WO2022073528A1 - Conjugados covalentes del dominio de unión al receptor del virus sars-cov-2 y una proteína portadora y las composiciones vacunales que los contienen - Google Patents

Conjugados covalentes del dominio de unión al receptor del virus sars-cov-2 y una proteína portadora y las composiciones vacunales que los contienen Download PDF

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carrier protein
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Yury VALDÉS BALBÍN
Darielys SANTANA MEDEROS
Sonsire FERNÁNDEZ CASTILLO
Dagmar GARCÍA RIVERA
Daniel GARCÍA RIVERA
Manuel GARCÍA RICARDO
Laura Marta RODRÍGUEZ NODA
Ubel Jesús RAMÍREZ GONZÁLEZ
Belinda SÁNCHEZ RAMÍREZ
Tammy Boggiano Ayo
Eduardo OJITO MAGAZ
Vicente Guillermo Verez Bencomo
Reynaldo OLIVA HERNÁNDEZ
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Instituto Finlay De Vacunas
Centro De Inmunología Molecular
Universidad De La Habana
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Definitions

  • the present invention relates to biotechnology, specifically to the field of human health.
  • it describes covalent conjugates of the receptor binding domain of the SARS-CoV-2 virus with a carrier protein, the method for obtaining these conjugates and the vaccine compositions that contain them.
  • the COVID19 disease is of very recent appearance, in Wuhan, China in December 2019, where serious cases of pneumonia of unknown etiology began to be reported.
  • the disease caused by the SARS-CoV-2 virus is characterized by rapid spread between people, mainly with the appearance of symptoms such as fever, cough, runny nose, sore throat and difficulty breathing, in symptomatic cases, which represent less than fifty %.
  • the disease is asymptomatic, this being an important element in the spread of the disease and an epidemiological challenge for its control (WHO Coronavirus disease (COVID-2019) situation reports, https://www.who .int/emerqencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports Accessed 13 August
  • SARS-CoV-2-like coronaviruses known as MERS and SARS
  • MERS and SARS have been causative agents of similar epidemics in previous decades.
  • SARS has greater homology with SARS-CoV-2, and one of the elements of similarity is that both viruses use the ACE2 protein as a receptor to penetrate human cells. Therefore, in SARS as in SARS-CoV-2, the interaction between the receptor binding domain (RBD) of the viral protein S1 and the ACE2 protein (angiotensin-converting enzyme 2 ) is decisive for infection with the virus in humans.
  • RBD receptor binding domain
  • This RBD domain of the protein S of the SARS-CoV-2 virus is a fragment of approximately 193 amino acids (corresponding to the sequence 333-527) that contains the receptor binding motif (RBM) that constitutes the region by which the virus interacts with the ACE2 receptor.
  • RBM receptor binding motif
  • the RBD contains in addition, 4 intramolecular disulfide bridges between Cisternae 336-361, 379-432, 391-525 and 480-488, which helps to create a very compact and stable structure (Lan et al (2020), Nature Vol 581: 215- 230.
  • the RBD is a small molecule, whose molecular mass ranges between 25-27 kDa depending on the host where it is expressed and the incorporated carbohydrates, fundamentally linked to asparagines N331 and N343 (Chen WH et al (2017) Journal of PharmaceuticaISciences 106: 1961 -1970).
  • Strategies for vaccines against SARS-CoV-2 include inactivated virus, genetic constructs containing the genetic material of the virus incorporated either into adenovirus or as messenger RNA, and vaccines based on subunits or fragments of viral proteins expressed in genetically modified hosts.
  • the preferred molecule is the S protein, also known as the Spike protein, or a fragment of its structure, ie the RBD. Its main advantage is its safety, and that this strategy is closer to that of many vaccines in use, however, its main challenge is to achieve an immune response that is sufficient to protect against viral infection.
  • These vaccines consist of RBD absorbed on alumina in high concentrations of up to 50 micrograms per dose.
  • the inventors of the present invention take advantage of the RBD structure to obtain RBD covalently conjugated to carrier proteins. These conjugates can be obtained from any fragment comprising the sequence 333-527 (SEQ ID NO. 2) or extensions thereof.
  • the immune response generated against these conjugates is stronger than that elicited by the unconjugated RBD monomer in terms of its kinetics and virus neutralization capacity, measured in a virus neutralization assay using SARS-CoV-2. and the ACE2 receptor binding inhibition assay.
  • SARS-CoV-2 the unconjugated RBD monomer in terms of its kinetics and virus neutralization capacity, measured in a virus neutralization assay using SARS-CoV-2. and the ACE2 receptor binding inhibition assay.
  • the vaccine compositions described in the present invention elicit an IgG anti-RBD antibody response 7 days after immunization with a polarization of the cellular response towards a Th1 pattern, characterized by the induction of IFNc, so the effects are not expected. Immunopathological studies reported for coronavirus vaccines that induce a Th2 pattern.
  • the vaccine compositions described in the present invention generate a response of memory CD4 + and CD8 + T lymphocytes, particularly IFN + producers, RBD-specific lymphocytes.
  • One embodiment of the present invention consists of covalent conjugates comprising the receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 and a carrier protein. Particularly, these conjugates are characterized in that the RBD/carrier protein ratio is preferably in the molar range: between 1-8 RBD units per carrier protein.
  • the carrier protein may be selected from the group consisting of, but not limited to, tetanus toxoid, diphtheria toxoid, and CRM197 diphtheria mutant.
  • the immunological effect that is achieved by conjugation to tetanus toxoid can be achieved by conjugation to the other carrier proteins, so the effect of this invention is not limited to tetanus toxoid.
  • the RBD antigen used for conjugation may have the amino acid sequences 319-541 (SEQ ID NO. 1), 333-527 (SEQ ID NO. 2) and 328-533 (SEQ ID NO. 3).
  • SEQ ID NO. 1 can also be found in dimeric form.
  • Said RBD antigen can be produced in hosts selected from the group comprising: mammalian cells, insect cells, bacteria and yeasts.
  • Another embodiment of the invention comprises vaccine compositions to induce a protective immune response against the SARS-CoV-2 virus, characterized in that it comprises covalent conjugates formed by the receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 and a carrier protein. .
  • RBD receptor binding domain
  • These vaccine compositions may additionally include an adjuvant selected from the group comprising any mineral salt such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate and calcium phosphate, among others.
  • the conjugate of said vaccine compositions has a RBD concentration range of 1 to 30 pg per dose, while the adjuvant is within a concentration range of 200 to 1500 pg per dose.
  • These compositions also contain pharmaceutically suitable excipients.
  • Another embodiment of the invention involves a process for obtaining covalent conjugates comprising the following: A) Functionalization of the carrier protein to introduce thiophilic groups, B) Covalent conjugation of the carrier protein to the RBD and C) Purification.
  • Said procedure may additionally comprise an in situ Reduction step of the RBD-dimeric form prior to step A, particularly where SEQ ID NO. 1 and it is in dimeric form ( Figure 1.).
  • the procedure may comprise another stage of Thiolation of the N-terminal end of the RBD prior to stage A, in which SEQ ID NO: 1-3 ( Figure 2.) are used.
  • the thiophilic groups introduced in step A are selected from the group comprising: maleimides, bromoacetyl, vinylsulfones, acrylates, acrylamides, acrylonitriles and methacrylates.
  • Another embodiment of the present invention is related to the use of the vaccine compositions mentioned above for the prevention of SARS-CoV-2 virus infection. It involves, in particular, the use of the vaccine compositions described in this document when required. a neutralizing antibody response.
  • the present invention now provides in a first aspect a covalent conjugate comprising the receptor binding domain of SARS-CoV-2 (RBD) and a carrier protein.
  • the carrier protein is selected from the group comprising tetanus toxoid, diphtheria toxoid and CRM197 mutant diphtheria toxoid ( Figures 3 and 4).
  • the molar ratio of RBD carrier protein is within the range of 1 to 8 RBD per carrier protein ( Figure 5).
  • the RBD is selected from the group comprising SEQ ID NO: 1, 2 and 3.
  • the RBD of SEQ ID NO: 1 is used in its dimeric form.
  • the RBD is produced in a host selected from the group comprising or consisting of mammalian (preferably non-human) cells, insect cells, bacteria and yeast.
  • the present invention provides a vaccine composition comprising the covalent conjugate of the invention as described above.
  • the vaccine composition is preferably used to induce an immune response against SARS-CoV-2.
  • the vaccine composition further includes an adjuvant selected from the group comprising or consisting of aluminum hydroxide, aluminum phosphate and calcium phosphate.
  • the conjugate is in a RBD concentration range of 1-30 pg per dose.
  • the adjuvant is in a concentration range of 200-1500 pg per dose.
  • the vaccine composition further includes appropriate pharmaceutical excipients.
  • the present invention provides a method for the preparation of the covalent conjugate of the invention as described above, the method comprising the steps of: providing a carrier protein and an RBD, wherein the RBD may be in monomeric or dimeric. , functionalizing the carrier protein by introducing thiophilic groups, covalently conjugating the carrier protein to the RBD and purifying the conjugate obtained.
  • the method comprises an additional step of reducing the RBD dimer, preferably in situ before its conjugation with the carrier protein, preferably before of the functionalization of the carrier protein through the introduction of thiophilic groups.
  • the RBD of any of SEQ ID NO: 1-3 can be used, more preferably, SEQ ID NO: 1 is used as RBD.
  • the introduced thiophilic groups are selected from the group comprising or consisting of maleimide, bromoacetyl, vinylsulfone, acrylate, acrylamide, acrylonitrile and methacrylate.
  • the present invention provides a conjugate obtained by the method for the preparation of the covalent conjugate of the invention as described above.
  • the present invention provides the use of the vaccine composition of the invention for the prevention of infection with the SARS-CoV-2 virus, in particular the prevention of the disease caused by infection with the SARS-CoV virus. -two.
  • the present invention provides a method of preventing disease caused by SARS-CoV-2 virus infection comprising administering to a subject a therapeutically effective dose of the vaccine composition of the invention as described above.
  • the use or method is for the prevention of infection or disease by the SARS-CoV-2 virus in subjects who need a neutralizing antibody response. after having received two doses or shots of the vaccine composition.
  • the use or method is to induce an antibody response against SARS-CoV-2 by applying an intramuscular vaccination program of 1 to 3 doses.
  • the amount of RBD in a dose is from 1 to 30 pg.
  • FIG. 1 Scheme of site-selective conjugation of the SARS-Cov-2 receptor binding domain (RBD) to activated tetanus toxoid (TT) with thiophilic maleimide groups. Conjugation takes place at the free thiol of Cys538, which is spatially distant from the receptor-binding motif (represented in red) and thus does not affect the antigenicity of the RBD.
  • Figure 2 N-terminal selective conjugation scheme of the SARS-Cov-2 receptor binding domain (RBD) to activated tetanus toxoid (TT) with thiophilic maleimide groups.
  • the N-terminal thiolation of the RBD sockets is carried out with the new thioacetyl-pyridinecarbaldehyde reagents (developed in-house) which selectively modifies the N-terminal amino group.
  • the N-terminal residue is spatially distant from the receptor-binding motif (represented in red) and thus does not affect the antigenicity of the RBD.
  • FIG. 3 Drawing of the RBD conjugate based on the RBD (319-541) conjugated to Cys538 using A) tetanus toxoid, B) diphtheria toxoid, or C) cross-reactive material 197 (CRM197) as carrier protein.
  • FIG. 4 Drawing of the RBD conjugate based on the RBD (328-533) conjugated at the N-terminus using A) tetanus toxoid, B) diphtheria toxoid, or C) cross-reactive material 197 (CRM197) as carrier protein.
  • FIG. 5 Representation of RBD-TT conjugates with an average of 2, 4 and 6 RBD units per tetanus toxoid unit. Conjugates bearing an average of 8, 10 or 13 RBD units were also obtained.
  • the coding sequences for the RBD protein are synthesized and subcloned into a suitable expression vector, preferably pcDNA3.1.
  • the selected amino acid sequences of the RBD are those corresponding to SEQ ID NO. 1-3 or extensions thereof.
  • the constructs containing the target proteins can be expressed in a host traditionally used in Biotechnology: mammalian cells (CHO, HEK293), insect cells, bacteria and yeasts, preferably in CHO cells.
  • FIG. 7 SDS-PAGE at 10% of the native form of RBD and the RBD derived from the reduction of the RBD dimer (SEQ ID NO: 1).
  • A The sample was incubated in reducing sample buffer before being applied to the gel.
  • NR The sample was applied in non-reducing sample buffer.
  • Figure 8 Antigenicity of the monomer obtained by reduction of the RBD dimer (SEQ ID NO: 1) with tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), compared to the antigenicity of the native monomer and dimer.
  • Figure 9 HPSEC Superdex 200 chromatograms of the purified RBD-TT conjugates 2 and 3 (Example 2), compared to the tetanus toxoid chromatogram.
  • FIG. 10 Recognition of the RBD(319-541)-TT conjugate by the ACE-2 receptor, analyzed by ELISA (A) and by dot blot using polyclonal anti-RBD antibodies (B).
  • Figure 1 1 Kinetics of anti-RBD IgG antibodies induced after vaccination on days 0 and 14 with RBD-TT conjugate formulated or not in Al(OH)3, compared with RBD formulated in Al(OH)3. Asterisks indicate significant differences ( p ⁇ 0.05) between groups at each time point.
  • FIG. 15 Production of IFNy, IL4 and IL17A in spleen cells of mice immunized with RBD-TT formulated in Al(OH) 3 or with the placebo (Al(OH) 3), as determined by quantitative ELISA. Asterisks indicate significant differences (p ⁇ 0.05), according to Tukey's test.
  • FIG. 16 Memory cell response induced in mice immunized with two doses of the RBD-TT conjugate formulated in Al(OH) 3.
  • A CD8 + CD44 ++ T lymphocytes,
  • B IFN ⁇ -producing CD8 T lymphocytes,
  • C CD4 + CD44 ++ memory T cells and
  • D IFN ⁇ -producing CD4 T cells.
  • RBD / RBD Group that received two doses (TO, T14) of RBD-TT and the extracted lymphocytes were stimulated in vitro with RBD.
  • Alum / RBD Group that received two doses (TO, T14) of Alum and the extracted lymphocytes were stimulated in vitro with RBD.
  • Figure 17. HPSEC Superdex 75 chromatograms, showing the selective thiolation of the N-terminal residue of the RBD monomer (SEQ ID NO: 3), compared to the reference profile of the RBD monomer.
  • FIG. 1 HPSEC Superdex 75 chromatograms, showing the conjugation of the RBD (SEQ ID NO: 3) monomer thiolated at the N-terminal residue (upper panel), the 16 h reaction mixture of RBD-TT 4 ( middle panel) and the purified RBD-TT conjugate 4 (lower panel).
  • B HPSEC Superdex 200 chromatograms of purified RBD-TT 4 conjugate, compared to tetanus toxoid.
  • FIG. 19 Recognition of the RBD(328-533)-TT conjugate by the ACE-2 receptor, analyzed (A) by an ELISA test and (B) by anti-RBD polyclonal antibodies, tested by dot blott.
  • Figure 20 Anti-RBD IgG antibodies induced 14 days (T42) after immunization on days 0 and 28 with conjugate vaccine in the phase II clinical trial (19-80 years) and the phase I/II clinical trial (3 -18 years / or).
  • PCP Pediatric Convalescent Sera Panel.
  • SARS-CoV-2 refers to severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus 2 (SARS-CoV-2), the virus that causes coronavirus disease 2019 (COVID-19 ).
