JP2021519596A - フェリチンタンパク質 - Google Patents

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Abstract

表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、システインを含むＮもしくはＣ末端リンカー、および／または表面に露出したアミノ酸を介してフェリチンタンパク質に連結された１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分を含むフェリチンタンパク質を開示する。フェリチンタンパク質は、例えば非フェリチンポリペプチドに対する抗体の誘発に使用するために、非フェリチンポリペプチドをさらに含み、抗原性であり得る。【選択図】図１Ｄ

Description

本出願は、その各々の全内容が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，２１７号、２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，１９９号、２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，２０１号、２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，２１０号、および２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，２０４号の利益を主張する。
本出願は、配列表を含有し、それらはＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年３月２７日に作成され、名称は２０１９−０３−２７＿０１１２１−００３５−００ＰＣＴ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは１，１１５，９９２バイトである。
ワクチン学の分野での多くの成功にも関わらず、生命を脅かす多くの感染疾患からヒトを保護するために、新規打開策が必要である。現在認可されている多くのワクチンは、何十年も前の技術に依存して生弱毒化または不活化死菌ワクチンを産生しているが、これらは固有の安全性の懸念を有し、多くの場合、ごく短命な弱い免疫応答を刺激するに過ぎず、複数回用量の投与を必要とする。遺伝子工学および生化学工学の進歩により、難題である疾患標的に対する治療薬を開発することが可能となっているが、ワクチン学の分野へのこれらの応用は、まだ十分に実現されていない。
組換えタンパク質技術により、現在では改善された抗原性ポリペプチドの設計が可能となっている。加えて、ナノ粒子は、有効な抗原提示および標的化薬物送達に関する潜在性をますます証明している。フェリチン粒子は、その分子積み荷を多価で呈示することによって与えられる結合アビディティの増加、およびその微視的サイズにより生物学的障壁をより効率的に通過する能力を有することが示されている。インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に融合したヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））フェリチン粒子は、マウスインフルエンザモデルにおいて抗原安定性の改善および免疫原性の増加を可能にした（非特許文献１を参照されたい）。この融合タンパク質は、８面体の対称性ナノ粒子へと自己集合して８個の３量体ＨＡスパイク構造を提示し、アジュバントと共に使用する場合、様々な前臨床モデルにおいて強力な免疫応答を与える。しかし、これらの粒子は、自己アジュバント性ではなく、ＨＡより免疫原性が低いＨＡインフルエンザ以外のポリペプチドにとって適したプラットフォームとして使用することができるか否かは不明であった。
本明細書において、フェリチンを伴う１組の新規ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、方法、および使用を提示する。本明細書において、アジュバントのような免疫刺激性部分が、表面に露出したアミノ酸を介して、またはフェリチンと非フェリチンポリペプチドとの間のリンカーを介してフェリチンにコンジュゲートされた自己アジュバント性プラットフォームを記載する。抗原性フェリチンポリペプチドは、非フェリチンポリペプチドをフェリチンと組み合わせることによって生成された。免疫刺激性部分を、非フェリチンポリペプチドと組み合わせたフェリチンとコンジュゲートすると、免疫刺激性部分と非フェリチンポリペプチドとを単一の高分子実体として標的化同時送達することが可能となり、これによって抗原およびアジュバントのような免疫刺激性部分を個別の分子として含む従来のワクチンに関して懸念される全身毒性の可能性を大きく減少させることができる。免疫刺激性部分を非フェリチンポリペプチドと共に高分子実体として同時送達すること、およびフェリチン粒子上でそれが多価で提示されることもまた、必要なワクチンの全体的な用量を低減させ、製造負荷およびコストを低減させることができる。同様に、本明細書において呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザによる感染、およびライム病に対して免疫するために使用するための抗原性フェリチンポリペプチド、ナノ粒子、および組成物も開示される。
さらに、本明細書に開示されるポリペプチド、ナノ粒子、組成物、および使用は、特定の病原体に対する所望の免疫学的転帰に調和するように、病原体由来の非フェリチンポリペプチドと、特定のタイプの免疫応答を誘発することができる目的に合わせた免疫シグナルの同時送達を可能にする。一例は、血球凝集素（ＨＡ）に融合したフェリチンにコンジュゲートされたＴＬＲ７／８アゴニストによるＴｈ１型応答の誘導であり、これによってＦｃγＲと会合してＡＤＣＣ機構によりウイルス感染細胞を除去するうえでより有効であることが公知であるＩｇＧ２ａクラススイッチ抗体の産生がもたらされる（非特許文献２を参照されたい）。さらに、フェリチンにコンジュゲートされた免疫刺激性部分と非フェリチンポリペプチドとを単一の分子実体として同時送達することにより、免疫細胞の刺激が、非フェリチンポリペプチドの存在下で確実に起こることを保証することができる。これに対し、コンジュゲーションを伴わない同じ免疫刺激性分子の混合物は、全身分布をもたらし、一般的により高用量を必要とし、同様に、抗原が接触していない細胞における無差別の免疫刺激による望ましくない作用のリスクを有する。
本明細書において、例えば、第１および第２の非フェリチンポリペプチドを含むフェリチン重鎖および軽鎖を提供することによって、複数のポリペプチドをフェリチン粒子に組み入れるプラットフォームも記載する。このプラットフォームは、二価であり、例えば本明細書に記載する免疫刺激性部分のコンジュゲーションのようなフェリチン治療薬に関連する他の利点を有する単一の高分子実体を提供することができる。
Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｎａｔｕｒｅ ４９９：１０２〜１０６頁（２０１３） ＤｉＬｉｌｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０：１４３〜１５１頁（２０１４）
本開示の目的は、上記の利点の１つまたはそれ以上を提供することができる、または有用な選択を公共に少なくとも提供する組成物、キット、方法、および使用を提供することである。
実施形態１は、表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含むフェリチンタンパク質である。
実施形態２は、システインを含むＮまたはＣ末端リンカーを含むフェリチンタンパク質である。
実施形態３は、表面に露出したアミノ酸を介してフェリチンタンパク質に連結された１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分を含むフェリチンタンパク質である。
実施形態４は、非フェリチンポリペプチドをさらに含む抗原性フェリチンタンパク質である、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態５は、抗原性フェリチンタンパク質であって、（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異およびシステインに連結した免疫刺激性部分；ならびに（ｉｉ）非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質である。
実施形態６は、抗原性フェリチンタンパク質であって、（ｉ）表面に露出したシステイン、（ｉｉ）フェリチンタンパク質のＮ末端側のペプチドリンカー、および（ｉｉｉ）ペプチドリンカーのＮ末端側の非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質である。
実施形態７は、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異をさらに含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態８は、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異をさらに含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態９は、内部システインが、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にある、実施形態８に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１０は、抗原性フェリチンタンパク質であって：
ａ．表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異およびシステインに連結した免疫刺激性部分；
ｂ．Ｈ．ピロリフェリチンの３１位の内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの３１位と類似の位置の内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異；
ｃ．表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異；ならびに
ｄ．非フェリチンポリペプチド
を含む抗原性フェリチンタンパク質である。
実施形態１１は、非システインアミノ酸がセリンである、実施形態８〜１０のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１２は、アスパラギンが、Ｈ．ピロリフェリチンの１９位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの類似の位置にある、実施形態７〜１１のいずれか１つに記載フェリチンタンパク質である。
実施形態１３は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異の１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つまたはそれ以上の対応する変異を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１３ａは、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態１３に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１３ｂは、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＳ２６Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態１３に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１３ｃは、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＳ７２Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態１３に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１３ｄは、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＡ７５Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態１３に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１３ｅは、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＫ７９Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態１３に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１３ｆは、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＳ１００Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態１３に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１３ｇは、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＳ１１１Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態１３に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１４は、非フェリチンポリペプチドが、インフルエンザ、エプスタイン−バーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、またはボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）由来のポリペプチドである、実施形態４〜１３ｇのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１４ａは、非フェリチンポリペプチドがインフルエンザ由来のポリペプチドを含み、場合によりポリペプチドが血球凝集素ポリペプチドを含む、実施形態４〜１３ｇのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１４ｂは、非フェリチンポリペプチドがエプスタイン−バーウイルス由来のポリペプチドを含み、場合によりポリペプチドが、ｇＬ、ｇＨ、ｇＬ／ｇＨ、ｇｐ２２０、またはｇｐ４２ポリペプチドの１つまたはそれ以上を含む、実施形態４〜１３ｇのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１４ｃは、非フェリチンポリペプチドが呼吸器合胞体ウイルス由来のポリペプチドを含み、場合によりポリペプチドがＲＳＶ ＦまたはＲＳＶ Ｇポリペプチドを含む、実施形態４〜１３ｇのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１４ｄは、非フェリチンポリペプチドがボレリア由来のポリペプチドを含み、場合によりポリペプチドがＯｓｐＡポリペプチドを含む、実施形態４〜１３ｇのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１５は、非フェリチンポリペプチドがＲＳＶ Ｇポリペプチドを含み、場合によりＲＳＶ ＧポリペプチドがＧポリペプチド中央保存領域を含む、実施形態１４または１４ｃに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１５ａは、ＲＳＶ Ｇポリペプチドがグリコシル化されていない、実施形態１５に記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１５ｂは、ＲＳＶ Ｇポリペプチドがフェリチンタンパク質に化学的にコンジュゲートされている、実施形態１５または１５ａに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１６は、フェリチンと非フェリチンポリペプチドとの間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態４〜５または７〜１５ｂのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１７は、システインに連結され、水素結合またはイオン結合することが可能な部分を含む免疫刺激性部分を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１８は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、またはＳＴＩＮＧのアゴニストである免疫刺激性部分を含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１８ａは、ＴＬＲ２のアゴニストである免疫刺激性部分を含み、場合によりアゴニストが、ＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＦＳＬ−１、またはＰＡＭ３ＣＳＫ４である、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１８ｂは、ＴＬＲ７／８のアゴニストである免疫刺激性部分を含み、場合によりアゴニストが一本鎖ＲＮＡ、イミダゾキノリン、ヌクレオシドアナログ、３Ｍ−０１２、またはＳＭ７／８ａである、実施形態１〜１８ａのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１８ｃは、ＴＬＲ９のアゴニストである免疫刺激性部分を含み、場合によりアゴニストが、ＣｐＨオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、５’プリン（Ｐｕ）−ピリミジン（Ｐｙ）−Ｃ−Ｇ−Ｐｙ−Ｐｕ３’を含む１つまたはそれ以上の６量体ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮ、配列番号２１０の配列を含むＯＤＮ、またはＩＳＳ−１０１８である、実施形態１〜１８ｂのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１８ｄは、ＴＬＲ９のアゴニストが、ホスホロチオエート結合を含む骨格を含む、実施形態１８ｃに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１８ｅは、ＳＴＩＮＧのアゴニストである免疫刺激性部分を含み、場合によりアゴニストが、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ｃｄＡ、ｃｄＧ、ｃＡＭＰ−ｃＧＭＰ、および２’−５’，３’−５’ｃＧＡＭＰ、またはＤＭＸＡＡである、実施形態１〜１８ｄのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９は、配列番号２０１〜２０７または２１１〜２１５のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１８ｅのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ａは、配列番号２０１と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｂは、配列番号２０２と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９ａのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｃは、配列番号２０３と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｂのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｄは、配列番号２０１〜２０７または２１１〜２１５と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｃのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｅは、配列番号２０４と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｄのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｆは、配列番号２０５と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｅのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｇは、配列番号２０６と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｆのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｈは、配列番号２０７と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｇのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｉは、配列番号２１１と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｈのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｊは、配列番号２１２と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｉのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｋは、配列番号２１３と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｊのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｌは、配列番号２１４と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｋのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態１９ｍは、配列番号２１５と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９ｌのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質である。
実施形態２０は、実施形態１〜１９ｍのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質を含むフェリチン粒子である。
実施形態２１は、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質またはフェリチン粒子、および薬学的に許容される担体を含む組成物である。
実施形態２２は、第１のフェリチンタンパク質および第２のフェリチンタンパク質を含む組成物であって、第１のフェリチンタンパク質が、フェリチン重鎖および第１の非フェリチンポリペプチドを含み、第２のフェリチンタンパク質が、フェリチン軽鎖および第２の非フェリチンポリペプチドを含み、ならびに第１および第２の非フェリチンポリペプチドが異なり、場合によりフェリチン粒子が、第１のフェリチンタンパク質および第２のフェリチンタンパク質を含む、組成物である。
実施形態２３は、アジュバントをさらに含む、実施形態２１または２２に記載の組成物である。
実施形態２４は、対象のワクチン接種に使用するための、実施形態４〜２３のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質、フェリチン粒子、または組成物である。
実施形態２５は、実施形態４〜２３のいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質、フェリチン粒子、または組成物を対象に投与することを含む、対象にワクチン接種する方法である。
実施形態２６は、対象がヒトである、実施形態２４に記載のフェリチンタンパク質、フェリチン粒子、もしくは組成物、または実施形態２５に記載の方法である。
実施形態２６ａは、対象が哺乳動物であり、場合により哺乳動物が霊長類もしくは家畜哺乳動物であり、さらに場合により霊長類が、非ヒト霊長類、サル、マカク、アカゲザル、もしくはカニクイザルもしくは類人猿であるか、または家畜哺乳動物が、イヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、またはロバである、実施形態２４に記載のフェリチンタンパク質、フェリチン粒子、もしくは組成物、または実施形態２５に記載の方法である。
実施形態２７は、場合により核酸がｍＲＮＡである、実施形態１〜２６ａのいずれか１つに記載のフェリチンタンパク質をコードする核酸である。
実施形態Ｆ１は、抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドであって、（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含むフェリチンタンパク質、および（ｉｉ）インフルエンザポリペプチドを含む抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ２は、抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドであって、（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、およびシステインにコンジュゲートした免疫刺激性部分を含むフェリチンタンパク質；ならびに（ｉｉ）インフルエンザポリペプチドを含む抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ３は、システインを介してフェリチンタンパク質にコンジュゲートされた免疫刺激性部分をさらに含む、実施形態Ｆ１に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ４は、インフルエンザポリペプチドが、血球凝集素（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを含む、実施形態Ｆ１〜Ｆ３のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ５は、ＨＡポリペプチドが保存領域を含む、実施形態Ｆ４に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ６は、保存領域がＨＡのステム領域の全てまたは一部を含む、実施形態Ｆ５に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ７は、インフルエンザ抗原がＹ９８Ｆ変異を含むＨＡ抗原を含む、実施形態Ｆ１〜Ｆ６のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ８は、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異をさらに含む、実施形態Ｆ１〜Ｆ７のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ９は、内部システインが、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にあり、場合により内部システインがセリンに変異している、実施形態Ｆ８に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１０は、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異をさらに含み、場合により非アスパラギンアミノ酸がグルタミンである、実施形態Ｆ１〜Ｆ９のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１１は、表面に露出したアミノ酸が、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ２６、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、もしくはＳ１１１の変異、または非Ｈ．ピロリフェリチンにおける類似のアミノ酸である、実施形態Ｆ１〜Ｆ１０のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１２は、表面に露出したアミノ酸の変異が、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、もしくはＳ１１１Ｃ、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける類似のアミノ酸である、実施形態Ｆ１１に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１３は、免疫刺激性部分が、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８のアゴニストである、実施形態Ｆ１〜Ｆ１２のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１４は、免疫刺激性部分がＴＬＲ９のアゴニストである、実施形態Ｆ１〜Ｆ１３のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１５は、免疫刺激性部分とフェリチンタンパク質との間にリンカーをさらに含む、実施形態Ｆ１またはＦ３〜Ｆ１４のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１６は、リンカーが、マレイミド部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分の１つ、２つ、または３つを含む、実施形態Ｆ１５に記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１７は、フェリチンタンパク質とインフルエンザポリペプチドとの間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態Ｆ１〜Ｆ１６のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
実施形態Ｆ１８は、実施形態Ｆ１〜Ｆ１７のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドを含むフェリチン粒子である。
実施形態Ｆ１９は、実施形態Ｆ１〜Ｆ１８のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドまたはフェリチン粒子、および薬学的に許容される担体を含む組成物である。
実施形態Ｆ２０は、フェリチンタンパク質および異なるインフルエンザポリペプチドを含む第２の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｆ１９の組成物である。
実施形態Ｆ２１は、インフルエンザポリペプチドが、インフルエンザＡ型に由来し、第２の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドのインフルエンザポリペプチドが、インフルエンザＢ型に由来するか、またはインフルエンザポリペプチドおよび第２のインフルエンザ−フェリチンポリペプチドのインフルエンザポリペプチドが、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、もしくはＨ１８に由来するか、またはインフルエンザポリペプチドの１つもしくは両方がサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ７、もしくはＨ１０に由来する操作された安定化ステム抗原を含む、実施形態Ｆ２０に記載の組成物である。
実施形態Ｆ２２は、インフルエンザに対する免疫応答を誘発する方法において、またはインフルエンザに感染した対象の保護において使用するための、実施形態Ｆ１〜Ｆ２１のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物である。
実施形態Ｆ２３は、インフルエンザに対する免疫応答を誘発する、またはインフルエンザ感染に対して対象を保護する方法であって、実施形態Ｆ１〜Ｆ２２のいずれか１つに記載の１つまたはそれ以上の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物を対象に投与する工程を含む方法である。
実施形態Ｆ２４は、対象がヒトである、実施形態Ｆ１〜Ｆ２３のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド、フェリチン粒子、組成物、または方法である。
実施形態Ｆ２５は、場合により核酸がｍＲＮＡである、実施形態Ｆ１〜Ｆ１７のいずれか１つに記載の抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドをコードする核酸である。
追加の目的および利点は、以下の説明に部分的に記載され、部分的に説明から明白であり、または実践により学ぶことができるであろう。目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘された要素および組合せによって実現および達成される。
前述の一般的説明および以下の詳細な説明は、単なる例示および説明であり、特許請求の範囲を制限するものではない。
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する以下の図面は、いくつかの実施形態を例証し、説明と共に本明細書に記載する原理を説明するために役立つ。
ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の例示的な設計を示す図である。図１Ａ．フェリチンに遺伝的に融合したＯｓｐＡは、融合タンパク質を形成する。ＯｓｐＡおよびフェリチン配列は、グリシン−セリンリンカー（−ＧＳ−）によって分離される。 ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の例示的な設計を示す図である。図１Ｂ．ＯｓｐＡのエクトドメインの構造を示す。ＯｓｐＡがフェリチンに結合しているＣ末端をアスタリスクで示す。 ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の例示的な設計を示す図である。図１Ｃ．Ｈ．ピロリフェリチンの２４モノマーで構成される例示的なフェリチンナノ粒子。 ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の例示的な設計を示す図である。図１Ｄ．例示的なＯｓｐＡ−フェリチン融合タンパク質ナノ粒子。フェリチン（薄灰色）、グリシン−セリンリンカー（ＧＳ）の位置、ＯｓｐＡ（濃灰色および黒色）を示す（ｎ：サブユニット数）。 図２Ａ−２Ｄは、例示的なＯｓｐＡ−フェリチンの発現および精製を示す図である。図２Ａ．Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム上で精製された例示的なＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイル。図２Ｂ．Ｅｘｐｉ２９３細胞由来の精製された例示的なＯｓｐＡ−フェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。図２Ｃ．例示的なＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）プロファイル。半径は１３ｎｍであり、Ｐｄ％（標準化された多分散性の尺度）は７．４であり、質量は１００％である。図２Ｄ．６７，０００倍で３１８個の粒子の透過電子顕微鏡写真のクラス平均から構成された例示的なＯｓｐＡ−フェリチンの複合画像。フェリチンナノ粒子は、中空中心を有する強い円形密度として透過型電子顕微鏡上に現れる。各ナノ粒子は、環状またはわずかに長円形に見えるＯｓｐＡに対応する多数の短い形状に囲まれている。 図２−１の続き。 図２−２の続き。 大腸菌における代替血清型ＯｓｐＡナノ粒子の生成を示す図である。図３Ａ．サイズ排除クロマトグラフィーにより精製したＯｓｐＡ−フェリチン血清型１〜５および７のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる生化学分析。 大腸菌における代替血清型ＯｓｐＡナノ粒子の生成を示す図である。図３Ｂ．ＯｓｐＡ−フェリチン血清型１〜５および７（９８，０００倍）の透過型電子顕微鏡検査。 例示的な血清型１のＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子のＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライム（ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）の精製された外表面タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）の液体懸濁液）との免疫原性および期間の比較を示す図である。Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）に１μｇのＯｓｐＡ−フェリチン＋Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａアジュバントシステム、カタログ番号Ｓ６３２２−１ｖｌ）またはＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライムを第０週および第４週に筋肉内に免疫した。抗体応答は、各組成物を用いて２回目の免疫（６週目）の２週間後および２回目の免疫（２５週目）の２１週間後に、ＥＬＩＳＡを介してエンドポイント力価を測定することにより評価された。 図５Ａ−５Ｃは、例示的なＯｓｐＡ−フェリチンに関する情報を提供する図である。ＯｓｐＡポリペプチドは、ヒト白血球機能関連抗原−１（ｈＬＦＡ−１）の配列の断片と相同性を有するＯｓｐＡ血清型１のエピトープで修飾される。図５Ａ．ＯｓｐＡエクトドメイン内のＬＦＡ−１相同部位（配列番号８３のアミノ酸１６５〜１７３）の位置を示す構造。図５Ｂ．配列番号８３（Ｂ．ブルドルフェリ血清型１のＯｓｐＡ）のＯｓｐＡアミノ酸１６５〜１７３と、ｈＬＦＡ−１および他のボレリア属（Borrelia）種および血清型の対応する配列との関係を示す樹状図。図５Ｃ．配列番号８３のアミノ酸１６５〜１７３における９アミノ酸セグメント（ノナペプチド）（「ＯｓｐＡ」と標識）を、血清型２および血清型３のＯｓｐＡ由来の対応するノナペプチド（それぞれ「Ｓ２」（配列番号７９）および「Ｓ３」（配列番号８０））、合理的に設計された置換ノナペプチド（「ＲＤ２」、配列番号８１）、およびｈＬＦＡ−１由来の対応するノナペプチド（配列番号７８）と比較する。図５Ｃは、配列番号７７、７９〜８１、および７８を、それぞれ、外観順に開示する。図５Ｄは、Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）に、１μｇ用量のＯｓｐＡ血清型１−フェリチンナノ粒子をＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント（スクアレンベース水中油ナノエマルジョン、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｖａｃ−ａｄｘ−１０から入手可能）で０週および４週に筋肉内（ＩＭ）に免疫した図である。ＯｓｐＡ配列は、野生型ｈＬＦＡ−１相同部位（すなわち、配列番号８３のアミノ酸１６５〜１７３、「Ｓｅｒｏ１」）または配列番号８１（「ＲＤ」）、配列番号８０（「Ｓｅｒｏ ３置き換え」）、配列番号７９（「Ｓｅｒｏ ２置き換え」）のような置換配列を含んでいた。抗体応答は、示された構築物の２回目の免疫の２週間後にＥＬＩＳＡにより測定したエンドポイント力価を介して評価された。 図５−１の続き。 図５−２の続き。 例示的な免疫刺激性部分：ＴＬＲ７／８アゴニスト（３Ｍ−０１２）にコンジュゲートされた例示的なＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子に関する情報を提示する図である。図６Ａ．３Ｍ−０１２をフェリチンに結合させるために、２ステップクリックケミストリー戦略を使用した。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドリンカーをフェリチン上の表面露出システインに最初に付着させた。過剰のリンカーを除去した後、アジド−３Ｍ−０１２を添加した。 例示的な免疫刺激性部分：ＴＬＲ７／８アゴニスト（３Ｍ−０１２）にコンジュゲートされた例示的なＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子に関する情報を提示する図である。図６Ｂ．Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）に、０および４週目に示された組成物１μｇを筋肉内に免疫し、２週間後に分析した。「コンジュゲート」は、ＯｓｐＡ−フェリチン−３Ｍ−０１２コンジュゲートナノ粒子を示す。「混合」は、２９ｎｇまたは２０μｇの３Ｍ−０１２またはミョウバンとともに投与された同じＯｓｐＡ−フェリチンの非コンジュゲート混合物を示す。ＯｓｐＡ−フェリチンと３Ｍ−０１２の２９ｎｇ「混合」混合物は、コンジュゲートナノ粒子上の３Ｍ−０１２のモル当量を表す。 図７Ａ−７Ｃは、例示的な免疫刺激性部分：ＩＳＳ−１０１８ ＣｐＧ（配列番号２１０）にコンジュゲートされた例示的なＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子に関する情報を提供する図である。図７Ａ．２ステップクリックケミストリー戦略を用いて、ＣＰＧをフェリチンに結合させた。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドリンカーを、フェリチン上の表面露出システインに最初に付着させた。過剰のリンカーを除去した後、アジド−ＣｐＧを添加した。図７Ａは、配列番号５３４を開示する。図７Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるＣｐＧコンジュゲーションの生化学的分析は、ＣｐＧにコンジュゲートされたＯｓｐＡ−フェリチンの９２％とのＣｐＧへのコンジュゲーション後の分子量のシフトを明らかにする。図７Ｃ．Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）は、指示された組成物の１μｇで０週目と４週目に筋肉内に免疫され、２週間後に分析された。「コンジュゲート」は、ＯｓｐＡ−フェリチン−ＣＰＧコンジュゲートナノ粒子を示す。「混合」は、３３９ｎｇもしくは５０μｇのＣｐＧまたはミョウバンとともに投与された同じＯｓｐＡ−フェリチンの非コンジュゲート混合物を示す。ＯｓｐＡ−フェリチンとＣＰＧの３３９ｎｇ「混合」混合物は、コンジュゲートナノ粒子上のＣｐＧのモル当量を表す。 図７−１の続き。 図８Ａ−８Ｆは、ミョウバンアジュバントを含む一価血清型適合ＯｓｐＡ−フェリチン（１μｇ／用量）（「一価」）、または血清型１のＯｓｐＡ−フェリチン、血清型２のＯｓｐＡ−フェリチン、血清型３のＯｓｐＡ−フェリチン、血清型４のＯｓｐＡ−フェリチン、血清型５のＯｓｐＡ−フェリチン、および血清型７のＯｓｐＡ−フェリチンの各々（各１μｇ／用量）をミョウバンアジュバントとともに含む六価組成物（「六価」）を投与した後、血清型１（図８Ａ）、血清型２（図８Ｂ）、血清型３（図８Ｃ）、血清型４（図８Ｄ）、血清型５（図８Ｅ）、および血清型７（図８Ｆ）に対する抗体応答を比較する図である。抗体応答は、Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）を第０週および第４週に筋肉内に免疫し、２週間後にＥＬＩＳＡにより測定したエンドポイント力価を介して評価された。ＥＬＩＳＡプレートをＯｓｐＡの特定の血清型で被覆した。 図８−１の続き。 図８−２の続き。 図９Ａ−９Ｇは、コンジュゲートされたおよびコンジュゲートされていない六価ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子組成物の投与後にマウスで観察された血清型１（図９Ａ）、血清型２（図９Ｂ）、血清型３（図９Ｃ）、血清型４（図９Ｄ）、血清型５（図９Ｅ）、血清型６（図９Ｆ）、および血清型７（図９Ｇ）に対するマウスにおける抗体応答を示す図である。「六価−ＣＰＧ」および「六価−３Ｍ−０１２」が、ナノ粒子がＣＰＧおよび３Ｍ−０１２に化学的にコンジュゲートされていることを示す以外は、六価組成物は、図８Ａ−Ｆに記載されるように、血清型１のＯｓｐＡ−フェリチン、血清型２のＯｓｐＡ−フェリチン、血清型３のＯｓｐＡ−フェリチン、血清型４のＯｓｐＡ−フェリチン、血清型５のＯｓｐＡ−フェリチン、および血清型７のＯｓｐＡ−フェリチンの各々を含む（図７Ａおよび６Ａ、ならびに添付の記載を参照されたい）。抗体応答は、２週間後にＥＬＩＳＡにより測定されたエンドポイント力価を介して評価された。ＥＬＩＳＡプレートをＯｓｐＡの特定の血清型で被覆した。 図９−１の続き。 図９−２の続き。 図９−３の続き。 図１０Ａ−１０Ｇは、六価ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子組成物に対する、アカゲサル（ｎ＝３匹／群）における血清型１〜７に対する抗体応答をそれぞれ示す図である。これは、用量が総６０μｇ（各血清型１０μｇ）であり、コンジュゲートされていないＡＦ０３アジュバントを含有すること以外は、図９Ａ〜Ｇについて記載したものであった。サルは、第０週および第６週に筋肉内に免疫された。抗体応答は、免疫後２週間で、ＥＬＩＳＡにより測定したエンドポイント力価を介して分析された。ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライムを比較対照として１０μｇ用量で使用した。全ての実験について、ＥＬＩＳＡプレートを各パネルに示されたＯｓｐＡ血清型で被覆した。図１０Ｈ−１０Ｎは、六価ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子組成物に対する、アカゲサル（ｎ＝３匹／群）における血清型１〜７に対する抗体応答をそれぞれ示す図である。これは、ＡＦ０３アジュバントを使用せず、代わりにナノ粒子を３Ｍ−０１２またはＣｐＧにコンジュゲートさせたこと以外は、図１０Ａ〜１０Ｇについて記載したものであった（図６Ａおよび７Ａ、ならびに添付の記載を参照されたい）。用量は、総６０μｇ（各血清型１０μｇ）であった。サルは、第０週および第６週に筋肉内に免疫された。抗体応答は、免疫後２週間で、ＥＬＩＳＡにより測定したエンドポイント力価を介して分析された。全ての実験について、ＥＬＩＳＡプレートを各パネルに示されたＯｓｐＡ血清型で被覆した。 図１０−１の続き。 図１０−２の続き。 図１０−３の続き。 図１０−４の続き。 ３Ｍ−０１２結合ＯｓｐＡ−フェリチン組成物のダニ負荷試験の結果を示す図である。マウスは、第０週および第４週に、示された組成物の１μｇ用量で免疫された。一価組成物は、３Ｍ−０１２にコンジュゲートされたＯｓｐＡ−フェリチン血清型１の１μｇを含有した。「六価−３Ｍ−０１２」組成物は、図９Ａ〜Ｇについて記載された通りであった。対照粒子は、ＯｓｐＡポリペプチドを欠いていた。マウスは、ボレリア・ブルグドルフェリＮ４０株（血清型１）に感染した５〜６匹のダニを、２回目の免疫後、２週間で５日間負荷させ、２週間後に屠殺した。心臓、足首および耳からの組織試料を、Ｂ．ブルグドルフェリに対する抗生物質を添加したＢＳＫ培地中で６週間培養した。陰性試料は、ＰＣＲ法によりＢ．ブルグドルフェリの存在について試験された。陽性試料は、培養またはＰＣＲ法のいずれかで陽性であった。 質量分析によるＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子のＴＬＲ７／８アゴニスト３Ｍ−０１２へのコンジュゲーションの確認を示す図である。上のパネルは、コンジュゲートされていない構築物を示し、下のパネルはコンジュゲートされた構築物を示す。データは、３Ｍ−０１２の添加と一致して、５８６．６９ダルトンの質量シフトを示した。 示される希釈系列にわたってＥＬＩＳＡにより測定されたグリコシル化対応物（ＲＤ）と比較した、非グリコシル化変異体ＯｓｐＡ−フェリチン（ＮＧ−ＲＤ）に対するマウスにおける抗体応答を示す図である。ＲＤ＝配列番号５２。ＮＧ−ＲＤ＝配列番号５３。マウスに第０週および第４週に１μｇ用量をワクチン接種した。 ＯｓｐＡ−フェリチン（配列番号５２）に対するマウスにおける抗体応答を示す図である。ＯｓｐＡ−フェリチングリコシル化変異体Ｎ＞Ｑ（配列番号５３）、およびグリコシル化変異体Ｓ／Ｔ＞Ａ（配列番号６３）は、示される希釈系列にわたってＥＬＩＳＡにより測定された、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライム対照および陰性（Ｐｒｅ免疫）対照と比較された。 図１５Ａ−１５Ｅは、異なるリンカー（ＧＳ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、ＧＳ１、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（配列番号４４３）、ＧＳ２、配列番号９１リンカー、ＧＳ５、配列番号９２リンカー、構築物配列は、それぞれ、配列番号５３および６０〜６２）を含むＯｓｐＡ構築物の精製および特徴付けを示す。図１５Ａ．示されるリンカーを含む精製ＯｓｐＡ構築物のクーマシー染色。図１５Ａは、外観順に、配列番号４４３〜４４５をそれぞれ開示する。図１５Ｂ．ＧＳ１（配列番号６０）を含むＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）。図１５Ｃ．ＧＳ２（配列番号６１）を含むＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子のＤＬＳ。図１５Ｄ．ＧＳ５（配列番号６２）を含むＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の電子顕微鏡写真（ＥＭ）。図１５Ｅ．ＧＳ５（配列番号６２）を含むＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子のＤＬＳ。 図１５−１の続き。 図１５−２の続き。 示される希釈系列にわたるＥＬＩＳＡにより測定したＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライムおよび陰性（Ｐｒｅ免疫）対照と比較した、異なるリンカーを（リンカー１×ＧＧＧＳ構築物、配列番号６０（配列番号４４３として開示された「１×ＧＧＧＳ」）、リンカー２×ＧＧＧＳ構築物、配列番号６１（配列番号４４４として開示された「２×ＧＧＧＳ」）、リンカー５×ＧＧＧＳ構築物、配列番号６２（配列番号４４５として開示された「５×ＧＧＧＳ」））含むＯｓｐＡ−フェリチン構築物に対するマウスの抗体応答を示す図である。 図１７Ａ−１７Ｃは、ルマジンシンターゼＯｓｐＡ血清型４構築物（配列番号１８）の特徴付けを示す図である。図１７Ａ．ＤＬＳデータ。図１７Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）トレースの示された画分２２〜６４のクーマシーゲル。図１７Ｃ．ＥＭデータ。 図１７−１の続き。 ミョウバンを伴うまたは伴わない、ＯｓｐＡ血清型４−フェリチン構築物（配列番号４）およびＯｓｐＡ血清型４−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１８）に対するマウスにおける抗体応答を示す図である。 図１９Ａ−１９Ｃは、ＯｓｐＡ血清型１−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１２）の特徴付けを示す図である。図１９Ａ．ＥＭデータ。図１９Ｂ．ＳＥＣトレースの示された画分２０〜４０のクーマシーゲル。図１９Ｃ．ＤＬＳデータ。 図１９−１の続き。 図２０Ａ−２０Ｃは、ＯｓｐＡ血清型２−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１６）の特徴付けを示す図である。図２０Ａ．ＥＭデータ。図２０Ｂ．ＳＥＣトレースの示された画分２７〜５６のクーマシーゲル。図２０Ｃ．ＤＬＳデータ。 図２０−１の続き。 ＯｓｐＡ血清型３−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１７）の特徴付けを示す図である。図２１Ａ．ＳＥＣトレースの示された画分２３〜３９のクーマシーゲル。 ＯｓｐＡ血清型３−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１７）の特徴付けを示す図である。図２１Ｂ．ＤＬＳデータ。 ＯｓｐＡ血清型５−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１９）の特徴付けを示す図である。図２２Ａ．ＥＭデータ。 ＯｓｐＡ血清型５−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１９）の特徴付けを示す図である。。図２２Ｂ．ＳＥＣトレースの示された画分２２〜３８のクーマシーゲル。 ＯｓｐＡ血清型５−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１９）の特徴付けを示す図である。図２２Ｃ．ＤＬＳデータ。 ＯｓｐＡ血清型７−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号２１）の特徴付けを示す。図２３Ａ．ＥＭデータ。 ＯｓｐＡ血清型７−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号２１）の特徴付けを示す。図２３Ｂ．ＳＥＣトレースの示された画分２０〜３８のクーマシーゲル。 ＯｓｐＡ血清型７−ルマジンシンターゼ構築物（配列番号２１）の特徴付けを示す。図２３Ｃ．ＤＬＳデータ。 図２４Ａ−２４Ｇは、Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５匹／群）において、ミョウバンまたはＡＦ０３のいずれかでアジュバント化したＯｓｐＡ血清型１〜７（全部で７μｇ）に対応する各１μｇのＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の七価ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子組成物、またはＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライムに対する血清型１〜７に対する抗体応答をそれぞれ示す図である。全ての実験において、ＥＬＩＳＡプレートは、各パネルに「Ｓ Ｘ」（Ｘは血清型番号である）として示されるＯｓｐＡ血清型で被覆された。 図２４−１の続き。 図２４−２の続き。 図２４−３の続き。 アカゲザルにおけるエンドポイント抗体価の時間経過を示す図である。０週目および６週目に、六価ＯｓｐＡ−フェリチンワクチン（別々のナノ粒子中に血清型１、２、３、４、５、および７のＯｓｐＡを含む）をＡＦ０３アジュバントまたはＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）でサルに筋肉内接種した。ＥＬＩＳＡプレートをＯｓｐＡ血清型１でコーティングした。 図２６Ａ−２６Ｂは、代表的なＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株の配列比較および相同性を示す図である。（図２６Ａ）ベクターＮＴＩ ＡｌｉｇｎＸソフトウェアを用いた、候補抗原性ＨＡポリペプチドの配列アライメント。白地に黒：所定の位置で完全に保存された残基に由来するコンセンサス残基。黒地に白：所定の位置で１個の残基が５０％を超えて出現することに由来するコンセンサス残基。白地に黒の下線および太字：所定の位置でコンセンサス残基に弱く類似した残基。二重下線およびイタリックの白地に黒：所定の位置で類似した残基のブロックに由来するコンセンサス残基。白地に黒の太字：類似しない残基。示された配列は、以下の配列のＨＡ部分＋Ｃ末端でのリンカーのセリンである：ＣＡ０９ ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号３１５の残基１〜５１９。ＣＯＢＲＡ Ｐ１ ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号３２７の残基１〜５１９。ＣＯＢＲＡ Ｘ６ ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号３２９の残基１〜５１８。ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号３０１の残基１〜５１８。ＨＫ７７ ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号３１８の残基１〜５１９。ＦＭ４７ ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号３１７の残基１〜５１９。ＤＶ５７ ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号３２１の残基１〜５１８。ＭＡＬ５４ ＨＡ−Ｎｐ＝配列番号３１６の残基１〜５１９。（図２６Ｂ）列挙されたインフルエンザ株由来のＨＡタンパク質配列について、近隣結合法（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ）を用いて作製された樹状図。矢印は、これらの配列からＨＡ−フェリチンナノ粒子を生成し、マウスにおけるそれらの免疫原性を試験することによって評価のための候補として選択された株を示す。 図２６−１の続き。 図２６−２の続き。 フェリチン上の操作された表面露出システイン（Ｃｙｓ）を示す図である。表面露出アミノ酸を置き換える変異から生じるシステインの位置は、フェリチンナノ粒子との関連で示される。 Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのフェリチンへのコンジュゲーションを示す図である。（図２８Ａ）マレイミド反応性基を有するＰＥＧ４リンカーを介してフェリチンの表面露出アミノ酸を置き換える変異から生じるシステインへのＳＭ７／８ａ小分子のコンジュゲーションの結果は、フェリチンナノ粒子との関連において示される。 Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのフェリチンへのコンジュゲーションを示す図である。（図２８Ｂ）フェリチンの表面露出アミノ酸を置き換える変異から生じるシステインへのＣｐＧ（配列番号５３５）のコンジュゲーションの結果は、２ステップクリックケミストリーを用いたフェリチンナノ粒子との関連において、マレイミド−ＤＢＣＯ二官能性リンカーおよびアジド官能化ＣｐＧ試薬で示される。 フェリチンに対するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのコンジュゲーションを示す図である。（図２９Ａ）マレイミド−ＤＢＣＯ二官能性リンカーおよびアジド官能化３Ｍ−０１２試薬を介した２ステップクリックケミストリー反応を用いて、フェリチンの表面露出システインにコンジュゲートしたＨＡポリペプチドおよび３Ｍ−０１２を含むフェリチンナノ粒子のモデル。 フェリチンに対するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのコンジュゲーションを示す図である。（図２９Ｂ）マレイミド−ＤＢＣＯ二官能性リンカーおよびアジド官能化ＣｐＧ試薬を用いた２ステップクリックケミストリー反応を用いて、フェリチンの表面露出システインにコンジュゲートしたＨＡポリペプチドおよびＣｐＧを含むフェリチンナノ粒子のモデル。図２９Ｂは、配列番号５３４を開示する。 特定のフェリチンナノ粒子構築物のフェリチン部分内のトリプシン切断部位を示す図である。いくつかのフェリチンナノ粒子は、アジュバントのコンジュゲーションのための不対表面露出システインに加えてトリプシン切断部位を含む。図３０に示されるアミノ酸配列は、複数の構築物に共通の配列を示す「一般化された」配列である。例えば、配列番号３１４の残基５１９〜６９４は、図３０に示される「一般化された」配列を含む。「ＸＸＸ」配列は、インフルエンザポリペプチドを表す。この配列に存在するフェリチンＳ１１１Ｃ変異の位置もまた示される。 図３１Ａ−３１Ｂは、コンジュゲーション有りまたは無しでのゲルシフトおよび質量分析（ＭＳ）の結果を示す図である。（図３１Ａ）マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションの存在（＋）または不存在（−）におけるＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（配列番号３４３）のゲルシフトおよび質量分析の結果。（図３１Ｂ）マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションの存在（＋）または不存在（−）におけるＨ５／ｈＣｏｂｒａ２−Ｎｐ（配列番号３３２）のゲルシフトおよび質量分析の結果。 コンジュゲーション有りまたは無しでの、さらなるゲルシフトの結果を示す図である。（図３２Ａ）マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションを伴うまたは伴わないペプチドＮ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）処理後のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐのゲルシフトの結果、またはマレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯおよびアジド−ＣｐＧを用いる２ステップクリックケミストリーによる結果。 コンジュゲーション有りまたは無しでの、さらなるゲルシフトの結果を示す図である。（図３２Ｂ）２ステップクリックケミストリーによる、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａまたはマレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯおよびアジド−ＣｐＧのいずれかへのコンジュゲーション有りまたは無しでの、トリプシン処理後のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐについてのゲルシフト結果。 マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーション有りまたは無しでの質量スペクトルを示す図である。（図３３Ａ）ＰＮＧａｓｅ処理後のＭＳデータは、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションの前後におけるＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐの質量を示す。 マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーション有りまたは無しでの質量スペクトルを示す図である。（図３３Ｂ）Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐをトリプシンで処理した後のＭＳデータは、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションの前後における切断されたフェリチンの質量を示す。 マレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーション有りまたは無しでの質量スペクトルを示す図である。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのマレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカー付加をリンカー添加後のＭＳにより測定した質量変化により確認した。 ２ステップクリックケミストリーによるＣｐＧのコンジュゲーションの前およびその種々の段階でのＨ１／Ｓｔｅｍ−ＮｐのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。「アジド−ＣｐＧコンジュゲーション後」とは、２ステップクリック反応の最終生成物を指す。 ３Ｍ−０１２を含むリンカーのＮＣ９９ ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ構築物へのコンジュゲーションの特徴付けを示す図である。ＷＴレーンおよび＋ＴＥＶレーンにおける構築物は、配列番号３１３の配列を有し、Ｓ２６Ｃは、配列番号３１０を指し、Ｓ７２Ｃは、配列番号３１１を指し、Ａ７５Ｃは、配列番号３１２を指し、Ｓ１１１Ｃは、配列番号３０９を指す。ＷＴを除く全ての試料をタバコエッチ秒ウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）で処理した。 図３７Ａ−３７Ｅは、還元またはコンジュゲーション有りまたは無しでの、種々の構築物の質量スペクトルを示す図である。（図３７Ａ）還元前のＳ１１１Ｃを含むＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ。（図３７Ｂ）還元後のＳ１１１Ｃを含むＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ。還元後に観察された質量（１１５Ｄａ）の減少は、システインの反応性を阻害する翻訳後修飾の除去と一致する。（図３７Ｃ）３Ｍ０１２とのコンジュゲーション有りまたは無しでの、ＮＣ９９ ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ−Ｓ２６Ｃナノ粒子（配列番号３１０）の質量スペクトル。（図３７Ｄ）３Ｍ０１２へのコンジュゲーション有りまたは無しでの、ＮＣ９９ ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ−Ａ７５Ｃナノ粒子（配列番号３１２）の質量スペクトル。（図３７Ｅ）３Ｍ０１２へのコンジュゲーション有りまたは無しでの、ＮＣ９９ ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ−Ｓ１１１Ｃナノ粒子（配列番号３０９）の質量スペクトル。 図３７−１の続き。 図３７−２の続き。 図３７−３の続き。 図３８Ａ−３８Ｆは、ＳＭ７／８ａ、３Ｍ０１２、またはＣｐＧへのコンジュゲーション有りまたは無しでの、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−ＮｐまたはＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐのナノ粒子のネガティブ染色電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す図である。（図３８Ａ）コンジュゲートしていないＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ。（図３８Ｂ）Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲート。（図３８Ｃ）Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート。（図３８Ｄ）ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ（配列番号３０９）。（図３８Ｅ）ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ０１２コンジュゲート。（図３８Ｆ）．ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート。 図３８−１の続き。 図３９Ａ−３９Ｃは、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲート（図３９Ａ）、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート（図３９Ｂ）、またはコンジュゲートしていないＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（図３９Ｃ）の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を示す図である。 図３９−１の続き。 図３９−２の続き。 示される混合アジュバントを用いて製剤化された、または図２８Ａ−Ｂに示されるように、ＰＥＧ４リンカーを介してＳＭ７／８ａもしくはＣｐＧなどのＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐに対する抗体応答を示す図である。血清を免疫後５週間（第０週および第３週）でマウス（ｎ＝５）から回収し、抗体力価を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。このデータは、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＴＬＲ−アゴニストコンジュゲートの自己アジュバント特性を実証する。図４０Ａは、Ｈ１／ニューカレドニア／２０／１９９９ ＨＡ三量体に対するＥＬＩＳＡを示す。ＰＡＡ＝ポリアクリル酸、混合された等モル＝８３．３ｎｇのＳＭ７／８ａ（ＳＭ７／８をコンジュゲートしたフェリチンナノ粒子を用いて投与される用量に同等である）、高用量＝２１．８４μｇ（ＳＭ７／８をコンジュゲートしたフェリチンナノ粒子を用いて投与される用量よりも高い）。 示される混合アジュバントを用いて製剤化された、または図２８Ａ−Ｂに示されるように、ＰＥＧ４リンカーを介してＳＭ７／８ａもしくはＣｐＧなどのＴＬＲアゴニストにコンジュゲートされたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐに対する抗体応答を示す図である。血清を免疫後５週間（第０週および第３週）でマウス（ｎ＝５）から回収し、抗体力価を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。このデータは、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＴＬＲ−アゴニストコンジュゲートの自己アジュバント特性を実証する。図４０Ｂは、Ｈ１／ステム三量体に対するＥＬＩＳＡを示す。混合等モル＝８５０ｎｇのＣｐＧ（ＣｐＧをコンジュゲートしたフェリチンナノ粒子を用いて投与される用量に同等である）、高用量＝２０μｇのＣｐＧ。 図４１Ａ−４１Ｃは、コンジュゲートされたまたは分離した３Ｍ−０１２（配列番号３０９）有りまたは無しでの、ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐを用いて得られた力価の比較を示す図である。ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ０１２をコンジュゲートしたナノ粒子（０．２２μｇ／用量）に対する抗体応答をマウスにおいて試験した。混合対照には、ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と１０μｇの３Ｍ０１２（典型的な文献用量）の混合物、およびＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と１．７ｎｇの３Ｍ０１２（コンジュゲートと等モルマッチ）の混合物が含まれた。追加の対照には、一致したＨＡ含量（０．１７μｇのＨＡ／用量）で投薬される、コンジュゲートされていないＨＡ−ＮｐおよびＩＩＶが含まれた。ＥＬＩＳＡエンドポイント力価（図４１Ａ）、偽ウイルス（ＰｓＶ）中和ＩＣ５０力価、および（図４１Ｂ）血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価（図４１Ｃ）に基づいて、ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ０１２コンジュゲートは、等モル混合対照よりも有意に強い抗体応答を誘導した。コンジュゲートされたナノ粒子はまた、コンジュゲートされていないナノ粒子およびＩＩＶ標準治療よりも強い応答（ＥＬＩＳＡ）および強い中和抗体応答（ＰｓＶ）を誘導したが、この結果は、ＨＡＩアッセイでは統計学的に有意ではなかった。アッセイは、ブーストの２週間後からの血清のものである。全試料を３重にして実験した。中央値±ＳＥＭをグラフにする。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 図４１−１の続き。 図４２Ａ−４２Ｃは、コンジュゲートされたまたは分離したＣｐＧ（配列番号３０９）有りまたは無しでの、ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐを用いて得られた力価の比較を示す図である。ＨＡ−Ｎｐ−ＣｐＧをコンジュゲートしたナノ粒子（０．２２μｇ／用量）に対する抗体応答をマウスにおいて試験した。混合対照には、ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と２０μｇのＣｐＧ（典型的な治療用量）の混合物、およびＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と２１ｎｇのＣｐＧ（コンジュゲートと等モルマッチ）の混合物が含まれた。追加の対照には、一致したＨＡ含量（０．１７μｇのＨＡ／用量）で投薬される、コンジュゲートされていないＨＡ−ＮｐおよびＩＩＶが含まれた。ＥＬＩＳＡエンドポイント力価（図４２Ａ）および偽ウイルス中和ＩＣ５０力価（図４２Ｂ）に基づいて、コンジュゲートは、マッチさせた混合物、コンジュゲートされていない粒子、またはＩＩＶよりも強い結合および中和抗体応答を誘導した。また、ＨＡ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲートは、等モル混合対照よりも有意に強いＨＡＩ力価（図４２Ｃ）を誘導した。さらに、ＨＡＩ力価は、コンジュゲートされていないＨＡ−ＦｅｒｒおよびＩＩＶよりも２．６倍および３．０倍高かったが、これらの結果は有意ではなかった。ＥＬＩＳＡおよびＰｓＶアッセイは、ブーストの２週間後の血清のものであり、ＨＡＩアッセイは、ブーストの５週間後の血清のものであった。全試料を３重にして実験し、中央値±ＳＥＭをグラフにした。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 図４２−１の続き。 図４３Ａ−４３Ｃは、６つの進化的に分岐したＨ１血球凝集素（ＨＡ）抗原および２つの計算的に生成した（ＣＯＢＲＡ）抗原に由来する自己集合ＨＡ−フェリチンナノ粒子の特徴付けを示す図である。（図４３Ａ）ナノ粒子サイズおよび多分散性（「分散性」）は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された。（図４３Ｂ）ＨＡ−ナノ粒子の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色により評価された。（図４３Ｃ）ナノ粒子の完全性は、８０，０００倍のネガティブ染色電子顕微鏡により可視化された。ＦＭ４７＝Ａ／フォートモンマス／１−ＪＹ２／１９４７、ＭＡＬ５４＝Ａ／マレーシア／３０２／１９５４、ＤＶ５７＝Ａ／デンバー／１９５７（ＤＶ５７）、ＨＫ７７＝Ａ／香港／１１７／１９７７、ＮＣ９９＝Ａ／ニューカレドニア／２０／９９、ＣＡ０９＝Ａ／カリフォルニア／４／２００９。ＣＯＢＲＡ Ｐ１およびＣＯＢＲＡ Ｘ６は、Ｃａｒｔｅｒ ＤＭら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９０：４７２０〜４７３４頁（２０１６）によって最近記載された複数の配列から計算により生成されたコンセンサスである。配列番号については、図２６Ａ〜図２６Ｂの凡例を参照されたい。 図４３−１の続き。 図４４Ａ−４４Ｈは、種々のＨＡ−フェリチンナノ粒子によって誘発される免疫応答の効力および幅を示す図である（配列番号については図２６Ａ〜図２６Ｂの凡例を参照されたい）。示されたＨＡ−Ｎｐワクチンを用いた免疫から６週間後のマウス由来血清の血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価（ｌｏｇ２）を多様なＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスのパネルに対してアッセイした。マウス（ｎ＝５）を第０週および第３週に血球凝集素ナノ粒子（ＨＡ−Ｎｐｓ）を用いて免疫した。破線は、アッセイの検出限界を示す。（図４４Ａ〜４４Ｅ）Ｒｉｂｉアジュバントを用いたデータ。（図４４Ｆ〜４４Ｈ）ＡＦ０３アジュバントを用いたデータ。ｘ軸は、基準年（１９３４〜２０１３年）のＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す。表２は、各年に対応する株の完全な名称を示す。アスタリスクは、適合株を示す。 図４４−１の続き。 図４４−２の続き。 図４４−３の続き。 図４５Ａ−４５Ｆは、ＨＡ−フェリチンナノ粒子によって誘導されるＨＡ抗体応答を示す図である。（図４５Ａ）マウス［ｎ＝５］を、Ｓｉｇｍａアジュバントシステム（カタログ番号 Ｓ６３２２）を使用して、特定のナノ粒子またはナノ粒子の組合せを用いて免疫した。ＩＩＶとは、インフルエンザ不活化ワクチンを指す。（図４５Ｂ−Ｆ）抗体応答は、Ａ／フォートモンマス／１／１９４７（図４５Ｂ）、Ａ／マレーシア／３０２／１９５４（図４５Ｃ）、Ａ／香港／１１７／１９７７（図４５Ｄ）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（図４５Ｅ）、またはＡ／カリフォルニア／４／２００９（図４５Ｆ）からＨＡ三量体に対するＥＬＩＳＡ力価を決定することによって測定された。ＥＬＩＳＡ力価は、最初の免疫の５週間後に測定された。試験した血清希釈の最低値は、点線で示されるように検出のアッセイ限界を設定する。白丸は、マウスに投与されたナノ粒子の起源の株とＥＬＩＳＡによりアッセイされた株との間の一致を示す。 図４５−１の続き。 図４５−２の続き。 図４６Ａ−４６Ｈは、ＨＡＩ力価のアッセイで測定した、マウスに投与された複数のフェリチンナノ粒子のＨＡ混合物に対する抗体応答を示す図である。（図４６Ａ〜４６Ｂ）二価の組合せ。（図４６Ｃ〜４６Ｅ）三価の組合せ。（図４６Ｆ〜４６Ｈ）四価の組合せ。一連の分岐型Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡＩ力価（ｌｏｇ２）をアッセイした。マウス（ｎ＝５）を第０週および第３週にアジュバントを用いて、示されたＨＡ−ナノ粒子の組合せで免疫した。二価組合せＣＯＢＲＡ Ｘ６＋ＣＯＢＲＡ Ｐ１ ＨＡ−Ｎｐｓは、一価ＣＯＢＲＡ ＨＡ−Ｎｐの評価と一致させるために、ＡＦ０３アジュバントを用いて試験された。同様に、個々の株ＨＡ−フェリチンナノ粒子の組合せは、一価の個々の株ＨＡ−Ｎｐｓの評価と一致させるためにＲｉｂｉアジュバントを使用された。アスタリスクは、マウスに投与されたナノ粒子の起源の株とＥＬＩＳＡによりアッセイされた株との間の一致を示す。ｘ軸は、基準年（１９３４〜２０１３年）のＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す。表２は、各年の株の完全な名称を示す。破線は、アッセイの検出限界を示す。 図４６−１の続き。 図４６−２の続き。 図４６−３の続き。 図４７Ａ−４７Ｆは、ＨＡＩ力価のアッセイにより測定した、ＲｉｂｉまたはＡＦ０３アジュバントを含む組成物に対する抗体応答を示す図である。ＡＦ０３アジュバントを用いて得られた結果（図４７Ｂ、４７Ｄ、および４７Ｆ）と比較して、Ｒｉｂｉアジュバントを用いて得られた結果（図４７Ａ、４７Ｃ、および４７Ｅ）は、ＮＣ９９とＣＡ０９ ＨＡ−Ｎｐｓの二価組合せ（図４７Ａ〜４７Ｂ）、ＮＣ９９、ＣＡ０９とＨＫ７７ ＨＡ−Ｎｐｓの三価組合せ（図４７Ｃ〜４７Ｄ）、ならびにＮＣ９９、ＣＡ０９とＦＭ４７ ＨＡ−Ｎｐｓの三価組合せ（図４７Ｅ〜４７Ｆ）について類似する。ＨＡＩ力価は、プライム投薬から６週間後にマウス血清で測定し、３週間後にブーストした。マウス［ｎ＝５］は、示されるように、ＲｉｂｉまたはＡＦ０３アジュバントのいずれかを用いて、ＨＡ−Ｎｐｓの組合せを用いて免疫された。アスタリスクは、マウスに投与されたナノ粒子の起源の株とＥＬＩＳＡによりアッセイされた株との間の一致を示す。ｘ軸は、基準年（１９３４〜２０１３年）のＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す。表２は、各年の株の完全な名称を示す。破線は、アッセイの検出限界を示す。 図４７−１の続き。 図４７−２の続き。 図４８Ａ−４８Ｃは、ＨＡＩ力価のアッセイによって測定された、卵で産生されたＮＣ９９およびＣＡ０９不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）によって誘発された比較抗体応答を示す図である。（図４８Ａ）ＮＣ９９ ＩＩＩＶ。（図４８Ｂ）ＣＡ０９ ＩＩＶ。（図４８Ｃ）ＮＣ９９＋ＣＡ０９ ＩＩＶ。多様なＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスのパネルに対して、単一成分または同時投与として、示されたＩＩＶワクチンによる免疫から６週間後のマウス由来血清の血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価（ｌｏｇ２）。マウス（ｎ＝５）は、Ｒｉｂｉアジュバントを用いて、第０週および第３週に各ワクチンの１７０ｎｇ（ＨＡ含有量）で免疫した。ｘ軸は、１９３４年から２０１３年までの基準年で試験したＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す（表２も参照されたい）。ｘ軸は、基準年（１９３４〜２０１３年）に試験されたＨ１Ｎ１インフルエンザ株のパネルを示す。表２は、各年の株の完全な名称を示す。破線は、アッセイの検出限界を示す。 図４８−１の続き。 図４９Ａ−４９Ｄは、ＨＡＩ力価のアッセイにより測定した、ＨＡ−フェリチンナノ粒子組成物またはＩＩＶを用いたフェレットの免疫後の種々のインフルエンザウイルスに対する抗体応答を示す図である。ＡＦ０３アジュバントと以下のものと混合した２回の免疫後のフェレット（ｎ＝１２匹／群）由来の血清のＨＡＩ力価（ｌｏｇ２）：図４９Ａ：ＰＢＳ単独、図４９Ｂ：Ａ／カリフォルニア／２００９ ＩＩＶ、図４９Ｃ：ＮＣ９９＋ＣＡ０９＋ＨＫ７７ ＨＡ−Ｎｐｓ、および図４９Ｄ：ＣＯＢＲＡ−Ｘ６＋Ｐ１＋ＨＫ７７ ＨＡ−Ｎｐｓ。図４９Ｅは、ＨＡ−フェリチンナノ粒子組成物、ＩＩＶ、またはＰＢＳで免疫したフェレットの異種負荷。フェレットを図４９Ａ−Ｄに記載されるように免疫し、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の１０４．６５倍で１ｍＬのＡ／フォートモンマス／１／１９４７ウイルスを鼻腔内接種することにより、最終免疫から４週間後に１９４７年フォートモンマスウイルスで負荷した。ウイルス力価は、負荷後の７日間にわたって鼻腔洗浄液で定量化された。破線は、アッセイの検出限界を示す。ウイルス力価は、ＨＡ−Ｎｐｓ組合せで免疫したフェレットでは、ワンテール非対ｔ検定およびワンウェイＡＮＯＶＡ［Ｆ（３，４４）＝５．１８、ｐ＝０．００３７５］によって、ビヒクル（ＰＢＳ）対照と比較して、負荷から５日後に有意に低下したが、ＣＡ０９ ＩＶでは低下しなかった。＊＊＊＝Ｐ≦０．００１、スチューデントｔ検定による。 図４９−１の続き。 図４９−２の続き。 図５０Ａ−Ｃは、混合したＡＦ０３アジュバントとともに製剤化された５０μｇのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ、または２００μｇのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（アジュバント対照なし）、または２００μｇのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲート（図２８Ａに示される）、または２００μｇのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート（図２８Ｂに示される）で免疫した後のカニクイザル（Macaca fascicularis）の抗体応答を示す図である。図５０Ａは、０、４および１０週目に免疫された、指示された時点でのＨ１／ニューカレドニア／２０／１９９９ ＨＡ三量体で被覆されたプレート上の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定されたＨＡ抗体力価を示す。図５０Ｂは、Ｈ１／ニューカレドニア／２０／１９９９ ＨＡおよびＮＡを用いてシュードタイプ化されたレンチウイルスの中和ＩＣ５０を示す。図５０Ｃは、Ｈ５／ベトナム／１２０３／２００４ ＨＡおよびＮＡを用いてシュードタイプ化されたレンチウイルスの中和ＩＣ５０を示す。このデータは、霊長類モデルにおけるＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＴＬＲ−アゴニストコンジュゲートの自己アジュバント特性を実証する。 図５０−１の続き。 図５１Ａ−５１Ｂは、コンジュゲートまたは分離された３Ｍ−０１２（配列番号３０９）有りまたは無しでの、ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐで得られた力価の比較を示す図である。ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ０１２をコンジュゲートしたナノ粒子に対する抗体応答は、０．１μｇ、０．５μｇ、２．５μｇ、および１２．５μｇの４用量であった。比較のために、混合対照およびコンジュゲートされていないナノ粒子を含めた。「等モル」混合対照および「高用量」混合対照に使用したＴＬＲアゴニストの量は、最初のコンジュゲーション試験で使用したアジュバントに対する抗原の比を維持するために計算された（「等モル」については１．７ｎｇの３Ｍ０１２または「高用量」については１０μｇのいずれかを伴う０．２２μｇのＨＡ−ＮＰ）。血清中和は、ＮＣ９９レンチウイルスレポーターアッセイ（左、図５１Ａ）およびＮＣ９９ ＨＡＩアッセイ（右、図５１Ｂ）において測定された。矢印は、２．５μｇ用量を強調し、ＨＡ−ＮＰ−３Ｍ０１２コンジュゲートは、５０００倍より少ない３Ｍ０１２アジュバントを含むにも関わらず、ＨＡ−ＮＰ＋３Ｍ０１２に対して同様の抗体力価を誘導した。平均値±標準誤差をグラフにする。 図５１−１の続き。 図５２Ａ−５２Ｂは、クーマシーおよびウエスタンブロット分析によるＨｉｓ−タグの除去の有無に関わらず、一本鎖ｇＬおよびｇＨ単量体（図５２Ａ）（配列番号４０６）および三量体（図５２Ｂ）（配列番号４１１）を示す図である。図５２Ｂはまた、サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６）精製からの画分のＵＶ吸光度トレースを示す。 図５２−１の続き。 図５３Ａ−５３Ｅは、一本鎖ｇＬ／ｇＨ−フェリチンナノ粒子（配列番号４１４）の精製および特徴付けを示す図である。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６精製画分のＵＶ吸光度トレース（図５３Ａ）、ならびに精製から選択された画分のクーマシー（図５３Ｂ）およびウエスタンブロット（図５３Ｃ）分析（Ｌは、分子量ラダーを示し、１５０および２５０ｋＤａのバンドは１５０および２５０ｋＤａのバンドの位置で標識され、図５３Ｂ右に示される）。また、一本鎖ナノ粒子の動的光散乱（図５３Ｄ）および電子顕微鏡（図５３Ｅ）分析を提示する。 図５３−１の続き。 図５３−２の続き。 図５３−３の続き。 異なる代表的な一本鎖ｇＬ／ｇＨ−フェリチン構築物を示す図である。 スクアレンエマルジョンベースのアジュバントである、ＡＦ０３アジュバントと混合した一本鎖ｇＬ／ｇＨ三量体またはナノ粒子（ＮＰ）でマウスを免疫した後の抗体力価を示す図である。＊ＮＰ構築物をその対応する三量体構築物と比較した場合のｐ値＝＜０．０５。左から右に、構築物は、配列番号４１６、４１０、４１１、４１３、４１２、および４１４であった。 図５６Ａ−５６Ｂは、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子および陰性対照の裸のフェリチン（すなわち、いずれの非フェリチンポリペプチドまたは免疫刺激性部分にも結合していないフェリチン）と比較した、ｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号４０１）と一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子（「ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ５ ＮＰ」、配列番号４１９）の両方を含む二価組成物に対するマウスの抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答を示す図である。結果は、二価組成物を使用しても、陰性対照の裸のフェリチンによる一本鎖ｇＬ／ｇＨの結果と比較して、抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答との干渉をもたらさないことを示す。両組成物は、ＡＦ０３アジュバントを含んだ。個々の希釈液（図５６Ａ）および結合力価（図５６Ｂ）におけるＥＬＩＳＡの結果を示す。 図５７Ａ−５７Ｂは、図５７Ａ〜図５７Ｂについて記載されるように、ｇｐ２２０ナノ粒子と一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子の両方を含む二価組成物に対する抗ｇｐ２２０抗体応答を示す図である。結果は、二価組成物を使用しても、陰性対照の裸のフェリチンを用いたｇｐ２２０ナノ粒子の結果と比較して、抗ｇｐ２２０抗体応答との干渉をもたらさないことを示す。両組成物は、ＡＦ０３アジュバントを含んだ。個々の希釈液（図５６Ａ）および結合力価（図５６Ｂ）におけるＥＬＩＳＡの結果を示す。 図５８Ａは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストなどの免疫刺激性部分へコンジュゲーションのために、表面露出アミノ酸をシステインで置き換える変異を含む、ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンを含むナノ粒子の設計を示す図である。この設計に対応する例示的な配列については、配列番号４１４を参照されたい。ここで、一本鎖ｇＬ／ｇＨ抗原は、可撓性４６アミノ酸リンカーによってフェリチンに結合される。図５８Ｂは、図５８Ａによる構築物へのコンジュゲーションに適した代表的なトール様受容体アゴニスト（ＰＥＧ４−マレイミドリンカーを有するＳＭ７／８ａ）を示す。図５８Ｃは、フェリチン表面上のシステインおよびＰＥＧ４−マレイミドリンカーを介してコンジュゲートされたＳＭ７／８ａを有するｇＬ／ｇＨナノ粒子の電子顕微鏡写真（ＥＭ）画像を示す。 図５９Ａは、表面露出アミノ酸をシステインで置き換える変異を含むフェリチンの一部の構造を示す図であり、システインの位置が示される。 図５９Ｂは、フェリチン、リンカー、およびＣｐＧアジュバントを隣接させることによる、フェリチンへのＣｐＧアジュバント（配列番号５３５）のコンジュゲーションを示し、これらは、互いに近接して結合するようになる各部分の一部を示すように配向される。 ｇＬ／ｇＨ−フェリチンをコンジュゲートしていない形態（図６０Ａ）およびＳＭ７／８ａをコンジュゲートした形態（図６０Ｂ）の質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図である。主ピークの質量の差は７１１Ｄａであり、これはＳＭ７／８ａとリンカーとのコンジュゲートから予測された差にほぼ対応する。 ｇＬ／ｇＨ−フェリチンをコンジュゲートしていない形態（図６０Ａ）およびＳＭ７／８ａをコンジュゲートした形態（図６０Ｂ）の質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図である。主ピークの質量の差は７１１Ｄａであり、これはＳＭ７／８ａとリンカーとのコンジュゲートから予測された差にほぼ対応する。 ｇｐ２２０−フェリチンのコンジュゲートしていない形態（図６１Ａ）およびＳＭ７／８ａをコンジュゲートした形態（図６１Ｂ）の質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図である。主ピークの質量の差は７１４．７Ｄａであり、これはＳＭ７／８ａとリンカーとのコンジュゲーションから予測された差にほぼ対応する。 ｇｐ２２０−フェリチンのコンジュゲートしていない形態（図６１Ａ）およびＳＭ７／８ａをコンジュゲートした形態（図６１Ｂ）の質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図である。主ピークの質量の差は７１４．７Ｄａであり、これはＳＭ７／８ａとリンカーとのコンジュゲーションから予測された差にほぼ対応する。 図６２Ａ−６２Ｄは、コンジュゲートしていない（図６２Ａ、Ｃ）およびコンジュゲートした（図６２Ｂ、Ｄ）一本鎖ｇＬ／ｇＨ（図６２Ａ、Ｂ）およびｇｐ２２０（図６２Ｃ、Ｄ）フェリチンナノ粒子の電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示し、これらのナノ粒子へのＳＭ７／８ａのコンジュゲーションは、ナノ粒子構造を破壊しなかったことを示す。 図６３Ａ−６３Ｂは、コンジュゲートしたＳＭ７／８ａまたは他のアジュバントを含まない一本鎖ｇＬ／ｇＨ、別個の分子としてのＡＦ０３アジュバント、またはコンジュゲートＳＭ７／８ａを含むフェリチンナノ粒子で処置した後のマウスにおける抗体応答を示す図である。ＥＬＩＳＡの結果は、個々の希釈（図６３Ａ）および結合力価（図６３Ｂ）として示される。 図６４Ａ−６４Ｂは、単独、別個の分子としてのＡＦ０３アジュバント、またはコンジュゲートしたＳＭ７／８ａのいずれかを含むナノ粒子での処置後のマウスにおける抗体応答を示す図である。ＥＬＩＳＡの結果は、個々の希釈（図６４Ａ）および結合力価（図６４Ｂ）として示される。 図６５Ａ−６５Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定した、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートした一本鎖ｇＬ／ｇＨフェリチンナノ粒子および裸のフェリチンでの処置と比較した、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇｐ２２０ナノ粒子およびＳＭ７／８ａにコンジュゲートした一本鎖ｇＬ／ｇＨフェリチンナノ粒子での処置後のマウスにおける抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答を示す図である。結果は、混合したＡＦ０３を用いない（図６５Ａ）または混合したＡＦ０３を用いた（図６５Ｂ）実験について示される。 図６６Ａ−６６Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定した、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇｐ２２０ナノ粒子および裸のフェリチンでの処置と比較した、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇｐ２２０ナノ粒子およびＳＭ７／８ａにコンジュゲートした一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子での処置後のマウスにおける抗ｇｐ２２０抗体応答を示す図である。結果は、混合したＡＦ０３を用いない（図６６Ａ）または混合したＡＦ０３を用いた（図６６Ｂ）実験について示される。 ＥＬＩＳＡエンドポイント力価によって測定した、ＥＬＩＳＡにより測定した、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子にコンジュゲートした混合したＡＦ０３アジュバントおよび／またはＳＭ７／８ａのいずれかまたは両方を伴うまたは伴わない、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子（ｇＬ／ｇＨ＿Ｃ５、配列番号４１９）および裸のフェリチンでの処置後のマウスにおける抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答を示す図である。 ｇｐ２２０ナノ粒子にコンジュゲートした混合ＡＦ０３アジュバントおよび／またはＳＭ７／８ａのいずれかまたは両方を伴うまたは伴わない、ｇｐ２２０ナノ粒子および裸のフェリチンでの処置後のマウスにおける抗ｇｐ２２０抗体応答を示す図である。 ｇｐ２２０ナノ粒子および一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子を含む二価組成物での処置後のマウスにおける抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答を示す図である。凡例に示されるように、いくつかのナノ粒子はＳＭ７／８ａにコンジュゲートされ、いくつかのナノ粒子はＡＦ０３と混合された。鍵となる上から下へのシンボルの順序は、グラフの左から右へのシンボルの順序と一致する。 一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子およびｇｐ２２０ナノ粒子および／または裸のフェリチンを含む二価組成物での処置後のマウスにおける抗ｇｐ２２０抗体応答を示す。凡例に示されように、いくつかのナノ粒子はＳＭ７／８ａにコンジュゲートされ、いくつかのナノ粒子はＡＦ０３と混合された。キーの上から下へのシンボルの順序は、グラフの左から右へのシンボルの順序と一致する。 図７１Ａ−７１Ｄは、混合ＡＦ０３および／またはＳＭ７／８ａ（図７１Ａ、７１Ｃ、または７１Ｄ）もしくはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（図７１Ｂ）へのコンジュゲーションを伴うまたは伴わない、ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ７ナノ粒子（配列番号４２０）での処置後のマウスにおける抗体応答を示す図である。示されているのは、ＥＬＩＳＡ（図７１Ａ）によって測定されたプライム採血からのエンドポイント力価、ブースター採血（図７１Ｂ）からの個々の希釈でのＥＬＩＳＡ結果、ならびにブースター採血（図７１Ｃ）および最終採血（図７１Ｄ）からのＥＬＩＳＡによって測定されたエンドポイント力価である。 図７１−１の続き。 プライム、ブースト、および最終採血からのＥＬＩＳＡにより測定されたエンドポイント力価として、混合ＡＦ０３アジュバントおよび／またはＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションを伴うまたは伴わない、ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ５ナノ粒子（配列番号４１９）での処置後のマウスにおける抗体応答を示す図である。 プライム、ブースト、および最終採血からのＥＬＩＳＡにより測定されたエンドポイント力価として、混合ＡＦ０３アジュバントおよび／またはＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションを伴うまたは伴わない、ｇｐ２２０ナノ粒子での処置後のマウスにおける抗体応答を示す図である。 図７４Ａは、クーマシー染色により可視化された、ｇｐ２２０またはｇＬ／ｇＨのいずれかとの融合有りまたは無しでの、Ｔ．ｎｉフェリチンの軽鎖および重鎖を示す図である。図７４Ａの最も右側のレーンにおける２０、２５、７５、１００、および１５０ｋＤａのマーカーは標識される。 図７４Ｂは、ｇｐ２２０またはｇＬ／ｇＨのいずれかとの融合有りまたは無しでの、Ｔ．ｎｉフェリチンの軽鎖および重鎖を含む構築物の例を提供する。 図７５Ａ−７５Ｄは、ｇｐ２２０−Ｔ．ｎｉフェリチンのイオン交換（Ｑカラム）クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を実証する図である。ｐＨ７でのＱカラム（図７５Ａ）およびＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６，１６／６００（図７５Ｂ）からの吸光度トレース、ｐＨ７でのＱカラムからの画分のクーマシー染色（図７５Ｃ）（左からのレーンは入力（「Ｉｎ」）、フロースルー（「ＦＴ」）、分子量ラダー（左にｋＤで表示されたサイズ）、および選択された画分）、およびＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標） ６，１６／６００からの画分のクーマシー染色（図７５Ｄ）（左からのレーンは分子量ラダーであり（左にｋＤで表示されたサイズ）および選択された画分）が示される。図７５Ｅは、構築物の例を示す。 図７５−１の続き。 図７５−２の続き。 図７６Ａ−７６Ｄは、ｇＬ／ｇＨ（軽）／ｇｐ２２０（重）−Ｔ．ｎｉフェリチンのイオン交換（Ｑカラム）クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を実証する図である。ｐＨ７でのＱカラム（図７６Ａ）およびＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６，１６／６００（図７６Ｂ）からの吸光度トレース、ｐＨ７でのＱカラムからの画分のクーマシー染色（図７６Ｃ）（左からのレーンは入力（「Ｉｎ」）、フロースルー（「ＦＴ」）、分子量ラダー（左にｋＤで表示されたサイズ）、および選択された画分）、およびＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標） ６，１６／６００からの画分のクーマシー染色（図７６Ｄ）（左からのレーンは分子量ラダーであり（左にｋＤで表示されたサイズ）および選択された画分）が示される。図７６Ｅは、構築物の例を示す。 図７６−１の続き。 図７６−２の続き。 図７７Ａ−７７Ｈは、クーマシー染色によって視覚化され（図７７Ａおよび７７Ｅ）、図式的に例示され（図７７Ｂおよび図７７Ｆ）、動的光散乱（ＤＬＳ）によって特徴付けられ（図７７Ｄおよび７７Ｈ）、および電子顕微鏡写真で可視化された（図７７Ｃおよび７７Ｇ）、ｇｐ２２０−Ｔ．ｎｉフェリチンまたはｇＬ／ｇＨ（軽鎖）／ｇｐ２２０（重鎖）−Ｔ．ｎｉフェリチン構築物を示す図である。図７７Ａ〜７７Ｄは、軽鎖と重鎖の両方に融合されたｇｐ２２０を用いたデータを示す（図７７Ｂの図）。図７７Ｅ〜７７Ｈは、重鎖に融合されたｇｐ２２０および軽鎖に融合されたｇＬ／ｇＨを用いたデータを示す（図７７Ｆの図）。 図７７−１の続き。 図７７−２の続き。 図７７−３の続き。 図７８Ａ−７８Ｃは、クーマシー染色によって可視化され（図７８Ａ）、電子顕微鏡写真で可視化され（図７８Ｂ）、およびＤＬＳによって特徴付けられた（図７８Ｃ）、裸のＴ．ｎｉフェリチン粒子（すなわち、非フェリチンポリペプチドに融合されていない）を示す図である。 図７８−１の続き。 図７９Ａは、２９３のｅｘｐｉ細胞で発現された精製ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰ構築物（配列番号２２７）を用いたＳＤＳ変性クーマシー染色ゲル（左）、および（右）ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ピークを示す図である。ＳＥＣクロマトグラムの水平軸の単位はｍＬである。 図７９Ｂは、約２６．２ｎｍの動的光散乱半径を有するようにＣＨＯプールから精製されたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰを示す。 図８０Ａ−Ｂは、裸のフェリチンナノ粒子と組み合わせた一価のｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ナノ粒子組成物、または二価組成物（ｇｐ２２０と組み合わせたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ナノ粒子）によって誘発された免疫応答の評価を示す図である。図８０Ａは、Ｂ細胞中和を示す。図８０Ｂは、上皮細胞中和を示す。 図８１Ａ−Ｅは、示された抗原に対するエンドポイント結合力価を示す図である。図８１Ｆ−Ｇは、示されるようにワクチン接種されたフェレット由来の血清のＥＢＶウイルス中和アッセイを示す図である。プライム＝Ｉｎｊ．１、ブースト＝Ｉｎｊ．２。 図８１−１の続き。 図８１−２の続き。 図８１−３の続き。 図８２Ａは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２＿ＮＰ＿Ｃ１２（配列番号２２８）の精製を示す図である。矢印は、変性クーマシーゲル分析および抗フェリチン抗体を用いたウエスタンブロット分析によりピークから回収した画分を示す。 図８２Ｂは、２０．６ｎｍの粒子径半径を示す、図３１Ａにおける試料の動的光散乱分析である。 図８３Ａは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２＿ＮＰ＿Ｃ１３（配列番号２２９）の精製を示す図である。矢印は、変性クーマシーゲル分析および抗フェリチン抗体を用いたウエスタンブロット分析によりピークから回収した画分を示す。 図８３Ｂは、１７．１ｎｍの粒径半径を示す、図３２Ａにおける試料の動的光散乱分析である。 図８４Ａは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２＿ＮＰ＿Ｃ１４（配列番号２３０）の精製を示す図である。矢印は、変性クーマシーゲル分析および抗フェリチン抗体を用いたウエスタンブロット分析によりピークから回収した画分を示す。 図８４Ｂは、１６．９ｎｍの粒径半径を示す、図８４Ａにおける試料の動的光散乱分析である。 左側のＳＤＳ還元クーマシーゲルは、精製された一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２−Ｈｉｓ産物（配列番号２２６）を示す図である。タンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。右側は、一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２−Ｈｉｓ産物（配列番号２２６）の２．９オングストローム結晶構造である。Ｇｐ４２（濃い灰色であって、矢印で示す）はｇＨ／ｇＬヘテロ二量体と相互作用する。 図８６Ａ−Ｅは、（配列番号２２７〜２３１の各々におけるように）フェリチンに融合されたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２の一本鎖構築物の描画を図８６Ａに示す図である。各タンパク質間の融合は、可撓性アミノ酸リンカーまたは上記に明記された堅いアミノ酸リンカーを介する。一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２分子は、ナノ粒子上のヘテロ三量体形成の１：１：１の比を確証する。このヘテロ三量体の結晶構造は、一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２が、天然に見られる野生型ｇＨ、ｇＬ、およびｇｐ４２タンパク質と同様のヘテロ三量体形成を採用し得ることを示すために解明されている（図８６Ｂ、図８５も参照されたい）。図８６Ｃは、この一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ヘテロ三量体がフェリチンとの融合を介してナノ粒子上にどのように提示されるかのモデルである。単一のナノ粒子上に提示される一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２のコピーが２４個ある。図８６Ｄは、２９３Ｅｘｐｉ細胞における配列番号２２７の発現後の精製を示す。変性ＳＤＳクーマシーゲルは、フェリチンに融合したｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２がグリコシル化により１５０ｋＤを超えることを示す。図３５Ｅは、精製産物のネガティブ染色電子顕微鏡分析を示し、フェリチンに融合した一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２が、表面上にｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２抗原を提示するナノ粒子を首尾よく形成できることを示す。 例示的なＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰポリペプチド構造を示す図である。（図８７Ａ）各セグメントのＮ末端に対応する残基番号を列挙する線形図。番号付けは配列番号５２６による。ドメイン１〜３は、それぞれＤＩ、ＤＩＩおよびＤＩＩＩで示され、７残基（ｈｅｐｔａｄ）反復領域Ａ（ＨＲＡ）および７残基反復領域Ｂ（ＨＲＢ）もまた標識される。Ｃ末端フェリチンは標識される（フェリチンナノ粒子）。ＲＳＶ Ｆ部分のＦ１およびＦ２断片を描画の下に表示する。ペプチド２７断片（ｐ２７）融合ペプチド（ＦＰ）とフリン切断部位（フリン部位）を欠失させ、可撓性リンカーで置き換えて一本鎖Ｆ構築物を形成したＦ１とＦ２断片の間の領域をラインとして示し、描画の上に表示した。図の上の星印は、操作されたグリコシル化部位Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８ＮおよびＲ５０７Ｎのおおよその位置を示す。 例示的なＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰポリペプチド構造を示す図である。（図８７Ｂ）Ｄ２５、ＡＭ１４、１０１Ｆ、およびパリビズマブ抗体についての鍵となる中和（Ｎａｂ）エピトープを示す、融合前ＲＳＶ Ｆ部分の構造モデル。共有される融合前および融合後の構造エピトープの近似領域は、白い三角形で示される。例示的な操作されたグリコシル化部位Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８ＮおよびＲ５０７Ｎの位置は標識される。操作されたグリコシル化部位は、融合前と融合後のコンフォメーション間で構造的に共有され、Ｄ２５、ＡＭ１４、１０１Ｆおよびパリビズマブなどの抗体によって認識される鍵となる中和エピトープから離れた領域にマップされる。このように、これらの操作されたグリカン部位を含有する構築物は、依然として上記の中和抗体に結合する（データは示されていない）。 例示的なＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰポリペプチド構造を示す図である。（図８７Ｃ）ＨＲＡおよびＨＲＢ領域を有するＲＳＶ融合前Ｆタンパク質ナノ粒子（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ）の構造モデルはより濃い影の者である。得られた折り畳まれたＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物は、図８７Ｂにリストされた鍵となるエピトープを提示する２４−量体を形成することができる。 例示的なＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰポリペプチド構造を示す図である。（図８７Ｄ）ＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物ＲＦ８０８５（配列番号５０１）の電子顕微鏡写真の２Ｄクラス平均は、２４マーのフェリチンナノ粒子上のＲＳＶ Ｆ三量体部分の対称性を示す。 Ｄ２５抗体ウエスタンブロットにより測定された、２９３細胞馴化培地中で発現された、いくつかのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物の小規模発現を示す図である。ＲＦ８０９０は、配列番号５０２であり、これは、ＲＦ８０８５と同じ配列、すなわち配列番号５０１を有するＣＨＯ発現において使用されるクローニング変異体である。ＲＦ８０８５およびＲＦ８０９０は、図８７Ａに記載の欠失および一本鎖リンカーを有するＤＳ−ＣＡＶのジスルフィドおよび空洞充填変異を有するＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物であり、Ｎ末端をフェリチンに融合させたものである。ＲＦ８１００−ＲＦ８１０５およびＲＦ８１０８−ＲＦ８１１２は、それぞれ配列番号５０３〜５０８および５１１〜５１４の配列を有する。ｓｃＦ−ｐＦｅｒｒ＝ＲＳＶ Ｆポリペプチドとフェリチンの融合タンパク質。ＲＦ８０９０ベンチマークに対する構築物の発現を改善すると思われる変異は、ウエスタンブロット下に示される。注目すべき変異には、Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８ＮおよびＲ５０７Ｎ変異を介したグリカン部位の付加、ならびにウエスタンブロットで測定した馴化培地中へのＲＳＶ Ｆナノ粒子の発現および分泌を増加させた中央へリックスキャッピング変異Ｉ３２７Ｐがある。 ２９３発現からの馴化培地のウエスタンブロット分析により測定した、ＲＦ８０８５（配列番号５０１、対照構築物）およびＲＦ８１０６（配列番号５０９、ＲＦ８１０８におけるＩ２１７Ｐ変異およびＤＳ−ＣＡＶ１のジスルフィド（ＤＳ）変異を欠除するＩ２１７Ｐ変異を含む）の発現を示す図である。ＤＳを中心へリックスキャッピング変異Ｉ２１７Ｐで置き換えると、発現が有意に増加した。ＤＳを中心ヘリックスキャッピング変異で置き換えても、融合前特異的抗体Ｄ２５およびＡＭ１４への構築物の結合に影響を及ぼさない。 ＲＦ８１０６構築物（配列番号５０９）のサイズ排除クロマトグラフィー精製の結果を示す。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６調製ＳＥＣカラム上の約６５ｍｌのＲＦ８１０６ナノ粒子の保持体積は、折り畳まれた２４マーのナノ粒子と一致しており、これは、ＲＦ８１０６における変異はナノ粒子形成を妨げなかったことを示唆する。 図９１Ａ−９１Ｂは、非還元（７９Ａ）および還元（７９Ｂ）ＲＦ８１０６の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を示す図である。ＳＥＣ分析と同様に、ＤＬＳは、ＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰが予想される折り畳みナノ粒子を形成することを実証した。さらに、還元データは、粒子が還元によって破壊されなかったことを示しており、これは、変異によってフェリチン上に導入された表面露出システインへのアジュバントコンジュゲーション前に行われた（図９２を参照されたい）。 ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧへのコンジュゲーションの有無に関わらず、ＲＦ８１０６のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す図である。ＣｐＧ処理ナノ粒子のゲルシフトの増加は、ＣｐＧアジュバントをＲＳＶ Ｆナノ粒子に約４０〜５０％完了まで添加し得ることを実証した。ＣｐＧ、またはＴＬＲ７／８アゴニストＳＭ７／８などの他の免疫刺激性部分のコンジュゲーションは、融合前特異的抗体Ｄ２５およびＡＭ１４に結合する粒子の能力を阻害しなかった。 （ＲＦ８１１７、配列番号５１７）を有するＲＳＶ Ｆ、および追加のグリカン（ＲＦ８０８５、配列番号５０１、およびＲＦ８１１３、配列番号５１６）を有しないＲＳＶ Ｆを含むナノ粒子のウエスタンブロットを示す図である。ＲＦ８１１３は、ＲＦ８１０６と同様であるが、ＲＦ８１０６からのＳ１１１Ｃ表面露出システイン（フェリチン残基番号付けを使用して、すなわち、配列番号２０８のフェリチン配列中の位置に対応する）を、Ｋ７９Ｃ表面露出システイン（またフェリチン残基番号付けを使用する）に置き換えて、コンジュゲーション部位をＰｒｅ−Ｆ部分からさらに離すようにした。ＲＦ８１０６と同様に、ＲＦ８１１３は、ベンチマーク分子ＲＦ８０８５に対して改善された発現を保持する。ＲＦ８１１７は、ＲＦ８１１３と同様であるが、図８８で同定された３つのグリコシル化変異、すなわち、Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８ＮおよびＲ５０７Ｎをさらに含み、発現をさらに改善し、図８７Ｂに記載されるように、融合前Ｆおよび融合後Ｆコンフォメーション間で共有される非中和エピトープをブロックする。 潜在的トリプシン様プロテアーゼ切断部位における異なる置換を有するＲＳＶ Ｆ構築物の発現を示す図である。ＲＦ８０９０（ＣＨＯ発現ベクターに適合した異なるＤＮＡ配列を有するＲＦ８０８５と同じタンパク質配列）のＣＨＯ細胞株発現において、ポリペプチドがＦとフェリチン部分の間で切り取られ、発現の低下をもたらすことが観察された。Ｆ部分の得られた質量により、タンパク質分解は、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物のＨＲＢ、ブル−フロッグリンカー領域の近くで起こる可能性があると推定された。この領域内のリジンおよびアルギニン残基（残基約４５０〜５５０）の変異を、構築物の潜在的トリプシン様タンパク質分解を排除するために探索した。ＲＦ８１１７（Ｋ４９８ＬおよびＫ５０８Ｑ）に対するＲＦ８１２２（配列番号５１８）の変異は、２９３細胞における改善された発現をもたらし、ＣＨＯ細胞におけるタンパク質分解を減少または排除し得る。選択的変異は、発現を制限した。 図９５Ａ−Ｂは、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＲＦ８０９０、ＲＦ８１１７およびＲＦ８１４０の発現を示す図である。ＲＦ８０９０（配列番号５０１）の発現収率は、低レベルで観察された。ＤＳ−ＣＡＶ１のジスルフィドを置き換える変異、および潜在的なチプシン切断部位を除去するためのＦ部分とフェリチン部分の間のリンカーへの変異を上記のように導入して、ＲＦ８１１７（配列番号５１７）およびＲＦ８１４０（配列番号５２３）を構築し、これを安定発現ＣＨＯ細胞にクローニングした。（図９５Ａ）ＣＨＯ馴化培地中のＣＨＯ細胞の３つおよび４つのプールからのＲＦ８１１７およびＲＦ８１４０のそれぞれの発現を、Ｄ２５−ウエスタンブロット分析によりＣＨＯ馴化培地中のＲＦ８０９０の収率と比較した。ＲＦ８１１７の３つ全てのＣＨＯプール、およびＲＦ８１４０の４つ全てのＣＨＯプールは、ＲＦ８０９０よりも高い収率で発現する。（図９５Ｂ）ＯｃｔｅｔによるＤ２５融合前Ｆ特異抗体により測定したＣＨＯ馴化培地へのＲＦ８１１７の発現。左のパネルは、標準曲線を提供するプロテインＡチップ上のＤ２５への結合の応答に対してプロットされた既知濃度の２９３培地から精製されたＲＦ８１４０の応答を示す。個々のドットは、ＲＦ８１１７ ＣＨＯ馴化培地からのＤ２５結合に対する応答を表す。右のパネルは、Ｄ２５結合応答に基づくＣＨＯプール馴化培地中のＲＦ８１１７またはＲＦ８１４０の計算された収率を示す。ＲＦ８１１７とＲＦ８１４０の両方は、Ｄ２５およびＡＭ１４の結合によって測定すると培地中で発現され、２９３細胞と同様に、ＣＨＯ細胞は、融合前Ｆ三量体構造を保持する折り畳まれた様式でＰｒｅ−Ｆ−ＮＰを発現することができることを実証した。 図９５−１の続き。 図９６Ａ−Ｂは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ ＲＦ８１１７に対する中和抗体応答。（図９６Ａ）ＤＳ−ＣＡＶ１（Ｐｒｅ−Ｆ三量体、配列番号５２５）、融合後Ｆ三量体（Ｐｏｓｔ−Ｆ三量体、配列番号５２４）または操作されたグリコシル化を有するＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ、ＲＦ８１１７、配列番号５１７）の高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価の比較をＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した。全てのＲＳＶポリペプチドを、本明細書に記載されるように、アジュバントＡＦ０３とともに投与した。全体を通じて、別段の記載がない限り、ＡＦ０３は、ＲＳＶポリペプチドまたはナノ粒子とともに投与されたが、それにコンジュゲートされなかった。ＲＳＶポリペプチドおよび用量は、ｘ軸の下に表示される。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ免疫と比較した高用量反応の統計学的解析が示される。（図９６Ｂ）ＤＳ−ＣＡＶ１（Ｐｒｅ−Ｆ三量体）、操作されたグリコシル化を伴わないＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３、配列番号５１６）、または操作されたグリコシル化を伴うＰｒｅ−Ｆ−ＮＰを用いた高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価の比較をＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した。全てのＲＳＶポリペプチドは、本明細書に記載されるように、アジュバントＡＦ０３（いずれのポリペプチドまたはナノ粒子にもコンジュゲートしていない）とともに投与された。ＲＳＶポリペプチドおよび用量は、ｘ軸の下に表示される。 図９７Ａ−Ｄは、マウスまたは非ヒト霊長類モデルにおいて、融合後Ｆ三量体（配列番号５２４）またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）を用いた免疫によって誘発されたＲＳＶ融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１）結合抗体およびＲＳＶ中和抗体の比較を示す図である。（図９７Ａ）融合後ＦとＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）との間の免疫からマウスにおいて誘発された融合前Ｆ三量体結合抗体応答を比較する。（図９７Ｂ）融合後ＦおよびＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）による免疫からマウスにおいて誘発された中和抗体応答を示す。（図９７Ｃ）アジュバントの有無に関わらず、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰによって非ヒト霊長類において誘発された融合前Ｆ三量体結合抗体応答（ＡＦ０３、下記括弧内に示される）を比較する。（図９７Ｄ）ＡＦ０３アジュバントの有無に関わらず、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）による免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価を比較する。マウスにおいては、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは、融合後三量体と比較して、高い融合前のＦ結合応答およびＲＳＶ中和反応を誘発する。非ヒト霊長類においては、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは、強力な中和反応を誘発する。 図９７−１の続き。 図９８Ａ−９８Ｂは、操作されたグリコシル化部位が融合後エピトープをブロックすることを示す図である。（図９８Ａ）Ｏｃｔｅｔにより測定した、高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）での操作されたグリコシル化を伴わないＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３）、または操作されたグリコシル化を伴うＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（操作されたＧｌｙ粒子）による免疫によって誘発された融合前Ｆ（ＤＳ−ＣＡＶ１）に対する抗体応答を示す。（図９８Ｂ）Ｏｃｔｅｔにより測定した、高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）での操作されたグリコシル化を伴わないＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３）、または操作されたグリコシル化を伴うＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１７）による免疫によって誘発された融合後三量体に対する抗体応答を示す。上記のように、全てのＲＳＶポリペプチドを免疫中にＡＦ０３と混合した。ＲＦ８１１３とＲＦ８１１７はいずれも、融合前Ｆに対する強固な抗体応答を誘発するが、ＲＦ８１１７によって誘発される融合後Ｆ抗体応答は、大幅に低下する。これは、共有される融合前エピトープおよび融合後エピトープへの操作されたグリカンマッピングによる（図８８Ｂ）。 図９９Ａ−Ｃは、操作されたグリコシル化部位による非中和エピトープのブロッキングを示す図である。（ＦＩＧ９９Ａ）ＶＥＲＯ細胞アッセイにより測定したマウス試験における０．１μｇ用量での野生型グリコシル化部位（「Ｗｔグリカン粒子」、ＲＦ８１１３、配列番号５１６）を有するＰｒｅ−Ｆ ＮＰ対追加的な操作されたグリコシル化部位（「＋グリカン粒子」、ＲＦ８１１７、配列番号５１７）を有するＰｒｅ−Ｆ ＮＰによる免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価の比較。（図９９Ｂ）マウス研究における０．１μｇ用量でのＷｔグリカン粒子（ＲＦ８１１３、配列番号５１６）対＋グリカン粒子（ＲＦ８１１７、配列番号５１７）による免疫によって誘発されたＲＳＶ融合後Ｆ三量体結合抗体応答の比較。（図９９Ｃ）パネルＡおよびＢからの結合力価に対する測定された中和力価の比は、操作されたグリカンが、機能的な中和抗体応答を低下させなかったが、共有された融合前後エピトープに誘発された非中和抗体を低下させ（図８７Ｂ）、それによって中和／結合抗体比を改善したことを実証する。 図９９−１の続き。 図１００Ａ−Ｄは、フェリチンナノ粒子にコンジュゲートしたＲＳＶ Ｇ中央ドメインペプチド（Ｇｃｃ）の特徴付けを示す図である。（図１００Ａ）Ｇｃｃ−ＮＰ抗原を形成する、ＲＳＶ Ｇ中央ドメイン（配列番号５２９）のフェリチンナノ粒子へのクリックコンジュゲーションを示すクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（図１００Ｂ）Ｇｃｃ−ＮＰの構造モデル。（図１００Ｃ）マウス研究における、Ｇｃｃペプチド単独（Ｇｃｃペプチド、配列番号５２９）対ナノ粒子にコンジュゲートしたＧｃｃペプチド（Ｇｃｃ−ＮＰ）による免疫によって誘発されたＧｃｃ結合抗体応答の比較。未処理血清からの代表的な反応を白枠で示し、２回目の免疫後からの反応を薄灰色枠で示し、３回目の免疫後からの反応を濃灰色枠で示す。（図１００Ｄ）ＨＡＥ細胞アッセイによって測定された、３回目の注射後のマウス研究におけるＧｃｃペプチド（配列番号５２９）対Ｇｃｃ−ＮＰによる免疫によって誘発されたＲＳＶ中和力価の比較。未処置動物からの血清およびＧｃｃペプチドで免疫した動物からの血清をプールし、力価をバーとして示した。 図１００−１の続き。 図１０１Ａ−Ｃは、ＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０）およびＧｃｃ−ＮＰの同時投与は、中和反応を誘発する。マウスを、抗原あたり１μｇ用量で、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０）単独、Ｇｃｃ−ＮＰ単独、またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰを組み合わせて免疫した。上記のように、全ての免疫をＡＦ０３でアジュバント化した。（図１０１Ａ）ＲＦ８１４０単独（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ）またはＲＦ８１４０およびＧｃｃ−ＮＰ（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ＋Ｇｃｃ−ＮＰ）によるマウスの免疫は、融合前Ｆ三量体に結合する抗体を誘発した。（図１０１Ｂ）Ｇｃｃ−ＮＰ単独（Ｇｃｃ−ＮＰ）またはＲＦ８１４０およびＧｃｃ−ＮＰ（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＯ＋Ｇｃｃ−ＮＰ）によるマウスの免疫は、Ｇｃｃペプチドに結合する抗体を誘発した。（図１０１Ｃ）Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ単独、Ｇｃｃ−ＮＰ単独、またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰとＧｃｃ−ＮＰの同時投与のいずれかで免疫した動物は、ＨＡＥ中和アッセイで測定した場合、第２および第３の免疫後に中和反応を誘発する。