CN116847830A - 含tlr4激动剂的脂质体、其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含皂苷、甾醇、磷脂和式(I)的Toll样受体4(TLR4)激动剂的脂质体，制备脂质体的方法，包含它们的组合物及其用途，以及包含所述脂质体作为佐剂的免疫原性组合物。

Description

含TLR4激动剂的脂质体、其制备和用途
[技术领域]
本公开文本涉及可在疫苗组合物中用作佐剂的新型脂质体配制品的领域。本公开文本还涉及产生所述脂质体的方法以及所述脂质体在医学中的用途。
本公开文本还涉及包含CMV(巨细胞病毒)gB抗原、CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原和含TLR-4激动剂的佐剂的免疫原性组合物。此外，本公开文本涉及被赋予低反应原性的含CMV抗原的组合物。本公开文本还涉及用作CMV疫苗的免疫原性组合物。
[背景技术]
佐剂配制品已在疫苗组合物中使用多年，通过增强抗原向免疫细胞的呈递来帮助增强对给定抗原的免疫反应，目的是赋予针对靶向病原体的长期保护。佐剂还可用于有用的应用，以在维持疫苗的有效免疫反应水平的同时减少给定抗原的所需量。抗原的这种节约可用于在所需的可用抗原量保持不变的同时提高疫苗制造体积容量。例如，在大流行情况下，这种抗原节约可能非常有用。
一些佐剂对某些抗原具有特异性，而其他佐剂具有更广泛的作用范围，并且可有效与化学性质不同的抗原组合并针对不同种类的疾病。具有平衡Th1/Th2谱的佐剂可能具有更广泛的作用范围。
这些最近类型的佐剂具有提前制造并可快速提供给制药公司或执业医师以使其与手头广泛的抗原选择组合的优点。它们可以直接施用给有需要的个体。在大流行期间，这种特征也可能特别令人感兴趣。
在本领域公认的佐剂系统中，可以提及由GlaxoSmithKline商业化的AS01佐剂。AS01是一种基于脂质体的疫苗佐剂系统，其含有两种免疫刺激剂：TLR4激动剂3-O-去酰基-4'-单磷酰脂质A(MPL)和皂苷QS-21(WO 2007/068907 A1、EP 0 955 059 B1)。
然而，由于其在溶剂(诸如乙醇)中的溶解度低，MPL在佐剂系统中(特别是在脂质体佐剂系统中)的存在限制了可用于其生产的方法，这可能严重阻碍工业发展和扩大。此外，在配制品中获得令人满意的免疫增强或佐剂特性所需的MPL量相对较高，这使得其使用成本相当高。这些缺点必然使这些佐剂的制造更加复杂，并且也增加了其生产成本。
其他TLR4激动剂是本领域已知的，其中许多被提议作为疫苗佐剂(Fox等人,Subcell Biochem.2010；53:303-21)。作为已知的TLR4激动剂，可以提及阿片类物质，诸如丁丙诺啡、羟考酮、美沙酮、芬太尼、姜黄素、甘草甜素、紫杉醇、吗啡(Peri等人,JMedChem.2014；57(9):3612-3622)；天然脂多糖，诸如单磷酰脂质A(MPL)；或合成TLR4激动剂，诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)(Alderson等人,J Endotoxin Res.2006；12(5):313-9)、GLA-60、ER112022或ONO-4007(Peri等人,J Med Chem.2014；57(9):3612-3622)、WO2019/157509中描述的化合物或E6020(Ishizaka等人,2007,Future Drugs)。然而，鉴定在仍维持令人满意的免疫增强和佐剂化(adjuvanting)反应的同时可以容易地在脂质体中配制的TLR4激动剂具有挑战性，特别是在工业制造工艺中。
在配制意在由人类或动物使用的佐剂时另一个问题是，应使用卫生机构普遍接受的产品进行尽可能多的制备步骤。例如，应避免某些溶剂，而从制药角度来看接受度更好的其他溶剂应优先。
因此，仍然需要在免疫反应增强方面至少与市场上可用的配制品一样有效的新的配制品，诸如佐剂组合物。
还仍然需要具有良好的安全性特征且没有或具有降低的反应原性效应的佐剂组合物。
此外，需要易于制造(特别是在工业规模上)且生产成本低的免疫增强和佐剂配制品。需要能够以工业规模和低成本制造含有TLR4激动剂的基于佐剂的脂质体。还需要使用大多数卫生部门认为安全的原材料和制造中间体提供在药学上尽可能无害的佐剂配制品。
需要可用于节约抗原的佐剂。
最后，仍然需要诱导更平衡的Th1/Th2反应(特别是与本领域已知的某些佐剂配制品相比)的配制品。
本公开文本提供了这些和其他相关优点。
人巨细胞病毒(HCMV)是一种属于疱疹病毒家族的普遍存在的病毒。该病毒由包含在衣壳中的线性双链脱氧核糖核酸(DNA)组成，衣壳被被膜包围并被包封于在其表面携带糖蛋白刺突的脂质双层中。与该家族的其他成员一样，HCMV具有潜伏和再激活的特征。
在有免疫能力的宿主中，大多数HCMV感染是无症状或非常轻微的，伴有一些非特异性症状，诸如疲劳、乏力、中度发热、淋巴结病、肝肿大或肝酶轻微增加。然而，在大约10％的先前健康的个体中观察到嗜异细胞阴性单核细胞增多症。相比之下，在子宫内感染的新生儿和因AIDS免疫受抑制的成人中或在实体器官或骨髓移植的情况下，临床表现可能非常严重。
HCMV感染的患病率随着年龄的增长而增加并受社会经济因素的影响。血清学调查已显示，发展中国家和发达国家社会经济地位较低的群体的患病率较高。对于育龄妇女，HCMV血清阳性妇女的比例的范围从发达国家中高收入群体的大约50％到低收入群体的超过80％。在不同西欧国家进行的调查显示，在全球范围内，学步儿和青少年的HCMV血清患病率的范围在40％与50％之间，而在年龄较大的受试者(40岁及以上)中，HCMV血清患病率高于80％。
HCMV是发达国家先天性感染的最常见原因。先天性感染是指在新生儿出生前从母亲传播给胎儿的感染。总体而言，妊娠期的原发性HCMV感染与40％的胎儿传播风险相关。由于先天性HCMV感染，婴儿可能会出现残疾，包括智力迟钝、失明和感音神经性耳聋。在先天性感染的新生儿中，5％至10％在出生时有诸如小头畸形、脉络膜视网膜炎、颅内钙化、肝脾肿大、肝炎、黄疸、直接高胆红素血症、血小板减少症、瘀点和贫血的主要表现。在这些患有有症状的先天性HCMV疾病的新生儿中，婴儿早期的死亡率为大约10％，并且在幸存者中，50％-90％会有诸如智力迟钝、脑瘫、感音神经性听力损失或视力损害的后遗症。此外，许多患有先天性HCMV感染的婴儿在出生时无症状。尽管如此，随访研究已表明，在新生儿期通过病毒学筛查呈HCMV血清阳性且出生时无症状的婴儿中，大约15％会有诸如听力损失或中枢神经系统异常的后遗症。总体而言，每年在欧洲和美国出生的大约17,000名婴儿会有永久性后遗症。
HCMV也是器官和骨髓移植接受者和AIDS患者体内的重要病毒性病原体。HCMV血清阴性实体器官移植接受者的HCMV相关发病率接近60％。在实体器官移植中，当血清阴性患者接受HCMV阳性供体的移植物时，疾病最为严重。相比之下，在骨髓或干细胞移植中，该疾病在接受血清阴性供体细胞的HCMV血清阳性受试者中最为严重，表明HCMV感染的起源是内源性感染的再激活。HCMV在大约15％的同种异体移植接受者中引起肺炎、肝炎、胃肠道疾病、骨髓抑制和视网膜炎。除了这些直接的端器官疾病外，HCMV还已与间接影响相关，所述间接影响诸如移植物排斥、动脉粥样硬化加速和免疫抑制，它们可能导致细菌或真菌感染。
目前还没有有效的手段来预防或治疗妊娠期HCMV感染或先天性HCMV感染，或器官和骨髓移植接受者和AIDS患者的HCMV感染。
因此，HCMV疫苗的开发被认为是医学研究所疫苗优先报告中的主要公共卫生目标(Institute of Medicine(US)Committee to Study Priorities for VaccineDevelopment,Stratton KR,Durch JS,Lawrence RS编辑.Vaccines for the 21stCentury:A Tool for Decision making.Washington(DC):National Academies Press(US)；2000)。已描述了许多候选疫苗，如例如在WO 20090/37359A1、WO 2017/070613 A1或WO 2019/052975中，但到目前为止，还没有一种获得许可(Plotkin等人,Vaccines,第6版,Ed.Elsevier,2013；Schleiss等人,Cytomegalovirus vaccines,第1032-1041页；Permar等人,J Virol.2018年3月14日；92(7):e00030-18)。
具有MF59佐剂的巨细胞病毒糖蛋白B疫苗在移植接受者中进行的2期随机安慰剂对照试验中显示出有希望的结果(Griffiths等人,Lancet.2011；377(9773):1256-1263)。一项在育龄妇女中进行的2期安慰剂对照、随机、双盲试验评价了由重组HCMV包膜糖蛋白B和MF59佐剂组成的相同疫苗，与安慰剂进行比较。结果显示出在预防代HCMV的HCMV获得方面的50％的功效。然而，免疫原性结果显示，由gB/MF59配制品诱导的中和抗体(Ab)水平在施用第3剂后一个月处于峰值水平，然后迅速下降(Pass等人,N Engl JMed.2009；360(12):1191-1199)。
因此，需要具有改进的功效的CMV疫苗，特别是能够通过诱导持续免疫反应来增加中和抗体水平并诱导持久保护的疫苗。
还需要能够诱导广泛免疫反应的CMV疫苗。
需要能够诱导保护水平的中和CMV的抗体的佐剂化(adjuvanted)CMV疫苗。
需要能够诱导能够中和个体中的CMV的持久抗体的佐剂化CMV疫苗。
除了对个体健康的预期有益作用外，疫苗有时可能暂时、局部或全身地诱导反应原性效应(Hervé等人,NPJ Vaccines.2019；4:39)。这些效应反映了疫苗注射引起的炎症反应的物理表现。例如，它们可能是注射部位疼痛或硬结、发红、肿胀，甚至是全身症状，诸如发热、肌痛或头痛。这些反应原性效应可能会诱导对疫苗使用和建议的负面行为，以及对疫苗计划的低水平依从性。关于个体可能对给定疫苗具有反应原性的看法，他或她可以拒绝接种疫苗。甚至医疗保健专业人员也可以决定是否推荐疫苗。因此，可能会出现疫苗接种依从性差或个体对给定疫苗的覆盖率低，这可能会极大地影响可从疫苗接种中获得的全球有益效果。
佐剂是增强免疫反应和/或定向对抗原的反应种类(Th1与Th2)的免疫刺激剂。不利的一面是，应承认与非佐剂化疫苗相比，佐剂的类型和剂量可能会增加疫苗的反应原性(Hervé等人,NPJ Vaccines.2019；4:39)。对于相同的抗原，使用不同的佐剂可能会诱导不同水平的反应原性和不同的反应原性反应类型。例如，一项报告用不同抗原(即明矾或佐剂系统AS01B、AS01E、AS03A或AS04)配制的乙型肝炎病毒抗原(HBsAg)的研究表明，具有AS01(特别是AS01B)的配制品诱导最高的局部和泛发反应原性(Leroux-Roels等人,ClinImmunol.2016；169:16-27)。AS01存在于各种上市疫苗的配方中，并且含有TLR4激动剂3-O-去酰基-4'-单磷酰脂质A(MPL)作为佐剂。
其他TLR4激动剂是本领域已知的，其中许多被提议作为疫苗佐剂(Fox等人,Subcell Biochem.2010；53:303-21)。作为已知的TLR4激动剂，可以提及阿片类物质，诸如丁丙诺啡、羟考酮、美沙酮、芬太尼、姜黄素、甘草甜素、紫杉醇、吗啡(Peri等人,JMedChem.2014；57(9):3612-3622)；天然脂多糖，诸如单磷酰脂质A(MPL)；或合成TLR4激动剂，诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)(Alderson等人,J Endotoxin Res.2006；12(5):313-9)、GLA-60、ER112022或ONO-4007(Peri等人,J Med Chem.2014；57(9):3612-3622)、WO2019/157509中描述的化合物或E6020(Ishizaka等人,2007,Future Drugs)。
鉴定含有TLR4激动剂的佐剂具有挑战性，所述佐剂可以用于在诱导低水平的反应原性的同时配制疫苗。鉴定具有低水平的反应原性的含有CMV抗原的佐剂化疫苗具有进一步的挑战性。
因此，需要选择在仍然是良好的免疫刺激剂的同时也在受试者中诱导对疫苗的低或轻度反应原性的佐剂。
因此，除了需要针对CMV感染的有效佐剂化疫苗之外，还需要该疫苗在受试者中诱导低反应原性。
需要用于多剂量疫苗计划的佐剂化CMV疫苗(例如，具有TLR4激动剂)，无论方案计划如何，其在后续剂量下都诱导低反应原性。
需要有利于对后续剂量施用的依从性和接受度的佐剂化CMV疫苗，例如具有TLR4激动剂。
需要用于多剂量疫苗计划的佐剂化CMV疫苗(例如，具有TLR4激动剂)，其在第一剂之后的后续剂量下诱导炎症血清生物标记物的低增加，所述炎症血清生物标记物诸如C反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原、中性粒细胞计数和/或球蛋白。
本公开文本的目的是满足全部或部分这些需求。
[发明内容]
含TLR4激动剂的脂质体、其制备和用途
本公开文本涉及一种脂质体，所述脂质体包含皂苷、甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂(诸如单一类型的脂质体)，或
一种脂质体组合，所述组合包含至少两种类型的脂质体，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，
其中所述Toll样受体4(TLR4)激动剂具有式(I)：
-其中R1选自：
a)C(O)；
b)C(O)-(C1-C14烷基)-C(O)，其中所述C1-C14烷基任选地被羟基、C1-C5烷氧基、C1-C5亚烷基二氧基、(C1-C5烷基)氨基或(C1-C5烷基)芳基取代，其中所述(C1-C5烷基)芳基的所述芳基部分任选地被C1-C5烷氧基、(C1-C5烷基)氨基、(C1-C5烷氧基)氨基、(C1-C5烷基)-氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基(C1-C5烷氧基)、O(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)OH或-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)-(C1-C5)烷基取代；
c)包含C2-C15直链或支链的烷基，任选地被羟基或烷氧基取代；和
d)-C(O)-(C6-C12亚芳基)-C(O)-，其中所述亚芳基任选地被羟基、卤素、硝基或氨基取代；
-a和b独立地为0、1、2、3或4；
-d、d’、d”、e、e’和e”独立地为0、1、2、3或4；
-X1、X2、Y1和Y2独立地选自空、氧、NH和N(C(O)(C1-C4烷基))和N(C1-C4烷基)；
-W1和W2独立地选自羰基、亚甲基、砜和亚砜；
-R2和R5独立地选自：
a)C2至C20直链或支链烷基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
b)C2至C20直链或支链烯基或二烯基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
c)C2至C20直链或支链烷氧基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
d)NH-(C2至C20直链或支链烷基)，其中所述烷基任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；和
e)
其中Z选自O和NH，并且M和N独立地选自包含C2-C20直链或支链的烷基、烯基、烷氧基、酰氧基、烷基氨基和酰氨基；
-R3和R6独立地选自C2至C20直链或支链烷基或烯基，任选地被氧代基或氟取代；
-R4和R7独立地选自C(O)-(C2至C20直链或支链烷基或烯基)、C2至C20直链或支链烷基、C2至C20直链或支链烷氧基和C2至C20直链或支链烯基；其中所述烷基、烯基或烷氧基能够独立且任选地被羟基、氟或C1-C5烷氧基取代；
-G1、G2、G3和G4独立地选自氧、亚甲基、氨基、硫醇、-C(O)NH-、-NHC(O)-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-；
或G2R4或G4R7能够一起是氢原子或羟基；
或该化合物的药学上可接受的盐，
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为1:1至约1:50或约1:25至约1:35，或TLR4激动剂:皂苷的重量比为约1:10存在。
在一个实施方案中，如本文公开的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/mL。
在一些实施方案中，第一类型的脂质体可以不含TLR4激动剂。在一些实施方案中，第二类型的脂质体可以不含皂苷。
如诸位发明人令人惊讶地观察到的，并在实施例中所详述的，如本文公开的脂质体(诸如单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合被赋予了强大的免疫增强活性、Th1/Th2平衡反应，并且能够佐剂化许多抗原，包括CMV抗原、Flu抗原和RSV抗原。此外，脂质体或至少两种类型的脂质体的组合呈现能够根据简单有效的方法制造的优点。有利地，制造方法可以实现仅乙醇溶剂作为有机溶剂用于制造脂质体的步骤。此外，本发明的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合含有少量的TLR4激动剂，同时它们能够诱导强烈的佐剂效应。这种与低量TLR4激动剂相关的生产容易性导致有利的生产成本降低，并使如本文公开的佐剂可用于在疫苗生产中节约抗原。此外，与类似的佐剂(诸如AS01B)相比，脂质体或至少两种类型的脂质体的组合呈现对广泛的抗原具有更平衡的Th1/Th2效应的佐剂效应，这赋予佐剂更广泛的疫苗接种应用。此外，如实施例所示，如本文公开的包含QS7作为皂苷的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合有利地呈现良好的安全性特征和良好的佐剂化效应。
此外，诸位发明人已令人惊讶地观察到，在单一类型的脂质体中没有必要具有TLR4激动剂和皂苷，但是至少两种类型的脂质体的组合能够诱导与包含甾醇、磷脂、皂苷和Toll样受体4(TLR4)激动剂的单一类型的脂质体类似的佐剂化效应，在所述组合中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，但不包含TLR4激动剂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，但不包含皂苷。在一些实施方案中，第一类型的脂质体可以不含任何TLR4激动剂，并且第二类型的脂质体可以不含任何皂苷。
在说明书中，表述“脂质体”可以可互换地指代包含甾醇、磷脂、皂苷和Toll样受体4(TLR4)激动剂的“单一类型”脂质体，或包含(i)皂苷、甾醇和磷脂，或(ii)甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂的“第一和/或第二类型”的脂质体中的任一种，除非上下文另有规定。“脂质体类型”旨在指代由其成分(诸如甾醇、磷脂、皂苷或TLR4激动剂)的性质和量定义的脂质体。
在说明书中，第一和第二类型的脂质体旨在指代如本文所述的因其组成而不同的第一和第二类型的脂质体。
在另一个实施方案中，合适的TLR4激动剂具有式(II)：
在另一个实施方案中，合适的TLR4激动剂是式(III)的E6020：
在另一个实施方案中，脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体可以包含皂树(Quillaja saponaria)皂苷作为皂苷。
在另一个实施方案中，脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体可以包含从石碱木(Quillaja saponaria Molina)树皮中提取的皂苷作为皂苷。
在另一个实施方案中，脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体可以包含选自QS7、QS17、QS18、QS21及其组合的皂苷作为皂苷。
在另一个实施方案中，皂苷可以是QS21或QS7。
在另一个实施方案中，脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体可以包含QS21作为皂苷。
在另一个实施方案中，脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体可以包含QS7作为皂苷。
在另一个实施方案中，脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体可以包含选自以下的甾醇作为甾醇：胆固醇或其衍生物、麦角甾醇、链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)、7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)、二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)、酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)、7-烯胆烷醇(lathosterol)(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)、薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、谷甾烷醇、菜油甾醇(菜油甾-5-烯-3β-醇)、菜油甾烷醇(5a-菜油甾烷-3b-醇)、24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-亚甲基-3β-醇)、胆甾醇基十七酸酯(胆甾-5-烯-3β-基十七酸酯)、胆甾醇基油酸酯、胆甾醇基硬脂酸酯及其混合物。
在另一个实施方案中，脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体可以包含来自胆固醇或其衍生物的甾醇(诸如胆固醇)作为甾醇。
在另一个实施方案中，皂苷和甾醇可以存在于脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体中，皂苷:甾醇的重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:2，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:5。
在另一个实施方案中，适用于脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体的磷脂可以选自磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及其混合物。
在另一个实施方案中，适用于脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体的磷脂可以是选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、SOPC(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)及其混合物的磷脂酰胆碱。在一个示例性实施方案中，磷脂可以是DOPC。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于制造脂质体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解式(I)的TLR4激动剂(其在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/mL，在25℃下测量)、甾醇和磷脂，
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体，
其中在步骤(a)时、步骤b)时或步骤(b)之后添加皂苷，并且
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:3至约1:40或范围为约1:5至约1:25存在。这种方法允许获得如本文公开的单一类型的脂质体。
在一个实施方案中，在步骤b)之后，即在步骤b)获得的含有脂质体的悬浮液中添加皂苷。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于制造脂质体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解式(I)的TLR4激动剂(其在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/mL，在25℃下测量)、甾醇和磷脂，
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体。这样的方法可以允许获得如本文公开的第二类型的脂质体。
在一个实施方案中，如本文公开的用于制造脂质体的方法还可以包括在上述步骤(a)之前选择在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/mL的式(I)的TLR4激动剂的步骤。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于制造脂质体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解甾醇和磷脂，
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体，
其中在步骤(a)时、步骤b)时或步骤(b)之后添加皂苷。这样的方法可以允许获得如本文公开的第一类型的脂质体。
在一个实施方案中，如本文公开的方法的将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体的步骤(b)通过使用溶剂注入法进行。
在一个实施方案中，将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体的步骤(b)包括以下步骤：
(b1)将步骤(a)获得的溶液注入和/或稀释到水性缓冲液中，以及
(b2)除去所述有机水混溶性溶剂。
在一个实施方案中，有机水混溶性溶剂选自乙醇、异丙醇或其混合物。在一个实施方案中，有机水混溶性溶剂是仅乙醇溶剂。
在一个实施方案中，所述方法还可以包括以下步骤(c)：过滤在步骤(b)中获得的脂质体并回收平均直径小于200nm的脂质体。
可替代地，在一个实施方案中，所述方法可以包括以下步骤(c)：过滤(例如，灭菌过滤)在步骤(b)中获得的脂质体并回收过滤的脂质体。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于制造至少两种类型的脂质体的组合的方法，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，所述方法至少包括混合第一和第二脂质体的步骤。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种佐剂组合物，所述佐剂组合物包含如本文公开的至少一种脂质体(诸如单一类型的脂质体)或如本文公开的至少两种类型的脂质体的组合或通过如本文公开的方法获得的至少一种脂质体或至少两种类型的脂质体的组合。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种免疫增强剂，所述免疫增强剂包含如本文公开的至少一种脂质体(诸如单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或通过如本文公开的方法获得的至少一种脂质体或至少两种类型的脂质体的组合。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种免疫原性组合物(诸如疫苗组合物)，所述免疫原性组合物包含如本文公开的至少一种脂质体(例如，如本文公开的单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或通过如本文公开的方法获得的至少一种脂质体或至少两种类型的脂质体的组合、或如本文公开的佐剂组合物以及至少一种抗原。
在另一个实施方案中，免疫原性组合物可以包含选自细菌抗原、原生动物抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生虫抗原和肿瘤抗原的抗原。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种试剂盒(kit-of-parts)，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含如本文公开的脂质体或通过如本文公开的方法获得的至少一种脂质体或如本文公开的佐剂组合物，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含至少一种抗原。在这样的实施方案中，脂质体可以是单一类型的脂质体。佐剂组合物可以包含单一类型的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含第一类型的脂质体，其包含皂苷、甾醇和磷脂，
-包含第二类型的脂质体的第二容器，所述第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，以及
-包含第三组合物的第三容器，所述第三组合物包含至少一种抗原。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于制造免疫原性组合物(诸如疫苗)的方法，所述方法至少包括以下步骤：将如本文公开的至少一种脂质体(例如，如本文公开的单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或通过如本文公开的方法获得的至少一种脂质体(例如，如本文公开的单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或如本文公开的佐剂组合物与至少一种抗原混合。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种根据如本文公开的方法可获得的免疫原性组合物。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于佐剂化至少一种抗原的方法，所述方法至少包括以下步骤：将所述至少一种抗原与如本文公开的至少一种脂质体(例如，如本文公开的单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或通过如本文公开的方法获得的至少一种脂质体或至少两种类型的脂质体的组合或如本文公开的佐剂组合物组合。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于在有需要的个体中佐剂化针对至少一种抗原的免疫原性反应的方法，所述方法包括向所述个体施用所述至少一种抗原与如本文公开的至少一种脂质体(例如，如本文公开的单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或通过如本文公开的方法获得的至少一种脂质体或至少两种类型的脂质体的组合或如本文公开的佐剂组合物。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于在有需要的个体中诱导针对至少一种抗原的免疫反应的方法，所述方法包括以下至少一个步骤：向所述个体施用所述至少一种抗原与如本文公开的至少一种脂质体(例如，如本文公开的单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或通过如本文公开的方法获得的至少一种脂质体或至少两种类型的脂质体的组合或如本文公开的佐剂组合物。
在另一个实施方案中，在根据本发明的用于诱导免疫反应的方法中，脂质体(例如，如本文公开的单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或佐剂组合物和抗原可以同时、单独或顺序施用。在一些实施方案中，如本文公开的脂质体组合的第一和第二类型的脂质体可以同时、单独或顺序施用。
在另一个实施方案中，诱导免疫反应的方法还可以包括增加所述个体的细胞因子和/或趋化因子反应。在一些实施方案中，诱导免疫反应的方法可以包括选自以下的细胞因子和/或趋化因子的增加：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IFN-γ、IP-10、MCP-1、MIP-1β、KC和/或TNF-α。在另一个实施方案中，诱导免疫反应的方法可以包括IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-17的增加。
含CMV抗原的佐剂化免疫原性组合物及其用途
根据其目的之一，本公开文本涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物至少包含：
-一种CMV gB抗原；
-一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原；和
-一种佐剂，其包含：
-至少一种包含皂苷、甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂的脂质体，或
-至少两种类型的脂质体的组合，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂。
根据其另一个目的，本公开文本涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物至少包含：
-一种CMV gB抗原；
-一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原；和
-一种佐剂，其包含：
-至少一种包含皂苷、甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂的脂质体，或
-至少两种类型的脂质体的组合，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，
其中所述Toll样受体4(TLR4)激动剂具有式(I)：
-其中R1选自：
a)C(O)；
b)C(O)-(C1-C14烷基)-C(O)，其中所述C1-C14烷基任选地被羟基、C1-C5烷氧基、C1-C5亚烷基二氧基、(C1-C5烷基)氨基或(C1-C5烷基)芳基取代，其中所述(C1-C5烷基)芳基的所述芳基部分任选地被C1-C5烷氧基、(C1-C5烷基)氨基、(C1-C5烷氧基)氨基、(C1-C5烷基)-氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)OH或-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)-(C1-C5)烷基取代；
c)包含C2-C15直链或支链的烷基，任选地被羟基或烷氧基取代；和
d)-C(O)-(C6-C12亚芳基)-C(O)-，其中所述亚芳基任选地被羟基、卤素、硝基或氨基取代；
-a和b独立地为0、1、2、3或4；
-d、d’、d”、e、e’和e”独立地为0、1、2、3或4；
-X1、X2、Y1和Y2独立地选自空、氧、-NH-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-和-N(C1-C4烷基)-；
-W1和W2独立地选自羰基、亚甲基、砜和亚砜；
-R2和R5独立地选自：
a)C2至C20直链或支链烷基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
b)C2至C20直链或支链烯基或二烯基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
c)C2至C20直链或支链烷氧基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
d)-NH-(C2至C20直链或支链烷基)，其中所述烷基任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；和
e)
其中Z选自O和NH，并且M和N独立地选自包含C2-C20直链或支链的烷基、烯基、烷氧基、酰氧基、烷基氨基和酰氨基；
-R3和R6独立地选自C2至C20直链或支链烷基或烯基，任选地被氧代基或氟取代；
-R4和R7独立地选自C(O)-(C2至C20直链或支链烷基或烯基)、C2至C20直链或支链烷基、C2至C20直链或支链烷氧基和C2至C20直链或支链烯基；其中所述烷基、烯基或烷氧基能够独立且任选地被羟基、氟或C1-C5烷氧基取代；
-G1、G2、G3和G4独立地选自氧、亚甲基、氨基、硫醇、-C(O)NH-、-NHC(O)-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-；
或G2R4或G4R7能够一起是氢原子或羟基；
或该化合物的药学上可接受的盐，
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为约1:50至约1:1或约1:35至约1:25，或TLR4激动剂:皂苷的重量比为约1:10存在。
佐剂由如本文所述的一种单一类型的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合组成。
在一些实施方案中，第一类型的脂质体可以不含TLR4激动剂。在一些实施方案中，第二类型的脂质体可以不含皂苷。
在一个示例性实施方案中，本公开文本中考虑的CMV是人巨细胞病毒(HCMV)。gB抗原和CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原可以来自HCMV。
如实施例部分所示，令人惊讶地观察到，与其他含HCMV的佐剂化免疫原性组合物相比，如本文公开的含有HCMV抗原和如本文公开的佐剂(SPA14)的免疫原性组合物能够引起持久的中和抗体。
此外，如本文公开的佐剂化免疫原性组合物呈现比含有相同抗原但使用AS01佐剂系统作为基准佐剂的组合物更低的反应原性效应，诸如用炎症血清生物标记物(诸如CRP、中性粒细胞计数或球蛋白)所测量(实施例4)。此外，如本文公开的免疫原性组合物显示出在第二剂下比在初免剂量下呈现甚至更低的反应原性效应。此外，如本文公开的免疫原性组合物在诱导中和抗体方面显示出与AS01佐剂化组合物一样有效。
本文给出的结果表明，如本文公开的免疫原性组合物可用作针对CMV感染的疫苗，因为它结合了免疫原性效率和低反应原性。因此，这种免疫原性组合物将有利于患者在多剂量方案中接受后续剂量施用的行为和疫苗计划依从性。
此外，诸位发明人已令人惊讶地观察到，至少两种类型的脂质体的组合能够诱导与包含甾醇、磷脂、皂苷和Toll样受体4(TLR4)激动剂和hCMV抗原的单一类型的脂质体类似的佐剂化效应，在所述组合中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，但不包含TLR4激动剂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，但不包含皂苷，每种类型都包含hCMV抗原，诸如gB和五聚体。此外，如实施例所示，如本文公开的包含QS7作为皂苷的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合有利地呈现良好的安全性特征和与hCMV抗原的良好佐剂化效应。
根据一个实施方案，如本文公开的免疫原性组合物可以包含选自以下的CMV gB抗原：全长CMV gB抗原、缺失跨膜结构域的至少一部分的截短的CMV gB抗原、基本上缺失所有跨膜结构域的截短的CMV gB抗原、缺失细胞内结构域的至少一部分的截短的CMV gB抗原、基本上缺失所有细胞内结构域的截短的CMV gB抗原以及基本上缺失跨膜结构域和细胞内结构域两者的截短的CMV gB抗原。
根据一个示例性实施方案，CMV gB抗原可以是gBdTM抗原。
根据另一个示例性实施方案，来自五聚体复合抗原的CMV gH抗原可以缺失了跨膜结构域的至少一部分或基本上所有跨膜结构域。
根据另一个示例性实施方案，来自五聚体复合抗原的CMV gH抗原可以包含由CMVUL75基因编码的全长gH多肽的胞外域。
根据一个实施方案，CMV gB抗原和CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原可能是如本文公开的免疫原性组合物中存在的唯一CMV抗原。
根据一个实施方案，TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/ml。
根据一个示例性实施方案，TLR4激动剂可以具有式(II)：
根据另一个示例性实施方案，TLR4激动剂可以具有式(III)：
根据一个实施方案，皂苷可以是皂树皂苷。
根据另一个实施方案，皂苷是从石碱木树皮中提取的。
在另一个实施方案中，皂苷可以选自QS7、QS17、QS18、QS21及其组合。皂苷可以是QS7或QS21。
根据另一个实施方案，皂苷可以是QS21。
根据另一个实施方案，皂苷可以是QS7。
根据一个实施方案，甾醇可以选自胆固醇或其衍生物、麦角甾醇、链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)、7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)、二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)、酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)、7-烯胆烷醇(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)、薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、谷甾烷醇、菜油甾醇(菜油甾-5-烯-3β-醇)、菜油甾烷醇(5a-菜油甾烷-3b-醇)、24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-亚甲基-3β-醇)、胆甾醇基十七酸酯(胆甾-5-烯-3β-基十七酸酯)、胆甾醇基油酸酯、胆甾醇基硬脂酸酯及其混合物。
根据另一个实施方案，甾醇可以选自胆固醇或其衍生物，特别是胆固醇。
根据一个实施方案，皂苷和甾醇可以以皂苷:甾醇的重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:2，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:5存在。
根据一个实施方案，磷脂可以选自磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及其混合物。
根据另一个实施方案，磷脂可以是选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、SOPC(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)及其混合物的磷脂酰胆碱。
根据一个实施方案，如本文公开的免疫原性组合物可用作CMV疫苗，诸如HCMV疫苗。
根据一个实施方案，如本文公开的免疫原性组合物可以用于在用于诱导针对CMV的中和抗体的方法中使用，所述方法包括向受试者施用至少第一剂和第二剂的所述组合物，所述至少第一剂和第二剂相隔至少一个月施用，其中所述第二剂向所述受试者诱导的反应原性低于所述第一剂，所述反应原性用至少包括以下步骤的方法测量：(a)将选自CRP、球蛋白和纤维蛋白原的至少一种生物标记物掺入(i)在从已施用所述第一剂的所述组合物并在施用所述第二剂的所述组合物前的所述受试者中取出的第一血液样品中以获得所述生物标记物的第一测量量，和(ii)在从已施用所述第二剂的所述组合物的所述受试者中取出的第二血液样品中以获得所述生物标记物的第二测量量，以及(b)将所述第一测量量与所述第二测量量进行比较，其中所述比较提供关于由所述施用的组合物引起的反应原性的有用信息。
在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中至少一种生物标记物的测量量增加可以指示反应原性组合物。在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中不存在至少一种生物标记物的测量量增加可以指示没有或具有减少的反应原性组合物。
根据一个实施方案，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含如本文公开的佐剂，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含如本文公开的至少一种CMVgB抗原和至少一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含如本文公开的第一类型的脂质体或通过如本文公开的方法获得的至少一种单一类型的脂质体或如本文公开的佐剂组合物，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含如本文公开的至少一种CMVgB抗原和至少一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。在这样的实施方案中，脂质体可以是单一类型的脂质体。
根据一个实施方案，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含第一类型的脂质体，其包含皂苷、甾醇和磷脂，
-包含第二类型的脂质体的第二容器，所述第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，以及
-包含第三组合物的第三容器，所述第三组合物包含如本文公开的至少一种CMVgB抗原和至少一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。
