CN108367062B - 抗金黄色葡萄球菌的免疫原性组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中所述糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的核糖醇残基均在4位被N‑乙酰基D‑葡糖胺基残基取代，并且其中所述N‑乙酰基D‑葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，并且其中所述载体蛋白质向缀合物提供至少一个被T辅助淋巴细胞识别的表位。
Description
发明领域
本发明涉及诱导针对金黄色葡萄球菌菌株的交叉反应性抗体应答的免疫原性组合物、制备此类组合物的方法和使用方法。
发明背景
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,或S.aureus)是一种机会性细菌病原体，可能引起人类各种疾病，从中度到重度皮肤和软组织感染到非常严重的疾病，如败血性休克、中毒性休克综合征或肺炎。这些感染中的一些可能是致命的，特别是与医院相关的感染，其常常因为许多医院菌株对诸如甲氧西林的抗生素具有抗性而变得复杂。目前正在开发通过使用治疗性抗体进行被动免疫或通过疫苗接种进行主动免疫来预防和/或治疗金黄色葡萄球菌感染的不同策略。金黄色葡萄球菌的毒力因子是有效的疫苗靶标。然而，仅靶向一种毒力因子的单价疫苗很可能不足以预防金黄色葡萄球菌感染，因为细菌已经发展出不同的策略来逃避宿主免疫系统。另一种策略是金黄色葡萄球菌菌株之间或甚至是在细菌生命期间的抗原变异性。例如，作为众所周知的毒力因子的金黄色葡萄球菌的荚膜多糖在菌株之间易发生变化。5型金黄色葡萄球菌菌株表达由具有以下结构的重复单元组成的5型荚膜多糖：→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)(1→3)-β-D-FucNAc-(1→，而8型金黄色葡萄球菌菌株表达由具有以下结构的重复单元组成的8型荚膜多糖：→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc-(1→。5型和8型菌株约占所有临床分离株的88％。不表达5型或8型荚膜多糖的其余分离株被描述为携带被称为336抗原的抗原。如WO 2007/053176中所述的336抗原是包含1,5-核糖醇磷酸酯重复单元的磷壁酸样结构，其中核糖醇的3位被N-乙酰基-β-D-葡糖胺基残基取代。包含与载体蛋白质缀合的5型和8型荚膜多糖的二价疫苗(staphVAX)在III期临床试验中失败后，正在开发第二代staphVAX疫苗，其除了金黄色葡萄球菌5型和8型抗原外还包含336抗原，并且预期其提供比先前疫苗更好的临床分离株覆盖率。staphVAX疫苗的这种演化反映了目前的金黄色葡萄球菌疫苗开发策略，其在疫苗组合物中包含越来越多的抗原以克服免疫逃避机制和金黄色葡萄球菌菌株之间的抗原变异性。尽管如此，仍需要尽可能地使在疫苗组合物中包含的抗原的数目合理化，以限制与开发和生产多价疫苗相关的成本。诱导识别在金黄色葡萄球菌菌株中广泛表达的同源和异源两种抗原结构的交叉反应性抗体的抗原的鉴定，可能是减少抗金黄色葡萄球菌的疫苗中要组合的抗原数目的有效方式。就此而言，WO 2007/057176描述了引发交叉反应性抗体的336抗原的缀合物形式，所述交叉反应性抗体结合同源336抗原和来自表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，或S.epidermidis)的异源PS1多糖。尽管这种缀合物引发物种间交叉反应性抗体(因为抗体识别由表皮葡萄球菌表达的异源抗原结构)，但没有明确证据表明所述抗体识别由金黄色葡萄球菌菌株表达的异源抗原结构。
EP 2848257提出了一种用于预防金黄色葡萄球菌感染的疫苗组合物，其包含含有经N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)修饰的核糖醇磷酸酯的天然形式的WTA，其包含以下活性成分：
(i)仅经β-构型的GlcNAc而不是经α-构型的GlcNAc修饰的核糖醇-磷酸酯；
(ii)仅经β-构型的GlcNAc而不是经α-构型的GlcNAc修饰的核糖醇-磷酸酯的重复单元；或
(iii)含有仅经β-构型的GlcNAc而不是经α-构型的GlcNAc修饰的核糖-磷酸酯的重复单元的壁磷壁酸(WTA)。
在本专利申请的图3提供的图示中，GlcNAc位于核糖醇-磷酸酯单元的2位。为了改善其抗原性，可加入载体或佐剂。
WO 2006/065,553公开了包含治疗有效量的与载体蛋白质缀合的金黄色葡萄球菌的荚膜多糖的糖缀合物疫苗，其中所述多糖包含一定量的肽聚糖(例如，至少约5％(w/w))，其例如通过提高多糖与载体蛋白质的缀合效率或通过增强的疫苗免疫原性而有效地增强疫苗的性质。
本发明人现已鉴定出引发识别由金黄色葡萄球菌菌株表达的异源抗原结构的交叉反应性抗体的新抗原结构，使得由此类抗原结构诱导的抗体识别广泛的金黄色葡萄球菌菌株组。因此，这些新的抗原结构代表可用的候选疫苗，因为它们有助于减少要并入到金黄色葡萄球菌疫苗中的抗原的数目。
发明概述
因此，本发明的主题是：
一种与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中所述糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的核糖醇残基在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β。
在另一个实施方案中，本发明的主题是一种与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中所述糖由1,5核糖醇磷酸酯的重复单元组成，其中所有的核糖醇残基都在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基取代，其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β。
在第一方面，本发明的糖是从金黄色葡萄球菌的细胞壁提取的。
在另一方面，糖是通过化学合成获得的。
通常，糖的所有重复单元具有以下结构或其盐：
其中：
R独立地是H或D-Ala，并且其中各重复单元R可以彼此不同，并且
N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型α。
优选地，糖的所有重复单元具有以下结构或其盐：
其中：
R独立地是H或D-Ala，并且其中各重复单元R可以彼此不同，并且
N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型β。
在一个优选的实施方案中，糖的重复单元的R基团是H。
在另一方面，重复单元的数目≥4，优选为4至14，更优选等于6、7、8、9、10、11或12。
通常，本发明的糖经由接头与载体蛋白质共价结合。
在一个具体方面，载体蛋白质连接至本发明的糖的末端磷酸酯，优选地经由接头连接。
在一个优选的方面，本发明的缀合物具有以下结构或这些结构之一的盐：
其中：
N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β；
n为≥4的整数，n优选为4至14，更优选地，n为6、7、8、9、10、11或12；并且
L是接头。
在又一个方面，缀合物具有以下结构或这些结构之一的盐：
其中：
N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β；
n为≥4的整数，n优选为4至14，更优选地，n为6、7、8、9、10、11或12。
在一个优选的方面，本发明的缀合物包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的核糖醇残基在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。
在一个优选的实施方案中，本发明的缀合物包含小于5％w/w的肽聚糖。有利地，本发明的缀合物包含小于4％w/w、小于3％w/、小于2％w/w、小于1％或0％w/w的肽聚糖。最优选地，本发明的缀合物不包含任何肽聚糖(即0％w/w)。
在又一个实施方案中，本发明的缀合物的载体蛋白质是脱毒的细菌毒素。
在又一方面，脱毒的细菌毒素是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外蛋白A(Exoprotein A)。优选地，所述外蛋白A是重组的外蛋白A(rEPA)。
在一个进一步优选的方面，脱毒的细菌毒素是金黄色葡萄球菌的α溶血素(Hla)。
在另一个实施方案中，糖和载体蛋白质之间的重量比为0.1至10。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及包含本发明的缀合物和佐剂的组合物。
通常，佐剂是TLR4激动剂。
更特别地，佐剂是TLR4激动剂与递送体系如水包油乳剂或铝盐的组合。
更具体地说，TLR4激动剂是E6020(CAS编号：287180-63-6)。
在另一方面，佐剂是Th1、Th17或Th1/Th17佐剂。
在另一方面，本发明的缀合物诱导抗体的产生，所述抗体结合以ATCC(美国典型培养物保藏中心)编号55804保藏的金黄色葡萄球菌336型菌株、以ATCC编号10832保藏的金黄色葡萄球菌Wood 46菌株和以ATCC编号25904保藏的Newman D2C菌株。
另一方面，本发明的主题涉及一种用于制备包含接头的本发明的缀合物的方法，所述方法包括：
a)提供包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成的糖，其中所有的核糖醇残基在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，
b)提供载体蛋白质，
c)用连接剂衍生化所述糖并将衍生化的糖与所述载体蛋白质偶联，或者可选地，用连接剂衍生化所述载体蛋白质并将衍生化的载体蛋白质与所述糖偶联以获得缀合物。
在一个具体方面，当本发明的糖是从金黄色葡萄球菌的细胞壁提取时，用于衍生化糖的连接剂可以是二酰肼，如己二酸二酰肼。可选地，当本发明的糖是通过化学合成获得时，可以使用二元活化的(di-activated)二酯如二琥珀酰亚胺琥珀酸酯来衍生化糖随后用肼处理。
步骤a)和b)可以分别包括制备糖或载体。
在另一个实施方案中，一种用于制备包含接头的本发明的缀合物的方法包括：
a)提供包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成的糖，其中所有的核糖醇残基都在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，
b)提供载体蛋白质，
c)用第一连接剂衍生化所述糖，
d)用第二连接剂衍生化所述载体蛋白质，以及
e)将所述衍生化的糖与所述衍生化的载体蛋白质偶联以获得缀合物。
步骤a)和b)可以分别包括制备糖或载体。
在一个具体方面，用于衍生化糖的连接剂是胱胺，用于衍生化载体蛋白质的连接剂是γ-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)或琥珀酰亚胺基-3(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
在这些方法的一个优选实施方案中，糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成，其中所有的核糖醇残基在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。有利地，载体蛋白质连接至本发明的糖的末端磷酸酯，优选经由接头连接。
在又一方面，本发明的方法还包括将佐剂加入到缀合物以形成组合物。
在又一个实施方案中，本发明的主题涉及一种包含本发明的缀合物的免疫原性组合物，用于具有金黄色葡萄球菌感染风险的个体，其中所述组合物在所述个体中诱导产生抗金黄色葡萄球菌菌株的交叉反应性抗体。
在第一方面，交叉反应性抗体结合金黄色葡萄球菌336型菌株，如以ATCC编号55804保藏的金黄色葡萄球菌336型菌株。
在另一方面，交叉反应性抗体还结合以ATCC编号10832保藏的金黄色葡萄球菌的Wood 46菌株和以ATCC编号25904保藏的金黄色葡萄球菌的Newman D2C菌株。
最后，本发明的主题涉及一种在具有金黄色葡萄球菌感染风险的个体中诱导抗金黄色葡萄球菌菌株的交叉反应性抗体的方法，其包括向所述个体施用包含本发明的缀合物的免疫原性组合物。
定义
在本发明的上下文中，下面引用的术语具有以下含义：
词语“包含”可以具有“包括”、“含有”或“由......组成”的含义。另一方面，“由......组成”意为“仅由......组成”并且排除加入未列出的组分。
本发明含义中的“糖”包括多糖和寡糖，并且是指含有多于一个糖亚单元的分子。特别地，本发明缀合物中使用的糖包含本说明书通篇所定义的几种核糖醇磷酸酯重复单元或由其组成。通常当重复单元的数目≤11时，该糖被认为是寡糖，当重复单元的数目为>11时，该糖被认为是多糖。
重复单元或缀合物的“盐形式”，是指缀合物的阴离子形式与一个或多个阳离子(例如Na+)的药学上可接受的盐。在pH接近于7的水性溶液中，大多数时间糖的磷酸酯基团将呈阴离子形式，与也将在水溶液中存在的阳离子形成盐。在一些情况下，糖的磷酸酯基团可以仅为酸性形式或仅为盐形式。在其他情况下，同一糖的一些磷酸酯基团可以为酸性形式，并且其他磷酸酯基团可以为盐形式。
在本发明的缀合物中，糖与包含至少一个被T辅助淋巴细胞识别的表位的蛋白质载体共价结合。T辅助淋巴细胞也被称为T辅助细胞。被T辅助淋巴细胞识别的表位被称为“T辅助表位”。特别地，“T辅助表位”通过在抗原呈递细胞(APC)表面上呈递表位与主要组织相容性复合体(MHC)II类分子一起来活化T辅助淋巴细胞。
糖单独的免疫原性较差。根据本发明，通过将糖缀合到免疫载体(即载体蛋白质)来改善对糖的免疫原性应答。据认为，单独的糖在以没有共价连接的载体蛋白质呈递时诱导T细胞非依赖性应答。T细胞非依赖性应答导致短暂的抗体应答，其特征在于以IgM为主的低亲和力抗体。载体蛋白质与糖的缀合为糖提供至少一个T细胞表位。这将T细胞非依赖性应答转化为T细胞依赖性应答。根据本发明，缀合物的载体蛋白质导致出现对本发明通篇所定义的糖具有特异性的T淋巴细胞依赖性免疫性，产生结合(或识别)该糖的抗体。有利地，它在加强免疫后也诱导针对糖的更强且更快的第二抗体应答(增强效应)。特别地，在对糖具有特异性的B细胞摄取缀合物后，T细胞表位与一种或多种MHC(并且特别是MHC II类)一起显示在B细胞的表面上，用于与T辅助细胞相互作用。因此，分泌抗糖的抗体的B细胞以T细胞依赖性方式扩增。
本发明含义中的“载体蛋白质”包含氨基酸链，无论其大小和翻译后修饰如何。载体蛋白质可以是肽(对应于至多100个氨基酸的氨基酸链)，但优选其是蛋白质(包含超过100个氨基酸的氨基酸链)。特别地，载体蛋白质包含至少一条为T辅助表位的氨基酸链。T-辅助表位的大小至少为10-15个氨基酸。蛋白质载体可以含有多个T细胞表位。
本发明含义中的“缀合物”是指通过共价键连接的糖和肽或蛋白质的组合。术语“缀合物”包括半合成和/或合成化合物，但优选地不包括在自然界中存在的化合物，无论它们是通过合成或半合成途径形成还是天然形成的。缀合物是糖与蛋白质缀合的结果，一般经由接头。在本发明的上下文中，至少缀合过程(即确保糖与载体蛋白质之间的连接的步骤)通过化学合成来进行。在本发明的上下文中，当糖和/或载体蛋白质是天然来源并且仅缀合过程是通过化学合成进行因此形成在自然界中找不到的化合物时，缀合物被认为是半合成化合物。当糖和载体蛋白质是通过化学合成产生的并且缀合过程也是通过化学合成进行时，缀合物是合成化合物。为了清楚起见，作为自然物的缀合物被排除在本发明的范围之外。例如，由与肽聚糖(PG)(在一定程度上PG可被认为是载体蛋白质)连接的磷壁酸(TA)组成的壁磷壁酸(WTA)是革兰氏阳性细菌细胞壁的天然组分，特别是金黄色葡萄球菌的WTA，并且被排除在本发明的领域之外，因为它们不包括T辅助表位。
术语“接头”是指在完整缀合物中位于糖和载体蛋白质之间的额外化学结构，其产生于糖与载体蛋白质的间接连接并且涉及一种或多种具有两种反应性官能基团的连接剂。
如本文所用，“佐剂”是指调节抗原的免疫原性的试剂或物质。“调节免疫原性”包括增强由抗原产生的免疫应答的量级和/或持续时间。术语“反应性官能基团”包含本领域中使用的“活性部分”、“活化基团”、“反应性部位”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”，并且在本文中是指分子的独特的、可限定的部分或单元。这些术语在化学领域中多少是同义的，并且在本文中用于表示分子的与其他分子反应的部分。术语“活性”当与官能团一起使用时，旨在包括容易与亲电或亲核基团反应的那些官能团。例如，如本领域所理解的那样，术语“活性或活化酯”将包括容易与亲核基团(如胺)反应的那些酯。
“交叉反应性抗体”表示与最初生成它们的抗原结构(所述抗原结构被称为同源抗原结构或同源抗原)结合，而且还与在结构上不同于同源抗原结构的一种或几种其他抗原结构(所述抗原结构被称为异源抗原结构或异源抗原)结合的抗体。引申开来，表达同源抗原结构的金黄色葡萄球菌菌株被称为“同源菌株”，而表达异源抗原结构的金黄色葡萄球菌菌株被称为“异源菌株”。
术语“个体”是指人或动物，所述动物选自犬科物种、猫科物种、牛科物种、猪科物种、马科物种、绵羊物种以及鼬科物种和禽鸟物种。
附图简要说明
图1是来自菌株ATCC 55804的纯化的β(1,3)TA在293K下在D2O中得到的500MHz 1HNMR谱。
图2是来自菌株Newman D2C的纯化的α(1,4)TA在293K下在D2O中得到的500MHz 1HNMR谱。
图3是来自菌株Wood 46的纯化的β(1,4)TA在293K下在D2O中得到的500MHz 1H NMR谱。
图4表示在AF04佐剂的存在或不存在下，用未缀合的β(1,3)糖(合成的九聚体或天然TA)或用缀合的β(1,3)糖[合成的β(1,3)九聚体缀合物或β(1,3)TA缀合物]免疫一次(D21)、两次(D35)或三次(D42)后，针对纯化的β(1,3)TA(336Ag)的特异性IgG1和IgG2a滴度的演变。
图5表示在AF04佐剂的存在下，用未缀合的α(1,4)TA[TA α(1,4)+rEPA]、未缀合的β(1,4)TA[TA β(1,4)+rEPA]、合成的α(1,4)八聚体缀合物[八α(1,4)-rEPA]、α(1,4)TA缀合物[TA α(1,4)-rEPA]、合成的β(1,4)八聚体缀合物[八β(1,4)-rEPA]或用β(1,4)TA缀合物[TA β(1,4)-rEPA]免疫3次(D42)后，针对同源TA的特异性IgG滴度。
图6是用合成的α(1,4)八聚体缀合物[抗α(1,4)]或合成的β(1,4)八聚体缀合物[抗β(1,4)]或用合成的β(1,3)九聚体缀合物[抗β(1,3)]免疫后，小鼠的免疫血清对一些金黄色葡萄球菌菌株的识别图。
发明详述
本发明人惊讶地发现，与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物诱导交叉反应性抗体，其中所述糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的核糖醇残基已在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，所述交叉反应性抗体识别广泛的金黄色葡萄球菌菌株组，显示菌株之间的抗原性变异的证据。为此，对来自在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中过夜培养过夜的一组20个金黄色葡萄球菌菌株的壁磷壁酸(WTA)的核糖醇磷酸酯重复单元的结构进行分析。金黄色葡萄球菌的WTA由与肽聚糖共价连接的磷壁酸部分组成。金黄色葡萄球菌的磷壁酸部分(TA)的化学结构在Int.J.Med.Microbiol 300(2010),148-154；和Nature ReviewsMicrobiology,6(2008),276-286中有报道，认为其由二糖连接单元和由11-40个核糖醇-磷酸酯重复单元组成的主链聚合物构成，其中核糖醇磷酸酯重复单元上的羟基已用阳离子D-丙氨酸酯和N-乙酰葡糖胺基残基修饰。二糖连接单元由N-乙酰甘露糖胺β(1-3)-N-乙酰葡糖胺1-磷酸酯与两个连接至N-乙酰甘露糖胺的C4羟基的甘油3-磷酸酯单元组成。
在本研究中，通过在用氟化氢处理后使用具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)进行碳谱分型(carbotyping)，对20株菌株中的每一株测定N-乙酰葡糖胺与核糖醇磷酸酯重复单元的核糖醇残基的连接的确切性质(参见“实施例”部分中的段落I)。同时，还使用对金黄色葡萄球菌的5型或8型荚膜多糖具有特异性的多克隆血清，通过流式细胞术测量每株菌株的荚膜多糖表达。
菌株分型结果在下表中示出。
这些结果清楚地表明TA的重复单元的结构在金黄色葡萄球菌菌株之间是高度异质的。
