CN117177774A - Sars-cov-2受体结合结构域与载体蛋白的共价缀合物以及包含它们的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术，更具体地说，涉及人健康领域。本发明特别地描述了与载体蛋白共价缀合的SARS‑CoV‑2受体结合结构域的缀合物，用于获得它们的方法，以及包含它们的疫苗组合物。本发明中描述的疫苗组合物可用于预防SARS‑CoV‑2感染，因为它们诱导强的中和性抗体应答。

Description

SARS-COV-2受体结合结构域与载体蛋白的共价缀合物以及包 含它们的疫苗组合物
技术领域
本发明涉及生物技术，更具体地说，涉及人健康领域。本发明具体地描述了SARS-CoV-2受体结合结构域与载体蛋白的共价缀合物，用于获得它们的方法，以及包含它们的疫苗组合物。
背景技术
COVID-19是一种非常新的疾病，于2019年12月发现，当时开始报告了不明病因的肺炎严重病例。由SARS-CoV-2病毒引起的疾病的特征在于其传播迅速以及在有症状患者中出现诸如发热、咳嗽、流鼻涕、喉咙痛和呼吸困难等症状，这样的患者占不到50％。其余感染该疾病的人无症状，这是病毒传播的关键因素，代表了在其控制方面的流行病学挑战。
其它类似于SARS-CoV-2的冠状病毒(称为MERS和SARS)在过去数十年中已经引起了类似的流行病。SARS与SARS-CoV-2显示出更大的同源性，它们之间的主要相似之处之一是两种病毒都使用ACE2蛋白作为受体来进入人细胞。因此，在SARS和SARS-CoV-2中，S1病毒蛋白的受体结合结构域(RBD)与ACE2(血管紧张素转化酶2)蛋白之间的相互作用是人感染该病毒的决定性因素。(Walls A等人(2020)Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058)。SARS-CoV-2的S蛋白的RBD是大约195个氨基酸的片段(序列333-257)，其包含受体结合基元(RBM)，是病毒与ACE2受体相互作用的区域。RBD包含4个分子内二硫桥，位于半胱氨酸Cys336-Cys361之间、Cys379-Cys432之间、Cys391-Cys525之间和Cys480-Cys488之间，这有助于产生非常紧密和稳定的结构(Lan等人(2020),Nature第581卷：215-230)。
RBD是小分子，其分子量范围为25-27kDa，这取决于表达宿主和掺入的主要与天冬酰胺N331和N343连接的碳水化合物(Chen等人，2017,Journal of PharmaceuticalSciences 106:1961-1970)。
SARS-Cov-2疫苗的策略包括灭活病毒、含有整合到腺病毒中或以信使RNA形式存在的病毒遗传物质的遗传构建体，以及基于在经遗传修饰的宿主中表达的病毒蛋白质亚单位或片段的疫苗。在这种情况下，优选的分子是S蛋白(也称为刺突蛋白)或其结构的片段，即RBD。它们的主要有利方面是它们的安全性，因为这种策略更接近于正在使用的许多疫苗的策略，然而，其主要挑战是实现足以防止病毒感染的免疫应答。
到目前为止(2020年9月21日)，有149种SARS-CoV-2候选疫苗接受临床前评估，38种处于临床试验中。在这38种疫苗中，至少有13种候选疫苗(5种在临床试验中，8种在临床前研究中)以RBD为特异性抗原(COVID-19候选疫苗DRAFT概况(DRAFT landscape)-2020年9月21日)。
这些疫苗包括以每剂高达50微克的高浓度吸附在氧化铝上的RBD(万维网，网址：clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04466085？term＝NCT04466085&draw＝2&rank＝1，于2020年8月17日咨询的)。其它候选疫苗使用在杆状病毒和昆虫细胞中表达的、经纯化并且使用氢氧化铝作为佐剂配制的包含氨基酸残基319-545的RBD蛋白。(Yang J等人(2020)Nature第586卷：572-592)。以其单体形式存在的RBD还被用于动物实验，其被吸附在氧化铝上，证明其可诱导中和抗体而不产生抗体依赖性增强作用(Zang J.等人(2020)bioRxiv2020.05.21.107565)。
上述技术方案中没有一个接近本发明。本发明的发明者利用RBD结构来获得与载体蛋白共价缀合的RBD。这些缀合物可从包含333-527序列(SEQ ID NO 2)或其延伸的任何片段获得。
令人惊讶的是，在其动力学和其病毒中和能力方面，针对这些缀合物引发的免疫应答强于非缀合的单体RBD引发的免疫应答(在使用SARS-CoV-2的病毒中和测定和ACE2-受体结合抑制测定中测定的)。这些是SARS-CoV-2引起的大流行情景中的关键特征。本发明中描述的疫苗组合物在免疫后第7天引发抗RBD IgG抗体应答，其中细胞反应极化为Th1模式，特征在于IFNγ的诱导；因此，在这种情况下，预计不会出现针对诱导Th2模式的冠状病毒疫苗所报道的免疫病理学效应。
冠状病毒感染后获得的免疫的一个弱点是其不会持续很长时间。本发明描述的疫苗组合物引发CD8+、CD4+和T细胞记忆反应，特别是对产生IFNγ的RBD特异的淋巴细胞。
值得注意的是，在本发明之前，没有任何技术方案或科学出版物描述了通过化学方法获得的RBD与载体蛋白的共价缀合物，也没有基于此类缀合物的疫苗组合物。
发明内容
本发明的一个实施方案在于包含SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)和载体蛋白的共价缀合物。这些缀合物的特征尤其在于RBD-载体蛋白的比例优选在每个载体蛋白1-8个RBD单位的摩尔范围内，尽管也可获得具有直至13个RBD单位的缀合物。载体蛋白可选自包含破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉毒素突变体CRM197的组。通过与破伤风类毒素缀合实现的免疫效果也可通过与其它载体蛋白的缀合来产生，因此本发明的效果不限于破伤风类毒素的使用。
用于缀合的RBD抗原可具有任何下列氨基酸序列，即319-541(SEQ ID NO:1)、333-527(SEQ ID NO:2)、328-533(SEQ ID NO:3)。特别是SEQ ID No:1也可以以二聚体形式存在。可在选自包含以下的组的宿主中产生所述RBD抗原：哺乳动物细胞(优选非人)、昆虫细胞、细菌和酵母。
本发明的另一个实施方案包括疫苗组合物，其通过由SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)和载体蛋白组成的共价缀合物诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。这些疫苗组合物还可包括佐剂，其选自包含诸如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙等的任何无机盐的组。所述疫苗组合物的缀合物具有每剂1-30μg的RBD浓度范围，而佐剂在每剂200-1500μg的浓度范围内。这些组合物还包含适当的药物赋形剂。
本发明的另一个实施方案涉及用于获得共价缀合物的方法，其包括以下步骤：A)载体蛋白的官能化，用于引入亲硫基团；B)载体蛋白与RBD的共价缀合，以及C)纯化。该方法还可以包括在步骤A之前原位还原RBD二聚体的步骤，其中SEQ ID NO:1呈其二聚体形式(图1)。此外，该方法还可在步骤A之前包括RBD N-末端硫醇化的另一个步骤，其中使用SEQ IDNO:1-3(图2)。在该方法的步骤A中引入的亲硫基团选自包含以下的组：马来酰亚胺类、溴乙酰基类、乙烯基砜类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、丙烯腈类和甲基丙烯酸酯类。
本发明的另一个实施方案涉及上述疫苗组合物用于预防SARS-CoV-2病毒感染的用途。其特别地包括当需要中和性抗体应答时使用本文所述的疫苗组合物。
最后，本发明的另一个实施方案包括使用上述疫苗组合物诱导抗SARS-CoV-2的早期IgG抗体应答，采用肌内免疫方案(包括1-3次注射，范围为1-30μg RBD)。
现在，本发明在第一方面提供了包含SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)和载体蛋白的共价缀合物。
在本发明的共价缀合物的一个优选实施方案中，所述载体蛋白选自包含以下的组：破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉类毒素突变体CRM197(图3和图4)。
在本发明的共价缀合物的一个优选实施方案中，RBD-载体蛋白的摩尔比在1至8RBD/载体蛋白的范围内(图5)。
在本发明的共价缀合物的一个优选实施方案中，RBD选自包含以下的组：SEQ IDNO:1、2和3.