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • Testing for positive cases of SARS-CoV-2 can be based on detection of virus RNA sequences by NAAT, such as real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (rRT-PCR) with confirmation by DNA sequencing. nucleic acids when necessary.
  • Viral genes targeted so far include the N, E, S, and RdRP genes.
  • SARS-CoV-2 disease and “COVID” are used interchangeably here, and refer to a viral infectious disease caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2).
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus-2
  • Common symptoms of COVID-19 include fever, cough, and shortness of breath. Muscle pain, sputum production, and sore throat are less common. While most cases cause mild symptoms, some progress to severe pneumonia and multi-organ failure.
  • the infection is usually spread from one person to another through respiratory droplets produced by coughing. It can also be spread by touching contaminated surfaces and then touching your face.
  • receptor binding domain refers to the receptor binding domain (RBD) of a coronavirus spike (S) protein of a coronavirus, and includes reference to a part of the coronavirus spike (S) protein that is involved in viral binding to a receptor on a subject cell and its subsequent entry into the cell.
  • the cellular receptor may be an angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) receptor.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • the RBD comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-3.
  • An RBD which is an antigenic part of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-3 is also envisaged within the definition of RBD.
  • RBD as described herein may be modified in that 1-100, preferably 1-50, more preferably 1-10 amino acid residues are added, substituted or deleted from an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-3 or an antigenic portion thereof, preferably wherein said modified RBD binds to a product of an immune response, preferably an antibody, that is elicited when a subject is immunized with a conjugate as described herein, in wherein the RBD of said conjugate comprises or consists of an amino acid sequence of SEO ID N s : 1-3.
  • the term "RBD" includes a reference to a sequence that has 80%, preferably 90%, more preferably 95% sequence identity to SEO ID NOs: 1-3 and binds to a response product.
  • immune preferably an antibody, that is elicited when a subject is immunized with a conjugate as described herein, wherein the RBD of said conjugate comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-3.
  • a receptor binding domain (RBD) of a coronavirus spike (S) protein refers only to the RBD portion of the entire coronavirus spike (S) protein.
  • spike (S) protein or the equivalent term “spike (S) glycoprotein” refers to the coronavirus S protein consisting of an S1 subunit (the N-terminal head) and an S2 subunit (the C-terminal stem).
  • the S1 subunit mediates virus attachment and entry through its N-terminal S1A domain (comprising sialic acids, a viral binding factor) and its C-terminal receptor-binding domain (RBD), which binds to the SARS ACE2 receptor.
  • the S2 subunit is more conserved and mediates viral fusion to the host cell through the fusion peptide (FP) and the two heptad repeats HR1 and HR2.
  • carrier protein refers to an immunogenic protein to which an antigen such as a protein, oligosaccharide, or polysaccharide can bind. When bound to a carrier, the bound molecule can become more immunogenic. Covalent attachment of a molecule to a carrier confers enhanced immunogenicity and T-cell dependence.
  • protein is used herein to designate a series of amino acid residues, connected to each other by peptide bonds between the alpha-amino and carboxy groups of adjacent residues, also known as a "polypeptide” .
  • protein and polypeptide refer to a polymer of amino acids, including modified amino acids (eg, phosphorylated, glycated, glycosylated, etc.) and amino acid analogs, regardless of their size or function.
  • modified amino acids eg, phosphorylated, glycated, glycosylated, etc.
  • amino acid analogs regardless of their size or function.
  • Protein and polypeptide are often used in reference to relatively large polypeptides, while the term “peptide” is often used in reference to small polypeptides, but the use of these terms in the art overlaps.
  • proteins including the (RBD) antigens of the invention
  • RBD the proteins, including the (RBD) antigens of the invention
  • the invention contemplates deletions, additions, and substitutions of the sequences shown, so long as the sequences function in accordance with the methods of the invention.
  • particularly preferred substitutions will generally be conservative in nature, ie those substitutions which occur within a family of amino acids.
  • amino acids are generally divided into four families: (1) acids: aspartate and glutamate; (2) basic - lysine, arginine, histidine; (3) non-polar - alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; and (4) uncharged polar: glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine. Phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are sometimes classified as aromatic amino acids.
  • % sequence identity is defined herein as the percentage of nucleotides in a nucleic acid sequence, or of amino acids in an amino acid sequence, that is identical to nucleotides, resp. amino acids, in a nucleic acid or amino acid sequence of interest, after aligning the sequences and optionally introducing gaps, if necessary, to achieve maximum percent sequence identity. Methods and computer programs for alignments are well known in the art. Sequence identity is calculated over substantially the full length, preferably the full (full) length of an amino acid sequence of interest. The skilled person will understand that consecutive amino acid residues in one amino acid sequence are compared to consecutive amino acid residues in another amino acid sequence.
  • tetanus toxoid refers to the well-known tetanus toxoid peptide, which peptide represents an epitope of residues 830-844 of tetanus toxin. This sequence has been shown to bind to multiple HLA-DR alleles and has been described as universally immunogenic.
  • the amino acid sequence is QYIKANSKFIGITEL.
  • diphtheria toxoid refers to the inactivated exotoxin secreted by Corynebacterium diphtheriae, a single polypeptide chain of 535 amino acids consisting of two disulfide-linked subunits. Diphtheria toxoid is produced worldwide in a standard way; in the United States, production and testing procedures are specified in the Code of Federal Regulations.
  • CCM197 diphtheria toxoid mutant refers to a non-toxic mutant of diphtheria toxin, regularly used as a carrier protein for polysaccharides and haptens to render them immunogenic.
  • a single G->A transition in the wild-type diphtheria toxoid sequence leads to the substitution of glycine-52 for glutamic acid (Giannini et al. 1984 Nucleic Acids Res. 12(10):4063-4069),
  • covalent refers to a chemical bond in which two atoms share one or more pairs of electrons that hold them together.
  • covalent conjugate refers to a compound in which an antigenic polypeptide is covalently linked to a carrier protein.
  • covalently conjugate refers to the step of preparing the conjugate by chemical reactions.
  • vaccine includes a reference to a composition of antigenic moieties, generally consisting of live modified (attenuated) or inactivated infectious agents, or some portion of the infectious agents, that is administered, with most often, with an adjuvant. , in the body to produce active immunity.
  • the present invention provides immunogenic compositions comprising a conjugate as described above in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Said carrier may be an aqueous liquid or an aerosol composition.
  • dose refers to an amount or metered amount of the conjugate or composition of the invention administered or recommended to be administered at a particular time.
  • the term "adjuvant” as used herein includes reference to a compound or compounds that, when used in combination with specific vaccine antigens in formulations, enhance or otherwise alter or modify the resulting immune responses.
  • the builder is an alum (an aluminum salt) such as aluminum hydroxide.
  • pharmaceutical excipient refers to a material such as an adjuvant, a carrier, a buffering and pH regulating agent, a tonicity regulating agent, a wetting agent, a preservative and the like. .
  • Vaccine excipients are described, for example, in government regulations such as the European Pharmacopoeia and American 9 CFR, and in manuals such as: The Handbook of Pharmaceutical Excipients (R. Rowe et al., Pharmaceutical press 2012, ISBN 08571 10276 ); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472).
  • in situ reduction refers to the conversion of RBD dimer to monomer as described herein. Dimer reduction is preferably carried out using tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP). Preferably, the reduction is in situ, which means that the dimer is mixed with the TCEP and then with the carrier protein, without any intermediate purification steps.
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine
  • thiolation refers to the introduction of a sulfhydryl (SH) group at the N-terminal or N-terminal residue of RBD. Thiolation can be achieved reacting the RBD with an excess of 2-thioacetyl-pyridine-2-carboxaldehyde followed by treatment with hydroxylamine.
  • the term "functionalize” as used herein refers to the introduction of one or more thiophilic groups on the carrier protein.
  • Thiophilic groups can include maleimides, bromoacetyls, vinylsulfones, acrylates, acrylamides, acrylonitriles, and methacrylates.
  • One of skill in the art is well familiar with methods for introducing one or more thiophilic groups into a protein.
  • Functionalization can be achieved, for example, by reacting the carrier protein with maleimido-propionic acid N-hydroxysuccinimide ester in an appropriate buffer.
  • the thiolated RBD is allowed to react with the carrier protein functionalized with the thiophilic group(s) to form the conjugate of the invention.
  • conjugates obtained will contain from one to eight RBD units per unit of carrier protein.
  • the conjugation procedure described for this invention is chemoselective and residue specific.
  • a covalent conjugate according to the present invention is preferably not a fusion protein, in which the RBD and the carrier protein are linked through a peptide bond.
  • administer refers to the placement of a compound or composition as described herein into a subject by a method or route that results in at least partial administration of the conjugate in a desired site.
  • Pharmaceutical compositions comprising the compounds described herein can be administered by any appropriate route that results in effective treatment in the subject. Administration is preferably by injection, preferably intramuscularly.
  • a "subject” means a human or non-human animal.
  • the non-human animal is a vertebrate, such as a primate, rodent, domestic animal, or game animal.
  • Primates include chimpanzees, cynomolgus monkeys, spider monkeys and macaques, eg Rhesus.
  • Rodents include mice, rats, woodchucks, ferrets, rabbits, and hamsters. Animals also include armadillos, hedgehogs, and camels to name a few.
  • domestic and game animals include cattle, horses, pigs, deer, bison, buffalo, feline species, eg, domestic cat, canine species, eg, dog, fox, wolf, bird species, eg, chicken, emu , ostrich and fish, for example, trout, catfish and salmon.
  • the subject is a mammal, eg, a primate, eg, a human.
  • the terms "individual”, “patient” and “subject” are used interchangeably herein.
  • the subject is a mammal.
  • the mammal may be a human, primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, or pig, but is not limited to these examples.
  • Mammals other than humans may be advantageously used as subjects representing animal models of a given condition.
  • a subject is a human.
  • a subject can be male or female.
  • a subject may be one who has been previously diagnosed or identified as suffering from or has a condition in need of treatment and, optionally, has already undergone treatment.
  • a subject may also be one who has not previously been diagnosed with a condition.
  • a subject may be one that exhibits one or more risk factors or a subject that exhibits no risk factors.
  • a "subject in need" of treatment for a particular condition may be a subject having that condition, diagnosed with that condition, or at risk of developing that condition.
  • prevention of infection with the SARS-CoV-2 virus refers to the prevention or treatment of COVID-19 disease. , or a disease caused by the SARS-CoV-2 virus or a variant thereof.
  • treat refers to therapeutic treatments, where the object is to reverse, alleviate, ameliorate, inhibit, slow or stop the progression or severity of a disease, condition associated with a disease or disorder, e.g. eg cancer or inflammation.
  • treating includes reducing or alleviating at least one adverse effect or symptom of a condition, disease or disorder.
  • Treatment is generally “effective” if one or more symptoms or clinical markers are reduced.
  • treatment is “effective” if the progression of a disease is slowed or stopped. That is, “treatment” includes not only improvement of symptoms or markers, but also cessation, or at least slowing of the progress or worsening of symptoms compared to what would be expected in the absence of treatment.
  • Beneficial or desired clinical outcomes include, but are not limited to, relief of one or more symptoms, decreased extent of disease, stabilized (i.e., not worsening) disease, delayed or slowed progression of disease.
  • treatment also includes providing relief of the symptoms or side effects of the disease (including palliative treatment).
  • an effective amount refers to the amount of vaccine antigen necessary to alleviate at least one or more symptoms of the disease or disorder, and refers to a sufficient amount of the pharmacological composition to provide the desired effect. wanted.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount of a therapeutic agent to treat, ameliorate, counteract, inhibit, or prevent a desired disorder or condition, or to exhibit a detectable therapeutic or prophylactic effect. .
  • the precise effective amount needed for a subject will depend on the size and health of the subject, the nature and extent of the condition, and the therapeutic or combination of therapies selected for administration. The therapeutically effective amount for a given situation can be determined by routine experimentation.
  • vaccination refers to the administration of a vaccine to induce a neutralizing antibody response by the immune system of the recipient in order to develop protection against disease.
  • pharmaceutically acceptable is used herein to refer to those compounds, materials, compositions and/or dosage forms which, within the scope of sound medical judgment, are suitable for use in contact with human tissue. and animals without excesses, toxicity, irritation, allergic response or other problem or complication, in accordance with a reasonable benefit / risk ratio.
  • RBD protein coding sequences are synthesized and subcloned into an appropriate expression vector, preferably pcDNA3.1.
  • Selected RBD amino acid sequences are SEQ ID NO: 1-3 or extensions thereof.
  • Constructs containing target proteins can be expressed in one of the hosts traditionally used in biotechnology, namely mammalian cells (CHO, HEK293), insect cells, bacteria and yeast, preferably CHO cells.
  • RBD is a globular protein containing 195 amino acids (sequence Thr333-Pro527, SEQ ID NO: 2).
  • This sequence contains four intramolecular disulfide bridges between cisternae (Cys336-Cys361, Cys379-Cys432, Cys391-Cys525 and Cys480-Cys488), creating a very compact and stable structure.
  • This sequence constitutes the biologically relevant structure that will be used for RBD conjugation as it contains the four immunodominant epitopes described for this molecule, as well as the receptor binding motif.
  • These conjugates can be obtained from any fragment comprising the 333-527 sequence or extensions thereof.
  • the genetic construct used to produce the RBD may include an extension at one or both terminal ends of the 333-527 sequence, either at the N-terminus at any of amino acids 333-300, or at the C-terminus. in the region of 527-560 amino acids. It is possible to activate one of the terminal ends without affecting the biologically relevant structure by the genetic construct itself, specifically by stretching the sequence to include one of the natural amino acids thought to be active, for example cysteine 538.
  • Other solution consists in the introduction of active functional groups in one of the terminal ends; an example of this is the functionalization of the N-terminal amino acid thiol group, for example, at arginine 328 of the sequence 328-533 RBD (SEQ ID NO: 3).
  • the target protein amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 contains 9 cysteines, including 8 involved in the 4 intramolecular disulfide bonds (Cys336-Cys361, Cys379-Cys432, Cys391-Cys525, and Cys480-Cys488), resulting in a Very compact and stable structure.
  • the RBD of SEQ ID NO: 1 can dimerize by forming a disulfide bridge between two free cysteines at position 538 of two RBD molecules.
  • an inert gas atmosphere i.e. nitrogen or argon
  • the cysteine 538 does not react, the RBD remains in its monomeric form and thus may be involved in chemical reactions with groups thiophilic
  • the carrier protein may be selected from the group consisting of tetanus toxoid, diphtheria toxoid, and CRM197 diphtheria mutant, or any other protein that fulfills that function for use in human vaccines.
  • the methods of obtaining and characterizing these carrier proteins can be found in the existing literature.
  • the conjugation procedure described in the present invention is chemo-selective and residue specific. Said procedure comprises 3 stages.
  • the first stage (A) involves the functionalization of the carrier protein to introduce thiophilic groups, preferably maleimides, although any of the known thiophilic groups can be used: bromoacetyl, vinylsulfones, acrylates, acrylamides, acrylonitriles and methacrylates.
  • the functionalization can be carried out using maleimidopropionic acid (EMP) N-hydroxysuccinimidic ester in dimethylsulfoxide (DMSO) in a molar ratio with the protein between 100-200, in a suitable buffer solution.
  • EMP maleimidopropionic acid
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the functionalized protein is purified by diafiltration using membranes with a suitable cut-off value depending on the protein in question and the extent of functionalization is determined by the modified Ellman method.