如该表中所示，存在菌株(被称为“100％α(1-4)菌株”)，其中1,5核糖醇磷酸酯重复单元的核糖醇残基在4位被全都为α端基异构体构型的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代。还存在菌株(被称为“100％β(1-4)菌株”)，其中1,5核糖醇磷酸酯重复单元的核糖醇基团在4位上被全都为β端基异构体构型的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代。还存在菌株(被称为“混合α(1-4)和β(1-4)菌株”)，其中1,5核糖醇磷酸酯重复单元的一部分核糖醇残基在4位被为一种特定端基异构体构型(α或β)的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，而其余部分的核糖醇残基在4位被为另一种特定端基异构体构型(β或α)的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代。最后，存在菌株(被称为“100％β(1-3)菌株”)，其中1,5核糖醇磷酸酯重复单元的核糖醇残基在3位被全都为β端基异构体构型的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代。
对应于WO 2007/053176中所述的336缀合物的多糖和载体蛋白质的缀合物(其中多糖由在3位被β端基异构体构型的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代的1,5核糖醇磷酸酯重复单元组成)诱导几乎仅识别表达同源抗原结构的“100％β(1-3)菌株”的抗体。相比之下，糖-载体蛋白质缀合物(其中糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的核糖醇残基在4位被为端基异构体构型β的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代)诱导识别同源“100％β(1-4)菌株”以及表达异源抗原结构的“混合α(1-4)和β-4)菌株”、“100％α(1-4)菌株”和“100％β(1-3)菌株”的抗体。类似地，糖-载体蛋白质缀合物(其中糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的核糖醇残基在4位被端基异构体构型α的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代)诱导识别同源“100％α(1-4)菌株”以及表达异源抗原结构的“混合α(1-4)和β(1-4)菌株”、“100％β(1-4)菌株”和“100％β(1-3)菌株”的抗体(参见实施例部分的段落VII)。
因此，为了使要包含在抗金黄色葡萄球菌疫苗中的抗原组分的数目合理化，与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物(其中所述糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成，其中所有的核糖醇残基在4位被仅为端基异构体构型β或仅为端基异构体构型α的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代)是特别合适的，因为它诱导识别广泛的金黄色葡萄球菌菌株的交叉反应性抗体，然而与预期相反，载体蛋白质和多糖的缀合物(其中所述多糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中核糖醇残基的3位被为端基异构体构型β的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代)则不能。
糖的制备和特征
用于制备本发明的缀合物的糖可以从可获得的“100％α(1-4)菌株”或“100％β(1-4)菌株”的壁磷壁酸(WTA)提取和纯化，例如所述菌株获自细胞保藏中心。“100％α(1-4)菌株”的一个实例是保藏编号为ATCC 25904的Newman D2C菌株。“100％β(1-4)”菌株的一个实例是保藏编号为ATCC10832的Wood 46菌株。
发酵后，杀死细胞，然后通过离心收获。然后通过用溶葡萄球菌素进行酶处理、诸如benzonase的核酸酶处理、链霉蛋白酶处理，然后用25-75％冷乙醇/CaCl2常规连续沉淀，从细胞团中提取糖。75％乙醇沉淀物含有粗糖提取物，其随后通过众所周知的分离方法如尺寸排阻色谱法或离子交换色谱法进行纯化。然后对含有如本发明定义的糖的级分进行透析和冻干。
在纯化过程结束时获得的糖一般包含多于1,5核糖醇磷酸酯的15个重复单元，其中所有的核糖醇残基在4位都被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基根据所使用的原始菌株的特征全都为端基异构体构型α或全都为端基异构体构型β。核糖醇基团的2位也可以随机地被D-丙氨酸(D-Ala)取代，但优选地，核糖醇残基在2位不被任何化学残基取代。通常，糖是多糖，因为多糖链中重复单元的数目为20至40个重复单元。如果需要，可通过温和的碱或酸处理或氧化还原解聚反应，减少重复单元的数目。1,5核糖醇磷酸酯的重复单元(其中所有的核糖醇残基在4位都被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代)全都为端基异构体构型α或全都为端基异构体构型β，并且一般共价连接于两个甘油磷酸酯残基，这两个甘油磷酸酯残基本身经由N-乙酰甘露糖胺残基的C4羟基连接于N-乙酰甘露糖胺-(β1,3)-N-乙酰葡糖胺1-磷酸酯二糖，如在金黄色葡萄球菌的磷壁酸结构中所描绘的。最后，从“100％α(1-4)菌株”或“100％β(1-4)菌株”提取并纯化的天然糖的完整化学结构一般等同于纯化该糖的菌株的相应磷壁酸(TA)结构。因此，通过与载体蛋白质缀合获得的缀合物的糖部分包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的核糖醇残基在4位被仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代。
有利地，以另一种方式，用于制备本发明的缀合物的糖通过化学合成以可重现的方式获得。在化学过程结束时获得的合成糖由1,5核糖醇磷酸酯的重复单元组成，其中所有的核糖醇残基在4位都被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，该N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β。这种合成糖的化学结构是如下或这些结构之一的盐：
其中：
N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为构型α或仅为构型β；
n为至少4；且
R1为H、烷基胺或烷基酰肼。
在该过程结束时获得的合成糖可以是寡糖或多糖。有利地，其含有至少4个1,5核糖醇磷酸酯单元，但更优选地，其含有5、6、7、8、9、10或11个1,5核糖醇磷酸酯单元。然而，如果需要，合成糖可含有超过15个本发明的重复单元。通常，在合成过程结束时获得的合成糖由6至12个核糖醇磷酸酯重复单元组成。
合成过程包括制备所需合成糖的完全受保护的等同物的步骤。完全受保护的等同物的合成是根据本领域技术人员众所周知的方法以及使用合成寡糖[例如G.J.Boons,Tetrahedron(1996),52,1095-1121或K.Toshima and K.Tatsuta,Chem.Rev.(1993),93,1503-1531]、核糖醇磷酸酯寡聚物[A.Fekete et al,Carbohydrate Research(2006),341,2037–2048]和核酸寡聚物[Y.Hayakawa et al.,J.Am.Chem.Soc.(2001),123(34),8165-8176]的方法来进行。例如在实施例1的步骤1.11中所述，在氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺的存在下，将寡糖供体与寡糖受体偶联以在两个寡糖之间引入受保护的磷酸酯基团。所得到的受保护的糖的大小等于两种反应性物质的大小的总和。重复该偶联步骤直到受保护的糖的重复单元的数目对应于所需的合成糖中重复单元的数目。然后进行几个去保护步骤以获得所需的合成糖。
当所需的合成糖具有式(I)，并且其中R1是烷基胺或烷基酰肼时，该产物可以从具有例如下式的所需糖的完全受保护的等同物获得：
其中
R'仅为
或仅为
MP为对甲氧基苯基；
N为至少4；
Bn为苄基；且
Z为苄氧基-羰基，
然后
1)消除对甲氧基苯基基团，
2)消除氰基乙基基团，
3)通过还原性乙酰化将叠氮化物转化成乙酰氨基，
4)氢解苄醚和苄氧基羰基基团，以及任选地，
5)当R1是烷基酰肼时，用二琥珀酰亚胺琥珀酸酯处理步骤4)结束时获得的糖，然后用肼处理以引入酰肼基团。
可选地，可在步骤2)之前进行步骤3)。
实施例1至3详述了制备具有8或9个重复单元的寡糖的化学步骤，其中受保护的N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β。根据这些实施例，可容易地获得具有不同数目的重复单元的其他受保护的寡糖。
当所需的合成糖具有式(II)时，采用与式(I)的合成糖描述的合同路线类似的合成路线。
相对于从金黄色葡萄球菌菌株中提取和纯化的那些糖相比，这些合成糖具有许多优点，尤其是产品的同质性，避免了微生物污染和/或分析问题。此外并且更重要地，我们已经能够证明，作为这些合成糖的唯一的抗原结构的1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中的核糖醇残基在4位被仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，代表了诱导形成如本发明所述的交叉反应性抗体应答所必需且有效的抗原结构。而且，合成糖中缺少任何其他另外的抗原结构(如从金黄色葡萄球菌菌株提取和纯化的糖可能出现的情况)，消除了与此类另外的抗原结构相关的可能的不良副作用，或者因分散免疫应答而减弱了交叉反应性抗体应答。例如，本发明的缀合物优选地包含小于5％w/w的肽聚糖。有利地，本发明的缀合物包含小于4％w/w、小于3％w/w、小于2％w/w、小于1％或0％w/w的肽聚糖。最优选地，本发明的缀合物不包含任何肽聚糖(即0％w/w)。
多糖样品中的肽聚糖(PG)含量可以用通过如下进行的氨基酸分析(AAA)测定的某些氨基酸的w/w％表示。简单地说，将含1mg/mL纯化多糖的水样品用蒸气相盐酸水解。将重构的伯氨基酸和仲氨基酸转化为稳定的荧光衍生物，其在395运行时发出强荧光。通过反相HPLC分析重悬的蛋白质水解物。借助于外标和内标定量氨基酸。存在于多糖溶液中的氨基酸来自(1)PG(残基Ala、Glx、Gly和Lys)和(2)残余蛋白质(残基Arg、Asx、He、Leu、Met、Phe、Ser、Thr、Thy、Val、His和Pro)。两种氨基酸(Cys和Trp)未定量，因此未报告。使用以下等式将与PG和残余蛋白质相关的氨基酸的浓度报告为相对于多糖的质量百分比：
计算肽聚糖％(w/w)：
％肽聚糖＝[PG]/[CPS]x 100
[PG]mg/mL＝Gln/Glu+Gly+Ala+Lys
其中：
[PG]＝计算的样品中的肽聚糖浓度(mg/mL)
[CPS]＝已知的样品中的多糖浓度(mg/mL)
计算残余蛋白质％(w/w)：
％RP＝(肽)cps–[PG]/[CPS]x 100
Σ(氨基酸)＝(肽)cps，其中：
(肽)cps＝总肽浓度
[RP]＝计算的样品中的残余蛋白质浓度(mg/mL)
[CPS]＝已知的样品中的多糖浓度(mg/mL)
载体蛋白质的特征
如前所述的载体蛋白质可以是任何肽或蛋白质，只要其含有至少一个T辅助表位。Del guercio等人[Vaccine(1997),Vol 15/4,441-448]描述的PADRE(Pan DR T-辅助表位)肽是可用的载体肽的一个实例。可选地，人血清白蛋白(HSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)和病毒或细菌蛋白质也是可用的载体蛋白质。举例来说，可以提及的有通过化学脱毒获得的细菌类毒素，如破伤风类毒素或白喉类毒素，或者通过基因突变获得的类毒素，如白喉类毒素(diphtheria toxoid，CRM 197)、脱毒的肺炎链球菌(Streptococcus pneumominae)肺炎链球菌溶素(PlyD)、脱毒的百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)毒素、脱毒的铜绿假单胞菌外蛋白A或金黄色葡萄球菌外毒素A的无毒突变体。细菌的外膜蛋白，如脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)的OMP1和OMP2蛋白；大肠杆菌(Escherichia coli)的lambB、OmpC、OmpaA、OmpF和PhoE蛋白；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的CotC和CotD蛋白；细菌孔蛋白如脑膜炎奈瑟球菌B 1型孔蛋白和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)孔蛋白P40；脂蛋白如伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorfi)OspA、肺炎链球菌PspA、脑膜炎奈瑟球菌2型转铁蛋白结合蛋白(TBP2)、大肠杆菌TraT、肺炎链球菌粘附素A、结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白D以及上述蛋白质的任何片段(其含有至少一个T辅助表位)也是合适的载体蛋白质。
葡萄球菌蛋白质或其片段也是尤其合适的载体蛋白质，因为它们可以进一步有助于减少要并入金黄色葡萄球菌疫苗中的抗原数目。举例来说，可以提及的有葡萄球菌的胞外组分结合蛋白，如层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。也可使用葡萄球菌转运蛋白，如免疫显性ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+转运蛋白、SiTC和Ni ABC转运蛋白。脱毒的葡萄球菌毒素如α毒素、溶血素、panton-valentine杀白细胞素、肠毒素B和TSST-1或其衍生物以及调节毒素产生的葡萄球菌蛋白质如RNA III活化蛋白(RAP)也是合适的载体蛋白质。
优选地，本发明的缀合物的载体蛋白质是脱毒的细菌毒素或其衍生物，其引起产生针对本发明所定义的糖具有特异性的持续性T细胞依赖性免疫。更具体地说，脱毒的细菌毒素可选自由破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉梭菌(Clostridium diphtheriae)、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌分泌的毒素。除非缀合过程本身负责细菌毒素的脱毒，否则通常毒素在进行载体蛋白质和本发明的糖之间的缀合过程之前预先脱毒。细菌毒素的脱毒可通过化学处理和/或热处理(如破伤风毒素或白喉毒素通常的情况)或通过基因突变来实现。白喉毒素的基因突变体CRM197可用作化学脱毒的白喉毒素的替代物。
在一个优选的实施方案中，载体蛋白质是脱毒的绿脓假单胞菌外蛋白A或其片段。铜绿假单胞菌的外蛋白A的脱毒形式可例如通过WO 88/02401中所述的使结合结构域I缺失而获得，或优选地通过缺失突变除去该蛋白553位处的谷氨酸来获得。通过例如由携带表达该突变体蛋白的质粒的大肠杆菌重组菌株产生的被命名为rEPA 553D的重组突变体蛋白，由于ADP-核糖基化催化活性受到抑制而缺乏毒性，并且也可用作载体蛋白质。
在另一个优选的实施方案中，本发明的缀合物的载体蛋白质是脱毒的金黄色葡萄球菌α-溶血素(Hla)或其衍生物或片段。脱毒可通过化学处理来实现，但优选地通过在Hla的氨基酸序列中引入点突变来进行脱毒。优选地，脱毒的Hla包含位于氨基酸35(His)和/或氨基酸48(His)的点突变，其中组氨酸残基被亮氨酸(如Menzies and Kerodle(1996)；Infect.Immun.64；1839和Menzies and Kerodle(1994)；Infect.Immun.62(5)；1843-7中所述)或其他氨基酸如精氨酸、赖氨酸、丙氨酸或谷氨酸置换。任选地，如WO 2007/145689中所述，这种脱毒的Hla也可以包含在氨基闭锁结构域中的缺失。在另一个可选方案中，可使用如US 8,632,783中所述的通过使茎状结构的一些或全部氨基酸缺失而脱毒的Hla的成熟或早熟形式的衍生物。已显示Hla的茎状结构的全部或部分缺失消除了毒素的溶血活性。在又一个实施方案中，包含Hla的氨基酸序列的N端部分的至少前50个氨基酸但不能组装成七聚体环结构的Hla片段也可用作载体蛋白质。还显示采用Hla毒素的前50个氨基酸的片段的主动免疫保护免受金黄色葡萄球菌介导的肺炎[Ragle et al.(2009)；Infect.Immun.77(7),2712]。
缀合物的制备和特征
如实施例部分的段落VI所示，本发明的糖，不论是合成的还是天然的(即从天然来源提取和纯化的)，必须与载体蛋白质偶联以诱导抗体应答。
本发明的缀合物由载体蛋白质和糖组成，所述糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的核糖醇残基在4位都被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β。特别地，所述糖包含至少4个相同的重复单元，其中所述重复单元具有以下结构(其可以为盐的形式)：
其中R独立地是H或D-Ala，并且各重复单元可以彼此不同，且
N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型α。
优选地，糖的重复单元的R基团全部都是H。
在一个优选的实施方案中，本发明的缀合物由载体蛋白质和包含至少4个相同重复单元的糖组成，其中所述重复单元具有以下结构(其可以为盐的形式)：
其中R独立地是H或D-Ala，并且各重复单元可彼此不同，且
N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型β。
优选地，糖的重复单元的R基团全部都是H。
确实，已令人惊讶地发现：当如实施例部分段落I所示将金黄色葡萄球菌菌株置于“体内”环境中时，磷壁酸的重复单元的结构可以在某种程度上朝“端基异构体构型β”进化。这被以下事实证实：当将100％的β(1-4)菌株置于“体内”环境中时，TA的结构没有变化，即重复单元的葡糖胺基残基仍保持为β(1-4)端基异构体构型。相比之下，当将“混合的α(1-4)和β(1-4)菌株”置于“体内”环境中时(例如通过施用于个体)，这有利于产生具有β(1-4)端基异构体构型的1,5核糖醇磷酸酯单元。
在一个更优选的实施方案中，本发明的缀合物由载体蛋白质和糖(由相同的重复单元组成)组成，其中重复单元的数目优选为4至14个，更优选为6、7、8、9、10、11或12个，并且重复单元具有以下结构(其可以是盐的形式)：
其中R是H，并且N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型α。
在一个还更优选的实施方案中，本发明的缀合物由载体蛋白质和糖(由相同的重复单元组成)组成，其中重复单元的数目优选为4至14个，更优选为6、7、8、9、10、11或12个，并且重复单元具有以下结构(其可以是盐的形式)：
其中R是氢原子，并且N-乙酰基D-葡糖胺基残基是端基异构体构型β。
如图5和图6所示，已令人惊讶地发现：由相同重复单元组成的合成糖的缀合物(其中N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β)诱导的交叉反应性抗体应答比N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α的类似缀合物更强。
本发明的缀合物可通过将糖直接共价连接至载体蛋白质来获得。可使用糖的反应性基团如磷酸酯基团和/或核糖醇或N-乙酰葡糖胺的的OH基团以及载体蛋白质上存在的反应性基团如羧基(例如经由天冬氨酸或谷氨酸)、氨基(例如经由赖氨酸)、巯基(例如经由半胱氨酸)、羟基(例如经由酪氨酸)、咪唑基(例如经由组氨酸)、胍基(例如经由精氨酸)和吲哚基(例如经由色氨酸)进行偶联。例如，当预期直接共价连接时，可使用溴化氰或1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)、1,1’-羰基二咪唑(CDI)或1,1’-羰基二-(1,2,4-三唑)(CDT)活化本发明的糖的OH基团。然后加入载体蛋白质并经由其氨基与活化的多糖反应。
优选地，糖和载体蛋白质之间的连接是经由糖的末端磷酸酯基团。
优选地，糖经由接头与载体蛋白质连接以最小化空间位阻效应，所述效应可降低针对糖的抗体应答水平和/或避免糖与载体蛋白质之间的随机偶联化学。接头的化学结构是在缀合过程中使用一种或几种连接剂的结果。连接剂一般用于：(i)获得衍生化的糖和/或衍生化的载体蛋白质；(ii)将新的反应性官能基团引入到衍生化的糖和/或衍生化的载体蛋白质中；和/或(iii)在糖和蛋白质之间引入间隔物。
当糖与载体蛋白质的偶联涉及使用一种连接剂时，用于制备本发明的缀合物的方法包括：