在本发明的共价缀合物的一个优选实施方案中，SEQ ID NO:1的RBD以其二聚体形式使用。
在本发明的共价缀合物的一个优选实施方案中，在选自包含以下的组的宿主中产生RBD：哺乳动物细胞(优选非人)、昆虫细胞、细菌和酵母。
另一方面，本发明提供了包含如上所述的本发明的共价缀合物的疫苗组合物。该疫苗组合物优选用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答。
在本发明的疫苗组合物的一个优选实施方案中，所述疫苗组合物还包含选自包含以下或由以下组成的组的佐剂：氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。
在本发明的疫苗组合物的一个优选实施方案中，所述缀合物的浓度范围为每剂1-30μg RBD。
在本发明的疫苗组合物的一个优选实施方案中，佐剂的浓度范围为每剂200-1500μg。
在本发明的疫苗组合物的一个优选实施方案中，所述疫苗组合物还包括合适的药物赋形剂。
另一方面，本发明提供了制备如上所述的本发明的共价缀合物的方法，该方法包括以下步骤：提供载体蛋白和RBD，其中RBD可呈单体形式或二聚体形式，通过引入亲硫基团使载体蛋白官能化，将载体蛋白与RBD共价缀合，以及纯化获得的缀合物。
在制备本发明的共价缀合物的方法的一个优选实施方案中，其中使用RBD二聚体，该方法包括还原RBD二聚体的额外步骤，优选在其与载体蛋白缀合之前原位还原，优选在通过引入亲硫基团使载体蛋白官能化之前还原。
在制备本发明的共价缀合物的方法的一个优选实施方案中，可使用SEQ ID NO:1-3中任一种的RBD，最优选使用SEQ ID NO:1作为RBD。
在制备本发明的共价缀合物的方法的一个优选实施方案中，引入的亲硫基团选自包含以下或由以下组成的组：马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜、丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯腈和甲基丙烯酸酯。
在另一个方面，本发明提供了通过上述制备本发明的共价缀合物的方法获得的结合物。
在另一个方面，本发明提供了本发明的疫苗组合物用于预防SARS-CoV-2病毒感染，特别是预防由SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病的用途。
在另一个方面，本发明提供了预防由SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的如上所述的本发明的疫苗组合物。
优选地，在根据本发明的预防感染的用途或预防疾病的方法中，所述用途或方法用于在接受两剂疫苗组合物或2次疫苗组合物接种后，在需要中和性抗体应答的受试者中预防SARS-CoV-2病毒感染或SARS-CoV-2病毒引起的疾病。
在根据本发明的预防感染或疾病的用途和方法的优选实施方案中，所述用途或方法是通过应用1至3剂的肌内接种方案来诱导SARS-CoV-2抗体应答。优选地，在根据本发明的一个预定疫苗接种剂中，一剂中RBD的量为1至30μg。
附图说明
图1.SARS-Cov-2受体结合结构域(RBD)与用亲硫性的马来酰亚胺基团活化的破伤风类毒素(TT)的位点选择性缀合方案。缀合发生在Cys538的游离巯基处，其在空间上远离受体结合基序(以红色表示)，因此，其不影响RBD的抗原性。
图2.SARS-Cov-2受体结合结构域(RBD)与用亲硫性的马来酰亚胺基团活化的破伤风类毒素(TT)的N-末端选择性缀合方案。RBD的N-末端硫醇化用新型(内部开发的)巯基乙酰基-吡啶基甲醛试剂进行，该试剂选择性修饰N-末端氨基。N-末端残基在空间上远离受体结合基序(用红色表示)，因此，其不影响RBD的抗原性。
图3.基于使用A)破伤风类毒素、B)白喉类毒素或C)交叉反应性物质197(CRM197)作为载体蛋白在Cys538处缀合的RBD(319-541)的RBD缀合物的图。
图4.基于使用A)破伤风类毒素、B)白喉类毒素或C)交叉反应物质197(CRM197)作为载体蛋白在N末端缀合的RBD(328-533)的RBD缀合物的图。
图5.每单位破伤风类毒素平均带有2个、4个和6个单位的RBD的代表性RBD-TT结合物。还获得了平均带有8个、10个或13个RBD单位的缀合物。
图6.HPSEC Superdex 75色谱图，其显示了将RBD二聚体(SEQ ID NO:1)还原为RBD单体，并与RBD单体的参考谱进行了比较。
图7.RBD的天然形式和源自RBD二聚体(SEQ ID NO:1)的还原的RBD的10％ SDS-PAGE。R：将样品在还原性样品缓冲液中孵育，然后施加于凝胶。NR：将样品施加在非还原性样品缓冲液中。
图8.与天然单体和二聚体的抗原性相比，通过用三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原RBD二聚体(SEQ ID NO:1)获得的单体的抗原性。
图9.与破伤风类毒素的色谱图相比，纯化的RBD-TT 2和3缀合物(实施例2)的HPSEC Superdex 200色谱图。
图10.通过ELISA(A)和使用抗RBD多克隆抗体的斑点印迹(B)分析的ACE-2受体对RBD(319-541)-TT缀合物的识别。
图11.与在Al(OH)3中配制的RBD相比，在用于Al(OH)3中配制的或不在Al(OH)3中配制的RBD-TT缀合物于第0天和第14天接种后诱导的抗RBD IgG抗体的动力学。星号表示各组之间在每个时间上的显著差异(p≤0.05)。
图12.在用在Al(OH)3中配制或不在Al(OH)3中配制的RBD-TT缀合物于第0天和第14天接种后诱导的抗TT IgG抗体的动力学。
图13.与在Al(OH)3中配制的RBD相比，在ELISA中用在小鼠(用在Al(OH)3中配制的或不在Al(OH)3中配制的RBD-TT缀合物的疫苗组合物在第0天和第14天免疫的)中于第28天诱导的抗体稀释液测定的RBD-ACE2结合的抑制。
图14.与在Al(OH)3中配制的RBD相比，来自用两剂在Al(OH)3中配制或不在Al(OH)3中配制的RBD-TT缀合物免疫的小鼠的血清在第28天的抗SARS-CoV-2中和活性。星号表示显著差异(p<0.05)。
图15.如通过定量ELISA测定的，用在Al(OH)3中配制的RBD-TT或用安慰剂(Al(OH)3)免疫的小鼠的脾细胞中IFNγ、IL4和IL17A的产生。根据Tukey检验，星号表示显著差异(p<0.05)。
图16.在用两剂在Al(OH)3中配制的RBD-TT缀合物免疫的小鼠中诱导的记忆细胞反应。(A)CD8+CD44++T淋巴细胞，(B)产生IFNγ的CD8 T淋巴细胞，(C)CD4+CD44++记忆T淋巴细胞和(D)产生IFNγ的CD4 T淋巴细胞。RBD/RBD：接受两剂(T0，T14)RBD-TT并且提取的淋巴细胞在体外用RBD刺激的组。明矾/RBD：接受两剂(T0，T14)明矾并且提取的淋巴细胞在体外用RBD刺激的组。
图17.HPSEC Superdex 75色谱图，其显示了与RBD单体的参考图谱相比，RBD单体(SEQ ID NO:3)的N-末端残基的选择性硫醇化。
图18.(A)HPSEC Superdex 75色谱图，其显示了在N-末端残基处硫醇化的RBD单体(SEQ ID NO:3)的缀合物(上图)、RBD-TT 4的16小时反应混合物(中图)和RBD-TT 4纯化的缀合物(下图)。(B)与破伤风类毒素相比，RBD-TT 4纯化的缀合物的HPSEC Superdex 200色谱图。
图19.(A)通过ELISA试验和(B)通过抗RBD多克隆抗体(通过斑点印迹测试的)分析的ACE-2受体对RBD(328-533)-TT缀合物的识别。
图20.在II期临床试验(19-80y/o)和I/II期临床试验(3-18y/o)中，在用缀合疫苗在第0天和第28天免疫后14天(T42)诱导的抗RBD IgG抗体。PCP：儿科康复期患者的血清的小组。
图21.来自接种或未接种的受试者的唾液样品的抗RBD IgG
具体实施方式