根据一个实施方案，公开了一种用于在受试者中诱导针对CMV的免疫反应的方法，所述方法包括以下至少一个步骤：向所述受试者施用如本文公开的至少一种免疫原性组合物。
根据另一个实施方案，如本文公开的方法可以包括间隔至少一个月向所述受试者施用第一剂和第二剂的所述组合物，其中所述第二剂诱导的反应原性低于所述第一剂，所述反应原性用至少包括以下步骤的方法测量：(a)将选自CRP、球蛋白和纤维蛋白原的至少一种生物标记物掺入(i)在从施用所述第一剂的所述组合物后并在施用所述第二剂的所述组合物前的所述受试者中取出的第一血液样品中以获得所述生物标记物的第一测量量，和(ii)在从施用所述第二剂的所述组合物后的所述受试者中取出的第二血液样品中以获得所述生物标记物的第二测量量，以及(b)将所述第一测量量与所述第二测量量进行比较，其中所述比较提供关于由所述施用的组合物引起的反应原性的有用信息。
在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中至少一种生物标记物的测量量增加可以指示反应原性组合物。在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中不存在至少一种生物标记物的测量量增加可以指示没有或具有减少的反应原性组合物。
[附图说明]
图1：E6020溶液(●)和MPL溶液(◆)在乙醇中的相对浊度单位(RNU)(纵坐标)随UV96孔微板上以下渐增的乙醇浓度(横坐标)的变化：0.5、1.0、2.0和10mg/ml。
图2：在施用后48h在以下情况下(横坐标轴从左到右)经由流式细胞术在PTE系统(模块化免疫体外构建体-外周组织等效物)中测量的细胞活力(％)(纵坐标)：模拟条件(M-模拟)，存在100ng/mL LPS(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，目录号L8643，Millipore Sigma，马塞诸塞州伯灵顿)和10μg/mL R848(目录号TLRL-R848，InvivoGen，加利福尼亚州圣迭戈)的混合物，存在SPA14-8(以1:40、1:400、1:4000和1:40000稀释)，存在QS21脂质体(SPA14-0)(以1:40、1:400、1:4000和1:40000稀释)，以及存在E6020-Eq-1:40。将每名供体的模拟条件归一化为100％，并且针对该值计算处理条件。条表示几何平均值±95％CI；n＝8-20名供体。
图3：在施用后48h在以下情况下(横坐标轴从左到右)经由流式细胞术在PTE系统中测量的CD86阳性APC(抗原呈递细胞)的量(HLA-DR+CD11c+CD86+％)(纵坐标)：模拟条件(M-模拟)，存在100ng/mL LPS(来自铜绿假单胞菌，目录号L8643，Millipore Sigma，马塞诸塞州伯灵顿)和10μg/mL R848(目录号TLRL-R848，InvivoGen，加利福尼亚州圣迭戈)的混合物，存在SPA14-20(以1:20、1:40、1:80和1:160稀释)，以及存在SPA14-8(以1:20、1:40、1:80和1:160稀释)。条表示几何平均值±95％CI；n＝8-20名供体。方差分析与图基事后检验。模拟相比于SPA14-20，1:20：****；模拟相比于SPA14-8，1:20：****；SPA14-20相比于SPA14-8：NS(****指示p值<0.05)。
图4：免疫兔血清中的HCMV中和抗体反应。在D15、D24和D36在不存在补体的情况下上皮细胞MRC-5上的μPRNT50(A)以及在D24和D36在存在补体的情况下成纤维细胞ARPE-19上的μPRNT50(B)。用gB+五聚体(●)、gB+五聚体+SPA14(0μg E6020)gB+五聚体+SPA14(1μg E6020)/>gB+五聚体+SPA14(2μg E6020)/>gB+五聚体+SPA14(5μg E6020)和gB+五聚体+AS01B(■)将兔免疫两次(D0、D21)。(参见实施例1和9)。
图5：在施用以下(从左到右)后D35在小鼠血清中QIV(0.1和0.5μg HA)针对A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)毒株获得的HAI滴度(纵坐标)：SPA14+0.1μg HAAS01B+0.1μg HA/>SPA14+0.5μg HA/>AS01B+0.5μg HA仅0.1μg HA/>和仅0.5μg HA/>(横坐标)。
图6：在施用以下(从左到右)后D35在小鼠血清中QIV 0.5μg HA针对HK/2014毒株、Michigan/2015毒株、Brisbanne/08毒株、Singapore/2016毒株和Colorado/2017毒株获得的HAI滴度(纵坐标)：含SPA14或AS01B的佐剂化配制品和仅/>QIV 0.5μgHA(横坐标)。/>
图7：在施用以下(从左到右)后D35在小鼠血清中QIV 1μg HA针对Michigan/2015(H1N1)毒株和Brisbanne/08毒株获得的HAI滴度(纵坐标)：含SPA14或AS01B的佐剂化配制品和仅/>QIV 1μg HA(横坐标)。
图8：响应于用和/>佐剂化配制品免疫IFNγ、IL-5、TNFα、MCP-1、KC和IL-6分泌的增加。在免疫后6h在免疫小鼠血清中在存在以下(从左到右)的情况下细胞因子/趋化因子的量(pg/mL)(纵坐标)：无抗原(放血前)、仅/>(Fzone)、仅/>(Fblok)、仅SPA14、Fzone+SPA14、Fblok+SPA14、AS01B、Fzone+AS01B和Fblok+AS01B(横坐标)。
图9：通过ELISPOT测量的在加强免疫后两周(第35天)免疫小鼠脾细胞中的Th1(IFNγ)/Th2(IL-5)细胞因子分泌。在施用以下(从左到右)后的比率Th1/Th2(纵坐标)：仅Fluzone(○)、Fluzone+SPA14(■)、Fluzone+AS01B(●)、仅Flublok(△)、Flublok+SPA14(▼)和Flublok+AS01B(▲)(横坐标)。
图10：对人CMV病毒株的佐剂化gB加五聚体中和抗体反应。在D0和D21不用佐剂、用SPA14或用AS01B(横坐标)向8只C57BL/6小鼠肌内施用后，在D20和D35在没有额外补体下在ARPE-19上皮细胞系上(A)和在有额外补体下在MRC-5成纤维细胞细胞系上(B)测量的人BADrUL131-Y4 CMV病毒株中和滴度(PRNT50)(纵坐标)。小鼠数据显示为每组的散点图和中和滴度的几何平均值(GMT)。图基调整和单因素方差分析(p<0.05)
图11：免疫小鼠脾细胞中分泌hCMVgB和五聚体IgG1和IgG2c的B细胞。
在D0和D21用非佐剂化hCMV gB加五聚体疫苗、用SPA14佐剂化hCMV gB加五聚体或AS01B佐剂化hCMV gB加五聚体向C57BL/6小鼠肌内施用后，在D35测量的hCMV gB特异性IgG1和IgG2c分泌B细胞(A和B)以及hCMV五聚体特异性IgG1和IgG2c分泌B细胞。(A)每106个脾细胞的gB特异性IgG1和IgG2c分泌B细胞频率。(B)对gB具特异性的分泌IgG1和IgG2c的B细胞的比率。(C)每106个脾细胞的五聚体特异性IgG1和IgG2c分泌B细胞频率。(D)对五聚体具特异性的分泌IgG1和IgG2c的B细胞的比率。条＝几何平均值，散点＝个体小鼠反应，(A)和(C)中的虚线＝反应者截止值，(B)和(D)中的虚线＝平衡Th1/Th2比率＝1。图基调整和单因素方差分析(p<0.05)
图12：免疫小鼠脾细胞中T细胞反应的表征。
在D0和D21用非佐剂化hCMV gB加五聚体疫苗、用SPA14佐剂化hCMV gB加五聚体和AS01B佐剂化hCMV gB加五聚体向C57BL/6小鼠肌内施用后，在D35测量的hCMV gB特异性IFN-γ和IL-5分泌细胞(A和B)以及hCMV五聚体特异性IFN-γ和IL-5分泌细胞。(A)gB特异性IFNγ分泌细胞频率(每106个脾细胞)。(B)每106个脾细胞的gB特异性IL-5分泌细胞频率。(C)对gB具特异性的分泌IFNγ和IL-5的细胞的比率。(D)每106个脾细胞的五聚体特异性IFNγ分泌细胞频率。(E)每106个脾细胞的五聚体特异性IL-5分泌细胞频率。(F)对五聚体具特异性的分泌IFNγ和IL-5的细胞的比率。条＝几何平均值，散点＝个体小鼠反应，(A)、(B)、(D)和(E)中的虚线＝反应者截止值，(C)和(F)中的虚线＝平衡Th1/Th2比率＝1。图基调整和单因素方差分析(p<0.05)。
图13：SPA14增强接种pre-F-铁蛋白疫苗的NHP血清中的F特异性IgG ELISA反应。显示了每组的个体猴数据。虚线＝定量限。
对于以下四只不同的猕猴，在施用pre-F-铁蛋白+SPA14(左图)或仅pre-F-铁蛋白(右图)后随时间(以天数计)(横坐标)的F特异性IgG滴度(血清)(纵坐标)：猕猴#1(●)、猕猴#2(■)、猕猴#3(▲)和猕猴#4(▼)。
图14：对pre-F-铁蛋白的RSV-A2中和抗体反应。在第0天和第28天不用佐剂或用SPA14对四只食蟹猴(猕猴#1(●)、猕猴#2(■)、猕猴#3(▲)和猕猴#4(▼))进行肌内疫苗接种后，在没有补体下(A)和在有补体下(B)随时间(以天数计)(横坐标)的RSV-A2中和滴度(PRNT60)(纵坐标)。显示了每组的个体猴数据。虚线＝定量限。(方差分析**P值<0.01)。
图15：pre-F-铁蛋白+SPA14在NHP中诱导针对RSV B毒株的交叉中和抗体。在不用佐剂或用SPA14对四只食蟹猴(猕猴#1(●)、猕猴#2(■)、猕猴#3(▲)和猕猴#4(▼))进行肌内疫苗接种后，在没有补体下随时间(以天数计)(横坐标)的RSV-A2中和滴度(PRNT60)(纵坐标)。显示了每组的个体猴数据。虚线＝定量限。
图16：免疫猕猴PBMC中的F特异性IgG记忆B细胞ELISpot反应。在第0天和第28天用经或未经SPA14佐剂化的pre-F-NP对食蟹猴进行肌内疫苗接种后，在基线、第119天和第161天的F特异性记忆B细胞ELISpot结果。(A)F特异性记忆IgG分泌细胞/106个细胞。(B)F特异性记忆IgG分泌细胞/总IgG分泌细胞％。条＝几何平均值；虚线＝反应者截止值；方差分析**P值<0.01。
图17：在疫苗接种后猕猴中细胞免疫反应的表征。免疫猕猴PBMC中在D7(第1剂后7天)和D35(第2剂后7天)的(A)F-特异性IFNγELISpot反应和(B)F特异性IL-2ELISpot反应。**P值<0.01。条＝几何平均值；虚线＝反应者截止值。
图18：表示用从注射盐水缓冲液(△)或用免疫原性组合物免疫的小鼠获得的血清在存在补体的情况下对上皮细胞系ARPE-19进行的微噬斑减少中和试验(μPRNT)的结果，所述免疫原性组合物包含缓冲液(例如，PBS pH 7.4，NaCl 140mM；--▼--)中的20μg/剂HCMVgB+20μg/剂HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131A，或用SPA14(▼)、AF04(◆)、AF03或AS01E(□)配制(参见实施例1和2)。在第0天、第21天和第221天(第7个月)向动物注射免疫原性组合物。横坐标轴给出血液取样日，即第19天(D)，第1个月(M)、M2、M3、M4、M5、M6、M7和M8；并且纵坐标轴给出μPRNT中和抗体滴度(log10)。
图19：对gB和五聚体具特异性的中和抗体滴度。图A：在不存在补体的情况下上皮细胞MRC-5上的中和抗体。图B：在存在补体的情况下成纤维细胞ARPE-19上的中和抗体。在第1个月和第8个月测量中和抗体(当与AF03相比时，*p值<0.05，**p值<0.001)。从用免疫原性组合物免疫的小鼠获得血清，所述免疫原性组合物包含缓冲液(例如，PBS pH 7.4，NaCl140mM)中的20μg/剂HCMV gB+20μg/剂HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131A，用SPA14、AF04、AF03或AS01E佐剂化(参见实施例1和2)。在第0天、第21天和第221天(第7个月)向动物注射免疫原性组合物。
图20：在CMV五聚体刺激后在第1个月、第7个月和第8个月通过ELISPOT测量的分泌IFN-γ(图A)和IL-5(图B)的细胞频率。从用免疫原性组合物免疫的小鼠获得血清，所述免疫原性组合物包含缓冲液(例如，PBS pH 7.4，NaCl 140mM)中的20μg/剂HCMV gB+20μg/剂HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131A，用SPA14、AF04、AF03或AS01E佐剂化(参见实施例1和2)。在第0天、第21天和第221天(第7个月)向动物注射免疫原性组合物。
图21显示了QS21或QS7(0.8μM至100μM)或柠檬酸盐缓冲液(用作对照)对绵羊红细胞的溶血作用。
图22A、图22B、图22C和图22D显示了用CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)免疫的小鼠中的hCMVgB和五聚体IgG1和IgG2c诱导反应，所述CMV gB和CMV五聚体用以下配制：含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(“QS21 LIP”(0:200μg/mL))、含有E6020且不含QS21或QS7的DOPC-Chol脂质体(“E6020 LIP”(20:0μg/mL))、含有QS21的SPA14(含有5μgQS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体(“SPA14”(20:200μg/mL))、含有QS7的SPA14样配制品(含有5、15或45μg QS7和0或0.5μgE6020/剂的DOPC-Chol脂质体)(“QS7 LIP”(0:200μg/mL)、(0:600μg/mL)或(0:1800μg/mL)，“LIP[QS7+E6020 20]”(20:200μg/mL)、(20:600μg/mL)或(20:1800μg/mL))。
图23A和图23B显示了用CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)免疫的小鼠中诱导的IgG1/IgG2c反应比率，所述CMV gB和CMV五聚体在以下中配制：含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(“QS21 LIP”(0:200))、含有E6020且不含QS21或QS7的DOPC-Chol脂质体(“E6020 LIP”(20:0))、含有QS21的SPA14(含有5μg QS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体(“SPA14”(20:200))和含有QS7的SPA14样配制品(含有5、15或45μg QS7和0或0.5μgE6020/剂的DOPC-Chol脂质体(“QS7 LIP”(0:200)、(0:600)或(0:1800)，“LIP[QS7+E602020]”(20:200)、(20:600)或(20:1800))。
图24显示了用CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)免疫的小鼠中诱导的血清中和滴度反应，所述CMV gB和CMV五聚体在以下中配制：含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(“QS21 LIP”(0:200))、含有E6020且不含QS21或QS7的DOPC-Chol脂质体(“E6020 LIP”(20:0))、含有QS21的SPA14(含有5μg QS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体(“SPA14”(20:200))和含有QS7的SPA14样配制品(含有5、15或45μg QS7和0或0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体(“QS7 LIP”(0:200)、(0:600)或(0:1800)，“LIP[QS7+E6020 20]”(20:200)、(20:600)或(20:1800))。
图25A和图25B显示了用CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)免疫的小鼠中诱导的IFN-γ和IL-5分泌反应比率，所述CMV gB和CMV五聚体在以下中配制：含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(“QS21 LIP”(0:200))、含有E6020且不含QS21或QS7的DOPC-Chol脂质体(“E6020 LIP”(20:0))、含有QS21的SPA14(含有5μg QS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体(“SPA14”(20:200))和含有QS7的SPA14样配制品(含有5、15或45μg QS7和0或0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体[请确认](“QS7LIP”(0:200)、(0:600)或(0:1800)，“LIP[QS7+E6020 20]”(20:200)、(20:600)或(20:1800))。
图26A和图26B显示了用CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)免疫的小鼠中的hCMVgB和五聚体IgG1和IgG2c诱导反应，所述CMV gB和CMV五聚体用以下配制：含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(“QS21 LIP”(0:200))、含有E6020且不含QS21的DOPC-Chol脂质体(“E6020 LIP”(20:0))、含有QS21的SPA14(含有5μg QS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体(“SPA14h20”(20:200))以及“QS21 LIP”和“E6020 LIP”的组合(“QS21 LIP”+“E6020LIP”)，其中QS21和E6020以与SPA14中相同的剂量注射。
图27A和图27B显示了用CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)免疫的小鼠中诱导的IgG1/IgG2c反应比率，所述CMV gB和CMV五聚体在以下中配制：含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(“QS21 LIP”(0:200))、含有E6020且不含QS21的DOPC-Chol脂质体(“E6020 LIP”(20:0))、含有QS21的SPA14(含有5μg QS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体)以及“QS21 LIP”和“E6020 LIP”的组合(“QS21 LIP”+“E6020 LIP”)，其中QS21和E6020以与SPA14中相同的剂量注射。
图28A和图28B显示了用CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)免疫的小鼠中诱导的IFN-γ和IL-5分泌反应比率，所述CMV gB和CMV五聚体在以下中配制：含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(“QS21 LIP”(0:200))、含有E6020且不含QS21的DOPC-Chol脂质体(“E6020 LIP”(20:0))、含有QS21的SPA14(含有5μg QS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体)以及“QS21 LIP”和“E6020 LIP”的组合(“QS21 LIP”+“E6020 LIP”)，其中QS21和E6020以与SPA14中相同的剂量注射。
图29A和图29B显示了用从用CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)免疫的小鼠获得的血清在不存在补体的情况下对上皮细胞系MRC5(B)和在存在补体的情况下对ARPE-19(A)进行的微噬斑减少中和试验(μPRNT)的结果，所述CMV gB和CMV五聚体在以下中配制：含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(“QS21 LIP”(0:200))、含有E6020且不含QS21的DOPC-Chol脂质体(“E6020 LIP”(20:0))、含有QS21的SPA14(含有5μg QS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体)以及“QS21 LIP”和“E6020 LIP”的组合(“QS21 LIP”+“E6020LIP”)，其中QS21和E6020以与SPA14中相同的剂量注射。
[具体实施方式]
定义
本说明书中所用的术语通常具有其在本领域中的普通含义。下文或本公开文本的别处讨论了某些术语，以在描述本公开文本主题的产品和方法时提供另外的指导。
以下定义适用于本公开文本的上下文：
除非内容另外明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”包括复数指示物。
如本文所用的术语“约”或“大约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。在一些实施方案中，术语“约”是指给定值的±10％。然而，只要所讨论的值指代不可分割的对象，如分子或一旦细分就会失去其身份的其他对象，则“约”指代不可分割的对象的±1。
应理解，本文所述的本公开文本的方面和实施方案包括“具有”、“包含”方面和实施方案，“由方面和实施方案组成”以及“基本上由方面和实施方案组成”。词语“具有”和“包含”或诸如“具有”(“has”、“having”)、“包含”(“comprises”或“comprising”)等变体应理解为暗示包含一种或多种所述要素(如物质组合物或方法步骤)，但不排除任何其他要素。术语“由……组成”暗示包含一种或多种所述要素，排除任何另外的要素。术语“基本上由……组成”暗示包含所述要素以及可能的一种或多种其他要素，其中所述一种或多种其他要素不会对本公开文本的一种或多种基本和新颖特征产生实质性影响。应理解，使用术语“包含”或等同术语的本公开文本的不同实施方案涵盖了其中该术语被替换为“由……组成”或“基本上由……组成”的实施方案。
如本文所用，关于抗原或抗原与佐剂的组合所使用的术语“免疫有效量”旨在指代当施用于受试者时有效引起针对抗原的免疫反应的量。该量可以根据各种因素而变化，所述各种因素如受试者的健康或身体状况、年龄、受试者免疫系统产生抗体的能力、所需的保护程度、含有抗原的组合物的配制品、治疗医生对医疗状况的评估。该量可以由技术人员已知的常规方法确定。
如本文所用，在免疫反应引起的背景下，术语“治疗”(“treat”)、“治疗”(“treatment”)、“疗法”(“therapy”)等是指施用或消耗如本文公开的组合物，其目的是治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进或影响疾病或障碍、病症的症状，或预防或延迟症状、并发症的发作，或以其他方式以统计学上显著的方式阻止或抑制障碍的进一步发展。
此外，如本文所用，在本公开文本的上下文中，术语“治疗”(“treat”)、“治疗”(“treatment”)等是指减轻或缓解由CMV感染介导的病理过程。在本公开文本的上下文中，在涉及本文所述的任何其他病症时，术语“治疗”(“treat”)、“治疗”(“treatment”)等是指减轻或缓解与此类病症相关的一种或多种症状。
如本文所用，关于疾病或障碍的术语“预防”(“prevent”、“preventing”)或“延迟进展”(及其语法变体)涉及例如在怀疑患有所述疾病或有患上所述疾病风险的个体中，对所述疾病或障碍的预防性处理。预防可以包括但不限于预防或延迟疾病的发作或进展和/或将疾病或障碍的一种或多种症状维持在期望水平或亚病理水平。术语“预防”不要求100％消除事件发生的可能或可能性。而是，它表示在存在如本文所述的组合物或方法的情况下，事件发生的可能性已降低。
如本文所用，术语“有效量”、“治疗有效量”和“预防有效量”是指在所考虑的疾病或障碍的治疗、预防或管理方面提供治疗益处的量。治疗有效的具体量可以由普通执业医师容易地确定并且可能根据诸如所考虑的疾病或障碍的类型和阶段、患者的病史和年龄以及其他治疗剂的施用的因素而变化。
如本文所用，术语“个体”或“受试者”或“患者”可互换使用，并且旨在指代哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些示例性实施方案中，个体或受试者是人。
在本公开文本的上下文中，表述“中和抗体”具有本领域技术人员已知的含义，并且旨在涵盖例如通过阻断病毒进入宿主细胞或通过阻断病毒在细胞之间传播而直接中和其靶病原体的抗体。中和抗体是能够诱导受试者对其病原体靶标的免疫保护的功能性抗体。本公开文本的实验部分提供了可用于确定中和抗体水平的存在和/或增加和/或量和/或中和抗体持久性的方法的一些说明。
在本公开文本的上下文中，表述“药学上可接受的载体”是指如下载体或媒介物，其对于施用于哺乳动物如人是生理学上可接受的，同时保留如本文公开的免疫原性组合物的生理活性，即其诱导具有低反应原性效应的免疫反应的能力。
术语“药学上可接受的盐”包括如本文公开的化合物的加成盐，其衍生自此类化合物与例如无毒的酸加成盐的组合。
术语“抗原”包括任何分子，例如肽、蛋白质、多糖或糖缀合物，其包含将引起免疫反应的至少一个表位和/或免疫反应针对其被引起的至少一个表位。例如，抗原是任选地在加工后诱导免疫反应的分子，所述免疫反应例如对抗原或表达抗原的细胞具有特异性。加工后，抗原可由MHC分子呈递并与T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。因此，抗原或其片段应是由T细胞受体可识别的，并且应能够在适当的共刺激信号的存在下诱导携带特异性识别抗原或片段的T细胞受体的T细胞的克隆扩增，这导致针对抗原或表达抗原的细胞的免疫反应。根据本公开文本，可以设想任何合适的作为用于免疫反应的候选者的抗原。抗原可对应于或可源自天然存在的抗原。此类天然存在的抗原可以包括或可以来源于过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染因子和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。所述抗原可以是蛋白质或肽抗原、多糖抗原或糖复合物抗原。本文中合适的抗原在本公开文本中进一步讨论。
在本公开文本和疫苗的上下文中，“反应原性”旨在指代疫苗接种后不久发生的症状子集，并且是对疫苗接种的炎症反应的物理表现。这些症状可能是局部(注射部位)或全身症状，并可能包括以下至少一种：疼痛、发红、肿胀、部位注射硬结作为局部症状和发热、肌痛、头痛或皮疹作为全身症状。疫苗或免疫原性组合物的反应原性也可以通过测量某些生物标记物(例如，球蛋白、CRP、纤维蛋白原或中性粒细胞计数)的水平以及将测量水平与参考水平比较来确定。在本公开文本的上下文中，“低反应原性”或“降低的反应原性”用于限定在接受该第一组合物剂量的个体中由用于给定治疗适应证的免疫原性或疫苗组合物引起的反应原性反应的水平，该水平低于在接受或已接受用于相同给定治疗适应证的等效剂量的第二免疫原性或疫苗组合物的同一或另一个体中引起的反应原性反应的水平，第二免疫原性在其配方方面与第一免疫原性不同。同样，“低反应原性”或“降低的反应原性”可以限定在接受该组合物剂量的个体中由用于给定治疗适应证的免疫原性或疫苗组合物引起的反应原性反应的水平，该水平低于在已接受先前相同剂量的该组合物或接受后续相同剂量的该组合物的同一个体中引起的反应原性反应的水平。反应原性反应的水平可以通过测量通常被认为是反应原性症状或生物标记物的至少一种症状或至少一种生物标记物来测定。反应原性的生物标记物可以是血液或血清样品中掺入的CRP、球蛋白或纤维蛋白原。
术语“甾醇”或“类固醇”是指由带有羟基部分的甾烷核心组成的一组脂质，该羟基部分可以是游离的或酯化的。作为具有游离羟基部分的类固醇的例子，可以列举胆固醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇和麦角甾醇。类固醇或甾醇的酯是指羧酸与类固醇的羟基的酯。除了羧基部分之外，合适的羧酸还包含饱和或不饱和、直链或支链的烷基。在一些实施方案中，烷基可以是C1-C20烷基。在其他实施方案中，羧酸可以是脂肪酸。
在本公开文本中，关于变化所使用的术语“显著”旨在意指观察到的变化是明显的和/或它具有统计学意义。
在本公开文本中，与本公开文本的特征结合使用的术语“基本上”旨在定义与该特征相关的在很大程度上类似于该特征但不完全类似于该特征的一组实施方案。与给定特征相关的一组实施方案与给定特征之间的区别使得在该组实施方案中，给定特征的性质和功能没有受到实质影响。
如本文所用，术语“免疫增强”是指具有通过激活其所施用的个体中的免疫系统成分来触发和/或增强免疫反应的能力的化合物或组合物。
在本公开文本中，术语“佐剂”或“佐剂效应”用于限定添加到含抗原的疫苗组合物中的化合物或组合物，以通过例如增强抗原向抗原特异性免疫细胞的呈递以及通过激活这些细胞来帮助触发或增强对抗原的免疫反应，目的是赋予针对靶向病原体的长期保护。
如本文所用，术语“疫苗”旨在意指针对病原体的免疫原性组合物，其被施用于受试者以诱导免疫反应，旨在保护或治疗受试者免于病原体引起的疾患。如本文公开的疫苗旨在用作预防(预防性)疫苗，以用于在感染之前施用于受试者，旨在预防或降低初始(和/或复发性)感染发生的可能性。在先天性CMV感染的情况下，如本文公开的组合物可在怀孕前用作少女和育龄妇女的预防性疫苗，以预防或降低发生CMV从母亲向胎儿或婴儿的垂直传播的可能性。
列出了如下文所述的来源、成分和组分的列表，它们的组合和混合物也被考虑并且在本文的范围内。
应理解在本说明书通篇中给出的每一个最大数值限包括每一个较低数值限，如同此类较低数值限被明确地书写在本文中一样。在本说明书通篇中给出的每一个最小数值限将包括每一个较高数值限，如同此类较高数值限被明确地书写在本文中一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落在这种较宽的数值范围内的每一个较窄数值范围，如同此类较窄数值范围都被明确地书写在本文中一样。
所有项列表，例如成分列表，旨在并且应解释为马库什组。因此，所有列表都可以被阅读和解释为“选自项的列表”的项“及其组合和混合物”。
本文引用的可以是包括在本公开文本中使用的各种成分的组分的商品名。本文的诸位发明人不意图受到任何特定商品名下的材料的限制。与以商品名引用的材料等同的材料(例如，以不同名称或参考编号从不同来源获得的材料)可以在本文的描述中被取代和使用。
Toll样受体4(TLR4)激动剂
适用于本公开文本的Toll样受体(TLR4)激动剂是式(I)的化合物：
/>
-其中R1选自：
a)C(O)；
b)C(O)-(C1-C14烷基)-C(O)，其中所述C1-C14烷基任选地被羟基、C1-C5烷氧基、C1-C5亚烷基二氧基、(C1-C5烷基)氨基或(C1-C5烷基)芳基取代，其中所述(C1-C5烷基)芳基的所述芳基部分任选地被C1-C5烷氧基、(C1-C5烷基)氨基、(C1-C5烷氧基)氨基、(C1-C5烷基)-氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)OH或-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)-(C1-C5)烷基取代；
c)包含C2-C15直链或支链的烷基，任选地被羟基或烷氧基取代；和
d)-C(O)-(C6-C12亚芳基)-C(O)-，其中所述亚芳基任选地被羟基、卤素、硝基或氨基取代；
-a和b独立地为0、1、2、3或4；
-d、d’、d”、e、e’和e”独立地为0、1、2、3或4；
-X1、X2、Y1和Y2独立地选自空、氧、-NH-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-和-N(C1-C4烷基)-；
-W1和W2独立地选自羰基、亚甲基、砜和亚砜；
-R2和R5独立地选自：
a)C2至C20直链或支链烷基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
b)C2至C20直链或支链烯基或二烯基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
c)C2至C20直链或支链烷氧基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
d)NH-(C2至C20直链或支链烷基)，其中所述烷基任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；和
e)
其中Z选自O和NH，并且M和N独立地选自包含C2-C20直链或支链的烷基、烯基、烷氧基、酰氧基、烷基氨基和酰氨基；
-R3和R6独立地选自C2至C20直链或支链烷基或烯基，任选地被氧代基或氟取代；
-R4和R7独立地选自C(O)-(C2至C20直链或支链烷基或烯基)、C2至C20直链或支链烷基、C2至C20直链或支链烷氧基和C2至C20直链或支链烯基；其中所述烷基、烯基或烷氧基能够独立且任选地被羟基、氟或C1-C5烷氧基取代；
-G1、G2、G3和G4独立地选自氧、亚甲基、氨基、硫醇、-C(O)NH-、-NHC(O)-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-；
或G2R4或G4R7能够一起是氢原子或羟基；
或该化合物的药学上可接受的盐。
式(I)的化合物的药学上可接受的盐可以是这些化合物的有机或无机碱的盐。例如，有机或无机碱可以来自以下：碱金属(诸如钠、钾和锂)的氢氧化物；碱土金属(诸如钙和镁)的氢氧化物；其他金属(诸如铝和锌)的氢氧化物；氨和有机胺，诸如未经取代或羟基取代的单、二或三烷基胺；二环己基胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基-N-乙基胺；二乙基胺；三乙基胺；单、二或三(2-羟基烷基胺)，诸如单、二或三(2-羟基乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺或三(羟基甲基)甲基胺、N,N-二烷基-N-(羟基烷基)胺(诸如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺)或三(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；以及氨基酸，诸如精氨酸和赖氨酸。
在一个实施方案中，适用于本发明的TLR4激动剂可以是如上所述的式(I)的化合物，其中
-R1是-C(O)-或-C(O)-(CH2)n-C(O)-，n是1、2、3或4，
-a、b、d、d’、d”、e、e’和e”独立地为1或2，
-X1、X2、Y1和Y2为NH，
-W1和W2为-C(O)-，
-R2和R5独立地选自任选地被氧代取代的C10-C15直链烷基、NH-(C10-C15直链烷基)，以及
其中M和N独立地为C2至C20直链烷基或烯基，
-R3和R6为C5-C10直链烷基，
-R4和R7选自氢、C(O)-(C8-C12直链烷基)或C(O)(C8-C12直链烯基)，
-G1和G3为氧或-NH(CO)-，
-G2和G4为氧。
在本公开文本的上下文中，除非在整个说明书中另有提及，否则以下术语具有以下定义：
-卤素原子：氟、氯、溴或碘原子；
-氧代：“＝O”基团；
-羟基基(hydroxyl或hydroxy group)：OH基团；
-烷基：包含(除非另有提及)1至6个碳原子的基于直链或支链饱和烃的脂肪族基团(记为“(C1-C6)-烷基”)。举例来说，可以提及但不限于：甲基、乙基、丙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基和异己基等；
-烷氧基：-O-烷基，其中烷基如先前所定义。举例来说，可以提及但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、直链仲丁氧基或叔丁氧基、异丁氧基、戊氧基或己氧基等；
-亚烷基：支链或直链的二价饱和烃基。除非另有说明，否则亚烷基包含1至6个碳原子(注为“(C1-C6)-亚烷基”)。
-亚烷基二氧基：-ORO-基团，其中R是亚烷基，如本文所定义。
-酰基：与碳基键合的羰基。
-芳基：衍生自芳环的官能团或取代基，通常是芳烃，如苯基和萘基；
-烯基：包含碳原子上的开放连接点的片段，如果从烯烃分子中去除与双键碳键合的氢原子，就会形成该片段。除非另有说明，否则烯基包含1至6个碳原子(注为“(C1-C6)-烯基”)。
-酰氧基：R-COO-，衍生自羧酸。除非另有说明，否则酰氧基包含1至6个碳原子(注为“(C1-C6)-酰氧基”)。
-烷基氨基：含有烷基和氨基，如本文所定义；
-酰氨基：含有酰基和氨基，如本文所定义；
-氨基：NH2基团；
-羰基：(C═O)基团；
-氟基：-F；
-硫醇：R-SH形式的任何有机硫化合物，其中R表示烷基，如文中所定义；
-硝基：-NO2；
-砜：限制连接到两个碳原子的磺酰基官能团。中心六价硫原子与两个氧原子中的每一个双键键合，并与两个碳原子中的每一个单键键合，通常在两个单独的烃取代基中；
-亚砜：与两个碳原子连接的亚磺酰基(SO)官能团，通常在两个单独的烃取代基中。
在一个实施方案中，合适的TLR4激动剂可以是式(II)的化合物：
在一个实施方案中，合适的TLR4激动剂可以是下式(III)的E6020：
式(II)和(III)的化合物是有效的TLR-4受体激动剂(Ishizaka等人,Expertreview of vaccines,2007,6:773-84)，因此可用于本公开文本的脂质体中，以当将脂质体与抗原(诸如细菌、病毒、真菌或寄生虫病疫苗)或肿瘤抗原(诸如癌症疫苗)共施用时用于提供免疫佐剂。
合适的TLR4激动剂可以如WO 2007/005583 A1中所述获得。
E6020的IUPAC名称是(1R,6R,22R,27R)-1,27-二庚基-9,19-二氧代-9,14,19,29-四氧代-6,22-双[(3-氧代十四烷酰基)氨基]-4,8,10,18,20,24,28-七氧杂-13,15-二氮杂-9,19-二磷酸四十烷-1-基十二烷酸二钠。其CAS号为287180-63-6。
根据本公开文本的合适的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/mL，在25℃下测量。
合适的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.5mg/mL、至少约1mg/mL、至少2mg/mL、至少4mg/mL、至少6mg/mL、至少10mg/mL、至少12mg/mL、至少15mg/mL、至少20mg/mL、至少25mg/mL或至少30mg/mL。
合适的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为约0.1至约50mg/mL、约0.2至约45mg/mL、约1至约40mg/mL、约2至约35mg/mL、约6至约30mg/mL、或约10至约25mg/mL。
合适的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)的范围为约至少约0.2mg/mL至约20mg/ml、约至少约0.5mg/mL至约15mg/ml、约至少约1mg/mL至约12mg/ml、约至少约2mg/mL至约10mg/ml、约至少约4mg/mL至约10mg/ml。
在一个示例性实施方案中，TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数为至少约10mg/mL。本文提供的溶解度参数是在约25℃和约1013hPa的大气压下测量的。
溶解度表示在给定温度和压力下，可溶解在溶剂(此处为乙醇)中的物质(此处为TLR4激动剂)的最大量。物质在特定溶剂中的溶解程度以饱和浓度来衡量，其中添加更多的溶质不会增加溶液的浓度并开始沉淀过量的溶质。
TLR4激动剂在乙醇中的溶解度可以通过本领域已知的任何方法测定。溶解度可以通过实验测量。例如，适合于确定给定TLR4激动剂(诸如根据本公开文本合适的TLR4激动剂)在乙醇中的溶解度参数的方法是通过进行浊度测定法，如下面在实施例中进一步提供的。用于测定给定TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数的其他方法可以包括Veseli等人(Drug Dev Ind Pharm.2019年11月；45(11):1717-1724)中描述的方法。
与其他可用的有机溶剂或有机溶剂混合物(如异丙醇或乙醇/异丙醇)相比，乙醇被认为是一种安全的化合物，并且其在药品制造工艺中的使用通常不会受到卫生机构的质疑。
由于所选TLR4激动剂在乙醇中的溶解度的特定展示范围，因此这些化合物可以在基于溶剂注入法的脂质体制造方法中有利地实施。这种方法具有能够在工业规模上扩大规模的优点。因此，所公开的基于脂质体的佐剂可以在工业规模上容易且成本有效地生产。
合适的TLR4激动剂可以与蛋白质或肽抗原、多糖抗原和/或糖缀合物抗原组合使用以得到免疫原性组合物，例如疫苗组合物。
如本文公开的TLR4激动剂以这样的量用于如本文公开的脂质体，诸如单一类型的脂质体或组合的第二类型的脂质体，当施用给个体时该量有效地赋予脂质体或脂质体组合(与脂质体的其他组分、或与脂质体组合的其他类型的脂质体的组分(诸如皂苷和磷脂)结合)免疫增强效应。TLR-4激动剂以这样的量用于如本文公开的脂质体，作为单一类型的脂质体或组合的第二类型的脂质体，该量有效地赋予脂质体或脂质体组合(与脂质体的其他组分、或与脂质体组合的其他类型的脂质体的组分(诸如皂苷和磷脂)结合)针对抗原的佐剂效应。
在可以包含脂质体的疫苗组合物中，TLR4激动剂的量可以为约0.5μg/ml至约200μg/ml、约1μg/ml至约150μg/ml、约1.5μg/ml至约100μg/ml、约2.0μg/ml至约50μg/ml，例如约2.5μg/ml至约20μg/ml，例如约4μg/ml至约10μg/ml的TLR4激动剂，以重量/体积计。
在一个实施方案中，TLR4激动剂与皂苷可以存在于如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体)或组合的第二类型的脂质体中，TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为约1:1至约1:500、范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:3至约1:40或范围为约1:5至约1:25。
在如本文公开的脂质体组合中，不同组分的含量，即TLR4激动剂、皂苷、甾醇或甾醇酯和磷脂可以根据脂质体类型或脂质体组合或包含脂质体的组合物表达。在一些实施方案中，不同组分的含量，即TLR4激动剂、皂苷、甾醇或甾醇酯和磷脂根据脂质体的组合或包含脂质体的组合物表达。例如，在如本文公开的脂质体组合中，当TLR4激动剂和皂苷的量以重量:重量比表示时，即指第一类型的脂质体中TLR-4激动剂的量和第二类型的脂质体中皂苷的量。作为另一个例子，在如本文公开的脂质体组合中，当TLR-4激动剂的量以重量/体积表示时，即指每体积单位含有该组合的组合物的脂质体组合中TLR-4激动剂的总量。同样例如，在如本文公开的脂质体组合中，当TLR4激动剂和例如磷脂的量以重量:重量比表示时，即指第一类型的脂质体中TLR-4激动剂的量以及第一和第二类型的脂质体中磷脂的总量。
在一个实施方案中，TLR4激动剂与皂苷可以存在于如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体)或组合的第二类型的脂质体中，TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为约1:1至约1:50或约1:25至约1:35，或TLR4激动剂:皂苷的重量比为约1:10。
TLR4激动剂与皂苷可以存在于如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体)或组合的第二类型的脂质体中，TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比为约1:10。
如实施例中所示，与其他TLR4激动剂(例如，MPLA)相比，本文公开的TLR4激动剂展示出引起免疫反应的增强功效，因此可以以与其他TLR4激动剂相比更低的量使用。因此，从相同绝对量的材料开始，使用如本文公开的TLR4激动剂，可以以比MPLA更低的成本制造更多的佐剂组合物。
此外，与其他TLR4激动剂相比，例如实施例中所示的MPL，如本文公开的并在脂质体中配制的TLR4激动剂展示出比其他TLR4激动剂或比相同的但未在脂质体中配制的TLR4激动剂更好的耐受性和更低的反应原性。
皂苷
本公开文本的脂质体(诸如如本文公开的单一类型的脂质体或组合的第一类型的脂质体)可以包括至少一种皂苷。皂苷的存在，例如与TLR4激动剂组合，赋予脂质体免疫增强效应。
皂苷可用于脂质体，诸如如本文公开的单一类型的脂质体或组合的第一类型的脂质体，与TLR4激动剂组合，以当将脂质体与抗原(诸如细菌、病毒、真菌或寄生虫病疫苗)或肿瘤抗原(诸如癌症疫苗)共施用时赋予免疫佐剂效应。
“皂苷”是指在各种植物物种中大量发现的一组表面活性两亲糖苷，其由亲水区(通常是几个糖链)与类固醇或三萜类结构的疏水区组合组成。
本领域已知(Fleck等人,Molecules.2019；24(1):171；Wang等人,ACS InfectDis.2019；5(6):974-981)，当不在胆固醇存在下配制时，皂苷(如Quillaja皂苷)可能诱导不期望的溶血效应，并且在水相中可能不稳定。此外，公认皂苷的佐剂活性与溶血效应之间可能存在相关性。在胆固醇存在下配制皂苷有利地降低溶血效应，同时维持佐剂化效应。施用后的一些不良反应可能涉及溶血效应。