1)提供了包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成的糖，其中所有的核糖醇残基在4位都被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，
2)提供载体蛋白质，
3)用连接剂衍生化所述糖并将所述衍生化的糖与所述载体蛋白质偶联，或者可选地，用连接剂衍生化所述载体蛋白质并将衍生化的载体蛋白质与所述糖偶联以获得所述缀合物。
应当理解，可以分别包括制备糖或载体的步骤1和2可以以任何顺序进行，并且总体步骤必须进行以使得它们不改变糖的重复单元的化学结构。优选地，糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成，其中所有的核糖醇残基在4位都被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。
用于获得衍生化的糖的连接剂(L1)通常具有通式R’1-A-R’2，其中：
A表示脂族和/或芳族链，其可以是取代或未取代的、饱和或不饱和的；
R'1表示胺(特别是–NH2)或携带氮的化学基团，例如包含酰肼的基团，如–C(O)-NH-NH2；并且
R'2表示能够与载体蛋白质的反应性基团反应的基团，或者可选地，表示能够与第二连接剂(L2)上存在的官能团反应的反应性基团。
有利地，A表示烷基、烯烃基(包括至少一个双键的烷基)或二硫代烷基(包括–S-S-的烷基)，其包含1至12个碳，有利地2至8个碳，优选2至6个碳原子。优选地，式R’1-A-R’2的连接剂是烷基二酰肼，如己二酸二酰肼；单氨基硫代烷基如半胱氨酸或半胱胺，或二氨基二硫代烷基如胱胺；或二氨基烷基或二氨基烯烃基，如二氨基甲烷、二氨基乙烷或二氨基己烷。
可以用溴化氰或1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化糖，以形成氰酸酯，该酯与连接剂L1的R’1基团反应以获得衍生化的糖。
在另一个实施方案中，本发明的糖通过在含水介质中在温和的酸性条件下在交联剂L1的存在下用碳二亚胺例如EDAC[1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺]处理而活化。在此步骤期间，连接剂与糖的摩尔比为高于1，优选高于5。
然后使获得的衍生化的糖经由连接剂的R’2基团共价连接于载体蛋白质。通常，糖与载体蛋白质的重量/重量比为0.1至10，优选为0.25至8，更优选为0.25至6，并且还更优选为0.25至4。
在本发明的一个具体实施方案中，用于制备本发明的缀合物的方法包括：
1)从“100％的α(1-4)菌株”如Newman D2C菌株(ATCC 25904)或“100％的β(1-4)菌株”如Wood 46菌株(ATCC 10832)的WTA提取和纯化本发明的糖；
2)在作为连接剂的己二酸二酰肼存在下，通过碳二亚胺例如EDAC处理来衍生化所纯化的多糖，
3)在碳二亚胺例如EDAC存在下，将衍生化的糖与脱毒形式的铜绿假单胞菌的外蛋白A例如rEPA偶联，以获得缀合物。
有利地，缀合过程涉及两种连接剂，以更加特异性地靶向糖与载体蛋白质之间的偶联化学作用，阻止糖与载体蛋白质之间的随机偶联化学作用和/或增加糖与载体蛋白质之间的距离(即接头的大小)。两种连接剂用于分别衍生化本发明的糖和载体蛋白质。因此，一种用于制备本发明的缀合物的方法包括：
1)提供包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成的糖，其中所有的核糖醇残基在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，
2)提供载体蛋白质，
3)用第一连接剂衍生化所述糖，
4)用第二连接剂衍生化所述载体蛋白质，以及
5)将所述衍生化的糖与所述衍生化的载体蛋白质偶联以获得缀合物。
可以理解：(i)步骤1和2可以分别包括制备糖或载体，它们可以任何顺序进行；(ii)步骤3和4可以任何顺序进行；并且(iii)必须进行步骤1至5以使它们不改变糖的重复单元的化学结构。
考虑到第一连接剂(L1)用于衍生化糖，第二连接剂(L2)的选择由第一连接剂(L1)携带的反应性官能基团R’2和在载体蛋白质上所靶向的反应性官能基团决定。
L2连接剂通常是式R3-B-R4的化学化合物，其中：
B表示脂族和/或芳族链，其可以是取代或未取代的、饱和或不饱和的；
R3表示能够与L1携带的官能团R’2反应的反应性官能基团；并且
R4表示能够与载体蛋白质的官能团反应的反应性官能基团。
有利地，B表示烷基或烯烃基，其可以是取代的或未取代的，包含1至12个碳、优选2至8个碳原子；包含7至12个碳原子的芳基、烷基芳基或芳基烯烃基；苯基或亚苯基，其可以是取代或未取代的。
当R’2包含硫醇基团时，R3可以是硫醇基团；不饱和的α-或β-羰基或酰亚胺基团，特别是马来酰亚胺基团；酰基卤或烷基卤化物，其中卤素是溴、氯或碘。
有利地，R4能够与载体蛋白质的羧基、硫醇或胺基团反应。因此，如果缀合过程中靶向的载体蛋白质的官能团是硫醇，则R4可以是马来酰亚胺基团。类似地，如果缀合过程中靶向的载体蛋白质的官能团是胺，则R4可以是羧基或优选N-羟基琥珀酰亚胺基或N-羟基磺基琥珀酰亚胺基。
当L1连接剂是二氨基烷基或二酰肼时，第二连接剂L2有利地选自式R3-B-R4的二琥珀酰亚胺基烷基或琥珀酰亚胺基马来酰亚胺基烷基化合物，其中B是烷基，R3是琥珀酰亚胺基并且R4是琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基。二琥珀酰亚胺基可以是二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、己二酸的琥珀酰亚胺二酯(SIDEA)或琥珀酸的琥珀酰亚胺二酯。琥珀酰亚胺基和/或磺基琥珀酰亚胺基能够与胺基团反应。琥珀酰亚胺基马来酰亚胺基烷基化合物可以是上面提及的那些中的一种。
在一个优选的实施方案中，L1连接剂是氨基硫醇如半胱氨酸、半胱胺或胱胺，第二连接剂L2有利地是琥珀酰亚胺基马来酰亚胺基烷基。后者优选地选自γ-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)、γ-马来酰亚胺丁酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MCS)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)、马来酰亚胺苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、马来酰亚胺苯甲酸N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)。
在本发明的另一个优选的实施方案中，制备本发明的缀合物的方法包括：
1)从“100％α(1-4)金黄色葡萄球菌菌株”如Newman D2C菌株(ATCC 25904)或“100％β(1-4)金黄色葡萄球菌菌株”如Wood 46菌株(ATCC 10832)的WTA提取和纯化本发明的多糖；
2)在胱胺的存在下通过碳二亚胺如EDAC处理，来衍生化所纯化的多糖；
3)用还原剂如二硫苏糖醇裂解衍生化的多糖的二硫键；
4)通过用γ-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)或用琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)处理，来衍生化载体蛋白质；以及
5)将裂解和衍生化的多糖与衍生化的载体蛋白质偶联，以获得缀合物。
主要化学步骤总结在下面的方案中，其中TA-OP(O)O-OH表示糖，Prot表示载体蛋白质：
优选地，载体蛋白质是金黄色葡萄球菌的脱毒的α-溶血素(Hla)、其衍生物或片段。
为了防止载体蛋白质在糖上的多个锚定，其可以潜在地掩蔽缀合物携带的一个或多个可用的表位并且不利于缀合物诱导的免疫应答的特征，本发明涉及缀合物，其中载体蛋白质经由接头与如本发明中定义的糖的末端磷酸酯连接。更具体地，缀合物具有以下结构或其药学上可接受的盐：
其中：
N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β；
n为≥4，优选为6至12，优选为6、7、8、9、10、11或12；并且
L为接头。
优选地，所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。
因此，用于制备这种缀合物的方法包括：
1)制备具有以下化学结构的合成糖或其盐：
其中N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β；
n为至少4，优选6、7、8、9、10、11或12；并且
R1为H、烷基胺或烷基酰肼，优选烷基胺或烷基酰肼；
2)制备载体蛋白质；
3)任选地用第一连接剂衍生化所述糖；
4)任选地用第二连接剂衍生化所述载体蛋白质；以及
5)将所述糖或所述衍生化的糖与所述蛋白质或所述衍生化的蛋白质衍生化的糖偶联，以获得缀合物。
可以理解：(i)步骤1和2可按任何顺序进行；(ii)步骤3和4可按任何顺序进行；并且(iii)必须进行步骤1-5以使它们不改变糖的重复单元的化学结构。优选地，N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。
在一个具体的方面，缀合物具有以下结构或所述缀合物的药学上可接受的盐：
其中N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β；
n为至少4；n优选为4至14，更优选地，n为6、7、8、9、10、11或12；
并且载体蛋白质优选为脱毒的细菌毒素，如rEPA；金黄色葡萄球菌的脱毒的α-溶血素(Hla)；或其衍生物或片段。优选地，N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。
因此，制备这种缀合物的方法包括：
1)制备具有以下化学结构的合成糖或其盐：
其中N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β；并且
n为至少4；优选6、7、8、9、10、11或12，
2)制备载体蛋白质，如rEPA或Hla，
3)使用二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯作为连接剂衍生化所述糖，然后进行酰肼处理，以及
4)将所述衍生化的糖与载体蛋白质偶联，以获得缀合物。
优选地，所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。优选地，载体蛋白质是金黄色葡萄球菌的脱毒的α-溶血素(Hla)或其衍生物或片段。优选地，N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。
如实施例部分中段落VI的表所示，已发现合成的缀合物，尤其是当N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β，从而糖仅通过其末端磷酸酯经由接头连接到载体蛋白质时，诱导的交叉反应性抗体应答比由天然糖制备的相应的半合成缀合物更强。不受理论束缚，载体蛋白质与糖在末端磷酸酯处的独特锚定以及在合成糖中除如本发明中定义的重复单元之外缺少任何其他抗原结构，是可用于优化交叉反应性抗体应答的质量的手段。
在缀合过程结束时，无论使用何种方法，通常对获得的缀合物进行纯化以除去残留的未缀合的糖和蛋白质级分，例如通过硫酸铵沉淀、超滤、疏水性色谱法或尺寸排阻色谱法。当使用尺寸排阻色谱法时，根据本发明的糖的大小，可使用Sepharose 6B或Superdex75柱。
缀合物的配制
本发明的缀合物可与任何药学上可接受的媒介物一起配制在组合物中。在本发明的上下文中，表述“药学上可接受的媒介物”是指在生理学上可接受施用于哺乳动物以及特别是施用于人，同时还保持本发明的缀合物的生理学活性(即其诱导免疫应答的能力)的媒介物。一个示例性的药学上可接受的媒介物是生理盐水。其他生理学上可接受的媒介物是本领域技术人员已知的并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(18thedition),ed.A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,Pa中。
组合物的pH通常在6至8之间，更优选在6.5至7.5之间(例如约7)。通过使用缓冲剂(例如Tris缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或组氨酸缓冲剂)可以维持稳定的pH。因此，该组合物一般将包括缓冲剂。该组合物可以是无菌的和/或无热原的。就人而言，组合物可以是等渗的。
本发明的组合物将包含免疫有效量的缀合物。“免疫有效量”是当施用于受试者时有效引发针对该缀合物的抗体应答的量。该量可以根据待治疗的受试者的健康和身体状况、他们的年龄、受试者的免疫系统产生抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的配制、治疗医生对医疗情况的评估而变化。组合物中具体缀合物的“免疫原性有效量”一般是基于该缀合物缀合和未缀合的总多糖而确定的。一般而言，本发明的组合物的剂量将含有0.1至100μg的多糖。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的缀合物与增强抗体应答的佐剂一起配制在组合物中。合适的佐剂的实例包括主要充当递送体系的那些，如铝盐、磷酸钙、脂质体、病毒体(virosomes)、ISCOM、微米和纳米颗粒、乳剂和/或主要充当免疫增强剂的那些，如TLR激动剂。TLR激动剂被理解为意指天然TLR配体、TLR配体模拟物、合成或化学TLR配体、包括病原体相关分子模式的细胞或颗粒、微生物病原体、细菌、病毒和病毒样颗粒。在本发明的一个优选实施方案中，佐剂包含TLR4激动剂。TLR4激动剂的实例包括单磷酰脂质A或其衍生物，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)、也称为GLA的磷酸化六酰基二糖(CAS编号1246298-63-4)、如WO 98/50399或WO 01/034617中所述的氨基烷基葡萄糖氨基磷酸酯(AGP，aminalkyl glucosaminide phosphates)，特别是如US 6,113,918中所述的RC529，以及如US 2003/0153532或US 2005/0164988中所述的化合物，特别是在US 2003/0153532中以以下名称鉴定和例举的化合物：ER803022(CAS编号：287180-56-7)、ER803058(CAS编号：287180-57-8)、ER803732(CAS编号：287106-29-0)、ER803789(CAS编号：287180-61-4)、ER804053(CAS编号：287180-62-5)、ER804057(CAS编号：287180-63-6)、ER804058(CAS编号：287180-65-8)、ER804059(CAS编号：287180-64-7)、ER 8044442(CAS编号：287180-78-3)、ER804764(CAS编号：287180-87-4)、ER111232(CAS编号：287180-48-7)、ER112022(CAS编号：287180-46-5)、ER112048(CAS编号：287106-02-9)、ER112065(CAS编号：287180-49-8)、ER112066(CAS编号：287180-50-1)、ER113651(CAS编号：287180-51-2)、ER118989(CAS编号：287180-52-3)、ER119327(CAS编号：287180-54-5)和ER119328(CAS编号：287180-55-6)。这些化合物一般具有一个或几个不对称碳。当这些化合物具有一个或几个不对称碳时，它们可作为旋光异构体的混合物或以特定异构体的形式使用。这些TLR4激动剂本身也可与递送体系如铝盐(例如磷酸铝和/或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、病毒体、ISCOM、微米和纳米颗粒、乳剂组合。作为与递送体系组合的TLR4激动剂的合适制剂的实例，有包含作为TLR4激动剂的化合物ER 804057(现称为E6020)(CAS编号：287180-63-6)的水包油乳剂，所述化合物是具有以下化学式的化合物的二钠盐：
E6020的四个不对称碳全部都为R构型(R,R,R,R)。这种乳剂可例如通过如WO2004/060396中所述的微流化技术或通过如WO 2007/080308中所述的相转化温度方法(PIT方法)来获得。
TLR4激动剂和递送体系的另一种合适的组合可以是TLR4激动剂与铝盐的混合物，特别是E6020在磷酸盐缓冲液中吸附在氢氧化铝上的混合物。
更具体地说，佐剂也可根据它们在抗原存在下诱导的免疫应答的类型来分类。Th1型免疫应答与T淋巴细胞产生的IFN-Υ和/或IL-2细胞因子增加相关，而Th-2型免疫应答与IL-4、IL-5、IL-13和/或IL-10细胞因子的产生增加相关。Th17型免疫应答与IL-17应答增加相关。主要诱导Th1型免疫应答的佐剂被认为是Th1佐剂。同样地，主要诱导Th2型免疫应答的佐剂被认为是Th2佐剂，主要诱导Th17型免疫应答的佐剂是Th17佐剂。在本发明的上下文中，佐剂优选是Th1佐剂、Th17佐剂或Th1/Th17佐剂(其主要诱导Th1型免疫应答和Th17型免疫应答)。
如果产品之间不存在不相容性，通常将一种佐剂或佐剂组合与本发明的缀合物混合在一起，或者可选地，可在即将施用于个体之前临时将佐剂加入到缀合物中。
缀合物的用途
本发明的主题还涉及一种在具有金黄色葡萄球菌感染风险的个体中诱导交叉反应性抗体应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包含本发明的缀合物的免疫原性组合物。该免疫原性组合物可如上文在“缀合物的配制”部分所述进行配制。
该方法可以应用于具有金黄色葡萄球菌感染风险的任何动物，即对金黄色葡萄球菌感染敏感的任何动物，而无论感染的结果如何：无症状和/或有症状的、致死性的或非致死性的、慢性或非慢性的。特别地，该方法适用于人或动物，所述动物选自犬科物种、猫科物种、牛科物种、猪科物种、马科物种、绵羊物种以及鼬科物种(mustelids species)和禽鸟物种，因为它们易患金黄色葡萄球菌感染。在一个具体的实施方案中，该方法适用于具有较大的感染金黄色葡萄球菌感染的风险的个体。就人而言，它适用于免疫受损的个体或因金黄色葡萄球菌相关的医院感染风险而住院治疗或将住院治疗的个体。因此，本发明的方法适用于将经历手术的个体，特别是他们的手术导致植入诸如尿道探头、整形外科假体、起搏器、心脏瓣膜等医疗装置的那些个体。
包含本发明的缀合物的组合物可经由任何常用的途径并遵循导致诱导免疫应答的方案进行施用。通常，免疫计划包括数次施用。施用的组合物的量足以产生所需的免疫应答，即交叉反应性抗体应答。优选地，本发明的缀合物的免疫原性组合物还包含佐剂，如TLR4激动剂(例如E6020)，其可以与如上所述的递送体系组合。
有利地，本发明的方法诱导交叉反应性抗体的产生，所述交叉反应性抗体识别广泛的金黄色葡萄球菌菌株组，特别是鉴定为“100％β(1-3)菌株”的金黄色葡萄球菌菌株，如金黄色葡萄球菌336型菌株(ATCC编号55804)，其中TA的重复单元的所有核糖醇基团都被β(1-3)N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代；被鉴定为“100％β(1-4)菌株”的金黄色葡萄球菌菌株，如Wood 46菌株(ATCC编号10832)，其中TA的重复单元的所有核糖醇基团都被β(1-4)N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代；以及被鉴定为“100％α(1-4)菌株”的金黄色葡萄球菌菌株，如Newman D2C菌株(ATCC编号25904)，其中TA的重复单元的所有核糖醇基团都被α(1-4)N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代。
在另一方面，包含本发明缀合物的免疫原性组合物可施用于个体，然后该个体作为含有针对广泛金黄色葡萄球菌菌株的抗体的“超免疫球蛋白”源。如此治疗的个体将是血浆供体，通过常规血浆分级方法可由其获得“超免疫球蛋白”，并施用于另一个受试者以赋予对金黄色葡萄球菌感染的抵抗。用本发明的缀合物获得的超免疫球蛋白特别可用于在施用本发明的免疫原之后不能产生抗体应答的免疫受损个体，或经历手术的个体，其中时间不允许个体在手术前产生他自己的抗体。
参考以下说明性实施例进一步描述本发明。
实施例
在实施例和含义中使用的缩略语的列表
缩略语：
Ac：乙酰基
AcOEt：乙酸乙酯
ADH：己二酸二酰肼
Bn：苄基
CAN：硝酸铈铵
CE：毛细管电泳
CFU：菌落形成单位
DCM：二氯甲烷
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
EDCI：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
Et：乙基