如本文中所用，术语“SARS-CoV-2”是指严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒2(SARS-CoV-2)，冠状病毒疾病2019(COVID-19)的致病病毒。SARS-CoV-2阳性病例的检测可以基于通过NAAT诸如实时逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)对病毒RNA序列的检测，必要时通过核酸测序进行确认。目前靶向的病毒基因包括N、E、S和RdRP基因。术语“SARS-CoV-2病”和“COVID”在本文中可互换使用，是指由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)引起的病毒感染性疾病。常见的COVID-19症状包括发烧、咳嗽和呼吸急促。肌肉疼痛、痰液产生和咽喉疼痛较不常见。大多数病例导致轻微的症状，而一些病例会发展为严重的肺炎和多器官衰竭。感染通常通过咳嗽时产生的呼吸道飞沫从一个人传播到另一个人。其也可以通过触摸被污染的表面，然后触摸人的脸而传播。
如本文中所用，术语“受体结合域(RBD)”是指冠状病毒的冠状病毒刺突(S)蛋白的受体结合域(RBD)，并且包括冠状病毒刺突(S)蛋白的一部分，该部分参与病毒至受试者细胞上受体的附着、并随后进入细胞。所述细胞受体可以是血管紧张素转化酶2(ACE2)受体。优选地，RBD包含SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或由所述序列组成。在RBD的定义中，还预见了作为SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的一个抗原部分的RBD。本文所述的RBD可被修饰，其中从SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列或其抗原性部分添加、取代或删除1-100个，优选1-50个，更优选1-10个氨基酸残基，优选其中所述经修饰的RBD结合免疫应答的产物(优选为抗体)，当用本文所述的缀合物免疫受试者时引发所述免疫应答，其中所述缀合物的RBD包含SEQ IDNO:1-3的氨基酸序列或由所述序列组成。因此，术语“RBD”包括与SEQ ID NO:1-3具有80％，优选90％，更优选95％序列同一性并且结合免疫应答的产物(优选为抗体)，当用本文所述的缀合物免疫受试者时引发所述免疫应答，其中所述缀合物的RBD包含SEQ ID No:1-3的氨基酸序列或由所述序列组成。
在本发明的一些方面，术语“冠状病毒刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)”仅指完整冠状病毒刺突(S)蛋白的RBD部分。
术语“刺突(S)蛋白”或等价术语“刺突(S)糖蛋白”是指由S1亚单位(N末端头部)和S2亚单位(C末端茎)组成的冠状病毒S蛋白。S1亚单位通过其N-末端S1A结构域(包含唾液酸，一种病毒附着因子)和其C-末端受体结合结构域(RBD)(其结合SARS ACE2受体)介导病毒附着和进入。S2亚单位更加保守，通过融合肽(FP)和两个七肽重复序列(heptad repeat)HR1和HR2介导病毒与宿主细胞的融合。SARS-CoV S蛋白RBD与人ACE2和CLEC4M/DC-SIGNR受体的结合导致病毒内化到宿主细胞的内体中。
如本文中所用，术语“载体蛋白”是指诸如蛋白质、寡糖或多糖等抗原可与之结合的免疫原性蛋白。当与载体结合时，结合的分子可以变得更具免疫原性。分子与载体的共价连接增强了免疫原性和T细胞依赖性。
如本文中所用，术语“蛋白质”在本文中指通过相邻残基的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基，也称为“多肽”。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸(包括经修饰的氨基酸(例如，磷酸化的、糖化的、糖基化的等))和氨基酸类似物的聚合物，无论其大小或功能如何。“蛋白质”和“多肽”通常用于指相对较大的多肽，而术语“肽”通常用于指小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是重叠的。在本发明的说明书中，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”完全可以互换。
应该理解的是，包括本发明的(RBD)抗原在内的蛋白质可以不同于本文所说明和描述的确切序列。因此，本发明考虑了所示序列的缺失、添加和取代，只要该序列根据本发明的方法起作用即可。在这一点上，特别优选的取代通常是性质保守的，即那些发生在一个氨基酸家族内的取代。例如，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类为芳香族氨基酸。可以合理地预测，用异亮氨酸或缬氨酸单独替换亮氨酸或反向；用谷氨酸替换天冬氨酸或反向；用丝氨酸替换苏氨酸或反向；或者用结构相关的氨基酸对氨基酸进行类似的保守替换，不会对生物活性产生重大影响。因此，具有与所示和所描述的序列基本相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质免疫原性的少量氨基酸取代的蛋白质在本发明的范围内。RBD蛋白全长上至少90％，优选至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性被认为是SEQ ID NO:1-3的RBD蛋白的功能变体，并可用于本发明的方面。术语“％序列同一性”在本文中被定义为在对序列进行比对并在必要时任选地引入缺口以获得最大百分比的序列同一性之后，核酸序列或氨基酸序列中分别与目的核酸序列或氨基酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域是公知的。序列同一性是在目的氨基酸序列的基本上整个长度，优选整个(全)长度上计算的。技术人员理解，将一个氨基酸序列中的连续氨基酸残基与另一个氨基酸序列中的连续氨基酸残基进行比较。
如本文中所用，术语“破伤风类毒素”是指公知的破伤风类毒素肽，该肽代表破伤风毒素的残基830-844的表位。该序列已被证明能结合多个HLA-DR等位基因，并被描述为具有普遍的免疫原性。氨基酸序列为QYIKANSKFIGITEL。
如本文中所用，术语“白喉类毒素”是指由白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)分泌的灭活的外毒素(一种由二硫键连接的两个亚单位组成的535个氨基酸的单一多肽链)。白喉类毒素在世界范围内以标准方式生产；在美国，美国联邦法规中规定了生产和测试程序。
如本文中所用，术语“白喉类毒素突变体CRM197”是指白喉毒素的无毒突变体，通常用作多糖和半抗原的载体蛋白，以使其具有免疫原性。野生型白喉类毒素序列中的单个G->A转换导致甘氨酸-52被谷氨酸取代(Giannini等人1984Nucleic Acids Res.12(10):4063-4069),
如本文中所用，术语“共价”是指两个原子共享一对或多对将它们保持在一起的电子的化学键。
如本文中所用，术语“共价缀合物”是指其中抗原多肽与载体蛋白共价连接的化合物。
如本文中所用，术语“共价缀合”是指通过化学反应制备缀合物的步骤。
如本文中所用，术语“疫苗”包括抗原部分的组合物，通常由经修饰的活的(减毒的)或灭活的感染因子或感染因子的某些部分组成，其最常见地与佐剂一起被施用到体内以产生主动免疫。本发明提供了免疫原性组合物，其在药学上可接受的载体中包含如上所述的缀合物。这种载体可以是含水液体或气溶胶组合物。
如本文中所用，术语“剂”是指在特定时间施用或推荐施用的本发明缀合物或组合物的量或测量的量。
如本文中所用，术语“佐剂”包括一种或多种化合物，当在制剂中与特定疫苗抗原组合使用时，其增强或以其它方式改变或修饰所产生的免疫应答。优选地，佐剂是明矾(铝盐)诸如氢氧化铝。
