도 36A). 추가로, Th1/Th2 면역 균형을 평가하기 위해, 개별 동물에서 IgG2a: IgG1 비율을 계산하였다(도 36B). 1 nmol 1V270은 Th2 편향된 면역 반응을 1Z105 또는 2B182C만큼 유의하게 이동시켰으며, 이는 1V270이 면역 반응을 Th1 편향으로 이동시켰음을 나타낸다(도 36B). 요약하면, 이러한 결과는 200 nmol/주사 2B182C + 1 nmol/주사 1V270의 조합이 가장 많은 양의 IgG1 및 IgG2a를 유도하고 Th1-왜곡 면역 반응이 인플루엔자 바이러스 감염에서 이종 보호를 위해 바람직하다는 것을 나타낸다. 따라서 우리는 추가 전임상 제제를 위해 이 조합을 선택했다.
TLR4 작용제를 사용한 예비 데이터
나노입자 제제에서 MPLA-2, MPLA의 황산염 유사체, 조합 및 모든 주요 TLR 작용제에 대한 생체내 평가를 수행했다. NIAID 어주번트 발견 및 개발 계약 중에 강력한 TLR4 작용제가 발견되어 인비트로에서 인플루엔자 관련 사이토카인 생산의 시너지적 향상은 아니더라도(hPBMC에서), 마우스 및 돼지의 생체내 1V270을 사용한 IgG2A 항체 및 HI 역가의 부가적인 향상을 입증했다. 어주번트로서의 MPLA-1의 주요 약점은 수성 매질에서 가수분해되기 쉽기 때문에 화학적 안정성이 부족하다는 것이다. 비특이적 내성에 대한 예비 뮤린 연구에서 MPLA-2는 동등한 용량의 MPLA-1보다 치명적인 인플루엔자 챌린지로부터 마우스를 보호하므로, MPLA-2는 차세대 TLR4 작용제를 나타낸다.
상기 설명된 목표를 뒷받침하기 위해 하기 설명된 실험이 수행된다.
연구 영역 1: 주요(lead) TLR 작용제 조합을 위한 제제 및 분석적인 분석 개발(analytical assay development)
TLR4/TLR7 조합 제제의 개발
작업 1A: 주요 화합물 단독 및 조합의 콜로이드적으로 안정한 나노입자 제제 개발
미립자 전달 시스템은 우리의 면역 시스템이 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해 인식하고 싸우도록 진화한 바이러스 및 박테리아 병원체의 크기와 모양을 모방하여 어주번트 역할을 한다. 지난 30년 동안의 연구를 통해 생분해되고 백신 항원 전달에 적합한 수많은 나노 및 마이크로입자 기반 시스템이 만들어졌다. 백신 전달 시스템으로서의 그들의 유용성은 인간 임상 시험으로 진행되는 각 유형의 예시와 함께 리포좀, 바이로솜(virosomes), Iscoms, 에멀젼, 바이러스 유사 입자(VLP), 고체 지질 나노입자(SLN) 및 폴리락트산 코-글리콜산(PLGA) 중합체와 함께 논문에서 입증되었다. 미립자 전달 비히클의 1차 보조 메커니즘은 APC에 의해 통합된 입자 또는 관련 항원의 흡수가 향상되는 것으로 생각된다. 이제 항원에 PAMP를 추가하면 TLR 및 기타 PRR의 결찰(ligation)을 통해 강력한 선천성 및 적응성 면역 반응을 촉진하여 선천성 면역 세포 활성화를 유도한다는 것이 잘 확립되었다. 다수의 PAMP(박테리아 리포단백질, 당지질, DNA 및 바이러스 RNA 등)가 식별되어 바이러스 및 박테리아 병원체로부터 분리되었다. 이들 작용제의 다수는 강력한 어주번트이지만 허용할 수 없는 수준의 염증을 나타내거나 임상 개발에 불리한 물리적/화학적 특성을 갖는다. 이에 대한 응답으로 연구원들은 개선된 안전성 및 화학적 프로필을 가진 합성 유사체를 성공적으로 생산했으며, 이들 중 많은 것들이 PRR 결찰을 통해 그들의 병원체 모방을 향상시키기 위해 미립자 전달 시스템에 추가되었다. 미립자 전달 시스템은 또한 생체내 어주번트의 생체분포 동역학을 개선하고 어주번트 면역원성을 희생하지 않으면서 어주번트 부작용을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
이중층이 통합된 TLR4 작용제 MPLA-1과 함께 PEG화된(PEGylated) 리포좀의 효과적인 설하 백신 사용은 인플루엔자의 쥐 모델에서 나타났다. 이 제제는 생체 내에서 어주번트 효능의 손실 없이 MPLA-1의 발열성(pyrogenicity)을 200배 감소시킨다. 이것은 수성 분산액에 비해 리포좀에 통합될 때 LPS의 발열성의 관찰된 감소와 유사하다. TLR4 작용제에 대해서도 동일한 발열성 감소가 예상된다.
나노입자/미세입자 형성, API 혼입, API 안정성 및 콜로이드 안정성을 위한 다수의 상이한 지질 및 성분을 평가하였다. 상업적으로 이용 가능한 다양한 양이온(DDA, DOTAP, DC-콜레스테롤), 음이온(DPPG, PS, POPG) 및 중성 지질(PC, DOPC, DSPC)을 TLR4 및 TLR7 작용제로 테스트한다. 다른 제제는 PLGA, 폴리카프로락톤, 폴리(프로파길 메타크릴레이트) 또는 PLMA를 사용할 수 있다. 입자 크기와 전하가 나노입자 흡수 및 DC에 의한 처리에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 상기 나열된 품질 특성에 대한 전달 비히클 설계를 향상시키는 이러한 변수들의 영향을 조사한다. 소규모 리포좀 제제는 스케일(scale)과 폐기물(waste)을 추가로 줄이기 위해 멸균 혈청 바이알에 적합한 박막 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
간단히 말해서 이것은 다음과 같이 수행된다:
1. API를 지질에 추가하고 클로로포름에 이들을 용해시키는 단계(원하는 경우 이 단계에서 형광 마커가 추가될 수도 있음(예를 들어 NBD, BODIPY, FITC 등).
2. 설정 속도로 회전 증발 및 건조 박막으로 진공 단계
3. 수성 완충액으로 재수화 단계(0.1M 인산염, TRIS 또는 HEPES)
4. 동적 광산란(DLS)에 의한 입자 크기, 다분산성 및 표면 전하(제타 전위)의 공정 모니터링과 함께 지질 전이 온도(Tm) 이상의 배스(bath) 초음파 처리에 의한 입자 크기 감소 단계
5. 초음파 처리 방법보다 입자 크기 균질성(다분산 지수, PDI)을 개선하는 Lipex 압출기(extruder)를 사용하여 3 내지 10mL 규모의 주요(lead) 제제가 제조된다
작업 1B: 제제의 콜로이드 및 물리적 안정성을 평가하기 위한 안정성 연구
제제 안정성은 제품 비용에 직접적으로 기여하는 제품 보관, 배송 및 저장 수명에 영향을 미치므로 성공적인 상용 제품 개발을 위해 필요하다. 제제는 특히 추가로 추구할 주요 후보를 선택할 때 안정성뿐만 아니라 잠재적인 제품으로 적합한 것으로 입증되었다.
주요 제제는 선택된 제제가 잠재적 제품 개발을 위한 충분한 안정성을 제공하도록 보장하기 위해(선호되는 보관 조건에서 최소 12개월) 단기 가속(25 및 40°C) 및 장기 실시간 안정성(2-8°C 및 25°C)에 대해 평가된다.
나노입자 전달 시스템에 통합되는 어주번트의 정확한 정량화는 적절한 투여, 백신 효능 및 안전성에 필수적이다. 리포좀을 포함한 나노입자에 통합된 TLR4 및 TLR7/8 작용제의 정량을 위한 SEC-HPLC 및 RP-HPLC 방법이 개발되었다. RP-HPLC는 충분히 낮은 배경 UV 흡광도를 갖는 수혼화성 유기 용매(메탄올, 테트라히드로푸란 등)로 샘플을 용해할 때 나노입자에 존재하는 총 작용제 함량 분석에 효과적이다. 유기 용매를 사용한 용해는 나노입자를 파괴하고 5-포인트 표준 곡선에 대한 RP-HPLC에 의한 정확한 정량을 위해 통합되거나 표면 결합된 작용제를 방출한다.
통합된 리포좀(이중층 또는 수성 코어) 작용제의 정량을 위해서는, 온전한 리포좀 및 리포좀 외 수상을 분석할 수 있는 방법이 필요하다. 296, 225 및 310 nm(각각 2B182C, MPLA-2 및 1V270에 대해)에서 UV 검출로 "유리" TLR 작용제를 정량할 수 있는 SEC-HPLC 방법을 사용했다. TSK gel SWxl 시리즈 컬럼은 30-200 nm 범위의 나노입자 제제에 대해 우수한 크기 기반 분해능을 제공한다. 사용된 이동상은 여분의 리포좀 유체와 리포좀 코어의 수상 사이에 일정한 삼투압 전위를 유지하기 위해 리포좀 재수화에 사용된 완충액과 동일하다. 이 방법은 통합되지 않은 수성 TLR4 작용제만 검출하는 인비트로 효능 분석에 대한 보완 방법으로 자격이 부여되었다.
예비 연구는 2B182C 및 1V270의 리포좀 제제를 평가하기 위해 이러한 분석 방법을 사용하여 수행되었으며, 각각 단독으로 및 조합하여 제조되었다(공동 캡슐화됨). 작업 흐름은 다음과 같이 수행되었다:
1) IM 주사용 50 uL에 함유된 2B182C에 대한 1 nmol 1V270 및 200 nmol의 목표 농도로 2 mL 규모의 주요 어주번트 제제 스크리닝 단계(약학적으로 허용되는 공용매, 부형제, 리포좀).
2) 제제가 품질 기준을 충족하는지 확인하기 위해 주요 제제에 대한 기본 분석 방법 개발 및 분석을 수행 단계
3) 실시간 및 가속 방법으로 선호되는 제제의 안정성을 평가하고 필요한 경우 안정제로 적절한 부형제를 추가하는 단계
4) 완성된 제제의 내독소 오염이 없는지 확인하기 위한 rFC 테스트 단계.
모든 리포좀 제제는 화합물 2B182C 및 1V270에 대해 2mL 규모로 제조되었다.