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ＋Ｇｃｃ−ＮＰの同時投与は、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ単独による免疫によって誘発されるものよりも優れた中和反応を誘発した。 図１０１−１の続き。 図１０２Ａ−Ｂは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰの同時投与は、Ｐｒｅ−融合Ｆ三量体またはＧｃｃ−ナノ粒子に結合する抗体の誘発と干渉しない。Ｆ感受性ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定された中和力価は、図１０２Ａの左側にあり、ＦおよびＧ感受性ＨＡＥアッセイによって測定された中和力価は、図１０２Ｂの右側に示される。動物の免疫は、図１０１と同様であった。免疫に使用されるＲＳＶポリペプチドは、水平軸下にある。黒いバーは、図１０１に記載される免疫群からプールされた血清を表し、同様に標識される。未処置動物の血清もまた黒いバーで示され、比較のために表示される。融合前Ｆ三量体で枯渇された血清は白色で示され、対応する黒いバーの右側にある。Ｇエクトドメインで枯渇された血清は、対応する黒いバーのちょうど右側に、斜めにストライプされた棒で示される。融合前Ｆ三量体で枯渇され、続いてＧエクトドメインで枯渇された血清は、垂直にストライプされたバーで示される。（図１０２Ａ）中和力価は、ＲＦ８１４０免疫およびＲＦ８１４０＋Ｇｃｃ−ＮＰ同時投与由来の血清について、ＶＥＲＯ細胞アッセイにおいて観察されたが、未処理血清またはＧｃｃ−ＮＰ免疫単独由来の血清では観察されなかった。ＲＦ８１４０またはＲＦ８１４０＋Ｇｃｃ−ＮＰ群の血清を融合前Ｆ三量体で枯渇させると、測定可能な中和力価が低下した。（図１０２Ｂ）中和力価は、ＲＦ８１４０、Ｇｃｃ−ＮＰ、またはＧｃｃ−ＮＰと同時投与したＲＦ８１４０で免疫した動物由来の血清について、ＨＡＥ細胞アッセイにおいて観察された。未処置動物からの血清は中和反応を示さなかった。融合前Ｆ三量体で枯渇させたＲＦ８１４０で免疫した動物由来の血清は、測定可能な中和力価の低下を示す。Ｇエクトドメインで枯渇させたＧｃｃ−ＮＰで免疫した動物由来の血清は、測定可能な中和力価の低下を示す。ＲＦ８１４０とＧｃｃ−ＮＰの同時投与で免疫した動物由来の血清は、融合前Ｆ三量体単独で枯渇させた場合、測定可能な中和力価の低下を示さないが、融合前Ｆ三量体とＧエクトドメインの両方で枯渇させた場合、測定可能な中和力価の低下を示す。まとめると、これらのデータは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰとＧｃｃ−ＮＰの同時投与は、融合前ＦまたはＧに対する中和抗体を誘発する抗原のそれぞれの能力と干渉しないことを示唆する。 図１０３Ａ−Ｂは、ＡＦ０３、ＳＰＡ０９もしくはミョウバンによるＲＦ８１１７またはＲＦ８１４０のアジュバント化は、非アジュバント化ＲＦ８１１７と比較して、マウスにおいて優れた中和反応を誘発する。（図１０３Ａ）非アジュバント化（Ｎｏ Ａｄｊ）、ミョウバンでアジュバント化またはＡＦ０３でアジュバント化のいずれかのＲＦ８１１７で免疫したマウス由来の血清の中和力価は、ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した場合に示される。（図１０３Ｂ）非アジュバント化（Ａｄｊなし）のＲＦ８１１７、ＳＰＡ０９でアジュバント化されたＲＦ８１１７、またはＡＦ０３でアジュバント化されたＲＦ８１４０のいずれかで免疫したマウス由来の血清の中和力価は、ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した場合に示される。ＲＦ８１１７またはＲＦ８１４０のいずれについての全ての場合において、未処置マウスのアジュバント化群では、非アジュバント化非群よりも高い中和力価が誘発された。 図１０４Ａ−Ｂは、ＡＦ０３またはＳＰＡ０９を用いたＲＦ８１４０のアジュバント化は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において、非アジュバント化Ｆ８１４０免疫と比較して優れた中和反応を誘発する。（図１０４Ａ）ＥＬＩＳＡで測定された、非アジュバント化（Ａｄｊなし）、ＡＦ０３でアジュバント化またはＳＰＡ０９でアジュバント化（以下に示されように、ＳＰＡ０９の２用量を使用した）のいずれかのＲＦ８１４０による免疫後のＮＨＰ血清で測定された融合前Ｆ三量体結合応答。全ての時点で、ＡＦ０３またはＳＰＡ０９によるアジュバント化は、優れた中和反応を誘発する。（図１０４Ｂ）非アジュバント化（Ｎｏ Ａｄｊ）、ＡＦ０３でアジュバント化された、またはＳＰＡ０９でアジュバント化された（下記に示すように、ＳＰＡ０９の２用量を使用した）のいずれかの、ＲＦ８１４０で免疫したＮＨＰからの血清の中和力価を、ＶＥＲＯ細胞アッセイにより測定した。全ての場合において、アジュバントによるＲＦ８１４０による免疫は、全ての時点において、アジュバント非アジュバント投与群よりも高い中和力価を誘導する。 図１０４−１の続き。 図１０５Ａ−Ｂは、ＲＦ８１４０のＴＬＲ７／８アゴニストＳＭ７／８またはＴＬＲ９アゴニストＣｐＧへのコンジュゲーションは、非アジュバント化ＲＦ８１４０単独と比較して優れた融合前Ｆ結合力価を誘導する。（図１０５Ａ）未処置マウス、非アジュバント化ＲＦ８１４０で免疫したマウス、ＳＭ７／８アジュバントとコンジュゲートされたＲＦ８１４０で免疫したマウス、１３０ｎｇのＳＭ７／８でアジュバント化されたＲＦ８１４０、または２０μｇのＳＭ７／８でアジュバント化されたＲＦ８１４０のいずれかからの血清において測定された融合前Ｆ三量体結合応答が示されている。ＳＭ７／８にコンジュゲートされたＲＦ８１４０は、非アジュバント化群またはＳＭ７／８アジュバント化群よりも高い融合前Ｆ三量体結合力価を誘発する。（図１０５Ｂ）未処置マウス、非アジュバント化ＲＦ８１４０で免疫したマウス、ＣｐＧアジュバントとコンジュゲートされたＲＦ８１４０、６８０ｎｇのＣｐＧでアジュバント化されたＲＦ８１４０、または２０μｇのＳＭ７／８でアジュバント化されたＲＦ８１４０のいずれかで免疫したマウスからの血清において測定された融合前Ｆ三量体結合応答を示す。ＳＭ７／８にコンジュゲートされたＲＦ８１４０は、非アジュバント化群またはＳＭ７／８アジュバント化群よりも高い融合前Ｆトリマー結合力価を誘発する。 図１０６Ａ−Ｇは、Ｆサブユニットワクチン候補は、ＭＩＭＩＣシステムにおいて、Ｐｒｅ−Ｆ指向性中和抗体およびＴｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘発する。（図１０６Ａ）ＭＩＭＩＣシステムにおける抗ｐｒｅ−Ｆ力価は、１０ｎｇ／ｍｌのＰｒｅ−Ｆ ＮＰで各Ａｇをモル等量濃度のＦでプライミングした後、ＡＦにより測定された（ｎ＝４８〜４９ドナー／群）。（図１０６Ｂ）微小中和力価を測定し、国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）で表す。（図１０６Ｃ）抗ｐｒｅ−Ｆとｐｏｓｔ−Ｆとの比＞１は、Ｆ結合後抗体と比較して、Ｆ結合前抗体のより高いレベルを表し、一方、比値＜１は、ポストＦに対するより大きな抗体応答を表す。（図１０６Ｄ）Ｆタンパク質負荷された標的細胞で再刺激された活性化ＣＤ１５４＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＮＦαの産生は、フローサイトメトリーを用いて測定された（ｎ＝４８）。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ−ＨＳＤ多重比較によって決定された。（図１０６Ｅ）ヒト対象における既存の抗体力価（血清状態）は、ＭＩＭＩＣシステムにおけるＲＳＶ免疫応答の大きさと強く相関する。各ドナーからの血清中の抗Ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧを示す線形回帰プロット対総抗Ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧ応答をソフトウェアまたはアルゴリズムにより生成し、共通の勾配に関するｐ値を統計学的方法により分析した（ｎ＝５０）。Ｙ軸は、ＲＳＶによるプライミング後に得られた抗Ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧレベルを表す。（図１０６Ｆ）図１０６Ｅと同様に、Ｆサブユニットワクチン候補でプライミングした後の各ドナーからの血清中の抗Ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧ対総抗Ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧを示す線形回帰プロット（ポストＦは四角形、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは円形、およびＤＣ−Ｃａｖ１は菱形）。抗Ｐｒｅ−ＩｇＦ ＩｇＧの既存循環力価は、１９９，８００〜３，０３７，６００，０００の範囲であった。各ドナーは、各々、各ドナーのＩｇＧ値を表す。（図１０６Ｇ）ヒトＢ細胞において、Ｇｃｃペプチド単独（Ｇｃｃペプチド）対ナノ粒子にコンジュゲートされたＧｃｃペプチド（Ｇｃｃ−ＮＰ）による処置によって誘発されたＧｃｃ結合抗体応答の比較。上述のように、比較のために処置なし群を示す。 図１０６−１の続き。 図１０６−２の続き。 図１０６−３の続き。 図１０７Ａ−Ｃは、低用量（０．５μｇ）のＲＳＶ Ｇｃｃ−フェリチンナノ粒子（「Ｇｃｃ−ＮＰ」）によって誘発される中和抗体力価を示す図である。陰性対照および陽性対照として未処理および高度免疫血清を用いて、２回目の免疫の２週間後（２ｗｐ２）に採取された血清（図１０７Ａ）、または３回目の免疫の２週間後（２ｗｐ３）に採取された血清（図１０７Ｂ）から、ＲＳＶ Ａ２ Ｇｃｃ配列（ＡＦ０３で製剤化される）を含有するＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰによる免疫から誘発されたＲＳＶ Ａ株ＨＡＥ中和力価が示される。また、３回目の免疫の２週間後（２ｗｐ３）に採取された血清（図１０７Ｃ）から、ＲＳＶ Ａ２ Ｇｃｃ配列（ＡＦ０３で製剤化される）を含有するＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰによる免疫から誘発されたＲＳＶ Ｂ株ＨＡＥ中和力価もまた示される。 図１０８Ａ−Ｂは、ＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発されたＲＳＶ Ａ２株抗原結合抗体応答を示す図である。（図１０８Ａ）高用量（５μｇ）のＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発された、２回目の注射から２週間後（薄灰色枠）および３回目の注射から２週間後（濃灰色枠）に測定されたＧｃｃ Ａ２株に対して誘発されたＧｃｃ結合抗体応答。未処置マウスの血清反応は陰性対照として示される。（図１０８Ｂ）低用量（０．５μｇ）のＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発された、２回目の注射から２週間後（薄灰色枠）および３回目の注射から２週間後（濃灰色枠）に測定されたＧｃｃ Ａ２株に対して誘発されたＧｃｃ結合抗体応答。 図１０９Ａ−Ｂは、ＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発されたＲＳＶ Ｂ１株抗原結合抗体応答を示す図である。（図１０９Ａ）高用量（５μｇ）のＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発された、２回目の注射から２週間後（薄灰色枠）および３回目の注射から２週間後（濃灰色枠）に測定されたＧｃｃ Ｂ１株に対して誘発されたＧｃｃ結合抗体応答。未処置マウスの血清反応は、陰性対照として示される。（図１０９Ｂ）低用量（０．５μｇ）のＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰによって誘発された、２回目の注射から２週間後（薄灰色枠）および３回目の注射から２週間後（濃灰色枠）に測定されたＧｃｃ Ｂ１株に対して誘発された、Ｇｃｃ結合抗体応答。
本明細書において、免疫に使用するための新規フェリチンプラットフォームポリペプチドおよびナノ粒子を提供する。このフェリチンは、免疫刺激性部分を、操作された表面に露出したシステインに直接コンジュゲートすることができるように、表面に露出したアミノ酸において非システインアミノ酸をシステインに変化させる変異を含み得る。本明細書に提供されるフェリチンポリペプチドは、非フェリチンポリペプチド構成要素をさらに含み得、個別の分子としてのアジュバントと共に単独で、および／またはナノ粒子の一部として投与した場合に抗原性であり得、自己アジュバント性であり得る。フェリチンプラットフォームタンパク質およびナノ粒子の設計は、免疫原性を増加させ、および／またはアジュバントを個別に投与する必要性をなくすまたは低減させ、同様にフェリチンに会合した（例えば、融合した）非フェリチンポリペプチドに対する免疫応答を誘発するために必要なアジュバント／免疫刺激性部分の量をおそらく低減させ得る。本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸も同様に提供される。
Ｉ．定義
「フェリチン」または「フェリチンタンパク質」は、本明細書で使用される場合、Ｈ．ピロリフェリチン（配列番号２０８または２０９）、またはＰ．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）フェリチン、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）フェリチン、もしくはヒトフェリチンのような本明細書で考察される別のフェリチンと検出可能な配列同一性を有し、鉄を例えば細胞内もしくは組織内で貯蔵する、または鉄を血流に運ぶ役目を果たすタンパク質を指す。重鎖および軽鎖（例えば、イラクサギンウワバおよびヒトフェリチン）として知られる２つのポリペプチド鎖として存在するフェリチンを含むそのような例示的なフェリチンを、以下で詳細に考察する。一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に、例えば表１（配列表）に開示されるフェリチン配列と少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。フェリチンは、完全長の天然に存在する配列の断片であり得る。「野生型フェリチン」は、本明細書で使用される場合、その配列が天然に存在する配列からなるフェリチンを指す。フェリチンはまた、完全長のフェリチン、または野生型フェリチンとはそのアミノ酸配列において１つまたはそれ以上の差を有するフェリチンの断片も含む。
本明細書で使用される場合、「フェリチン単量体」は、他のフェリチン分子と集合していない単一のフェリチン分子（例えば、該当する場合、単一のフェリチン重鎖または軽鎖）を指す。「フェリチン多量体」は、複数の会合したフェリチン単量体を含む。「フェリチンタンパク質」は、単量体フェリチンおよび多量体フェリチンを含む。
本明細書で使用される場合、「フェリチン粒子」は、球状形態に自己集合したフェリチンを指す。フェリチン粒子は時に、「フェリチンナノ粒子」または単に「ナノ粒子」と呼ばれる。一部の実施形態では、フェリチン粒子は、２４個のフェリチン単量体（または該当する場合、全体で２４個の重鎖および軽鎖）を含む。
「ハイブリッドフェリチン」は、本明細書で使用される場合、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部を有するＨ．ピロリフェリチンを含むフェリチンを指す。ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部として使用される例示的な配列を、配列番号２１７として示す。ハイブリッドフェリチンでは、免疫刺激性部分の結合部位がフェリチン粒子表面上に均一に分布するように、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部をＨ．ピロリフェリチンに融合することができる。「ウシガエルリンカー」は、本明細書で使用される場合、配列番号２１７の配列を含むリンカーである。ハイブリッドフェリチンはまた、時に「ｂｆｐＦｅｒｒ」または「ｂｆｐフェリチン」と呼ばれる。ウシガエル配列を含むいずれの構築物も、ウシガエル配列がなくとも、例えばリンカーまたは代替リンカーがなくとも提供することができる。例示的なウシガエルリンカー配列を、表１に提供する。表１はウシガエルリンカーを示すが、リンカーまたは代替リンカーを有しない同じ構築物を作製してもよい。
「Ｎ−グリカン」は、本明細書で使用される場合、タンパク質のＮ（アスパラギン）残基のアミド窒素でタンパク質に結合した糖質鎖を指す。そのため、Ｎ−グリカンは、Ｎグリコシル化のプロセスによって形成される。このグリカンは多糖類であり得る。
「グリコシル化」は、本明細書で使用される場合、タンパク質への糖質単位の付加を指す。
「免疫応答」は、本明細書で使用される場合、抗原またはワクチンのような刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、または多形核細胞のような免疫系の細胞の応答を指す。免疫応答は、例えばインターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関係する体の任意の細胞を含み得る。免疫応答は、生得のおよび／または適応免疫応答を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「保護的免疫応答」は、対象を感染から保護する（例えば、感染を防止する、または感染に関連する疾患の発生を防止する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は、当技術分野で周知であり、例えばリンパ球（例えば、ＢまたはＴ細胞）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生等を測定することを含む。「抗体応答」は、抗体が産生される免疫応答である。
本明細書で使用される場合、「抗原」は、生物に曝露または投与した場合に、免疫応答を誘発する作用物質、および／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）が結合する、もしくは抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される場合）に結合する作用物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、生物において液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。あるいはまたは加えて、一部の実施形態では、抗原は、生物において細胞性応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘発する。特定の抗原は、標的生物（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つまたはいくつかのメンバーにおいて免疫応答を誘発し得るが、標的生物種の全てのメンバーにおいて誘発するわけではない。一部の実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、抗原は、抗体および／またはＴ細胞受容体に結合するが、生物において特定の生理的応答を誘導しても誘導しなくてもよい。一部の実施形態では、例えば、抗原は、ｉｎ ｖｉｖｏでそのような相互作用が起こるか否かによらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体および／またはＴ細胞受容体に結合し得る。一部の実施形態では、抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特異的液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。抗原は、本明細書に記載されるフェリチン（例えば、１つまたはそれ以上の変異を含む）および非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質を含む。
「免疫刺激性部分」は、本明細書で使用される場合、フェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合し、免疫系の構成要素を活性化することができる（単独で、またはフェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに結合した場合）部分を指す。例示的な免疫刺激性部分は、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）、例えば、ＴＬＲ４、７、８、または９のアゴニストを含む。一部の実施形態では、免疫刺激性部分はアジュバントである。
「アジュバント」は、本明細書で使用される場合、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクルを指す。アジュバントには、抗原を吸着させた無機質（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、抗原溶液を鉱油または水中で乳化させた油中水型または水中油型乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント）を挙げることができるがこれらに限定されない。時に、抗原性をさらに増強するために死菌マイコバクテリア（例えば、フロイント完全アジュバント）を含める。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ）もまた、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントはまた、Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび共刺激分子のような生物学的分子も含み得る。アジュバントは、組成物中の個別の分子として、またはフェリチンもしくは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合（コンジュゲート）して投与してもよい。
「抗原性フェリチンポリペプチド」および「抗原性フェリチンタンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、フェリチン、および分子が非フェリチンポリペプチドに関して抗原性であるのに十分な長さの非フェリチンポリペプチドを含むポリペプチドを指す。抗原性フェリチンポリペプチドはさらに、免疫刺激性部分を含み得る。抗原性は、より大きい構築物の一部としての非フェリチン配列の特色であり得る。すなわち、構築物は、フェリチンを有しない非フェリチンポリペプチド（および該当する場合、免疫刺激性部分）がそうすることができるか否かによらず、非フェリチンポリペプチドに対する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。非フェリチンポリペプチドは、抗原性フェリチンポリペプチドの文脈において、その宿主において病原体に対する保護的免疫応答を生じることができる、病原体のポリペプチドから得た、それに由来する、またはそれと類似の分子、例えば病原体に由来する分子全体または分子の断片であり得る。非フェリチンポリペプチドは、天然に存在する配列を含んでもよく、またはその構造が天然に存在する分子と非同一であるように人工的に設計もしくは改変することができる。例えば、ポリペプチドは、それがより大きい免疫原性を有するように、または対象において不適切な応答（例えば、自己免疫応答）を媒介するリスクが減少するように、その天然に存在する型とは異なり得る。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、ＲＳＶ、インフルエンザ、ＥＢＶ、またはＯｓｐＡポリペプチドであり、この場合抗原性フェリチンポリペプチドはまた、「抗原性Ｘポリペプチド」であり、ＸはＲＳＶ、インフルエンザ、ＥＢＶ、またはＯｓｐＡである。しかし、明白にするために、抗原性ＲＳＶ、インフルエンザ、ＥＢＶ、またはＯｓｐＡポリペプチドは、フェリチンを含む必要はない。「抗原性ポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、抗原性フェリチンポリペプチド、および抗原性ＲＳＶ、ＥＢＶ、またはＯｓｐＡポリペプチドのいずれかまたは両方であるポリペプチドを指す。
「抗原性ＥＢＶポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、分子がＥＢＶに関して抗原性であるのに十分な長さのＥＢＶアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。抗原性は、フェリチンまたはルマジンシンターゼタンパク質のような異種配列、および／または免疫刺激性部分をさらに含む構築物の一部としてのＥＢＶ配列の特色であり得る。すなわち、ＥＢＶ配列が異種配列をさらに含む構築物の一部である場合、構築物は、異種配列を有しないＥＢＶ配列がそうすることができるか否かによらず、抗ＥＢＶ抗体を生成する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。
「抗原性ＲＳＶポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、分子がＲＳＶに関して抗原性であるのに十分な長さのＲＳＶアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。抗原性は、フェリチンのような異種配列、および／または免疫刺激性部分をさらに含む構築物の一部としてのＲＳＶ配列の特色であり得る。すなわち、ＲＳＶ配列が異種配列をさらに含む構築物の一部である場合、構築物は、異種配列を有しないＲＳＶ配列がそうすることができるか否かによらず、抗ＲＳＶ抗体を生成する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。
「抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、分子がインフルエンザポリペプチドに関して抗原性であるフェリチンおよびインフルエンザポリペプチドを含む分子を指す。抗原性は、より大きい構築物の一部としてのインフルエンザポリペプチドの特色であり得る。すなわち、構築物は、フェリチンを有しないインフルエンザポリペプチドがそうすることができるか否かによらず、インフルエンザポリペプチドに対する抗体を生成する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドおよびフェリチンは、融合タンパク質として遺伝子融合されている。一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドおよびフェリチンは、例えば化学コンジュゲーションによって非遺伝的に連結されている。
「抗原性ＯｓｐＡポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドがＯｓｐＡに関して抗原性であるのに十分な長さのＯｓｐＡの全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。完全長のＯｓｐＡは、以下に定義するように、膜貫通ドメインおよびエクトドメインを含む。抗原性は、フェリチンまたはルマジンシンターゼタンパク質のような異種配列をさらに含む構築物の一部としてのＯｓｐＡ配列の特色であり得る。すなわち、ＯｓｐＡが異種配列をさらに含む構築物の一部である場合、構築物は、異種配列を有しないＯｓｐＡ配列がそうすることができるか否かによらず、抗ＯｓｐＡ抗体を生成する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。
「自己アジュバント性」は、本明細書で使用される場合、フェリチンおよび免疫刺激性部分が同じ分子実体中にあるように、フェリチンおよびフェリチンに直接コンジュゲートされた免疫刺激性部分を含む組成物またはポリペプチドを指す。非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンポリペプチドを、免疫刺激性部分にコンジュゲートして、自己アジュバント性ポリペプチドを生成してもよい。
「表面に露出した」アミノ酸は、本明細書で使用される場合、該当する場合に、多量体形成後、タンパク質がその本来の三次元コンフォメーションにある場合に溶媒分子が接触することができる側鎖を有するタンパク質（例えば、フェリチン）中のアミノ酸残基を指す。このように、例えば２４量体を形成するフェリチンの場合、表面に露出したアミノ酸残基は、フェリチンが２４量体として、例えばフェリチン多量体またはフェリチン粒子として集合する場合に、その側鎖に溶媒が接触することができる残基である。
本明細書で使用される場合、「対象」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「対象」はヒトを指す。一部の実施形態では、「対象」は非ヒト動物を指す。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または虫を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。本発明のある特定の実施形態では、対象は成体、青年期、または幼体である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に使用され、互換的であると意図される。
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」は、例えば病原体に対して免疫応答を生成することが意図される組成物の投与を指す。ワクチン接種は、病原体に対する曝露および／または１つもしくはそれ以上の症状の発生の前、間、および／または後に投与することができ、一部の実施形態では、病原体に対する曝露の前、間、および／または直後に投与することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン接種組成物の適切な間隔を空けた複数回の投与を含む。
本明細書で使用される場合、「ＥＢＶポリペプチド」は、ＥＢＶによってコードされるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。同様に、ｇＬ、ｇＨ、ｇｐ４２、およびｇｐ２２０ポリペプチドはそれぞれ、ＥＢＶによってコードされるｇＬ、ｇＨ、ｇｐ４２、またはｇｐ２２０アミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。例えば、ＥＢＶコードポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドは、必然的にＥＢＶコードポリペプチドの一部を含む。用語「ｇＬポリペプチド」、「ｇＨポリペプチド」、「ｇｐ４２ポリペプチド」、および「ｇｐ２２０ポリペプチド」はそれぞれ、「ＥＢＶ ｇＬポリペプチド」、「ＥＢＶ ｇＨポリペプチド」、「ＥＢＶ ｇｐ４２ポリペプチド」、および「ＥＢＶ ｇｐ２２０ポリペプチド」と互換的に使用される。抗原性ポリペプチドの一部または全てとしてのＥＢＶポリペプチドによる免疫は、ＥＢＶによる感染症に対する保護を付与し得る。本文がそれ以外であると述べていない限り、ＥＢＶポリペプチドを含む本明細書に開示される任意のポリペプチドは、ＥＢＶ（例えば、ＥＢＶのｇＬおよびｇＨの全てもしくは一部、またはＥＢＶのｇＬ、ｇＨ、およびｇｐ４２の全てもしくは一部）によってコードされる複数の配列の全てまたは一部を含み得る。
本明細書で使用される場合、ＥＢＶポリペプチドの文脈における「単量体」または「単量体構築物」は、一本鎖タンパク質として発現される構築物を指す。単量体は、一本鎖で発現されるＥＢＶのｇＬおよびｇＨ、または一本鎖で発現されるＥＢＶのｇＬ、ｇＨ、およびｇｐ４２を含み得る。
本明細書で使用される場合、ＥＢＶポリペプチドの文脈における「三量体」または「三量体構築物」は、Ｔ４ファージフィブリチンに由来するフォルドン三量体形成ドメインのような三量体形成ドメインと共にＥＢＶのｇＬおよび／またはｇＨを含む構築物を指す。ヒトコラーゲンＸＶＩＩＩ三量体形成ドメイン（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６；６：２８６４３を参照されたい）およびＬ１ＯＲＦ１ｐ三量体形成ドメイン（例えば、Ｋｈａｚｉｎａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００９ Ｊａｎ １２；１０６（３）：７３１−３６を参照されたい）のような他の三量体形成ドメインもまた当技術分野で公知であり、三量体構築物において使用することができる。
「抗原性部位０」または「部位０エピトープ」は、本明細書で使用される場合、野生型ＲＳＶ（配列番号５２６）のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９を含む、融合前ＲＳＶ Ｆ三量体の頂点に位置する部位を指す。部位０エピトープは、Ｄ２５およびＡＭ１４のような、融合前ＲＳＶ Ｆに対して特異性を有する抗体の結合部位であり、部位０エピトープに対する抗体の結合は、ＲＳＶの細胞表面結合をブロックする（ＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０（６１３６）：１１１３−１１１７（２０１３）を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「抗原安定性」は、経時的なまたは溶液中での抗原の安定性を指す。
「空洞充填置換」は、本明細書で使用される場合、融合前のＲＳＶ Ｆ三量体に存在する空洞を充填するための操作された疎水性置換を指す。
「Ｆタンパク質」または「ＲＳＶ Ｆタンパク質」は、ウイルス侵入時のウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合の促進に関与するＲＳＶのタンパク質を指す。
「ＲＳＶ Ｆポリペプチド」または「Ｆポリペプチド」は、Ｆタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドを指す。
「グリカン付加」は、本明細書で使用される場合、構築物の発現を増加させる、構築物の安定性を増加させる、または融合前および融合後のコンフォメーションの間で共有されるエピトープをブロックするように操作することができる、野生型配列（例えば、野生型ＲＳＶ Ｆ）には存在しないグリコシル化部位を導入する変異の付加を指す。グリカン付加を含む改変タンパク質は、より多くのグリコシル化を有し、したがってより高い分子量を有するであろう。グリカン付加は、ＲＳＶ ＦポリペプチドがＲＳＶ Ｆの融合後コンフォメーションに対する抗体を誘発する程度を低減させることができる。
「Ｇタンパク質」または「ＲＳＶ Ｇタンパク質」は、本明細書で使用される場合、ＲＳＶとヒト気道上皮細胞との会合に関与する結合タンパク質を指す。例示的な野生型ＲＳＶ Ｇアミノ酸配列を配列番号５２７として提供する。ＲＳＶ Ｇタンパク質は、細胞外に存在するエクトドメイン（ＲＳＶ Ｇ（配列番号５２７）のアミノ酸およそ６６〜２９７）を含む。ＲＳＶ Ｇのエクトドメイン内に中央保存領域（ＧｃｃまたはＣＣＲ、配列番号５２７のアミノ酸およそ１５１〜１９３）がある。ＲＳＶ ＧのＣＣＲは、ＣＸ３Ｃモチーフを含む。ＣＸ３Ｃモチーフは、ＣＸ３ＣＲ１受容体に対するＧタンパク質の結合を媒介する。
「ヘリックスＰＲＯキャッピング」または「ヘリックスプロリンキャッピング」は、本明細書で使用される場合、ヘリックスキャップがプロリンを含む場合、ヘリックス形成を安定化できることを指す。
「プロモーター内安定化置換」は、本明細書で使用される場合、ＲＳＶ Ｆ三量体のプロモーター内の相互作用を安定化することによって融合前のコンフォメーションを安定化させる、ＲＳＶ Ｆにおけるアミノ酸置換を記載する。
「プロモーター間安定化置換」は、本明細書で使用される場合、ＲＳＶ Ｆ三量体のプロモーターと互いとの相互作用を安定化させることによって融合前コンフォメーションを安定化させる、ＲＳＶ Ｆにおけるアミノ酸置換を記載する。
「プロテアーゼ切断」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチド配列における感受性がある残基（例えば、リシンまたはアルギニン）のタンパク質分解（時に、当技術分野で「クリッピング」とも呼ばれる）を指す。
「融合後」は、ＲＳＶ Ｆに関連して本明細書で使用される場合、ウイルスと細胞膜の融合後に起こるＲＳＶ Ｆの安定なコンフォメーションを指す。
「融合前」は、ＲＳＶ Ｆに関連して本明細書で使用される場合、ウイルス−細胞相互作用の前に取り入れられるＲＳＶ Ｆのコンフォメーションを指す。
「プロトマー」は、本明細書で使用される場合、オリゴマータンパク質の構造単位を指す。ＲＳＶ Ｆの場合、ＲＳＶ Ｆ三量体の個々の単位はプロトマーである。
「血球凝集素」または「ＨＡ」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞膜上のシアル酸に対する結合に関与する任意のインフルエンザウイルスの糖タンパク質を指す（例示的な血球凝集素は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ０３４５１である）。ＨＡは、以下に記載されるＣＯＢＲＡ Ｐ１、ＣＯＢＲＡ Ｘ６、およびＣＯＢＲＡ Ｘ３のような抗ＨＡ抗体によって認識されるまたは抗ＨＡ抗体を誘発することができる合成ポリペプチドを包含する。
「ＨＡステム」は、本明細書で使用される場合、ＨＡエクトドメイン内のＨＡの保存領域から設計された操作されたインフルエンザポリペプチドを指す。保存されたとは、領域が全体としてのＨＡの配列同一性より、異なるＨＡサブタイプを有するインフルエンザの異なる株由来のＨＡの間で有意により高い配列同一性を維持することを意味する。ＨＡステム抗原は、例えばＩｍｐａｇｌｉａｚｚｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５ Ｓｅｐ １８，３４９（６２５４）：１３０１〜６頁；Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６ Ｍａｒ ７，６：２２６６６頁；Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５，６：３２９頁において詳細に考察されている。
「ノイラミニダーゼ」または「ＮＡ」は、本明細書で使用される場合、ウイルスおよび細胞グリココンジュゲート由来の末端のシアル酸残基の除去を触媒することに関与する任意のインフルエンザウイルスの糖タンパク質を指す（例示的なノイラミニダーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ０３４７２である）。
「Ｙ９８Ｆ変異」は、本明細書で使用される場合、シアル酸と直接接触する野生型ＨＡ配列中のチロシンのフェニルアラニンによる置き換えを指す。この変異に起因するフェニルアラニンの位置を図２６Ａに示す。正確な位置は一部のＨＡサブタイプにおいて異なり得るが、配列アライメントまたは構造分析によって同定することができる。ＨＡ配列にＹ９８Ｆ変異が存在すれば、対応する野生型ＨＡが、シアル酸と直接接触するチロシンを含むサブタイプであることを暗示している。
「免疫刺激性部分」は、本明細書で使用される場合、免疫系の構成要素を活性化することができる（単独で、またはフェリチンもしくは抗原性フェリチンポリペプチドに結合した場合）フェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合した部分を指す。例示的な免疫刺激性部分は、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト、例えば、ＴＬＲ４、７、８、または９を含む。一部の実施形態では、免疫刺激性部分はアジュバントである。
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、１つまたはそれ以上の化合物または組成物のような関連する構成要素、および溶媒、溶液、緩衝液、説明書、または乾燥剤のような１つまたはそれ以上の関連する材料の包装された組を指す。
「Ｎ−グリカン」は、本明細書で使用される場合、タンパク質のＮ（アスパラギン）残基のアミド窒素でタンパク質に結合する糖質鎖を指す。そのため、Ｎ−グリカンは、Ｎ−グリコシル化プロセスによって形成される。このグリカンは多糖類であり得る。
「ＯｓｐＡエクトドメイン」は、本明細書で使用される場合、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ＯｓｐＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＬ６６）のアミノ酸残基約２７〜２７３、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって同定される、そのホモログの対応する位置を指す。ＯｓｐＡエクトドメインのさらなる例は、配列番号８３〜８９のいずれかの２７〜Ｘ位を含み、ここでＸは関連する配列のＣ末端位置であり、場合によりＣ末端Ｌｙｓは含まれていない。一部の実施形態では、エクトドメインは、そのＮ末端に、対応する完全長の野生型配列の２６番目の残基または２５番目および２６番目の残基をさらに含み；配列番号８３〜８９では、２５番目および２６番目の残基はＡｓｐおよびＧｌｕである。ＯｓｐＡエクトドメインのなおさらなる例は、配列番号９４〜１０２のいずれかを含み、場合によりＮ末端の１、２、または３つの残基（Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ）が含まれておらず、さらに場合によりＣ末端Ｌｙｓが含まれていない。
「ＯｓｐＡ膜貫通ドメイン」は、本明細書で使用される場合、Ｂ．ブルグドルフェリＯｓｐＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＬ６６）のアミノ酸残基約２〜２４、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって同定される、そのホモログの対応する位置を指す。
本開示は、所定の核酸配列またはアミノ酸配列（参照配列）に対してそれぞれ、ある特定の程度の同一性を有する核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同定されたヌクレオチドのパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
用語「同一％」、「同一性％」、または類似の用語は、特に比較される配列間の最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すと意図される。前記パーセンテージは、純粋に統計学的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたって分布していてもよいが、必ずしもランダムに分布している必要はない。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアライメント後に前記配列を、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して比較することによって実行される。比較のための最適なアライメントは、手動で、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２頁によるローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３頁のローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４頁の類似性検索アルゴリズムの助けを借りて、または前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラムの助けを借りて（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ、 ｉｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）実行してもよい。
パーセンテージ同一性は、比較される配列が対応する同一の位置の数を決定する工程、この数を比較される位置の数（例えば、参照配列における位置の数）で除算する工程、およびこの結果に１００を乗算する工程によって得られる。
一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である領域に関して与えられる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００ヌクレオチド、一部の実施形態では、連続ヌクレオチドに関して与えられる。一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長にわたって与えられる。
所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対してそれぞれ、特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有することができ、例えば、一部の例では前記所定の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性は、特に、対象に投与した場合にサイトカインとして作用する能力を含む。一部の実施形態では、所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列と機能的に等価である。
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、１つまたはそれ以上の化合物または組成物のような関連する構成要素、および溶媒、溶液、緩衝液、説明書、または乾燥剤のような１つまたはそれ以上の関連する材料の包装された組を指す。
ＩＩ．例示的なフェリチン、抗原性フェリチンポリペプチド、コンジュゲート、組成物、方法、および使用
フェリチンタンパク質は、複数の個々の単量体を含む球状のタンパク質複合体へと自己集合する。自己集合したフェリチン複合体は、フェリチン粒子またはナノ粒子と呼ぶことができる。
フェリチン遺伝子は、多くの種において見出され、配列の変動はあるものの一般的に保存された高度のアルファヘリックス構造を示す。そのため、任意の特に記載されたフェリチンとのその配列同一性にも関わらず、細菌、昆虫、およびヒトフェリチンを含む任意のフェリチンを本発明において使用することができる。
一部の実施形態では、フェリチンは、細菌、昆虫、真菌、鳥類、または哺乳動物である。一部の実施形態では、フェリチンはヒトである。一部の実施形態では、フェリチンは細菌である。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｈ．ピロリフェリチンである。
一部の実施形態では、フェリチンは、軽鎖および／または重鎖フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンは、場合により本明細書に記載される１つまたはそれ以上の改変を有する、ヒト重鎖フェリチン（ＦＴＨ１、ＧＥＮＥ ＩＤ番号：２４９５）、またはヒト軽鎖フェリチン（ＦＴＬ、ＧＥＮＥ ＩＤ番号：２５１２）である。一部の実施形態では、フェリチンは、場合により本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有する、イラクサギンウワバ重鎖フェリチン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ９７０２９１．１）またはイラクサギンウワバ軽鎖フェリチン（ＡＹ９７０２９２．１）である。一部の実施形態では、フェリチンナノ粒子は、重鎖フェリチンおよび軽鎖フェリチンの全体で２４個のサブユニット、例えば１２個の重鎖サブユニットおよび１２個の軽鎖サブユニットを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む。
一部の実施形態では、フェリチン、および分子が非フェリチンポリペプチドに関して抗原性であるのに十分な長さの非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンポリペプチドが提供される。
一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドは、重鎖フェリチンまたは非フェリチンポリペプチド、ならびに軽鎖フェリチンおよび非フェリチンポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドを組み合わせて、単一のフェリチン多量体または粒子上で同じまたは異なる２つの非フェリチンポリペプチドを発現させることができる。一部の実施形態では、２つの異なる非フェリチンポリペプチドは、単一の感染作用物質によってコードされる。一部の実施形態では、２つの異なる非フェリチンポリペプチドは、２つの異なる感染作用物質によってコードされる。一部の実施形態では、感染作用物質はウイルスまたは細菌である。一部の実施形態では、２つの異なる非フェリチンポリペプチドは、２つの異なる感染作用物質、例えばインフルエンザ、ボレリア、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶのような異なる病原体、またはインフルエンザ、ボレリア、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶのような病原体の異なる株もしくはタイプによってコードされ、重鎖および軽鎖フェリチンに結合してナノ粒子へと集合する。
一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよび非フェリチンポリペプチドと共に集合して二価組成物を産生する、重鎖フェリチンおよび非フェリチンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有するＨ．ピロリフェリチン（例示的なＨ．ピロリフェリチン配列に関しては、配列番号２０８または２０９を参照されたい）である。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチン（または他の細菌フェリチン）とヒトフェリチンとの間の配列相同性がより低いことにより、ワクチンプラットフォームとして使用した場合に自己免疫の可能性を減少させ得る（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ １６２，１０９０〜１１００頁（２０１５）を参照されたい）。
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有するピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）フェリチン（ＮＣＢＩ ｓｅｑ ＷＰ＿０１１０１１８７１．１）である。
一部の実施形態では、フェリチンは、野生型フェリチンと７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ナノ粒子を形成することが可能な異なるタンパク質を、フェリチンの代わりに使用する。一部の実施形態では、このタンパク質は、ルマジンシンターゼ（Ｒａら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓ ３：２２７〜２３４頁（２０１４）を参照されたい）である。一部の実施形態では、このタンパク質は、ルマジンシンターゼ血清型１、２、３、４、５、６、または７である。例示的なルマジンシンターゼ配列を、配列番号２１６および２１９に提供する。一部の実施形態では、ルマジンシンターゼは、配列番号２１６または２１９と、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
Ａ．フェリチン変異
１つまたはそれ以上の変異を含むフェリチンを本明細書に開示する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、例えば野生型フェリチンのアミノ酸配列の変化、および／またはＮもしくはＣ末端での挿入を含む。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、またはそれより多くの異なるアミノ酸が、野生型フェリチンと比較してフェリチンにおいて変異している（一部の実施形態では、任意のＮ末端挿入に加えて）。１つまたはそれ以上の変異は、例えば以下で詳細に考察するように、フェリチンの機能的特性を変化させることができる。一般的に、変異は単に、対応する野生型フェリチンと比較した配列の差（置換された、付加された、または欠失されたアミノ酸残基または複数の残基のような）を指す。
１．コンジュゲーションのためのシステイン
一部の実施形態では、フェリチンを、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供するように変異させる。これは、表面に露出した非システインアミノ酸をシステインに置き換える変異によって達成することができる。誤解を避けるため、「表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える」のような表現は、野生型または変異前配列における表面に露出したアミノ酸がシステインではないことを必然的に暗示している。免疫刺激性部分または非フェリチンポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供する別のアプローチは、リンカーのようなアミノ酸のセグメントをフェリチンのＮまたはＣ末端に含めることであり、アミノ酸のセグメントはシステインを含む。一部の実施形態では、このシステイン（表面に露出したアミノ酸を置き換えるか、またはＮもしくはＣ末端リンカーにある）は不対であり、このことは、これがジスルフィド結合を形成するために適切なパートナーシステインを有していないことを意味する。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの二次構造を変化させない。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの三次構造を変化させない。
一部の実施形態では、このシステインを使用して、免疫刺激性部分のような作用物質をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、このシステインは、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン上のこのシステインにコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン粒子の表面上で露出する。一部の実施形態では、このシステインは、投与後にフェリチン粒子が集合する間、対象の分子および細胞と相互作用することができる。
一部の実施形態では、このシステインの存在により、１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分、例えばアジュバントのコンジュゲーションが可能となる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分のコンジュゲーションは、このシステインの非存在下では起こらない。
一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、およびＳ１１１から選択される。このように、一部の実施形態では、システインのために置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ２６、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、またはＳ１１１に対応するアミノ酸残基である。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、ヒト軽鎖フェリチンのＳ３、Ｓ１９、Ｓ３３、Ｉ８２、Ａ８６、Ａ１０２、およびＡ１２０に対応するアミノ酸から選択することができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、本来のアミノ酸がシステインに置き換えられた場合、これは集合したフェリチン多量体もしくは粒子において反応性である、および／またはこのシステインはフェリチン多量体もしくは粒子の安定性を妨害しない、および／またはこのシステインがフェリチンの発現レベルの低減をもたらさないという理解に基づいて選択される。
一部の実施形態では、フェリチンはＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＥ１２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＥ１２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ２６Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ２６Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ２６Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ７２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ７２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
一部の実施形態では、フェリチンは、Ａ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＡ７５Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＡ７５Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｋ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＫ７９Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＫ７９Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１００Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１００Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１１１Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１１１Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
２．内部システインの除去
一部の実施形態では、フェリチンは、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含む。本来の内部システイン残基を除去することによって、フェリチン単量体あたり１つのみの不対システインが存在することを確実にし、ジスルフィド形成のような望ましくない反応を回避することができ、より安定かつ効率的な結果（例えば、アジュバントの提示）をもたらし得る。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１が非システインアミノ酸に置き換えられる。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１がセリンに置き換えられる（Ｃ３１Ｓ）が、任意の非システイン残基、例えばアラニン、グリシン、トレオニン、またはアスパラギンを使用してもよい。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、非システインのために置き換えられる内部システインは、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１と整列するアミノ酸残基である。Ｃ３１Ｓ変異を示す例示的なフェリチン配列を、配列番号２０１〜２０７に示す。一部の実施形態では、１つより多くの内部システインがフェリチンに存在する場合、２つまたはそれより多く（例えば、各々の）内部システインは、セリン、またはセリン、アラニン、グリシン、トレオニン、もしくはアスパラギンから選択されるアミノ酸のような非システインアミノ酸に置き換えられる。
３．グリコシル化
ヒト適合性のグリコシル化は、組換え薬物製品における安全性および効能に関与し得る。規制当局の承認は、極めて重要な品質属性として適切なグリコシル化を証明することを条件とし得る（Ｚｈａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２１（５）：７４０〜７６５頁（２０１６）を参照されたい）。Ｎ−グリカンは、アスパラギン側鎖のグリコシル化に起因することができ、ヒトと、細菌および酵母のような他の生物との間で構造が異なり得る。このように、本開示に従うフェリチンにおいて、非ヒトグリコシル化および／またはＮグリカン形成を低減または除去することが望ましいであろう。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化を制御することにより、特にヒトワクチン接種に使用する場合、組成物の効能および／または安全性が改善される。
一部の実施形態では、フェリチンを、Ｎ−グリカンの形成を阻害するように変異させる。一部の実施形態では、変異したフェリチンは、その対応する野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する。
一部の実施形態では、フェリチンは、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含む。一部の実施形態では、表面に露出したアスパラギンは、Ｈ．ピロリフェリチンのＮ１９、またはペアワイズまたは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置である。一部の実施形態では、そのようなアスパラギン、例えばＨ．ピロリフェリチンのＮ１９を変異させることは、フェリチンのグリコシル化を減少させる。一部の実施形態では、変異は、アスパラギンをグルタミンに置き換える。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異を含むＨ．ピロリフェリチンである。配列番号２０１〜２０７は、Ｎ１９Ｑ変異を含む例示的なフェリチン配列である。
細菌または酵母において産生されたグリコシル化タンパク質に曝露された哺乳動物は、細菌または酵母における所定のタンパク質のグリコシル化パターンが、哺乳動物における同じタンパク質のグリコシル化パターンとは異なり得ることから、グリコシル化タンパク質に対する免疫応答を生じ得る。このように、いくつかのグリコシル化治療タンパク質は、細菌または酵母における産生にとって適切ではないことがあり得る。
一部の実施形態では、アミノ酸変異によるフェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母におけるタンパク質の産生を促進する。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母において発現された変異フェリチンの投与時の哺乳動物における副作用の可能性を低減させる。一部の実施形態では、細菌または酵母において産生された変異フェリチンのヒト対象における反応原性は、グリコシル化が減少していることから低い。一部の実施形態では、ヒト対象における過敏応答の発生率は、野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンによる処置後では低い。
一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物の対象における分解は、野生型フェリチンを含む組成物、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して遅い。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して、対象において低減されたクリアランスを有する。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較してより長い血清中半減期を有する。