如本文中所用，术语“药物赋形剂”是指诸如佐剂、载体、pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、防腐剂等物质。疫苗赋形剂例如描述于政府法规诸如欧洲药典和美国9CFR中，以及诸如以下的手册中：The Handbook of Pharmaceutical Excipients(R.Rowe等人，Pharmaceutical press 2012,ISBN 08571 10276)；Remington:the science andpractice of pharmacy(2000,Lippincot,USA,ISBN:683306472)。
如本文中所用，术语“原位还原”是指本文所述的RBD从二聚体向单体的转化。二聚体的还原优选使用三(2-羧基乙基)膦(TCEP)进行。优选地，还原是原位的，这意味着将二聚体与TCEP混合，然后与载体蛋白混合，而没有任何中间纯化步骤。
如本文中所用，术语“硫醇化”是指在RBD N-末端或N-末端残基中引入巯基(SH)基团。硫醇化可通过使RBD与过量的2-巯基乙酰基-吡啶-2-甲醛反应，然后用羟胺处理来实现。
如本文中所用，术语“官能化”是指在载体蛋白中引入一个或多个亲硫基团。亲硫基团可包括马来酰亚胺类、溴乙酰基类、乙烯基砜类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、丙烯腈类和甲基丙烯酸酯类。本领域技术人员非常熟悉在蛋白质中引入一个或多个亲硫基团的方法。官能化可以例如通过使载体蛋白与马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在合适的缓冲液中反应来实现。
在本发明的一些方面，然后使硫醇化的RBD与一种或多种亲硫基团官能化的载体蛋白反应，以形成本发明的缀合物。根据反应化学计量学，获得的缀合物将每单位载体蛋白含有1-8个RBD单位。针对本发明描述的缀合方法是化学选择性的和残基特异性的。根据本发明的共价缀合物优选不是融合蛋白，其中RBD与载体蛋白通过肽键键合。
如本文中所用，术语“施用”是指将本文所公开的化合物或组合物通过一种方法或途径置于受试者体内，该方法或途径导致缀合物在所需部位处的至少部分递送。包含本文公开的化合物的药物组合物可通过任何合适的途径施用，这在受试者中产生有效的治疗。优选通过注射(优选肌内)施用。
如本文中所用，“受试者”意指人或非人动物。通常非人动物是脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿类动物、家畜或游戏动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。举几个例子，动物还包括犰狳、刺猬和骆驼。家养动物和游戏动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物物种(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛或猪，但不限于这些实例。除人外的哺乳动物可以有利地用作代表给定疾患的动物模型的受试者。受试者优选是人。受试者可以是男性或女性。受试者可以是先前已被诊断或鉴定为患有或具有需要治疗的疾患，并且任选地已经接受过治疗的受试者。或者，受试者也可以是以前未被诊断为患有某种疾患的受试者。例如，受试者可以是表现出一种或多种风险因素的受试者，或者是不表现风险因素的受试者。
“需要治疗特定疾患的受试者”可以是患有该疾患、经诊断患有该疾患或有发展该疾患的风险的受试者。
本文中所用，术语“预防SARS-CoV-2病毒感染”和术语“预防由SARS-CoV-2病毒感染引起的疾病”是指预防或治疗COVID-19病，或由SARS-CoV-2病毒或其变体引起的疾病。
如本文中所用，术语“治疗(treat)”、“处理(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善(amelioration)”是指治疗性处理，其中目的是逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症(例如癌症或炎症)相关的疾患的进展或严重性。术语“治疗”包括减少或减轻疾患、疾病或病症的至少一种副作用或症状。如果一个或多个症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减缓或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括与在不进行治疗时预期的情况相比，症状进展或恶化的停止或至少减缓。有益的或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、缓解(无论是部分或全部)和/或死亡率的降低，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括缓解疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。
本文所用的术语“有效量”是指缓解疾病或病症的至少一种或多种症状所需的疫苗抗原的量，并涉及提供所需效果的药物组合物的足够量。因此，术语“治疗有效量”是指当向典型受试者施用时，足以产生特定效果的疫苗抗原的量。本文在各种上下文中使用的有效量还包括足以延缓疾病症状的发展、改变症状性疾病的进程(例如但不限于减缓疾病症状的进展或其严重性)或逆转疾病症状的量。因此，规定确切的“有效量”通常是不可行的。然而，对于任何给定的情况，合适的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。有效量优选在受试者中引起中和性抗体应答。
如本文中所用，术语“治疗有效量”是指用于治疗、改善、抵消、抑制或预防所需病症或疾患，或表现出可检测的治疗或预防效果的治疗剂的量。受试者所需的精确有效量将取决于受试者的体型和健康状况、疾病的性质和程度以及选择施用的治疗剂或治疗剂的组合。对于给定情况的治疗有效量可以通过常规实验确定。
术语“中和性抗体应答”是指在受试者中产生抗体，所述抗体结合外源蛋白例如SARS-CoV-2的RBD并降低或减弱其活性。例如，与在中和性抗体应答不存在的情况下或在引发中和性抗体应答之前的外源蛋白的活性相比，外源蛋白的活性可被降低可检测的量，例如10％、25％、50％、75％或100％(即，完全失活)。外源蛋白的活性将取决于外源蛋白，这可通过本领域已知的任何方法来测定。
如本文中所用，术语“疫苗接种”是指施用疫苗以诱导接受者的免疫系统产生中和性抗体应答，以产生对疾病的保护。
术语“药学上可接受的”在本文中用来指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
获得RBD抗原的方法
合成RBD蛋白的编码序列，并将其亚克隆在合适的表达载体，优选pcDNA3.1中。选择的RBD氨基酸序列是SEQ ID NO:1-3或其延伸。含有靶蛋白的构建体可在生物技术中常规使用的宿主(即哺乳动物细胞(CHO、HEK293)、昆虫细胞、细菌和酵母，优选为CHO细胞)之一中表达。
通过离心和过滤收获表达的靶蛋白；将其在亲和柱上，优选在Ni-Sepharose柱上纯化，随后进行大小排阻色谱纯化，优选采用Superdex 200。通过应用合适的方法诸如SDS-PAGE、HPSEC和MS分析纯化的蛋白质，以确定分子大小、纯度、身份和氨基酸序列以及其它分子特征。
为了获得与载体蛋白的共价缀合物，本发明人利用了RBD的结构，其为含有195个氨基酸的球状蛋白(序列Thr333-Pro527，SEQ ID NO:2)。所述序列包含半胱氨酸之间的四个分子内二硫键(Cys336-Cys361、Cys379-Cys432、Cys391-Cys525和Cys480-Cys488)，产生非常紧密和稳定的结构。该序列构成了用于RBD的缀合的生物学相关结构，因为其含有针对该分子所描述的四个免疫显性表位，以及受体结合基序。这些缀合物可从包含该333-527序列或其延伸的任何片段中获得。