  • Step (B) comprises the covalent conjugation of the RBD to the functionalized carrier protein, which are added to the reaction mixture in a mass:mass ratio of 0.2-9.4.0 RBD: carrier protein (w:w), in a solution adequate buffer, gentle agitation between 4-18 h at 5 ⁇ 3 °C in an inert atmosphere.
  • cystamine is added in a suitable proportion.
  • Stage (C) comprises the purification of the conjugates obtained, which can be carried out by membrane diafiltration with an appropriate cut-off value depending on the carrier protein in question.
  • Another embodiment of the present invention comprises a thiolation step through the N-terminal residue of the RBD prior to step A.
  • This procedure involves the reaction with 2-thioacetyl-pi ⁇ dino-2-carbaldehyde in excess (20-50 equivalents with respect to al RBD) between 12 and 48 hours of reaction and a temperature of 23-37 s C; followed by washing and treatment with excess hydroxylamine at room temperature, for 1-5 hours of reaction.
  • the conjugates obtained contain from one to eight RBD units in the new molecule.
  • the vaccine compositions against the SARS-COV-2 virus based on the covalent conjugates of the receptor binding domain to a carrier protein are administered intramuscularly or subcutaneously, in RBD doses between 1-30 Dg, preferably between 5-25 Dg .
  • the vaccine compositions can contain as adjuvant any mineral salt such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate and calcium phosphate without being limited to these, in doses between 200-1500 Dg, preferably between 500-1000 Dg.
  • the vaccine compositions comprise pharmaceutically suitable excipients that can regulate the pH, including phosphate buffers in a concentration range between 3.0-7.0 mM, isotonic solutions such as sodium chloride in a concentration range between 50-150 mM, and preservatives such as thiomersal, phenol, 2-phenoxyethanol, methyl parahydroxybensoate, formaldehyde, m-cresol and other methyl and propyl prabens, preferably thiomersal.
  • These vaccine composition formulations are preferably administered on a 1 to 3 dose schedule, preferably every 7 to 28 days, more preferably every 14 to 28 days, most preferably every 21 to 28 days.
  • a single dose for administration preferably comprises an amount of RBD from 1 to 30 pg.
  • a container such as an injection flask, may comprise multiple doses for vaccination of multiple subjects. Each dose is preferably from about 0.05 to about 1 mL, preferably each dose is from about 0.3-0.5 mL, most preferably about 0.3 mL. Doses may be contained in the container in concentrated or lyophilized form, and may be diluted or reconstituted with a suitable injection fluid prior to administration.
  • Administration is preferably intramuscular. Administration is preferably not intravascular, subcutaneous or intradermal.
  • the vaccine compositions proposed in this invention demonstrate their superiority compared to a vaccine composition containing the adjuvanted, unconjugated RBD; There are several characteristics of these vaccine compositions that are crucial in the current circumstances of the pandemic, namely the speed of the response elicited and the high levels of antibody titers that act as neutralizers of the SARS-CoV-2 virus and blockers of RBD-ACE2 receptor interaction. These compositions elicit a Th1 pattern immune response as well as a memory response of CD8 +, CD4 + and RBD-specific T cells, in particular those that produce IFN ⁇ .
  • the vaccine compositions proposed in this invention demonstrate superior results with clinical trials in the pediatric population.
  • the vaccine compositions proposed in this invention demonstrate a mucosal IgG response in vaccinated humans.
  • the significance of this is that such an induced mucosal response reduced virus transmission as well as its affectivity.
  • the present inventor considers this to be a unique and new property among currently available Covid-19 vaccines.
  • the RBD structure currently proposed as part of the full Spike protein vaccine is considered to have important advantages, since the full Spike protein vaccine shows significant adverse events such as myocarditis and pericarditis. These secondary effects are related to the carboxyl region of the Spike protein. This region is not present in currently proposed RBD carrier protein conjugate vaccines. It is noteworthy that the The proposed vaccine composition is currently well suited for pediatric use, as the reported side effects of whole Spike protein vaccines are particularly dramatic in the pediatric population.
  • the present inventors have not identified other adverse events, as reported for inactivated viral vaccines or adenovirus vector vaccines, and the assessment of immune response or neutralizing antibody response is higher than for inactivated viral vaccines.
  • the RBD dimer (sequence 319-541) is dissolved in 35 mM PBS buffer pH 7.4 with 0.5 mM EDTA, to achieve a final concentration between 5-10 mg/mL of protein.
  • a solution of TCEP is added to complete a final concentration between 125 pM-420 pM. The reaction is allowed to proceed for 10 min under argon atmosphere with moderate stirring at room temperature.
  • Example 2 Preparation of the conjugate of RBD (sequence 319-541) to Tetanus Toxoid Functionalization of the carrier protein: The tetanus toxoid carrier protein in 100 mM HEPES buffer solution pH 7.8 at a concentration of 5mg/mL is reacted with N-hydroxysuccinimidic ester of maleimidopropionic acid (EMP) in DMSO (75 mg/mL). mL) dripping the latter slowly. The reaction is kept for one hour at room temperature. Purification is carried out by diafiltration, washing with a PBS 35mM pH 7.4 buffer solution with 5mM EDTA. The extent of functionalization is determined by the modified ELLMAN method.
  • EMP N-hydroxysuccinimidic ester of maleimidopropionic acid
  • the RBD/TT ratio was determined by a combination of dot blot densitometry and colorimetry. Unconjugated RBD content and molecular size distribution were determined by HPSEC. Molecular size and polydispersity index were determined by Dynamic Light Scattering (DLS). Table 1 shows that the molar ratio of the conjugates varies between 1.8 and 6.3 moles of RBD / mole of TT, while the content of unbound RBD is less than 15%.
  • Example 3 Demonstration of the unaffected recognition of the RBD (319-541)-Tetanus Toxoid conjugate by the ACE2 receptor and specific antibodies.
  • RBD-TT Recognition of RBD conjugated to tetanus toxoid (RBD-TT) by the ACE2 receptor is performed by an ELISA in which the plate is coated with the recombinant ACE2 receptor.
  • the samples (RBD-TT (lots 1 and 2), dimeric RBD as positive control and hPDLHys as negative control) are added at different concentrations (0.001; 0.004; 0.019; 0.078; 0.3125; 1.25 and 5 pg/ml) and After incubation, a polyclonal rabbit serum specific for RBD is added. Subsequently, an anti-rabbit IgG conjugated to peroxidase is added. The reaction is revealed with the corresponding substrate and read at an Abs of 405 nm).
  • RBD-TT The antigenicity of RBD-TT is further verified by Dot Blot using a specific anti-RBD polyclonal IgG serum.
  • Figure 10B it is observed that the conjugate is strongly recognized by the specific anti-RBD antibodies in all the dilutions evaluated, while the tetanus toxoid (TT) applied at a 1/80 dilution is not recognized. It is shown that the conjugation does not affect the recognition of the antibodies to the RBD.
  • Example 4 The RBD (319-541 )-TT conjugate induces a strong antibody response in BALB/c mice.
  • mice are immunized intramuscularly at time 0 and 14 days, in an administration volume of 0.1 mL with one of the following formulations:
  • Group 3 3 pg of RBD-(319-541)-TT.
  • Group 4 3 pg of RBD-(319-541 )-TT co-adsorbed in 500 pg of Al(OH) 3 .
  • Group 6 constitutes the negative control formulation.
  • Blood extraction is performed at times 7, 14, 21 and 28 days after the start of immunization. Serum from immunized animals is analyzed by indirect ELISA to determine anti-RBD antibody titer.
  • NUNC Maxisorp 96-well microtiter plates were coated with 50 pL of RBD at a concentration of 3 pg/mL in carbonate-bicarbonate buffer solution pH 9.6, incubated for 1 hour at 37 ° C and at the end washed three times with solution. washing. Subsequently, uncoated sites were blocked using 100 pL of a 5% skim milk blocking solution for 1 hour at 37 °C . After another washing step as previously described, sera dissolved in buffer solution were added.
  • phosphates pH 7.2 + BSA at 1% in serial dilutions (1:3) generally starting from 1/50 and in a volume of 50 pL/well. Plates were incubated for 1 hour at 37° C and washed again. Next, 50 pL of a dilution of anti-mouse immunoglobulin G conjugated to peroxidase in phosphate buffer solution pH 7.2 + 1% BSA (1:5000) were added and incubated for 1 hour. After a final washing step, 50 pL/well of the peroxidase enzyme substrate solution was applied. It was incubated in the dark for 20 minutes and the reaction was stopped with 50 pL/well 2N H2SO4 solution.
  • Figure 11 shows that the IgG response induced by immunization with RBD-TT 3 pg adjuvanted in AI(OH) 3 induces a significantly higher (p ⁇ 0.05) early antibody response (7 and 14 days) compared to the same dose of unconjugated RBD and also adjuvanted in AI(OH) 3 .
  • This property is attributable to the conjugation of the RBD to a carrier protein.
  • RBD-TT 1 pg adjuvanted in AI(OH) 3 induces antibody kinetics similar to 3 pg of unconjugated RBD, which shows that the conjugation allows to increase the response to the antigen at a lower dose.
  • an increase in the levels of anti-RBD antibodies induced by the adjuvanted conjugate formulations is observed with respect to the non-adjuvanted ones, for the same dose.
  • Example 6 Functional activity of anti-RBD antibodies induced by the RBD (319-541)-Tetanus Toxoid conjugate formulation by RBD-ACE2 interaction inhibition assay.
  • mice immunized according to the procedure described in example 4 were used in an ELISA to determine their ability to inhibit the interaction of RBD and ACE2.
  • An ELISA was performed to inhibit the interaction of RBD with ACE2 induced by anti-RBD antibodies.
  • the plates coated with mouse ACE2-Fc (5 pg/mL) were blocked and the human RBD-Fc mixture was added with serum from mice immunized with the different experimental formulations, dilutions from 1:25 to 1:10,000, which had been previously incubated for 1 h at 37 S C.
  • Figure 13 shows the inhibitory capacity of the serum of mice immunized with the formulation object of the present invention. It is observed that the antibodies induced by the adjuvanted RBD-TT formulations have greater inhibitory capacity than the antibodies induced by the non-adjuvanted formulations. On the other hand, the inhibitory capacity 50 of the adjuvanted conjugate formulations is 2 (RBD-TT 1 pg /AI(OH) 3 ) and 6.5 (RBD-TT 3 pg /AI(OH) 3 ) times higher than that of the formulation. RBD 3 pg/AI(OH) 3 unconjugated, demonstrating that RBD conjugation increases the functionality of the antibodies even using lower doses.
  • Example 7 Functional activity of the anti-RBD antibodies induced by the formulation of the RBD (319-541)-Tetanus Toxoid conjugate by neutralizing capacity of the anti-RBD antibodies against the SARS-CoV-2 virus.
  • the neutralizing capacity against SARS-CoV-2 of sera from mice immunized with RBD-TT 3 pg /AI(OH) 3 and RBD 3 pg/AI(OH) 3 after 28 days of the first dose was evaluated by a colorimetric assay using Neutral Red.
  • Vero E6 cells were incubated in MEM medium supplemented with 2% fetal bovine serum (FBS), 25 mM/mL L-glutamine, 2 pg/mL bicarbonate, 80 pg/mL gentamicin, and 5 pg/mL Amphotericin B.
  • FBS fetal bovine serum
  • the supernatant was removed from the plate and 100 ⁇ l of balanced salts solution pH 7.2 (PBS) containing 0.02% red was added to each well. The plates were incubated for one hour at room temperature and then the neutral red solution was discarded. The cell monolayer was washed twice with sterile PBS containing 0.05% Tween 20. 100 ⁇ L of the lysis solution (50 parts absolute ethanol, 49 parts ultrapure water, and 1 part glacial acetic acid) were added to each well. . The plate was incubated for 15 minutes at room temperature and measured with a spectrophotometer at 540 nm. The highest dilution of the evaluated serum with an optical density value greater than the cutoff value. The cut-off value was calculated as the average of the optical density values of the cell control wells divided by two.
  • PBS balanced salts solution pH 7.2
  • Figure 14 shows that the neutralizing antibody titers induced by the RBD-TT conjugate are significantly higher (p ⁇ 0.01) than those induced by the unconjugated RBD, demonstrating the superiority of the RBD conjugation by increasing the functionality of the induced antibodies.
  • Example 8 Cellular immune response Th1 pattern, determined by the induction of IFNy of the formulation with RBD (319-541)-Tetanus Toxoid conjugate.
  • the evaluation of the cellular immune response was carried out in the immunized mice according to the procedure described in example 4 extracted at time 21 .
  • Splenocytes were isolated from mice immunized with 1 ug RBD-TT formulated in AI(OH) 3 or Placebo (AI(OH) 3 ) and restimulated in vitro with RBD (5 pg/mL), determined by quantitative ELISA.
  • the cell concentration used was 1 x 10 6 cells/mL.
  • the levels of IL-4, IL-17A and IFN-y were determined in the culture supernatant by quantitative ELISA at 72 hours of stimulation.
  • Figure 15 demonstrates that immunization with 1 ug RBD-TT/AI(OH) 3 induces IFN- ⁇ , demonstrating polarization of the T cell response to a Th1 pattern.
  • IL-4 and IL-17A were not detected demonstrating that the conjugate does not polarize towards a Th2 or Th17 pattern.
  • Example 9 Response of memory T cells, specific for the RBD protein of SARS-CoV-2 induced by the formulation with RBD (319-541)-Tetanus Toxoid conjugate
  • Splenocytes were isolated from mice immunized with 1 ug RBD-TT formulated in AI(OH) 3 or Placebo (AI(OH) 3 ). Splenocytes were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (vol/vol), 100U penicillin, 100 pg/mL streptomycin, 1 mM pyruvate, 50 pM [3- mercaptoethanol, 20 U/mL IL- 2 (Sigma-Aldrich) for 72 hours. At the same time, 5 pg/ml of the RBD was added to activate the cells.
  • Brefeldin A (BD Biosciences) was administered 4-6 hours before labeling to block cytokine secretion.
  • Cells were then washed with 1X PBS (Gibco) and stained for 30 min at 4 C with anti-CD8, anti-CD4, anti-CD44 and anti-CD220 (BioLegend). Subsequently, the cells were fixed and permeabilized to facilitate intracellular staining with anti-IFN-y and anti-IL-4 (BioLegend). Cytometry data were acquired at the Gallios flow cytometer (Beckman Coulter), the results were processed with the Kaluza software (Beckman Coulter).
  • Figure 16 shows that immunization with 1 ug RBD-TT /AI(OH) 3 generates memory CD8 + (A) and CD4 + T (C) lymphocytes, RBD-specific, with CD44 ++ phenotype. In addition, it produced an increase in the frequency of IFN-Y-producing memory CD8 (B) and CD4 T (D) cells.
  • the reaction mixture is stirred at a temperature between 23-37 °C for a period ranging between 12 h and 48 h.
  • Purification is carried out by diafiltrating washing with a 35 mM PBS buffer solution pH 7.4 with 5 mM EDTA.
  • the functionalized RBD (328-533) is brought to a final concentration of 20-200
  • the reaction mixture is stirred at room temperature under a nitrogen atmosphere for a period between 1-5 h, and the degree of conversion is determined by the Ellman test (>90% conversion obtained).
  • FIG. 18A An overlay of the HPSEC Superdex 75 chromatograms of the RBD, the 16 hr conjugation reaction mixture and the purified conjugate is shown in Figure 18A.