４．変異の組合せ
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される変異の１つより多くのタイプを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異から独立して選択される１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＡ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＫ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、前述の変異の組のいずれかに対応する変異を含み、対応する変異は、フェリチンアミノ酸配列とＨ．ピロリフェリチンアミノ酸配列（配列番号２０８または２０９）とのペアワイズアライメントによって決定した位置で、ＮをＱに、ＣをＳに、および非システインの表面に露出したアミノ酸をシステインに変化させる。
１つより多くのタイプの変異を含む例示的なフェリチンを、配列番号２０１〜２０７に提供する。
５．構造アライメント
上記で考察したように、Ｈ．ピロリフェリチンに関して記載した変異に対応する変異の位置は、ペアワイズまたは構造アライメントによって同定することができる。構造アライメントは、タンパク質がかなりの配列変動にも関わらず類似の構造を共有し、ファミリーの多くのメンバーが構造的に特徴付けされている、フェリチンのような大きいタンパク質ファミリーにとって適切であり、これもまた、インフルエンザ（例えば、血球凝集素）、ボレリア（例えば、ＯｓｐＡ）、ＲＳＶ（例えば、ＲＳＶ ＦまたはＧ）、およびＥＢＶ（例えば、ｇＬ、ｇＨ、ｇｐ２２０、またはｇｐ４２）のような、本明細書に記載される他のポリペプチドの異なる形態における対応する位置を同定するために使用することができる。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）は、その受託番号と共に以下に列挙するフェリチンを含む、多くのフェリチンに関する３Ｄ構造を含む。
２ｊｄ６，２ｊｄ７−ＰｆＦＲ−ピュロコックス・フリオスス。２ｊｄ８−ＰｆＦＲ＋Ｚｎ。３ａ６８−遺伝子ＳｆｅｒＨ４由来のｓｏＦＲ−ダイズ。３ａ９ｑ−遺伝子ＳｆｅｒＨ４（変異体）由来のｓｏＦＲ。３ｅｇｍ，３ｂｖｆ，３ｂｖｉ，３ｂｖｋ，３ｂｖｌ−ＨｐＦＲ−ヘリコバクター・ピロリ。５ｃ６ｆ−ＨｐＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ４ａ，１ｖｌｇ−ＦＲ−テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ）。１ｓ３ｑ，１ｓｑ３，３ｋｘ９−ＦＲ−アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ），１ｋｒｑ−ＦＲ−カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）。１ｅｕｍ−ＥｃＦＲ−大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）。４ｒｅｕ−ＥｃＦＲ＋Ｆｅ。４ｘｇｓ−ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ２。４ｚｔｔ−ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ＋Ｆｅ２＋Ｆｅ＋Ｏ２。１ｑｇｈ−ＬｉＦＲ−リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）。３ｑｚ３−ＶｃＦＲ−ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）。３ｖｎｘ−ＦＲ−アナアオサ（Ｕｌｖａ ｐｅｒｔｕｓａ）。４ｉｓｍ，４ｉｓｐ，４ｉｔｔ，４ｉｔｗ，４ｉｗｊ，４ｉｗｋ，４ｉｘｋ，３ｅ６ｓ−ＰｎｍＦＲ−プセウドニッチア（Ｐｓｅｕｄｏ−ｎｉｔｓｃｈｉａ ｍｕｌｔｉｓｅｒｉｅｓ）。４ｚｋｈ，４ｚｋｗ，４ｚｋｘ，４ｚｌ５，４ｚｌ６，４ｚｌｗ，４ｚｍｃ−ＰｎｍＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ６ｏ−ＦＲ−イラクサギンウワバ。４ｃｍｙ−ＦＲ＋Ｆｅ−緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）。フェリチン軽鎖（ＦＴＬ）。１ｌｂ３，１ｈ９６−ｍＦＴＬ−マウス。１ｒｃｃ，１ｒｃｄ，１ｒｃｉ−ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｇ。１ｒｃｅ，１ｒｃｇ−ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｎ。３ｎｏｚ，３ｎｐ０，３ｎｐ２，３ｏ７ｒ−ｈｏＦＴＬ（変異体）−ウマ。３ｏ７ｓ，３ｕ９０−ｈｏＦＴＬ。４ｖ１ｗ−ｈｏＦＴＬ−ｃｒｙｏ ＥＭ。３ｒａｖ，３ｒｄ０−ｈｏＦＴＬ＋バルビツレート。フェリチン軽鎖＋重鎖：５ｇｎ８−ｈＦＴＨ＋Ｃａ。
構造アライメントは、（ｉ）第２の配列の公知の構造を使用して第１の配列の構造をモデリングする工程、または（ｉｉ）両方が公知である第１および第２の配列の構造を比較する工程、ならびに第２の配列における目的の残基に最も類似に位置する第１の配列中の残基を同定する工程によって、２つ（またはそれより多く）のポリペプチド配列を超えて対応する残基を同定する工程を伴う。対応する残基は、重ねた構造におけるアルファ炭素の距離の最小化（例えば、どの組のアルファ炭素対がアライメントに関する最小平均二乗偏差を提供するか）に基づいて一部のアルゴリズムにおいて同定される。Ｈ．ピロリフェリチンに関して記載された位置に対応する非Ｈ．ピロリフェリチンにおける位置を同定する場合、Ｈ．ピロリフェリチンは、「第２の」配列であり得る。目的の非Ｈ．ピロリフェリチンが利用可能な公知の構造を有しないが、公知の構造を有する別の非Ｈ．ピロリフェリチンに、Ｈ．ピロリフェリチンより密接に関連する場合、密接に関連する非Ｈ．ピロリフェリチンの公知の構造を使用して目的の非Ｈ．ピロリフェリチンをモデリングし、次にそのモデルをＨ．ピロリフェリチン構造と比較して、目的のフェリチンにおける所望の対応する残基を同定することが最も有効であり得る。構造モデリングおよびアライメントに関して広範囲の文献が存在し、代表的な開示には、米国特許第６８５９７３６号；米国特許第８７３８３４３号；およびＡｓｌａｍら、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（２０１６）９〜１３頁において引用される開示が挙げられる。公知の関連する構造または複数の構造に基づく構造のモデリングの考察に関して、例えば、Ｂｏｒｄｏｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ４（２００９）１〜１３頁、およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。
Ｂ．免疫刺激性部分；アジュバント；コンジュゲートされた非フェリチンポリペプチド
一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドおよび／またはアジュバントのような免疫刺激性部分は、表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、例えば上記で考察した変異に起因するシステインである。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、リシン、アスパルテート、またはグルタメートである。グルタルアルデヒド（リシンをアミノ担持リンカーまたは部分にコンジュゲートするため）またはカルボジイミド（例えば、アスパルテートもしくはグルタメートをアミノ担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、またはリシンをカルボキシル担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリン−４−イル−エチル）カルボジイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；ＥＤＡＣ））を使用するコンジュゲーション手順は、例えばｗｗｗ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ．から入手可能な、Ｃｈａｐｔｅｒ ４ ｏｆ Ｈｏｌｔｚｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２００６，ＩＳＢＮ ９７８−３−５４０−３２７８５−１に記載されている。
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分は、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、アジュバントのような１つより多くの免疫刺激性部分が、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、２４個の免疫刺激性部分が、フェリチン多量体または粒子（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン粒子における各々の単量体の１つの部分）に結合する。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一である。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一ではない。
１．免疫刺激性部分のタイプ；アジュバント
表面に露出したアミノ酸（例えば、システイン）に結合することができる免疫刺激性部分を、本開示に従ってフェリチンにおいて使用することができる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、Ｂ細胞アゴニストである。
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、疎水性ではない。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は親水性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、極性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、水素結合またはイオン結合することが可能であり、例えば水素結合ドナー、水素結合アクセプター、カチオン性部分またはアニオン性部分を含む。部分が、ｐＨ ６、７、７．４、または８のような生理的に関連するｐＨで、水溶液中でイオン化される場合、部分はカチオン性またはアニオン性であると考えられる。
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストまたはインターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの刺激剤である。一部の実施形態では、アジュバントはＢおよび／またはＴ細胞におけるＴＬＲシグナル伝達を活性化する。一部の実施形態では、アジュバントは、適応免疫応答を調節する。
ａ）ＴＬＲ２アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
一部の実施形態では、ＴＬＲ２アゴニストは、ＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＦＳＬ−１、またはＰＡＭ３ＣＳＫ４である。
ｂ）ＴＬＲ７／８アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニスト（すなわち、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の少なくとも１つのアゴニスト）である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、イミダゾキノリンである。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ヌクレオシドアナログである。
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、３Ｍ−０１２（３Ｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなイミダゾキノリンアミンＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。遊離の３Ｍ−０１２の構造は：
Figure 2021519596
 である。３Ｍ−０１２または本明細書で考察する任意の部分のような免疫刺激性部分は、この部分の適切な末端原子（例えば、水素）を、例えば表面に露出したシステインの硫黄での本明細書に記載されるフェリチンとの結合に置換することによって、またはそのような硫黄に結合するリンカーによってフェリチンにコンジュゲートすることができると理解される。このように、フェリチンにコンジュゲートする場合、免疫刺激性部分の構造は、遊離の分子の構造とはわずかに異なる。
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ＳＭ７／８ａである。遊離のＳＭ７／８ａの構造は：
Figure 2021519596
 である。
例えば、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；３３（１１）：１２０１〜１０頁．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３７１を参照されたい。
ｃ）ＴＬＲ９アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、非メチル化ＣｐＧ ＯＤＮである。一部の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、通常のＤＮＡにおいて見出される天然のホスホジエステル（ＰＯ）骨格の代わりに、部分的または完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。
一部の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＢ ＯＤＮであり、これは５’プリン（Ｐｕ）−ピリミジン（Ｐｙ）−Ｃ−Ｇ−Ｐｙ−Ｐｕ３’を含む１つまたはそれ以上の６量体ＣｐＧモチーフを含み；十分にホスホロチオエート化された（すなわち、ＰＳ改変された）骨格を有し；１８〜２８ヌクレオチド長を有する。一部の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、配列番号２１０の配列を含み、場合により、骨格にホスホロチオエート結合を含む。
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）を含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＩＳＳ−１０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）（配列番号２１０）である。
ｄ）ＳＴＩＮＧアゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子タンパク質刺激因子、小胞体ＩＦＮ刺激因子とも呼ばれる）アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧの合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。例えば、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａら、Ｃｅｌｌ １５４：９６２〜９７０頁（２０１３）を参照されたい。例示的なＣＤＮは、ｃｄＡ、ｃｄＧ、ｃＡＭＰ−ｃＧＭＰ、および２’−５’，３’−５’ｃＧＡＭＰを含む（構造に関しては、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａら、を参照されたい）。ＳＴＩＮＧアゴニストはまた、ＤＭＸＡＡのような合成アゴニストも含む。
Figure 2021519596
２．コンジュゲートされた非フェリチンポリペプチド
一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、フェリチンの表面に露出したアミノ酸にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、病原体由来のポリペプチドであり、フェリチンタンパク質を抗原性にする。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、単独で抗原性であるが、一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、フェリチンとのその会合のために抗原性である。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、本明細書に記載される非フェリチンポリペプチドのいずれか１つである。
３．コンジュゲーション
一部の実施形態では、表面に露出したシステイン（例えば、本明細書に記載される変異に起因する）、またはフェリチン（例えば、フェリチンのＮ末端）に結合したペプチドリンカー中のシステインを使用して、アジュバントのような免疫刺激性部分または非フェリチンポリペプチドを、フェリチンにコンジュゲートする。一部の実施形態では、リンカーは、そのようなシステインにコンジュゲートされ、リンカーを次に、アジュバントのような免疫刺激性部分、または非フェリチンポリペプチドにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、そのようなシステインは、アジュバント、リンカー、または非フェリチンポリペプチドを結合させるコンジュゲーション反応のための化学ハンドルを作製する。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートが産生され、アジュバントのような免疫刺激性部分または非フェリチンポリペプチドは、そのようなシステインの還元後にフェリチンに連結される。一部の実施形態では、システインは、表面に露出した不対システイン、すなわちジスルフィド結合を形成するための適切な位置にパートナーシステインを欠如するシステインである。一部の実施形態では、システインは、遊離のチオール側鎖を含む不対システインである。
ａ）コンジュゲーションケミストリーのタイプ
任意のタイプのケミストリーを使用して、例えばシステインまたはＬｙｓ、Ｇｌｕ、もしくはＡｓｐのような別のアミノ酸のような表面に露出したアミノ酸の反応を介して、アジュバントのような免疫刺激性部分または非フェリチンポリペプチドをフェリチンにコンジュゲートすることができる。
一部の実施形態では、コンジュゲーションは、クリックケミストリーを使用して実施される。本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー」は、互いに急速かつ選択的に反応する（すなわち、「クリックする」）１対の官能基間での反応を指す。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、緩和な水性条件下で実施することができる。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインのようなフェリチンの表面上のシステインを利用し、システインと反応することができる官能基を使用してクリックケミストリーを実施する。
クリックケミストリーの基準を満たす多様な反応が、当技術分野で公知であり、当業者は、複数の公表された方法論のいずれかを使用することができる（例えば、Ｈｅｉｎら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２５（１０）：２２１６〜２２３０頁（２００８）を参照されたい）。クリックケミストリーに関してＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＬｕｍｉｐｒｏｂｅの試薬のような広範囲の市販の試薬を使用することができる。一部の実施形態では、コンジュゲーションは、以下の実施例に記載されるようにクリックケミストリーを使用して実施される。
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、フェリチンの還元後に起こる。
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、１ステップクリック反応であり得る。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、２ステップクリック反応であり得る。
一部の実施形態では、反応は、金属フリーのクリックケミストリーを含む。一部の実施形態では、反応は、チオール−マレイミドおよび／またはジスルフィド交換を含む。
金属フリークリックケミストリー
金属フリークリックケミストリーは、タンパク質の起こり得る酸化を回避するためにコンジュゲーション反応に関して使用することができる。金属フリークリックケミストリーは、抗体コンジュゲートを形成するために使用されている（ｖａｎ Ｇｅｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３〜２２４２頁を参照されたい）。
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において使用される。一部の実施形態では、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において銅フリーコンジュゲーションを使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）を使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を使用する。一部の実施形態では、ＢＣＮまたはＤＢＣＯは、アジド基と反応する。
ＤＢＣＯは、触媒の非存在下での歪み促進型クリック反応を介してアジド基に対して高い特異性を有し、高収率の安定なトリアゾールをもたらす。一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、銅触媒の非存在下でアジドと反応する。
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、１ステップクリック反応において使用される。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、２ステップクリック反応において使用される。
チオール−マレイミドおよびジスルフィド交換
本明細書で使用されるフェリチンは、スルフヒドリルとしても知られるチオールを含むシステインを含むことができ、これはスルフヒドリル反応性化学基との反応に関して利用可能である（または還元を通して利用可能となり得る）。このように、システインは、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンに付加するための化学選択的改変を可能にする。塩基性条件下では、システインは、脱プロトン化されて、チオレート求核試薬を生成し、これはマレイミドおよびヨードアセトアミドのような弱い求電子試薬と反応することができる。システインとマレイミドまたはヨードアセトアミドとの反応は、炭素−硫黄結合をもたらす。
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、表面に露出したシステインまたはフェリチンのリンカー中のシステインと反応する。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、またはＴＮＢ−チオールである。
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、アルキル化によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、チオエーテル結合の形成）。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ジスルフィド交換によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、ジスルフィド結合の形成）。
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、チオール−マレイミド反応である。
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、マレイミドである。一部の実施形態では、マレイミドとシステインとの反応は、例えば可逆的ではない安定なチオエステル結合の形成をもたらす。一部の実施形態では、マレイミドは、フェリチン中のチロシン、ヒスチジン、またはメチオニンとは反応しない。一部の実施形態では、非反応マレイミドは、遊離のチオールを例えば過剰に添加することによって、反応終了時にクエンチされる。
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、ジスルフィド相互交換としても知られるチオール−ジスルフィド交換である。一部の実施形態では、反応は、当初のジスルフィドの一部を含む混合ジスルフィドの形成を伴う。一部の実施形態では、当初のジスルフィドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインである。
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ピリジルジチオールである。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ＴＮＢ−チオール基である。
ｂ）コンジュゲーションのためのリンカー
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分、または非フェリチンポリペプチドは、システインのような表面に露出したアミノ酸に共有結合したリンカーを介してフェリチンに結合する。一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧリンカーを含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ）リンカーは、アジュバントのような免疫刺激性部分に連結したフェリチンの水溶性およびライゲーション効率を増加させる。ＰＥＧリンカーは、２〜１８ＰＥＧ長の間、例えば、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、およびＰＥＧ１８である。
一部の実施形態では、リンカーは、マレイミドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、免疫刺激性部分（ＩＳＭ）−リンカー−マレイミドの構成要素を含む。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドは、マレイミドとフェリチンのシステインとの反応によって１ステップクリックケミストリーにおいてフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、アジュバント−リンカー−マレイミドのＩＳＭは、ＳＭ７／８ａである。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドのリンカーはＰＥＧ４である。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドは、ＳＭ７／８ａ−ＰＥＧ４−マレイミドである。
一部の実施形態では、２ステップクリックケミストリープロトコルを、１つの末端でスルフヒドリル反応性化学基および他方の末端でアミン反応基を含むリンカーと共に使用する。そのような２ステップクリックケミストリープロトコルでは、スルフヒドリル反応性化学基は、フェリチンのシステインと反応するが、アミン反応基はＩＳＭに結合した試薬と反応する。このようにして、ＩＳＭは、１組の２クリックケミストリー試薬の組を介してフェリチンにコンジュゲートされる。
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基はマレイミドである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、マレイミドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインと反応する。
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、アミン反応基はＤＢＣＯである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、ＩＳＭに結合したアジド基と反応する。
一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−ＤＢＣＯを使用する。一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−ＤＢＣＯは、フェリチンの還元後、フェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−試薬は、第１のステップでマレイミドとフェリチンのシステインとの反応によってフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＤＢＣＯを使用してアジドに結合したＩＳＭに連結する。一部の実施形態では、アジドに連結したＩＳＭは、ＩＳＳ−１０１８である。一部の実施形態では、アジドにカップリングしたアジュバントは、３Ｍ−０１２またはＣｐＧである。
一部の実施形態では、反応基を有するリンカーをＩＳＭに付加する。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ４−アジドリンカー、またはＰＥＧ４−マレイミドリンカーである。
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−アジドリンカーは、３Ｍ−０１２にコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−アジドリンカーにコンジュゲートされた３Ｍ−０１２の例示的な構造は：
Figure 2021519596
 である。
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−アジドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−アジドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
Figure 2021519596
 である。
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−マレイミドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−マレイミドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
Figure 2021519596
 である。
一部の実施形態では、アジド基は、ＩＳＳ−１０１８にコンジュゲートされる。ＮＨＳエステル−アジドリンカーにコンジュゲートされたＩＳＳ−１０１８の例示的な構造は：
Figure 2021519596
 である。
Ｃ．抗原性フェリチンポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフェリチンは、非フェリチンポリペプチドをさらに含む抗原性フェリチンポリペプチドの一部である。一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドは、非フェリチンポリペプチドにカップリングしたフェリチンを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、フェリチンのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、フェリチンのＣ末端に融合される。非フェリチンポリペプチドはまた、例えば表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインまたはＮもしくはＣ末端リンカーに導入されたシステインを介して上記で考察したフェリチンにコンジュゲートすることもできる。
１．リンカー
一部の実施形態では、リンカーは、非フェリチンポリペプチドのアミノ酸配列をフェリチンのアミノ酸配列から分離する。任意のリンカーを使用してもよい。一部の実施形態では、リンカーは、融合タンパク質としての抗原性フェリチンポリペプチドの発現を容易にすることができるペプチドリンカーである（例えば、単一のオープンリーディングフレーム由来）。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。一部の実施形態では、グリシン−セリンリンカーは、ＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号４４３）、２ＸＧＧＧＳ（すなわち、ＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号４４４）、または５ＸＧＧＧＳ（配列番号４４５）である。リンカーは、フェリチンに対してＮまたはＣ末端である。
一部の実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約２〜４、２〜６、２〜８、２〜１０、２〜１２、または２〜１４アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも４０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、６０アミノ酸長未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、リンカーは、５０アミノ酸長未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、リンカーは、約１６、２８、４０、４６、または４７アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、フレキシブルである。一部の実施形態では、リンカーは、例えば免疫刺激性部分（例えば、アジュバント）のコンジュゲーション部位として使用するためのシステインを含む；システインを含む例示的なリンカーを、配列番号２２５として提供する。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含み、配列番号２２５中のシステインに対応するシステインをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸（例えば、２５〜６０アミノ酸）を含み、システインは、Ｎ末端から８番目のアミノ酸からＣ末端から８番目のアミノ酸までの範囲の位置、または中央残基の１０アミノ酸以内の位置、またはリンカーの結合位置に位置する。
一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）および／またはセリン（Ｓ）アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、および／またはアラニン（Ａ）アミノ酸、ならびに場合により上記で考察されているようなシステインを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２２０）、ＧＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＧＳＧＳＡＳＳＧＡＳＡＳＧＳＳＮＧＳＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２２）、またはＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＦＲ１（配列番号２２３）またはＦＲ２（配列番号２２４）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２３３〜２３８を含む。
一部の実施形態では、フェリチンは、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部を有するＨ．ピロリフェリチン（ハイブリッドフェリチンと呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、このハイブリッドフェリチンは、表面上に均一に分布した非フェリチンポリペプチド結合部位を有する多量体を形成する（Ｋａｎｅｋｉｙｏ ２０１５を参照されたい）。一部の実施形態では、ハイブリッドフェリチンとのＮ末端融合タンパク質は、フェリチンナノ粒子表面上の非フェリチンポリペプチドの提示を可能にする。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、ウイルスまたは細菌ポリペプチドである。一部の実施形態では、フェリチンは、配列番号２０８（このグルタメートを含むハイブリッドフェリチン）の１３位、または配列番号２０９（６位がイソロイシンである野生型Ｈ．ピロリフェリチン）の６位に対応する位置でグルタメートを含む。ウシガエルリンカーと組み合わせると、このグルタメートは、ヒトおよびウシガエルフェリチンにおいて見出される保存された塩架橋を維持すると考えられる（ヒト軽鎖およびウシガエル下部サブユニットフェリチンの両方における６Ｒおよび１４Ｅ）。Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ １６２，１０９０〜１１００頁（２０１５）を参照されたい。
一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを介してフェリチンに連結される。一部の実施形態では、このリンカーを使用して、クリックケミストリーを介してある部分（例えば、免疫刺激性部分または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンに直接コンジュゲートする。システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを含む例示的な配列は、配列番号２１８である。システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを伴うコンジュゲーション反応にとって適したクリックケミストリーは上記で考察されている。
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分のためのコンジュゲーション部位としてシステインを含むリンカーは、表面に露出した不対システインを欠如するフェリチン分子を含む構築物において、または表面に露出した不対システインを含むフェリチン分子を含む構築物において使用される。
一部の実施形態では、構築物はリンカーを含まない。一部の実施形態では、構築物は、１つのリンカーを含む。一部の実施形態では、構築物は、２つまたは２つより多くのリンカーを含む。
抗原性フェリチンポリペプチドに組み入れるために非フェリチンポリペプチドの起源として使用することができる代表的な病原体（ウイルスおよび細菌）には、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザ、ボレリア（例えば、Ｂ．ブルグドルフェリのような、ライム病を引き起こすボレリア種）、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含む。一部の実施形態では、病原体由来の非フェリチンポリペプチドは、病原体によって発現またはコードされるタンパク質由来のペプチド配列を含む。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドのアミノ酸は、ハイブリッドフェリチンのアミノ酸配列に連結され、非フェリチンポリペプチド配列は、ウシガエルフェリチンのＮ末端伸長部の前にある。
一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドのアミノ酸が、ハイブリッドフェリチンのアミノ酸配列に結合すると、融合タンパク質を生成する。一部の実施形態では、この融合タンパク質は、非フェリチンポリペプチドが、フェリチンの各々の単量体に存在するように、非フェリチンポリペプチドと共にハイブリッドフェリチンを含む。一部の実施形態では、これらの単量体は、フェリチンナノ粒子へと自己集合する。一部の実施形態では、ハイブリッドフェリチン単量体を含むフェリチンナノ粒子は、ナノ粒子表面上に非フェリチンポリペプチドの複数のコピーを含む。一部の実施形態では、２４個のハイブリッドフェリチン単量体の集合体は、ナノ粒子の表面上で２４個の非フェリチンポリペプチドと共にフェリチンナノ粒子を形成する。
一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドは、配列番号１〜７６、３０１〜３４３、４０１〜４０３、４１０、４１３〜４１４、４１７〜４２７、または５０１〜５２３のいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、前述の配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性有する配列を含み、フェリチン配列は、表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む。そのようなフェリチン配列は、遊離のＨ．ピロリフェリチン（配列番号２０８）の１９位に対応する位置でＡｓｎからＧｌｕへの変異、および／または遊離のＨ．ピロリフェリチン（配列番号２０８）の３１位に対応する位置でＣｙｓからＳｅｒへの変異をさらに含み得る。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインは、本明細書に開示される任意のシステイン位置、例えば、Ｈ．ピロリフェリチンの１２、２６、７２、７５、７９、１００、または１１１位に対応する。
２．非フェリチンポリペプチドとしてのＥＢＶポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフェリチンポリペプチドは、ＥＢＶポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドの非フェリチンポリペプチドは、ＥＢＶポリペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドもまた、抗原性ＥＢＶポリペプチドである。
ａ）ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含むＥＢＶポリペプチド
ＥＢＶは、コア膜融合機構を形成し、ウイルスを細胞内に貫通させる３つの糖タンパク質、すなわち糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、およびｇＬを有する。ｇＬおよびｇＨは、例えば以前に、Ｍａｔｓｕｕｒａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ Ｄｅｃ ２８；１０７（５２）：２２６４１〜６頁に記載されている。ワクチンとして使用するためのｇＬおよびｇＨの単量体および三量体は、例えばＣｕｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１６ Ｊｕｌ ２５；３４（３４）：４０５０〜５頁に記載されている。ｇＨおよびｇＬタンパク質は会合して、ウイルス侵入にとって必要な効率的な膜融合および上皮細胞受容体との結合にとって必要であると考えられるヘテロ二量体複合体を形成する。
一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＶ ｇＬおよびＥＢＶ ｇＨを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、一本鎖として存在する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、フェリチンの多量体形成またはルマジンシンターゼを通して、ナノ粒子（例えば、フェリチンまたはルマジンシンターゼ粒子）を形成する。一部の実施形態では、本開示に従う抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＶ ｇＬポリペプチドおよびＥＢＶ ｇＨポリペプチド、ならびにＥＢＶ ｇＬポリペプチドとＥＢＶ ｇＨポリペプチドとを隔てる少なくとも１５アミノ酸長を有するリンカーを含む。比較的長いリンカーは、発現および／または免疫原性の改善のような利益を提供することができることが見出されている。
一部の実施形態では、ＥＢＶ ｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドは、完全長のｇＨおよび／またはｇＬ（例示的な完全長の配列に関してはそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＥＱ３５７６５．１およびＹＰ＿００１１２９４７２．１を参照されたい）を含む。一部の実施形態では、ＥＢＶ ｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドは、ｇＨおよび／またはｇＬの断片である。一部の実施形態では、ｇＬポリペプチドは、ｇＬ Ｃ末端の端部で７アミノ酸の欠失を有するｇＬ（Ｄ７）構築物である。一部の実施形態では、ｇＨポリペプチドは、Ｃ１３７Ａ変異のような変異をＣ１３７で含む。一部の実施形態では、Ｃ１３７変異は、非特異的コンジュゲーションを回避するために、本来の不対システインを除去する。一部の実施形態では、ｇＨポリペプチドは、Ｃ１３７Ａ変異のような、配列番号４３７のシステイン１３７に対応する位置を除去する変異を含む。一部の実施形態では、Ｃ１３７変異は、非特異的コンジュゲーションを回避するために本来の不対システインを除去する。
一部の実施形態では、ＥＢＶ ｇＬポリペプチドは、配列番号４３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＥＢＶ ｇＨポリペプチドは、配列番号４３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列（シグナル配列としても知られる）は、ｇＨまたはｇＬポリペプチドのようなＥＢＶポリペプチドのＮ末端に、例えばポリペプチドのＮ末端に付加される。一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列は、哺乳動物細胞において発現される場合、タンパク質の分泌をもたらす。
本来のＥＢＶ ｇＨおよび／またはｇＬ配列を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００９３３４．１（ヒトヘルペスウイルス４、完全なゲノム、日付２６−Ｍａｒ−２０１０）に示す。完全長または断片化した本来のＥＢＶ ｇＨおよび／またはｇＬを、非フェリチンポリペプチドとして利用してもよい。本明細書に開示される構築物の一部では、ＮＣ＿００９３３４．１におけるｇＬアミノ酸配列のアミノ酸２３〜１３７をｇＬポリペプチドとして使用し、本来のシグナルペプチド（ＮＣＢＩ配列のアミノ酸１〜２２）をＩｇＧκリーダー配列に置き換えた。構築物の一部では、ＮＣ＿００９３３４．１におけるｇＨアミノ酸配列のアミノ酸１９〜６７８を、ｇＨポリペプチドとして使用した。一部の実施形態では、ｇＬおよびｇＨを本明細書に記載される配列表に示すようにリンカーを介して連結した。
一部の実施形態では、ｇＬおよびｇＨポリペプチドは、一本鎖単量体として発現される。一部の実施形態では、単量体組成物は、配列表に示され、「単量体」として説明に記載されている配列を含むまたはそれからなる。ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含む一本鎖は、「ｇＬ／ｇＨ」と呼ぶことができ、これらは、「ｇＨ＿ｇＬ」、「ｇＬ＿ｇＨ」、または「ｇＬ／ｇＨ」と互換的に使用することができる。
ｇＬ／ｇＨポリペプチドを、本明細書で考察されるフェリチンまたはルマジンシンターゼのいずれかと組み合わせることができる。例えば、一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、単量体または三量体ｇＬ／ｇＨポリペプチド（＋／−ｇｐ４２および／またはｇｐ２２０）、およびｉ）重鎖もしくは軽鎖フェリチン（例えば、イラクサギンウワバ重鎖または軽鎖フェリチン）；またはｉｉ）場合により表面に露出したシステインを含む、フェリチンを含む。
加えて、一部の実施形態では、ＥＢＶ ｇＬ／ｇＨポリペプチドおよびフェリチンを含むいずれの抗原性ＥＢＶポリペプチドも、フェリチン、ならびにｇＬ／ｇＨ以外のＥＢＶポリペプチド、例えばｇｐ２２０および／またはｇｐ４２を含む別の抗原性ＥＢＶポリペプチドのような、本明細書に開示される別のポリペプチドを含む組成物中に存在することができる。
ｂ）ｇｐ２２０ポリペプチドを含むＥＢＶポリペプチド
一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドは、ｇｐ２２０ポリペプチドを含む。ｇｐ２２０−ハイブリッドウシガエル／Ｈ．ピロリフェリチンナノ粒子は、Ｋａｎｅｋｉｙｏ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ａｕｇ ２７；１６２（５）：１０９０〜１００頁において既に記載されている。このナノ粒子は、本明細書に記載されるある特定のフェリチンからの他の差の中でも、表面に露出したシステインを提供する変異またはシステインを含むリンカーを含まない。
一部の実施形態では、ｇｐ２２０ポリペプチドは、配列番号４３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列（シグナル配列としても知られる）は、ｇｐ２２０ポリペプチドのＮ末端に付加される。一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列は、哺乳動物細胞において発現された場合にタンパク質の分泌をもたらす。
ｇｐ２２０ポリペプチドを、本明細書で考察される任意のフェリチンまたはルマジンシンターゼと組み合わせることができる。例えば、一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ｇｐ２２０ポリペプチド（＋／−ｇＬ／ｇＨおよび／またはｇｐ４２）、およびｉ）重鎖もしくは軽鎖フェリチン（例えば、イラクサギンウワバ重鎖または軽鎖フェリチン）；またはｉｉ）場合により本明細書に記載される表面に露出したシステインを含む、フェリチンを含む。
加えて、一部の実施形態では、ｇｐ２２０ポリペプチドおよびフェリチンを含むいずれの抗原性ＥＢＶポリペプチドも、フェリチン、ならびにｇｐ２２０以外のＥＢＶポリペプチド、例えばｇＬ／ｇＨおよび／またはｇｐ４２を含む別の抗原性ＥＢＶポリペプチドのような、本明細書に開示される別のポリペプチドを含む組成物中に存在することができる。
ｃ）ｇｐ４２ポリペプチドを含むＥＢＶポリペプチド
一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドは、ｇｐ４２ポリペプチドを含む。例示的なｇｐ４２配列を、配列番号４３４として提供する。例えばｇＬおよびｇＨポリペプチドとの融合体に含めるために適したさらに例示的なｇｐ４２配列を、配列番号２３９として提供する。ｇＬおよびｇＨポリペプチドとの融合体に含めるために適したさらに例示的なｇｐ４２配列を配列番号２４０として提供する。
一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは、配列番号４３４と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは、配列番号２３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは、配列番号２４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列配列（シグナル配列としても知られる）は、ｇｐ４２ポリペプチドのＮ末端に付加される。一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列は、哺乳動物細胞において発現された場合にタンパク質の分泌をもたらす。例示的なリーダー配列は、配列番号２２６のアミノ酸１〜２２である。
一部の実施形態では、ｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ｇｐ４２ポリペプチドをさらに含む。上記のｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドを含む任意のＥＢＶポリペプチドが、ｇｐ４２ポリペプチドをさらに含み得る。一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは、配列番号４２１および２２６〜２３１に例証されるようにｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドのＣ末端に位置する。一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは、配列番号４２１および２２７〜２３１に例証されるようにフェリチンのＮ末端に位置する。このように、例えば抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ＮからＣ末端方向に、ｇＬポリペプチド、ｇＨポリペプチド、ｇｐ４２ポリペプチド、および場合によりフェリチンを含む。本明細書で記載されるリンカーのようなリンカーは、ＥＢＶポリペプチド由来のｇｐ４２ポリペプチド、ならびに／またはそのＮ末端および／もしくはＣ末端に位置するフェリチンを分離する。一部の実施形態では、リンカーは、抗原性フェリチンポリペプチド中の各々のＥＢＶポリペプチド（例えば、ｇＬポリペプチド、ｇＨポリペプチド、およびｇｐ４２ポリペプチド）を分離し、存在する場合にはフェリチンと、それに対して近位のＥＢＶポリペプチド（例えば、ｇｐ４２ポリペプチド）との間にさらなるリンカーが存在してもよい。
一部の実施形態では、少なくとも１５アミノ酸長を有するリンカーは、ＥＢＶ ｇＨポリペプチドおよびＥＢＶ ｇｐ４２ポリペプチドを分離する。そのようなリンカーは、１５〜６０アミノ酸長、２０〜６０アミノ酸長、３０〜６０アミノ酸長、４０〜６０アミノ酸長、３０〜５０アミノ酸長、または４０〜５０アミノ酸長を有し得る。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｇｐ４２およびフェリチンがポリペプチド中に存在する場合、リンカーは、ＥＢＶ ｇｐ４２ポリペプチドおよびフェリチンを分離する。そのようなリンカーは、少なくとも１５アミノ酸長を有してもよく、または１５〜６０アミノ酸長、２０〜６０アミノ酸長、３０〜６０アミノ酸長、４０〜６０アミノ酸長、３０〜５０アミノ酸長、または４０〜５０アミノ酸長を有する。一部の実施形態では、そのようなリンカーは、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、または２３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｇｐ４２ポリペプチドを、本明細書で考察するフェリチンまたはルマジンシンターゼのいずれかと組み合わせることができる。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ｇｐ４２ポリペプチド（＋／−ｇＬ／ｇＨおよび／またはｇｐ２２０）および重鎖もしくは軽鎖フェリチン（例えば、イラクサギンウワバ重鎖または軽鎖フェリチン）；またはｉｉ）場合により本明細書に記載される表面に露出したシステインを含む、フェリチンを含む。
一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、配列番号２２６のアミノ酸２３〜１０７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、配列番号２２６のアミノ酸１〜１０７８と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、配列番号２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、または２３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み、場合によりリーダー配列を欠如する（例えば、これらの配列のアミノ酸１〜２２のいずれかまたは全てを欠如する）。
加えて、一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドおよびフェリチンを含むいずれの抗原性ＥＢＶポリペプチドも、フェリチン、ならびにｇｐ４４２以外のＥＢＶポリペプチド、例えばｇＬ／ｇＨおよび／またはｇｐ２２０を含む別の抗原性ＥＢＶポリペプチドのような、本明細書で開示される別のポリペプチドを含む組成物中に存在することができる。
ｄ）起こり得る酸化、脱アミド、またはイソアスパルテート形成部位を除去するためのｇＬ、ｇＨ、ｇｐ４２、リンカー、および／またはフェリチン配列における変異
一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、以下の表１に記載の例示的な変異のような、起こり得る酸化、脱アミド、またはイソアスパルテート形成部位を除去するための１つまたはそれ以上の変異を含む。
例えば、一部の実施形態では、ｇＬ配列は、起こり得るスクシンイミド／イソアスパルテートまたは脱アミド部位を除去するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ｇＬ配列は、配列番号２２７の３６位に対応する位置でＧからＡへの変異；配列番号２２７の４７位に対応する位置でＮからＱへの変異；または配列番号２２７の１０５位に対応する位置でＮからＱへの変異を含み得る。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのような標準的な配列アライメントアルゴリズムに従って、デフォルトパラメータを使用してその位置を整列させる場合、アミノ酸配列におけるある位置は、配列番号２２７における所定の位置に「対応する」。
一部の実施形態では、リンカーは、起こり得る脱アミド部位を除去するために１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、リンカー配列は、配列番号２２７の１３２または１４１位に対応する位置でＮからＧへの変異を含み得る。
一部の実施形態では、ｇＨ配列は、起こり得るスクシンイミド／イソアスパルテートまたは酸化部位を除去するために１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ｇＨ配列は、配列番号２２７の１８９、４０１、もしくは７２９位に対応する位置でＭからＬへの変異；配列番号２２７の３６８位に対応する位置でＤからＥへの変異；配列番号２２７の４９９もしくは６３９位に対応する位置でＭからＩへの変異；または配列番号２２７の６５３位に対応する位置でＮからＱへの変異を含み得る。
一部の実施形態では、ｇｐ４２配列は、起こり得る脱アミド部位を除去するために１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ｇｐ４２配列は、配列番号２２７の９５９もしくは９９０位に対応する位置でＮからＱへの変異；または配列番号２２７の９８８位に対応する位置でＮからＳへの変異を含み得る。
一部の実施形態では、フェリチン配列は、起こり得る脱アミド、酸化、またはイソアスパルテート形成部位を除去するために１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、フェリチン配列は、配列番号２２７の１１５０位に対応する位置でＱからＳへの変異；配列番号２２７の１１６８位に対応する位置でＭからＩへの変異；配列番号２２７の１１７７位に対応する位置でＭからＬへの変異；配列番号２２７の１１８８位に対応する位置でＧからＡへの変異；または配列番号２２７の１２５３もしくは１２９６位に対応する位置でＮからＱへの変異を含み得る。
例示的な変異を以下の表６に示す。位置の番号付けは配列番号２２７に対応する。
Figure 2021519596
３．非フェリチンポリペプチドとしてのインフルエンザポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフェリチンポリペプチドは、インフルエンザポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドの非フェリチンポリペプチドは、インフルエンザポリペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドは、抗原性インフルエンザ−フェリチンポリペプチドである。
ａ）ＨＡおよびＮＡポリペプチド
一部の実施形態では、インフルエンザポリペプチドは、完全長または部分長のＨＡまたはＮＡを含むＨＡまたはＮＡポリペプチドである。任意のＨＡまたはＮＡポリペプチドを使用してもよい。ＨＡまたはＮＡポリペプチドは、天然に存在してもよく、または天然から変化してもよい。一部の実施形態では、ＨＡは、Ｈ１〜Ｈ１８のいずれか１つに由来する。一部の実施形態では、ＮＡは、Ｎ１〜Ｎ１１のいずれか１つに由来する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、ＨＡエクトドメインを含む。ＨＡエクトドメインは、Ｈ１〜Ｈ１８を含むインフルエンザの任意のサブタイプに由来し得る。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、ＨＡのステム領域を含む。ＨＡのステム領域は、Ｈ１〜Ｈ１８を含むインフルエンザの任意のサブタイプに由来し得る。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザＡ型ウイルスに由来する。インフルエンザＡ型ウイルスは、Ａ／プエルトリコ／１９３４、Ａ／ワイス／１／１９４３、Ａ／フォートモンマス／１／１９４７（ＦＭ４７）、Ａ／マレーシア／３０２／５４（ＭＡＬ５４）、Ａ／デンバー／１／１９５７（ＤＶ５７）、Ａ／ニュージャージー／８／１９７６、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７、Ａ／香港／１１７／１９７７（ＨＫ７７）、Ａ／ブラジル／１１／１９７８、Ａ／チリ／１／１９８３、Ａ／台湾／１／１９８６、Ａ／テキサス／３６／１９９１、Ａ／北京／２６２／１９９５、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（ＮＣ９９）、Ａ／ソロモン諸島／６／２００６、Ａ／ブリスベン／５９／２００７、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（ＣＡ０９）、Ａ／バングラデシュ／２０２１／２０１２、またはＡ／ベトナム／３０５０／２０１３であり得る。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｈ１インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｈ１ウイルスは、Ａ／サウスカロライナ／１／１８である。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｈ２インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｈ２ウイルスは、１９５７年に流行したＨ２Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルスである。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｈ３インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｈ３インフルエンザウイルスは、Ｈ３Ｎ８ウイルスである。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ８ウイルスは、ウマ−オハイオ２００３である。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ８ウイルスは、ウマ−バリ２００５である。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ８ウイルスは、ウマ−アボイン２００３である。一部の実施形態では、Ｈ３インフルエンザウイルスは、Ｈ３Ｎ２ウイルスである。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ２ウイルスは、パース２００９である。一部の実施形態では、Ｈ３Ｎ２ウイルスは、ビクトリア２０１１である。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｈ５インフルエンザウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｈ５インフルエンザウイルスは、Ｈ５／Ｎ１ウイルスである。一部の実施形態では、Ｈ５／Ｎ１ウイルスは、インドネシア２００５である。一部の実施形態では、Ｈ５／Ｎ１ウイルスは、インドガン２００５である。一部の実施形態では、Ｈ５／Ｎ１ウイルスは、オオハクチョウ２００５である。一部の実施形態では、Ｈ５／Ｎ１ウイルスは、マガモ／ホワドン２００３である。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザＢ型ウイルスに由来する。一部の実施形態では、Ｂ型ウイルスは、ウィスコンシン２０１０である。一部の実施形態では、Ｂ型ウイルスは、マサチューセッツ２０１２である。一部の実施形態では、Ｂ型ウイルスは、プーケット２０１３である。一部の実施形態では、Ｂ型ウイルスは、ブリスベン２００８である。一部の実施形態では、ブリスベン２００８配列は、Ｄ１９７Ｎ変異を含む。この変異は、このナノ粒子の発現を改善することが見出され、これは、Ｂ／ブリスベン／２００９およびＢ／プーケット／２０１３のような他の株における天然に存在する変異である。このアミノ酸は、シアル酸受容体の接触に関係し得る。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｇｉｌｅｓ ＢＭ ａｎｄ Ｒｏｓｓ ＴＭ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（１６）：３０４３〜５４頁（２０１１）またはＣａｒｔｅｒ ＤＭら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９０：４７２０〜４７３４頁（２０１６）の実施例に従って生成された計算上最適化された広範反応性抗原（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｂｒｏａｄｌｙ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＯＢＲＡ））を含む。