EDAC：乙基二氨基丙基碳二亚胺
ESI：电喷雾离子化
ESI-MS：质谱串联ESI
ETT：5-(乙硫基)四唑
h：小时
Hla：金黄色葡萄球菌α-溶血素，也被称为α-毒素
HladM：脱毒的双突变金黄色葡萄球菌α毒素(HladM)作为载体蛋白质。HladM包含脱毒突变H35L和H48L
HPAEC-PAD：与脉冲安培检测偶联的高效阴离子交换色谱
HPSEC：高效尺寸排阻色谱法
IF缓冲剂：免疫荧光缓冲剂
Lev：乙酰丙酰基
LC-MS：质谱串联液相色谱
Me：甲基
MEKC：胶束毛细管电泳
MES：2-(N-吗啉基)乙磺酸
MeOH：甲醇
MIBK：甲基异丁基酮
min：分钟
mL：毫升
mm：毫米
mM：毫摩尔
mmol：毫摩尔
MP：对甲氧基苯基
MW：分子量
NMR：核磁共振
PBS：磷酸盐缓冲盐水
Ph：苯基
Py：吡啶
rEPA：无毒的铜绿假单胞菌重组外毒素A
Rib：核糖醇磷酸酯
Rf：保留因子
rt：室温
RT：保留时间
SFC：超临界流体色谱法
SFC-MS：质谱串联SFC
TA：磷壁酸
TBAF：四丁基氟化铵
TBDMS：叔丁基二甲基甲硅烷基
TBDPS：叔丁基二苯基甲硅烷基
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
TLC：薄层色谱法
TNBS：2,4,6-三硝基苯磺酸
TSB：胰蛋白酶大豆肉汤
Z：苄氧基-羰基
I)来自一组金黄色葡萄球菌菌株的磷壁酸的表征
通过在用氟化氢(HF)酸处理后使用与脉冲安培检测偶联的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)进行碳谱分型，逐个测定与来自20株代表性金黄色葡萄球菌菌株的TA的核糖醇磷酸酯单元连接的GlcNAc糖苷键的性质，所述20株金黄色葡萄球菌菌株包含例如从细胞保藏获得的金黄色葡萄球菌菌株和来自Centre National de réference desStaphylocoques,
Edouard Herriot,Lyon,France友情提供的临床分离株的金黄色葡萄球菌菌株。通过HF水解从TA的多核糖醇磷酸酯骨架释放GlcNAc-Rib二糖。
●细胞生长
金黄色葡萄球菌菌株在胰蛋白酶大豆肉汤培养基(TSB)上生长过夜。对于每株菌株，将一定体积的含有109CFU的肉汤培养物在5,000g和+4℃下离心20min。然后将细胞团用0.5mL的0.15M NaCl洗涤并再次离心。丢弃上清液。将细胞沉淀物悬浮于200μL的48％HF中并在室温下孵育过夜。在40℃、氮气流下除去酸，并将干燥的细胞水解物悬浮在400μL水中。通过离心除去细胞碎片后，使300μL样品通过离心过滤器单元(截留分子量10kDa，Ultracel-10，Millipore)，以除去蛋白质和其他大分子。在Dionex系统上使用具有预先在480mM NaOH中平衡的保护柱(4mmx50mm)的CarboPac MA1(4mmx250mm)分析柱，以0.4mL/min的流速分离GlcNAc-Rib二糖。使用480mM NaOH等梯度(isocratically)分离二糖40min。如段落IV中所述的纯化的TA(其结构已经通过核磁共振波谱法确定，如图1至3所示)以相同的方式水解并作为标准品用于测定20个分离的GlcNAc-Rib二糖的GlcNAc糖苷键的确切性质。
对应于其中N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型α的GlcNAc-Rib二糖的峰面积与对应于其中N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型β的GlcNAc-Rib二糖的峰面积之间的比率，直接与所分析的菌株的TA的核糖醇磷酸酯单元中为端基异构体构型α和为端基异构体构型β的N-乙酰基D-葡糖胺基残基的比例有关。当只有一个对应于其中N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型α的GlcNAc-Rib二糖的峰时，该菌株是100％α1-4菌株。同样地，当只有一个对应于其中N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型β的GlcNAc-Rib二糖的峰时，根据色谱图中该峰的位置并参照标准品的色谱图，该菌株为100％β1-4菌株或100％β1-3菌株。
下表总结了20株测试菌株的碳谱分型结果。
这些结果清楚地显示了金黄色葡萄球菌TA的核糖醇磷酸酯重复单元的结构变化。3株菌株为100％α(1-4)，5株菌株为100％β(1-4)，9株菌株为混合α(1-4)和β(1-4)，3株菌株为100％β(1-3)。
TA结构在“体内”的变化
为了评估金黄色葡萄球菌菌株的TA结构的结构变化是否发生在体内，用非致死剂量的HT2005 0742菌株(其是100％β(1-4)金黄色葡萄球菌菌株)或Newman Foster菌株(其是混合α(1-4)和β(1-4)金黄色葡萄球菌菌株)感染小鼠。15天后，收获感染小鼠的器官，并分析来自感染器官的TA的结构。使用的方案如下。
从在+37℃下在TSB中生长20小时的Newman菌株或HT2005 0742菌株的50mL培养物，获得细菌悬浮液。用1.7x106CFU/500μL的Newman菌株或7x106CFU/500μL的HT2005 0742菌株经由腹膜内途径感染小鼠。通过1:1混合无菌20％猪粘蛋白和2倍浓缩的调整的细菌悬浮液，临时制备细菌接种物。感染后15天，使小鼠安乐死。取出肝脏和肾脏，在无菌PBS中解离并匀浆。通过系列稀释并在胰蛋白酶大豆琼脂上铺板来计算每个器官的CFU。选出以至少6x107CFU/肾脏和109CFU/肝脏包含的来自感染小鼠的肾脏和肝脏，并针对TA表征进行进一步分析。研磨选出的器官，分别用5mL和1mL 0.15M NaCl洗涤两次。将沉淀物悬浮于400μL48％HF中并在室温下孵育过夜。通过离心除去细胞碎片，并在40℃、氮气流下除去HF。然后将样品溶解于400μL水中并通过离心过滤单元(截留分子量10kDa，Ultracel-10，Millipore)以除去蛋白质和其他大分子。根据前段所述的方案，在Dionex系统上分离GlcNAc-Rib二糖并进行分析。
对于HT2005 0742菌株，获得的结果显示，1,5核糖醇磷酸酯重复单元的核糖醇残基在4位被仅为端基异构体构型的N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代。因此，在感染的小鼠器官中“体内”扩增后，HT2005 0742的TA结构没有变化，其仍保持100％β(1-4)菌株。
相比之下，观察到，“体内”扩增后，Newman Foster菌株具有磷壁酸特征，其中1,5核糖醇磷酸酯的N-乙酰基D-葡糖胺基残基中几乎90％为β(1-4)端基异构体构型。因此该菌株的TA结构根据生长条件而发生变化，并且“体内”环境有助于β(1-4)端基异构体构型。
总之，这些结果表明，当金黄色葡萄球菌菌株被置于“体内”环境中时，TA的结构朝向其中1,5核糖醇磷酸酯上的N-乙酰基D-葡糖胺基残基主要为β端基异构体构型的结构演化。
II)八聚体和九聚体寡糖的合成和表征
材料和方法：
所有的化学品(Acros、Fluka、Merck、Sigma-Aldrich、Interchim)均按接收时原样使用并且反应在干燥、氩气氛下进行，除了含有水的那些。所有的亚磷酰胺偶联反应均使用来自Sigma-Aldrich的DNA合成级乙腈。
和
分子筛粉末在使用前至少12h在300℃的烘箱中活化。在TLC硅胶玻璃板(Merck，硅胶60，F245)上或在碱性氧化铝TLC玻璃板(具有254nm荧光指示剂，Teledyne Isco)上，进行薄层色谱法(TLC)分析。通过用含20％的H2SO4的乙醇溶液喷雾，通过UV吸收(254nm)使化合物可视化。在Merck硅胶(0.015-0.040mm)填充柱上进行柱色谱法。在配备有CarboPacTM PA-100柱(22x 250mm)、柱温箱(设置为27℃)和UV检测器(设置为206nm)的Varian PrepStar机器上，进行制备型离子型Dionex色谱法。使用以下洗脱液进行洗脱：相A—9:1H2O-MeCN；相—9:1 2M NaCl-MeCN。洗脱梯度如下(流速：10mL/min)：9至13％相B线性持续12min，13至80％B线性持续1min，80％B持续2min，80至9％B持续1min，以及9％B持续2min。
除非另有说明，在Perkin Elmer旋光计(钠D-线，λ＝589nm)上采用10mg/mL的浓度(c＝1)进行旋光度测量([α]D 20)。
采用Bruker AV 400(400MHz)、Bruker AV 500(500MHz)或Bruker DMX 600(600MHz)记录1H NMR谱。除非另有说明，在CDCl3中以相对于四甲基硅烷的化学位移(δ)记录NMR谱。当使用D2O时，以相对于HDO(4.755ppm)的化学位移(δ)记录1H-NMR谱。
在HPLC或UPLC/220nm下UV检测/具有以正或负模式操作的电喷雾电离(ESI)源的单级四极杆MS分析仪上，进行LC-MS HPLC分析。
方法1
仪器：HP 1100 MSD(Agilent)
柱：Symmetry C18(50x 2.1mm)3.5μm(Waters)；柱温：30℃
溶剂A：H2O+0.005％TFA；溶剂B：CH3CN+0.005％TFA
流速：0.4mL/min
梯度A/B：100/0(t0min)至0/100(t10min)保持0/100(t15min)
方法2
仪器：UPLC Acquity SQD(Waters)
柱：BEH C18(50x2.1mm)1.7μm(Waters)；柱温：55℃
溶剂A：H2O+0.02％HCOOH；溶剂B：CH3CN+0.02％HCOOH
流速：1mL/min
梯度A/B：98/2(t0min)至2/98(t4min)保持2/98(t4.5min)
方法3
仪器：UPLC Acquity SQD(Waters)
柱：BEH C18Shield(100x2.1mm)1.7μm(Waters)；柱温：65℃
溶剂A：H2O+0.02％HCOOH；溶剂B：CH3CN+0.02％HCOOH
流速：0.7mL/min
梯度A/B：95/5(t0min)至75/25(t0.5min)至40/60(t7min)至15/85(t9.7min)至2/98(t10min)保持2/98(t10.5min)
方法4
仪器：UPLC Acquity SQD(Waters)
柱：CSH C18(50x2.1mm)1.7μm(Waters)；柱温：55℃
溶剂A：H2O+0.02％HCOOH；溶剂B：CH3CN+0.02％HCOOH
流速：1mL/min
梯度A/B：98/2(t0min)至2/98(t4min)保持2/98(t4.5min)
方法5
仪器：HP 1100 MSD(Agilent)
柱：X Terra MS C8 3.5μm(100x3.0mm)Waters)；柱温：30℃
溶剂A：H2O+NH4OAc 10mM pH 7；溶剂B：CH3CN
流速：从t0min时的0.6mL/min到t12min时的0.4mL/min
梯度A/B：70/30(t0min)至5/95(t12min)保持5/95(t36min)
方法11
仪器：HP 1100 MSD(Agilent)
柱：Kinetex C18(50x 3.0mm)2.6μm(Phenomenex)；柱温：30℃
溶剂A：H2O+0.05％TFA；溶剂B：CH3CN+0.035％TFA
流速：0.8mL/min
梯度A/B：7/3(t0min)至0/1(t30min)保持0/1(t35min)
方法12a和12b
仪器：UPLC Acquity SQD(Waters)
柱：BEH C18(50x2.1mm)1.7μm(Waters)；柱温：55℃
溶剂A：H2O+0.02％HCOOH；溶剂B：CH3CN+0.02％HCOOH
流速：1mL/min
a：梯度A/B：95/5(t0min)至2/98(t2min)保持2/98(t2.5min)
b：梯度A/B：95/5(t0min)至0/100(t2min)保持0/1(t2.5min)
在UPLC Acquity/以正或负模式操作的ESI Tof质谱仪LCT-Premier XE(Waters)上，进行LC-HRMS分析。
方法6
柱：BEH300 C4(100x2.1mm)1.7μm(Waters)；柱温：70℃
溶剂A：H2O+0.005％TFA；溶剂B：CH3CN+0.005％TFA
流速：0.6mL/min(分流1/20进入离子源)
梯度A/B：7/3(t0min)至0/1(t10min)保持0/1(t15min)
方法7
柱：BEH300 C4(100x2.1mm)1.7μm(Waters)；柱温：70℃
溶剂A：H2O+0.1％TFA；溶剂B：CH3CN+0.1％TFA
流速：0.6mL/min(分流1/20进入离子源)
梯度A/B：7/3(t0min)至0/1(t10min)保持0/1(t15min)
在P/ACE MDQ(Beckman)系统上进行CE毛细管区带电泳。
方法8a和8b
毛细管：PVA涂层50μm(id)，有效长度：40cm
缓冲剂：5-磺基水杨酸，4mM
a：pH＝3.51(NaOH)
b：pH＝3.64(NaOH)
电压：-15kV
温度：25℃
进样：5sec(0.5psi)0.5mg/mL在H2O中的溶液与5sec(0.5psi)DMSO共进样
检测：间接UV 214nm
在SFC(Berger)/在220nm下的UV检测器(Agilent)/具有以正模式操作的电喷雾电离(ESI)源的单级四极杆质谱仪ZQ(Waters)上，进行SFC-MS分析。在背压调节器之后且在离子源之前加入溶剂补充剂，由HP1100(Agilent泵)输送。
方法9
柱：Diol 60A(250x4.6mm)5μm(Princeton)；柱温：34℃
超临界流体：CO2，压力：180bar，温度：40℃
改性剂：MeOH/CH3CN 1/1(V/V)
改性剂梯度：以3％/min从5％(t2min)至40％(t13.7min)，在40％时保持1min
流速：3mL/min
补充溶剂：MeOH+0.2％HCOOH，0.2mL/min
方法10
柱：Diol 60A(250x4.6mm)5μm(Princeton)；柱温：36℃
超临界流体：CO2，压力：180bar，温度：40℃
改性剂：MeOH
改性剂梯度：以3％/min从5％(t1min)至40％(t12.7min)，在40％时保持2min
流速：3mL/min
补充溶剂：MeOH+0.2％HCOOH，0.2mL/min
在以正或负模式操作的ESI Tof质谱仪LCT-Premier XE(Waters)上通过以5μL/min的流速注入1μg/μL的溶液来获得ESI HRMS谱。
在配备有正模式的电喷雾离子源(源电压3.5kV，鞘气流量10，毛细管温度275℃)的质谱仪(Thermo Finnigan LTQ Orbitrap)上，采用m/z 400(质量范围m/z＝150-2000)下的分辨率R＝60000和邻苯二甲酸二辛酯(m/z＝391.28428)作为锁定质量，通过直接注射(2μl的2μM寡聚物在1/1水/乙腈和0.1％甲酸或10mM甲酸铵中的溶液)，来记录高分辨率质谱(HRMS)。在测量前用校准混合物(Thermo Finnigan)对高分辨率质谱仪进行校准。
实施例1-β(1,4)八聚体的合成
4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-[(4-肼基-4-氧代丁酰基)氨基]乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(1)
方案1
步骤1.1：甲基2,3-O-亚异丙基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-呋喃核糖苷(5)
将碳酸铯(50g,153mmol)和MIBK(50mL)加入至4-甲氧基苯酚(17.3g,140mmol)在MIBK(64mL)中的溶液。将混合物在110℃下搅拌，并逐滴加入甲基2,3-O-亚异丙基-5-O-甲苯磺酰基-D-呋喃核糖苷(4)(50g,140mmol)[Baird,Lynton J.et al,Journal of OrganicChemistry,2009,74(6),2271-2277]在MIBK(140mL)中的溶液，然后加入MIBK(50mL)。在105℃下进一步搅拌过夜后，将褐色的混合物冷却至室温，用MIBK稀释，并用水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，产生目标化合物5，其不经进一步纯化用于下一步骤中。
LC-MS(方法1)m/z 333.2[(M+Na)+]；RT＝8.53min
步骤1.2：甲基5-O-(4-甲氧基苯基)-D-呋喃核糖苷(6)
将硫酸水溶液1N(56mL)逐滴加入至5(140mmol)在甲醇(405mL)中的溶液。将溶液在回流下搅拌5h。将溶液冷却至0℃并分份加入碳酸氢钠，直到达到中性pH。在
上过滤混合物，并将滤液在真空中浓缩。得到的残留物通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/EtOAc7/3至1/1)纯化，得到32g(2步后收率为84％)目标化合物6。
LC-MS(方法1)m/z 293.1[(M+Na)+]；RT＝5.64和5.76min
步骤1.3：甲基2,3-二-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-呋喃核糖苷(7)
在0℃、氩气下将氢化钠(60％在油中的悬浮液,8.79g,0.22mol)分份加入到化合物6(66g,0.18mol)在DMF(0.9L)中的溶液。在0℃下搅拌20min后，逐滴加入苄基溴(31.3mL,0.26mol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并在0℃下逐滴加入MeOH(7mL)。在室温下搅拌30min后，将混合物在真空中浓缩，用AcOEt稀释，并用水洗涤。有机层用水洗涤两次，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/EtOAc 1/0至4/1)纯化，得到74.9g(91％收率)目标化合物7。
LC-MS(方法2)m/z 468.2[(M+NH4)+]；RT＝2.65min
步骤1.4：2,3-二-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-呋喃核糖(8)
在室温下将3M盐酸水溶液(208mL)缓慢加入至化合物7(95.5g,0.21mol)在1,4-二氧六环(1.2L)中的溶液。将混合物回流加热5h并冷却至0℃。在0℃下将碳酸氢盐饱和水溶液逐滴加入至反应混合物以达到pH 9。用EtOAc(500mL)稀释后，有机层用水和盐水洗涤。水相用EtOAc(3x200mL)萃取，并将得到的有机层用盐水洗涤。合并的有机相经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/EtOAc 1/0至7/3)纯化，得到57.6g(62％收率)目标化合物8。
LC-MS(方法2)m/z 454.2[(M+NH4)+]；RT＝2.46和2.51min
步骤1.5：2,3-二-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(9)
在0℃下将硼氢化钠(8.84g,0.23mol)分份加入到化合物8(78.5g,0.18mol)在MeOH(1.2L)中的溶液。在0℃下搅拌1h以及在室温下搅拌30min后，将反应混合物用DCM(1L)稀释。将有机溶液用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，产生目标化合物9为无色糖浆，其不经进一步纯化用于下一步骤中。
步骤1.6：2,3-二-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-1-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-D-核糖醇(10)
向0℃下的粗化合物9(7.73g,17.63mmol)在DCM(140mL)中的溶液依次加入三乙胺(6.21mL,44.1mmol)、DMAP(1.1g,8.8mmol)和叔丁基二苯基甲硅烷氯化物(9.32mL,35.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。用DCM(800mL)稀释后，有机溶液用10％硫酸钾水溶液(200mL)、水(3x150mL)、2％碳酸氢钠水溶液(150mL)和水(150mL)洗涤。得到的有机相经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/EtOAc 1/0至9/1)纯化，产生10.6g(89％收率)目标化合物10。
LC-MS(方法2)m/z 677.3[(M+H)+]；RT＝3.73min