本公开文本中提到的皂苷可以通过化学合成制备，如例如以下文献中所述：WangP.等人,J Org Chem,2013年11月15日；78(22):11525-11534、Kim YJ等人,J Am Chem Soc,2006；128:11906-11915或Deng K等人,Angew Chem Int Ed Engl.2008；47(34):6395-6398。
可用于本公开文本的皂苷可以是皂树皂苷。如本文所用的“皂树皂苷”旨在指代在结构和功能上与可以在石碱木树中找到的皂苷相同的皂苷，例如在石碱木树的树皮中，但其可以从另一种植物来源或通过合成手段获得。合成手段可以是化学合成手段或体外生物生产手段，例如在发酵罐中生长的分离的重组细胞中生产，或甚至在体外重建的人工细胞中生产。培养细胞可以是体外生长的分离细胞，例如植物细胞，来自石碱木树或来自另一种植物但经过修饰(重组分离细胞)以产生可以在石碱木树中找到的皂苷。
在一个实施方案中，皂树皂苷可以通过从石碱木中提取而获得。
来源于南美石碱木树的树皮的具有佐剂活性的免疫活性皂苷级分是本领域已知的。例如，QS21(也称为QA21，一种来自石碱木树的HPLC纯化级分)及其生产方法在US 5,057,540中公开(作为QA21)。皂树皂苷也被Scott等人,1985,Int Archs.AllergyAppl.Immun.,77,409公开为佐剂。
本领域技术人员已知的用于从植物中提取组分的任何方法都可用于从石碱木中提取皂苷。用于从石碱木制造皂苷提取物的方法描述于例如WO 2019/106192 A1中。皂苷可以通过Quil A的进一步分级获得，Quil A是来自石碱木树皮的皂苷级分。
皂苷可以作为混合物或纯化的单个组分使用。合适的皂苷包括QS-7、QS-17、QS-18和QS-21，均从QuilA中分级。
在一些实施方案中，脂质体可以包含选自QS-7、QS-17、QS-18、QS-21及其组合的皂苷。
在一个实施方案中，脂质体可以包含QS-21作为皂苷，也称为QS21或QA21。
在一个实施方案中，脂质体可以包含QS-7作为皂苷。QS7的溶血效应远低于QS21的溶血效应。如实施例中所示，当在本公开文本的脂质体中配制时，QS7能够诱导与QS21的佐剂化效应一样好的佐剂化效应。这可以有利地用于增加QS7的量，例如与QS21相比，以进一步增强佐剂化效应而不增加施用给个体后不良反应的可能风险。
其他合适的皂苷是木鳖(Momordica cochichinensis Spreng)皂苷。如本文所用的“木鳖皂苷”旨在指代在结构和功能上与可以在木鳖果实中找到的皂苷相同的皂苷，但其从另一种植物来源或通过如上所公开的合成手段获得。
这种皂苷由P.Wang等人(J.Med.Chem.2020,63,3290-3297)描述。
在其中可包含脂质体(作为单一类型的脂质体或作为不同类型的脂质体的组合)的疫苗组合物中，皂苷的量可以是1μg/ml至1000μg/ml，例如25μg/ml至750μg/ml，例如50μg/ml至500μg/ml的皂苷，以重量/体积计。皂苷可以以约100μg/ml的量存在于疫苗组合物中。
在一个实施方案中，皂苷与TLR4激动剂可以存在于如本文所述的脂质体中，或存在于如本文所述的脂质体组合中，皂苷:TLR4激动剂的重量:重量比的范围为约1:1至约400:1、范围为约2:1至约200:1、范围为约2.5:1至约100:1、范围为约3:1至约40:1或范围为约5:1至约25:1。
皂苷与TLR4激动剂可以存在于如本文公开的脂质体(诸如单一类型的脂质体)或组合的脂质体中，皂苷:TLR4激动剂的重量:重量比为约10:1。
皂苷如QS21或QS7与TLR4激动剂如E6020可以存在于如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体)或脂质体组合中，其量以μg/mL表达，TLR4激动剂:皂苷为约20:200、或约20:600、或约20:1800。
皂苷QS21与E6020可以存在于如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体)或组合中，其量以μg/mL表达，E6020:QS21为约20:200、或约20:600、或约20:1800，例如约20:200。
皂苷QS7与E6020可以存在于如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体)或组合中，其量以μg/mL表达，E6020:QS7为约20:200、或约20:600、或约20:1800，例如约20:600。
皂苷可以存在于如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体)或组合中，皂苷:甾醇的重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:2，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:5。
甾醇
本公开文本的脂质体(作为如本文公开的单一类型的脂质体和/或作为如本文公开的组合的第一或第二类型的脂质体)可以包括甾醇或其酯。甾醇或甾醇酯的存在可以改善脂质体的结构稳定性。
本文中可用的甾醇可以选自胆固醇或其衍生物、麦角甾醇、链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)、7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)、二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)、酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)、7-烯胆烷醇(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)、薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、谷甾烷醇、菜油甾醇(菜油甾-5-烯-3β-醇)、菜油甾烷醇(5a-菜油甾烷-3b-醇)、24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-亚甲基-3β-醇)及其混合物。
甾醇酯是指羧酸与类固醇的羟基的酯。除了羧基部分之外，合适的羧酸还包含饱和或不饱和、直链或支链的烷基。在一些实施方案中，烷基可以是C1-C20饱和或不饱和直链或支链烷基，例如C2-C18，例如C4-C16，例如C8-C12饱和或不饱和直链或支链烷基，在其他实施方案中，羧酸可以是脂肪酸。例如，脂肪酸可以是辛酸、癸酸、月桂酸、硬脂酸、十七烷酸、油酸、亚油酸或花生酸。
在一个实施方案中，甾醇酯可以是胆甾醇酯。
本文中有用的甾醇酯可选自胆甾醇基十七酸酯(胆甾-5-烯-3β-基十七酸酯)、胆甾醇油酸酯和胆甾醇硬脂酸酯及其混合物。
甾醇或其酯可以选自胆固醇或其衍生物、麦角甾醇、链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)、7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)、二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)、酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)、7-烯胆烷醇(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)、薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、谷甾烷醇、菜油甾醇(菜油甾-5-烯-3β-醇)、菜油甾烷醇(5a-菜油甾烷-3b-醇)、24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-亚甲基-3β-醇)、胆甾醇基十七酸酯(胆甾-5-烯-3β-基十七酸酯)、胆甾醇基油酸酯和胆甾醇基硬脂酸酯及其混合物。
可替代地，有用的甾醇可以是胆固醇衍生物，如氧化胆固醇。
合适的氧化胆固醇可以是25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇、20α-羟基胆固醇、6-酮基-5α-羟基胆固醇、7-酮基-胆固醇、7β,25-羟基胆固醇和7β-羟基胆固醇。氧化胆固醇可以是25-羟基胆固醇和20α-羟基胆固醇，及其混合物，例如它可以是20α-羟基胆固醇。
在一个实施方案中，甾醇或其酯可以是胆固醇、胆甾醇酯或胆固醇衍生物，例如氧化胆固醇。在一个实施方案中，甾醇或类固醇可以是胆固醇或胆甾醇酯。在另一个实施方案中，甾醇或类固醇是胆固醇。
在如本文公开的脂质体组合中，不同类型的脂质体(例如，第一和第二类型的脂质体)中甾醇的含量可以是相同或不同的。在一些实施方案中，不同类型的脂质体(例如，第一和第二类型的脂质体)中甾醇的含量是相同的。
甾醇或其酯可以以范围为约0.1mM至约10mM的摩尔量、以范围为约0.2mM至约7mM的摩尔量、以范围为约0.5mM至约5mM的摩尔量、或以范围为约0.8mM至约4mM的摩尔量、或以范围为约1mM至约3mM的摩尔量、或以范围为约1,2mM至约2mM的摩尔量存在于可包含脂质体的疫苗组合物中。在一个示例性实施方案中，甾醇或其酯可以以约1.3mM的摩尔量存在于可以包含脂质体的疫苗组合物中。
甾醇或其酯可以存在于本公开文本的脂质体(作为如本文公开的单一类型的脂质体，或作为如本文公开的组合的第一和/或第二类型的脂质体)中，皂苷:甾醇的重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:2，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:5。
磷脂
本公开文本的脂质体(作为如本文公开的单一类型的脂质体和/或作为如本文公开的组合的第一或第二类型的脂质体)可以包括至少一种磷脂。磷脂的存在可以改善脂质体的结构稳定性。
合适的磷脂可以选自磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及其混合物。
作为有用的磷脂酰胆碱的例子，可以提及DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、SOPC(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)及其混合物。
作为有用的磷脂酰乙醇胺的例子，可以提及DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2--二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、POPE(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、SOPE(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-磷脂酰乙醇胺)及其混合物。
作为有用的磷脂酸的例子，可以提及DSPA(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酸)、DPPA(1,2--二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酸)、DMPA(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酸)、POPA(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酸)、DOPA(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酸)、SOPA(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-磷脂酸)及其混合物。这些磷脂酸的药学上可接受的盐也可能是有用的。
作为有用的磷脂酰甘油的例子，可以提及DSPG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油)、DPPG(1,2--二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油)、DMPG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油)、POPG(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油)、SOPG(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-磷脂酰甘油)及其混合物。
作为有用的磷脂酰丝氨酸的例子，可以提及DSPS(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸)、DPPS(1,2--二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸)、DMPS(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸)、POPS(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸)、DOPS(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸)、SOPS(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-磷脂酰丝氨酸)及其混合物。
作为有用的磷脂酰肌醇的例子，可以提及DSPI(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰肌醇)、DPPI(1,2--二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰肌醇)、DMPI(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰肌醇)、POPI(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰肌醇)、DOPI(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰肌醇)、SOPI(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-磷脂酰肌醇)及其混合物。
磷脂可选自磷脂酰胆碱，如DSPC、DPPC、DMPC、POPC、DOPC；SOPC以及磷脂酰乙醇胺，如DSPE、DPPE、DMPE、POPE、DOPE、SOPE；及其混合物。
在一个实施方案中，合适的磷脂可以是DSPC、DOPC和DOPE，并且可以是DSPC或DOPE及其混合物。
在如本文公开的脂质体组合中，不同类型的脂质体(例如，第一和第二类型的脂质体)中磷脂的含量可以是相同或不同的。在一些实施方案中，不同类型的脂质体(例如，第一和第二类型的脂质体)中磷脂的含量是相同的。
磷脂可以以范围为约0.1mM至约20mM的摩尔量、以范围为约0.2mM至约15mM的摩尔量、以范围为约0.5mM至约10mM的摩尔量、以范围为约0.8mM至约7mM的摩尔量、以范围为约1mM至约5mM的摩尔量或以范围为约1.2mM至约2.5mM的摩尔量存在于可包含如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体，或作为组合的第一和/或第二类型的脂质体)的疫苗组合物中。在一个示例性实施方案中，磷脂可以以约1.25mM的摩尔量存在于可以包含脂质体的疫苗组合物中。
磷脂可以存在于如本文公开的脂质体(作为单一类型的脂质体，或作为组合的第一和/或第二类型的脂质体)中，皂苷:磷脂的重量:重量比的范围为1:400至1:4、范围为1:200至1:8、范围为1:100至1:10、范围为1:50至1:10、为约1:8或为约1:20。
磷脂可以存在于本公开文本的脂质体(作为如本文公开的单一类型的脂质体，或作为如本文公开的组合的第一和/或第二类型的脂质体)中，甾醇:磷脂的重量:重量比的范围为100:1至1:200、范围为50:1至1:100、范围为10:1至20:1、为约1:1、为约1:2或为约1:4。
抗原
根据一个实施方案，本公开文本的脂质体可用于佐剂化野生型或重组抗原，或其片段或亚基。所述抗原可以是蛋白质、肽、多糖和/或糖复合物。
在实施至少两种脂质体的组合的实施方案中，抗原可以存在于如本文公开的组合的第一和/或第二类型的脂质体中。
本公开文本的含脂质体/抗原的组合物的效价可以变化。效价是指组合物中抗原组分的数量，即不同抗原的数量。在一些实施方案中，组合物是单价的。它们也可以是包含一价以上的组合物，例如二价、三价或多价组合物。多价组合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种抗原或抗原部分(例如，抗原肽等)。
本公开文本的含脂质体/抗原的组合物可用作免疫原性组合物，例如疫苗组合物，以保护、治疗或治愈因接触感染原(诸如细菌、病毒、真菌、原生动物和寄生虫)引起的感染。含脂质体/抗原的组合物可用于保护、治疗或治愈癌症。
根据一个实施方案，适合本文的抗原可以选自细菌抗原、原生动物抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或肿瘤抗原。
细菌抗原
细菌抗原可能来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌抗原可以获自鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucellacanis)、羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase Negative Staphylococcus)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli)(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)、大肠杆菌0157:H7、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)、土拉氏弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、卡他莫拉菌(Moraxella catarralis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、变形杆菌属物种(Proteus sps.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcesens)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内志贺杆菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)或鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)。
病毒抗原
病毒抗原可获自腺病毒；单纯疱疹1型；单纯疱疹2型；脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒；EB病毒；人巨细胞病毒(CMV)；人类疱疹病毒8型；人乳头瘤病毒；BK病毒；JC病毒；天花；脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒；人博卡病毒；细小病毒B19；人类星状病毒；诺瓦克病毒；柯萨奇病毒；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病毒；登革病毒；西尼罗病毒；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人类免疫缺陷病毒(HIV)；甲型或乙型流感病毒；瓜纳瑞托病毒；鸠宁(Junin)病毒；拉沙病毒；马丘波病毒；萨比亚病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒(RSV)；人偏肺病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；狂犬病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；科罗病毒(Coltivirus)；汉坦病毒、中东呼吸道冠状病毒；SARS-Cov-2病毒；基孔肯雅病毒；寨卡病毒；副流感病毒；人肠道病毒；汉塔病毒；日本脑炎病毒；水疱性疱疹病毒(Vesicular exanthernavirus)；东方马脑炎病毒；或版纳(Banna)病毒。
在一个实施方案中，抗原来自甲型流感或乙型流感病毒或其组合的毒株。甲型流感病毒株或乙型流感病毒株可以与鸟、猪、马、狗、人或非人灵长类动物相关。
核酸可以编码血凝素蛋白或其片段。血凝素蛋白可以是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18或其片段。血凝素蛋白可以包含或不包含头部结构域(HA1)。可替代地，血凝素蛋白可以包含或不包含胞质结构域。
在某些实施方案中，血凝素蛋白是截短的血凝素蛋白。截短的血凝素蛋白可以包含跨膜结构域的一部分。
在一些实施方案中，病毒可选自H1N1、H3N2、H7N9、H5N1和H10N8病毒或B株病毒。
在另一个实施方案中，抗原可以来自CMV。抗原可以来自HCMV。抗原可以是五聚体(gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131)和gB的组合。在另一个实施方案中，抗原不来自CMV。抗原不来自HCMV。抗原不是五聚体(gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131)和gB的组合。
在另一个实施方案中，抗原来自冠状病毒，诸如SARS-Cov-1病毒、SARS-Cov-2病毒、或MERS-Cov病毒。
在另一个实施方案中，抗原可以来自RSV。抗原可以是preF-铁蛋白。合适的融合前RSV F抗原可以如在WO 2014/160463 A1或WO 2019/195316 A1中公开。
在一个实施方案中，适合本文的抗原可以是来自人CMV的抗原，诸如五聚体(gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131)和gB的组合；来自人流感病毒株(诸如A/H1N1、A/H3N2和乙型流感病毒株)的抗原；来自RSV的抗原，诸如处于融合前构象的F抗原(preF)，其融合或不融合到铁蛋白部分(preF-铁蛋白)。
CMV抗原
可用于根据本公开文本的免疫原性组合物中的CMV抗原可以是CMV gB抗原和CMVgH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。
在一个示例性实施方案中，CMV抗原可以来自人巨细胞病毒(HCMV)，因此可以是HCMV抗原。
CMV gB抗原
根据本公开文本的CMV gB抗原可以是诱导中和抗体的全长gB多肽或gB衍生的多肽。gB衍生的多肽是从全长gB中获得的多肽，其中引入了一些修饰，例如氨基酸添加、缺失和/或替换，并且仍然诱导针对CMV的中和抗体。作为gB衍生的多肽的例子，可以提及截短的gB抗原和/或含有一些氨基酸替换的突变gB抗原，例如在弗林蛋白酶位点中。如本文所公开的，截短的gB是指已从中全部或部分缺失一个或多个区域或结构域(诸如跨膜区)的gB。
gB多肽由CMV基因组的UL55基因编码。天然形式的gB(或gp130)的大小取决于开放阅读框(ORF)的大小，该大小可能根据所考虑的毒株而变化。例如，长2717bp的AD169毒株的ORF编码906个氨基酸的全长gB，而Towne毒株的ORF编码907个氨基酸的天然gB。这两种毒株的蛋白质序列描述于US 2002/0102562中，将其通过引用以其整体并入。天然形式的gB包含可能长22至25个氨基酸的氨基酸信号序列；随后是细胞外结构域或胞外域，其跨度为氨基酸26至706或707，并且包含内蛋白水解切割位点(弗林蛋白酶位点，RTRR，毒株AD169中的残基456-459或毒株Towne中的RTKR)，导致残基精氨酸459(或毒株Towne中的460-编号可能因毒株而异)和丝氨酸460(或毒株Towne中的461-编号可能因毒株而异)之间的切割；随后是近膜区(从氨基酸707或708到750)和跨膜结构域(从氨基酸750或751到772)；然后由跨越氨基酸772或773至906或907的胞内结构域封端(Sharma等人,Virology.2013；435(2):239-249和Burke等人,PLOS Pathogen.2015；11(10):e1005227)。加工后，由于感染细胞中发生的翻译后机制，全长gB缺失了氨基酸信号序列。用于本公开文本目的的全长gB抗原的例子包括CMV毒株Towne和AD169的全长gB，以及其他等效毒株。在gB多肽序列中已描述了几种诱导中和抗体的抗原结构域(AD)。作为示例性抗原结构域，可以提及从氨基酸残基461延伸到680的结构域。该结构域可以细分为两个不连续结构域，第一个从残基461延伸到619，第二个从残基620延伸到680(US 5,547,834)。作为鉴定的其他抗原结构域，可以列举位于氨基酸残基560至640的抗原结构域1(AD-1)(Schoppel K.等人,Virology,1996,216:133-45)或位于氨基酸残基65至84(Axelsson F等人,Vaccine,2007,26:41-6)或氨基酸残基27至84(Burke HG等人,PLoS pathogens,2015,11(10):e1005227)的抗原结构域2(AD-2)。因此，在其序列中包含与上述一个或多个抗原结构域同源的序列的多肽也可能适用于本公开文本的目的。术语“同源序列”是指与被认为是来源于Towne或AD169毒株的天然gB的抗原结构域的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列(其在US 2002/0102562中有描述)。通常，序列同源性基于至少90％的序列同一性，更具体地说，序列同源性是完全的(100％的序列同一性)。
如本文所用，与第二序列具有至少x％同一性的第一序列意味着相对于第二氨基酸序列的总长度，x％表示当两个序列通过全局比对进行最佳比对时，第一序列中与其匹配的第二序列的氨基酸相同的氨基酸的数量。当x最大时，两个序列都以最佳方式比对。比对和确定同一性百分比可以使用全局比对算法手动或自动进行，所述算法例如在Needleman和Wunsch,J.Mol Biol.,48,443-453(1970)中描述的Needleman和Wunsch算法，使用例如用于多肽序列比较的以下参数：比较矩阵：来自Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,89,10915-10919(1992)的BLOSUM62，空位罚分：8和空位长度罚分：2；以及以下用于多核苷酸序列比较的参数：比较矩阵：匹配＝+10，不匹配＝0；空位罚分：50，空位长度罚分：3。
可与上述参数一起使用的程序作为“gap”程序可从威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机集团公开获得。上述参数分别是肽比较(最终空位无罚分)和核酸比较的默认参数。
在可用于本公开文本目的的gB衍生的多肽中，可以提及如US 5,547,834中所述的gp 55。它来源于gB在内蛋白水解切割位点的切割；其氨基酸序列对应于从丝氨酸残基461延伸到C末端的序列。也可以使用截短形式的gp 55，诸如缺失全部或部分跨膜序列以及全部或部分细胞内C末端结构域的gp 55。此类gB截短抗原的例子可以是具有与gB的范围为残基461至646的氨基酸序列同源的序列的肽，或者缺失全部或部分细胞内C末端结构域的gp55，诸如具有与gB的范围为残基461至680的氨基酸序列同源的序列的肽。这种截短形式的gp 55也描述于US 5,547,834中，将其通过引用以其整体并入。
还可以使用突变形式的全长gB，其可以在内蛋白水解切割位点携带一个或多个氨基酸替换，使得后者无效。作为示例性实施方案，氨基酸替换可以位于gp130序列的残基457和460之间，例如像精氨酸460和/或赖氨酸459和/或精氨酸457。这种突变形式的全长gB可能携带整个细胞外结构域以及作为中和抗体靶标的所有结构域。这种突变形式可以二次截短全部或部分跨膜序列(从aa 752延伸到773)和/或全部或部分细胞内C末端结构域(从aa774延伸到907)中，以允许它们在作为重组蛋白产生时在宿主中分泌并易于下游纯化。只要基本上所有作为中和抗体靶标的结构域都是保守的，这种gB衍生物就是有用的。
在一个示例性实施方案中，CMV gB抗原可以选自全长CMV gB抗原、缺失跨膜结构域的至少一部分的截短的CMV gB抗原、基本上缺失所有跨膜结构域的截短的CMV gB抗原、缺失细胞内结构域的至少一部分的截短的CMV gB抗原、基本上缺失所有细胞内结构域的截短的CMV gB抗原以及基本上缺失跨膜结构域和细胞内结构域两者的截短的CMV gB抗原。
在另一个实施方案中，无论是否与前一个组合，CMV gB抗原可以包含一个或多个突变，例如内蛋白水解切割位点的氨基酸替换。
表述“基本上缺失所有细胞内结构域”或“基本上缺失所有跨膜结构域”意指所述结构域的至少80％的氨基酸序列被缺失。因此，基本上缺失所有给定结构域的截短的gB抗原可以包含所述结构域(例如，细胞内结构域)的序列的长度的0％至约20％，例如约5％至约10％。
如本文所公开的，“缺失结构域的至少一部分”意指缺失至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％但小于80％的结构域。因此，缺失给定结构域的至少一部分的截短的gB抗原可以包含所述结构域(例如，细胞内结构域)的序列的长度的约20％至约95％，例如约30％至约90％、例如约40％至约60％或例如50％。
在一个实施方案中，CMV gB抗原可以由gB多肽的胞外域组成，即缺失所有跨膜序列(可能包括近膜结构域)和所有细胞内C末端结构域的全长gB。“胞外域”是跨膜锚定蛋白的一部分，其延伸到膜外进入细胞外间隙。例如，来自AD169毒株的全长gB多肽的胞外域从氨基酸26跨越到氨基酸707。
如本文公开的CMV gB抗原还可以含有其他突变和/或缺失和/或添加。例如，CMVgB抗原可以在位于细胞外结构域的融合环1(FL1)结构域和融合环2(FL2)结构域中的至少一个中含有至少一个氨基酸缺失或取代，如EP 2 627 352中所述。可替代地，或者另外地，它可以包含前导序列的至少一部分的缺失，如EP 2 627 352中所述。如本文公开的CMV gB抗原还可以包括在疏水表面1(由氨基酸残基154-160和236-243组成的结构域)内引入糖基化位点的突变，如WO 2016/092460中所述。这种糖基化位点可以是包含N-X-S/T/C基序的N-糖基化位点，其中X可以是任何氨基酸残基(通常不是脯氨酸)。CMV gB抗原可能包含引入糖基化位点的突变。在这样的实施方案中，糖基化位点可以(1)在疏水表面2(由氨基酸残基145-167和230-252组成的结构域)内；或(2)在距离融合环1(FL1)(由氨基酸残基155-157组成的结构域)和/或融合环2(FL2)(氨基酸残基240-242)20埃以内的残基处，如WO 2016/092460中所述。
在另一个实施方案中，CMV gB抗原可以包含在C末端处至少12个残基长的异源序列，如WO 2016/092460中所述。在这样的实施方案中，gB蛋白可以是融合蛋白，其中异源序列可以在胞外域的C末端融合。
基于gB蛋白在相关病毒中的3D晶体学结构，CMV gB已被假定组装为同源三聚体，单纯疱疹病毒1(HSV-1)gB和EB病毒(EBV)gB，它们是同源三聚体(Heldwein等人,Science,2006,313:217-220；Backovic等人,PNAS,2009,106(8):2880-2885)。如本文公开的CMV gB抗原可以是三聚体形式，和/或六聚体形式(三聚体形式的二聚体)，和/或十二聚体形式(六聚体的二聚体)。例如，如本文公开的免疫原性组合物的CMV gB抗原可以基本上不是单体形式。表述“基本上不是单体形式”是指小于20％，例如小于10％，例如小于5％的CMV gB抗原可以是单体形式。
根据一个实施方案，gB抗原可以包含或由与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列组成。例如，所述gB抗原包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性的氨基酸序列。
STRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQTVSHGVNETIYNTTLKY GDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNTTQTSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKRLCMQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGNTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALVRLDAEQRAQQNGTDSLDGQTGTQDKGQKPNLLDRLRHRKNGYRHLKDSDEEENV
在一个示例性实施方案中，gB抗原可以包含或由与SEQ ID NO:1具有100％同一性的氨基酸序列组成。
适合于本公开文本的CMV gB抗原可以是从全长gB获得的截短gB多肽，其中全部或部分C末端结构域和/或全部或部分跨膜序列已被去除并且其中切割位点无效。示例性截短形式的这种gB抗原可以是US 6,100,064中描述的抗原，称为gBdTM，将其通过引用以其整体并入。在US 6,100,064中，gB的信号序列被假设为24个氨基酸长。事实上，信号序列为25个氨基酸长。因此，US 6,100,064中指示的gB氨基酸的编号应移动1。考虑到这一点，US 6,100,064中描述的gBdTM在切割位点携带三个突变：精氨酸432被苏氨酸替换，赖氨酸434被谷氨酰胺替换，精氨酸435被苏氨酸替换(考虑到重新编号的位置并且不计算信号序列)；以及氨基酸残基缬氨酸676和精氨酸751之间的跨膜区的缺失(考虑到重新编号的位置)，使得细胞外结构域直接连接到细胞质结构域。这种gB抗原更容易纯化，因为它是由以分泌形式表达该产物的重组细胞产生的。所得形式是一种806个氨基酸长的多肽，当它来源于gBTowne毒株时，其信号序列和其跨膜区被缺失。在一个示例性实施方案中，gB抗原可以是gBdTM，如本文所公开的。
本文所述的CMV gB抗原可以根据本领域技术人员熟知的任何方法制备。这些方法可以包括常规化学合成、由组成型氨基酸或其衍生物进行固相(R.B.Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85(14),2149–2154(1963))或液相酶促合成(K.Morihara,Trends inBiotechnology,5(6),164-170(1987))、无细胞蛋白质合成(Katzen等人,Trends inBiotechnology,23(3),150-156(2005))以及通过重组技术的生物生产方法。
例如，CMV gB抗原可以用重组宿主细胞通过生物生产方法获得。在这样的方法中，将含有编码如本文所述的CMV gB抗原的核酸的表达盒转移到宿主细胞中，所述宿主细胞在能够表达相应蛋白质的条件下进行培养。然后可以回收和纯化由此产生的蛋白质。蛋白质纯化的方法为本领域技术人员所熟知。所获得的重组蛋白可以通过单独或组合使用的方法从裂解物和细胞提取物或培养基上清液中纯化，所述方法诸如分级、色谱法、使用特异性单克隆或多克隆抗体的免疫亲和方法等。在一个实施方案中，所获得的重组蛋白可以从培养基上清液中纯化。
CMV gB抗原通常可以通过重组DNA技术获得，并根据本领域技术人员熟知的方法纯化。例如，可以使用US 6,100,064和US 2002/0102562中描述的方法，将其通过引用以其整体并入。
例如，如本文公开的CMV gB抗原可以是重组糖蛋白，其可以在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物中产生。来自CMV的Towne毒株的gB基因可以被诱变以去除分子的切割位点和跨膜部分，以促进细胞培养物中的分泌，如US 6,100,064中所述。分泌分子可以是806个氨基酸的多肽，保留19个潜在的N连接糖基化位点，也称为gBdTm。纯化方法可以涉及亲和和离子交换色谱步骤。
CMV gB抗原可以以免疫活性量存在于组合物中，即适于在预期接受者中诱导免疫反应的量。作为适合于本公开文本的gB抗原的免疫活性量的例子，可以列举范围为约1μg/ml至约500μg/ml、或约10μg/ml至约400μg/ml、或约20μg/ml至约350μg/ml、或约40μg/ml至约300μg/ml或约50μg/ml至约280μg/ml、或约80μg/ml至约240μg/ml的量。
CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原
如本文公开的免疫原性组合物的另一种抗原是CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。
这种五聚体复合物通过五种组分之间的二硫键和非共价相互作用组装以形成能够呈递构象表位的功能复合物(Ciferri等人,PNAS,2015,112(6):1767–1772；Wen等人,Vaccine,2014,32(30):3796–3804)。
用于本公开文本的合适的五聚体复合物已有描述并且为本领域技术人员所知。例如，这种五聚体复合物描述于Ryckman等人(Journal of Virology,2008年1月,第60-70页)和专利申请WO 2014/005959或WO 2019/052975中。
gH抗原
CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物可以包含修饰的CMV gH多肽。修饰的CMV gH多肽可以缺失了跨膜(TM)结构域的至少一部分。在一些实施方案中，修饰的gH多肽可以保留TM结构域的一部分，但不足以使蛋白质停留在脂质双层中。在一个示例性实施方案中，gH多肽可以缺失了基本上所有跨膜结构域。在另一个示例性实施方案中，gH多肽可以缺失了所有TM结构域。
在一个实施方案中，CMV糖蛋白H(gH)多肽可含有gH TM结构域的多达10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)。在另一个实施方案中，gH多肽可含有gH TM结构域的不多于10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)。
在一个实施方案中，gH抗原可以缺失了跨膜结构域的至少一部分或基本上所有跨膜结构域
在本发明的上下文中，“缺失结构域的至少一部分”意指缺失至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％但小于80％的结构域。因此，缺失给定结构域的至少一部分的截短的gH抗原可以包含所述结构域(例如，跨膜结构域)的序列的长度的约20％至约95％，例如约30％至约90％、例如约40％至约60％或例如50％。
表述“缺失基本上所有细胞内结构域”或“缺失基本上所有跨膜结构域”意指相应结构域的至少80％的氨基酸序列被缺失。因此，基本上缺失所有给定结构域的截短的gH抗原可以包含所述结构域(例如，跨膜结构域)的序列的长度的0％至约20％，例如约5％至约10％。
可替代地，或者除了缺失至少一部分、基本上所有或所有TM结构域之外，gH多肽可以缺失了CMV gH的一部分、基本上所有或所有细胞内结构域。
在一个实施方案中，gH抗原可以缺失了CMV gH的细胞内结构域的一部分。在另一个实施方案中，gH抗原可以缺失了基本上所有细胞内结构域。在另一个实施方案中，gH多肽可以缺失了所有细胞内结构域。
在一个实施方案中，gH多肽可以缺失了所有TM结构域和所有细胞内结构域。
在一个实施方案中，gH抗原可以包含由CMV UL75基因编码的全长gH多肽的胞外域，或由其组成。
由UL75基因编码的gH抗原是一种病毒颗粒糖蛋白，其对感染性至关重要，并且在α、β和γ疱疹病毒的成员中是保守的。它与gL形成稳定的复合物，并且该复合物的形成有利于gH的细胞表面表达。基于HSV-2和EBV gH/gL复合物的晶体结构，gH的gL亚基和N末端残基在结构的一端(“头部”)形成球状结构域，这涉及与gB的相互作用和膜融合的激活。gH靠近病毒膜的C末端结构域(“尾部”)也涉及膜融合。
在一个实施方案中，本文所述的五聚体复合物中的gH多肽可以包含或由与SEQ IDNO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，gH抗原可以包含或由与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性的氨基酸序列组成。
RYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNNSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYVVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDSR
在另一个实施方案中，gH多肽可以包含或由与SEQ ID NO:2具有100％同一性的氨基酸序列组成。
gL抗原
CMV糖蛋白L(gL)由UL115基因编码。gL抗原被认为是病毒复制所必需的，gL的所有已知功能特性都与其与gH的二聚化直接相关。gL/gH复合物是病毒和质膜融合所必需的，导致病毒进入宿主细胞。
根据一个实施方案，本文所述的五聚体复合物的gL多肽可以包含或由与SEQ IDNO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，gL抗原可以包含，由与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性的氨基酸序列组成。
在一个示例性实施方案中，gL多肽可以包含或由与SEQ ID NO:3具有100％同一性的氨基酸序列组成。
AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYERSIFTEHVLGFELVPPSLFNVVVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
UL128抗原
根据一个实施方案，本文所述的五聚体复合物中的UL128多肽可以包含或由与SEQID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，UL128抗原可以包含或由与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性的氨基酸序列组成。
在一个示例性实施方案中，UL128多肽可以包含或由与SEQ ID NO:4具有100％同一性的氨基酸序列组成。
EECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ
UL130抗原
UL130是UL131A-128基因座的中心和最大(214个密码子)基因。该基因的概念翻译预测了一个长的(25个氨基酸)N末端信号序列，该信号序列位于亲水蛋白之前，该亲水蛋白含有假定的趋化因子结构域(氨基酸46至120)内的两个潜在的N-连接糖基化位点(Asn85和Asn118)和一个靠近独特C末端区末端的额外N-糖基化位点(Asn201)。预测UL130没有TM结构域。
据报道，它是一种管腔糖蛋白，其从感染细胞中低效分泌，但以高尔基体成熟形式掺入病毒颗粒包膜中(Patrone等人,Journal of Virology.79(2005):8361-8373)。
根据一个实施方案，本文所述的五聚体复合物中的UL130多肽可以包含或由与SEQID NO:5具有至少80％同一性的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，UL130抗原可以包含或由与SEQ ID NO:5具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性的氨基酸序列组成。
在一个示例性实施方案中，UL130多肽可以包含或由与SEQ ID NO:5具有100％同一性的氨基酸序列组成。
SPWSTLTANQNPSPLWSKLTYSKPHDAATFYCPFIYPSPPRSPLQFSGFQRVLTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV
UL131A抗原
UL131，也称为UL131A，功能是CMV不仅在内皮细胞中而且在上皮细胞中复制所必需的。根据一个实施方案，本文所述的五聚体复合物中的UL131A多肽可以包含或由与SEQID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，UL131A抗原可以包含或由与SEQ ID NO:6具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性的氨基酸序列组成。
在一个示例性实施方案中，UL131多肽可以包含或由与SEQ ID NO:6具有100％同一性的氨基酸序列组成。
QCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN
SEQ ID NO:2至6来自毒株BE/28/2011(Genbank ID KP745669)。
五聚体复合抗原
在如本文公开的免疫原性组合物的五聚体复合抗原中，gH、gL和UL128可以通过二硫键连接，但是UL130和UL131A可以通过非共价相互作用结合到五聚体复合物中。例如，UL130蛋白和/或UL131A蛋白可以通过非共价相互作用结合到五聚体复合物中。此外，UL130蛋白和/或UL131A蛋白可以通过非共价相互作用相互连接。