一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列は、ヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ配列から生成される。一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列は、１９９９〜２０１２年の期間のヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ配列から生成される。１９９９〜２０１２年の期間のヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ配列から生成された例示的なＣＯＢＲＡ配列は、配列番号３２９に含まれるＣＯＢＲＡ Ｘ６である。一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列は、１９３３〜１９５７年および２００９〜２０１１年の期間のヒトＨ１Ｎ１株に加えて、１９３１〜１９９８年の期間のブタＨ１Ｎ１インフルエンザ株から生成される。１９３３〜１９５７年および２００９〜２０１１年の期間のヒトＨ１Ｎ１株に加えて１９３１〜１９９８年の期間のブタＨ１Ｎ１インフルエンザ株から生成される例示的なＣＯＢＲＡ配列は、配列番号３２７に含まれるＣＯＢＲＡ Ｐ１である。
一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列はＸ３である。一部の実施形態では、ＣＯＢＲＡ配列はＨ５Ｎ１から生成されるｈＣＯＢＲＡ−２である。
ＨＡ受容体結合部位を除去する変異（Ｙ９８Ｆ）は、Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１（８）：４０４７〜４０５７頁（２０１４）に記載された。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、Ｙ９８Ｆ変異を含む。上記のＨＡのいずれも、Ｙ９８Ｆ変異を含むように改変することができる。一部の実施形態では、ＨＡは、Ｈ１／ニューカレドニア／１９９９（ＮＣ９９）ウイルスに由来し、Ｙ９８Ｆ変異を含む。
４．非フェリチンポリペプチドとしてのボレリアおよびＯｓｐＡポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフェリチンポリペプチドは、ボレリアポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドの非フェリチンポリペプチドは、ボレリアポリペプチドである。一部の実施形態では、ボレリアポリペプチドは、Ｂ．ブルグドルフェリに由来する。一部の実施形態では、ボレリアポリペプチドは、血清型１、２、３、４、５、６、または７に対応するボレリア種に由来する。一部の実施形態では、ボレリアは、マダニ（Ｉｘｏｄｅｓ）属のダニが運ぶことができる。
一部の実施形態では、ボレリアポリペプチドは、ＯｓｐＡポリペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドもまた、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ボレリアの改変外部表面タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）を含む。ＯｓｐＡは、ＯｓｐＡの異なる種に対するモノクローナル抗体との反応性によって定義されるように複数の血清型で存在する（Ｗｉｌｓｋｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ３１（２）：３４０〜３５０頁（１９９３）を参照されたい）。これらの血清型は、ボレリア細菌の異なる遺伝子種と相関する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、血清型１〜７のいずれか１つである。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・マヨニイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｍａｙｏｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、またはボレリア・ババリエンシス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）に由来する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡである。一部の実施形態では、ボレリアは、マダニ属のダニが運ぶことができる。一部の実施形態では、ボレリアは、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・マヨニイ、ボレリア・アフゼリ、ボレリア・ガリニ、またはボレリア・ババリエンシスである。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１エクトドメインのようなＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドである。文献により、配列番号８３のアミノ酸１６５〜１７３でのＯｓｐＡ血清型１のエピトープは、ヒト白血球機能関連抗原−１（ｈＬＦＡ−１）、すなわち配列番号７８の配列の断片と相同性を有することが報告されている（Ｇｒｏｓｓ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７７）：７０３〜６頁（１９９８）を参照されたい）。配列番号８３のアミノ酸１６５〜１７３は、配列番号７７における単離されたノナペプチドとして示され、ｈＬＦＡ−１相同性部位と呼ばれる。配列番号８３は、本明細書においてＯｓｐＡにおけるアミノ酸位置の考察のための基準配列として使用される例示的な野生型血清型１のＯｓｐＡ配列である。この相同性部位は、抗生物質耐性ライム関節炎を含むライム関節炎の発症において役割を果たし得る。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ボレリアの改変ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含み、改変ＯｓｐＡは、配列番号７７の配列を含まない。そのようなポリペプチドは、抗体を誘発するために使用する場合、安全性の改善、例えば自己免疫応答を誘発するリスクの低減を有し得る。一部の実施形態では、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドは、ｈＬＦＡ−１との同一性を低減させる１つまたはそれ以上の改変を有する。配列番号７８との相同性を低減させる、配列番号７８との同一性を低減させる、または配列番号７８と比較して１つもしくはそれ以上の非保存的置換を導入する任意の改変が包含される。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ボレリアのＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含み、ＯｓｐＡポリペプチドは、配列番号７７の配列を含まない。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のエクトドメインを含み、エクトドメインは、配列番号７７の配列を含まない。一部の実施形態では、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドは、配列番号９４〜１０２のいずれか１つの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
「相同性を低減させる」は、配列同一性を低減させることおよび／または配列類似性を低減させることを包含し、以下の表４において保存的置換として記載された１組のアミノ酸の各メンバーは、記載された当初の残基およびその組の他のメンバーに対して類似であると考えられ；例えば表の１列目は、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンが互いに類似であることを示し、８列目は、アラニンおよびグリシンが互いに類似であることを示している。類似性は、推移的ではなく、そのため例えばイソロイシンおよびグリシンは類似ではないと考えられる。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、野生型ＯｓｐＡ血清型と比較してｈＬＦＡ−１に対して低減された相同性を有するＯｓｐＡ血清型１タンパク質を包含する。一部の実施形態では、改変されたＯｓｐＡは、配列番号７７のアミノ酸の任意の１つまたはそれ以上に対する改変を含むＯｓｐＡ血清型１を含む。一部の実施形態では、配列番号７７に対する改変は、非保存的アミノ酸置換である。非保存的置換は、以下の表に示す保存的置換とは異なる置換である。
Figure 2021519596
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、配列番号７７の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、血清型２、３、４、５、６、または７のＯｓｐＡのような非血清型１ＯｓｐＡの対応するアミノ酸に置き換えられているＯｓｐＡ血清型１タンパク質を含む。一部の実施形態では、配列番号７７のアミノ酸の各々は、血清型２、３、４、５、６、または７のＯｓｐＡの対応するアミノ酸に置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号７７のアミノ酸は、血清型２（Ｓ２、配列番号７９）または血清型３（Ｓ３、配列番号８０）の対応するアミノ酸に置き換えられている。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、配列番号８１を含む。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、配列番号８２を含む。配列番号８１および８２は、配列番号７７を置き換えると意図され、それによって配列番号７８に対する相同性を低減させる。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、完全長のＯｓｐＡ（例えば、本明細書に記載されるｈＬＦＡ−１に対する相同性を低減させる改変を含んでもよくまたは含まなくてもよい膜貫通ドメインおよびエクトドメインを含む）である。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠如する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインの一部、例えば野生型ＯｓｐＡ配列のＮ末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のアミノ酸１７、またはペアワイズまたは構造アライメントによって同定される、そのホモログの対応する位置を含むセグメントを欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のような、ＯｓｐＡのアミノ酸少なくとも１〜１７、またはペアワイズまたは構造アライメントによって同定される、そのホモログにおける対応するアミノ酸を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のようなＯｓｐＡの少なくともＮ末端の１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４アミノ酸、またはペアワイズまたは構造アライメントによって同定される、そのホモログにおける対応するアミノ酸を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のようなＯｓｐＡのアミノ酸１〜２５、またはペアワイズまたは構造アライメントによって同定される、そのホモログにおける対応するアミノ酸を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のアミノ酸１〜２６、またはペアワイズまたは構造アライメントによって同定される、そのホモログにおける対応するアミノ酸を欠如する。誤解を避けるために、膜貫通ドメインを欠如することは、ポリペプチドがＮ末端メチオニンを欠如することを必要としない；例えば第１の残基がメチオニンで第２の残基が野生型ＯｓｐＡの残基２６に対応し、その後に２７番目、２８番目等の野生型ＯｓｐＡ残基に対応する残基が続くポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠如すると考えられる。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドを含むポリペプチドは、野生型ＯｓｐＡ血清型１の膜貫通ドメイン内に含有される脂質付加部位のような脂質付加部位を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、野生型ＯｓｐＡ、例えば配列番号８３〜８９のいずれかの１〜２５位のいずれかに対応するシステインを含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７を欠如するか、またはシステイン１７で置換を有する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、脂質付加部位を欠如するように、野生型ＯｓｐＡ膜貫通ドメインの少なくとも一部を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のアミノ酸１〜１７と整列するアミノ酸を欠如する。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、パルミトイル基を含まない。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ジアシルグリセロール基を含まない。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、脂質付加されていない。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、脂質付加部位を欠如する。一部の実施形態では、この脂質付加部位は、膜貫通ドメイン内に含有される。一部の実施形態では、除去される脂質付加部位は、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７である。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７を欠如するかまたはシステイン１７で置換を有する。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡ脂質付加部位および／もしくは膜貫通ドメインもしくはその一部の除去、ならびに／またはパルミトイルおよび／もしくはジアシルグリセロール基の欠如は、例えばタンパク質の溶解度を改善することによって、および／またはタンパク質を、イオン交換および他の形態のクロマトグラフィーのような技術による精製をより受けやすくすることによって、より容易なタンパク質精製を可能にする。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、哺乳動物リーダー配列（シグナル配列としても知られる）を含む。一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列は、哺乳動物細胞において発現された場合に、ポリペプチドの分泌をもたらす。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、グリコシル化部位を欠如する。グリコシル化部位を除去する改変を、本明細書において詳細に記載する。本開示に従うＯｓｐＡポリペプチドは、ｈＬＦＡ−１相同性部位に対する改変、および／または膜貫通ドメインの一部もしくは全ての欠失を含む、本明細書に記載される任意の他の改変と組み合わせることができる任意のそのような改変を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７７（例えば、ｈＬＦＡ−１ａに対して低減された相同性を有する）を含まず、およびグリコシル化を低減させる変異を有し、および／または膜貫通ドメインを欠如する。
ａ）グリコシル化の改変
Ｎ結合グリコシル化は、タンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）残基のアミド窒素に対するグリカンの結合である。結合プロセスは、グリコシル化タンパク質をもたらす。グリコシル化は、タンパク質の翻訳後にグリコシル化酵素により接近可能であり、認識されるタンパク質中の任意のアスパラギン残基で起こり得、ＮＸＳ／ＴＸ部位の一部である接近可能なアスパラギンで最も一般的であり、アスパラギンの後に続く第２のアミノ酸残基は、セリンまたはトレオニンである。非ヒトグリコシル化パターン（例えば、ある特定の非ヒト細胞タイプにおけるグリコシル化部位を含むポリペプチドの発現に起因する）は、抗体を誘発するために使用する場合、ポリペプチドを望ましくないほど反応原性にすることがある。加えて、通常グリコシル化されないポリペプチドのグリコシル化は、その免疫原性を変化させることができる。例えば、グリコシル化は、タンパク質内の重要な免疫原性エピトープを隠すことができる。このように、グリコシル化を低減または除去するために、アスパラギン残基またはセリン／トレオニン残基のいずれかを、例えば別のアミノ酸への置換によって改変することができる。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドを含むポリペプチドは、グリコシル化を低減または除去するように改変される。一部の実施形態では、ＯｓｐＡにおける１つまたはそれ以上のＮグリコシル化部位が除去される。一部の実施形態では、Ｎグリコシル化部位の除去は、ＯｓｐＡのグリコシル化を減少させる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、野生型血清型１ＯｓｐＡのような野生型ＯｓｐＡと比較して減少したグリコシル化を有する。一部の実施形態では、Ｎグリコシル化部位の除去は、ＯｓｐＡのグリコシル化を除去する。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡにおける１つまたはそれ以上のアスパラギンは、非アスパラギンアミノ酸に置き換えられる。一部の実施形態では、ＯｓｐＡにおける各アスパラギンは、非アスパラギンアミノ酸に置き換えられる。タンパク質において見出される任意の天然または非天然アミノ酸、例えばグルタミンを使用して、アスパラギンを置き換えてもよい。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去するための改変は、ＮＸＳ／ＴＸグリコシル化部位を改変する（Ｎの後の第２の残基はＳまたはＴである）。一部の実施形態では、ＮＸＳ／ＴＸ部位における第１のＸおよび／またはＮＸＳ／ＴＸ部位における第２のＸは、プロリンではない。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＮからＱへの置換である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、Ｓ／ＴのＡへの置換である。
グリコシル化を低減または除去するように改変することができる位置の詳細な考察を以下に述べる。位置の番号は、配列番号８３〜８９として提供される完全長のＯｓｐＡ配列における位置を指す。位置の番号は、部分的および改変ＯｓｐＡ配列に関して適切に調節すべきであると理解される（例えば、Ｎ末端欠失によって２５アミノ酸残基の真の短縮がもたらされる場合、位置の番号を２５減少すべきである）。
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型１（配列番号８３）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型１のＮ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型１のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１９０Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、またはＮ２５１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。対応するアミノ酸は、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型２〜７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型１のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型１の２２、７３、１９２、２０４、および２５３位でＳｅｒまたはＴｈｒの任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型１の２２、７３、１９２、２０４、および２５３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型２（配列番号８４）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ１６４、Ｎ２０２、およびＮ２０５の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型２のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ１６４、Ｎ２０２、およびＮ２０５の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型２のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１４１Ｑ、Ｎ１６４Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、またはＮ２０５Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１または３〜７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型２のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ１６４、Ｎ２０２、およびＮ２０５と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型２の２２、７３、１４３、１６６、２０４、および２０７位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型２の２２、７３、１４３、１６６、２０４、および２０７位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型３（配列番号８５）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ９５、Ｎ１４１、Ｎ１９１、およびＮ２０３の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型３のＮ２０、Ｎ２０、Ｎ７１、Ｎ９５、Ｎ１４１、Ｎ１９１、およびＮ２０３の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型３のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ９５Ｑ、Ｎ１４１Ｑ、Ｎ１９１Ｑ、またはＮ２０３Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１〜２、または４〜７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型３のＮ２０、Ｎ２０、Ｎ７１、Ｎ９５、Ｎ１４１、Ｎ１９１、およびＮ２０３と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型３の２２、７３、９７、１４３、１９３、および２０５位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型３の２２、７３、９７、１４３、１９３、および２０５位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型４（配列番号８６）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ２０２、Ｎ２０５、およびＮ２１９の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型４のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ２０２、Ｎ２０５、およびＮ２１９の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型４のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１４１Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、Ｎ２０５Ｑ、またはＮ２１９Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１〜３、または５〜７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型４のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ２０２、Ｎ２０５、およびＮ２１９と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型４の２２、７３、１４３、２０４、２０７、および２２１位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型４の２２、７３、１４３、２０４、２０７、および２２１位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型５のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む（血清型５〜７を含むある特定の血清型は、血清型１のようなある特定の他のＯｓｐＡ配列より少ないグリコシル化部位を含有する）。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型５（配列番号８７）のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型５のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、またはＮ１４１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって、異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１〜４、または６〜７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型５のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型５の２２、７３、および１４３位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型５の２２、７３、および１４３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型６（配列番号８８）のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１の任意の１つまたはそれ以上の置換を含み得る。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型６のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型６のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、またはＮ１４１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１〜５、または７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型６のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型６の２２、７３、および１４３位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型６の２２、７３、および１４３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型７（配列番号８９）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、およびＮ１９１の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型７のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、およびＮ１９１の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型７のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１４１Ｑ、またはＮ１９１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１〜６のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型７のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、およびＮ１９１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型７の２２、７３、１４３、および１９３位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型７の２２、７３、１４３、および１９３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
５．非フェリチンポリペプチドとしてのＲＳＶポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載されるフェリチンポリペプチドは、ＲＳＶポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドの非フェリチンポリペプチドは、ＲＳＶポリペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドは、抗原性ＲＳＶポリペプチドである。ＲＳＶポリペプチドは、本明細書に記載される任意のＲＳＶ ＦポリペプチドのようなＲＳＶ Ｆポリペプチドであり得る。ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、ＲＳＶ Ｆの配列全体またはＲＳＶ Ｆの一部を含み得る。ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、野生型配列と比較して１つまたはそれ以上の改変（例えば、アミノ酸置換）を含み得る。ＲＳＶポリペプチドは、本明細書に記載される任意のＲＳＶ ＧポリペプチドのようなＲＳＶ Ｇポリペプチドであり得る。
ａ）ＲＳＶ Ｆポリペプチド
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、完全長または断片の野生型ＲＳＶ Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、融合前ＲＳＶ Ｆと融合後ＲＳＶ Ｆの間で共有されるＲＳＶポリペプチドのエピトープをブロックする。エピトープのブロッキングにより、抗原性ＲＳＶポリペプチドを対象に投与した場合に、エピトープに対する抗体の生成が低減または除去される。これは、融合前コンフォメーションのようなＦの特定のコンフォメーションに対して特異的なエピトープを標的とする抗体の割合を増加させることができる。Ｆは、まだ細胞に侵入していないウイルスの融合前コンフォメーションを有することから、融合前Ｆを標的とする抗体の割合の増加は、より大きい程度の中和を提供することができる（例えば、本明細書に記載されるように中和対結合比として表記される）。ブロッキングは、共有されたエピトープの近位にあるＮグリカンのようなかさ高い部分を操作することによって達成することができる。例えば、野生型Ｆに存在しないＮグリコシル化部位を、例えば適切な残基をアスパラギンに変異させることによって付加することができる。一部の実施形態では、ブロックされたエピトープは、ＲＳＶ Ｆの抗原性部位１のエピトープである。一部の実施形態では、融合前ＲＳＶ Ｆと融合後ＲＳＶ Ｆの間で共有される２つまたはそれより多くのエピトープがブロックされている。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆの抗原性部位１の２つまたはそれより多くのエピトープがブロックされている。一部の実施形態では、ブロックされたエピトープと地形学的に重複する１つもしくはそれ以上、または全てのエピトープが、同様にブロックされ、場合によりブロックされたエピトープはＲＳＶ Ｆの抗原性部位１のエピトープである。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５２６の３２８、３４８、または５０７位に対応するアスパラギンを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５２６の３２８、３４８、または５０７位の少なくとも２つに対応するアスパラギンを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５２６の３２８、３４８、または５０７位に対応するアスパラギンを含む。実施例に記載するように、そのようなアスパラギンは、グリコシル化部位として機能することができることが見出されている。さらに、いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、これらの部位でのグリカンは、ポリペプチドを対象に投与する場合、融合前および融合後ＲＳＶ Ｆタンパク質に共通するエピトープを含む近くのエピトープに対する抗体の発生を阻害し得る。一部の実施形態では、配列番号２６の３２８、３４８、または５０７位に対応するアスパラギンのグルコシル化は、抗原性部位１のエピトープのような、融合前ＲＳＶ Ｆと融合後ＲＳＶ Ｆの間で共有される少なくとも１つのエピトープをブロックする。融合前および融合後ＲＳＶタンパク質に共通するエピトープに対する抗体の発生を阻害することは、それが、他のＲＳＶ Ｆエピトープに対する抗体より有効な中和活性を有し得る部位０エピトープのような、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して特異的なエピトープに対する抗体発生を方向付けることができることから有益であり得る。部位０エピトープは、配列番号５２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９を伴う。したがって、一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５２６のアミノ酸残基６２〜６９および１９６〜２０９を含む。
本明細書に記載される構築物は、野生型ＲＳＶ Ｆと比較して異なる長さの欠失または置換を有し得ることに注意すべきである。例えば、配列番号５２３および他の構築物において、野生型配列（配列番号５２６）の９８〜１４４位を、ＧＳＧＮＶＧＬ（配列番号５２３の９８〜１０４位；同様に配列番号５３１）に置き換えると、４０アミノ酸の真の除去をもたらし、それによって配列番号５２６の３２８、３４８、または５０７位は、配列番号５２３の２８８、３０８、および４６７位に対応する。一般的に、本明細書に記載される構築物における位置は、ペアワイズアライメントによって、例えば標準的なパラメータ（ＥＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）によるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用することによって、配列番号５２６の野生型配列上にマッピングすることができる。同様に、対応する位置を同定するための代替アプローチとして、本明細書に提供される構造アライメントの考察も参照されたい。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、融合前ＲＳＶ Ｆの表面上のエピトープと構造的に類似である融合前抗原上のエピトープをブロックするためにグリカンを付加する変異を含む。一部の実施形態では、グリカンは、ＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーションに存在し得るエピトープを特異的にブロックするように付加される。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーションに存在し得るエピトープをブロックするが、部位０エピトープのようなＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーションに存在する１つまたはそれ以上のエピトープに影響を及ぼさないグリカンが付加される。
一部の実施形態では、上記の１つまたはそれ以上のグリコシル化部位で付加されるグリカンは、他の構築物と比較して、哺乳動物細胞のような発現系において分泌を増加させる。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５１７のアミノ酸１〜４７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５１７の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５１７のアミノ酸１〜４７８を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５１７の配列を含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５２３のアミノ酸１〜４７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５２３の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５２３のアミノ酸１〜４７８を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５２３の配列を含む。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、上記のアスパラギンの少なくとも１つ、２つ、または３つを含むさらなる改変が作製されるＤＳ−ＣＡＶ１配列（例えば、ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）に記載される）（配列番号５２５）を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、フェリチンタンパク質をさらに含む。フェリチンタンパク質は、フェリチンに関する章において以下に記載した特色のいずれかまたはその組合せをさらに含み得る。
ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、あるいはまたは加えて、以下の考察に記載される任意の追加の特色、またはそのような特色の任意の実現可能な組合せを含み得る。
一本鎖構築物
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、一本鎖構築物、例えばフリン切断部位を欠如するＲＳＶ Ｆポリペプチドである。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆは、１つまたはそれ以上のフリン切断部位を含む。フリン切断部位を欠如する構築物は、本来のＦタンパク質の生物学的Ｆ１／Ｆ２断片に切断されない単一のポリペプチドとして発現される。
アミノ酸置換
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆは、野生型配列と比較して単一のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆは、野生型配列と比較して１つより多くの単一のアミノ酸置換、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の置換を含む。例示的な野生型配列は、配列番号５２６である。
一部の実施形態では、アミノ酸置換またはアミノ酸置換の対は、プロトマー間の安定化置換である。プロトマー間安定化であり得る例示的な置換は、配列番号５２６の位置番号付けを使用してＶ２０７Ｌ；Ｎ２２８Ｆ；Ｉ２１７ＶおよびＥ２１８Ｆ；Ｉ２２１ＬおよびＥ２２２Ｍ；またはＱ２２４ＡおよびＱ２２５Ｌである。
一部の実施形態では、アミノ酸置換またはアミノ酸置換の対は、プロトマー間安定化である。プロトマー間安定化であり得る例示的な置換は、配列番号５２６の位置番号付けを使用してＶ２２０Ｉ；ならびにＡ７４ＬおよびＱ８１Ｌである。
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ヘリックス安定化、すなわちＲＳＶ Ｆのヘリックスドメインを安定化すると予想される。ヘリックスドメインの安定化は、部位０エピトープの安定性およびＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーションの安定性に関与し得る。ヘリックス安定化であり得る例示的な置換は、配列番号５２６の位置番号付けを使用してＮ２１６ＰまたはＩ２１７Ｐである。
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ヘリックスキャッピングである。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ヘリックスＰＲＯキャッピングである。ヘリックスキャッピングは、アルファヘリックスにおけるプロリン残基変異部位が、ヘリックス形成を妨害し得るが、ヘリックス領域のＮ末端でのプロリンは、ＰＨＩ／ＰＳＩ結合角を安定化することによってヘリックス形成の誘導に役立ち得る、という生物物理学的観察に基づく。ヘリックスキャッピングであり得る例示的な置換は、配列番号５２６の位置番号付けを使用してＮ２１６ＰまたはＩ２１７Ｐである。
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＤＳ−ＣＡＶ１のジスルフィド変異を置き換える。一部の実施形態では、ＤＳ−ＣＡＶ１の操作されたジスルフィドを、野生型に復帰させる（ＤＳ−ＣＡＶ１のＣ６９Ｓおよび／またはＣ２１２Ｓ変異、配列番号５２６の位置番号付けを使用して）。一部の実施形態では、ＤＳ−ＣＡＶ１の１つまたはそれ以上のＣ残基をＳ残基に置き換えて、ジスルフィド結合を除去する。一部の実施形態では、配列番号５２６の位置番号付けを使用するＣ６９ＳまたはＣ２１２Ｓ置換は、ジスルフィド結合を除去する。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５２６の位置番号付けを使用してＣ６９ＳおよびＣ２１２Ｓの両方を含む。一部の実施形態では、そのようなシステインの置き換えおよびそれによるジスルフィド結合の除去は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの還元（すなわち、還元剤からの電子の受容）をブロックする。一部の実施形態では、配列番号５２６の位置番号付けを使用するＩ２１７Ｐ置換は、Ｃ６９および／またはＣ２１２での置換の代わりに抗原に含まれる。配列番号５２６における位置２１７は、配列番号５２３における位置１７７に対応する。
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、トリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼによるタンパク質分解を防止する。一部の実施形態では、そのようなタンパク質分解を防止するアミノ酸置換は、ＲＳＶ Ｆの７残基反復領域Ｂ（ＨＲＢ）にある。野生型ＨＲＢ領域を含むＲＳＶ Ｆ−フェリチン構築物のタンパク質分解と一貫する断片の出現は、この領域におけるリシンまたはアルギニンがタンパク質分解の標的であることを示唆した。ＫまたはＲ残基を除去するアミノ酸置換は、ノックアウト（ＫＯ）と呼ぶことができる。一部の実施形態では、ＫまたはＲを、ＬまたはＱの代わりに使用する。一部の実施形態では、Ｋは、ＬまたはＱの代わりに使用される。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、配列番号５２６の位置番号付けを使用してＫ４９８Ｌおよび／またはＫ５０８Ｑを含む。配列番号５２３における対応する位置はそれぞれ、４５８および４６８である。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、Ｋ４９８ＬおよびＫ５０８Ｑの両方を含む。
一部の実施形態では、アミノ酸置換はグリカンを付加する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、グリカンをＲＳＶ Ｆポリペプチドに付加することによってグリコシル化を増加させる。グリカンを付加する置換はまた、本来のグリコシル化（追加のグリカンを有しない）と比較して操作されたグリコシル化と呼ぶことができる。
一部の実施形態では、グリカンを付加するアミノ酸置換は、Ｎへの置換であった。一部の実施形態では、Ｎへのアミノ酸置換は、Ｎ結合グリコシル化を可能にする。一部の実施形態では、Ｎへの置換は、Ｎに対してＣ末端側の第２のアミノ酸位置でＴまたはＳへの置換を伴い、これはＮｘＴ／Ｓグリコシル化モチーフを形成する。一部の実施形態では、Ｎは、表面に露出している。以下の例に示すように、グリコシル化を増加させる変異は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドを含むポリペプチドの発現の増加を提供することができる。
改変に基づくＲＳＶ Ｆポリペプチドの特性に対する変化
ＲＳＶ Ｆのアミノ酸配列に対する改変は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの特性を変化させることができる。ＲＳＶ Ｆポリペプチドの特性は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの任意の構造的または機能的特徴を含み得る。
一部の実施形態では、アミノ酸配列に対する単一の改変は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの複数の特性を変化させる。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの異なる特性を変化させる複数の改変を含み得る。一部の実施形態では、複数の改変は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの特性のより大きい変化を生じる。
一部の実施形態では、複数の改変は、特定の特性に対して相加効果を有し得る。例えば、グリカンを付加する２つのアミノ酸置換は、単一のアミノ酸置換と比較してＲＳＶ Ｆポリペプチドのグリコシル化のより大きい増加を生じることができる。
一部の実施形態では、複数の改変は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの異なる特性に影響を及ぼす。例えば、グリコシル化を増加させる１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を、低減をブロックするために１つまたはそれ以上のアミノ酸置換と共に作製することができる。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドに対する改変は、融合前コンフォメーションを安定化させる。
一部の実施形態では、改変は、例えばＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０（６１３６）：１１１３〜１１１７頁（２０１３）に記載されるように融合前ＲＳＶ Ｆの部位０エピトープ（抗原性部位０としても知られる）を安定化させる。一部の実施形態では、部位０エピトープを安定化させる改変は、プロトマー間安定化である。一部の実施形態では、部位０エピトープを安定化させる改変は、抗体Ｄ２５またはＡＭ１４に対する結合によってそれぞれ測定する部位０および部位Ｖ結合によって測定した場合に融合前Ｆを安定化させる。
一部の実施形態では、改変は、発現系においてＲＳＶ Ｆの発現を増加させる。一部の実施形態では、改変は発現系においてＲＳＶ Ｆの分泌を増加させる。一部の実施形態では、改変は、発現後に組換えＲＳＶ Ｆの安定性を増加させる。この変化は、細菌、真菌、昆虫、または哺乳動物のような任意のタイプの発現系に存在し得る。
一部の実施形態では、プロリンを導入するアミノ酸置換は、他の構築物と比較して発現を増加させる。一部の実施形態では、グリカンを付加するアミノ酸置換は、他の構築物と比較して発現を増加させる。一部の実施形態では、ＫまたはＲを他のアミノ酸に置換するアミノ酸置換は、他の構築物と比較して発現を増加させる。発現の観察可能な増加は、宿主細胞または細胞外環境におけるプロテアーゼ切断もしくは分解の相対的阻害および／または安定性の増加を含む、発酵の実施または他の産生プロセスの収量を増加させる任意の機構に起因し得る。一部の実施形態では、ＲＳＶ ＦのＨＲＢ領域における１つまたはそれ以上のＫ残基を他のアミノ酸に置換するアミノ酸置換は、他の構築物と比較して発現を増加させる。
一部の実施形態では、Ｋを他のアミノ酸に置換するアミノ酸置換は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの安定性を増加させる。一部の実施形態では、ＲＳＶ ＦのＨＲＢ領域における１つまたはそれ以上のＫ残基を他のアミノ酸に置換するアミノ酸置換は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの安定性を増加させる。一部の実施形態では、この安定性の増加は、プロテアーゼ切断の低減による。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆは、例えば還元後のコンジュゲーションを防止するために、ジスルフィドを除去する変異を含む。一部の実施形態では、Ｉ２１７Ｐ置換は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドの低減をブロックする。一部の実施形態では、Ｋを他のアミノ酸に置換するアミノ酸置換は、還元剤の存在下でＲＳＶ Ｆポリペプチドの低減をブロックする。
一部の実施形態では、一本鎖構築物は、他の構築物と比較して発現を増加させる。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、ＤＳ−ＣＡＶ１配列（配列番号５２５）（例えば、ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）に記載されている）を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆポリペプチドは、上記のアスパラギンの少なくとも１つ、２つ、または３つを含むさらなる改変が作製されるＤＳ−ＣＡＶ１の配列を含む。
ｂ）ＲＳＶ Ｇポリペプチド
本明細書で使用される場合、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、ＲＳＶ Ｇの配列全体またはＲＳＶ Ｇの一部を含み得る。ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、野生型配列と比較して改変を含み得る。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、野生型ＲＳＶ Ｇ（配列番号５２７）と比較して改変されたＲＳＶ Ｇである。一部の実施形態では、これらの改変は、野生型ＲＳＶ Ｇと比較してＲＳＶ Ｇポリペプチドのアミノ酸に対する変化である。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、ＲＳＶ Ｇのエクトドメイン（配列番号５２８またはそれに対応する位置）の全てまたは一部を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、Ｇｃｃ領域（ＲＳＶ Ｇ（配列番号５２７）のアミノ酸１５１〜１９３）の全てまたは一部を含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、ＣＸ３Ｃモチーフを含む。一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、ＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する。Ｇｃｃ領域は、保存され、かつ免疫原性であり、このようにＲＳＶ株に対して広い活性を有する抗体を誘発するために使用することができる。一部の実施形態では、配列番号５３６に示すＲＳＶ Ｇｃｃ株Ａを提供する。一部の実施形態では、配列番号５３７に示すＲＳＶ Ｇｃｃ株Ｂを提供する。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、グリコシル化されない。例えば、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、ＮまたはＳ／Ｔ残基の切断または変異（例えばそれぞれ、ＱまたはＡへの）またはその組合せのいずれかにより、ＮＸＳ／ＴＸグリコシル化部位を欠如し得る。
一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、例えばフェリチン上の表面に露出したシステインを介して、本明細書に記載されるフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、このフェリチンナノ粒子は、ＲＳＶ Ｆポリペプチドを含むいずれかのポリペプチドのようなＲＳＶ Ｆポリペプチドおよび上記のフェリチンタンパク質も含む融合タンパク質である。
Ｄ．例示的な組成物、キット、核酸、使用、および方法
一部の実施形態では、本発明は、病原体による感染に対して対象を免疫する方法を提供する。本発明は、対象における病原体に対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドまたはナノ粒子の有効量を対象に投与する工程を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、病原体による感染に対して対象を免疫するために、ヒトを含む対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、ヒトのような対象の免疫に使用するためである。一部の実施形態では、投与される組成物は、配列番号１〜７６、３０１〜３４３、４０１〜４０３、４１０、４１３〜４１４、４１７〜４２７、または５０１〜５２３のいずれか１つの配列を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態では、投与は、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、またはボレリアに対して免疫する。
同様に、組成物を将来の感染に対する保護的免疫応答を生じるために投与してもよい。一部の実施形態では、将来の感染は、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、またはボレリア感染である。
一部の実施形態では、保護的免疫応答は、入院の発生率を減少させる。一部の実施形態では、組成物がインフルエンザポリペプチドを含む場合、保護的免疫応答は、検査により確認されたインフルエンザ感染症の発生率を減少させる。一部の実施形態では、組成物がＥＢＶポリペプチドを含む場合、保護的免疫応答は、ＥＢＶ感染症、単核球症、単核球症によって引き起こされる合併症（例えば、肝炎、脳炎、重度の溶血性貧血、または脾腫）、鼻咽頭がん、胃がん、またはＢリンパ腫（バーキットまたはホジキンリンパ腫を含む）の発生率を減少させる。一部の実施形態では、組成物がＲＳＶポリペプチドを含む場合、保護的免疫応答は、ＲＳＶによる感染症、肺炎、気管支炎、または喘息の発生率を減少させる。一部の実施形態では、組成物がボレリアポリペプチドを含む場合、保護的免疫応答は、関節の炎症、神経学的症状、認知障害、または心リズム不規則を含む急性または慢性ライム病の発生率を減少させる。
１．対象
一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
一部の実施形態では、対象は成人（年齢１８歳より上または１８歳に等しい）である。一部の実施形態では、対象は小児または青年（年齢１８歳未満）である。一部の実施形態では、対象は高齢者（年齢６０歳より上）である。一部の実施形態では、対象は、非高齢成人（年齢１８歳より上またはそれに等しく、年齢６０歳未満またはそれに等しい）である。
一部の実施形態では、組成物の１回より多くの投与を対象に投与する。一部の実施形態では、ブースター投与は免疫応答を改善する。
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の１つまたはそれ以上は、霊長類（例えば、サル（例えば、アカゲザルまたはカニクイザルのようなマカク）または類人猿のような非ヒト霊長類）、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、または家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、またはロバ）のような哺乳動物において使用するためである。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の１つまたはそれ以上は、家禽（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、または白鳥）のような鳥類において使用するためである。
２．アジュバント
本明細書で使用される場合、アジュバントは、表面に露出したアミノ酸，例えば、システインを介してフェリチンにコンジュゲートしてもよい。非コンジュゲートアジュバントもまた、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドと共に対象に投与してもよい。一部の実施形態では、抗原性フェリチンポリペプチドと共にアジュバントを投与すると、アジュバントを投与しない非フェリチンポリペプチド単独、または抗原性フェリチンポリペプチド単独の投与と比較して、対象において非フェリチンポリペプチドに対するより高力価の抗体を生じる。アジュバントは、抗原性ポリペプチドに対するより早期の、より強力な、またはより持続性の免疫応答を促進し得る。
一部の実施形態では、組成物は、１つのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は１つより多くのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。
一部の実施形態では、アジュバントはアルミニウムを含む。一部の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。一部の実施形態では、アジュバントはミョウバン（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５ ２％；Ｂｒｅｎｎｔａｇ−カタログ番号２１６４５−５１−２）である。
一部の実施形態では、アジュバントは有機アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは油基剤のアジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは水中油型ナノ乳剤を含む。
一部の実施形態では、アジュバントはスクアレンを含む。一部の実施形態では、スクアレンを含むアジュバントは、Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍカタログ番号Ｓ６３２２−１ｖｌ）、Ａｄｄａｖａｘ（商標）ＭＦ５９、ＡＳ０３、またはＡＦ０３（米国特許第９７０３０９５号を参照されたい）である。一部の実施形態では、スクアレンを含むアジュバントは、ナノ乳剤である。
一部の実施形態では、アジュバントは、ポリアクリル酸ポリマー（ＰＡＡ）を含む。一部の実施形態では、ＰＡＡを含むアジュバントはＳＰＡ０９である（ＷＯ２０１７２１８８１９を参照されたい）。
一部の実施形態では、アジュバントは非代謝性油を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。
一部の実施形態では、アジュバントは、非代謝性油および結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントはフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）である。
一部の実施形態では、アジュバントは、リポ多糖類である。一部の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルＡ（ＭＰＬまたはＭＰＬＡ）である。
３．医薬組成物