此外，用于产生RBD的基因构建体可在所述333-527序列的一个或两个末端包含延伸，或者在从333至300的任何氨基酸中的N端处包含延伸，或者在527-560的氨基酸区域中的C端包含延伸。通过基因构建体本身，特别是通过延伸序列以包括被认为有活性的天然氨基酸之一(例如半胱氨酸538)，有可能激活末端之一而不影响生物学相关的结构。另一种解决方案在于在一个末端引入活性官能团；这方面的一个实例是N-末端氨基酸(例如在328-533RBD序列(SEQ ID NO:3)的精氨酸328上)的硫醇基团官能化。
来自SEQ ID NO:1的靶蛋白的氨基酸序列含有9个半胱氨酸，其中8个参与4个分子内二硫键(Cys336-Cys361、Cys379-Cys432、Cys391-Cys525和Cys480-Cys488)，这导致非常紧密和稳定的结构。在RBD的纯化过程中以及在空气存在的情况下(温和的氧化条件)，SEQID NO:1的RBD可通过在两个RBD分子的位置538处的两个游离半胱氨酸之间形成二硫键而二聚化。然而，如果将RBD保持在惰性气体(即氮气或氩气)的气氛中，半胱氨酸538不反应，RBD保持其单体形式，因此，其可参与与亲硫基团的化学反应。
获得RBD与载体蛋白的共价缀合物的方法
载体蛋白可选自包含以下的组：破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉毒素突变体CRM197或在人用疫苗中执行相同功能的任何其它蛋白。获得和表征这些载体蛋白的方法可见于可获得的文献中。
针对本发明描述的缀合方法是化学选择性的和残基特异性的。所述方法分为三个阶段。第一阶段(A)包括对载体蛋白进行官能化以引入亲硫基团，优选马来酰亚胺类，也可以使用任何已知的亲硫基团，即溴乙酰基、乙烯基砜、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、丙烯腈类和甲基丙烯酸酯类。可通过以100-200摩尔比使用于二甲基亚砜(DMSO)中的马来酰亚胺基-丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与于适当缓冲液中的所述蛋白质来实现官能化。通过使用具有适合纯化中的蛋白质的MWCO值的膜渗滤来纯化官能化的蛋白质，并且通过使用改进的Ellman方法测定官能化的程度。
阶段(B)包括在合适的缓冲液中共价缀合RBD与所述官能化的载体蛋白，将它们以0.2-9.4RBD∶载体蛋白(w:w)的质量比加入到反应混合物中；在5±3℃下于惰性气体的气氛中，将混合物轻轻搅拌4-18小时。通过加入适量的胱胺来封闭剩余的亲硫基团。
阶段(C)包括纯化获得的缀合物，这可以通过使用MWCO值适合所述载体蛋白的膜进行渗滤来实现。
缀合可通过使用单体和二聚体形式的SEQ ID NO:1的RBD来实现。在步骤(A)之前引入另一个步骤，包括在温和的还原条件下，使用浓度在125μM-420μM范围内的二硫键还原剂(优选为二硫苏糖醇(DDT)或三(2-羧基乙基)膦(TCEP))，在范围为0至23℃的温度下，在5-20分钟内完成RBD二聚体中分子间二硫桥的还原。这些条件特别地选择性断裂该桥，但不影响上述其它四个分子内二硫桥。二聚体还原成单体可通过HPSEC来验证，而四个分子内二硫桥的保留和抗原性分别通过SDS-PAGE和间接ELISA测试来检查。
本发明的另一个实施方案包括在步骤A之前对RBD的N-末端残基进行硫醇化的另一个步骤。该操作需要在23-37℃下与过量的2-巯基乙酰基-吡啶-2-甲醛(相对于RBD为20-50当量)反应12-48小时，随后洗涤并用过量的羟胺在环境温度下处理1-5小时。
根据反应化学计量学，获得的缀合物将每单位载体蛋白含有1-8个RBD单位。
疫苗组合物和施用途径
以1-30μg、优选5-25μg的RBD剂量通过肌内或皮下途径施用基于受体结合结构域与载体蛋白的共价缀合物的SARS-CoV-2疫苗。这些疫苗组合物可以以范围为200至1500μg，优选500至1000μg的剂量含有任何矿物盐作为佐剂，包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。疫苗组合物包含可调节pH的合适的药物赋形剂，诸如浓度在3.0至7.0mM范围内的磷酸盐缓冲液，浓度为50至150mM范围内的等渗溶液(如氯化钠)，以及防腐剂，诸如硫柳汞、苯酚、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、甲醛、间甲酚或其它对羟基苯甲酸甲酯和丙酯，优选为硫柳汞。
优选地，按照1至3剂的方案施用这些疫苗组合物制剂，优选每7至28天，更优选每14至28天，更优选每21至28天施用。优选地，在连续给药之间有至少一至三周的间隔，优选至少两周的间隔。用于施用的单个剂量优选包含1至30μg的量的RBD。容器(诸如注射瓶)可包括多剂用于多个受试者的疫苗接种。每剂优选为约0.05至约1mL，优选每剂为约0.3-0.5mL，最优选为约0.3mL。剂量可以以浓缩或冻干的形式包含在容器中，并且可以在施用前用合适的注射液稀释或复原。
施用优选为肌内施用。施用优选不是血管内、皮下或皮内施用。本发明中提出的疫苗组合物证明了它们与含有佐剂化的、非缀合的RBD的疫苗组合物相比的优越性；这些疫苗组合物有几个特征在当前的大流行情况下至关重要，即引发响应的迅速性，以及作为SARS-CoV-2病毒的中和剂和RBD-ACE2受体相互作用的阻断剂的高水平抗体滴度。这些组合物引发Th1型免疫应答以及对RBD特异的CD8+、CD4+和T细胞(特别是那些产生IFNγ的细胞)的记忆反应。
更多有利方面
本发明提出的疫苗组合物对于儿科人群的临床试验显示出优异的结果。
此外，本发明中提出的疫苗组合物在接种的人中显示了粘膜IgG反应。其重要性在于，这种诱导的粘膜反应减少了病毒的传播及其感染性。本发明人认为这在目前可获得的Covid-19疫苗中是独特的新特性。
认为目前提出的RBD结构作为完全刺突蛋白疫苗的一部分具有重要的有利方面，因为完整刺突蛋白疫苗显示出重要的不良事件，如心肌炎和心包炎。这些副作用与刺突蛋白的羧基区域有关。该区域不存在于目前提出的RBD-载体蛋白缀合疫苗中。值得注意的是，目前提出的疫苗组合物非常适合儿科使用，因为提到的完整刺突蛋白疫苗的副作用在儿科人群中特别严重。
初步结果表明，免疫抑制和免疫受损的受试者的免疫应答是高度有益的，并且优于其它疫苗。
本发明人未鉴定到针对灭活病毒疫苗或腺病毒载体疫苗所报道的其它不良事件，并且免疫应答或中和性抗体应答的评估高于灭活病毒疫苗。
实施例
实施例1.由在Cys 538处二聚化的RBD制备RBD(319-541)单体。
将RBD二聚体(319-541)溶解在PBS缓冲液(35mM,pH 7.4)，0.5mM EDTA中，使最终蛋白浓度为5至10mg/mL。添加TCEP至125μM至420μM的最终浓度。在环境温度下，在适度搅拌下，将反应在氩气氛中保持十分钟。
分别通过HPSEC和聚丙烯酰胺凝胶电泳验证向单体形式的转化及其分子完整性。图6显示了HPSEC图谱，其揭示了由还原获得的单体与天然单体具有相同的分子分布。图7(SDS-PAGE)显示：通过还原再生的RBD单体(泳道3)与天然RBD单体(泳道2，天然构象)具有相同的迁移模式，而与经受剧烈条件以还原分子间和分子内桥的对照样品(泳道4)形成对比，所述对照样品显示更慢的迁移。
使用COVID-19人恢复期血清，通过间接ELISA分析通过还原获得的单体的抗原性。图8证明了通过还原再生的RBD像天然的RBD一样被识别，而在剧烈条件下被还原的RBD单体断裂了分子间和分子内二硫键(总的，C-)，不被所述血清识别。
实施例2.RBD(319-541)-破伤风类毒素缀合物的制备
载体蛋白的官能化：将HEPES缓冲液(100mM,pH 7.8)中的破伤风类毒素载体蛋白(5mg/mL)与DSMO中的马来酰亚胺-丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(75mg/mL)(缓慢滴入反应混合物中)反应。将反应在环境温度下保持一小时。官能化的破伤风类毒素通过用PBS缓冲液(35mM,pH 7.4),5mM EDTA洗涤进行渗滤来纯化。官能化的程度由改进的Ellman方法确定。