步骤1.7：4-O-[2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α,β-D-吡喃葡萄糖基]-2,3-二-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-1-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-D-核糖醇(12)
将化合物10(5.17g,7.64mmol)、乙基2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(11)(5.64g,993mmol)[Y.Du,J.Lin,R.J.Linhardt,Journal ofCarbohydrate Chemistry,1997,16(9),1327-1344]和
粉末状分子筛(11.5g)在无水DCM(153mL)和Et2O(230mL)中的混合物在室温、干氩气下搅拌2.5h。在-20℃下向混合物加入N-碘代琥珀酰亚胺(4.30g,19.09mmol)和三氟甲磺酸(167μL,1.91mmol)，将混合物再搅拌10min。加入三乙胺(535μL,4.06mmol)，并将混合物通过
垫过滤，并用DCM(600mL)稀释。然后将有机层用1M Na2S2O3水溶液(3x150mL)、水(3x150mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。残留物在硅胶柱上用甲苯–EtOAc的快速色谱，产生期望产物12(8.63g,7.61mmol)，为52:48α/β混合物，收率为94％。
LC-MS(方法3)m/z 1156.1[(M+Na)+]；RT＝4.24min
步骤1.8：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(13)
4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(14)
在0℃下将乙酸(13.9mL,0.24mol)和1M TBAF在THF(244mL,0.24mol)中的溶液依次加入到化合物12(9.22g,8.13mmol)在THF(325mL)中的溶液。将溶液在室温下搅拌17h并在真空中浓缩。残留物溶解于DCM(800mL)中，并将溶液用水(3x200mL)、2％NaHCO3水溶液(3x100mL)和水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/EtOAc 1/0至4/1)纯化，产生2.94g(40％)β-端基异构体化合物13和3.37g(46％)α-端基异构体化合物14，二者均为无色油状物。
13：Rf＝0.63硅胶，甲苯/EtOAc:4/1
LC-MS(方法3)m/z 896.3[(M+H)+]；RT＝3.66min
δH(600MHz,CDCl3)7.35-7.14(m,25H),6.81(4H,s),4.90(1H,d),4.76-4.80(3H,m),4.71(1H,d),4.66(1H,d),4.65(1H,d,J1’-2’＝7.7Hz),4.62(1H,d),4.54(1H,d),4.52(1H,d),4.47(1H,d),4.37(1H,ddd),4.20(1H,dd),4.06(1H,dd),4.00(1H,dd),3.91(1H,m),3.88(1H,dd),3.78(1H,dd),3.77(3H,s),3.64(1H,dd),3.60(1H,dd),3.52(1H,dd),3.41(1H,ddd),3.39(1H,dd),3.38(1H,dd)。
14：Rf＝0.49硅胶，甲苯/EtOAc:4:1
LC-MS(方法3)m/z 896.3[(M+H)+]；RT＝3.63min
δH(600MHz,CDCl3)7.35-7.15(m,25H),6.77-6.70(4H,m),5.18(1H,d,J1’-2’＝3.7Hz),4.86(1H,d),4.82(1H,d),4.79(1H,d),4.78(1H,d),4.70(1H,d),4.68(1H,d),4.61(1H,d),4.59(1H,d),4.54(1H,d),4.44(1H,d),4.31(1H,dt),4.14(1H,ddd),4.08(2H,m),3.99(1H,dd),3.95(1H,dd),3.84(3H,m),3.77(3H,s),3.76(1H,dd),3.70(1H,dd),3.54(1H,dd),3.52(1H,dd)。
步骤1.9：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(15)
在0℃下向化合物13(1.96g,2.18mmol)在无水DCM(2.6mL)和1,4-二氧六环(26mL)中的溶液依次加入乙酰丙酸(0.45mL,2.18mmol)、DMAP(53mg,0.43mmol)和EDCI(0.84g,4.37mmol)。在室温下搅拌15h后，将溶液用DCM稀释，用10％硫酸钾水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，产生目标化合物15，为油状物，其不经进一步纯化用于下一步骤中。
Rf＝0.52硅胶，甲苯/EtOAc 4/1
步骤1.10：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(17)
将CAN(3.6g,6.57mmol)分份加入到在0℃下冷却的化合物15(2.18mmol)在乙腈(200mL)和水(22mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2h，在真空中浓缩，用DCM(1.8L)稀释，用水、2％碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/EtOAc 1/0至7/3)纯化，产生1.94g(81％收率)目标化合物17。
LC-MS(方法2)m/z 905.3[(M+NH4)+]；RT＝3.45min
方案2
步骤1.11：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(19)
将化合物13和17各自分别溶解于无水MeCN，并在真空中浓缩，产生白色泡沫。在反应前将该程序重复至少两次。所有的化学品和玻璃器皿在使用前在真空中经P2O5和氢氧化钾片干燥过夜。
在氩气下将化合物13(1.78g,1.99mmol)和活化的分子筛(
粉末，0.66g)在干燥的MeCN(50mL)中的混合物在室温下搅拌1h。将混合物冷却至0℃，并在氩气下依次逐滴加入N,N-二异丙基乙胺(0.83mL,4.77mmol)和氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(0.59mL,2.58mmol)。在0℃下再搅拌0.5h后，在转移前将活化的亚磷酰胺的混合物冷却至-10℃。
同时，在氩气下将化合物17(1.18g,1.33mmol)和活化的分子筛(
粉末，0.66g)在干燥的MeCN(50mL)中的混合物在室温下搅拌1h。将混合物冷却至-10℃，并加入含有活化的亚磷酰胺的混合物，然后加入5-乙基硫代-1H-四唑(2.07g,15.9mmol)。在0℃下搅拌1h后，在0℃下加入干燥的吡啶(3.25mL,40mmol)，然后加入0.4M碘(在THF/水2/1中)溶液，直到持续为褐色。反应混合物经
过滤。滤液用DCM稀释，用1M硫代硫酸钠水溶液、2％碳酸氢钠水溶液、水和盐水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/丙酮1/0至3/2)纯化，产生1.74g(69％收率)目标化合物19。
LC-MS(方法4)m/z 1920.8[(M+Na)+]；RT＝4.15min
方案3
步骤1.12：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-D-核糖醇(21)
将0℃下的水合肼(2.66mL,30.0mmol)在吡啶(48mL)和乙酸(32mL)中的溶液逐滴加入到0℃下的化合物19(10.2g,5.36mmol)在吡啶(80mL)中的溶液。在0℃下再搅拌0.5h后，将溶液用DCM稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过快速色谱法在硅胶(甲苯/丙酮1/0至7/3)上纯化，产生8.08g(83％收率)目标化合物21。
LC-MS(方法5)m/z 1817.6[(M+NH4)+]；RT＝16.55min
步骤1.13：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(22)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物19(7.84g,4.13mmol)，经快速色谱法在硅胶上(甲苯/丙酮1/0至7/3)纯化后产生5.81g(79％收率)目标化合物22。
LC-MS(方法5)m/z 1809.6[(M+NH4)+]；RT＝16.02min
方案4
步骤1.14：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(25)
根据在步骤1.11中描述的程序使化合物21(1.0g,0.56mmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(166μL,0.72mmol)和化合物22(0.71mg,0.39mmol)反应，经快速色谱法(甲苯/丙酮1/0至3/2)纯化后产生1.21g(80％收率)目标化合物25，为白色泡沫。
ESI HRMS：C205H222N15O45P3m/z计算为[M+Na]+3729.47，实测为3729.26
LC(方法5)：RT＝22.83min
步骤1.15：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-D-核糖醇(27)
根据在步骤1.12中描述的程序处理化合物25(5.1g,1.38mmol)，通过快速色谱法在硅胶(甲苯/丙酮1/0至7/3)上以及尺寸排阻色谱法在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上纯化后，产生3.51g(71％收率)目标化合物27，为白色泡沫。
ESI HRMS：C200H216N15O43P3m/z计算为[M+Na]+3631.43，实测为3631.35
LC(方法5)：RT＝21.84min
步骤1.16：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(28)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物25(4.19g,1.13mmol)，通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/丙酮1/0至7/3)以及尺寸排阻色谱法在
LH-20上(DCM/MeOH 1/1)纯化后，产生3.07g(76％收率)目标化合物28，为白色泡沫。
ESI HRMS：C198H216N15O44P3m/z计算为[M+Na]+3623.43，实测为3623.37
LC(方法5)：RT＝20.31min
步骤1.17：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(31)
根据在步骤1.11中描述的程序使化合物27(1.5g,0.42mmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(124μL,0.54mmol)和化合物28(1.20g,0.33mmol)反应，经快速色谱法(甲苯/丙酮1/0至3/2)纯化后产生1.73g(72％收率)目标化合物31，为胶状物。
LC-HRMS(方法6)：C401H434N31O89P7m/z计算为[M+3H]3+2443.63，实测为2443.65；RT＝9.22min
步骤1.18：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-D-核糖醇(33)
根据在步骤1.12中描述的程序处理化合物31(3.23g,0.44mmol)，通过快速色谱法在硅胶上(甲苯/丙酮1/0至7/3)以及尺寸排阻色谱法在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上纯化后产生2.54g(80％收率)目标化合物33，为白色泡沫。
LC-HRMS(方法6)：C396H428N31O87P7m/z计算为[M+3H]3+2410.95，实测为2410.95；RT＝9.24min
方案5
步骤1.19：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(35)
根据在步骤1.11中描述的程序使N-(2-羟基乙基)氨基甲酸苄酯(108mg,0.55mmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(115μL,0.50mmol)和化合物33(800mg,0.11mmol)反应，通过快速色谱法(甲苯/丙酮1/0至3/2)以及尺寸排阻色谱法在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上纯化后，产生0.56g(67％收率)目标化合物35，为白色泡沫。
LC-HRMS(方法6)：C409H443N33O92P8m/z计算为[M+3H]3+2514.31，实测为2514.31；RT＝9.19min
步骤1.20：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(37)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物35(550mg,72.9μmol)，经快速色谱法在硅胶上(甲苯/丙酮1/0至7/3)纯化后产生414mg(76％收率)目标化合物37，为胶状物。
LC-HRMS(方法6)：C402H437N33O91P8m/z计算为[M+3H]3+2478.96，实测为2478.96；RT＝9.10min
步骤1.21：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(铵次膦酸基)]-D-核糖醇(39)
将氢氧化铵(20％溶液，4.6mL)加入至化合物37(380mg,51.1μmol)在MeOH(9.2mL)中的溶液。将混合物回流搅拌5h并冷却至室温。残留物通过尺寸排阻色谱法在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上纯化，得到339mg(铵盐，95％收率)目标化合物39，为白色胶状物。
LC-HRMS(方法7)：C378H405N25O91P8m/z计算为[M+6H]2-3503.32，实测为3503.07；RT＝8.99min
步骤1.22：4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(41)
将硫代乙酸(1.38mL,18.8mmol)加入到化合物39(335mg,46.9μmol)在吡啶(1.4mL)中的溶液。在室温下搅拌3.5天后，将混合物通过尺寸排阻色谱法在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上纯化，得到324mg(97％收率)目标化合物41，为胶状物。
LC-HRMS(方法6)：C394H437N9O99P8 8-m/z计算为[M+5H]3-2378.26，实测为2378.14；RT＝8.38min
步骤1.23：4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-氨基乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(43)
将钠(600mg,26.1mmol)在-78℃下分份加入到搅拌中的用液氨饱和的化合物41(310mg,43.5μmol)在干燥的THF(31mL)中的溶液。在-78℃下搅拌30min后，在-78℃下逐滴加入氯化铵饱和水溶液(50mL)。再搅拌1h后，将混合物在真空中浓缩并用水稀释。混合物通过在
G25(0.2M NaCl)上然后在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法纯化，产生142mg(96％收率)目标化合物43，为白色固体。
ESI HRMS：C106H191N9O97P8m/z计算为[M+H+4Na]3-1161.27，实测为1161.35
步骤1.24：4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-({4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁酰基}氨基)乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(45)
将化合物43(80mg,22.4μmol)在水(3.4mL)中的溶液在剧烈搅拌下逐滴加入到二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(140mg,0.45mmol)和N,N-二异丙基乙胺(86μL,0.49mmol)在DMF(3.4mL)中的溶液。在室温下搅拌1h后，将混合物通过在
G25(0.2M NaCl)上然后在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法纯化，产生74mg(88％收率)目标化合物45，为白色固体。
CE(方法8a)：MT＝7.24min
步骤1.25：4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-[(4-肼基-4-氧代丁酰基)氨基]乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(1)
在室温下将水合肼(106μL,1.19mmol)加入到化合物45(60mg,15.9μmol)在水(4mL)中的溶液。5h后，将反应混合物通过在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法、通过制备型离子型Dionex色谱法、然后通过在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法纯化，产生13mg(24％收率)目标化合物1，为白色泡沫。
ESI HRMS：C110H197N11O99P8m/z计算为[M+H+Na]6-588.14，实测为588.15
1H NMR(600MHz,D2O)δ＝4.81(7H,m),4.76(1H,d),4.22(7H,m),4.21-4.03(30H,m),4.05(1H,m),4.05-3.93(16H,m),3.99(3H,m),3.89(1H,m),3.99-3.82(16H,m),3.81(7H,m),3.78(1H,m),3.77(1H,m),3.63(8H,m),3.53(16H,m),3.50(2H,m),2.63(2H,m),2.55(2H,m),2.16(21H,s),2.11(3H,s)。
实施例2-α(1,4)八聚体的合成
4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-[(4-肼基-4-氧代丁酰基)氨基]乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(2)
步骤2.1：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(16)
根据在步骤1.9中描述的程序处理化合物14(13.80g,15.4mmol)，产生无色油状物的目标化合物16，其不经进一步纯化用于下一步骤中。
步骤2.2：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(18)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物16(15.3g,15.4mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/EtOAc 95/5至3/1)上纯化后产生12.1g(87％收率)目标化合物18。
LC-MS(方法3)m/z(ESI)888.2[(M+H)+]；RT＝8.91min
步骤2.3：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(20)
根据在步骤1.11中描述的程序使合物14(3.8g,4.24mmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.27mL,5.51mmol)和化合物18(2.82g,3.18mmol)反应，经快速色谱法(甲苯/EtOAc 95/5至7/3)纯化后，产生5.70g(94％收率)目标化合物20，为胶状物。
SFC-MS(方法9)m/z 1920.7[M+Na]+；RT＝9.29min
步骤2.4：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-D-核糖醇(23)