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドおよび／または関連する実体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、病原体に対して保護的免疫応答のような免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。
例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：（１）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、および（ｉｉ）非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（２）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、およびシステインに連結した免疫刺激性部分；ならびに（ｉｉ）非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（３）（ｉ）表面に露出したシステイン、（ｉｉ）フェリチンタンパク質に対してＮ末端側のペプチドリンカー；および（ｉｉｉ）ペプチドリンカーに対してＮ末端側の非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（４）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、およびシステインに連結した免疫刺激性部分、（ｉｉ）Ｈ．ピロリフェリチンの３１位の内部システイン、またはペアワイズまたは構造アライメントによって同定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの３１位と類似の位置の内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異；（ｉｉｉ）表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異、ならびに（ｉｖ）非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；または（５）前述のフェリチンタンパク質を含むフェリチン粒子。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに関連する抗体または他の作用物質を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに結合するおよび／またはそれと競合する抗体を含む。あるいは、抗体は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドの非フェリチンポリペプチド構成要素を含むウイルス粒子または細菌を認識し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、単独で、または免疫応答を増強するための１つもしくはそれ以上の作用物質、例えば本明細書に記載されるアジュバントと組み合わせて投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、上記のアジュバントをさらに含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「担体」は、それと共に医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。例示的な実施形態では、担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等を含み得る。一部の実施形態では、担体は、１つまたはそれ以上の固体構成要素であるか、またはそれらを含む。薬学的に許容される担体はまた、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその組合せを含み得るがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、賦形剤は、例えば所望のコンシステンシーまたは安定化効果を提供するまたはそれに関与するように医薬組成物に含めることができる任意の非治療剤である。適した薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含むがこれらに限定されない。様々な実施形態では、医薬組成物は無菌的である。
一部の実施形態では、医薬組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定化剤、緩衝剤、または保存剤のような任意の多様な添加剤を含み得る。加えて、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を含めることができる。
様々な実施形態では、医薬組成物は、任意の所望の投与様式に適合するように製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、滴剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を含有するカプセル、ゼラチンカプセル、散剤、徐放性製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、凍結乾燥粉末、凍結懸濁液、乾燥粉末の形態、または使用するために適した他の任意の形態をとることができる。薬剤の製剤化および製造における一般的検討は、例えば参照によって本明細書に組み入れられる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出すことができる。
医薬組成物は、任意の投与経路を介して投与することができる。投与経路は、例えば経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸内、気管内点滴、気管支点滴、吸入、または局所投与経路を含む。投与は局所または全身であり得る。一部の実施形態では、投与は経口で実施される。別の実施形態では、投与は非経口注射による。一部の例では、投与は、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドの血流への放出をもたらす。投与様式は、医師の裁量に委ねることができる。
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、および皮下）にとって適している。そのような組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤等として製剤化することができる。それらは、使用直前に滅菌注射可能媒体に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造してもよい。例えば、非経口投与は注射によって達成することができる。そのような実施形態では、注射剤は、通常の形態、すなわち液体溶液または懸濁液、注射前に液体中の溶液または懸濁液にとって適した固体形態、または乳剤として調製される。一部の実施形態では、注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、凍結乾燥粉末、または顆粒から調製される。
さらなる実施形態では、医薬組成物は、吸入（例えば、肺および呼吸器への直接送達）による送達のために製剤化される。例えば、組成物は、点鼻用噴霧剤または他の任意の公知のエアロゾル製剤の形態をとり得る。一部の実施形態では、吸入用またはエアロゾル送達のための調製物は、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、そのような調製物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンの平均粒子サイズを有し得る。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、例えば湿潤剤を含めることを通して湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、鼻または口腔への滴剤として投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５滴等）を含み得る。
本発明の医薬組成物は、所望の転帰を達成するために適切な任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の転帰は、組成物に存在する抗原性フェリチンポリペプチドに存在する非フェリチンポリペプチドの起源のような病原体に対する長期間持続する適応免疫応答の誘導である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の１つまたはそれ以上の症状の強度、重症度、頻度の低減、および／または発生の遅延である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の阻害または予防である。必要な用量は、対象の種、年齢、体重、および全身状態、予防または処置される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に応じて対象毎に変化する。
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、単回または複数回用量で投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、異なる日に投与される複数回用量で投与される（例えば、プライム−ブーストワクチン接種戦略）一部の実施形態では、医薬組成物は、ブースターレジメンの一部として投与される。
様々な実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の追加の治療剤と同時投与される。同時投与は、それらの投与時期が、追加の治療剤および医薬組成物中の活性成分の薬理活性が時間的に重複し、それによって組み合わせた治療効果を発揮する場合には、治療剤を同時に投与する必要はない。一般的に、各々の作用物質は、その作用物質に関して決定された用量および時間スケジュールで投与される。
４．核酸／ｍＲＮＡ
同様に、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドをコードする核酸も提供される。一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。ポリペプチドをもたらす翻訳を受けることが可能な任意の核酸は、本開示の目的に関してｍＲＮＡであると考えられる。
５．キット
同様に本明細書において、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の抗原性ポリペプチド、核酸、抗原性フェリチン粒子、抗原性ルマジンシンターゼ粒子、組成物、または医薬組成物を含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、溶媒、溶液、緩衝剤、説明書、または乾燥剤の１つまたはそれ以上をさらに含む。
本説明および例示的な実施形態は、制限すると解釈すべきではない。本明細書および添付の特許請求の目的に関して、特に示していない限り、量、パーセンテージ、または割合を表記する全ての数値、ならびに本明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値は、全ての例において、既にそのように修飾されていない程度に、用語「約」によって修飾されると理解される。「約」は、記載される主題の特性に実質的に影響を及ぼさない変動の程度、例えば１０％、５％、２％、または１％以内の変動を示す。したがって、逆を示していない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲で記載される数値パラメータは、得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、および特許請求の範囲と均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各々の数値パラメータは、報告された有効数字を検討する、および通常の四捨五入技術を適用することによると少なくとも解釈すべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」、ならびに他の用語の任意の単数形での使用は、１つの指示対象に明白かつ明確に限定されていない限り、複数の指示対象を含むことに注意されたい。本明細書に使用される場合、用語「含む」およびその文法的変形形態は、非制限的であると意図され、リストにおける項目の引用は、列挙される項目に置換または追加することができる他の類似の項目の除外ではない。用語「または」は、包括的な意味で使用され、すなわち本文がそれ以外であることを示していない限り、「および／または」と等価である。
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実施例
以下の実施例は開示した特定の実施形態を説明するために提供され、本開示の範囲を限定するものとは決して解釈すべきでない。
ＯｓｐＡ−フェリチン抗原性ポリペプチドの調製
ＯｓｐＡおよびフェリチンを含む抗原性ポリペプチドを産生した。
ＯｓｐＡは、以下の配列：ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株Ｂ３１（血清型１）ＮＢＣＩ配列ＩＤ ＷＰ＿０１０８９０３７８．１、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）株ＰＫＯ（血清型２）ＮＣＢＩ配列：ＷＰ＿０１１７０３７７７．１、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ（血清型３）ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ５６５４９．１、ボレリア・ババリエンシス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）（血清型４）ＮＣＢＩ配列ＷＰ＿０１１１８７１５７．１、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）（血清型５）ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ５９７２７．１、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）（血清型６）ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ４５０１０．１、およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）（血清型７）ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ５６５４７．１からＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成した。Ｎ末端ウシガエルフェリチン配列を挿入したＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）フェリチンはＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成した。その中でウシガエルフェリチン配列は以前の研究のものと同様である（Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ １６２（５）：１０９０〜１００頁（２０１５）を参照）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＨｉｓタグ付けＯｓｐＡおよびＯｓｐＡ−フェリチンのナノ粒子を発現させるために、ｐｅｔ２１ａベクターを用いた。Ｅｘｐｉ２９３細胞中で発現させるために、以前用いたものと同様の哺乳動物発現ベクターを用いた（Ｘｕ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８（６３５９）：８５〜９０頁（２０１７）を参照）。
ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子は、ＯｓｐＡのエクトドメインをフェリチンのアミノ末端に遺伝子的に融合させて抗原性ポリペプチドを産生させることによって創成した（図１Ａ）。ＯｓｐＡは、ただ１つのカルボキシ末端αヘリックスを有する２１個の連続したアンチパラレルβストランドから作られた、延長されたβシート構造を有する３１ｋＤａのリポタンパク質である（図１Ｂ）（Ｋｉｔａｈａｒａ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １０２（４）：９１６〜２６頁（２０１２）を参照）。ＯｓｐＡのカルボキシ末端はまた、著しく大きな空洞（約２００Å）を有し、これがグリシン−セリン配列を用いるフェリチンへの連結に適合する部位に相当する（図１Ｂ）。フェリチンの２４個のサブユニットは自発的に集合して、中空の球状ナノ粒子を形成する（図１Ｃ）。本研究で用いたフェリチンはヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）のフェリチンに融合したウシガエルフェリチンのアミノ末端配列を含み、ヒトフェリチンとの関連が最小のキメラを創成している（Ｋａｎｅｋｉｙｏ、２０１５を参照）。アミノ末端ウシガエルフェリチン配列はナノ粒子のコアから半径方向に突出しており（Ｔｒｉｋｈａ，Ｊ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８（５）：９４９〜６７頁（１９９５）を参照）、ナノ粒子の表面上におけるＯｓｐＡの均一な提示を容易にしている。
フェリチンの機能性を改善するために、フェリチンの構造に３つの追加的な変更、すなわちＮ１９Ｑ、Ｃ３１Ｓ、およびＳ１１１Ｃを行った。Ｎ１９Ｑの置換によってアミノ末端のグリコシル化の可能性のある部位を除去した。Ｓ１１１Ｃの置換によって、フェリチンの表面に露出したシステインが導入され、これは例えばクリックケミストリーによってアジュバントをコンジュゲートするために用いることができる。最後に、コンジュゲーションによってただ1つのシステインが修飾されるように、システイン３１をセリンに改変した。ナノ粒子の表面上のＯｓｐＡの呈示は、２４量体の抗原性ナノ粒子を提供する（図１Ｄ）。
大腸菌からの精製のため、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃Ｃ６０１００３）を用いた。１００μＭのＩＰＴＧと終夜、１６℃でタンパク質を誘起した。Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌ中での超音波処理を用いて、細胞ペレットを溶解した。濾過滅菌した上清をアニオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、ＧＥ社）でフロースルーからＯｓｐＡ−フェリチンを採取することによって精製した。次いで１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４抽出を６回繰り返すことによって、エンドトキシンを除去した。次いでＡｍｉｃｏｎ １００ＭＷカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｃａｔ＃ＵＦＣ９１００９６）を用いて水相を濃縮し、次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ６調製用ＳＥＣカラム １２０ｍｌにて４℃でナノ粒子をさらに精製した。哺乳動物細胞の培養からの精製については、ＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社、Ｃａｔ＃１１６−１００）を用い、メーカーの指示書に従ってＥｘｐｉ２９３細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を５日目に培養し、上清を採取して濾過した。エンドトキシンフリーの試薬およびガラス器具を用い、エンドトキシンフリーのプロトコルに従った。５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７、５０ｍＭのＮａＣｌを用いてＱセファロースファストフロービーズ（ＧＥ社、Ｃａｔ＃１７−０５１０−０１）を調製し、濾過滅菌した上清に重力流で添加した。フロースルーを採取し、Ａｍｉｃｏｎ １００ＭＷカットオフフィルターを用いて４ｍｌに濃縮した。次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ６調製用ＳＥＣカラム １２０ｍｌにて室温でナノ粒子をさらに精製した。
Ｈｉｓ６タグ付けした（配列番号４４２）ＯｓｐＡの精製のため、血清型１、４、５、および７のＯｓｐＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃Ｃ６００００３）から精製し、血清型２および３をＥｘｐｉ２９３細胞から精製した。これらの構築物は膜貫通ドメインを欠除し、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号４４２）を含み、それ以外は野生型であった。大腸菌の精製については、５００μＭのＩＰＴＧで５時間、タンパク質を誘起し、細胞をペレット化して−２０℃で凍結した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ＃１１６９７４９８００１）を含むＴＢＳ緩衝液中１％ Ｔｒｉｔｏｎにペレットを再懸濁し、超音波処理によって細胞を溶解した。上清を濾過滅菌した。哺乳動物細胞の培養については、トランスフェクションの５日後に上清を採取し、濾過滅菌した。上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣに取り付けたＧＥ社のＨｉＴｒａｐ ＨＰ ５ｍｌカラム（Ｃａｔ＃１７−５２４８−０２）に流した。ＴＢＳ中２０ｍＭのイミダゾールでカラムを洗浄し、負荷し、再び洗浄した。ＴＢＳ中２５０ｍＭのイミダゾールで最終のタンパク質を溶出させた。
ＯｓｐＡ血清型１は、トランスフォームされたヒト腎上皮細胞株Ｅｘｐｉ２９３中のフェリチンに融合したＢ．ブルグドルフェリ株Ｂ３１から発現した（図２Ａ〜図２Ｄ、配列番号５２）。ナノ粒子の形成およびタンパク質の純度は、サイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（それぞれ図２Ａおよび図２Ｂ）によって確認した。ＳＥＣ解析により、予想された保持時間における単一で対称的なピークが明らかになった（図２Ａ）。
動的光散乱（ＤＬＳ）解析も実施した。精製したナノ粒子を、透明な底を有する黒色の３８４ウェルのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ＃３５４０）に濃度約０．４μｇ／ｍｌで負荷した。サンプルを制御温度２５℃で、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーＩＩ（Ｗｙａｔｔ社）で読み取った。ＤＬＳにより、純粋で凝集物のない、低い多分散性（７．４％）の粒径１３ｎｍが記録された（図２Ｃ）。脂質化部位を含むＯｓｐＡの膜貫通ドメイン（アミノ酸１〜２５）を除去することにより、精製の容易さが改善された。ＯｓｐＡの配列はアミノ連結グリコシル化の可能性のある４つの部位を含んでおり、哺乳動物細胞から精製されたＯｓｐＡ−フェリチンはグリカンの付加に符合する高い分子量で泳動した（図２Ｂ）。
ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子について透過型電子顕微鏡陰性染色イメージングおよび２Ｄクラス平均解析を実施した（図２Ｄ）。ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子のサンプルを１×ＴＢＳで３００倍に希釈し、４００メッシュの銅グリッド上のニトロセルロースによって支持された連続炭素層の上でイメージングした。グリッドは、清浄したグリッドの上にサンプル懸濁液３μｌを塗布し、濾紙で吸い取り、直ちにギ酸ウラニルで染色することによって調製した。電子顕微鏡観察は、ＦＥＩ Ｅａｇｌｅ ４ｋ×４Ｋ ＣＣＤカメラを取り付けたＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２電子顕微鏡を用いて実施した。高拡大画像は６７，０００倍（０．１６ｍｍ／ピクセル）で取得した。画像は−１．９μｍ〜−０．８μｍの公称アンダーフォーカスおよび約３０ｅ−／Å２の電子量で取得した。自動摘取プロトコル（Ｌａｎｄｅｒ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，１６６（１）：９５〜１０２頁（２００９）を参照）を用いて、６７，０００倍高拡大画像中の個別の粒子を選択した。ＸＭＩＰＰ処理パッケージに基づく参照なし整列戦略を用いた（Ｓｏｒｚａｎｏ，Ｃ．Ｏ．ら、Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １４８（２）：１９４〜２０４頁（２００４）を参照）。このパッケージにおけるアルゴリズムは選択した粒子を整列させ、これらを自己相似群またはクラスに分類する。
フェリチンナノ粒子は、中央部に中空の中心を有する円形の高密度として現れた（図２Ｄ）。それぞれのナノ粒子は、やや楕円形状に見えるＯｓｐＡの多くの短く均一なスパイクに取り囲まれていた。粒子は約１９４〜２２０Åの範囲の全体の直径を有し、フェリチンコアの直径は１２５Åであった。スパイクは粒子の表面から長さ４５Åまでで、均一な大きさ、形状、および配向をもって延在していた。ＯｓｐＡスパイクの幅は約３０Åで、フェリチンのグリシン−セリンリンカーにおいて最小の密度に細くなっていた。
ＬＹＭＥｒｉｘ（商標）ワクチンが２００２年に中止された際に、このワクチンがヒト白血球機能関連抗原−１（ｈＬＦＡ−１、Ｇｒｏｓｓ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７７）：７０３〜６頁（１９９８）参照）のノナペプチドセグメント（配列番号７８）にホモロジーを有するエピトープ（配列番号８３のアミノ酸１６５〜１７３）を含んでいるという懸念が生じていた（図５Ａ）。配列番号８３のアミノ酸１６５〜１７３をｈＬＦＡ−１ホモロジー部位と称する。ＯｓｐＡ血清型１は、この配列ホモロジーを含む唯一の血清型である（図５Ｂ）。この配列に関する潜在的な懸念があればこれを避けるため、ｈＬＦＡ−１ホモロジー部位を、対応するＯｓｐＡ血清型２（配列番号７９）または血清型３（配列番号８０）のノナペプチド配列に置き換え、あるいはｈＬＦＡ−１に対する類似性を低減させる点置換を導入し、ｈＬＦＡ−１に結合する抗体の産生を防止することを意図した（ＲＤ２、配列番号８１）（図５Ｃ）。点置換については、βシート構造の不安定化を避けまたは最小化しつつ、ｈＬＦＡ−１への類似性を低減させるために表面に露出したアミノ酸を置換した。
ｈＬＦＡ−１へのホモロジー部位を改変したｈＬＦＡ−１ナノ粒子の免疫原性をマウスで試験し、そのような改変を行っていないＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子に対して免疫応答を比較した（図５Ｄ）。ｈＬＦＡ−１ホモロジー部位を改変したナノ粒子によって誘発された抗体力価は強力であり、改変していないｈＬＦＡ−１ホモロジー部位を有するナノ粒子との間に有意な差はなかった。
ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の免疫原性の特徴解析
ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の免疫原性を評価するため、Ｒｉｂｉアジュバントの存在下の血清型１ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子、または血清型１で脂質化された完全長の組換えＯｓｐＡを含むイヌワクチンであるＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ（Ｂ．ブルグドルフェリの精製された外表面プロテインＡ（ＯｓｐＡ）の脂質懸濁液）で２回、Ｃ３Ｈマウスを免疫した（図４）。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスは、０週および４週で筋肉内ワクチン接種した。２回目の投与の２週後から血清についてＥＬＩＳＡを行った。Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ社アジュバントシステムＣａｔ＃Ｓ６３２２−１ｖｌ）をＰＢＳ１ｍｌ中に再懸濁して１分ボルテックスし、免疫に先立って等体積で抗原に添加した。
抗体応答は、組換えＯｓｐＡに対する酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。簡単には、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのＯｓｐＡ−Ｈｉｓで９６ウェルプレートをコートし、４℃で終夜インキュベートした。ＯｓｐＡ−Ｈｉｓを除去し、ＰＢＳＴに溶解した５％のスキムミルクでプレートをブロックした。ブロッキング試薬を除去した後、一次血清サンプルをＰＢＳＴで連続的に希釈して加えた。最終的に５０％のブロッキング溶液濃度になるよう、一次サンプルをブロッキング溶液に等体積で加えた。１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを洗浄し、ＨＲＰ連結ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ブロッキング溶液中５，０００倍希釈）と室温で１時間インキュベートした。二次抗体を吸引除去し、洗浄して、プレートをＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とインキュベートし、続いて等体積の停止溶液（０．５Ｎ硫酸）を加えた。４５０ｎｍで吸光度を測定した。
ＯｓｐＡ−フェリチンによる免疫は６週でＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅより４．４倍高いエンドポイント力価を誘起した（ｐ＜０．００１）。２５週における抗体力価も、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅより有意に高かった（ｐ＜０．００５）（図４）。
グリコシル化変異体；有効性の評価
このＯｓｐＡ−フェリチンの保護有効性を評価するため、Ｂ．ブルグドルフェリを持つダニを免疫マウスまたは対照マウスに感染させるチャレンジモデルを用いた（Ｒｏｓａ，Ｐ．Ａ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３（２）：１２９〜４３頁（２００５）参照）。
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに筋肉内で、ＡｄｄａＶａｘ（商標）と１：１で混合したＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子１μｇ、またはフェリチンナノ粒子１μｇをワクチン接種した。マウスは０週および４週でワクチン接種した。マウスを免疫するために、ｈＬＦＡ−１ホモロジー部位に対する合理的に設計した改変および全ての潜在的なＮ−グリコシル部位を除去する改変を加えた血清型１ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子（配列番号５３）を用いた。それは、天然に細菌で発現されたＯｓｐＡはこれらの部位でグリコシル化されないからである。グリコシル化を防止するため、配列は下記：Ｎ７１Ｑ、Ｎ１９０Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、およびＮ２５１ＱのＮ＞Ｑ置換を含んでいた。その免疫原性はグリコシル化ナノ粒子と同様であった（図１３）。
グリコシル化部位セリン／トレオニンがアラニンに変異した場合（配列番号６３）、ＯｓｐＡ−フェリチンのグリコシル化変異体も試験した。この構築物および上で論じたＮ＞Ｑ構築物のいずれも、野生型のグリコシル化部位を有するＯｓｐＡ−フェリチン（配列番号５２）と比較して強い免疫応答を生じ、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ対照より優れていた（図１４）。
ダニチャレンジモデルにおいてＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の保護有効性を評価するさらなる実験では、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｉｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ，ＯＫ）からイクソデス・スカプラリス（Ｉｘｏｄｅｓ ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）ダニ幼虫（larvae）を入手した。Ｂ．ブルグドルフェリに感染した幼虫（ニンフ、nymphs）は、未感染の幼虫にＢ．ブルグドルフェリ株Ｎ４０に感染させたＳＣＩＤマウスを飽食するまで吸血させることによって産生した。充血した幼虫を採取し、室温および高相対湿度で４〜６週、脱皮させてニンフとした。吸血した幼虫におけるＢ．ブルグドルフェリ感染率は、各バッチから回収したダニの一部を培養することによって決定した。
ＯｓｐＡ−フェリチン（配列番号５３）およびＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント、または対照のフェリチンの１μｇ用量で０週と４週の２回、マウスを免疫し、並行して比較群をＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅで免疫した。６週目（すなわち２回目のワクチン投与の２週後）に５〜６匹のＢ．ブルグドルフェリ感染ダニニンフを飽食するまで吸血させることによってマウスをチャレンジした。吸血したニンフを採取し、ＢＳＫ培地中で培養することによってＢ．ブルグドルフェリ感染をアッセイした。チャレンジの２週後にマウスを屠殺し、耳、足首、および心臓の培養によってＢ．ブルグドルフェリ感染をアッセイした。Ｂ．ブルグドルフェリの存在は、暗視野顕微鏡によって培養液を観察することによって決定した。暗視野顕微鏡によって１つまたはそれ以上の臓器培養が陽性となった場合に、マウスはＢ．ブルグドルフェリに感染していると定義した。陰性培養もＢ．ブルグドルフェリに特異的なＰＣＲによって試験した。
２週後にマウスを屠殺した。心臓、足首、および耳からの組織サンプルをＢＳＫ培地中、Ｂ．ブルグドルフェリに対する抗生剤の存在下に６週培養した。陰性サンプルはＰＣＲによってＢ．ブルグドルフェリの存在について試験した。また、陰性培養液は全てＰＣＲ陰性であった。保護は感染しなかったマウスの百分率として計算した。
ＯｓｐＡ−フェリチンおよびＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバントを含む組成物は感染を示さず（０／４）、５匹中４匹の動物が感染した陰性対照フェリチンと対照的であった（表５、ｐ＜０．０１）。
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免疫刺激性部分にコンジュゲートしたＯｓｐＡ−フェリチンの有効性の評価
クリックケミストリーによってＴＬＲアゴニスト（図６Ａ）またはＣｐＧ（配列番号２１０；ＩＳＳ−１０１８、図７Ａ）等の免疫刺激性部分の直接コンジュゲーションを可能にする、フェリチンナノ粒子の表面上のシステインの操作（Ｓ１１１Ｃ）によって、自己アジュバント性構築物を産生した。直接コンジュゲーションの手順は下記の通りであった。哺乳動物から生成された材料を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５中の１０ｍＭのＴＣＥＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ社、Ｋ８３１−１０Ｇ）で１時間還元してシステイン化を解除した。次いでタンパク質を１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌ中に透析してＴＣＥＰを除去した。大腸菌から生成した材料は還元する必要はない。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドリンカー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社ｃａｔ＃７６０６７６、５ｍｇ）をＤＭＳＯ中で５ｍｇ／ｍｌに再懸濁した。リンカー２．５ｍｇを体積１０ｍｌでタンパク質３ｍｇに加えた（最終ＤＭＳＯ濃度は５％であった）。リンカーを還元タンパク質と室温で３０分インキュベートした。Ａｍｂｉｃｏｎ社の１００ＭＷカットオフフィルター濃縮器を用いて緩衝液交換により過剰なリンカーを除去した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社Ｃａｔ＃ＵＦＣ９１００９６）。アジド−ＰＥＧ４−３Ｍ−０１２（社内で合成）およびアジド−ＣＰＧ（ＩＳＳ−１０１８、ＩＤＴ社によりカスタム合成）を最終のクリックケミストリーステップに用いた。最終のコンジュゲーションステップとしてアジュバント０．５ｍｇをタンパク質０．５ｍｇに加え、３７℃で６時間、次いで４℃で終夜インキュベートした。Ａｍｂｉｃｏｎ社の１００ＭＷカットオフフィルター濃縮器を用いて緩衝液交換により過剰なアジュバントを除去した。コンジュゲーションの効率は、３Ｍ−０１２についてはマススペクトロメトリーで、ＣＰＧについてはＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で確認した。
ＨＩＶのＧａｇタンパク質に直接コンジュゲートした場合に抗体応答を増大させることが以前に示されたＴＬＲ７／８アゴニスト３Ｍ−０１２（Ｗｉｌｌｅ−Ｒｅｅｃｅ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２（４２）；１５１９０〜４頁（２００５）参照）を用いた。２ステップクリックケミストリーアプローチを用いて３Ｍ−０１２を配列番号５３のナノ粒子に結合させた。最初にＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドリンカーをシステインに連結し、次いで修飾した３Ｍ−０１２をＰＥＧ４−アジドリンカーとともに銅を含まないアジド−アルキン環化付加によって付加した（図６Ａ）。マススペクトロメトリーによって９９％超のコンジュゲーション効率が確認され、マスシフトは５８７ダルトンであった（図１２）。アジド−３Ｍ−０１２に加えて、アジド−ＣＰＧの付加にも成功した（図７Ａ）。これについては、ゲルシフトによってコンジュゲーションが確認できた（図７Ｂ）。
フェリチンのほぼ完全なコンジュゲーションが観察され、大部分のナノ粒子が２４分子のアゴニストを持っていることが示唆された。次いでコンジュゲートしたＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の免疫原性をマウスで評価した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスを０週と４週に筋肉内でワクチン接種した。２回目の投与の２週後から血清についてＥＬＩＳＡを行った。免疫に先立ってアラム（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５ ２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ社、Ｃａｔ＃２１６４５−５１−２）を等体積で抗原に添加した。Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ社アジュバントシステムＣａｔ＃Ｓ６３２２−１ｖｌ）をＰＢＳ １ｍｌ中に再懸濁して１分ボルテックスし、免疫に先立って等体積で抗原に添加した。
３Ｍ−０１２をコンジュゲートした粒子で免疫したマウスは、コンジュゲートしていない材料より４．５倍高いＯｓｐＡ抗体応答を生成した（図６Ｂ、ｐ＜０．０５）。３Ｍ−０１２をコンジュゲートした粒子によって誘発された抗体応答は、等モル量の３Ｍ−０１２（２９ｎｇ）と混合した粒子よりも大きく、１０００倍高い用量（２０μｇ）の３Ｍ−０１２または標準のアラム（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５、２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ社−Ｃａｔ＃２１６４５−５１−２）アジュバントと混合した粒子と同程度であった。
同様の抗体生成の増強がＣＰＧをコンジュゲートしたＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子（配列番号５３）で観察され、コンジュゲートしていない粒子と比較して免疫応答が６．３倍増大し、ナノ粒子と混合した等量のコンジュゲートしていないＣＰＧに対して４．７倍増大した（図７Ｃ）。
したがって、ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子にコンジュゲートしたアジュバントの標的送達により、効果的かつ特異的な抗体応答を刺激しつつ、アジュバントの量を実質的に低減させることが可能になる。
様々な血清型を含むＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子の免疫原性の評価
血清型１ＯｓｐＡ株Ｂ．ブルグドルフェリは米国で疾患を引き起こす一方、Ｂ．アフゼリ（血清型２）、Ｂ．ガリニ（血清型３、５、６、７）、およびＢ．ババリエンシス（血清型４）は欧州、アジア、およびその他の地域で疾患を引き起こす。幅広く交差保護する組成物を産生するため、血清型１、２、３、４、５、および７（配列番号１、５、６、７、８、および１０）についてＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子を設計した。これらの粒子を発現させ、大腸菌からアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図３Ａ）。全てのＯｓｐＡ−フェリチン抗原性ポリペプチドは予想された分子量である４７ｋＤａを有し、ＤＬＳ解析および透過型電子顕微鏡によっても６種のＯｓｐＡナノ粒子全ての形成が確認された（図３Ｂ）。
血清型１〜５および７のＯｓｐＡ−フェリチンのそれぞれを等モルの割合で組み合わせることによって、６成分の組成物を産生した。
アラムを添加したこの６成分の組成物（すなわち六価）の免疫原性を、同じアジュバントを添加した単一血清型の粒子（すなわち一価）とマウスで比較した（図８Ａ〜図８Ｆ）。各血清型について一価の組成物は１μｇ用量で、六価の組成物は１μｇで投与した（総量６μｇ用量）。免疫に先立ってアラム（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５、２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ社−Ｃａｔ＃２１６４５−５１−２）を等体積で抗原に添加した。６成分の組成物はＯｓｐＡ血清型１〜５および７の６種全てに対して強力な抗体応答を誘起した。さらに、単一血清型の対照に対する応答は混合物と同様であり、６種の血清型の組合せの中で干渉がないことが示された。血清型４に対し、六価の組成物において単一成分の組成物と比較して改善された免疫応答が見られた（図８Ｄ、血清型４を参照）。
六価の組成物が免疫原性であること、およびいくつかの例では一価の組成物より優れていることが確立されたので、６種のＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子のそれぞれと３Ｍ−０１２およびＣｐＧとのコンジュゲートを調製した。３Ｍ−０１２にコンジュゲートした６種のＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子を組み合わせ、別にＣｐＧにコンジュゲートした６種のＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子を組み合わせることによって、２種の６成分をコンジュゲートした組成物を創成した。ＣｐＧコンジュゲートした六価の組成物および３Ｍ−０１２コンジュゲートした六価の組成物は、世界的に見出されるＯｓｐＡの７種の血清型全てについて、コンジュゲートしていない六価の組成物と比較して抗体応答の顕著な増大をマウスで示し（図９Ａ〜図９Ｇ）、ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドが組成物中に存在していないにも関わらず、六価の処方も血清型６に対する保護を付与していることが示された。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ、アカゲザル）で試験すると、ＡＦ０３アジュバントを添加した六価のナノ粒子組成物（非コンジュゲート）は、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ対照より性能が優れており、循環するボレリア血清型７種全てに対して１１倍〜２００倍高いＡｂ力価を示した（図１０Ａ〜図１０Ｇ）。マウスと同様に、六価の組成物はアジュバントの存在下で高い力価の抗体応答を誘発した。３Ｍ−０１２およびＣｐＧとコンジュゲートした組成物はＮＨＰにおいてＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ対照と同様の応答を誘起した（図１０Ａ〜図１０Ｇをそれぞれ図１０Ｈ〜図１０Ｎと比較）。ＮＨＰにおける六価のワクチンの抗体力価はブースト投与の１９週後も強力であり、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ対照に対する優位性を保持していた（図２５）。
コンジュゲートした組成物をダニチャレンジモデルでも試験した。マウスを０週および４週に１μｇの用量の抗原でワクチン接種した。一価の組成物は３Ｍ−０１２にコンジュゲートしたＯｓｐＡ−フェリチン血清型１ １μｇを含んでいた。六価の組成物はそれぞれ３Ｍ−０１２にコンジュゲートした血清型１、２、３、４、５、および７のＯｓｐＡ １μｇを含んでいた。２回目の免疫の２週後にボレリア・ブルグドルフェリＮ４０株（血清型１）に感染させた５〜６匹のダニを５日間、マウスにチャレンジし、２週後に屠殺した。心臓、足首、および耳からの組織サンプルを、Ｂ．ブルグドルフェリに対する抗生剤を添加したＢＳＫ培地中で６週培養した。陰性サンプルをＰＣＲによりＢ．ブルグドルフェリの存在について試験した。陽性サンプルは培養またはＰＣＲのいずれかについて陽性であった（図１１）。
さらに、７種の血清型全てを含む七価のワクチンをマウスで試験した。アラムもしくはＡＦ０３をアジュバントとして添加したＯｓｐＡ血清型１〜７に対応するＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子それぞれ１μｇ（総量７μｇ）の七価ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子組成物、またはＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ（１μｇ用量）で、マウスを０週および４週に筋肉内で免疫した。免疫の２週後にＥＬＩＳＡによって測定したエンドポイント力価で抗体応答を解析した。ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）と比較して強力な免疫応答が実証された（図２４Ａ〜図２４Ｇ）。
このように、ＯｓｐＡ−フェリチンナノ粒子は、７種の主要な血清型に対して高い力価の抗体応答を誘発した。さらに、７成分のライムワクチン候補は、ライム病の世界的な蔓延を制御する可能性を提示している。
様々な可撓性のリンカーを有するＯｓｐＡ−フェリチン構築物の特徴解析
ＯｓｐＡとフェリチンとの間に可撓性を提供するためにいくつかの異なったリンカーを試験した。構築物は１個から５個の−ＧＧＧＳ−（配列番号４４３）配列の範囲であった。種々のリンカー構築物を精製し、均一な大きさのナノ粒子を形成した。
ＧＳ１（ＧＧＧＳ）（配列番号４４３）、ＧＳ２（配列番号９１）、またはＧＳ５（配列番号９２）のリンカーを含むＯｓｐＡ−リンカー−フェリチン構築物は全て発現することができ（図１５Ａ）、矛盾のないＤＬＳ（図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｅ）およびＥＭ（図１５Ｄ）のプロファイルを示した。
さらに、様々な−ＧＧＧＳ−リンカー構築物（配列番号４４３として開示される「ＧＧＧＳ」）（リンカー１×ＧＧＧＳ（配列番号４４３として開示される「１×ＧＧＧＳ」）［配列番号６０］、リンカー２×ＧＧＧＳ（配列番号４４４として開示される「２×ＧＧＧＳ」）［配列番号６１］、およびリンカー５×ＧＧＧＳ（配列番号４４５として開示される「５×ＧＧＧＳ」）［配列番号６２］）は全てＣ３Ｈマウスにおいて強い免疫応答を示した（図１６）。
ルマジンシンターゼＯｓｐＡナノ粒子の特徴解析
もう1つのナノ粒子であるアクイフェックス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）由来のルマジンシンターゼについて、ＯｓｐＡの抗原呈示を検討した。様々な血清型を含むＯｓｐＡ−ルマジンシンターゼ粒子は、大腸菌細胞からアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって容易に精製された。ＯｓｐＡ血清型１（配列番号１２、図１９Ａ〜図１９Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型２（配列番号１６、図２０Ａ〜図２０Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型３（配列番号１７、図２１Ａ〜図２１Ｂ）、ＯｓｐＡ血清型４（配列番号１８、図１７Ａ〜図１７Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型５（配列番号１９、図２２Ａ〜図２２Ｃ）、およびＯｓｐＡ血清型７（配列番号２１、図２３Ａ〜図２３Ｃ）からなる構築物を産生し特徴解析した。ＯｓｐＡ−ルマジンシンターゼ粒子はＥＭで１５．８ｎｍの粒子を形成しており、ＤＬＳで大きさは均一であった。
ＯｓｐＡ血清型４ルマジンシンターゼ粒子（配列番号１８）をマウスで免疫原性について試験した（図１８）。アラムを添加しまたは添加していないＯｓｐＡルマジンシンターゼ粒子は、同様のＯｓｐＡ血清型４フェリチンナノ粒子（配列番号７）の免疫応答と少なくとも同じく強力と思われる強い免疫応答を生じた。
したがって、ルマジンシンターゼおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドも、抗ＯｓｐＡ抗体応答を誘発させるために用いることができる。
ＨＡ−フェリチンナノ粒子の設計、精製、および特徴解析
ＨＡのエクトドメイン配列（４８個のＣ末端膜貫通残基を欠除する）をフェリチンのＮ末端に融合して哺乳動物細胞中で自己集合するナノ粒子を生成させることによって、ＨＡナノ粒子（ＨＡ−Ｎｐ）を産生した。フェリチンは表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異（配列番号２０８のフェリチン配列に対するＳ２６Ｃ、Ａ７５Ｃ、またはＳ１１１Ｃの変異に起因する）を含み、ＨＡ−Ｎｐへのアジュバントのコンジュゲーションが可能になる。そのようなシステインの表現を図２７に提示する。
上記の変異に起因するシステインは免疫刺激性部分をコンジュゲートするために用いることができる。図２８Ａに、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａクリック試薬を用いてＴＬＲアゴニストをフェリチンにコンジュゲートする例示的な１ステップクリックケミストリー反応の結果を図示する。この反応では、マレイミドは対になっていないシステインと反応し、表面に露出したシステインにおいて介在するリンカーを介してＴＬＲ７／８アゴニスト分子を共有結合でフェリチンにコンジュゲートさせ、共有結合によるＴＬＲ７／８アゴニスト−フェリチンコンジュゲートを生じる。本例では１つの単量体の表面上の１つのシステインを示している。フェリチンナノ粒子は多量体であり、例えば２４個の単量体からなっている。したがって、フェリチンナノ粒子は単量体の数と等しい数の表面露出システインを含むことができ、表面露出システインのそれぞれがコンジュゲートすることができる。
図２８Ｂおよび図２９Ａ〜図２９Ｂに、アジュバントをフェリチンナノ粒子にコンジュゲートするために用いることができる例示的な２ステップクリックケミストリー、ならびにＣｐＧおよび３Ｍ−０１２（３Ｍ０１２と称することもある）が中間二官能性リンカーを介する２ステップクリックケミストリー反応によってどのようにしてフェリチンにコンジュゲートさせることができるかを示す。例示的なリンカーは、マレイミドおよびＤＢＣＯ反応基を含むＳｉｇｍａ社のＰＥＧリンカー（カタログ＃７６０６７６）である。本例では、ＴＬＲアゴニストは反応性アジド基によって官能化される。
以下に記載した実験においてマススペクトロメトリー（ＭＳ）を用いて、コンジュゲートした免疫刺激性部分を含みおよび含まないインフルエンザ−フェリチンを特徴解析する。ＭＳに供した分析物質は、いくつかの場合にはインフルエンザ−フェリチンのトリプシン消化物であった。トリプシンは一般に、プロリンが後に続く場合を除いて、リシンおよびアルギニン残基の後で切断する。しかし、構成したナノ粒子（指示したトリプシン部位のＣ末端）は、タンパク質分解に耐性がある。天然の条件下で配列番号３１４等のウシガエル−Ｈ．ピロリフェリチン構築物においてトリプシンによって切断される最遠位（Ｃ末端）のトリプシン部位を図３０に示す。このように、トリプシン消化はＭＳ解析に好適なタンパク質分解耐性のフェリチン粒子を放出する。
したがって、リンカー配列がトリプシンにより接近可能であるという前提で、切断されていないポリペプチドの中のＮ末端抗原の存在とは関係なしに、トリプシン消化およびそれに続く単純化されたＭＳ解析を用いてナノ粒子へのコンジュゲーションを評価することができる。本方法は、糖タンパク質抗原がＭＳ解析に提起する複雑さを克服するために考案された。例えば、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−ＮｐがＭＳによって解析できるのは、そうでなければＰＮＧａｓｅ処理の後のみである（図３３Ａ）。
以下のインフルエンザ株からのＨＡ配列をヘリコバクター・ピロリ−ウシガエルハイブリッドフェリチンのＮ末端に遺伝子的に融合してＨＡナノ粒子を構築した。Ａ／フォートマンモス／１−ＪＹ２／１９４７（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＹ１４７３４２、アミノ酸１〜５１８、Ｙ１０８Ｆ）；Ａ／マレーシア／３０２／１９５４（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＹ００９３４０．１、アミノ酸１〜５１８、Ｙ１０８Ｆ）；Ａ／デンバー／１９５７（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＹ００８９８８、アミノ酸１〜５１７、Ｙ１０８Ｆ）；Ａ／香港／１１７／１９７７（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＹ００９２９２、アミノ酸１〜５１８、Ｙ１０８Ｆ）；Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨＪ０９８８３．１、アミノ酸１〜５１８）；Ａ／カリフォルニア／４／２００９（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨＪ０９８８４．１、アミノ酸１〜５１８）；ＣＯＢＲＡ Ｐ１（米国特許出願公開第２０１５００１７１９６Ａ１の配列番号３０２、アミノ酸１〜５１８、Ｙ１０８Ｆ）、およびＣＯＢＲＡ Ｘ６（米国特許出願公開第２０１４０１２７２４８Ａ１、アミノ酸１〜５１７、Ｙ１０８Ｆ）。ＣＯＢＲＡ Ｐ１およびＣＯＢＲＡ Ｘ６は、階層的配列平均化（Ｃａｒｔｅｒ ＤＭら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９０：４７２０〜４７３４頁（２０１６））のコンピュータ法によって産生した。ＣＯＢＲＡ Ｘ６は１９９９年〜２０１２年にわたるヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ配列から、またＣＯＢＲＡ Ｐ１は１９３３年〜１９５７年および２００９年〜２０１１年にわたるヒトＨ１Ｎ１株ならびに１９３１年〜１９９８年にわたるブタＨ１Ｎ１インフルエンザ株から産生した（Ｃａｒｔｅｒ、２０１６）。ＨＡ−フェリチン遺伝子は哺乳動物での発現のために、ＡＴＧ開始コドンの前のｇｃｃａｃｃ ｋｏｚａｋ配列とともにＳＩＢ００２ベクターのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。全ての配列はヒト細胞株での発現のためにコドン最適化した。
ＨＡ−ＮｐプラスミドをＰｏｗｅｒｐｒｅｐキット（Ｏｒｉｇｅｎｅ社カタログ＃ＮＰ１００００９）で精製して、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社カタログ＃Ａ１４６３５）にトランスフェクトするために用いた。ＦｅｃｔｏＰＲＯ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社＃１１６−１００）を標準的条件（ＤＮＡ０．５μｇ／ｍＬ、ＦｅｃｔｏＰＲＯ試薬０．７５μｌ／ｍＬ、エンハンサー０．４５μｌ／ｍＬ）で用いた。トランスフェクションの４〜６日後に４℃で１５分、３，４８８ｇで遠心分離することによって、Ｅｘｐｉ２９３の上清からナノ粒子を回収し、０．４５μｍの真空駆動フィルターユニット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ＃１６７−００４５）を通して濾過した。ＨＡ−Ｎｐを重力流でＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔフローカラム（ＧＥ社カタログ＃１７０５１００１）に通過させ、フロースルーを採取し、水で３倍に希釈し、Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を加えて最終濃度５０ｍＭになるようｐＨを調節した。あるいは、最初のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いる代わりに、上清を緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、５ｍＭ ＮａＣｌ）で５倍に希釈した。次いでサンプルをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、ＧＥ社カタログ＃１７１１５４０１）に負荷し、カラム体積の３０倍の緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、５ｍＭ ＮａＣｌ）と緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌ）の０〜６０％の混合物のＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶出させた。ＨＡ−ナノ粒子タンパク質分画を採取し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社カタログ＃ＵＦＣ９１００２４）で濃縮し、リン酸緩衝食塩液中のＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムＰＧ ＸＫ １６／７０、６０〜６５ｃｍ（カタログ＃＃９０１０００４２）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。最終分画を濃縮し、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＳＬＧＶ００４ＳＬ）を通して濾過滅菌した。エンドトキシンフリーの溶液を用い、検出限界０．０５ＥＵ／ｍｌのＬＡＬカートリッジを備えたＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＰＴＳ装置を用いて最終タンパク質を試験した。
Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（配列番号３４３、図３１Ａ）およびＨ５／ＣＯＢＲＡ−Ｎｐ（配列番号３３２、図３１Ｂ）のトリプシン消化を示す。両方の例では、トリプシン消化による分子量のシフト（「＋」で示す）は、ＳＭ７／８ａの分子量（７１１ダルトン）に相当する。したがって、これらのデータは、表面に露出したシステインを含むフェリチンナノ粒子へのＳＭ７／８ａのコンジュゲーションが成功したことを示している。
マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａのような低分子量の分子へのコンジュゲーションの後のフェリチンナノ粒子の質量変化の決定は、トリプシン処理なしにＰＮＧａｓｅを用いてＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐのグリコシル化を除去するゲルシフト実験（図３２Ａ）では明確でない。図３２Ｂに示すように、トリプシン処理によって、ＳＭ７／８ａのような小分子のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーションをゲルシフトアッセイで確認することが可能になる。ＣｐＧのような分子量がより高い分子のコンジュゲーションは、脱グリコシル化されたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐのゲルシフトアッセイによって（図３２Ａ）、および天然の条件下でのトリプシン消化によってＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐから放出されたフェリチンナノ粒子のゲルシフトアッセイによって、観察することができる。したがって、天然の条件下でのフェリチンナノ粒子のトリプシン消化を用いることによって、これらの分析アッセイに干渉する可能性がある特性を有する所与の抗原について、さもなければゲルシフトまたはマススペクトロメトリー（ＭＳ）実験で解析することが困難なプラットフォーム技術としての、ＴＬＲアゴニストがコンジュゲートするコア断片の特徴解析の方法が提供される。
ＳＭ７／８ａ−ＰＥＧ４−マレイミドをＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐにコンジュゲートし、分析目的のためのみにＰＮＧａｓｅ処理を行った後、ＭＳ上のコンジュゲーション生成物は４２９３０Ｄａの質量を有することが分かった。これはコンジュゲートしていないＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐよりほぼ７１５ｋＤａ重かった（図３３Ａ）。トリプシン消化の後、還元したフェリチンナノ粒子は１９５１０Ｄａの質量を有していた（ナノ粒子のＨ１／Ｓｔｅｍ部分の切断に基づく）（図３３Ｂ）。コンジュゲーションの後、トリプシン消化したコンジュゲートしたナノ粒子の質量もほぼ７１５ｋＤａ重かった。したがって、図３３Ａおよび図３３Ｂはいずれも、アジュバントを含むリンカーのフェリチンナノ粒子へのコンジュゲーションにおけるコンジュゲーション効率は約１００％であることを支持している。
マレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーを２ステップのクリックケミストリー反応でＨ１−ｓｔｅｍ−Ｎｐにコンジュゲートした。このとき、マレイミドはフェリチンナノ粒子の表面上に露出したシステインと反応し、トリプシン消化後のＭＳ解析によって、リンカー付加の分子量であるほぼ６７５Ｄａと符合する質量増加が見られた（図３４）。