  • the purified conjugate has an RBD/TT molar ratio of 1.9, with an unbound RBD content of less than 15%.
  • Figure 19A shows that the conjugate is recognized by the ACE2 receptor in the same way as the positive control RBD. Therefore, it is verified that the processes of thiolation by the N-terminal residue and conjugation do not affect the epitopes of the RBD responsible for its recognition by the ACE2 receptor.
  • the antigenicity of the conjugate is further checked by Dot Blot using a specific anti-RBD polyclonal IgG serum.
  • Figure 19B it is observed that the conjugate is strongly recognized by the specific anti-RBD antibodies in all the dilutions evaluated, while the tetanus toxoid (TT) applied at a dilution of 1/80 is not recognized. It is shown that the conjugation does not affect the recognition of the antibodies to the RBD.
  • Example 13 The RBD(319-541)-TT conjugate elicits a strong antibody response in humans, especially in the pediatric population.
  • the vaccine formulation including RBD-(319-541)-TT in alum was evaluated in clinical trials on a two-dose schedule (TO, T28 days).
  • the procedures for clinical trials in the adult population (Phase II, 19-80 years) and pediatric population (Phase I / II, 3-18 years) are described at: https://rpcec.sld.cu/essayos/RPCEC00000347, https ://rpcec.sld.cu/essays/RPCEC00000374
  • Figure 20 shows the results of serum specific anti-RBD IgG 14 days after the second dose in both clinical trials.
  • High levels of antibodies were raised in all age groups with 74% seroconversion in the adult population (19-80 years).
  • children achieved 92.8% and 99.3% seroconversion in the 12-18 year old and 3-11 year old groups, respectively.
  • the medians of both pediatric groups 50.3 (15.9; 62.0 in 12-18 years) and 99.8 (39.1; 216.8 in 3-11 years) were higher than the median of a panel of serum made with COVID-19. convalescent children: 8.7 (3.4, 15.7).
  • Example 14 The RBD(319-541)-TT conjugate induces mucosal-specific IgG in humans
  • Figure 16 shows that subjects who were immunized elicited a specific anti-RBD IgG response in saliva.

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Abstract

La presente invención se relaciona con la biotecnología, específicamente con el campo de la salud humana. Describe conjugados covalentes del dominio de unión al receptor del virus SARS-CoV-2 con una proteína portadora, el método para obtener esos conjugados y las composiciones vacunales que los contienen. Las composiciones vacunales que se describen en la presente invención son útiles en la prevención de la infección por el virus SARS-CoV-2 ya que inducen una potente respuesta de anticuerpos neutralizantes.

Description

CONJUGADOS COVALENTES DEL DOMINIO DE UNIÓN AL RECEPTOR DEL VIRUS SARS- COV-2 Y UNA PROTEÍNA PORTADORA Y LAS COMPOSICIONES VACUNALES QUE LOS CONTIENEN.
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se relaciona con la biotecnología, específicamente con el campo de la salud humana. Particularmente, describe conjugados covalentes del dominio de unión al receptor del virus SARS-CoV-2 con una proteína portadora, el método para obtener esos conjugados y las composiciones vacunales que los contienen.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La enfermedad COVID19 es de muy reciente aparición, en Wuhan, China en diciembre de 2019, donde comenzaron a reportarse casos graves de neumonías de etiología desconocida. La enfermedad causada por el virus SARS-CoV-2 se caracteriza por una rápida difusión entre personas, principalmente con la aparición de síntomas como fiebre, tos, rinorrea, dolor de garganta y dificultad para respirar, en los casos sintomáticos, que representan menos del 50 %. En el resto de las personas la enfermedad cursa de forma asintomática, siendo este un elemento importante en la diseminación de la enfermedad y un reto epidemiológico para su control (WHO Coronavirus disease (COVID-2019) situation reports, https://www.who.int/emerqencies /diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports. Consultado el 13 de aqosto
Coronavirus similares a SARS-CoV-2, conocidos como MERS y SARS, han constituido agentes causantes de epidemias similares en décadas anteriores. El SARS tiene mayor homología con el SARS-CoV-2, y uno de los elementos de similitud es que ambos virus utilizan la proteína ACE2 como receptor para penetrar en las células humanas. Por tanto, en el SARS como en el SARS- CoV-2, la interacción entre el dominio de unión al receptor (RBD, del inglés receptor binding domain) de la proteína viral S1 y la proteína ACE2 (del inglés angiotensin-converting enzyme 2) es decisiva para la infección con el virus en el ser humano. (Walls A y cois. (2020) Cell https://doi.Org/10.1016/¡.cell.2020.02.058). Este dominio RBD de la proteína S del virus SARS- CoV-2 es un fragmento de aproximadamente 193 aminoácidos (correspondiente la secuencia 333-527) que contiene el motivo de unión al receptor (RBM, del inglés receptor binding motivé) que constituye la región por la cual el virus interacciona con el receptor ACE2. El RBD contiene además, 4 puentes bisulfuros intramoleculares entre las Cisternas 336-361 , 379-432, 391 -525 y 480-488, lo que ayuda a crear una estructura muy compacta y estable (Lan y cois (2020), Nature Vol 581 : 215-230.
El RBD es una molécula pequeña, cuya masa molecular oscila entre 25-27 kDa en función del hospedero donde de expresa y los carbohidratos incorporados, fundamentalmente vinculados a las asparaginas N331 y N343 (Chen WH y cois (2017) Journal of PharmaceuticaISciences 106: 1961 -1970).
Las estrategias para las vacunas contra el SARS-CoV-2 incluyen el virus inactivado, construcciones genéticas que contienen el material genético del virus incorporado ya sea en adenovirus o como ARN mensajero, y vacunas basadas en subunidades o fragmentos de proteínas virales expresadas hospederos modificados genéticas. En este caso, la molécula preferida es la proteína S, también conocida como proteína Spike, o un fragmento de su estructura, es decir, el RBD. Su principal ventaja es su seguridad, y que esta estrategia se acerca más a la de muchas vacunas en uso, sin embargo, su principal desafío es lograr una respuesta inmune que sea suficiente para proteger de la infección viral.
Hasta el presente (21 de septiembre de 2020) se encuentran en evaluación preclínica 149 candidatos vacunales contra el SARS-CoV-2 y 38 en fase de ensayos clínicos. De ellos, al menos 13 candidatos (5 en fase clínica y 8 en fase preclínica), utilizan el RBD como antígeno específico (DRAFT landscape of COVID-19 candidate vaccines -21 September 2020).
Estas vacunas consisten en el RBD absorbido en alúmina en altas concentraciones de hasta 50 microgramos por dosis
(https ://clinicaltrials.qov/ct2/show/NCT04466085?term=NCT04466085&draw=2&rank=1 consultado el 17 de agosto 2020). Otras candidatos vacunales usan la proteína RBD que comprende los residuos de aminoacídicos del 319-545 expresados en baculovirus y células de insectos, purificados y formulados usando hidróxido de aluminio como adyuvante (Yang J y cois (2020) Nature https://doi.Org/10.1038/s41586-020-2599-8). El RBD en su forma monoméñca también se ha utilizado en experimentos con animales absorbidos en alúmina, lo que demuestra que puede inducir anticuerpos neutralizantes sin incremento de la enfermedad provocada por anticuerpos Zang J. y cois (2020) https://doi.Org/10.1 101/2020.05.21 .107565).
Ninguna de las soluciones técnicas mencionadas anteriormente se acerca a la presenta invención. Los inventores de la presente invención aprovechan la estructura del RBD para obtener RBD conjugado covalentemente a proteínas portadoras. Estos conjugados pueden ser obtenidos a partir de cualquier fragmento que comprenda la secuencia 333-527 (SEQ ID NO. 2) o extensiones de la misma.
Sorprendentemente, la respuesta inmune generada contra estos conjugados, es más fuerte que la provocada por el monómero no conjugado de RBD en términos de su cinética y su capacidad de neutralización de virus, medida en un ensayo de neutralización de virus utilizando SARS-CoV- 2 y el ensayo de inhibición de unión al receptor ACE2. Estas son características fundamentales en medio del escenario pandémico causado por el SARS-CoV-2. Las composiciones vacunales descritas en la presente invención provocan una respuesta de anticuerpos IgG anti-RBD a los 7 días de inmunización con una polarización de la respuesta celular hacia un patrón Th1 , caracterizado por la inducción de IFNc, por lo que no se esperan los efectos inmunopatológicos reportados para vacunas contra coronavirus que inducen un patrón Th2.
Una de las debilidades de la inmunidad adquirida tras la infección con el coronavirus es la corta duración. Las composiciones vacunales descritas en la presente invención generan una respuesta de linfocitos T CD4+ y CD8+ de memoria, particularmente los productores de IFN +, linfocitos específicos al RBD.
Es procedente establecer respecto a la presente invención que ninguna solución técnica anterior o publicación científica describe conjugados covalentes del RBD a una proteína portadora obtenida por métodos químicos, ni composiciones vacunales basadas en estos conjugados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Una realización de la presente invención consiste en conjugados covalentes que comprenden el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 y una proteína portadora. Particularmente, estos conjugados se caracterizan porque la relación RBD/proteína portadora está preferiblemente en el rango molar: entre 1 -8 unidades de RBD por una proteína portadora. La proteína portadora puede seleccionarse del grupo que comprende: el toxoide tetánico, el toxoide diftérico, y el mutante diftérico CRM197, sin limitarse a éstos. El efecto inmunológico que se logra mediante la conjugación a toxoide tetánico se puede lograr mediante conjugación a las otras proteínas portadoras, por lo que el efecto de esta invención no se limita a toxoide tetánico.
El antígeno RBD utilizado para conjugar puede tener las secuencias aminoacídicas 319-541 (SEQ ID NO. 1 ), 333-527 (SEQ ID NO. 2) y 328-533 (SEQ ID NO. 3). Particularmente, la SEQ ID NO. 1 puede encontrarse además en forma dimérica. Dicho antígeno RBD puede ser producido en los hospederos que se seleccionan del grupo que comprenden: células de mamíferos, células de insectos, bacterias y levaduras. Otra realización de la invención comprende composiciones vacunales para inducir una respuesta inmune protectora contra el virus SARS-CoV-2 que se caracteriza porque comprende conjugados covalentes formados por el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 y una proteína portadora. Estas composiciones vacunales adicionalmente pueden incluir un adyuvante que se selecciona del grupo que comprende cualquier sal mineral como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato cálcico, entre otros. El conjugado de dichas composiciones vacunales tiene un intervalo de concentración de RBD de 1 a 30 pg por dosis, mientras que el adyuvante está dentro de un intervalo de concentración de 200 a 1500 pg por dosis. Estas composiciones también contienen excipientes farmacéuticamente adecuados.
Otra realización de la invención implica un procedimiento para la obtención de conjugados covalentes que comprende las siguientes: A) Funcionalización de la proteína portadora para introducirle grupos tiofilicos, B) Conjugación covalente de proteína portadora al RBD y C) Purificación. Dicho procedimiento adicionalmente puede comprender un paso de Reducción in situ de la forma RBD-dimérico previo a la etapa A, particularmente donde se emplee la SEQ ID NO. 1 y éste se encuentre en forma dimérica (Figura 1.). Además el procedimiento puede comprender otra etapa de Tiolación del extremo N-terminal del RBD previo a la etapa A, en la que se utilizan las SEQ ID NO: 1 -3 (Figura 2.). Los grupos tiofilicos introducidos en la etapa A se seleccionan del grupo que comprende: maleimidos, bromoacetilo, vinilsulfonas, acrilatos, acrilamidas, acrilonitrilos y metaacrilatos.
Otra realización la presente invención, está relacionada con el uso de las composiciones vacunales mencionadas anteriormente para la prevención de la infección por el virus SARS-CoV- 2. Implica, en particular, el uso de las composiciones vacunales descritas en este documento cuando se requiere una respuesta de anticuerpos neutralizantes.
Finalmente, existe otra realización de la presente invención que consiste en el uso de las composiciones vacunales antes mencionadas para inducir una respuesta temprana de anticuerpos IgG contra el virus SARS-CoV-2 aplicando un esquema de inmunización por vía intramuscular que cubre de 1 a 3 inyecciones, que van desde 1 a 30 pg de RBD.
La presente invención proporciona ahora en un primer aspecto un conjugado covalente que comprende el dominio de unión al receptor de SARS-CoV-2 (RBD) y una proteína transportadora. En una realización preferida del conjugado covalente de la invención, la proteína transportadora se selecciona del grupo que comprende toxoide tetánico, toxoide diftérico y toxoide diftérico mutante CRM197 (Figuras 3 y 4). En una realización preferida del conjugado covalente de la invención, la relación molar de proteína portadora de RBD está dentro del intervalo de 1 a 8 RBD por proteína portadora (Figura 5).
En una realización preferida del conjugado covalente de la invención, el RBD se selecciona del grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 , 2 y 3. En una realización preferida del conjugado covalente de la invención, el RBD de SEQ ID NO: 1 se usa en su forma dimérica.
En una realización preferida del conjugado covalente de la invención, el RBD se produce en un huésped seleccionado del grupo que comprende o consiste en células de mamífero (preferiblemente no humanas), células de insectos, bacterias y levaduras.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende el conjugado covalente de la invención como se describió anteriormente. La composición de la vacuna se usa preferiblemente para inducir una respuesta inmune contra el SARS-CoV-2.
En una realización preferida de la composición de vacuna de la invención, la composición de vacuna incluye además un adyuvante seleccionado del grupo que comprende o consiste en hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio.
En una realización preferida de la composición de vacuna de la invención, el conjugado está en un intervalo de concentración de RBD 1 -30 pg por dosis.
En una realización preferida de la composición de vacuna de la invención, el adyuvante está en un intervalo de concentración de 200-1500 pg por dosis.
En una realización preferida de la composición de vacuna de la invención, la composición de vacuna incluye además excipientes farmacéuticos apropiados.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación del conjugado covalente de la invención como se describe anteriormente, el método comprende los pasos de: proporcionar una proteína portadora y un RBD, en el que el RBD puede estar en forma monomérica o dimérica. , funcionalizando la proteína transportadora mediante la introducción de grupos tiof ílicos, conjugando covalentemente la proteína transportadora al RBD y purificando el conjugado obtenido.
En una realización preferida del método para la preparación del conjugado covalente de la invención en el que se usa un dímero RBD, el método comprende un paso adicional de reducción del dímero RBD, preferiblemente in situ antes de su conjugación con la proteína transportadora, preferiblemente antes de la funcionalización de la proteína transportadora mediante la introducción de grupos tiof ílicos. En una realización preferida del método para la preparación del conjugado covalente de la invención, se puede usar el RBD de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 -3, más preferiblemente, se utiliza la SEQ ID NO: 1 como RBD.
En una realización preferida del método de preparación del conjugado covalente de la invención, los grupos tiofílicos introducidos se seleccionan del grupo que comprende o consiste en maleimida, bromoacetilo, vinilsulfona, acrilato, acrilamida, acrilonitrilo y metacrilato. En otro aspecto, la presente invención proporciona un conjugado obtenido mediante el método para la preparación del conjugado covalente de la invención como se describe anteriormente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de la composición de vacuna de la invención para la prevención de la infección con el virus SARS-CoV-2, en particular la prevención de la enfermedad causada por la infección por el virus SARS-CoV-2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para prevenir la enfermedad causada por la infección por el virus del SARS-CoV-2 que comprende administrar a un sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de vacuna de la invención como se describe anteriormente.