缀合：将官能化的破伤风类毒素以0.2-0.4的RBD/TT摩尔比加入到单体形式的RBD溶液或原位还原成单体的RBD的溶液中。在5±3℃下，在温和搅拌下，将反应保持在氩气气氛中4至18小时。为了封闭剩余的马来酰亚胺基团，以高达157μM的浓度加入半胱胺盐酸盐，并保持搅拌30分钟。
纯化：使用MWCO值为100kDa的膜，同时用PBS(6mM,pH 7.0)洗涤，通过渗滤实现纯化。
RBD/TT比率通过斑点印迹密度测定法和比色法的组合来确定。非缀合的RBD的含量和分子大小分布通过HPSEC测定。通过动态光散射(DLS)测定分子大小和多分散指数。表1显示缀合物的摩尔比在1.8mol RBD/mol TT与6.3mol RBD/mol TT之间，而未结合的RBD的含量低于15％。分子大小分布常数(Kd)表明与破伤风类毒素(Kd＝0.31)相比，缀合物的分子大小增加。还表明，当载体蛋白中掺入的RBD摩尔数越多，缀合物群体的相对大小就越大(表1和图9)。
表1.RBD-TT缀合物的物理化学表征。
*通过RBD二聚体的原位还原再生的单体
实施例3.证明ACE 2受体和特异性抗体对RBD(319-541)-破伤风类毒素缀合物的识别
通过ELISA测试分析了ACE2受体对RBD-破伤风类毒素缀合物(RBD-TT)的识别，在所述ELISA测试中，用重组ACE2受体包覆平板。以不同的浓度(0.001、0.004、0.019、0.078、0.3125、1.25和5μg/ml)加入样品(批次1和2的RBD-TT，RBD二聚体-作为阳性对照，hPDLHys-作为阴性对照)。孵育后，加入RBD特异性兔多克隆血清，随后加入与过氧化物酶缀合的抗兔IgG。通过相应的底物显示反应，并在405nm处读取。
图10A显示两个缀合物批次被ACE2受体以及RBD二聚体(阳性对照)识别。因此，证明了原位还原和缀合不影响负责ACE2受体识别RBD的RBD表位。
使用抗RBD特异性多克隆IgG血清，通过斑点印迹验证RBD-TT的抗原性。图10B显示，在测试的每个稀释度中，缀合物被抗RBD特异性抗体强烈识别，而以1∶80稀释度应用的破伤风类毒素(TT)不被识别。因此，证明了缀合不影响抗体对RBD的识别。
实施例4.RBD(319-541)-TT缀合物在BALB/c小鼠中诱导强烈的抗体响应。
在第0天和第14天，用0.1mL下列制剂之一对BALB/c小鼠进行肌内免疫：
-组1：1μg RBD-(319-541)-TT。
-组2：吸附在500μg Al(OH)3中的1μg RBD-(319-541)-TT。
-组3：3μg RBD-(319-541)-TT。
-组4：吸附在500μg Al(OH)3中的3μg RBD-(319-541)-TT。
-组5：吸附在500μg Al(OH)3中的3μg RBD-(319-541)-TT。
-组6：安慰剂。PBS和500μg Al(OH)3。
组6是阴性对照制剂。
在第7天、第14天、第21天和第28天抽取血液。通过间接ELISA分析动物血清以确定抗RBD抗体滴度。用50μL的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中的RBD(3μg/mL)包覆96孔NUNC Maxisorp微量滴定板，并在37℃孵育1小时然后，用洗涤溶液液将平板洗涤三次。后来，用100μL 5％的脱脂奶在37℃封闭未涂覆的位点1小时。如上所述再次洗涤平板后，加入以连续稀释度在磷酸盐缓冲液(pH 7.2)，1％BSA中以1:3稀释的血清(50μL/孔)，通常从1:50的稀释度开始。将平板在37℃孵育1小时，并再次洗涤。接下来，将与过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG的稀释液50μL加入磷酸盐缓冲液(pH 7.2)、1％BSA(1∶5000)中，并孵育1小时。最后一次洗涤后，加入过氧化物酶底物溶液(50μL/孔)。然后在黑暗中孵育20分钟，用50μL/孔的2NH2SO4终止反应。在Multiskan EX ELISA读数器(Thermo Scientific)中于450nm处读取吸光度。IgG滴度被定义为达到1:50稀释度的免疫前血清(T0)平均吸光度值四倍的血清稀释度的倒数。为了分析和显示结果，计算了每只动物的滴度的Log10。为了定义应答动物，取对数滴度＞1.70作为截止值，对应于＞1:50的血清稀释度。对于其滴度低于测定检测限的动物，设定了25的滴度值和1.4的log10。
图11显示，用在Al(OH)3中佐剂化的RBD-TT 3μg免疫所诱导的IgG反应引发了早期抗体应答(在免疫后第7天和第14天)，这明显强于用相同剂量的在Al(OH)3中佐剂化的非缀合的RBD所引发的早期抗体应答(p<0.05)。这一特性归因于RBD与载体蛋白的缀合。还表明，1μg在Al(OH)3中佐剂化的RBD-TT诱导了与3μg非缀合的RBD诱导的抗体动力学相似的抗体动力学，证明了缀合增强了对抗原的反应。
还发现，与相同剂量的非佐剂化的制剂相比，佐剂化的缀合物提高了抗RBD抗体水平。
实施例5.由RBD(319-541)-TT缀合物诱导的抗破伤风类毒素抗体滴度
根据实施例4中描述的方法在免疫后第7天、第14天、第21天和第28天从小鼠中提取的血清用于评估抗TT抗体的诱导。将96孔NUNC Maxisorp微量滴定板用100μL破伤风类毒素(浓度为2.5μg/mL，在PBS(pH 7.2)中)包覆，并在湿室中于4℃孵育过夜。用洗涤液将平板洗涤三次。以各种稀释度(在磷酸盐缓冲液(pH 7.2)，1％BSA中)加入(100μL/孔)血清。将平板在37℃孵育1小时，并再次洗涤。接下来，在37℃下，将100μL与过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG稀释液加入磷酸盐缓冲液(pH 7.2)，1％ BSA(1:10000)中进行1小时。最后一次洗涤后，加入100μL/孔的过氧化物酶底物溶液，在黑暗中孵育25分钟，用2N H2SO4(50μL/孔)终止反应。在Multiskan EX ELISA读数器(Thermo Scientific)中于450nm处读取吸光度。通过将吸光度值转化为IU/ml(国际单位/毫升)来确定滴度；基于标准品的系列稀释度，使用四参数对数逻辑函数构建参考曲线。
图12显示，含有在Al(OH)3中佐剂化的缀合物的制剂诱导的抗TT IgG应答显著强于(p<0.05)未佐剂化的制剂诱导的抗TT IgG应答。
实施例6.通过RBD-ACE2相互作用抑制测定法评估由RBD(319-541)-破伤风类毒素缀合物诱导的抗RBD抗体的功能活性。
在ELISA测定中分析根据实施例4中描述的方法免疫小鼠后第28天从所述小鼠中提取的血清，以确定它们对RBD-ACE2相互作用的抑制。进行另一个ELISA测试来分析抗RBD抗体诱导的对RBD-ACE2相互作用的抑制。为了确定RBD-ACE2相互作用的抑制百分比，封闭用小鼠ACE2-Fc(5μg/mL)包覆的平板；然后以范围为1:25至1:10000的稀释度加入已在37℃与来自用各种实验制剂免疫的小鼠的血清一起孵育1h的人RBD-Fc。为了检测识别，使用在SSTF-T缓冲液，0.2％牛奶中稀释的抗人IgG(γ链特异性)-碱性磷酸酶缀合物。最后一次洗涤后，将pNPP(1mg/mL,50μL/孔)加入二乙醇胺缓冲液中。将平板在黑暗中孵育20分钟，用3MNaOH(50μL/孔)终止反应。在405nm处读取吸光度。通过以下公式计算抑制百分比：(1-Abs405nm人RBD-Fc+小鼠血清/Abs405nm人RBD-Fc)*100。使用软件GraphPad 7.00(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA,USA)通过非线性回归确定最大抑制浓度(IC50)。图13显示了用本发明的制剂免疫的小鼠的血清的抑制能力。佐剂化的RBD-TT制剂诱导的抗体相较于非佐剂化的制剂诱导的抗体具有更强的抑制能力。此外，佐剂化的缀合物的抑制能力(IC 50)比非缀合的制剂(RBD 3μg/Al(OH)3)的抑制能力高2倍(RBD-TT 1μg/Al(OH)3)和6.5倍(RBD-TT 3μg/Al(OH)3)，这表明RBD缀合甚至在较低剂量下也增强了抗体的功能性。