次に、アジド−ＣｐＧをＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ中間体（図３５において「Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ後」とラベル）に添加した。これは、ゲルシフトアッセイによって確認した。アジド−ＣｐＧはＩＤＴ社に発注した（配列番号３４５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、コンジュゲートおよび対照をＰＮＧａｓｅで処理した。ＣｐＧのコンジュゲーションは、付加された質量（約７．５ｋＤａ）のために、リンカーのコンジュゲーションと比較して上方へのゲルシフトを生じた。「Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧ」および「Ｓｔｅｍ−Ｎｐ」とラベルした２つのバンドのデンシトメトリーによって定量したコンジュゲーション効率５０％の例を図３６に示す。Ｓｔｅｍ−ＮｐはＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（配列番号３４３）である。未処理は還元前のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐを意味する。ＴＣＥＰ−還元は３ｍＭのＴＣＥＰと室温で１時間処理し、ＰＢＳに対して４℃で終夜透析したＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐを意味する。
コンジュゲーションを評価するためにタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（配列番号３４４）も用いた。２ステップクリックケミストリープロセスを用いて３Ｍ−０１２を種々のＮＣ９９ ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ構築物（配列番号３０９〜３１２）にコンジュゲートした。２ｍＭまたは１０ｍＭのＴＣＥＰを用いてＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ構築物を還元した。ＴＣＥＰはＴＲＩＳ緩衝液（１００ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）への透析（ＭＷＣＯ １０ｋＤａの３ｍＬの透析カセット、Ｔｈｅｒｍｏ社＃８７７３０）によって除去した。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドリンカー（Ｓｉｇｍａ社＃７６０６７６）を加えた。緩衝液をＰＢＳ７．４に変更しつつ過剰なリンカーを超濾過（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社Ａｍｉｃｏｎ＃ＵＦＣ８１００２４または＃ＵＦＣ９１００９６）によって除去した。最後に、アジド官能化ＴＬＲアゴニスト（ＣｐＧまたは３Ｍ−０１２）を分子にクリックした。超濾過（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社Ａｍｉｃｏｎ＃ＵＦＣ８１００２４または＃ＵＦＣ９１００９６）またはゲル濾過によって過剰な薬物を除去した。ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐの中のＴＥＶ切断部位により、コンジュゲーションの解析のためのＴＥＶによる選択的切断が可能になる。
３Ｍ−０１２（リンカー約５００Ｄａ＋約６００Ｄａ）のＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ構築物へのコンジュゲーションの後、構築物をＴＥＶで処理した。ＴＥＶ切断の後、ゲルシフトＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の得られたＨＡバンドは約５７ｋＤａとグリカンおよびＦｅｒｒの約２０ｋＤａである（図３６、「＋ＴＥＶ」とラベルしたレーン）。約２０ｋＤａおよび２１ｋＤａの二重のバンド（「Ｓ２６Ｃ」、「Ｓ７２Ｃ」、「Ａ７５Ｃ」、および「Ｓ１１１Ｃ」（それぞれ配列番号３１０、３１１、３１２、および３０９）は、コンジュゲーションの成功を示している。コンジュゲーションの有効性はバンドの強度に対応し、ここで低いバンドはコンジュゲートされていないフェリチン、高いバンドはコンジュゲートされたフェリチンである。
Ｓ１１１Ｃを含むＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐは２９３Ｅｘｐｉ細胞中に発現されると１０９ダルトン（システイン化に符合する）の翻訳後改変を有することが見出された（図３７Ａ）。これは、反応性チオールを遊離させるための３ｍＭ濃度のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）との室温、１時間の還元によって除去した（図３７Ｂ）。したがって、改変部位を還元して表面に露出したシステインを遊離のチオールとして露出することができ、これは市販のリンカーまたはカスタム化された小分子の上のマレイミド基との反応性が極めて高い。
ＭＳデータによっても、３Ｍ−０１２のＨＡ−Ｎｐへのコンジュゲーションが成功したことが確認された。ＨＡ−ＴＥＶ−Ｎｐ−Ｓ２６Ｃ（配列番号３１０、図３７Ｃ）、Ａ７５Ｃ（配列番号３１２、図３７Ｄ）、またはＳ１１１Ｃ（配列番号３０９、図３７Ｅ）。Ａ７５ＣおよびＳ１１１Ｃのフェリチン改変を含むナノ粒子（それぞれ配列番号３１２および３０９）は、３Ｍ−０１２への９５％を超えるコンジュゲーションを示した。したがって、ＭＳデータは、アジュバントをフェリチンの変異に起因する種々の表面露出システインに連結して、アジュバントに連結された抗原性フェリチンポリペプチドを成功裏に産生できることを示している。
陰性染色電子顕微鏡（ＥＭ）から、コンジュゲーションがナノ粒子の一体性に影響しないことが確認された。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（配列番号３４３）単独（図３８Ａ）、マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（図３８Ｂ）、ＣｐＧにコンジュゲートされたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（図３８Ｃ）、ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ（配列番号３０９）単独（図３８Ｄ）、ＤＢＣＯ−マレイミドリンカーを介して３Ｍ−０１２にコンジュゲートされたＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ（図３８Ｅ）、およびＤＢＣＯ−マレイミドリンカーを介してＣｐＧにコンジュゲートされたＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ（図３８Ｆ）を示す。さらに、マレイミド−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーを介するＴＬＲ７／８アゴニスト（マレイミド−ＰＥＧ４−ＳＭ７／８ａ、図３８Ａ）またはＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ、図３８Ｂ）のＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐへのコンジュゲーションは、動的光散乱（ＤＬＳ）による測定で、コンジュゲートしていないＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐと比較して、ナノ粒子の一体性に影響しない（図３９Ｃ）。
これらのデータは、フェリチンおよびＨＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドの調製が成功したことを実証している。さらに、アジュバントを含むリンカーをこれらのフェリチンナノ粒子に成功裏にコンジュゲートすることができる。
ＨＡ−フェリチンナノ粒子組成物の免疫原性の特徴解析
種々のアジュバントおよびＨ１／Ｓｔｅｍ−ＮｐへのＴＬＲアゴニストのコンジュゲーションのＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ組成物の免疫原性に対する影響を評価した。図４０Ａに、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ ＴＬＲ７／８アゴニストコンジュゲートによる免疫で誘起されたＨ１／ニューカレドニア／１９９９（ＮＣ９９）ＨＡ三量体に対するＩｇＧ抗体力価を示す。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ １０μｇを、アジュバントなしに、等モル量の遊離ＳＭ７／８ａアジュバント（８３．３ｎｇ）と混合して、高用量の遊離ＳＭ７／８ａアジュバント（２１．８４μｇ）と混合して、または体積比１：１のＰＡＡもしくはＡＦ０３アジュバントと、０週および３週で投与した。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲートは、他のアジュバントなしに投与した。２回目の投与の２週後に血清をアッセイした。図４０Ｂに、Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ ＴＬＲ９アゴニストコンジュゲートによる免疫で誘起されたＨ１／Ｓｔｅｍ三量体に対するＩｇＧ抗体力価を示す。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ １０μｇを、アジュバントなしに、等モル量の遊離ＣｐＧアジュバント（８５０ｎｇ）と混合して、高用量の遊離ＣｐＧアジュバント（２０μｇ）と混合して、または体積比１：１のＡＦ０３アジュバントと、０週および３週で投与した。Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲートは、他のアジュバントなしに投与した。２回目の投与の２週後に血清をアッセイした。
図４０Ａのデータは、ＳＭ７／８ａとコンジュゲートしたＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐが、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）またはＡＦ０３アジュバントと混合したコンジュゲートしていないナノ粒子と同程度の免疫原性を示すことを示している。フェリチンナノ粒子に直接コンジュゲートしたＳＭ７／８ａは、フェリチンナノ粒子とは別の化合物として投与した等モル用量のＳＭ７／８ａ（「等モル混合」）よりも効果的であった。さらに、フェリチンナノ粒子に直接コンジュゲートしたＳＭ７／８は、フェリチンナノ粒子とは別の化合物として投与した高用量のＳＭ７／８ａ（「高用量混合」）よりも効果的であった。したがって、ＨＡポリペプチドおよびフェリチンを含む抗原ポリペプチドにＳＭ７／８ａをコンジュゲートすることによって、この化合物は免疫原性かつ自己アジュバント性になった。自己アジュバント性組成物を投与することによって、別個のアジュバントを低減しまたは排除することができた。同様に図４０Ｂは、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧをＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐにコンジュゲートすることによって、コンジュゲートしていない等モル混合物の対照と比較して、混合したＣｐＧ分子を２３倍高い用量で投与した場合に匹敵するレベルまで、その免疫原性が改善されることを示している。
血清は、Ｈ１／ニューカレドニア／１９９９（ＮＣ９９）ＨＡ／ＮＡシュードタイプ化レンチウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏで中和する能力についても評価した。シュードタイプ化中和アッセイは以前記載されたように実施した（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｎａｔｕｒｅ ４９９：１０２〜１０６頁（２０１３））。簡単には、Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ＃Ｅ１２００）を用い、５種のプラスミド、すなわちＨＡ ４００ｎｇ、ＮＡ １００ｎｇ、ＴＭＰＲＳＳ２ ５０ｎｇ、ＣＭＶΔＲ８．２ ７μｇ、およびｐＨＲ’ＣＭＶ−Ｌｕｃ ７μｇのトランスフェクションによってレンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージした。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後にウイルス粒子を採取し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。
マウス（ｎ＝５／群）を、３週の投与間隔で２回免疫した。３Ｍ−０１２にコンジュゲートしたＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ（配列番号３０９）（ＨＡ−Ｆｅｒｒ−３Ｍ−０１２、０．２２μｇ／用量）を、混合した対照と並行して投与した。対照は、ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と３Ｍ−０１２ １０μｇの混合物（典型的な治療用量）、および別にＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）と３Ｍ−０１２ １．７ｎｇの混合物（コンジュゲートと等モルで一致）とした。ＨＡ含量（ＨＡ ０．１７μｇ／用量）を一致させて投与したコンジュゲートしていないＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐおよび不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）を追加の対照とした。５週目に、これらのマウスからの血清を段階希釈して、指示された株からのＨＡおよびニューラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子でシュードタイプ化したレンチウイルスに対する中和活性についてアッセイした。希釈の範囲の抗血清を固定された量のレンチウイルスと前インキュベートし、標的の２９３Ａ細胞に感染させるために用いた。感染はＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ＃Ｅ１５００）を用いて７２時間後に定量した。これらの中和曲線からＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてＩＣ５０値を計算し、ＰｓＶの５０％中和を達成する血清希釈係数を決定した。エンドポイント力価（ＥＬＩＳＡ）および血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価も、それぞれ５週目と８週目に決定した。例示的なＥＬＩＳＡおよびＨＡＩの手順については以下の実施例を参照されたい。全てのサンプルは３重測定した。
ＥＬＩＳＡのエンドポイント力価（図４１Ａ）またはシュードウイルス中和ＩＣ５０力価（図４１Ｂ）に基づいて、３Ｍ−０１２にコンジュゲートしたＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐは、一致させた混合物、コンジュゲートしていない粒子、またはＩＩＶよりも強い結合および中和抗体応答を誘起した。ＨＡ−Ｎｐ−３Ｍ−０１２コンジュゲートは、等モル混合の対照より有意に強いＨＡＩ力価（図４１Ｃ）をも誘起した。さらに、ＨＡＩ力価はコンジュゲートしていないＨＡ−ＦｅｒｒおよびＩＩＶよりも３．７倍および１．６倍高かったが、これらの結果は有意ではなかった。
Ｈ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＴＬＲアゴニストコンジュゲートの免疫原性も、非ヒト霊長類モデルで評価した。ＵＳＤＡの規制およびＡｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔを含む全ての連邦規制を順守して、Ｂｉｏｑｕａｌ Ｉｎｃ．社によって１２匹のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を収容し、世話した。動物は事前スクリーニングし、ＥＬＩＳＡによって２０１６〜２０１７年のＦｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ抗原（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９；Ａ／香港／４８０１／２０１４ Ｘ−２６３Ｂ；Ｂ／プーケット／３０７３／２０１３；Ｂ／ブリスベン／６０／２００８）への反応性がないことで選択した。ＮＨＰ対象（雌１０匹、雄２匹）（５〜１３年齢、体重３．５ｋｇ〜７．８ｋｇ）を各免疫群（ｎ＝３匹／群）にランダムに割り付けた。各群に、Ｈ１−ＳＳ−ｎｐとＡＦ０３ ５０μｇ、またはＨ１−ＳＳ−ｎｐ（アジュバント対照なし） ２００μｇ、またはＨ１−ＳＳ−ｎｐ−ＳＭ７／８コンジュゲート ２００μｇ、またはＨ１−ＳＳ−ｎｐ−ＣｐＧ ２００μｇのいずれかを０週、４週、および１０週に３用量投与した。血清を単離するため、０週、２週、４週、６週、８週、１０週、および１２週に血液サンプル１０ｍＬを採取した。ＰＢＭＣを単離するため、０週、２週、５週、６週、および１２週に血液サンプル１０〜１６ｍＬを採取した。血清およびＰＢＭＣを単離し、標準的な操作手順に従って凍結保存した。カニクイザルを、ＡＦ０３アジュバントを混合して処方したＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ ５０μｇ、またはＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ（アジュバント対照なし） ２００μｇ、またはＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＳＭ７／８ａコンジュゲート（図２８Ａに示す） ２００μｇ、またはＨ１/Ｓｔｅｍ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲート（図２８Ｂに示す） ２００μｇのいずれかで０週、４週、および１０週に免疫するように割り付けた。種々の時点で単離した血清を、ＥＬＩＳＡによる抗ＨＡ抗体力価について（図５０Ａ）、ならびにＨ１サブタイプＨＡおよびＮＡ（図５０Ｂ）またはＨ５サブタイプＨＡおよびＮＡ（図２５Ｃ）でシュードタイプ化したレンチウイルスの中和について、アッセイした。これらを合わせて、図５０Ａ〜図５０Ｃに示す結果は、ＴＬＲ−アゴニストのコンジュゲーションが非ヒト霊長類モデルにおけるＨ１／Ｓｔｅｍ−Ｎｐの免疫原性を改善することを実証している。このモデルでは、ＴＬＲ７／８アゴニストコンジュゲートはＣｐＧコンジュゲートよりも高い力価を生じるようであり、ＡＦ０３混合アジュバントは試験した条件において最高の力価を誘発した。
ＣｐＧにコンジュゲートしたＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐ（配列番号３０９）（ＨＡ−Ｆｅｒｒ−ＣｐＧ、０．２２μｇ／用量）の免疫原性も、混合した対照（ＨＡ−Ｎｐ（０．２２μｇ／用量）とＣｐＧ ２０μｇの混合物（典型的な治療用量）およびＨＡ−ｆｅｒｒ（０．２２μｇ／用量）とＣｐＧ ２１ｎｇの混合物（コンジュゲートと等モルで一致））と比較して評価した。ＨＡ含量（０．１７μｇＨＡ／用量）を一致させて投与したコンジュゲートしていないＨＡ−ＮｐおよびＩＩＶを追加の対照とした。上記のように０週と３週に投与した。ＥＬＩＳＡおよびＰｓＶアッセイはブーストの２週後から血清について実施し、ブーストの５週後の血清についてＨＡＩを実施した。全てのサンプルは３重測定した。
ＥＬＩＳＡのエンドポイント力価（図４２Ａ）またはシュードウイルス中和ＩＣ５０力価（図４２Ｂ）に基づいて、コンジュゲートは、一致させた混合物、コンジュゲートしていない粒子、またはＩＩＶよりも強い結合および中和抗体応答を誘起する。ＨＡ−Ｎｐ−ＣｐＧコンジュゲートは、等モル混合の対照より有意に強いＨＡＩ力価（図４２Ｃ）を誘起する。さらに、ＨＡＩ力価はコンジュゲートしていないＨＡ−ＦｅｒｒおよびＩＩＶよりも２．６倍および３．０倍高かったが、これらの結果は有意ではなかった。
次に、より高い用量で与えた場合に３Ｍ０１２コンジュゲートの免疫原性が改善されるか否かを決定した。これを行うため、コンジュゲート、等モル混合物、高用量混合物、コンジュゲートしていないナノ粒子を、ＨＡ−ＮＰの用量を０．１μｇ、０．５μｇ、２．５μｇ、および１２．５μｇとして試験した（図５１Ａ〜図５１Ｂ）。ＨＡ−ＮＰの用量０．１μｇおよび０．５μｇでは、高い混合用量の場合を除いて中和およびＨＡＩアッセイにおいて最小の応答が見られた。２．５μｇの用量では、コンジュゲートしていないＨＡ−ＮＰおよびＨＡ−ＮＰと３Ｍ０１２の等モル混合物はいずれも最小限の抗体応答を誘起した。高用量の混合物群と比較すると、３Ｍ０１２をコンジュゲートしたＨＡ−ＮＰは３Ｍ０１２の含量が５０００分の１以上少ないにも関わらず、同様の抗体応答を誘起し、直接のコンジュゲーションおよびＴＬＲアゴニストの標的送達の有効性が立証された。
候補ポリペプチドを含むナノ粒子のＥＭおよびＤＬＳによる特徴解析
上に概要を示したプロセスを用いて、図２６Ａに提示するインフルエンザポリペプチドを含むＨＡ−Ｎｐを発現し、培地中に放出した（ＨＡ部分の配列アライメントを図２６Ａに示し、デンドグラムを図２６Ｂに示す）。図２６Ｂ中の矢印は候補ポリペプチドを示す。図４３Ａに列挙するＨＡ−Ｎｐはアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって２９３Ｅｘｐｉ細胞培養上清から精製した。ナノ粒子の生成に成功したことを確認するクーマシー染色の結果を図４３Ｂに示す。
電子顕微鏡（ＥＭ）および動的光散乱（ＤＬＳ）解析は、下記のように実施した。
動的光散乱はＷｙａｔｔ社のＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩを用いて２５℃で測定した。精製したＨＡ−Ｎｐは動的光散乱で予想された１６〜１８ｎｍの大きさを呈した（図４３Ａ、「サイズ」尺度で示す）。ナノ粒子の形成は陰性染色透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）でも確認された（図４３Ｃ）。ＥＭのために、グロー放電に３０秒曝露することによって親水化した炭素コートグリッドにＨＡ−フェリチンナノ粒子サンプルを１分間吸着させた。過剰な液体を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社＃１）で除去し、サンプルを０．７５％のギ酸ウラニルで３０秒染色した。過剰なギ酸ウラニルを濾紙で除去した後、グリッドをＴｅｃｎａｉＧ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮで検査し、ＡＭＴ ２ｋ ＣＣＤカメラで画像を記録した。
分岐したＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスの代表的なパネルに対する単一株ＨＡ−フェリチンナノ粒子の免疫原性
特定のウイルス株からのＨＡ−Ｎｐの免疫原性を検討するため、目的の株からのナノ粒子でマウスを２回免疫し、第２の免疫の３週後に血球凝集素阻害アッセイ（ＨＡＩ）を用いて血清をアッセイした。全ての免疫は動物の取り扱いのための確立されたガイドラインに従った。Ｂａｌｂ／ｃマウス（５匹／群）を０週および３週にＨＡ−フェリチンナノ粒子２２０ｎｇ（ＨＡ含量１７０ｎｇ）で、および適用可能な場合には筋肉内注射（後ろ足あたり５０μＬ）の直前に１：１でアジュバントと混合して、免疫した。Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ社アジュバントシステムカタログ＃Ｓ６３２２−１ｖｌ）またはＡＦ０３（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ社）を図の凡例に指示するように用いた。二価、三価、および四価の組合せについては、注射の前に各ナノ粒子２２０ｎｇを事前混合した。ブースト注射の２週および３週後に血清を採取した。
インフルエンザシードストックを用いるＨＡ阻害アッセイ（ＨＡＩ）は、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）から入手した。免疫血清は血清１部を酵素３部で希釈することによる受容体破壊酵素（ＲＤＥ）で前処理し、３７℃の水浴中で終夜インキュベートした。酵素は５６℃、３０分のインキュベーションおよびそれに続いてＰＢＳ６部を添加して最終希釈１０倍にすることによって不活化した。ＨＡＩアッセイは、Ｖ底９６ウェルのマイクロ力価プレート中、０．５％のシチメンチョウ赤血球中の４ＨＡ単位（ＨＡＵ）のウイルスを用いて実施した。ＨＡＩ力価は、血球凝集の完全な阻害をもたらす血清の最大希釈度として決定した。
全てのデータについて、エラーバーは所与の処置群（マウスについてｎ＝５、フェレットについてｎ＝１２）における各動物からのサンプルをアッセイして得られた平均値の標準誤差を表す。ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社のＥｘｃｅｌを用いて計算した。ＡＮＯＶＡはＶａｓｓａｒＳｔａｔｓ（ウェブからvassarstats.net/anova1u.htmlで入手可能）を用いて計算した。
ウイルスの進化の７８年にわたる代表的な１６種のインフルエンザ株のパネルを用いた。パネル中のウイルスを表２に列挙する。
Figure 2021519596
全ての例において、一致した株の強力な中和が観察された（ＣＡ０９、ＮＣ９９、ＦＭ４７、およびＨＫ７７、図４４Ａ〜図４４Ｄ）。
血清学的応答も、一致した抗原に対するＥＬＩＳＡによって確認した（図４５Ａ〜図４５Ｆ）。各群に投与した免疫原を図４５Ａに列挙する。図４５Ｂ〜図４５Ｆに示すように、ＥＬＩＳＡには三量体を用いた。
ＥＬＩＳＡアッセイのため、Ｎｕｎｃ社のＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレート（カタログ＃４４−２４０４−２１）を１００ｎｇ／ウェルの三量体ＨＡまたは安定化されたステムタンパク質で、４℃で終夜コートし、ＰＢＳＴ中５％のスキムミルクでブロックした。指示した通りに抗血清を希釈し、室温で１時間インキュベートし、結合した抗体を、抗マウス−ＨＲＰ抗体（カタログ＃ＮＡ９３１、５，０００倍）または抗サル−ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ＃４７００−０５、ロット＃Ａ３８１４−Ｐ９０７、５，０００倍）と５％ミルク−ＰＢＳＴ中でこれも室温で、１時間インキュベートすることによって検出した。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ基質（カタログ＃５２−００−０２）でＨＲＰを発色させ、０．５Ｎの硫酸で停止した。吸光度は４５０ｎｍ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５）で読み取った。エンドポイント力価は、閾値を０．２、典型的バックグラウンドレベルを０．０５として、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズムで計算した。
ＨＡ／ＮＡシュードタイプ化レンチウイルスの中和も上記のようにして評価した。結果を表３に示す。試験した全ての例において、一致した株については強い中和活性が観察され、これらの値を閾値として用いた。ＨＡ−Ｎｐと相補的中和活性との組合せにより、交差反応性への加成的な拡張が導かれた。
Figure 2021519596
ＣＡ０９ ＨＡ−Ｎｐは強い免疫応答を誘発したが、これらは、これもブタ起源でＣＡ０９と近いホモロジーを有する現代（２００９年以降）の株および１９７６年の単離株に限られていた（図４４Ａ）（Ｇａｙｄｏｓら、２００６．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １２：２３〜２８頁（１９７６）を参照）。ＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐは１９９０年代後半および２０００年代初期のインフルエンザウイルスに対して強力な中和を誘発した（図４４Ｂ）。ＦＭ４７ ＨＡ−Ｎｐに対する免疫応答は一次的には一致した株に拡張していたが、これも１９７７年の株への中等度の交差反応性を示した（図４４Ｃ）。この交差反応性のレベルは、主として２６歳以下の人が罹患した１９７７年の流行との臨床的関連性を有しており、１９４０年〜１９５０年の流行によるインフルエンザウイルスへの曝露によって１９７７年の株に対する保護が付与されたことを示唆している（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ、２００６）。興味深いことに、ＨＡ配列の中でＨＫ７７ ＨＡ−Ｎｐは、その交差反応性が１９４７年、１９７８年、および１９８３年の株に拡張しており、目を引く（図４４Ｄ）。一方、ＭＡＬ５４ ＨＡ−ＮｐおよびＤＶ５７ ＨＡ−Ｎｐへの免疫応答は一致した株に制限されている（図４４Ｅ、図４４Ｆ、および表３）。
ＣＯＢＲＡ Ｐ１およびＣＯＢＲＡ Ｘ６のナノ粒子で観察された交差反応性は、それらのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の同等物と符合した（Ｃａｒｔｅｒ ＤＭら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９０：４７２０〜４７３４頁（２０１６）参照）。ＣＯＢＲＡ Ｐ１ ＨＡ−Ｎｐによって誘発された免疫応答はＣＡ０９ ＨＡ−Ｎｐと同様であり（図４４Ａおよび図４４Ｇ）、ＣＯＢＲＡ Ｘ６ ＨＡ−ＮｐはＮＣ９９ ＨＡ−Ｎｐと同様の免疫プロファイルを示した（図４４Ｂおよび図４４Ｈ）。
ＨＡ−フェリチンナノ粒子の一価、二価、三価、および四価の処方
選定したＨＡ−Ｎｐの組合せによって誘発されたＨＡＩ交差反応性を評価した。個別のナノ粒子を組み合わせることによって作成した二価、三価、または四価の処方で、上述のようにマウスを免疫し、試験した。ＮＣ９９およびＣＡ０９のＨＡ−Ｎｐの二価の組合せは、いずれかの一価の組成物と比較して拡張した交差反応性を示した（図４６Ａ）。しかし、この二価の組合せは１９３４年〜１９５７年および１９７７年〜１９９１年の古い分岐した株に対しては検出可能な抗体力価を誘発しなかった。ＣＯＢＲＡ Ｘ６およびＣＯＢＲＡ Ｐ１の二価の組合せの免疫原性は同じ傾向に従った（図４６Ｂ）。この組合せはＮＣ９９／ＣＡ０９の二価組成物と比較して増大した幅を示したが、いくつかの株に対するＨＡＩ力価は中程度であった。三価の組合せについては、ＮＣ９９およびＣＡ０９のＨＡ−Ｎｐへの第３成分の含有によって、第３成分がＦＭ４７ ＨＡ−Ｎｐ（図４６Ｃ）またはＨＫ７７ ＨＡ−Ｎｐ（図４６Ｅ）の場合には交差反応性が増大したが、ＭＡＬ５４ ＨＡ−Ｎｐ（図４６Ｄ）は幅を増強しなかった。四価処方における第４成分の添加は、ＮＣ９９、ＣＡ０９、およびＨＫ７７のＨＡ−Ｎｐの三価の組合せと比較して観察可能な交差反応性の付加を生じなかった（図４６Ｆ〜図４６Ｈ）。
様々なアジュバントを用いた場合に、類似の結果が観察された（すなわち、Ｒｉｂｉ対ＡＦ０３、図４７Ａ〜図４７Ｆ）。重要なことに、様々なＨＡ−Ｎｐの共投与による抗原の競合の証拠はなかった。これらのデータは、個別のＨＡＩプロファイルに高度の相補性がある場合には、交差反応性プロファイルに加成性があることを示唆している。正規化したＨＡの用量を用いて卵から製造した不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）として送達したＮＣ９９およびＣＡ０９の免疫原によって得られたＨＡＩプロファイルも測定した（図４８Ａ〜図４８Ｃ）。
フェレットにおけるナノ粒子組成物によるチャレンジに対する保護
ある種のＨＡ−Ｎｐ組合せの有効性を、ヒト疾患に関連する動物モデルであるフェレットで試験した。フェレット（ｎ＝１２匹／群）を、リン酸緩衝食塩液（図４９Ａ）、ＣＡ０９不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ、図４９Ｂ）、野生型ＨＡ−Ｎｐの三価の組合せ（ＮＣ９９＋ＣＡ０９＋ＨＫ７７、図４９Ｃ）、またはＣＯＢＲＡ Ｐ１＋ＣＯＢＲＡ Ｘ６＋ＨＫ７７ ＨＡ−Ｎｐの組合せ（図４９Ｄ）のいずれかで免疫した。筋肉内注射の前に、これらの組成物をＡＦ０３アジュバントと１：１で混合して最終注射量を１ｍｌとした。
２回の免疫の後、一致した株に対する顕著なＨＡＩ力価が観察された（図４９Ｂ〜図４９Ｄ）。ナノ粒子の組合せで免疫した両方の群のフェレットは、ＦＭ４７、ＨＫ７７、およびＮＣ９９に対して顕著なＨＡＩ力価を示した。ＣＡ０９ ＩＩＶはマウスで観察されたＦＭ４７およびＨＫ７７株に対する交差中和力価をフェレットでは誘発しなかった（図４９Ｂ）。
免疫の後、一致しない分岐株であるＨ１／フォートマンモス／１９４７ウイルスをフェレットにチャレンジした。インフルエンザチャレンジは２回目の免疫の４週後に５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）の１０４．６５倍のＡ／フォートマンモス／１／１９４７ウイルス１ｍｌの鼻内接種で実施した。臨床兆候を２週間、毎日追跡し、チャレンジ後７日の間、鼻の洗浄液を毎日採取し、標準的なＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス負荷を試験した。チャレンジに続いて鼻の洗浄液からウイルス力価を定量した。三価のＮＣ９９＋ＣＡ０９＋ＨＫ７７またはＣＯＢＲＡ−Ｐ１＋Ｘ６＋ＨＫ７７のナノ粒子の組合せのいずれかを受けたフェレットのコホートでは対照群より早くウイルスが消滅し、感染後５日目のウイルス力価が顕著に低減したことを示した（図４９Ｅ、ｐ≦０．００１）。対照的に、ＣＡ０９ ＩＩＶで免疫した群はＰＢＳで免疫した対照群より顕著に早くウイルスが消滅しなかった。全ての群では、ＦＭ４７株の複製に成功し、感染後１週以内に消滅した。したがって、ヒト疾患に関連する感染の動物モデルにおいて、三価の組合せは効果的なＨＡＩ応答を刺激し、これは分岐したウイルスチャレンジに対しても保護する。
ＥＢＶに対する抗体を誘発するための抗原性ＥＢＶポリペプチド
ＥＢＶに対する抗体を誘発する抗原性ポリペプチドを開発した。ＥＢＶのｇＬおよびｇＨのポリペプチドを一本鎖として呈示する自己集合性フェリチンナノ粒子を開発し、これらのナノ粒子のマウスにおける免疫原性を評価した。
単量体および三量体のｇＬ／ｇＨ構築物を発現させ、精製した。図５２Ａは、クーマシーおよびウエスタンブロット（抗Ｈｉｓ）解析による、Ｈｉｓタグ切断を伴いまたは伴わない一本鎖のｇＬおよびｇＨの単量体（配列番号４０６）を示す。図５２ＢにＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）ＳＥＣカラム上の吸光度のトレースとして、およびクーマシーによるｇＬおよびｇＨの三量体（配列番号４１１）の分画を、トロンビンプロテアーゼによるＨｉｓタグの切断を確認するためのウエスタンブロットとともに示す。配列番号４０６の構築物について、サンプルの最終濃度は１ｍｇ／ｍＬ、全体積は１５ｍＬ、エンドトキシンレベルは１．４８ＥＵ／ｍＬであった。
一本鎖ｇＬ／ｇＨフェリチンナノ粒子（配列番号４１４）を発現させ、精製した。図５３Ａ〜図５３Ｅは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６ ＳＥＣ分画（５３Ａ）、ＳＥＣ分画のクーマシー（５３Ｂ）、ＳＥＣ分画の抗フェリチン一次抗体によるウエスタンブロット（５３Ｃ）、動的光散乱（ＤＬＳ、５３Ｄ）、および電子顕微鏡（５３Ｅ）による精製および特徴解析を示す。
フェリチンに融合した一本鎖ＥＢＶのｇＬおよびｇＨの例示的な構築物を図５４に示す。トール様受容体７／８アゴニスト（ＴＬＲ７／８ａ）等の免疫刺激性部分のためのコンジュゲート部位は、フェリチン上またはリンカー上に存在することができる（例示的な配列として例えば配列番号４１４、４１９、４２２、４２０、４２３、および４３３を参照）。
様々なリンカーを含むｇＬ／ｇＨ三量体またはナノ粒子をマウスに注射して、免疫血清を評価した（図５５）。マウスには３週の投与間隔で、２μｇの注射を２回、スクアレンエマルジョン系のアジュバントであるアジュバントＡＦ０３とともに投与した。６週目にＥＬＩＳＡによって抗ｇＬ／ｇＨ抗体エンドポイント力価を測定した。ｇＨ＿１６＿ｇＬについては、ナノ粒子（配列番号４１０）が三量体構築物（配列番号４１６）より優れていた。ｇＬ＿２８＿ｇＨナノ粒子（配列番号４１３）は、三量体構築物（配列番号４１１）と顕著に異なる性能はなかった。ｇＬ＿４６＿ｇＨナノ粒子（配列番号４１４）は、ｇＬ＿４６＿ｇＨ三量体（配列番号４１２）より優れていた。
これらのデータは、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子がＥＢＶに対して強力な免疫応答を誘発し得ることを示している。
ｇＬ／ｇＨおよびｇｐ２２０に対する二価の免疫
一本鎖のｇＬ／ｇＨナノ粒子およびｇｐ２２０ナノ粒子を含む組成物を用いて、二価の免疫を実施した。ｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号４０１）を含ませることは、上述のようにワクチン接種したマウスの血清を用いるＥＬＩＳＡ結合アッセイによって測定して、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子（ｇＬ−ｇＨ＿Ｃ５ ＮＰ［配列番号４１９］）によって誘発された免疫応答に対して顕著な干渉効果を有しなかった（図５６Ａ〜図５６Ｂ、それぞれ個別の希釈および結合力価における測定を示す）。同様に、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子と組み合わせて投与した場合、ＥＬＩＳＡによって測定して、ｇｐ２２０ナノ粒子への免疫応答に対する応答において干渉は観察されなかった（図５７Ａ〜図５７Ｂ、それぞれ個別の希釈および結合力価における測定を示す）。
したがって、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子およびｇｐ２２０ナノ粒子の両方による免疫は、いずれのポリペプチドに対する免疫応答も低減しなかった。
フェリチンナノ粒子へのアジュバントのコンジュゲーション
次に、フェリチンナノ粒子へのアジュバントのコンジュゲーションを評価した。図５８Ａに、その中のフェリチンが表面に露出したアミノ酸をコンジュゲーションのために利用可能なシステインに置き換える変異を含む構築物を図示する。図５８Ｂは、ＰＥＧ４リンカーおよびマレイミドに連結された例示的な免疫刺激性部分（ＳＭ７／８ａ、ＴＬＲ−７／８アゴニスト）を示す。このマレイミドはフェリチンの表面に露出したシステインにリンカー（それ自体ＳＭ７／８ａに結合している）を共有結合でコンジュゲートするために用いることができる。ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされたフェリチンに融合した一本鎖ｇＬ／ｇＨポリペプチドを含むポリペプチドを、図５８Ｃの電子顕微鏡写真に示す。
表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインを、図５９Ａのフェリチン分子の構造に図示する。ＣｐＧアジュバント（配列番号５３５）のフェリチンへのコンジュゲーションを、フェリチン、リンカー、およびＣｐＧアジュバントを並置し、互いに近接して結合する各部分のパーツを示すように配向させて、図５９Ｂに図示する。
ｇＬ／ｇＨナノ粒子（配列番号４１９）を２ｍＭのＴＣＥＰを用いて還元し、次いで１Ｘ ＰＢＳの添加および１００ｋＤのミクロスピンカラムを用いてＴＣＥＰを除去することによって酸化した。次いでコンジュゲーションのためにＳＭ７／８ａをｇＬ／ｇＨナノ粒子とインキュベートした。過剰なＳＭ７／８ａを１００ｋＤのミクロスピンカラムによって反応から除去した。マススペクトロメトリー（ＭＳ）データより、コンジュゲートしていないポリペプチドのスペクトル（図６０Ａ）に対する主要なＭＳピークのシフトに基づいて、一本鎖ｇＬ／ｇＨおよびフェリチン（配列番号４１９）を含むポリペプチドの約１００％がＳＭ７／８ａにコンジュゲートされた（図６０Ｂ）ことが示された。コンジュゲートされたポリペプチドとコンジュゲートされていないポリペプチドの質量の差はＳＭ７／８ａ−リンカー−マレイミドアダクトの分子量（７１１Ｄａ）に相当する。
ｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号４０１）を２ｍＭのＴＣＥＰを用いて還元し、次いで１Ｘ ＰＢＳの添加および１００ｋＤのミクロスピンカラムを用いてＴＣＥＰを除去することによって酸化した。次いでコンジュゲーションのためにＳＭ７／８ａをｇＬ／ｇＨナノ粒子とインキュベートした。過剰なＳＭ７／８ａを１００ｋＤのミクロスピンカラムによって反応から除去した。ＭＳデータより、コンジュゲートしていないポリペプチドのスペクトル（図６１Ａ）に対する主要なＭＳピークのシフトに基づいて、ｇｐ２２０およびフェリチン（配列番号４０１）を含むコンジュゲートされたポリペプチドの約１００％がＳＭ７／８ａにコンジュゲートされている（図６１Ｂ）ことが示された。
電子顕微鏡（ＥＭ）データからも、一本鎖ｇＬ／ｇＨおよびフェリチンを含むポリペプチド（図６２Ａにおけるコンジュゲートしていないサンプルと比較した図６２Ｂ）またはｇｐ２２０およびフェリチンを含むポリペプチド（図６２Ｃにおけるコンジュゲートしていないサンプルと比較した図６２Ｄ）へのＳＭ７／８ａのコンジュゲーションがナノ粒子の集合を破壊しなかったことが確認された。
一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子（ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ５ ＮＰ、図６３Ａおよび図６３Ｂ）またはｇｐ２２０を含むナノ粒子（図６４Ａおよび図６４Ｂ）１μｇで免疫した後のＥＬＩＳＡによって抗体応答をアッセイした。ナノ粒子は裸のフェリチン１μｇと組み合わせ、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたものとしないものであった。コンジュゲートしていないナノ粒子は混合したＡＦ０３アジュバントとともに、またはそれなしに投与した。それぞれのマウスは上述のナノ粒子組成物１００μＬの投与を受けた。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とナノ粒子を混合した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で２回免疫した。５週目にＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。最も強力なＥＬＩＳＡ応答はＡＦ０３アジュバント中で投与したナノ粒子で見られた。ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションは、アジュバントなしのコンジュゲートしていないナノ粒子と比較してより強力なＥＬＩＳＡ応答を生じた。
ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ５ナノ粒子およびＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇｐ２２０ナノ粒子それぞれ１μｇの共投与の効果も、裸のフェリチンナノ粒子を伴ういずれかのナノ粒子の単独の投与と比較して、図６５Ａ〜図６５Ｂおよび図６６Ａ〜図６６Ｂで評価した。一本鎖ｇＬ／ｇＨ（図６５Ａ〜図６５Ｂ、それぞれＡＦ０３なしおよびあり）またはｇｐ２２０（図６６Ａ〜図６６Ｂ、それぞれＡＦ０３なしおよびあり）のいずれに対する免疫応答に対しても干渉は観察されなかった。
長期免疫原性の検討
一本鎖ｇＬ／ｇＨ（ｇＬ／ｇＨ＿Ｃ５、配列番号４１９）を含むナノ粒子を投与した３カ月後の免疫原性を評価する検討を実施した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で２回免疫した。裸のフェリチン（すなわち、いずれのポリペプチドまたはアジュバントにもコンジュゲートしていないフェリチン）１μｇを一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子１μｇと投与し、ナノ粒子は混合したＡＦ０３アジュバントの存在下または非存在下に処方した。１３週目にＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とナノ粒子組成物を混合した。それぞれのマウスは上述のナノ粒子組成物１００μＬの投与を受けた。数匹のマウスはその中のフェリチンがＳＭ７／８ａにコンジュゲートされた一本鎖のｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子の投与を受けた（図６７〜図６８における「７／８ａ」）。
図６７に示すように、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートした一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子は、ＡＦ０３中で処方すると最大の免疫応答を生じた。これらのナノ粒子についても、ＡＦ０３がない場合でも強力な免疫応答が見られた。
一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子の代わりにｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号４０１）（ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションありまたはなし）を用いて並行実験を実施した。これらのナノ粒子についても同様の結果が見られ、混合したＡＦ０３を含む処方は最も強力な応答を生じ、これらのナノ粒子についても、ＡＦ０３がない場合でも強力な免疫応答が見られた（図６８）。
一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子（ｇＬ／ｇＨ＿Ｃ５、配列番号４１９）およびｇｐ２２０を含むナノ粒子（配列番号４０１）を含む二価の組成物によって誘発される免疫応答を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で免疫した。各ナノ粒子１μｇを含むナノ粒子組成物１００μＬを投与した。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とワクチンを混合した。最終の１３週目にＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。一本鎖ｇＬ／ｇＨ（図６９）およびｇｐ２２０（図７０）に対する免疫応答については、いずれかのナノ粒子を裸のフェリチンと組み合わせて投与した場合と比較して、組み合わせたナノ粒子の投与による干渉は見られなかった。
ｇＬ／ｇＨ＿Ｃ５ナノ粒子（配列番号４１９）を用いたさらなる実験により、ナノ粒子をＳＭ７／８ａにコンジュゲートした場合（７／８ａ）、またはナノ粒子をＡＦ０３中で処方した場合（図７２）に長期の免疫応答が見られることが確認された。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で免疫した。ナノ粒子１μｇを含むナノ粒子組成物１００μＬを投与した。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とワクチンを混合した。２週（プライム）、５週（ブースト）、および１３週（最終）でＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。ｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号４０１）を用いて並行実験を実施し、ｇｐ２２０ナノ粒子についても同様の長期応答が見られた（図７３）。
一本鎖ｇＬ／ｇＨを含む様々なナノ粒子（ｇＬ＿ｇＨ−Ｃ７、配列番号４２０）も評価した。ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ７構築物は、ｇＨポリペプチドと、免疫刺激性部分のためのコンジュゲーション部位としてのシステインを含むフェリチンとの間の可撓性のリンカーを含む。リンカーは表面に露出したシステインを含まないフェリチンとともに用いてもよい（配列番号４２０に示すように）。ＳＭ７／８ａは２ｍＭのＴＣＥＰを用いてこのタンパク質を還元し、次いで１Ｘ ＰＢＳの添加および１００ｋＤのミクロスピンカラムを用いてＴＣＥＰを除去することによって酸化して、ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ７にコンジュゲートした。次いでＳＭ７／８ａをｇＬ／ｇＨナノ粒子とともにインキュベートした。コンジュゲートの後、過剰なＳＭ７／８ａを１００ｋＤのミクロスピンカラムによって反応から除去した。
７／８ａにコンジュゲートしまたはコンジュゲートしていないこれらのｇＬ／ｇＨナノ粒子１μｇおよび裸のフェリチン１μｇをマウスに投与した。ナノ粒子１μｇを含むナノ粒子組成物１００μＬを投与した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で免疫した。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とナノ粒子組成物を混合した。２週（プライム）、５週（ブースター）、および１３週（最終）でＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。これらのナノ粒子は、プライム採血におけるＥＬＩＳＡエンドポイント力価によって測定して、ＡＦ０３中で処方した場合またはＳＭ７／８ａにコンジュゲートした場合に、免疫応答を誘発した（図７１Ａ）。ブースター採血（図６７Ｃ）または最終採血（図７１Ｄ）のサンプルで同様の結果が見られた。これらのナノ粒子をＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドにもコンジュゲートし、同様にして投与した。ＣｐＧコンジュゲートについての結果は５週においてコンジュゲートしていないナノ粒子と同様であった（図７１Ｂ）。
トリコプルシア・ニイ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）フェリチンを含むナノ粒子の特徴解析
トリコプルシア・ニイフェリチンならびにｇｐ２２０および／またはｇＬ／ｇＨポリペプチドを含むナノ粒子も開発した。トリコプルシア・ニイフェリチンナノ粒子は１：１の比で自己集合した重鎖および軽鎖を含む。軽鎖を有する１つの非フェリチンポリペプチドと重鎖上の別の非フェリチンポリペプチドとを組み合わせることにより、個別のナノ粒子の表面上に２つの異なったポリペプチドを提示することができることが見出された。したがって、例えば自己集合したトリコプルシア・ニイフェリチンナノ粒子は、ｇｐ２２０とｇＬ／ｇＨの両方を提示することができた。
トリコプルシア・ニイフェリチンナノ粒子は、ｇｐ２２０（配列番号４２４）または一本鎖ｇＬ／ｇＨ（配列番号４２５）に融合した重鎖およびｇｐ２２０（配列番号４２６）または一本鎖ｇＬ／ｇＨ（配列番号４２７）に融合した軽鎖を用いて生成し精製した（構築物を図７４Ｂに図示し、クーマシーゲル染色によって図７４Ａに可視化している。軽鎖および重鎖の単独と比較して予想される分子量の増大を示す）。それぞれｇＬ／ｇＨおよびｇｐ２２０に融合した軽鎖および重鎖またはその逆の組合せによって、２つの異なるＥＢＶポリペプチドを提示することができる個別の多価ナノ粒子が産生された。
重鎖と軽鎖の両方にｇｐ２２０のみを含むもの（図７５Ｅに示す）または重鎖にｇｐ２２０、軽鎖にｇＨ＿ｇＬを含むもの（図７６Ｅに示す）の２つのＴ．ニイフェリチンナノ粒子も生成した。精製は２つの工程に従った。最初の精製工程はイオン交換クロマトグラフィー工程であった（Ｑカラム、図７５Ａおよびクーマシー結果の図７５Ｃ、ならびに図７６Ａおよびクーマシー結果の図７６Ｃを参照）。この工程に続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った（図７５Ｂおよびクーマシー結果の図７５Ｄ、ならびに図７６Ｂおよびクーマシー結果の図７６Ｄを参照）。
ｇｐ２２０に融合したトリコプルシア・ニイ軽鎖および重鎖を含むナノ粒子（配列番号４２４および４２６、図７７Ｂに図示）は、クーマシー染色（図７７Ａ）、裸のＴ．ニイフェリチン（図７８Ｃ）と比較したＤＬＳ半径の増大（図７７Ｄ）、および裸のナノ粒子と比較してナノ粒子のコアの周囲にさらに末梢の密度が現れたＥＭ解析（図７７Ｃ）に基づいて、異種のｇｐ２２０ポリペプチドを含むナノ粒子の形成と符合するプロファイルを示した（図７７Ｂ）。配列番号４２４および４２７についても、ナノ粒子中の異種のｇＬ／ｇＨおよびｇｐ２２０ポリペプチドの存在を示す同様の結果が見られた（トリコプルシア・ニイのｇＬ／ｇＨポリペプチドを含む軽鎖およびｇｐ２２０ポリペプチドを含む重鎖、それぞれクーマシー染色による可視化、構築物の図示、電子顕微鏡写真、およびＤＬＳによる特徴解析について図７７Ｅ〜図７７Ｈを参照）。比較のため、図７８Ａ〜図７８Ｃに裸の（すなわち、いずれのポリペプチドにもコンジュゲートしていない）Ｔ．ニイフェリチンについてのクーマシー染色（図７８Ａ）、ＤＬＳ半径（図７８Ｂ）、およびＥＭ解析（図７８Ｃ）を示す。
したがって、Ｔ．ニイフェリチンを用いることにより、個別のナノ粒子の上に２つのポリペプチドを提示することが可能になる。
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２構築物
フェリチンに融合したｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２の一本鎖構築物の概略図を（配列番号２２７〜２３１および２４１〜２４２のそれぞれにおいて）図８６Ａに示す。各タンパク質の間の融合は、可撓性のアミノ酸リンカーまたは硬いアミノ酸リンカーを介している。一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２分子は、ナノ粒子上で１：１：１の比のヘテロ三量体を形成する。
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ Ｈｉｓタグ付け融合（配列番号２２６）の結晶構造が解明され、一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２は、天然に見出される野生型のｇＨ、ｇＬ、およびｇｐ４２タンパク質と同様のヘテロ三量体コンフォメーションをとり得ることが示された（図８５および図８６Ｂ）。図８５および図８６Ｂにおいて、Ｇｐ４２（図８５では暗灰色矢印を示す）はｇＨ／ｇＬヘテロ二量体と相互作用する。図８６Ｃは、フェリチンに融合したこの一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ヘテロ三量体がナノ粒子上にどのように呈示されるかのモデルである。単一のナノ粒子の上に呈示される一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２の２４個のコピーが存在する。
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰ構築物（配列番号２２７）を２９３ｅｘｐｉ細胞に発現させて精製した（図７９Ａ）。ＣＨＯプールから精製したｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰは、約２６．２ｎｍの動的光散乱半径を有していた（図７９Ｂ）。
一価（ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰ＋裸のフェリチンナノ粒子）または二価（ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰ＋ｇｐ２２０ ＮＰ）の組成物によって誘発された免疫応答を評価した。ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰは配列番号２２７の配列を有し、ｇｐ２２０ ＮＰは配列番号１の配列を有していた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で免疫した。各ナノ粒子１μｇを含むナノ粒子組成物１００μＬをＡＦ０３アジュバント（１：１の体積比でＡＦ０３をワクチンと混合）とともに投与した。ブーストは２回目の免疫の５週後に血清を採取したことを示す。５週でマウスから採取した血清を用いて、Ｂ細胞中（図８０Ａ）および上皮細胞中（図８０Ｂ）におけるＥＢＶウイルス中和アッセイ解析を行った。一価形（裸のフェリチンとｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２）の投与と比較して、二価処方のナノ粒子の投与による干渉は見られなかった。
アジュバントＡＦ０３の存在下の一本鎖ｇＬ／ｇＨ／ナノ粒子（ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ１３７Ａ＿ｂｆｐ Ｆｅｒｒナノ粒子Ｎ１９Ｑ／Ｃ３１Ｓ／Ｓ１１１Ｃ［配列番号２２］）およびｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）（図８１Ａ〜図８１Ｂ）またはアジュバントＡＦ０３の存在下のｇＬ／ｇＨ／ｇｐ４２ ＮＰ（配列番号２２７）およびｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）（図８１Ｃ〜図８１Ｅ）を含む組成物を用いてフェレットの二価免疫を実施した。Ｉｎｊ．１＝注射１（Ｉｎｊ．１の２週後に６匹のフェレットから血清を採取）。Ｉｎｊ．２＝注射２（Ｉｎｊ．２の２週後に６匹のフェレットから血清を採取）。図８１Ａ〜図８１Ｅ、図８１Ｆ〜図８１Ｇに示す抗原に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイで測定したエンドポイント結合力価は、アジュバントＡＦ０３の存在下のｇＬ／ｇＨ／ｇｐ４２ ＮＰ（配列番号２２７）およびｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）の二価ワクチン接種を受けたフェレットの血清の（それぞれＢ細胞および上皮細胞における）ＥＢＶウイルス中和アッセイを示す。プライム＝Ｉｎｊ．１、ブースト＝Ｉｎｊ．２。
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰ＿Ｃ１２（配列番号２２８）を発現して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図８２Ａ）。図８２Ａのサンプルの動的光散乱解析により、２０．６ｎｍの粒子半径が示された（図８２Ｂ）。
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰ＿Ｃ１３（配列番号２２９）を発現して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図８３Ａ）。図８３Ａのサンプルの動的光散乱解析により、１７．１ｎｍの粒子半径が示された（図８３Ｂ）。
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ ＮＰ＿Ｃ１４（配列番号２３０）を発現して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図８４Ａ）。図８４Ａのサンプルの動的光散乱解析により、１６．９ｎｍの粒子半径が示された（図８４Ｂ）。
図８６Ｄに、２９３Ｅｘｐｉ細胞中で発現した後の配列番号２２７の精製を示す。変性ＳＤＳクーマシーゲルにより、フェリチンに融合したｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２がグリコシル化により１５０ｋＤを超えることが示される。精製した生成物の陰性染色電子顕微鏡解析により、フェリチンに融合した一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２がナノ粒子を形成することに成功し、表面上にｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２抗原を呈示することが示される（図８６E）。０日、３日、７日、または１４日における温度、酸化、および／または脱アミド化のストレス試験により、配列番号２２７の一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ナノ粒子の配列解析またはマススペクトロメトリーから潜在的な不安定配列が同定された。ワクチンの安定性を改善するため、様々な組合せ、特に表１に列挙した部位において、このワクチン構築物の発現および／または免疫原性、保存的なアミノ酸置換変異を配列番号２２７に加えることになる。特定の遺伝子のそれぞれの場所における保存的なアミノ酸置換は、ｇｐ４２のＣ末端をフェリチン配列のＮ末端と融合するリンカー配列のみが配列番号２２７と異なる配列番号２２８〜２３０においても試験することになる。
ＲＳＶ Ｆポリペプチドに対する改変の設計および特徴解析
他のパラミキソウイルスＦタンパク質と同じく、ＲＳＶ ＦはＮ末端シグナルペプチドおよびタンパク質をウイルス表面に固定するＣ末端膜貫通領域を有する前駆体タンパク質として発現される。ＲＳＶ Ｆはプロテアーゼフリンによって細胞内切断を受けて疎水性の融合ペプチド（図８７Ａの「ＦＰ」）を放出する。融合ペプチドの役割は、感染の際に標的細胞に結合することである。融合ペプチドに隣接してヘプタッドリピート領域Ａ（ＨＲＡ）があり、一方ヘプタッドリピート領域Ｂ（ＨＲＢ）は膜貫通ドメインに隣接している。
融合前および融合後のコンフォメーションにおけるＲＳＶ Ｆエクトドメイン三量体の結晶構造によって、ＨＲＡおよびＨＲＢ領域がどのように顕著な再配置を受けて細胞融合事象を促進するかが実証される（図８７Ｂ）（Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｋ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８（２３）：９６１９〜２４頁（２０１１）；ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）；ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５（１５）：７７８８〜９６頁（２０１１）；およびＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５８）：５９２〜８頁（２０１３）参照）。融合前のコンフォメーションにおいて、ヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）領域は球状のヘッドに関連しており、融合ペプチドの先端は大部分、タンパク質の中央に埋め込まれている。融合前のコンフォメーションはいくつかのヘリックスを含み、プロトマーの間のある種の接触が関与して融合前三量体を形成している。
プロトマー間の安定化であるように一連のアミノ酸置換を設計した。例示的な置換にはＶ２０７Ｌ；Ｎ２２８Ｆ；Ｉ２１７ＶおよびＥ２１８Ｆ；Ｉ２２１ＬおよびＥ２２２Ｍ；またはＱ２２４ＡおよびＱ２２５Ｌが含まれる。実施例におけるＲＳＶ Ｆアミノ酸配列の全ての番号付けは、配列番号５２６の番号付けを用いる。
ヘリックスの安定化であるようにアミノ酸置換を設計した。したがって、これらの置換はＲＳＶ Ｆのヘリカルドメインを安定化することが予測される。例示的な置換にはＮ２１６ＰまたはＩ２１７Ｐが含まれる。
プロトマー内の安定化であるようにアミノ酸置換を設計した。例示的な置換にはＶ２２０Ｉ；またはＡ７４ＬおよびＱ８１Ｌが含まれる。
ヘリックスのキャッピングであるようにアミノ酸置換を設計した。例示的な置換にはＮ２１６ＰまたはＩ２１７Ｐが含まれる。
凝集を減少させるようにアミノ酸置換を設計した。例示的な置換にはＶ１９２ＥおよびＬ６１Ｑが含まれる。
Ｎ２２８Ｆ等の疎水性アミノ酸を導入することによって空洞を満たすように他のアミノ酸置換を設計した。
非アスパラギン残基をアスパラギンに置き換えることによってグリコシル化部位を追加するために、アミノ酸置換Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８Ｎ、およびＲ５０７Ｎを設計した。融合前のＦタンパク質の表面上の融合後のＲＳＶ Ｆに露出したエピトープをブロックするために非天然グリカンの付加を用いることができると仮定された（図８７Ｂ）。
目的のＲＳＶ Ｆ構築物は、Ｎ末端ウシガエルフェリチンリンカーとＨ．ピロリフェリチン（ｐＦｅｒｒ）を含むハイブリッドフェリチンとの一本鎖（ｓｃＦ）融合タンパク質として産生した（図８７Ａ）。フェリチンはＫ７９ＣまたはＳ１１１Ｃの変異に起因する表面露出システインを含んでいた（フェリチン配列の番号付けは配列番号２０８に対応する）。