五聚体复合物的一系列构象表位是已知的。例如，Macagno等人(Macagno等人,Journal of Virology.84(2010):1005-13)分离出一组人单克隆抗体，其中和内皮细胞、上皮细胞和髓细胞的CMV感染。在一个实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物的五聚体复合抗原可以展示出Macagno等人(2010)鉴定的一个或多个构象表位。
五聚体复合抗原的每个蛋白质可以含有突变，例如插入、缺失和替换，只要这些突变对使用该蛋白质作为抗原无害。此外，这种突变不应阻止蛋白质形成本发明的五聚体复合物的能力。形成如本文公开的五聚体复合物的能力可以通过执行蛋白质纯化，并通过非还原PAGE、蛋白质印迹和/或尺寸排阻色谱分析蛋白质来测试。如果蛋白质构成复合物的一部分，则它们可能在天然PAGE凝胶上全部以单个条带存在和/或在尺寸排阻色谱图中以单个峰存在。
所述五聚体复合物的表达可以根据本领域技术人员已知的方法实现。例如，可以提及Hofmann等人(Biotechnology和Bioengineering,2015)中描述的方法。
用于本公开文本上下文的合适表达系统是本领域技术人员所熟知的，并且许多详细描述于Doyle(Doyle编辑High Throughput Protein Expression and Purification:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,编辑Humana Press,2008)中。通常，可以使用适合维持、繁殖和表达核酸分子以在所需宿主中产生多肽的任何系统或载体。合适的核苷酸序列可以通过各种众所周知的常规技术中的任一种插入到表达系统中，所述技术例如像Sambrook(Sambrook,J.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000)中描述的那些。通常，编码基因可以置于控制元件如启动子和任选地操作子的控制下，使得编码所需肽的DNA序列在转化的宿主细胞中被转录成RNA。合适的表达系统的例子包括例如染色体、附加体和病毒衍生的系统，包括例如衍生自以下的载体：细菌质粒，噬菌体，转座子，酵母附加体，插入元件，酵母染色体元件，病毒诸如杆状病毒(诸如专利申请WO 2015/170287中所述)、乳多空病毒诸如SV40、痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒，或其组合，诸如衍生自质粒和噬菌体遗传元件(包括粘粒和噬菌粒)的那些。人类人工染色体(HAC)也可用于递送比质粒中可以包含和表达的更大的DNA片段。
为了同时并以等摩尔方式表达CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原的五种不同重组蛋白，有几种可能性。第一种可能性(1)可能是在相同或类似的调控元件(启动子、增强子、剪接信号、终止信号等)和任选地用于细胞系选择的选择系统的控制下构建包含所有五种ORF的单个载体。载体可以包含五个表达盒(例如，如Albers等人,J.Clin.Invest.,2015,125(4):1603-1619；或Cheshenko等人,Gene Ther.,2001,8(11):846-854中所述)，或者五种组分(gH、gL、UL128、UL130和UL131)可以与触发正确的多蛋白成熟为CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原的五种蛋白质的元件(例如，如Szymczak-Workman等人,Cold Spring Harb.Protoc.,2012,2012(2):199-204中所述的自切割序列)融合在单个ORF中。在第二种情况下，假设所有切割都正确发生，则保证等摩尔数。表达CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物的另一种可能性(2)可以是构建五个载体，每个载体表达CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原的一种组分，和任选地用于细胞系选择的选择系统。这五种载体可以在靶细胞系中共转染。可能性(1)和可能性(2)之间的任何中间系统也可以被设计为最小化所需的载体数量，并将每个载体维持在合理的大小(例如，小于12kb)。
合适的表达系统包括微生物，诸如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体感染或转染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒，诸如专利申请WO 2015/170287中所述)；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。无细胞翻译系统也可用于生产蛋白质。
合适的植物细胞遗传表达系统的例子可以包括美国专利5,693,506；美国专利5,659,122；美国专利5,608,143和Zenk,Phytochemistry,1991,30(12):3861-3863中描述的那些。例如，可以使用所有可以分离和培养原生质体以产生整个再生植物的植物，以便回收含有转移基因的整个植物。几乎所有植物都可以从培养的细胞或组织中再生，包括但不限于甘蔗、甜菜、棉花、水果和其他树木、豆类和蔬菜的所有主要物种。
HEK293细胞可适用于瞬时表达如本文公开的五聚体复合物的CMV蛋白，因为它们通过各种技术的高转染性，包括磷酸钙和聚乙烯亚胺(PEI)方法。HEK293的有用细胞系可能是表达EBV的EBNA1蛋白的细胞系，例如293-6E(Loignon,等人,BMC Biotechnology,2008；8:65)。转化的HEK293细胞已被证明可以将高水平的蛋白质分泌到生长培养基中，从而允许直接从生长培养基中纯化此类蛋白质复合物。
CHO细胞可以是适合于CMV蛋白工业化生产的哺乳动物宿主，例如根据本发明的免疫原性组合物的CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原部分的工业化生产。转染可以通过一系列本领域公知的方法进行，包括使用磷酸钙、电穿孔，或者通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将其货物沉积在内部的脂质体。
从细胞上清液或包涵体中纯化重组蛋白的方法在本领域是公知的。在一个示例性实施方案中，CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原可以通过尺寸排阻色谱纯化。
CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原可以以免疫活性量存在于组合物中，即适于在预期接受者中诱导免疫反应的量。作为适合于本公开文本的gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原的免疫活性量的例子，可以列举范围为约1μg/ml至约500μg/ml、或约10μg/ml至约400μg/ml、或约20μg/ml至约350μg/ml、或约40μg/ml至约300μg/ml或约50μg/ml至约280μg/ml、或约80μg/ml至约240μg/ml的量。
在一个实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物不包含任何完整的CMV病毒。
在一个实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物可以包含本文所述的CMV抗原的其他抗原。作为可添加到如本文公开的组合物中的其他抗原的例子，可以列举来自以下的抗原：百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptheriae)、破伤风梭菌、结核分枝杆菌、疟原虫属物种(Plasmodium spp.)、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、疏螺旋体属物种(Borrelia spp.)、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、梭菌属物种(Clostridium spp.)、麻风分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、流感病毒、水痘带状疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS-Cov-2病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、人乳头瘤病毒、埃博拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丽沙病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒。在一个示例性实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物可以包含CMV gB抗原和CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原作为组合物的唯一CMV抗原。
在一个示例性实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物可以包含CMV gB抗原和CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原作为组合物的唯一CMV抗原。
真菌抗原
真菌抗原可以获自子囊菌门(Ascomycota)(例如，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、基氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、粗球孢子菌/波萨达斯球孢子菌(Coccidioides immitis/posadasii)、白色念珠菌(Candida albicians))、担子菌门(Basidiomycota)(例如，新型线黑粉菌(Filobasidiellaneoformans)、毛孢子菌属(Trichosporon))、微孢子目(Microsporidia)(例如，兔脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)、比氏肠微孢虫(Enterocytozoon bieneusi))或毛霉菌亚门(Mucoromycotina)(例如，卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、米根霉(Rhizopus oryzae)、伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera))。
原生动物抗原
原生动物抗原可以获自溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambila)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(T.cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、疟原虫属物种(Plasmodiumspp.)或田鼠巴贝虫(Babesia microti)。
寄生虫抗原
寄生虫抗原可以获自棘阿米巴属(Acanthamoeba)、异尖线虫属(Anisakis)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、马蝇(botfly)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、臭虫(bedbug)、绦虫纲(Cestoda)、恙螨(chiggers)、嗜人锥蝇(Cochliomyia hominivorax)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambila)、钩虫(hookworm)、利什曼原虫属(Leishmania)、锯齿舌虫(Linguatula serrata)、肝吸虫(liver fluke)、罗阿丝虫(Loa loa)、并殖吸虫属(Paragonimus)、蛲虫(pinworm)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、血吸虫属(Schistosoma)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、螨虫(mite)、绦虫(tapeworm)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、锥虫属(Trypanosoma)、鞭虫(whipworm)或班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)。
肿瘤抗原
在一个实施方案中，抗原可以是肿瘤抗原，即癌细胞的成分，诸如在癌细胞中表达的蛋白质或肽。术语“肿瘤抗原”涉及在正常条件下在有限数量的组织和/或器官中或在特定发育阶段中特异性表达而在一个或多个肿瘤或癌症组织中表达或异常表达的蛋白质。肿瘤抗原包括例如分化抗原，诸如细胞类型特异性分化抗原，即在正常条件下在某一分化阶段在某一细胞类型中特异性表达的蛋白质和种系特异性抗原。例如，肿瘤抗原由表达它的癌细胞呈递。
例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、a 1-胎蛋白、异铁蛋白以及胎儿硫糖蛋白、cc2-H-铁蛋白和γ-胎蛋白。
可用于本发明的肿瘤抗原的其他例子是p53、ART-4、BAGE、β-连环素/m、Bcr-abLCAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CD 4/m、CEA、密封蛋白家族的细胞表面蛋白(如CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gapl OO、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A(诸如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12)、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1 R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl 90次要BCR-abL、Pm l/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVrVIN、TEL/AMLl、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/1NT2、TPTE和WT，诸如WT-1。
脂质体及其制造方法
本公开文本还涉及用于制造脂质体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解式(I)的TLR4激动剂(其在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/mL，在25℃下测量)、甾醇和磷脂，
(b)将步骤(a)获得的溶液加工成脂质体，
其中在步骤(a)时、步骤(b)时或步骤(b)之后添加皂苷，并且
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以皂苷:TLR4激动剂的重量:重量比的范围为约1:1至约400:1、范围为约2:1至约200:1、范围为约2.5:1至约100:1、范围为约3:1至约40:1或范围为约5:1至约25:1存在。这样的方法可以允许获得如本文公开的单一类型的脂质体。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于制造脂质体的方法，例如第二类型的脂质体，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解式(I)的TLR4激动剂(其在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/mL，在25℃下测量)、甾醇和磷脂，
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体。在这样的实施方案中，所述方法不包括在步骤(a)和/或(b)时添加皂苷。在这样的实施方案中，所获得的脂质体可以不含皂苷。这样的方法可以允许获得如本文公开的第二类型的脂质体。
在一个实施方案中，如本文公开的用于制造脂质体的方法可以包括在步骤(a)之前选择在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/mL的式(I)的TLR4激动剂的步骤。
本公开文本还涉及用于制造如本文公开的脂质体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(a1)选择在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/mL的式(I)的TLR4激动剂，
(a2)在有机水混溶性溶剂中溶解步骤(a1)选择的TLR4激动剂、甾醇和磷脂，以及
(b)将步骤(a2)获得的溶液加工成脂质体，
其中在步骤(a2)时、步骤(b)时或步骤(b)之后添加皂苷，并且
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以皂苷:TLR4激动剂的重量:重量比的范围为约1:1至约400:1、范围为约2:1至约200:1、范围为约2.5:1至约100:1、范围为约3:1至约40:1或范围为约5:1至约25:1存在。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于制造脂质体的方法，例如第二类型的脂质体，所述方法至少包括以下步骤：
(a1)选择在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/mL的式(I)的TLR4激动剂，
(a2)在有机水混溶性溶剂中溶解步骤(a1)选择的TLR4激动剂、甾醇和磷脂，以及
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体。这样的方法可以不包括在步骤(a)和/或(b)时添加皂苷。在这样的实施方案中，所获得的脂质体可以不含皂苷。这样的方法可以允许获得如本文公开的第二类型的脂质体。
在一个实施方案中，如本文公开的用于制造脂质体的方法可以包括在步骤(a1)之前，在约25℃的温度和约1 013hPa的大气压下测定式(I)的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数的步骤。
本公开文本还涉及用于制造如本文公开的脂质体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(a1)在约25℃的温度和约1 013hPa的大气压下测定式(I)的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数；
(a2)选择在步骤(a1)测量的溶解度参数为至少约0.2mg/mL的式(I)的TLR4激动剂；
(a3)在有机水混溶性溶剂中溶解TLR4激动剂、甾醇和磷脂，
其中TLR4激动剂是在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/mL的式(I)的TLR4激动剂，以及
(b)将步骤(a3)获得的溶液加工成脂质体，
其中在步骤(a3)时、步骤(b)时或步骤(b)之后添加皂苷，并且
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以皂苷:TLR4激动剂的重量:重量比的范围为约1:1至约400:1、范围为约2:1至约200:1、范围为约2.5:1至约100:1、范围为约3:1至约40:1或范围为约5:1至约25:1存在。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于制造脂质体的方法，例如第二类型的脂质体，所述方法至少包括以下步骤：
(a1)在约25℃的温度和约1 013hPa的大气压下测定式(I)的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数；
(a2)选择在步骤(a1)测量的溶解度参数为至少约0.2mg/mL的式(I)的TLR4激动剂；
(a3)在有机水混溶性溶剂中溶解TLR4激动剂、甾醇和磷脂，
其中TLR4激动剂是在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/mL的式(I)的TLR4激动剂，以及
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体。这样的方法可以不包括在步骤(a)和/或(b)时添加皂苷。在这样的实施方案中，所获得的脂质体可以不含皂苷。这样的方法可以允许获得如本文公开的第二类型的脂质体。
上文已描述了适用于根据本文公开的方法制造脂质体的TLR4激动剂、皂苷、甾醇和磷脂。上文也已描述了这些化合物可以混合的量和比率。
所选的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数可以为至少约0.2mg/mL。
所选的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数为至少约0.5mg/mL、至少约1mg/mL、至少2mg/mL、至少4mg/mL、至少6mg/mL、至少10mg/mL、至少12mg/mL、至少15mg/mL、至少20mg/mL、至少25mg/mL或至少30mg/mL。
所选的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数为约0.1至约50mg/mL、约0.2至约45mg/mL、约1至约40mg/mL、约2至约35mg/mL、约6至约30mg/mL、或约10至约25mg/mL。
所选的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数的范围为约至少约0.2mg/mL至约20mg/ml、约至少约0.5mg/mL至约15mg/ml、约至少约1mg/mL至约12mg/ml、约至少约2mg/mL至约10mg/ml、约至少约4mg/mL至约10mg/ml。
在一个实施方案中，所选的TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数为至少约10mg/mL。
溶解度参数是在约25℃的温度和约1 013hPa的大气压下测量的。溶解度参数可以通过浊度法测量。
测定分子(如式(I)的TLR4激动剂)的溶解度参数的方法为本领域技术人员所熟知。此类方法的例子包括在不同浓度的所述分子下对乙醇中的分子进行浊度测量。例如，可以在BMG-Labtech Nephelostar上进行浊度测定，在UV 96孔微板(Thermo UV Flat Bottom96，参考8404)上每种溶液0.200ml(包括不同浓度的待测分子)，采用乙醇中的空白。可以记录每种溶液的RNU(相对浊度单位)。Veseli等人(Drug Dev Ind Pharm.2019年11月；45(11):1717-1724)描述了测定分子溶解度参数的其他方法。
将步骤(a)获得的溶液加工成脂质体的方法是本领域已知的(Wagner A等人JDrug Deliv.2011；591325)。作为示例性实施方案，可以提及“薄膜法”或“溶剂注入法”。
“薄膜法”(例如，在Liposomes:A practical approach.RRC New.OxfordUniversity Press编辑,1990中所详述)包括根据步骤(a)获得脂质化合物(即TLR4激动剂、甾醇、磷脂和任选地皂苷)在适当的有机溶剂或有机溶剂混合物中的溶液。例如，所述方法在WO 2007/068907 A1中用于制备脂质体。
合适的有机溶剂或溶剂混合物可以是氯仿、二氯甲烷、氯仿/乙醇、二氯甲烷/乙醇、异丙醇、异丙醇/乙醇、氯仿/甲醇、二氯甲烷/甲醇、异丙醇或异丙醇/甲醇。
然后将获得的溶液干燥以蒸发有机溶剂，从而获得脂质干物质，作为脂质薄膜或脂质饼。蒸发可以通过在通风橱中使用干燥的氮气或氩气流或通过在玻璃容器壁上旋转蒸发来进行。
然后将获得的脂质干物质通过重悬在适当的水性介质或水性缓冲液中来水合。水合时间可能因脂质种类和结构而略有不同。合适的水性介质或缓冲液可以是pH 6.1的PBS，或pH 6.3的柠檬酸盐缓冲液，以获得脂质体。
在本文公开的方法中，如果皂苷不是在步骤(a)时添加而是在步骤(b)时添加，则在薄膜法中，可以在脂质干物质的水合步骤时添加，通过添加并溶解在用于水合步骤的水性介质或水性缓冲液中。可替代地，可以在步骤b)之后将其作为皂苷溶液添加到步骤(b)获得的脂质体悬浮液中。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于制造脂质体的方法，例如第一类型的脂质体，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解甾醇和磷脂，
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体，
其中在步骤(a)时、步骤b)时或步骤(b)之后添加皂苷。在这样的实施方案中，步骤a)不包括在有机水混溶性溶剂中溶解TLR4激动剂的步骤。在这样的实施方案中，所获得的脂质体可以不含TLR4激动剂。这样的方法可以允许获得如本文公开的第一类型的脂质体。
然后通过超声处理、微流化或挤出来确定所得脂质体或脂质体悬浮液的大小，以减小脂质体的直径，从而能够通过0.2μm孔径的膜过滤进行灭菌。
薄膜法通常使用通常难以操作的氯化有机溶剂。此外，薄膜法依赖于脂质干燥步骤以在玻璃容器壁上获得薄脂质膜。这步给扩大规模带来了许多障碍，例如在工业水平上。因此，在制备脂质体时，其他方法可能被证明是更有利的。
“溶剂注入法”(例如，在Liposomes:A practical approach.RRC New编辑.OxfordUniversity Press,1990中所详述)包括获得脂质化合物，即TLR4激动剂、甾醇、磷脂和任选地皂苷按选定的比率在有机水混溶性溶剂或有机水混溶性溶剂混合物中的溶液。
合适的有机水混溶性溶剂或有机水混溶性溶剂混合物可以是乙醇、异丙醇或异丙醇/乙醇。在一个示例性实施方案中，合适的有机水混溶性溶剂可以是乙醇。与其他可用的溶剂或溶剂混合物(如异丙醇)相比，乙醇被卫生机构认为是药品制造工艺中使用的最安全的化合物之一。
溶剂注入法规定了将脂质化合物溶解在适当的有机水混溶性溶剂或有机水混溶性溶剂混合物(如乙醇)中的步骤。使用如本文公开的制造脂质体的方法是可能的，因为选择在有机水混溶性溶剂中具有特定溶解度阈值的特定TLR4激动剂。在一个实施方案中，所选的TLR4激动剂在乙醇中具有特定溶解度阈值，如本文所公开的。
与其他可能的脂质体制造方法(例如，薄膜法)相比，溶剂注入法具有易于在工业水平上扩大规模的优点
在一个实施方案中，将步骤(a)获得的溶液加工成脂质体的步骤(b)通过使用溶剂注入法进行。
在另一个实施方案中，将步骤(a)获得的溶液加工成脂质体的步骤(b)包括以下步骤：
(b1)将步骤(a)获得的溶液注入和/或稀释到水性缓冲液中。
然后将步骤(a)中得到的溶液注入或稀释到过量的水性介质或水性缓冲液中。合适的缓冲液可以是pH 6.1的PBS、pH 6.3的柠檬酸盐缓冲液。然后通过透析或渗滤除去溶剂。稀释可以通过使用T连接器或错流注射装置进行错流混合，如Wagner等人,JLiposomeRes.2006；16(3):311-9或Wagner等人,J Drug Deliv.2011；2011:591325中所述或通过使用微流体装置来进行。合适的微流体装置可以是来自加拿大温哥华Precison Nanosystems的NanoAssemblR。通过使用溶剂注入法，可以通过适当选择工艺参数(溶剂/缓冲液体积和比率、混合速度等)直接获得与在0.2μm孔径的膜上过滤灭菌相容的小脂质体。
在一个实施方案中，注射步骤可以通过稀释步骤、用注射器注射或错流注射系统进行。
在另一个实施方案中，将步骤(a)获得的溶液加工成脂质体的步骤(b)还可以包括以下步骤：
(b2)除去所述有机水混溶性溶剂。
可以通过透析、渗滤或切向流过滤去除有机水混溶性溶剂。
在另一个实施方案中，将步骤(a)获得的溶液加工成脂质体的步骤(b)可以包括以下步骤：
(b1)将步骤(a)获得的溶液注入和/或稀释到水性缓冲液中，以及
(b2)除去所述有机水混溶性溶剂。
在一个实施方案中，用于制造脂质体的方法可以至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解式(I)的TLR4激动剂(其在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/mL，在25℃下测量)、甾醇和磷脂，
(b1)将步骤(a)获得的溶液注入和/或稀释到水性缓冲液中，以及
(b2)除去所述有机水混溶性溶剂，
其中在步骤(a)时、步骤(b1)时、步骤(b2)时或步骤(b2)之后添加皂苷，并且
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以皂苷:TLR4激动剂的重量:重量比的范围为约1:1至约400:1、范围为约2:1至约200:1、范围为约2.5:1至约100:1、范围为约3:1至约40:1或范围为约5:1至约25:1存在。
当在步骤(b1)时添加时，将皂苷溶解在水性缓冲液中。
当在步骤(b2)时添加时，将皂苷溶解在用于透析含有脂质体的悬浮液以除去有机水混溶性溶剂的水性缓冲液中。
当在步骤(b2)之后添加时，将皂苷溶解在水性缓冲液中，然后混合到步骤(b2)后获得的脂质体悬浮液中。
当皂苷对甾醇展示出高亲和力时，例如当使用QS21和胆固醇时，皂苷可以通过后添加到预先形成的含甾醇的脂质体中而掺入脂质体中。在这种情况下，如上所述制备含甾醇的脂质体，并且通过将皂苷溶液(在水或酸性缓冲液中，如PBS pH 6.1或柠檬酸盐pH6.3)与含甾醇脂质体的悬浮液简单混合来掺入皂苷。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于制造脂质体的方法，例如第一类型的脂质体，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解甾醇和磷脂，
(b1)将步骤(a)获得的溶液注入和/或稀释到水性缓冲液中，以及
(b2)除去所述有机水混溶性溶剂，
其中在步骤(a)时、步骤(b1)时、步骤(b2)时或步骤(b2)之后添加皂苷。在这样的实施方案中，步骤a)不包括在有机水混溶性溶剂中溶解TLR4激动剂的步骤。在这样的实施方案中，所获得的脂质体可以不含TLR4激动剂。这样的方法可以允许获得如本文公开的第一类型的脂质体。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于制造脂质体的方法，例如第二类型的脂质体，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解式(I)的TLR4激动剂(其在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/mL，在25℃下测量)、甾醇和磷脂，
(b1)将步骤(a)获得的溶液注入和/或稀释到水性缓冲液中，以及
(b2)除去所述有机水混溶性溶剂。在这样的实施方案中，所述方法不包括在步骤(a)和/或(b)时添加皂苷。在这样的实施方案中，所获得的脂质体可以不含皂苷。这样的方法可以允许获得如本文公开的第二类型的脂质体。
如本文公开的方法的步骤(a)可以分解为如上所述的步骤(a1)和(a2)或(a1)、(a2)和(a3)。
本公开文本的脂质体是小单层囊泡和小多层囊泡的混合物，其平均直径为约100nm，当使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instrument；英国马尔文)按照仪器的推荐操作说明通过动态光散射进行测量时。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于制造至少两种类型的脂质体的组合的方法，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，所述方法至少包括混合第一和第二脂质体的步骤。
在一些实施方案中，如本文公开的制造脂质体的方法还包括以下步骤(c)：过滤在步骤(b)中获得的脂质体并回收平均直径小于200nm的脂质体。在一个示例性实施方案中，如本文公开的脂质体可以具有范围为约80nm至约200nm或范围为约120nm至约180nm的平均直径。
在至少两种类型的脂质体的组合的情况下，过滤步骤可以在混合至少两种类型的脂质体的步骤之前和/或之后对脂质体进行。
在另一个实施方案中，步骤(c)包括回收平均直径低于175nm、低于150nm或约100nm的脂质体。因此，过滤在步骤(b)中获得的脂质体的步骤(c)可以在0.22μm孔径的膜上进行。
在一个示例性实施方案中，如本文公开的制造脂质体的方法还包括以下步骤(c)：在灭菌过滤器上过滤在步骤(b)中获得的脂质体。灭菌过滤器可以具有0.22μm孔径的膜。在这样的实施方案中，所述方法包括回收平均直径与在0.22μm孔径的膜上的灭菌过滤相容的脂质体的步骤。
当通过电子显微镜检查进行分析时，如本文公开获得的脂质体悬浮液包括单层脂质体以及一些多层和多泡脂质体的混合物。
如本文公开的脂质体，或根据本文方法获得的脂质体，可以进一步与抗原结合。在至少两种类型的脂质体的组合中，第一或第二或两种类型的脂质体可以含有至少一种抗原。第一和第二类型的脂质体可以含有相同或不同的抗原。
因此，如本文公开的方法可以包括另一步骤：将步骤b)或步骤c)之后获得的脂质体与至少一种抗原混合。合适的抗原可以是如上所公开的。混合可以通过添加至少一种抗原和脂质体悬浮液来完成。在混合之前，调节每种抗原和脂质体悬浮液的体积和浓度，以在最终组合物中获得每种组分的期望浓度，例如抗原、TLR-4激动剂、QS21或QS7、胆固醇(或类似物)和磷脂。
可替代地，可以在所公开的方法的步骤a)或b)中的一个中添加抗原，前提是不改变抗原的性质和功能。
抗原可以以液体、半液体(例如，凝胶)或固体(例如，粉末)形式提供。在一个示例性实施方案中，抗原以液体形式(作为溶液)添加到脂质体中。
所述方法还可以包括纯化、过滤和/或灭菌的步骤，如通常在该领域实践的那样。所获得的组合物可以包装在小瓶或注射器中以用于进一步储存和使用。
在如本文公开的脂质体组合中，不同组分的含量，即TLR4激动剂、皂苷、甾醇或甾醇酯和磷脂可以根据脂质体类型或脂质体组合或包含脂质体的组合物表达。在一些实施方案中，不同组分的含量，即TLR4激动剂、皂苷、甾醇或甾醇酯和磷脂根据脂质体的组合或包含脂质体的组合物表达。例如，在如本文公开的脂质体组合中，当给定组分的量以重量/体积表示时，即指每体积单位含有该组合的组合物的脂质体组合中该组分的总量。作为另一个例子，在如本文公开的脂质体组合中，当给定组分的量以重量:重量比表示时，即指第一和第二类型的脂质体中每种组分的量。
在如本文公开的脂质体组合中，不同类型的脂质体(例如，第一和第二类型的脂质体)中甾醇和磷脂的含量可以是相同或不同的。在一些实施方案中，不同类型的脂质体(例如，第一和第二类型的脂质体)中甾醇和磷脂的含量是相同的。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂(即，单一类型的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合)可以包含：
-重量:重量比的范围为约1:1至约1:500、范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:2.5至约1:90、范围为约1:3至约1:40、范围为约1:3至约1:30、或范围为约1:5至约1:25、或范围为约1:5至约1:10的TLR4激动剂:皂苷，
-重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5、为约1:2或为约1:5的皂苷:甾醇，
-重量:重量比的范围为100:1至1:200、范围为50:1至1:100、范围为10:1至20:1、为约1:1、为约1:2或为约1:4的甾醇:磷脂。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂(即，单一类型的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合)可以包含：
-重量:重量比的范围为约1:1至约1:500、范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:2.5至约1:90、范围为约1:3至约1:40、范围为约1:3至约1:30、或范围为约1:5至约1:25、或范围为约1:5至约1:10的TLR4激动剂:皂苷，
-重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5、为约1:2或为约1:5的皂苷:甾醇，
-重量:重量比的范围为1:400至1:4、范围为1:200至1:8、范围为1:100至1:10、范围为1:50至1:10、为约1:8或为约1:20的皂苷:磷脂。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包括：
-重量:重量比的范围为约1:1至约1:500、范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:3至约1:40、或范围为约1:5至约1:25、或范围为约1:5至约1:10的E6020:QS21，
-重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5、为约1:2或为约1:5的QS21:胆固醇，
-重量:重量比的范围为100:1至1:200、范围为50:1至1:100、范围为10:1至20:1、为约1:1、为约1:2或为约1:4的胆固醇:DOPC。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包括：
-重量:重量比的范围为约1:1至约1:500、范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:3至约1:40、或范围为约1:5至约1:25、或范围为约1:5至约1:10的E6020:QS21，
-重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5、为约1:2或为约1:5的QS21:胆固醇，
-重量:重量比的范围为1:400至1:4、范围为1:200至1:8、范围为1:100至1:10、范围为1:50至1:10、为约1:8或为约1:20的QS21:DOPC。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包括：
-重量:重量比的范围为约1:1至约1:500、范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:3至约1:90、或范围为约1:5至约1:30、或范围为约1:5至约1:10的E6020:QS7，
-重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5、为约1:2或为约1:5的QS7:胆固醇，
-重量:重量比的范围为100:1至1:200、范围为50:1至1:100、范围为10:1至20:1、为约1:1、为约1:2或为约1:4的胆固醇:DOPC。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包括：
-重量:重量比的范围为约1:1至约1:500、范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:3至约1:90、或范围为约1:5至约1:30、或范围为约1:5至约1:10的E6020:QS7，
-重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5、为约1:2或为约1:5的QS7:胆固醇，
-重量:重量比的范围为1:400至1:4、范围为1:200至1:8、范围为1:100至1:10、范围为1:50至1:10、为约1:8或为约1:20的QS7:DOPC。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含如本文公开的磷脂/甾醇或其酯/皂苷/TLR-4激动剂，其重量:重量比的范围为约2:0.5:0.05:X mg/ml至约8:1.5:1.8:X mg/ml，其中X的范围为0.001mg/ml至0.05mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含如本文公开的磷脂/甾醇或其酯/皂苷/TLR-4激动剂，其重量:重量比的范围为约2:0.5:0.05:X mg/ml至约8:1.5:0.8:X mg/ml，其中X的范围为0.001mg/ml至0.05mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含如本文公开的磷脂/甾醇或其酯/皂苷/TLR-4激动剂，其重量:重量比为4:1:0.2:X mg/ml，X为0.004mg/ml、0.008mg/ml或0.02mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含如本文公开的磷脂/甾醇或其酯/皂苷/TLR-4激动剂，其重量:重量比为4:1:0.6:X mg/ml，X为0.004mg/ml、0.008mg/ml或0.02mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS21/E6020，其重量:重量比的范围为约2:0.5:0.05:X mg/ml至约8:1.5:0.8:X mg/ml，其中X的范围为0.001mg/ml至0.05mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS21/E6020，其重量:重量比为4:1:0.2:X mg/ml，X为0.004mg/ml、0.008mg/ml或0.02mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS7/E6020，其重量:重量比的范围为约2:0.5:0.05:X mg/ml至约8:1.5:1.8:X mg/ml，其中X的范围为0.001mg/ml至0.05mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS7/E6020，其重量:重量比为4:1:0.2:X mg/ml，X为0.004mg/ml、0.008mg/ml或0.02mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS7/E6020，其重量:重量比为4:1:0.6:X mg/ml，X为0.004mg/ml、0.008mg/ml或0.02mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS7/E6020，其重量:重量比为4:1:1.8:X mg/ml，X为0.004mg/ml、0.008mg/ml或0.02mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS21/E6020，其重量:重量比为4:1:0.2:0.020mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS7/E6020，其重量:重量比为4:1:0.2:0.020mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS7/E6020，其重量:重量比为4:1:0.6:0.020mg/ml。
在一个实施方案中，如本文公开的脂质体佐剂可以包含DOPC/Chol/QS7/E6020，其重量:重量比为4:1:1.8:0.020mg/ml。
特别地，可用于上述实施方案的脂质体佐剂中的抗原是CMV抗原。
这些实施方案中提供的比率可能是特别有利的，因为它们允许脂质体被赋予低反应原性并诱导针对给定抗原的高水平和持久水平的中和抗体，同时需要比其他已知脂质体佐剂更少的TLR4激动剂，从而降低生产成本。
包含脂质体的组合物
根据一些实施方案，本公开文本涉及组合物，所述组合物包含如本文公开的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合，或包含脂质体的组合物。本节中提到的脂质体包括如上所述的脂质体和通过上述脂质体制造方法获得的脂质体，以及如本文公开的或通过如本文公开的方法获得的至少两种类型的脂质体的组合。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及佐剂组合物，所述佐剂组合物包含如本文所述的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)或如本文公开的至少两种类型的脂质体的组合。
所述佐剂组合物还可以包含本领域已知具有佐剂性质的其他化合物。
在一个实施方案中，本公开文本涉及免疫增强剂，所述免疫增强剂包含如本文所述的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)或如本文公开的至少两种类型的脂质体的至少一种组合。本文所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或如本文公开的至少两种类型的脂质体的组合也可以单独用作免疫增强剂。