实施例7.通过它们的SARS-CoV-2中和能力评估由RBD(319-541)-破伤风类毒素缀合物的制剂诱导的抗RBD抗体的功能活性。
通过使用中性红的比色测定法测试用RBD-TT 3μg/Al(OH)3和RBD 3μg/Al(OH)3免疫的小鼠在第一次给药(实施例4)后第28天的血清的SARS-CoV-2中和能力。将Vero E6细胞在补充有2％胎牛血清、25mM/mL L-谷氨酰胺、2μg/mL碳酸氢盐、80μg/mL庆大霉素和5μg/mL两性霉素B的MEM中孵育。从平板中取出上清液，加入含有0.02％中性红的pH 7.2的PBS(100μL/孔)。将平板在环境温度下孵育1小时。弃去溶液，用无菌PBS、0.05％ Tween 20洗涤细胞单层两次。加入裂解溶液(无水乙醇:超纯水:冰醋酸，50:49:1)(100μL/孔)。将平板在环境温度下孵育15分钟，并在分光光度计中于540nm处进行测量。中和滴度是光密度值高于截止值的最高血清稀释度。截止值是对应于细胞对照的孔的光密度的平均值除以2。
图14显示，由RBD-TT缀合物诱导的中和抗体滴度明显高于由未缀合的RBD诱导的中和抗体滴度(p<0.01)，证明了RBD缀合的优越性，因为其增强了所诱导抗体的功能性。
实施例8.通过RBD(319-541)-破伤风类毒素缀合物诱导的IFNγ确定的Th1细胞免疫应答。
在免疫后第21天提取血清后，在根据实施例4中描述的方法免疫的小鼠中评估细胞免疫应答。分离用1ug于Al(OH)3中的RBD-TT或安慰剂Al(OH)3免疫的小鼠的脾细胞，并在体外用RBD(5μg/mL)再次刺激，如通过定量ELISA所测定的。应用的浓度为1x 106个细胞/mL。刺激72小时后，测定培养上清液中的IL4、IL17A和IFNγ。
图15显示利用1ug RBD-TT/Al(OH)3的免疫诱导了IFNγ，证明了T细胞应答的Th1极化。未检测到IL4和IL17A，这证明所述缀合物没有极化为Th2或Th17模式反应。
实施例9.RBD(319-541)-破伤风类毒素缀合物诱导的对SARS-CoV-2RBD蛋白特异的记忆T细胞应答。
在免疫后第21天，在根据实施例4中描述的方法免疫的小鼠中评估记忆T细胞应答。分离用1ug于Al(OH)3中配制的RBD-TT或用安慰剂Al(OH)3免疫的小鼠的脾细胞，将其在RPMI 1640，10％胎牛血清，100U青霉素，100μg/mL链霉素，1mM丙酮酸盐，50μMβ-巯基乙醇和20U/mL IL-2中培养72小时。为了活化所述细胞，加入5μg/ml RBD。为了阻断细胞因子的分泌，在染色前4至6小时加入布雷菲德菌素A(BD Biosciences)。用PBS1X洗涤细胞，并用抗CD8、抗CD4、抗CD44和抗CD220(BioLegend)在4℃下染色30分钟。将细胞固定并透化，以便于用抗-IFNγ和抗-IL4(BioLegend)进行细胞内染色。在Gallios流式细胞仪(BeckmanCoulter)上获得细胞计数数据，并用软件Kaluza(Beckman Coulter)处理结果。
图16显示，利用1μg RBD-TT/Al(OH)3的免疫接种产生了RBD特异性CD4+(C)和CD8+(A)记忆T细胞，表型为CD44++。免疫接种还增加了产生IFNγ的CD8(B)和CD4(D)记忆T细胞。
实施例10.在其N-末端硫醇化的RBD(328-533)的制备
用2-巯基乙酰基-吡啶-2-甲醛(终浓度1-10mM)处理在5-10mL PBS(50mM，pH 7.5，5mM EDTA)中终浓度为20-200μM的RBD(328-533)。将反应混合物在23-37℃的温度下搅拌12至48h的时间。通过用PBS(35mM,pH 7.4,5mM EDTA)洗涤经渗滤实现纯化。将官能化的RBD(328-533)浓缩至20-200μM，并用盐酸羟胺处理(终浓度为40mM)。将反应混合物在环境温度下于氮气氛中搅拌1至5h，通过Ellman方法测定转化率>90％。
质谱法测定的N-末端残基的转化水平高于80％。HPSEC分析证明，在反应过程中没有发生聚集，并且硫醇化的RBD保持了其分子大小分布(图17)。
实施例11.将N-末端硫醇化的RBD(328-533)转化为RBD(328-533)破伤风类毒素缀合物。
按照实施例2中描述的方法，将硫醇化的RBD(328-533)与破伤风类毒素缀合。
图18A显示了缀合16h后的反应混合物和纯化的缀合物的RBD的HPSEC Superdex75色谱图。纯化的缀合物的RBD-TT摩尔比为1.9，未结合的RBD含量低于15％。HPSECSuperdex 200色谱图(图18B)显示了与载体蛋白(Kd＝0.31)相比缀合物(Kd＝0.27)的分子大小的增加。
按照实施例2中描述的方法从SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3获得的缀合物具有相似的物理化学特征。
实施例12.保留了ACE2受体和特异性RBD抗体对RBD(328-533)-破伤风类毒素缀合物的识别
如实施例3所述评价ACE2受体和特异性抗RBD抗体对RBD-破伤风类毒素缀合物的识别。
图19A显示了RBD-破伤风类毒素缀合物被ACE2受体识别，以及其在RBD阳性对照(在破伤风类毒素不存在的情况下的RBD)中被识别。因此，证明了RBD的N-末端残基的硫醇化和缀合过程都不影响负责ACE2受体对RBD的识别的RBD表位。
使用抗RBD特异性多克隆IgG血清通过斑点印迹验证缀合物的抗原性。图19B显示，在所有测试的稀释度中，缀合物被抗RBD特异性抗体强烈识别，而1:80稀释度的破伤风类毒素(TT)不被识别。因此，证明了缀合不影响抗体对RBD的识别。
实施例13.RBD(319-541)-TT缀合物在人中(尤其是在儿科人群中)引发强烈的抗体应答。
在两剂(T0，T28天)方案中于临床试验中评估在明矾中包含RBD-(319-541)-TT的疫苗制剂。成人(II期，19-80岁)和儿科人群(I/II期，3-18岁)的临床试验程序描述于：https://rpcec.sld.cu/trials/RPCEC00000347-En,https://rpcec.sld.cu/trials/ RPCEC00000374-En。
图20显示了在两个临床试验中第二剂后14天血清中特异性抗RBD IgG的结果。在所有年龄组中都产生高水平的抗体，成年人群(19-80岁)的血清转换率为74％。值得注意的是，12-18岁和3-11岁组中的儿童分别达到了92.8％和99.3％的血清转换率。此外，两个儿科组的中值：50.3(12-18岁中15.9；62.0)和99.8(3-11岁中39.1；216.8)优于用COVID-19恢复期儿童产生的血清小组的中值：8.7(3.4；15.7)。
实施例14.RBD(319-541)-TT缀合物在人中诱导特异性粘膜IgG
如下所述(https://rpcec.sld.cu/trials/RPCEC00000360-En)，通过“内部”ELISA测定法分析来自用两剂(T0，28天)的明矾中的RBD-(319-541)-TT制剂和加强剂的明矾中的二聚体RBD(T56)免疫的受试者的唾液。RBD作为包衣(5μg/mL)和PBS-BSA 3％作为封闭剂。唾液样品一式两份评价为纯的。在孵育步骤后，加入于适当缓冲液中的过氧化物酶抗IgG人缀合物(Sigma A6029,1:2500)。通过加入OPD底物诱导最终的荧光反应。结果以吸光度值表示。
图16显示被免疫接种的受试者在唾液中引发了特异性抗RBD IgG应答。
序列表
<110> Instituto Finlay de Vacunas, Centro de Inmunology
Molecular, Universidad de la Habana
<120> SARS-COV-2受体结合结构域与载体蛋白的共价缀合物以及包含它们的疫苗组合物