Preferiblemente, en el uso de prevención de infección o método de prevención de enfermedad de acuerdo con la invención, el uso o método es para la prevención de infección o enfermedad por el virus SARS-CoV-2 en sujetos que necesitan una respuesta de anticuerpos neutralizantes después de haber recibió dos dosis o vacunas de la composición de la vacuna.
En realizaciones preferidas del uso y método de prevención de infecciones o enfermedades según la invención, el uso o método es inducir una respuesta de anticuerpos contra el SARS- CoV-2 aplicando un programa de vacunación intramuscular de 1 a 3 dosis. Preferiblemente, en una dosis de vacunación programada según la invención, la cantidad de RBD en una dosis es de 1 a 30 pg.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 . Esquema de conjugación selectiva de sitio del dominio de unión al receptor de SARS- Cov-2 (RBD) al toxoide tetánico (TT) activado con grupos de maleimida tiofílica. La conjugación tiene lugar en el tiol libre de Cys538, que está espacialmente distante del motivo de unión al receptor (representado en rojo) y, por lo tanto, no afecta la antigenicidad del RBD. Figura 2. Esquema de conjugación selectiva N-terminal del dominio de unión del receptor de SARS-Cov-2 (RBD) al toxoide tetánico (TT) activado con grupos de maleimida tiofílica. La tiolación N-terminal de las tomas RBD se lleva a cabo con los nuevos reactivos de tioacetil- piridinocarbaldehído (desarrollados internamente) que modifica selectivamente el grupo amino N-terminal. El residuo N-terminal está espacialmente distante del motivo de unión al receptor (representado en rojo) y, por lo tanto, no afecta la antigenicidad del RBD.
Figura 3. Dibujo del conjugado RBD basado en el RBD (319-541 ) conjugado en Cys538 usando A) toxoide tetánico, B) toxoide diftérico o C) material de reacción cruzada 197 (CRM197) como proteína transportadora.
Figura 4. Dibujo del conjugado RBD basado en el RBD (328-533) conjugado en el extremo N- terminal usando A) toxoide tetánico, B) toxoide diftérico o C) material de reacción cruzada 197 (CRM197) como proteína transportadora.
Figura 5. Representación de conjugados RBD-TT con un promedio de 2, 4 y 6 unidades de RBD por unidad de toxoide tetánico. También se obtuvieron conjugados que llevan un promedio de 8, 10 o 13 unidades RBD. Las secuencias de codificación para la proteína RBD se sintetizan y subclonan en un vector de expresión adecuado, preferentemente pcDNA3.1. Las secuencias aminoacídicas seleccionadas del RBD son las correspondientes a las SEQ ID NO. 1 - 3 o extensiones de las mismas. Las construcciones que contienen las proteínas objetivo pueden ser expresadas en un hospedero de los tradicionalmente utilizados en Biotecnología: células de mamíferos (CHO, HEK293), células de insectos, bacterias y levaduras, preferiblemente en células CHO.
Figura 6. Cromatogramas HPSEC Superdex 75, que muestran la reducción del dímero de RBD (SEQ ID NO: 1 ) al monómero RBD, y se compara con un perfil de referencia del monómero RBD.
Figura 7. SDS-PAGE al 10% de la forma nativa de RBD y el RBD derivado de la reducción del dímero de RBD (SEQ ID NO: 1 ). R: La muestra se incubó en tampón de muestra reductor antes de aplicarse al gel. NR: La muestra se aplicó en tampón de muestra no reductor.
Figura 8. Antigenicidad del monómero obtenido por reducción del dímero RBD (SEQ ID NO: 1 ) con tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), en comparación con la antigenicidad del monómero y dímero nativos. Figura 9. Cromatogramas HPSEC Superdex 200 de los conjugados RBD-TT 2 y 3 purificados (Ejemplo 2), en comparación con el cromatograma de toxoide tetánico.
Figura 10. Reconocimiento del conjugado RBD (319-541 ) -TT por el receptor ACE-2, analizado por ELISA (A) y por dot blot usando anticuerpos policlonales anti-RBD (B).
Figura 1 1 . Cinética de anticuerpos IgG anti-RBD inducidos después de la vacunación los días 0 y 14 con conjugado RBD-TT formulado o no en Al (OH) 3, en comparación con RBD formulado en Al (OH) 3. Los asteriscos indican diferencias significativas (p<0.05) entre los grupos en cada momento.
Figura 12. Cinética de anticuerpos IgG anti-TT inducidos tras la vacunación los días 0 y 14 con el conjugado RBD-TT formulado o no en Al (OH) 3.
Figura 13. Inhibición de la unión de RBD-ACE2 determinada en un ELISA con diluciones de anticuerpos inducidas el día 28 en ratones inmunizados los días 0 y 14 con las composiciones de vacuna del conjugado RBD-TT formulado o no en Al (OH) 3, comparado al RBD formulado en Al (OH) 3.
Figura 14. Actividad neutralizante anti-SARS-CoV-2 el día 28 de los sueros de los ratones inmunizados con dos dosis del conjugado RBD-TT formulado o no en Al (OH) 3, comparado con el RBD formulado en Al (OH) ) 3. Los asteriscos indican diferencias significativas (p <0.05).
Figura 15. Producción de IFNy, IL4 e IL17A en células de bazo de ratones inmunizados con RBD- TT formulado en Al (OH) 3 o con el placebo (Al (OH) 3), según se determina mediante un ELISA cuantitativo. Los asteriscos indican diferencias significativas (p <0.05), según la prueba de Tukey.
Figura 16. Respuesta de células de memoria inducida en ratones inmunizados con dos dosis del conjugado RBD-TT formulado en Al (OH) 3. (A) linfocitos T CD8 + CD44 ++, (B) linfocitos T CD8 productores de IFNy, (C) linfocitos T de memoria CD4 + CD44 ++ y (D) linfocitos T CD4 productores de IFNy. RBD / RBD: Grupo que recibió dos dosis (TO, T14) de RBD-TT y los linfocitos extraídos fueron estimulados in vitro con RBD. Alumbre / RBD: Grupo que recibió dos dosis (TO, T14) de Alum y los linfocitos extraídos fueron estimulados in vitro con RBD. Figura 17. Cromatogramas HPSEC Superdex 75, que muestran la tiolación selectiva del residuo N-terminal del monómero RBD (SEQ ID NO: 3), en comparación con el perfil de referencia del monómero RBD.
Figura 18. (A) Cromatogramas HPSEC Superdex 75, que muestran la conjugación del monómero RBD (SEQ ID NO: 3) tiolado en el residuo N-terminal (panel superior), la mezcla de reacción de 16 h de RBD-TT 4 (centro panel) y el conjugado purificado RBD-TT 4 (panel inferior). (B) Cromatogramas HPSEC Superdex 200 del conjugado purificado RBD-TT 4, en comparación con el toxoide tetánico.
Figura 19. Reconocimiento del conjugado RBD (328-533) -TT por el receptor ACE-2, analizado (A) por una prueba ELISA y (B) por anticuerpos policlonales anti-RBD, probado por dot blott.
Figura 20. Anticuerpos IgG anti-RBD inducidos 14 días (T42) después de la inmunización los días 0 y 28 con vacuna conjugada en el ensayo clínico de fase II (19-80 años) y el ensayo clínico de fase I / II (3-18 años / o). PCP: Panel de sueros de convalecientes pediátricos.
Figura 21 . IgG anti-RBD de muestras de saliva de sujetos vacunados o no vacunados
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El término "SARS-CoV-2", como se usa en este documento, se refiere al síndrome respiratorio agudo severo (SARS) coronavirus 2 (SARS-CoV-2), el virus causante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Las pruebas para detectar casos positivos de SARS-CoV-2 pueden basarse en la detección de secuencias de ARN del virus mediante NAAT, como la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) con confirmación mediante secuenciación de ácidos nucleicos cuando sea necesario. Los genes virales objetivo hasta ahora incluyen los genes N, E, S y RdRP.
El término enfermedad del SARS-CoV-2” y “COVID” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una enfermedad infecciosa viral causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-CoV-2). Los síntomas comunes de COVID-19 incluyen fiebre, tos y dificultad para respirar. El dolor muscular, la producción de esputo y el dolor de garganta son menos comunes. Si bien la mayoría de los casos provocan síntomas leves, algunos progresan a neumonía grave e insuficiencia multiorgánica. La infección generalmente se transmite de una persona a otra a través de las gotitas respiratorias que se producen al toser. También se puede propagar al tocar superficies contaminadas y luego tocarse la cara. El término "dominio de unión al receptor (RBD)", como se usa en este documento, se refiere al dominio de unión al receptor (RBD) de una proteína de pico (S) de coronavirus de un coronavirus, e incluye una referencia a una parte de la proteína de pico (S) de coronavirus que está involucrado en la unión viral a un receptor en una célula del sujeto y su posterior entrada en la célula. El receptor celular puede ser un receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2). Preferiblemente, el RBD comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1 -3. Dentro de la definición de RBD también se prevé un RBD que es una parte antigénica de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1 -3. Un RBD como se describe en el presente documento se puede modificar en el sentido de que se añaden, sustituyen o eliminan 1 -100, preferiblemente 1 -50, más preferiblemente 1 -10 residuos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 -3 o una parte antigénica del mismo, preferiblemente en el que dicho RBD modificado se une a un producto de una respuesta inmune, preferiblemente un anticuerpo, que se provoca cuando un sujeto se inmuniza con un conjugado como se describe en este documento, en el que el RBD de dicho conjugado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEO ID Ns: 1 -3. Por tanto, el término RBD incluye una referencia a una secuencia que tiene un 80%, preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95% de identidad de secuencia con las SEO ID NO: 1 -3 y se une a un producto de una respuesta inmune, preferiblemente un anticuerpo, que se provoca cuando un el sujeto se inmuniza con un conjugado como se describe en este documento, en el que el RBD de dicho conjugado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 -3.
En aspectos de esta invención, el término "un dominio de unión al receptor (RBD) de una proteína de pico (S) de coronavirus" se refiere únicamente a la porción RBD de la proteína de pico (S) de coronavirus completo.
El término "proteína de pico (S)", o el término equivalente "glucoproteína de pico (S)", se refiere a la proteína S del coronavirus que consta de una subunidad S1 (la cabeza N-terminal) y una subunidad S2 (el tallo C-terminal ). La subunidad S1 media la unión y entrada del virus a través de su dominio S1 A N-terminal (que comprende ácidos siálicos, un factor de unión viral) y su dominio de unión al receptor C-terminal (RBD), que se une al receptor ACE2 del SARS. La subunidad S2 está más conservada y media la fusión viral a la célula huésped a través del péptido de fusión (FP) y las dos repeticiones de heptada HR1 y HR2. La unión de la proteína RBD del SARS-CoV S a los receptores humanos ACE2 y CLEC4M / DC-SIGNR da como resultado la internalización del virus en los endosomas de la célula huésped. El término "proteína portadora", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína inmunogénica a la que se puede unir un antígeno tal como una proteína, oligosacárido o polisacárido. Cuando se une a un portador, la molécula unida puede volverse más inmunogénica. La unión covalente de una molécula a un portador confiere una mayor inmunogenicidad y dependencia de las células T.
Como se usa en este documento, el término "proteína" se usa en este documento para designar una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de residuos adyacentes, también conocidos como "polipéptido".
Los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a un polímero de aminoácidos, incluidos aminoácidos modificados (por ejemplo, fosforilados, glicados, glicosilados, etc.) y análogos de aminoácidos, independientemente de su tamaño o función. "Proteína" y "polipéptido" se usan a menudo en referencia a polipéptidos relativamente grandes, mientras que el término "péptido" se usa a menudo en referencia a polipéptidos pequeños, pero el uso de estos términos en la técnica se superpone.
En el contexto de la presente invención, los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" son completamente intercambiables. Debe entenderse que las proteínas, incluidos los antígenos (RBD) de la invención, pueden diferir de las secuencias exactas ¡lustradas y descritas en el presente documento. Por tanto, la invención contempla deleciones, adiciones y sustituciones de las secuencias mostradas, siempre que las secuencias funcionen de acuerdo con los métodos de la invención. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1 ) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básico - lisina, arginina, histidina; (3) no polar - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar no cargado: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, o viceversa; un aspartato con un glutamato o viceversa; una treonina con una serina o viceversa; o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que las secuencias ¡lustradas y descritas pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por tanto, dentro del alcance de la invención. Se considera que una identidad de secuencia en toda la longitud de la proteína RBD de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% es una variante funcional de la proteína RBD de las SEQ ID NO. : 1 -3 y puede usarse en aspectos de esta invención.
El término "% de identidad de secuencia" se define aquí como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico, o de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a los nucleótidos, resp. aminoácidos, en un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos de interés, después de alinear las secuencias y, opcionalmente, introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Los métodos y programas informáticos para alineamientos son bien conocidos en la técnica. La identidad de secuencia se calcula sustancialmente sobre la longitud total, preferiblemente la longitud completa (completa) de una secuencia de aminoácidos de interés. El experto entenderá que los residuos de aminoácidos consecutivos en una secuencia de aminoácidos se comparan con los residuos de aminoácidos consecutivos en otra secuencia de aminoácidos.
El término "toxoide tetánico", como se usa en este documento, se refiere al péptido toxoide tetánico bien conocido, péptido que representa un epítopo de los residuos 830-844 de la toxina tetánica. Se ha demostrado que esta secuencia se une a múltiples alelos HLA-DR y se ha descrito como universalmente inmunogénica. La secuencia de aminoácidos es QYIKANSKFIGITEL.
El término "toxoide diftérico", como se usa en este documento, se refiere a la exotoxina inactivada secretada por Corynebacterium diphtheriae, una cadena polipeptídica única de 535 aminoácidos que consta de dos subunidades unidas por puentes disulfuro. El toxoide diftérico se produce en todo el mundo de forma estándar; en los Estados Unidos, los procedimientos de producción y prueba se especifican en el Código de Regulaciones Federales.
El término "mutante de toxoide diftérico CRM197", como se usa en este documento, se refiere a un mutante no tóxico de la toxina diftérica, usado regularmente como proteína portadora de polisacáridos y haptenos para hacerlos inmunogénicos. Una sola transición G-> A en la secuencia del toxoide diftérico de tipo salvaje conduce a la sustitución de glicina-52 por ácido glutámico (Giannini et al. 1984 Nucleic Acids Res. 12 (10): 4063-4069),
El término "covalente", como se usa en este documento, se refiere a un enlace químico en el que dos átomos comparten uno o más pares de electrones que los mantienen juntos.
El término "conjugado covalente", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto en el que un polipéptido antigénico está unido covalentemente a una proteína portadora. El término "conjugar covalentemente", como se usa en este documento, se refiere al paso de preparar el conjugado mediante reacciones químicas.
El término "vacuna", como se usa en este documento, incluye una referencia a una composición de restos antigénicos, que generalmente consisten en agentes infecciosos vivos modificados (atenuados) o inactivados, o alguna parte de los agentes infecciosos, que se administra, con mayor frecuencia, con un adyuvante. , en el cuerpo para producir inmunidad activa. La presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden un conjugado como se describió anteriormente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo puede ser un líquido acuoso o una composición en aerosol.
El término "dosis", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad o cantidad medida del conjugado o composición de la invención administrada o recomendada para ser administrada en un momento particular.
El término "adyuvante", como se usa en el presente documento, incluye referencia a un compuesto o compuestos que, cuando se usan en combinación con antígenos de vacuna específicos en formulaciones, aumentan o alteran o modifican de otro modo las respuestas inmunes resultantes. Preferiblemente, el adyuvante es un alumbre (una sal de aluminio) tal como hidróxido de aluminio.