在一个实施方案中，包含本文所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或如本文公开的至少两种类型的脂质体的组合的组合物还可以包含其中悬浮脂质体的缓冲溶液。适用于本文的缓冲溶液包括水性缓冲溶液，例如酸性缓冲液，例如柠檬酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、组氨酸缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。例如，水性缓冲液可以是柠檬酸盐缓冲溶液或乙酸盐缓冲溶液，或者组氨酸缓冲液。
缓冲溶液还可以包含稳定剂。合适的稳定剂包括碳水化合物、表面活性剂、聚合物如聚乙烯醇、氨基酸、环糊精和小分子量赋形剂如尿素。
可以冻干包含本文所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或如本文公开的至少两种类型的脂质体的组合的组合物。冻干是一种低温脱水过程，包括冷冻脂质体，降低压力，然后通过升华去除冰。适用于脂质体并避免其降解的冻干方法是本领域技术人员所熟知的。冻干组合物具有延长脂质体保质期的优点。
可以灭菌如本文公开的组合物。适用于脂质体并避免其降解的灭菌方法是本领域技术人员所熟知的。灭菌组合物特别有利于个体施用。
免疫原性组合物
在另一个实施方案中，本公开文本涉及免疫原性组合物(诸如疫苗组合物)，所述免疫原性组合物包含本文所述的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)、或如本文公开的至少两种类型的脂质体的组合、或如本文所述的包含脂质体的组合物、或如上所述的佐剂组合物、以及至少一种抗原。本节中提到的脂质体包括如上所述的脂质体和通过上述脂质体制造方法获得的脂质体，以及如本文公开的或通过如本文公开的方法获得的至少两种类型的脂质体的组合。
疫苗组合物是用于引起对给定抗原的保护性免疫反应的组合物。疫苗通常用作预防工具，但在某些情况下也可以用作治疗。
如本文公开的脂质体在免疫原性组合物(例如，疫苗组合物)中的存在通过增加组合物中抗原引起的免疫反应而充当佐剂。
上文描述了可用于免疫原性组合物(例如，疫苗组合物)的合适抗原。在一个实施方案中，抗原可以选自细菌抗原、原生动物抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生虫抗原和肿瘤抗原。
本公开文本的某些方面涉及免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含如本文公开的gB抗原、CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原和佐剂，所述佐剂包含至少一种脂质体，其包含皂苷、甾醇、磷脂和如本文所述的式(I)的Toll样受体4(TLR4)激动剂。在一些实施方案中，免疫原性组合物还可以包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物可用于预防和/或治疗CMV感染。
在一方面，如本文公开的免疫原性组合物是免疫原性组合物亚基，例如疫苗组合物亚基。
如本文公开的免疫原性组合物或疫苗组合物可以被配制成固体、半固体、液体形式的制剂，如片剂、胶囊、散剂、气雾剂、溶液、混悬剂或乳剂。施用此类组合物的典型途径包括而不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、颊、鼻内。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、皮内、胸骨内注射或输注技术。在一些实施方案中，如本文公开的疫苗组合物可通过透皮、皮下、皮内或肌内途径施用。本公开文本的组合物基于递送方式被配制，包括例如被配制用于经由肠胃外递送(如肌内、皮内或皮下注射)递送的组合物。
如本文公开的免疫原性组合物可以经由任何合适的途径施用，如通过粘膜施用(例如，鼻内或舌下)、肠胃外施用(例如，肌内、皮下、经皮或皮内途径)或口服施用。如本领域技术人员所理解的，免疫原性组合物可以适合地被配制为与预期的施用途径相容。在一个实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物可以被配制为经由肌内途径或皮内途径或皮下途径施用。在一个实施方案中，免疫原性组合物可以被配制为经由肌内途径施用。
如本文公开的组合物被配制为允许其中所含的活性成分在组合物被施用于受试者时是生物可利用的。
制备此类剂型的实际方法对于本领域技术人员是已知的或将是清楚的；例如参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Philadelphia College ofPharmacy and Science,2000)。
如本文公开的免疫原性组合物可以用任何药学上可接受的载体来配制。所述组合物可以含有至少一种惰性稀释剂或载体。一种示例性的药学上可接受的媒介物是生理盐水缓冲液。其他生理学上可接受的媒介物是本领域技术人员已知的并且例如描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版),编辑A.Gennaro,1990,MackPublishing Company,Easton,Pa。如本文所述的免疫原性组合物可以任选地包含接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、人血清白蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸、L-精氨酸盐酸盐、蔗糖、D-海藻糖脱水物、山梨醇、三(羟甲基)氨基甲烷和/或尿素。此外，疫苗组合物可以任选地包含药学上可接受的添加剂，包括例如稀释剂、粘合剂、稳定剂和防腐剂。
在一个实施方案中，组合物可以呈液体形式，例如溶液、乳液或悬浮液。液体可用于通过注射递送。旨在通过注射施用的组合物可以含有以下中的至少一种：表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂。如本文公开的液体组合物可以包含以下中的至少一种：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液，如生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠；固定油，如可用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖；作为冷冻保护剂的试剂，如蔗糖或海藻糖。
本文公开的免疫原性组合物的pH可为约5.5至约8，例如约6.5至约7.5，或可为约7。通过使用缓冲液可维持稳定的pH。可以列举Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液或组氨酸缓冲液作为可能的可用缓冲液。如本文公开的免疫原性组合物通常可以包括缓冲液。免疫原性组合物对于哺乳动物如人可以是等渗的。免疫原性组合物还可以包含一种或几种额外的盐，例如NaCl
可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射的组合物是例如无菌的。
如本文公开的免疫原性组合物可以通过常规灭菌技术(例如，用UV或γ辐射)灭菌，或者可以进行无菌过滤。通过对如本文公开的液体免疫原性组合物无菌过滤得到的组合物可以液体形式包装和储存或冻干。冻干组合物可以在施用前用无菌水性载体重构。
如本文公开的组合物可以通过制药领域熟知的方法来制备。例如，打算通过注射施用的组合物可以通过将脂质体、如本文公开的至少两种类型的脂质体的组合物或如本文公开的包含脂质体的组合物与无菌、蒸馏水或其他载体组合以形成溶液来制备。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。
将如本文公开的组合物以治疗有效量施用，所述治疗有效量将取决于多种因素，包括所使用的具体治疗剂的活性；治疗剂的代谢稳定性和作用时间；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用方式和时间；排泄率；药物组合；具体障碍或病症的严重程度；和接受疗法的受试者。
在一个实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物可以以干燥形式如冻干组合物或作为通过如WO 2009/109550中所述的造粒工艺获得的微丸来包装和储存。在一个实施方案中，组合物的不同组分，例如gB抗原、gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原和佐剂，可以全部存在于相同的微丸中。在另一个实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物的组分，例如gB抗原、gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原和gB抗原的佐剂，可以各自在不同的微丸中，即每个微丸一种组分。在这样的实施方案中，单独含有不同组分的不同微丸可以在施用给受试者之前混合。在一个实施方案中，可以将它们在液体载体中重构之前混合。在另一个实施方案中，可以将它们在液体载体中重构时通过添加至一个体积的液体载体中来混合。在另一个实施方案中，首先可以将它们各自单独添加至不同体积的液体载体中，其次，可以然后将不同体积的液体载体混合在一起以得到有待施用于受试者的最终液体组合物。
干组合物可以包含稳定剂，如甘露醇、蔗糖或十二烷基麦芽糖苷以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。
在一个实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物的佐剂和抗原可以在单个组合物中混合在一起。在这样的实施方案中，免疫原性组合物可以被制备为CMV gB抗原、CMVgH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原和佐剂的即用型混合物。
在一个实施方案中，佐剂和抗原可以制备于至少两种不同的组合物中。然后，就在施用给患者之前，可以以临时方式将不同的组合物混合在一起。在另一个实施方案中，不同的组合物可以分开施用，即同时(实际上仅相隔几秒或几分钟，例如少于5分钟)但经由至少两个不同的施用部位(如至少两个不同的注射部位)施用。在另一个实施方案中，不同的组合物可以依序施用，即在至少两个不同的时间点，如相隔至少5分钟，或最多相隔数小时或1天或2天施用。在这样的实施方案中，不同的组合物可以在相同的施用部位(如相同的注射部位)或在不同的施用部位(如不同的注射部位)施用。
在一个示例性实施方案中，免疫原性组合物可以就在施用给患者之前即兴制备。在这样的实施方案中，如本文公开的组合物的不同组分可以作为试剂盒单独提供。如本文公开的试剂盒可以包含免疫原性组合物的不同组分，每种组分位于单独的容器中，并准备混合。
在一个实施方案中，本公开文本涉及试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含如本文公开的脂质体或佐剂组合物，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含至少一种抗原。在这样的实施方案中，脂质体可以是单一类型的脂质体。佐剂组合物可以包含单一类型的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含第一类型的脂质体，其包含皂苷、甾醇和磷脂，
-包含第二类型的脂质体的第二容器，所述第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，以及
-包含第三组合物的第三容器，所述第三组合物包含至少一种抗原。
在一个实施方案中，佐剂和抗原中的至少一种可以是干燥形式。
在另一个实施方案中，所有的佐剂和抗原在单独的容器中可以是干燥形式。在这样的实施方案中，试剂盒还可以包括包含液体药物载体的容器，用于在使用前以液体形式重构组合物的不同组分。
如本文公开的试剂盒中使用的容器可以是单独的容器，例如小瓶。在某些布置中，所有组分都单独保存，直到使用时。然后可以混合小瓶的内容物，例如，通过取出一个小瓶的内容物并将其添加到另一个小瓶中，或者通过单独取出所有小瓶的内容物并将它们混合在新容器中。
在一个实施方案中，如本文公开的试剂盒可以包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含如本文公开的佐剂，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含至少一种gB抗原和至少一种如本文公开的CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。在这样的实施方案中，脂质体可以是单一类型的脂质体。佐剂组合物可以包含单一类型的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含第一类型的脂质体，其包含皂苷、甾醇和磷脂，
-包含第二类型的脂质体的第二容器，所述第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，以及
-包含第三组合物的第三容器，所述第三组合物包含至少一种gB抗原和至少一种如本文公开的CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。
在一个实施方案中，CMV抗原，即gB抗原和gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原，可以提供在单独的容器中。在这样的实施方案中，试剂盒可以包含至少三个、四个或多个容器。
在一个实施方案中，佐剂和CMV抗原(即gB抗原和gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原)中的至少一种可以是干燥形式。
在另一个实施方案中，所有的佐剂和CMV抗原(即gB抗原和gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原)在单独的容器中可以是干燥形式，例如在2或3个容器中。在这样的实施方案中，试剂盒还可以包括包含液体药物载体的容器，用于在使用前以液体形式重构组合物的不同组分。
如本文公开的试剂盒中使用的容器可以是单独的容器，例如小瓶。在某些布置中，所有组分都单独保存，直到使用时。例如，gB抗原和CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原可以在同一容器中，佐剂可以在另一容器中。然后可以混合小瓶的内容物，例如，通过取出一个小瓶的内容物并将其添加到另一个小瓶中，或者通过单独取出所有小瓶的内容物并将它们混合在新容器中。
在一个实施方案中，至少一个容器可以是注射器，而其它容器可以是小瓶。可以使用注射器(例如，与针头一起)将其内容物插入另一容器中进行混合，然后可以将混合物抽回到注射器中。然后可以将注射器的混合内容物通常通过新的无菌针头施用给患者。
在另一个实施方案中，试剂盒的容器可以是单个注射器(如多腔室注射器)的单独、连续、连通的腔室。在这样的实施方案中，每个腔室与相邻腔室连通，该连通在使用前保持关闭。该连通可以通过致动注射器的柱塞来打开，这样破坏腔室之间的密封，从而允许不同组分的混合。在这样的实施方案中，至少一个腔室包含液体组合物。其他腔室可以包含液体形式或干燥形式的组分，例如冻干产品或微丸。
在一个示例性实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物可以作为即用型抗原和佐剂的混合物包装在单个小瓶或单个注射器中。
在一个示例性实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物可以作为CMV gB抗原、CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原和佐剂的即用型混合物包装在单个小瓶或单个注射器中。
用途、使用方法和治疗方法
本公开文本还涉及如本文所述的脂质体、佐剂组合物、免疫增强剂和免疫原性组合物的用途。本节中提到的脂质体包括如上所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)和通过上述脂质体制造方法获得的脂质体，以及至少两种类型的脂质体的组合和如本文公开的脂质体的组合。
在一些实施方案中，本公开文本涉及用于佐剂化至少一种抗原的方法，所述方法至少包括以下步骤：将如本文公开的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或如本文所述的佐剂组合物与至少一种抗原组合。
在另一实施方案中，本公开文本涉及用于在有需要的个体中佐剂化针对至少一种抗原的免疫原性反应的方法，所述方法包括向所述个体施用如本文公开的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或如本文所述的佐剂组合物与所述抗原。
在另一个实施方案中，本公开文本涉及用于在有需要的个体中诱导针对至少一种抗原的免疫反应的方法，所述方法包括以下至少一个步骤：向所述个体施用如本文公开的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合或如本文所述的佐剂组合物与所述抗原。
上文描述了合适的抗原。
在本文公开的方法中，将脂质体(例如，如本文公开的单一类型的脂质体或至少两种类型的脂质体的组合)或佐剂组合物与抗原同时、单独或顺序施用。
在一个实施方案中，本文公开的方法还包括增加有需要的个体的细胞因子和/或趋化因子反应的步骤。在一些实施方案中，细胞因子和/或趋化因子反应包括有需要的个体的IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IFN-γ、IP-10、MCP-1、MIP-1β、KC和/或TNF-α的反应。在另一个实施方案中，本文公开的方法包括以下步骤：增加IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-17的反应，其向有需要的个体赋予平衡的Th1/Th2免疫反应。在另一个实施方案中，本文公开的方法包括增加有需要的个体的IL-2、IL-4、IL-5、IL-12、IL-17、IFNγ的反应的步骤。“增加细胞因子和/或趋化因子反应”是指与单独施用抗原或不使用脂质体或佐剂组合物时个体的细胞因子和/或趋化因子反应相比，个体的细胞因子和/或趋化因子反应更高。
在一个实施方案中，包含至少一种如本文公开的佐剂和至少一种抗原的如本文公开的免疫原性组合物用于在用于在接受所述组合物的患者中引起针对所述抗原的免疫反应的方法中使用，所述免疫反应是平衡的Th1/Th2免疫反应。
Th1免疫反应基本上是细胞介导的免疫反应。IFN-γ可用作Th1免疫反应的生物标记物。Th2免疫反应基本上是体液介导的免疫反应。IL-5可以是Th2免疫反应的生物标记物。
平衡的Th1/Th2免疫反应可以是这样的免疫反应，其中每百万个细胞中分泌IFNγ的细胞数与每百万个细胞中分泌IL-5的细胞数的比率的log10的范围为约1至约15、优选约2至约10、约3至约8，为约5。分泌IFNγ和IL-5的细胞可以通过ELISPOT测量，如实施例部分所详述。
IL-5或INFγ的分泌可以在免疫细胞(例如，脾细胞)上测量，这些免疫细胞是从接受了如本文公开的免疫组合物的个体获得的。
在一些实施方案中，本公开文本还涉及在有需要的个体中预防和/或治疗疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的个体施用有效量的如本文公开的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合、如本文所述的至少一种佐剂组合物、至少一种免疫增强剂或至少一种免疫原性组合物。例如，如本文公开的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合、如本文公开的佐剂组合物、免疫增强剂或免疫原性组合物可以用于在用于预防和/或治疗感染性疾病、过敏、自身免疫性疾病、罕见血液病、罕见代谢疾病、罕见神经系统疾病以及肿瘤或癌症疾病的治疗方法中使用。
在一些实施方案中，本公开文本还涉及如本文公开的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合、如本文公开的至少一种佐剂组合物、至少一种免疫增强剂或至少一种免疫原性组合物用于制造用于预防和/或治疗感染性疾病、过敏、自身免疫性疾病、罕见血液病、罕见代谢疾病、罕见神经系统疾病以及肿瘤或癌症疾病的药物的用途。例如，本公开文本可涉及的疾病可以是感染性疾病，诸如病毒性感染性疾病、细菌性感染性疾病、真菌性感染性疾病或寄生虫感染性疾病。本公开文本还涉及的疾病可以是癌症或肿瘤疾病。
在一些实施方案中，本公开文本还涉及如本文公开的至少一种脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合、如本文公开的至少一种佐剂组合物、至少一种免疫增强剂或至少一种免疫原性组合物，用于预防和/或治疗感染性疾病、过敏、自身免疫性疾病、罕见血液病、罕见代谢疾病、罕见神经系统疾病以及肿瘤或癌症疾病。
病毒感染性疾病可以是急性发热性咽炎、咽结膜热、流行性角膜结膜炎、婴儿胃肠炎、柯萨奇病毒感染、感染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、原发性HSV-1感染(例如，儿童牙龈口炎、成人扁桃体炎和咽炎、角膜结膜炎)、潜伏性HSV-1感染(例如，唇疱疹和感冒疮)、原发性HSV-2感染、潜伏性HSV-2感染、无菌性脑膜炎、感染性单核细胞增多症、巨细胞包涵体病、卡波西肉瘤、多中心型卡斯尔曼病、原发性渗出性淋巴瘤、AIDS、流感、瑞氏综合征、麻疹、感染后脑脊髓炎、流行性腮腺炎、增生性上皮病变(例如，寻常疣、扁平疣、足跖疣和肛门生殖器疣、喉乳头状瘤、疣状表皮发育不良)、宫颈癌、鳞状细胞癌、哮吼、肺炎、细支气管炎、普通感冒、脊髓灰质炎、狂犬病、细支气管炎、肺炎、流感样综合征、伴有肺炎的严重细支气管炎、德国麻疹、先天性风疹、水痘、Covid-19、呼吸道合胞病毒(RSV)感染和带状疱疹。
在一个实施方案中，疾病是流感、呼吸道合胞病毒(RSV)感染或Covid-19，并且例如是流感。
在一个实施方案中，疾病不是巨细胞病毒感染。
细菌感染性疾病可以是诸如脓肿、放线菌病、急性前列腺炎、嗜水气单胞菌、一年生黑麦草中毒、炭疽、杆菌性紫癜、菌血症、细菌性胃肠炎、细菌性脑膜炎、细菌性肺炎、细菌性阴道病、细菌相关皮肤病症、巴尔通体病、BCG-oma、葡萄球菌病、肉毒中毒、巴西紫癜热、布罗迪脓肿、布鲁氏菌病、布鲁里溃疡(Buruli ulcer)、弯曲杆菌病、龋齿、卡里翁病、猫抓病、蜂窝组织炎、衣原体感染、霍乱、慢性细菌性前列腺炎、慢性复发性多灶性骨髓炎、梭菌坏死性肠炎、牙周牙髓联合病变、传染性牛胸膜肺炎、白喉、白喉性口炎、埃里希体病、丹毒、会厌炎、丹毒、菲茨-休-柯蒂斯综合征(Fitz-Hugh-Curtis syndrome)、蚤传播斑点热、脚腐病(传染性足皮炎)、加雷氏硬化性骨髓炎(Garre's sclerosing osteomyelitis)、淋病、腹股沟肉芽肿、人粒细胞无形体病、人单核细胞增生性埃里希体病、百日咳嗽(hundred days'cough)、脓疱病、晚期先天性梅毒性眼病、军团菌病、勒米尔综合征(Lemierre'ssyndrome)、麻风病(汉森氏病(Hansen'sDisease))、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、淋巴结炎、类鼻疽病、脑膜炎球菌病、脑膜炎球菌败血症、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRS A)感染、鸟-胞内分枝杆菌(mycobacterium avium-intracellulare，MAI)、支原体肺炎、坏死性筋膜炎、诺卡菌病、坏疽性口炎(noma)(口颊坏疽或坏疽性口炎)、脐炎、眼眶蜂窝织炎、骨髓炎、脾切除术后凶险性感染(OPSI)、羊布鲁氏菌病、巴氏杆菌病、眶周蜂窝织炎、百日咳(pertussis、whooping cough)、瘟疫、肺炎球菌肺炎、波特病、直肠炎、假单胞菌感染、鹦鹉热、脓血症、脓肌炎、Q热、回归热(relapsing fever)(伤寒(typhinia))、风湿热、落基山斑疹热(RMSF)、立克次氏体病、沙门氏菌病、猩红热、败血症、沙雷氏菌感染、志贺氏菌病、南方蜱相关皮疹病患、葡萄球菌烫伤样皮肤综合征、链球菌性咽炎、游泳池肉芽肿瘤、猪布鲁氏菌病、梅毒、梅毒性主动脉炎、破伤风、中毒性休克综合征(TSS)、沙眼、战壕热、热带溃疡、结核病、兔热病、伤寒热、斑疹伤寒、泌尿生殖器结核、尿路感染、耐万古霉素金黄色葡萄球菌感染、沃-弗综合征、假结核病(耶尔森氏鼠疫杆菌)和耶尔森氏菌病。
寄生虫感染性疾病可以是阿米巴病、贾第虫病、滴虫病、非洲昏睡病、美洲昏睡病(American Sleeping Sickness)、利什曼病(黑热病)、小袋纤毛虫病、弓形体病、疟疾、棘阿米巴角膜炎和巴贝西虫病。
真菌感染性疾病可以是曲霉病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病、足分支菌病、类球孢子菌病和足癣。此外，患有免疫缺陷的人易感于真菌属的疾病，所述真菌属诸如曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptoccocus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)和肺囊虫属(Pneumocystis)。其他真菌可能侵袭眼睛、指甲、头发，并且尤其是皮肤，即所谓的皮肤寄生性真菌和嗜角质真菌，并且引起多种病症，其中常见的是癣菌病诸如脚癣。真菌孢子也是过敏的主要原因，并且来自不同分类群的大范围真菌可能引起一些人的过敏反应。
癌症或肿瘤疾病可以是例如选自以下的癌症或肿瘤疾病：黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结肠癌、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤、肾癌、胃肠肿瘤、神经胶质瘤、前列腺肿瘤、膀胱癌、直肠肿瘤、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌(mammary carcinoma)(＝乳腺癌(breastcancer))、子宫癌、宫颈癌、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓样白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肝癌、各种病毒诱导的肿瘤，例如像乳头状瘤病毒诱导的癌(例如，宫颈癌(cervical carcinoma)＝宫颈癌(cervical cancer))、腺癌、疱疹病毒诱导的肿瘤(例如，伯基特淋巴瘤、EBV诱导的B细胞淋巴瘤)、乙型肝炎诱导的肿瘤(肝细胞癌)、HTLV-1和HTLV-2诱导的淋巴瘤、听神经瘤、肺癌(lung carcinoma)(＝肺癌(lungcancer)＝支气管癌)、小细胞肺癌、咽癌、肛门癌、胶质母细胞瘤、直肠癌、星形细胞瘤、脑肿瘤、视网膜母细胞瘤、基底细胞瘤、脑转移瘤、髓母细胞瘤、阴道癌、胰腺癌、睾丸癌、霍奇金综合征、脑膜瘤、施耐博格病(Schneeberger disease)、脑下垂体肿瘤、蕈样肉芽肿、类癌、神经鞘瘤、脊柱瘤、伯基特淋巴瘤、喉癌、肾癌、胸腺瘤、子宫体癌、骨癌、非霍奇金淋巴瘤、尿道癌、CUP综合征、头/颈部肿瘤、少突神经胶质瘤、外阴癌、肠癌、结肠癌、食道癌(oesophageal carcinoma)(＝食道癌(oesophageal cancer))、疣受累(wartinvolvement)、小肠肿瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、卵巢癌、生殖器肿瘤、卵巢癌(ovarian cancer)(＝卵巢癌(ovarian carcinoma))、胰腺癌(pancreatic carcinoma)(＝胰腺癌(pancreatic cancer))、子宫内膜癌、肝转移瘤、阴茎癌、舌癌、胆囊癌、白血病、浆细胞瘤、眼睑肿瘤、前列腺癌(＝前列腺肿瘤)。
其中本公开文本可用作治疗性干预的疾病包括诸如SMN1相关脊髓性肌萎缩症(SMA)；肌萎缩侧索硬化(ALS)；GALT相关半乳糖血症；囊性纤维化(CF)；SLC3A1相关障碍，包括胱氨酸尿症；COL4A5相关障碍，包括奥尔波特综合征；半乳糖脑苷脂酶缺乏症；X连锁肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病；弗里德希氏共济失调；佩利措伊斯-梅茨巴赫病；TSC1和TSC2相关结节性硬化症；圣菲利波综合征B型(Sanfilippo B syndrome)(MPSIIIB)；CTNS相关胱氨酸病；FMR1相关障碍，包括脆性X综合征、脆性X相关震颤/共济失调综合征和脆性X卵巢早衰综合征；普拉德-威利综合征；遗传性出血性毛细血管扩张症(AT)；尼曼-皮克病C1型；神经元蜡样脂褐素相关疾病，包括幼年神经元蜡样脂褐素沉积症(JNCL)、幼年巴滕病(Juvenile Batten disease)、桑塔沃里-哈尔蒂亚病(Santavuori-Haltiadisease)、詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)、以及PTT-1和TPP1缺陷；EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4和EIF2B5相关的儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘形成不足/白质消失；CACNA1A和CACNB4相关的发作性共济失调2型；MECP2相关障碍，包括典型雷特综合征(Classic Rett Syndrome)、MECP2相关严重新生儿脑病和PPM-X综合征；CDKL5相关非典型雷特综合征；肯尼迪病(Kennedy's disease)(SBMA)；Notch-3相关脑常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病的(CADASIL)；SCN1A和SCN1B相关癫痫发作障碍；聚合酶G相关障碍，包括阿尔珀斯-胡滕洛赫尔综合征(Alpers-Huttenlocher syndrome)、POLG相关感觉性共济失调性神经病、构音障碍和眼肌瘫痪以及常染色体显性和隐性进行性眼外肌麻痹伴线粒体DNA缺失；X连锁肾上腺发育不全；X连锁无丙种球蛋白血症；法布里病；和威尔逊病。
根据一个实施方案，本公开文本的组合物可以以足以诱导针对组合物中存在的CMV抗原的免疫反应的剂量施用。CMV抗原和佐剂以免疫活性量施用。
通常，对于人类受试者，要施用的免疫原性或疫苗组合物的剂量可具有0.2至1mL的体积，例如0.4至0.8mL。在一个示例性实施方案中，剂量可以为0.5mL。
免疫原性或疫苗组合物可以作为单个组合物或作为包含至少两个容器的试剂盒提供，第一容器含有CMV抗原，例如配制为液体配制品的CMV gB抗原和CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原，第二容器含有作为液体配制品的佐剂组合物，两个容器的内容物在使用前可以按体积混合。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含至少三个容器，第一容器含有CMV抗原，例如配制为液体配制品的CMV gB抗原和CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原，第二容器含有作为液体配制品的如本文公开的第一类型的脂质体，第三容器含有作为液体配制品的如本文公开的第二类型的脂质体，三个容器的内容物在使用前可以按体积混合。
要施用给受试者的CMV抗原和佐剂的量可以根据本领域技术人员公知的各种因素而变化，例如受试者的年龄、大小、体重、性别、症状或状况，以及施用途径等。例如，可以根据体重或体表面积计算剂量。
根据另一个实施方案，如本文公开的免疫原性组合物可用作CMV疫苗，例如HCMV疫苗。
如本文公开的免疫原性或疫苗组合物可以通过通常用于施用免疫原性或疫苗组合物的任何途径施用。将使用导致诱导预期免疫反应的方案。通常，免疫计划可以包括几次施用。施用的免疫原性组合物的量足以产生所需的免疫反应，并且可以由本领域技术人员确定。
根据另一个实施方案，如本文公开的免疫原性组合物可作为药物用于诱导针对CMV(例如，HCMV)的中和抗体的方法中。诱导的中和抗体可以中和CMV，例如HCMV。中和CMV可以预防CMV疾病或感染，或降低CMV疾病或感染发生的风险，或可以减轻CMV疾病的症状。如本文公开的方法可以包括向受试者施用至少第一剂和第二剂的所述组合物，所述至少第一剂和第二剂间隔至少一周施用，例如间隔至少一个月或两个月。在如本文公开的方法中，第二剂可向受试者诱导的反应原性低于第一剂，所述反应原性用至少包括以下步骤的方法测量：(a)将选自CRP、球蛋白和纤维蛋白原的至少一种生物标记物掺入(i)在从已施用所述第一剂的所述组合物并在施用所述第二剂的所述组合物前的所述受试者中取出的第一血液样品中以获得所述生物标记物的第一测量值，和(ii)在从已施用所述第二剂的所述组合物的所述受试者中取出的第二血液样品中以获得所述生物标记物的第二测量值，以及(b)将所述第一测量值与所述第二测量值进行比较，其中所述比较提供关于由所述施用的组合物引起的反应原性的有用信息。
在一个实施方案中，如本文公开的方法可以包括施用第三剂。第三剂可以与第一剂间隔至少4、5、6或7个月施用。在一个实施方案中，第三剂可以与第一剂间隔6个月施用。
在一个实施方案中，所公开的方法可以包括施用第一剂和与第一剂相隔一或两个月的第二剂。在另一个实施方案中，所公开的方法可以包括施用第一剂、与第一剂相隔一或两个月的第二剂，和与第一剂相隔六个月的第三剂。
根据另一个实施方案，本公开文本涉及作为药物在受试者中诱导针对CMV(例如，HCMV)的免疫反应的方法。诱导的免疫反应可以预防CMV疾病或感染，或可以降低CMV疾病或感染发生的风险，或可以减轻CMV疾病或感染的症状。如本文公开的方法可以包括以下至少一个步骤：向受试者施用如本文公开的至少一种免疫原性或疫苗组合物。
要预防或降低发生可能性的CMV感染或疾病可以是育龄妇女的CMV感染、妊娠期的CMV感染、婴儿的CMV先天性感染或接受器官移植(如实体器官移植或骨髓移植)的受试者的CMV病染。
在一个实施方案中，如本文公开的方法用于在接受如本文公开的组合物的受试者中预防CMV疾病或感染，例如HCMV疾病或感染。
在一个实施方案中，如本文公开的方法可以包括间隔至少一周(例如，间隔至少一个月或两个月)向所述受试者施用至少第一剂和第二剂的所述组合物，其中所述第二剂诱导的反应原性低于所述第一剂，所述反应原性用至少包括以下步骤的方法测量：(a)将选自CRP、球蛋白和纤维蛋白原的至少一种生物标记物掺入(i)在从已施用所述第一剂的所述组合物并在施用所述第二剂的所述组合物前的所述受试者中取出的第一血液样品中以获得所述生物标记物的第一测量量，和(ii)在从已施用所述第二剂的所述组合物的所述受试者中取出的第二血液样品中以获得所述生物标记物的第二测量量，以及(b)将所述第一测量量与所述第二测量量进行比较，其中所述比较提供关于由所述施用的组合物引起的反应原性的有用信息。
在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中至少一种生物标记物的测量量增加可以指示反应原性组合物。
在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中不存在至少一种生物标记物的测量量增加可以指示没有或具有减少的反应原性组合物。
如本文公开的免疫原性组合物，例如疫苗组合物，可以在施用这种组合物的受试者中增加中和抗体水平和/或中和抗体持久性。
在一个实施方案中，本公开文本涉及用于预防或降低受试者中CMV感染或疾病发生可能性的方法。这样的方法可以包括施用免疫有效量的如本文公开的免疫原性组合物或疫苗组合物的步骤。
本发明的免疫原性组合物，例如疫苗组合物，可以按照包括施用至少第一剂和第二剂组合物的施用方案施用给受试者。施用方案可以包括2或3剂，在时间上连续施用给受试者。2个连续剂量之间的时间为1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间。
第一剂和第二剂可以间隔至少约一个月，例如约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月、约七个月或约八个月。在一个示例性实施方案中，第一剂和第二剂可以间隔至少约一个月、两个月、或约三个月、或约四个月。在一个示例性实施方案中，第一剂和第二剂间隔一个月。
在一个实施方案中，第二剂之后可以接着进一步的后续剂量，例如至少一个、至少两个或至少四个后续剂量。分隔每个后续剂量的时间间隔可能与分隔第一剂和第二剂的时间段相同。在另一个实施方案中，分隔后续剂量的时间段可以不同。在一个实施方案中，分隔后续剂量的每个时间段可以彼此不同。将后续剂量彼此分隔的时间段可以是约1至约8个月、约2至约4个月或可能为约3个月。在一个实施方案中，分隔第一剂和第三剂的时间段可以是约4至约8个月，例如约6个月。
在一个示例性实施方案中，如本文公开的免疫原性或疫苗组合物可以分两剂或三剂施用。在一个实施方案中，其中组合物可以分三剂施用，第一剂和第三剂可以间隔约4至约8个月施用，例如间隔约6个月。例如，组合物可以分第一剂、第二剂和第三剂施用。在这样的实施方案中，第二剂可以在第一剂后约1至约3个月施用，例如在第1剂后约1个月或1个半月施用，并且第三剂可以在第一剂后约4至8个月施用，例如约6个月。
在另一个实施方案中，如本文公开的组合物以单剂量施用。
根据本发明的疫苗可以分两剂施用。优选地，第一剂和第二剂大约约间隔一个月、二个月、三个月、六个月、八个月或九个月施用。在一个示例性实施方案中，第一剂和第二剂可以间隔两个月施用。
如本文公开的免疫原性组合物可以施用给任何有需要的受试者。作为这些组合物所涉及的受试者的例子，可以列举：婴儿、儿童、青少年、年轻人、成年人或老年人。在一个实施方案中，受试者可以是新生儿或育龄妇女。在另一个实施方案中，受试者可以是要接受器官移植的受试者，例如实体器官、骨髓或干细胞移植。在一个示例性实施方案中，受试者可以是育龄妇女(16-45岁)或少女(11-15岁)。
如本文公开的组合物可以单独施用，或与其他免疫原性或疫苗组合物同时施用。这些组合物可以针对百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌、破伤风梭菌、结核分枝杆菌、疟原虫属物种、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、疏螺旋体属物种、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、梭菌属物种、麻风分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、流感病毒、水痘带状疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS-Cov-2病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、人乳头瘤病毒、埃博拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丽沙病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒。
应理解，本公开文本包括其中将来自所列权利要求中至少一个的至少一个限制、要素、条款描述项等引入从属于相同基础权利要求(或相关的任何其他权利要求)的另一权利要求中的所有变体、组合和排列，除非另有说明或除非本领域普通技术人员清楚会出现矛盾或不一致。在要素被呈现为列表，例如以马库什群组或类似形式的情况下，应理解还公开了所述要素的每个子组，并且可以从所述群组中移除一种或多种任何要素。应理解，通常，在本公开文本或本公开文本的多方面被称为包括特定要素、特征等的情况下，本公开文本或本公开文本的多方面还包括由此类要素、特征等组成或基本上由此类要素、特征等组成的实施方案。为了简单起见，这些实施方案并不是在每种情况下都以如此多的词语在本文中具体阐述。还应理解，本公开文本的任何实施方案或方面都可以明确地从权利要求中排除，而不管在本说明书中是否叙述了特定的排除。将用于描述本公开文本的背景并提供关于其实践的其他细节的本文引用的出版物和其他参考材料特此通过引用并入。
本说明书中公开的序列作为参考。相同的序列也呈现于根据用于专利事务目的的标准要求格式化的序列表中。如与标准序列表有任何序列差异，以本说明书中描述的序列为准。
在不限制本公开文本的情况下，下文出于说明的目的描述了本公开文本的多个实施方案。
在以下项中进一步详述了本发明的实施方案。
根据第一项，本公开文本涉及一种脂质体，所述脂质体包含皂苷、甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂(诸如单一类型的脂质体)，或
一种脂质体组合，所述组合包含至少两种类型的脂质体，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，
其中所述Toll样受体4(TLR4)激动剂具有式(I)：
-其中R1选自：
a)C(O)；
b)C(O)-(C1-C14烷基)-C(O)，其中所述C1-C14烷基任选地被羟基、C1-C5烷氧基、C1-C5亚烷基二氧基、(C1-C5烷基)氨基或(C1-C5烷基)芳基取代，其中所述(C1-C5烷基)芳基的所述芳基部分任选地被C1-C5烷氧基、(C1-C5烷基)氨基、(C1-C5烷氧基)氨基、(C1-C5烷基)-氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)OH或-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)-(C1-C5)烷基取代；
c)包含C2-C15直链或支链的烷基，任选地被羟基或烷氧基取代；和
d)-C(O)-(C6-C12亚芳基)-C(O)-，其中所述亚芳基任选地被羟基、卤素、硝基或氨基取代；
-a和b独立地为0、1、2、3或4；
-d、d’、d”、e、e’和e”独立地为0、1、2、3或4；
-X1、X2、Y1和Y2独立地选自空、氧、-NH-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-和-N(C1-C4烷基)-；
-W1和W2独立地选自羰基、亚甲基、砜和亚砜；
-R2和R5独立地选自：
a)C2至C20直链或支链烷基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
b)C2至C20直链或支链烯基或二烯基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
c)C2至C20直链或支链烷氧基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
d)-NH-(C2至C20直链或支链烷基)，其中所述烷基任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；和
e)
其中Z选自O和NH，并且M和N独立地选自包含C2-C20直链或支链的烷基、烯基、烷氧基、酰氧基、烷基氨基和酰氨基；
-R3和R6独立地选自C2至C20直链或支链烷基或烯基，任选地被氧代基或氟取代；
-R4和R7独立地选自C(O)-(C2至C20直链或支链烷基或烯基)、C2至C20直链或支链烷基、C2至C20直链或支链烷氧基和C2至C20直链或支链烯基；其中所述烷基、烯基或烷氧基能够独立且任选地被羟基、氟或C1-C5烷氧基取代；
-G1、G2、G3和G4独立地选自氧、亚甲基、氨基、硫醇、-C(O)NH-、-NHC(O)-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-；
或G2R4或G4R7能够一起是氢原子或羟基；
或该化合物的药学上可接受的盐；
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为约1:50至约1:1或约1:35至约1:25，或TLR4激动剂:皂苷的重量比为约1:10存在。
根据第二项，本公开文本涉及根据项1所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/ml。
根据第三项，本公开文本涉及根据项1或2所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述TLR4激动剂具有式(II)：
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根据第四项，本公开文本涉及根据项1至3中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述TLR4激动剂是式(III)的E6020：
根据第五项，本公开文本涉及根据项1至4中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述皂苷是皂树皂苷。
根据第六项，本公开文本涉及根据项1至5中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述皂苷是从石碱木树皮中提取的。
根据第七项，本公开文本涉及根据项1至6中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述皂苷选自QS-7、QS-17、QS-18、QS-21及其组合。在一些实施方案中，所述皂苷是QS21或QS7。