根据在步骤1.12中描述的程序处理化合物20(12.80g,6.74mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/EtOAc 95/5至3/2)上纯化后，产生8.70g(72％收率)目标化合物23，为白色泡沫。
SFC-MS(方法9)m/z 1822.5[M+Na]+；RT＝10.07min
步骤2.5：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(24)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物20(9.60g,5.06mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/EtOAc 95/5至7/3)上纯化后，产生6.23g(69％收率)目标化合物24。
SFC-MS(方法9)m/z 1814.5[M+Na]+；RT＝9.74min
步骤2.6：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(26)
根据在步骤1.11中描述的程序使化合物23(0.99g,0.55mmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(164μL,0.71mmol)和化合物24(0.73g,0.41mmol)反应，经快速色谱法(甲苯/EtOAc 9/1至1/1)纯化后，产生1.17g(77％收率)目标化合物26，为白色泡沫。
SFC-MS(方法9)m/z 1872.3[M+2NH4]2+；RT＝11.68min
步骤2.7：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-D-核糖醇(29)
根据在步骤1.12中描述的程序处理化合物26(4.51g,1.21mmol)，通过在硅胶(甲苯/EtOAC 7/3至2/3)上进行快速色谱法以及在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，产生3.58g(82％收率)目标化合物29，为白色泡沫。
LC-MS(方法5)m/z 1823.1(平均质量)[M+2NH4]2+；RT＝21.91min
步骤2.8：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(30)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物26(3.20g,0.86mmol)，通过在硅胶(甲苯/EtOAc 85/15至3/1)上进行快速色谱法以及在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上进行尺寸排阻色谱法纯化后产生2.13g(68％收率)目标化合物30，为白色泡沫。
LC-MS(方法5)m/z(ESI)1870.1(平均质量)[(M+2HCO2H+Na)2+]；RT＝20.72min
步骤2.9：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(32)
根据在步骤1.11中描述的程序使化合物29(1.39g,0.38μmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(115μL,0.50mmol)和化合物30(1.05g,0.29mmol)反应，通过在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上进行尺寸排阻色谱法以及快速色谱法(甲苯/EtOAc 9/1至1/1)纯化后，产生1.01g(47％收率)目标化合物32，为白色泡沫。
LC-HRMS(方法6)：C401H434N31O89P7m/z计算为[M+3H]3+2443.63，实测为2443.56；RT＝9.30min
步骤2.10：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-D-核糖醇(34)
根据在步骤1.12中描述的程序处理化合物32(1.10g,0.15mmol)，通过在硅胶(甲苯/EtOAc/EtOH 7/3/0至7/3/0.3)上进行快速色谱法以及在
LH-20(DCM/MeOH 3/2)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，产生0.80g(92％收率)目标化合物34，为白色泡沫。
LC-HRMS(方法6)：C396H428N31O87P7m/z计算为[M+2H]2+3615.92，实测为3615.83；RT＝9.27min
步骤2.11：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(36)
根据在步骤1.11中描述的程序使N-(2-羟基乙基)氨基甲酸苄酯(70mg,0.36mmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(71μL,0.30mmol)和化合物34(370mg,51.2μmol)反应，经快速色谱法(甲苯/丙酮1/0至0/1)纯化后，产生209mg(54％收率)目标化合物36，为白色泡沫。
Rf＝0.53，在硅胶上，甲苯/丙酮3/2
步骤2.12：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(38)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物36(122mg,16μmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/丙酮9/1至3/2)上纯化后，产生76mg(63％收率)目标化合物38，为白色泡沫。
LC-HRMS(方法6)：C402H437N33O91P8m/z计算为[M+2H]2+3717.94，实测为3717.99；RT＝9.12min
步骤2.13：4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(铵次膦酸基)]-D-核糖醇(40)
根据在步骤1.21中描述的程序处理化合物38(318mg,42.8μmol)，通过在
LH-20(DCM/MeOH 1/4)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，产生295mg(96％收率)目标化合物40，为白色胶状物。
LC-HRMS(方法6)：C378H405N25O91P8m/z计算为[M+6H]2-3503.82，实测为3503.59；RT＝9.23min
步骤2.14：4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-2,3-二-O-苄基-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-2,3-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(42)
根据在步骤1.22中描述的程序处理化合物40(362mg,50.7μmol)，通过在
LH-20(DCM/MeOH 1/4)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，产生347mg(96％收率)目标化合物42，为胶状物。
LC-HRMS(方法6)：C394H437N9O99P8m/z计算为[M+5H]3-2378.26，实测为2378.10；RT＝8.27min
步骤2.15：4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-氨基乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(44)
根据在步骤1.23中描述的程序处理化合物42(171mg,22.1μmol)，通过在
G25(0.2M NaCl)上然后在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，定量产生胶状物的目标化合物44。
ESI HRMS：C106H191N9O97P8 8-m/z计算为[M+2H+Na]5-683.17，实测为683.17
步骤2.16：4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{4-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-[(4-肼基-4-氧代丁酰基)氨基]乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(2)
将化合物44(75mg,21μmol)在水(2.1mL)中的溶液在剧烈搅拌下逐滴加入到在DMSO(11.0mL)中含有二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(130mg,0.42mmol)和N,N-二异丙基乙胺(80μL,0.46mmol)的溶液，产生中间体46。在室温下搅拌0.5h后，将第一份水合肼(0.74mL,8.4mmol)加入到该反应混合物，然后在1h、1.5h和2.5h后加入其他3份(0.57mmol,0.23mmol)。通过在
G25(0.2M NaCl)上然后在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法、通过制备型离子型Dionex色谱法、然后通过在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法纯化，在冻干后得到21mg(27％)目标化合物2，为白色泡沫。
ESI HRMS：C110H197N11O99P8m/z计算为[M+2H]6-584.48，实测为584.48
CE(方法8b)：MT＝7.38min
1H(600MHz,D2O)δ＝5.12(8H,m),4.20-4.01(30H,m),4.13(7H,m),4.09(9H,m),4.02-3.93(16H,m),4.00(8H,m),3.98(3H,m),3.96(1H,m),3.96-3.85(16H,m),3.89(8H,m),3.56(8H,m),3.49(2H,m),2.63(2H,m),2.55(2H,m),2.13(24H,s)。
实施例3-β(1,3)九聚体的合成
3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-[(4-肼基-4-氧代丁酰基)氨基]乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(3)
方案6
步骤3.1：甲基2-O-苄基5-O-(4-甲氧基苯基)-D-呋喃核糖苷(47)
向6(45.3g,168mmol)在DCM(1.68L)中的溶液依次加入四正丁基溴化铵(10.8g,33.5mmol)、苄基溴(21.9mL,184mmol)和10％氢氧化钠水溶液(168mL)。将反应混合物在室温下搅拌20h，用DCM和水稀释。两层分离后，有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过在硅胶(甲苯/EtOAc 1/0至0/1)上进行快速色谱法纯化，得到20.25g(34％收率)目标化合物47。
LC-MS(方法1)m/z 383[M+Na]+；RT＝8.2min
步骤3.2：甲基3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-呋喃核糖苷(48)
将在乙腈/丙腈/DCM 2/1/1(1.12L)中的乙基2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(11)(7.6g,13.5mmol)[Y.Du,J.Lin,R.J.Linhardt,JournalofCarbohydrate Chemistry,1997,16(9),1327-1344]、甲基2-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-呋喃核糖苷47(4.04g,11.2mmol)和分子筛
粉末(11.2g)的混合物在氩气下室温搅拌1h。然后将混合物冷却至-70℃，并依次加入N-碘代琥珀酰亚胺(4.5g,20.2mmol)和1M三氟甲磺酸的DCM溶液(3.9mL,3.9mmol)。在-70℃下搅拌10min后，逐滴加入三乙胺(0.5mL)，将反应混合物在
上过滤，并用DCM稀释。将有机溶液用1M硫代硫酸钠水溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过在硅胶(甲苯/EtOAc1/0至9/1)上进行快速色谱法纯化，得到9.33g(84％收率)目标化合物48。
LC-MS(方法12a)m/z 835.2[M+NH4]+；RT＝2.08min
步骤3.3：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-呋喃核糖(49)
将盐酸3M(47mL)加入到化合物48(15.3g,18.7mmol)在1,4-二氧六环(140mL)中的溶液。将混合物回流搅拌7h并冷却至室温。在0℃下将反应混合物缓慢倒入到碳酸氢钠(20g)在水(500mL)中的溶液。用DCM萃取后，有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。得到的残留物通过在硅胶(甲苯/EtOAc 1/0至3/2)上进行快速色谱法纯化，产生10.9g(73％收率)目标化合物49。
LC-MS(方法1)m/z 826.4[(M+Na)+]；RT＝11.64min
步骤3.4：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(50)
在0℃下将硼氢化钠(1.7g,45.3mmol)分份加入到化合物49(20.2g,25.2mmol)在甲醇(250mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌3.5h。将混合物用DCM稀释，并缓慢倒入到水中。分层，有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，产生目标化合物50，其不经进一步纯化用于下一步骤中。
步骤3.5：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-O-苄基-1-O-叔丁基二甲基甲硅烷基5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(51)
向0℃、氩气下的化合物50(25.2mmol)在DCM(330mL)中的溶液依次加入DMAP(462mg,3.78mmol)、三乙胺(17.7mL,126mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷氯化物(11.4g,75.6mmol)。溶液在室温下搅拌过夜，用DCM稀释并用10％硫酸氢钾水溶液、2％碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，产生目标化合物51，其不经进一步纯化用于下一步骤中。
步骤3.6：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(52)
向0℃、氩气下的化合物51(25.2mmol)在无水DMF(240mL)中的溶液依次分份加入氢化钠(60％在油中的悬浮液,1.5g,37.8mmol)和苄基溴(7.5mL,63.0mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，并冷却至0℃，然后加入甲醇。将混合物在真空中浓缩，用DCM稀释并用水洗涤两次。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，产生目标化合物52，其不经进一步纯化用于下一步骤中。
步骤3.7：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(53)
向0℃、氩气下的化合物52(25.2mmol)在无水THF(1L)中的溶液依次加入乙酸(43mL,0.75mol)和1M TBAF的THF溶液(756mL,0.75mol)。将混合物在室温下搅拌过夜并冷却至0℃，然后加入乙酸(7.4mL,0.126mol)和1M TBAF的THF溶液(126mL,0.126mol)。将混合物在室温下再搅拌5h，并在真空中浓缩。残留物溶解于DCM并用水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩，得到的残留物通过在硅胶(甲苯/EtOAc 1/0至4/1)上进行快速色谱法纯化，产生21.3g(94％收率)目标化合物53。
SFC-MS(方法10)m/z 918.4[(M+Na)+]；RT＝4.84和4.94min
步骤3.8：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(54)
根据在步骤1.9中描述的程序处理化合物53(17.9g,20.0mmol)，产生作为无色油状物的目标化合物54，其不经进一步纯化用于下一步骤中。
步骤3.9：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(55)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物54(20.0mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/EtOAc 1/0至7/3)上纯化后，产生12.6g(2步收率为71％)目标化合物55。
LC-MS(方法4)m/z 910.4[(M+Na)+]；RT＝3.46min
方案7
步骤3.10：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(56)
根据在步骤1.11中描述的程序使化合物53(2.83g,3.15mmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(0.94mL,4.10mmol)和化合物55(2.0g,2.25mmol)反应，经快速色谱法(甲苯/EtOAc 1/0至4/1)纯化后，产生3.49g(82％收率)目标化合物56，为白色泡沫。
LC-MS(方法5)m/z 1915.5[M+NH4]+；RT＝14.61min
方案8
步骤3.11：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-D-核糖醇(57)
根据在步骤1.12中描述的程序处理化合物56(7.73g,4.0mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/EtOAc 1/0至4/1)上纯化后，产生6.29g(86％收率)目标化合物57。
LC-MS(方法11)m/z 1822.5[(M+Na)+]；RT＝29.16min
步骤3.12：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(58)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物56(0.95g,0.50mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/丙酮9/1至3/2)上纯化后，产生0.56g(62％收率)目标化合物58。
SFC-MS(方法9)m/z 1814.5[M+Na]+；RT＝9.76min
步骤3.13：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-乙酰丙酰基-D-核糖醇(59)
根据在步骤1.11中描述的程序偶联化合物57(2.33g,1.29mmol)和化合物58(1.93g,1.08mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/EtOAc 1/0至1/3)上纯化后，产生3.15g(79％收率)目标化合物59。
LC-HRMS(方法7)：C205H222N15O45P3m/z计算为[M+H]+3709.49，实测为3709.48；RT＝8.22min
步骤3.14：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-D-核糖醇(60)
根据在步骤1.12中描述的程序处理化合物59(12.39g,3.34mmol)，通过在硅胶(甲苯/EtOAc 1/0至3/7)上进行快速色谱法以及在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，产生9.65g(82％收率)目标化合物60。