간략하게, 하기 절차를 사용하여 리포좀을 제조하고 하기 조성을 평가하였다: (DOPC/콜레스테롤이 있는 경우 및 없는 경우, 각각 2:1)를 사용하여 1V270이 있는 및 없는 2B182. 시험된 DOPC의 농도는 40 mg/mL로 일정하게 유지되었고, 이는 10 mg/mL의 콜레스테롤 농도를 초래했다. 9:1 클로로포름:메탄올을 용매로 사용하여 지질막 재수화 방법에 따라 리포좀을 생산했다. 초기에 사용된 재수화 완충액은 50mM NaPB, 100mM NaCl, pH=6.1이었다. 시험된 작용제 농도는 목표 농도였다. 리포좀 입자 크기를 줄이기 위해 고온에서 초음파 처리를 사용했다. 분석 결과의 요약은 표 4에 나와 있다.
제조된 제제의 이론적 농도:
c[mg/mL] [mM]
2B182C 2.0505 4000
1V270 0.0217 20
DOPC 60 ND
Chol 15 ND
표 5. 2B182C 및 1V270의 예비 리포좀 제제 분석은 주요 제제의 철저한 분석적 특성을 입증한다.
TLR 작용제의 다른 비율, 다른 지질 성분, 및 나노입자 형성을 위한 다양한 양의 콜레스테롤이 평가된다. 작업 2A에 따라 적어도 10가지 다른 제제가 준비되고 적합성을 위해 스크리닝되며, 상기 설명된 간단한 DMSO-물 제제를 사용하여 얻은 결과와 비교된다.
나노입자: TLR7 및 TLR4 작용제는 나노입자 제제(리포좀, SLN, PLGA, 에멀젼 등)로 제조된다. 최종 주요 제제는 면역학, 안정성 및 제조 데이터를 기반으로 선택된다. DOPC/콜레스테롤 리포좀 제제는 예비 면역학 및 안정성 데이터를 기반으로 매우 유망한 것으로 보인다. TLR4 및 TLR7 작용제에서 예상되는 과제 중 하나는 두 작용제를 동일한 나노입자에 제어되고 일관된 방식으로 공동 통합하는 것이다. 서로에 대한 작용제의 비율은 일단 공동 캡슐화되면 고정되므로, 해당 지점에서 임의의 용량 조정은 두 작용제를 함께 변경한다.
분석 방법: 작업 1C에 설명된 모든 분석 방법은 우리의 지질화된 TLR-7/8 작용제 및 TLR4 작용제와 함께 사용되었으며 추가 최적화로 그들의 특이성, 선형성 및 범위를 더욱 개선할 것으로 기대한다. TLR4 및 TLR7 작용제 제제에서 어주번트의 정량을 위한 RP-HPLC 방법은 피크 모양, LOD 및 LOQ에 대해 최적화될 것이다. 이러한 동일한 방법은 제품 안정성의 정확한 모니터링을 허용하기 위해 안정성 연구에서 검출된 모든 분해물에 대한 기준선 분해능 및 최적의 LOD/LOQ를 달성하기 위해 구배(gradient) 및 컬럼 최적화될 것이다. TLR4 및 TLR7 작용제 조합의 각 작용제에 대한 나노입자 혼입 백분율의 정확한 정량화는 SECHPLC가 유체역학적 부피만을 기준으로 분리하기 때문에 어려울 수 있다. 리포좀과 통합되지 않은 작용제는 유사한 입자 크기를 가질 수 있으며, 이는 통합 결정을 위한 SEC-HPLC의 유용성을 제한한다. 이에 대해서는 아래에서 대안적인 접근 방식에 대해 설명한다.
대안적 접근: 공동 캡슐화된 TLR4 및 TLR7 작용제의 개발이 나노입자의 작용제의 일관성 없는 수준으로 인해 너무 어려운 것으로 판명된 경우, 우리의 면역학 데이터는 리포좀에서 리포좀의 TLR4 작용제를 TLR7 작용제와 단순히 혼합함으로써 어주번트 시너지 효과를 여전히 달성할 수 있음을 보여주었다. 이 접근법은 작용제 신호가 서로 간섭할 가능성을 줄임으로써 분석적 특성화가 더 쉬워지는 더 간단하고 신뢰할 수 있는 제품을 생산할 가능성이 있다.
또 다른 옵션은 수성 및 유상이 나노 액적으로 혼합되기 때문에 기본적으로 작용제의 100%가 통합되는 나노 에멀젼과 같은 공동 캡슐화를 위한 다른 제제를 탐색하는 것이다. 에멀젼은 또한 투여 부위에 저장소를 형성하여 면역 반응을 더욱 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 연구 영역 2에서 논의된 바와 같이, 공동 캡슐화된 TLR4 및 TLR7 작용제 대 혼합을 인비트로 및 인비보에서 비교하여 이러한 접근 방식의 장단점을 평가한다. 나노입자에 작용제 혼입을 결정하기 위해 SEC-HPLC를 사용하는 또 다른 방법은 고속 밀도 구배 원심분리를 통해 나노입자를 펠렛화하고 확립된 RP-HPLC 방법을 사용하여 통합되지 않은 작용제에 대한 상층액을 분석하는 것이다.
진행을 위해 허용되는 특성을 갖는 목표 비율 범위의 제제는 면역화 및 바이러스 공격 연구를 포함하는 생체 내 연구에 적용된다.
연구 영역 2: 주요 어주번트 제제에 의한 치명적인 인플루엔자 바이러스 공격으로부터 보호하는 면역학적 바이오마커 확립
안전하고 효과적인 백신의 성공적인 개발을 위해서는 신뢰할 수 있는 바이오마커를 정의하는 것이 필요하다. 백신 개발 프로그램에서는 임의의 안전성 문제 없이 감염을 효과적으로 예방할 수 있는 프로파일을 가진 백신 후보를 선택하는 것이 필수적이다. 백신 임상 시험에서는 최소한의 반응성으로 항원 특이적 적응 면역 반응을 예측하는 바이오마커의 식별이 필요하다. 이 프로젝트에서 바이오마커는 1) 항원 유무에 관계없이 제제화된 주요 어주번트에 의해 유도된 선천적 면역 바이오마커, 2) 적응 면역 반응과 관련된 바이오마커의 두 단계로 식별된다. 따라서, 인비트로 및 생체내 연구를 수행하여 TLR4 및 TLR7/8 리간드의 생물학적 활성과 상관관계가 있고 반응원성과도 관련된 바이오마커 후보를 확인한다.
작업 2A: 면역활성 및 반응성에 대한 생체내 항체 생산 연구에 기반한 조합 제제
백신 접종을 통한 감염병 예방의 특징은 효과적인 항체 생산의 유도이다. TLR4와 TLR7 작용제를 조합하면 항원 특이적 항체 역가가 크게 증가했다. 면역 반응의 Th1 편향 경향이 관찰되었다. 제제화된 어주번트 및 이들의 조합의 효과는 단순한 DMSO-물 제제와 비교된다.
작업 2A.1: 주요 콤보 제제에 대한 마우스의 면역화 연구
주요 어주번트의 제제는 면역화 연구 단독 및 DMSO-물 제제에 대해 이전에 완료된 것과 유사한 방식으로 다양한 비율의 TLR 작용제의 조합으로 평가될 것이다. IgM, 총 IgG, HA 및 NA 모두에 대해 특이적인 IgG1 및 IgG2a의 수준이 평가된다. 항원-특이적 항체의 최대 역가를 제공하는 조합된 TLR 작용제의 하나 이상의 비율이 확인된다. 이 제제(들)은 연구 영역 3에서 챌린지 연구를 위해 발전될 것이다.
작업 2A.2: 마우스에서 주요 콤보 제제의 반응성 및 독성 평가
감염성 질병 백신은 건강한 개인을 보호하도록 설계되었기 때문에, 백신의 안전성은 개발 목표 중 최우선 순위가 되어야 한다. 따라서, 후보 제제의 독성 및 반응성을 평가하기 위한 적절한 실험이 수행된다. 이러한 실험과 일반적으로 명백한 독성은 초기 독성 평가로 면밀히 평가된다. 마우스의 모든 고통(distress)의 징후(즉, 몸단장(grooming) 부족, 이동성 문제, 결합(conjunctives), 비정상적인 행동, 반응성 등)가 기록된다. 총체적 관찰 외에도 독성 측정에는 전체 혈구 수, 혈청 화학 평가(AST, ALT, ALP, 아밀라제, 혈액 요소 질소, 크레아티닌, 총 단백질, 포도당, 칼륨, 칼슘, 나트륨, 총 빌리루빈) 및 부검 평가(헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 비장, 간 및 신장 섹션)를 포함한다. 또한, 주사 부위에 염증의 가시적 징후 및 임의의 기타 비정상 발견(findings)이 있는지 평가한다. 주사 부위의 조직은 또한 부검 평가의 일부로 조직학적으로 평가된다. 이러한 연구는 하기 표 6에 요약되어 있다.
작업 2B: 보호 적응 면역 반응을 예측할 수 있는 면역 마커의 식별
언급한 바와 같이, 최소 반응성으로 항원 특이적 적응 면역 반응을 예측하는 바이오마커의 식별은 임상 시험 설계 및 방법을 촉진한다.
작업 2B.1: 선천적 면역 반응 신호(사이토카인, 케모카인)
케모카인에 의한 국소 백신 투여 부위로의 면역 세포 모집은 항원 제시 세포(APC)를 모집하고 후속 적응 면역 반응의 유도에 영향을 미치는 데 필수적이다. 그러나 주사 부위, 즉 근육 조직은 상대적으로 적은 수의 면역 세포를 포함하므로 효과적인 어주번트는 면역 세포의 국소 부위로의 동원을 유도해야 한다. TLR4는 TLR7/8과 달리 비면역 세포에서 풍부하게 발현되어, 염증 세포를 모집하기에 충분한 케모카인을 발현할 수 있다. TLR 자극 후 APC의 모집은 일반적으로 염증 세포를 동반하기 때문에 염증 반응과 어주번트 효과를 구별하기가 어렵다. 이러한 복잡한 면역 활성화 캐스케이드는 인비트로 분석만으로는 연구할 수 없다. 따라서, 마커들의 패널은 마우스의 생체내 연구에서 얻은 샘플에서 상기 인비트로 실험으로부터 선택된다.