El término "excipiente farmacéutico", como se usa en este documento, se refiere a un material tal como un adyuvante, un portador, un agente tamponador y regulador del pH, un agente regulador de la tonicidad, un agente humectante, un conservante y similares. Los excipientes de vacunas se describen, por ejemplo, en regulaciones gubernamentales tales como la Farmacopea Europea y la American 9 CFR, y en manuales tales como: The Handbook of Pharmaceutical Excipients (R. Rowe et al., Pharmaceutical press 2012, ISBN 08571 10276); Remington: la ciencia y la práctica de la farmacia (2000, Lippincot, EE. UU., ISBN: 683306472).
El término "reducción in situ", como se usa en el presente documento, se refiere a la conversión de dímero en monómero de RBD como se describe en el presente documento. La reducción de dímeros se lleva a cabo preferiblemente usando tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP). Preferiblemente, la reducción es in situ, lo que significa que el dímero se mezcla con el TCEP y luego con la proteína transportadora, sin ninguna etapa de purificación intermedia.
El término "tiolación", como se usa en este documento, se refiere a la introducción de un grupo sulfhidrilo (SH) en el residuo N-terminal o N-terminal de RBD. La tiolación se puede lograr haciendo reaccionar el RBD con un exceso de 2-tioacetil-p¡r¡d¡n-2-carboxaldehído seguido de tratamiento con hidroxilamina.
El término "funcionalizar", como se usa en este documento, se refiere a la introducción de uno o más grupos tiofílicos en la proteína portadora. Los grupos tiofílicos pueden incluir maleimidas, bromoacetilos, vinilsulfonas, acrilatos, acrilamidas, acrilonitrilos y metacrilatos. Un experto en la técnica está bien familiarizado con los métodos para introducir uno o más grupos tiofílicos en una proteína. La funcionalización puede conseguirse, por ejemplo, haciendo reaccionar la proteína portadora con éster de N-hidroxisuccinimida del ácido maleimido-propiónico en un tampón apropiado. En aspectos de esta invención, se deja que el RBD tiolado reaccione con la proteína portadora funcionalizada con el grupo o grupos tiofílicos para formar el conjugado de la invención. Dependiendo de la estequiometría de la reacción, los conjugados obtenidos contendrán de una a ocho unidades RBD por unidad de proteína transportadora. El procedimiento de conjugación descrito para esta invención es quimioselectivo y específico de residuo. Un conjugado covalente de acuerdo con la presente invención preferiblemente no es una proteína de fusión, en la que el RBD y la proteína portadora están unidos a través de un enlace peptídico.
Como se usa en el presente documento, el término "administrar" se refiere a la colocación de un compuesto o composición como se describe en el presente documento en un sujeto mediante un método o ruta que da como resultado la administración al menos parcial del conjugado en un sitio deseado. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos descritos en el presente documento se pueden administrar mediante cualquier ruta apropiada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto. Preferiblemente, la administración es por inyección, preferiblemente intramuscular.
Como se usa en este documento, un "sujeto" significa un animal humano o no humano. Por lo general, el animal no humano es un vertebrado, como un primate, un roedor, un animal doméstico o un animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cinomólogos, monos araña y macacos, por ejemplo, Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales también incluyen armadillos, erizos y camellos, por nombrar algunos. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, especies felinas, por ejemplo, gato doméstico, especies caninas, por ejemplo, perro, zorro, lobo, especies de aves, por ejemplo, pollo, emú, avestruz y pescado, por ejemplo, trucha, bagre y salmón. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano. Los términos "individuo", "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente en el presente documento. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo, una vaca o un cerdo, pero no se limita a estos ejemplos. Se pueden usar ventajosamente mamíferos distintos de los humanos como sujetos que representan modelos animales de una afección determinada. Preferiblemente, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser hombre o mujer. Un sujeto puede ser uno a quien se le ha diagnosticado o identificado previamente que padece o tiene una afección que necesita tratamiento y, opcionalmente, ya se ha sometido a tratamiento. Alternativamente, un sujeto también puede ser uno a quien no se le haya diagnosticado previamente una afección. Por ejemplo, un sujeto puede ser uno que exhibe uno o más factores de riesgo o un sujeto que no exhibe factores de riesgo. Un "sujeto que necesita" tratamiento para una afección particular puede ser un sujeto que tiene esa afección, diagnosticado con esa afección o en riesgo de desarrollar esa afección.
El término "prevención de la infección con el virus SARS-CoV-2", como se usa en este documento, y el término "prevención de la enfermedad causada por la infección por el virus SARS-CoV-2", como se usa en este documento, se refieren a la prevención o el tratamiento de la enfermedad COVID-19. , o una enfermedad causada por el virus SARS-CoV-2 o una vahante del mismo.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento", "tratar" o "mejora" se refieren a tratamientos terapéuticos, en los que el objeto es revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresión o gravedad de una enfermedad, condición asociada con una enfermedad o trastorno, p. ej. cáncer o inflamación.
El término "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto o síntoma adverso de una afección, enfermedad o trastorno. El tratamiento es generalmente "efectivo" si se reducen uno o más síntomas o marcadores clínicos. Alternativamente, el tratamiento es "efectivo" si la progresión de una enfermedad se reduce o se detiene. Es decir, “tratamiento” incluye no solo la mejora de los síntomas o marcadores, sino también el cese, o al menos la desaceleración del progreso o empeoramiento de los síntomas en comparación con lo que se esperaría en ausencia de tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de uno o más síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, mejoría o paliación, del estado de la enfermedad, remisión (ya sea parcial o total) y / o disminución de la mortalidad, ya sea detectable o indetectable. El término "tratamiento" de una enfermedad también incluye proporcionar alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluido el tratamiento paliativo).
El término "cantidad eficaz" como se usa en este documento se refiere a la cantidad de antígeno de vacuna necesaria para aliviar al menos uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, y se refiere a una cantidad suficiente de composición farmacológica para proporcionar el efecto deseado.
Por tanto, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de antígeno de vacuna que es suficiente para producir un efecto particular cuando se administra a un sujeto típico. Una cantidad eficaz como se usa aquí, en varios contextos, también incluiría una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de un síntoma de enfermedad (por ejemplo, pero no limitado a, ralentizar la progresión de un síntoma de enfermedad o su gravedad), o revertir un síntoma de la enfermedad. Por lo tanto, generalmente no es factible especificar una "cantidad efectiva" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, una "cantidad eficaz" apropiada puede ser determinada por un experto en la técnica usando sólo experimentación de rutina. Preferiblemente, una cantidad eficaz provoca una respuesta de anticuerpos neutralizantes en el sujeto.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar, contrarrestar, inhibir o prevenir un trastorno o afección deseados, o para exhibir un efecto terapéutico o profiláctico detectable. La cantidad eficaz precisa necesaria para un sujeto dependerá del tamaño y la salud del sujeto, la naturaleza y extensión de la afección y la terapéutica o combinación de terapias seleccionadas para la administración. La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación dada se puede determinar mediante experimentación de rutina.
El término "respuesta de anticuerpos neutralizantes" se refiere a la generación de anticuerpos en un sujeto que se unen y reducen o disminuyen la actividad de una proteína extraña, p. el RBD de SARS-CoV-2. La actividad de la proteína extraña puede reducirse en una cantidad detectable, por ejemplo, 10%, 25%, 50%, 75% o 100% (es decir, completamente inactivada), por ejemplo, en comparación con la actividad de la proteína extraña en la ausencia o antes de provocar la respuesta del anticuerpo neutralizante. La actividad de la proteína extraña dependerá de la proteína extraña que se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica.
El término "vacunación", como se usa en este documento, se refiere a la administración de una vacuna para inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes por parte del sistema inmunológico del receptor con el fin de desarrollar protección contra una enfermedad. El término "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y / o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesos, toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio / riesgo razonable.
Método de obtención del antígeno RBD
Las secuencias codificantes de la proteína RBD se sintetizan y subclonan en un vector de expresión apropiado, preferiblemente pcDNA3.1. Las secuencias de aminoácidos de RBD seleccionadas son SEQ ID NO: 1 -3 o extensiones de las mismas. Las construcciones que contienen proteínas diana pueden expresarse en uno de los huéspedes usados tradicionalmente en biotecnología, a saber, células de mamífero (CHO, HEK293), células de insectos, bacterias y levaduras, preferiblemente células CHO.
La proteína objeto expresado se recolecta por centrifugación y filtración; se purifica en una columna de afinidad, preferiblemente una columna de Ni-Sepharose, seguida de una purificación por cromatografía de exclusión por tamaño, preferiblemente en Superdex 200. La proteína purificada se analiza aplicando métodos apropiados como SDS-PAGE, HPSEC y MS para determinar tamaño, pureza, identidad y secuencia de aminoácidos, entre otras características moleculares.
Para obtener conjugados covalentes con proteínas transportadoras, los inventores capitalizan la estructura del RBD, que es una proteína globular que contiene 195 aminoácidos (secuencia Thr333-Pro527, SEQ ID NO: 2). Dicha secuencia contiene cuatro puentes disulfuro intramoleculares entre cisternas (Cys336-Cys361 , Cys379-Cys432, Cys391 -Cys525 y Cys480- Cys488), creando una estructura muy compacta y estable. Esta secuencia constituye la estructura biológicamente relevante que se utilizará para la conjugación del RBD ya que contiene los cuatro epítopos inmunodominantes descritos para esta molécula, así como el motivo de unión al receptor. Estos conjugados pueden obtenerse a partir de cualquier fragmento que comprenda la secuencia 333-527 o extensiones de la misma.
Además, la construcción genética utilizada para producir el RBD puede incluir una extensión en uno o ambos extremos terminales de la secuencia 333-527, ya sea en el N-terminal en cualquiera de los aminoácidos de 333 a 300, o en el C -terminus en la región de 527-560 aminoácidos. Es posible activar uno de los extremos terminales sin afectar la estructura biológicamente relevante mediante la propia construcción genética, específicamente estirando la secuencia para incluir uno de los aminoácidos naturales que se consideran activos, por ejemplo la cisteína 538. Otra solución consiste en en la introducción de grupos funcionales activos en uno de los extremos terminales; un ejemplo de esto es la funcionalización del grupo tiol del aminoácido N-terminal, por ejemplo, en la arginina 328 de la secuencia 328-533 RBD (SEQ ID NO: 3).
La secuencia de aminoácidos de la proteína diana de SEQ ID NO: 1 contiene 9 cisteína, incluidas 8 implicadas en los 4 puentes disulfuro intramoleculares (Cys336-Cys361 , Cys379-Cys432, Cys391 -Cys525 y Cys480-Cys488), lo que da como resultado un Estructura muy compacta y estable. Durante la purificación del RBD y en presencia de aire (condiciones oxidantes suaves), el RBD de SEQ ID NO: 1 puede dimerizarse formando un puente disulfuro entre dos cisteínas libres en la posición 538 de dos moléculas RBD. Sin embargo, si el RBD se mantiene en una atmósfera de gas inerte (es decir, nitrógeno o argón), la cisteína 538 no reacciona, el RBD permanece en su forma monomérica y, por lo tanto, puede estar involucrado en reacciones químicas con grupos tiofílicos
Método de obtención de conjugados covalentes RBD a una proteína portadora
La proteína portadora puede seleccionarse del grupo que comprende el toxoide tetánico, toxoide diftérico y mutante diftérico CRM197, o cualquier otra proteína que cumpla esa función para uso en vacunas humanas. Los métodos de obtención y caracterización de estas proteínas portadoras pueden ser encontrados en la literatura existente.
El procedimiento de conjugación descrito en la presente invención es quimio-selectiva y residuo específica. Dicho procedimiento comprende de 3 etapas. La primera etapa (A) involucra la funcionalización de la proteína portadora para introducirle grupos tiofílicos, preferiblemente maleimidos, aunque pueden emplearse cualquiera de los grupos tiofílicos conocidos: bromoacetilo, vinilsulfonas, acrilatos, acrilamidas, acrilonitrilos y metacrilatos. La funcionalización puede realizarse empleando éster N-hidroxisuccinimídico del ácido maleimidopropiónico (EMP) en dimetilsu Ifóxido (DMSO) en una relación molar con la proteína entre 100-200, en una solución tampón adecuada. La proteína funcionalizada se purifica por diaf iltración empleando membranas con un valor de corte adecuado según la proteína que se trate y la extensión de la funcionalización se determina por el método de Ellman modificado.
La etapa (B) comprende la conjugación covalente del RBD a la proteína portadora funcionalizada las cuales se adicionan a la mezcla de reacción en una relación masa:masa de 0.2-9.4.0 RBD: proteína portadora (w:w), en una solución tampón adecuada, agitación suave entre 4-18 h a 5 ± 3 °C en atmósfera de inerte. Para bloquear los grupos tiofílicos remanentes se adiciona cistamina en una proporción adecuada. La etapa (C) comprende la purificación de los conjugados obtenidos que puede realizarse por diafiltración con membrana con valor de corte adecuado según la proteína portadora de la que se trate.
Para la conjugación puede utilizarse RBD de la SEQ ID NO. 1 tanto en su forma monomérica como en su forma dimérica. Como parte de la presente invención, se introduce un paso previo a la etapa (A) que incluye la ruptura del puente bisulfuro intermolecular que forma el dímero de RBD emplean condiciones reductoras suaves utilizando un agente reductor de enlaces bisulfuro, preferiblemente ditiotreitol (DTT) o tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP) en el rango de concentración de 125 pM- 420 pM, durante 5-20 minutos y a temperaturas de 0-23sC. Estas condiciones provocan la ruptura selectiva de este puente sin afectar los 4 puentes bisulfuro intramoleculares señalados anteriormente. La reducción del dímero a monómero puede ser comprobada por HPSEC mientras que la no afectación de los 4 puentes bisulfuro intramoleculares se comprueba por SDS-PAGE y la Antigenicidad por ELISA indirecto.
Otra realización de la presente invención, comprende un paso de tiolación por el residuo N- terminal del RBD previo a la etapa A. Este procedimiento conlleva la reacción con 2-tioacetilo- piñdino-2-carbaldehído en exceso (20-50 equivalentes con respecto al RBD) entre 12 y 48 horas de reacción y una temperatura de 23-37sC; seguido de lavados y tratamiento con exceso de hidroxilamina a temperatura ambiente, durante 1 -5 horas de reacción.
Dependiendo de la estequiometría utilizada, los conjugados obtenidos contienen desde una a ocho unidades de RBD en la nueva molécula.