LC-HRMS(方法7)：C200H216N15O43P3m/z计算为[M+2H]2+1806.23，实测为1806.15；RT＝8.19min
方案9
步骤3.15.3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇(61)
根据在步骤1.11中描述的程序使化合物53(3.4g,3.79mmol)与氯-2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(2.1mL,9.49mmol)和N-(2-羟基乙基)氨基甲酸苄酯(3.7g,18,95mmol)反应，经快速色谱法在硅胶(甲苯/EtOAc 1/0至4/1)上纯化后，产生2.97g(65％收率)目标化合物61，为白色泡沫。
LC-MS(方法1)m/z 1228.2[(M+Na)+]；RT＝12.39min
步骤3.16：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(62)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物61(3.56g,2.95mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/丙酮4/1至7/3)上纯化后，产生3.10g(85％收率)目标化合物62。
LC-MS(方法1)m/z 1122.2[(M+Na)+]；RT＝11.59min
步骤3.17：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(63)
根据在步骤1.11中描述的程序偶联化合物60(1.79g,0.50mmol)和化合物62(0.60g,0.54mmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/丙酮1/0至3/2)上纯化后，产生1.85g(77％收率)目标化合物63。
LC-HRMS(方法7)：C262H284N21O59P5m/z计算为[M+2H]2+2413.94，实测为2413.86；RT＝8.49min
步骤3.18：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(64)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物63(568mg,118μmol)，产生411mg(74％收率)目标化合物64。
ESI HRMS：C255H278N21O58P5m/z计算为[M+2Na]2+2382.90，实测为2382.86
SFC(方法9)：RT＝13.40min
步骤3.19：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-5-O-(4-甲氧基苯基)-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(65)
根据在步骤1.11中描述的程序偶联化合物60(430mg,119μmol)和化合物64(469mg,99μmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/丙酮9/1至7/3)上纯化后，产生225mg(27％收率)目标化合物65。
LC-HRMS(方法7)：C458H496N37O103P9m/z计算为[M+2H]2+4223.63，实测为4223.72；RT＝9.27min
步骤3.19：3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-叠氮基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(66)
根据在步骤1.10中描述的程序处理化合物65(566mg,67.1μmol)，经快速色谱法在硅胶(甲苯/丙酮9/1至3/2)上纯化后，产生445mg(80％收率)目标化合物66。
LC-HRMS(方法7)：C451H490N37O102P9m/z计算为[M+3H]3+2780.75，实测为2780.43；RT＝9.21min
方案10
步骤3.20：3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷酰基]-D-核糖醇(67)
根据在步骤1.22中描述的程序处理化合物66(440mg,52.8μmol)，通过在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，产生401mg(90％收率)目标化合物67。
步骤3.21：3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2,4-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇]-2,4-二-O-苄基-1-O-[铵次膦酸基]-D-核糖醇}-2,4-二-O-苄基-1-O-[(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙氧基)(铵次膦酸基)]-D-核糖醇(68)
根据在步骤1.21中描述的程序处理化合物67(401mg,47.3μmol)，通过在
LH-20(DCM/MeOH 1/1)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，产生368mg(97％收率)目标化合物68。
LC-HRMS(方法7)：C442H490N10O111P9m/z计算为[M+12H]3+2669.73，实测为2669.69；RT＝8.73min
步骤3.22：3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-氨基乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(69)
根据在步骤1.23中描述的程序处理化合物68(232mg,28.4μmol)，通过在
G25(0.2NaCl)上然后在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法以及通过制备型离子型Dionex色谱法，然后通过在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，产生54mg(50％收率)目标化合物69。
ESI HRMS：C119H214N10O109P9m/z计算为[M+2H+2Na]5-770.98，实测为770.99
步骤3.23：3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-[3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-5-O-{3-O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇]-1-O-[钠次膦酸基]-D-核糖醇}-1-O-[(2-[(4-肼基-4-氧代丁酰基)氨基]乙氧基)(钠次膦酸基)]-D-核糖醇(3)
根据在步骤2.16中描述的程序处理化合物69(50mg,12.5μmol)产生中间体，向其中加入水合肼(0.50mL,5.73mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后在
G25柱(水)上洗脱。将目标化合物3和活化的酯的混合物在真空中浓缩，用水(3mL)稀释，并在室温下与水合肼(0.32mL,3.63mmol)反应2h。通过在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法、通过制备型离子型Dionex色谱法、然后通过在
G25(水)上进行尺寸排阻色谱法纯化后，冻干后得到25mg(53％)目标化合物3，为白色固体。
ESI HRMS：C123H220N12O111P9m/z计算为[M+3H+Na]5-789.40，实测为789.40
CE(方法8b)：MW＝5.65min
III)八聚体和九聚体缀合物的制备和表征
将根据实施例1(β(1,4)八聚体)、2(α(1,4)八聚体)和3(β(1,3)九聚体)中描述的方法生产的合成寡糖中的每一个与rEPA和EDAC混合，以在150mM NaCl 50mM MES缓冲液(pH5.7)中分别获得最终浓度为5mg/mL、1mg/mL和50mM。将混合物在室温下孵育3小时。将获得的每种缀合物通过尺寸排阻色谱法在Superdex 75凝胶上纯化，以使其与未缀合的蛋白质和未缀合的合成寡糖分离。然后在PBS中配制缀合物用于免疫原性测试。
表征缀合物的糖与蛋白质的比率和大小。使用与TSKgel G3000柱组合的TDA301Viscotek HPSEC系统测定每种缀合物的摩尔质量。将100μL每种溶液注入到柱中，并用0.2M磷酸盐缓冲液pH 6.9以0.5mL/min的流速洗脱。通过OmniSEC 4.2软件计算每种缀合物的Mw(以kDa计)。通过SDS-PAGE证实不存在未缀合的蛋白质。下表总结了合成寡糖缀合物的特征。
ND：未测定
IV)来自细菌菌株的天然多糖(磷壁酸)的提取、纯化和表征
将为100％β(1-4)菌株的Wood 46金黄色葡萄球菌菌株(ATCC 10832)、为100％α(1-4)菌株的Newman D2C金黄色葡萄球菌菌株(ATCC 25904)和为100％β(1-3)菌株的引用编号ATCC 55804的金黄色葡萄球菌菌株在TSB中培养过夜。然后通过用苯酚-乙醇(1:1，v/v)处理使每种菌株的整个培养物失活，达到2％的最终浓度。通过在5,000g和+4℃下离心1小时，从培养肉汤中分离失活的金黄色葡萄球菌细胞。弃去上清液并将细胞团悬浮于0.05MTris、2mM MgSO4pH 7.5(0.5g湿重/mL)中。加入溶葡萄球菌素(5mg/mL，在水中)至最终浓度为100μg/mL，并将反应混合物在37℃下搅拌孵育3小时。随后分别加入100mM MgCl2和benzonase(2.5UI/mL)至最终浓度分别为1mM和50UI/mL，并在37℃下搅拌孵育4小时。最后，将Tris缓冲液的浓度调节至50mM，并加入CaCl2和链霉蛋白酶至终浓度分别为1mM和0.5mg/mL。将反应混合物在37℃孵育16小时，随后在8,000g和4℃下离心30min。
将CaCl2粉末加入到上清液中至最终浓度为10mM，反应混合物用25％乙醇沉淀，并在+4℃下搅拌16小时。离心(8,000g，15min)后，弃去沉淀物。在10mM CaCl2的存在下用75％乙醇沉淀上清液并在+4℃下搅拌4小时。通过以8,000g离心30分钟使75％乙醇沉淀物沉淀并且重新溶于水中。在室温下使该溶液对水充分透析。
加入1M Tris缓冲液pH 7.0至终浓度为50mM，并加载到Q Sepharose柱上。使用0-0.5M NaCl在50mM Tris缓冲液pH 7.0中的线性梯度，使磷壁酸(TA)与其余物分离。将通过使用HPAEC-PAD的核糖醇测定法检测的含有磷壁酸的级分合并，在室温下对水充分透析并冷冻干燥。
在48％氢氟酸(HF)和2M三氟乙酸(TFA)水解后，通过HPAEC(高pH阴离子交换色谱法)分析TA的单糖组成，其表明如预期的那样，针对这3种结构存在摩尔比为1：1的核糖醇和葡糖胺。
纯化的TA的质子核磁共振谱与包含其中核糖醇的位置4或3被N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)取代的1,5-聚(核糖醇磷酸酯)聚合物的TA的结构一致。根据公布的数据，如图1至3所示，它们各自的单个端基质子的化学位移表明，Newman D2C菌株的TA的核糖醇残基上的GlcNAc部分的端基异构状态和位置是GlcNAcα(1,4)(5.07ppm)，Wood 46菌株的TA的核糖醇残基上的GlcNAc部分的端基异构状态和位置是GlcNAcβ(1,4)(4.75ppm)，并且菌株ATCC55804(PS336)的TA的核糖醇上的GlcNAc部分的端基异构状态和位置是GlcNAcβ(1,3)(4.66ppm)。
使用与TSKgel G3000柱组合的TDA301Viscotek HPSEC系统测定每种纯化的TA的摩尔质量。在水中制备浓度为2mg/mL的每种纯化的磷壁酸的溶液。将100μL每种溶液注入到柱中，用0.2M磷酸盐缓冲液pH 6.9以0.5mL/min的流速洗脱。通过OmniSEC 4.2软件计算Mw和Pd(按照公式Mw/Mn计算多分散性；其中Mn是数均摩尔质量，Mw是重均摩尔质量)。三种纯化多糖的摩尔质量分布很窄，如低的多分散性值(Pd＝1.1)所反映的。α-连接的GlcNAc TA和β-连接的GlcNAc TA的Mw是相同的，大约是18,000g/mol。由于TA重复单元的摩尔质量为438g/mol，每种聚合物中重复单元的数目约为40。
V)天然多糖(磷壁酸)缀合物的制备和表征
使用连接剂己二酸二酰肼(ADH)，将如段落IV中所述的纯化的TA与作为载体蛋白质的rEPA或脱毒的双突变金黄色葡萄球菌α毒素(HladM)偶联。首先，TA用ADH衍生化。多糖以10mg/mL溶于200mM NaCl中。加入900mM ADH的水溶液以获得500mM的最终浓度，并用1MHCl将pH调节至5.7。加入1M EDAC的水溶液以获得100mM的最终浓度，并且在室温下将pH保持在5.7达3小时。用0.5M NaOH将pH调节至7.0。将反应混合物在室温下对0.5M NaCl透析2天，其中7次替换，然后对水透析3天，其中4次替换，并冷冻干燥。使用缩略语TA-AH命名ADH衍生化的TA。通过TNBS比色测定法测量ADH的衍生化(Snyder and Sobocinski(1975),Anal.Biochem.64pp：284-288)。TA的ADH衍生化范围为2.3至4.3％(w/w)。
在150mM NaCl 50mM MES缓冲液pH 5.7中，将TA-AH与rEPA和EDAC混合至最终浓度分别为4mg/mL、4mg/mL和50mM。将混合物在室温下孵育3小时。
然后通过Sepharose 6BCl凝胶上进行尺寸排阻色谱法纯化所获得的每种缀合物，以将其与未缀合的蛋白质和未缀合的多糖分离。然后将缀合物在PBS中配制，用于免疫原性测试。表征缀合物的多糖与蛋白质的比率和大小。使用与TSKgel G3000柱结合的TDA301Viscotek HPSEC系统测定每种缀合物的摩尔质量。将100μL各溶液注入到柱中，用0.2M磷酸盐缓冲液pH 6.9以0.5mL/min的流速洗脱。通过OmniSEC 4.2软件计算Mw。通过胶束毛细管电泳(MEKC)核实不存在未缀合的TA。TA缀合物的特征总结在下表中。
VI)未缀合和缀合的糖的免疫原性的评价
VI-1)免疫方案
在远系繁殖的OF-1小鼠中，在不同的条件下测试了如段落I-V所述的基于糖和rEPA的缀合物的免疫原性。测试了以下形式的糖(在PBS溶液中：磷酸盐10mM，NaCl 200mM，pH＝7.2)：
-与连接剂ADH连接的未缀合的合成寡糖：β(1,4)八聚体-AH(化合物1)；α(1,4)八聚体-AH(化合物2)和β(1,3)九聚体-AH(化合物3)，
-与ADH连接的未缀合的天然TA：β(1,4)TA-AH；α(1,4)TA-AH和β(1,3)TA-AH，
-经由该连接剂与rEPA缀合的合成寡糖：β(1,4)八聚体-AH-rEPA；α(1,4)八聚体-AH-rEPA和β(1,3)九聚体-AH-rEPA，和
-经由ADH连接剂与rEPA缀合的天然TA：β(1,4)TA-AH-rEPA；α(1,4)TA-AH-rEPA和β(1,3)TA-AH-rEPA)。
在所有免疫方案中，对OF1小鼠施用相当于5μg糖的量的待测试化合物。在D0、D21和D35天，将剂量经由SC途径施用在肩胛骨区域。对用非缀合的糖免疫的小鼠也给予每剂寡糖9μg rEPA，这是在用缀合的糖免疫的小鼠组中每只小鼠注射的rEPA的量的范围内。根据要进行的测试，在存在或不存在作为Th1佐剂的AF04的情况下评估糖(非缀合的或与rEPA缀合的)的免疫原性。对于单独用AF04佐剂(作为阴性对照)或与在AF04的存在下用待测试化合物免疫的小鼠组，进行的方法如下：AF04，一种含有TLR4激动剂的基于角鲨烯的水包油(O/W)乳剂，根据WO 2007/080308中所述的方法获得。简单来说，在第一步中，根据WO 2007/080308的实施例1中所述的方案，制备浓缩的热可逆性基于角鲨烯的O/W乳剂。然后将浓缩的O/W乳剂在PBS溶液中稀释以获得乳剂中5％的角鲨烯浓度，其组成如下：角鲨烯：50mg/mL；Ceteareth-12(Emulgin B1)：9.5mg/mL；脱水山梨糖醇单油酸酯(Dehymuls SMO)：7.4mg/mL，甘露醇：9mg/mL，E6020：40μg/mL。然后在施用于小鼠前将该稀释的O/W乳剂与待测试免疫原性的化合物的溶液或与PBS(对于单独用AF04免疫的小鼠的阴性对照组)按体积与体积比混合，使得每次注射给予每只小鼠在2.5％基于角鲨烯的O/W乳剂中量为4μg的E6020。
VI-2)未缀合和缀合的糖诱导的抗体应答分析
对于每只小鼠，从在D0、D21、D35和D42天采集的血液样品收集血清并储存在-20℃直至使用。通过ELISA使用与ADH连接的相应磷壁酸(TA-AH)作为涂布剂，评估针对用于免疫方案中的糖的抗体应答水平。例如，当免疫方案中使用的糖是β(1,3)九聚体-AH-rEPA时，在ELISA中使用β(1,3)AT-AH作为涂布剂。简单来说，通过在+4℃用100μL/孔的1.5μg/mL在碳酸盐缓冲溶液(pH：9.6)中的TA-ADH涂覆ELISA板(Dynex Ref：655071)过夜，然后用饱和缓冲液(PBS/吐温0.05％/牛血清白蛋白1％)(100μL/孔)进行饱和步骤,来进行ELISA。然后将待测试血清在饱和缓冲液中的系列稀释液加入到孔中。在37℃孵育90min，然后连续洗涤后，向每孔加入100μL根据所测量的Ig的种类在饱和缓冲液中按需稀释的偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠Ig溶液。在37℃下再孵育90min，然后连续洗涤后，使用众所周知的四甲基联苯胺底物测量酶反应强度，其反映每孔固定的抗小鼠Ig的量。在450和650nm下测量吸光度。使用Softmax Pro软件，将抗体滴度表示为对应于OD450nm＝1倒数血清稀释度的任意单位。通过生物统计分析测定ELISA测定的阈值为1.3Log。
VI-3)结果
在第一系列测试中，在用缀合或未缀合的β(1,3)糖免疫的小鼠中评估缀合的重要性以及佐剂的作用，其中GlcNAc残基全部都在核糖醇基团的β(1,3)位。
下表列出了进行测试的小鼠组。
| 组名称 | 测试的组合物 |
| 336缀合物 | β(1,3)TA-ADH-rEPA |
| 336缀合物+AF04 | β(1,3)TA-AH-rEPA+AF04 |
| 合成九聚体缀合物 | β(1,3)九聚体-AH-rEPA |
| 合成九聚体缀合物+AF04 | β(1,3)九聚体-AH-rEPA+AF04 |
| rEPA+九-AH+AF04 | β(1,3)九聚体-AH+rEPA+AF04 |
| rEPA+336-AH+AF04 | β(1,3)TA-AH+rEPA+AF04 |
| AF04 | AF04 |
| PBS | PBS |
图4中显示的结果清楚地表明：
1)未缀合的β(1,3)糖无论其来源如何(合成的或天然的)，都不能诱导针对糖的特异性免疫应答。由于与AF04一起配制的未缀合的β(1,3)糖仍然不能触发特异性免疫应答，因此AF04没有作用。
2)相比之下，缀合的β(1,3)糖无论糖的来源如何(合成的或天然的)，都能够在第二次免疫后诱导针对糖的特异性免疫应答，所述免疫应答在第三次免疫后甚至更强(指示载体蛋白质的“增强效应”)。当β(1,3)糖缀合物与AF04一起配制时，抗体应答增加。由合成的β(1,3)九聚体缀合物(与或不与AF04一起配制)诱导的抗体应答类似于由336缀合物诱导的抗体应答。
在第二系列测试中，在用缀合的或未缀合的β(1,4)糖(其中GlcNAc残基全部都在核糖醇基团上的β(1,4)位)免疫的小鼠中以及在用缀合的或未缀合的α(1,4)糖(其中GlcNAc残基全部都在核糖醇基团上的α(1,4)位)免疫的小鼠中，测试与载体蛋白质缀合的重要性。所有测试的组合物都与AF04一起配制。
下表列出了进行测试的小鼠组。
| 组名称 | 测试的组合物 |
| TAα(1,4)+rEPA | α(1,4)TA-AH+rEPA+AF04 |
| TAβ(1,4)+rEPA | β(1,4)TA-AH+rEPA+AF04 |
| 八聚体α(1,4)-rEPA | α(1,4)八聚体-AH-rEPA+AF04 |
| TAα(1,4)-rEPA | α(1,4)TA-AH-rEPA+AF04 |
| 八聚体β(1,4)-rEPA | β(1,4)八聚体-AH-rEPA+AF04 |
| TAβ(1,4)-rEPA | β(1,4)TA-AH-rEPA+AF04 |
| AF04 | AF04 |
图5中显示的结果清楚地表明：
1)未缀合的β(1,4)糖以及未缀合的α(1,4)糖(合成的或天然的)即使在AF04的存在下也不能诱导针对糖的特异性免疫应答；3次免疫后的抗体应答水平与在AF04阴性对照组中观察到的抗体应答水平相同。