<130> 032020CU00
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组DNA技术
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 2
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组DNA技术
<400> 2
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
1 5 10 15
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
20 25 30
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
35 40 45
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
65 70 75 80
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
85 90 95
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
100 105 110
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
115 120 125
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
130 135 140
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
145 150 155 160
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
165 170 175
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
180 185 190
Cys Gly Pro
195
<210> 3
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组DNA技术
<400> 3
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
1 5 10 15
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
20 25 30
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
35 40 45
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
50 55 60
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
65 70 75 80
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
85 90 95
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
100 105 110
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Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
130 135 140
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
145 150 155 160
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
165 170 175
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
180 185 190
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu
195 200 205

Claims (21)

1.一种包含SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)和载体蛋白的共价缀合物。
2.如权利要求1所述的共价缀合物，其中所述载体蛋白选自包含以下的组：破伤风类毒素、白喉类毒素和CRM197。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的共价缀合物，其中RBD-载体蛋白摩尔比在1至8个单位的RBD/1个载体蛋白的范围内。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的共价缀合物，其中所述RBD选自包含SEQ ID NO:1、2和3的组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的共价缀合物，其中SEQ ID NO:1的RBD以其二聚体形式存在。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的共价缀合物，其中在选自包含以下的组的宿主中产生所述RBD：哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌和酵母。
7.一种用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的疫苗组合物，其特征在于包含权利要求1至5中任一项的共价缀合物。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其还包含选自包含以下的组的佐剂：氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。
9.如权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述缀合物在每剂1-30μg的浓度范围内，按照RBD。
10.如权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述佐剂在每剂200-1500μg的浓度范围内。
11.如权利要求7至10所述的疫苗组合物，其还包含适当的药物赋形剂。
12.用于制备权利要求1至5中任一项所述的共价缀合物的方法，包括以下步骤：A)对所述载体蛋白进行官能化，以引入亲硫基团；B)将所述载体蛋白与RBD共价缀合，以及C)纯化。
13.如权利要求12所述的方法，其包括在步骤A之前原位还原所述RBD二聚体的额外步骤。
14.如权利要求12所述的方法，其包括在步骤A之前对RBD N-末端进行硫醇化的额外步骤。
15.如权利要求13所述的方法，其中使用SEQ ID NO:1。
16.如权利要求14所述的方法，其中使用SEQ ID NO:1-3中的任一个。
17.如权利要求12所述的方法，其中在步骤A中，引入的所述亲硫基团选自包含以下的组：马来酰亚胺类、溴乙酰基类、乙烯基砜类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、丙烯腈类和甲基丙烯酸酯类。
18.一种缀合物，其是根据权利要求12至17中任一项的方法获得的。
19.如权利要求7至11中任一项所述的疫苗组合物的用途，其用于预防SARS-CoV-2病毒感染。
20.如权利要求7至11中任一项所述的疫苗组合物的用途，其用于在两剂所述疫苗组合物之后当需要中和性抗体应答时预防SARS-CoV-2病毒感染。
21.如权利要求7至11中任一项所述的疫苗组合物的用途，其用于按照1至3剂的接种方案以1至30μg RBD的剂量通过肌内途径来诱导针对SARS-CoV-2的抗体应答。
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