주요 어주번트 제제을 마우스에 근육내(IM) 투여하고, 전신 사이토카인/케모카인의 수준을 조사하기 위해 주사 후 1일, 3일 및 7일에 혈청을 수집할 것이다. 국소 근육 조직에 대한 상기 작업 2A.2에서 언급한 바와 같이, 사이토카인/케모카인 및 공동-자극 분자 유전자의 발현은 qPCR 또는 NanoString 분석에 의해 조사될 것이다. 면역 세포 침윤은 헤마톡실린-에오신 염색 및 면역조직화학 염색으로 선택된 샘플의 조직학적 검사에 의해 평가된다. 비장 세포 또는 PBMC는 유세포 분석에 의해 평가된 공동 자극 분자의 발현을 평가하는 데 사용된다. 드레이닝(draining) 림프절은 표시된 시점에서 수집되고 각 실험 그룹에서 풀링되고(pooled) 면역 세포 집단과 케모카인 수용체 및 공동자극 분자의 발현에 대해 분석된다. 연구 설계의 요약이 표 6에 나와 있다. "그룹 5: 항원과 결합된 어주번트" 그룹에는 원하는 사이토카인/케모카인 유도 프로필을 제공하는 데 필요한 TLR4 및 TLR7 작용제의 다양한 비율의 조합이 포함될 수 있다. TLR4 및 TLR7 리간드 둘 다의 생물학적 활성을 나타내고 또한 반응성과 관련된 선천적 면역 시그니처(signature)가 선택된다.
선천적 케모카인/케모카인 마커에 대한 연구 설계의 예시(마우스)
설명
그룹 그룹 1: 비히클 단독 항원 없음그룹 2: 항원 없는 조합된 어주번트
그룹 3: 어주번트(TLR4 리간드) 단독
그룹 4: 어주번트(TLR7 리간드) 단독
그룹 5: 항원과 조합된 어주번트
그룹 6: FDA 승인된 어주번트(예를 들어 MF59)
주사 0일 및 21일
경로 IM
평가 최종 주사 이후 1일, 3일, 7일
# 마우슷 각 시점에 N=10
작업 2B.2: 적응 면역 반응 시그니처.
적응 면역 반응을 평가하기 위한 실험은 상기 작업 2A.1과 함께 수행된다. 하기 기준을 만족하는 바이오마커 후보가 식별된다: 1) 말초혈액에서 검출, 2) 각 TLR 리간드의 작용기전 및 이들의 생물학적 효과 상관관계에 의한 구동, 3) 장기간의 항원 특이적 항체 유도 및 광범위한 보호 예측, 4 ) 반응성 예측.
결과 및 대안적 접근
조합된 TLR 작용제의 하나 이상의 비율은 항원 특이적 항체의 최대 역가를 제공한다. 더욱이, 두 부류의 TLR 리간드의 조합의 사용은 TLR4 작용제 단독의 사용과 비교하여 Th1 편향된 반응으로의 적응 면역 반응의 이동을 초래한다. 따라서, Th1/Th2 응답비가 증가할 가능성이 있다. 이 Th1 편향은 이종 바이러스 보호를 포함하도록 반응을 확대하는 데 유리할 수 있다. 독성과 관련하여 이미다조퀴놀린 계열의 TLR7/8 리간드의 전신 및 경구 투여는 높은 수준의 혈청 TNFα 및 IL-1β와 함께 독감 유사 증상, 메스꺼움 및 림프구 감소증을 포함하는 심각한 부작용을 나타냈다. 이것은 1V270이 구성원인 옥소아데닌 계열에 대해서도 마찬가지일 수 있다. 그러나 이러한 바람직하지 않은 부작용의 대부분은 백신 접종을 위한 일반적인 국소 투여 경로인 IM을 사용하여 피할 수 있다. 게다가, TLR7/8 리간드는 제제를 맞춤화함으로써 뿐만 아니라 지질 모이어티에 접합함으로써 제조되었고, 어주번트 활성을 유지하면서 전신 사이토카인 방출을 성공적으로 감소시켰다. 따라서 염증성 사이토카인에 대한 전신 노출이 낮기 때문에, 주요 제제 조합과 관련된 반응성이 거의 또는 전혀 없을 것이다.
연구 영역 3: 제제(들) 선택 및 면역화 - 마우스에서 바이러스 챌린지 연구(면역)
안정성(작업 1B), 면역 활성(작업 2A.1) 및 반응성 프로파일(작업 2A.2)을 포함한 제제 연구 결과에 기초하여 예비 조합과 함께 주요 제제 조합이 마우스에서 전임상 면역/바이러스 챌린지 연구를 위해 선택된다. 연구에 사용된 바이러스 항원은 A/Victoria/3/75(H3N2), A/Michigan/45/2015 (H1N1) pdm09-유사 바이러스 및 A/Hong Kong /4801/2014 (H3N2)-유사 바이러스와 같은 승인된 상업 백신에 사용되는 재조합 백신 항원 또는 비활성화 전체 바이러스로부터 선택될 수 있다.
작업 3A: 리드 콤보 제제(들)의 선택
리드 선택 기준은 1) 제제화된 조합의 안정성, 2) 원하는 항원 특이적 항체 수준을 제공하는 TLR 작용제의 비율, 및 3) 국소 및 전신 모두에서 낮은 반응성 프로파일을 기반으로 한다. 이러한 기준과 관련된 특정 연구는 표 7에 요약되어 있다.
주요 제제화된 조합 및 백업 주요 조합을 선택한 후, 마우스에서 면역화/바이러스 챌린지 모델에서 선택 평가가 수행된다(작업 3B).
기능 설명
항원 제시 기능 · 드레이닝(draining) 림프절 세포 및 비장에서 CD11c 양성 세포의 CD80, CD83, CD86, CD40, MHC 클래스 II 발현의 유세포 분석
염증 반응, 사이토카인 및 케모카인 · 주사된 부위에 국소 조직의 유전자 발현 연ㄱ우· 주사 부위의 조직학적 실험
· 전신 사이토카인 및 케모카인 방출에 대한 혈청의 Luminex 분석
B 세포 분석 (II상 계획) · CD19+CD138- B 세포의 유세포 분석 및· 드레이닝 림프절, PBMC 및 비장 내 CD19-CD138+ 형질모세포
· 림프절 세포, PBMC 및 비장의 BCR 레파토리 분석
T 세포 분석 (II상 계획) · CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ 세포의 CD69 발현에 대한 유세포 분석· CD62LloCCR7loCD44hi (주효 기억 T 세포)
· CD62LhiCCR7hiCD44high (중앙 기억 T 세포)
· 다기능 CD4+ T 세포 (TNF, IL-2, IFNg에 대한 세포내 염색)
· CD4+CXCR5+ICOS+PD-1+ 난포 T 세포
· T 세포 ELISpot (IFNg)
일반 독성 측정 · 완전 혈액 카운트· 혈청 화학: AST, ALT, ALP, 아밀라아제, 혈액 요소 질소, 크레아티닌, 총 단백질, 글루코스, 포타슘, 칼슘, 소듐, 총 빌리루빈
· 생검(헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 비장, 간, 및 신장 구획)
표 7. 측정 요약
작업 3B: 주요 제제를 사용한 면역화/바이러스 챌린지 연구
작업 3B.1: 바이러스 챌린지 연구를 위한 최소 보호 용량 결정
비활성화된 인플루엔자 바이러스는 선천적 면역 수용체 리간드(PAMPS)를 포함하기 때문에, 충분한 항원만 사용하여 마우스를 면역시킨 후 특정한 낮은 수준의 보호가 예상될 수 있다. 따라서 비활성화된 바이러스에 대한 최소 보호 용량이 있는 경우 이를 결정하기 위한 연구가 수행된다. 항원의 최소 보호 용량은 일치하는 활성 바이러스 균주에 대한 후속 공격 시 부분적 보호(30% 생존 미만)만 제공하는 용량이다. 이 전략을 사용하면 선택된 주요 제제화된 어주번트 조합으로 다양한 활동을 관찰할 수 있다. 또한, 면역화되지 않은 마우스에 대해 완전한 사망률, 통상적으로 약 5 LD50의 용량을 초래하는 챌린지 바이러스의 양이 또한 확인될 수 있다.
작업 3B.2: 동종 바이러스 보호 연구
항원 용량 범위를 찾는 연구에 이어서, 마우스 모델을 사용하여 동종 인플루엔자 백신 항원과 함께 주요 어주번트 조합의 면역원성을 평가한다. 성공의 주요 결정 요인은 아래와 같다: 1) 혈청 내 인플루엔자 특이적 IgG2a 및 IgG1의 지속성, 2) 치명적인 인플루엔자 바이러스 공격으로부터의 보호, 3) 낮은 반응성, 및 4) 세포내 IFNg/TNFα 염색에 의해 평가된 CD8+ T 세포에 대한 다기능성 CD4+의 유도. 2차 종료점에는 백신 접종 또는 인플루엔자 바이러스 챌린지 후 관찰 가능한 임상 증상(헝클어진 털(ruffled fur), 구부린 자세 및 호흡 곤란)의 모니터링을 통한 체중 증가/감소 및 질병 중증도 점수가 포함된다.
일반적인 생체내( in vivo ) 방법
면역학적 평가: 마우스(수컷 및 암컷)는 1차 및 2차 백신 접종 사이에 21일 동안 IM 투여를 통해 1회 또는 2회 백신 접종(어쥬번트 + A/Victoria/3/75(H3N2)와 같은 독감 항원)되었다(도 12). 세포 매개 면역(CMI)은 비장 세포 배양에서 Th1/Th2 사이토카인 유도(ELISA로 분석) 및 다기능 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응(FACS로 분석, 10색 세포내 사이토카인 염색)을 측정함으로써 그룹당 4마리 마우스의 서브세트로 평가되었다. 또한, 사량체 염색 및 세포 표면 표현형을 수행하여 인플루엔자 특이적 기억 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도를 결정한다. 독감 특이적 체액 반응은 혈청(IgG1 및 IgG2a)에서 측정하고 HI 역가는 기능적 항체 역가를 측정하는 데 사용된다. 백신 접종 및 대조군 마우스에 A/HK/68(H3N2)의 5 LD50을 챌린지하고 21일 동안 생존, 체중 증가/감소 및 질병 중증도 스코어링에 대해 평가하였다. 이러한 뮤린 연구에서 반응원성은 체중 감소, 증상 점수 및 주사 부위 침윤물의 평가에 의해 측정된다. <0.05의 p 값 차이는 유의미한 것으로 간주된다. 분산 분석(ANOVA) 및 Tukey ANOVA는 강력한 통계적 유의성을 입증하기 위해 모든 데이터에 대해 수행된다.