2)相比之下，如先前所示，β(1,4)糖缀合物和α(1,4)糖缀合物无论糖的来源如何(合成的或天然的)，都能够诱导针对相应糖的特异性免疫应答。合成的β(1,4)-八聚体缀合物[β(1,4)八聚体-AH-rEPA)]与半合成的β(1,4)-八聚体缀合物[β(1,4)TA-AH-rEPA]一样具有免疫原性，但比合成的α(1,4)-八聚体聚合物[α(1,4)八聚体-AH-rEPA]更具免疫原性。
VII)用缀合的α(1,4)糖、缀合的β(1,4)糖或缀合的β(1,3)糖免疫的小鼠的免疫血
清的交叉反应性研究。
然后通过流式细胞术对用缀合的α(1,4)糖[α(1,4)八聚体-AH-rEPA或α(1,4)TA-AH-rEPA]、缀合的β(1,4)糖[β(1,4)八聚体-AH-rEPA或β(1,4)TA-AH-rEPA]或缀合的β(1,3)糖[β(1,3)九聚体-AH-rEPA或β(1,3)TA-AH-rEPA]免疫的小鼠的免疫血清测试其识别表达结构不同的TA的多种金黄色葡萄球菌菌株的能力。使用了段落VI-1)中描述的免疫方案，除了所有测试的免疫原都与AF04一起配制外。还引入了单独用AF04免疫的一组小鼠并用作“阴性对照组”(未示出)。在D42天收集每组小鼠(每组包括至少5只小鼠)的免疫血清，汇集，并通过流式细胞术针对实施例第1段中描述的19株金黄色葡萄球菌菌株组进行测试。
将菌株在Difco胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)(Beckton Dickinson-编号：211825)中在37℃、温和搅拌(110rpm)下培养20h。离心各培养物的等分试样后，用PBS-1％BSA免疫荧光(IF)缓冲液洗涤，将各细菌悬浮液在IF缓冲液中调节至108CFU/mL。为了避免金黄色葡萄球菌菌株表面上表达的蛋白质A产生的非特异性信号，将约108CFU的每种细菌悬浮液在37℃、振摇下与100μg/mL豚鼠IgG溶液(Bioscience，编号006-000-003)一起孵育1小时。离心然后用IF缓冲液洗涤，将20μL 108CFU/mL细菌悬浮液移液转移到96孔板(Ritter-参考：539034)的孔中。然后将20μL每种汇集免疫血清的10倍稀释液(“测试样品”)或“阴性对照”的汇集血清加入到孔中。对所有血清均一式两份地进行测试。在37℃、搅拌(200rpm)下孵育1小时后，将孔用400μL IF缓冲液洗涤两次。然后将每孔中的细菌沉淀物用100μL稀释于IF缓冲液中的藻红蛋白标记的山羊抗小鼠F(ab’)2IgG(Southern Biotech-编号：1032-09)的稀释溶液重悬浮。将仅含有Ig-处理的细菌悬浮液的几个孔用作“对照”，并用100μL IF缓冲液(“细菌”对照)或用100μL相同的藻红蛋白标记的山羊抗小鼠F(ab’)2IgG(Southern Biotech-编号：1032-09)的稀释溶液(“抗体”对照)重悬浮。在37℃、搅拌(200rpm)下孵育1小时后，用～400μL IF缓冲液将孔洗涤两次，然后用500μL IF缓冲液重悬浮以用于FACS分析。对于测试的每种免疫血清，基于荧光和散射参数的分析，以直方图的形式使数据可视化。对于每个直方图，然后通过软件计算荧光强度的几何平均值(MFI)。然后根据一式两份测试的“测试样品”提供的两个MFI的平均值与“阴性对照组”血清提供的两个MFI的平均值之间的比率，计算每个测试样品的“比值”。高于2的比值被认为是阳性的并且意味着测试的汇集免疫血清识别在孔中沉积的金黄色葡萄球菌的菌株。比值越高，测试的汇集免疫血清对金黄色葡萄球菌菌株的识别越强。
上表和图6中显示的结果非常清楚地表明：
与来自用半合成的缀合物[α(1,4)TA-AH-rEPA、β(1,4)TA-AH-rEPA和β(1,3)TA-AH-rEPA]各自免疫的小鼠的汇集免疫血清相比，来自用合成的缀合物[α(1,4)八聚体-AH-rEPA、β(1,4)八聚体-AH-rEPA和β(1,3)九聚体-AH-rEPA]免疫的小鼠的汇集免疫血清更强地识别金黄色葡萄球菌的同源和异源菌株。
与来自用合成的β(1,3)九聚体缀合物[β(1,3)九聚体-AH-rEPA]免疫的小鼠的汇集免疫血清相比，来自用合成的β(1,4)八聚体缀合物[β(1,4)八聚体-AH-rEPA]或合成的α(1,4)八聚体缀合物[α(1,4)八聚体-AH-rEPA]免疫的小鼠的汇集免疫血清识别更广泛的金黄色葡萄球菌菌株组。用合成的β(1,3)九聚体缀合物免疫的小鼠的汇集免疫血清几乎仅识别同源的100％β(1-3)菌株(在测试的五株100％β(1-4)菌株中仅有一株100％β(1-4)菌株以及在测试的七株“混合α(1-4)和β(1-4)”菌株中仅有一株“混合α(1-4)和β(1-4)”菌株观察到略高于2的比值)。相比之下，来自用合成的β(1,4)八聚体缀合物免疫的小鼠和来自用合成的α(1,4)八聚体缀合物免疫的小鼠的汇集免疫血清广泛地“交叉反应”，因为它们识别几乎测试的全部金黄色葡萄球菌菌株。如图6所示，它们识别100％β(1-3)菌株、100％β(1-4)菌株、100％α(1-4)菌株以及混合α(1-4)和β(1-4)菌株。与来自用合成的α(1,4)八聚体缀合物免疫的小鼠的汇集免疫血清相比，用合成的β(1,4)八聚体缀合物免疫的小鼠的汇集免疫血清更强地识别金黄色葡萄球菌菌株，具有更高的比值。
总之，使用包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元的糖的缀合物(其中所有的核糖醇残基都在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述GlcNAc残基仅为端基异构体构型α或端基异构体构型β)有助于减少待在金黄色葡萄球菌疫苗中组合的抗原的数目。如图6所示，两种缀合物中的每一种都诱导识别几乎测试的全部金黄色葡萄球菌菌株的交叉反应性抗体。为了使用荚膜多糖缀合物作为免疫原获得类似识别模式，需要使用PS5缀合物、PS8缀合物和包含1,5核糖醇磷酸酯单元的糖的缀合物，其中所有的核糖醇残基均在3位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代并且为端基异构体构型β。
VIII)在小鼠中比较β(1,4)TA-HladM和β(1,4)TA-rEPA缀合物的免疫原性
在远系繁殖的OF-1小鼠(Charles River Laboratories；年龄：在D0天时为7周龄；性别：雌性)中测试了如段落V中所述的纯化的天然β(1,4)TA-HladM和β(1,4)TA-rEPA缀合物的免疫原性。将小鼠分成4组，每组30只小鼠(每组接受的组合物参见下表)。对于所有的组，小鼠在D0、D21和D35天经由SC途径(0.2mL/注射)注射，在第一次注射时注射至右侧腹中，在第二次注射时注射至左侧腹中，以及在第三次注射时注射至肩胛骨束中。施用的佐剂(其不同于实施例VI中施用的佐剂AF04)是包含TLR4激动剂E6020(E6020描述于WO 2007/005583)的氢氧化铝盐。通过乙醇注射法制备E6020脂质体，然后将其吸附到氢氧化铝上，并在PBS和Tris缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，88mM磷酸盐，pH 7.4)的混合物中稀释。使用PBS溶液中的测试组合物按体积对体积稀释佐剂，使得施用于小鼠的佐剂化组合物含有240μg铝和4μg E6020。组2至4中的小鼠各自还接受相同的与下表中列出的组合物组合的额外蛋白质的混合物。在D45天在在下颌下区域麻醉下收集血液样品。通过将小鼠维持在具有异氟烷气体的隔室中3分钟来进行麻醉。将约200μL的血液样品收集在含有凝块活化剂和血清分离剂(BD Microtainer SST，编号365951)的管中。将管以4000rpm离心15min以从血细胞中分离血清。将血清转移至Deepwell(ritter)中，并在+56℃下加热失活30min。将它们储存在–20℃下直到用于ELISA测试。
使用相关抗原作为包被抗原，通过ELISA从每个免疫组收集的血清汇集物，定量由测试组合物的每种组分产生的IgG1和IgG2抗体。简单来说，用100μL/孔的1.5μg/mL的相关抗原涂布板，并在+4℃保持过夜。用150μL缓冲液1(PBS/吐温0.05％/牛白蛋白1％)封闭游离部位，并在+37℃孵育60min后，将板清空。将血清在体积为100L的微孔板中的缓冲液1中连续稀释(12次)。将板在+37℃孵育90min，然后用缓冲液2(PBS/吐温0.05％)洗涤。将100μl稀释的抗小鼠IgG1或抗小鼠IgG2a过氧化物酶缀合物加入到每孔中。在+37℃孵育90min后，用缓冲液2洗涤板。通过在每个孔中加入100μL四甲基联苯胺底物溶液使反应显色。在室温下用HCl(1N)处理30分钟后化学停止反应，并在450-650nm下测量吸光度。使用SoftmaxPro软件，通过对应于OD＝1的稀释度的倒数，以任意ELISA单位/mL表示结果。
在下表中显示了测试组合物的每种组分的体液应答(如通过ELISA定量的IgG1和IgG2a抗体)。
β(1,4)TA抗体应答
| 组 | IgG1 | IgG2a |
| 1 | 1.70 | 1.70 |
| 3 | 5.17 | 4.32 |
| 4 | 5.25 | 4.47 |
HladM抗体应答
| 组 | IgG1 | IgG2a |
| 1 | 4.17 | 3.99 |
| 2 | 6.13 | 6.25 |
| 3 | 6.10 | 5.94 |
rEPA抗体应答
| 组 | IgG1 | IgG2a |
| 1 | 1.70 | 1.70 |
| 4 | 5.39 | 5.15 |
这些数据证明，测试的缀合物能够在小鼠中诱导稳健且特异的抗磷壁酸抗体应答，而不管磷壁酸是否与作为载体蛋白质的rEPA或HladM缀合。此外，这些数据证明，当用基于明矾的佐剂作为段落VI中描述的基于角鲨烯的水包油乳剂佐剂(AF04)的替代物进行佐剂化时，测试的磷壁酸缀合物能够在小鼠中诱导抗体应答。
α-溶血素(Hla)中和
当与天然α-溶血素一起预孵育时，基于对兔红血细胞(RRBC)的溶血的中和，来确定小鼠血清的α-溶血素中和滴度。简单来说，将25ng纯化的天然Hla在室温下与从用上表中所述的组合物免疫的小鼠获得的不同浓度的血清一起预孵育。以1:10的最终起始浓度测试血清，并进行两倍的连续稀释，然后在+37℃下与1.107兔红细胞一起孵育30min。孵育后，将样品在800g+4℃(加速9，减速9)下离心3分钟。在VersamaxTM板读数器(Molecular Devices)中在405nm测定上清液中的吸光度。在每次运行期间在测定中还包括标准对照兔多克隆抗体抗-Hla(Sigma,S7531)。Hla中和滴度被定义为导致50％的Hla毒性抑制的血清最高稀释度的倒数。
结果显示在下表中。
从上表可以看出，由含有HladM(组2)或HladM-TAβ1-4(组3)的所有组合物产生的抗体能够中和天然毒素的溶血活性。此外，在含有HladM或HladM-TAβ1-4的组合之间未观察到中和抗体滴度的显著差异，表明HladM与磷壁酸的缀合不影响缀合物的HladM部分诱导能够中和天然Hla的特异性抗-Hla抗体的能力。
Claims (47)
1.与载体蛋白质共价结合的糖的缀合物，其中所述糖包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中所有的所述核糖醇残基都在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，并且其中所述载体蛋白质为所述缀合物提供至少一个被T辅助淋巴细胞识别的表位。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体蛋白质包含至少一个为T辅助表位的氨基酸链。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述糖由1,5核糖醇磷酸酯的重复单元组成，其中所有的所述核糖醇残基都在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β。
4.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述糖是从金黄色葡萄球菌(S.aureus)的细胞壁提取的。
5.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述糖是通过化学合成得到的。
6.根据权利要求1所述的缀合物，其中所有的所述重复单元都具有以下结构或其盐：
其中：
R独立地是H或D-Ala，并且各重复单元的R可以彼此不同，并且
所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型α。
7.根据权利要求1所述的缀合物，其中所有的所述重复单元都具有以下结构或其盐：
其中：
R独立地是H或D-Ala，并且各重复单元的R可以彼此不同，并且
所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基为端基异构体构型β。
8.根据权利要求6所述的缀合物，其中R是H。
9.根据权利要求7所述的缀合物，其中R是H。
10.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述重复单元的数目为≥4。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中所述重复单元的数目为4至14。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述重复单元的数目等于6、7、8、9、10、11或12。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述载体蛋白质连接至所述糖的末端磷酸酯。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述糖经由接头与所述载体蛋白质共价结合。
15.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述糖经由接头与所述载体蛋白质共价结合。
16.根据权利要求14所述的缀合物，具有以下结构或这些结构之一的盐：
或
其中：
所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β；
n为≥4；并且
L是接头。
17.根据权利要求16所述的缀合物，其中n为4至14。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其中n为6、7、8、9、10、11或12。
19.根据权利要求16所述的缀合物，具有以下结构或这些结构之一的盐：
或
其中：
所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β；
并且n为≥4。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中n为4至14。
21.根据权利要求20所述的缀合物，其中n为6、7、8、9、10、11或12。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的缀合物，其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型β。
23.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其包含小于5％w/w的肽聚糖。
24.根据权利要求23所述的缀合物，其包含0％(w/w)的肽聚糖。
25.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述载体蛋白质是脱毒的细菌毒素。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述脱毒的细菌毒素是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外蛋白A。
27.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述脱毒的细菌毒素是金黄色葡萄球菌的α溶血素。
28.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中所述糖和所述载体蛋白质之间的重量比为0.1至10。
29.一种组合物，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的缀合物以及佐剂。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述佐剂是TLR4激动剂。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述TLR4激动剂与递送体系组合。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述递送体系为水包油乳剂或铝盐。
33.根据权利要求30所述的组合物，其中所述TLR4激动剂是E6020(CAS编号：287180-63-6)。
34.根据权利要求29所述的组合物，其中所述佐剂是Th1、Th17和/或Th1/Th17佐剂。
35.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物或根据权利要求29至34中任一项所述的组合物，其中所述缀合物诱导抗体的产生，所述抗体结合以ATCC 55804保藏的金黄色葡萄球菌336型菌株、以ATCC编号10832保藏的金黄色葡萄球菌Wood 46菌株和以ATCC编号25904保藏的Newman D2C菌株。
36.一种用于制备权利要求1至28中任一项所述的缀合物的方法，包括：
a)提供包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成的糖，其中所有的所述核糖醇残基都在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，其中所述糖如权利要求1至12中任一项所定义；
b)提供载体蛋白质；
c)用连接剂衍生化所述糖并将衍生化的糖与所述载体蛋白质偶联，或者可选地，用连接剂衍生化所述载体蛋白质并将衍生化的载体蛋白质与所述糖偶联以获得所述缀合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中使用二酰肼衍生化所述糖，或者其中使用二元活化的二酯衍生所述糖，然后用肼处理。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述二酰肼为己二酸二酰肼。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述二元活化的二酯为二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯。
40.一种用于制备权利要求1至28中任一项所述的缀合物的方法，包括：
a)提供包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元或由其组成的糖，其中所有的所述核糖醇残基都在4位被N-乙酰基D-葡糖胺基残基取代，并且其中所述N-乙酰基D-葡糖胺基残基仅为端基异构体构型α或仅为端基异构体构型β，其中所述糖如权利要求1至12中任一项所定义；
b)提供载体蛋白质；
c)用第一连接剂衍生化所述糖；
d)用第二连接剂衍生化所述载体蛋白质；以及
e)将所述衍生化的糖与所述衍生化的载体蛋白质偶联以获得所述缀合物。
41.如权利要求40所述的方法，其中用于衍生化所述糖的连接剂是半胱氨酸、半胱胺或胱胺，并且用于衍生化所述载体蛋白质的连接剂是γ-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)或琥珀酰亚胺基-3(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
42.如权利要求36至41中任一项所述的方法，还包括向所述缀合物加入佐剂以形成组合物。
43.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1至28中任一项所述的缀合物或权利要求29至34中任一项所述的组合物，用于在具有金黄色葡萄球菌感染风险的个体中诱导抗金黄色葡萄球菌菌株的交叉反应性抗体的方法，其中所述方法包括将所述组合物施用于所述个体。
44.如权利要求43所述使用的组合物，其中所述交叉反应性抗体结合金黄色葡萄球菌336型菌株。
45.如权利要求44所述使用的组合物，其中所述交叉反应性抗体结合以ATCC编号55804保藏的金黄色葡萄球菌336型菌株。
46.如权利要求43至45中任一项所述使用的组合物，其中所述交叉反应性抗体还结合以ATCC编号10832保藏的金黄色葡萄球菌的Wood 46菌株和以ATCC编号25904保藏的金黄色葡萄球菌的Newman D2C菌株。
47.一种组合物在制备药物中的用途，所述药物用于通过诱导抗金黄色葡萄球菌菌株的交叉反应性抗体来预防和/或治疗个体中的金黄色葡萄球菌感染，其中所述组合物包含根据权利要求1至28中任一项所述的缀合物或权利要求29至34中任一项所述的组合物。
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