Composiciones vacunales y métodos de administración:
Las composiciones vacunales contra el virus SARS-COV-2 basadas en los conjugados covalentes del dominio de unión al receptor a una proteína portadora se administran por vía intramuscular o subcutánea, en dosis de RBD entre 1 -30 Dg, preferentemente entre 5-25 Dg. Las composiciones vacunales pueden contener como adyuvante cualquier sal mineral como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato cálcico sin limitarse a estos, en dosis entre 200-1500 Dg, preferentemente entre 500-1000 Dg. Las composiciones vacunales comprenden excipientes farmacéuticamente adecuados que pueden regular el pH entre ellos tampones fosfatos en rango de concentraciones entre 3, 0-7,0 mM, soluciones ¡sotónicas como por ejemplo el cloruro de sodio en rango de concentraciones entre 50-150 mM, y conservantes tales como tiomersal, fenol, 2-fenoxietanol, parahidroxibensoato de metilo, formaldehído, m-cresol y otros metil y propil prabenos, preferiblemente tiomersal. Estas formulaciones de composición de vacuna se administran preferiblemente siguiendo un esquema de 1 a 3 dosis, preferiblemente cada 7 a 28 días, más preferiblemente cada 14 a 28 días, más preferiblemente cada 21 a 28 días. Preferiblemente, hay al menos un intervalo de una a tres semanas, preferiblemente un intervalo de al menos dos semanas, entre dosis consecutivas. Una dosis única para administración comprende preferiblemente una cantidad de RBD de 1 a 30 pg. Un recipiente, como un matraz de inyección, puede comprender múltiples dosis para la vacunación de múltiples sujetos. Cada dosis es preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1 mi, preferiblemente cada dosis es de aproximadamente 0,3-0, 5 mi, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,3 mi. Las dosis pueden estar comprendidas en el recipiente en forma concentrada o liof ilizada, y pueden diluirse o reconstituirse con un fluido de inyección adecuado antes de la administración.
La administración es preferiblemente intramuscular. La administración preferiblemente no es intravascular, subcutánea o intradérmica. Las composiciones de vacuna propuestas en esta invención demuestran su superioridad en comparación con una composición de vacuna que contiene el RBD adyuvado, no conjugado; Hay varias características de estas composiciones de vacuna que son cruciales en las circunstancias actuales de la pandemia, a saber, la rapidez de la respuesta provocada y los altos niveles de títulos de anticuerpos que actúan como neutralizadores del virus SARS-CoV-2 y bloqueadores de la interacción del receptor RBD-ACE2. Estas composiciones provocan una respuesta inmune de patrón Th1 así como una respuesta de memoria de células CD8 +, CD4 + y T específicas para el RBD, en particular aquellas que producen IFNy.
Ventajas adicionales
Las composiciones de vacuna propuestas en esta invención demuestran resultados superiores con ensayos clínicos en la población pediátrica.
Además, las composiciones de vacuna propuestas en esta invención demuestran una respuesta de IgG mucosal en humanos vacunados. La importancia de esto es que tal respuesta mucosa inducida redujo la transmisión del virus así como su ¡afectividad. El presente inventor considera que esta es una propiedad única y nueva entre las vacunas Covid-19 actualmente disponibles. Se considera que la estructura RBD propuesta actualmente como parte de la vacuna de proteína Spike completa tiene ventajas importantes, ya que la vacuna de proteína Spike completa muestra eventos adversos importantes como miocarditis y pericarditis. Estos efectos secundarios están relacionados con la región carboxilo de la proteína Spike. Esta región no está presente en las vacunas conjugadas de proteína portadora RBD propuestas actualmente. Es de destacar que la composición de vacuna propuesta actualmente es muy adecuada para uso pediátrico, ya que los efectos secundarios referidos de las vacunas de proteína Spike completas son particularmente drásticos en la población pediátrica.
Los resultados iniciales muestran que la respuesta inmune de sujetos inmunodeprimidos e inmunodeprimidos es altamente beneficiosa y mejor que con otras vacunas.
Los presentes inventores no han identificado otros eventos adversos, como se informa para las vacunas virales inactivadas o las vacunas de vectores de adenovirus, y la evaluación de la respuesta inmune o la respuesta de anticuerpos neutralizantes es mayor que para las vacunas virales inactivadas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Preparación del RBD (319-541) activado por la cisteína 538 a partir del dímero.
El dímero de RBD (secuencia 319-541 ) se disuelve en tampón PBS 35 mM pH 7,4 con 0,5 mM de EDTA, para lograr una concentración final entre 5-10 mg/mL de proteína. Se adiciona una disolución de TCEP para completar una concentración final entre 125 pM- 420 pM. La reacción se deja transcurrir durante 10 min en atmósfera de argón con agitación moderada a temperatura ambiente.
La conversión en monómero se verifica por HPSEC y la integridad molecular por electroforesis en gel de poliacrilamida. En la figura 6 se muestran los perfiles en HPSEC donde se observa que el monómero generado por reducción tiene la misma distribución molecular que el monómero nativo. En la figura 7 (SDS-PAGE) se puede observar que el RBD monómero regenerado por reducción (línea 3) tiene igual patrón de migración que el RBD monómero nativo (línea 2, conformación nativa). A diferencia de una muestra control a la que se aplicaron condiciones drásticas para reducir los puentes ínter e intramoleculares (línea 4), que migra menos.
La conservación de la Antigenicidad del monómero generado luego de la reducción se realiza mediante un ELISA indirecto utilizando un suero humano de convaleciente de COVID-19. Como se observa en la Figura 8, se comprueba que el RBD regenerado por reducción, fue reconocido de manera similar que el RBD nativo en este sistema mientras que el control de monómero de RBD reducido en condiciones drásticas, que rompen los puentes bisulfuro ínter e intramoleculares (Total (C-)) no es reconocido por el suero.
Ejemplo 2. Preparación del conjugado del RBD (secuencia 319-541) a Toxoide tetánico Funcionalización de la proteína portadora: La proteína portadora toxoide tetánico en disolución tampón a HEPES 100 mM pH 7,8 a una concentración de 5mg/mL se pone a reaccionar con éster N-hidroxisuccinimídico del ácido maleimidopropiónico (EMP) en DMSO (75 mg/mL) goteando este último lentamente. La reacción se mantiene durante una hora a temperatura ambiente. La purificación se realiza por diafiltración realizando lavados con disolución tampón PBS 35mM pH 7,4 con 5mM de EDTA. La extensión de la funcionalización se determina por el método de ELLMAN modificado.
Conjugación: A una disolución del RBD en su forma monomérica o regenerado por reducción in situ del RBD dimérico a monómero, se adiciona el toxoide tetánico previamente funcionalizado, en una relación RBD:TT (m:m) entre 0, 2-4,0. La reacción se mantiene con agitación suave entre 4-18 h a 5 ± 3 °C en atmósfera de argón. Para bloquear los grupos maleimidos remanentes se adiciona hidrocloruro de cisteamina hasta una concentración de 157 uM y se mantiene la agitación durante 30 min. Transcurrido este tiempo el conjugado se purifica.
Purificación: Se realiza por diafiltración con membrana de 100 kDa como valor de corte, realizando lavados con PBS 6 mM pH 7,0.
La relación RBD / TT se determinó mediante una combinación de densitometría de transferencia puntual y colorimetría. El contenido de RBD no conjugado y la distribución del tamaño molecular se determinaron mediante HPSEC. El tamaño molecular y el índice de polidispersión se determinaron mediante Dynamic Light Scattering (DLS). La tabla 1 muestra que la relación molar de los conjugados varía entre 1 ,8 y 6,3 moles de RBD / mol de TT, mientras que el contenido de RBD no unido es inferior al 15%. La constante de distribución de tamaño molecular (Kd) demuestra un aumento en el tamaño molecular de los conjugados en comparación con el toxoide tetánico (Kd = 0,31 ). También se muestra que el tamaño relativo de la población de conjugado aumenta a medida que se incorporan más moles de RBD en la proteína transportadora (Tabla 1 y Figura 9).
Tabla 1. Caracterización químico-física de conjugados RBD-TT
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Ejemplo 3. Demostración de la no afectación del reconocimiento del conjugado RBD (319- 541)-Toxoide Tetánico por el receptor ACE2 y anticuerpos específicos.
El reconocimiento del RBD conjugado a toxoide tetánico (RBD-TT) por el receptor ACE2 se realiza mediante un ELISA en el cual se recubre la placa con el receptor ACE2 recombinante. Las muestras (RBD-TT (lotes 1 y 2), RBD dimérico como control positivo y hPDLHys como control negativo) se adicionan a diferentes concentraciones (0.001 ; 0.004; 0.019; 0.078; 0.3125; 1 .25 y 5 pg/ml) y luego de incubadas se adiciona un suero policlonal de conejo específico a RBD. Posteriormente, se adiciona una IgG anti- conejo conjugada a peroxidasa. La reacción es revelada con el sustrato correspondiente y leída a una Abs de 405 nm).
Como se observa en la figura 10A, los dos lotes de conjugado son reconocidos por el receptor ACE2 al igual que el control positivo RBD dimérico. Se comprueba, por tanto, que los procesos de reducción in situ y conjugación, no afectan los epítopos del RBD responsables del reconocimiento del mismo al receptor ACE2.
La antigenicidad del RBD-TT se comprueba además por Dot Blot utilizando un suero IgG policlonal específico anti-RBD. En la Figura 10B, se observa que el conjugado es reconocido fuertemente por los anticuerpos específicos anti-RBD en todas las diluciones evaluadas, mientras que el toxoide tetánico (TT) aplicado a una dilución 1/80 no es reconocido. Se demuestra que la conjugación no afecta el reconocimiento de los anticuerpos al RBD.
Ejemplo 4. El conjugado RBD (319-541 )-TT induce una potente respuesta de anticuerpos en ratones BALB/c.
Ratones BALB/c se inmunizan por vía intramuscular a tiempo 0 y 14 días, en un volumen de administración de 0,1 mL con una de las siguientes formulaciones:
- Grupo 1 :1 pg de RBD-(319-541 )-TT.
- Grupo 2:1 pg de RBD-(319-541 )-TT co-adsorbido en 500 pg de AI(OH)3.
- Grupo 3:3 pg de RBD-(319-541 )-TT. - Grupo 4:3 pg de RBD-(319-541 )-TT co-adsorbido en 500 pg de AI(OH)3.
- Grupo 5: 3 pg de RBD-(319-541 ) co-adsorbido en 500 pg de AI(OH)3.
- Grupo 6: Placebo. PBS y 500 pg de AI(OH)3
El grupo 6 constituye la formulación control negativa.
Se realiza la extracción de sangre a tiempos 7, 14, 21 y 28 días después de iniciada la inmunización. El suero de los animales inmunizados se analiza mediante un ELISA indirecto para determinar el título de anticuerpos anti-RBD. Las placas de microtitulación de 96 pocilios NUNC Maxisorp se recubrieron con 50 pL de RBD a una concentración de 3 pg/mL en disolución reguladora carbonato-bicarbonato pH 9.6, se incubaron 1 hora a 37SC y al término se lavaron tres veces con disolución de lavado. Posteriormente, se bloquearon los sitios no recubiertos empleando 100 pL de una disolución de bloqueo de leche descremada al 5% durante 1 hora a 37SC. Luego de otro paso de lavado como se describió previamente, se adicionaron los sueros disueltos en disolución reguladora de fosfatos pH 7.2 + BSA al 1 % en diluciones seriadas (1 :3), generalmente partiendo de 1/50 y en un volumen de 50 pL/pozo. Las placas se incubaron 1 hora a 37SC y fueron lavadas nuevamente. A continuación, se adicionaron 50 pL de una dilución de anti-inmunoglobulina G de ratón conjugada a peroxidasa en disolución reguladora de fosfatos pH 7.2 + BSA al 1 % (1 :5000) y se incubaron durante 1 hora. Luego de un último paso de lavado, se aplicó 50 pL/pozo de la disolución sustrato para enzima peroxidasa. Se incubó en la oscuridad durante 20 minutos y se detuvo la reacción con disolución de H2SO4 2N 50 pL/pozo. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de ELISA Multiskan EX (ThermoScientific). El Título de IgG se definió como el inverso de la dilución del suero de cada animal individual donde se alcanza cuatro veces el valor de la media de la absorbancia de los sueros pre-inmunes (T0) diluido 1/50. Para una mejor presentación y análisis de los resultados se calcula el Log 10 del Título de cada animal individual. Para definir los animales respondedores, se consideró como valor de corte un Log del Título > 1.70, lo que se corresponde con una dilución del suero superior a 1/50. Los animales cuyo Título fue inferior al límite de detección del ensayo, se consideró un valor de Título igual a 25 y de log 10 de 1 .4.
En la figura 1 1 muestra que la respuesta IgG inducida por la inmunización con RBD-TT 3 pg adyuvado en AI(OH)3 induce una respuesta de anticuerpos temprana (7 y 14 días) significativamente mayor (p< 0,05) comparado con la misma dosis de RBD sin conjugar y adyuvado también en AI(OH)3. Esta propiedad es atribuible a la conjugación del RBD a una proteína portadora. De igual modo, se observa que RBD-TT 1 pg adyuvado en AI(OH)3 induce una cinética de anticuerpos similar a 3 pg de RBD sin conjugar, lo que demuestra que la conjugación permite incrementar la respuesta al antígeno a más baja dosis. Adicionalmente, se observa un incremento de los niveles de anticuerpos anti-RBD inducido por las formulaciones conjugadas adyuvadas respecto a las no adyuvadas, para la misma dosis.
Ejemplo 5. Título de anticuerpos anti-Toxoide tetánico inducidos por el conjugado RBD (319-541)-Toxoide Tetánico
Para evaluar la inducción de anticuerpos anti-TT inducidos por los conjugados RBD-TT se utilizaron los sueros provenientes de los ratones inmunizados según el procedimiento descrito en el ejemplo 4 extraídos a tiempo 7, 14, 21 y 28 días. Las placas de microtitulación de 96 pocilios NUNC Maxisorp se recubrieron con 100 pL de toxoide tetánico a una concentración de 2.5 pg/mL en PBS 1X pH 7.2 y se incubaron toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Luego se lavaron tres veces con disolución de lavado. Posteriormente, se adicionaron los sueros y la curva disueltos en disolución reguladora de fosfatos pH 7.2 + BSA al 1 % en diferentes diluciones y se aplicaron 100 pL/pozo. Las placas se incubaron 1 hora a 37SC y fueron lavadas nuevamente. A continuación, se adicionaron 100 pl de una dilución de anti-inmunoglobulina G de ratón conjugada a peroxidasa en disolución reguladora de fosfatos pH 7.2 + BSA al 1 % (1 :10000) durante 1 hora a 37SC. Luego de un último paso de lavado, se aplicó 100 pL/pozo de la disolución sustrato para enzima peroxidasa. Se incubó en la oscuridad durante 25 minutos y se detuvo la reacción con disolución de H2SO42N 50 pL/pozo. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de ELISA Multiskan EX (Thermo Scientific). El título se determinó transformando los valores de absorbancias a Ul/ml (Unidades Internacionales por mililitro); se utilizó la función logistic-log de cuatro parámetros para construir la curva de referencia a partir de las diluciones del estándar.
Como se observa en la Figura 12, las formulaciones que contenían el conjugado adyuvado en AI(OH)3 indujeron una elevada respuesta de IgG anti-TT, superior significativamente (p< 0,05) a los grupos sin adyuvar.
Ejemplo 6. Actividad funcional de los anticuerpos anti-RBD inducidos por la formulación del conjugado RBD (319-541 )-Toxoide Tetánico mediante Ensayo de Inhibición de la interacción de RBD-ACE2.
Los sueros provenientes de los ratones inmunizados según el procedimiento descrito en el ejemplo 4 extraídos a tiempo 28 se emplearon en un ELISA para determinar su capacidad de inhibición de la interacción del RBD y ACE2.