작업 3B.3: 이종 바이러스 보호 연구
동종 보호 연구에 이어, 이종 또는 이종아형 보호의 마우스 모델에서 주요 어주번트 조합을 평가하기 위해 동일한 연구 설계가 사용된다. 마우스는 상기 설명한 대로 면역화되지만(작업 3B.2) 다른 HA/NA 유형(예를 들어 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))의 인플루엔자 바이러스 균주로 챌린지된다. 이러한 챌린지 모델에서 관찰된 보호는 HA 단백질의 줄기 영역과 같이 두 균주에 공통적인 항원을 포함하도록 항원 특이적 반응의 확장을 제안한다. 이러한 확장을 확인하기 위해, B 세포 수용체(BCR) 및 T 세포 수용체(TCR) 서열에 대한 연구가 수행된다.
결과 및 대안적 접근
이전에 언급한 바와 같이, 증가하고 있는 논문 보고서에서 백신 매개 면역의 크기를 시너지적으로 증가시킬 수 있고 생성된 다운스트림 적응 면역 반응의 유형을 변경함으로써 이러한 백신의 효능을 향상시킬 수 있는 다양한 TLR 작용제의 조합을 인용하고 있다. 인플루엔자 바이러스 챌린지 보호에 대한 어주번트 조합이 본원에 기술되어 있다.
실시예 3
백신 항원으로서의 인플루엔자 혈구응집소(HA)
줄기 항체를 광범위하게 중화하기 위한 전략은 하기를 포함한다: 1) 헤드리스(headless) HA에 중점을 두고 전체 헤드 도메인을 제거하여 줄기 도메인을 보다 "가용성(available)"으로 만들어, 줄기 도메인에 대한 항체 반응을 유도, 2) H1, H3 또는 조합된 인플루엔자 B 바이러스로부터 줄기 도메인으로 구성된 키메라 HA를 사용.
하나의 항원으로 면역하면 두 번째 유사한 항원에 대한 강력한 면역 반응을 차단하는 것으로 알려져 있다("항원 원죄(original antigenic sin)"). 이는 반복 감염(인플루엔자) 또는 항원 진화(HIV, 말라리아)가 있는 감염병에 중요하다. 인플루엔자의 경우 바이러스 혈구응집소(HA)의 머리 부분에 대해 만들어지는 주요 중화 항체. 다른 바이러스 균주는 항체와 약하게 교차 반응하지만 새로운 에피토프에 대한 반응을 억제하는 다른 HA 헤드 영역을 가지고 있다. HIV의 경우 바이러스의 돌연변이된 에피토프는 에피토프 억제 때문에 항체 또는 T 세포를 자극하지 않는다.
백신에서 항원 원죄의 메커니즘은 에피토프 배제(기존 항체, 특히 점막 IgA는 모든 항원 제시 세포(APC)로부터 백신을 보호함; 수지상 세포 접근(기억 B 세포는 감소된 DC 활성화 및 T 세포 면역화로 새로운 백신 내재화); 및/또는 T 세포 경쟁(기억 B 세포가 활성화되어 사이토카인, 보조 인자 및 항원 로딩된 DC와 반응할 수 있는 포획 T 세포를 소비)에 기인할 수 있다.
백신에서 항원 원죄를 극복하기 위해 용량을 증량하거나(예를 들어 대량 백신 접종(60세 이상 환자는 인플루엔자 백신 3배 접종)); 캡슐화하거나(수지상 세포에 백신을 우선적으로 전달하는 에멀전 또는 리포좀에 백신을 넣음(Shingrix, 대상 포진용 수두 백신)); 및/또는 수지상 세포 활성화제(TLR 작용제는 백신 항원에 대한 활성화된 T 세포의 수 다양성을 증가시킬 수 있음)를 사용할 수 있다.
마우스 모델에서 항원 원죄를 연구하기 위해 다음을 사용할 수 있다: 합텐-단백질 접합체(합텐은 오브알부민 및 KLS와 같은 단백질 항원에 결합될 수 있는 플로레세인 또는 DNP와 같은 작은 분자임); 또는 비접합 단백질 항원을 사용한 사전 면역화는 합텐-단백질 접합체를 사용한 면역화에 대한 항체 반응을 억제함. 이 모델에서 인플루엔자의 경우, 한 바이러스 균주에 대해 인플루엔자 HA와 같은 한 단백질로 과면역하고, 다른 균주의 부분적으로 교차 반응성인 HA로 부스트한 다음, 인식된 에피토프, 넥스젠(nexgen) RNA 시퀀싱의 클론 다양성, 및 중화 능력을 포함하여 두 번째 HA에 대한 B 및 T 세포 면역 반응을 분석하고, 이후 생체내 보호화 상관 관계가 있다.
Shingrix는 사용시 재구성되는 완충 식염수 내 디올레오일 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤로부터 만든 리포좀 제제 내 재조합 VSV 당단백질 E, 살모넬라의 노노포스포릴 지질 A, 및 QS-21 사포닌 분자이다. Shingrix와 유사한 인플루엔자 백신을 만들기 위해, 상기 백신은 리포좀 제제 내 단백질 항원, 두 가지 어주번트를 갖는다.
실시예 4
연간 인플루엔자 백신의 효과는 인플루엔자 바이러스의 항원 드리프트로 인해 여전히 10~60%로 평가된다. 합성 TLR4 및 TLR7 작용제(1Z105 및 1V270)는 각각 Th2 및 Th1 매개 항-헤마글루티닌 항체 생산을 향상시켰다. 1Z105 및 1V270과의 조합은 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 보호하기 위해 균형 잡힌 Th1/Th2 면역을 촉진했다. 어주번트 효능을 향상시키기 위해, 1Z105에 대한 구조 활성 관계 연구가 수행되었으며 2B182C가 확인되었다; 인비트로에서 더 높은 효능을 가진 유도체. 모델 항원 오브알부민을 사용한 생체내 백신 접종 연구에서, 2B182C는 더 높은 혈청 IgG1 수준을 유도하고 1V270에 의해 유도된 항원 특이적 IgG2a의 방출을 부가적으로 향상시킨다. 또한, 2B182C 및 1V270의 리포좀 제제는 세포독성 및 반응성을 감소시키고 Th1 및 Th2 매개 항체 생산을 모두 향상시키는 활성을 유지하였다. 비활성화된 A/California/04/2009 (H1N1) (pdm09)를 항원으로 사용한 생체 내 백신 접종 연구에서, 리포좀 조합 어주번트는 T 여포 보조 세포, 배중심 B 세포 및 항체 분비 형질 세포의 개체군을 증가시켰다. 드레이닝(draining) 사타구니 림프절에서 B 및 T 림프구의 차세대 서열 분석은 조합된 어주번트가 면역글로불린 중쇄(IGH) 유전자의 B 세포 클론형을 증가시키고, B 세포 클론 및 TCR 클론성을 공유함을 보여주었다. 이러한 발견은 상기 조합이 항원 특이적 Th1 면역 반응을 향상시키는데 기여했음을 시사했다. 마지막으로, 조합 어주번트를 포함하는 백신은 폐 손상이 적으면서 치명적인 동종 바이러스 챌린지로부터 보호되었다.
방법
마우스
암컷 6-8주령 BALB/c 마우스는 Jackson labolatory(Bar Harbor, MA)에서 구입했다. 오브알부민, 또는 생 바이러스 챌린지가 필요하지 않은 항원으로 비활성화된 인플루엔자 바이러스를 사용한 동물 실험은 캘리포니아 대학의 샌디에이고 동물 시설(University of California San Diego Animal Facility)에서 수행되었다. 인플루엔자 챌린지 연구는 6주령 암컷 BALB/c 마우스(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)를 사용하여 유타 주립 대학의 동물 연구 센터에서 수행되었다. 모든 동물 실험은 UC 샌디에고 또는 유타 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 사전 승인을 받았다.
세포 및 시약
TLR4/NF-kB 리포터 세포주 HEK-BlueTM humanTLR4 및 HEK-BlueTM 뮤린 TLR4 세포는 InvivoGen(카탈로그 번호, San Diego, CA)에서 구입했다. 마우스 1차 BMDC는 C57BL/6 마우스의 대퇴골에서 채취한 골수 세포에서 준비되었다. BMDC는 10% FBS(Omega, Tarzana, CA) 및 페니실린/스트렙토마이신(100 unit/mL/100 mg/mL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)이 보충된 RPMI의 표시된 화합물로 처리되었다. 모노포스포리피드 A(MPLA), AddaVax는 InvivoGen(카탈로그 번호 San Diego, CA)에서 구입했다. 비활성화된 인플루엔자 A 바이러스[A/California/04/2009 (H1N1) pdm09](IIAV)는 BEI 리소스(# NR-49450, Manassas, VA)에서 입수했다. TLR7 작용제 1V270, TLR4 작용제 1Z105 및 2B182C를 포함하는 이의 유도체를 합성하였다. 1V270(20 mM), 2B182C(4mM) 및 1V270+2B182C(20 mM + 4mM)의 리포좀 제제는 Innimune corp. (Missoula, MT)에서 수행되었다.
TLR4/ NF-κB 리포터 세포 분석
TLR4/NF-κB 활성화는 HEK-BlueTM hTLR4 및 HEK-BlueTM mTLR4(InvivoGen)를 사용하여 평가되었다. 세포를 20시간 동안 1Z105 및 2B182C(10 mM에서 시작하는 2배 연속 희석)로 처리했다. 배양 상청액에서 NF-kB 유도성 분비 배아 알칼리 인산분해효소(SEAP) 단백질을 제조업체의 프로토콜에 따라 측정했다.