当分野で公知の標準的なクローニング慣習を用いて種々のＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびフェリチンコーディング配列の産生を実施した。一般的に言えば、記載した置換を有するＲＳＶ Ｆ構築物のためのＤＮＡを合成して、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって哺乳動物の発現ベクターにクローニングした。以前に刊行されたプロトコルと同様にＲＳＶ Ｆ ＤＳ−ＣＡＶ１および融合後Ｆ三量体を産生した（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）参照）。ＤＳ−ＣＡＶ１構築物はＲＳＶ ＦのＣ末端三量体化ドメインを保持しており、これを空洞充填疎水性置換と組み合わせた。ＲＳＶ Ｆ ＤＳ−ＣＡＶ１はＳ１５５Ｃ〜Ｓ２９０Ｃジスルフィドマルチネイション（ＤＳ）およびＳ１９０Ｆ〜Ｖ２０７Ｌ（ＣＡＶ１）を含んでいる。
ＲＳＶ Ｆ−フェリチンナノ粒子をコードするベクター、裸のフェリチン（ＲＳＶ Ｆに結合していない）、およびＲＳＶ Ｆ三量体を２９３ＥＸＰＩ細胞にトランスフェクトし、４日後に馴化培地から発現生成物を回収した。ＲＳＶ Ｆナノ粒子は従来のクロマトグラフィー法を用い、ｐＨ７．０および８．５の一連のアニオン性Ｑカラム精製（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｃａｔ＃１７−１１５４−０１）およびそれに続くＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ ＳＥＣ精製（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｃａｔ＃９０−１０００−４２）によって精製した。ＤＳ−ＣＡＶ１融合前三量体および融合後三量体は−８０℃で保存し、ＲＳＶ Ｆナノ粒子は４℃で保存した。
ＲＳＶ Ｆナノ粒子のコンフォメーションを決定するため、電子顕微鏡を実施した。ＲＳＶ Ｆナノ粒子調製物（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ中、３０μｇ／ｍＬ）を４００メッシュの炭素コートグリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に吸収させ、０．７５％のギ酸ウラニルで染色した。８０ｋＶで操作するＪＥＯＬ社の１２００ＥＸ顕微鏡を用いてサンプルを解析した。顕微鏡写真は６５，０００倍の拡大で取得し、ＥＭ会社Ｎａｎｏｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による当分野の従来法を用いて２Ｄクラス平均を調製した（図８７Ｄ）。
過渡的にトランスフェクトした２９３ＥＸＰＩ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によるこれらのＲＳＶ Ｆポリペプチドおよびフェリチンを含むポリペプチド（配列番号５０１〜５０８および５１１〜５１５）の発現および分泌を、抗ＲＳＶ Ｆウエスタンブロットによって評価した。全ての抗ＲＳＶ Ｆウエスタンブロットは、ＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０（６１３６）：１１１３〜１１１７頁（２０１３）および米国特許第８，５６２，９９６号に記載された部位０特異的Ｄ２５抗体を用いた。図８８に示すように、多くの構築物の発現および分泌に成功した。
ＲＦ８０８５ポリペプチド（配列番号５０１）は、Ｎ末端でフェリチンナノ粒子に融合した発表済みのＤＳ−ＣＡＶ１ ＲＳＶ Ｆの一本鎖変異体を表す（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５８）：５９２〜５９８頁（２０１３）参照）。この構築物は抗原部位０を保持したＲＳＶ ＦのＳ１５５Ｃ〜Ｓ２９０Ｃ二重変異体（ＤＳ）を含んでいる。
ＲＦ８１０６ポリペプチド（配列番号５０９）は、ＤＳ−ＣＡＶ１に置換される２つのシステインの代わりにＩ２１７Ｐ置換を有している。図８９に示すように、ＲＦ８１０６構築物は４日後に抗ＲＳＶ Ｆウエスタンブロットによる馴化培地からの評価で、過渡的にトランスフェクトした２９３ＥＸＰＩ細胞において顕著に良好な発現を有していた。
ＲＦ８１０６のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、融合タンパク質ナノ粒子と符合するＲＳＶ抗原に融合した集合したフェリチン粒子と符合する保持時間において主ピークの溶出を示した（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ、図９０）。ＲＦ８１０６の動的光散乱（ＤＬＳ）解析を、還元状態（図９１Ｂ）および非還元状態（図９１Ａ）で行った。還元は２ｍＭ ＴＣＥＰによる処理で行った。ＲＦ８１０６はほぼ１５ｎｍの半径を有しており、これは還元状態および非還元状態のナノ粒子（２４量体）への組み込みと符合している。以下に述べるように、融合タンパク質の還元剤への安定性は、アジュバントが融合タンパク質にコンジュゲートして自己アジュバント性ナノ粒子を形成することを容易にしている。
次に、ＲＳＶ Ｆポリペプチドとフェリチンとの融合タンパク質へのアジュバントのコンジュゲーション（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ）を評価した。フェリチンの上の遊離の表面システインを用いてｓｃＦ−ｐＦｅｒｒ融合タンパク質に追加の部分を結合させることができることが見出された。図９２に、配列Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ（配列番号５３０、＊はホスホロチオエートリンケージを示す）を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のＲＦ８１０６へのコンジュゲーションの成功を示す。これは、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで評価した分子量の増大によって証明された。
Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８Ｎ、およびＲ５０７Ｎの置換（ＲＦ８１１７、配列番号５１７）を用いてグリコシル化部位を追加することの効果を、フェリチンとの融合タンパク質としてのこの構築物（すなわちＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ構築物として）を過渡的にトランスフェクトした２９３ＥＸＰＩ細胞で評価した。ＲＦ８１１７はまた、ＲＦ８１１３と同様にＩ２１７Ｐ置換を含んでいる。図９３に示すように、ＲＦ８０８５対照構築物およびＲＦ８１１３構築物（配列番号５１６、これはＩ２１７Ｐのプロリン置換を含むが、Ｅ３２８Ｎ、Ｓ３４８Ｎ、およびＲ５０７Ｎの置換を含まない）と比較して、ＲＦ８１１７の発現の増大が見られた。ＲＦ８１１３は、操作されたフェリチンのシステインがフェリチン残基のＳ１１１ＣでなくＫ７９Ｃの上にあることを除いて、既に述べたＲＦ８１０６と同様である。ＲＦ８１１７構築物はまた、ＲＦ８１１３およびＲＦ８１１７の分子量の増大を示し、グリカンの付加に成功したことを示した。
図９４に、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰのタンパク質分解安定性を増大したＲＳＶ Ｆナノ粒子の改変をまとめる。出発構築物はＲＦ８１１７（上記）であった。その前の構築物ＲＦ８０８５をＲＦ８０９０としてＣＨＯベクターにクローニングしてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした際、いくらかの物質がＦとフェリチン部分との間で切り取られたことが観察された。ＨＲＢ領域またはＦとフェリチン部分との間のリンカーにおけるアルギニンまたはリシンの残基がトリプシン様のプロテアーゼで切断されていたことが疑われた。この領域内のリシンおよびアルギニン残基の変異を、２９３細胞中での発現に関して試験した。図９４より、Ｋ４９８ＬおよびＲ５０８Ｑの変異（ＲＦ８１２２、配列番号５１８における）が、ＲＦ８１１７と比較して発現に影響しまたは発現を増大させないことが確認された。これらの変異をＲ５２３Ｑとともに本明細書で述べたＲＦ８１１７の変異と組み合わせて、構築物ＲＦ８１４０（配列番号５２３）を形成した。
２９３細胞での発現において、一本鎖とプロリン（Ｉ２１７Ｐ）改変の組合せにより、発現のより大きな改善（ほぼ５倍）（これらの置換を有する例示的な構築物にはＲＦ８１０６（配列番号５０９）およびＲＦ８１１３（配列番号５１６）が含まれる）、およびＲＳＶ Ｆのグリコシル化部位改変の追加に起因する発現および溶解性のさらなる改善（例示的な構築物ＲＦ８１１７（配列番号５１７）およびＲＦ８１４０（配列番号２３））が見られた。これらの構築物は全て、配列ＧＳＧＮＶＧＬ（配列番号５３１）に置き換えられた融合ペプチドおよびｐ２７ペプチド領域（配列番号５２６のアミノ酸９８〜１４４）を有していた。しかし、ＲＦ８０９０を製造用ＣＨＯ細胞株で発現した場合には、ウエスタンブロットでさらなるＲＳＶ Ｆバンドが観察され、この構築物はおそらくアルギニンまたはリシン残基におけるトリプシン様切断によるタンパク質分解を受けやすいことを示唆している。
プロテアーゼに対する感受性の潜在的役割も検討した。ＨＲＢ領域およびＦ部分とフェリチン部分との間のリンカーにおけるＫ残基の置換（ノックアウトまたはＫＯ）を行った。それは、これらの部分が製造用ＣＨＯ細胞株において初期に観察されたＫ介在切断の可能性のある部位であると予想されたからである。図９５Ａおよび図９５Ｂに示すように、Ｄ２５ウエスタンブロットまたはＤ２５およびＡＭ１４ Ｏｃｔｅｔ解析で測定して、ＲＦ８１１７およびＲＦ８１４０はいずれも、製造用ＣＨＯ細胞株においてＲＦ８０９０と比較して高いレベルを発現した。
これらのデータより、一本鎖の構築物およびヘリックスキャッピングのためのアミノ酸の改変、グリコシル化の増大、ならびにプロテアーゼによる切断を受けやすいリシンまたはアルギニンの除去によって、ＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ抗原を含むＲＳＶ Ｆポリペプチドの発現を改善できることが示される。
ＲＳＶ Ｆおよびフェリチンナノ粒子の融合タンパク質の特徴解析
動物研究に先立って、ＤＳ−ＣＡＶ１およびＲＳＶ Ｆナノ粒子の濃度を、Ｏｃｔｅｔを用いる結合によって解析した。融合前抗原の融合前特異的抗体Ｄ２５およびＡＭ１４への結合も、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ装置を用いて測定した。全てのアッセイはＰＢＳ中、３０℃で実施した。抗体をプロテインＡ（ＰｒｏＡ）センサーチップ（ｆｏｒｔｅＢｉｏ＃１８−５０１３）に４００秒、負荷して、ほぼ飽和に達するまで捕捉させた。次いでバイオセンサーチップをＰＢＳ中で９０秒、平衡にし、次いで公知の濃度の抗原とＰＢＳ中で３００秒会合させ、次いでＰＢＳ中で抗原を解離させた。１：１の相互作用を仮定したデータ解析および曲線フィッティングを、公知の濃度の精製したＰｒｅ−Ｆ−ＮＰの結合の外部標準曲線を用いるＯｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ１０．０ソフトウェアで行った。ＣＨＯ馴化培地中のＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ濃度を決定する例示的なアッセイ結果を図９５Ｂに示す。
ＲＳＶ Ｆポリペプチドへの免疫応答のｉｎ ｖｉｖｏ特徴解析
マウスにおけるＲＳＶ抗原に対するｉｎ ｖｉｖｏ応答を評価するため、雌ＢＡＬＢｃマウスを０週、３週、および６週で指定した用量のＲＳＶ抗原で筋肉内免疫した。他に注記しなければ、ＲＳＶ抗原を（例えばとりわけ図９６Ａ〜図９６Ｂ、および図１２Ａ〜図１２Ｂの実験において）ベッドサイド混合戦略によりＡＦ０３でアジュバント化した。すなわち、それぞれの後ろ足に５０μｌを注射する直前に、関連するタンパク質の溶液５０μｌをＳａｎｏｆｉ社のアジュバントＡＦ０３（スクアレン系エマルジョン、Ｋｌｕｃｋｅｒら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０１２ Ｄｅｃ；１０１（１２）：４４９０〜５００頁参照）５０μｌと混合した。非アジュバント化群については、抗原を上記のように混合したが、ＡＦ０３を等体積のＰＢＳに置き換えた。ＳＰＡ０９またはアラムと混合した抗原については、ＡＦ０３をそれぞれ等体積のＳＰＡ０９またはアラムに置き換えて上記の手順を実施した。いずれの処方についても免疫による有害な影響は観察されなかった。最初の免疫の１日前、およびそれぞれの注射の少なくとも２週後（すなわち、２週、５週、および８週）に血液を採取した。他に特定しなければ、示したデータは３回目の注射の２週後（８週、２ｗｐ３とも注記する）のものであった。典型的には、血清は免疫前の動物（ナイーブと注記）、２回目の注射の２週後（ポスト２または２ｗｐ２）、または３回目の注射の２週後（ポスト３ｒｄまたは２ｗｐ３）から分析した。
Ｖｅｒｏ細胞中和アッセイのため、血清を５６℃で３０分、熱不活化した。不活化血清の４倍連続希釈系列を、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、および１％の抗生−抗有糸分裂剤を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で作成した。ＲＳＶウイルスストックを希釈血清と１：１で合わせ、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いでウイルス−血清混合物を、コンフルエントなＶｅｒｏ細胞単層を含む２４ウェルのプレートに１ウェルあたり１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。次いで接種材料を１ウェルあたり１ｍＬの、２％のＦＢＳ、２％のＧｌｕｔａＭＡＸ、および２％の抗生−抗有糸分裂剤を補ったＤＭＥＭ中、０．７５％のメチルセルロースで覆った。５％ＣＯ２中、３７℃で５日インキュベートした後、上層を除去し、単層を氷冷メタノールで２０分固定した。
次いでプレートを水で１回洗浄し、室温で３０分、穏やかに振盪しながらリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中５％の脂肪を含まないドライミルクでブロックした。次いでブロッキング溶液を、１ウェルあたり２００μＬのセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ＲＳＶ抗体（Ａｂｃａｍ社ＡＢ２０６８６）の２０００倍希釈物を含むＰＢＳ中、２％ドライミルクに置き換えた。室温で３時間インキュベートした後、プレートを水で２回洗浄し、ＴｒｕｅＢｌｕｅ ＨＲＰ基質で発色させ、水でさらに２回洗浄して風乾した。
染色したプラークを解剖用顕微鏡を用いて計数した。中和抗体力価は、式：６０％プラーク低減力価＝（Ｃ／Ｖ×０．４−Ｌｏｗ）／（Ｈｉｇｈ−Ｌｏｗ）×（ＨＳＤ−ＬＳＤ）＋ＬＳＤを用いてモック中和ウイルス対照の６０％低減エンドポイントで決定した。ここでＣ／Ｖ＝モック中和ウイルス対照ウェルにおけるＲＳＶプラークの平均、ＬｏｗおよびＨｉｇｈは血清サンプルのＣ／Ｖ×０．４値を挟む２つの希釈におけるＲＳＶプラークの平均数、ＨＳＤおよびＬＳＤは高い方および低い方の血清希釈倍率である。
ＨＡＥ中和アッセイのため、血清を５６℃で３０分、熱不活化した。不活化血清の４倍連続希釈系列を、ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ １０Ｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５００３）および１％の抗生−抗有糸分裂剤を補ったＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５００２）（以下、培地）中で作成した。ＲＳＶウイルスストックを希釈血清と１：１で合わせ、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いでウイルス−血清混合物を、完全に分化したＨＡＥ細胞を含む２４ウェルのプレートに１ウェルあたり５０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２で１．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、接種材料を除去し、ウェルを培地で２回洗浄して未結合のウイルスを除去し、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２０時間インキュベートした。ｍＫａｔｅ（ＴａｇＦＰ６３５）レポーターを発現するＲＳＶに感染した培養における感染事象を、蛍光顕微鏡で計数した。
ｍＫａｔｅレポーターを発現しないＲＳＶによる感染を検出するため、偽重層上皮を培地で十分に洗浄して粘液を除去し、次いで４％パラホルムアルデヒドで室温、３０分固定し、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３０分透過性にし、２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで３７℃で、１時間ブロックした。ブロッキング液を１ウェルあたり１００μＬの２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで２００倍に希釈したマウス抗ＲＳＶモノクローナル抗体混合物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ ８５８−４）に置き換え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。次いでプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を補ったＰＢＳで３回洗浄した。２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中、２００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ１１００１）１００μＬを１ウェルあたりに加え、プレートを４℃で終夜インキュベートした。翌朝、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を補ったＰＢＳで３回洗浄し、蛍光シグナルをＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ＡｎｔｉＦａｄｅおよびＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｐ３６９３５）で安定化させ、蛍光顕微鏡で計数した。中和抗体力価は上記のように６０％低減エンドポイントで決定した。
抗Ｆ結合のため、融合前Ｆ（ＤＳ−ＣＡＶ１）または融合後ＦのいずれかをＯｃｔｅｔ上の抗ＨＩＳ抗体チップに結合した。特定しない限り、全ての抗Ｆ結合は抗融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１）結合を意味する。Ｈｉｓ６−タグ付け（配列番号４４２）ＲＳＶ Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１）または融合後Ｆを抗ペンタ−ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社＃１８−５１２２）に４００秒、前負荷して、ほぼ飽和に達するまで捕捉させた。次いでバイオセンサーチップをＯｃｔｅｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中で９０秒、平衡にし、希釈した血清と３００秒会合させた。会合曲線の最終応答は、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ１０．０ソフトウェアを用いて測定し、応答に希釈係数（１００または３００）を乗じて最終報告応答を得た。
抗Ｇｃｃ結合のため、Ｃ末端ＨＩＳタグを有するＧｃｃペプチドの三量体化二量体を上と同様にＯｃｔｅｔチップ上で用いた。Ｈｉｓ６−タグ付け（配列番号４４２）Ｇｃｃ（Ａ２株）六量体を抗ペンタ−ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社＃１８−５１２２）に４００秒、前負荷して、ほぼ飽和に達するまで捕捉させた。次いでバイオセンサーチップをＯｃｔｅｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中で９０秒、平衡にし、希釈した血清と３００秒会合させた。会合曲線の最終応答は、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ１０．０ソフトウェアを用いて測定し、応答に希釈係数（１００または３００）を乗じて最終報告応答を得た。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の研究のため、ＮＨＰをＲＳＶ応答について事前スクリーニングした（ベースラインは全てのアッセイについて検出限界未満であることが見出された）。ＮＨＰは上記のマウスプロトコルと同様に表示されたアジュバントとともにＲＦ８１４０ ５０μｇで免疫したが、アジュバントの体積は多かった（図９７Ｃ〜図９７Ｄおよび図１０４）。
非ヒト霊長類の研究のため、ＶＥＲＯ中和アッセイを上記のように実施した。Ｐｒｅ−Ｆ結合は下記のＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。
ＮＨＰ血清サンプルを２倍段階希釈し（初期希釈１００倍）、ブロックされたＲＳＶ可溶性Ｆ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社＃１１０４９−Ｖ０８Ｂ）でコートしたプレート（１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）上、３７℃で１時間インキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗サルＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ社 ＡＡＩ４２Ｐ、１０，０００倍希釈）を用いて３７℃、９０分でＲＳＶ Ｆ特異的ＩｇＧを検出した。３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ社）を用いてプレートを発色させ、１Ｎ塩酸（Ｐｒｏｌａｂｏ社＃３００２４２９０）で停止した。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ社）を用いて４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定した。ＲＳＶ ｓＦ特異的ＩｇＧ力価はＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアを用いて滴定曲線からＯＤ値範囲０．２〜３．０について計算した（各プレートに標準のマウス超免疫血清を加えた）。
随意のＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で表したこの参照のＩｇＧ力価はＯＤ１．０を与える希釈倍数の逆数のｌｏｇ１０に対応した。抗体検出の閾値は２０（１．３ｌｏｇ１０）ＥＵであった。グラフ化のため、全ての最終力価をｌｏｇ１０で表した。１．３ｌｏｇ１０未満のそれぞれの力価に、随意の力価１．０ｌｏｇ１０を割り付けた。
ＮＨＰ研究における細胞介在免疫を評価するため、ＩＦＮγ／ＩＬ−２ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔキット（ＦＳ−２１２２−１０、Ｍａｂｔｅｃｈ社）をメーカーの説明書に従って用いた。簡単には、ＩＰＦＬプレートの膜を３５％エタノールで前湿潤化し、捕捉抗体（抗ＩＦＮγおよび抗ＩＬ−２）を４℃で終夜コートした。
次いでプレートを、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む２００μＬ／ウェルの細胞インキュベーション培地で、３７℃で２時間ブロックした。培地を除去し、刺激剤：完全長のＦ抗原（抗原特異的刺激）、抗ＣＤ３（陽性対照）、または細胞培養培地（非刺激対照）をウェルに加えた。マカク末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍して計数した。１ウェルあたり４００，０００個の細胞を加え、５％ＣＯ２を含む加湿したインキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。
検出のため細胞を取り出し、検出抗体（コンジュゲートした抗ＩＦＮγおよび抗ＩＬ−２）を加え、室温で２時間インキュベートした。次いでフルオロフォアをコンジュゲートした試薬を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを空にし、乾燥させ、分析まで暗所に室温で保存した。陽性対照として抗ＣＤ３ｍＡｂを用い、ＰＢＭＣ百万個あたり５００超のスポット形成カウント（ＳＦＣ）の応答が全サンプルで見られ、サンプルの品質が許容できることを確認した。非刺激ウェル（細胞培養培地）で検出されたスポットをＦ抗原刺激細胞から差し引いた。
ヒト細胞（またはＢ細胞）の解析のため、Ｄａｕｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１７ Ｏｃｔ ４；３５（４１）：５４８７〜５４９４頁の参照した実験と同様の実験を実施した（図１０６）。細胞は未処理（ＰＢＳで処理）、または１００ｎｇ用量と注記したようにＲＳＶ ＦまたはＲＳＶ Ｇポリペプチドで処理した。Ｆ結合およびＧ結合の応答は、それぞれプレＦ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１）またはＧエクトドメインでコートしたビーズを用いて文献に記載されたルミネックスアッセイを用いて実施した。
ＲＦ８１１７（配列番号５１７）はＥ３２８Ｎ、Ｓ３４８Ｎ、およびＲ５０７Ｎで操作されたグリコシル化部位を含み、これらは上述のようにＤ２５またはＡＭ１４の結合を阻止しない。これらの融合前ナノ粒子が他の融合前抗原（ＤＳ−ＣＡ１）と同様の免疫応答を誘発することを実証するため、５匹の群のマウスを１μｇまたは０．１μｇの用量で、全てＡＦ０３アジュバントとともに、ｐｒｅ−Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡ１）、融合後Ｆ、またはＲＦ８１１７で、注射の間３週あけて３回免疫した。３回目の免疫の２週後に血清の中和力価をＶＥＲＯ細胞アッセイによって試験した。高用量のＲＦ８１１７は融合前対照と同様で融合後対照よりも優れた中和力価を誘発した。低用量ではＲＦ８１１７は融合前対照および融合後対照のいずれよりも高い中和力価を誘発した（図９６Ａ）。
ＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは、融合前および融合後のコンフォメーションの間で共有されたエピトープをブロックするように操作されたグリコシル化部位を有している。これらのグリカンが中和性応答を阻害していたかどうかを評価した。操作されたグリカンを有するＲＦ８１１７（配列番号５１７）を、ＲＦ８１１３（ＲＦ８１１７と同様であるが操作されたグリカンを欠除する。配列番号５１６）および融合前三量体対照（ＤＳ−ＣＡＶ１）と比較した。５匹の群のマウスを１μｇまたは０．１μｇの用量で、全てＡＦ０３アジュバントとともに、注射の間３週あけて３回免疫した。３回目の免疫の２週後に血清の中和力価をＶＥＲＯ細胞アッセイを用いて試験した。中和力価によって判断して、ＲＦ８１１３およびＲＦ８１１７の構築物の間でいずれの用量でも有意な相違はなかった。
本明細書で述べたＲＦ８１４０（配列番号５２３）のリシンおよびアルギニンのノックアウトが抗原の中和性応答を誘発する能力に影響しないことを実証するため、ＲＦ８１４０（配列番号５２５）の免疫原性を、融合後Ｆ三量体（配列番号５２４）の免疫原性とマウスで比較した（図９７Ａおよび図９７Ｂ）。低用量（０．１μｇ）ではＲＦ８１４０（配列番号５２５）は融合後三量体（配列番号５２４）より優れた中和力価を誘発する。ＲＦ８１４０（配列番号５２３）がＮＨＰで免疫応答を誘発することを実証するため、アジュバント（ＡＦ０３）の存在下または非存在下で、ＮＨＰをＲＦ８１４０（配列番号５２５）で免疫した。図９７ＣにＲＳＶ Ｆ結合応答（ＥＬＩＳＡ力価）を示す一方、図９７ＤでＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）による免疫で誘発されたＲＳＶ中和力価を比較する。アジュバントの非存在下および存在下のＲＦ８１４０（配列番号５２５）はいずれもＮＨＰで免疫応答を誘発する。
ＲＦ８１１７（配列番号５１７）およびＲＦ８１４０（配列番号５２３）の操作されたグリコシル化部位はこれらの抗原が中和性応答を誘発することを阻止しないことが示されたので、これらが融合前および融合後のコンフォメーションの間で共有された非中和性または低中和性のエピトープをブロックすることを実証することが望まれた（図９８）。Ｏｃｔｅｔで測定して、高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）で、操作されたグリコシル化なしのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３、配列番号５１６）または操作されたグリコシル化ありのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（操作されたＧｌｙ粒子、ＲＦ８１１７、配列番号５１７）による免疫で誘発された融合前Ｆ（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号５２５）に対する抗体応答（図９８Ａ）。いずれかのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰによって誘発された応答は同様であった。Ｏｃｔｅｔで測定して、高用量（１μｇ）および低用量（０．１μｇ）で、操作されたグリコシル化なしのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１３、配列番号５１６）または操作されたグリコシル化ありのＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１１７、配列番号５１７）による免疫で誘発された融合後三量体に対する抗体応答（図９８Ｂ）。ＲＦ８１１７（配列番号５１７）によって誘発された融合後Ｆ結合応答は、ＲＦ８１１３（配列番号５１６）によって誘発された応答より有意に低かった。したがって、ＲＦ８１１３とＲＦ８１１７はいずれも融合前Ｆに強力な抗体応答を誘発する一方、ＲＦ８１１７によって誘発される融合後Ｆ抗体応答は大きく抑制される。これは、共有された融合前および融合後のエピトープに対する操作されたグリカンのマッピングによる（図８８Ｂ）。
操作されたグリコシル化部位は非中和性エピトープをブロックするが、中和性抗体力価を非中和性抗体力価に迂回することをさらに実証するため、上記のデータを異なる方法で解析した（図９９Ａ〜図９９Ｃ）。マウス研究における野生型グリコシル化部位を有するＰｒｅ−Ｆ ＮＰ（Ｗｔ グリカン粒子、ＲＦ８１１３、配列番号５１６）による免疫で誘発され、ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定したＲＳＶ中和力価と、操作されたグリコシル化部位を追加したＰｒｅ−Ｆ ＮＰ（＋グリカン粒子、ＲＦ８１１７、配列番号５１７）の比較を測定し、有意な相違がなかった（図９９Ａ）。マウス研究におけるＷｔグリカン粒子（ＲＦ８１１３、配列番号５１６）による免疫と、＋グリカン粒子（ＲＦ８１１７、配列番号５１７）による免疫で誘発されたＲＳＶ融合後Ｆ三量体結合抗体応答の比較は、操作されたグリカンを有するＰｒｅ−Ｆ−ＮＰについて抑制された融合後Ｆ結合応答を示した（図９９Ｂ）。操作されたグリカンが機能的な中和性抗体応答を低減しないが、共有された融合前／融合後エピトープに対して誘発される非中和性抗体を減少させ、それにより操作されたグリカン構築物によって誘発される中和性抗体の全抗体に対する比を改善することを実証するため、Ｆ結合応答に対する中和力価の比をプロットした（図９９Ｃ）。したがって、操作されたグリカンを有するＰｒｅ−Ｆ−ＮＰはマウスの研究において結合抗体プロファイルに優れた中和性を誘発する。
フェリチンナノ粒子がＲＳＶ Ｇの中央ドメイン抗原の免疫原性を改善するために用いることができることを実証するため、Ｇｃｃペプチド（配列番号５２９）をフェリチンナノ粒子に化学的にコンジュゲートする方法を開発した。本明細書に記載したＳ１１１Ｃ変異を有するフェリチンは、ＮＨＳ基を介してＮ末端に結合したＰＥＧ４リンカーの上のマレイミド基を用いて合成されたＧｃｃペプチド（配列番号５２９）でコンジュゲートすることができる。Ｎ末端マレイミドを有するＧｃｃペプチドを合成し、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）がＨＰＬＣで精製した。マレイミド−Ｇｃｃ抗原をフェリチンＳ１１１Ｃ粒子に添加すれば、マレイミドが遊離のシステインにコンジュゲートしてＧｃｃ−ＮＰを形成し、これはクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察することができる（図１００Ａ）。コンジュゲーションの効率は典型的には５０％〜９０％であるが、Ｇｃｃペプチドフェリチンナノ粒子（１００％コンジュゲーション）のモデルを図１００Ｂに示す。
Ｇｃｃ−ＮＰがＧｃｃペプチド（配列番号５２９）より優れた免疫応答を誘発するかどうかを決定するため、１群あたり５匹のマウスをＧｃｃペプチドまたはＧｃｃ−ＮＰで免疫した（それぞれの免疫のため１．３μｇの用量をＲＩＢＩと１：１で混合）。２回目の免疫の２週後、および３回目の免疫の２週後のＧｃｃ結合応答（Ｏｃｔｅｔ）を、ナイーブなマウス血清の代表的な群と比較した（図１００Ｃ）。マウスの研究における３回目の注射後のＧｃｃペプチド（配列番号５２９）とＧｃｃ−ＮＰによる免疫で誘発された中和性応答も、ＨＡＥ中和アッセイで比較した（図１００Ｄ）。Ｇｃｃ結合応答と中和性応答の両方で判断して、Ｇｃｃ−ＮＰはＧｃｃペプチド単独より優れた免疫応答を誘発する。
ＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０）とＧｃｃ−ＮＰの共投与がいずれの抗原の免疫応答を誘発する能力に干渉しないことを実証するため、マウスをＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ単独（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）、Ｇｃｃ−ＮＰ（Ｇｃｃペプチド配列番号５２９とコンジュゲートしたフェリチン）、またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）とＧｃｃ−ＮＰとの組合せで免疫した（図１０１Ａ〜図１０１Ｃ）。全ての免疫はＡＦ０３でアジュバント化した。ＲＦ８１４０単独（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ）またはＲＦ８１４０とＧｃｃ−ＮＰ（Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ＋Ｇｃｃ−ＮＰ）で免疫したマウスは融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号５２５）に結合する抗体を生じたが、Ｇｃｃ−ＮＰで免疫したマウスはこれを生じなかった。Ｇｃｃ−ＮＰ単独（Ｇｃｃ−ＮＰ）またはＲＦ８１４０とＧｃｃ−ＮＰで免疫したマウスはＧｃｃペプチドに結合する抗体を生じたが、ＲＦ８１４０だけで免疫したマウスはこれを生じなかった。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ単独、Ｇｃｃ−ＮＰ単独、またはＰｒｅ−Ｆ−ＮＰとＧｃｃ−ＮＰの共投与で免疫した動物は全て、ＨＡＥ中和アッセイで測定して２回目の免疫および３回目の免疫の後で中和性応答を生じた。
ＲＳＶ Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰとＧｃｃ−ＮＰの共投与がいずれの抗原の中和性抗体を誘発する能力に干渉するかどうかを決定するため、ＦおよびＧに対する中和性抗体を枯渇アッセイで検討した（図１０２Ａ〜図１０２Ｂ）。Ｇｃｃ−ＮＰの添加がＰｒｅ−Ｆ−ＮＰの中和性応答を誘発する能力に干渉しないことを実証するため、上記の群についてＦ感受性ＶＥＲＯ細胞アッセイによって中和力価を測定した（図１０２Ａ）。抗原枯渇の品質を判断するため、ナイーブな動物からの血清も試験した。ＶＥＲＯアッセイにおいて、ＲＦ８１４０（配列番号５２３）単独またはＧｃｃ−ＮＰと混合したＲＦ８１４０で免疫したマウスの血清は同様の中和性応答を誘発した一方、Ｇｃｃ−ＮＰはＦ抗体感受性ＶＥＲＯアッセイにおいて中和性応答を誘発しないようであった。融合前三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号５２５）に結合する抗体がＲＦ８１４０（配列番号５２３）単独で免疫された動物またはＲＦ８１４０（配列番号５２３）とＧｃｃ−ＮＰで免疫された動物からのプール血清から枯渇している場合には、ＶＥＲＯアッセイにおいて測定可能な中和力価の低減が観察された。上記の群をＨＡＥ細胞アッセイにおける中和力価について測定すると、全ての免疫群はＦおよびＧ感受性アッセイにおいて中和性応答を生じることが観察された（図１０２Ｂ）。ＲＦ８１４０（配列番号５２３）単独で免疫された動物からのプール血清はＨＡＥアッセイにおいて融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号５２５）で枯渇された可能性がある中和性応答を誘発した。Ｇｃｃ−ＮＰ単独で免疫された動物からのプール血清はＨＡＥアッセイにおいてＧエクトドメイン（配列番号５２８）で枯渇された可能性がある中和性応答を誘発した。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）とＧｃｃ−ＮＰの両方で免疫された動物からのプール血清はＨＡＥアッセイにおいて、ＤＳ−ＣＡＶ１（配列番号５２５）によって完全には枯渇しないが、ＤＳ−ＣＡＶ１、次いでＧエクトドメイン（配列番号５２８）による引き続く枯渇によって完全に枯渇する中和性応答を誘発した。併せて、これらのデータは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰの共投与が、いずれの抗原のそれぞれ融合前のＦまたはＧに対する中和性抗体を誘発する能力にも干渉しないことを示唆している。
ＲＦ８１１７（配列番号５１７）またはＲＦ８１４０（配列番号５２３）のアジュバント化の効果を実証するため、ＡＦ０３、ＳＰＡ０９、またはアラムと混合したこれらの構築物をマウスに投与した。図１０３Ａではアジュバントと混合した抗原１０μｇでマウスを免疫し、図１０３Ｂではアジュバントと混合した抗原１μｇでマウスを免疫した。図１０３Ａでは３回目の免疫時点の２週後にＶＥＲＯ細胞アッセイによって中和力価を測定した。非アジュバント化（Ｎｏ Ａｄｊ）、アラムでアジュバント化、またはＡＦ０３でアジュバント化したＲＦ８１１７（配列番号５１７）で免疫したマウスからの血清を示す。図１０３Ｂでは、ＡＦ０３でアジュバント化したＲＦ８１１７（配列番号５１７）、ＳＰＡ０９でアジュバント化したＲＦ８１１７（配列番号５１７）、またはＡＦ０３でアジュバント化したＲＦ８１４０によって免疫したマウスからの血清についてのＶＥＲＯ細胞アッセイによって中和力価を測定した。ＲＦ８１１７（配列番号５１７）またはＲＦ８１４０（配列番号５２３）のいずれについても全ての場合に、ナイーブマウスのアジュバント群は非アジュバント群より高い中和力価を誘発した。ＡＦ０３と混合したＲＦ８１１７（配列番号５１７）またはＲＦ８１４０（配列番号５２３）で免疫したマウスは同様の中和性応答を誘発し、ＲＦ８１４０（配列番号５２３）に付加されたリシンおよびアルギニンの変異はＰｒｅ−Ｆ−ＮＰの中和性応答を誘発する能力に干渉しないことが示唆された。
ＡＦ０３およびＳＰＡ０９のアジュバント効果をさらに検討するため、非アジュバント化、ＡＦ０３でアジュバント化、または２種の用量のＳＰＡ０９でアジュバント化したＲＦ８１４０で非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を免疫した（図１０４Ａ）。ＮＨＰは０日および２９日に指示されたアジュバントと混合した抗原５０μｇで免疫し、指示された時点でＥＬＩＳＡまたはＶＥＲＯ中和性応答によって免疫応答を測定した。融合前Ｆ三量体ＥＬＩＳＡ応答は、非アジュバント化（Ｎｏ Ａｄｊ）、ＡＦ０３でアジュバント化、またはＳＰＡ０９でアジュバント化したＲＦ８１４０で免疫した後のＮＨＰ血清で測定した（ＳＰＡ０９の５００μｇおよび２０００μｇの用量を用いた）。全ての時点で、ＡＦ０３またはＳＰＡ０９によるアジュバント化により、優れた中和性応答が誘発された。上記のＮＨＰ群の血清の中和力価も、ＶＥＲＯ細胞アッセイによって測定した（図１０４Ｂ）。全ての例では、アジュバントを伴うＲＦ８１４０による免疫は、全ての時点において非アジュバント化群より高い中和力価を誘発した。
ＲＦ８１４０（配列番号５２３）のＴＬＲ７／８アゴニストＳＭ７／８またはＴＬＲ９アゴニストＣｐＧへの直接コンジュゲーションの効果を試験した。抗原を小分子のＳＭ７／８またはＣｐＧでコンジュゲートし、マウスに１０μｇ投与した。ＲＦ８１４０はそのフェリチン配列中に、表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異（Ｋ７９Ｃ）を含んでおり、これをクリックケミストリーによってコンジュゲーションに用いることができる。比較のため、図１０５に示すように、高用量または低用量（コンジュゲートしない）で小分子と混合することによって、非アジュバント化（Ｎｏ−ａｄｊ）またはアジュバント化したＲＦ８１４０をマウスに投与した。２回目および３回目の免疫の後の動物からの血清を融合前Ｆ三量体結合について試験した。
図１０５Ａでは、融合前Ｆ三量体結合応答を、ナイーブなマウス、非アジュバント化ＲＦ８１４０（配列番号５２３）で免疫したマウス、ＳＭ７／８アジュバントとコンジュゲートしたＲＦ８１４０（配列番号５２３）、１３０ｎｇのＳＭ７／８でアジュバント化したＲＦ８１４０（配列番号５２３）、または２０μｇのＳＭ７／８でアジュバント化したＲＦ８１４０（配列番号５２３）で免疫したマウスのいずれかの血清中で測定した。ＳＭ７／８にコンジュゲートしたＲＦ８１４０（配列番号５２３）は、非アジュバント群またはＳＭ７／８アジュバント群より高い融合前Ｆ三量体結合力価を誘発した。
図１０５Ｂでは、融合前Ｆ三量体結合応答を、ナイーブなマウス、非アジュバント化ＲＦ８１４０（配列番号５２３）で免疫したマウス、ＣｐＧアジュバントとコンジュゲートしたＲＦ８１４０（配列番号５２３）、６８０ｎｇのＣｐＧでアジュバント化したＲＦ８１４０（配列番号５２３）、または２０μｇのＣｐＧでアジュバント化したＲＦ８１４０（配列番号５２３）で免疫したマウスのいずれかの血清中で測定した。ＳＭ７／８にコンジュゲートしたＲＦ８１４０（配列番号５２３）は、非アジュバント群またはＳＭ７／８アジュバント群より高い融合前Ｆ三量体結合力価を誘発した。
Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ抗原およびＧｃｃ−ＮＰ抗原のヒト細胞における応答を誘発する能力を実証するため、ＭＩＭＩＣプラットフォームでの実験を実施した（図１０６Ａ〜図１０６Ｄ）。ＭＩＭＩＣプラットフォームはチャレンジに際して先天的なまたは後天的な抗原特異的応答を迅速かつ再現性よく産生することができる自己ヒト免疫細胞のみからなっている。以前の研究により、ＨＢＶ、破傷風トキソイド、モノクローナル抗体、ＹＦ−ＶＡＸ、およびインフルエンザＢ細胞応答等の多様な標的に対してｉｎ ｖｉｖｏの免疫プロファイルを反復するＭＩＭＩＣシステムの能力が実証されている。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ ＲＦ８１４０（配列番号５２３）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号５２４）による処置によって誘発されるＲＳＶ融合前Ｆ三量体結合抗体応答をヒトＢ細胞で比較した。代表的なベースライン応答を比較のために示す（処置なし）（図１０６Ａ）。ヒトＢ細胞において、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）、対、融合後Ｆ（配列番号５２４）による処置によって誘発された融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号５２５）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号５２４）に対する測定された結合応答の比を図１０６Ｃに示す。異なるＦ抗原による処置によって誘発されたＭＩＭＩＣからの抗体をＶＥＲＯ細胞アッセイを用いて測定した（図１０６Ｃ）。ヒトＢ細胞において、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号５２３）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号５２４）による処理によって誘発された中和力価を非処理群と比較し、ＲＦ８１４０（配列番号５２３）がヒト細胞において優れた中和性応答を誘発することを示した。
ＲＳＶ感染またはＦサブユニットワクチンの候補に対する抗体応答の大きさを、ＭＩＭＩＣ研究で検討したヒト対象の血清状態に基づいて決定した。これは線形回帰解析によって評価した。以前から存在する抗ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧの高い循環力価を有するドナーは、ＲＳＶ処置の後（図１０６Ｅ、ｐ＝０．００４１）およびｐｏｓｔ−Ｆプライミングの後（図１０６Ｆ、ｐ＝０．００１９）に、有意により高い抗ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧを生成した。相関は統計的有意性に達しなかったが、ｐｒｅ−Ｆはまた、誘起された抗体のレベルと以前から存在する抗体のレベルとの間に関連性を示した。他の処置と異なり、ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰは以前から存在する抗ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧが高いドナーからと同様に、以前から存在する抗体が低いドナーから比較的高いレベルの抗ｐｒｅ−Ｆ ＩｇＧを誘起したことは注目に値する（図１０６Ｆ）。これは、ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰが以前から存在するＩｇＧのレベルが低いドナーからでも効果的に抗体応答を取り戻す（または強化する）ことができることを示している。
Ｇｃｃ−ＮＰがＧｃｃペプチド（配列番号５２９）単独より優れたＧ抗体応答を誘発することを実証するため、ヒト細胞をＧｃｃペプチド単独（配列番号５２９）またはヒトＢ細胞中でナノ粒子にコンジュゲートしたＧｃｃペプチド（Ｇｃｃ−ＮＰ）で処理した。Ｇｃｃ−ＮＰは優れたＧ結合抗体応答を誘発した（図１０６Ｇ）。組み合わせて、これらのデータは、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰがヒトの免疫において免疫応答を誘発することを示唆している。
ＲＳＶ Ｇｃｃ−フェリチンナノ粒子に対する免疫応答のｉｎ ｖｉｖｏ特徴解析
ＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰを上述のように調製した。マウスにおけるＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰに対するｉｎ ｖｉｖｏ応答を評価するため、雌ＢＡＬＢｃマウスを０週、３週、および６週で、高用量（５μｇ）または低用量（０．５μｇ）の抗原を用い、指定された用量のＲＳＶ抗原で筋肉内免疫した。他に注記しなければ、ＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰをベッドサイド混合戦略によりＡＦ０３でアジュバント化した。すなわち、それぞれの後ろ足に５０μｌを注射する直前に、タンパク質溶液５０μｌをＳａｎｏｆｉ社のアジュバントＡＦ０３（スクアレン系エマルジョン、Ｋｌｕｃｋｅｒら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０１２ Ｄｅｃ；１０１（１２）：４４９０〜５００頁参照）５０μｌと混合した。免疫による有害な影響は観察されなかった。最初の免疫の１日前、およびそれぞれの注射の少なくとも２週後（すなわち、２週、５週、および８週）に血液を採取した。他に特定しなければ、示したデータは３回目の注射の２週後（８週、２ｗｐ３とも注記する）のものである。典型的には、血清は免疫前の動物（ナイーブと注記）、２回目の注射の２週後（ポスト２または２ｗｐ２）、または３回目の注射の２週後（ポスト３ｒｄまたは２ｗｐ３）から分析した。
ＨＡＥ中和アッセイのため、血清を５６℃で３０分、熱不活化した。不活化血清の４倍連続希釈系列を、ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ １０Ｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５００３）および１％の抗生−抗有糸分裂剤を補ったＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ（商標）−ＡＬＩ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０５００２）（以下、培地）中で作成した。ＲＳＶウイルスストックを希釈血清と１：１で合わせ、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いでウイルス−血清混合物を、完全に分化したＨＡＥ細胞を含む２４ウェルのプレートに１ウェルあたり５０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、接種材料を除去し、ウェルを培地で２回洗浄して未結合のウイルスを除去し、３７℃、５％ＣＯ２でさらに２０時間インキュベートした。ｍＫａｔｅ（ＴａｇＦＰ６３５）レポーターを発現するＲＳＶに感染した培養における感染事象を、蛍光顕微鏡で計数した。
ｍＫａｔｅレポーターを発現しないＲＳＶによる感染を検出するため（ＲＳＶ Ｂ株中和）、偽重層上皮を培地で十分に洗浄して粘液を除去し、次いで４％パラホルムアルデヒドで室温、３０分固定し、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３０分透過性にし、２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで３７℃、１時間ブロックした。ブロッキング液を１ウェルあたり１００μＬの２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭで２００倍に希釈したマウス抗ＲＳＶモノクローナル抗体混合物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ ８５８−４）に置き換え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。次いでプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を補ったＰＢＳで３回洗浄した。２％のＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中、２００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ１１００１）１００μＬを１ウェルあたりに加え、プレートを４℃で終夜インキュベートした。翌朝、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を補ったＰＢＳで３回洗浄し、蛍光シグナルをＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ＡｎｔｉＦａｄｅおよびＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｐ３６９３５）で安定化させ、蛍光顕微鏡で計数した。中和抗体力価は６０％低減エンドポイントで決定した。
ＲＳＶ Ｇ抗原による中和性応答の誘発が高い多価性によって改善されることを実証するため、ＲＳＶ Ｆ抗原によってマウスを免疫した。全ての免疫はＡＦ０３によってアジュバント化した。ＡＦ０３とともに処方したＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰでマウスを免疫し、２回目の注射の２週後および３回目の注射の２週後に中和力価を測定した（図１０７Ａ〜図１０７Ｃ）。ＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰは、ナイーブなマウス血清に関連する中和性応答を誘発した。２回目の免疫の２週後（図１０７Ａ）および３回目の免疫の２週後（図１０７Ｂ）に、Ａ２株からのＧｃｃを含むＧｃｃ−ＮＰで免疫したマウスはＲＳＶ Ａ株に対する中和性応答を示した。３回目の注射の２週後に、Ｇｃｃ−ＮＰはＲＳＶ Ｂ１株に対する中和性応答をも誘発した（図１０７Ｃ）。
抗Ｇｃｃ結合のため、Ｃ末端ＨＩＳタグを有するＧｃｃペプチドの三量体化された二量体をＯｃｔｅｔチップ上で用いた。Ｈｉｓ６タグ付けしたＧｃｃ（Ａ２株）六量体またはＨｉｓ６タグ付けしたＧｃｃ（Ｂ１株）六量体を抗ペンタ−ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社＃１８−５１２２）に４００秒、前負荷して、ほぼ飽和に達するまで捕捉させた。次いでバイオセンサーチップをＯｃｔｅｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中で９０秒、平衡にし、希釈した血清と３００秒会合させた。会合曲線の最終応答は、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ１０．０ソフトウェアを用いて測定し、応答に希釈係数（１００または３００）を乗じて最終報告応答を得た。
ＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰがＧｃｃ結合免疫応答を誘発するかどうかを決定するため、上記の免疫による血清のＧｃｃ Ａ２六量体またはＧｃｃ Ｂ１六量体に結合する能力について試験した。高用量（図１０８Ａおよび図１０９Ａ）および低用量（図１０８Ｂおよび図１０９Ｂ）におけるＧｃｃ結合応答を２回目の免疫の２週後および３回目の免疫の２週後に試験した。Ａ２株（図１０８Ａ〜図１０８Ｂ）およびＢ１株（図１０９Ａ〜図１０９Ｂ）のいずれについても、ＲＳＶ Ｇｃｃ−ＮＰはナイーブなマウス血清に関連する結合応答を誘発した。
ヒト細胞におけるＰｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰへの応答
Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰのヒト細胞における応答を誘発する能力を実証するため、ＭＩＭＩＣプラットフォームでの実験を実施した。ＭＩＭＩＣプラットフォームはチャレンジに際して先天的なおよび後天的な抗原特異的応答を迅速かつ再現性よく産生することができる自己ヒト免疫細胞のみからなっている。以前の研究により、ＨＢＶ、破傷風トキソイド、モノクローナル抗体、ＹＦ−ＶＡＸ、およびインフルエンザＢ細胞応答等の多様な標的に対してｉｎ ｖｉｖｏの免疫プロファイルを反復するＭＩＭＩＣシステムの能力が実証されている。Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ ＲＦ８１４０（配列番号２３）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）による処置によって誘発されるＲＳＶ融合前Ｆ三量体結合抗体応答をヒトＢ細胞で比較し、代表的なベースライン応答と比較した。ヒトＢ細胞において、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）、対、融合後Ｆ（配列番号２４）による処置によって誘発された融合前Ｆ三量体（ＤＳ−ＣＡＶ１、配列番号２５）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）に対する測定された結合応答の比を決定した。異なるＦ抗原による処置によって誘発されたＭＩＭＩＣからの抗体をＶＥＲＯ細胞アッセイを用いて測定した。ヒトＢ細胞において、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰ（ＲＦ８１４０、配列番号２３）、対、融合後Ｆ三量体（配列番号２４）による処理によって誘発された中和力価を非処理群と比較し、ＲＦ８１４０（配列番号２３）がヒト細胞において優れた中和性応答を誘発することを示す。Ｇｃｃ−ＮＰがＧｃｃペプチド（配列番号２９）単独より優れたＧ抗体応答を誘発することを実証するため、ヒト細胞をＧｃｃペプチド単独（配列番号２９）またはヒトＢ細胞中でナノ粒子にコンジュゲートしたＧｃｃペプチド（Ｇｃｃ−ＮＰ）で処置した。Ｇｃｃ−ＮＰは優れたＧ結合抗体応答を誘発した。したがって、Ｐｒｅ−Ｆ−ＮＰおよびＧｃｃ−ＮＰはヒトの免疫において免疫応答を誘発した。

Claims (27)

  1. 表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含むフェリチンタンパク質。
  2. システインを含むＮまたはＣ末端リンカーを含むフェリチンタンパク質。
  3. 表面に露出したアミノ酸を介してフェリチンタンパク質に連結した１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分を含むフェリチンタンパク質。
  4. 非フェリチンポリペプチドをさらに含む抗原性フェリチンタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  5. 抗原性フェリチンタンパク質であって、（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異およびシステインに連結した免疫刺激性部分；ならびに（ｉｉ）非フェリチンポリペプチドを含む前記抗原性フェリチンタンパク質。
  6. 抗原性フェリチンタンパク質であって、（ｉ）表面に露出したシステイン、（ｉｉ）該フェリチンタンパク質のＮ末端側のペプチドリンカー、および（ｉｉｉ）該ペプチドリンカーのＮ末端側の非フェリチンポリペプチドを含む前記抗原性フェリチンタンパク質。
  7. 表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  8. 内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  9. 内部システインは、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にある、請求項８に記載のフェリチンタンパク質。
  10. 抗原性フェリチンタンパク質であって：
    ａ．表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異およびシステインに連結した免疫刺激性部分；
    ｂ．Ｈ．ピロリフェリチンの３１位の内部システイン、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの３１位と類似の位置の内部システインを、非システインアミノ酸に置き換える変異
    ｃ．表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異；ならびに
    ｄ．非フェリチンポリペプチド
    を含む前記抗原性フェリチンタンパク質。
  11. 非システインアミノ酸はセリンである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  12. アスパラギンはＨ．ピロリフェリチンの１９位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの類似の位置にある、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  13. フェリチンは、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異の１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つまたはそれ以上の対応する変異を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  14. 非フェリチンポリペプチドは、インフルエンザ、エプスタイン−バーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、またはボレリア由来のポリペプチドである、請求項４〜１３のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  15. 非フェリチンポリペプチドはＲＳＶ Ｇポリペプチドを含み、場合により該ＲＳＶ Ｇポリペプチドは、Ｇポリペプチド中央保存領域を含む、請求項１４に記載のフェリチンタンパク質。
  16. フェリチンと非フェリチンポリペプチドとの間にペプチドリンカーをさらに含む、請求項４〜５または７〜１５のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  17. システインに連結され、水素結合またはイオン結合することが可能な部分を含む免疫刺激性部分を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  18. ＴＬＲ２、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、またはＳＴＩＮＧのアゴニストである免疫刺激性部分を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  19. 配列番号２０１〜２０７または２１１〜２１５のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質。
  20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質を含むフェリチン粒子。
  21. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質またはフェリチン粒子、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
  22. 第１のフェリチンタンパク質および第２のフェリチンタンパク質を含む組成物であって、該第１のフェリチンタンパク質はフェリチン重鎖および第１の非フェリチンポリペプチドを含み、該第２のフェリチンタンパク質はフェリチン軽鎖および第２の非フェリチンポリペプチドを含み、該第１および第２の非フェリチンポリペプチドは異なり、場合によりフェリチン粒子が該第１のフェリチンタンパク質および該第２のフェリチンタンパク質を含む、前記組成物。
  23. アジュバントをさらに含む、請求項２１または２２に記載の組成物。
  24. 対象のワクチン接種に使用するための、請求項４〜２３のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質、フェリチン粒子、または組成物。
  25. 対象にワクチン接種する方法であって、請求項４〜２３のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質、フェリチン粒子、または組成物を対象に投与する工程を含む前記方法。
  26. 対象はヒトである、請求項２４に記載のフェリチンタンパク質、フェリチン粒子、もしくは組成物、または請求項２５に記載の方法。
  27. 場合により、核酸はｍＲＮＡである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のフェリチンタンパク質をコードする核酸。
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