Se realizó un ELISA de inhibición de la interacción del RBD al ACE2 inducido por los anticuerpos anti-RBD. Para la determinación del % de inhibición de la interacción RBD-ACE2, las placas recubiertas con ACE2-Fc de ratón (5 pg/mL), se bloquearon y se les añadió la mezcla RBD-Fc humano con suero de ratones inmunizados con las diferentes formulaciones experimentales, a diluciones desde 1 :25 a 1 :10000, que habían sido previamente incubados 1 h a 37SC. Para la detección del reconocimiento se utilizó un conjugado anti human IgG (gamma chain specific)- fosfatasa alcalina, diluido en tampón SSTF-T-leche al 0.2%. Luego de un último paso de lavado, se aplicó 50 pL/pozo de la pNPP (1 mg/mL) en tampón dietanolamina. Se incubó en la oscuridad durante 20 minutos y se detuvo la reacción con disolución de NaOH 3M 50 pL/pozo. Se leyó la absorbancia a 405 nm. Se calculó el porciento de inhibición mediante la siguiente fórmula: (1 - Abs405nm RBD Fe humano + suero de ratón/Abs405nm RBD Fe humano) *100. La concentración máxima inhibitoria 50 (IC50) por regresión no-lineal utilizando el programa GraphPad 7.00 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).
La figura 13 muestra la capacidad inhibitoria del suero de los ratones inmunizados con la formulación objeto de la presente invención. Se observa que los anticuerpos inducidos por las formulaciones RBD-TT adyuvadas tienen mayor capacidad inhibitoria que los anticuerpos inducidos por las formulaciones no adyuvadas. Por otra parte, la capacidad inhibitoria 50 de las formulaciones conjugadas adyuvadas es 2 (RBD-TT 1 pg /AI(OH)3) y 6.5 (RBD-TT 3 pg /AI(OH)3) veces superior a la de la formulación RBD 3 pg/AI(OH)3 sin conjugar, demostrando que la conjugación del RBD incrementa la funcionalidad de los anticuerpos incluso utilizando dosis inferiores.
Ejemplo 7. Actividad funcional de los anticuerpos anti-RBD inducidos por la formulación del conjugado RBD (319-541 )-Toxoide Tetánico mediante Capacidad neutralizante de los anticuerpos anti-RBD contra el virus SARS-CoV-2.
La capacidad neutralizante contra el SARS-CoV-2 de los sueros de los ratones inmunizados con RBD-TT 3 pg /AI(OH)3 y RBD 3 pg/AI(OH)3 luego de 28 días de la primera dosis (Ejemplo 4) se evaluó mediante un ensayo colorimétrico utilizando Rojo Neutro. Las células Vero E6 se incubaron en medio MEM suplementado con 2 % de suero fetal bovino (SFB), 25 mM/mL de L- glutamina, 2 pg/mL de bicarbonato, 80 pg/mL de gentamicina y 5 pg/mL Anfotericin B. Se eliminó el sobrenadante de la placa y se añadieron 100 pl de solución de sales balanceadas pH 7.2 (PBS) que contenía 0.02% de rojo a cada pozo. Las placas se incubaron una hora a temperatura ambiente y posteriormente se desechó la solución de rojo neutro. La monocapa de células se lavó dos veces con PBS estéril que contenía 0.05% Tween 20. Se adicionaron 100 pL de la solución de lisis (50 parte de etanol absoluto, 49 parte de agua ultrapura y una parte de ácido acético glacial) a cada pozo. La placa se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente y se realizó la medición con un espectrofotómetro a 540 nm. Se consideró como título de neutralización, la mayor dilución del suero evaluado con un valor de densidad óptica mayor que el valor de corte. El valor de corte se calculó como el promedio de los valores de la densidad óptica de los pozos del control celular dividido por dos.
En la Figura 14 se observa que los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos por el conjugado RBD-TT son significativamente superiores (p< 0,01 ) a los inducidos por el RBD sin conjugar, demostrando la superioridad de la conjugación del RBD aumentando la funcionalidad de los anticuerpos inducidos.
Ejemplo 8. Respuesta inmune celular patrón Th1, determinado por la inducción de IFNy de la formulación con conjugado RBD (319-541 )-Toxoide Tetánico.
La evaluación de la respuesta inmune celular se realizó en los ratones inmunizados según el procedimiento descrito en el ejemplo 4 extraídos a tiempo 21 . Los esplenocitos fueron aislados de ratones inmunizados con 1 ug RBD-TT formulado en AI(OH)3 o Placebo (AI(OH)3) y reestimulados in vitro con RBD (5 pg/mL), determinado por ELISA cuantitativo. La concentración celular empleada fue de 1 x 106 células/mL. Los niveles de IL-4, IL-17A e IFN-y fueron determinados en el sobrenadante de cultivo, mediante ELISA cuantitativo a las 72 horas de estimulación.
La figura 15 demuestra que la inmunización con el 1 ug RBD-TT/AI(OH)3 induce IFN-y, demostrándose la polarización de la respuesta de células T a un patrón Th1 . No se detectó IL-4 e IL-17A demostrando que el conjugado no polariza hacia un patrón Th2 o Th17.
Ejemplo 9. Respuesta de células T de memoria, específicas por la proteína RBD del SARS- CoV-2 inducida por la formulación con conjugado RBD (319-541)-Toxoide Tetánico
La evaluación de la respuesta de células T de memoria se realizó en los ratones inmunizados según el procedimiento descrito en el ejemplo 4 extraídos a tiempo 21 . Los esplenocitos fueron aislados de ratones inmunizados con 1 ug RBD-TT formulado en AI(OH)3 o Placebo (AI(OH)3). Los esplenocitos fueron cultivados en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (vol/vol), 100U penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 1 mM de piruvato, 50 pM [3- mercaptoethanol, 20 U/mL IL-2 (Sigma-Aldrich) por 72 horas. Al mismo tiempo, 5 pg/ml del RBD fue añadido para activar las células. Brefeldina A (BD Biosciences) fue administrada de 4-6 horas antes del mareaje para bloquear la secreción de citoquinas. Las células fueron entonces lavadas por PBS 1X (Gibco) y teñidas por 30 min a 4 C con anti- CD8, anti-CD4, anti CD44 y anti-CD220 (BioLegend). Posteriormente, las células fueron fijadas y permeabilizadas para facilitar la tinción intracelular con anti-IFN-y y anti-IL-4 (BioLegend). Los datos de citometría fueron adquiridos en el citómetro de flujo Gallios (Beckman Coulter), los resultados se procesaron con el software Kaluza (Beckman Coulter).
La figura 16 muestra que la inmunización con el 1 ug RBD-TT /AI(OH)3 genera linfocitos T CD8+ (A) y T CD4+ (C) de memoria, RBD específicos, con fenotipo CD44++. Además, produjo un incremento de la frecuencia de células T CD8 (B) y T CD4 (D) de memoria productoras de IFN- Y-
Ejemplo 10. Preparación del RBD (328-533) tiolado en el residuo N-terminal
Una disolución del RBD (328-533), concentración final 20-200 p.M en 5-10 mL de disolución tampón fosfato 50 mM (pH 7,5) en presencia de EDTA 5 mM se trata con el reactivo 2-tioacetil- piridino-2-carbaldehido (1 -10 mM concentración final). La mezcla de reacción se agita a temperatura entre 23-37 °C durante un periodo que oscila entre 12 h y 48 h. La purificación se realiza por diaf iltración realizando lavados con disolución tampón PBS 35 mM pH 7,4 con 5 mM de EDTA. El RBD (328-533) funcionalizado se lleva a concentración final de 20-200 |_iM y se trata con hidrocloruro de hidroxilamina hasta una concentración final de 40 mM. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente en atmosfera nitrógeno por un periodo entre 1 -5 h, y el grado de conversión de determina por el ensayo de Ellman (>90% conversión obtenido).
Por espectrometría de masa se verifica una conversión superior al 80% del residuo N-terminal. La evaluación por HPSEC evidencia que no hubo fenómenos de agregación durante la reacción, el RBD mantiene su distribución de talla molecular, una vez tiolado (Figura 17).
Ejemplo 11. Preparación del conjugado RBD (328-533) tiolado por el N-terminal a toxoide tetánico
La obtención del conjugado RBD (328-533) tiolado por el N-terminal a toxoide tetánico se realiza como se describe en el ejemplo 2.
En la figura 18A se muestra una superposición de los cromatogramas en HPSEC Superdex 75 del RBD, la mezcla de reacción de conjugación de 16 h y el conjugado purificado. El conjugado purificado tiene una relación molar RBD/TT de 1 .9, con un contenido de RBD no enlazado menor del 15 %. El perfil cromatográfico en HPSEC Superdex 200 (figura 18B), muestra un incremento en la talla molecular del conjugado (Kd=0,27) respecto a la proteína portadora (Kd=0,31 ).
Los conjugados obtenidos a partir de las SEQ ID NO. 1 y NO. 3, por el procedimiento de conjugación descrito en el ejemplo 2, tienen similares características químico físicas. Ejemplo 12. Demostración de la no afectación del reconocimiento del conjugado RBD (328- 533) a Toxoide Tetánico por el receptor ACE2 y anticuerpos específicos.
El reconocimiento del RBD conjugado a toxoide tetánico por el receptor ACE2 y a anticuerpos específicos anti-RBD se analiza cómo se describe en el ejemplo 3.
En la figura 19A se observa, que el conjugado es reconocido por el receptor ACE2 al igual que el control positivo RBD. Se comprueba, por tanto, que los procesos de tiolación por el residuo N- terminal y la conjugación, no afectan los epítopos del RBD responsables del reconocimiento del mismo al receptor ACE2.
La antigenicidad del conjugado se comprueba además por Dot Blot utilizando un suero IgG policlonal específico anti-RBD. En la Figura 19B, se observa que el conjugado es reconocido fuertemente por los anticuerpos específicos anti-RBD en todas las diluciones evaluadas, mientras que el toxoide tetánico (TT) aplicado a una dilución 1/80 no es reconocido. Se demuestra que la conjugación no afecta el reconocimiento de los anticuerpos al RBD.
Ejemplo 13. El conjugado RBD (319-541) -TT provoca una fuerte respuesta de anticuerpos en humanos, especialmente en población pediátrica.
La formulación de la vacuna que incluye RBD- (319-541 ) -TT en alumbre se evaluó en ensayos clínicos en un programa de dos dosis (TO, T28 días). Los procedimientos de los ensayos clínicos en población adulta (Fase II, 19-80 años) y pediátrica (Fase I / II, 3-18 años) se describen en: https://rpcec.sld.cu/ensayos/RPCEC00000347, https://rpcec.sld.cu/ ensayos/RPCEC00000374
La Figura 20 muestra los resultados de IgG anti-RBD específica en suero 14 días después de la segunda dosis en ambos ensayos clínicos. Se elevaron niveles elevados de anticuerpos en todos los grupos de edad con un 74% de seroconversion en la población adulta (19-80 años). En particular, los niños alcanzaron el 92,8% y el 99,3% de seroconversion en los grupos de 12-18 años y 3-1 1 años, respectivamente. Además, las medianas de ambos grupos pediátricos: 50,3 (15,9; 62,0 en 12-18 años) y 99,8 (39,1 ; 216,8 en 3-11 años) fueron superiores a la mediana de un panel de suero elaborado con COVID-19. niños convalecientes: 8,7 (3,4; 15,7).
Ejemplo 14. El conjugado RBD (319-541) -TT induce IgG mucosa específica en humanos
Saliva de sujetos inmunizados con dos dosis (T0, 28 días) de una formulación de RBD- (319- 541 ) -TT en alumbre y una dosis de refuerzo de RBD diméñco en alumbre (T56) como se describe: https://rpcec.sld.cu/ensayos /RPCEC00000360 se analizó mediante un ensayo ELISA “interno”. RBD como revestimiento (5 pg / ml) y PBS-BSA al 3% como bloqueo. Las muestras de saliva se evaluaron puras por duplicadas. Después de las etapas de incubación, se añadió el conjugado humano de peroxidasa anti-lgG (Sigma A6029, 1 : 2500) en un tampón apropiado. La reacción fluoñmétñca final se indujo añadiendo sustrato OPD. Los resultados se expresaron en valores de absorbancia.
La Figura 16 muestra que los sujetos que fueron inmunizados provocaron una respuesta IgG anti-RBD específica en la saliva.

Claims

CONJUGADOS COVALENTES DEL DOMINIO DE UNIÓN AL RECEPTOR DEL VIRUS SARS- COV-2 Y UNA PROTEÍNA PORTADORA Y LAS COMPOSICIONES VACUNALES QUE LOS CONTIENEN. REIVINDICACIONES
1 . El conjugado covalente que comprenden el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS- CoV-2 y una proteína portadora.
2. El conjugado covalente de la reivindicación 1 donde la proteína portadora se selecciona del grupo que comprende: el toxoide tetánico, el toxoide diftérico y CRM197.
3. El conjugado covalente de cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, donde la relación RBD/proteína portadora se encuentra en el rango molar: entre 1 -8 unidades de RBD por
1 proteína portadora.
4. El conjugado covalente según las reivindicaciones 1 -3, donde el RBD se selecciona del grupo que comprende las SEQ ID NO. 1 -3.
5. El conjugado covalente según las reivindicaciones 1 -4 donde el RBD que tiene la SEQ ID NO.1 se encuentra en forma de dímero.
6. El conjugado covalente de las reivindicaciones 1 -5 donde el RBD es producido en los hospederos que se seleccionan del grupo que comprenden: células de mamíferos, células de insectos, bacterias y levaduras.
7. Una composición vacunal para inducir una respuesta inmune contra el virus SARS-CoV-
2 caracterizada porque comprende el conjugado covalente de las reivindicaciones 1 -5.
8. La composición vacunal de la reivindicación 7 que adicionalmente comprende un adyuvante que se selecciona del grupo que comprende: hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato cálcico.
9. La composición vacunal de la reivindicación 7 donde el conjugado se encuentra en el rango de concentración de 1 -30 pg por dosis en función del RBD.
10. La composición vacunal de la reivindicación 8 donde el adyuvante se encuentra en el rango de concentración de 200-1500 pg por dosis.
11. La composición vacunal según la reivindicación 7-10, que además comprende excipientes farmacéuticamente adecuados.
12. Un procedimiento para la preparación del conjugado covalente de las reivindicaciones 1 - 5 que comprende las siguientes etapas: A) Funcionalización de la proteína portadora para introducirle grupos tiofilicos, B) Conjugación covalente de proteína portadora al RBD y C) Purificación.
13. El procedimiento según la reivindicación 12 que adicionalmente comprende un paso de Reducción in situ de la forma RBD-dimérico previo a la etapa A.
14. El procedimiento según la reivindicación 12 que adicionalmente comprende un paso de Tiolación del extremo N-terminal del RBD previo a la etapa A.
15. El procedimiento según la reivindicación 13 donde se emplea la SEQ ID NO. 1 .
16. El procedimiento según la reivindicación 14 donde se emplea cualquiera de las SEQ ID NO. 1 -3.
17. El procedimiento según la reivindicación 12 donde en la etapa A, los grupos tiofilicos que se introducen se seleccionan del grupo que comprende: maleimidos, bromoacetilo, vinilsulfonas, acrilatos, acrilamidas, acrilonitrilos y metaacrilatos.
18. El conjugado obtenido según el procedimiento de la reivindicaciones 12-17.
19. Uso de la composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 7-1 1 en la prevención de la infección por el virus SARS-CoV-2.
20. Uso de la composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 7-1 1 en la prevención de la infección por el virus SARS-CoV-2 cuando se requiere de una respuesta de anticuerpos neutralizantes después de dos dosis de la composición vacunal.
21 . Uso de la composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones 7-1 1 en la inducción de una respuesta de anticuerpos contra el virus SARS-CoV-2 por vía intramuscular en dosis de RBD de entre 1 -30 pg, en esquema de inmunización de 1 a 3 dosis.
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