생체 내 항체 생산 평가
BALB/c 마우스는 0일과 21일에 뒷다리의 비복근에 IAV(10 ㎍/주사)와 표시된 어주번트로 근육내(im) 면역화되었다. 어주번트의 상세한 농도 및 각 처리의 동물 수는 각 그림의 범례에 설명되어 있다. 혈청을 28일째에 수집하고 항원 특이적 항체(항-HA IgG1, 항-NA IgG1, 항-HA IgG2a, 항-NA IgG2a, 항-HA IgM 및 항-NA IgM)에 대해 평가하였다. 이러한 항체에 대한 ELISA는 이전에 설명한 대로 수행되었다(참조). DMSO 제제에 대한 연구를 위해 10% DMSO를 비히클로 사용했다. 리포좀-제제의 어주번트를 사용한 실험에서, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 콜레스테롤(DOPC/Chol, 대조 리포좀)을 비히클로서 사용하였다.
BCR 및 TCR 레퍼토리에 대한 NGS 분석
면역화 프로토콜은 도 28A에 나타내었다. 간단히 말해서, 28일째에 마우스를 희생시키고 사타구니 림프절을 수확했다. RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 림프구(벌크)에서 총 RNA를 추출하고 Agilent 4200 TapeStation(Agilent, Santa Clara, CA)을 사용하여 RNA의 품질을 확인했다. 차세대 시퀀싱은 편향되지 않은 TCR 레퍼토리 분석 기술(Repertoire Genesis Inc., Osaka, Japan)을 사용하여 수행되었다.
치명적인 인플루엔자 바이러스 공격으로부터 보호를 위한 평가
BALB/c 마우스는 i.m. 0일에 IIAV(3 ug/주사)로 제제화된 1V270 및 2B182C로 백신 접종하고 21일째에 동종 또는 이종 인플루엔자 A 바이러스, A/California/04/2009(pdmH1N1) 및 A/Victoria/3/75(H3N2) 각각으로 비강내 감염시켰다. IIAV의 면역화 용량; 동물의 30-50%를 동종 바이러스 챌린지로부터 보호하는 3 μg/주사가 예비 실험에서 결정되었다. 인플루엔자 바이러스 챌린지를 위해, 마우스 그룹을 마우스당 1 Х 105(3 x LD50) 세포 배양 감염 용량(CCID50)의 인플루엔자 A/California/04/2009(H1N1pdm) 바이러스; 90-mL 현탁액에서 마우스당 5 x 102(3 x LD50) CCID50의 인플루엔자 A/Victoria/3/75(H3N2) 바이러스로 비강내 챌린지하기 전에 케타민/자일라진(50 mg/kg//5 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취했다; 모든 마우스는 연구 21일째에 바이러스 챌린지를 받았다. 인플루엔자 바이러스(H1N1pdm), 균주 명칭 175190은 Elena Govorkova 박사(감염병과, St. Jude Children's jemResearch Hospital, Memphis TN)로부터 받았다. 상기 바이러스는 마우스에서 9회의 연속 계대배양에 의해 BALB/c 마우스의 폐에서 복제되도록 적응되었다. 바이러스는 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포에서 플라크 정제되었고, 바이러스 스톡은 부화한 닭 계란에서 성장한 다음 MDCK 세포에서 성장하여 준비되었다. 인플루엔자 A/Victoria/3/75(H3N2) 바이러스는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)에서 입수했다. 이 바이러스는 처음에는 쥐에게 치명적이지는 않았지만, 감염된 동물의 폐에서 7번 연속 계대 배양 후 치명적이었다. 마우스 적응 후 MDCK 세포에서의 성장에 의해 바이러스 스톡을 제조하였다.
폐 바이러스 역가 및 폐 염증 측정
바이러스 챌린지 6일 후, 기관지폐포 세척(BAL) 절차는 혈액 수집 직후 수행되었으며, 각 동물의 사망 후 5-10분 이내에 완료되었다. 0.75mL 부피의 인산염 완충 식염수(PBS)를 기관 튜브를 통해 폐로 천천히 전달했다. 전달 직후 유체를 부드러운 흡입으로 천천히 빼내고 샘플을 -80
Figure pct00036
에 저장했다. 절차를 총 3회 반복하고 각 마우스의 세척액을 모았다. 폐 바이러스 역가를 결정하기 위해, BAL 샘플을 5분 동안 2000g에서 원심분리했다. BAL 상청액의 다양한 10배 희석액을 MDCK 세포에서 감염성 바이러스에 대해 3중으로 분석하고 바이러스 역가를 계산했다. 폐 사이토카인 수준을 측정하기 위해 제조업체의 지침에 따라 화학 발광 다중 ELISA 기반 분석을 사용하여 각 폐 세척액의 샘플(200 mL)을 MCP-1 및 IL-6에 대해 테스트했다(Quansys Biosciences Q-PlexTM Array, Logan, UT).
혈구응집 억제 역가
혈구응집 억제(HI) 역가를 위해, 혈청을 수용체 파괴 효소 II(RDE; Vibrio cholerae neuraminidase; YCC-340; Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY)로 전처리하여 삼부(three parts) 효소로 일부(one part) 혈청을 희석하고 37°C에서 18시간 동안 배양하여 비특이적 억제제를 제거했다. RDE는 후속적으로 56°C에서 45분 동안 가열을 통해 비활성화되었다. 혈청 샘플을 96웰 둥근 바닥 미세역가 플레이트(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)의 PBS에 희석했다. 혈청 희석 후, 8 HA 유닛/웰의 인플루엔자 A/CA/04/2009(H1N1pdm) 또는 인플루엔자 A/Victoria/3/75(H3N2) 바이러스와 터키(turkey) 적혈구(Lampire Biological Laboratories, Pipersville, PA)를 첨가하고(웰당 50 mL), 간단히 혼합하고, 실온에서 60분 동안 배양했다. 혈청 샘플의 HI 역가는 혈구응집이 완전히 억제된 최고 혈청 희석도의 역수(reciprocal)로 표시된다.
바이러스 중화 역가
항인플루엔자 바이러스 중화 항체 분석을 위해, MDCK 세포를 사용 24시간 전에 5% FBS를 포함하는 MEM에서(Hyclone, Logan, UT) 웰당 1x104개 세포로 96웰 플레이트에 시딩했다. 1:32 희석에서 시작하여 1:4096에서 끝나는 10 unit/mL 트립신 및 1 mg/mL EDTA를 포함하는 무혈청 배지에서 혈청 샘플의 계열 2배 희석을 준비했다. 각 혈청 희석액을 약 100 CCID50/웰 H1N1pdm 또는 인플루엔자 A/Victoria/3/75(H3N2) 바이러스를 함유하는 무혈청 배지(트립신 및 EDTA 함유)와 1:1(0.1mL) 혼합했다. 실온에서 1시간 동안 배양 후, 혈청-인플루엔자 바이러스 혼합물(0.2mL)을 MDCK 세포를 함유하는 웰에 옮기고 3일 동안 배양하였다. 항인플루엔자 바이러스 중화 항체를 세포변성(cytopathic) 효과(CPE) 억제로 측정하였다. CPE는 감염 후 3일째에 광학 현미경으로 MDCK 세포 단층을 검사함으로써 중복 샘플로부터 점수를 매겼다.
통계 분석
생체 내 연구에서 얻은 데이터는 평균의 표준 오차(SEM)가 있는 평균으로 표시되고 인비트로 데이터는 표준 편차(SD)가 있는 평균으로 표시된다. 인비트로 데이터의 경우, 투 테일드 웰치 테스트를 사용하여 두 그룹을 비교했다. 항원 특이적 항체의 경우, 면역 세포 집단에 대한 유세포 분석, BCR-seq, TCR-seq, 폐 바이러스 역가, HI 종말점 역가 및 VN 종말점 역가, Dunn의 사후 테스트와 함께 크루스컬 테스트가 적용되었다. 폐 바이러스 역가와 사이토카인/케모카인 수준 사이의 상관관계는 Spearman 순위 상관관계 테스트를 사용하여 분석되었다. 체중의 경우, 각 마우스에 대해 곡선 아래 면적을 계산하고 원웨이 ANOVA를 통계 분석에 사용했다. 로그 순위(Mantel-Cox) 테스트는 카플란 메이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선 간의 유의한 차이를 테스트하는 데 사용되었다. Prism 5 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
hIL-8, mIL-12 및 mIL-6에 대한 ELISA에 사용된 시약
시약 희석 인자 소스(Source) 카탈로그 #
포획 항체
정제된 마우스 항-인간 IL-8 250 BD 바이오사이언스 554716
정제된 랫 항-마우스 IL-12 200 BD 바이오사이언스 551219
정제된 랫 항-마우스 IL-6 100 BD 바이오사이언스 554400
항체 검출
비오틴 마우스 항-인간 IL-8 1000 BD 바이오사이언스 554718
비오틴 랫 항-마우스 IL-12 1000 BD 바이오사이언스 554476
비오틴 랫 항-마우스 IL-6 1000 BD 바이오사이언스 554402
다른 시약
스트렙타비딘, HRP 1000 써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific) 43-4323
KPL SureBlueTM TMB 퍼옥시다제 기질 세라케어(Seracare) 5120-0077
hIL-8, mIL-12 및 mIL-6에 대해 ELISA에 사용된 시약
항체 (클론) 희석 인자 소스 카탈로그 #
Anti-CD86, APC/Cy7 (GL1) 200 바이오레전드(BioLegend) 105030
Anti-CD40, PE (1C10) 200 e바이오사이언스 12-0401
Anti-CD3, BV510 (145-2C11) 200 BD 바이오사이언스 563024
Anit-CD19, FITC (1D3) 500 BD 바이오사이언스 553785
Anti-CD4, e450 (RM4-5) 1500 e바이오사이언스 48-0042
Anti-CD95, PE/Cy7 (Jo2) 500 BD 바이오사이언스 557653
Anti-CD138, APC (281-2) 200 BD 바이오사이언스 558626
Anti-GL7, Pacific Blue (GL7) 350 바이오레전드 144614
Anti-PD-1, APC (J43) 150 BD 바이오사이언스 562671
Anti-CXCR5, 비오틴 (2G8) 50 BD 바이오사이언스 551960
Anti-CD16/32 (FcR) 300 BD 바이오사이언스 553142
스트렙타비딘 PE 500 BD 바이오사이언스 554061
요오드화 프로피듐 염색 용액 400 BD 바이오사이언스 556463
염색 버퍼 BD 바이오사이언스 554657
IgGs에 대해 ELISA에 사용된 시약
시약 소스 카탈로그 #
코팅을 위한 단백질 농도
인플루엔자 A H1N1 (A/California/04/2009) 헤마글루티닌/ HA 단백질 (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼(Sino Biological) 11055-V08H
인플루엔자 A H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934) 헤마글루티닌 / HA 단백질 (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 11684-V08B
인플루엔자 A H3N2 (A/Victoria/3/1975) 헤마글루티닌 / HA1 단백질 (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 40396-V08H1
인플루엔자 A H7N7 (A/Netherlands/219/2003) 헤마글루티닌 / HA 단백질 (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 11082-V08B
인플루엔자 A H11N9 (A/mallard/Alberta/294/1977) 헤마글루티닌 / HA 단백질 (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 11704-V08H
인플루엔자 A H12N5 (A/green-winged teal/ALB/199/1991) 헤마글루티닌 / HA 단백질 (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 11718-V08H
인플루엔자 A H1N1 (A/California/04/2009) 뉴라미니다제/ NA (Fc Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 11058-V07B
인플루엔자 A H5N1 (A/Thailand/1(KAN-1)/2004) 뉴라미니다제 / NA (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 40064-V07H
인플루엔자 A H3N2 (A/Babol/36/2005) 뉴라미니다제 / NA (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 40017-V07H
인플루엔자 A H10N8 (A/duck/Guangdong/E1/2012) 뉴라미니다제 / NA 단백질 (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 40352-V07B
인플루엔자 A H7N7 (A/Netherlands/219/2003) 뉴라미니다제 / NA 단백질 (His Tag) 100 ng/mL 시노 바이오로지칼 40202-V07H
항체 Dilution factor
IgG1-AP 염소 항-마우스 2000 서던 바이오테크(Southern Biotech) 1070-04
IgG2a-AP 염소 항-마우스 2000 서던 바이오테크 1080-04
IgG-AP 염소 항-마우스 2000 서던 바이오테크 1030-04
p-니트로페닐 포스페이트 타블렛(pNPP) 시그마(Sigma) N2770
결과
1Z105 생산된 2B182C의 구조 활성 관계 연구 결과
소분자 피리미도인돌 TLR4 리간드인 1Z105에 대한 효능을 개선하기 위해 구조 활성 관계 분석을 수행했다(화학자들이 작성함). 총 56개의 화합물이 합성되었고 인간 및 뮤린 HEK TLR4 리포터 세포(각각 HEK-Blue mTLR4 및 hTLR4)에 의해 스크리닝되었다. 이러한 SAR 화합물 중에서 2B182C는 뮤린 및 인간 리포터 세포 모두에서 더 높은 TLR4 자극 효능을 갖는 유도체로 발견되었다. 2B182C의 EC50은 HEK TLR4 리포터 세포를 사용하여 조사되었고 1Z105의 EC50과 비교되었다(도 21B). 뮤린 및 인간 TLR4 리포터 세포에서 2B182C의 EC50은 1Z105의 EC50과 비교하여 각각 5.8배 및 870배 증가했다. 이러한 데이터는 SAR 연구가 더 높은 TLR4 자극 효능, 특히 인간 TLR4 효능을 나타내는 유도체를 성공적으로 산출했음을 나타낸다.