根据第八项，本公开文本涉及根据项1至7中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述甾醇选自胆固醇或其衍生物、麦角甾醇、链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)、7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)、二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)、酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)、7-烯胆烷醇(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)、薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、谷甾烷醇、菜油甾醇(菜油甾-5-烯-3β-醇)、菜油甾烷醇(5a-菜油甾烷-3b-醇)、24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-亚甲基-3β-醇)、胆甾醇基十七酸酯(胆甾-5-烯-3β-基十七酸酯)、胆甾醇基油酸酯、胆甾醇基硬脂酸酯及其混合物。
根据第九项，本公开文本涉及根据项1至8中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述甾醇选自胆固醇或其衍生物，特别是胆固醇。
根据第十项，本公开文本涉及根据项1至9中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述皂苷和所述甾醇以皂苷:甾醇的重量:重量比的范围为1:100至1:1，皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:2，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:5存在。
根据第十一项，本公开文本涉及根据项1至10中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及其混合物。
根据第十二项，本公开文本涉及根据项1至11中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体，其中所述磷脂是选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、SOPC(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)及其混合物的磷脂酰胆碱。
根据第十三项，本公开文本涉及一种用于制造脂质体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解式(I)的TLR4激动剂(其在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/ml，在25℃下测量)、甾醇和磷脂，
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体，
其中在步骤(a)时、步骤(b)时或步骤b)之后添加皂苷，并且
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以皂苷:TLR4激动剂的重量:重量比的范围为约1:1至约400:1、范围为约2:1至约200:1、范围为约2.5:1至约100:1、范围为约3:1至约40:1或范围为约5:1至约25:1存在。
根据第十四项，本公开文本涉及根据项13所述的方法，所述方法包括在步骤(a)之前选择在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/ml的式(I)的TLR4激动剂的步骤。
根据第十五项，本公开文本涉及根据项13至14中任一项所述的方法，其中将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体的步骤(b)通过使用溶剂注入法进行。
根据第十六项，本公开文本涉及根据项13至15中任一项所述的方法，其中将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体的步骤(b)包括以下步骤：
(b1)将步骤(a)获得的溶液注入和/或稀释到水性缓冲液中，以及
(b2)除去所述有机水混溶性溶剂。
根据第十七项，本公开文本涉及根据项13至16中任一项所述的方法，其中所述有机水混溶性溶剂选自乙醇、异丙醇或其混合物，或者是乙醇。
根据第十八项，本公开文本涉及根据项13至17中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤(c)：过滤在步骤(b)中获得的脂质体并回收平均直径小于200nm的脂质体。
根据第十九项，本公开文本涉及一种佐剂组合物，所述佐剂组合物包含至少一种根据项1至12中任一项所述的脂质体或脂质体组合或至少一种按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体。
根据第二十项，本公开文本涉及一种免疫增强剂，所述免疫增强剂包含至少一种根据项1至12中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体或至少一种按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体。
根据第二十一项，本公开文本涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种根据项1至12中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体、或至少一种按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体、或根据项19所述的佐剂组合物、以及至少一种抗原。
根据第二十二项，本公开文本涉及根据项21所述的免疫原性组合物，其中所述抗原选自细菌抗原、原生动物抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生虫抗原和肿瘤抗原。
根据第二十三项，本公开文本涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含至少一种根据项1至12中任一项所述的脂质体、或至少一种按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体、或根据项19所述的佐剂组合物，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含至少一种抗原。
在一些实施方案中，本公开文本涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含根据项1至12中任一项所述的脂质体组合的至少第一类型的脂质体，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含根据项1至12中任一项所述的脂质体组合的至少第二类型的脂质体，以及
-包含第三组合物的第三容器，所述第三组合物包含至少一种抗原。
根据第二十四项，本公开文本涉及一种用于制造免疫原性组合物的方法，所述方法至少包括以下步骤：将至少一种根据项1至12中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体、或至少一种按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体、或根据项19所述的佐剂组合物与至少一种抗原混合。
根据第二十五项，本公开文本涉及一种用于佐剂化至少一种抗原的方法，所述方法至少包括以下步骤：将所述至少一种抗原与至少一种根据项1至12中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体、或至少一种按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体、或根据项19所述的佐剂组合物组合。
根据第二十六项，本公开文本涉及一种用于在有需要的个体中佐剂化针对至少一种抗原的免疫原性反应的方法，所述方法包括向所述个体施用所述至少一种抗原与至少一种根据项1至12中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体、或至少一种按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体、或根据项19所述的佐剂组合物。
根据第二十七项，本公开文本涉及一种用于在有需要的个体中诱导针对至少一种抗原的免疫反应的方法，所述方法包括以下至少一个步骤：向所述个体施用所述至少一种抗原与至少一种根据项1至12中任一项所述的脂质体(例如，单一类型的脂质体)或至少两种类型的脂质体的组合的脂质体、或至少一种按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体、或根据项19所述的佐剂组合物。
根据第二十八项，本公开文本涉及根据项26或27所述的方法，其中将所述脂质体或所述佐剂组合物与所述抗原同时、单独或顺序施用。
根据第二十九项，本公开文本涉及根据项26至28中任一项所述的方法，所述方法还包括增加所述个体的细胞因子和/趋化因子反应。
根据第三十项，本公开文本涉及根据项29所述的方法，所述方法包括选自以下的细胞因子和/或趋化因子的增加：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IFN-γ、IP-10、MCP-1、MIP-1β、KC和/或TNF-α。
根据第三十一项，本公开文本涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物至少包含：
-一种CMV gB抗原；
-一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原；和
-一种佐剂，其包含至少一种包含皂苷、甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂的脂质体，或至少一种包含至少两种类型的脂质体的脂质体组合，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂。
根据第三十二项，本公开文本涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物至少包含：
-一种CMV gB抗原；
-一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原；和
-一种佐剂，其包含至少一种包含皂苷、甾醇、磷脂和式(I)的Toll样受体4(TLR4)激动剂的脂质体，或
包含至少两种类型的脂质体的脂质体组合，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，
其中所述Toll样受体4(TLR4)激动剂是：
-其中R1选自：
a)C(O)；
b)C(O)-(C1-C14烷基)-C(O)，其中所述C1-C14烷基任选地被羟基、C1-C5烷氧基、C1-C5亚烷基二氧基、(C1-C5烷基)氨基或(C1-C5烷基)芳基取代，其中所述(C1-C5烷基)芳基的所述芳基部分任选地被C1-C5烷氧基、(C1-C5烷基)氨基、(C1-C5烷氧基)氨基、(C1-C5烷基)-氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)OH或-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)-(C1-C5)烷基取代；
c)包含C2-C15直链或支链的烷基，任选地被羟基或烷氧基取代；和
d)-C(O)-(C6-C12亚芳基)-C(O)-，其中所述亚芳基任选地被羟基、卤素、硝基或氨基取代；
-a和b独立地为0、1、2、3或4；
-d、d’、d”、e、e’和e”独立地为0、1、2、3或4；
-X1、X2、Y1和Y2独立地选自空、氧、-NH-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-和-N(C1-C4烷基)-；
-W1和W2独立地选自羰基、亚甲基、砜和亚砜；
-R2和R5独立地选自：
a)C2至C20直链或支链烷基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
b)C2至C20直链或支链烯基或二烯基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
c)C2至C20直链或支链烷氧基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
d)-NH-(C2至C20直链或支链烷基)，其中所述烷基任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；和
e)
其中Z选自O和NH，并且M和N独立地选自包含C2-C20直链或支链的烷基、烯基、烷氧基、酰氧基、烷基氨基和酰氨基；
-R3和R6独立地选自C2至C20直链或支链烷基或烯基，任选地被氧代基或氟取代；
-R4和R7独立地选自C(O)-(C2至C20直链或支链烷基或烯基)、C2至C20直链或支链烷基、C2至C20直链或支链烷氧基和C2至C20直链或支链烯基；其中所述烷基、烯基或烷氧基能够独立且任选地被羟基、氟或C1-C5烷氧基取代；
-G1、G2、G3和G4独立地选自氧、亚甲基、氨基、硫醇、-C(O)NH-、-NHC(O)-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-；
或G2R4或G4R7能够一起是氢原子或羟基；
或该化合物的药学上可接受的盐
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为约1:50至约1:1或约1:35至约1:25，或TLR4激动剂:皂苷的重量比为约1:10存在。
根据第三十三项，根据项31或32所述的免疫原性组合物，其中所述CMV gB抗原选自全长CMV gB抗原、缺失跨膜结构域的至少一部分的截短的CMV gB抗原、基本上缺失所有跨膜结构域的截短的CMV gB抗原、缺失细胞内结构域的至少一部分的截短的CMV gB抗原、基本上缺失所有细胞内结构域的截短的CMV gB抗原以及基本上缺失跨膜结构域和细胞内结构域两者的截短的CMV gB抗原。
根据第三十四项，根据项31至33中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述CMVgB抗原是gBdTm。
根据第三十五项，根据项31至34中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述gH缺失了跨膜结构域的至少一部分或基本上所有跨膜结构域。
根据第三十六项，根据项31至35中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述gH包含由CMV UL75基因编码的全长gH多肽的胞外域。
根据第三十七项，根据项31至36中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述CMVgB抗原和所述CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原是唯一的CMV抗原。
根据第三十八项，根据项31至37中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数(在25℃下测量)为至少约0.2mg/ml。
根据第三十九项，根据项31至38中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR4激动剂具有式(II)：
根据第四十项，根据项31至39中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR4激动剂是式(III)的E6020：
根据第四十一项，根据项31至40中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷是皂树皂苷。
根据第四十二项，根据项31至41中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷是从石碱木树皮中提取的。
根据第四十三项，根据项31至42中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷选自QS-7、QS-17、QS-18、QS-21及其组合。在一些实施方案中，所述皂苷是QS21或QS7。
根据第四十四项，根据项31至43中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述甾醇选自胆固醇或其衍生物、麦角甾醇、链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)、7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)、二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)、酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)、7-烯胆烷醇(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)、薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、谷甾烷醇、菜油甾醇(菜油甾-5-烯-3β-醇)、菜油甾烷醇(5a-菜油甾烷-3b-醇)、24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-亚甲基-3β-醇)、胆甾醇基十七酸酯(胆甾-5-烯-3β-基十七酸酯)、胆甾醇基油酸酯、胆甾醇基硬脂酸酯及其混合物。
根据第四十五项，根据项31至44中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述甾醇选自胆固醇或其衍生物，特别是胆固醇。
根据第四十六项，根据项31至45中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷和所述甾醇以皂苷:甾醇的重量:重量比的范围为1:100至1:1，皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:2，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:5存在。
根据第四十七项，根据项31至46中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及其混合物。
根据第四十八项，根据项31至47中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述磷脂是选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、SOPC(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)及其混合物的磷脂酰胆碱。
根据第四十九项，本公开文本涉及根据项31至48中任一项所述的免疫原性组合物，用作CMV疫苗。
根据第五十项，本公开文本涉及根据项31至49中任一项所述的免疫原性组合物，用于在用于诱导针对CMV的中和抗体的方法中使用，所述方法包括向受试者施用至少第一剂和第二剂的所述组合物，所述至少第一剂和第二剂相隔至少一个月施用，其中所述第二剂向所述受试者诱导的反应原性低于所述第一剂，所述反应原性用至少包括以下步骤的方法测量：(a)将选自CRP、球蛋白和纤维蛋白原的至少一种生物标记物掺入(i)在从已施用所述第一剂的所述组合物并在施用所述第二剂的所述组合物前的所述受试者中取出的第一血液样品中以获得所述生物标记物的第一测量量，和(ii)在从已施用所述第二剂的所述组合物的所述受试者中取出的第二血液样品中以获得所述生物标记物的第二测量量，以及(b)将所述第一测量量与所述第二测量量进行比较，其中所述比较提供关于由所述施用的组合物引起的反应原性的有用信息。在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中至少一种生物标记物的测量量增加可以指示反应原性组合物。在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中不存在至少一种生物标记物的测量量增加可以指示没有或具有减少的反应原性组合物。
根据第五十一项，本公开文本涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含根据项31和38至48中任一项的佐剂，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含根据项32至37中任一项的至少一种CMV gB抗原和至少一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。
在一些实施方案中，本公开文本涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含第一组合物的第一容器，所述第一组合物包含根据项1至12中任一项所述的脂质体组合的至少第一类型的脂质体，以及
-包含第二组合物的第二容器，所述第二组合物包含根据项1至12中任一项所述的脂质体组合的至少第二类型的脂质体，以及
-包含第三组合物的第三容器，所述第三组合物包含根据项32至37中任一项的至少一种CMV gB抗原和至少一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原。
根据第五十二项，本公开文本涉及一种用于在受试者中诱导针对CMV的免疫反应的方法，所述方法包括以下至少一个步骤：向所述受试者施用至少一种根据项31至48中任一项所述的免疫原性组合物。
根据第五十三项，根据项52所述的方法，间隔至少一个月向所述受试者施用第一剂和第二剂的所述组合物，其中所述第二剂诱导的反应原性低于所述第一剂，所述反应原性用至少包括以下步骤的方法测量：(a)将选自CRP、球蛋白和纤维蛋白原的至少一种生物标记物掺入(i)在从施用所述第一剂的所述组合物后并在施用所述第二剂的所述组合物前的所述受试者中取出的第一血液样品中以获得所述生物标记物的第一测量量，和(ii)在从施用所述第二剂的所述组合物后的所述受试者中取出的第二血液样品中以获得所述生物标记物的第二测量量，以及(b)将所述第一测量量与所述第二测量量进行比较，其中所述比较提供关于由所述施用的组合物引起的反应原性的有用信息。在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中至少一种生物标记物的测量量增加可以指示反应原性组合物。在一些实施方案中，与第一次测量相比，第二次测量中不存在至少一种生物标记物的测量量增加可以指示没有或具有减少的反应原性组合物。
根据第五十四项，本公开文本涉及根据项1至12中任一项所述的脂质体或脂质体组合、按照根据项13至18中任一项所述的方法获得的脂质体、根据项19所述的免疫增强剂、根据项19所述的佐剂组合物、根据项21所述的免疫原性组合物或根据项31至47中任一项所述的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗感染性疾病、过敏、自身免疫性疾病、罕见血液病、罕见代谢疾病、罕见神经系统疾病以及肿瘤或癌症疾病。
[实施例]
实施例1：制备脂质体的方法
I.材料和方法
根据如下溶剂(例如，乙醇)注入法制备脂质体。
通过将2.0mg E6020粉末溶解在0.998ml乙醇中，以2mg/ml制备E6020乙醇溶液。
通过将40mg DOPC和10mg胆固醇溶解在0.850ml乙醇中并添加0.100ml先前制备的E6020乙醇溶液，以40mg/ml DOPC、10mg/ml胆固醇和0.200mg/ml E6020制备4倍浓缩的乙醇溶液。
将溶液在室温(RT)下搅拌直至产物完全溶解，得到无色溶液。
在7ml Lyo玻璃小瓶中，在室温下以1000rpm搅拌3.0mL CBS(柠檬酸盐缓冲溶液)pH6.3(柠檬酸盐10mM，NaCl 140mM，pH 6.3)。使用具有22ga针头的Hamilton注射器和注射泵以0.1ml/min缓慢添加1.0ml脂质溶液以形成脂质体。将脂质体用CBS pH 6.3透析(在10000MCWO透析盒上)三次(半天、一夜和一天)。
将脂质体悬浮液在直径33mm的Millex过滤器PVDF 0,22μm上无菌过滤，并在氮气下在+4℃下储存。
根据透析稀释因子估计脂质体组分浓度。对于1.6的透析稀释因子，脂质体组分浓度为6.25mg/ml DOPC、1.56mg/ml胆固醇和0.031mg/ml E6020。
在流动罩下，将3.0mg QS21重新悬浮在3.0mL CBS pH 6.3中，以获得1.0mg/ml的QS21溶液，并在直径25mm的Pall Acrodisc 0.2μm上无菌过滤。
在无菌条件下，通过向5.000ml先前脂质体悬浮液和1.250ml CBS pH 6.3中添加1.563ml在CBS pH 6.3中1.0mg/ml的QS21溶液来配制SPA14(脂质体悬浮液)。将混合物使用涡旋搅拌10秒，并在氮气下在+4℃下储存，得到4mg/ml DOPC、1mg/ml胆固醇、0.020mg/mlE6020和0.200mg/ml QS21的最终SPA14无菌悬浮液。
为了与抗原混合，将SPA14佐剂轻轻倒置5次，以使产物均质化，然后与两次浓缩的抗原混合。然后将免疫原性组合物(佐剂SPA14+抗原)储存在适当的温度(2℃-8℃)下，直到进一步使用。
需要制备2x C浓缩的抗原(例如，对于50μl注射下5μg抗原的剂量(C＝100μg/ml)，以200μg/ml制备抗原)
与抗原的混合按体积/体积进行，并且将所得混合物轻轻倒置5次。
将混合物在注射前或注射前最多3小时制备好。在后一种情况下，必须将它们放置在2℃-8℃下直到注射。
从Shingrix商业疫苗的佐剂小瓶中取样比较佐剂AS01B。
在体外MIMIC系统中进行的整个研究中(参见实施例3)，所谓的“媒介物”或“QS21脂质体”如针对SPA14所述制备，而不在脂质乙醇溶液中包括E6020。
实施例2：E6020的醇溶性
I.材料和方法
将E6020(E6020 Eisai)和MPL粉末(来自明尼苏达沙门氏菌(SalmonellaMinnesota)Re 595，Sigma L6895)以0.5、1.0、2.0和10mg/ml溶解在无水乙醇(EtOH)(CarloErba)中。
将1ml每种溶液在室温(约25℃)下混合3h。
E6020溶液是透明的，但是MPL溶液是乳白色的，乳白色随着浓度的增加而增加。在乳白色(指示不溶性)出现和增加后进行浊度测定。
在BMG-Labtech Nephelostar上进行浊度测定，在UV 96孔微板(Thermo UV FlatBottom 96，参考8404)上0.200ml样品，采用无水乙醇空白。
记录每种溶液的RNU(相对浊度单位)并绘制在图表上。
II.结果
E6020乙醇溶液在至少10mg/ml的浓度下完全澄清，而MPL乙醇溶液即使在测试的最低浓度下也是乳白色的，乳白色随着MPL浓度的增加而增加。(图1)。
如数据所示，适合于本公开文本的TLR4激动剂(诸如E6020)的溶解度为至少10mg/ml。这种溶解度使TLR4激动剂有利于与乙醇注入法一起使用以制造脂质体。
MPL在乙醇中的非常低的溶解度使其与这种脂质体制造方法不相容。
实施例3：含E6020-QS21的脂质体的免疫增强作用
在该实施例中，使用MIMIC系统的先天臂(arm)评估SPA14的先天免疫谱。MIMIC系统(模块化免疫体外构建体)是模仿人免疫系统的人工系统。该模块(称为外周组织等效(peripheral tissue equivalent，PTE)构建体)是一种三维组织工程化内皮细胞/胶原基质培养系统，其先前已用于研究TLR激动剂和疫苗(Ma Y等人,Immunology,2010,130:374-87)。将TLR激动剂应用于PTE模块不仅诱导可通过基于多重珠的阵列评价的细胞因子和趋化因子产生，还促进可通过流式细胞术分析检测的树突细胞(DC)分化和成熟(Drake等人,Disruptive Science and Technology,2012,1:28-40；Higbee等人,Altern Lab Anim,2009,37增刊1:19-27)。对于该分析，在未处理或用不同剂量的SPA14或QS21脂质体处理的培养物中评价抗原呈递细胞(APC)激活和细胞因子/趋化因子谱。
I.材料和方法
1.脂质体制备
根据实施例1中描述的方案制备SPA14和QS21脂质体。
SPA14-20：由DOPC/Chol/QS21/E6020组成的脂质体配制品(用PBS稀释1/2后为2:0.5:0.1:0.01mg/ml)
SPA14-8：由DOPC/Chol/QS21/E6020组成的脂质体配制品(用PBS稀释1/2后为2:0.5:0.1:0.004mg/ml)
QS21脂质体(SPA14-0)：由DOPC/Chol/QS21/组成的脂质体配制品(用PBS稀释1/2后为2:0.5:0.1mg/ml)
该研究(其主要评价SPA14刺激人免疫细胞的能力)旨在测试SPA14中E6020的两种浓度，即8和20μg/mL，使所有其他SPA14成分保持不变。
接下来，将测试项目按10倍剂量曲线稀释1:40-1:4000或按2倍剂量曲线稀释1:20-1:160。为了了解QS21脂质体对由SPA14诱导的先天免疫特性的贡献，还在使用与如上所述相同剂量方案的测定中检查了QS21脂质体(减去任何TLR激动剂)。
作为SPA14中的TLR-4激动剂的E6020(EISAI)(Ishizaka等人,Expert review ofvaccines,2007,6:773-84；WO 2007005583A1)也以每个剂量范围的最高浓度单独掺入测定中。
2.PBMC制备
从OneBlood(佛罗里达州奥兰多)血库的供体收集单采血液制品。研究方案和供体计划由Chesapeake Research Review,Inc.(马里兰州哥伦比亚)审查和批准。在收集时，将来自健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)通过Ficoll密度梯度分离富集，并将其冷冻保存在含DMSO的冷冻培养基中，如Ma Y.等人(Assessing the immunopotency of Toll-likereceptor agonists in an in vitro tissue-engineered immunologicalmodel.Immunology 130:374-87,2010)所教导的那样。
3. PTE测定
使用上述Ma Y.等人教导的方法在机器人生产线上组装PTE构建体。
简而言之，使内皮细胞生长至汇合在胶原基质(Advanced Biomatrix，加利福尼亚州圣迭戈)上。此后，将从冷冻原液制备的供体PBMC应用于测定孔。在孵育90分钟后，通过洗涤去除未迁移的细胞，并将测试项目以不同的浓度添加到培养物中，如上所述。
在这些测定中使用100ng/mL LPS(来自铜绿假单胞菌，目录号L8643，MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿)和10μg/mL R848(目录号TLRL-R848，InvivoGen，加利福尼亚州圣迭戈)的混合物作为阳性对照(L+R)。用未添加任何处理的培养基设置阴性测定对照无Ag/Mock(M-模拟)。
在48h处理时间段后收获培养物上清液，并且通过多重测定分析细胞因子/趋化因子，并通过ELISA分析PGE2分泌。对在相同时间点收获的细胞使用流式细胞术进行细胞活力和APC激活的表型分析。
4.细胞因子/趋化因子分析
使用人12重多细胞因子检测系统(Millipore)分析/>培养物上清液。试剂盒包括IFN-α2、IFNγ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IP-10、MCP-1、MIP-1β、RANTES和TNFα。使用Bio-Plex manager软件基于相关标准曲线计算分析物浓度(Luna等人PloS one第13卷,6e0197478.2018年6月6日,doi:10.1371/journal.pone.0197478)。
对于运行验收标准，每种分析物的定量下限(LLOQ)和定量上限(ULOQ)是针对标准值的5参数逻辑(5PL)曲线拟合基于每个点的回收百分比(观测值/预期值*100)确立的。80％-120％的回收百分比被认为是可接受的，因此落在此范围内的值限定了标准曲线的下限和上限。审查了原始数据文件的珠计数；当每个区域至少计数35个珠时，数据点被认为是有效的。
5.流式细胞术
如上述Luna等人所教导的那样进行流式细胞术染色和采集。
简而言之，将MIMIC PTE衍生的细胞用PBS洗涤并用Live-Dead Aqua(InvitroGen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)在冰上标记20min。在洗涤并进行IgG-Fc阻断(正常小鼠血清；目录号015-000-120，Jackson ImmunoResearch Laboratories)后，将细胞与荧光染料标记的mAb的混合物一起孵育，所述mAb诸如抗CD14、抗HLA-DR、抗CD11c、抗CD86、抗CD25、抗CD83、抗CD3和抗CD19，它们对非髓系细胞和免疫配体具有特异性(BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞)。此后，将细胞用缓冲培养基洗涤，并在配备有BD FACS Diva软件(BDBiosciences)的BD Fortessa流式细胞仪上采集。使用FlowJo软件(Tree Star，俄勒冈州阿什兰)进行数据分析。对于流式门控，首先从活细胞群体中排除双联体，然后使用转储通道(dump-channel)方法从分析中去除淋巴细胞(CD3+，CD19+)。接下来，将HLA-DR+细胞门控为CD11c+单核DC和CD123+pDC。此后，分析每个DC亚群体的HLA-DR和单独激活标记物(CD14、CD25、CD86、CD83)的表达。
6.数据分析和图形生成
数据被导出到GraphPad Prism(GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣迭戈)用于统计分析和图形制作。细胞因子数据被导出到excel数据库中。从数据表中去除超出范围的高(>OOR)值(高于ULOQ的值)。超出范围的低(<OOR)值被替换为代表1/2LLOQ的值。经由单因素方差分析检验和图基事后检验调整对不同测试项目进行比较。“p”值p<0.05被认为是显著的。
II.结果
1.SPA14的免疫毒性最小
细胞活力的评估对于确定化合物在细胞亚群中的潜在免疫细胞毒性作用至关重要。为了在本研究中进行这种分析，从48h处理的MIMIC-培养物中收获细胞，将其用live-dead染色液标记，并经由流式细胞术分析其细胞活力。
如在图2(其显示了基于模拟条件归一化为100％活力的每种处理条件)中所见，SPA14-8和SPA14-0(QS21脂质体)在所有测试剂量下对细胞活力的影响最小且相当。有趣的是，当单独测试时，E6020在相当于SPA14的1:40稀释度的剂量下触发细胞活力降低40％-50％。这一观察结果表明，脂质体配制品能够调节E6020的免疫细胞毒性作用。
TLR4和TLR7/8激动剂组合(LPS+R848：L+R)在处理后48h诱导PTE细胞活力降低约80％的观察结果是预期的，并表明测定按预期进行。
2.SPA14诱导APC激活/成熟
APC(抗原呈递细胞)代表先天免疫的主要元素，其可以通过其接合和激活B和T淋巴细胞的能力来引导适应性免疫。TLR4激动剂的一个主要功能特征是它们可以触发APC成熟，这是一个复杂的过程，涉及表面标记物(诸如HLA-DR、CD14和CD80/86)表达的变化，以及各种细胞因子和趋化因子表达的改变。在MIMIC PTE模块中，通过分析收获细胞表面的共刺激标记物和经由在从未处理和处理的培养物中提取的上清液中评价的可溶性细胞因子的产生来测量CD11c+(mDC)亚群的激活状态。值得注意的是，虽然在MIMIC PTE构建体中产生了其他DC亚群，但该分析的重点是传统的CD11c+DC，因为它们对不同的TLR激动剂有反应，并且构成了体内主要循环APC亚群之一(Collin等人,Human dendritic cellsubsets.Immunology,2013,140:22-30)。
诸位发明人评价了在不存在或存在佐剂处理的情况下PTE衍生的APC表面成熟和激活标记物的表达。该研究特别感兴趣的是共刺激标记物CD86(B7-2)和CD83，因为它们已被描述为APC成熟和激活的重要配体，并且对于驱动幼稚CD4+T细胞反应至关重要(参见图3)。
SPA14能够以剂量依赖性方式触发CD86阳性PTE衍生的APC的增加。CD83遵循类似的表达模式(数据未显示)。
3.SPA14在PTE测定中诱导免疫刺激性细胞因子的分泌
在48h后收获来自未处理和处理的MIMIC PTE培养物的培养物上清液，并使用Millipore定制12重阵列分析其细胞因子/趋化因子分泌。评价了以下先天趋化因子/细胞因子：IL-6、IL-8、TNFα、MIP-1β和IP-10，因为它们对先天免疫活性至关重要，并且还可以驱动免疫细胞毒性。
从测试的最高剂量(稀释度1:20)获得的结果报告在下表1中。
表1
实施例4：含E6020-QS21的脂质体对施用给兔的CMV抗原的佐剂化效应SPA14和AS01B在兔体内的免疫原性评价
该研究的目的是研究在间隔三周肌内注射两次后由含有SPA14或AS01B作为佐剂的含CMV抗原的疫苗组合物在新西兰白兔中诱导的免疫反应。
I.材料和方法
通过在缓冲液(例如，PBS pH 7.4，NaCl 140mM)中稀释浓缩抗原以获得以80μg/mLgB+80μg/mL五聚体浓缩两倍的溶液来制备CMV的CMV gB+CMV五聚体(五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131)抗原，并单独使用(在PBS中以40μg/mL gB+40μg/mL五聚体半倍稀释)或与E6020-QS21脂质体-SPA14佐剂组合使用(按体积/体积混合物)。通过肌内途径以以下浓度施用500μL抗原/佐剂混合物：每剂20μg gB+20μg五聚体。
在用5种质粒转染的CHO细胞系中获得HCMV五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131，每种质粒包含编码构成HCMV五聚体的5种蛋白质之一的序列。这些序列来自毒株BE/28/2011(Genbank ID KP745669)。gH序列没有用于分泌重组五聚体的跨膜结构域。表达五聚体复合物的例子在Hofmann等人,Biotechnology and Bioengineering,2015,第112卷,第12期,第2505-2515页中给出。如US 6,100,064中所述获得gBdTM，其是一种806个氨基酸长的多肽。
分别以2:0.5:0.1:0.1mg/ml的DOPC/Chol/QS21/MPL从商业疫苗Shingrix获得AS01B。由于它不是两倍浓缩的，因此将其与浓缩抗原混合以达到550μl的注射体积，每剂含有20μg gB+20μg五聚体。
分别以4:1:0.2:X mg/ml的DOPC/Chol/QS21/E6020如实施例1所述或如实施例10所述制备SPA14。使用以下四种不同浓度X的E6020：0mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml和0.02mg/ml E6020，以获得下表2中描述的E6020剂量(用抗原以v/v稀释并注射500μl)。
向56只12-14周龄的新西兰白雌兔(法国Charles River Laboratoires-ESD)肌内注射2次(肌内-0.5mL或0.55mL)不同的CMV-gB和五聚体(Pent)抗原佐剂配制品，间隔3周给予。将兔分配到6个不同的佐剂配制品组，每组包含8只兔。每只兔在第1天和第22天在腰区的2个不同部位接受2次肌内注射，每个部位注射一次。对照组1兔接受无菌生理盐水(0.9％NaCl)。来自第2组和第3组的处理兔分别接受缓冲液中的抗原和AS01B对照佐剂中的抗原。来自第4组至第7组的处理兔分别以0、1、2和5μg的剂量接受含有E6020的SPA14佐剂中的抗原。
表2
组别 处理 剂量体积(mL)
1 0.9％NaCl 0.5
2 20μg gB+20μg Pent+缓冲液 0.5
3 20μg gB+20μg Pent+AS01B 0.55
4 20μg gB+20μg Pent+SPA14(0μg E6020) 0.5
5 20μg gB+20μg Pent+SPA14(1μg E6020) 0.5
6 20μg gB+20μg Pent+SPA14(2μg E6020) 0.5
7 20μg gB+20μg Pent+SPA14(5μg E6020) 0.5
血清中和测定
简而言之，在微中和(MN)测定前一天，将2,5x104个MRC5成纤维细胞或ARPE-19细胞分配在96孔暗板中。在D0，将血清在56℃下热灭活30min。将血清样品在96深孔板的DMEM/F12 1％FBS中连续稀释两倍，从1/10开始到1/10240，并与4,2log FFU/ml的BADrUL131-Y4CMV病毒株(如Wang等人,J Virol.2005年8月；79(16):10330-8中所述)在37℃下在5％CO2细胞培养箱中一起孵育60min。然后将血清/病毒混合物转移到MRC5或ARPE-19细胞上，并在37℃下在5％CO2细胞培养箱中孵育3天(对于MRC5细胞)和4天(对于ARPE细胞)。
然后去除培养物上清液，并在室温下用100μl 1％甲醛的PBS将细胞固定1小时。然后将板用PBS洗涤并在室温下风干，然后在Microvision荧光读板器上进行分析以计数每个孔中的感染细胞。
作为对照，每个板上存在两个细胞对照孔(无病毒)和六个这样的孔，其中细胞感染了含有4,2log FFU/mL的一半病毒稀释液。这六个孔的平均值定义了血清中和阈值，确定为50％特征信号值。中和终点滴度定义为低于计算的50％特征信号值的最后一次稀释度的倒数。每份个体血清的中和滴度(μPRNT50)定义为诱导感染细胞减少50％的最后一次稀释度，即诱导的感染细胞低于计算的50％特征信号值的最后一次稀释度。计算每组的几何平均中和抗体滴度。
II.结果
功能性体液反应
HCMVgB+HCMV五聚体+SPA14诱导血清中和抗体滴度
测试在第1天、第15天、第24天和第36天从所有动物收集的个体血清样品的中和活性。下文给出了在不存在幼兔补体的情况下抑制HCMV进入上皮细胞的中和抗体滴度和在存在幼兔补体的情况下抑制HCMV进入成纤维细胞的中和抗体滴度，以分别关注对CMV-五聚体和CMV-gB具特异性的功能性抗体。
在第15天和第24天，所有佐剂化组都产生了功能性抗体反应(图4A和图4B)。与非佐剂化组相比，所有佐剂化组都观察到高度显著的佐剂效应，GMT至少高9倍(所有p值<0.001，方差分析，邓尼特调整)。
在第24天，在第二次接种疫苗后的早期，与第15天获得的滴度相比，观察到上皮细胞上的中和抗体滴度略有但显著增加(所有p值≤0.028)，无论配制品如何。类似地，所有佐剂化组在存在补体的情况下在成纤维细胞上产生了平均中和抗体滴度的范围为2.1至2.5log10μPRNT50的功能性抗体反应(图4B)。在第36天进一步证实了中和抗体反应增加，与第24天相比，所有疫苗配制品增加了至少15倍，无论所使用的血清中和测定如何。
关于SPA14配制品中的E6020剂量范围，未观察到E6020剂量对中和抗体反应的显著影响。与不含E6020的SPA14脂质体相比，在SPA14脂质体中添加1、2或5μg E6020诱导高2倍的中和抗体滴度，但是这些差异均无统计学显著性(所有p值>0.06)。关于SPA14配制品与AS01B基准的比较，SPA14佐剂化组在有和没有补体下的上皮细胞上测量的中和抗体滴度与AS01B佐剂化组测量的滴度没有显著差异，无论SPA14中包含的E6020剂量如何以及无论时间点如何(所有p值>0.05，单侧邓尼特检验)。对于在成纤维细胞上测量的GMT(第24天在有补体下)，在用SPA14+0μg E6020和SPA14+1μg E6020施用的组中获得的中和抗体滴度分别比AS01B佐剂化组测量的滴度明显低2.3和2倍(p值≤0.02，单侧邓尼特检验)，无论SPA14中包含的E6020剂量如何以及无论时间点如何(所有p值>0.05，单侧邓尼特检验)。对于在成纤维细胞上测量的GMT(第24天在有补体下)，在用SPA14+0μg E6020和SPA14+1μg E6020施用的组中获得的中和抗体滴度分别比AS01B佐剂化组测量的滴度明显低2.3和2倍(p值≤0.02，单侧邓尼特检验)。然后，在SPA14中掺入较高的E6020剂量，即2和5μg，未观察到显著差异(p值>0.18)。
总体而言，这些结果倾向于显示，SPA14增强免疫兔血清中的HCMV中和抗体反应，无论佐剂中存在的E6020量如何。此外，当E6020含量为至少2μg/剂(这仍远低于AS01B中使用的MPL浓度)时，SPA14佐剂化组在有补体下的成纤维细胞上测量的中和抗体滴度与AS01B佐剂化组测量的滴度没有显著差异。
使用E6020在含QS21的脂质体中配制佐剂显示出其特别的优势，因为与使用MPLA相比，其所需化合物少25倍。这带来了成本和潜在反应原性方面的优势。
SPA14增强免疫兔血清中的HCMV中和抗体反应。在不存在补体的情况下在上皮细胞上的μPRNT50(图4A)，在存在补体的情况下在成纤维细胞上的μPRNT50(图4B)。
实施例5：含E6020-QS21的脂质体对施用给小鼠的CMV抗原的佐剂化效应
I.材料和方法
在本小鼠研究中，7周龄幼稚雌性C57BL/6J小鼠组在第0天、第21天和第221天(第7个月)通过肌内途径接受三次肌内免疫接种用SPA14(含有5μg QS21和1μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体)或AS01E(从商业疫苗Shingrix获得的如实施例3所述的AS01B的两倍稀释液)佐剂配制的CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)。在第1个月、第2个月、第3个月、第4个月、第5个月、第6个月、第7个月和第8个月收集血液样品，以监测血清中和抗体反应(血清中和测定如实施例4所述)。此外，在第1个月、第7个月和第8个月时，从每组10只小鼠收集血液和脾脏，以监测CMV gB和CMV五聚体特异性IgG抗体亚类、抗体分泌细胞(ASC)频率以及IL-5和IFN-γ分泌。
II.结果
直到第7个月(在晚期加强剂之前)，所有测试配制品的CMV gB和CMV五聚体特异性免疫反应均显示出佐剂效应。
SPA14相比于AS01E的结果如下表3所示。
对于所有时间点和参数，AS01E佐剂对照获得的抗体反应(诸如中和抗体以及B记忆分泌细胞频率)与SPA14获得的反应类似或趋于更低(但没有显著差异)。SPA14和AS01E之间的一些差异在Th1/Th2细胞因子谱方面观察到，得到SPA14诱导更平衡的Th1/Th2细胞因子谱。
表3
总之，在小鼠模型中进行的长达8个月的分析允许得出结论，SPA14在改善对CMV抗原的免疫反应方面至少与AS01一样有效。
实施例6：含E6020-QS21的脂质体对施用给小鼠的Flu抗原的佐剂化效应
采用与SPA14临时混合的季节性四价流感疫苗(QIV)进行免疫原性研究，以测试佐剂在幼稚BALB/c小鼠中的益处。
在该研究中使用GlaxoSmithKline的佐剂AS01B作为比较对照。使用了北半球2017-2018年季节性QIV和/>的商业批次，其包含A/Michigan/45/2015(H1N1)、A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)和B/Phuket/3073/2013(Yamagata谱系)毒株。
抗原和佐剂批次如下表4和5所提供的制备。
该研究的目的是评价SPA14佐剂化和/>疫苗(+/-SPA14)在小鼠模型中的免疫原性。此处在幼稚BALB/c小鼠中评估SPA14佐剂化季节性四价流感疫苗(QIV)的免疫原性。
I.材料和方法
用SPA14或AS01B佐剂化和/>QIV免疫小鼠组(n＝8)，并测试血凝抑制(HAI或HI)反应、先天反应和Th1/Th2比率。将佐剂与市售配制品混合。抗原、TLR4激动剂和QS21的最终量如下表4和5所指示。
采用6-8周龄且在D0时体重至少为20g的BALB/c雌性小鼠进行测试。使用28g针头，0.5mL注射器(BD#329461)通过肌内途径注射到右大腿肌肉中对动物进行免疫。每只小鼠注射50μL测试组合物。
表4
表5
生物取样
在第21天，在施用第2剂测试组合物之前，通过下颌下放血收集75μL血液。在第35天通过心脏穿刺将末梢血收集到凝胶管中。随后，将其在室温下孵育至少30min，然后在23℃下以10 000g离心5分钟。将上清液等分到微量瓶中并储存在-20℃冰箱中。
血凝素抑制测定：
将血清在RDE(RDE(II)“Seiken”(受体破坏酶)，目录号UCC-340-122，AccurateChemical)中以1:5稀释，并置于37℃水浴中过夜(18-20小时)。将血清在56℃下热灭活40分钟。用PBS进行额外的1:2稀释，导致最终血清稀释度为1:10。通过将0.75％TRBC的PBS/0.75％BSA混合来制备火鸡红细胞(TRBC)。将抗原在PBS/0.75％BSA中稀释以在25μl中含有4个血凝单位(HAU)，并如下验证：用50μl PBS填充三排96孔板。用额外的50μl病毒填充两排的第一个孔，并以两倍稀释度滴定到最后一个孔。添加50微升(50μl)TRBC，搅拌板，并且在室温下孵育1小时后读取HAU。
用25μl PBS填充96孔V底测定板的每个孔。在顶行添加血清，并以两倍稀释度稀释各列。一式两份地测试每个样品。倒数第二列包含阳性对照血清，并且最后一列包含阴性对照(PBS)和病毒反滴定液。除最后一列外，向每个孔中添加25μL病毒。将板搅拌并在室温下孵育1小时。然后将50μL TRBC添加到每个孔中，然后孵育1小时，然后通过以轻微角度倾斜板来读取血凝模式。
在本研究中，使包括A/Michigan/45/2015(H1N1)、A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)、B/Brisbane/60/2008毒株的同源病毒组以及包括A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016和B/Colorado/06/2017毒株的异源病毒组在卵中生长。
通过基于Luminex的测定法进行18重细胞因子/趋化因子评估
通过使用Milliplex MAP试剂盒小鼠高灵敏度T细胞磁珠组套(EMD Millipore：MHSTCMAG-70KPMX)定量血清细胞因子/趋化因子水平来评价免疫后小鼠中诱导的细胞因子谱。定量以下细胞因子/趋化因子：GM-CSF、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17A、KC/CXCL1、LIX、MCP-1、MIP-2和TNF-α。
遵循小鼠高灵敏度T细胞磁珠组套测定试剂盒测定方案。在生物安全柜内，将每孔200μl洗涤缓冲液分配到试剂盒中提供的96孔板中。用提供的板密封试剂盒覆盖板，并在室温下以500rpm-800rpm放置在定轨板摇床上10分钟。倾析洗涤缓冲液，并在吸收纸上敲出任何残留液体。将25μL血清基质添加到标准品和对照孔中；将25μL测定缓冲液添加到每个样品孔中。将25μL血清添加到每个板的指定孔中。
一式两份地评估样品。将50μL标准品和质量对照添加到适当的孔中，并将50μL血清基质用于空白(BL)。将预混合的18重珠涡旋1分钟，然后添加到板中。用移液管上下混合珠，然后每孔添加25μL珠。用粘性铝板密封器密封板，并在2℃-8℃下以500rpm-800rpm在定轨板摇床上孵育过夜。
第二天，打开并启动Bio-Plex Wash Station Pro。启动功能在洗涤站通道中填充洗涤缓冲液，并在使用前去除任何气泡。在使用前30分钟，将检测抗体和链霉亲和素-藻红蛋白从2℃-8℃下储存中取出，以使试剂可达到环境温度。使用“Mag 3x”洗涤程序将板洗涤三次。向每个孔中添加25μL检测抗体溶液。用粘性铝板密封器覆盖板，并在室温下以500rpm-800rpm在定轨板摇床上孵育1小时。
在此检测抗体孵育期间对Bio-Plex Luminex读板器系统进行了校准。使用具有已知低和高分析物浓度珠组的校准试剂盒来测量机器运转正常并在校准试剂盒定义的设定参数范围内读取。在孵育后，向每个孔中添加25μL链霉亲和素-藻红蛋白(不洗涤)。用粘性铝板密封器密封板，并在室温下以500rpm-800rpm在定轨板摇床上孵育30分钟。使用“Mag3x”洗涤程序将板洗涤三次。
向所有孔中添加150μL鞘液。用粘性铝板密封器覆盖板，并允许在2℃-8℃下以500rpm-800rpm在定轨板摇床上振荡至少5分钟以确保珠悬浮。建立读板方案，其包括在Bioplex Manager软件方案中的样品、标准品和对照的稀释因子的样品板图。样品的稀释因子设定为2，因为样品在测定缓冲液中以1:2稀释。还设定了标准品和对照的稀释度。在Bio-Plex Luminex 200读板器或CS 1000(Perkin Elmer)上以低PMT RP1设置读取板。
通过ELISPOT评估IL-5和INF-γ细胞因子
将抗小鼠IFN-γ(目录号3321-3-1000，MABTECH)和IL-5mAb(目录号3391-3-1000，MABTECH)在无菌PBS pH 7.4(目录号10010023，Thermo Fisher Scientific)中稀释至15μg/mL，并将96孔ELISpot PVDF膜板(目录号MSIPS4W10，EMD Millipore)在4℃下用100μL/孔这些稀释的mAb包被过夜。
在10ml冰冷的完全培养基中收获每个小鼠脾脏，并将其转移到GentleMACS C管(目录号130-096-334，MACS Miltenyi Biotec)中进行均质化。将管以1,200rpm离心6分钟。丢弃上清液，将细胞沉淀重悬于4ml ACK裂解缓冲液(目录号A10492-01，Gibco)中，并在室温(RT)下孵育3分钟以裂解红细胞。使用40μm细胞过滤器(目录号352340，BD Falcon)过滤细胞悬浮液，并以1,200rpm离心6分钟。丢弃上清液，并用10mL完全培养基重悬细胞沉淀。
将重悬的细胞用Guava溶液(目录号4000-0041，EMD Millipore Co.)稀释至1:20。使用easyCyte细胞计数器测定细胞数量和活力，并将细胞浓度调整至1x107个细胞/mL(5x105个细胞/50μL/孔)。
去除包被抗体溶液，用200μL/孔无菌PBS将板洗涤3次，并向板中添加200μl/孔封闭溶液(完全培养基)，在室温下持续2小时。
将含刺激剂、重组A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)蛋白质或肽池(特定刺激)和ConA(阳性对照)的溶液在完全培养基中稀释至终浓度的2倍。重组蛋白的终浓度为5μg/mL。肽池包含122种肽。每种肽的长度为15个氨基酸，其中11个氨基酸重叠。每种肽的终浓度为2μg/mL。Con A的浓度为2.5μg/ml。使用完全培养基作为阴性对照。在用封闭溶液孵育2小时后，将板清空，并且向板中添加50μL稀释的刺激剂，然后添加50μL细胞悬浮液，并通过轻敲板两侧进行混合。然后将板在37℃下在提供5％CO2的情况下孵育20小时。
从板中取出细胞，添加200μL/孔的水，并将板在室温下孵育3分钟以裂解附着在板上的细胞。然后用200μL/孔的PBS将板洗涤5次，并添加100μL/孔用完全培养基稀释的1μg/mL生物素化的抗小鼠IFN-γ(目录号3321-6-1000，MABTECH)或IL-5mAb(目录号3391-6-1000，MABTECH)。将板在室温下孵育2小时，然后用200μl/孔的PBS洗涤5次。将100μl/孔的1:1000稀释的碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素(目录号7100-04，SouthernBiotech)添加到板中并在室温下孵育1小时。用200μl/孔的PBS将板洗涤5次，并添加100μl/孔的NBT/BCIP底物溶液(目录号P134042，Thermo Fisher Scientific)进行显色。将板在室温下在黑暗中孵育30分钟或直到出现斑点。将板用水冲洗5次，并在室温下在黑暗中风干24小时。使用CTL免疫斑点读板器(ImmunoSpot 7.0.23.2Analyzer Professional DC\ImmunoSpot 7，CellularTechnology Limited)和软件(CTL Switchboard 2.7.2)对斑点进行计数和分析。报告了每百万个的斑点形成细胞数。
数据分析
对于HAI滴度：
目的是测定136份小鼠血清(136份血清x 3种病毒株；136份血清x 2种病毒株)针对同源(Michigan/2015、Hong Kong/2014、Brisbane/2008)和异源(Singapore/2016、Colorado/2017)流感病毒株的HAI滴度。对所有处理组的D35时间点的个体动物血清进行HAI测试。对HAI滴度进行log2转换，并对同源(Michigan/2015、Hong Kong/2014、Brisbane/2008)和异源(A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016和B/Colorado/06/2017)流感病毒株进行描述性分析以按组计算平均值。在进行log2转换之前，低于检测限(<10)的值被替换为一半限值。
对于细胞因子评估：
在小鼠高灵敏度T细胞磁珠组套试剂盒(EMD Millipore)中测试了9组(8只动物/组)。该试剂盒评估18种分析物。在免疫前4天从有限数量的动物中收集放血前组。因此，没有成对的放血前和免疫后6小时样品。在分析方面，将放血前样品作为单独组处理。
使用Bio-Plex Luminex 200读板器(Biorad)或CS 1000(Perkin Elmer)测量样品、对照和标准品的平均荧光强度(MFI)值。使用Bio-Plex Manager软件分析数据。质量控制的验收标准是，高质量和低质量对照的计算浓度都在制造商设定的批次特定浓度范围内。如果对照值在该范围内，则对照通过，并且测定结果被接受。使用Bio-Plex Manager软件绘制五参数逻辑回归曲线。从标准曲线内插每个样品的特定细胞因子浓度，并以pg/ml报告。任何低于测定试剂盒参数/制造商为每种细胞因子设定的定量限(LOQ)或“OOR<＝超出范围的低”的结果都被更改为测定的LOQ值进行分析。
II.结果
发现SPA14通过诱导高滴度的抗原特异性抗体来增强免疫原性，如通过功能性HA测定所监测的。所有佐剂化疫苗组的同源HI滴度均显著增加。
SPA14还增强了接种疫苗组对该研究中测试的H3和B异源病毒的异源HAI滴度。SPA14使反应向Th1反应转移。此外，与未佐剂化配制品相比，两种佐剂使IFNγ、IL-5、TNFα、MCP-1、KC和IL-6分析物可测量地增加。SPA14的性能与AS01B相当。
SPA14佐剂化 和/> 疫苗的免疫原性
在BALB/c小鼠中评价SPA14佐剂化和/>QIV(+/-SPA14)诱导同源和异源免疫反应的能力。为此，将25组8只雌性BALB/c小鼠通过肌内途径用商业/>和季节性流感疫苗免疫两次，间隔3周(在D0和D21)。/>疫苗选择0.1μg和0.5μg HA剂量，并且/>疫苗选择0.1μg和1.0％HA剂量，以评价SPA14佐剂的免疫原性。
对照组接受来自H3A/Hong Kong/4801/2014毒株的0.5μg剂量的重组HA(rHA)(n＝8只小鼠)。通过用鸡红细胞(RBC)针对流感病毒株的同源组[A株：A/Michigan/45/2015(H1N1)、A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)；B株：B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)]和异源组(A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016和B/Colorado/06/2017)进行的HAI测定来测量在免疫后35天动物中引起的血清抗体反应。
图5中的结果描绘了QIV(0.1μg HA(图5中的FZ 0.1)和0.5μg HA(图5中的FZ 0.5))针对A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)毒株获得的初步HAI滴度。在两种剂量的QIV(0.1和0.5μg HA)下，当与仅抗原相比时，佐剂SPA14和AS01B增强了HAI滴度。基于/>QIV获得的这些结果，诸位发明人选择了更高剂量0.5μg HA，以对同源和异源流感病毒株的扩大组进行后续测试。
图6中描绘的QIV(0.5μg HA)(图6中的FZ 0.5)的结果显示，对于3种同源毒株，当与仅抗原相比时，佐剂SPA14和AS01B均增强了HAI滴度。SPA14和AS01B佐剂还增强了能够与异源毒株(Singapore/2016和Colorado)交叉反应的HAI滴度。/>QIV获得的结果表明，SPA14佐剂的性能与AS01B相当。
图7中描绘的QIV(1μg HA)(图7中的FB 1)的结果显示，对于A/Michigan/45/2015(H1N1)和Brisbane毒株，当与仅抗原相比时，佐剂SPA14和AS01B均增强了HAI滴度。
正如所预期的，仅SPA14和AS01B佐剂对异源毒株没有诱导抗体反应。
对SPA14佐剂化疫苗的先天细胞因子反应
在免疫后6h在免疫动物血清中评估的图8中的细胞因子/趋化因子谱显示，响应于用(图8中的Fzon)和/>(图8中的Fblok)佐剂化配制品免疫，IFNγ、IL-5、TNFα、MCP-1、KC和IL-6分泌有可测量的增加。用非佐剂化配制品免疫产生的谱与放血前类似。SPA14和AS01B佐剂当与/>一起使用时诱导细胞因子反应的类似增加。对于AS01B和SPA14，当与/>一起使用时，观察到类似或明显更高的反应。
对SPA14佐剂化疫苗的适应性细胞反应
在加强免疫后两周(第35天)，在免疫小鼠脾细胞中评估Th1(IFNg)/Th2(IL-5)细胞因子分泌。如通过ELISPOT所测量的，仅或/>免疫的小鼠表现出低Th1/Th2比率，而与仅抗原组相比，添加SPA14显著提高了Th1/Th2比率。与SPA14组相比，AS01B佐剂显著提高了Th1/Th2细胞因子反应比率(图9)。与AS01B相比，SPA14诱导了更平衡的Th1/Th2细胞因子极化。
实施例7：含E6020-QS21的脂质体对施用给小鼠的人巨细胞病毒(hCMV)抗原的佐剂化效应以及与由GlaxoSmithKline(GSK)的佐剂AS01B触发的免疫反应谱的比较
使用与SPA14临时混合的来自人巨细胞病毒(hCMV)的重组蛋白进行免疫原性研究，以测试佐剂配制品在幼稚C57BL/6小鼠中的益处。使用GlaxoSmithKline的佐剂AS01B(GSK AS01B)来比较由SPA14和AS01B在同一研究中引起的免疫反应谱。使用来自hCMV的糖蛋白B(gB)和含有gH/gL/UL128/UL130/UL131蛋白的五聚体作为抗原。
该研究的目的是评价由SPA14佐剂化gB加五聚体疫苗(+/-SPA14)引起的抗体和效应细胞免疫反应，并与AS01B佐剂化gB加五聚体疫苗在幼稚C57Bl/6小鼠和实验条件下在相同方案设计下获得的免疫反应进行比较。
用SPA14佐剂化或AS01B佐剂化hCMV gB和五聚体在D0和D21免疫小鼠组(n＝8)，并测试上皮ARP-19和成纤维细胞MRC-5细胞系中的血清中和病毒活性(SN)、对gB和五聚体具特异性的分泌IgG1和IgG2c的B细胞(ASC)、以及对gB和五聚体具特异性的T辅助细胞反应(Th1/Th2)。
在初免后3周(D20)和加强后2周(D35)采集血液和脾细胞样品以进行免疫读出分析。
I.材料和方法
动物信息
6-8周龄C57BL/6雌性小鼠由法国Saint Germain sur l’Arbresle的CharlesRiver Laboratories提供，并根据AAALAC认证条件安置在Sanofi Pasteur设施(Marcy L’Etoile，法国)中。该研究由Sanofi Pasteur伦理委员会(Marcy L’Etoile，法国)审查。所有实验均按照2013年2月7日法国官方公报上发布的欧洲指令2010/63/UE进行。
对在D0天体重最低为20g的动物在D0天进行初免，并在D21使用28g针头，0.5mL注射器(BD#329461)通过肌内途径施用(IM.)到右大腿肌肉中进行加强。每只小鼠每次注射施用50μL测试组合物。
在D20对每只小鼠进行中间血液取样，并在加强后在D35从每只小鼠采集血液和脾样品。佐剂配制品、抗原和疫苗组合物的制备如下表6所指示。
表6
生物取样和分析试验
血液取样用于血清制备
初免后在D20从异氟烷轻度麻醉小鼠的下颌下静脉收集中间血液样品(约200μL)。在D35，在深度麻醉下，通过心脏穿刺收集血液样品(约1mL)。将血液样品收集到含凝血激活剂和分离凝胶的Vacutainer管(BD，法国梅朗)中。在5℃±3℃下停留过夜后，将管以2600g离心20min以从细胞中分离血清。将血清以100μL的等分试样转移到深孔板中，并在56℃下热灭活30min。将样品储存在-20℃下直到用于ELISA和中和测定。
脾脏取样用于脾细胞分离
对于B细胞和T细胞ELISpot测定，将每只免疫小鼠的脾脏收集在含有RPMI(罗斯威尔公园纪念研究所培养基)的无菌管中。尽快使用GentleMACS(Mylteni Biotech)机械解离脾脏，在50mL Falcon管中以500g在4℃下离心10min，并丢弃上清液。将对应于一个小鼠脾脏的每个细胞沉淀用1mL红细胞裂解缓冲液(R 7757Sigma-Aldrich)悬浮并轻轻混合1分钟。在冰中停止裂解反应，然后每个沉淀添加20mL冷却的RPMI缓冲液。将Falcon管以500g离心7分钟，并丢弃上清液。将脾细胞在含有10％FCS的RPMI完全缓冲液中稀释，并在用于ELISpot测定之前制备用于细胞计数。
hCMV噬斑减少中和试验(PRNT50)以检测ARPE-19上皮细胞系中的hCMV中和抗体。
使用噬斑减少血清中和试验滴定免疫小鼠血清中的中和抗体。该测定基于人巨细胞病毒(hCMV)感染人上皮细胞和成纤维细胞的能力。简而言之，在微中和(MN)测定前一天，将2.5x104个上皮ARPE-19细胞分配在96孔暗板中。在使用前，首先将在D20和D35从每只免疫小鼠收集的血清样品在56℃下热灭活30min，并在-20℃下储存。在中和测定的第D天，将热灭活血清在室温(20℃-25℃)下缓慢解冻，并在96深孔板的DMEM/F12 1％FBS中连续稀释两倍，从1/10开始到1/10240，并与4.2Log10 FFU/mL的BADrUL131-Y4CMV病毒株(滴度5.63log10 FFU/ml)在37℃下在5％CO2细胞培养箱中一起孵育60min。最终将不同稀释度的血清/病毒混合物转移到ARPE-19细胞培养物上，并在37℃下在5％CO2中孵育4天。在D4，去除培养物上清液，并在20℃-25℃下用100μL/孔的1％甲醇的PBS将ARPE-19细胞固定1小时。将板用PBS 1x洗涤三次，并在20℃-25℃下风干，然后在Microvision荧光读板器上进行分析。在每个孔中对感染的荧光细胞进行计数。作为对照，将细胞仅与不含病毒的培养基一式两份地一起孵育。作为每板6孔感染的对照，将细胞以4.2Log10 FFU/mL的病毒稀释初始浓度的一半感染。没有感染细胞的两个孔的平均值定义了血清中和的阈值。含有用1/2病毒剂量感染的细胞的6个孔中的荧光平均值定义了50％感染特征信号。对于每份血清，中和终点滴度定义为低于计算的50％特征信号值的最后一次稀释度的倒数(μPRNT50)，即诱导的感染细胞少于计算的50％特征信号值的最后一次稀释度。对于每个样品，使用4参数逻辑曲线测定滴度。计算每组的几何平均中和抗体滴度。
类似的方案用于成纤维细胞MRC-5细胞系的PRNT50测定。简而言之，在微中和测定前一天，将2.5x104个MRC-5细胞分配在96孔暗板中。将热灭活血清在96深孔板的DMEM/F121％FBS中连续稀释两倍，从1/10开始到1/10240，并与4.2Log10 FFU/mL的BADrUL131-Y4 CMV病毒株(滴度5.63log10 FFU/ml)在存在10％幼兔补体的情况下在37℃下在5％CO2细胞培养箱中孵育60min。然后将不同稀释度的血清/病毒混合物转移到MRC-5细胞培养物上，并在37℃下在5％CO2中孵育3天。在D3，去除培养物上清液，并在室温下用100μl/孔的1％甲醇的PBS将MRC-5细胞固定1小时。如上先前针对ARPE-19细胞系所述，测定中和抗体滴度(μPRNT50)。
注意：ARPE-19细胞系的噬斑减少中和测定反映了由两种抗原gB和五聚体引起的中和抗体活性，而MRC-5细胞系的噬斑减少中和测定反映了由gB引起的中和抗体活性。
分泌hCMV gB和五聚体特异性IgG1和IgG2c的B细胞ELISpot
荧光联免疫斑点(FLUOROSPOT)测定用于检测和计数分泌对hCMV gB和五聚体抗原具特异性的抗体(IgG1、IgG2c、IgG)的个体B细胞(ASC)，并与分泌总IgG的ASC进行比较，而不考虑抗原特异性。
将配备有低荧光PVDF膜的fluorospot板用35％乙醇预润湿1min，用无菌水洗涤，然后用PBS 1X洗涤，并在5℃±3℃下用10μg/mL hCMV gB或10μg/mL hCMV五聚体或捕获mAb(10μg/mL KDL)的混合物包被过夜。
首先将96孔IPFL底微板(Multiscreen)的膜在室温下用25μL的35％乙醇预润湿，并在1min处理后去除。在用200μL/孔的PBS 1X洗涤后，用hCMV gB抗原或hCMV五聚体(10μg/ml)或无关小鼠IgG抗体(10μg/ml，KPL)包被微板。将板用PBS洗涤，并在37℃下用完全培养基RPMI 10％FBS封闭2小时。在用PBS洗涤后，每孔接种来自免疫小鼠的5x105个新鲜分离的脾细胞，并在37℃下在5％CO2培养箱中孵育5h。在PBS 1X Tween 200.05％中洗涤3次并在PBS 1X中洗涤6次后，将板在37℃下与100μL/孔的抗小鼠IgG1 PE(4μg/mL)、抗小鼠IgG2cFITC(2μg/mL)或抗小鼠总IgG(0.5μg/mL)检测mAb孵育2小时。在用PBS洗涤后，用自动斑点读取器(Microvision)计数荧光斑点。
分泌hCMVgB和五聚体特异性IFNγ和IL-5的T细胞ELISpot
FluoroSpot测定用于检测和计数分泌IFN-γ或IL-5细胞因子的单个细胞。简而言之，将MultiscreenTM 96孔IPFL板(Millipore)在20℃-25℃下用25μL 35％乙醇预润湿1分钟，用无菌水洗涤，用PBS 1X洗涤两次。然后将板在5℃±3℃下用每孔100μL大鼠抗小鼠IFN-γ或大鼠抗小鼠IL-5mAb(10μg/ml，Pharmingen)(分别以1/100和1/50稀释)包被过夜。在用每孔200μL无菌PBS 1X将板洗涤3次后，用200μL完全培养基(含有10％胎牛血清、200mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和10μg/ml的罗斯威尔公园纪念研究所培养基)在37℃下进行2小时饱和步骤。在板洗涤后，每孔添加5x105个新鲜分离的脾细胞，并在存在鼠IL-2(10U/ml)的情况下，与hCMV gB抗原(0.1μg/mL)、hCMV五聚体抗原(0.1μg/mL)或刀豆球蛋白A(ConA，2.5μg/mL)(作为阳性对照)一起孵育过夜。
在PBS 1X BSA 0.1％(每孔200μL)中洗涤6次后，添加生物素化的抗小鼠IFN-γ或抗小鼠IL5抗体，使用浓度为1μg/mL的PBS 1X BSA 0.1％(每孔100μL)，并在20℃-25℃下在黑暗中孵育2小时。在PBS 1X BSA 0.1％中洗涤3次后，每孔添加100μL链霉亲和素PE(1μg/mL)的PBS 1X-BSA 0.1％，并在20℃-25℃下在黑暗中孵育1小时。用PBS 0.25％BSA将板进一步洗涤6次。最后，去除板的背面，并用无菌水迅速冲洗孔底。将板风干并储存在黑暗中直到读取。用配备有Cy3和FITC荧光过滤器的荧光读板器(Microvision)计数对应于IFNγ或IL-5的单个生产细胞的每个斑点。结果表示为每106个脾细胞的IFN-γ或IL-5分泌细胞数。
II.结果
与hCMV gB和五聚体蛋白一起配制的SPA14引起的hCMV中和抗体滴度与AS01B类似
在C57BL/6小鼠中评价SPA14佐剂化hCMV gB和五聚体蛋白诱导血清中和反应的能力。为此，将3组8只雌性C57BL/6小鼠在第0天(D)和D21间隔3周通过肌内途径用2μg每种重组蛋白(hCMV gB和五聚体)免疫两次。将蛋白质在没有佐剂的情况下施用，或用SPA14或AS01B配制，其组成已在实施例3中描述。
使用AS01B作为基准佐剂。基于人BADrUL131-Y4 CMV病毒株分别在有或没有补体下感染人成纤维细胞和上皮细胞的能力，使用噬斑减少血清中和测定测量免疫动物在首次注射后20天(D20)和第二次注射后14天(D35)引起的中和抗体反应。
图10A和图10B的结果显示，在没有佐剂下，hCMV gB加五聚体蛋白在初免后和加强后在成纤维细胞(MRC-5)或上皮(ARPE-19)细胞系上测量到没有诱导或诱导低水平的BADrUL131-Y4 CMV病毒血清中和抗体(SN Ab)。
在两种细胞系中，测量到SPA14和AS01B对BADrUL131-Y4 CMV病毒中和抗体的显著佐剂效应，并且与非佐剂化组hCMV gB加五聚体相比主要在加强后观察到(p值<0.0001)。
此外，在SPA14和AS01B佐剂化组中测量到显著加强效果(p<0.0001)，中和抗体滴度从D20到D35约增加了2Log。
在没有补体下在ARPE-19上皮细胞系上(图10A)，代表由gB和五聚体诱导的中和抗体，SPA14的中和滴度的几何平均值(GMT)达到3.75Log10，使用AS01B达到3.98Log10，而在非佐剂化组中测定GMT为1.82Log10。在存在补体的情况下在MRC-5成纤维细胞系中获得了类似的结果(图10B)，反映了主要由gB诱导的中和抗体滴度。SPA14的中和抗体滴度的几何平均值(GMT)为3.84Log10，使用AS01B观察到4.05Log10，而在非佐剂化组中观察到GMT为1.3Log10。
在初免后(D21)和加强后(D35)，没有测量到由用SPA14配制的hCMV gB加五聚体和用AS01B配制的gB加五聚体诱导的中和抗体滴度的差异(ns)。
与非佐剂化组相比，与gB和五聚体蛋白一起配制的SPA14在D35触发了分泌gB和五 聚体特异性IgG1和IgG2c的B细胞(ASC)
在C57BL/6小鼠中评价SPA14佐剂化hCMV gB和五聚体蛋白诱导对两种hCMV抗原具特异性的分泌IgG1和IgG2c的B细胞(ASC)的能力。为此，将3组8只雌性C57BL/6小鼠在第D0和D21天间隔3周通过肌内途径用2μg每种重组蛋白(hCMV gB和五聚体)免疫两次。将重组蛋白在没有佐剂的情况下施用，或用SPA14或AS01B配制。对D35从免疫小鼠收集的脾细胞通过Fluorospot评估对gB或五聚体具特异性的分泌IgG1和IgG2c的B细胞(ASC)(图11A至图11D)。
与非佐剂化组相比，SPA14诱导的对gB和五聚体具特异性的IgG1和IgG2c ASC频率显著更高(p<0.001)。
事实上，在SPA14佐剂化组中测量的特定ASC数是中等的，对gB具特异性的分泌IgG2c的B细胞的几何平均值为42个斑点/106个细胞，IgG1为83个斑点/106个细胞，对五聚体具特异性的分泌IgG2c的B细胞为25个斑点/106个细胞，IgG1为105个斑点/106个细胞。
同样，AS01B诱导中等频率的对gB和五聚体具特异性的IgG1和IgG2c-ASC数，但是这些细胞频率显著高于非佐剂化组中测量的频率(p<0.001)。
有趣的是，数据还显示，与SPA14相比，AS01B显著提高了抗gB IgG2c-ASC(p＝0.005)和抗五聚体IgG2c-ASC(p＝0.002)的频率，导致针对gB(p＝0.024)和针对五聚体(p＝0.011)的IgG2c/IgG1分泌B细胞比率显著更高。
总之，SPA14导致比AS01B更平衡的Th1/Th2抗体反应，从而显著诱导更偏向Th-1的抗体反应。
与非佐剂化组相比，在D35与gB和五聚体蛋白一起配制的SPA14引起低的对gB具特 异性的分泌IFN-γ的细胞，但高的对五聚体具特异性的分泌IFN-γ的细胞
在C57BL/6小鼠中评价SPA14佐剂化hCMV gB和五聚体蛋白诱导对gB和五聚体具特异性的分泌IFN-γ和IL-5的细胞的能力。为此，将3组8只雌性C57BL/6小鼠在第0天(D)和D21间隔3周通过肌内途径用2μg gB和五聚体免疫两次。将重组蛋白在没有佐剂的情况下施用，或用SPA14或AS01B配制。
对D35从免疫小鼠收集的新鲜脾细胞通过Fluorospot评估分泌IFN-γ和IL-5的细胞(图12)。
在用非佐剂化gB和五聚体免疫的小鼠中，没有检测到对gB具特异性的分泌IFN-γ和IL-5的细胞，也没有检测到对五聚体具特异性的分泌IFN-γ的细胞。在非佐剂组中，检测到低但可测量的对五聚体具特异性的分泌IL-5的细胞数(每106个脾细胞54个斑点)。
图12A、图12B和图12C中描述的gB离体脾细胞刺激相关数据显示，与非佐剂化组相比，SPA14诱导的IFN-γ分泌细胞频率显著更高(p＝0.003)，而SPA14对IL-5分泌细胞数没有显著的佐剂效应。此外，IFN-γ分泌细胞频率的增加对分泌IFN-γ和IL-5的细胞的比率没有影响(p＝0.074；ns)，比率>1代表偏向Th1反应(数据未显示)。
图12D、图12E和图12F中描述的五聚体离体脾细胞刺激相关数据显示，SPA14诱导的IFN-γ分泌细胞数显著更高，GM值为每106个脾细胞321个斑点(p<0.001)，相比之下非佐剂化组的GM值为每106个脾细胞9个斑点。没有测量到SPA14对对五聚体具特异性的分泌IL-5的细胞数的显著佐剂效应。这些结果与和非佐剂化组相比分泌IFN-γ和IL-5的细胞比率的显著增加(p<0.001)相关，反映了与非佐剂化组相比，针对五聚体与SPA14的更偏向Th-1的免疫反应(SPA14相比于非佐剂化组的比率数据未显示)。
在图12中，结果显示，在D35，与非佐剂化组相比，AS01B诱导显著更高的对gB和五聚体具特异性的分泌IFN-γ的细胞数(p＝<0.001)。没有测量到AS01B对对gB具特异性的分泌IL-5的细胞数的显著佐剂效应，但是AS01B诱导对五聚体具特异性的分泌IL-5的细胞数的显著减少，GM值为每106个细胞11个斑点，相比之下非佐剂化组展示的GM值为每106个细胞54个斑点(p<0.001)。
总之，数据表明，与非佐剂化组相比，对gB或五聚体具特异性的分泌IFN-γ和IL-5的细胞比率显著增加(p<0.001)，反映了与非佐剂化gB加五聚体相比，针对hCMV抗原与AS01B的更偏向Th-1的免疫反应(AS01B相比于非佐剂化组的比率数据未显示)。
2个佐剂化组的比较显示，与AS01B相比，SPA14引起显著更低的对gB具特异性的分泌IFN-γ的细胞数(p＝0.001)，但是诱导类似数量的对五聚体具特异性的分泌IFN-γ的细胞。正如SPA14所观察到的，AS01B没有诱导对gB具特异性的特异性IL-5分泌细胞，但有趣的是，SPA14触发了比AS01B显著更高的对五聚体具特异性的分泌IL-5的细胞(p＝0.02)。
总之，数据表明SPA14诱导比AS01B更平衡的Th1/Th2反应。
III.结论
在C57BL/6小鼠中，与hCMV gB和五聚体一起配制的SPA14引起高体液和细胞免疫反应。SPA14在上皮(在没有补体下)和成纤维细胞(在有补体下)上引起针对hCMV的高血清中和抗体滴度，类似于AS01B诱导的滴度；对两种hCMV抗原具特异性的分泌IgG1和IgG2c的效应细胞；对gB具特异性的分泌IFN-γ和IL-5的细胞；以及主要对五聚体具特异性的分泌IFN-γ的细胞。
结果表明，SPA14引起针对hCMV gB和五聚体的混合Th1/Th2免疫谱，而AS01B触发了更偏向Th-1的免疫反应，引起更高频率的特异性IgG2c分泌B细胞和IFN-γ分泌T细胞。
实施例8：含E6020-QS21的脂质体对施用给食蟹猴的RSV pre-F-铁蛋白抗原的佐剂化效应
该研究评价了在幼稚食蟹猴模型(长尾猕猴(Macaca fascicularis))中，佐剂化RSV pre-F-铁蛋白疫苗相比于未佐剂化RSV pre-F-铁蛋白疫苗的免疫原性。pre-F-铁蛋白是在CHO细胞中产生的重组蛋白抗原颗粒，由封闭为融合前构象并融合到自组装的幽门螺杆菌铁蛋白部分的RSV-F糖蛋白组成(Swanson等人,Sci Immunol.2020；5(47))。测试了一种佐剂：SPA14(脂质体+QS21+E6020)。
使用8只食蟹猴(4只雄性和4只雌性)并分配为2组，每组4只动物(2只雄性和2只雌性)。
在第0天和第28天，通过三角肌肌内注射共评估两种RSV候选疫苗(每个动物组一种配制品)。在免疫前后5个月内的不同时间点采集样品(血清和PBMC)。
只有SPA14佐剂化pre-F-铁蛋白诱导RSV-A2中和抗体，其在第49天(第2剂后三周)达到峰值。重要的是，佐剂化RSV pre-F-铁蛋白配制品诱导了针对RSV-B毒株(ATCC 18537)的交叉中和抗体。在雄性和雌性之间没有观察到差异。血清中的中和抗体反应在第2剂后的5个月内仍可检测到，表明反应寿命长。
SPA14佐剂化pre-F-铁蛋白也显示出诱导F特异性记忆IgG分泌细胞。
与非佐剂化组相比，SPA14佐剂化配制品显著诱导更高水平的RSV F特异性T细胞IFNγ/IL-2ELISpot反应，显示出TH1型反应。
I.材料和方法
动物信息
将24至30个月的食蟹猴(长尾猕猴-Noveprim)安置在Cynbiose,SA(Marcy l’Etoile-法国)。该研究由Cynbiose动物福利机构和VetAgro-Sup伦理委员会(1avenueBourgelat,69280Marcy l’法国)审查，并以1633-V3号(MESR编号：2016071517212815)获得批准。所有实验均按照2013年2月7日法国官方公报上发布的欧洲指令2010/63/UE进行。
所测试的组合物和剂量在下表7中提供。
表7
生物取样和分析试验
血液取样用于血清制备
通过静脉穿刺从清醒动物的股骨血管收集血液样品用于血清制备。如下将每只动物大约4mL取样到装有凝血激活剂和分离凝胶的管(SSTTMII Advance，参考：367955，Becton Dickinson)中：D12(基线)、D13、D28(第2剂之前)、D49、D63、D91、D119、D149和D163。
在+2℃至+8℃的温度下将血液样品储存过夜后，通过在+4℃下以2000x g离心20min提取血清。从每只动物制备至少四份300μL等分的血清，并在2型层流柜下的冷冻管中调节。
血液取样用于外周血单个核细胞(PBMC)分离
通过静脉穿刺从股骨血管收集血液样品用于PBMC分离。将每只动物大约12mL取样到6mL的肝素钠管(参考：367876，Becton Dickinson)中。
如下对清醒动物进行该操作：D12(基线)、D7、D35、D119和D161。
全身RSV F特异性IgG ELISA
通过手动ELISA测试RSV-F特异性抗体滴度。简而言之，将微量滴定板(Dynex，Nunc)用1μg/mL在碳酸氢盐缓冲液(Sigma，目录号C3041-100CAP)中的RSV F蛋白(SinoBiologicals，目录号11049-V08B)包被。将板在4℃下孵育过夜，然后用PBS-Tween0.05％-乳5％封闭1h。将血清在包被板的PBS-Tween 0.05％-乳5％中连续稀释。在37℃下孵育1h30后，将洗涤板(用PBS-Tween 0.05％)在37℃下与1:10000稀释的山羊抗猴IgG-HRP(Biorad，目录号AAI42P)孵育1h30。将板洗涤并与四甲基联苯胺(TMB)底物(Tebu-bio，目录号TMB 100-1000)在室温下在黑暗中孵育30m。用每孔100μL HCl 1M(VWRProlabo，目录号30024290)停止比色反应，并在Versamax读板器(Molecular Devices)上在450和650nm下进行测量。
RSV噬斑减少中和试验(PRNT60)以检测RSV中和抗体(RSV-A2和RSV-B毒株)
在感染前一天，将Vero细胞以70,000个细胞/孔在500μL下接种在24孔板上。在感染当天，首先将血清样品在56℃下灭活30min，然后在DMEM-Glutamax+2％FBS+1％PS培养基中稀释4倍，最后在有或没有豚鼠补体(10％)下，与等体积的病毒(70PFU/孔)混合，在37℃下孵育1h。
去除Vero细胞的上清液，并用100μL DMEM-Glutamax+2％FBS+1％PS和100μL/孔的血清/病毒混合物代替。在37℃下孵育1.5小时后，在孔中添加甲基纤维素覆盖物(0.75％DMEM-2％FBS-1％PS)。将板在37℃ 5％CO2下孵育5天。
在孵育时间后，将板在4℃下用无水甲醇(-20℃)固定1h。
在室温下用PBS-乳5％将洗涤板封闭1h，然后进行免疫染色：
-对于RSV-A2毒株，以1:2000稀释的多克隆抗RSV-HRP抗体(abcam，目录号20686)在室温下至少2h。
-对于RSV-B毒株，以1:2000稀释的单克隆抗RSV融合蛋白抗体(abcam，目录号24011)在室温下1h，洗涤后以1:2000稀释的抗小鼠HRP(abcam，目录号ab6789)在室温下1h。
在洗涤后，将板与True Blue底物(SeraCare，目录号5510-0030)在室温下搅拌孵育几分钟。当噬斑可见时，通过用水洗涤来停止反应。在多模式读取器(Viruscope，Microvision)中检测和计数噬斑，并在60％减少终点下测定中和抗体滴度。
F特异性IgG记忆B细胞ELISpot
在PBMC多克隆刺激(IL-2+R848)5天后以诱导静止记忆B细胞分化为抗体分泌细胞(ASC)来评价F特异性B细胞记忆反应。然后通过适于测量F(SinoBio，参考号1149_V08B)特异性反应的来自Mabtech的人IgG FluoroSpot试剂盒(产品代码#FS_05R24G-10)测量ASC频率。
简而言之，将PBMC在补充有R848(1μg/ml)和重组人IL-2(10ng/ml)的完全培养基(含有10％胎牛血清、200mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和10μg/ml链霉素的罗斯威尔公园纪念研究所培养基)中培养。在培养5天后，回收细胞，洗涤并用于FluoroSpot测定，如下所述。
将配备有低荧光PVDF膜的fluorospot板用35％乙醇预润湿1min，用无菌水洗涤，然后用PBS洗涤，并在5℃±3℃下用F抗原(SinoBio 11049-V08B)或捕获mAb的混合物(MT91/145和MT57)包被过夜。将板用PBS洗涤，并在37℃下用完全培养基封闭1小时。在用PBS洗涤后，将PBMC铺板并在37℃下孵育5h。在含有0.05％Tween20的PBS中洗涤3次和PBS洗涤6次后，将板与抗人IgG-550(MT78/145)检测mAb在37℃下孵育2h。在用PBS洗涤后，用斑点读取器(Microvision)计数荧光斑点。
RSV F特异性IFNγ/IL-2 fluorospot
使用来自Mabtech的猴IFNγ/IL-2FluoroSpot试剂盒(产品#52122-10)进行FluoroSpot测定，以检测和计数分泌一种或两种细胞因子的细胞。简而言之，首先将MultiscreenTM 96孔IPFL板(Millipore)在室温下用25μL 35％乙醇预润湿1分钟，用无菌水洗涤，然后用PBS洗涤两次，并在5℃±3℃下分别用100μL抗猴IFNγ和抗IL-2纯化克隆MT126L和MT2A91的混合物包被过夜。将每孔用200μL无菌PBS洗涤孔3次，然后在37℃下用200μL完全培养基(含有10％胎牛血清、200mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和10μg/ml的罗斯威尔公园纪念研究所培养基)进行2小时饱和步骤。在消除完全培养基后，向每孔中添加0.2 106个PBMC和作为共刺激因子的抗CD28 mAb(0.1μg/mL)，并与2μg/mL预混合肽或RSV F蛋白池、2μg/mL RSV F蛋白(Sino Biological#11049100_V08B)或阳性对照(抗CD3)孵育过夜。在PBS 0.25％BSA中洗涤6次后，在室温下在黑暗中添加100μL FITC缀合的抗IFNγ(7-B6-1-FS克隆)和生物素化的抗IL-2(MT8G10克隆)的混合物，持续2h。在PBS 0.25％BSA中洗涤3次后，向每孔中添加100μL抗FITC Ab和SA-550链霉亲和素的混合物，并在室温下在黑暗中孵育1h。用PBS 0.25％BSA将板进一步洗涤6次。最后，去除板的背面，并用水迅速冲洗孔底。将板风干并储存在黑暗中直到读取。用配备有Cy3和FITC荧光过滤器的荧光读板器(Microvision)计数对应于IFNγ或/和Il-2的单或双生产细胞的每个斑点。
II.结果
全身体液反应
pre-F-铁蛋白+SPA14诱导血清中增强的F特异性IgG滴度
该研究旨在评价血清幼稚食蟹猴对重复剂量的RSV pre-F-铁蛋白(非佐剂化组)相比于RSV pre-F+SPA14疫苗接种(佐剂化组)的免疫反应时程，在研究开始时(D0)和D28进行免疫。
使用来自Sinobiological的F抗原进行ELISA。在免疫后的所有时间点，与非佐剂化组相比，SPA14组的RSV F特异性IgG滴度显著更高(图13)。SPA14组的F特异性IgG滴度在D49(第2剂后3周)达到峰值，比非佐剂化组高大约200倍(几何平均值为20000相比于100)。
在整个研究中，SPA14组的F特异性IgG滴度保持高于非佐剂化组。反应者定义为比测定LOD(检测限)20高≥4倍(给药后水平≥80)的动物。应用该标准，SPA14组在D13达到100％反应率，并且F特异性IgG滴度持续持久，在研究结束时为100％反应者(D161＝第2剂后5个月)。非佐剂化组在D49(第2剂后3周)和D161达到最大50％的反应率。
RSV pre-F-铁蛋白+SPA14诱导RSV-A2中和抗体
血清病毒中和抗体与人类抵抗RSV疾病相关。
与F特异性IgG滴度不同，RSV-A2病毒中和抗体(补体依赖性和补体非依赖性)仅由SPA14佐剂化配制品诱导(图14)。
与RSV F特异性IgG反应类似，RSV-A2病毒中和抗体在D49(第2剂后3周)达到峰值。
SPA14佐剂化组的中和滴度显著高于非佐剂化组(p<0.01)。
反应者定义为比测定LOD 20高≥4倍(给药后水平≥80)的动物。应用该标准，SPA14组在存在补体的情况下在D28达到75％(4只动物中的3只)反应率，并在D49达到100％。相比之下，非佐剂化组未显示任何反应者(图14B)。
在不存在补体的情况下，SPA14在D49达到100％的反应率(图14A)。
在研究结束时(D161＝第2剂后5个月)，SPA14组仍有100％反应者(在有和没有补体下)。
pre-F-铁蛋白+SPA14诱导针对RSVB毒株(ATCC18537)的交叉中和抗体
RSV A和B毒株的多种变体在人群中传播，因此有效的RSV疫苗必须诱导交叉中和抗体。因此，评价了免疫血清交叉中和RSV-B毒株(ATCC18537)的能力。
应用反应者标准(>80)，非佐剂化配制品在第49天仅诱导25％的针对RSV-B毒株的反应者(1/4NHP)，而SPA14佐剂化pre-F-铁蛋白在D49可在100％的NHP中诱导交叉中和滴度，佐剂化组比非佐剂化组引起更高的交叉中和滴度(图15)。
总之，这些结果表明，与非佐剂化RSV pre-F-铁蛋白疫苗相比，佐剂化RSV pre-F-铁蛋白疫苗诱导更高水平的交叉中和RSV抗体。
全身细胞反应
F特异性记忆B细胞反应
在D119(第2剂后3个月)和D161(第2剂后5个月)通过Fluorospot评估F特异性IgG记忆B细胞(图16A至图16B)。
SPA14诱导的F特异性IgG循环记忆B细胞可在D119和D161检测到。记忆反应低但可测量(<100个斑点/106个细胞或总IgG分泌细胞的0.01％至0.1％)。与非佐剂化组相比，SPA14诱导显著更高的记忆IgG分泌细胞(P值<0.01)。
F特异性IFNγ和IL-2 T细胞ELISpot