TLR4 작용제 2B182c는 항원 특이적 IgG1 생산을 향상시킨다
TLR4 작용제 1Z105는 Th2 매개 IgG1 생성을 유도하고 TLR7 작용제 1V270은 인플루엔자 바이러스에 대한 Th1 세포 면역을 강화했다(Goff et al., J. Virol., 89:3221 (2015); Goff et al., J. Virol., 91:e01050 (2017)). 1V270과 조합하면 인플루엔자 백신 어주번트로서 TLR4 작용제 2B182C의 효능이 향상될 수 있다는 가설을 세웠다. 따라서, 1V270와 함께 2B182C가 1Z105와 1V270을 포함하는 콤보 어주번트와 비교하여 생체내 어주번트성(adjuvanticity)을 개선하는지 여부를 조사하였다.
효과적인 조합된 백신 애쥬번트를 개발하기 위해, 불활성화된 인플루엔자 A 바이러스[A/California/04/2009 (H1N1) pdm09](IIAV)를 항원으로 사용하여 1Z105 및 2B182C의 효능과 단일 제제로서의 최적 용량을 비교하였다. BALB/c 마우스를 0일 및 21일에 TLR4 작용제, 1Z105 또는 2B182C와 혼합된 IIAV로 면역화하고 28일에 채혈하였다(도 22A). 혈청은 바이러스 표면의 2개의 당단백질인 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)에 대한 항체(IgM, IgG1 및 IgG2a)에 대해 ELISA로 평가되었다. 1Z105 및 2B182C를 DMSO에 용해시키고 DMSO의 최종 농도는 10%였다. 결과는 200 nmol/주사로서 더 높은 용량을 갖는 2B182C가 HA 및 NA 둘 다에 대한 IgG1 항체를 유의하게 증가시킴을 보여주었다(도 22B). 흥미롭게도, 1Z105가 아닌 2B182C는 항-NA 특이적 IgG2a를 향상시켰다(도 12C). 항-HA IgM 수준은 2B182C에 의해서만 약간 증가했다(도 24A).
2B182C 및 TLR7 작용제 1V270과의 조합은 항원 특이적 IgG1 및 IgG2a 모두를 증가시켰다
다음으로 항체 생산에 대한 이러한 TLR4 작용제의 공동-어주번트 효과를 1 nmol/주사 용량으로 TLR7 작용제 1V270과 조합했을 때 분석되었으며, 이는 Th1 면역 반응을 향상시키는 IgG2a 생산을 유도하는 것으로 보고되었다(Goff et al., 2017). 결과는 1V270 단독으로 항-HA IgG2a 생성만을 유도한 반면, 2B182C와 조합했을 때 HA 및 NA 둘 다에 대한 IgG1 및 IgG2a 항체가 유의하게 유도되었음을 나타낸다. 이는 이러한 화합물이 부가적인 방식으로 작용할 수 있음을 시사한다(도 23A 및 23B). 반면, 1Z105는 1V270에 의해 유도된 IgG2a 생산을 향상시키지 못했다. 1V270+2B182C 그룹의 동물들은 더 많은 양의 IgG1 및 IgG2a를 모두 생산했고 면역 균형은 Th1 매개 IgG2a 생산 쪽으로 기울어져, 치료가 Th1 면역 반응을 향상시키는 데 기여함을 시사한다(도 23C). 1V270 및 2B182C와의 조합은 항-HA IgM 생산에 중간 정도의 효과를 나타냈다(도 24B).
종합하면, 200 nmol/주사 2B182C와 1 nmol/주사 1V270의 조합은 인플루엔자 바이러스 감염에서 보호에 바람직한 항원 특이적 IgG1 및 IgG2a 및 Th1-왜곡 면역 반응을 가장 높은 양으로 유도했다. 따라서 이 조합은 다음 제제로 선택되었다.
세포독성을 감소시키는 2B182C 업그레이드된 리포좀 제제
상기 결과를 감안할 때 1/200의 1V270/2B182C 비율(TLR4/TLR7) [1nmol/주사(20 mM) 1V270 및 200 nmol/주사 (4mM) 2B182C]이 사용되었다. 백신에 대한 반응을 유지하면서 원치 않는 세포독성 및 반응성을 방지하기 위해, 백신 어주번트의 개발에서 화합물의 제제를 조정하는 것이 중요할 수 있다. 따라서, 1V270 및 2B182c는 Inimmune Corp(Missoula, MT)에 의해 리포좀으로 제제화되었다. 제제화된 화합물의 활성을 마우스 1차 BMDC에서 시험하였다. 이들 제제화된 화합물은 DMSO-제제 화합물과 유사한 수준의 IL-12 분비를 유지하였다(도 25A). DMSO-2B182C 또는 DMSO-1V270+2B182C에 의해 유도된 세포독성은 리포좀 제제에 의해 유의하게 개선되었다. (도 25B). 주사된 부위에서 근육의 H&E 염색에 의한 조직학적 분석이 도 25C에 나타나 있다. 화합물 투여 후 혈청의 다중 사이토카인/케모카인 분석이 도 25D에 제시되어 있다.
리포좀 1V270 및 2B182C는 항-HA 및 항-NA IgG1 및 IgG2a 생산을 시너지적으로 향상시켰다
도 22A에 기재된 바와 같이 프라임-부스트 요법을 사용하여 생체내 화합물의 어주번트성을 평가하였다. 28일째에 수거된 혈청을 ELISA에 의해 항원 특이적 항체에 대해 평가하였다. 결과는 lipo-2B182C가 DMSO-2B182C와 일치하는 더 높은 수준의 IgG1을 유도함을 나타낸다(도 26A). DMSO-1V270과 달리, 리포-1V270 단독은 IgG2a 생산을 촉진하지 않았다(도 26B). 각각의 작용제에 의한 IgG2a에 대한 이러한 최소 효과에도 불구하고, 2개의 어주번트가 조합될 때 항원 특이적 항체 생산이 시너지적으로 향상되었다(도 26B). 한편, 리포좀 비히클, 1V270, 2B182C 및 1V270+2B182C에 의해 유도된 총 IgG 수준은 비슷했다(도 26C). 항원 특이적 IgM 수준은 어떤 치료에도 영향을 받지 않았다(그림 27). DMSO 제제에서 관찰된 경향과 일치하게, 리포좀 조합된 어주번트는 Th1 편향 면역 균형을 발전시켰다(도 26D).
제제화된 1V270 + 2B182C 향상된 항체 분비 반응
제제화된 어주번트가 항원 특이적 항체 분비를 촉진하는 B 세포의 활성화를 유도하는지 여부를 조사하기 위해, 사타구니 림프절의 림프구에서 Tfh 세포, GC B 세포, 형질모세포 및 형질 세포에 대해 유세포 분석을 사용하여 조사하였다. 상기 설명한 면역화 프로토콜을 사용하고 사타구니 림프절의 림프구를 28일째에 수거하고 유세포 분석으로 분석했다(도 28A 및 28B). 그 결과, CD3+ CD4+ PD-1+ CXCR5+ 세포로 확인된 Tfh 세포의 비율이 lipo-1V270+2B182C에 의해 크게 증가하였다(도 28B 및 도 29). 또한, 조합된 어주번트는 GC B 세포(CD3-CD19+ CD95+ GL7+)의 비율을 증가시켰다. 증가된 형질모세포 및 형질 세포가 lipo-1V270+2B182C로 백신 접종된 마우스에서 관찰되었다. 결과는 조합된 어주번트가 단일 제제에 비해 GC 반응을 향상시킨다는 것을 시사한다.
1V270 + 2B182C로 콤보 어주번트에 의해 증가된 BCR 다양성 및 TCR 클론성
조합된 어주번트가 BCR의 다양성에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, IGH 유전자에 대해 차세대 염기서열 분석을 수행했다(Repertoire Genesis Inc를 통함, Osaka, Japan). 프라임-부스트 IIAV 모델이 사용되었고 사타구니 림프절의 림프구가 28일째에 수집되었다(도 30A). BCR 서열 분석은 Pielou 지수로 표시된 총 판독값으로 정규화된 BCR 다양성이 lipo-1V270+2B182C에 의해 유의하게 증가되었음을 보여주었다(도 30A). IgG 유전자의 클론형은 공유된 클론이 있는지 확인하고 Jaccard 지수를 계산하기 위해 그룹 내 두 마우스 간의 IGH 클론을 비교하는 유사성 분석에 의해 분석되었다; Jaccard 인덱스; J (A, B) = (도 30B). IGH, IGHG1 및 IGHG2A에 대한 Jaccard 지수는 lipo-1V270+2B182C에 의해 유의하게 증가되었으며, 이는 이 그룹 내에서 두 마우스 간에 공유되는 클론이 증가되었음을 나타낸다. 또한, lipo-1V270+2B182c 그룹에서는 6개의 클론(0.03%)이 3마리의 마우스에서 공유되었다. 이러한 결과는 리포좀 조합된 어주번트가 총 IGH 및 IGHG2A에서 BCR 다양성을 증가시켰음을 시사한다. 이는 조합된 어주번트의 면역화 후 더 높은 IgG2a 수준과 일치한다. 조합된 어주번트로 면역화된 그룹에서 검출된 공통 클론은 항원의 우세한 에피토프(들)를 인식할 수 있다. 제제화된 어주번트가 항원에 대한 f TCR 클론성을 증가시키는데 기여하는지 여부를 확인하기 위해 TCR 시퀀싱을 수행하였다. 예상대로, 조합된 어주번트와 lipo-2B182C는 TCRa 및 TCRb의 클론성을 증가시켰다(도 30C). 종합적으로, lipo-1V270+2B182C에서 동물은 더 높은 BCR 다양성과 TCR 클론성을 보였다. 이것은 조합된 어주번트에 의해 Th1 반응이 향상된다는 데이터를 뒷받침할 수 있다.
Lipo-2B182C 및 lipo-1V270+2B182C는 동종 인플루엔자 바이러스로부터 마우스를 보호한다.
조합된 어주번트는 다양한 BCR 및 TCR의 높은 클론성을 수반하는 Th1 편향된 면역 반응을 유도했다. 이러한 다양성이 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응의 지표일 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 제제화된 1V270 및 2B182c를 동종 및 이종 인플루엔자 바이러스 챌린지 모델에서 테스트했다. IIAV + 리포좀 1V270, 2B182C 또는 1V270+2B182C로 백신 접종된 Balb/c 마우스는 백신 접종 후 21일째에 동종 (H1N1) 인플루엔자 바이러스로 비강내 챌린지되었다(단일 용량). 추가 21일 동안 마우스의 체중 및 생존을 모니터링하였다(도 31A). Lipo-2B182C 및 lipo-1V270+2B182C는 바이러스 감염 후 체중 감소를 유의하게 억제하였다(도 31B). 또한, lipo-1V270은 90% 보호를 보였고, lipo-2B182C 및 lipo-1V270+2B182C는 동종 인플루엔자 바이러스에 대해 마우스를 완전히 보호하였다(도 31C). 마우스의 생존이 폐의 바이러스 역가와 상관 관계가 있는지 평가하기 위해, 세척액에서 바이러스 역가에 대해 기관지폐포 세척을 수행했다. 결과는 lipo-1V270+2B182C가 6일째에 폐에서 바이러스 역가를 효과적으로 억제함을 나타내었다(도 31D). 인간의 경우 치명적인 폐 손상 및 폐렴과 상관관계가 있는 기도 상피 세포에서 사이토카인 및 케모카인(예를 들어 MCP-1, IL-6 등)의 상향 조절이 있다(Gurczynski et al., Mucosal Immun., 12:518 (2019); Zhou et al., Nature, 499:500 (2013)). 따라서 우리는 Quansys multiplex ELISA를 사용하여 폐액에서 전염증성 사이토카인(IL-6)과 케모카인(MCP-1) 수준을 평가했다. 결과는 조합된 리포좀 어주번트가 MCP-1 및 IL-6 생성 모두를 유의하게 억제함을 보여주었다(도 31E). 전염증성 사이토카인의 수준은 폐 바이러스 역가와 상관관계가 있었다 [MCP-1(P<0.0001, Spearman r= 0.83), IL-6(P<0.0001, Spearman r= 0.79)(도 31F). 이러한 경향은 lipo-1V270+2B182C 군에서 더욱 강화되었다. 이러한 결과는 조합된 어주번트가 감염 후 바이러스 진입 및 증식을 억제함으로써 폐 손상을 감소시킴을 시사하였다. 상기 보호가 혈구응집 억제 역가(HI) 및 바이러스 중화 역가(VN)와 관련되었는지 평가하기 위해, 면역화 후 21일째에 혈청을 수집하고 HI 및 VN에 대해 조사하였다(도 31A). 비면역 그룹과 비교하여 증가된 HI 역가는 lip-1V270, lipo-2B182C 및 lipo-1V270+2B182C에서 20마리의 마우스 중 19마리의 마우스에서 관찰되었다(도 31G). 또한, lipo-2B182c 및 lipo-1V270+2B182C는 리포좀 대조군과 비교하여 상당히 더 높은 VN을 유도하였다(도 31H). VN 역가는 폐 바이러스 역가와 음의 상관관계가 있었다(P<0.01, Spearman r= -0.59, 도 27I). 이종 인플루엔자 바이러스 A/Victoria3/75(H3N2)에 대한 보호는 동종 챌린지 실험과 동일한 프로토콜을 사용하여 평가되었다(도 31A). 리포좀 대조군과 비교하여 체중 감소, 생존 및 폐 바이러스 역가에는 유의한 차이가 없었다(도 32A-C). 종합적으로, 제제화된 조합된 어주번트는 비록 이종 보호에는 충분하지 않았지만 유해한 염증 효과 없이 동종 H1N1 바이러스에 대해 상당한 보호를 나타내었다.
BCR-seq에서 전체 IgG 유전자의 공유된 클론 수
#클론(%) 비히클 Lipo-1V270 Lipo-2B182C Lipo-1V270+2B182C AddaVax
# 클론 (%)
공유되지 않음(Not shared) 11418 (99.7) 14387 (100.0) 9157 (99.9) 18037 (99.5) 19019 (99.7)
2마리 마우스 31 (0.27) 4 (0.03) 10 (0.11) 90 (0.50) 51 (0.27)
3마리 마우스 0 (0) 0 (0) 1 (0.01) 6 (0.03) 0 (0)
4마리 마우스 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
5마리 마우스 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
BALB/c 마우스를 0일 및 21일째에 제제화된 어주번트와 함께 IIAV로 백신 접종하였다. IGH 유전자에 대한 차세대 시퀀싱을 위해 사타구니 림프절의 림프구를 28일째에 수확했다. IGH 클론형의 유사성 분석을 수행했다. 그룹 내에서 2, 3, 4 및 5마리의 마우스에서 공유되고 공유되지 않은 클론의 수가 표시되었다. 6개의 클론이 조합 그룹의 3마리 마우스 간에 공유되었다.
실시예 5
1V270(TLR7 리간드) 및 2B182C(TLR4 리간드)의 리포좀 공동 캡슐화로 항체 에피토프 확장
인플루엔자 바이러스 감염에 대한 보편적인 백신은 주요 항원 분자인 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)의 광범위한 에피토프를 인식하는 항체의 유도를 필요로 한다. 따라서, 조합된 어주번트(1V270 및 2B182C)에 의해 유도된 항체의 에피토프 퍼짐(spreading) 및 교차 반응성을 조사하였다. BALB/c 마우스(n=5-10)는 별개의 리포좀들에서 1V270(Lipo-1V270), 2B182C(Lipo-2B182C), 공동 캡슐화된 리포좀 1V270+2B182C[Lipo-+(1B18870+2B182C), 및 첨가-혼합된 Lipo-1V270 및 Lipo-2B182C의 리포좀 제제로 혼합된 비활성화된 바이러스로 면역화되었다. 블랭크(blank) 리포좀을 대조군으로 사용하고, 0일(프라임) 및 21일(부스트)에 면역화를 수행하고 28일째에 혈청을 수집했다.
에피토프 퍼짐은 HA 펩티드 ELISA에 의해 평가되었다. 인플루엔자 A(H1N1)pdm09 바이러스의 중첩 HA 펩타이드 어레이(139개 펩타이드)는 BEI Resources에서 입수했다. 5개의 연속 펩티드(총 28개 풀)로 구성된 풀링된 펩티드를 ELISA 플레이트에 플레이팅하였다. 1:200 희석된 혈청을 OD405-570에 의해 각 펩티드 풀에 대한 반응성에 대해 테스트했다. 각 혈청의 OD를 히트맵에 표시하고(도 38A), 개별 동물의 평균 OD를 비교했다. 공동-캡슐화된 리포좀 1V270+2B182C[Lipo-(1V270+2B182C)]로 백신 접종된 마우스의 혈청은 단일 리간드 또는 혼합물(admix)의 리포좀 제제와 비교하여 상당히 더 높은 OD를 나타냈다(도 38B). 이러한 데이터는 Lipo-(1V270+2B182C)가 광범위한 HA 에피토프를 인식하는 항체 반응을 유도함을 나타낸다. Lipo-(1V270+2B182C)에 의해 유도된 광범위한 HA 에피토프의 인식이 인플루엔자 바이러스 감염의 다른 하위 유형의 교차 보호와 관련이 있는지 여부를 테스트하기 위해 ELISA를 통해 다양한 하위 유형의 HA 및 NA에 대한 항체의 교차 반응성을 테스트했다. (도 39 및 40). 다른 계통발생(phylogenic) 거리에 속하는 하위 유형 HA 및 NA. 공동 캡슐화된 Lipo-(1V270+2B182C)로 면역화된 마우스의 IgG의 기하 평균 역가(GMT)는 리포좀 단일 리간드, 또는 첨가-혼합된 2개의 별개 리포좀과 비교하여, 그룹 1의 HA(H1, H11, H12)뿐만 아니라 그룹 2의 HA(H3 및 H7)에서도 높은 반응성을 나타냈다. 확장된 반응성은 NA의 다른 하위 유형에서도 관찰되었다. 요약하면, IIAV와 Lipo-(1V270+2B182C)로 백신 접종된 동물에서 생산된 항체는 HA 및 NA의 다른 하위 유형에 대해 고도로 교차 반응성이었다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 전술한 명세서에서 본 발명은 이의 특정한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었고, 많은 세부사항이 예시의 목적으로 제시되었지만, 본 발명이 추가적인 실시예에 영향을 받기 쉽고 본원에 설명된 특정 세부 사항은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고 상당히 변경될 수 있음은 당업자에게 명확할 것이다.