CD4+T细胞发挥基本的辅助功能，并对B细胞激活和分化至关重要。选择干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-2分析Th1免疫反应。与非佐剂化组相比，接种SPA14疫苗的猴对F产生了强烈的细胞免疫反应(P值<0.01)，如第一次和第二次注射后一周的IFNγ和IL-2ELISpot测定结果所示(图17)。在第35天，IFNγ斑点形成细胞(SFC)的范围为每百万个PBMC 100至500个(图17A)，并且IL-2SFC的范围为每百万个PBMC 200至1000个(图17B)。
III.结论
在该研究中，只有佐剂化pre-F-铁蛋白诱导RSV-A2中和抗体，其在第49天(第2剂后三周)达到峰值并持续至少6个月。SPA14诱导显著高的中和滴度。重要的是，佐剂化RSVpre-F-铁蛋白配制品诱导了针对RSV-B毒株(ATCC 18537)的交叉中和抗体。
SPA14诱导F特异性记忆IgG分泌细胞(反应性记忆)，如果循环中和抗体(组成型记忆)不足以提供保护，则这可能对RSV感染后重新激活中和抗体的产生是非常有意义的。
与仅抗原组相比，SPA14佐剂化配制品诱导显著更高水平的RSV F特异性T细胞IFNγ/IL-2ELISpot反应(Th1)。
通过测量PBMC上清液中的细胞因子，SPA14产生IFNγ分泌细胞(Th1)。
实施例9：CMV抗原和疫苗组合物的制备
实施例4、10和11的CMV抗原和疫苗组合物的制备
材料
表8描述了以下实施例中使用的抗原和佐剂。
表8：佐剂配制品
制备方法
如表8所指示或如下所公开制备抗原和佐剂配制品。
除AS01E和AS01B外，将佐剂的原液按体积与抗原体积混合，然后施用所需剂量：50或500μL(用于小鼠或兔)。
AS01B从获得，并与更浓缩的抗原一起使用以维持初始浓度。
AS01E由与抗原的体积:体积混合产生(与其他佐剂一样)。
HCMV五聚体
在用5种质粒转染的CHO细胞系中获得HCMV五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131，每种质粒包含编码构成HCMV五聚体的5种蛋白质之一的序列。这些序列来自毒株BE/28/2011(Genbank ID KP745669)。gH序列没有用于分泌重组五聚体的跨膜结构域。表达五聚体复合物的例子在Hofmann等人(Biotechnology and Bioengineering,2015,第112卷,第12期,第2505-2515页)中给出。
SPA14
例如，如下制备含20μg/ml的E6020的SPA14的原液。
根据如下溶剂(例如，乙醇)注入法制备脂质体。
通过将2.0mg E6020粉末溶解在0.998ml乙醇中，以2mg/ml制备E6020乙醇溶液。
通过将40mg DOPC和10mg胆固醇以及0.100ml先前制备的E6020乙醇溶液溶解在0.850ml乙醇中，以40mg/ml DOPC、10mg/ml胆固醇和0.200mg/ml E6020制备4倍浓缩的乙醇溶液。将溶液在室温(RT)下搅拌直至产物完全溶解，得到无色溶液。
在7ml Lyo玻璃小瓶中，在室温下以1000rpm搅拌3.0mL CBS(柠檬酸盐缓冲溶液)pH 6.3(柠檬酸盐10mM，NaCl 140mM，pH 6.3)。使用具有22ga针头的Hamilton注射器和注射泵以0.1ml/min缓慢添加1.0ml脂质溶液以形成脂质体。将脂质体用CBS pH 6.3透析(在10000MCWO透析盒上)三次(半天、一夜和一天)。
将脂质体悬浮液在直径33mm的Millex过滤器PVDF 0,22μm上无菌过滤，并在氮气下在+4℃下储存。
根据透析稀释因子估计脂质体组分浓度。对于1.6的透析稀释因子，脂质体组分浓度为6.25mg/ml DOPC、1.56mg/ml胆固醇和0.031mg/ml E6020。
在流动罩下，将3.0mg QS21重新悬浮在3.0mL CBS pH 6.3中，以获得1.0mg/ml的QS21溶液，并在直径25mm的Pall Acrodisc 0.2μm上无菌过滤。
在无菌条件下，通过向5.000ml先前脂质体悬浮液和1.250ml CBS pH 6.3中添加1.563ml在CBS pH 6.3中1.0mg/ml的QS21溶液来配制SPA14(脂质体悬浮液)。将混合物使用涡旋搅拌10秒，并在氮气下在+4℃下储存，得到4mg/ml DOPC、1mg/ml胆固醇、0.020mg/mlE6020和0.200mg/ml QS21的最终SPA14无菌悬浮液。
为了与抗原混合，将SPA14佐剂轻轻倒置5次，以使产物均质化，然后与两次浓缩的抗原混合。然后将免疫原性组合物储存在适当的温度(2℃-8℃)下，直到进一步使用。
与抗原的混合按体积/体积进行，并且将所得混合物轻轻倒置5次。将混合物在注射前或注射前最多3小时制备好。在后一种情况下，必须将它们放置在2℃-8℃下直到注射。
对于实施例10，如上所述制备SPA14原液，但是最终比率为DOPC:胆固醇:QS21:E6020为4:1:0.2:0.04mg/ml。
对于实施例4和11，如上所述分别以4:1:0.2:X mg/ml的DOPC/Chol/QS21/E6020制备SPA14原液。使用以下四种不同浓度X的E6020：0mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml和0.02mg/ml E6020，以获得实施例9的表8中描述的E6020剂量(用抗原以v/v稀释并注射500μl)。
实施例10：不同佐剂的评价
不同佐剂的评价
将佐剂AF04、SPA14和AS01E与AF03进行比较(AF03是一种角鲨烯乳液佐剂，与gB抗原临床试验中使用的MF59一样-参见WO 2007/005583-其在预防原代HCMV的HCMV获得方面显示出50％的功效，但是中和抗体水平迅速下降)。
材料与方法
在本小鼠研究中，37周龄幼稚雌性C57BL/6J小鼠组在第0天、第21天和第221天(第7个月)通过肌内途径接受三次肌内(IM)免疫接种用以下佐剂配制的CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂-剂量：50μL)：AF03(1.25mg角鲨烯/剂)、AF04(含有1μg/剂E6020的AF03角鲨烯基乳液)、SPA14(含有5μg QS21和1μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体)或AS01E(从商业疫苗Shingrix获得的AS01B的半倍稀释液)。在第1个月、第2个月、第3个月、第4个月、第5个月、第6个月、第7个月和第8个月收集血液样品，以监测血清中和抗体反应。将约1mL血液收集在装有凝血激活剂和血清分离剂的小瓶(BD Vacutainer SST，参考367783)中。在+4℃下过夜后，将血液以3000rpm离心20分钟，收集血清并储存在-20℃直至分析。此外，在第1个月、第7个月和第8个月时，从每组10只小鼠收集血液和脾脏，以监测CMV gB和CMV五聚体特异性IgG抗体亚类、抗体分泌细胞(ASC)频率以及IL-5和IFN-γ分泌。
对于细胞反应测定，在无菌条件下收集脾脏，并在脾脏取样后尽快分离脾细胞。
血清中和测定
简而言之，在微中和(MN)测定前一天，将2,5x104个MRC-5成纤维细胞或ARPE-19细胞分配在96孔暗板中。在D0，将血清在56℃下热灭活30min。将血清样品在96深孔板的DMEM/F12 1％FBS中连续稀释两倍，从1/10开始到1/10240，并与4,2log FFU/ml的BADrUL131-Y4CMV病毒株(如Wang等人,J Virol.2005年8月；79(16):10330-8中所述)在37℃下在5％CO2细胞培养箱中一起孵育60min。然后将血清/病毒混合物转移到MRC5或ARPE-19细胞上，并在37℃下在5％CO2细胞培养箱中孵育3天(对于MRC5细胞)和4天(对于ARPE细胞)。
然后去除培养物上清液，并在室温下用100μl 1％甲醛的PBS将细胞固定1小时。然后将板用PBS洗涤并在室温下风干，然后在Microvision荧光读板器上进行分析以计数每个孔中的感染细胞。
作为对照，每个板上存在两个细胞对照孔(无病毒)和六个这样的孔，其中细胞感染了含有4,2log FFU/mL的一半病毒稀释液。这六个孔的平均值定义了血清中和阈值，确定为50％特征信号值。中和终点滴度定义为低于计算的50％特征信号值的最后一次稀释度的倒数。每份受试血清的中和滴度(μPRNT50)定义为诱导感染细胞减少50％的最后一次稀释度，即诱导的感染细胞低于计算的50％特征信号值的最后一次稀释度。计算每组的几何平均中和抗体滴度。
ELISA测定
根据以下程序，通过机器人ELISA测定法滴定针对CMV-gB抗原或CMV-五聚体抗原的血清IgG1和IgG2c抗体。
将Dynex 96孔微板在4℃下用1μg/孔在0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6(Sigma)中的CMV-gB或CMV-五聚体包被过夜。然后将板在37℃下用150μL/孔的PBS Tween-乳(PBS pH 7.1，0.05％Tween 20，1％(w/v)脱脂乳粉(DIFCO))封闭至少1小时。所有接下来的孵育均在100μL的最终体积中进行，然后用PBS pH 7.1，0.05％Tween 20洗涤3次。在PBS-Tween-乳中对血清样品进行连续两倍稀释(从1/1000或1/10000开始)并添加到孔中。将板在37℃下孵育90min。在洗涤后，将用PBS-Tween-乳以1/2000稀释的山羊抗小鼠IgG1或IgG2c过氧化物酶缀合物抗体(Southern Biotech)添加到孔中，并将板在37℃下孵育90min。将板进一步洗涤并在20℃下在黑暗中与100μL/孔的即用型四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(TEBU)孵育30min。用100μL/孔的HCl 1M(Prolabo)停止反应。
用读板器(VersaMax-Molecular Devices)在450nm-650nm下测量光密度(OD)。从滴定曲线(每个板上放有参考小鼠超免疫血清)，使用CodUnit软件针对0.2至3.0的OD值范围计算IgG1或IgG2c抗体滴度。以任意ELISA单位(EU)表示的该参考的IgG1或IgG2c滴度对应于给出1.0OD值情况下的倒数稀释度的log10。抗体检测阈值为10个ELISA单位(1.0log10)。所有最终滴度均以log10(Log)表示。
使用单个算术值计算IgG1/IgG2c比率，并计算各组的单个IgG1/IgG2c比率的几何平均值。
FLUOROSPOT
荧光联免疫斑点(FLUOROSPOT)用于检测和计数分泌IFN-γ和IL-5细胞因子的单个细胞。
将96孔IPFL底微板(Multiscreen)的膜用35％乙醇预润湿，然后用PBS 1X洗涤两次。然后用分别以1/100和1/50稀释的大鼠抗小鼠IFN-γ或大鼠抗小鼠IL-5抗体(10μg/ml，Pharmingen)包被微板，并在4℃下孵育过夜。
在D1，将板用PBS洗涤，然后在37℃下用RPMI 10％FBS封闭至少2h。在板洗涤后，在存在鼠IL-2(10U/ml)的情况下，将5x105个新鲜分离的脾细胞/孔与CMV-gB抗原(0.1μg/ml)、CMV-五聚体(0.1μg/ml)或刀豆球蛋白A(Con A，2.5μg/mL)(作为阳性对照)一起孵育过夜。
在D2，用PBS 1X-BSA 0.1％(200μL/孔)将板洗涤6次。在洗涤步骤后，在室温下在黑暗中添加100μL/孔的1μg/mL的在PBS 1X-BSA 0.1％中的生物素化的抗小鼠IFN-γ或抗小鼠IL5抗体，持续2小时。用PBS 1X-BSA 0.1％(200μL/孔)将板再次洗涤3次。然后，将100μL/孔的1μg/mL的在PBS 1X-BSA 0.1％中的链霉亲和素-PE在室温下在黑暗中孵育1小时。
用PBS 1X-BSA 0.1％(200μL/孔)将板进一步洗涤6次。将板在5℃±3℃下在黑暗中储存直到读取。
用自动FLUOROSPOT读板器(Microvision)计数对应于IFN-γ或IL5分泌细胞(IFN-γSC或IL5 SC)的每个斑点。结果表示为每106个脾细胞的IFN-γ或IL-5分泌细胞数。
IgG、IgG1和IgG2c FLUOROSPOT测定
荧光联免疫斑点(FLUOROSPOT)用于检测和计数分泌抗体的单个B细胞，而不考虑抗原特异性(IgG1、IgG2c或总IgG)。
将96孔IPFL底微板(Multiscreen)的膜用35％乙醇预润湿，然后用PBS 1X洗涤两次。然后用分别以1/68、1/100和1/100稀释的CMV gB抗原(10μg/ml，Sanofi)、CMV-五聚体(10μg/ml，NAC)或总IgG抗体(10μg/ml，KPL)包被微板，并在4℃下孵育过夜。
在D1，将板用PBS洗涤，然后在37℃下用RPMI 10％FBS封闭至少2h。
在板洗涤后，将对于CMV-gB抗原或CMV-五聚体5x105个新鲜分离的脾细胞/孔和对于总IgG抗体2.5.105个新鲜分离的脾细胞/孔孵育5小时。
在5小时后，将板用PBS 1X洗涤3次，并储存在4℃下过夜。
在D2，用PBS 1X-BSA 0.1％(200μL/孔)将板洗涤6次。在洗涤步骤后，在室温下在黑暗中添加100μL/孔的分别为4、2或0.5μg/mL的在PBS 1X-BSA 0.1％中的抗小鼠IgG1PE或抗小鼠IgG2c FITC或抗小鼠总IgG抗体，持续2小时。用PBS 1X-BSA 0.1％(200μL/孔)将板再次洗涤6次。将板在5℃±3℃下在黑暗中储存直到读取。
用自动FLUOROSPOT读板器(Microvision)计数对应于抗体分泌细胞(ASC)(IgG1ASC、IgG2c ASC或总IgG ACS)的每个斑点。结果表示为每106个脾细胞的抗体分泌细胞数。
统计分析
所有分析均在SAS(SAS Institute，北卡罗来纳州卡里)上进行。进行方差分析(ANOVA)单因子模型，以组为固定因子；或ANOVA，双因子模型，以组和时间为固定因子。对于纵向分析，进行协方差分析(ANCOVA)，以组为类别变量，以时间为连续变量。为了与AF03进行比较，使用了邓尼特调整。
结果
如图18所示，无论时间点如何，所有测试配制品对CMV gB和CMV五聚体特异性免疫反应均显示出佐剂效应。与AF03相比，SPA14引起统计学上显著更高(≥3倍)且更持久的中和抗体滴度(优效性检验，双侧邓尼特调整，所有p值<0.05)。此外，SPA14引起比AF04更高的中和抗体反应。SPA14和AS01E引起类似幅度的中和抗体反应。
如图19A和图19B所示，第1个月(第2剂后15天)和第8个月(最后一剂后28天)的分析证实了在较早时间点观察到的SPA14、AS01E、AF03和AF04的免疫谱以及SPA14和AS01E佐剂诱导更高且更持久的中和抗体滴度的能力(图19A和图19B，所有p值<0.05)。
此外，与AF03相比，SPA14和AS01E诱导了更高的IgG2c B记忆细胞频率以及更偏向Th1的细胞反应。关于免疫反应谱，接受SPA14和AS01E的组的IgG1/IgG2c比率显示Th1谱，而AF03引起高IgG1滴度，观察到Th2谱。在第1个月通过细胞反应分析证实了这一点。与AF03相比SPA14和AS01E的偏向Th1的谱表现为在用CMV gB或CMV五聚体刺激后IL-5产生减少而IFN-γ产生增加。第7个月和第8个月的分析证实了在较早时间点观察到的SPA14和AS01E的免疫谱以及这些佐剂诱导比AF03更偏向Th1的细胞反应的能力(图20A至图20B)。此外，在SPA14和AS01E情况下的与Th1偏向相关的浆母细胞和B记忆细胞中CMV gB和CMV五聚体特异性IgG2c/IgG1 ASC比率高于AF03。SPA14在第35天测量的这种早期记忆B细胞反应在第7个月得到证实(检测到0.6％至1％的对CMV gB和CMV五聚体具特异性的IgG2c-ASC记忆B细胞)。这些IgG2c ASC频率明显高于AF03(所有p值<0.001)。此外，观察到SPA14比AS01E引起更平衡的Th1/Th2反应。如图20所示，特别是在第8个月，与AS01E相比，SPA14诱导更低的IFN-γ分泌细胞增加(降低2.6倍，不显著)和更低的IL-5分泌细胞减少(高2.9倍，p值<0.001)，导致与AS01E相比，Th1/Th2比率更低且更平衡。
在小鼠模型中进行到第8个月的分析允许我们得出结论，SPA14和AS01E能够满足以下预期标准：(i)比AF03更高的中和抗体滴度；(ii)与AF03相比，偏向Th1的谱，如较低的IgG1/IgG2c亚类比率和较高的IFNγIL-5比率所证明的；以及(iii)与AF03相比，更持久的中和抗体反应和更高频率的记忆B细胞，并且可能是改进CMV候选疫苗的合适佐剂。
当比较SPA14和AF04时，我们观察到AF04引起了在AF03和SPA14之间的中间反应。对于在乳液(AF04)或脂质体(SPA14)中评价的相同TLR4激动剂浓度，AF04能够在第1个月和第8个月诱导比AF03更高的中和抗体(图18)，但是中和滴度的这种增加低于SPA14获得的。同样，对于Th1/Th2谱，与AF03相比，AF04能够增加IFN-γ并减少IL-5，但是这些变化在SPA14配制品中得到增强且更明显。
结论
总之，SPA14和AS01E是诱导最高gB和五聚体特异性中和抗体滴度以及针对gB和五聚体的最高持久免疫反应的佐剂。两种佐剂均诱导Th1谱免疫反应。SPA14诱导更平衡的Th1/Th2反应。
实施例11：用SPA14佐剂化的组合物的反应原性
用SPA14佐剂化的组合物的反应原性
该研究的目的是研究在间隔三周肌内注射两次后含有SPA14或AS01B作为佐剂的含CMV抗原的疫苗组合物在实施例4的相同新西兰白兔组中的潜在反应原性，并评价在2周观察期内任何局部反应的延迟发生和/或可逆性。
含有CMV抗原的SPA14和AS01B佐剂化免疫原组合物如实施例4所述。
材料和方法
动物和研究设计
动物和研究设计是实施例4中的动物和研究设计。
血液样品收集
在开始研究之前，然后在第2天、第3天、第7天、第23天、第24天和第36天收集血液样品。对于纤维蛋白原分析，在含有乙酸三钠的小瓶中采集血液样品，并且对于中性粒细胞计数，用含有EDTA-K2的试管采集血液样品。
中性粒细胞计数
根据制造商的建议，使用ADVIA(120或2120，Siemens)测定中性粒细胞计数。
纤维蛋白原
根据制造商的建议，使用STAR Max(Stago)系统测定纤维蛋白原参数。
球蛋白
根据制造商的建议，使用AU680(Beckman Coulter)系统测定球蛋白参数。
C反应蛋白
使用ELISA(CRP-10Life Diagnostics)测定CRP。如下制备样品：将样品在约4℃下以1 800G离心10分钟。然后在冰上收集血清。根据制造商的建议使用ELISA试剂盒。
结果
间隔3周向NZW兔两次肌内施用用AS01B或SPA14佐剂化的包含CMV抗原gB+五聚体(gH/gL/UL128/UL130/UL131A)的免疫原性组合物没有诱导任何全身毒性。
与接受SPA14的动物相比，在接受AS01B佐剂化组合物的动物中观察到中性粒细胞计数和纤维蛋白原水平略有增加，以及球蛋白和CRP水平的增加。
表9：在注射后24h和48h，AS01B和SPA14诱导中性粒细胞计数(G/L)增加
在第一次注射后，与仅抗原相比，AS01B(第3组)诱导中性粒细胞计数增加(约2倍)。虽然SPA14也观察到增加，但它保持适中，且仅在5μg E6020下与AS01B一样强。
AS01B在第二次注射免疫原性组合物后也诱导增加，这在SPA14配制品中没有观察到，或者仅非常适度且持续时间较短(SPA14，在5μg/ml E6020下)。
表10：在注射后24h和48h，AS01B和SPA14诱导纤维蛋白原水平(g/L)增加
在第一次和第二次注射后48小时，与仅抗原相比，AS01B诱导纤维蛋白原水平增加高达88％。同样，如果在第一次注射后48h SPA14诱导纤维蛋白原增加，则第二次注射后纤维蛋白原水平的增加程度较小(与由AS01B诱导的增加相比)。
表11：在注射后24h和48h，AS01B和SPA14诱导球蛋白水平(g/L)增加
与仅抗原相比，AS01B诱导球蛋白水平增加，略高于用SPA14佐剂化组合物观察到的水平，特别是在第二次注射后。
表12：在注射后24h和48h，AS01B和SPA14诱导CRP浓度(mg/L)增加
AS01B诱导的CRP水平增加高于SPA14佐剂化配制品观察到的增加。此外，增加持续时间比SPA14观察到的时间更长，长达48h。值得注意的是，在第二次注射后48h，AS01B诱导的CRP水平是由含5μg/ml的E6020的SPA14诱导的CRP水平的两倍。CRP是一种众所周知的反应原生物标记物。
结论
间隔3周向NZW兔两次肌内施用用AS01B或SPA14(含有0至5μg的E6020)佐剂化的CMV-gB+五聚体耐受性良好，并且没有诱导任何全身毒性。在所有处理组中，仅在注射部位(IS)观察到局部反应，主要表现为水肿，但是不被认为是不良反应。观察到轻微且可逆的中性粒细胞计数和纤维蛋白原水平增加，这在佐剂化处理组之间相当，但是SPA14的这些增加的程度小于AS01B。在所有佐剂化处理组中，观察到球蛋白和CRP水平也增加，SPA14配制品较低，并且对于反应原生物标记物CRP，比AS01B更快地恢复到基础水平。这些变化表明，与AS01B相比，SPA14配制品的反应原特征更低。
实施例4、10和11的总体结论
如上述实施例4、10和11所示，与含有TLR4激动剂的其他佐剂(诸如AF04)相比，含有CMV抗原(例如，gB和五聚体(gH/gL/UL128/UL130/UL131)抗原)并用SPA14佐剂佐剂化的免疫原性组合物被证明可引起更持久的血清中和抗体。SPA14引起的免疫反应与AS01B引起的免疫反应相当。
尽管诱导了偏向Th1的反应，但与AS01B相比，用SPA14佐剂化的免疫原性组合物引起的免疫反应呈现出更平衡的Th1/Th2谱。
最后，如CRP、纤维蛋白原或球蛋白反应所示，与AS01B佐剂化免疫原性组合物相比，用SPA14佐剂化的CMV免疫原性组合物呈现出较低的反应原特征。
含有CMV抗原(诸如gB和五聚体(gH/gL/UL128/UL130/UL131)抗原)并用SPA14佐剂化的免疫原性组合物在引起的免疫反应和低反应原性方面呈现出优异的特征，以确保实践医生或预期接受者对CMV疫苗接种计划的良好依从性。
实施例12：SPA14样配制品中的QS21和QS7皂苷
SPA14配制品中QS21与QS7的比较
该研究的目的是比较含有QS21或QS7作为皂苷的SPA14配制品的溶血活性和佐剂化效应。
材料和方法
脂质体的制备
用hCMV抗原gB和五聚体制备脂质体，如实施例1和4所述。
溶血测定
在使用前，将红细胞(绵羊红细胞10％，Rockland，参考R405-0050，批号BP30202(储存在+4℃下))在冷PBS中洗涤。将5mL绵羊红细胞转移到15mL Falcon管中，并添加7mL冷PBS。将细胞在4℃下700g离心10min。小心地去除上清液，并将细胞沉淀悬浮在12mL冷PBS中。然后，将细胞悬浮液在4℃下700g离心10min。将细胞悬浮和离心步骤重复两次。最后，将细胞悬浮在PBS中，最终体积为5mL，备用。
在圆底P96板中，每孔添加100μL PBS。然后，以在柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸盐10mM，NaCl 140mM，pH 6.3)中连续2倍稀释(1.6μM至200μM)，每孔添加100μL皂苷QS21或QS7溶液。使用仅柠檬酸盐缓冲液作为对照溶液。
添加25μL/孔的10％红细胞溶液，将板在37℃下孵育30分钟，然后在室温下700g离心5min。收集每孔80μL上清液并转移到平底板用于分光光度计读取(OD 540nm)。根据以下公式计算以μM为单位测试的每种皂苷浓度的细胞溶血百分比：100x[(样品吸光度-阴性对照吸光度)÷(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)]。
通过图基调整+单因素方差分析进行统计分析：p<0.05。
在C57BL/6小鼠中进行的免疫反应研究
9组(n＝8)6-8周龄C57BL/6小鼠在股四头肌中接受两次肌内免疫接种(初免和加强：D0和D20)含有用以下配制的2μg CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)的最终注射量50μL：
-含有QS21(5μg)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(4000:1000μg/ml)(“QS21LIP”(0:200μg/mL))，
-含有E6020且不含QS21或QS7的DOPC-Chol脂质体(4000:1000μg/ml)(“E6020LIP”(20:0μg/mL))，
-SPA14(含有5μg QS21和0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体(4000:1000μg/ml)(“SPA14”(20:200μg/mL))
-含有QS7的SPA14样配制品(含有5、15或45μg QS7和0或0.5μg E6020/剂的DOPC-Chol脂质体(4000:1000μg/ml)(“QS7 LIP”(0:200μg/mL)、(0:600μg/mL)或(0:1800μg/mL)，“LIP[QS7+E6020 20]”(20:200μg/mL)、(20:600μg/mL)或(20:1800μg/mL))
表13：配制品
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根据实施例7中描述的方法，在D35收集血液样品和脾细胞，用于测量血清中和抗体反应、CMV gB和CMV五聚体特异性IgG抗体亚类以及IL-5和IFN-γ分泌。
结果
溶血测定
如图21所示，QS21在25μM至100μM下引起100％的红细胞溶血，并在4.2μM下展示出诱导50％红细胞溶血的有效浓度(EC50)，而在类似浓度下，QS7未检测到溶血活性。
在C57BL/6小鼠中进行的免疫反应研究
对于hCMV gB和五聚体抗原，观察到的佐剂效力效应QS21 LIP(0:200)高于QS7LIP(0:200)。然而，如图22A、图22B、图22C和图22D所示，与SPA14(E6020:QS21为20:200)相比，在SPA14样配制品(E62020:QS7为20:200；600或1800)中配制的QS7诱导了类似的IgG1和IgG2c反应。
如图23A和图23B所示，对于hCMV gB和五聚体抗原，含有QS21或QS7的SPA14配制品诱导了相当的IgG2c/IgG1比率。此外，如图24所示，对于hCMV gB和五聚体抗原，SPA14(E6020:QS21为20:200)和LIP[QS7+E6020 20](E6020:QS7为20:200、600或1800)诱导了类似的中和抗体滴度。
尽管在每种测试浓度下，由LIP[E6020+QS7]诱导的分泌细胞因子IFN-γ和IL-5水平略低于由SPA14(E62020:QS21为20:200)诱导的水平，但SPA14(E6020:QS21)与不同测试浓度的LIP[E6020+QS7]之间的IFN-γ/IL-5比率类似，如图25A和图25B所示。
已知由皂树皂苷诱导的佐剂化反应与也是其毒性原因的其酰基相关(Fleck等人,Molecules.2019；24(1):171)。与QS21相比，QS7具有更短的酰基链，并且也具有降低的毒性(Wang等人,ACS Infect Dis.2019；5(6):974-981)。此处的结果证实，基于其体外溶血活性，QS7具有良好的安全性特征。此外，出乎意料的是，当在SPA14样配制品中配制时，它能够诱导与含有QS21的SPA14配制品相当的佐剂化效应。因此，这些结果表明，QS7可有利地用作SPA14配制品中的皂苷，以诱导良好且安全的佐剂化效应。
实施例13：组合QS21脂质体和E6020脂质体相比于SPA14配制品
含有QS21或E6020的组合脂质体与SPA14配制品的比较
该研究的目的是比较含有QS21或E6020的脂质体组合与含有QS21和E6020的SPA14配制品对小鼠模型中由hCMV抗原诱导的免疫反应的佐剂化效应。
材料和方法
脂质体的制备
用hCMV抗原gB和五聚体制备脂质体，如实施例1和4所述。
在C57BL/6小鼠中进行的免疫反应研究
5组6-8周龄C57BL/6小鼠(n＝8)在股四头肌中接受两次肌内免疫接种(初免-加强：D0和D20)含有用以下配制的2μg CMV gB和CMV五聚体(各2μg/剂)的最终注射量50μL：
-含有QS21(200μg/ml)且不含E6020的DOPC-Chol脂质体(4000:1000μg/ml)(“QS21LIP”)，
-含有E6020(20μg/ml)且不含QS21的DOPC-Chol脂质体(4000:1000μg/ml)(“E6020LIP”)，
-SPA14(含有200μg/ml QS21和20μg/ml E6020的DOPC-Chol脂质体(4000:1000μg/ml))
一组小鼠接受不含佐剂(无佐剂)的抗原，并且一组小鼠接受QS21 LIP和E6020LIP的组合。每组抗原的施用量相同。
在D35收集血液样品和脾细胞，用于测量CMV gB和CMV五聚体特异性IgG抗体亚类、IL-5和IFN-γ分泌以及中和抗体，如实施例7所指示。
通过图基调整+单因素方差分析进行统计分析：p<0.05。
结果
如图26A和图26B所示，对于hCMV gB和五聚体抗原，QS21 LIP(0:200)或E6020 LIP(20:0)观察到的IgG1和IgG2c反应低于SPA14(E6020:QS21为20:200)观察到的佐剂效力效应。然而，组合脂质体QS21 LIP(0:200)或E6020 LIP(20:0)诱导的IgG1和IgG2c反应与SPA14类似。
如图27A和图27B所示，组合脂质体QS21 LIP和E6020 LIP与SPA14配制品之间的IgG2c/IgG1比率类似。
对于hCMV gB和五聚体抗原，QS21 LIP(0:200)或E6020 LIP(20:0)观察到的细胞因子IFN-γ/IL-5的分泌水平低于SPA14(E6020:QS21为20:200)观察到的IFN-γ/IL-5的分泌水平。然而，组合脂质体QS21 LIP(0:200)或E6020 LIP(20:0)诱导的细胞因子IFN-γ/IL-5水平与SPA14类似。
如图28A和图28B所示，组合脂质体QS21 LIP和E6020 LIP与SPA14配制品之间分泌的细胞因子IFN-γ/IL-5的比率类似。
如图29A和图29B所示，组合脂质体QS21 LIP(0:200)或E6020 LIP(20:0)诱导了与SPA14类似的在成纤维细胞(MRC-5)或上皮细胞(ARPE-19)细胞系上测得的初免后(D20)和加强后(D35)血清中和抗体。测量到组合脂质体QS21 LIP(0:200)或E6020LIP(20:0)的显著佐剂效应。
总之，组合脂质体QS21 LIP和E6020 LIP可以诱导与SPA14配制品(即，同时含有E6020和皂苷诸如QS21的脂质体)获得的效应类似的佐剂化效应。
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Trp Val Lys Lys Val Ile Trp Tyr Leu Ser Gly Arg Asn Gln Thr Ile
85 90 95
Leu Gln Arg Met Pro Arg Thr Ala Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Val
100 105 110
Gln Ile Ser Val Glu Asp Ala Lys Ile Phe Gly Ala His Met Val Pro
115 120 125
Lys Gln Thr Lys Leu Leu Arg Phe Val Val Asn Asp Gly Thr Arg Tyr
130 135 140
Gln Met Cys Val Met Lys Leu Glu Ser Trp Ala His Val Phe Arg Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Val Ser Phe Gln Val Arg Leu Thr Phe Thr Glu Ala Asn Asn
165 170 175
Gln Thr Tyr Thr Phe Cys Thr His Pro Asn Leu Ile Val
180 185
<210> 6
<211> 111
<212> PRT
<213> Cytomegalovirus
<400> 6
Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Val Pro
1 5 10 15
His Tyr Trp Asp Ala Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr Arg Tyr
20 25 30
Lys Tyr Val Glu Gln Leu Val Asp Leu Thr Leu Asn Tyr His Tyr Asp
35 40 45
Ala Ser His Gly Leu Asp Asn Phe Asp Val Leu Lys Arg Ile Asn Val
50 55 60
Thr Glu Val Ser Leu Leu Ile Ser Asp Phe Arg Arg Gln Asn Arg Arg
65 70 75 80
Gly Gly Thr Asn Lys Arg Thr Thr Phe Asn Ala Ala Gly Ser Leu Ala
85 90 95
Pro His Ala Arg Ser Leu Glu Phe Ser Val Arg Leu Phe Ala Asn
100 105 110

Claims (26)

1.一种脂质体，所述脂质体包含皂苷、甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，或
一种脂质体组合，所述组合包含至少两种类型的脂质体，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂，
其中所述Toll样受体4(TLR4)激动剂具有式(I)：
-其中R1选自：
a)C(O)；
b)C(O)-(C1-C14烷基)-C(O)，其中所述C1-C14烷基任选地被羟基、C1-C5烷氧基、C1-C5亚烷基二氧基、(C1-C5烷基)氨基或(C1-C5烷基)芳基取代，其中所述(C1-C5烷基)芳基的所述芳基部分任选地被C1-C5烷氧基、(C1-C5烷基)氨基、(C1-C5烷氧基)氨基、(C1-C5烷基)-氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基(C1-C5烷氧基)、-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)OH或-O-(C1-C5烷基)氨基-C(O)-(C1-C5烷基)-C(O)-(C1-C5)烷基取代；
c)包含C2-C15直链或支链的烷基，任选地被羟基或烷氧基取代；和
d)-C(O)-(C6-C12亚芳基)-C(O)-，其中所述亚芳基任选地被羟基、卤素、硝基或氨基取代；
-a和b独立地为0、1、2、3或4；
-d、d’、d”、e、e’和e”独立地为0、1、2、3或4；
-X1、X2、Y1和Y2独立地选自空、氧、-NH-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-和-N(C1-C4烷基)-；
-W1和W2独立地选自羰基、亚甲基、砜和亚砜；
-R2和R5独立地选自：
a)C2至C20直链或支链烷基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
b)C2至C20直链或支链烯基或二烯基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
c)C2至C20直链或支链烷氧基，其任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；
d)-NH-(C2至C20直链或支链烷基)，其中所述烷基任选地被氧代基、羟基或烷氧基取代；和
e)
其中Z选自O和NH，并且M和N独立地选自包含C2-C20直链或支链的烷基、烯基、烷氧基、酰氧基、烷基氨基和酰氨基；
-R3和R6独立地选自C2至C20直链或支链烷基或烯基，任选地被氧代基或氟取代；
-R4和R7独立地选自C(O)-(C2至C20直链或支链烷基或烯基)、C2至C20直链或支链烷基、C2至C20直链或支链烷氧基和C2至C20直链或支链烯基；其中所述烷基、烯基或烷氧基能够独立且任选地被羟基、氟或C1-C5烷氧基取代；
-G1、G2、G3和G4独立地选自氧、亚甲基、氨基、硫醇、-C(O)NH-、-NHC(O)-和-N(C(O)(C1-C4烷基))-；
或G2R4或G4R7能够一起是氢原子或羟基；
或该化合物的药学上可接受的盐；
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为约1:1至约1:50或约1:25至约1:35，或TLR4激动剂:皂苷的重量比为约1:10存在。
2.根据权利要求1所述的脂质体或脂质体组合，其中所述TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/ml，在25℃下测量。
3.根据权利要求1或2所述的脂质体或脂质体组合，其中所述TLR4激动剂具有式(II)：
特别地所述TLR4激动剂是式(III)的E6020：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的脂质体或脂质体组合，其中所述皂苷是皂树(Quillaja saponaria)皂苷，特别地是从石碱木(Quillaja Saponaria Molina)树皮中提取的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的脂质体或脂质体组合，其中所述皂苷选自QS-7、QS-17、QS-18、QS-21及其组合，优选地所述皂苷是QS-7或QS-21。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的脂质体或脂质体组合，其中所述甾醇选自胆固醇或其衍生物、麦角甾醇、链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)、豆甾醇(豆甾-5,22-二烯-3-醇)、羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)、7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)、二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)、酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)、7-烯胆烷醇(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)、薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、谷甾烷醇、菜油甾醇(菜油甾-5-烯-3β-醇)、菜油甾烷醇(5a-菜油甾烷-3b-醇)、24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-亚甲基-3β-醇)、胆甾醇基十七酸酯(胆甾-5-烯-3β-基十七酸酯)、胆甾醇基油酸酯、胆甾醇基硬脂酸酯及其混合物，特别地所述甾醇选自胆固醇或其衍生物，特别地所述甾醇是胆固醇。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的脂质体或脂质体组合，其中所述皂苷和所述甾醇以皂苷:甾醇的重量:重量比的范围为1:100至1:1、范围为1:50至1:2或范围为1:10至1:5，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:2，或皂苷:甾醇的重量:重量比为约1:5存在。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的脂质体或脂质体组合，其中所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及其混合物，特别地所述磷脂是选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DMPC(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、SOPC(1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)及其混合物的磷脂酰胆碱。
9.一种用于制造脂质体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(a)在有机水混溶性溶剂中溶解式(I)的TLR4激动剂、甾醇和磷脂，所述TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/ml，在25℃下测量，
(b)将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体，
其中在步骤(a)时、步骤(b)时或步骤b)之后添加皂苷，并且
其中所述TLR4激动剂和所述皂苷以TLR4激动剂:皂苷的重量:重量比的范围为约1:1至约1:400、范围为约1:2至约1:200、范围为约1:2.5至约1:100、范围为约1:3至约1:40或范围为约1:5至约1:25存在。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括在步骤(a)之前选择式(I)的TLR4激动剂的步骤，所述TLR4激动剂在乙醇中的溶解度参数为至少约0.2mg/ml，在25℃下测量。
11.根据权利要求9或10中任一项所述的方法，其中将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体的步骤(b)通过使用溶剂注入法进行。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中将步骤(a)获得的混合物加工成脂质体的步骤(b)包括以下步骤：
(b1)将步骤(a)获得的溶液注入和/或稀释到水性缓冲液中，以及
(b2)除去所述有机水混溶性溶剂。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述有机水混溶性溶剂选自乙醇、异丙醇或其混合物，或者是乙醇。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤(c)：过滤在步骤(b)中获得的脂质体并回收平均直径小于200nm的脂质体。
15.一种佐剂组合物，所述佐剂组合物包含至少根据权利要求1至8中任一项所述的一种脂质体或一种脂质体组合或至少一种按照根据权利要求9至14中任一项所述的方法获得的脂质体。
16.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少根据权利要求1至8中任一项所述的一种脂质体或一种脂质体组合、或至少一种按照根据权利要求9至14中任一项所述的方法获得的脂质体、或根据权利要求15所述的佐剂组合物、以及至少一种抗原。
17.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物至少包含：
-一种CMV gB抗原；
-一种CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原；和
-一种佐剂，其包含至少一种包含皂苷、甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂的脂质体，或至少一种包含至少两种类型的脂质体的脂质体组合，其中第一类型的脂质体包含皂苷、甾醇和磷脂，并且第二类型的脂质体包含甾醇、磷脂和Toll样受体4(TLR4)激动剂。
18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物，其中所述CMV gB抗原选自全长CMV gB抗原、缺失跨膜结构域的至少一部分的截短的CMV gB抗原、基本上缺失所有跨膜结构域的截短的CMV gB抗原、缺失细胞内结构域的至少一部分的截短的CMV gB抗原、基本上缺失所有细胞内结构域的截短的CMV gB抗原以及基本上缺失跨膜结构域和细胞内结构域两者的截短的CMV gB抗原，特别地所述CMV gB抗原是gBdTM。
19.根据权利要求17或18所述的免疫原性组合物，其中所述gH缺失了跨膜结构域的至少一部分或基本上所有跨膜结构域，或者其中所述gH包含由UL75基因编码的全长gH多肽的胞外域。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述CMV gB抗原和所述CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合抗原是唯一的CMV抗原。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR4激动剂是根据权利要求1至3中任一项的。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷是根据权利要求4或5的。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述甾醇是根据权利要求6或7的。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述磷脂是根据权利要求8的。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的免疫原性组合物，用作CMV疫苗。
26.根据权利要求1至8中任一项所述的脂质体或脂质体组合、按照根据权利要求9至14中任一项所述的方法获得的脂质体、根据权利要求15所述的佐剂组合物、根据权利要求16所述的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗感染性疾病、过敏、自身免疫性疾病、罕见血液病、罕见代谢疾病、罕见神经系统疾病以及肿瘤或癌症疾病。
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