Claims (44)

  1. 유효량의 TLR4 작용제 및 TLR7 작용제를 포함하는 리포좀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 면역 반응을 향상시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제가 동시에 투여되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TLR4 작용제가 하기 화학식 (II)를 갖는 방법:

    여기서 z1은 0 내지 4의 정수이고, z2는 0 내지 5의 정수이고, R5는 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R6는 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R7은 수소, 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고, 및 각각의 R8은 독립적으로 할로겐, -CN, -SH, -OH, -COOH, -NH2, -CONH2, 니트로, -CF3, -CCl3, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴임.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR7 작용제가 하기 화학식 (I), 또는 이의 호변이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물인 방법:

    여기서 X1은 -O-, -S-, 또는 -NRc-이며;
    R1은 수소, (C1-C10)알킬, 치환된 (C1-C10)알킬, C6-10아릴, 또는 치환된 C6-10아릴, C5-9헤테로사이클릭, 치환된 C5-9헤테로사이클릭이며;
    Rc는 수소, C1-10알킬, 또는 치환된 C1-10알킬이며; 또는 Rc 및 R1은 이들이 부착된 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리 또는 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
    각각의 R2는 독립적으로 -OH, (C1-C6)알킬, 치환된 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, 치환된 (C1-C6)알콕시, -C(O)-(C1-C6)알킬 (알카노일), 치환된 -C(O)-(C1-C6)알킬, -C(O)-(C6-C10)아릴 (아로일), 치환된 -C(O)-(C6-C10)아릴, -C(O)OH (카르복실), -C(O)O(C1-C6)알킬 (알콕시카르보닐), 치환된 -C(O)O(C1-C6)알킬, -NRaRb, -C(O)NRaRb (카르바모일), 할로, 니트로, 또는 시아노이며, 또는 R2는 부재하고;
    각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, 치환된 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 치환된 (C3-C8)사이클로알킬, (C1-C6)알콕시, 치환된 (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알카노일, 치환된 (C1-C6)알카노일, 아릴, 아릴(C1-C6)알킬, Het, Het (C1-C6)알킬, 또는 (C1-C6)알콕시카르보닐이며;
    여기서 상기 알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릭 기의 치환기는 하이드록시, C1-6알킬, 하이드록시C1-6알킬렌, C1-6알콕시, C3-6-사이클로알킬, C1-6알콕시C1-6알킬렌, 아미노, 시아노, 할로, 또는 아릴이며;
    n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이며;
    X2는 결합 또는 연결기이며; 및
    한 실시양태에서, Rx는 하나 또는 두 개의 카르복실산 에스테르를 포함하는 인지질임.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜이 PC, DOPC, 또는 DSPC를 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜이 콜레스테롤을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역원을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역원이 미생물 면역원인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 바이러스 또는 박테리아인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜이 하나 이상의 면역원을 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, TLR7 작용제의 양이 약 0.01 내지 100 nmol, 약 0.1 내지 10 nmol, 또는 약 100 nmol 내지 약 1000 nmol인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TLR4 작용제의 양이 약 2 내지 20 umol, 약 20 nmol 내지 2 umol, 또는 약 2 umol 내지 약 100 umol인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, TLR7 대 TLR4 작용제의 비가 약 1:10, 1:100, 1:200, 5:20, 5:100, 또는 5:200인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 주사, 근육내 투여, 비강내 투여 또는 정맥내 투여되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜이 DOPC 및 콜레스테롤을 포함하는 방법.
  17. 리포좀, TLR4 작용제 및 TLR7 작용제를 포함하는 약학적 제제(formulation).
  18. 제17항에 있어서, 상기 리포좀은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (DOPS), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (18:1 DOTAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3- PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (16:0 PEG-2000 PE), 1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-릴)아미노]라우로일]-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:1-12:0 NBD PC), 1-팔미토일-2-{12-[(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-릴)아미노]라우로일}-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0-12:0 NBD PC), 및 이의 혼합물; 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤 또는 이의 혼합물을 포함하는 제제.
  19. 제17항에 있어서, 상기 리포좀이 DOPC, 콜레스테롤 또는 이들의 조합을 포함하는 제제.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, TLR7 작용제의 양이 약 0.01 내지 100 nmol, 약 0.1 내지 10 nmol, 또는 약 100 nmol 내지 약 1000 nmol인 제제.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, TLR4 작용제의 양이 약 2 nmol 내지 20 umol, 약 20 nmol 내지 2 umol, 또는 약 2 umol 내지 약 100 umol인 제제.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, TLR7 대 TLR4 작용제의 비가 약 1:10, 1:100, 1:200, 5:20, 5:100, 또는 5:200인 제제.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, TLR7 작용제가 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 호변이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 제제:

    여기서 X1은 -O-, -S-, 또는 -NRc-이며;
    R1은 수소, (C1-C10)알킬, 치환된 (C1-C10)알킬, C6-10아릴, 또는 치환된 C6-10아릴, C5-9헤테로사이클릭, 치환된 C5-9헤테로사이클릭이며;
    Rc는 수소, C1-10알킬, 또는 치환된 C1-10알킬이며; 또는 Rc 및 R1은 이들이 부착된 질소와 함께 헤테로사이클릭 고리 또는 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
    각각의 R2는 독립적으로 -OH, (C1-C6)알킬, 치환된 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, 치환된 (C1-C6)알콕시, -C(O)-(C1-C6)알킬 (알카노일), 치환된 -C(O)-(C1-C6)알킬, -C(O)-(C6-C10)아릴 (아로일), 치환된 -C(O)-(C6-C10)아릴, -C(O)OH (카르복실), -C(O)O(C1-C6)알킬 (알콕시카르보닐), 치환된 -C(O)O(C1-C6)알킬, -NRaRb, -C(O)NRaRb (카르바모일), 할로, 니트로, 또는 시아노이며, 또는 R2는 부재하고;
    각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, 치환된 (C1-C6)알킬, (C3-C8)사이클로알킬, 치환된 (C3-C8)사이클로알킬, (C1-C6)알콕시, 치환된 (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알카노일, 치환된 (C1-C6)알카노일, 아릴, 아릴(C1-C6)알킬, Het, Het (C1-C6)알킬, 또는 (C1-C6)알콕시카르보닐이며;
    여기서 상기 임의의 알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릭 기에 치환기는 하이드록시, C1-6알킬, 하이드록시C1-6알킬렌, C1-6알콕시, C3-6-사이클로알킬, C1-6알콕시C1-6알킬렌, 아미노, 시아노, 할로, 또는 아릴이며;
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이며;
    X2는 결합 또는 연결기이며; 및
    R3은 하나 또는 두 개의 카르복실산 에스테르를 포함하는 인지질임.
  24. 제23항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 R3이 하기를 포함하며,

    여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 수소 또는 아실기이고, R13은 음전하 또는 수소이고, m은 1 내지 8이며, 여기서 물결선은 결합 위치를 나타내고, 여기서 OR12를 포함하는 탄소 원자에서의 절대 배열은 R, S, 또는 이들의 임의의 혼합물인 제제.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, m이 1이거나 또는 R11및 R12가 각각 올레오일기인 제제.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, R3의 인지질이 2개의 카르복실산 에스테르를 포함하고, 각각의 카르복실산 에스테르가 불포화, 에폭시화, 히드록실화, 또는 이들의 조합의 1, 2, 3 또는 4개의 부위를 포함하는 제제.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, R3의 인지질이 2개의 카르복실산 에스테르를 포함하고 상기 카르복실산 에스테르가 동일하거나 또는 상이한 제제.
  28. 제27항에 있어서, 인지질의 각각의 카르복실산 에스테르가 C8-C9에 불포화 부위를 갖는 C17 카르복실산 에스테르인 제제.
  29. 제27항에 있어서, 인지질의 각각의 카르복실산 에스테르가 C9-C10에 불포화 부위를 갖는 C18 카르복실산 에스테르인 제제.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, X2는 결합 또는 사슬에 1 내지 약 10개의 원자를 갖는 사슬이고, 여기서 사슬의 원자는 탄소, 질소, 황 및 산소로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 임의의 탄소 원자는 옥소로 치환될 수 있고, 여기서 임의의 황 원자는 1개 또는 2개의 옥소 기로 치환될 수 있는 제제.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)을 포함하는 제제.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포 에탄올아민이고 X2가 C(O)인 제제.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 산소인 제제.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 O이고, R1이 C1-4알콕시-에틸이고, n이 0이고, X2가 카르보닐이고, R3이 1,2-디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)인 제제.
  35. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기인 제제:
  36. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기인 제제
  37. 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, TLR4 작용제가 화학식 (II)를 포함하는 제제:

    여기서 z1은 0 내지 4의 정수이고, z2는 0 내지 5의 정수이고, R5는 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R6는 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R7은 수소, 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고, 및 R8은 독립적으로 할로겐, -CN, -SH, -OH, -COOH, -NH2, -CONH2, 니트로, -CF3, -CCl3, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴임.
  38. 제37항에 있어서, z2가 1, 2 또는 3인 제제.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, z1이 1 또는 2인 제제.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, z1이 0인 제제.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 치환 또는 비치환된 아릴인 제제.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, R6이 치환 또는 비치환된 사이클로알킬인 제제.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, R7이 치환 또는 비치환된 알킬인 제제.
  44. 제37항 내지 제39항 또는 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, z1이 1이고 R8이 치환 또는 비치환된 아릴 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴인 제제.
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